RU2015120524A

RU2015120524A - Способы и продукты для экспрессии белков в клетках

Info

Publication number: RU2015120524A
Application number: RU2015120524A
Authority: RU
Inventors: Матью ЭНДЖЕЛ; Кристофер РОДЕ
Original assignee: Фэктор Байосайенс Инк.
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2016-12-20
Also published as: KR20210127818A; US20200032298A1; AU2013337651B2; US20150267189A1; CA3150985A1; AU2018264115A1; US20190345519A1; US10752919B2; JP2015534817A; JP6890565B2; US20170362612A1; JP2024056815A; EP2914728B1; KR20200067921A; US20150275193A1; KR20150080573A; RU2019143431A; BR122019025681B1; US20200032297A1; KR102596302B1

Abstract

1. Синтетическая молекула РНК, содержащая по меньшей мере два из нуклеотидов: 5-метилуридина, 5-метилцитидина и 7-дезазагуанозина.2. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один остаток каждого из нуклеотидов: 5-метилуридина, 5-метилцитидина и 7-дезазагуанозина.3. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты уридина и в пределах между около 20% и около 80% фрагментов уридина представляют собой 5-метилуридины.4. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты цитидина и в пределах между около 50% и около 100% фрагментов цитидина представляют собой 5-метилцитидины.5. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты гуанозина и в пределах между около 20% и около 80% фрагментов гуанозина представляют собой 7-дезазагуанозины.6. Синтетическая молекула РНК по п. 2, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты уридина, цитидина и гуанозина, и в пределах между около 20% и около 80% уридинов представляют собой 5-метилуридины, в пределах между около 50% и около 100% цитидинов представляют собой 5-метилцитидины, и в пределах между около 20% и около 80% гуанозинов представляют собой 7-дезазагуанозины.7. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая 5′-кэп структуру.8. Синтетическая молекула РНК по п. 7, отличающаяся тем, что 5′-кэп структура представляет собой структуру Кэп 1.9. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая 3′-поли(А) хвост.10. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая нетранслируемый участок.11. Синтетическая

Claims

1. Синтетическая молекула РНК, содержащая по меньшей мере два из нуклеотидов: 5-метилуридина, 5-метилцитидина и 7-дезазагуанозина.

2. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один остаток каждого из нуклеотидов: 5-метилуридина, 5-метилцитидина и 7-дезазагуанозина.

3. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты уридина и в пределах между около 20% и около 80% фрагментов уридина представляют собой 5-метилуридины.

4. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты цитидина и в пределах между около 50% и около 100% фрагментов цитидина представляют собой 5-метилцитидины.

5. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты гуанозина и в пределах между около 20% и около 80% фрагментов гуанозина представляют собой 7-дезазагуанозины.

6. Синтетическая молекула РНК по п. 2, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК содержит фрагменты уридина, цитидина и гуанозина, и в пределах между около 20% и около 80% уридинов представляют собой 5-метилуридины, в пределах между около 50% и около 100% цитидинов представляют собой 5-метилцитидины, и в пределах между около 20% и около 80% гуанозинов представляют собой 7-дезазагуанозины.

7. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая 5′-кэп структуру.

8. Синтетическая молекула РНК по п. 7, отличающаяся тем, что 5′-кэп структура представляет собой структуру Кэп 1.

9. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая 3′-поли(А) хвост.

10. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая нетранслируемый участок.

11. Синтетическая молекула РНК по п. 1, дополнительно содержащая сильную последовательность Козак.

12. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК кодирует белок репрограммирования.

13. Синтетическая молекула РНК по п. 12, отличающаяся тем, что белок репрограммирования выбран из белка Oct4, белка Sox2, белка Klf4, белка c-Мус или белка Lin28.

14. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что данная синтетическая молекула РНК кодирует ген-редактирующий белок.

