DE10029194A1

DE10029194A1 - L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton

Info

Publication number: DE10029194A1
Application number: DE10029194A
Authority: DE
Inventors: Maria Keseler; Bernhard Hauer; Thomas Friedrich; Ralf Mattes
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-06-19
Filing date: 2000-06-19
Publication date: 2001-12-20

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nukleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton auf weisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nucleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.

D-Pantolacton ist eine Vorstufe in der chemischen Synthese bzw. Biosynthese von Pantothensäure, Panthenol und Pantethein und deren Derivate. Diese werden als Vitaminzusätze in der mensch lichen Ernährung, im Tierfutter, in der Medizin beispielsweise für die Wundheilung und in der Kosmetik beispielsweise in der Haarkosmetik eingesetzt. Wirtschaftliche Verfahren zur Synthese von enantiomerenreinem D-Pantolacton sind daher von großer Bedeutung. Neben den seit langem ausgeübten chemischen Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton wurden in jüngerer Zeit auch verschiedene biotechnologische Verfahren bearbeitet. Eine Über sicht über Pantolacton und seine chemische Synthese ist Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Vol. A27, 1996, VCH Ver lagsgesellschaft mbH, 69451 Weinheim, Seite 559-566) zu ent nehmen.

Für die biotechnologische Synthese von Pantolacton wurden ver schiedenen Synthesestrategien verfolgt.

Eine Racematspaltung durch selektive Hydrolyse von O-Acetyl-Pantolacton mittels Lipasen oder Esterasen wird von Glänzer et al. (1988, Enzyme Microb. Technol. 10, 689-690) beschrieben. Eine derartige Racematspaltung wird in den Schutzrechten DE 40 05 150 und EP-A-0 507 278 beansprucht. Die erreichbare Enantiomerenreinheit ist für eine technische Nutzung bei diesem Verfahren ungenügend.

Von Degussa wird die Herstellung von Pantolacton mit dem Enzym Oxinitrilase ausgehend von Hydroxypivalaldehyd und Blausäure über optisch reines Hydroxypivalaldehydcyanhydrin beschrieben (DE 41 26 580, EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). In dieser Reaktion sind theoretisch 100% Ausbeute zu erreichen. Nach teil dieser Reaktion ist der hohe Enzymbedarf (äquimolare Mengen Enzym: Substrat) sowie die relativ geringe Enantiomerenreinheit des Produkts (max. 82% ee).

In JP 47019745 wird die Synthese von D-Pantolacton mit Hilfe von Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus oder Corynebacterium beschrieben. In der Reaktion setzen die genannten Organismen racemisches Pantolacton zu D-Pantolacton um, in dem sie das L-Pantolacton verstoffwechseln. Nachteil dieses Verfahren ist, daß die Hälfte des Edukts verstoffwechselt wird und damit ver loren ist.

Mitsubishi Chemical Ind. und Ube Ind. haben Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton aus D,L-Pantolacton beansprucht (JP 6067320, JP 62294092, JP 62294096, JP 57152895). In diesen Verfahren werden L-Pantolacton-Hydrolasen aus den Hefen Rhodothorula, Sporidiobolus und Sterigmatomyces beschrieben. Aus heutiger Sicht (siehe Yamada & Shimizu, Ann. N.Y. Acad. Sci. 672 [1992] in Enzyme Eng. XI, Clark et al., 372-386; Chimia, 47, 1993: 5-10, JP 62187426; JP 61293384; JP 61293386; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1988: 622-642, Chemical Aspects of Enzyme Biotechnology, eds. T. O. Baldwin et al., Plenum Press, New York, 1990: 151-163) bestätigt durch eigene Arbeiten scheint die di rekte Hydrolyse des L-Pantolactons in diesen Hefen jedoch zweifelhaft. Die Reaktion verläuft vielmehr über das Ketopanto lacton, das durch die Ketopantoat-Oxidoreduktasen zum L-Panto lacton umgesetzt wird. In eigenen Arbeiten konnte das Ketopanto lacton als Zwischenstufe nachgewiesen werden, das heißt es er folgt keine direkte Hydrolyse zum L-Pantolacton. Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Pantolacton-Konzentration, die im Ver fahren umgesetzt werden kann.

Diese Reaktion über Ketopantolacton- und Ketopantoat-Oxido reduktasen wurde auch für Bakterien beschrieben (z. B. Yamada & Shimizu, s. o.; Shimizu et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 12077-12084, Kataoka et al. 1992, Eur. J. Biochem. 204, 799-806). Entsprechende Verfahren zur enantioselektiven Synthese von D-Pantolacton aus D,L-Pantolacton via Ketopantolacton und Keto pantoat haben zwar den Vorteil einer hohen Ausbeute (theoretisch 100%, 90,5% erreicht mit Rhodococcus s. u.), sind jedoch wegen des Cofaktorbedarfs (NADH oder NADPH), der Zufütterung eines Energiesubstrates (Glucose), der niedrigen Raum-Zeit-Ausbeute und der geringen Endkonzentrationen (18,2-72 g/l D-Pantolacton) nicht wirtschaftlich. Desweiteren ist ein solches Verfahren dadurch benachteiligt, daß die beiden beteiligten Enzyme i.d.R. verschiedene Optima für die Umsatzbedingungen aufweisen, ein Problem, das bei Verwendung eines einzigen (hydrolytischen) Enzyms entfällt.

