RS65535B1 - Kompozicije i postupci za smanjenje ekspresije tau - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotide, njihove kompozicije i upotrebu za smanjenje ekspresije tau iRNK i proteina kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovi antisens oligonukleotidi, njihove kompozicije i upotrebe su korisni za lečenje bolesti povezanih sa tau.

POZADINA

[0002] Tau je protein povezan sa mikrotubulama koji stabilizuje mikrotubule i olakšava aksonski transport. Tau protein interaguje sa tubulinom kako bi stabilizovao mikrotubule i podstakao spajanje tubulina u mikrotubule. Mreža mikrotubula učestvuje u brojnim značajnim ćelijskim procesima, uključujući nastanak citoskeleta i održavanje strukture i morfologije ćelije, i obezbeđivanje platforme za intracelularni transport vezikula, organela i makromolekula. Pošto vezivanje tau proteina za mikrotubule stabilizuje mikrotubule, tau je ključni medijator ovih ćelijskih procesa.

[0003] U ljudskom mozgu postoji najmanje šest izooblika tau proteina, sa dužinom u rasponu od 352-441 aminokiselina. Izooblici tau proteina su dobijeni od jednog gena MAPT (tau protein povezan sa mikrotubulama, microtubule-associated protein tau) koji je lociran na hromozomu 17. Transkript MAPT podleže složenom, regulisanom alternativnom splajsovanju, što daje više vrsta iRNK. Egzoni 2 i 3 MAPT kodiraju sekvencu od 29, odnosno 58 aminokiselina, te tako alternativno splajsovanje egzona 2 i/ili 3 dovodi do uključivanja nula, jedne ili dve kopije N-terminalnog domena od 29 aminokiselina, što se označava sa 0N, 1N, odnosno 2N tau. Egzon 10 MAPT kodira domen vezivanja mikrotubula, te uključivanje egzona 10 dovodi do prisustva dodatnog domena vezivanja mikrotubula. Pošto u tau proteinu pored toga postoje tri domena vezivanja mikrotubula, izooblici tau koji uključuju egzon 10 se nazivaju „4R tau“, što označava tau protein sa četiri ponavljanja domena vezivanja mikrotubula. Izooblici tau proteina bez egzona 10 se nazivaju „3R tau“, što označava tau protein sa tri ponavljanja domena vezivanja mikrotubula. Pretpostavka je da izooblici 4R tau vezuju mikrotubule bolje nego izooblici 3R tau jer imaju jedan domen vezivanja mikrotubula više. Odnos 3R tau prema 4R tau je regulisan tokom razvoja, gde tkiva fetusa eksprimiraju isključivo 3R tau, a tkiva odraslog čoveka eksprimiraju približno jednake nivoe 3R tau i 4R tau.

[0004] Tau je fosfoprotein sa približno 85 potencijalnih mesta fosforilacije (Ser, Thr ili Tyr) na najdužem izoobliku tau proteina (Pedersen i Sigurdsson, Trends in Molecular Medicine 2015, 21 (6): 394). Fosforilacija je prijavljena na približno pola ovih mesta kod normalnih tau proteina. Tau se dinamički fosforiluje i defosforiluje tokom ćelijskog ciklusa. Tau može da se vezuje sa mikrotubulama samo u svom defosforilovanom obliku, te tako fosforilacija tau deluje kao direktan prekidač u neuronu za asocijaciju-disocijaciju mikrotubula. U patološkim uslovima, tau protein postaje hiperfosforilovan, što dovodi do smanjenog vezivanja tubulina i destabilizacije mikrotubula, nakon čega sledi agregacija i taloženje tau proteina u patogenim neurofibrilarnim čvorovima. U neurofibrilarnim čvorovima su takođe otkriveni fragmenti tau za cepanje proteaze (Asp 13, Glu391 i Asp421). Jedan od pristupa koji se trenutno razmatraju za rešavanje agregacije tau otkriven je u WO 2015/010135 (ISIS Pharmaceuticals Inc.) i obuhvata korišćenje 5-10-5 MOE gapmera sa fosforotioatnim vezama i 5-metilcitozinom.

REZIME PRONALASKA

[0005] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Ovde su obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji imaju SEQ ID NO:208 ili 285 i ciljaju humani tau protein povezan sa mikrotubulama (MAPT), kompozicije koje sadrže antisens oligonukleotide i njihovo korišćenje za smanjivanje ekspresije tau iRNK i proteina pomoću ovih antisens oligonukleotida, kao što je definisano u zahtevima. Ovi ovde obezbeđeni antisens oligonukleotidi, njihove kompozicije i upotrebe su korisni za lečenje bolesti povezanih sa tau proteinom.

[0006] Antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT a koji su ovde obezbeđeni su gapmeri, koji imaju centralni segment praznine od uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida, koji je pozicioniran između dva segmenta krila na 5' i 3' krajevima (takođe se nazivaju 5', odnosno 3' krilo). Takvi antisens oligonukleotidid smanjuju ekspresiju tau iRNK i/ili proteina putem aktivacije RNaze H. Internukleozidne veze gapmera su fosforotioatne veze. Gapmeri sadrže niz od deset (10) uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida, a 5' i 3' segmenti krila sadrže jedan ili više 2'-modifikovanih nukleotida.2'-modifikacija je 2'-O-metoksietil (2'-O-MOE).

[0007] U predmetnom otelotvorenju iz zahteva, gapmeri koji ciljaju tau protein su 5-10-5 gapmeri dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni segment praznine obuhvata deset uzastopnih 2'-dezoksinukleozida, koji su okruženi 5' krilom i 3' krilom, pri čemu svako krilo sadrži pet nukleozida, svaki sa 2'-O-MOE modifikacijom.

[0008] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT koji su ovde obezbeđeni mogu da smanje nivo ekspresije tau iRNK ili proteina za najmanje 30% in vitro.

[0009] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT koji su ovde obezbeđeni mogu da smanje nivo ekspresije tau iRNK ili proteina za najmanje 30% in vivo.

[0010] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže bilo koji od ovde opisanih antisens oligonukleotida i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0011] U daljem aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za smanjenje nivoa ekspresije tau kod ispitanika, npr. ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa tau ili ima predispozicije da od nje oboli, putem primene terapeutski delotvorne količine bilo kog antisens oligonukleotida koji je ovde opisan na ispitaniku. Takvi postupci mogu da obuhvataju primenu drugog agensa na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid koji cilja MAPT može da se primenjuje na ispitaniku intratekalnim, intrakranijalnim, intranazalnim, oralnim, intravenskim ili supkutanim putem. U nekim aspektima, ispitanik je čovek.

[0012] Takođe su obezbeđeni ovde opisani antisens oligonukleotidi ili kompozicije za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa tau proteinom kod ispitanika kome je to potrebno, npr. ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa tau proteinom ili ima predispozicije da od nje oboli.

[0013] Bolest povezana sa tau proteinom je izabrana iz grupe koja se sastoji od Alchajmerove bolesti (AD), kompleksa amiotrofične lateralne skleroze/parkinsonizma-demencije (ALSPDC), bolesti argirofilnih zrna (AGD), amiloidne angiopatije britanskog tipa, cerebralne amiloidne angiopatije, hronične traumatske encefalopatije (CTE), kortikobazalne degeneracije (CBD), Krojcfeld-Jakobove bolesti (CJD), dementia pugilistica, difuznih neurofibrilarnih čvorova sa kalcifikacijom, Daunovog sindroma, Dravetovog sindroma, epilepsije, frontotemporalne demencije (FTD), frontotemporalne demencije sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17 (FTDP-17), frontotemporalne lobarne degeneracije, gaglioglioma, gangliocitoma, Gerštman-Štrausler-Šajnkerove bolesti, Halervorden-Spacove bolesti, Hantingtonove bolesti, miozitisa sa inkluzivnim telašcima, olovne encefalopatije, Guamske bolesti, meningioangiomatoze, multiple sistemske atrofije, miotonične distrofije, Niman-Pikove bolesti tipa C (NP-C), neguamske bolesti motornog neurona sa neurofibrilarnim čvorovima, Pikove bolesti (PiD), postencefalitičnog parkinsonizma, cerebralne amiloidne angiopatije prionskog proteina, progresivne subkortikalne glioze, progresivne supranuklearne paralize (PSP), subakutnog sklerozirajućeg panencefalitisa, demencije samo sa čvorovima, demencije pretežno sa čvorovima, multiinfarktne demencije, ishemijskog moždanog udara ili tuberozne skleroze.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014]

SL. 1A-1E prikazuju fizičku karakterizaciju antisens oligonukleotida koji cilja MAPT. SL. 1A prikazuje strukturu antisens oligonukleotida (ASO) koji obuhvata SEQ ID NO: 284, sa formulom C230H321N72O120P19S19 i očekivanom molekulskom masom 7212,3 Da. SL. 1B prikazuje podatke dobijene tečnom hromatografijom sa masenom spektrometrijom (LC-MS) ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 284, uz izmereni pik mase 7214,3. SL.1C prikazuje izveštaj o dekonvoluciji pikova LC-MS ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 284. SL.1D prikazuje LC-MS podatke ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 285, uz izmereni pik mase 7232,5. SL. 1E prikazuje izveštaj o dekonvoluciji pikova LC-MS ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 285.

SL. 2A-2E prikazuje nivo ekspresije humane tau iRNK i proteina u reprezentativnoj hTau BAC transgenoj mišjoj liniji pre tretiranja antisens oligonukleotidom i nakon toga. SL.2A prikazuje rezultate RT-PCR koji pokazuju da je svih šest humanih tau transkripta pronađeno u prednjem mozgu hTau BAC trangenih miševa (transgena linija 510, dva meseca stare ženke miša). Egzoni 2, 3 i 10 su alternativno splajsovani, što daje šest izooblika tau proteina: 2-3-10-; 2+3-10-; 2+3+10-; 2-3-10+; 2+3-10+; 2+3+10+.4R predstavlja izooblike tau proteina sa egzonom 10, 3R predstavlja izooblike tau proteina bez egzona 10; 0N predstavlja izooblike tau proteina koji nemaju ni egzon 2 ni egzon 3; 1N predstavlja izooblike tau proteina koji imaju egzon 2 ili egzon 3; 2N predstavlja izooblike tau proteina koji imaju egzon 2 kao i egzon 3. SL.2B je prikaz vestern blota koji prikazuje šest izooblika tau proteina u rasponu od 352-441 aminokiseline sa molekulskom masom od 48-67 kD. Oni se razlikuju po (1) uključivanju nula, jednog ili dva inserta N-terminalnog dela od 29 aminokiselina (0N, 1N, 2N), ili (2) uključivanju tri ili četiri domena vezivanja mikrotubula (3R ili 4R). SL.2C je prikaz imunohistohemijskog snimka koji prikazuje normalnu aksonsku raspodelu humanog tau proteina u mozgu hTau BAC transgenog miša, pomoću bojenja antitelom koje je specifično za humani tau protein. SL.2D je trakasti grafikon koji prikazuje nokdaun tau iRNK u korteksu hTau BAC transgenog miša 4 nedelje nakon jednog tretmana antisens oligonukleotidom koji obuhvata SEQ ID NO: 285. SL.2E je reprezentativni vestern blot koji prikazuje nokdaun tau proteina u hipokampusu hTau BAC transgenog miša 4 nedelje nakon jednog tretmana antisens oligonukleotidom koji obuhvata SEQ ID NO: 285.

SL. 3 je skup snimaka in situ hibridizacije koji prikazuju široku raspodelu antisens oligonukleotida u mozgu SEQ ID NO: 285 kod hTau BAC transgenih miševa.

SL. 4A i 4B su tačkasti dijagrami koji pokazuju inhibiciju ekspresije humane tau iRNK (SL.

4A) i proteina (SL.4B) zavisnu od doze kod hTau BAC transgenog miša 4 nedelje ili 12 nedelja nakon jedne ICV injekcije sa 1, 10, 50, 200 ili 400 ug antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285.

SL. 5A i 5B su tačkasti dijagrami koji pokazuju vremenski tok ekspresije humane tau iRNK (SL. 5A) i proteina (SL.5B) kod hTau BAC transgenog miša nakon jedne ICV injekcije od 200 ug antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285.

DETALJNI OPIS

[0015] Ovde su obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji ciljaju tau protein povezan sa mikrotubulama (MAPT), kompozicije koje sadrže antisens oligonukleotide iz zahteva, i njihovo korišćenje za ciljanje tau povezanih bolesti iz zahteva.

Definicije

[0016] Kao što se koristi u specifikaciji i zahtevima, oblik za jedninu uključuje i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, izraz „ćelija“ uključuje mnoštvo ćelija, uključujući njihove smeše.

[0017] Sve numeričke oznake, npr. pH, temperatura, vreme, koncentracija i molekulska masa, uključujući opsege, predstavljaju približne vrednosti koje variraju (+) ili (-) u koracima od 0,1. Podrazumeva se, iako nije uvek izričito navedeno, da svim numeričkim oznakama prethodi izraz „oko“. Takođe se podrazumeva, iako nije uvek izričito navedeno, da su ovde opisani reagensi samo primeri, i da su njihovi ekvivalenti poznati u struci.

[0018] Termin „2'-modifikacija“ odnosi se na supstituciju H ili OH na 2'-poziciji furanoznog prstena nukleozida ili nukleotida drugom grupom.