15. Синтетическая молекула РНК по п. 14, отличающаяся тем, что ген-редактирующий белок содержит ДНК-связывающий домен и каталитический домен ДНК-эндонуклеазы или их биологически активный фрагмент.

16. Синтетическая молекула РНК по п. 14, отличающаяся тем, что ген-редактирующий белок содержит по меньшей мере один из белков: нуклеазу цинкового пальца, эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции, нуклеазу, мегануклеазу, никазу и белок, ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), или их биологически активный фрагмент или вариант.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем ген-редактирующий белок нацелен на одну из мишеней из следующего списка: TERT, TERC, НВВ, BRCA1, BRCA2, CCR5, CFTR, CXCR4, DDB2, DMD, EGFR, ERCC4, ERCC5, ERCC6, F9, F8, F11, SLC40A1, HAMP, НЕХА, HFE, HJV, семейство JAK, семейство MYC, NF1, NF2, ТР53, POLH, RAD2, PKN3, семейство RAS, BIRC5, TFR2, ХРА, ХРВ, ХРС, XPD, Rosa26, AAVS1, FBN1, НТТ, АРР, PSEN1, PSEN2, АРОЕ, SNCA, PRKN, LRRK2, CR1, CLU, PICALM, BIN1, MS4A4, MS4A6E, CD2AP, CD33, ЕРНА1, PINK1, PARK7, АТР13А2, HNPCC1, HNPCC2, HNPCC5, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM, FANCN, FANCP, RAD51C, семейство VEGF, GCK, HNF1A, HNF4A, HNF1B, SOD1, PTEN, RET, KIT, MET, АРС, RBI и TNF или их варианты.

18. Синтетическая молекула РНК по п. 14, отличающаяся тем, что ген-редактирующий белок снижает экспрессию одного или более белков.

19. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок обеспечивает образование гена, который кодирует нефункциональный белок.

20. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок обеспечивает образование гена, который кодирует доминантно-негативный белок.

21. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок нацелен на последовательность, которая отсутствует в геноме нераковых клеток человека.

22. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем ген-редактирующий белок нацелен на одну из мишеней из следующего списка: вирусную последовательность, бактериальную последовательность, последовательность грибкового паразита, последовательность паразита и последовательность ракового генома.

23. Нуклеиновая кислота по п. 17, отличающаяся тем, что ген-редактирующий белок нацелен по меньшей мере на одну из последовательностей: TTGCCCCCTGCCTGGCAGCC и TTCTTGAATGTAGAGATGCG.

24. Синтетическая молекула РНК, кодирующая ген-редактирующий белок, содержащая по меньшей мере один из нуклеотидов: псевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин, 5-метилуридин, 5-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, N4-метилцитидин, N4-ацетилцитидин и 7-дезазагуанозин или их производные.

25. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок снижает экспрессию белка сурвивина.

26. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок обеспечивает образование гена, который кодирует нефункциональный вариант белка сурвивина.

27. Нуклеиновая кислота, кодирующая ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок обеспечивает образование гена, который кодирует доминантно-негативный вариант белка сурвивина.

28. Терапевтическая композиция, содержащая синтетическую молекулу РНК по п. 1 или нуклеиновую кислоту по п. 17.

29. Терапевтическая композиция по п. 28, дополнительно содержащая реагент для доставки.

30. Терапевтическая композиция по п. 29, отличающаяся тем, что реагент для доставки содержит липид.

31. Терапевтическая композиция по п. 29, отличающаяся тем, что реагент для доставки содержит полиэтиленгликоль или его производное.

32. Терапевтическая композиция по п. 28, отличающаяся тем, что данная терапевтическая композиция готовится в виде стерильной водной суспензии частиц.

33. Терапевтическая композиция по п. 32, отличающаяся тем, что частицы представляют собой липосомы.

34. Терапевтическая композиция по п. 28, дополнительно содержащая вторую синтетическую молекулу РНК или нуклеиновую кислоту.

