TWI248515B - Array of two or more oligonucleotide primers immobilized to a solid support, and HBV variant generally in isolated form and method for identifying expression products - Google Patents

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1248515 九、發明說明： n号务明所屬才支系餘領】 發明領域 本發明一般而言係關於一種以核酸為主之分析法，以 "5 用來檢測一個病毒病原體（尤其是B型肝炎病毒）之存在。更 • 特別地，本發明提供一種單步驟之擴增分析以用來檢測B型 肝炎病毒之核酸序列。本發明之分析可容易地適用於自動 化，並且允許要被測試的樣品之快速通過。本發明進一步 I 提供可用於執行一種用於B型肝炎病毒的以核酸為主之分 ίο 析的試劑，以及一種包含有該等試劑之套組。 發明背景 於本案說明書内被編號引述之文獻明細，被收集在詳 細說明之後。 15

B型肝炎病毒（此後以HBV”簡稱）可以引起使人衰弱 之病狀且會導致急性肝病變，肝硬化出血及初期肝癌。每 年有上百萬人感染HBV且導致每年至少一百萬人之死亡。 HBV是一種DNA病毒，其經由RNA中間物複製並使用逆轉 錄做為其複製之方法。染色體基本上是一個複合體，其 具有一個部份雙股DNA結構，該結構於重疊之開放讀碼架構 編碼有各種病毒蛋白質。 雖然有上百萬人感& HBV病毒’但卻只有·一種HBV疫苗 可用。一般HBV病毒之鑑定是以檢測HBV表面抗原（HBsAg)、 病毒核心體抗原（HBcAg)以及針對HBcAg之抗體（抗-HBcAg) 《20 1248515 ο

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广、 方;HBV感染或疫苗注射HBV表面抗原（HbsAg)之後，血清 抗體中出現HBV表面抗原（HbsAg)(抗-HBs)。此為免疫檢測 HBV表面抗原（HbsAg)之理論基礎。於檢測系統中，篩選出 HBV表面抗原（HbsAg)或抗-HBs。於輸血之前分析法被使用 以供篩選HBV，檢測患有急性和慢性肝炎、肝硬化及初期肝 癌的病患之HBV相關的肝臟疾病和篩選HBV帶原者（諸如在 器官移植中之接受者和捐贈者）。’ HBsAg包含一個抗原決定區被稱之為，，3，，決定區（1) 。a 決定區是複雜，具結構形態且由高度守恒之半胱胺 酸殘基的雙硫鍵結。HBV突變株中展現由基因變昊所導致之 a”決定區的改變，其無法由一般疫苗產生之免疫反應所 檢測（2-6)。一個特定之一般突變是在HBV表面抗原（HbsAg) 之胺基酸位置145 (G145F)，該位置的一個甘胺酸（〇被取 代為精胺酸（R)。此突變影響” a”抗原決定區。 加重使用化學和免疫干擾於治療或防治HBV感染，其原 因是急需篩選對干擾治療有抗性之HBV突變株。基於HBV基 因構造之重疊性，HBV變異株可以使用化學試劑或疫苗做直 接或間接之_選。 因此，一般以抗體做為HBsAg之分析法，會產生錯誤的 陰性反應。此檢測錯誤對控制疾病擴散和病患之醫療會有 非常嚴重之影響。 由本發明之研究中’發明人想出一種替代之HBV的分析 法。依照本發明，發明人發展出一種單一步驟之核酸擴增 1248515 刀析法4方法可由展現有或無免疫可檢測之病毒標 幟的 HBV篩檢細V核酸序列。本發明以核酸檢測之分析法提供 -種里敏之HBV樣品分析法，尤其當此丽樣品不能由一般 免疫診斷所檢料。更進—步而言，經由本發明之分析法 5

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-20 可以七展出’由’變異株之守悝區域所產生之專一性免疫 球蛋白（即IgG)和疫苗。 |[考务日月内】 發明概要 包 除非文早内各需要，否則經由此特定說明，術語 括 或諸如 “comprises，，或，，comprising，， ==解是隱含地指包含-個所描述之要素或整數 是要素/整組’但不排除任何其他的要素或整數或 本發明之一方 生之核酸標的序列之方艾=、=㈣—個樣品中刪-衍 態，令變魏條件下以產生該標的序列之單股型 一 表品接觸一包含至少兩個引子之引子組， /、、夕们引子能夠雜交至該標的序列之一股，且其中 ^ 们引子能夠雜交至一個與該第一個提到之一互補 二中4等引子可由其等之3，#延伸以形成一個延 伸產物.亥延伸產物互補於為各個該等引子所雜交之股， =及將雜會促進擴增反應之條件下，以產生一包 ” 纟之伸產物之擴增產物，並接而檢測擴增產物之 存在”中垓擴増產物的存在係為該hbv-衍生之核酸標的 7 1248515 序列的指標。 10 15 本發明之另一方面提供一種用於檢測一個樣品中之一 個HBV-衍生之核酸標的序列的方法，該方法包含將樣品引 至’變性條件下以產生該標的序列之單股型態，令變性後之 樣品接觸一包含至少兩個引子之引子組，其中至少一個引 子能夠雜交該標的序列之一股，且其中至少另一個引子能 夠雜父一與該第一個提到之股互補的股，且其中該等引子 可由其等之3’端延伸形成一個延伸產物，該延伸產物互補 方；為各個該等引子所雜交之股，且其中該等引子被選擇以 亦隹父至對應於或旁出於一個落在編碼HBsAg之核酸序列内 或為.玄編碼序列之一部分的守恆性核菩酸序列之區域，並 將U至會促進擴增反應之條件下，以產生—包含有 、勺^伸產物之擴增產物，且接而檢測擴增產物之存在 2中補增產物的存在係綱-衍生之核酸標的序列的 ί曰標。 本發明之又另一 ►之一個HBV-衍生之Μ $ θ供—種用於檢測一個樣# 地將該樣品弓I至逆=序列的方法，該方法包含選招 息RNA)產生單股或雙俨 卜以由HBV-衍生之mRNA丨 20下以產生對應於該枳、CDNA分子；將樣品引至變性搞 樣品接觸一包含5，勺序列之單股之DNA分子，令變性移 芝乂兩個弓|子 子能夠雜交該標的序列之 子組，其中至少一値 子能夠雜交至一個與該第〜個^入股，且其中至少另一# 該等引子可由其等之3，山個提到之股互補的股，且其 而L伸形成一個延伸產物，該延 1248515 鵝 5

15 產物互補於為各個該等引子所雜交之股，並且將該樣品引 至會促進擴增反應之條件下，以產生一包含有互補之延伸 產物的擴增產物，且接而檢測擴增產物之存在，其中該擴 增產物的存在係為HBV-衍生之DNA標的序列的指標。 此外’本發明於另一方面係提供一種用於檢測一個樣 品中之一個HBV-衍生之DNA標的序列的方法，該方法包含將 該樣品引至一個反應容器中，該容器具有一個引子被固定 至一個固態擔體上以及一個第二引子位於溶液相中，其中 該兩種引子皆能夠雜交至位在HBV-衍生之DNA的互補單股 上之一個互補之核酸序列内的一個落在HBV基因組上之一 個守恆性區域内或與之鄰近或鄰接的區域，且其中該溶液 相引子被標幟以一個能夠產生一個可鑑定之訊號之報導者 分子；將該樣品引至會促進擴增反應之條件下，以及接而 檢測可鑑定訊號之存在，其中該可鑑定訊號的存在是為 HBV-衍生之DNA存在的指標。 本發明於另一方面係提供一種用於檢測樣品中一個或 # 多個衍生自之DNA標的序列之方法，這些序列來自於相 ’ 同或不同之HBV病毒株/變異株，該方法包含令一個假定含 有呈單股型悲之HBV-衍生之dna的樣品接觸兩個或多個引 “ 2〇子，該兩個或多個引子被個別地或是呈一個陣列形式被固 定於-個反應容器中之-個固態擔體上，其中該反應容器 • 進一步包含具有一個被固定至該固態擔體的搭檔之溶液相 引子，其中該固定之引子及其溶液相搭槽引子皆能夠於擴 增條件下來擴增HBV-衍生之難的一個區域，其中該溶液相 9 1248515 引子帶有一個能夠提供一個可鑑定的信號之報導者分子， 藉此，一個位在該固態擔體上之一個限定位置處之信號的 存在即能鑑定出一個特定HBV分離株或變異體。

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於本發明於另一方面提供一種配置是將兩個或多個寡 核苷酸引子固定至一個固態擔體，該引子能夠與一個衍生 自HBV之DNA互補之核酸序列雜交。 還有本發明於另一方面提供的是一種陣列之使用，該 陣列包含一系列之寡核笞酸，該陣列是以下列通式來定 義：a]a2…an，具有位於陣上之座標（x]y])，（X2y2)···· (xny〇， 其中a!a2…an代表相同或不同之寡核苷酸，總數為η個寡核 苦酸，且每一個寡核苦酸能夠以格柵座標（xiy!)、 (X2y2)"、（xnyn)來定義，且其中該等募核苷酸具有擴增搭 擋，該擴增搭擔被定義為b!b2…bn，藉此，a]bi、a2b2···. anbn 能夠雜交至HBV-衍生之DM的互補股，其中插入DNA包含有 一個於兩個或多個HBV變異株（諸如HbsAg變異株）之間係為 守恆的核酸序列，其中該矩陣可供用於檢測以帶有該HBV-衍生之DNA的守恆性擴增區域被定義之特定HBV試劑。 I：實施方式2 較佳實施例之詳細說明 20 本發明於某種程度上主要闡述的是鑑定HBV變異株中 守恆之核酸序列，及藉由該核酸序列鑑定法提供出引子供 使用擴增反應檢測HBV之診斷分析法。 為說明而定義下列數辭。 “擴增反應混合物”係意指一種液態溶液，其包含擴 ]〇 1248515 增一個標的物為病毒之核酸序列所需之各種試劑。該等包 含：酵素、液態緩衝液、鹽類、標的核酸和去氧核糖三石粦 酸0 5

