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CN120958129A - 用于治疗癌症的多核苷酸组合物和方法 - Google Patents

用于治疗癌症的多核苷酸组合物和方法

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CN120958129A
CN120958129A CN202480019822.6A CN202480019822A CN120958129A CN 120958129 A CN120958129 A CN 120958129A CN 202480019822 A CN202480019822 A CN 202480019822A CN 120958129 A CN120958129 A CN 120958129A
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CN
China
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sequence
engineered polynucleotide
nucleotides
engineered
spliceosome
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Application number
CN202480019822.6A
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English (en)
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卡约·布鲁诺昆塔德索萨利尔
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Apta Biotech
Original Assignee
Apta Biotech
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Filing date
Publication date
Application filed by Apta Biotech filed Critical Apta Biotech
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Abstract

本公开提供了与mRNA前体和剪接体相互作用以调节基因表达的工程化多核苷酸。该工程化多核苷酸可以具有募集剪接体和在外显子‑内含子剪接点处与靶序列互补的靶向序列的茎环结构，并且可以包括具有2’修饰和硫代磷酸酯键联的核苷酸。该工程化多核苷酸可以施用于对象以治疗癌症。

Description

用于治疗癌症的多核苷酸组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2023年1月18日提交的美国临时申请号63/480,466的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
异常剪接与许多疾病状态有关。信使RNA前体(mRNA前体)的正确剪接对于蛋白质的正确翻译至关重要。必须调节剪接效率，以确保mRNA前体的正确剪接以及适当的过早聚腺苷酸化抑制，从而避免产生错误折叠且可能致病的蛋白质。核糖核酸(RNA)水平的基因调节效率仍然有限。因此，有开发用于例如在治疗有效且安全的水平下调节基因表达和活性的多核苷酸组合物和方法的需求。
发明内容
在一些方面，本文描述了一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含工程化多核苷酸的药物组合物，所述多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
在一些方面，本文描述了一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括：向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)紫杉烷类药物和(b)工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。在一些实施方案中，与施用紫杉烷类药物但未施用工程化多核苷酸的对象相比，所述方法改善所述对象的预后。在一些实施方案中，所述方法降低对象中的tau的总水平，从而减少与所述紫杉烷类药物结合的tau的量。
在一些方面，本文描述了一种改善已施用紫杉烷类药物的患有癌症的对象的预后的方法，其中所述方法包括：向所述对象施用包含工程化多核苷酸的药物组合物，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。在一些实施方案中，所述方法降低对象中的tau的总水平，从而减少对象中与紫杉烷类药物结合的tau的量。
在一些实施方案中，所述癌症选自：脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidney cancer)、肺癌和肝癌。在一些实施方案中，所述癌症选自：胶质母细胞瘤(GBM)、神经母细胞瘤、肝细胞癌、乳腺腺癌、人前列腺腺癌、肾细胞癌和肾腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是GBM。
在一些实施方案中，本文公开的方法减少所述对象的一种或多种转录物的过早聚腺苷酸化。在一些实施方案中，本文公开的方法减少所述对象的一种或多种转录物的隐蔽剪接。在一些实施方案中，本文公开的方法提高与组织病理学发现相关的评分。在一些实施方案中，所述组织病理学发现包括肿瘤分级、脂质含量、坏死或核质比(N:C)。
在一些实施方案中，所述方法降低肿瘤体积比率。在一些实施方案中，所述方法减缓肿瘤进展。在一些实施方案中，所述方法改变tau的表达。在一些实施方案中，所述方法降低tau的表达。在一些实施方案中，所述方法减少对象中的tau的总量。在一些实施方案中，所述方法降低Akt的表达。在一些实施方案中，所述方法降低胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸通过静脉内施用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸通过鞘内施用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸通过皮下注射、肌内注射、皮内注射、透皮注射(transdermal injection)经皮施用(percutaneous administration)、鼻内施用、淋巴管内注射、鞘内施用、肺部施用、直肠施用胃内施用或任何其他合适的肠胃外施用进行施用。
在一些方面，本文描述了一种降低细胞活力的方法，所述方法包括：向细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为特异性地结合信使核糖核酸前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体；(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
在一些方面，本文描述了一种降低细胞增殖率的方法，所述方法包括：向细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体；(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
在一些实施方案中，所述方法增加细胞坏死或凋亡。在一些实施方案中，所述方法增加所述细胞处于G2/M期的倾向。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是胶质瘤、神经母细胞瘤或癌。
在一些方面，本文描述了一种改变多个细胞的细胞周期阶段分布的方法，所述方法包括：向所述多个细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体；(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
在一些实施方案中，所述方法增加处于G2/M期的细胞数量。在一些实施方案中，所述方法增加处于坏死期或凋亡期的细胞数量。在一些实施方案中，所述多个细胞包括肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞包括胶质瘤、神经母细胞瘤或癌。
在一些方面，本文描述了一种降低神经元的tau表达的方法，所述方法包括：向所述神经元施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。在一些实施方案中，所述神经元来自患有癌症的个体。在一些实施方案中，所述方法减少所述神经元的一种或多种转录物的隐蔽剪接。
在一些方面，本文描述了一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的所有核苷酸间键均包含硫代磷酸酯键联，并且其中所述工程化多核苷酸的位置1-5和20-24处的核苷酸包含2’-O-甲基部分，从而调节U1 snRNP复合物的形成。
在一些方面，本文描述了一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的工程化多核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的核苷酸间键包含硫代磷酸酯键联，在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的位置1-5和20-24处的核苷酸包含2’-O-甲基部分。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用紫杉烷类药物。
在一些方面，本文描述了一种治疗患有癌症的对象的方法，其中所述对象已施用紫杉烷类药物，所述方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的核苷酸间键包含硫代磷酸酯键联，并且其中所述工程化多核苷酸的位置1-5和20-24处的核苷酸包含2’-O-甲基部分，从而降低所述对象中的tau蛋白水平和tau与所述紫杉烷类药物的结合。