[0019] Kao što se ovde koristi, „2'-O-metoksietil“, „2'-MOE“ ili „2'-OCH2CH2-OCH3“ odnosi se na O-metoksietil modifikaciju na 2' poziciji furanoznog prstena. 2'-O-metoksietil modifikovani šećer je modifikovani šećer. „2'-MOE nukleozid/nukleotid“ ili „2'-O-metoksietil nukleozid/nukleotid“ se odnosi na nukleozid/nukleotid koji sadrži 2'-MOE modifikovani ostatak šećera.

[0020] „5-metilcitozin“ se odnosi na citozin modifikovan metil grupom koja je vezana na poziciji 5'.

[0021] Termin „antisens oligonukleotid“, kao što se ovde koristi, odnosi se na jednolančani oligonukleotid koji ima sekvencu nukleobaza koja je komplementarna sa odgovarajućim segmentom ciljne nukleinske kiseline, npr. ciljnom genomskom sekvencom, pre-iRNK ili molekulom iRNK. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid je dugačak 12 do 30 nukleobaza.

[0022] Termin „komplementarnost“ ili „komplementarno“ se odnosi na kapacitet za bazno sparivanje između nukleobaza prvog lanca nukleinske kiseline i nukleobaza drugog lanca nukleinske kiseline, koje je posredovano vodoničnim vezama (npr. Votson-Krikove, Hugstinove ili obrnute Hugstinove vodonične veze) između odgovarajućih nukleobaza. Na primer, u DNK, adenin (A) je komplementaran sa timinom (T), a guanozin (G) je komplementaran sa citozinom (C). Na primer, u RNK, adenin (A) je komplementaran sa uracilom (U), a guanozin (G) je komplementaran sa citozinom (C). U nekim otelotvorenjima, komplementarna nukleobaza označava nukleobazu antisens oligonukleotida koja je sposobna za bazno sparivanje sa nukleobazom njene ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ako je nukleobaza na određenoj poziciji antisens oligonukleotida sposobna za vodonično vezivanje sa nukleobazom na određenoj poziciji ciljne nukleinske kiseline, onda se smatra da je pozicija vodoničnog vezivanja između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline komplementarna na tom nukleobaznom paru. Nukleobaze koje sadrže određene modifikacije mogu zadržati sposobnost sparivanja sa parnjačkom nukleobazom, i tako su i dalje sposobne za nukleobaznu komplementarnost.

[0023] „Delotvorna količina“ odnosi se na količinu dovoljnu za postizanje korisnih ili željenih rezultata. Na primer, terapeutska količina je ona koja postiže željeni terapeutski efekt. Ova količina može biti ista ili različita od profilaktički delotvorne količine, koja je potrebna količina da bi se sprečio nastanak bolesti ili simptoma bolesti. Delotvorna količina se može primeniti u jednoj ili više primena, aplikacija ili doza. „Terapeutski delotvorna“ količina terapeutskog jedinjenja (tj. delotvorna doza) zavisi od odabranih terapeutskih jedinjenja. Kompozicije mogu da se primenjuju od jednom ili više puta dnevno do jednom ili više puta nedeljno, uključujući svakog drugog dana. Stručnjak će znati da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje ispitanika, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravlje i/ili starost ispitanika i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje ispitanika terapeutski delotvornom količinom ovde opisanih terapeutskih jedinjenja može uključivati pojedinačno lečenje ili niz lečenja.

[0024] Kao što se ovde koristi, termin „gapmer“ se odnosi na antisens oligonukleotid koji sadrži centralni segment praznine koji se sastoji od uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida, koji može da aktivira RNazu H, i okružen je sa dva segmenta krila na 5' i 3' krajevima, pri čemu svaki sadrži jedan ili više modifikovanih nukleotida, koji daju povećanu otpornost na razgradnju nukleaze.

[0025] Termin „hibridizacija“ se odnosi na bazno sparivanje komplementarnih lanaca nukleinske kiseline i nastanak strukture dupleksa. Hibridizacija može da se odigra između potpuno komplementarnih lanaca nukleinske kiseline ili između „suštinski komplementarnih“ lanaca nukleinske kiseline koji sadrže manje regione neslaganja. Iako nije ograničeno na određeni mehanizam, najčešći mehanizam sparivanja uključuje vodonične veze, koje mogu biti Votson-Krikove, Hugstinove ili obrnute Hugstinove vodonične veze između komplementarnih nukleobaza lanaca nukleinske kiseline. Na primer, adenin i timin su komplementarne nukleobaze koje se sparuju nastankom vodoničnih veza. Hibridizacija može da se javi u različitim strogim okolnostima. Kao što se ovde koristi, hibridizacija se odnosi na bazno sparivanje komplementarnih lanaca nukleinske kiseline i nastanak strukture dupleksa barem u relativno niskim uslovima strogosti, na primer, hibridizacija u 2X SSC (0,3 M natrijum hlorid, 0,003 M natrijum citrat), 0,1% SDS na 37 °C, nakon čega sledi ispiranje u rastvoru koji sadrži 4 X SSC, 0,1% SDS može da se koristi na 37 °C, uz finalno ispiranje u 1 X SSC na 45 °C.

[0026] Termin „inhibicija“ ili „inhibiranje“ odnosi se na smanjenje ili blokiranje ekspresije ili aktivnosti ciljne nukleinske kiseline ili proteina, i ne mora nužno da ukazuje na potpunu eliminaciju ekspresije ili aktivnosti cilja.

[0027] Termin „internukleozidna veza“ se odnosi na hemijsku vezu između nukleozida.

[0028] Termin „nokdaun“ ili „nokdaun ekspresije“ se odnosi na smanjenu ekspresiju gena od strane iRNK ili proteina nakon tretiranja reagensom, npr. antisens oligonukleotidom.

Nokdaun ekspresije može da se javi tokom transkripcije, splajsovanja iRNK ili translacije.

[0029] Termin „pogrešno sparivanje“ označava slučaj kada nukleobaza prvog lanca nukleinske kiseline nije komplementarna sa odgovarajućom nukleobazom drugog lanca nukleinske kiseline.

[0030] Termin „sekvenca nukleobaze“ označava redosled uzastopnih nukleobaza nezavisno od bilo kog šećera, veze i/ili modifikacije nukleobaze.

[0031] Termin „oligonukleotid“ se odnosi na polimer vezanih dezoksiribonukleotida (DNK) i/ili ribonukleotida (RNK), pri čemu je svaki modifikovan ili nemodifikovan. Ukoliko nije specifično ograničen, termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao prirodna nukleinska kiselina, i nukleinske kiseline koje imaju alternativne internukleozidne veze koje nisu fosfodiestarske veze.

[0032] Termin „fosforotioatna veza“ se odnosi na vezu između nukleozida gde je fosfodiestarska veza modifikovana zamenom jednog od nepremošćavajućih atoma kiseonika atomom sumpora.

[0033] Termin „sens lanac“ se odnosi na kodirajući lanac, plus lanac, ili nešablonski lanac molekula DNK koji se sastoji od dvolančane strukture. Kodirajući lanac ima istu sekvencu kao iRNK osim što je timin (T) u DNK zamenjen uracilom (U) u RNK. „Antisens lanac“ se odnosi na nekodirajući lanac ili šablonski lanac molekula DNK, koji predstavlja šablon za sintezu iRNK. Stoga, sekvenca antisens lanca je komplementarna sa sekvencom sens lanca i iRNK (U u RNK umesto T).

[0034] Kao što se ovde koristi, termin „sterni blokator“ se odnosi na antisens oligonukleotid koji se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom (npr. ciljna genomska sekvenca, preiRNK ili molekul iRNK) i ometa transkripciju, splajsovanje i/ili translaciju ciljne nukleinske kiseline bez aktivacije RNaze H.

[0035] Kao što se ovde koristi, „ciljanje“ ili „ciljano“ se odnosi na konstruisanje i odabir antisens oligonukleotida koji specifično može da se hibridizuje u ciljnu nukleinsku kiselinu, npr. ciljnu genomsku sekvencu, pre-iRNK ili molekul iRNK, ili na njegov fragment ili varijantu, i modulira transkripciju, splajsovanje i/ili translaciju ciljne nukleinske kiseline.

[0036] Kao što se ovde koristi, „tau“ (naziva se i „tau protein povezan sa mikrotubulama“, MAPT, MSTD; PPND; DDPAC; MAPTL; MTBT1; MTBT2; FTDP-17; PPP1R103) odnosi

1

se na protein povezan sa mikrotubulama kodiran genom MAPT. Humani MAPT gen se preslikava na hromozomsku lokaciju 17q21.1, a genomska sekvenca humanog MAPT gena se može naći u GenBank pod NG_007398.1 (SEQ ID NO: 304). Sekvence MAPT introna i egzona i tačke grananja mogu da se utvrde pomoću Ensembl veb stranice sa bazom podataka genoma koristeći transkript: MAPT-203 ENST00000344290. Zbog komplikovanog alternativnog splajsovanja, osam izooblika tau je prisutno u čoveku. Termin „tau“ se koristi da se zbirno ukaže na sve izooblike tau. Sekvence proteina i iRNK za najduže humane izooblike tau su:

Tau protein povezan sa mikrotubulama (MAPT) homo sapiensa, transkript varijanta 6,

iRNK (NM_ 001123066.3)

�

Tau protein povezan sa mikrotubulama homo sapiensa izooblik 6 (NP_001116538.2)

[0037] Sekvence iRNK i proteina drugih humanih izooblika tau mogu se pronaći u GenBank sa sledećim pristupnim brojevima:

tau izooblik 1: NM_016835.4 (iRNK) → NP_058519.3 (protein);

tau izooblik 2: NM_005910.5 (iRNK) → NP_005901.2 (protein);

tau izooblik 3: NM_016834.4 (iRNK) → NP_058518.1 (protein);

tau izooblik 4: NM_016841.4 (iRNK) → NP_058525.1 (protein);

tau izooblik 5: NM_001123067.3 (iRNK) → NP_001116539.1 (protein);

tau izooblik 7: NM_001203251.1 (iRNK) → NP_001190180.1 (protein);

tau izooblik 8: NM_001203252.1 (iRNK) → NP_001190181.1 (protein).

Kako se ovde koristi, humani tau protein takođe uključuje proteine koji u svojoj punoj dužini imaju najmanje oko 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa bilo kojim izooblikom tau. Sekvence mišjih, cinomolgusovih i drugih životinjskih tau proteina poznate su u struci.

[0038] Termin „bolest povezana sa tau proteinom“ uključuje, ali nije ograničen na, bolest povezanu sa abnormalnom ekspresijom, sekrecijom, fosforilacijom, raskidanjem i/ili taloženjem tau proteina. Bolesti povezane sa tau uključuju, bez ograničenja, Alchajmerovu bolest (AD), kompleks amiotrofične lateralne skleroze/parkinsonizma-demencije (ALS-PDC), bolest argirofilnih zrna (AGD), amiloidnu angiopatiju britanskog tipa, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, hroničnu traumatsku encefalopatiju (CTE), kortikobazalnu degeneraciju (CBD), Krojcfeld-Jakobovu bolest (CJD), dementia pugilistica, difuzne neurofibrilarne čvorove sa kalcifikacijom, Daunov sindrom, Dravetov sindrom, epilepsiju, frontotemporalnu demenciju (FTD), frontotemporalnu demenciju sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17 (FTDP-17), frontotemporalnu lobarnu degeneraciju, gagliogliom, gangliocitom, Gerštman-Štrausler-Šajnkerovu bolest, Halervorden-Spacovu bolest, Hantingtonovu bolest, miozitis sa inkluzivnim telašcima, olovnu encefalopatiju, Guamsku bolest, meningioangiomatozu, multiplu sistemsku atrofiju, miotoničnu distrofiju, Niman-Pikovu bolest tipa C (NP-C), neguamsku bolest motornog neurona sa neurofibrilarnim čvorovima, Pikovu bolest (PiD), postencefalitični parkinsonizam, cerebralnu amiloidnu angiopatiju prionskog proteina, progresivnu subkortikalnu gliozu, progresivnu supranuklearnu paralizu (PSP), subakutni sklerozirajući panencefalitis, demenciju samo sa čvorovima, demenciju pretežno sa čvorovima, multi-infarktnu demenciju, ishemijski moždani udar i tuberoznu sklerozu.

[0039] Izraz „homologija“ ili „identičnost“ odnosi se na identičnost sekvence podjedinice između dva polimerna molekula, npr. između dva molekula nukleinske kiseline, kao što su

1

dva molekula DNK ili dva molekula RNK, ili između dva molekula polipeptida. Kada položaj podjedinice u oba molekula zauzima ista monomerna podjedinica; npr. ako položaj u svakom od dva molekula DNK zauzima adenin, tada su oni homologi ili identični na tom položaju. Homologija između dve sekvence direktno zavisi od broja podudarnih ili homolognih položaja; npr. ako je polovina (npr. pet položaja u polimeru dužine deset podjedinica) položaja u dve sekvence homologna, dve sekvence su 50% homologne; ako je 90% pozicija (npr.9 od 10) podudarno ili homologno, dve sekvence su 90% homologne. Procenat „identičnosti sekvence“ može se odrediti poređenjem dve optimalno poravnate sekvence preko okvira za poređenje, gde fragment aminokiselinske sekvence u okviru za poređenje može da sadrži adicije ili delecije (npr. praznine ili prepuste) u odnosu na referentnu sekvencu (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnavanje dve sekvence. Procenat se može izračunati određivanjem broja položaja na kojima se identični aminokiselinski ostatak javlja u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja ukupnim brojem položaja u okviru za poređenje, i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Rezultat je procenat identičnosti sekvence ispitanika u odnosu na ispitivanu sekvencu.