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“擴增反應系統”係意指任何一種試管内方法，其用 於增加一標的核酸序列之套數。 “擴增反應試劑”係意指擴增反應所需之各種緩衝液 ，酵素，引子和去氧核糖三填酸。 “核酸”係意指單股或雙股之核糖核酸或去氧核糖核 聚合物。 “聚合酶”係意指酵素，能夠催化由核糖三磷酸前驅 物合成DNA之反應。於本發明之聚合酶鏈瑣反應PCR之擴增 反應中，理想的聚合酶是依靠模板，具有熱安定性且一般 由DNA聚合物之3’端添加核酸而產生DNA聚合物之延長。 “募核笞酸”係意指一個分子包含兩個或更多個核糖 核苦酸/去氧核糖核4酸。 “引子”係意指募核苷酸，無論是天然性或合成，能 夠做為一個DNA合成之起始點，所處之狀態是誘導一個引子 延伸產物之合成，該產物與一個標的核酸股互補。這些狀 態包含4種不同之核誓三磷酸和聚合酶，其溶於適當之緩衝 液中及一個適當之溫度。一個引子理想是一個單股之寡去 氧核苷酸。一個適當之引子長度是依其使用引子之目的和 狀態而定（包含標的核酸之序列守恆程度，聚合酶鏈瑣反應 PCR之循環狀態及引子之狀態）。 本發明提供一種，其用於檢測一個樣品中之一個衍生 "20 1248515 自HBV之«標的序列，該方法包含將樣品置於變性之反應 ，產生單股之該標的序列，將變性之樣品與—組引子加在 -起’其包含至少兩則子’其中至少—個引子能夠與該 標的序列之—股進行雜交，且其中至少另-個引子能夠與 第-個提到之-股互補的—股進行雜交，且其中該引子可 以由其3’卿成-個延伸產物，該產物與其個別之引子互 補’並且《品置於產生擴增反應之條件下，藉此產生擴 力曰產物-玄產物包3互補之延伸產物，且藉此檢測擴增產 10 15

物之存在’其巾該擴增產物的存麵代表的是衍生自膽之 核酸標的序列。 於一個具體例中，標的序列相對應於Ηβν基因之一個區 域，該區域於HBV變異株中為守恆性，且尤其是具有改變之 HBV表面彳几原（HBsAg)的HBV變異株。一個改變之服v表面抗 原（HBsAg)，可以包含於編碼HBV表面抗原（HBsAg)之核酸序 列上，一個由於單一或多重胺基酸取代，刪除及/或增添而 形成之單一或多重胺基酸取代，刪除及/或增添。除非HBV 表面抗原（HBsAg)之免疫性改變，一個HBV基因之守恆區域 ’尤其是於編碼HBV表面抗原（HBsAg)之核酸序列内，是應 當保持相當之安定性。因此，一個無法由免疫檢測HBV表面 20 抗原之分析法所檢測之HBV變異株，其依照本發明，仍然可 以經由HBV表面抗原（HBsAg)基因之一個守恆區域來檢測。 總之，本發明所欲係使用本發明之方法，鑑定HBV基因之變 異區域，該變異區域例如該等產生改變或新的抗原決定區（ 舉例而言，位於HBV表面抗原（HBsAg))。 12 1248515 HBV表面抗原（HBsAg)變異株之參考說明同時包含其他 重疊基因之變異株，該變異株例如DNA聚合酶。 本發明於此部份和其他部份並不受”基因”之辭所限 制，其包含辭彙如”核酸分子編碼”，”核苷酸序列編碼 ”和”基因序列編碼”。

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”基因”一辭之使用係以其最廣泛之辭意，且包含相 對應於一個基因之編碼序列（exon)的cDNA。因此，在本案 對一個”基因”之參考說明是包含： (0—個典型之基因組基因，其包含轉錄及/或轉譯之 調控序列，及/或一個編碼區域，及/或非轉譯序列（即插入 序列（introns)，5’ -和3’ -端之不轉譯序列）；或 (i i)相對應於編碼區域（即編碼序列）之訊息RNA (mRNA)或cDNA和基因之5’ -和3’ -端不轉譯序列。 “基因”一辭亦使用於描述合成或融合之分子，其編 碼所有或部份之一個基因表現的產物。於特定之具體例中 ，”核酸分子”和”基因”可以彼此交替使用。 因此，本發明於另一方面係提供一種，其用於檢測一 樣品中之一個衍生自HBV的核酸標的序列，該方法包含將樣 品置於變性之反應，產生單股之該標的序列，將變性之樣 品與一組引子加在一起，其包含至少兩個引子，其中至少 一個引子能夠與該標的序列之一股進行雜交，且其中至少 另一個引子能夠與第一個提到之一股互補的一股進行雜交 ，且其中該引子可以由其3’端形成一個延伸產物，該產物 與其個別之引子互補，且其中所選擇之引子可與一個區域 J3 1248515 雜交，該區域係相對應或緊臨一個守恆之核酸序列，該核 酸序列為部份或包含於編碼丽表面抗原⑽_)之核酸^ 列中，並且將樣品置於產生擴增反應之條件下，藉此產生 擴增產物，該產物包含互補之延伸產物，且藉此檢測擴增 5絲之存在，其中該擴增產物的存在所代表的是衍生自ΗΒθν . 之核酸標的序列。 一個樣品其普遍但並非絕對是一個生物樣品其包含組 二 織或組織卒取物，流體包含血液或分泌物或任何其他材料 _ ，其可能包含HBV顆粒或HBV DNA，訊息RNA (mRNA)或RNA複 1〇製之中間物。因此，一個首要步驟通常包含自一個哺乳動 物身體分離一個樣品，於一個理想之具體例中，為一個人 體。樣品也可以是一個環境之檢體，或由HBV為可能之污染 源所產生之一個樣品。 • 雖然本發明是特別提供”逃過檢測”之HBV變異株，即 15 抗至少一種型態之HBV表面抗原（HBsAg)之抗體無法產生抗 原抗體反應之變異株。本發明進一步係對HBV基因之任何區 φ 域，該區域於HBV變異株中具守恆性，且特別是臨床相關之 HBV變異株，並以其當做有用之標的序列。HBV基因中特別 有用的區域是該等編碼新的抗原決定基或HBV表面抗原 、20 (HBsAg)。這些區域之用途為產生診斷用途之重組胜肽。 因此，本發明係提供一種方法，該方法是藉由檢測HBV . • 衍生之核酸序列來檢測一個HBV。一個”衍生自HBV”之核 酸序列包含HBV基因本身，相關之單股DNA型態，RNA複製之 中間物，及使用一個逆轉錄酶所製備之單股或雙股cDNA分 14 I248515 子。對於後者，一個衍生自HBV之核酸序列產生之訊息RNA (mRNA)可以進行逆轉錄作用而產生一個互補之單股ΜΑ。該 單股DNA及/或與其互補之DNA可以進行擴增反應。檢測RNA 複製之中間物及/或與衍生自HBv之訊息RNA (mRNA)相對應 5 之⑼从，亦為一個活性病毒複製之指標。

15 任何一種型態之擴增反應皆可用於中，其包含但不限 制是聚合酶鏈鎖反應（PCR)，結合鏈鎖反應，核酸序列為基 礎之擴增反應，Q複製酶為基礎之擴增反應，股置換方法， 繞轉圓形之擴增反應及重複循環特定對偶基因之引子延伸 反應。然而，最理想是應用於PCR。 因此，本發明於另一方面係提供一種，其用於檢測一 木八ϋσ中之一個衍生自HBV的核酸標的序列，該方法選擇性地 包含’將樣品置於逆轉錄反應，產生以HBV衍生之訊息舰 (mRNA)所合成之單股或雙股之⑼财分子，將樣品置於變性 之反應，產生單股之DNA分子，其係相對應於該標的序列， 將.交性之樣品與一組引子加在一起，該一組引子包含至少 兩個引子，其中至少一個引子能夠與該標的序列之一股⑽八 進订雜交，且其中至少另一個引子能夠與第一個提到之一 股互補的一股進行雜交，且其中該引子可以由其3，端形成 一個延伸產物，該產物與其個別之引子互補，並且將樣品 置於產生擴增反應之條件下，藉此產生擴增產物，該產物 包含互補之延伸產物，且藉此檢測擴增產物之存在，其中 。亥擴增產物的存在所代表的是衍生自HBV之核酸標的序列。 個4寸疋之理想的具體例中，引子係選擇自編碼冊'7 15 1248515 表面抗原（HBsAg)之核酸序列。最理想的是，引子是<4〇〇>l [訊息引子]和<4〇〇>2[反訊息引子]。本發明亦涵概之募核 苔酸引子，其與<4〇〇>1和<4〇〇>2有至少約70%近似度，且於 低嚴苛條件張下能夠與<4〇〇>1或<4〇〇>2或<400>1/ <400>2 5 之互補體進行雜交。