35. Терапевтическая композиция по п. 28, дополнительно содержащая репарационную матрицу.

36. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества терапевтической композиции по п. 28.

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что рак включает по меньшей мере один из видов: рака простаты, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легких, рака кожи, рака головного мозга, лейкемии, рака поджелудочной железы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака костей, рака яичка, саркомы, карциномы, рака гортани, рака почки, лимфомы, рака сердца, рака шейки матки, рака яичников, рака глазного яблока, рака матки, протокового рака, рака желчного пузыря, рака ротовой полости, рака шеи, мезотелиомы, рака носа, рака пазух носа, рака полового члена, рака анального канала, рака слюнной железы, рака тонкой кишки, рака щитовидной железы, рака мочеиспускательного канала, рака влагалища и рака вульвы.

38. Способ индукции экспрессии клеткой целевого белка, включающий приведение клетки в контакт с синтетической молекулой РНК по п. 1 или нуклеиновой кислотой по п. 17.

39. Клетка, полученная с помощью способа по п. 38.

40. Организм, полученный путем имплантации клетки по п. 39 в бластоцисту или матку.

41. Организм по п. 40, отличающийся тем, что данный организм выбран из: крыс, мышей, кроликов, морских свинок, приматов, свиней, коров, кур, коз, ослов, кошек, собак и данио-рерио.

42. Организм по п. 40, отличающийся тем, что клетку дополнительно приводят в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей ген человека или его фрагмент.

43. Организм по п. 42, отличающийся тем, что ген человека вставлен в геном данного организма.

44. Организм по п. 40, отличающийся тем, что ген-редактирующий белок нацелен на один или более эндогенных ортологов гена человека.

45. Организм по п. 44, отличающийся тем, что один или более эндогенных ортологов инактивированы.

46. Клетка по п. 39, отличающаяся тем, что данная клетка дополнительно дифференциируется в: клетку кожи, глюкозочувствительную инсулин-продуцирующую клетку, гемопоэтическую клетку, клетку сердечной мышцы, клетку сетчатки, клетку почки, нервную клетку, стромальную клетку, жировую клетку, костную клетку, мышечную клетку, ооцит или сперматозоид.

47. Клетка по п. 39, отличающаяся тем, что данную клетку культивируют в формате, совместимом с высокопроизводительным скринингом.

48. Клетка по п. 47, отличающаяся тем, что данный формат представляет собой многолуночный планшет.

49. Терапевтическая композиция, содержащая клетку по п. 39.

50. Композиция для изменения последовательности ДНК живой клетки, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок содержит:

a. ДНК-связывающий домен и

b. домен нуклеазы,

причем ДНК-связывающий домен содержит множество последовательностей повторов, по меньшей мере две из последовательностей повторов обладают по меньшей мере 50% гомологии друг к другу, и по меньшей мере одна из последовательностей повторов содержит один или более участков, способных связываться с сайтом связывания молекулы ДНК-мишени; сайт связывания содержит определенную последовательность длиной между 1 и 5 основаниями, а домен нуклеазы содержит каталитический домен белка, выбранных из StsI, StsI-HA, StsI-HA2, StsI-UHA, StsI-UHA2, StsI-HF, StsI-UHF или их биологически активного фрагмента.

51. Композиция, содержащая смесь нуклеиновых кислот, для изменения последовательности ДНК живой клетки, содержащая:

а. первую нуклеиновую кислоту, которая кодирует первый ген-редактирующий белок и

b. второю нуклеиновую кислоту, которая кодирует второй ген-редактирующий белок,

причем первый ген-редактирующий белок или второй ген-редактирующий белок или и первый ген-редактирующий белок и второй ген-редактирующий белок содержат:

i. ДНК-связывающий домен и

ii. домен нуклеазы,

причем ДНК-связывающий домен содержит множество последовательностей повторов, по меньшей мере две из последовательностей повторов обладают по меньшей мере 50% гомологии друг к другу, и по меньшей мере одну из последовательностей повторов содержит один или более участков, способных связываться с сайтом связывания молекулы ДНК-мишени, сайт связывания содержит определенную последовательность длиной между 1 и 5 основаниями, а домен нуклеазы содержит каталитический домен белка, выбранный из FokI, StsI, StsI-HA, StsI-HA2, StsI-UHA, StsI-UHA2, StsI-HF, StsI-UHF или их биологически активного фрагмента.