[0040] Izraz „izolovan“ znači izmenjen ili uklonjen iz prirodnog stanja. Na primer, nukleinska kiselina ili peptid koji su prirodno prisutni u živoj životinji nisu „izolovani“, ali su ista nukleinska kiselina ili peptid delimično ili potpuno razdvojeni od istovremeno postojećih supstanci svog prirodnog stanja „izolovani“. Izolovana nukleinska kiselina ili protein mogu postojati u suštinski prečišćenom obliku, ili mogu postojati u nenativnom okruženju kao što je, na primer, ćelija domaćin.

[0041] Pojam „lečiti“ i „lečenje“ odnosi se i na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere, naznačeno time što je cilj da se spreči ili uspori neželjena fiziološka promena ili poremećaj. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovano stanje bolesti (tj. bez pogoršanja), odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje ili palijaciju stanja bolesti, i remisiju (delimičnu ili potpunu), bilo da može ili ne može da se detektuje. „Lečenje“ takođe može značiti i produžavanje preživljavanja u odnosu na očekivano preživljavanje ako se ne prima lečenje.

1

[0042] Izraz „ispitanik“ odnosi se na životinju, humanu ili nehumanu, kojoj se pruža tretman prema postupcima iz predmetnog pronalaska. Razmatra se veterinarska i neveterinarska primena. Izraz uključuje, ali nije ograničen na sisare, npr. ljude, druge primate, svinje, glodare kao što su miševi i pacovi, zečevi, zamorci, hrčci, krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Tipični ispitanici uključuju ljude, domaće životinje i kućne ljubimce, kao što su mačke i psi.

[0043] Ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje kao što obično podrazumevaju stručnjaci u struci na koju se ovaj pronalazak odnosi. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praktikovanju pronalaska, odgovarajući postupci i materijali su opisani u nastavku. U slučaju neusaglašenosti, imaće prednost predmetna specifikacija, uključujući definicije. Pored toga, materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativni, i ne predstavljaju ograničenje.

[0044] Detaljni podaci o jednom ili više otelotvorenja pronalaska navedeni su na priloženim crtežima i u donjem opisu. Ostale karakteristike, predmeti i prednosti pronalaska biće očevidni iz opisa i crteža, i iz zahteva.

Antisens oligonukleotidi

[0045] Antisens oligonukleotidi (ASO) su moćni i svestrani agensi koji se koriste u sve većem broju primena, uključujući redukciju RNK, zaustavljanje translacije, inhibiciju miRNK, modulaciju splajsovanja i odabir mesta poliadenilacije. Antisens oligonukleotid vezuje ciljnu nukleinsku kiselinu kada dovoljan broj nukleobaza antisens oligonukleotida može da gradi vodoničnu vezu sa odgovarajućim nukleobazama ciljne nukleinske kiseline, i modulira transkripciju i/ili translaciju ciljne nukleinske kiseline. Tako, sekvenca nukleobaza antisens oligonukleotida je komplementarna sa sekvencom nukleobaza ciljne nukleinske kiseline, npr. sa ciljnom genomskom sekvencom, pre-iRNK ili molekulom iRNK. Do hibridizacije dolazi kada se vodonična veza (npr. Votson-Krikove, Hugstinove ili obrnute Hugstinove vodonične veze) formira između komplementarnih nukleobaza antisens oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. Nekomplementarne baze između antisens oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline mogu se tolerisati pod uslovom da je antisens oligonukleotid sposoban da se specifično hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom.

1

[0046] ASO mogu da se konstruišu tako da smanje ekspresiju ciljnog proteina na način koji je zavisan od RNaze H ili nezavisan od RNaze H (vidite Watts JK, et al., J Pathol.2012 January; 226(2): 365-379). Kada se ASO koji obuhvata neprekinuti niz DNK hibridizuje sa ciljnom RNK, heterodupleks DNK-RNK regrutuje RNazu H, koja raskida ciljnu RNK u dupleksu i promoviše dalju razgradnju fragmenata RNK od strane ćelijskih nukleaza. ASO takođe mogu da smanje ekspresiju cilja nezavisno od RNaze H putem sternog blokiranja preiRNK obrade i/ili translacije iRNK u protein.

[0047] Ovde su obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji ciljaju tau protein povezan sa mikrotubulama (MAPT) u skladu sa zahtevima.

[0048] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni imaju 100% komplementarnost (tj. potpunu komplementarnost) sekvence nukleobaza sa segmentom MAPT genomske DNK, pre-iRNK ili iRNK. Kao što se ovde koristi, „potpuna komplementarnost“ ili „100% komplementarnost“ znači da je svaka nukleobaza antisens jedinjenja sposobna za precizno bazno sparivanje sa odgovarajućim nukleobazama ciljne nukleinske kiseline. Na primer, antisens jedinjenje od 20 nukleobaza je potpuno komplementarno sa ciljnom sekvencom dužine 400 nukleobaza, sve dok postoji odgovarajući deo ciljne nukleinske kiseline od 20 nukleobaza koji je potpuno komplementaran sa antisens jedinjenjem.

Hemijske modifikacije antisens oligonukleotida

[0049] Oligonukleotidi se sastoje od ponavljajućih nukleotidnih jedinica koje su međusobno vezane putem internukleozidnih fosfodiestarskih veza. Svaki nukleotid je sačinjen od nukleozida, koji obuhvata nukleobazu vezanu sa ostatkom šećera, i jednu ili više fosfatnih grupa kovalentno vezanih sa ostatkom šećera. Fosfodiestarske veze su sačinjene od ostatka šećera (riboza za RNK ili dezoksiriboza za DNK, zbirno furanoza) vezanog preko glikozidne veze sa purinskom (guanin i/ili adenin) i/ili pirimidinskom bazom (timin i citozin za DNK, a uracil i citozin za RNK).

[0050] Antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni mogu da sadrže jednu ili više modifikovanih podjedinica nukleotida i/ili internukleozidnih veza. Hemijske modifikacije

1

oligonukleotida obuhvataju promene internukleozidnih veza, ostataka šećera, nukleobaza i/ili skeleta. Modifikacije mogu da poboljšaju stabilnost, delotvornost i/ili da smanje imunogenost antisens oligonukleotida. Na primer, oligonukleotidi mogu biti modifikovani da imaju povećanu otpornost na nukleaze, povećan afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu, povećano ćelijsko preuzimanje i/ili povećanu inhibitornu aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim oligonukleotidima.

[0051] Fosfodiestarske veze su modifikovane u druge veze koje sadrže fosfor kao što je fosforotioatna veza. U predmetnim otelotvorenjima, svaka internukleozidna veza antisens oligonukleotida je fosforotioatna internukleozidna veza.

[0052] Antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni obuhvataju hemijski modifikovane ostatke šećera. Antisens oligonukleotidi imaju 2' modifikaciju na prstenu furanoze, koja premošćava negeminalne atome prstena dajući biciklične nukleinske kiseline (BNK), zamenu atoma kiseonika u prstenu šećera drugim atomima, ili kombinaciju prethodnog. Primer za 2'-modifikaciju je 2'-O-metoksietil (2'-O-MOE).

[0053] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni mogu da obuhvataju supstituciju nukleotida na datoj poziciji modifikovanom verzijom istog nukleotida. Na primer, nukleotid (C) može biti zamenjen odgovarajućim 5-metilcitozinom.

[0054] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni obuhvataju hemijski modifikovane oligonukleotide koji smanjuju imunogenost oligonukleotida. Na primer, pokazalo se da oligonukleotidi koji obuhvataju 5-metilcitozin ili 2'-O-MOE modifikaciju ispoljavaju smanjenu imunsku stimulaciju kod miševa (Henry S. et al., J Pharmacol Exp Ther. 2000 Feb; 292(2):468-79). U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni obuhvataju 5-metilcitozine umesto citozina. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni obuhvataju 2'-O-MOE modifikaciju (obeležena sa *). U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni obuhvataju 5-metilcitozine i 2' MOE modifikacije.

1

Gapmeri

[0055] Antisens oligonukleotidi koji obuhvataju neprekidni niz DNK mogu da regrutuju ćelijsku endonukleazu RNazu H da cilja heterodupleks RNK:DNK i raskine ciljnu RNK u dupleksu RNK:DNK. Gapmeri su himerna antisens jedinjenja. Himerna antisens jedinjenja tipično obuhvataju najmanje jedan region koji je modifikovan tako da daje povećanu otpornost na degradaciju nukleaze, povećano ćelijsko preuzimanje, povećan afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu i/ili povećanu inhibitornu aktivnost, i drugi region koji ima nukleotide koji su hemijski različiti od nukleotida prvog regiona.

[0056] Gapmeri imaju segment centralne praznine koji se sastoji od niza uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida, pozicioniran između dva segmenta krila koji se sastoje od modifikovanih nukleotida na 5' i 3' kraju. Segment praznine služi kao supstrat za cepanje endonukleaze RNaze H, dok segmenti krila sa modifikovanim nukleotidima daju povećanu otpornost na degradaciju drugim nukleazama. Segment krilo-praznina-krilo može da se opiše sa „X-Y-Z“, gde „X“ predstavlja dužinu 5' krila, „Y“ predstavlja dužinu praznine, a „Z“ predstavlja dužinu 3' krila. „X“ i „Y“ mogu da obuhvataju jednoobrazne, varijantne ili naizmenične ostatke šećera.

[0057] U nekim otelotvorenjima, segment centralne praznine gapmera se sastoji od deset (10) uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida, a segmenti 5' i 3' krila obuhvataju jedan ili više 2'-modifikovanih nukleotida. Objavljeno je da himerni oligonukleotid koji sadrži niz do četiri uzastopna 2'-dezoksiribonukleotida ne aktivira RNazu H. Vidite U.S. patent br.9,157,081. U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT su gapmeri koji obuhvataju deset uzastopnih 2'-dezoksiribonukleotida.2'-modifikacija je 2'-O-metoksietil (2'-O-MOE).

[0058] U nekim otelotvorenjima, gapmeri koji ciljaju MAPT su 5-10-5 gapmeri koji su dugački 20 nukleozida, pri čemu segment centralne praznine obuhvata deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je segmentima 5' i 3' krila od kojih svaki obuhvata pet nukleozida, svaki sa 2'-modifikacijom.

[0059] . U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT su gapmeri koji se sastoje od bilo koje od sekvenci nukleobaza koje su date u bilo kojoj od tabela 11. Kao što je detaljno prikazano u primerima ispod, gapmeri su konstruisani

2

da ciljaju sekvence koje okružuju početni kodon, egzon 1 ili 3' neprevedeni region (untranslated region, UTR) transkripta MAPT. U nekim otelotvorenjima, gapmeri su konstruisani da ciljaju 3' UTR.

[0060] U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT su 5-10-5 gapmeri koji obuhvataju bilo koju od sekvenci nukleobaza obezbeđenih u bilo kojoj od tabela 9-15 i 17, pri čemu svaki od prvog do petog nukleotida obuhvata 2'-O-MOE modifikovani nukleozid, pri čemu svaki od šestog do petnaestog nukleotida obuhvata 2'-dezoksinukleozid, i pri čemu svaki od šesnaestog do dvadesetog nukleotida obuhvata 2'-O-MOE modifikovani nukleozid.

Genomske sekvence MAPT koje ciljaju antisens oligonukleotidi

[0061] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi su konstruisani da ciljaju određeni region genomske sekvence MAPT (GenBank pristupni br. NG_007398.1; SEQ ID NO: 304) ili region odgovarajuće tau iRNK ili transkripta (SEQ ID NO: 306). Sekvence MAPT introna i egzona i tačke grananja su određene pomoću Ensembl veb stranice sa bazom podataka genoma koristeći transkript: MAPT-203 ENST00000344290. Skrining egzona, introna i spojeva egzon/intron humanog MAPT gena otkrio je da je ciljanje nekih regiona MAPT gena ili transkripta antisens oligonukleotidima delotvornije za smanjenje ekspresije tau nego ciljanje drugih regiona. Na primer, tabela 1 navodi sekvence nekih poželjnih regiona u MAPT genu ili transkriptu koji mogu da se ciljaju antisens oligonukleotidima.

[0062] . U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni antisens oligonukleotidi obuhvataju sekvencu nukleobaza koja je 100% komplementarna sa SEQ ID NO: 480.

Tabela 1: Izabrane MAPT genomske, iRNK ili pre-iRNK sekvence koje su ciljane tau antisens oligonukleotidima.

2

Konjugati antisens oligonukleotida

[0063] Konjugacija antisens oligonukleotida sa drugim ostatkom može da poboljša aktivnost, ćelijsko preuzimanje i/ili raspodelu antisens oligonukleotida u tkivu. Na primer, antisens oligonukleotidi mogu biti kovalentno vezani sa jednim ili više dijagnostičkih jedinjenja, reporterskih grupa, agenasa za umrežavanje, ostataka koji daju otpornost na nukleazu, lipofilnih molekula, holesterola, lipida, lektina, linkera, steroida, uvaola, hecigenina, diosgenina, terpena, triterpena, sarsasapogenina, fridelina, epifriedelanol-derivatizovanih litoholinskih kiselina, vitamina, biotina, ugljovodonika, dekstrana, boja, pululana, hitina, hitozana, sintetičkih ugljovodonika, oligo laktat 15-mera, prirodnih polimera, polimera male ili srednje molekulske mase, inulina, ciklodekstrina, hijaluronskih kiselina, proteina, protein vezujućih agensa, molekula koji ciljaju integrin, polikatjonskih agensa, peptida, poliamina, peptidnih mimetika, transferina, kumarina, fenazina, folata, fenantridina, antrahinona, akridina, fluoresceina i/ili rodamina.