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於本案所使用之“近似度”一辭包含，所比較序列之 核苦酸為完全相同。當序列之核苷酸無完全相同時，“近 似度”包含序列間的差異，該差異產生不同之胺基酸而交 互影響其結構，功能，生化及/或構型。於一個特別理想的 具體例中，核酸序列之比較是以相同之程度而非近似度。 用來描述兩個或更多之多核苷酸或多胜肽之間關係的 辭彙包含，”參考序列”，”比較視窗”，”序列近似度 ’’，”序列相同度”，”序列近似度百分比”，”序列相 同度百分比”，”實質上近似，，和，’實質上相同”。一個 ’’參考序列”之長度是至少12，但通常是15至ι8，及通常 是至少25或更多，例如30個單體單元，包括核誓酸和胺基 酸殘基。因為兩個多核苷酸可以個別包含（丨）—個序列（即 只有多核笞酸序列之一部份）該序列是兩個多核苔酸之間 彼此近似的序列’（2 ) —個序列為兩個多核誓酸之間彼此相 異的序列，由”比較視窗”比較兩個多核苷酸之序列，來 確認並比較局部區域之序列近似度。一個”比較視窗，，所 指的典型是12個緊鄰殘基之一個概念性區段，以其_ 故為與 一參考序列之比較。比較視窗與參考序列（其並不含有增添 或刪除）比較下，可以包含約20%或更少之增添或刪除（即缺 16 I248515 口），以使兩序列有最理想之對齊排列。為使排列一個比較 視窗有最理想之序列對齊排列，可以使用電腦化完成之、寅 算法（GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA包含於威斯康辛基因 軟體套組7.0版，Genetics C⑽puter Group，575 Scienc

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Drive Madison，WI，USA)或使用檢視，及所選擇之任何不 同的方法所產生之最佳之對齊排列（即由比較視窗產生最 高之近似百分比）。參考說明亦可提供BLAST家族之程式， 其舉例而言如由Altschul等人所揭露之内容（8)。—個序列 分析之詳細討論可以查閱Ausubel等人所發表之單元19 3。 使用於本案之”序列近似度”和”序列相同度，，，其 辭意所涵概的範疇是，於一個比較視窗内，以一個核苔酸 接核苷酸為基準’具相同之序列或具近似之功能或結構。 因此，舉例而言，一個’’序列相同度百分比”之計算是由 比較視窗内比較兩個最佳化排列之序列，而決定出兩個序 列上有相同核酸驗基（如A，T，C，G，I)之位置的數目，而 產生符合相同之位置的數目，將符合相同之位置的數目除 以比較視窗内之總位置數（即視窗大小），並將結果乘1〇〇， 得到序列相同度百分比。為了本發明之目的，”序列相同 度”將被認定為表示”符合相同之百分比”，其計算是以 DNASIS電腦程式（2· 5版，供微軟視窗使用，可購自軟體公 司 Hitachi Software engineering Co·，Ltd·，South San

Francisco，California，USA)使用如軟體所附之參考手 冊的標準預設值。類似之解說相關應用至，，序列近似度” 17 1248515

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本案對低嚴苛性之參考說明涵概並包含由至少約0-15 %體積/體積之曱醯胺及由至少約1-2莫耳濃度Μ之鹽類做 為沖洗條件。一般而言，低嚴苛性是由約25-35°C至約42t 。溫度可以改變且使用更高之溫度取代曱醯胺且/或產生選 擇性之嚴苛條件。選擇性之嚴苛條件可以使用於需要之處 ，例如中度嚴苛性，其涵概並包含由至少約31-50%體積/體 積之曱醯胺及由至少約0· 01-0· 15M莫耳濃度Μ之鹽類供雜 交反應，及由至少約0. 01-0. 15Μ莫耳濃度Μ之鹽類做為沖洗 條件。一般而言，沖洗是進行於Tm=69. 3+0. 41 (G+C)% (10) 。然而，雙螺旋DNA之Tm隨配對錯誤之數目每增加1%而降低 1°C (11)。甲醯胺於這些雜交反應中是可以選擇的。藉此， 特別理想之嚴苛性的定義如下：低嚴苛性是6 X SSC緩衝液 ，◦. 1%重量/體積之SDS，於25-42°C ; —個中度嚴苛性是2x SSC缓衝液，0. 1%重量/體積之SDS，於20-65°C ;高嚴苛性 是0. 1 X SSC缓衝液，0. 1%重量/體積之SDS，於一個溫度至 少 65°C。 本案對一個”引子”之參考說明，不採任何結構，大 小或功能之限制。引子可以當做一個擴增反應之分子使用 ，或當做探針使用於雜交反應之用途中。引子分子之理想 型態是以一個用於擴增反應之核酸引子。 本案對一個”核酸引子”之參考說明，包含一個去氧 核糖核酸或核糖核酸序列其至少包含3個核苔酸。一般而言 ，核酸引子包含至少約由3-100個核苷酸，理想是由5-50個 核苷酸，且更理想是由5-25個核苷酸。一個引子具有少於 J8 1248515 5

50個核苷酸於本案也可以稱為一個，，募核苷酸弓I子，，。本 發明之引子可以由合成法產生，舉例而言，逐步添加核普 酸或其他核苷酸分子之片段，部份，部份或延伸之產物。 ’’引子”之辭意係指其最普通之含義，其包含任何長度之 核苷酸，當其使用於擴增反應之用途時，其可以提供一個 自由之3’羥基供一個DNA聚合酶催化DM合成之起始。陳八 合成產生引子之延伸，而產生一個引子延伸產物，該產物 與核酸雜交之核酸股彼此互補。 15

·- 20 雜交之引子延伸所產生之一個延伸產物，係以，，擴增 ’’ 一辭包含於本案。擴增反應一般發生於變性-引子雜交一 延伸之循環。本發明包含由約丨個週期至約12〇個週期，理 想是由約2個週期至約70個週期，且更理想是由約5個週期 至約40個週期，其包含約1〇，15，20，25和3〇個週期。 擴增反應之產物（亦稱為一個擴增物）可以由任何方便 之方法k /則。於一個具體例中，擴增反應之產物以電泳分 離，並於溴化乙錠（ethidium bromide)染色後以紫外線觀 察。可選擇地，擴增反應產物可以使用多種不同型態之層 析法解析，例如高壓液相層析法HPLC或光譜法，如 MALDI-T0F和質譜儀。此外，另一個選擇是使用標幟有一個 傳讯分子之引子。以後者而言，引子中的一個引子可以標 幟一個傳訊分子，而引子中的其他引子可以標幟一個捕捉 部分使擴增物固定至一個固體擔體，再經由傳訊之訊號鑑 定擴增物。此具體例之實際操作可藉由一組使用於擴增反 應之引子，或由一個第二組，巢組（nested set)之引子。 】9 1248515 然而，於一個理想之具體例中，只使用一個單組之引子， 此分析法為一個單一步驟之擴增反應分析法。

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-20 因此，本發明於另一方面係提供一種，其用於檢測一 樣品中之一個衍生自HBV的核酸標的序列，該方法選擇性地 包含，將該樣品置於逆轉錄之反應下，使其衍生自HBV之 mRNA(訊息RNA)產生單股或雙股之cDNA分子；將樣品置於變 性之反應下，使其產生單股之DNA分子，該DNA分子與該標 的序列相對應，將變性之樣品與一組引·子加在一起，該一 組引子包含至少兩個引子，其中至少一個引子能夠與該標 的序列之一股DNA進行雜交，且其中至少另一個引子能夠與 第一個提到之一股互補的一股進行雜交，且其中該引子可 以由其3’端形成一個延伸產物，該產物與其個別之引子互 補，其中該引子之一標幟有一個傳訊分子，該分子能夠產 生一個可鑑定之訊號，而其餘之該引子標幟有一個捕捉部 分，將該樣品置於產生擴增反應之條件下，以產生一個擴 增產物，該產物包含互補之延伸產物，其一股具有提供一 個可鑑定訊息之一個傳訊分子，而另一股具有固定至一個 固體擔體之捕捉部分，經由其捕捉部分將擴增反應之產物 固定，然後篩選可鑑定之訊號，所產生之訊號代表擴增反 應之產物，更進而代表衍生自HBV之標的DNA序列。 上述分析法之多種變異方法對熟悉技藝之工作者是易 於明瞭的。舉例而言，擴增反應可以進行於一個試管或微 量分析盤之凹槽中，該等具有一個捕捉分子被固定於管壁 或凹槽内緣。捕捉分子，舉例而言，可以是一個引子，其 20 1248515 5

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20 •能夠與擴增物之一個核酸序列雜交而捕捉該擴增物，或與 其中一個引子之捕捉部分的捕捉分子為互補之一個核酸序 列。選擇性的是，捕捉分子可以是一個DNA結合蛋白質，該 蛋白質能夠專一辨認其中一個引子之捕捉部分。捕捉分子 亦可參與擴增反應。 捕捉分子可以任何一種可行之方法來固定至固相擔體 。固相擔體可以是任何一種結構，其具有一個表面能夠引 發固定一個核酸引子或其他捕捉分子。理想的是，固相擔 體為一個平面狀材料，例如或一個微量分析盤之凹槽底面 或一個插條（dipstick)之截面。 本案中所提供之固相擔體是一般採用之玻璃或一個聚 合物，例如但不限制為纖維素、陶曼材料、頌化纖維素、 聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯及其衍生物、聚偏二氟乙烯 (PVDF)、曱基丙烯酸及其衍生物、聚氯乙烯或聚丙烯。硝 化纖維素是特別好用。一個固相擔體亦可以是一個組合體 ，例如一個硝化纖維素膜片置放於一玻璃或聚合物基質上 。一個”組合體”之參考說明涵概以上文所述兩個或多個 玻璃或聚合物之表面物所構成之一個層體組成物的參考說 明。固相擔體可以是一種型態為膜片、或試管、珠粒、圓 盤或微型圓盤、插條、微量分析盤或其他任何一種適合進 行分析法之表面。 於一個具體例中，固定之核酸經由雜交捕捉到一個標 的核酸分子，且選擇性的參與一個擴增反應。選擇性地， 固定之核酸分子可以捕捉經過擴增反應之核酸分子。 21 1248515 連結核酸分子至固相單體之方法為技藝中所熟知。連 結引子至固相單體之操作原理包含醯胺連結、醯胺化作用 連連結、硫酯連結及添加一個胺基至固相單體上。連結至 固相單體之範例可以於國際專利申請案編號PCT/AU92/ • 5 00587 [W0 93/09250]找到。