在一些实施方案中，本文公开的方法调节U1 snRNP复合物的形成。
在一些方面，本文描述了用于整个本公开内容中公开的方法中的工程化多核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-4中任一个至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或4中任一个相同或互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含：一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和募集部分，所述募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述转录后调节部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。在一些实施方案中，靶向部分与所述靶序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，靶向部分与所述靶序列的共有序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，所述靶序列包含剪接位点。在一些实施方案中，剪接位点是保守剪接位点。在一些实施方案中，剪接位点包含5’-GU-3’在一些实施方案中，mRNA前体由所述靶基因编码在一些实施方案中，所述方法改变所述靶基因的表达或活性。
在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分包含：第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第一靶标序列；和第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第二靶标序列。在一些实施方案中，所述第一靶标序列包含所述靶序列中的共有序列。在一些实施方案中，所述第二靶标序列包含所述靶序列中的共有序列。在一些实施方案中，所述第一和第二靶标序列在所述靶序列中相隔不超过五个核苷酸(例如，一个或两个核苷酸)的间隔序列。在一些实施方案中，所述靶序列包含所述mRNA前体中的外显子-内含子边界。在一些实施方案中，所述第一和第二靶标序列均位于外显子-内含子边界的5’或3’。在一些实施方案中，所述第一和第二靶标序列中的一个位于所述外显子-内含子边界的5’；并且其中所述第一和第二靶标序列中的另一个位于所述外显子-内含子边界的3’。在一些实施方案中，所述靶序列包含所述mRNA前体中的剪接位点。在一些实施方案中，所述第一或第二靶标序列包含所述mRNA前体中的剪接位点(例如，5’ss)。在一些实施方案中，所述第一和第二靶向部分中的一个位于所述募集部分的5’，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个位于所述募集部分的3’。在一些实施方案中，所述靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。在一些实施方案中，所述第二靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。与所述核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列可以为约2个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，所述募集核苷酸序列包含：(i)与U1 snRNA的茎环II(SL2)的至少4个核苷酸互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与表1中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分包含与选自表1的5’-靶向部分序列栏的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的3’-靶向部分序列栏中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分包含与表1的3’-靶向部分序列栏中所示的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的5’-靶向部分序列栏中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与内含子供体位点的共有序列(例如，选自GU、GT、GC和CA)相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与外显子供体位点的共有序列(例如，G)相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与选自GU、GC、G和CA的共有序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述剪接体部分选自剪接体核糖核蛋白复合物、剪接体小核核糖核酸(snRNA)、剪接体蛋白、其功能变体或其功能片段。在一些实施方案中，所述剪接体部分包含U1 snRNA和剪接体蛋白。在一些实施方案中，所述剪接体snRNA选自U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U14atac、U6atac及其组合。在一些实施方案中，所述剪接体蛋白选自Sm、U1-70k、U1A、U1C及其组合。在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述募集部分与snRNA(例如，U1snRNA)的茎环-II区互补。在一些实施方案中，所述募集部分与snRNA(例如，U1 snRNA)的茎环-II区杂交。在一些实施方案中，所述募集部分包含AGGCC。在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列的至少五个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列的约5至约10个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含(例如，二级)结构特征。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含顶环、上茎、内环、下茎或其组合。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，所述茎包含两个互补的茎序列。在一些实施方案中，所述茎(例如，所述下茎或所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，所述环是与包含两个互补茎序列的所述茎(例如，所述下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环。在一些实施方案中，所述内环包含不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，所述另一茎(例如，所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸还包含顶环。在一些实施方案中，所述顶环包含不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。在一些实施方案中，当所述工程化多核苷酸与所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)碱基配对。在一些实施方案中，当所述工程化多核苷酸与所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性相互作用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸(被配置为与U1-C蛋白的锌指共价地相互作用(例如，通过二硫键)。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指非共价地相互作用(例如，通过氢键)。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的茎环结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述部分序列包含与U1 snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列。在一些实施方案中，所述部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的内环基本上不表现出与U1snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的下茎基本上不表现出与U1 snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，所述锚定序列包含与5’-CACGUUA-3’对应的序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一个2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸为2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，所述2’-修饰的核苷酸包括2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基、2’-甲氧基乙基、2’氟或2’-氨基乙基核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包括通过核苷酸间键联连接的核苷酸，并且所述核苷酸间键联中的至少一个不包含磷酸酯。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包括通过核苷酸间键联连接的核苷酸，并且所述核苷酸间键联中的至少一个包含硫(S)；硒(Se)；BR3，其中每个R独立地选自氢、烷基和芳基；碳(C)；或NR2，其中每个R独立地选自氢、烷基和芳基。