[0064] U nekim aspektima otkrića, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni vezani su sa molekulom linkera. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni vezani su sa lipidom ili holesterolom. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi su vezani sa neutralnim lipozomima (NL) ili lipidnim nanočesticama (LNP). LNP su samosastavljajući sistemi na bazi katjonskih lipida koji mogu da obuhvataju, na primer, neutralni lipid (lipozomna baza), katjonski lipid (za punjenje oligonukleotida), holesterol (za stabilizaciju lipozoma) i PEG-lipid (za stabilizaciju formulacije, zaštitu naelektrisanja i produženu cirkulaciju u krvotoku). Neutralni lipozomi (NL) su čestice na bazi nekatjonskih lipida.

[0065] U nekim aspektima otkrića, antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni vezani su sa masnom kiselinom, npr. omega-3 masnom kiselinom ili omega-6 masnom kiselinom. Odgovarajuće omega-3 masne kiseline uključuju, npr. alfa-linoleinsku kiselinu (ALA), dokosaheksanoinsku kiselinu (DHA), ikosapentaenoinsku kiselinu (EPA), dokosapentaenoinsku kiselinu (DPA), ikosatetraenoinsku kiselinu (ETA), ikosatrienoinsku kiselinu (ETE), ikosapentaenoinsku kiselinu (EPA), heksadekatrienoinsku kiselinu (HTA), henikosapentaenoinsku kiselinu (HPA), stearidonsku kiselinu (SDA), tetrakosapentaenoinsku kiselinu i tetrakosaheksaenoinsku kiselinu.

2

Testiranje aktivnosti antisens oligonukleotida

[0066] Aktivnost antisens oligonukleotida može da se testira in vitro ili in vivo. Za in vitro testiranje, ASO mogu da se uvedu u uzgajane ćelije putem transfekcije ili elektroporacije. Nakon perioda tretiranja, nivo ekspresije MAPT (tau) u ćelijama koje su tretirane sa ASO može da se utvrdi i uporedi sa nivoom ekspresije MAPT (tau) u netretiranim kontrolnim ćelijama.

[0067] Nivo ekspresije MAPT može da se utvrdi bilo kojim odgovarajućim postupkom, na primer, kvantifikacijom nivoa iRNK MAPT, merenjem količine kDNK proizvedene putem reversne transkripcije iRNK MAPT, ili određivanjem količine tau proteina. Ovi postupci mogu da se vrše na bazi pojedinačnih uzoraka ili mogu da se modifikuju za visokoprotočnu analizu.

[0068] Nivoi iRNK MAPT mogu da se detektuju i kvantifikuju pomoću sonde koja se specifično hibridizuje sa segmentom MAPT transkripta, npr. putem nortern blot analize. Nivoi iRNK MAPT takođe mogu da se detektuju i kvantifikuju pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), koristeći par prajmera koji prepoznaju MAPT transkript. Opšti postupci PCR su dati u MacPherson et al., PCR: A Practical Approach, (IRL Press at Oxford University Press (1991)). Međutim, uslovi PCR koji se koriste za svaku reakciju se empirijski određuju. Brojni parametri određuju uspeh reakcije, na primer, temperatura i trajanje komplementarnog vezivanja prajmera, vreme ekstenzije, koncentracija Mg<2+>i/ili ATP-a, pH, i relativna koncentracija prajmera, šablona i/ili dezoksiribonukleotida. Nakon amplifikacije, dobijeni fragmenti DNK mogu da se detektuju elektroforezom na agaroznom gelu, nakon čega sledi vizuelizacija pomoću bojenja etidijum bromidom i ultraljubičastog svetla.

[0069] U nekim otelotvorenjima, nivoi iRNK MAPT mogu da se detektuju i kvantifikuju pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu, koja prati amplifikaciju ciljne nukleinske kiseline tako što simultano inkorporira detektabilnu boju ili reporter tokom koraka amplifikacije, koristeći bilo koji komercijalno dostupan sistem za PCR u realnom vremenu.

[0070] Alternativno, oznaka može da se doda neposredno u prvobitni uzorak nukleinske kiseline (npr. iRNK, polyA, iRNK, kDNK, itd.) ili u proizvod amplifikacije nakon što je amplifikacija završena. Postupci za vezivanje oznaka za nukleinske kiseline su dobro poznati stručnjacima za oblast i uključuju, na primer, nick translaciju ili obeležavanje kraja (npr. sa

2

obeleženom RNK) putem kinaziranja nukleinske kiseline, a zatim vezivanja (ligacije) linkera nukleinske kiseline koji vezuje nukleinsku kiselinu uzorka sa oznakom (npr. fluoroforom).

[0071] Detektabilne oznake koje su pogodne za korišćenje u predmetnom pronalasku uključuju bilo koju kompoziciju koja može da se detektuje spektroskopijskim, biohemijskim, imunohemijskim, električnim, optičkim ili hemijskim putem. Korisne oznake iz predmetnog pronalaska uključuju biotin za bojenje sa obeleženim konjugatom streptavidina, magnetne perlice (npr. Dynabeads<™>), fluorescentne boje (npr. fluorescein, Teksas crvena, rodamin, zeleni fluorescentni protein, i slično), radioaktivne oznake (npr.3H, 125I, 35S, 14C, ili 32P), enzime (npr. peroksidaza rena, alkalna fosfataza i drugi koji se uobičajeno koriste za ELISA), i kalorimetrijske oznake kao što su perlice od koloidnog zlata ili obojenog stakla ili plastike (npr. polistiren, polipropilen, lateks, itd.). Patenti koji se bave takvim oznakama uključuju U.S. pat. br.3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; i 4,366,241.

[0072] Detekcija oznaka je dobro poznata stručnjacima za oblast. Tako, na primer, radioaktivne oznake mogu da se detektuju koristeći fotografski film ili scintilacione brojače, fluorescentni markeri mogu da se detektuju koristeći detektor svetlosti za detekciju emitovane svetlosti. Enzimske oznake se obično detektuju tako što se enzimu obezbedi supstrat i detektuje se proizvod reakcije koji proizvodi dejstvo enzima na supstrat, a kalorimetrijske oznake se detektuju prostom vizuelizacijom obojene oznake. Za detaljan pregled postupaka za obeležavanje nukleinskih kiselina i detekciju označenih hibridizovanih nukleinskih kiselina vidite Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, sveska 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

[0073] Aktivnost antisens oligonukleotida takođe može da se ispita merenjem nivoa tau proteina koristeći postupke koji su poznati u struci. Na primer, nivo tau proteina može da se kvantifikuje putem vestern blot analize (imunoblot), testa sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunohistohemije, imunoloških testova, imunoprecipitacije, imunofluorescentnih testova, imunocitohemije, sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS), radioimunoloških testova, imunoradiometrijskih testova, tečne hromatografije visokih performansi (HPLC), masene spektrometrije, konfokalne mikroskopije, enzimskih testova ili površinske plazmonske rezonance (SPR).

2

[0074] In vivo aktivnost antisens oligonukleotida takođe može da se testira na životinjskim modelima. Testiranje može da se vrši na normalnim životinjskim modelima ili eksperimentalnim modelima bolesti životinja. Antisens oligonukleotidi mogu da se formulišu u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču i da se isporuče putem odgovarajućeg puta primene. Nakon perioda tretmana, uzorci tkiva, npr. moždanog tkiva, cerebrospinalne tečnosti (CSF), kičmene moždine, mogu da se sakupe i nivo ekspresije tau može da se izmeri koristeći bilo koji od prethodno opisanih postupaka. Histološka analiza može da se obavi za procenu strukture mozga i/ili prisustva neurofibrilarnih čvorova. Takođe mogu da se prate i ispitaju fenotipske promene tretiranih životinja, kao što je poboljšana kognicija ili mobilnost.

Sinteza i karakterizacija oligonukleotida

[0075] Jednolančani oligonukleotidi mogu da se sintetišu koristeći bilo koje postupke polimerizacije nukleinskih kiselina koji su poznati u struci, na primer, sintezu čvrste faze koristeći metodologiju fosforamidita (S. L. Beaucage i R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage i R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223), H-fosfonat, fosfortriestarsku hemiju ili enzimsku sintezu. Mogu da se koriste automatizovani komercijalni sintetizatori, na primer, sintetizatori kompanija BioAutomation (Irving, Texas), ili Applied Biosystems (Foster City, California). U nekim otelotvorenjima, jednolančani oligonukleotidi se dobijaju koristeći standardnu fosforoamiditnu hemiju čvrste faze, kao što je opisano u Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S.L. et al. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Fosforotioatne veze mogu da se uvedu koristeći reagens za sumporovanje kao što je fenilacetil disulfid ili DDTT (((dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazaolin-3-tion). Dobro je poznato korišćenje sličnih tehnika i komercijalno dostupnih modifikovanih amidita i proizvoda od poroznog stakla (CPG) kao što su amiditi i/ili CPG modifikovani biotinom, fluorescinom, akridinom ili psoralinom za sintezu modifikovanih oligonukleotida, ili fluorescentno obeleženih, biotinskih ili drugačije konjugovanih oligonukleotida.

[0076] Kontrola kvaliteta polaznih supstanci i proizvoda iz svakog koraka sinteze je ključna za svođenje nivoa nečistoća u finalnom proizvodu na najmanji mogući nivo. Međutim, imajući u vidu broj koraka sinteze po kuplovanju i broj kuplovanja, prisustvo nečistoća je neizbežno. Postupci prečišćavanja mogu da se koriste za odstranjivanje neželjenih nečistoća iz finalnog oligonukleotidnog proizvoda. Tehnike prečišćavanja koje se uobičajeno koriste za

2

jednolančane oligonukleotide uključuju reversno faznu tečnu hromatografiju visokih performansi sa jonskim parom (RP-IP-HPLC), kapilarnu gel elektroforezu (CGE), anjonsko izmenjivačku HPLC (AX-HPLC) i hromatografiju na molekulskim sitima (SEC).

[0077] Nakon prečišćavanja, oligonukleotidi mogu da se analiziraju masenom spektrometrijom i kvantifikuju spektrofotometrijom na talasnoj dužini 260 nm.

Terapeutske primene i postupci lečenja

[0078] .

[0079] Antisens oligonukleotidi koji su ovde obezbeđeni ili njihove farmaceutske kompozicije mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa tau kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotide, kako su ovde opisani, ili njihove farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa tau kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid se primenjuje na ispitaniku intratekalnim, intrakranijalnim, intranazalnim, intravenskim, oralnim ili supkutanim putem.

[0080] Bolesti povezana sa tau uključuju, bez ograničenja, Alchajmerovu bolest (AD), kompleks amiotrofične lateralne skleroze/parkinsonizma-demencije (ALS-PDC), bolest argirofilnih zrna (AGD), amiloidnu angiopatiju britanskog tipa, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, hroničnu traumatsku encefalopatiju (CTE), kortikobazalnu degeneraciju (CBD), Krojcfeld-Jakobovu bolest (CJD), dementia pugilistica, difuzne neurofibrilarne čvorove sa kalcifikacijom, Daunov sindrom, Dravetov sindrom, epilepsiju, frontotemporalnu demenciju (FTD), frontotemporalnu demenciju sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17 (FTDP-17), frontotemporalnu lobarnu degeneraciju, gagliogliom, gangliocitom, Gerštman-Štrausler-Šajnkerovu bolest, Halervorden-Spacovu bolest, Hantingtonovu bolest, miozitis sa inkluzivnim telašcima, olovnu encefalopatiju, Guamsku bolest, meningioangiomatozu, multiplu sistemsku atrofiju, miotoničnu distrofiju, Niman-Pikovu bolest tipa C (NP-C), neguamsku bolest motornog neurona sa neurofibrilarnim čvorovima, Pikovu bolest (PiD), postencefalitični parkinsonizam, cerebralnu amiloidnu angiopatiju prionskog proteina, progresivnu subkortikalnu gliozu, progresivnu supranuklearnu paralizu (PSP), subakutni

2

sklerozirajući panencefalitis, demenciju samo sa čvorovima, demenciju pretežno sa čvorovima, multi-infarktnu demenciju, ishemijski moždani udar i tuberoznu sklerozu.

Kombinovane terapije

[0081] Različiti oligonukleotidi koji su prethodno opisani mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim sredstvima za lečenje. Shodno tome, postupci za lečenje bolesti povezane sa tau koji su ovde opisani dalje mogu da obuhvataju primenu drugog agensa na ispitaniku kome je potrebno lečenje. Na primer, antisens oligonukleotidi koji ciljaju tau protein povezan sa mikrotubulama (MAPT) mogu da se koriste u kombinaciji sa antitelom koje specifično vezuje tau protein i/ili sa agensom koji cilja amiloid beta (Aβ), npr. antitelom koje vezuje Aβ ili inhibitorom beta-sekretaze (BACE). U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT se koriste u kombinaciji sa antitelom koje specifično vezuje tau protein. U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT se koriste u kombinaciji sa inhibitorom BACE.