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-20 固定之引子可以參與於一個擴增反應中之一個溶液相 的引子。選擇性地，一個”上位的（generic)”之引子被固 定至固相單體，以擴增包含有一個標的序列之核酸分子。 此時再由溶液相之引子來完成標的序列之專一性擴增反應 可以使用該等提供一個可供檢測訊號之標幟物。標幟 物可以與一個特定之核酸分子或核苔酸有關，或者該標幟 物可以連結至一個與一核酸分子或核苔酸實際結合之中間 物。 標幟物可選擇自一群組包含一個呈色劑、一個催化劑 、一個酵素、一個螢光劑、一個生物冷光分子、一個化學 冷光分子、一個L系金屬離子：例如銪（Eu34)，一個放射性 同位素及一個直接可見之標幟物。直接可見之標幟物，其 使用可以利用膠狀金屬或非金屬顆粒狀物、一個染料顆粒 ，一個酵素或一個受質、一個有機聚合物、一個乳膠顆粒 、一個脂質體、或其他囊泡物含有一個產生訊號之物質或 類似物。於美國專利案編號4, 366, 241，4, 843, 000和 4, 849, 338之中揭露的内容有為數不少之酵素適合做為標 幟物使用。使用於本發明之適當的酵素標幟物包含鹼性磷 22 1248515 酸酶、辣根過氧物酶、蟲螢光素酶、半乳糖苔酶，葡萄糖 氧化酶、溶菌酶、蘋果酸酶及類似物。酵素標幟物可以單 獨使用或組合溶液中之第二個酵素。選擇性地，依據本發 明可以使用當做一個適當標幟物的一個螢光團，其包含但 不限制是，螢光素、薔薇紅、德州紅、黃色蟲螢光素或R-藻紅素。

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於另一個具體例中，其中一個引子被固定至一個固態 擔體上，固態擔體例如一個試管或微量分析盤凹槽之管壁 ，而其他之引子則溶於溶液中。溶於溶液中之引子一般是 標幟有一個傳訊分子。於擴增反應之後，一個可檢測之訊 號的出現是代表一個擴增物的存在。 因此，本發明於另一方面係提供一種，其用於檢測一 樣品中之一個衍生自HBV的核酸標的序列，該方法包含將該 樣品置入一個反應容器，該容器具有一個引子被固定至一 個固態擔體，及一個溶於溶液中之第二個引子，其中的兩 個引子皆能夠與衍生自HBV之DNA互補單股上之一段互補核 酸序列做雜交，該雜交區段是位於HBV基因之守恆區域的兩 側或臨近位置，且該溶於溶液中之引子標幟有一個傳訊分 子，其能夠產生一個可判讀之訊號；將反應容器置於一個 產生擴增反應之條件，然後檢測可判讀訊號之存在，該可 判讀訊號之存在所代表的是衍生自HBV之DNA的存在。 於另一個具體例中，本發明使用一系列之引子係對應 HBV基因中之不同的區域，例如HBV基因上的守恆區段或守 恆/變異區段。此方法會特別有用是當HBV需要做”定型” 23 1248515

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20 或當其HBV變異區段需要鑑別時。於一個有用之具體例中， 對應HBV基因中之不同的區域之多種引子被固定至一個固 態擔體，該擔體例如一個微晶片、反應容器壁、插條、載 片或其他基質。引子一般排列成一個矩陣具有特殊定位用 來鑑定引子。然而，”矩陣” 一辭並不做任何一種特定之 次序，且”矩陣”一辭亦可以包含在一個整體排列内隨機 散佈的點。 於任何一種情況下，每一個固定化之引子普遍具有一 個溶於溶液中之第二個引子，其用途是使HBV基因之特定區 域能夠成為擴增反應之標的。溶於溶液中之引子一般帶有 一個能夠產生一個可供鑑定訊號之傳訊分子。藉由擴增反 應，於矩陣定義位置所產生之一個訊號可以被使用來定鑑 定一個特定之HBV。 因此，本發明於另一方面係針對一種，其用於檢測來 自相同或不同HBV病毒品系或變異株之一個或多個衍生自 HBV的核酸標的序列，該方法包含將假定含有單股型態之衍 生自HBV的DNA樣品，與兩個或多個引子加在一起，該兩個 或多個引子以個別或一矩陣排列方式被固定至反應容器之 一個固態擔體上，該反應容器更進而含有溶於溶液中之引 子，其與被固定至固態擔體之引子為共同合作，其中固定 之引子與其溶於溶液中之引子皆能夠於擴增反應條件下擴 增一個衍生自HBV之DNA區域，其中溶於溶液中之引子標幟 有一個傳訊分子，其能夠產生一個可判讀之訊號，於固態 擔體上之一個定義位置有可判讀訊號存在時，即表示鑑定 24 1248515 出—個特定HBV分離物或變異株。 如以上所述，理想之引子如上文所提出之〈400>1和 <4Q〇>2 ’或具有與aooHiaoow至少有約70%近似度之引 子 5 10 15 20 ’及能夠與<4〇〇>1或<400>2或二者之互補體於低張狀態 下雜交之引子。較佳地，這些引子是以化學合成製備，然 而’這些引子亦可由以核酸分子之片段來產生，例如但並

不限制是限制酶切割片段。選擇引子普遍是依循由已知HBV 品系所做之序列對齊排列，該已知HBV品系包含變異株，例 如該等突變位置在HBV表面抗原（HBsAg)之主要親水環上之 變異株。當該等突變位置有大約20個緊鄰之核誓酸顯示為 守恆性時，則挑選該等突變位置做為Ηβν基因之守恆區域的 可選用引子。 因此，本發明尚於另一方面提供一個以兩個或更多募 核苔酸引子所組成之矩陣，其侧定至___體，^ 引子能夠與衍生自_之臟的-個互補核苔酸序列雜交/ 較佳地，該矩陣之型態是以—個生物晶片或其他微矩 !之::微量分析盤凹槽之管壁、載破片、插條或其他適 矩陣分析法可以適用於以電腦裎式分析之方、 法可以檢測出@定之擴增物所產生的^可㈣=號該方 因此，本發明於另一方面提供一個 ~u。 ，其用於檢測或鑑定衍生自HBV之核酸序μ ^ 助方法 W序列，該方法包含· ⑴進行擴增反應之方法，該方法係使用1包. 兩個引子之引子組合’其中至少—個料能夠與該標的^ 25 1248515 列之一股DNA進行雜交，且直中5 ”宁至少另一個引子能夠與第 個提到之一股互補的一股進行雜交丨及 11 數據處理係意指記錄可檢測之訊號。

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：20 於另-方面本發明係提供—個矩陣之使用方法，· 陣列是以下列通式來絲：咖、，具有位於陣上之座標 (卿）’（xw)·.·· (Xny〇，其中咖.1代表相同或不同之臭 核魏，總數為η個寡核《，且每—個寡核I酸能夠以格 柵座標(Xiy])、U2y〇....(Xnyn)來定義，且其中該等寡核苷 酸具有擴增搭擋，該擴增搭擋被定義為匕匕…匕，藉此，出匕 、能夠雜交至HBV-衍生之DNA的互補股，其中插 入DNA包含有一個於兩個或多個肪v變異株（諸如此sAg變異 株）之間係為守恆的核酸序列，其中該矩陣可供用於檢測以 帶有該HBV-衍生之DNA的守恆性擴增區域被定義之特定HBV 試劑。 本發明之引子募核誓酸被使用於連結至一個擴增反應 ’例如標的HBV核酸之聚合酶鏈鎖反應PCR。雖然擴增反應 的方法是技藝中所熟知，如本發明所使用之聚合酶鏈鎖反 應PCR方法上的一些基本資料強調於下文中做為說明之用。 為擴增一個樣品中之一個標的HBV核酸序列，該序列必 須能夠被擴增反應系統之組成物所接受。於聚合酶鏈鎖反 應PCR之前，由樣品中分離HBV標的核酸來達成能夠被擴增 反應系統之組成物所接受。由生物性樣品中萃取核酸分子 之技術已建立好並被廣泛使用（12)。 聚合酶鏈鎖反應PCR之每一個循環的第一個步驟係關 26 1248515