Die Firma Fuji in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Yamada an der Kyoto Universität hat ein Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung mit Hilfe einer pilzlichen D-Pantolacton-Hydro lase (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP-B-0 504 421, EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5,275,949, US 5,372,940) entwickelt. Das Enzym läßt sich beispielsweise aus den Pilzen Cylindrocarpon tonkinense, Gibberella fujikuroi und Fusarium oxysporum isolieren. Die D-Pantolacton-Hydrolase ist ein glycosyliertes Enzym, das aus einem 125 kDa Homodimer besteht und Ca²⁺-abhängig ist (Ann. N.Y. Acad. Sci. 1996, 799: 650-658, Enzyme Engineering). Das Enzym wird durch Cd²⁺, Hg²⁺, Cu²⁺ und EDTA inhibiert (US 5,372,940). Die Reinigung der D-Pantolacton-Hydrolase wurde von Shimizu et al. beschrieben. Das gereinigte Enzym zeigt gegenüber einer Reihe von Lactonen speziell gegenüber Zuckerlactonen eine Hydrolaseaktivität (Eur. J. Biochem., 209, 1992: 383-390). Seine Sequenz zeigt schwache Homologien zur Gluconolactonase aus Zymomonas mobilis (28,9%), der humanen und Ratten-Paraoxonase (25,3%) und der Strictosidin Synthase aus Catharanthus roseus (15,9%; EP-A-0 794 251, Kobayashi et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12787-12792). Von Kataoko et al. wird eine starke Abhängigkeit der erzielten Enantiomeren reinheit des Produkts vom Umsatz bei unterschiedlichen pH-Werten (Enzym. Microbiol. Technol. 19: 307-310, 1996 und Appl. Micro biol. Biotechnol. 1995, 44: 333-338) beschrieben. Bei pH-Werten, die nahe oder über pH 7 liegen, werden geringere Enantiomeren reinheiten erzielt, da die spontane chemische Hydrolyse des L-Pantolactons bei höheren pH-Werten immer stärker wird und so die Enantiomerenreinheit des Produkts herabsetzt. Als optimaler pH-Wert für die Herstellung möglichst enantiomerenreinen D-Panto lactons wird pH 5 angegeben. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms ist bei diesem pH jedoch erheblich verlangsamt. Um optisch reines Produkt zu erhalten, ist nach Extraktion eine anschließende Kristallisation erforderlich (Yamada, H. Chimia 47, 1993: 5-10).

Von Nachteil bei den oben genannten Prozessen ist, daß sie häufig nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen. Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Nach wie vor besteht deshalb ein großer Bedarf nach einem einfachen, wirt schaftlichen biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist. Dieses Verfahren sollte ausgehend von der bestehenden chemischen Synthese einen einfachen Zugang zu D-Pantolacton in hohen Aus beuten und Enantiomerenreinheiten ermöglichen, so daß keine weitere Aufreinigung des Produkts mehr erforderlich ist.

Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches, wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäure sequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrola seaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäurese quenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.

Diese L-Pantolacton-Hydrolasen lassen sich in Organismen vorteil haft Mikroorganismen wie Bakterien finden. Das Enzym bzw. die Enzyme besitzen eine hohe enzymatische Aktivität zur hydro lytischen Umwandlung von L-Pantolacton in L-Pantoinsäure.

Diese L-Pantolacton-Hydrolasen setzen D-Pantolacton nicht um, so daß die Organismen, Extrakte oder gereinigte Enzyme sowie entsprechende rekombinante Stämme bzw. Proteine zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Pantolacton verwendet werden können.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu ver stehen, die mindestens 50% Homologie auf der abgeleiteten Amino säureebene, bevorzugt mindestens 60% Homologie, besonders bevor zugt 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80% Homologie aufweisen. Die Homologie wurde entweder nach der Methode von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970: 443-453) oder Smith & Waterman (Adv. Appl. Math., 2, 1981: 482-489) bestimmt. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen ins besondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine nicht wesent lich reduziert sein sollte. Unter Enzymen mit einer nicht wesent lich reduzierten enzymatischen Aktivität sind Enzyme zu verstehen, die eine enzymatische Aktivität von mindestens 20%, be vorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% aufweisen. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäure sequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nuklein säuresequenzen kodiert werden. Vorteilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Enzyme kodieren, die L-Pantolacton zur entsprechenden Säure hydrolysieren und die mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% der Aktivität der unter SEQ ID NO: 2 genannten Sequenz aufweisen, nicht durch EDTA (1 mM-Lösung) gehemmt werden und zwischen pH 4 bis 10 stabil sind. Diese funktionellen Äquivalente weisen außerdem vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 7 und 8 auf und ein Temperaturoptimum zwischen 70°C und 80°C.

Weiterhin sind unter Derivate auch Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 50%, bevor zugt von mindestens 60%, besonders bevorzugt von mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80% über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo tidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startcodon oder 0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopcodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) [der Plural und Singular sollen für die Anmeldung gleichbedeutend sein] aus gram-negativen Bakterien vorteilhaft aus α-Proteobacterien, β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae, ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, Pseudomonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert. Als vorteilhaft geeignete Pilze seien die Gattungen Beauveria oder Psilocybe genannt. Vorteilhafte Hefen sind bei spielsweise in der Gattung Apiotrichum zu finden.

SEQ ID No: 1 oder seine Derivate, Homologen oder Teile dieser Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridi sierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit der D-Pantolacton-Hydrolase in dem Fach mann bekannter Weise ermittelt werden können (ein solcher Bereich ist beispielsweise das sog. HTGT-Motiv), verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung ver wendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein säure Temperaturen zwischen 20 und 70°C in einer wäßrigen Puffer lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 2,0 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 70°C, bevorzugt zwischen etwa 50°C bis 70°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs bedingungen vorteilhaft bei 2,0 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 60°C, bevorzugt zwischen etwa 35°C bis 60°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit ein er Länge von ca. 1000 Nukleotiden und einem G- + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G- + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni versity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die L-Pantolacton-Hydrolasegene mit Sequenz SEQ ID No: 1 und seine Derivate und Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Gen expression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden, und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No: 1 oder seine Homologen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent fernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Das Nukleinsäurekonstrukt kann außerdem vor teilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie aphII (Tn5)-, trc-, cos-, tac-, trp-, lacPAI, rha, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulations sequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie in den konstitutiven oder induzierbaren Streptomyces-Promotoren aphI, ermE, melC, tipA, mcrAB, gylCAB, veg, SPO1, amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren AOX1, GAL1, ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammen hang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirts organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pBluescript, pBAD, pQE (His-tag System), pICIC223-3, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pGEM7Z, pKK223-3, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI oder broad-host-range Plasmide wie pBBR1MCS oder pRK293, in Streptomyces und anderen Actinomyceten pIJ101, pIJ364, pMVS301, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Genen für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine L-Pantolacton-Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA.