[0082] Pojam „kombinacija“ se odnosi bilo na fiksnu kombinaciju u jednom jediničnom doznom obliku, ili na kombinovanu primenu kada jedinjenje iz predmetnog pronalaska i partner u kombinaciji (npr. drugi lek, kako je u nastavku objašnjeno, naziva se i „terapeutski agens“ ili „koagens“) mogu da se primene nezavisno u isto vreme ili zasebno unutar vremenskih intervala, naročito kada ovi vremenski intervali dopuštaju da partneri u kombinaciji pokažu kooperativno, npr. sinergijsko dejstvo. Pojedinačne komponente je moguće spakovati u komplet ili odvojeno. Jednu ili obe komponente (npr. prahovi ili tečnosti) moguće je rekonstituisati ili razblažiti do željene doze pre isporuke. Pojmovi „koisporuka“ ili „kombinovana isporuka“ ili slično kako je ovde korišćeno su zamišljeni da obuhvate isporuku izabranog partnera kombinacije pojedinačnom ispitaniku kome je potrebno (npr. pacijent), i predviđeni su da obuhvate režime lečenja kod kojih agensi nisu neophodno isporučeni istim načinom primene ili u isto vreme. Termin „farmaceutska kombinacija“, kako se ovde koristi, označava proizvod koji je rezultat mešanja ili kombinovanja više od jednog terapeutskog agensa, i uključuje i nepromenljive i promenljive kombinacije terapeutskih agenasa. Termin „fiksna kombinacija“ znači da se terapeutski agensi, npr. oligonukleotid iz predmetnog pronalaska i partner u kombinaciji, primenjuju na pacijentu istovremeno u obliku jednog entiteta ili doze. Termin „promenljiva kombinacija“ znači da se terapeutski agensi, npr. oligonukleotid iz predmetnog pronalaska i partner u kombinaciji, primenjuju na pacijentu kao odvojeni entiteti bilo istovremeno, paralelno ili sekvencijalno bez određenih vremenskih ograničenja, naznačeno time što takva primena obezbeđuje terapeutski delotvorne nivoe dva jedinjenja u telu pacijenta. Ovaj poslednji takođe važi za koktel terapiju, npr. isporuku tri ili više terapijska agensa.

[0083] Termin „farmaceutska kombinacija“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se ili na fiksnu kombinaciju u jednom obliku jedinice doziranja, ili na nefiksnu kombinaciju ili komplet delova za kombinovanu primenu gde se dva ili više terapijskih agenasa mogu primeniti nezavisno u isto vreme ili zasebno u vremenskim intervalima, posebno kada ovi vremenski intervali omogućavaju da partneri u kombinaciji pokažu kooperativni, npr. sinergijski efekat.

[0084] Termin „kombinovana terapija“ odnosi se na primenu dva ili više terapeutska agensa za lečenje terapeutskog stanja ili poremećaja opisanog u predmetnom otkriću. Takva primena obuhvata istovremenu primenu ovih terapijskih sredstava suštinski istovremeno, na primer u jednoj kapsuli sa fiksnim odnosnom aktivnih sastojaka. Alternativno, takva primena obuhvata zajedničku primenu u više kontejnera, ili u odvojenim kontejnerima (npr. tabletama, kapsulama, prahovima, i tečnostima) za svaki aktivni sastojak. Praškovi i/ili tečnosti mogu se rekonstituisati ili razblažiti do željene doze pre primene. Pored toga, takva primena takođe obuhvata upotrebu svakog terapijskog agensa sekvencijalno, bilo u približno isto vreme ili u različito vreme. U bilo kom slučaju, režim tretiranja će pružiti korisna dejstva kombinacije leka pri tretiranju ovde opisanih stanja ili poremećaja.

Priprema uzorka

[0085] Uzorci tkiva mogu da se dobiju od ispitanika koji je lečen antisens oligonukleotidom koristeći bilo koji od postupaka koji su poznati u struci, npr. putem biopsije ili hirurškog postupka. Na primer, uzorak koji sadrži cerebrospinalnu tečnost može da se dobije lumbalnom punkcijom, gde se tanka igla pričvršćena na špric ubacuje u spinalni kanal u lumbalnoj oblasti i kreira se vakuum tako da cerebrospinalna tečnost može da se usisa kroz iglu i sakupi u špric. CT snimanje, ultrazvuk ili endoskopija mogu da se koriste za navođenje ove vrste postupka.

1

[0086] Uzorak može biti liofilizovan i uskladišten na -80 °C za kasnije korišćenje. Uzorak takođe može biti fiksiran fiksativom, kao što je formaldehid, paraformaldehid ili sirćetna kiselina/etanol. RNK ili protein mogu da se ekstrahuju iz svežeg, zamrznutog ili fiksiranog uzorka za analizu.

Farmaceutske kompozicije, doziranje i primena

[0087] Ovde su takođe obezbeđene kompozicije, npr. farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedan ili više antisens oligonukleotida koji su ovde obezbeđeni. Farmaceutske kompozicije obično sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje fiziološki rastvor, rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su kompatibilni sa farmaceutskom primenom. Farmaceutske kompozicije su obično formulisane da budu kompatibilne sa njenim nameravanim putem primene. Primeri za puteve primene uključuju intratekalnu, intrakranijalnu, intranazalnu, intravensku, oralnu ili supkutanu primenu.

[0088] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid koji je ovde opisan može biti konjugovan sa antitelom koje može da pređe krvno-moždanu barijeru (npr. antitelo koje vezuje receptor transferina, insulin, leptin ili faktor rasta nalik insulinu 1) i isporuči se intravenski (Evers et al., Advanced Drug Delivery Reviews 87 (2015): 90-103).

[0089] Postupci za formulaciju pogodnih farmaceutskih kompozicija su poznati u struci, vidite, npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21. izd., 2005; i knjige iz serijala Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY). Na primer, rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu, intratekalnu ili supkutanu primenu mogu da uključuju sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekciju, fiziološki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače; antibakterijske agense kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuće agense kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i agense za podešavanje toničnosti, kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH može da se podesi pomoću kiselina ili baza, kao što su hlorovodonična kiselina

2

ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može biti priložen u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili plastičnim ili staklenim višedoznim bočicama.

[0090] Farmaceutska kompozicija pogodna za injektabilnu upotrebu može da uključuje sterilne vodene rastvore (kada je rastvorljiva u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za preparat za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki slani rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL<™>(BASF, Parsippany, NJ) ili fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude tečna u meri da se lako može ubrizgati špricem. Treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja, i mora se sačuvati od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloga, poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata.

Prevencija dejstva mikroorganizama se može postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, kao što su, na primer, parabeni, hlorbutanol, fenol, askorbinska kiselina, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manitol, sorbitol, natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija se može ostvariti putem uključivanja u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0091] Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jedinim sastojkom ili kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, po potrebi, a zatim sterilizacijom putem filtracije.

[0092] Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su sušenje pod vakuumom i liofilizacija, čime se dobija prašak aktivnog sastojka i bilo kojih željenih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0093] Oralne kompozicije generalno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. Za svrhu oralne terapeutske primene, aktivno jedinjenje može biti inkorporirano sa ekscipijensima i korišćeno u vidu tableta, lozengi ili kapsula, npr. želatinskih kapsula. Oralne kompozicije takođe mogu da se pripreme koristeći tečni nosač za upotrebu, kao što je tečnost za ispiranje usta. Farmaceutski kompatibilni vezujući agensi i/ili adjuvansi mogu biti uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, lozenge, i slično, mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što je mikrokristalna celuloza, tragakant guma ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, dezintegrans kao što je alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni skrob; lubrikans kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; glidans kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aromu kao što je pepermint, metil salicilat ili aroma narandže.

[0094] Za primenu inhalacijom, jedinjenja mogu da se isporučuju u obliku aerosolnog spreja iz ambalaže pod pritiskom ili dozatora koji sadrži odgovarajući propelant, npr. gas kao što je ugljen dioksid, ili raspršivač. Takvi postupci uključuju one opisane u U.S. patentu br.

6,468,798. Sistemska primena terapeutskog jedinjenja, kao što je ovde opisano, takođe može da se vrši transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetrati pogodni za barijeru koja treba da se pređe. Takvi penetrati su uopšteno poznati u struci i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, soli žučne kiseline i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozna primena može da se vrši korišćenjem nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja se formulišu u masti, meleme, gelove ili kreme kao što je generalno poznato u struci.

[0095] U jednom otelotvorenju, terapeutska jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi terapeutska jedinjenja od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikroenkapsulirane sisteme za isporuku.

[0096] Farmaceutske kompozicije mogu da se nalaze u ambalaži, pakovanju ili dozatoru zajedno sa uputstvom za upotrebu.

4

[0097] U neograničavajućim primerima, farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan farmaceutski agens je formulisana kao tečnost (npr. termoreaktivna tečnost), kao komponenta čvrste supstance (npr. prašak ili biorazgradivi biokompatibilni polimer (npr. katjonski biorazgradivi biokompatibilni polimer)) ili kao komponenta gela (npr. biorazgradivi biokompatibilni polimer). U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna kompozicija koja sadrži najmanje jedan farmaceutski agens je formulisana kao gel izabran iz grupe koja se sastoji od alginatnog gela (npr. natrijum alginat), gela na bazi celuloze (npr. karboksimetil celuloza ili karboksietil celuloza) ili gela na bazi hitozana (npr. hitozan glicerofosfat). Dodatni neograničavajući primeri za polimere koji eluiraju lek koji mogu da se koriste za formulaciju bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih kompozicija uključuju karagenan, karboksimetilcelulozu, hidroksipropilcelulozu, dekstran u kombinaciji sa polivinil alkoholom, dekstran u kombinaciji sa poliakrilnom kiselinom, poligalakturonsku kiselinu, galakturonski polisaharid, polisamlečnu kiselinu, poliglikolnu kiselinu, tamarind gumu, ksantan gumu, celuloznu gumu, guar gumu (karboksimetil guar), pektin, poliakrilnu kiselinu, polimetakrilnu kiselinu, N-izopropilpoliakrilomid, polioksietilen, polioksipropilen, pluronsku kiselinu, polimlečnu kiselinu, ciklodekstrin, cikloamilozu, resilin, polibutadien, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid (HP MA) kopolimer, anhidrat maleinske kiseline - alkil vinil etar, polidepsipeptid, polihidroksibutirat, polikaprolakton, polidioksanon, polietilen glikol, poliorganofosfazen, poliorto estar, polivinilpirolidon, polimlečnu-ko-glikolnu kiselinu (PLGA), polianhidride, polisilamin, poli N-vinil kaprolaktam i gelan.

[0098] U nekim otelotvorenjima, isporučivanje antisens oligonukleotida u ciljno tkivo može da se pojača pomoću isporuke posredovane nosačem uključujući, bez ograničenja, katjonske lipozome, ciklodekstrine, derivate porfirina, dendrimere razgranatog lanca, polietileniminske polimere, nanočestice i mikrosfere (Dass CR. J Pharm Pharmacal 2002; 54(1):3-27).

[0099] „Delotvorna količina“ je količina dovoljnu za postizanje korisnih ili željenih rezultata. Na primer, terapeutska količina je ona koja postiže željeni terapeutski efekt. Ova količina može biti ista ili različita od profilaktički delotvorne količine, koja je potrebna količina da bi se sprečio nastanak bolesti ili simptoma bolesti. Delotvorna količina se može primeniti u jednoj ili više primena, aplikacija ili doza. Terapeutski delotvorna količina terapeutskog jedinjenja (tj. delotvorna doza) zavisi od odabranih terapeutskih jedinjenja. Kompozicije mogu da se primenjuju od jednom ili više puta dnevno do jednom ili više puta nedeljno, uključujući svakog drugog dana. Stručnjak će znati da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje ispitanika, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravlje i/ili starost ispitanika i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje ispitanika terapeutski delotvornom količinom ovde opisanih terapeutskih jedinjenja može uključivati pojedinačno lečenje ili niz lečenja.

[0100] Doza, toksičnost i terapeutska delotvornost terapeutskih jedinjenja mogu da se utvrde pomoću standardnih farmaceutskih procedura u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LD50 (doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski delotvorna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnog i terapeutskog dejstva je terapeutski indeks, i on može da se izrazi kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju velike terapeutske indekse. Iako se mogu koristiti jedinjenja koja pokazuju toksična neželjena dejstva, treba posvetiti pažnju projektovanju sistema isporuke koji usmerava takva jedinjenja na mesto zahvaćenog tkiva kako bi se umanjila potencijalna šteta po neinficirane ćelije, i tako se smanjila neželjena dejstva.

[0101] Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu da se koriste za formulisanje opsega doze za upotrebu kod ljudi. Doza takvih jedinjenja leži poželjno u opsegu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50 sa malom ili nepostojećom toksičnošću. Doza može da varira u ovom opsegu zavisno od korišćenog doznog oblika i korišćenog načina primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u postupku iz pronalaska, terapeutski delotvorna doza može inicijalno da se proceni iz testova uzgajanja ćelija. Doza može da se formuliše na životinjskim modelima kako bi se postigao raspon cirkulišuće koncentracije u plazmi koji uključuje IC50 (tj. koncentraciju testiranog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kako je utvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi mogu da se izmere, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.