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於分離HBV核酸雙螺旋體，舉例而言，經由加熱樣品於一個 適當之溫度，例如95°C。當雙股分開之後，緊接著下一個 ♦合峰鏈鎖反應PCR之步驟係關於將分開之核酸股與夾在 標的序列兩端之引子雜交。引子雜交後延伸形成標的核酸 股之互補性複製物。對聚合峰鏈鎖反應pcR之擴增反應而言 ，引子之設計是使引子延著一個雙螺旋體序列，於每一個 引子雜交之位置由引子形成延伸產物，當該產物與模板分 離後，該產物當做其他引子延伸之模板使用。變性、雜交 和延伸之循環的次數是由1個循環至12〇個循環，但一般約 35個循環以減低經由聚合酶鏈鎖反應pCR之擴增反應產生 在擴增產物之突變數量。 聚合酶鏈鎖反應PCR之擴增反應中，依賴模板延伸之引 子是以一個聚合試劑催化，於足量之4種去氧核糖核苷三碟 酸酸（一般為dATP，dGTP，dCTP，dTTP)存在於一個反應溶 液係包含適當之鹽類、金屬離子和酸鹼緩衝液系統。適當 之聚合試劑為酵素，該酵素為已知之催化依賴模板之DNA合 成。這些酵素包含Taq聚合酶，一種熱穩定性DNA聚合酶， 其係分離自777enffus aguat/cus及Pfu聚合酶。後者被廣泛 使用於高準確度之擴增反應。聚合酶鏈鎖反應PCR之擴增反 應之操作通常是以一個自動化操作一個熱穩定性酵素。於 此自動化操作中，反應混合物之溫度的循環是經由一個變 性溫度，一個引子黏合溫度和一個延伸反應之溫度。 以實驗測量來避免一個聚合酶鏈鎖反應PCR之擴增反 應，受到其他反應所擴增之核酸及非專一性擴增反應的污 27 1248515 染。為避免來自其他反應之污染，每一個反應混合物包含 適當之鹽類、金屬離子和酸鹼緩衝液系統，足量之4種去氧 核糖核誓三磷酸酸（一般為dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，DNA 聚合酶和引子寡核誓酸，但不包含由生物體樣品分離之病 5 毒標的核酸，將反應混合物置於UV(波長260nm)照射5分鐘 。此預防操作排除擴增反應前之反應混合物中所有可能存 在之雙股DNA分子，且維持單股之引子寡核酶酸和其他前文

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·· 20 該反應混合物的諸成份不變。於另一方面，擴增之病毒標 的核酸的序列分析不僅排除非專一性擴增反應之污染，且 同時決定出擴增產物之特性。尤其是主要親水環上可能性 之突變，該突變使病毒無法由目前所使用之免疫原理診斷 分析法檢測。 因此，本發明包含嶄新之HBV變異株，例如該等依據本 發明之方法所鑑定出來的HBV變異株。 因此’於另一方面本發明係提供一個HBV變異株，_妒 是以分離株之型態，該HBV變異株之鑑定是以一個檢測—個 HBV衍生之核酸標的序列的方法，該方法包含將樣品置於織 性之反應下，使其產生該單股型態之標的序列；將變性之 樣品與一組引子加在一起’該組引子包含至少兩個弓|子 其中至少一個引子能夠與該標的序列雜交，且其中至少另 一個引子能夠與第一個提到之一股互補的一股進行雜六 且其中該引子可以由其3’端形成一個延伸產物，該產物與 其個別之引子互補，將该樣品置於產生擴增反應之條件 ，以產生一個擴增產物，該產物包含互補之延伸產物 、 然 28 1248515 後檢測擴增產物之存在，其中擴增產物的存在代表衍生自 HBV之標的核酸標的序列，此時再分離所檢測出來的刪。 本發明於更進1還提供-種用於鐘定表現性產物（ 例如一個供用作為免疫性標幟物及/或用於產生一個供診 5斷及/或治療使用之免疫球蛋白之胜肽、多胜肽或蛋白質） 之技術手段。

由本發明所鑑定出來的HBV核酸序列，可以被使用於多 種重組表現系統中。此核酸序列可以是守值性或變異性序 列。變異性序列的一個範例為一個變異或新生之Ηβν表面抗 ίο原（HBsAg)的抗原決定基。此表現系統能夠使所欲之基因有 足量之表現，尤其是，基因編碼有HBV表面抗原（HBsAg)或 其變異體。於原核或真核寄主之核酸序列重組表現法已建 立方法，由這些表現的蛋白質來產生對特定HBV表面抗原 (HbsAg)有專一性的免疫球蛋白。 15 於轉形和轉染至哺乳動物、酵母菌或昆蟲細胞之前， 般使用彳示準技術將所欲之病毒序列插入一個適當之載體 。雖然原核生物較佳的使用是用於產生中間物的選殖基因 步驟中，但其可以有效的運用於所欲病毒序列之大量誘導 表現上。 ；20 使用特殊之方法將改變之基因材料引入寄主細胞以表 現病毒序列，該方法並無特別之限定。任何一種已知的方 • 法，用於將外來核酸序列引入寄主細胞皆可以採用。這些 方法包含使用磷酸鈣感染、電穿透、脂質體、質體載體、 病毒載體及其他任何，種已建立之方法，該方法用於將選 29 1248515 5

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20 殖之病毒DNA引入，尤其是該等由本發明所鑑定出來之病毒 DNA，其係於一個待測樣品為具有或無病毒標幟物，且該樣 品能夠或不能夠由免疫原理之診斷測試所檢測。 特定之載體使用來運送基因訊息至細胞，該載體並無 特別之限定。用於真核細胞中供重組蛋白質之表現的任何 一種普通之載體皆可以採用。 表現載體包含一個真核轉錄單元或表現盒，其包含所 有要件係供於真核細胞中表現病毒核酸序列所需。一個典 型之表現盒包含一個啟動子運作上連結至D N A序列編碼一 個病毒蛋白質及一個供轉錄之訊息RNA (mRM)有效產生聚 腺苷合成所需之訊號。 本發明所使用之表現載體一般是含有原核生物序列以 促進於細菌（例如大腸桿菌）内之載體選殖，及一個或多個 真核生物轉錄單元，其表現只限於真核生物細胞内（例如喝 乳動物細胞）。載體可以含有或不含有一個真核生物複製元 。當此複製元存在時，則載體可以使用適當之選擇性標幟 物於真核生物細胞内進行擴增。當載體不包含一個真核生 物複製元時，則epis⑽al擴增為不可能。於此情況下，則 感染之DNA嵌入寄主細胞之基因組，是藉由於表現載體上共 同嵌入哺乳動物之啟動子所驅動之病毒基因表現而達成。 於表現載體引入細胞内部後，該感染之細胞係培養於 有利於病毒蛋白質表現之條件下，且自培養之細胞純化蛋 白質是以標準技術。 多種用於純化蛋白質的標準方法可以使用，例如，舉 30 I248515 例而t 分子大小篩撿層析法及離子交換 °親和性層析法 層析法。 擬對二欲病毒基因編碼之蛋白質外，胜狀其係模 生對㈣專原吻，亦㈣被使用來產 10 15 以使多胜狀或人工合成胜肤其係如上文所討論，可 1方法來產生抗體。免疫球蛋白可錢用於多種 例如’免疫球蛋白可以❹來分析—個待測樣品中 势的存在或純化病毒抗原，舉例而言，使用親和性層 厅去。免疫球蛋白亦可以使用來中和相對應之病毒蛋白質 ’其包含抑㈣體之病毒感染。多㈣術可用於產生及處 理各種不同之免疫球蛋白，可因此而應用來產生免疫球^ 白分子，其用途係供診斷及檢測待測樣品中特定之Ηβν病毒 株，該HBV病毒株可以有或無展示病毒標幟物，且其可以或 無法由免疫原理之診斷測試法所檢測出來。 專一性結合至所欲HBV病毒株之抗原決定基的抗體，可 • 以經由多種方法產生。非人體（例如：老鼠）之單株抗體的 產生已為熟知，且可經由以一個製備之含有病毒或一個與 病毒有關之片段來免疫動物。得自免疫動物所產生抗體之 I 20 細胞，係使用標準技術使其癌細胞化並做筛選。 如上文所述而產生之免疫球蛋白可以使用於多種診斷 分析法’其檢測待測樣品中HBV病毒株之存在，該耶y病毒 株可以有或無展示病毒標幟物，且其可以或無法由免疫原 理之診斷測試法所檢測出來。例如，標幟之免疫球蛋白可 31 1248515 以使用於分析法，其包含將免疫球蛋白與疑含有HBV病毒株 之一個待測樣品加在一起，該樣品之HBV病毒株可以有或無 展示病毒標幟物，且其可以或無法由免疫原理之診斷測試 法所檢測出來，且檢測是否形成一個複合體。多種標幟物 • 5 可以使用來偶合至免疫球蛋白上。一個常用之檢測方法是 . 使用以1251或35S之自動放射性分析法。非放射性標幟物亦可

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20 以使用。此種標幟物包含化學冷光試劑或酵素。這些非放 射性標幟物通常是以間接之方法連結。一般而言，一個配 位基分子（例如生物素）是以共價鍵結合至分子上。配位基 再與抗配位基[例如鏈黴抗生物素（stretavidin)]分子結 合，其係具備有可檢測或共價結合之一個訊號系統，例如 一個可檢測之酵素、一個螢光化合物或一個化學冷光化合 物0 該分子亦能夠直接共軛結合產生訊號之化合物，例如 結合一個酵素。戶斤採用當做標幟物的酵素可以是磷酸酶或 過氧化酶。 為檢測複合物之存在，將混合物與一個蛋白質加在一 起，該蛋白質係能夠結合免疫球蛋白之固定區域（Fc區域） ，例如一個二級抗體，蛋白質A或蛋白質G。理想上，蛋白 質是固定至一個固體表面，且該固體表面以沖洗移除未結 合之免疫球蛋白，該免疫球蛋白係對所欲之病毒有專一性 。許多用於固定生物分子之方法皆可以使用。例如，固體 表面可以是一個膜體（例如确化纖維素），一個微量分析盤（ 例如聚苯乙稀）或一個珠粒。所欲之成份可以共價結合或藉 32 1248515 由非專一性結合產生之非共價連結。固定至一個固體表面 之後，再使用標準方法進行標幟。 5