52. Способ модификации генома клетки, включающий введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей не встречающийся в природе гибридный белок, содержащий искусственный повторяющийся домен эффектора, подобного активатору транскрипции (TAL), несущий одну или более единиц повторов длиной 36 аминокислот и домен эндонуклеазы, причем данный повторяющийся домен сконструирован для распознавания заданной нуклеотидной последовательности, причем данный гибридный белок распознает эту заданную нуклеотидную последовательность.

53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой эукариотическую клетку.

54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку животного.

55. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку млекопитающего.

56. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку человека.

57. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку растения.

58. Способ по п. 52, отличающийся тем, что клетка представляет собой прокариотическую клетку.

59. Способ по п. 52, отличающийся тем, что гибридный белок приводит к эндонуклеолитическому расщеплению нуклеиновой кислоты клетки, благодаря чему модифицируется геном клетки.

60. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая не встречающийся в природе гибридный белок, содержащий искусственный повторяющийся домен эффектора, подобного активатору транскрипции (TAL), несущий одну или более единиц повторов длиной 36 аминокислот и обладающий эндонуклеазной активностью, причем данный повторяющийся домен сконструирован для распознавания заданной нуклеотидной последовательности, и причем данный гибридный белок распознает эту заданную нуклеотидную последовательность.

61. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 60, отличающаяся тем, что каждая из единиц повторов отличается от других не более чем семью аминокислотами.

62. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 60, отличающаяся тем, что каждая из единиц повторов содержит аминокислотную последовательность: LTPXQVVAIAS, в которой X может быть аминокислотой Е или Q, и причем за аминокислотной последовательностью LTPXQVVAIAS на карбоксильном кольце следуют одна или две аминокислоты, которые определяют распознавание одного из: аденина, цитозина, гуанина и тимина.

63. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 60, отличающаяся тем, что кодирует от около 1,5 до около 28,5 единиц повторов.

64. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 60, отличающаяся тем, что кодирует около 11,5; около 14,5; около 17,5 или около 18,5 единиц повторов.

65. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 60, отличающаяся тем, что заданная нуклеотидная последовательность представляет собой участок промотора.

66. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 60.

67. Вектор по п. 66, отличающийся тем, что данный вектор представляет собой вирусный вектор.

68. Вирусный вектор по п. 67, отличающийся тем, что данный вектор включает один или более вирусов из: аденовируса, ретровируса, лентивируса, вируса герпеса, адено-ассоциированного вируса и сконструированного вируса.

69. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая не встречающийся в природе гибридный белок, включающий первый участок, который распознает заданную нуклеотидную последовательность, и второй участок с эндонуклеазной активностью, причем первый участок содержит искусственный повторяющийся домен эффектора TAL, несущий одну или более единиц повторов длиной 36 аминокислот, которые отличаются друг от друга не более чем семью аминокислотами, причем данный повторяющийся домен сконструирован для распознавания этой заданной нуклеотидной последовательности.

70. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 69, отличающаяся тем, что первый участок содержит аминокислотную последовательность: LTPXQVVAIAS, в которой X может быть аминокислотой Е или Q.

71. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 70, отличающаяся тем, что за аминокислотной последовательностью LTPXQVVAIAS в составе закодириванного не встречающегося в природе гибридного белка непосредственно следует аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из: HD, NG, NS, N1, NN и N.

72. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 69, отличающаяся тем, что гибридный белок обладает активностью рестрикционной эндонуклеазы.

73. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 69.

74. Вектор по п. 73, отличающийся тем, что данный вектор представляет собой вирусный вектор.

75. Вирусный вектор по п. 74, отличающийся тем, что данный вектор включает один или более вирусов из: аденовируса, ретровируса, лентивируса, вируса герпеса, адено-ассоциированного вируса и сконструированного вируса.

76. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который содержит одну или более последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60.

77. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность внутриядерной локализации.

78. Композиция по п. 77, отличающаяся тем, что последовательность внутриядерной локализации содержит аминокислотную последовательность PKKKRKV.

79. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность внутримитохондриальной локализации.

80. Композиция по п. 30, отличающаяся тем, что последовательность внутримитохондриальной локализации содержит аминокислотную последовательность LGRVIPRKIASRASLM.

81. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что ДНК-связывающий домен и домен нуклеазы разделены линкером.

82. Композиция по п. 81, отличающаяся тем, что линкер имеет длину в пределах между приблизительно 1 и приблизительно 10 аминокислотами.

83. Ген-редактирующий белок, содержащий множество последовательностей повторов, причем данное множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxyzGHGG, где «v» является аминокислотой Q, D или Е, «w» является аминокислотой S или N, «х» является аминокислотой N, Н или I, «y» является любой или никакой аминокислотой, a «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

84. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxyzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «х» является N, Н или I, «y» выбирается из аминокислот: D, A, I, N, Н, К, S и G, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

85. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxyzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «х» является любой аминокислотой, отличной от N, Н и I, «y» является любой или никакой аминокислотой, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

86. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwIyzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «у» является любой аминокислотой, отличной G, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

87. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwIAzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

88. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxyzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «х» является S, Т или Q, «y» является любой или никакой аминокислотой, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

89. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxyzGHGG, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «х» является S, Т или Q, «y» выбирают из аминокислот: D, A, I, N, Н, К, S и G, а «z» представляет собой последовательности GGRPALE, GGKQALE, GGKQALETVQRLLPVLCQD, GGKQALETVQRLLPVLCQA, GKQALETVQRLLPVLCQD или GKQALETVQRLLPVLCQA.

90. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwx, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, а «х» является S, Т или Q.

91. Ген-редактирующий белок по п. 83, отличающийся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, который включает аминокислотную последовательность: LTPvQVVAIAwxy, где «v» является Q, D или Е, «w» является S или N, «х» является S, Т или Q, а «y» выбирается из аминокислот: D, A, I, N, Н, K, S и G.

92. Композиция по п. 51, отличающаяся тем, что сайт связывания первого ген-редактирующего белка и сайт связывания второго ген-редактирующего белка присутствуют в одной и той же молекуле ДНК-мишени.

93. Композиция по п. 92, отличающаяся тем, что сайт связывания первого ген-редактирующего белка и сайт связывания второго ген-редактирующего белка разделены не более чем около 50 основаниями.

94. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что ген-редактирующий белок способен вносить одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК-мишени.

95. Композиция по п. 51, отличающаяся тем, что домен нуклеазы первого ген-редактирующего белка и домен нуклеазы второго ген-редактирующего белка способны образовывать димер, а данный димер способен создавать одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК-мишени.

96. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере одну последовательность повтора, обладающий по меньшей мере 50% гомологии мономера эффектора, подобного активатору транскрипции.

97. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что множество последовательностей повторов содержит по меньшей мере один мономер цинкового пальца.

98. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой синтетическую молекулу РНК.

99. Композиция по п. 98, отличающаяся тем, что синтетическая молекула РНК, содержит по меньшей мере один из нуклеотидов: псевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин, 5-метилуридин, 5-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, N4-метилцитидин, N4-ацетилцитидин и 7-дезазагуанозин.