Diese L-Pantolacton-Hydrolase kann im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend der im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Expression der erfindungsgemäßen Gene und der von diesen Genen kodierten Proteine in einem Wirtsorganismus beinhaltet in der Regel einen Streß für diese Organismen. Durch gleichzeitige Expression dieser Gene in Gegenwart mindestens eines Gens, das für ein sogenanntes Streßprotein kodiert oder in Gegenwart einer Kombination dieser Gene, können die erfindungsgemäßen Nuklein säuren vorteilhaft in den erfindungsgemäßen Wirtsorganismen exprimiert werden. Streßproteine, auch Hitzeschockproteine (= HSP) oder molekulare Chaperone (engl. Anstandsdame oder Gouvernante) genannt, gehören zu den in der Evolution sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten am besten konservierten Proteine und sind universell bei allen Organismen zu finden. Ihre Unterteilung erfolgt nach dem Molekulargewicht in Kilodalton, z. B. HSP60, 70, 90 usw. Diese Streßproteine verdanken ihre Bezeichnung ihrer Eigenschaft durch Streßbedingungen wie zu niedriger Glukose spiegel, Hitzeschock, Alkohol, UV-Licht, oxidative Reagenzien etc. induzierbar zu sein.

Viele Streßproteine und konstitutiv gebildete verwandte Proteine sind für die korrekte Faltung, Zusammenlagerung, Stabilisierung und den Transport von Proteinen essentiell. Durch die Koex pression der erfindungsgemäßen Proteine in Gegenwart mindestens eines Streßproteins können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorteilhaft exprimiert werden. Eine gegebenenfalls vorkommende Proteinaggregation der Hydrolasen kann so vorteilhaft verhindert werden. Dabei binden die Streßproteine an hydrophobe Teile der Proteine und verhindern so eine falsche Faltung der Proteine bzw. ermöglichen die korrekte Faltung. Bereits aggregierte oder dena turierte Proteine werden wieder dissoziiert und richtig gefaltet. Häufig treten diese Streßproteine bei der Ausübung ihrer Funktion in Kooperation mit anderen Proteinen sogenannten Helferproteinen (= cohort-Proteinen) man spricht deshalb von sogenannten Chaperon-Maschinen, die die vorteilhafte Wirkung bei der Expression der erfindungsgemäßen Gene haben (Frydaman et al., Nature, 370, 1994: 111-117). Die Wirkung dieser Chaperon-Maschinen kann unter ATP- Verbrauch erfolgen (= "Hauptchaperon-Maschinen") oder ohne ATP-Verbrauch (= "Junior-Chaperone"). Vorteilhafte Chaperone oder Hitzeschockproteine sind beispielsweise die eukaryontischen Gene HSP17,5, HSP22, HSP25, HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, TRiC, UBI1, 2, 3, 4 oder ihre prokaryontischen Homologen wie HtpG, DnaK, DnaJ, GroES, GroEL, HtrC, ClpB, GrpE etc. Bevorzugte Chaperone sind GroES, GroEL, HtpG, DnaK, DnaJ, HSP70 oder HSP27.

Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Gegen wart mindestens eines Streßproteins exprimiert, dabei können die Gene unter gemeinsamer Kontrolle eines Promoters liegen oder von getrennten Promotoren gelesen werden. Dementsprechend kann ihre Expression durch Zugabe einer oder mehrerer Induktorsubstanzen gleichzeitig oder zu getrennten Zeitpunkten induziert werden. Die Nukleinsäuren können auf einem Vektor liegen oder auf getrennten Vektoren. Es ist auch möglich die Streßproteine des Wirts organismus über eine genetische Manipulation so zu verändern, daß sie überexprimiert werden.

Auch alternative Methoden zur Erhöhung des nativen Enzymanteils wie die Anzucht der Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Protein synthetisieren, bei niedrigen Temperaturen oder die Renaturierung durch Anwendung hoher Drücke (vorteilhaft 1 bis 2 kbar) auf Suspensionen des erfindungsgemäßen Proteins (mit oder ohne Zusatz denaturierender Agenzien, beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid) können vorteilhaft sein.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, Hefen wie Pichia, Saccharo myces oder Hansenula oder Pilze wie Beauveria oder Psilocybe besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudo monas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agro bacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüberhinaus in der Gruppe der α-Proteobacterien, β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien zu finden.

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäu rekonstrukte oder Vektoren, die für L-Pantolacton-Hydrolasen kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenen falls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung ange zogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch Weise, semi batch Weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier lich nach gefüttert werden. Gleiches gilt für Induktoren wie bei spielsweise Isopropythiogalactosid, (IPTG), Lactose, Arabinose, Rhamnose und Antibiotika bzw. Temperatur-Shifts, die je nach verwendetem Promotor die Expression des erfindungsgemäßen Gens anschalten. Das racemische Pantolacton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Die Wirtsorganismen enthalten vorteilhaft 0,5 U/g BTM (= Bio trockenmasse) L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität, bevorzugt 4 U/g BTM, besonders bevorzugt 20 bis 150 U/g BTM, ganz besonders bevorzugt 40 bis 600 U/g BTM.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 95°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 85°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 75°C durchgeführt.

Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 6 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 6 und 8, ganz besonders bevorzugt zwischen pH 6,5 und 7,5 gehalten.

Unter racemischen Pantolacton im erfindungsgemäßen Verfahren ist Pantolacton zu verstehen, das aus einem 50 : 50 Gemisch der beiden Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch besteht.

Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Pantolacton (D- oder L-Enantiomer) sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 70% ee, bevorzugt von min. 80% ee, besonders bevorzugt von min. 90% ee, ganz besonders bevorzugt min. 98% ee erreicht.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen ver wendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein säurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufge schlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z. B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteil haft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.

Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweck mäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation. Dies ist bei Verwendung von immobilisierten Organismen oder Enzymen vorteilhaft nicht notwendig, kann aber auch erfolgen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten D-Pantolacton läßt sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Kristallisation oder vorteilhaft über Extraktion und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktions lösung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Vorteilhaft wird die Lösung vor Extraktion auf ca. 0°C bis 10°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wird vor dem Herunterkühlen oder danach vorteilhaft auf ca. pH 6,0 bis pH 7,0 neutralisiert, um die freie Säure in das Salz zu überführen, so daß sie unter den Reaktionsbedingungen nicht extrahiert werden kann. Für die Neutralisation wird beispielsweise Bicarbonat oder eine andere Base wie NaOH oder KOH genommen. Als organische Lösungsmittel können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze zeigen und in die das Lacton aus der wäßrigen Phase übergehen kann. Vorteilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die nur wenig Wasser aufnehmen, so daß nur wenig Säure in das Lösungs mittel übergeht wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diiso propylether, Benzol, Methyltertiärbutylether, Methylisobutyl keton, Diethylketon oder Essigester.

Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90% chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wäßrigen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungs mittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und noch mals kristallisiert werden. Durch die anschließende vorteilhafte mindestens einmalige Kristallisation kann die Enantiomerenrein heit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden.

Vorteilhaft kann jedoch das entstandene D-Pantolacton direkt als organische Lösung ohne Kristallisation verwendet werden.

Das in wäßriger Lösung verbliebene L-Enantiomer kann durch An säuren beispielsweise mit Schwefelsäure zum Lacton geschlossen werden und anschließend wie oben beschrieben extrahiert werden. Zur Lactonisierung wird die Lösung vorteilhaft erwärmt. Das gewonnene L-Lacton kann nach Abziehen des Lösungsmittels in der Schmelze mit katalytischen Mengen (ca. 1 bis 5% Mol-%) einer Base wie NaOH, Na-Pantoat oder Na-Methylat racemisiert und rückgeführt werden. Durch die vorteilhafte Racemisierung und Rückführung des unerwünschten Enantiomers kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine theoretische Ausbeute von 98% erreicht werden.

Bei den genannten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100%, be vorzugt von 80 bis 100%, besonders bevorzugt von 90 bis 100% bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte racemische Panto lacton isolieren. Das isoliert Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von < 90%, bevorzugt < 95% besonders bevorzugt von < 98% aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantiomerenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.

Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für die Synthese von Panthenol, Pantethein und deren Derivate. Diese Stoffe und das erhaltene enantiomerenreine Pantolacton können in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.

Die nachstehenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung.

Beispiele 1. L-Pantolacton-Hydrolyse mit Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere der in Tabelle 1a, 1b angegebenen Stämme) wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen, geerntet, in Puffer gewaschen und resuspendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM D,L-Pantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Konzentrationen an D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch GC- bzw. HPLC-Analyse bestimmt (Tab. 1a). Alternativ wurde die Umsetzung über Nacht unter Titration mit 4 M NaOH durchge führt (4 ml Zellsuspension, 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris/HCl pH 7,0 ad 20 ml dest. Aqua; Tab. 1b). Alle Stämme der Tabelle 1 hydrolysierten das racemische Pantolacton zu L-Pantoinsäure. Der ee-Wert bei hohem Umsatz (<45%) und damit die Enantio selektivität E des Enzyms wurde nach Straathof und Jongejan, Enzyme & Microbiol. Technology 21: 559-571, 1997 bestimmt.

2. Verifizierung der hydrolytischen Aktivität

Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere Stämme aus Tab. 1) wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen, geerntet, in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und resus pendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM Ketopantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Konzentrationen an Ketopantolacton, Ketopantoinsäure, D,L-Panto lacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt (Tab. 1a). Alle aufgeführten Stämme außer Beauveria amorpha Lu7953 vermochten die aus Ketopantolacton durch spontane Hydro lyse entstehende Ketopantoinsäure zu Pantoinsäure zu reduzieren. Da bei allen Stämmen jedoch D- Pantoinsäure anstelle des unter Beispiel 1 beschriebenen L-Pantoinsäure gebildet wurde, kann die Umsetzung von Pantolacton zu L-Pantoinsäure nicht durch einen Oxidations-Reduktionsprozeß (über Ketopantolacton und Ketopanto insäure) entstehen. Es wurde auch im dialysierten Rohextrakt von Lu681 oder Lu5351 und bei Einsatz der gereinigten Enzyme aus Lu681 und Lu5351 keine Abhängigkeit der L-Pantolacton-Hydrolyse von Cofaktoren festgestellt. Die enzymatische Aktivität läßt sich damit auf ein hydrolytisches Enzym zurückführen.

3. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit ver schiedenen Wildtypstämmen a. Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt) angezogen (OD600 = 6,7, BTM = 2,97 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,5 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 45%, ee = 95%; 19, 5 h: c = 59%, ee = 89% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 73% bzw. 100%.

b. Agrobacterium radiobacter Lu5351

Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen (OD600 = 11,5, BTM = 2,90 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 20%, ee = 93%; 19,4 h: c = 53%, ee = 94% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 21% bzw. 100%.

c. Pseudomonas diminuta Lu683

Pseudomonas diminuta Lu683 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt) angezogen (OD600 = 7,3, BTM = 3,78 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,3 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 48%, ee = 97%; 19, 4 h: c = 69%, ee = 79% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 82% bzw. 100%.

d. Apiotrichum humicola Lu3215

Apiotrichum humicola Lu3215 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen (OD600 = 18,5, BTM = 7,34 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 55%, ee = 79% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84%.

4. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 14 l Komplexmedium (HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 200 U) aus dem Rohextrakt gereinigt. Dazu wurden die Zellen (1128 g Feuchtmasse) zunächst durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer (1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert. Endvolumen 3 l. Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension (3,2 l) wurde 2 mal bei 1500 bar im Z04 Microfluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (4 l) wurden einer er sten Fällung mit 200 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natron lauge auf pH 7,0 gehalten. Der Niederschlag wurde 30 Minuten bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (3,1 l) wurde mit 200 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung (pH 7,5) versetzt. Durch die Zugabe sank der pH auf 5,0 ab. Es bildete sich ein Niederschlag, der wiederum bei 6000 U/min (20 Minuten, Sorvall) abzentrifugiert wurde. Der Überstand (3,4 l) wurde auf pH 7,0 zurücktitriert.

Anschließend wurden 989 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 50%igen Sättigung) zugegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung wurde 20 Minuten bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand (3,7 l) wurde geteilt: 1,2 l wurden in einer Phenyl sepharose Chromatographie eingesetzt.

Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natrium phosphatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% Puffer-B nach 120 Minuten erreicht und für 40 Minuten gehalten. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (250 ml).

Nach Verdünnung auf <7 mS/cm wurden diese 3 l durch Chromato graphie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml, Fast Flow, Pharmacia) gereinigt. Die Säule wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min)). Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde linear auf 100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei linear 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (118 ml). Dieses Volumen wurde konzentriert (10 kD Omega-Membran) und gegen 5 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert; Endvolumen 21 ml. 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquilibriert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und dann entwickelt mit einem Gradienten (1% pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive Fraktionen wurden vereinigt (3,7 ml) und zwei mal gegen 2 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert (4 ml).