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以重組化表現及純化之病毒蛋白質或病毒溶解物亦可 用於診斷方法。這些方法一般包含將一個疑含有抗體之生 物性樣品（例如血清）與HBV力α在一起，然後檢測免疫性反應 。此免疫性反應最佳地檢測是使用如上文所描述之標幟蛋 白質。 因此，本發明之方法係有用於鑑定HBV基因之守恆區域 ，該區域可以是HBV蛋白質上的守恆區域，例如HBV表面抗 原（HBsAg)。本發明之方法亦可鑑定變異區域。其結果是， 胜肽、多胜肽及相當於守恆區域之蛋白質皆可用來當做疫 苗成份及用於診斷測試。類似地，胜肽、多胜肽及相當於 變異區域之蛋白質皆可用於對特定HBV變異株有專一性之 疫苗或用做診斷試劑。 因此，本發明係提供一個重組或化學合成之胜肽，多 胜肽或蛋白質或該等之衍生物、該等之同型或近似化合物 ，其所包含之一個胺基酸序列，係含有在兩個或更多之HBV 分離株或來自HBV野生型變異體當中為守恆性的一個胺基 酸序列。對一個HBV野生型之認定為包含有一個由HBV基因 型E和A至基因型F的組成、或相同之核苷酸、或胺基酸序列 (13)。 一個”衍生物”包含一份、部份、片段、區段或區域 之多胜肽，該多胜肽包含一個單一或多重之胺基酸取代、 添加及/或刪除。簡要而言，一個胜肽及蛋白質均包含於” • 20 1248515 多胜肽”之辭意内。 本發明涉及所欲之主題多胜肽的化學性類似物，其包 含該等於支鏈做改變、及/或該等有非天然性胺基酸併人之 多胜肽。對於當做診斷試劑或用於治療而言，此種化學性 修改或合成之多胜肽的類似物其安定性可能更佳。

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20 本發明所提出之支鏈修改的範例包含··胺基之修改， 例如：還原性烷基化反應係由與一個醛類作用並以NaBH4還 原而產生；以曱基乙醯亞胺產生醯胺化反應；以醋酸酐產 生乙醯化反應；以氰酸產生胺基之胺曱醯基化反應；以 2, 4, 6,三硝基苯磺酸（TNBS)產生胺基之三硝基苯化反應； 以琥珀酸酐和四氫肽酸酐產生胺基之乙醯化反應及以5-磷 酸吡哆醛作用並以NaBH4還原而產生離胺酸之吡哆醛化反 應0 精胺酸殘基之胺基曱脒基其修改可以經由與試劑：例 如2, 3-丁二酮、苯基乙二醛及乙二醛之反應形成異雜環之 知百合產物而產生。 羧基之修改可以經由氧-乙醯異尿素形成之碳二醯胺 的活化，再產生接續之衍生反應，舉例而言，衍生為一個 相對應之醯胺。 氫硫基之改變可以經由之方法，例如：以鏘乙酸或碘 乙醯胺產生之羧甲基化反應；半胱胺酸之過甲酸氧化反應 ;以其他之硫醇化合物形成之一種混合的雙硫化物；與順一 丁稀二醯亞胺、順—丁烯二酸酐或其他取代之順_ 丁炸一 && 亞胺之反應；使用4-氯化汞苯曱酸、4-氯化汞苯磺酸、氯 34 1248515 化苯基汞、2-氯汞-4-硝基酚及其他汞化物形成之汞的衍生 物；於鹼性酸鹼值下，以氰酸產生胺基之胺曱醯基化反應

對於色胺酸殘基之修改，舉例而言，可以經由N-溴琥 珀醯亞胺產生氧化反應，或以溴化2-羥基-5-硝基苯或硫苯 基鹵化物，使σ弓丨嗓環產生烧基化。於另一方面，酷胺酸殘 基之修改，可以四硝基甲烷進行硝化作用以產生一個3-硝 基酪胺酸衍生物。 組織胺酸之咪唑環的修改，可以藉由吲哚乙酸衍生物 之烷基化反應，或藉由焦碳酸二乙酯之Ν-乙氧羰基化反應 於胜肽合成當中，併入非天然性胺基酸和衍生物之範 例，包含但不限制，使用正白胺酸、4-胺基丁酸、4-胺基 * ' -3-羥基-5-苯基戊酸、6-胺基己酸、t-丁基甘胺酸、正纈 15 胺酸、苯基甘胺酸、鳥胺酸、sarcosine、4-胺基-3-羥基 -6-曱基庚酸、2-噻吩基-苯基甘胺酸、及/或胺胺基酸之D ^ φ 型-異構物。於表1顯示本案引用之非天然性胺基酸的一覽 表0 35 1248515

表1 非一般丨生胺基酸 代石馬 非一般性胺基酸 代石馬 α-胺基丁酸 Abu L - N-曱基丙胺酸 Nmala α-胺基-丁酸曱酯 Mgabu L-N-曱基精胺酸 Nmarg 羧酸胺基環丙酯 Cpro L-N-曱基天冬酸胺酸 Nmasn 胺基異丁酸 Aib L-N-甲基天冬胺酸 Nmasp 羧酸胺基正冰片酯 Norb L-N-甲基半胱胺酸 Nmcys 環己烷丙胺酸 Chexa L-N-甲基麵胺酸胺酸 Nmgln 環戍烷丙胺酸 Cpen L-N-甲基麩胺酸 Nmglu D-丙胺酸 Dal L-N-甲基組織胺酸 Nmhis D-精胺酸 Darg L - N-曱基異亮胺酸 Nmile D-天冬胺酸 Dasp L_N-甲基白胺酸 Nmleu D-半胱胺酸 Dcys L - N-曱基離胺酸 Nmlys 0-麩胺_安酸 Dgln L-N-曱基曱硫胺酸 Nminet D_麩胺酸 Dglu L-N-曱基正白胺酸 Nmnle D-組織胺酸 Dhis L_n_甲基正離胺酸 Nmnva D-異亮胺酸 Dile L - N-甲基烏胺酸 Nmorn D-白胺酸 Dleu L-N-甲基苯丙胺酸 Nmphe D-離胺酸 Dlys L-N-曱基脯胺酸 Nmpro D-曱硫胺酸 Dmet L-N-甲基絲胺酸 Nmser D-鳥胺酸 Dorn L - N-甲基穌胺酸 Nmthr D-苯丙胺酸 Dphe L-N-甲基色胺酸 Nmtrp D-脯胺酸 Dpro L-N-甲基酪胺酸 Nmtyr D-絲胺酸 Dser L-N-甲基纈胺酸 Nmval D-酥胺酸 Dthr L-N-甲基乙基甘胺酸 Nmetg D-色胺酸 Dtrp L-N-曱基-t-丁基甘胺酸Nmtbug D-酪胺酸 Dtyr L-正白胺酸 Nle D-纈胺酸 Dval L-正纈胺酸 Nva D-α-甲基丙胺酸 Dmala α -胺基異丁酸曱酯 Maib D-a-甲基精胺酸 Dmarg 1胺基丁酸-α-甲酯 Mgabu D-a-曱基天冬胺酸 Dmasn α-曱基環己烷丙胺酸 Mchexa D-a-曱基天冬醢胺酸 Dmasp α-曱基環戊烷丙胺酸 Mcpen D-α-曱基半胱胺酸 Dmcys oc-曱基-α基丙胺酸 Manap D - oc-麵藤胺酸 Dmgln α-曱基青黴素胺 Mpen D-a-組織胺酸 Dinhis Ν-(4-胺基丁基)甘胺酸 Nglu D-a-異亮胺酸 Dmile Ν- (2-胺基乙基)甘胺酸 Naeg D-cx-白胺酸 Dmleu Ν - (3-胺基丙基)甘胺酸 Norn D -離胺酸 Dinlys Ν-胺.基-α-丁酸曱酯 Nmaabu D-曱硫胺酸 Dmiiiet α-乃基丙胺酸 Anap 36 1248515 D-鳥胺酸 Draorn D-苯丙胺酸 Dmphe D -脯胺酸 Dmpro D-絲胺酸 Dmser D-酥胺酸 Dmthr D-色胺酸 Dmtrp D -酷胺酸 Dmty D-線胺酸 Dinval D-N-曱基丙胺酸 Dnmala D-N-甲基精胺酸 Dnmarg D- N-曱基天冬醯胺酸 Dnmasn D - N-曱基天冬胺酸 Dnmasp D-N-曱基半胱胺酸 Dnmcys D-N -曱基麵醢胺酸 Dnmgln D - N-曱基楚胺酸 Dnmglu D-N-曱基組織胺酸 Dnmhis D-N-曱基異亮胺酸 Dnmile D- N-曱基白胺酸 Dnmleu D_N-甲基離胺酸 Dnmlys D-N-曱基環己基丙胺酸Nmchexa D- N-曱基鳥胺酸 Dnmom D-N-曱基丙胺酸 Nala N-曱基胺基異丁酸 Nmaib N-(l-曱基丙基)甘胺酸Nile N-(2-曱基丙基)甘胺酸Nleu D-N-曱基色胺酸 Dnmtrp D-N-甲基酪胺酸 Dnmtyr D-N-甲基綠胺酸 Dnmval 讪-胺基丁酸 Gabu L_t-丁基甘胺酸 Tbug L-t-乙基甘胺酸 Etg L-同苯基丙胺酸 Hphe L - α-曱基精胺酸 Marg L-α-曱基天冬胺酸 Masp L - α-甲基半胱胺酸 Mcys L-a-曱基麩胺驢胺酸 Mgln L-a-甲基組織胺酸 Mhis L - α-曱基異亮胺酸 Mile L-a-甲基白胺酸 Mien