100. Продукт производства, содержащий нуклеиновую кислоту, для синтеза белка или нуклеиновой кислоты, кодирующей ген-редактирующий белок, в котором данная нуклеиновая кислота содержит:

a. нуклеотидную последовательность, кодирующую ДНК-связывающий домен, и

b. нуклеотидную последовательность, кодирующую домен нуклеазы, причем ДНК-связывающий домен содержит множество последовательностей повторов, по меньшей мере две из последовательностей повторов обладают по меньшей мере около 50% гомологии друг к другу, и по меньшей мере одна из последовательностей повторов содержит один или более участков, способных связываться с сайтом связывания молекулы ДНК-мишени; сайт связывания содержит определенную последовательность длиной между приблизительно 1 и приблизительно 5 основаниями, а домен нуклеазы содержит каталитический домен белка, выбранный из: FokI, StsI, StsI-HA, StsI-HA2, StsI-UHA, StsI-UHA2, StsI-HF и StsI-UHF или их биологически активного фрагмента.

101. Продукт по п. 100, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор РНК-полимеразы.

102. Продукт по п. 101, отличающийся тем, что промотор РНК-полимеразы выбирают из промотора Т7 и промотора SP6.

103. Продукт по п. 100, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота дополнительно содержит вирусный промотор.

104. Продукт по п. 100, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота дополнительно содержит нетранслируемый участок.

105. Продукт по п. 100, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой транскрипционную матрицу для проведения синтеза in vitro.

106. Способ индукции экспрессии живой клеткой ген-редактирующего белка, включающий трансфекцию клетки композицией по п. 50.

107. Способ изменения последовательности ДНК живой клетки, включающий трансфекцию клетки композицией по п. 50.

108. Способ снижения экспрессии целевого белка живой клеткой, включающий трансфекцию клетки композицией по п. 50, отличающийся тем, что молекула ДНК-мишени кодирует целевой белок.

109. Способ изменения последовательности ДНК живой клетки для синтеза неактивного белка, белка со сниженной активностью или доминантно-негативного варианта целевого белка, включающий трансфекцию клетки композицией по п. 50, отличающийся тем, что молекула ДНК-мишени кодирует целевой белок, и приводящий к тому, что клетка синтезирует неактивный белок, белок со сниженной активностью или доминантно-негативный вариант белка.

110. Способ по п. 109, отличающийся тем, что целевой белок представляет собой сурвивин.

111. Способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п. 50 и приводящий к тому, что уменьшается проявление одного или более симптомов пациента.

112. Способ лечения рака, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п. 50 и приводящий к тому, что снижается и/или останавливается рост раковых клеток.

113. Композиция по п. 50, отличающаяся тем, что молекула ДНК-мишени содержит ген BIRC5.

114. Композиция, содержащая ген-редактирующий белок, для изменения последовательности ДНК живой клетки, причем данный ген-редактирующий белок способен связываться с последовательностью, обладающей по меньшей мере 50% гомологии с последовательностью, выбранной из: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15.

115. Композиция, содержащая ген-редактирующий белок, для изменения последовательности ДНК живой клетки, причем данный ген-редактирующий белок способен связываться с одним или более сайтов связывания, и причем множество сайтов связывания являются по меньшей мере на 50% гомологичными двум или более последовательностям из: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.

116. Композиция по п. 50, дополнительно содержащая репарационную матрицу.

117. Способ лечения пациента, включающий:

a. извлечение клетки из организма пациента,

b. индукцию экспрессии клеткой ген-редактирующего белка путем трансфекции клетки композицией по п. 50,

c. репрограммирование данной клетки путем трансфекции клетки одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих один или более белков репрограммирования,

d. обеспечение дифференциации клетки в одну из следующих клеток: клетку кожи, глюкозочувствительную инсулин-продуцирующую клетку, гемопоэтическую клетку, клетку сердечной мышцы, клетку сетчатки, клетку почки, нервную клетку, стромальную клетку, жировую клетку, костную клетку, мышечную клетку, ооцит или сперматозоид, и

е. введение полученной клетки в организм пациента.

