RU2001114072A

RU2001114072A - Диагностический анализ

Info

Publication number: RU2001114072A
Application number: RU2001114072/14A
Authority: RU
Inventors: Чонг Джин УН; Вей Нинг ЧЕН
Original assignee: Правительство Республики Сингапур
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2003-03-20

Claims

1. Способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, предусматривающий подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, по меньшей мере один из которых способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, а по меньшей мере один другой - с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, причем указанные праймеры могут удлиняться от их 3'-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, при этом способ предусматривает также подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия продукта амплификации, свидетельствующего о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что праймеры гибридизуются с районами, соответствующими нуклеотидной последовательности или фланкирующими нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, или ее части.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что праймеры гибридизуются с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в части нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg.

4. Способ по п. 1, или 2, или 3, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает предварительное подвергание пробы условиям обратной транскрипции с получением одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что один из указанных праймеров помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, а другой из указанных праймеров помечен улавливаемой частью молекулы.

6. Способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, предусматривающий введение указанной пробы в реакционный сосуд, содержащий праймер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй праймер в фазе раствора, причем оба праймера способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью на комплементарных отдельных цепях происходящей из HBV ДНК в районе, находящемся в консервативном районе, вблизи него или смежно с ним на геноме HBV, а праймер фазы раствора помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, при этом способ предусматривает подвергание указанного реакционного сосуда условиям, облегчающим амплификацию, и затем детектирование присутствия идентифицируемого сигнала, свидетельствующего о присутствии происходящей из HBV ДНК.

7. Способ обнаружения одной или нескольких происходящих из HBV последовательностей-мишеней ДНК из одинаковых или различных штаммов или вариантов HBV, предусматривающий контактирование пробы, предположительно содержащей происходящую из HBV ДНК в одноцепочечной форме, с двумя или более праймерами, иммобилизованными индивидуально или в виде ряда (матрицы) на твердом носителе в реакционном сосуде, дополнительно содержащем праймеры фазы раствора, имеющие партнера, иммобилизованного на твердом носителе, причем иммобилизованный праймер и его партнер фазы раствора способны амплифицировать в условиях амплификации район происходящей из HBV ДНК, при этом праймер фазы раствора несет репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал, присутствие которого в определенном местоположении на твердом носителе позволяет идентифицировать конкретный изолят или вариант HBV.

8. Матрица из двух или более олигонуклеотидных праймеров, иммобилизованных на твердом носителе и способных гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью из происходящей из HBV ДНК.

9. Матрица по п. 8, отличающаяся тем, что она определяется формулой а₁a₂ . . . a_n, имеющих координаты на этой матрице (x₁y₁), (х₂y₂) . . . (х_ny_n), где а₁a₂ . . . a_n обозначают одинаковые или различные олигонуклеотиды, всего n олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид определяется координатами координатной сетки (x₁y₁), (x₂y₂) . . . (x_ny_n), при этом указанные олигонуклеотиды имеют партнеров амплификации, определяемых b₁b₂ . . . b_n, так что олигонуклеотиды a₁b₁, а₁b₂ . . . a_nb_n способны гибридизоваться с комплементарными цепями происходящей из HBV ДНК, причем интронная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, консервативную между двумя или более вариантами HBV, такими как HBsAg-варианты, при этом указанная матрица применима для детектирования конкретных HBV-агентов, определяемых тем, что они несут консервативный район амплификации указанной происходящей из HBV ДНК.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что праймеры выбраны из <400>1 и <400>2 или праймеров, имеющих по меньшей мере 70%-ное сходство с ними, или праймеров, способных гибридизоваться с <400>1 или <400>2 в условиях низкой строгости.

11. Вариант HBV, обычно в изолированной форме, идентифицируемый при помощи способа обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, предусматривающего подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, по меньшей мере один из которых способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, а по меньшей мере один другой - с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, причем указанные праймеры могут удлиняться от их 3'-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, при этом способ предусматривает также подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, детектирование присутствия указанного продукта амплификации, свидетельствующего о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и затем выделение указанного детектированного таким образом HBV.

12. Средство для идентификации продуктов экспрессии, таких как пептид, полипептид или белок, применимых в качестве иммунологических маркеров и/или для генерирования иммуноглобулинов для применения в диагностике и/или терапии.