2-一本基乙基）甘胺池恤 ^(3, 3一一本基丙基)甘胺Nbhe I苯基甘胺酸 Nphe 1(2-胺基曱醯乙基)甘胺Ngln N:(胺基曱醯乙基)甘胺酸Nasn N - (2-叛基曱基)甘胺酸 Nglu 1H羧基曱基)甘胺酸 Nasp N-環丁基甘胺酸 Ncbut N-環庚基甘胺酸 Nchep N -環己基甘胺酸 Nchex Μ-環癸基甘胺酸 Ncdec N-環十二烧基甘胺酸 Ncdod N -環辛基甘胺酸 Ncoct N-環丙基甘胺酸 Ncpro 環十一烧基甘胺酸 Ncund 1H3-胍基丙基)甘胺酸 Narg N-(l-羥基乙基)甘胺酸 Nthr N-(經基乙基)甘胺酸 Nser N- (咪唑基乙基)甘胺酸他匕 N-(3-吲嗓基乙基)甘胺酸池士卬 α-胺基丁酸-N-甲S旨 Nmgabu D~N-曱基甲硫胺酸 Dnmmet N-曱基環戊基丙胺酸 Nmcpen D - N-甲基苯基丙胺酸 Dnmphe

D- N-甲基脯胺酸 DnmpiO D~N-甲基絲胺酸 Dnmser ΙΗί-曱基跡胺酸 Dnmthr 1H1-曱基乙基)甘胺酸 Nvai N-甲基3基丙胺酸 Nmanap N-甲基青彳致素胺 Nmpen N- (對-經基笨基)甘胺酸他tyr N - (ϋι曱基)甘胺酸 Ncys 青黴素胺 pen L - α-曱基丙胺酸 Mala L-α-甲基天冬酿胺酸 Masn L-α-甲基一卜丁基甘胺酸Mi：bug L-甲基乙基甘胺酸 Metg L-a-曱基麵胺酸 Mgiu L - a-甲基同笨丙胺酸 Mlphe 37 1248515 L-a-曱基曱硫胺酸 Mmet L - a-曱基苯丙胺酸 Mphe L-a-曱基絲胺酸 Mser L-a-甲基色胺酸 Mtrp L-a-曱基纈胺酸 Mral !^-(.(2,2-二苯基乙基此1*111

Nmet Mlys Mnle Morn Mpro Mthr Mtyr 产每曱拳：)甘胺酸 羧基-1 -(2, 2-二笨基 Nmbc A基胺基)環雨校 曱基硫乙基)甘胺酸 L-α-曱基離胺酸 曱基正白胺酸 〜曱基鳥胺酸 曱基脯胺酸 L：a：?|||| ”

5 10 本勒明之多胜肽可以用於抗—麵V或-麵v變異株 的製製藥_物除了包含主要之多胜狀外， 亦同時包含製藥可接受之制及/或稀釋劑。 製樂可接受之載體及/或稀釋劑包含任何—種或所有 之溶劑、分散之基質、裹覆物質、抗細菌和抗真菌之試劑 、寺張性及延緩吸收之試劑、及類似物。為了製藥活性物 質而使用料基質及試劑為技藝中所熟知。惟對於目前_ 般所使狀基質或_與純成份抑容者，抑所使用 之製藥組成物。補充性的活性成份亦可加人組成物中。

如以上所述，本發明進一步涉及的是抗主題多胜肽的 抗體。此抗體可从單株或多株抗體。此抗體之用途是用 於治療或診斷分析法。 本發明於另一方面係提供一種，其用於檢測一個生物 中的—個順病毒，該方法包含將該生物性樣品與— 個專一性抗HBV病毒或抗HBV病毒變異株之抗體加在一起， 置放奴犄間於足夠一個抗體—Ηβν複合體形成之反應條件 下’然後檢測該複合體。 Ύ以由任何一種方法檢測冊γ之存在，該方法例如西方 38 1248515 墨潰法及酵素免疫分析法ELISA。可供利用之一個廣範圍之 免疫分析法技術係詳見於美國專利案編號4, 016, 043， 4, 424, 279及4, 018, 653。這些專利案包含非競爭性型態之 單一位置和雙位置或”三明治”分析法，及傳統之競爭性 結合分析法。這些分析法亦包含將一個標幟抗體直接結合 至標的物。

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20 三明治分析法是最有用途且常用之分析法，其亦為本 發明之理想的使用分析法。有多種變化性的三明治分析法 存在，且皆為本發明所函概。簡要而言，於一個典型之分 析法中，一個未標幟之抗體被固定至一個固態受質上，然 後將待測樣品與固定之抗體分子加在一起。於一段適當時 間的培養後，即一段時間足以使一個抗體-抗原複合物形成 ，一個對抗原有專一性的第二種抗體，其標幟有一個報導 者分子而能夠產生一個可檢測訊息，於此時加入培養，培 養時間為足以使另一個抗體-抗原-標幟之抗體複合物形成 。任何未結合之反應物皆被沖洗掉，抗原之存在是以觀察 由報導者分子產生之一個訊息而決定。結果可以做定性， 其係由可見之訊息的簡易性觀察，或可以做定量，其係由 比較一個包含有已知量肝素的控制組樣品而得。所進行之 分析法的變異包含一個近似之分析法，於該分析法中樣品 與標幟之抗體兩者同時加入至結合之抗體。這些技術為該 等技藝中所熟知，其包含任何一種微細之改變，將視如明 顯之改變。依照本發明，樣品係為一個包含有一個HBV或一 個HBV-衍生之多胜肽的一個細胞萃取物、組織或血清、唾 39 1248515 液、黏膜分泌物、淋巴、組織液及呼吸道液體。因此，樣 品一般為一個生物性樣品，其包含生物性液體，但其亦函 概發酵液體及上清液：例如來自一個細胞培養之上清液。

15

20 於一個典型之三明治分析法中，一個具有對HBV或其抗 原決定基有專一性的第一抗體，以共價或被動地結合至一 個固體表面。一般的固體表面為玻璃或一個聚合物，最常 使用的聚合物是纖維素、聚丙烯醯胺、奈龍、聚苯乙烯、 聚乙烯氯或聚丙烯。固態擔體的型態可以是試管、珠粒、 微量分析盤之圓底槽、或任何一種適合進行免疫分析之表 面。結合之方式為技藝中所熟知，且一般多以共價結合形 成之交錯連結或物理性吸附，清洗聚合物-抗體之錯合物以 供待測樣品使用。加入待測樣品之一定量分液至固態錯合 物，並培養足夠之一段時間（例如：2-40分鐘或隔夜視其方 便）且於適當之條件下（例如：由室溫至約37°C，例如：約 25°C)，以結合至任何一個抗體所具有之次單位。於培養之 後，固相化之抗體結合部位沖洗並乾燥，然後與一個具半 抗原專一性的第二抗體一起培養。第二抗體連結有報導者 分子，其用途是顯示第二抗體與半體之結合。 一個可選擇之方法是涉及固定生物性樣品中之標的分 子，然後將固定之標的物暴露給專一性抗體，該專一性抗 體可以有標幟或沒有標幟一個報導者分子。視標的物和報 導者分子訊號之強弱，可以經由直接標幟抗體而檢測出一 個結合之標的物。 可選擇性地，一個標幟之第二抗體，其係對第一抗體 40 1248515 有專一性，被暴露至標的物-第一抗體錯合物而形成一個標 的物-第一抗體-第二抗體之三級錯合物。此錯合物之檢測 是經由報導者分子所散發的訊號。

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20 所謂”報導者分子”，如本案所使用，係意指一個分 子，其以化學特性而言，提供一個分析性可鑑別之訊號， 藉由該訊號可以檢測到與抗原結合之抗體。此檢測可以是 定性或定量檢測。於此種型態之分析法中，最常使用之報 導者分子是酵素、螢光團或含有放射性分子（即放射性同位 素）及化學冷光分子。 於酵素免疫分析法的個例中，一個酵素被軛合至第二 抗體，一般是經由戊二酿或過碳酸作用。然而，誠如易於 確認地，有多種不同之軛合技術可供技術人員採用。常用 之酵素包含辣根（horseradish)過氧化酶、葡萄糖氧化酶、 -半乳糖酶及鹼性磷酸酶。特定酵素所使用之受質的選擇， 通常係依相對之酵素水解所產生之一個可檢測之顏色變化 。適當之酵素的範例包含驗性碌酸酶及過氧化酶。也有可 能會使用產生螢光之受質，其產生一個螢光產物而非前文 該發色性受質。於所有之個例中，酵素標幟之抗體被添加 至第一抗體含半體之錯合物，令其結合後，將多餘之試劑 沖洗掉。於此時，將一個含有適當量受質之溶液添加至抗 體-抗原-抗體錯合物。受質會與結合至第二抗體之酵素結 合，產生一個定性可視之訊號，該訊號可以進一步定量， 通常是以光譜儀方法，來產生一個樣品中半體量的顯示。 ”報導者分子”亦涉及使用於細胞凝集反應或抑制凝集反 4] 1248515 應，例如：乳膠珠粒及類似物上之紅血球細胞。 可、擇1·生地，赏光化合物，例如勞光素和若單明 (r—)，可以化學方法偶合至抗體上， 其結合能力。當藉由一特定光波長照射激發時，螢光染料 • 5標幡之抗體吸收光的能量，其包含一個分子内之激發態’ .再經由光發散出一個特定顏色，可以—個光學顯微鏡視察 如同酵素免疫分析法（_，勞光染料標幟之抗體可 ·· 半體錯合物結合。於沖洗未結合之試劑後， • 訂來的三級錯合物於此時暴露至―個適當的光波長下， 10觀測到的勞光代表欲測之半體的存在。免疫營光法與酵素 免疫分析法（EIA)技術二者均為技藝中已建立良好’且為本 .發明方法所特別理想。然而，其他報導者分子，例如放射 性同位素、化學冷光或生物冷光分子，亦可以使用。 • I發明更進—步是以下列非限制性範例做描述說明。 15 範例1 於高度抗.但對表面抗原為負反應之新加坡成人及 參接種疫苗之嬰幼兒中檢測和鑑定_表面抗原突變株 於對HBV表面抗原⑽sAg)為負反應之新加坡成人及接 ^ 種疫苗之嬰幼兒中，調查腳醜之存在，係使用本發明所 .20提供之引子寡核㈣進行聚合_鎖反應（pgr)擴增反應 。63個成人及15個接種疫苗之嬰幼兒（年齡小於15歲，且接 . 種的是重組式疫苗）係來自不同之種族群體，這些人係選擇 自經由4種獨立不同之免疫診斷套組測試為Ηβν表面抗原 (HBsAg)陰性反應者（表2)。這些人皆為對昍ν核心抗原（抗 42 1248515 -HBc)之所有的抗體（Corzyme，Abbott Laboratories，USA) 有正反應。這些人皆為對抗—HBs (Ausab，Abbott