118. Способ лечения пациента, включающий:

а. удаление гемопоэтической клетки или стволовой клетки из организма пациента,

b. индукцию экспрессии клеткой ген-редактирующего белка путем трансфекции клетки композицией по п. 50 и

с. введение полученной клетки в организм пациента.

119. Способ лечения рака, включающий:

a. удаление с помощью биопсии одной или более раковых клеток из организма пациента,

b. определение последовательности ассоциированного с раковым заболеванием генетического маркера из одной или более раковых клеток и

c. введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п. 50, отличающийся тем, что последовательность молекулы ДНК-мишени является по меньшей мере на приблизительно 50% гомологичной последовательности ассоциированного с раковым заболеванием генетического маркера.

120. Способ по п. 119, отличающийся тем, что дополнительно включает сравнение последовательности одного или более ассоциированных с раковым заболеванием генетических маркеров из одной или более раковых клеток с последовательностью таких же ассоциированных с раковым заболеванием генетических маркеров в одной или более нераковых клеток, выбор ассоциированного с раковым заболеванием генетического маркера, имеющего последовательность, которая отличается у одной или более раковых клеток и у одной или более нераковых клеток, причем данная последовательность молекулы ДНК-мишени является по меньшей мере приблизительно на 50% гомологичной последовательности выбранного ассоциированного с раковым заболеванием генетического маркера.

121. Способ лечения нейродегенеративного заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ген-редактирующего белка или нуклеиновой кислоты, кодирующей ген-редактирующего белок, причем данный ген-редактирующий белок способен связываться с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует белок, образующий ассоциированные с заболеванием бляшки, и данный способ приводит к задержке или остановке прогрессирования заболевания и/или уменьшению ассоциированных с заболеванием бляшек в организме пациента.

122. Способ по п. 121, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность содержит ген SNCA.

123. Способ по п. 121, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует α-синуклеин.

124. Способ по п. 121, отличающийся тем, что нейродегенеративное заболевание выбирают из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и деменции.

125. Набор для изменения последовательности ДНК живой клетки, содержащий композицию по п. 50.

126. Набор для изменения последовательности ДНК живой клетки человека, содержащий композицию по п. 50, отличающийся тем, что молекула ДНК-мишени содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует локус AAVS1.

127. Набор для изменения последовательности ДНК живой клетки грызуна, содержащий композицию по п. 50, отличающийся тем, что молекула ДНК-мишени содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует локус Rosa26.

128. Способ идентификации болезнетворного токсического вещества, включающий трансфекцию живой клетки ген-редактирующим белком или нуклеиновой кислотой, кодирующей ген-редактирующий белок, для изменения последовательности ДНК клетки, причем данная измененная последовательность ДНК обеспечивает восприимчивость к заболеванию; приведение клетки в контакт с предполагаемым болезнетворным токсическим веществом и оценку степени, с которой данная клетка проявляет фенотип, ассоциированный с данным заболеванием.

129. Способ по п. 128, отличающийся тем, что заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание, аутоиммунное заболевание, респираторное заболевание, репродуктивное нарушение или рак.

130. Способ оценки безопасности терапевтической субстанции, включающий трансфекцию живой клетки ген-редактирующим белком или нуклеиновой кислотой, кодирующей ген-редактирующий белок, для изменения последовательности ДНК клетки, причем данная измененная последовательность ДНК обеспечивает восприимчивость к одному или более токсических воздействий терапевтической субстанции; приведение клетки в контакт с данной терапевтической субстанцией и измерение одного или более токсических воздействий данной терапевтической субстанции на эту клетку.

131. Способ оценки эффективности терапевтической субстанции, включающий трансфекцию живой клетки ген-редактирующим белком или нуклеиновой кислотой, кодирующей ген-редактирующий белок, для изменения последовательности ДНК клетки, причем данная измененная последовательность ДНК вызывает проявление клеткой одного или более ассоциированных с заболеваниями фенотипов; приведение клетки в контакт с данной терапевтической субстанцией и измерение степени, в которой снижается проявление одного или более ассоциированных с заболеваниями фенотипов.