Dieses Material wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharmacia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt. Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Aceton fällung bei -20 Grad Celsius konzentriert.

Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben (Tris/Glycin Gel 12%, Fa. Novex ca. 2,5 h 125 V, 50 mA, Laemmli, U. K., 1970, Nature, 227: 680-685). Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert und ausgeschnitten. Hierzu wurde das Gel kurz in TBS-Puffer (= 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) geschwenkt und dann mit 50 ml TBS + 50 ml α-Naphthylacetat-Lösung (Sigma N-8505, 0,4 g/l in 10% Aceton) 10 min. vorinkubiert. Anschließend wurden 50 ml Fast Red TR-Lösung (Sigma F-8764, 1 g/l) zugegeben und das Gel weiter bei RT (= ca. 23°C) geschwenkt. Die L-Pantolacton-Hydrolase war als rot braun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gel stücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten.

5. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Agrobacterium radiobacter Lu5351

Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 14 l Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, auf geschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 60 U) aus dem Rohextrakt gereinigt (Tab. 2). Dazu wurden die Zellen (400 g Feuchtmasse) von Agrobacterium radiobacter (Lu5351) zunächst durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer (1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert (Endvolumen 2,2 l). Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension wurde 2mal bei 1500 bar im Z04 Micro fluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (2,7 l) wurden einer ersten Fällung mit 135 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natron lauge auf pH 7,0 gehalten und der Niederschlag 30 min bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (2,6 l) wurde mit 575 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung versetzt und der pH erneut kontrolliert. Zu diesen 3,15 l wurden 711 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 40%igen Sättigung) gegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung wurde 30 min bei 6000 Upm abzentrifugiert.

Der erhaltene Überstand (3,3 l) wurde in einer Phenylsepharose Chromatographie eingesetzt.

Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natrium phosphatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% B nach 120 min erreicht und für 40 min gehalten. Aktive Fraktionen wurden ge sammelt und vereinigt (350 ml, 20,9 mS).

Nach Verdünnung auf 7 mS/cm (3,1 l Endvolumen) wurde eine Chromatographie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml, Fast Flow, Pharmacia) durchgeführt. Die Säule wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min)). Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde auf 100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (134 ml). Dieses Volumen wurde konzen triert (10 kD Omega-Membran) und gegen 3 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert (Endvolumen 19 ml). 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquili briert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und entwickelt mit einem Gradienten (1% pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive Fraktionen wurden vereinigt (12,5 ml) und gegen 5 l 10 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert.

Der Überstand wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharma cia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt.

Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Acetonfällung bei -20 Grad Celsius konzentriert. Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben. Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert (siehe Beispiel 4) und ausgeschnitten. Sie war als rotbraun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 36 kDa zu er kennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide wurden sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 5 und 6) erhalten. Die Sequenzierung von SEQ ID NO: 5 ergab eine Unklarheit bei der ersten Aminosäure der Sequenz. Das in Position 1 wiedergegebene Tyrosin kann auch ein Leucin sein die Sequenz war hier nicht eindeutig.

6. Substratspezifität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolasen aus Lu681 und Lu5351

0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten Enzyme aus Lu681 oder Lu5351 wurden in 150 mM Pipes pH 6,8 mit verschiedenen Estern und Lactonen inkubiert. Nach 0, 1 und 20 h wurden Proben gezogen, die Reaktion durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt und die Konzentration des Substrates sowie der korrespondierenden Säure durch HPLC-Analyse bestimmt. Die Aktivität ist in den Tabellen 3a und 3b im Ver gleich zur Aktivität mit L-Pantolacton angegeben.

Für das Lipasesubstrat 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutar säure-resorufinester wurde für das Lu681-Enzym ein optischer Test in der Mikrotiterplatte durchgeführt (Boehringer Mannheim, modifiziert). 60 bis 482 U/l Enzym wurden in 45 mM KH₂PO₄ pH 6,8 mit 0,18 g/l Resorufinester (2 g/l in Dioxan + 2% SDS + 10% H₂O) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion E wurde nach 2 min und 82 min bei 572 nm gemessen. Tab. 3c zeigt die Extinktions differenz und die daraus berechnete Lipase-Aktivität, die ca. 0,05% von der L-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität beträgt.

7. Inhibition und Aktivierung der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolasen aus Lu681 und Lu5351

0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten Proteine aus Lu681 oder Lu5351 wurden 5 min mit verschiedenen Effektorsubstanzen in 150 mM Pipes (pH 7.0) vorinkubiert. Der Assay wurde durch Zugabe von 150 mM L-Pantolacton gestartet (1 h 30°C) und durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt. Anschließend wurden die Konzentrationen an D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Die Tabellen 4a und 4b zeigen die Aktivität im Vergleich zur Probe ohne Zusatz einer Effektorsubstanz. Insgesamt sind die gereinigten Enzyme aus Lu681 und Lu5351 unempfindlich (<85% Restaktivität) gegen chelatisierende Substanzen, SH-Reagenzien, Protease-Inhibitoren, Detergenzien (Ausnahme: Lu5351 mit 74%-Restaktivität in 1% SDS) und verschiedene Kationen.

Eine signifikante Aktivierung (+20%) ist allenfalls mit HgCl₂ festzustellen (133/170%). Desweiteren wurde für die rekombinante 681-Lactonase (E. coli-Zellen, s. Bsp. 8ff.) eine kompetitive Hemmung durch D-Pantolacton nachgewiesen.

8. Genbank + Screening: Klonierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681

Genomische DNA aus Burkholderia caryophylli Lu681 wurde iso liert (Qiagen, Hilden), mit EcoRI verdaut und in mit EcoRI ge schnittenen und dephosphorylierten pBluescriptKS+-Vektor ligiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989). Das Ligationsgemisch wurde gemäß Instruktion der Fa. Stratagene (LaJolla, Calif.) in E. coli XL1Blue transformiert. Die Tansformanten wurden auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg/ml) IPTG (= Isopropyl-β-thiogalactosid, 0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) ausplattiert und über Nacht bei 30 oder 37°C inkubiert. Die weißen Kolonien wurden gepickt auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) und wiederum über Nacht inkubiert. Anschließend wurde durch Filterabklatsch mit sterilen Nitrocellulosefiltern eine Kopie dieser Masterplatte auf LB-Ampicillin- (100 mg/ml) IPTG-Platten angelegt. Der Filter wurde nach Inkubation über Nacht auf dieser Platte (s. o.) einem Aktivitätstest mit 150 mM L-Pantolacton, 0,1% Nitrazingelb und 10 mM Tris/HCL pH 7,0 unterzogen (3 h-ÜN 30°C). Ein Klon mit Gelb färbung (XL1Blue pKS+681) wurde isoliert.