[0102] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid koji je ovde opisan radi primene se rastvara u sterilnoj vodi, fiziološkom rastvoru (npr. fiziološki rastvor puferovan fosfatom) ili cerebrospinalnoj tečnosti (CSF). U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid koji je ovde opisan primenjuje se intratekalno, npr. putem bolusne injekcije na području L3 ili L4 diska ili putem infuzije koristeći intratekalnu pumpicu.

[0103] U nekim otelotvorenjima, oko 0,001-1000 mg (npr. oko 0,1-800 mg, oko 1-600 mg, oko 10-500 mg, oko 50-450 mg, oko 80-300 mg, oko 100-200 mg) antisens oligonukleotida koji je ovde opisane primenjuje se na ispitaniku kome je to potrebno.

Kompleti

[0104] Takođe su otkriveni kompleti koji sadrže jedan ili više prethodno opisanih antisens oligonukleotida i uputstvo za upotrebu. Uputstvo za upotrebu može da sadrži uputstvo za dijagnozu ili lečenje bolesti povezane sa tau. Ovde obezbeđeni kompleti mogu da se koriste u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Stručnjaci za ovu oblast će biti svesni drugih odgovarajućih namena za ovde obezbeđene komplete, i umeće da koriste komplete za takve namene. Ovde obezbeđeni kompleti takođe mogu da uključuju i podatke o pošiljaocu (npr. koverta sa plaćenom poštarinom ili pakovanje za pošiljku) koji mogu da se koriste da se uzorci vrate na analizu, npr. u laboratoriju. Komplet može da sadrži jedan ili više sudova za uzorak, ili uzorak može biti u standardnoj epruveti za sakupljanje krvi. Komplet takođe može da sadrži jedan ili više obrazaca informisanog pristanka, obrazac za trebovanje testova, i uputstvo za korišćenje kompleta u ovde opisanom postupku. Postupci za upotrebu takvih kompleta su takođe ovde uključeni. Jedan ili više obrazaca (npr. obrazac za trebovanje testova) i sud koji sadrži uzorak mogu biti kodirani, na primer, pomoću bar koda za identifikaciju ispitanika koji je obezbedio uzorak.

PRIMERI

[0105] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ne ograničavaju opseg pronalaska koji je opisan u zahtevima.

Primer 1: Opšte supstance i postupci

Sinteza i prečišćavanje antisens oligonukleotida

[0106] Modifikovani antisens oligonukleotidi opisani u ovom pronalasku pripremljeni su koristeći standardnu fosforoamiditnu hemiju na sintetizatoru Mermade 192 (BioAutomation) za in vitro upotrebu i na Mermade 12 (BioAutomation) za in vivo primenu. Fosforoamiditi su rastvoreni u acetonitrilu pri koncentraciji od 0,15 M (0,08 M na Mermade 192), kuplovanje je obavljeno aktivacijom fosforoamidita pomoću 0,5 M rastvora 5-etiltiotetrazola u acetonitrilu (0,25 M na Mermade192). Vreme kuplovanja je obično bilo između 3-4 minuta.

Sumporovanje je obavljeno koristeći 0,2 M rastvor fenilacetil disulfida tokom pet minuta. Oksidacija je obavljena pomoću 0,02 M rastvora joda u piridinu (20%)/vodi (9,5%)/tetrahidrofuranu (70,5%) tokom dva minuta. Zatvaranje je obavljeno koristeći standardni reagens za zatvaranje. Rastući lanci oligonukleotida su detritilovani za sledeće kuplovanje pomoću 3% dihlorsirćetne kiseline u toluenu. Nakon završetka sekvenci, jedinjenja vezana za podlogu su otcepljena i deprotektovana pomoću tečnog amonijum hidroksida na 65 °C tokom 2 sata. Dobijeni sirovi rastvori su neposredno prečišćeni pomoću HPLC (Akta Explorer). Prečišćene frakcije su analizirane masenom spektrometrijom i kvantifikovane pomoću UV prema koeficijentu ekstinkcije na 260 nM. Izolovane frakcije su desalinizovane i liofilizovane do suva.

In vitro testiranje antisens oligonukleotida

[0107] Antisens oligonukleotidi su testirani in vitro u različitim ćelijskim linijama, uključujući, bez ograničenja, humane ćelijske linije kao što su Huh7 ćelije, Hela ćelije i SH-SY5Y ćelije, i COS1 ćelijske linije zelenog majmuna. Ćelije su nabavljene od komercijalnih dobavljača (npr. American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), i uzgajane u skladu sa uputstvom dobavljača.

[0108] Antisens oligonukleotidi su takođe testirani u humanim neuronima koji su dobijeni od matičnih ćelija humanog embriona (hESC), koje su dobijene od WiCell Research Institute, Inc., koji se nalazi u Medisonu, Viskonsin, SAD. hESC su konvertovane u funkcionalne neuronske ćelije putem prinudne ekspresije neurogenina-2 (Ngn2), transkripcionog faktora koji je specifičan za neuronsku liniju. Ngn2 konstrukt je isporučen u hESC koristeći lentivirusnu isporuku za konstitutivnu ekspresiju rtTA i ekspresiju koja može da se indukuje tetraciklinom egzogenih proteina koju pokreće tetO promoter. Uzorci su saglasni sa smernicama za istraživanje matičnih ćelija humanih embriona koje je uspostavio Institut za medicinu nacionalnog saveta nacionalnih akademija („NAS smernice“) i sa propisima za zaštitu ljudskih ispitanika (45 CFR Part1Q) Kancelarije za zaštitu ljudskih istraživanja, Ministarstvo zdravlja i usluga stanovništvu („DHHS“).

[0109] Antisens oligonukleotidi su uvedeni u uzgajane ćelije putem transfekcije ili nukleofekcije, kada su ćelije dostigle približno 60-80% konfluencije u kulturi. Za transfekciju, antisens oligonukleotidi su pomešani sa transfekcionim reagensom OptiFect<™>(Life Tech kat. br. 12579-017) u odgovarajućem medijumu za uzgajanje ćelija za postizanje željene koncentracije antisens oligonukleotida i koncentracije OptiFect<™>u rasponu od 2 do 12 ug/ml na 100 nM antisens oligonukleotida. Za nukleofekciju, antisens oligonukleotidi su uvedeni u SH-SY5Y ćelije neuroblastoma sa uređajem Amaxa Nucleofector-II (Lonza, Walkersville, MD). Za testiranje delotvornosti ASO, nukleofekcija je vršena u pločama sa 96 bunarčića. Nucleofector SF rastvor je izabran na osnovu velike vijabilnosti bi delotvorne transfekcije nakon preliminarnih eksperimenata. Na dan nukleofekcije, kulture sa 60-80% konfluencije su tripsinizovane i ćelije su zasejane u svaki bunarčić. Humani neuroni dobijeni od hESC su tretirani dodavanjem 1 ili 10 uM antisens oligonukleotida u medijum koji će biti preuzet putem pasivnog preuzimanja.

[0110] Ćelije su sakupljene 24-72 sata nakon tretiranja antisens oligonukleotidom, i tada su tau iRNK ili protein izolovani i izmereni koristeći postupke koji su poznati u struci i kao što je ovde opisano. Generalno, kada je tretiranje ponovljeno u više primeraka, podaci su predstavljeni kao prosek istih tretiranja. Koncentracija korišćenog antisens oligonukleotida je razlikovala za pojedinačne ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalne koncentracije antisens oligonukleotida za konkretnu ćelijsku liniju su dobro poznati u struci. Antisens oligonukleotidi su tipično korišćeni u rasponu koncentracije od 1 nM do 1000 nM kod transfekcije sa OptiFect, i u rasponu koncentracije od 25 nM do 20.000 nM kod transfekcije putem nukleofekcije.

[0111] Kvantifikacija nivoa iRNK MAPT (tau) izvršena je pomoću kvantitativnog PCR u realnom vremenu koristeći PCR sistem u realnom vremenu ViiA7 (Life Technologies) prema uputstvu proizvođača. Pre PCR u realnom vremenu, izolovana RNK je podvrgnuta reakciji reversne transkripcije, što je dalo komplementarnu DNK (kDNK) koja je zatim korišćena kao supstrat za PCR amplifikaciju u realnom vremenu. Reakcije reversne transkripcije i PCR u realnom vremenu su obavljene jedna za drugom u istim bunarčićima sa uzorcima. Komplet Fastlane cell multiplex (Qiagen kat. br.216513) korišćen je za liziranje ćelija u bunarčiću i reversnu transkripciju iRNK u kDNK neposredno iz uzgajanih ćelija bez prečišćavanja RNK. kDNK su zatim korišćene za analizu ekspresije tau koristeći kvantitativni PCR u realnom vremenu. Nivoi iRNK tau koji su utvrđeni pomoću PCR u realnom vremenu su normalizovani koristeći nivo ekspresije domaćinskog gena čiji nivo ekspresije je konstantan u ćelijama, kao što je humana gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH), humani TATA-boks vezujući protein (TBP), ili humana hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza (HPRT1).

[0112] Testovi ekspresije TaqMan gena su obavljeni za kvantitativnu RT-PCR u realnom vremenu, u skladu sa protokolom koji je opisan u kompletu QuantiTect Multiplex RT-PCR (Qiagen kat. br.204643) koristeći dvostruku reakciju RT-PCR. Korišćene su Taqman sonde specifične za humani MAPT (LifeTech AssayID br. Hs00902194_m1: FAM-MGB), humani GAPDH (LifeTech AssayID br. Hs02758991_g1: VIC-MGB), humani TBP (LifeTech kat. br.

4326322E) ili humani HPRT1 (LifeTech kat. br.4333768T). Uzorci su ispitani na sistemu ViiA7 Real-Time PCR (Life Technologies) u skladu sa preporučenim uslovima ciklizacije za dvostruki RT-PCR. Svi podaci su kontrolisani na kvantitet kDNK inputa i nivoi tau iRNK su normalizovani na nivoe endogenog referentnog gena. Tau i kontrolni gen su amplifikovani u istoj reakciji uz sličnu, visoku PCR efikasnost, što omogućava relativnu kvantifikaciju pomoću ΔΔCT postupka. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om.

In vivo testiranje antisens oligonukleotida

[0113] Antisens oligonukleotidi za MAPT su testirani in vivo isporučivanjem ASO u cerebrospinalnu tečnost (CSF) miševa putem intracerebralne ventrikularne (ICV) primene. Miševi su anestezirani 5% izofluranom nakon čega je sadržaj izoflurana u kiseoniku/azotsuboksidu smanjen na 1,5-2% za održavanje tokom hirurškog zahvata. Rektalna temperatura je održavana na 36,9±1,0 °C pomoću homeotermnog toplotnog ćebeta i rektalne sonde.

Anestezirani miševi su ubačeni u stereotaksičnu aparaturu i koža glave je obrijana i dezinfikovana rastvorom povidon-joda (Betadine). Pre pravljenja reza, miševima je dat buprenorfin (Temgesic, 0,03 mg/kg, 1 ml/kg, s.c.). Nakon toga je načinjen rez koji je otkrio lobanju za određivanje moždanih koordinata za injekciju. Injekcija (ukupne zapremine 2 µl) data je koristeći špric Hamilton od 10 µl i iglu veličine 28 G sa mikro pumpicom (Harvard Apparatus) u desnu lateralnu ventrikulu za sve životinje na sledećim koordinatama: AP = 0,5 mm; ML = 1,0 mm; DV = -2,5 mm. Protok je bio 1 µl/min, i igla je ostavljena na poziciji tokom 1 minuta nakon infuzije pre vađenja. Koža je zatvorena i miševi su ostavljeni da se oporave u zasebnim kavezima pre nego što su vraćeni u prvobitni kavez. Dodatne doze

4

buprenorfina (Temgesic, 0,03 mg/kg, 1 ml/kg, s.c.) primenjivane su dva puta dnevno tokom prvih 48 sati.

[0114] Laboratorijski/veterinarski tehničari su svakodnevno nadgledali životinje. Praćeno je opšte stanje životinja i zaceljenje rane, i svakodnevno je merena telesna težina. Životinje su na kraju snažno anestezirane natrijum pentobarbitalom (60 mg/kg Mebunat, Orion Pharma, Finska). Miševi su podvrgnuti punkciji cisterna magne i sakupljena je CSF (3-5 µl po mišu). Miševi su nakon toga podvrnuti srčanoj punkciji i sakupljeni su uzorci krvi. Približno 0,4-0,5 ml krvi je sakupljenu u plastične K2EDTA epruvete sa antikoagulansom od 500 µl sa ljubičastim poklopcem i centrifugirano na 2000 g tokom 10 min na 4 °C i plazma je alikvotovana. Miševi su nakon toga dekapitovani i mozak je sakupljen i diseciran u različite regije mozga, kao što su korteks, hipokampus i mali mozak. Pored toga, sakupljena je i kičmena moždina.

Referentni primer 2 (nije deo pronalaska): Inhibicija ekspresije humanog tau u Huh7 ćelijama putem 18mernih 2'-O-MOE sternih blokatora

[0115] Antisens oligonukleotidi sterni blokatori su konstruisani da ciljaju spojeve intronegzon konstitutivnih egzona u humanom tau proteinu, koji su nepromenljivi egzoni prisutni u svim izooblicima. Antisens oligonukleotidi sterni blokatori su konstruisani da indukuju preskakanje egzona, putem hibridizacije sa sekvencama tačke granjanja introna, neposrednog ciljanja mesta splajsovanja, grupisanja intronskih i egzonskih sekvenci, mesta pojačivača splajsovanja egzona. Sterni blokatori koji ciljaju MAPT su prvobitno konstruisani da imaju dužinu 18 nukleozida sa modifikacijama 2'-O-(2-metoksietil) (2'-O-MOE) šećera riboze u svim nukleozidima, i deluju putem sterne smetnje i ne aktiviraju RNazu ili RISC. Sve internukleozidne veze su fosfodiestarske veze. Obavljen je nepristrasan test za 18-merne uniformno modifikovane 2'-MOE ASO sa fosfodiestarskim skeletom. Obavljene su BLAST analize za svaku morfolino oligonukleotidnu sekvencu kako bi se izbegla hibridizacija van cilja.