在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联为硫代磷酸酯。在一些实施方案中，所述核苷酸间键联包含甲基膦酸酯、羟基氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基或亚甲基氧基甲基亚氨基。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸为约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约10至约25个核苷酸。在一些实施方案中，所述募集部分包含约10至约30个核苷酸、或约10至约20个核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分各自独立地包含约2至约15个核苷酸、约2至约10个核苷酸、或约2至约8个核苷酸。在一些实施方案中，所述第一和第二靶向部分中的一个包含约2个核苷酸，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个包含约5或6个核苷酸。在一些实施方案中，当与所述工程化多核苷酸和所述mRNA前体结合时，所述剪接体部分切割或剪接所述靶序列中的所述mRNA前体。在一些实施方案中，所述剪接体部分进一步促进对切割的mRNA前体的修饰。
在一些方面，本文描述了一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含与表2-3中所示序列至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列，所述工程化多核苷酸的特征在于(例如，二级)结构特征。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与表2-3中所示序列相同或互补。在一些实施方案中，所述结构特征包含一个或多个茎环结构。在一些实施方案中，所述结构特征包含顶环、上茎、内环、下茎或其组合。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，所述茎包含两个互补的茎序列。在一些实施方案中，所述茎(例如，所述下茎或所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，所述环是与包含两个互补茎序列的所述茎(例如，所述下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环。在一些实施方案中，所述内环包含不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，所述另一茎(例如，所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸还包含顶环。在一些实施方案中，所述顶环包含不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸还包含一个或多个与靶基因的靶序列足够相同或互补的靶向部分。在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与所述靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。在一些实施方案中，所述靶基因是微管相关蛋白tau(MAPT)。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联为硫代磷酸酯。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含至少一个2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸为化学修饰核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸为2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约10至约25个核苷酸。
在一些方面，本文描述了一种用于改变细胞中信使核糖核酸前体(mRNA前体)的方法，所述方法包括使所述细胞与包含一个或多个靶向部分和募集部分的工程化多核苷酸接触，其中所述一个或多个靶向部分在所述mRNA前体中的靶序列处结合所述mRNA前体，并且所述募集部分募集所述mRNA前体的所述靶序列附近内的转录后调节部分(例如，剪接体部分)以改变所述细胞中的所述mRNA前体，从而产生一个或多个改变的mRNA前体。在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与基因(例如，靶基因)的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。在一些实施方案中，所述mRNA前体与靶基因对应。在一些实施方案中，所述靶基因是微管相关蛋白tau(MAPT)。在一些实施方案中，所述方法改变所述靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，在所述接触之前，所述细胞表现出与所述靶基因相对应的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质。
在一些实施方案中，所述工程化多核苷酸包含：(i)第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的第一靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体，其中所述第一靶向部分包含与5’-GTCCA-3’相同或互补的序列，(ii)募集部分，所述募集部分包含与SEQ ID NO:1至少90％相似或互补的序列，并且被配置为募集包含U1snRNA和U1-C蛋白的剪接体部分，其中所述募集部分包含顶环、与所述顶环相邻的上茎、下茎以及位于所述上茎和所述下茎之间的内环，和(iii)第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为在所述mRNA前体中的第二靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体，其中所述第二靶向部分包含与5’-CG-3’相同或互补的序列。
在一些方面，本文描述了一组工程化多核苷酸，每个工程化多核苷酸独立地包含：一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在靶序列处结合信使核糖核酸前体(mRNA前体)；和募集部分，所述募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)，其中所述工程化多核苷酸组被配置为在包括所述靶序列的多个靶序列处特异性地结合所述mRNA前体。
本文描述的另一个实施方案是工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的第一靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体；募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分；和第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为在所述mRNA前体中的第二靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体；其中，所述募集部分包含顶环、与所述顶环相邻的上茎、下茎以及位于所述上茎和所述下茎之间的内环；并且其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分改变包含所述第一靶标序列和所述第二靶标序列的靶序列中的所述mRNA前体。在一些实施方案中，所述第一靶向部分与所述第一靶序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，所述第二靶向部分与所述第二靶序列互补和/或杂交。在一些方面，所述第一靶标序列和第二靶标序列在所述靶序列中相隔不超过五个核苷酸的间隔序列。在一些方面，所述靶序列包含所述mRNA前体中的外显子-内含子边界。在一些方面，所述第一靶标序列位于所述外显子-内含子边界的5’，并且所述第二靶标序列位于所述外显子-内含子边界的3’。在一些方面，所述第一靶向部分包含与表1的外显子序列栏所示的序列相同或互补的序列；并且所述第二靶向部分包含与表1的内含子序列栏所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述第一靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。在一些实施方案中，所述第二靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。在一些实施方案中，与所述核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列可以为约2个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，所述募集部分与snRNA(例如，U1 snRNA)的茎环-II区互补。在一些实施方案中，所述募集部分与snRNA(例如，U1 snRNA)的茎环-II区杂交。在一些实施方案中，所述募集部分包含AGGCC。在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列的至少五个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述募集部分包含与表2-3中所示序列的约5至约10个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列在一些方面，所述剪接体部分包含U1 snRNA和U1-C蛋白。在一些方面，所述上茎或所述下茎包含两个互补序列，并且这两个互补序列各自包含不超过5个核苷酸；所述内环包含两个核酸序列，并且这两个核酸序列各自包含不超过5个核苷酸；并且所述顶环包含不超过8个核苷酸的核酸序列。在其他方面，当与所述工程化多核苷酸结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1snRNA的RNA结合结构域(RBD)碱基配对，并且当与所述工程化多核苷酸和所述剪接体部分结合时，所述剪接体部分基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性相互作用。在另一个方面，所述工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在另一个方面，所述募集部分包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)序列的至少4个核苷酸互补的核苷酸序列。在另一个方面，U1 snRNA的SL2序列包含5’-GGCCU-3’。所述工程化多核苷酸可以具有2’-修饰的核苷酸。所述工程化多核苷酸的至少50％的所述核苷酸可以是2’-修饰的核苷酸。所述2’-修饰的核苷酸可以是2’-甲氧基核苷酸。在另一个方面，所述工程化多核苷酸包含通过核苷酸间键联连接的核苷酸，并且所述核苷酸间键联中的至少一个不包含磷酸酯。至少一个或50％、60％、70％、80％或90％的所述核苷酸间键联可以是硫代磷酸酯。