9. Restriktionskartierung und Sequenzierung des EcoRI-Inserts aus E, coli XL1Blue pKS+681

Aus E. coli XL1Blue pKS+681 wurde die Plasmid-DNA gemäß Instruktion der Fa. Qiagen (Hilden) isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, PstI und HindIII einzeln bzw. im Doppelverdau geschnitten. Die fragmentierte DNA wurde durch Agarose-Gelelektrophorese im 0,8%igen Agarosegel analysiert. Aus den erhaltenen Fragmentgrößen resultiert die in Fig. 3 abgebildete Restriktionskarte des 7,5 kB-Insert. Es wurde voll ständig sequenziert (Sanger et al. 1977) und enthält u. a. die Nukleotidsequenz ID NO: 1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) wiederum enthält die Peptide YGIEGLNNLEAL und AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO: 3 und 4), die nach tryptischem Verdau der gereinigten und geblotteten L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681 und Agrobacterium radiobacter Lu5351 gefunden wurden (siehe Beispiel 4 und 5).

Datenbankabgleiche (Genbank, EMBL, SwissProt Stand 7.5.99, [Sptrembel] bzw. 5.1.99 [PIR]) der Nukleotid- und der abge leiteten Aminosäuresequenz ergaben lediglich eine geringe Homo logie zu einer Gruppe hypothetischer Proteine und zu bestimmten Tetracyclin-Cyclasen aus Streptomyceten (Tab. 5). Insbesondere das Motiv mit der Consensus-Sequenz HTGTHVDAP ist in allen Proteinen hochkonserviert. Außerdem wurde eine Homologie von 48% (38% identische Aminosäuren) zur Isatin-Hydrolase aus Pseudomonas putida WW2 gefunden (WO 94/09175), die ebenfalls das genannte Sequenzmotiv enthält. Da keine Homologie zu anderen Lactonasen, Esterasen oder Lipasen gefunden wurde, handelt es sich bei den gefundenen L-Pantolacton-Hydrolasen um eine neue Klasse von Enzymen. Die Sequenzvergleiche lassen eine entfernt verwandte phylogenetische Familie vermuten, zu der auch die benannten hypothetischen Proteine und Tetracyclin-Cyclasen sowie die Isatin-Hydrolase gehören.

10. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XL1Blue pKS+681

Eine volle Impföse E. coli XL1Blue pKS+681 wurde nach Wachstum (ÜN = über Nacht, 37°C) auf einer LB-Platte mit Ampicillin (100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) in 0,5 ml Tris-HCl pH 7,0 und 50 mM D,L-Pantolacton resuspendiert (OD600 = 2,5). Als Vergleich diente eine entsprechende E. coli XL1Blue pBluescriptKS+-Probe (OD600 = 2,5). Nach 1 h wurden die Zellen ab zentrifugiert und D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Tab. 6a zeigt Aktivitäten und ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Suspension besaß eine Aktivität von ≧90 U/L. In Flüssigkultur-Ansätzen (vgl. Beispiel 12) war jedoch keine signifikante Aktivität zu erkennen.

11. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E, coli XL1Blue pKK223-3

Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 wurden die Oligo nukleotide 5'-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedingungen: 20 mM Tris/HCl pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 µg/ml pKS+681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25 U/ml Pfu-Polymerase (Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten und in mit EcoRI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al. 1990, Gene 96: 23-28). Die Tansformanten wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformati onsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filterabklatsch und ein anschließender Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktionsverdau (EcoRI-HindIII, EcoRI-HindIII-BamHI) der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Mole cular Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 4 abgebildete Plasmid pKK681.

12. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XL1Blue pKK681

E. coli XL1Blue pKK681 wurde in 30 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) und IPTG (0,5 mM) über Nacht bei 37°C angezogen, geerntet und in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und resuspendiert (3 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0). 0,25 ml der Suspension wurden mit 150 mM L-Pantolacton, 150 mM Pipes pH 7,0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h bei 30°C inkubiert. Daneben wurden 0,25 ml der Suspension mit 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris pH 7,0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h inkubiert. Weiterhin wurden 2 ml der Suspension mit 300 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris pH 6,8 ad 20 ml Aqua dest. versetzt und unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 6,8 3 h inkubiert. Nach 1 h und nach 3 h wurden Proben entnommen, die Zellen abgetrennt und der Überstand auf D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure untersucht. Tab. 6b zeigt Aktivitäten und ee-Werte der ver schiedenen Proben. Die Über-Nacht-Kultur (1 × konzentriert) besitzt somit eine Aktivität von 90 bis 150 U/l.

Bei Induktion von E. coli XL1Blue pKK681 in der frühexponentiellen Wachstumsphase (OD600 = 0,6, + 0,5 mM IPTG) besitzen die entsprechenden Zellen nach 5 h Inkubation bei 37°C in der spätexponentiellen Phase (OD600 = 4,1) eine Aktivität von ca. 480 U/l.

13. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli TG1 pDHE19

Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 wurden die Oligo nukleotide 5'-CAGGATGCCATATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedingungen: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 µg/ml pKS+681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25 U/ml Pfu-Polymerase (Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit NdeI und HindIII geschnitten und in mit NdeI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten pDHE19 (Prof. Mattes, Stuttgart) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al. 1990, Gene 96: 23-28). Die Transformanten wurden auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformationsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filte rabklatsch auf LB-Ampicillin-(100 µg/ml)Rhamnose-(2 g/l) Platten (LB = Luria Broth) und ein anschließender Aktivitätstest durch geführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktionsverdau (NdeI-HindIII, NdeI-HindIII-BamHI) sowie Sequenzanalyse der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 5 abgebildete Plasmid pDHE681.

14. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli TG1 pDHE681

E. coli TG1 pDHE681 wurde in 14 l Minimalmedium mit 40 g/l Glycerin und 2,5 g/l Rhamnose 6 bis 7 h bei 37°C angezogen, geerntet und in Tris/HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und ad 1,4 l Puffer resuspendiert. Die Aktivität der einfach konzentrierten Zellsuspension betrug im Standardassay (150 mM Pipes pH 7,0, 150 mM L-Pantolacton, 1 h 30°C) 680 bis 2700 U/l bzw. 60 bis 160 g/BTM.

10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach 0,4 h und 3 h wurden der Umsatz und der ee-Wert durch HPLC- Analyse bestimmt (0,4 h: c = 48%, ee = 92%; 3 h: c = 58%, ee = 72% bzgl. L-Pantoinsäure). Dies entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84% bzw. 100%.

15. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit E. coli TG1 pDHE681

3 g D,L-Pantolacton wurden in 10 ml H₂O gelöst und mit 4 M NaOH auf pH 6,5 titriert. Nach Zugabe von 5 bis 10 ml Zellsuspension E. coli TG1 pDHE681 (Beispiel 14) und Auffüllen ad 20 ml mit H₂O wurde die Reaktion bei 30°C unter Titration auf pH 6,8 15 bis 22 h inkubiert. Wahlweise wurden nochmals 0 bis 2 ml Zell suspension zugesetzt und weitere 3 h inkubiert bzw. 3 × 5 ml Zellsuspension zugesetzt und weitere 90 h inkubiert. Fig. 6 zeigt den Verlauf anhand des NaOH-Verbrauches. Je nach Umsatz und Inkubationszeit wurden ee-Werte für D-Pantolacton von 71 bis 97% erzielt. Anschließend wurden die Zellen aus den 22 ml-Ansätzen abzentrifugiert und mit 5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,0 gewaschen und die Überstände vereinigt (20 bis 25 ml) und 3 × mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde nach Zugabe von 10 g Na₂SO₄ (wasserfrei) 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Der Niederschlag wurde abfiltriert, 1 × mit Ethylacetat gewaschen und das Filtrat 3 h bei 40°C einrotiert. Der viskose Rückstand wurde ausgewogen und durch HPLC, GC, GC-MS sowie H-NMR analysiert (Tab. 7). Er enthielt reines D-Pantolacton (ee 71 bis 87% nach 50 bis 52% Umsatz).

Die wäßrige Phase (21 ml; Na-L-Pantoat) wurde mit ca. 5 ml 3 M H₂SO₄ auf pH 1 gestellt, 15 min bei 80°C erhitzt und mit 8 g wasserfreiem Na₂SO₄ versetzt. Das erhaltene L-Pantolacton wurde analog 3 × mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, mit Na₂SO₄ getrocknet und einrotiert. Zur Rückführung in die Hydrolyse kann die L-Pantolacton-Schmelze durch Erhitzen nach NaOH-Zugabe in Gegenwart von geringen Mengen Na-L-Pantoat racemisiert werden (3 h 180°C).

16. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit L-Panto lacton-Hydrolase aus E. coli-Stämmen

L-Pantolacton-Hydrolase wurde direkt aus Fermenterbrühe von E. coli (TG1 pDHE681 bzw. bevorzugt Stämme, die Chaperone wie z. B. GroEL co-exprimieren) durch Zellaufschluß (2 × 1000 bar im Microfluidizer), Zelltrümmerabtrennung (20 min 9000 g bei 10°C), 10-fache Konzentration über eine Cross-Flow-Filtration (Hämoflow F60, Fresenius, Membran mit Ausschluß von ca. 10 kDa) und Hitze fällung (20 min 60°C, 20 min RT-10°C, Zentrifugation) gewonnen und auf eine spezifische Aktivität von ca. 3000 U/g Protein angereichert. Dieses 10 × Homogenat besaß eine Aktivität von 63-100 000 U/l und eine Proteinkonzentration von 20-30 g/l.

Die Racematspaltungen von 2,3 M D,L-Pantolacton (30% w/v) mit hitzegefälltem Homogenat (16000 U/l, 6 g/l Protein) wurden bei 30°C unter Titration mit 4 bis 10 M NaOH (pH 7,5) mit leichter Pufferung (6 bis 20 mM NaHCO₃) im 0,75 bis 1,0 l batch-Ansatz durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht wurde das Enzym durch Cross-Flow-Filtration (Hämoflow F40, Fresenius, Membran mit Ausschluß von ca. 10 kDa) des Ansatzes von der Produkt-haltigen Lösung getrennt, 1 bis 2 × mit VE-Wasser gewaschen und konzentriert. Anschließend wurde das Enzym erneut unter den obigen Bedingungen eingesetzt. Der Standzeitversuch zeigte eine Verdopplung der für einen ee-Wert von <90% (D-PL) notwendigen Verweilzeit von 12 auf 24 h nach 6d (Fig. 7). Die Aktivitäts verluste sollten sich durch Verwendung größerer Volumina (z. B. 10-l-Ansatz für die F40-Kartusche) reduzieren lassen.

Die Aufarbeitung von Racematspaltungsansätzen mit Homogenat (50,8% Umsatz, 92,5% ee) erfolgte durch Extraktion mit 5 × 1 Vol. MTBE. Es wurden 43% D-Pantolacton mit 91,4% ee und 98,2% Reinheit (GC_int.St.; bezogen auf 100% Racemat). Nach Erhitzen (65°C/15 min) mit Schwefelsäure (konz., 25 ml) und abermaliger Extraktion mit MTBE (5 × 1 Vol) wurden 53% L-Pantolacton mit 62,3% ee und 98,2% Reinheit (GC_int.St.) erhalten. Verun reinigungen durch Protein oder DNA waren mit Standardverfahren nicht erkennbar.

* NaOH-Daten vom 6. Tag nicht verfügbar. 50,4% Umsatz, 89,8% ee bei 1390 min (23,17 h).

Proben vom 7. Tag nicht verfügbar, daher keine analytischen Daten.

17. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit immobili sierter L-Pantolacton-Hydrolase

L-Pantolacton-Hydrolase wurde wie in Beispiel 16 isoliert und an verschiedene Trägermaterialien wie das kommerziell erhältliche EupergitC (Röhm GmbH, Darmstadt) oder Deloxan DAPIII (Degussa, Frankfurt) gebunden.

EupergitC

Eupergit ist ein durch Epoxidgruppen aktiviertes Trägermaterial. Das Protein wird dadurch hauptsächlich an Aminogruppen kovalent fixiert.