[0116] 18-merni 2'-O-MOE sterni blokatori koji ciljaju tau testirani su in vitro na aktivnost inhibicije iRNK humanog tau. Huh7 ćelije su zasejane pri gustini od 10.000 ćelija po bunarčiću i transficirane koristeći reagens OptiFect (LifeTech kat. br.12579-017) sa 25 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od 48 sati, kDNK je neposredno pripremljena od uzgajanih ćelija koristeći komplet Fastlane cell multiplex (Qiagen kat. br.

216513). Nivoi iRNK tau su izmereni pomoću kvantitativnog PCR u realnom vremenu u dvostrukoj reakciji RT-PCR koristeći Taqman sonde specifične za humani MAPT (LifeTech AssayID br. Hs00902194_m1: FAM-MGB) i humani TBP (TATA-boks vezujući protein) kao endogenu kontrolu (LifeTech kat. br.4326322E). Svi podaci su kontrolisani na kvantitet kDNK inputa i nivoi tau iRNK su normalizovani na nivoe endogenog referentnog gena TBP. Tau i TBP kontrolni gen su amplifikovani u istoj reakciji uz sličnu, visoku PCR efikasnost, što omogućava relativnu kvantifikaciju pomoću ΔΔCT postupka. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 2 prikazuje aktivnost tih 18-mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u Huh7 ćelijama.

Tabela 2: Inhibicija iRNK tau putem 18-mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u Huh7 ćelijama.

4

4

4

4

4 Referentni primer 3 (nije deo pronalaska): Inhibicija ekspresije humanog tau u SH-SY5Y ćelijama putem 18mernih 2'-O-MOE sternih blokatora

[0117] Sterni blokatori koji su značajno smanjili ekspresiju tau u primeru 2 izabrani su i testirani u SH-SY5Y ćelijama humanog neuroblastoma. Uzgajane SH-SY5Y ćelije su nukleoficirane sa 1000 nM izabranog antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, kDNK je neposredno pripremljena od uzgajanih ćelija koristeći komplet Fastlane cell multiplex (Qiagen kat. br.216513). Nivoi iRNK tau su izmereni pomoću kvantitativnog PCR u realnom vremenu koristeći dvostruku reakciju RT-PCR, Taqman sonde specifične za humani MAPT (LifeTech AssayID br. Hs00902194_m1: FAM-MGB), i humani GAPDH (LifeTech AssayID br. Hs02758991_g1: VIC-MGB). Svi podaci su kontrolisani na kvantitet kDNK inputa i nivoi tau iRNK su normalizovani na nivoe endogenog referentnog gena GAPDH. Tau i GAPDH kontrolni gen su amplifikovani u istoj reakciji uz sličnu, visoku PCR efikasnost, što omogućava relativnu kvantifikaciju pomoću ΔΔCT postupka. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 3 prikazuje aktivnost izabranih 18-mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama.

Tabela 3: Inhibicija iRNK tau putem 18mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama.

4

[0118] Sterni blokatori koji su pokazali značajnu in vitro inhibiciju iRNK tau testirani su u različitim dozama. Uzgajane SH-SY5Y ćelije su nukleoficirane sa 0,125 nM, 0,25 nM, 0,5 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM i 8000 nM jednog izabranog antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, kDNK je neposredno pripremljena i nivoi iRNK tau su izmereni putem kvantitativnog PCR u realnom vremenu kao što je prethodno opisano. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) određena je konstruisanjem krive odgovora na dozu i ispitivanjem dejstva različitih koncentracija antisens oligonukleotida na smanjenje iRNK tau. Vrednosti IC50 su izračunate utvrđivanjem koncentracija koja je potrebna za inhibiciju polovine maksimalnog biološkog odgovora jedinjenja i mogu da se koriste kao mera potentnosti antisens oligonukleotida. Tabela 4 prikazuje IC50 vrednosti izabranih 18-mernih 2'-O-MOE sternih blokatora.

Tabela 4: IC50 izabranih 18mernih 2'-O-MOE sternih blokatora.

1

Referentni primer 4 (nije deo pronalaska): Inhibicija ekspresije humanog tau u SH-SY5Y ćelijama putem 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora

[0119] Sterni blokatori koji su značajno smanjili ekspresiju tau u primerima 2 i 3 izabrani su i konstruisani tako da imaju različitu dužinu od 12 do 25 nukleozida. Ovi 12-25merni 2'-O-MOE sterni blokatori su testirani u SH-SY5Y ćelijama. Uzgajane SH-SY5Y ćelije su nukleoficirane sa 2000 nM izabranog antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, kDNK je neposredno pripremljena i nivoi iRNK tau su izmereni kao što je prethodno opisano. Tabela 5 prikazuje aktivnost 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama.

Tabela 5: Inhibicija iRNK tau putem 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama.

2

4

[0120] IC50 vrednosti izabranih 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora sa

fosfodiestarskim internukleozidnim vezama su utvrđene kao što je prethodno opisano, i

prikazane u tabeli 6.

[0121] Sintetisano je više 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora sa fosforotioatnim

internukleozidnim vezama i vrednosti IC50 nekih od tih blokatora su prikazane u tabeli 7.

Tabela 6: IC50izabranih 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora sa fosfodiestarskim

internukleozidnim vezama.

Tabela 7: IC50izabranih 12-25mernih 2'-O-MOE sternih blokatora sa fosforotioatnim internukleozidnim vezama.

Referentni primer 5 (nije deo pronalaska): Inhibicija ekspresije humanog tau u SH-SY5Y ćelijama putem sternih blokatora 17mer 2'-O-MOE

[0122] 2'-MOE sterni blokatori dužine 17 nukleozida su konstruisani za ciljanje konstitutivnih egzona u humanom tau. Ti 17merni 2'-O-MOE sterni blokatori su testirani u SH-SY5Y ćelijama. Uzgajane SH-SY5Y ćelije su nukleoficirane sa 2000 nM izabranog antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, kDNK je neposredno pripremljena i nivoi iRNK tau su izmereni kao što je prethodno opisano. Tabela 8 prikazuje aktivnost 17mernih 2'-O-MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama.

Tabela 8: Inhibicija iRNK tau putem 17mernih MOE sternih blokatora u SH-SY5Y ćelijama

1

2

4

Primer 6: Inhibicija ekspresije humanog tau u Huh7 ćelijama putem 5-10-5 gapmera

[0123] Sekvence antisens oligonukleotida su konstruisane da budu komplementarne sa najkraćim izooblikom tau, transkriptnom varijantom 4, iRNK (GenBank: NM_016841.4). Obavljene su BLAST analize za svaku oligonukleotidnu sekvencu kako bi se izbegla hibridizacija van mete. Novi modifikovani himerni antisens oligonukleotidi su konstruisani kao 5-10-5 gapmeri dugački 20 nukleozida, pri čemu segment centralne praznine obuhvata deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je segmentima krila u 5' smeru i 3' smeru od kojih svaki obuhvata pet nukleozida sa 2'-O-MOE modifikacijom šećera riboze. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze.

[0124] Gapmeri koji ciljaju tau su testirani na inhibiciju ekspresije iRNK humanog tau in vitro. Huh7 ćelije su zasejane pri gustini od 10.000 ćelija po bunarčiću i transficirane koristeći reagens OptiFect (LifeTech kat. br.12579-017) sa 25 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od 48 sati, kDNK je neposredno pripremljena od uzgajanih ćelija koristeći komplet Fastlane cell multiplex (Qiagen kat. br.216513). Nivoi iRNK tau su izmereni pomoću kvantitativnog PCR u realnom vremenu u dvostrukoj reakciji RT-PCR koristeći Taqman sonde specifične za humani MAPT (LifeTech AssayID br.

Hs00902194_m1: FAM-MGB) i humani TBP (TATA-boks vezujući protein) kao endogenu kontrolu (LifeTech kat. br.4326322E). Svi podaci su kontrolisani na kvantitet kDNK inputa i nivoi tau iRNK su normalizovani na nivoe endogenog referentnog gena TBP. Tau i TBP kontrolni gen su amplifikovani u istoj reakciji uz sličnu, visoku PCR efikasnost, što omogućava relativnu kvantifikaciju pomoću ΔΔCT postupka. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 9 prikazuje aktivnost gapmera u Huh7 ćelijama.

Tabela 9: Inhibicija iRNK tau putem 5-10-5 MOE gapmera u Huh7 ćelijama

1

2

Primer 7: Inhibicija ekspresije humanog tau u SH-SY5Y ćelijama putem 5-10-5 gapmera

[0125] Gapmeri koji su značajno smanjili ekspresiju iRNK tau u primeru 6 izabrani su i testirani u SH-SY5Y ćelijama. Uzgajane SH-SY5Y ćelije su nukleoficirane sa 2000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, kDNK je neposredno pripremljena od uzgajanih ćelija koristeći komplet Fastlane cell multiplex (Qiagen kat. br.

216513). Nivoi iRNK tau su izmereni pomoću kvantitativnog PCR u realnom vremenu koristeći dvostruku reakciju RT-PCR, Taqman sonde specifične za humani MAPT (LifeTech AssayID br. Hs00902194_m1: FAM-MGB), i humani GAPDH (LifeTech AssayID br.

Hs02758991_g1: VIC-MGB). Svi podaci su kontrolisani na kvantitet kDNK inputa i nivoi tau iRNK su normalizovani na nivoe endogenog referentnog gena GAPDH. Tau i GAPDH kontrolni gen su amplifikovani u istoj reakciji uz sličnu, visoku PCR efikasnost, što omogućava relativnu kvantifikaciju pomoću ΔΔCT postupka. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 10 prikazuje aktivnost izabranih 5-10-5 gapmera u SH-SY5Y ćelijama. IC50 vrednosti izabranih 5-10-5 gapmera sa 5-metilcitozinom utvrđene su u SH-SY5Y ćelijama kao što je prethodno opisano, i prikazane u tabeli 11.

Tabela 10: Inhibicija iRNK tau putem 5-10-5 gapmera u SH-SY5Y ćelijama

4

Tabela 11: IC50 izabranih 5-10-5 gapmera sa 5-metilcitozinom u SH-SY5Y ćelijama

Primer 8: Karakterizacija antisens oligonukleotida koji ciljaju MAPT

[0126] Antisens oligonukleotidi koji ciljaju MAPT su okarakterisani koristeći Thermo Scientific instrument za visokopropusnu tečnu hromatografiju sa masenom spektrometrijom (LC-MS). Ovaj postupak je korišćen da se potvrdi očekivana masa antisens oligonukleotida (ASO) i da se dobiju informacije o čistoći uzorka i identifikaciji glavnih prisutnih komponenata. Na primer, antisens oligonukleotid koji obuhvata SEQ ID NO: 284 ima strukturu koja je prikazana na SL.1A i formulu C230H321N72O120P19S19. Tako, očekivana molekulska masa ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 284 je oko 7212,3 Da. SL.1B pokazuje da pik mase za ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 284 izmeren putem LC-MS iznosi 7214,3 Da. SL.1C prikazuje izveštaj o dekonvoluciji pikova LC-MS ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 284.

[0127] Antisens oligonukleotid koji obuhvata SEQ ID NO: 285 ima formulu C230 N690124 P19 S19 H318, sa procenjenom molekulskom masom 7231,11 Da. SL.1D pokazuje da pik mase za ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 285 izmeren putem LC-MS iznosi 7232,5. SL.1E prikazuje izveštaj o dekonvoluciji pikova LC-MS ASO koji obuhvata SEQ ID NO: 285.

Primer 9: In vivo testiranje gapmera koji ciljaju MAPT

Generisanje humanih tau (hTau) transgenih miševa

[0128] BAC vektori (pBACe3.6) koji sadrže humani tau gen MAPT su nabavljeni iz humanih genomskih biblioteka kompanije Life technologies. Ispitana su tri vektora za koje je predviđeno da sadrže sve regulatorne regione MAPT gena. Humana genomska DNK je podvrgnuta standardnom PCR kako bi se testiralo prisustvo svakog egzona, prajmeri koji rastežu introne humanog tau gena i regulatorni regioni su takođe korišćeni da se utvrdi sekvenca klonova. Poređenje sa humanom DNK je pokazalo da je jedan klon (RP11669E14) imao netaknute sve delove tau gena. Ovaj BAC vektor je korišćen da se generišu hTau BAC transgeni miševi. Prečišćena DNK je injektovana u oplođene embrione C57BL/6 miševa. Repna DNK mladunaca osnivača je digestovana restrikcionim enzimima i hibridizovana sa sondama specifičnim za egzon, koristeći slično digestovanu humanu DNK kao kontrolu za testiranje integriteta transgena. Pozitivni mladunci osnivači su ekspandirani. Generisano je nekoliko hTau BAC transgenih linija i jedna linija je pokazala ekspresiju iRNK humanog MAPT i proteina (SL.2A-2C). Ova linija je eksprimirala svih šest transkripta ljudskog mozga i izooblika proteina koji se mogu naći u ljudskom mozgu (SL.2A-2C). Heterozigotni hTau BAC transgeni miševi imaju jednu kopiju transgena i nivoi ekspresije RNK i humanog tau su uporedivi sa ekspresijom endogenog mišjeg tau.