附图说明
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。专利局将根据请求和收到的必要费用来提供带有彩色附图的本专利或专利申请的副本。
图1示出了用于鉴定剪接供体和剪接受体位点的示意图。动物和植物中信使核糖核酸(mRNA)剪接的示例共有序列为“GU_AG”，其中“GU”为示例剪接供体序列，并且“AG”为示例剪接受体序列。哺乳动物中较长的剪接供体共有序列可以为“GUrAGU”，其中“r”代表“G”或“A”。通常，“GU_AG”的表达意味着该序列的仅5’和3’末端两个核苷酸分别不变地为“GU”和“AG”，并且下划线表示的序列可以是任意序列。然而，本文所述的这种表达表示由下划线表示的序列可以是除与任何其他共有序列不匹配的序列之外的任意序列。剪接受体共有序列之前为分支点序列，其包含腺嘌呤，其连接至5’剪接位点核糖核苷酸以形成内含子套索；以及多嘧啶束(C或U)，其在分支点与剪接受体序列之间。虽然内含子的短GU_AG共有序列显然不足以区分众多的选择性剪接事件，但令人惊讶的是，我们对RNA剪接选择性调节需要什么其他序列信息知之甚少。位于内含子两侧侧翼的一个或两个核苷酸也通常是保守的，且它们包含在我们的补充表中，但本文不会进一步讨论它们，如此我们可以将我们的分析关注于在内含子端部的共有序列上。从这个意义上说，工程化多核苷酸的合理设计在逻辑上鉴定了剪接的内含子共有序列(GU_AG)。然后，使得确定供体位点(5’外显子和内含子下游)和受体(3’外显子和内含子下游)的保守区域成为可能。值得注意的是，保守和共有区域位于组成型剪接供体或受体的同一位点内。共有区域的识别决定了5’剪接位点，即外显子与内含子之间的连接界限。同时，对保守区域的识别鉴定了选择用于调节的转录物的身份。
图2A-2B示出了本文所述的示例工程化多核苷酸，其包含：(1)3’-靶向部分：3’-GC-5’；(2)下茎：3’-GA-5’/5’-CT3’；(3)内环：3’-CC-5’/5’-AA-3’；(4)上茎：3’-GGA-5’/5’-CCT-3’；(5)顶环：3’-CTT-5’；和(6)5’-靶向部分：5’-GTCCA-3’。图2C示出了示例工程化多核苷酸与靶mRNA前体序列的相互作用。图2D示出了示例工程化多核苷酸与U1 RNP复合物的多种组分的相互作用。
图3A-3B示出了通过工程化多核苷酸“茎5’/3’”(又名，5’-靶向部分或/和3’-靶向部分)发生的锚定，该工程化多核苷酸被设计为与存在于组成型供体位点中的保守部分相互作用。图3A。茎5’/3’(GTCCA和CG)，诸如硫代磷酸酯核苷酸间键和2’O-甲基(2’O-ME)对分子糖的取代增加了对核酸内切酶的抗性，并增加了茎5’/3’的碱基与来自组成型供体的保守区域之间相互作用的分子强度。图3B。本文所述的工程化多核苷酸与组成型供体的相互作用，U1 snRNA的RNA结合部分(RBD)通过组成型供体剪接-外显子的剪接和沉默。
图4示出了人U1 snRNP的示意图。U1 snRNP由1个U1 snRNA、7个常见Sm蛋白和3个U1 snRNP特异性蛋白(U1-70K、U1A和U1C)组成。U1 snRNA的二级结构由四个茎环(SL)和突出显示的H螺旋组成。示出了形成H螺旋的核苷酸。此外，还给出了与RNA:蛋白质或RNA:5’ss相互作用相关的U1 snRNA序列。SL1的环部分是根据晶体结构绘制的。它由A29和A36之间形成的反式WC/Hoogsteen碱基对封闭。还示出了U1 snRNP的蛋白质组分、它们的大小和它们的大致位置。由显示为绿色圆圈的Sm蛋白形成的Sm环与框出的Sm位点结合。显示为红色的U1-70K识别SL1。显示为黄色的U1A结合SL2。显示为蓝色的U1C通过与U1-70K和Sm蛋白的蛋白质:蛋白质相互作用被募集至U1 snRNP。标注表示U1C与Sm环之间的相互作用。
图5A-5C示出U1 snRNP与mRNA前体的5’外显子-内含子连接点结合，且因此在mRNA前体剪接的早期阶段发挥关键作用。示出了工程化U1子结构的两个晶体结构，它们共同以原子分辨率揭示了U1snRNP内几乎完整的蛋白质-蛋白质和RNA-蛋白质相互作用网络，并示出了通过U1 snRNP如何识别mRNA前体的5’剪接位点。U1-C的锌指与mRNA前体和U1 snRNA5’端之间的双链体相互作用。RNA双链体的结合通过U1-C和剪接点周围的RNA主链之间的氢键和静电相互作用来稳定，但U1-C与mRNA前体没有碱基特异性接触。该结构与RNA结合测定一起显示，由U1 snRNP对5’-剪接位点核苷酸的选择主要是通过与U1 snRNA的碱基配对来实现的，而U1-C则微调不匹配的5’-剪接位点的相对亲和力。图5A。U1-70K与U1 snRNA茎环复合以及U1-A RRM与茎环2复合。图5B。U1 snRNA茎环1和2(55-MER)。图5C。U1小核核糖核蛋白A和70kDa。
图6示出了U1-70K与U1 snRNA茎环复合以及U1-A RRM与茎环2复合，通过U1-C锌指稳定化。
图7示出了由本文所述的工程化多核苷酸(ASMO1，也被称为APT20TTMG)对剪接体机制的调节的示意图。靶向部分(“茎5’/3’”)(5’-GTCCA-3’和5’-CG-3’)的锚定允许通过沉默U1 snRNA的RNA结合部分(RBD)与组成型供体的保守位点相互作用。U1 snRNP复合物的稳定化可以通过U1-C锌指的强离子吸引力(这是由ASMO1茎5’/3’的硫醇的二硫桥诱导的)观察到。mRNA前体/ASMO1双链体键通过U1-C与缝接点周围的mRNA前体主链之间的氢键和静电相互作用来稳定，但U1-C不会与mRNA前体进行碱基特异性接触。该结构表明，由U1 snRNP对5’-剪接核苷酸的选择主要是通过茎5’/3’与mRNA前体之间的相互作用来实现的。同时，U1-C通过U1-70 kDa和Sm环之间的相互作用桥调整5’-剪接不相容位点的相对亲和力并稳定剪接体机制的中央核心。可以观察到茎环II与上茎(又名“发夹-2”；见图2B)(3’-GGA-5’/5’-CCT-3’)和内环：(3’-mCC-5’/5’-AA-3’)的特定碱基(5’-AGGCC-3’)的静电相互作用和氢桥，与U1-A的聚腺苷酸化信号和乙酰化调节有关。值得注意的是，茎环II(5’-CAACGUUA-3’)中U1-A的锚定部分不会被上茎沉默，从而诱导基因表达和乙酰化水平的调节。此外，2’-OME基团的存在诱导介质分子动力学的变化，促进U1-snRNA的构象改变以及茎环II与ASMO1的近似，其中ASMO1靶向或募集部分不同于U1-A蛋白，从而通过聚腺苷酸化信号失调来减少阅读框过早中断的可能性。
图8示出U1-70K与U1 snRNA茎环的复合，以及U1-A RRM与茎环2的复合，通过U1-C锌指稳定。可以观察到，茎环II与上茎(3’-GGA-5’/5’-CCT-3’)和内环：(3’-mCC-5’/5’-AA-3’)的特定碱基(3’-CCGGA-5’)的静电相互作用和氢桥，与U1-A的聚腺苷酸化信号和乙酰化调节有关。值得注意的是，茎环II(5’-CAACGUUA-3’)中U1-A的锚定部分不会被上茎沉默，诱导基因表达和乙酰化水平的调节。此外，2’-OME基团的存在诱导介质分子动力学的变化，促进U1-snRNA的构象改变以及茎环II与本文所述的工程化多核苷酸(ASMO1)的近似。
图9A示出了位于SmD3上的U1-C并且其结合可以通过U1-70K的N末端来稳定化。图9B示出了U1-C与糖-磷酸酯主链原子形成氢键但不与RNA碱基接触。在5’SS链上，外显子序列的核苷酸着色为青色，内含子序列为黄褐色。图9C示出了5’-剪接位点识别的图示。红色虚线：由U1-C锌指氨基酸侧链形成的氢键。蓝色虚线：由U1-C锌指主链原子形成的氢键。绿色虚线：由U1-C锌指的氨基酸侧链形成的二硫键。橙色虚线：由U1-C锌指主链中的原子形成的二硫键。5’SS核苷酸由如图9B中的核编码。
图10A示出了指纹Z1 U1-C snRNP，由蓝色的36个氨基酸残基表示。图10B示出了U1-C snRNP的Z1指部分，呈现与5’组成型供体区域中的mRNA前体/ASMO1双链体相互作用的主要残基。图10C示出了含有145-aa的U1-C snRNP的代表性序列，其中以绿色突出显示的36-aa指的是锌指部分。
图11A-D示出了U-87细胞系在ASMO1(也称为“APT20TTMG”)中孵育后4个时间点的细胞活力。图11A示出了孵育24小时的结果。图11B示出了孵育48小时的结果。图11C示出了孵育72小时的结果。图11D示出了孵育96小时的结果。
图12A-12D示出了MCF-7细胞系在ASMO1中孵育后4个时间点的细胞活力。图12A示出了孵育24小时的结果。图12B示出了孵育48小时的结果。图12C示出了孵育72小时的结果。图12D示出了孵育96小时的结果。
图13A-13D示出了SHSY5Y细胞系在ASMO1中孵育后4个时间点的细胞活力。图13A示出了孵育24小时的结果。图13B示出了孵育48小时的结果。图13C示出了孵育72小时的结果。图13D示出了孵育96小时的结果。
图14A-C示出了PC-3细胞系在ASMO1中孵育后3个时间点的细胞活力。图14A示出了孵育24小时的结果。图14B示出了孵育48小时的结果。图14C示出了孵育72小时的结果。
图15A-15C示出了786-O细胞系在ASMO1中孵育后3个时间点的细胞活力。图15A示出了孵育24小时的结果。图15B示出了孵育48小时的结果。图15C示出了孵育72小时的结果。
图16示出了乳腺癌细胞系MCF-7对化合物ASMO1的内化的动力学。