Homogenat wurde zunächst durch Hitzebehandlung einer Fällung unterzogen. 1,1 l Homogenat wurden zu Mengen von je 550 ml für 30 Minuten bei 60°C inkubiert und dann für 20 Minuten auf Eis zur Abkühlung gestellt. Diese Lösung wurde zentrifugiert (1 Stunde 8000 U/min GS3 Rotor), um denaturiertes Protein abzutrennen. Der Überstand wurde dann auf einer Hämoflow F40 Kartusche konzen triert und in einen 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, umgepuffert. Die Menge Protein pro g Eupergit kann frei gewählt werden. In dem folgenden Beispiel wurden 7,2 g Protein in 270 ml Puffer mit 30 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 verdünnt und mit 17,5 g festem NaCl eingesalzt. Die hohe Salzmenge fördert die Bindung des Proteins an den Träger. Der pH wurde auf genau pH 6,8 ein gestellt und zu dieser Lösung wurden dann 15 g trockenes Eupergit gegeben. Die Lösung wurde für 17 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf einer Glasnutsche abgesaugt und der Träger mit Wasser gewaschen. Das feuchte Material wog ca. 60 g. Die Aufbewahrung erfolgte in einem 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5.

Deloxan DAPIII, mit und ohne Reduktion

Deloxan ist ein mit Aminogruppen modifiziertes Silikat. Diese Aminogruppen können mit Glutardialdehyd unter Bildung einer Schiff'schen Base aktiviert werden. Der überschüssige Aldehyd wird dann weggewaschen und das Protein zum aktivierten Träger hinzugegeben. Die freien Aminogruppen des Proteins reagieren unter Bildung einer zweiten Schiff'schen Base mit dem noch freien Aldehyd des gebundenen Glutardialdehyds. Dieses so immobilisierte Protein ist bereits einsetzbar. Die Schiff'sche Base neigt jedoch zur Hydrolyse, so daß das Protein langsam vom Träger in wäßriger Lösung abblutet. Dies kann durch Reduktion mit Natriumborhydrid vermieden werden. Dabei wird die Schiff'sche Base in ein sekundäres Amin umgewandelt. Vorraussetzung dafür ist die Stabilität des Enzyms gegen eine Reduktion mit Natriumborhydrid.

Hitzefällung des Homogenats wie bei der Immobilisierung auf EupergitC.

Aktivierung

140 g Deloxan DAPIII wurde mit Wasser, dann mit 1,5 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6, und 1,5 l 0,1 M Natriumphosphat puffer, pH 7,5, gewaschen und resuspendiert. Dazu wurden 560 ml einer 2,5%igen Glutardialdehydlösung (pH 7,5 korrigiert im gleichen Puffer) gegeben und für 3 bis 4 Stunden reagiert. Der Träger wurde orangerot. Danach wurde der aktivierte Träger mit 6 l Wasser gewaschen und in 1 l Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert.

Zu 40 g aktiviertem Deloxan wurden z. B. 10 000 U (ca. 2,7 g Protein) L-Pantolacton-Hydrolase gegeben. Das Protein wurde mit dem aktivierten Träger für 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde über eine Glasnutsche vom Träger getrennt. Der Träger wurde mehrfach mit Wasser und dann mit 1 l 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 und 1 M NaCl gewaschen. Die Hälfte des Trägers wurde entnommen (ohne Reduktion). Die andere Hälfte wurde wieder mit Wasser gewaschen und dann in 0,1 M Natriumborat puffer, pH 7,2, gegeben.

Reduktion durch Natriumborhydrid

Zu dem in 80 ml Boratpuffer resuspendierten Träger wurden 0,4 g Natriumborhydrid gegeben (0,5%) und 3 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Dabei wurde das Trägermaterial wieder hellgelb. Der Träger wurde über eine Glasnutsche abgesaugt und mit 400 ml Boratpuffer gewaschen. Danach wurde der Träger mit 1 l Wasser gewaschen und dann in 20 mM Phosphatpuffer aufgenommen.

Racematspaltung

Zur Racematspaltung von 2,3 M D,L-Pantolacton (30% w/v) mit Immobilisaten wurden diese unter Titration mit 10 M NaOH (pH 7,5) in 10 mM NaHCO₃ in 40-ml-Ansätzen bei 30°C gerührt, bis der ee-Wert für D-Pantolacton bei ca. 90% lag (25 bis 60 h). Der Biokatalysator wurde nach jedem Batch durch Filtration (Absaugen des Reaktionsansatzes durch einen HPLC-Laufmittel-Filter) vom Produkt getrennt und ggf. 3 × Waschen (VE-Wasser) zurückgewonnen. Die nachfolgenden Abbildungen zeigen die NaOH-Kurven der Standzeit-Versuche im gerührten Ansatz.

Tabelle 3a

Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681

Tabelle 3b

Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu5351

Tabelle 3c

Lipaseaktivität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681

Tabelle 4a

Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Burkholderia caryophylli Lu681 im Standardassay

Tabelle 4b

Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Agrobacterium radiobacter Lu5351 im Standardassay

Tabelle 7a

Tabelle 7b

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.

4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.

6. Mikroorganismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäure sequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäure konstrukt gemäß Anspruch 4 oder einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-negatives Bakterium handelt.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium aus der Gruppe der α-Proteobacterien, β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien handelt.

9. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae, Pseudo monadaceae oder Rhizobiaceae handelt.

10. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium der Gattungen Agrobacterium, Pseudomonas, Burkholderia, Salmonella oder Escherichia handelt.

11. L-Pantolacton-Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

12. Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Reaktionsschritte umfaßt:

a) Umsetzung racemischen Pantolactons in Gegenwart einer L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer L-Pantolacton-Hydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 zu D-Pantolacton und L-Pantoinsäure
b) Abtrennung des D-Pantolactons.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die unter Reaktionsschritt (b) erhaltene L-Pantoinsäure racemisiert und in Reaktionsschritt (a) rückgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart einer immobilisierten L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer immobilisierten L-Pantolactonhydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart eines wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikro organismus gemäß Anspruch 6 durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus immobilisiert ist.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei einem pH zwischen 4 bis 12 durchgeführt wird.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 95°C durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Pantolacton über Extraktion abgetrennt wird.

20. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeich net, daß das D-Pantolacton eine optische Reinheit von minde stens 90% ee besitzt.