In vivo nokdaun humanog tau putem antisens oligonukleotida

[0129] Odabrani antisens oligonukleotidi su testirani in vivo. Na grupama od pet hTau BAC transgenih miševa je primenjeno 1, 10, 50, 200 ili 400 ug izabranog antisens oligonukleotida putem intracerebroventrikularne (ICV) bolusne injekcije, ili su ostavljeni bez lečenja kao grupa kontrolnih miševa. Svi postupci su obavljeni uz anesteziju izofluoranom u skladu sa propisima IACUC. Za ICV bolusne injekcije, antisens oligonukleotid je injektovan u desnu lateralnu ventrikulu hTau BAC transgenih miševa. Injektovano je dva ili četiri mikrolitra PBS rastvora koji sadrži 100 ug/ul oligonukleotida. Tkivo je sakupljeno neposredno posle ili 1 sat, 4 sata, 24 sata, 2 nedelje, 4 nedelje, 12 nedelja ili 24 nedelje nakon primene oligonukleotida. RNK je ekstrahovana iz hipokampusa ili korteksa i ispitana na ekspresiju iRNK humanog tau putem PCR analize u realnom vremenu. Nivoi iRNK humanog tau su izmereni kao što je prethodno opisano. Rezultati su izračunati kao procenat inhibicije ekspresije iRNK humanog tau normalizovan na nivoe GAPDH u poređenju sa kontrolnim nelečenim miševima. Protein je ekstrahovan iz hipokampusa ili korteksa i ispitan na nivoe ekspresije humanog tau proteina putem ELISA i normalizovan na ukupan nivo proteina.

[0130] In vivo aktivnost 5-10-5 gapmera koji sadrže SEQ ID NO: 284 ili SEQ ID NO: 285 je testirana koristeći postupke koji su prethodno opisani. Kao što je prikazano u tabeli 12, oba antisens oligonukleotida značajno inhibiraju ekspresiju iRNK humanog tau u korteksu i hipokampusu 2 nedelje nakon jedne ICV injekcije antisens oligonukleotida. Nokdaun iRNK humanog tau je bio približno 65% u korteksu kao i hipokampusu za gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 285. Nokdaun iRNK humanog tau je bio približno 42% u korteksu kao i hipokampusu za gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 284. Što se tiče nivoa tau proteina 2 nedelje nakon lečenja putem ASO, gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 285 eliminisao je oko 50% ekspresije tau proteina u korteksu, a gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 284 eliminisao je oko 36% ekspresije tau proteina u korteksu. Nismo uočili značajno smanjenje nivoa tau proteina u hipokampusu 2 nedelje nakon ASO lečenja.

Tabela 12: Inhibicija ekspresije iRNK tau i proteina putem 5-10-5 MOE gapmera in vivo

[0131] Nivo tau iRNK i proteina je takođe testiran 4 nedelje nakon jedne ICV injekcije gapmera. Antisens oligonukleotidi koji obuhvataju SEQ ID NO: 285 značajno su inhibirali ekspresiju iRNK (SL.2D) i proteina (SL.2E) humanog tau u mozgu. Nokdaun iRNK humanog tau je bio približno 60% u korteksu kao i hipokampusu za gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 285 (SL.2D i podaci koji nisu prikazani). Vestern blot analiza je pokazala da gapmer koji obuhvata SEQ ID NO: 285 smanjuje nivo humanog tau proteina za približno 50% u hipokampusu 4 nedelje nakon lečenja (SL.2E).

[0132] Za detekciju moždane distribucije antisens oligonukleotida u mozgu hTau BAC transgenih miševa, obavljeni su eksperimenti in situ hibridizacije koristeći sondu zaključane nukleinske kiseline (LNA<™>, Exiqon) dvostruko obeleženu digoksigeninom (DIG).

Dvostruke-DIG LNA sonde koje su komplementarne sa ciljnim antisens oligonukleotidima hibridizovane su preko noći. Sonde su zatim detektovane koristeći antitelo konjugovano sa ovčjom anti-DIG alkalnom fosfatazom (Roche Diagnostics, kat. br.11093274910) i kolorimetrijsku reakciju nitro plavog tetrazolijuma konjugovanog sa supstratom alkalne fosfataze 5-brom-4-hlor-3-indolil fosfatom (BCIP). Moždana raspodela antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285 u reprezentativnom eksperimentu prikazana je na SL.3, koja pokazuje inicijalnu difuziju ASO iz ventrikula u parenhim mozga miša i signal za distribuciju se ne menja od 24 h do 2. nedelje. (SL.3). Antisens oligonukleotid je stabilan u mozgu čak i nakon 4 nedelje (podaci nisu prikazani).

[0133] Inhibicija iRNK (SL.4A) i proteina (SL.4B) humanog tau zavisna od doze kod hTau BAC transgenog miša putem antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285 je uočena (SL.4A i 4B).

[0134] Vremenski tok nivoa ekspresije humane tau iRNK (SL.5A) i proteina (SL.5B) kod hTau BAC transgenog miša nakon jedne ICV injekcije 200 ug antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285 pokazao je zadržanu inhibiciju ekspresije tau iRNK i proteina do 12 nedelja pomoću antisens oligonukleotida SEQ ID NO: 285 (SL.5A i 5B).

Referentni primer 10 (nije deo pronalaska): Inhibicija ekspresije humanog tau u Huh7 i SH-SY5Y ćelijama putem dodatnih 5-10-5 gapmera sa 5-metilcitozinom

[0135] Sekvence dodatnih gapmera sa 5-metilcitozinom koji ciljaju tau su testirane na inhibiciju ekspresije iRNK humanog tau in vitro u Huh7 i SH-SY5Y ćelijama kao što je prethodno opisano. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 13 prikazuje aktivnosti dodatnih ispitanih sekvenci 5-10-5 gapmera kod Huh7 i SH-SY5Y ćelija.

Tabela 13: Inhibicija iRNK tau putem 5-10-5 MOE gapmera u Huh7 i SH-SY5Y ćelijama

1

2

4

1

2

4

[0136] Gapmeri koji su značajno smanjili ekspresiju iRNK tau u tabeli 13 izabrani su i testirani u SH-SY5Y ćelijama. IC50 vrednosti izabranih 5-10-5 gapmera sa 5-metilcitozinom utvrđene su u SH-SY5Y ćelijama kao što je prethodno opisano, i prikazane u tabeli 14.

Tabela 14: IC50 izabranih 5-10-5 gapmera sa 5-metilcitozinom u SH-SY5Y ćelijama

Primer 11: Inhibicija ekspresije majmunskog i humanog tau putem antisens oligonukleotida sa 5-metilcitozinom

[0137] Neki gapmeri koji značajno smanjuju ekspresiju iRNK Tau su izabrani i testirani u COS1 ćelijama zelenih majmuna. Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 15 prikazuje aktivnost izabranih 5-10-5 gapmera u COS1 ćelijama.

Tabela 15: Inhibicija iRNK tau zelenog majmuna putem 5-10-5 MOE gapmera u Cost ćelijama

[0138] Neki antisens oligonukleotidi koji značajno smanjuju ekspresiju iRNK tau izabrani su i testirani u neuronima dobijenim od matičnih ćelija humanih embriona (hESC). Rezultati su dati kao procenat rezidualne tau iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje su tretirane PBS-om. Tabela 16 prikazuje aktivnost izabranih antisens oligonukleotida u humanim neuronima.

Tabela 16: Inhibicija ekspresije humanog Tau u hESC dobijenim neuronima putem izabranih Tau ASO

Referentni primer 12 (nije deo pronalaska): In vivo testiranje gapmera koji ciljaju MAPT

[0139] In vivo aktivnost izabranih 5-10-5 gapmera je testirana koristeći postupke koji su opisani u primeru 9. Kao što je prikazano u tabeli 17, neki antisens oligonukleotidi značajno inhibiraju ekspresiju iRNK i proteina humanog tau u korteksu i hipokampusu.

Tabela 17: Inhibicija ekspresije iRNK tau i proteina putem 5-10-5 MOE gapmera in vivo

1

[0140] Ako nije drugačije definisano, tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje je uobičajeno poznato stručnjaku upoznatom sa oblašću kojoj otkriće pripada.

[0141] Ako nije drugačije naznačeno, svi postupci, koraci, tehnike i obrade koji nisu specifično detaljno opisani mogu da se obavljaju, i obavljani su na način koji je sam po sebi poznat, kao što će biti jasno stručnjaku. Na primer, ponovo se upućuje na ovde pomenute standardne priručnike i opštu poznatu struku, i na dalje reference koje su u njima navedene.

1 1

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Oligonukleotid koji obuhvata sekvencu nukleobaza koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa:

GGTTGACATC GTCTGCCTGT (SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 285)

pri čemu, C je u svakoj sekvenci nukleobaza citozin ili 5-metilcitozin, i pri čemu najmanje jedan nukleotid oligonukleotida ima 2'-modifikaciju.

2. Oligonukleotid iz zahteva 1, pri čemu oligonukleotid obuhvata sekvencu nukleobaza koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa:

GGTTGACATC GTCTGCCTGT (SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 285)

3. Oligonukleotid iz zahteva 2, pri čemu oligonukleotid obuhvata sekvencu nukleobaza:

GGTTGACATC GTCTGCCTGT (SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 285);

4. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-3, pri čemu je internukleozidna veza oligonukleotida fosfodiestarska ili fosforotioatna veza.

5. Oligonukleotid iz zahteva 4, pri čemu, internukleozidna veza oligonukleotida je fosforotioatna veza.

6. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 4-5, pri čemu oligonukleotid obuhvata najmanje pet uzastopnih 2'-dezoksinukleozida, poželjno najmanje sedam uzastopnih 2'-dezoksinukleozida, poželjnije deset uzastopnih 2'-dezoksinukleozida.

7. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 5-6, pri čemu oligonukleotid smanjuje ekspresiju tau iRNK ili proteina putem aktivacije RNaze H.

8. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-7, pri čemu, svako C u bilo kojoj sekvenci nukleobaza je 5-metilcitozin.

9. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-8, pri čemu, 2'-modifikacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od 2'-fluor, 2'-dezoksi-2'-fluor, 2'-O-metil, 2'-O-metoksietil (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloksietil (2'-O-DMAEOE) i 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA).

10. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-9, pri čemu, 2'-modifikacija je 2'-O-metoksietil (2'-O-MOE).

11. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-10, pri čemu oligonukleotid može da smanji nivo ekspresije tau iRNK ili proteina za najmanje 30% in vitro, ili za najmanje 30% in vivo.

12. Oligonukleotid koji obuhvata sekvencu nukleobaza izabranu iz grupe koja se sastoji od G*G*T*T*G*ACATCGTCTGC*C*T*G*T* (SEQ ID NO: 208) i G*G*T*T*G*A<m>CAT<m>CGT<m>CTG<m>C*<m>C*T*G*T* (SEQ ID NO: 285), pri čemu nukleotidi sa * imaju 2'-0-MOE modifikaciju, nukleotidi bez * su 2'-dezoksinukleozidi,<m>C označava 5'-metilcitozin i internukleozidne veze su fosforotioatne.

13. Kompozicija koja sadrži oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-12 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

14. Oligonukleotid iz bilo kog od zahteva 1-12 ili kompozicija prema zahtevu 13 za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa tau proteinom kod ispitanika kome je to potrebno.

15. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je bolest povezana sa tau izabrana iz grupe koja se sastoji od Alchajmerove bolesti (AD), kompleksa amiotrofične lateralne skleroze/parkinsonizma-demencije (ALS-PDC), bolesti

1

argirofilnih zrna (AGD), amiloidne angiopatije britanskog tipa, cerebralne amiloidne angiopatije, hronične traumatske encefalopatije (CTE), kortikobazalne degeneracije (CBD), Krojcfeld-Jakobove bolesti (CJD), dementia pugilistica, difuznih neurofibrilarnih čvorova sa kalcifikacijom, Daunovog sindroma, Dravetovog sindroma, epilepsije, frontotemporalne demencije (FTD), frontotemporalne demencije sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17 (FTDP-17), frontotemporalne lobarne degeneracije, gaglioglioma, gangliocitoma, Gerštman-Štrausler-Šajnkerove bolesti, Halervorden-Spacove bolesti, Hantingtonove bolesti, miozitisa sa inkluzivnim telašcima, olovne encefalopatije, Guamske bolesti, meningioangiomatoze, multiple sistemske atrofije, miotonične distrofije, Niman-Pikove bolesti tipa C (NP-C), neguamske bolesti motornog neurona sa neurofibrilarnim čvorovima, Pikove bolesti (PiD), postencefalitičnog parkinsonizma, cerebralne amiloidne angiopatije prionskog proteina, progresivne subkortikalne glioze, progresivne supranuklearne paralize (PSP), subakutnog sklerozirajućeg panencefalitisa, demencije samo sa čvorovima, demencije pretežno sa čvorovima, multi-infarktne demencije, ishemijskog moždanog udara ili tuberozne skleroze.

1 4