图17示出了与ASMO1孵育后MCF-7细胞系中线粒体活性的评估。
图18示出了与ASMO1孵育后MCF-7细胞系的细胞周期阶段分布。
图19示出了与ASMO1孵育后MCF-7阶段的分布。
图20示出了与ASMO1孵育后MCF-7细胞系中的线粒体膜电位。
图21示出了神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y对化合物ASMO1的内化的动力学。
图22A-22B示出了在ASMO1中孵育后SH-SY5Y细胞系中的线粒体活性的评估。孵育24小时(图22A)和48小时(图22B)后进行MTT测定。
图23示出了与ASMO1孵育后SH-SY5Y细胞系的细胞周期阶段分布。
图24示出了与ASMO1孵育后SH-SY5Y阶段的分布。
图25示出了与ASMO1孵育后SH-SY5Y细胞系中的线粒体膜电位。
图26示出了与ASMO1(0.5μM)孵育24、48、96和144小时后在神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)中获得的细胞活力结果。
图27A-27B示出了与ASMO1(0.5μM)孵育24、48、96和144小时后在神经母细胞瘤细胞系中获得的MAPT表达和tau定量。图27A显示ASMO1(0.5μM)后不同时间点的MAPT表达。图27B显示ASMO1(0.5μM)后不同时间点的tau定量。
图28示出了胶质母细胞瘤细胞系U87-MG对化合物ASMO1的内化的动力学。
图29示出了与ASMO1孵育后U87-MG细胞系的细胞周期阶段分布。
图30示出了与ASMO1孵育后U87-MG阶段的分布。图31示出了与ASMO1孵育后U87-MG细胞系中的线粒体膜电位的定量。
图32显示与APT20TTMG孵育后U87-MG细胞系中的线粒体活性的评估。
图33示出了使用APT20TTMG对U87-MG细胞系的增殖的评估。
图34A-34C示出了在无胸腺裸小鼠的胶质母细胞瘤异种移植模型中静脉内施用APT20TTMG的效果。
图35A-35B示出了静脉内施用APT20TTMG对无胸腺裸小鼠的胶质母细胞瘤异种移植模型中的增殖标志物(Ki-67)的影响。
图36显示静脉内施用APT20TTMG对组织病理学发现和肿瘤体积总评分的影响。
图37A-37D显示施用APT20TTMG对无胸腺裸小鼠的胶质母细胞瘤异种移植模型中的信号传导通路蛋白的影响。
本公开的新颖特征在所附权利要求中特别阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述，将会获得对本公开的特征和优点的更好理解。
具体实施方式
本文描述了(例如，工程化)多核苷酸和(例如，药物)组合物以及其使用方法，例如，用于调节调节基因表达或活性。
本文描述了使用本公开中描述的工程化多核苷酸治疗癌症类型的方法。这些方法适用于各种癌症类型，诸如不同器官或细胞类型的癌症，或与不同遗传畸变相关或由其引起的癌症。本文描述的工程化多核苷酸可通过募集剪接体的组分来有效调节mRNA前体的剪接。不受特定机制的约束，剪接体的组分向mRNA前体的募集的改善可有效调节导致癌症的细胞机制。这些工程化多核苷酸可施用于患有癌症的对象，并可治疗癌症，例如通过减少癌细胞数量或阻止癌细胞增殖或转移。
在生理条件下，剪接负责处理信使RNA前体(mRNA前体)，去除内含子区域并连接外显子区域，从而产生成熟的mRNA。剪接由一系列snRNP和小核RNA(snRNA)的复合物进行。U1snRNP复合物是构成人类剪接体的五种复合物之一(命名为U1、U2、U4、U5和U6)。U1snRNP复合物由以下组成：U1 snRNA、七个形成七聚体环的Sm蛋白、以及三种另外蛋白质：U1-70K、U1A和U1C。在剪接体中，U1 snRNP复合物在剪接体组装的早期阶段在识别mRNA前体剪接位点(剪接供体位点)方面起着特定作用。然后，其他snRNP，诸如U2 snRNP，被吸引到剪接位点，并且它们的蛋白质组分之间的相互作用完成整个剪接体组装和剪接。此后，经过加帽和聚腺苷酸化的化学修饰后形成的成熟mRNA可以离开细胞核并翻译成蛋白质。除了在剪接中的作用外，U1snRNP还在积极抑制聚腺苷酸化机制使用早期(主要是内含子)聚腺苷酸化信号(这些信号会导致异常和截短的mRNA)方面发挥作用。准确剪接是基因表达中的必要步骤，也使得可变剪接成为可能，该可变剪接允许剪接位点识别的准确性和灵活性之间的平衡，并且从单个转录物创建具有多种不同、有时甚至是拮抗性生物学功能的多种同种型。
除了具有剪接功能外，U1 snRNP复合物还具有远端抑制(telescripting)功能，并且主动抑制聚腺苷酸化机制对近端聚腺苷酸化信号(PAS，这些信号主要位于内含子内)的利用，从而抑制被称为过早聚腺苷酸化的过程。值得注意的是，聚腺苷酸化是mRNA成熟的主要过程之一，并且包括通过去除3’端部分(通常位于3’非翻译区(UTR))并添加poly(A)尾来终止mRNA前体。该过程与剪接和5’加帽一起产生成熟的mRNA，影响转录物的稳定性、输出和翻译。U1 snRNP复合物对过早聚腺苷酸化的抑制防止产生异常和缩短的mRNA。
此外，U1 snRNP已被描述为与应激颗粒(细胞质RNA颗粒，其包含mRNA、相关翻译起始因子以及响应于各种应激而形成的各种RNA结合蛋白(诸如snRNP))有关，并且与溶酶体和自噬体-溶酶体生物发生中的自噬有关。
细胞中U1功能障碍引发的细胞周期重新进入已被假设为是可能导致过度增殖和癌症的因素之一。在多种癌症类型的情况下，观察到U1snRNP和snRNA在抑制RNA转录物的过早裂解和聚腺苷酸化方面发挥着重要作用，并且这些snRNP可能在细胞迁移和增殖中发挥作用。
事实上，许多研究已表明了可变聚腺苷酸化(APA)变化和失调在癌症及其进展中的重要性。除剪接过程外，聚腺苷酸化也是转录物多样性的来源，因为mRNA前体可能具有多个可变聚腺苷酸化信号(PAS)。几项研究已经发现APA对基因表达调节和功能的潜在影响。例如，分化良好的细胞(如神经元)通常使用位于终止密码子更远下游的远端PAS，导致具有更长3’UTR的转录物的表达以及蛋白质表达水平可能更低。相反，生长更快的细胞(主要是癌细胞)倾向于使用近端PAS，产生更短的3’UTR和可能更高的蛋白质表达水平。近端3’UTRPAS在多种癌细胞系和组织中的使用率增加与癌细胞增殖的促进有关。
除了过早聚腺苷酸化之外，有证据表明，在癌症如胶质母细胞瘤(GBM)中，剪接体也发生了改变，从而激活了与肿瘤进展和严重程度相关的致癌剪接事件。在一组定义明确的成人型弥漫性胶质瘤(主要为GBM)中，观察到剪接体成分(诸如U1小核RNA(RNU1))和协同识别靶内含子的剪接因子的表达功能障碍。值得注意的是，在特定剪接因子(诸如RBM22、RBM3、PTBP1，尤其是SRSF3)沉默后，观察到细胞增殖和迁移、肿瘤球形成和凋亡诱导减少。这些影响可能是通过调节关键信号传导通路(诸如PDGFRB和PI3K-AKT/ERK)介导的，这些通路是胶质瘤中的促癌通路。
多项研究已表明这些机制在与snRNP的组装(即U1 snRNP的生物发生)有关的癌症中的重要性。例如，已在人宫颈上皮样癌(HeLa)细胞系中鉴定了这些snRNP与细胞迁移和增殖之间的潜在关联。本研究表明，使用反义吗啉代寡核苷酸(U1 AMO，旨在靶向U1 snRNA)抑制U1snRNA会导致广泛的转录提前终止和mRNA 3’-UTR缩短，这是由于在内含子和最后一个外显子中使用了更近端的PAS，从而产生了较短的mRNA同种型。有趣的是，即使是较低浓度的U1 AMO(影响约15-30％的U1 snRNA表达)，也能增强癌细胞的迁移和侵袭性质。此外，这种现象与致癌基因的上调和肿瘤抑制基因的下调相关。当U1 snRNA过表达时，观察到相反的效果，即降低癌细胞的迁移和侵袭。在一项同样使用HeLa细胞的对比研究中，U1 snRNA的过表达逆转了DNA损伤，尤其是紫外线处理引起的损伤。这种DNA损伤的主要特征是U1snRNA水平降低，同时显著调节内含子可变切割和3′UTR中的聚腺苷酸化，导致3UTR缩短和基因的延长以及截短的转录物的表达。总而言之，这些研究强调了聚腺苷酸化在调节癌细胞命运中的关键作用。
另一项在肝细胞癌(HCC)中的研究表明，U1A表达(经mRNA表达和免疫组织化学验证而证实)与肿瘤分期和分级呈正相关，是HCC的独立不良预后因素。为进一步了解U1A在HCC中的作用而敲低U1A抑制迁移和细胞周期进程，同时促进HCC细胞系的凋亡。此外，还观察到U1AmRNA表达与肿瘤浸润免疫细胞之间的关联。另一项涉及HCC细胞系和HeLa的研究表明，敲低U1A还会导致CCN2表达和结缔组织生长因子(CTGF)分泌大幅下降(CTGF蛋白由CCN2致癌基因编码)，从而减少细胞迁移和增殖。值得注意的是，CTGF参与细胞增殖、血管生成和迁移，这一现象对上皮-间质转化以及最终的转移至关重要。同样，U1A在肺腺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌组织(LUSC)中上调。U1A的高表达与LUAD病例的首次进展和进展后生存预后较差相关。然而，U1A的4％的遗传改变(如错义突变和深度缺失)率与LUSC病例(而不是LUAD病例)的总生存预后相关。在LUAD和LUSC中，U1A的表达与M2巨噬细胞的浸润水平呈负相关，而与滤泡B辅助性T细胞的浸润水平呈正相关。此外，在LUAD发病机制中，U1A的表达与涉及细胞周期和泛素机制相关问题的基因有关，而对于LUSC主要观察到与RNA剪接相关的细胞问题(例如，剪接体、RNA剪接、mRNA前体结合、可变mRNA剪接等)的相关性。
综上所述，这些关于不同癌症类型的U1 snRNP研究可能表明，U1稳态对于维持正常基因同种型的表达平衡至关重要，而U1 snRNP失衡可能影响癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，调节U1可能成为肿瘤治疗的一个靶点。事实上，调节癌症中U1 snRNP的活性有可能纠正剪接和过早聚腺苷酸化功能障碍引起的病理效应，因为在生理条件下，U1snRNP参与了这两种机制。U1 snRNP是负责选择剪接位点并通过结合通常含有GU序列的5’剪接位点(称为供体剪接位点)来促进剪接体组装的剪接机制的必要组成部分。它还在抑制mRNA前体的3’端(特别是在位于内含子内的富含GU的区域内)的过早切割和聚腺苷酸化方面发挥着至关重要的作用。这种抑制机制阻止了聚腺苷酸化机制识别这些隐蔽区域，否则这些隐蔽区域会导致截短和异常的mRNA转录物的产生。此外，强调U1 snRNP亚基(诸如U1-A、U1-C和U1-70K蛋白)的作用也很重要，它们已被确定为剪接和聚腺苷酸化的关键调节因子。因此，U1snRNP的正确功能及其远端抑制(telescripting)功能(包括抑制过早聚腺苷酸化和隐蔽剪接)保护mRNA前体并有助于调节可变聚腺苷酸化，从而避免促癌过程。
