RU2002114044A - L-пантолактон-гидролаза и способ получения d-пантолактона - Google Patents

Claims (20)

1. Выделенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая полипептид с активностью L-пантолактон-гидролазы, выбранная из группы, включающей а) последовательность нуклеиновых кислот с представленной в SEQ ID NO: 1 последовательностью, б) последовательности нуклеиновых кислот, которые отводятся как результат дегенерированного генетического кода от представленной в SEQ ID NO: 1 последовательности нуклеиновых кислот, в) производные представленной в SEQ ID NO: 1 последовательности нуклеиновых кислот, которые кодирует полипептиды с представленной в SEQ ID NO: 2 аминокислотной последовательностью и которые имеют по меньшей мере 50% гомологии на аминокислотном уровне, без значительного снижения ферментативной активности полипептидов,

г) функциональные эквиваленты приведенных в пунктах от (а) до (в) последовательностей.

2. Аминокислотная последовательность, кодированная последовательностью нуклеиновых кислот по п.1.

3. Аминокислотная последовательность по п.2, кодированная представленной в SEQ ID NO: 1 последовательностью.

4. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновых кислот по п.1, причем последовательность нуклеиновых кислот связана с несколькими регуляторными сигналами.

5. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновых кислот по п.1 или конструкт нуклеиновых кислот по п.4.

6. Микроорганизм, содержащий последовательность нуклеиновых кислот по п.1, по меньшей мере один конструкт нуклеиновых кислот по п.4 или вектор по п.5.

7. Микроорганизм по п.6, отличающийся тем, что микроорганизмом является грам-отрицательной бактерией.

8. Микроорганизм по п.6 или 7, отличающийся тем, что микроорганизмом является бактерия из группы, включающей α-протеобактерии, β-протеобактерии или γ-протеобактерии.

9. Микроорганизм по пп.6-8, отличающийся тем, что микроорганизмом является бактерия из семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae или Rhizobiaceae.

10. Микроорганизм по пп.6-8, отличающийся тем, что микроорганизмом является бактерия вида Agrobacterium, Pseudomonas, Burkholderia, Salmonella или Escherichia.

11. L-пантолактон-гидролаза, отличающаяся следующими свойствами: a) превращением L-пантолактона в соответствующую кислоту, b) стабильностью значения рН: L-пантолактон гидролаза стабильна в диапазоне значений рН от 4 до 10, c) оптимальными значениями рН: от 7,2 до 7,6, d) оптимальными температурами 70-75°С, e) не имеет места ингибирование активности посредством этилендиамино-тетрауксусной кислоты.

12. Способ получения D-пантолактона, отличающийся тем, что он включает следующие стадии: а) взаимодействие рацемического пантолактона в присутствии L-пантолактон-гидролазы по п.11 или L-пантолактон-гидролазы с аминокислотной последовательности по п.2 или микроорганизма по п.6 с получением D-пантолактона и L-пантоиновой кислоты, б) отделение D-пантолактона.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что полученную на стадии (б) L-пантоиновую кислоту рацемизируют и возвращают на стадию (а).

14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что взаимодействие рацемического пантолактона проводят в присутствии иммобилизированной L-пантолактон-гидролазы по п.11 или иммобилизированной L-пантолактон-гидролазы с аминокислотной последовательностью по п.2.

15. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что взаимодействие рацемического пантолактона проводят в присутствии промытого, покоящегося или вскрытого микроорганизма по п.6.

16. Способ по п.12 или 15, отличающийся тем, что микроорганизм иммобилизирован.

17. Способ по пп.12-16, отличающийся тем, что его проводят в водной реакционной смеси при значении рН между 4 и 12.

18. Способ по пп.12-17, отличающийся тем, что его проводят при температуре 0-95°С.

19. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что D-пантолактон отделяют экстракцией.

20. Способ по пп.12-18, отличающийся тем, что D-пантолактон имеет оптическую чистоту по меньшей мере 90%.