Laboratories，_USA)有正反應。抽取自100 μΐ血清之DM 係以蛋白酶K處理，再以氯仿/酚萃取及酒精沉澱。本發明

所提供之券核答酸係與pfu DNA聚合酶（Stratagene，USA) 作用於聚合酶鏈鎖反應（PCR)擴增反應中。擴增反應進行 35個周期，每一個周期包含變性於94°C下（1分鐘）、黏合於 50°C下（2分鐘）及延長反應於73°C下（3分鐘）。結果顯示15 名嬰幼兒中有3名（20%)及63名成人中有8名（13%)的HBV DNA 可以被本發明所提供之引子寡核菩酸所擴增。與本發明人 之前的報導··由對HBV表面抗原（HBsAg)為陽性反應且接種 過疫苗之新加坡嬰幼兒中檢測Η B V表面抗原（Η B s A g)之突變 株相比較下，本案由HBV表面抗原（HBsAg)為陰性反應之嬰 幼兒中，鑑定HBV表面抗原（HBsAg)突變株呈現一個相當明 15顯的區別。接種過疫苗之嬰幼兒的所有血清檢體HBVDNA皆 可以被本發明所提供之引子寡核苔酸所擴增。

20 經擴增後之DNA片段進行直接定序後顯示此等血清檢 體中MHR之多點位置有突變（表2)。這些突變包含最常見之 疫苗缺失G145R，其發生於6個血清檢體中。本案亦有3個血 清檢體為G130D突變（表2)，該突變於最近被發現與 lamivudine治療有關。此外，於4個血清檢體中鑑定出T131N 突變。該突變並不像報導之基因型相關之713謂突變常於 HBV表面抗原（HbsAg)上帶有一個共同之τι 14S突變，使用本 發明提供之引子寡核苷酸所鑑定出來的丁131N突變於殘基 43 1248515 位置114具有一個野生型S(絲胺酸)。由此差異反推出變異 株巧·能因此而逃過檢測。

該等熟諳技藝之技術人員將喜愛本發明的描述，因其 相較於其他專一性描述而言，容許有變異和修改。也因此 而可理解的是本發明包含所有函概性的變異和修改。本f 明亦包含所有之步驟、特性、組成物和化合物，其係以其 專一性、分別地或集合地指稱或指明，及任何一種與所有 之任何兩種或更多的該步驟或特性之組合。 C圖式簡單説明：！ 圖式簡單說明 第1圖是一圖表結果顯示HBV表面抗原之結構組成。（a) 主要之親水環的位置覆蓋守恒之” a”決定區（摘要自Chen et al· (7))。HBV表面抗原（HbsAg)全長之大小以胺基酸殘 基 1-400編列。？^81(1_118)，？^32(119-174)和主要之册¥ 15 表面抗原（HbsAg)(175-400)的位置指示於長條圖下方。主

要之親水環的位置與HBV表面抗原（HbsAg)全長之關係亦同 時指出。於主要HBV表面抗原（SHbsAg)之中的主要親水環位 置是由胺基酸100至160，且守恆之” a”決定區於主要HBV 表面抗原（SHbsAg)之中是由胺基酸124至147。（B)主要HBV 20 表面抗原（SHbsAg)之編碼區域於基因所在的位置。5’和 3’端編碼區域之位置指示於長條圖下方（分別為HBV基因 之nt 156和835，位置1定義為野生型HBV(基因庫登錄號碼 Z35717)之EcoRI位置-GAATTC之第1個A核苷酸）。於本發明 所提供之引子寡核苷酸的位置（<4.00>1和<400>2)亦同時指 44 1248515

15

示於長條圖下方（分別由HBV基因之nt 456和689開始）。使 用本發明所提供之引子募核菩酸（<4〇〇>1和<400>2)經由 PCR擴增之DNA片段的大小是233對鹼基（bp)，如指示於長條 圖下方。 5 弟2圖為一張照片結果顯示測試樣品經由PCR擴增之 HBV片段的電泳圖，由免疫分析法之診斷套組測試hbv表面 抗原（HBsAg)為陰性反應，但測試抗HBc和抗HBs為陽性反 應，所使用的是本發明所提供之引子寡核苷酸〈<4〇〇>1和 <400>2)。於第4道電泳線指示的是分子大小標幟之移動位 10置（l〇〇bp(鹼基對）之階梯，MBI Fermentas)。第1道電泳 線對應的是表1之第1個測試樣品；第2道電泳線對應的是表 1之第2個測試樣品；第6和第9道電泳線分別對應的是表 第3和第4個測試樣品。於第3、5、7和8道電泳線看不到擴 增產物，其表示測試樣品顯現近似之病毒標幟（測試HBV表 面抗原（HBsAg)為陰性反應，但測試抗HBc和抗HBs為陽性反 應）。 【主要元件符號說明】 無 45 1248515 參考書目 1. Carman et al., Gastroenterology 102:711-719,1992. 2. Carman et al. Lancet 336:325-329, 1990. 3. Okamoto et al. Paediatric Research 32:264-268, 1992. 4. McMahon et al. Hepatology 15:757-766, 1992. 5. Fujii et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:1152-1157, 1992.

6. Harrison et al. J. Hepatol. 13:5105-5107, 1991. 7. Chen et al. FEBS Lett. 453:237-242, 1999. 8. Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997. 9. Ausubel et al·, "Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15. 10. Bonner and Laskey Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974. 11. Marmur and Doty J. Mol. Biol. 5: 109, 1962. 12. Oon et al. Vaccine 13:699-702, 1999. 1248515

K3 * 病患 女性/60燁人 男性/9個月库人 女性/3/華人 ： 男性/10個月/馬來人 丨側/年齡(歲)纖 1 1 1 1 > S S|l ύ\ gDg > es 1 1 1 1 1 1 1 1 〇 1 1 1 1 Ό + + + + 抗-HBc 免疫球蛋白G 72.0 3150.0 14.0 ON 抗-HBs 1 1 1 1 抗-HAV i免疫球蛋白G 1 1 1 1 抗HCF 1 • 1 • 抗-HEV 免疫球蛋白G T131N G145 T131N, G145 G130D, M133T, G145R HBV麵麵 之突變型 »2 sv^aJ^^SAg)-歷sjt-sc-變4;^gn^^AMms!^3e&SJi 陳HiivHBV»§1gtil;{HBSAg)^)i 1248515 序列表 <110〉溫崇仁 <120〉檢驗分析 <130> 2269257/EJH <140〉 <141> <160〉 3

<170> Patentln Ver. 2. 1 <210〉 1 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400〉 1 caaggtatgt tgcccgtttg t <210〉 2 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400〉 2 tggctcagtt tactagtgcc att 1248515 <210〉 3 <211〉 6 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 3 gaattc

Claims (1)

1. 1248515 拾、申請專利範圍： 第94100468號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：94年9月

   1 · 一種用於偵測HBV之陣列，其中該陣列包含兩個或多個 被固定至一個固態擔體上之寡核苷酸引子，該等引子能 夠雜交至一個來自於HBV-衍生之DNA的互補核苷酸序 列，其中該等引子係選自於序列辨識編號第1號 (5，-CAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3，）或序歹ij 辨識編號第 2 E(5，-TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATT-3，）。 2.如申請專利範圍第1項之陣列，其中該陣列是以下列通 式來定義：aja^..an，具有位於陣上之座標 (Xiyi)，(X2y2)....(xnyn)，其中代表相同或不同之 引子，總數為η個引子，且每一個寡核苷酸能夠以格柵 座標（xiyi)、（X2y2)....(xnyn)來定義，且其中該等引子具 有擴增搭擋，該擴增搭擋被定義為1^ΐ32...1)η，藉此，引 子、a2b2....anbn能夠雜交至HBV-衍生之DNA的互補 股’其中插入DNA包含有一個於兩個或多個HBV變異 株（諸如HBsAg變異株）之間係為守恆的核苷酸序列，其 中該矩陣可供用於檢測以帶有該HBV-衍生之DNA的守 恆性擴增區域被定義之特定HBV試劑。 -50-