除了对U1 snRNP复杂调节的作用外，揭示ASMO在癌症治疗中的应用潜力的其它证据是ASMO调节tau表达的能力：用不同浓度的APT20TTMG(ASMO1)处理的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系显示，tau在mRNA和蛋白质水平上的表达以及细胞活力结果降低，这表明APT20TTMG处理具有潜在的细胞抑制作用。此外，用人胶质母细胞瘤癌(U-87MG)异种移植小鼠模型进行的体内研究也显示，与对照组相比，在APT20TTMG处理后，肿瘤tau表达降低，同时肿瘤体积减小。这些结果很有意义，因为越来越多的证据表明tau蛋白在癌症中发挥了作用。此外，作为微管结合蛋白，tau可能会干扰紫杉烷类药物(微管稳定药物)与微管蛋白的结合，因此，抗tau分子可以成为改善基于紫杉烷类药物的化疗的效果的一种策略。
例如，在乳腺癌细胞系中，已证实在tau表达与对紫杉烷类药物的响应之间存在关联：通过RNA干扰而敲低tau增强ZR75-1和MCF-7细胞系对紫杉烷类药物(紫杉醇和多西他赛)的敏感性，这可能与小于70kDa的tau蛋白同种型有关。此外，已证实雌激素受体(ER)信号传导会影响小于70kDa的tau蛋白同种型的表达，这可能影响对紫杉烷类药物的敏感性。此外，氟维司群(一种用作治疗转移性乳腺癌的药物的选择性雌激素受体降解剂)降低ER和tau的表达，并且其与紫杉烷类药物的组合增强tau和ER阳性乳腺癌细胞对紫杉烷类药物的敏感性。尽管如此，一项研究表明，在ER阳性患者中，患有tau阳性癌症的患者的无病生存期和总生存期比tau阴性肿瘤患者更好，但在tau表达与从紫杉醇获益之间没有显著的相互作用。在该研究的ER阴性患者中，tau表达没有预后价值。作者提出的一个问题是，为什么一项大型随机研究没有证实之前描述的临床前发现。一个可能的答案是，tau在紫杉醇耐药性(以及其他耐药性原因)中的作用可能仅对一小部分患者具有临床意义。但这种差异也可能是例如由化疗方案差异引起的。与患有乳腺癌的患者的观察结果相反，高tau表达与前列腺癌(PC)预后不良相关。此外，tau的敲低抑制了雄激素受体的表达(AR在进展为去势抵抗性PC的过程中起着决定性的作用)，并增加了对比卡鲁胺(一种阻止睾酮到达癌细胞的抗雄激素药物)的敏感性。用前列腺肿瘤细胞系ALVA-31衍生物(ALVA-NEO和ALVA-hCD40)进行的研究表明，除其他同种型外，所有六种可变剪接的成人脑tau同种型均有表达并高度磷酸化，其中大部分不与微管结合。此外，ALVA-NEO tau与PI3K/AKT相互作用，PI3K/AKT与许多癌症中的细胞存活和增殖相关。与此一致，在耐紫杉烷类药物的前列腺细胞系中，tau的下调通过PI3K/Akt/mTOR信号传导通路抑制细胞增殖，从而对紫杉烷类药物的细胞毒性敏感。
例如，在GBM中，通过短发夹干扰RNA(shRNA)方法在U87-MG细胞系中下调tau通过重新定位ROCK通过诱导细胞尾部低效回缩而显著降低2D细胞运动性。已知Rho-ROCK信号传导通过调节肌动蛋白细胞骨架而作用于细胞迁移和侵袭表型。在本研究中，观察到tau有助于微管和肌动蛋白细胞骨架的重塑，这两者对于迁移都至关重要。这种特性可能是由Rho-ROCK通路(其参与调节细胞后部的聚合)的活性受限引起的。所有这些作用都是通过tau诱导的微管成束和稳定而在上游启动的。tau的耗尽会扰乱U87MG细胞后部的这一微管和肌动蛋白组装平衡，也会扰乱细胞迁移中很重要的后部的细胞回缩。值得一提的是，在GBM细胞系(U118、U138和U251)中，U87-MG细胞表达的tau的量最高。另一项较新的研究(其使用shRNA敲低U87-MG细胞的多细胞球体(MCS)的3D模型中的tau)表明，通过影响细胞迁移和球体凝聚力，MCS生长和细胞逃逸受到抑制。还观察到由于N-钙粘蛋白错误定位导致的MCS致密性降低。此外，在胶质母细胞瘤异种移植模型中，注射U87MG sh-tau细胞(tau水平降低的细胞)的小鼠的中位存活率明显高于注射U87MG对照细胞的小鼠。基于这些结果，作者提出tau在胶质母细胞瘤中通过经由PI3K/AKT信号传导轴控制3D细胞组织和功能而发挥作用。
此外，在这项MCS研究中，提出了tau在控制PI3K/AKT信号传导和N-钙粘蛋白-β-连环蛋白中的作用的模型。N-钙粘蛋白连接负责球体致密性所必需的细胞间粘附，并且已经证实膜上的钙粘蛋白-连环蛋白复合物募集PI3K，从而启动信号传导级联。tau可能通过稳定微管网络来加强这些相互作用。具体而言，在PTEN无效突变的GBM细胞中(PTEN缺失在GBM中非常常见，这可能会刺激侵袭性行为)，提出tau通过微管依赖性相互作用促进N-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物的稳定和致密性，从而加强细胞间粘附。还提出tau通过促进肌动蛋白组装而参与细胞收缩。tau还通过不依赖MT的相互作用或通过增加的N-钙粘蛋白-β-连环蛋白信号传导来刺激PI3K-AKT信号传导通路的间接激活级联，从而导致细胞存活和增殖。在tau耗尽的U87MG细胞中，提出N-钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物向肌动蛋白细胞骨架的募集存在缺陷。在这种情况下，N-钙粘蛋白在膜上不稳定，导致MCS致密性丧失。此外，提出细胞间凝聚力的丧失与错误定位的N-钙粘蛋白对β-连环蛋白的隔离有关并且是由PI3K-AKT信号传导活性的降低引起的。还观察到磷酸化的Akt激酶的减少。由于这种建议的机制，预计在tau耗尽的GBM细胞中细胞增殖和迁移会受到抑制。此外，值得注意的是，tau蛋白被描述为具有广泛的相互作用组(包括与癌症相关的激酶蛋白的相互作用)，这也可能对涉及其他级联机制的细胞通路(诸如细胞信号传导、细胞运动和细胞代谢)产生影响。
与胶质母细胞瘤研究不同的是，用肾细胞癌系进行的研究表明，tau的下调增强了786-O细胞系的细胞生长和侵袭，并且tau可能在该癌症类型中发挥肿瘤抑制作用。类似地，在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y系中，通过CRISPR-Cas9技术敲除tau并通过RNA干扰(shRNA)敲低tau导致促凋亡肿瘤抑制因子P53的失调改变和活性改变，从而导致DNA损伤诱导的细胞凋亡减少和细胞衰老增加。与tau在神经母细胞瘤中的这种有益作用一致，另一项研究表明，tau mRNA表达较高(通过微阵列和RNA测序数据测量)的患者与儿童神经母细胞瘤中总生存率显著增加相关。tau表达较高与更好的结局相关，这一结果与以下相一致：tau高表达所示的样品中的某些凋亡效应基因(主要是CASP3和CASP9)的表达较高，而tau高表达的样品中的促增殖组蛋白基因的表达较低。tau表达较低的患者的总生存率也降低，MYCN扩增的发生率也显著较高(通常与神经母细胞瘤更差结局有关)。这些tau表达与良好结局相关的病例可能与导致细胞抑制作用的微管稳定有关，该细胞抑制作用是一种与广泛用于癌症治疗中的微管稳定剂如紫杉醇类似的机制。
因此，本公开提供了用作肿瘤疗法的工程化多核苷酸，以及使用这些工程化多核苷酸的相应方法。工程化多核苷酸可以通过稳态调节U1 snRNP的功能的机制、调节tau表达、这两者的组合(例如，协同地)发挥作用，并对所选癌症类型产生细胞抑制或细胞毒性作用，从而广泛应用于肿瘤治疗。为了允许这种U1调节，可以将工程化多核苷酸设计成具有尺寸化学修饰、构象化学修饰和策略性化学修饰，从而允许直接与U1C发生吸引和相互作用，并间接与U1-70K发生吸引和相互作用。工程化多核苷酸(例如，ASMO1)可以具有与mRNA前体中存在的高度保守区域互补的序列，这些区域通常位于内含子5’端的外显子-内含子连接点(称为供体剪接位点)处。U1调节可以确保组成U1复合物的snRNP正确组装(具有正确的距离、位置和行为)，这与剪接过程高度相关。由于剪接可以在转录后水平控制表达模式，因此在由U1功能障碍导致基因表达异常的细胞中，由工程化多核苷酸(例如，ASMO1)触发的U1调节可以帮助蛋白质表达正常化。用工程化多核苷酸(例如，ASMO1)处理后对tau表达的调节可能对失调细胞中这种剪接调节有响应，这可能有助于癌症治疗。总而言之，U1 snRNP和tau蛋白在癌症迁移和进展中的关键作用以及我们的体外和体内研究结果表明，本公开中考虑的工程化多核苷酸可以用作治疗癌症如GBM的治疗剂。
工程化多核苷酸
本公开提供了工程化多核苷酸及使用这些工程化多核苷酸的方法。工程化多核苷酸通常指非天然存在的多核苷酸。这些工程化多核苷酸不限于任何合成形式，并且可以通过任何合成方法(例如，重组技术或固相合成)生成。工程化多核苷酸或本文所述的工程化多核苷酸可以包括多个部分。“部分”可以指工程化多核苷酸的区域。在一些情况下，部分可以根据该部分的功能进行描述。例如，“靶向部分”可以指工程化多核苷酸的可与靶RNA至少部分互补的区域；“募集部分”可以指能够募集本文所述的任一个调节部分的部分；并且“间隔序列”可以指在其他部分之间提供间隔的部分。在一些情况下，部分名称的叙述并不将该部分限制为特定功能。例如，可以与靶RNA至少部分互补的“靶向部分”在一些情况下可以募集调节部分。整个本公开中描述的各个部分可以组合产生可执行特定功能的工程化多核苷酸。例如，工程化多核苷酸可以包含具有本文公开的募集部分的本文公开的靶向部分。
在本文所述的一些实施方案中，工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，一个或多个靶向部分被配置为在核糖核酸(RNA)中的靶序列处(例如，特异性地)结合所述RNA(例如，信使核糖核酸(mRNA)，诸如信使核糖核酸前体(mRNA前体))。工程化多核苷酸还可包含(ii)募集部分，募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)，使得当与RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)和工程化多核苷酸结合时，转录后调节部分在靶序列中或附近处改变RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)。在一些实施方案中，“被配置为特异性地结合”是指杂交。在一些实施方案中，配置为特异性地结合mRNA前体的部分是指与其特异性地结合的mRNA前体序列至少80％、90％或100％互补的部分。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)编码靶基因。在一些实施方案中，与工程化多核苷酸结合的mRNA前体是指与该工程化多核苷酸的至少一个核苷酸(且最多约100％)杂交的mRNA前体。在一些实施方案中，“改变RNA”是指通过切割核酸、使核酸的核苷酸发生反应或剪接核酸来修饰核酸分子。在一些实施方案中，“附近”是指不超过5个核苷酸的距离。