132. Способ лечения инфекционного заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ген-редактирующего белка или нуклеиновой кислоты, кодирующей ген-редактирующий белок, причем данный ген-редактирующий белок способен связываться с одной и более нуклеотидных последовательностей, которые присутствуют в возбудителе инфекции.

133. Способ по п. 112, отличающийся тем, что рак представляет собой глиому.

134. Способ по п. 112, отличающийся тем, что пациент ранее прошел хирургическую или лучевую терапию для удаления раковых клеток.

135. Способ по п. 112, отличающийся тем, что введение проводится одним или более вариантов из: интратекальной инъекции, внутричерепной инъекции, внутривенной инъекции, перфузии, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, инфузии в воротную вену и поступления при местном нанесении.

136. Способ по п. 111, отличающийся тем, что у пациента диагностируют протеинопатию.

137. Набор по п. 125, дополнительно содержащий репарационную матрицу.

138. Набор по п. 137, отличающийся тем, что репарационная матрица содержит сайт множественного клонирования.

139. Способ экспрессии клеткой целевого белка путем приведения данной клетки в контакт с синтетической молекулой РНК, содержащей 5-метилуридин, 7-дезазагуанозин и по меньшей мере один из нуклеотидов: 5-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, N4-метилцитидин и N4-ацетилцитидин.

140. Способ по п. 139, отличающийся тем, что синтетическая молекула РНК содержит остатки уридина и около 40% остатков уридина представляют собой остатки 5-метилуридина.

141. Способ по п. 139, отличающийся тем, что синтетическая молекула РНК содержит остатки цитидина и в пределах между около 40% и около 100% остатков цитидина выбирают из: остатков 5-метилцитидина, остатков 5-гидроксиметилцитидина, остатков N4-метилцитидин и остатков N4-ацетилцитидина.

142. Способ по п. 139, отличающийся тем, что синтетическая молекула РНК содержит остатки гуанозина и около 50% остатков гуанозина представляют собой остатки 7-дезазагуанозина.

143. Нуклеиновая кислота, кодирующая целевой белок, содержащая 5-метилуридин, 7-дезазагуанозин и по меньшей мере один из нуклеотидов: 5-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, N4-метилцитидин и N4-ацетилцитидин.

144. Способ увеличения гомологичной рекомбинации в клетке, включающий:

a. приведение клетки в контакт с ингибитором NHEJ,

b. трансфекцию клетки одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих один или более ген-редактирующих белков, причем по меньшей мере один из одного или более ген-редактирующих белков связывается с участком-мишенью и

c. трансфекцию клетки одной или более нуклеиновых кислот, обладающих по меньшей мере 50% гомологии с данным участком-мишенью.

145. Способ по п. 144, отличающийся тем, что ингибитор NHEJ представляет собой ингибитор ДНК-ПК.

146. Способ по п. 144, отличающийся тем, что ингибитор ДНК-ПК является одним из: соединения 401 (2-(4-морфолинил)-4H-пиримидо[2,1-а]изохинолин-4-он), DMNB, IC87361, LY294002, NU7026, NU7441, OK-1035, PI 103 гидрохлорида, ванилина и вортманнина или их производных.

147. Способ лечения мышечной дистрофии Дюшенна, включающий введение пациенту одного или более ген-редактирующих белков или нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более ген-редактирующих белков, причем по меньшей мере один или более ген-редактирующих белков нацелены на последовательность в пределах гена DMD.

148. Способ по п. 147, отличающийся тем, что результаты лечения заключаются в образовании усеченной формы белка DMD.

149. Способ по п. 147, отличающийся тем, что последовательность-мишень находится в пределах около 1 т.п.н. сайта сплайс-акцептора.