靶向部分
在各个方面，工程化多核苷酸包含一个或多个靶向部分。靶向部分可以使工程化多核苷酸与核糖核酸(例如，mRNA前体)相互作用。靶向部分可以包含与核糖核酸(例如，mRNA前体)的序列互补或相同的序列，使得工程化多核苷酸和核糖核酸可以相互作用或杂交。靶向部分可以与靶序列互补或相同。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶序列中的共有序列足够相同或互补。靶序列可以位于靶基因中。靶序列可以是存在于多个不同mRNA前体中的保守序列或共有序列。例如，靶序列可以使工程化多核苷酸与编码一个基因的第一mRNA前体和编码另一个基因的第二mRNA前体相互作用。靶向部分可以在工程化多核苷酸的5’端和3’端找到，且也可称为下茎或腿。不希望受理论束缚，一个或两个靶向部分与靶mRNA前体的组成型供体5’的稳定结合可允许与组成型供体的保守位点相互作用并可沉默U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)。靶向部分可包含与U1 snRNA RBD的序列基本相同的序列。例如，RBD可包含以下序列：3’-GUCCAUUCAUA-5’，并且靶向部分可包含GTCCA(或GUCCA)。基于U1 snRNA RBD与靶向部分的序列相似性，靶向部分可有效取代U1 snRNA RBD使其不与mRNA前体结合，或阻止U1snRNA RBD与mRNA前体结合。
可以根据未知意义的遗传变异(VUS)的鉴定来确定共有序列。任何外显子或内含子VUS都可以通过破坏顺式DNA序列来产生剪接，这些顺式DNA序列定义用于正确RNA剪接过程所需的外显子、内含子和调节序列。顺式DNA元件可以包括：外显子-内含子边界核心共有核苷酸(例如，5’供体位点的+1和+2处的GT以及3’受体位点的-1和-2处的AG)；或与这些不变核苷酸相邻的内含子的和外显子的核苷酸，它们也高度保守并且已发现参与剪接位点选择(例如，供体位点中的CAG/GUAAGU和受体位点中的NYAG/G)。这些元件中的任何一个核苷酸变化都可导致错误的剪接位点识别，从而产生新的剪接位点或激活隐蔽的剪接位点，导致与疾病或病况相关的异常转录物或非功能性蛋白质。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分中的至少一个靶向部分与靶核糖核酸或靶基因的靶序列中的共有序列足够相同或互补。在一些实施方案中，共有序列包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸或约2个核苷酸至约8个核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分中的至少两个靶向部分与靶基因或靶核糖核酸的靶序列中的至少两个共有序列足够相同或互补。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分各自独立地与靶基因或靶核糖核酸的靶序列中的共有序列足够相同或互补。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，一个或多个靶向部分各自独立地包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸或约2个核苷酸至约8个核苷酸。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，一个或多个靶向部分各自独立地包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，一个或多个靶向部分包含(1)第一靶向部分，第一靶向部分被配置为特异性地结合RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)的靶序列中的第一靶标序列，和(2)第二靶向部分，第二靶向部分被配置为特异性地结合RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)的靶序列中的第二靶标序列。在一些实施方案中，第一靶标序列包含靶序列中的共有序列。在一些实施方案中，第一靶标序列的共有序列包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸、或约2个核苷酸至约8个核苷酸。在一些实施方案中，第一靶标序列的共有序列包含2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8或8-10个核苷酸。在一些实施方案中，第二靶标序列包含靶序列中的共有序列。在一些实施方案中，第二靶标序列的共有序列包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸或约2个核苷酸至约8个核苷酸。在一些实施方案中，第二靶标序列的共有序列包含2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8或8-10个核苷酸。在一些实施方案中，第一靶标序列的共有序列和第二靶标序列的共有序列具有不同的核苷酸长度。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列的共有序列中的一个包含约1至约5个核苷酸，并且第一和第二靶标序列的共有序列中的另一个包含约4至约8个核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列的共有序列中的一个包含至少约2个核苷酸，并且第一和第二靶标序列的共有序列中的另一个包含至少约5或6个核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列的共有序列中的一个包含约2个核苷酸，并且第一和第二靶标序列的共有序列中的另一个包含约5或6个核苷酸。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分具有不同的核苷酸长度。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分中的一个包含约1至约5个核苷酸，并且第一靶向部分和第二靶向部分中的另一个包含约4至约8个核苷酸。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分中的一个包含至少约2个核苷酸，并且第一靶向部分和第二靶向部分中的另一个包含至少约5或6个核苷酸。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分中的一个包含约2个核苷酸，并且第一靶向部分和第二靶向部分中的另一个包含约5或6个核苷酸。
在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含具有至多十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个或两个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷酸、或任何两个前述数值之间的范围的核酸序列。
在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中紧邻内含子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中相邻或紧邻在外显子3’端的内含子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中相邻或紧邻在外显子5’端的内含子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中紧邻在外显子5’端的内含子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中与内含子相邻的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中紧邻在外显子5’端的内含子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中在内含子5’的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中在内含子3’的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3'、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向外显子中不紧邻内含子的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。
在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中邻近或紧邻外显子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中邻近或紧邻在内含子5’端的外显子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中邻近或紧邻在内含子5’端的外显子的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向完全位于内含子内的核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中与外显子相邻的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中且紧邻在内含子5’端的外显子的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中且紧邻在内含子3’端的外显子的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3'、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含靶向内含子中不与外显子相邻的核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含5’-AA-3’、5’-AT-3’、5’-AC-3’、5’-AG-3’、5’-TA-3’、5’-TT-3’、5’-TC-3’、5’-TG-3’、5’-CA-3’、5’-CT-3’、5’-CC-3’、5’-CG-3’、5’-GA-3’、5’-GT-3’、5’-GC-3’或5’-GG-3’。
如所述，靶向部分(例如，第一或第二)可以是基因不可知的，使得它可以靶向多个不同基因的mRNA前体中共享(或基本相似)的保守区域。此外，靶向部分(例如，第一或第二)可以靶向特定基因，或基因的特定外显子和内含子。例如，表1提供了MAPT基因外显子-内含子连接序列，用于多个外显子-内含子连接。例如，使用表1(或来自基因的其他序列或者目标基因的外显子-内含子连接点)，可以将工程化多核苷酸设计为靶向特定的外显子-内含子连接点，或者可以设计为靶向多于一个外显子-内含子连接点。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与表1中所示的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与表1中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与选自表1的“外显子序列”栏和表1的“内含子序列”栏的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与选自表1的“外显子序列”栏和表1的“内含子序列”栏的序列相同或互补的序列。
在一些实施方案中，第一靶向部分包含与选自表1的“外显子序列”栏的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列；并且第二靶向部分包含与表1的“内含子序列”栏中所示的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列。在一些实施方案中，第一靶向部分包含与选自表1的“外显子序列”的序列相同或互补的序列；并且第二靶向部分包含与表1的“内含子序列”栏中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，第一靶向部分包含与表1的“内含子序列”栏中所示的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列；并且第二靶向部分包含与表1的“外显子序列”中所示的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的序列。在一些实施方案中，第一靶向部分包含与表1的“内含子序列”栏中所示的序列相同或互补的序列；并且第二靶向部分包含与表1的“外显子序列”栏中所示的序列相同或互补的序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与内含子供体位点的共有序列(例如，选自GU、GT、GC和CA)相同或互补的序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与外显子供体位点的共有序列(例如，G)相同或互补的序列。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶向部分包含与选自GU、GC、G和CA的共有序列相同或互补的序列。
表1.由工程化多核苷酸的5’和3’-靶向部分所靶向的MAPT基因外显子-内含子连接序列的示例以及两个靶序列之间的距离
示例共有序列包括：(例如，5’-)内含子供体位点#1：GU；(例如，5’-)内含子供体位点#2：GC；(例如，5’-)外显子供体位点#1：G；和(例如，5’-)内含子供体位点#3：CA。
靶向部分(例如，第一或第二)可以对基因具有特异性，或对基因的外显子和内含子具有特异性。例如，靶向部分可以对外显子-内含子连接点以及外显子或内含子的一部分具有特异性。在一些实施方案中，靶向部分对基因的剪接位点之外的部分具有特异性。在一些实施方案中，靶向部分靶向特定基因。例如，靶向部分可以包含对剪接位点具有特异性和对基因具有特异性的部分。如本文其他地方所述，靶向部分可以包含共有剪接位点的序列。通过具有对共有剪接位点有特异性的靶向部分，靶向部分可以与基因无关，并靶向不同基因的多个不同mRNA。可替代地，靶向部分可以包含对基因具有特异性的部分。然后工程化多核苷酸能够调节特定靶基因(而非任何包含共有剪接位点的基因/mRNA)的剪接。例如，靶向部分可以包含与MAPT特有序列互补的序列。
靶序列
如本公开所述，工程化多核苷酸可包含一个或多个靶向部分。靶向部分可靶向(例如，结合、杂交或以其他方式被配置为与之相互作用)靶序列，例如，其中靶向部分靶向靶序列中的相邻或附近区域。靶向部分可以与靶序列互补。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，第一靶标序列和第二靶标序列在靶序列中相隔不超过五个、四个或三个核苷酸(例如，一个或两个核苷酸)的间隔序列。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，第一靶标序列和第二靶标序列彼此连续或相邻。
在一些实施方案中，当靶序列中的间隔序列与靶序列的靶标序列的5’-或3’-端相邻时，间隔序列可以不与工程化多核苷酸的靶向部分互补。在一些实施方案中，当靶序列中的间隔序列与靶序列的靶标序列的5’-或3’-端相邻时，间隔序列可以不与工程化多核苷酸的任何靶向部分互补。
在一些实施方案中，间隔序列将本文所述的第一靶标序列和第二靶向序列隔开。在一些实施方案中，间隔序列与工程化多核苷酸的靶向部分不互补也不结合。在一些实施方案中，间隔序列与工程化多核苷酸的所有靶向部分不互补也不结合。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，靶序列可包含RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)中的外显子-内含子边界。在一些实施方案中，第一靶标序列和第二靶标序列均位于外显子-内含子边界的5’或3’。在一些实施方案中，第一靶标序列和第二靶标序列中的一个位于外显子-内含子边界的5’，且第一靶标序列和第二靶标序列中的另一个位于外显子-内含子边界的3’。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，靶序列包含RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)中的剪接位点。在一些实施方案中，(例如，第一或第二)靶标序列包含RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)中的剪接位点(例如，5’ss)。
在一些实施方案中，两个靶标序列(例如，第一靶标序列和第二靶标序列)为单个核酸分子(即，RNA，例如，mRNA，诸如mRNA前体)的一部分。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列在单个核酸分子上跨越隔开。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列跨越单个核酸分子的外显子-内含子边界。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列不跨越单个核酸分子的外显子-内含子边界。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列与单个核酸分子的外显子-内含子边界相邻。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列均靶向单个核酸分子的内含子。在一些实施方案中，第一和第二靶标序列跨越单个核酸分子中的剪接位点。在一些实施方案中，第一和第二靶标核酸序列不跨越单个核酸分子中的剪接位点。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，靶序列中的共有序列包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸或约2个核苷酸至约8个核苷酸。
在一些实施方案中，工程化多核与靶序列互补且结合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少一部分结合靶序列。在一些实施方案中，靶序列编码靶基因。靶基因的非限制性示例可以包括微管相关蛋白tau(MAPT)。
在一些实施方案中，靶序列包括RNA序列。在一些实施方案中，RNA为核RNA、细胞质RNA或线粒体RNA。在一些实施方案中，靶RNA序列包括信使RNA(mRNA)、信使RNA前体(mRNA前体)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、重组多核苷酸、分支多核苷酸、分离的RNA、指导RNA、寡核苷酸、核酸探针、引物、snRNA、长非编码RNA、小RNA、snoRNA、siRNA、miRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)、反义RNA、shRNA或小rDNA衍生的RNA(srRNA)。在一些实施方案中，靶RNA序列为mRNA前体。在一些实施方案中，工程化多核苷酸不是反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，靶RNA序列包含至少一个外显子。在一些实施方案中，靶RNA序列包含至少一个内含子。在一些实施方案中，靶RNA序列包含至少一个外显子或至少一个内含子。在一些实施方案中，靶RNA序列包含至少一个外显子-内含子边界。靶RNA序列可以包含对基因具有特异性的序列。例如，靶RNA序列可以包含编码多肽的序列。例如，靶RNA序列可以包含编码tau的序列。靶序列可以包含与外显子-内含子边界对应的序列和与特定基因对应的序列。
在一些实施方案中，靶序列为内源核酸分子。在一些实施方案中，工程化多核苷酸通过碱基配对诸如Watson-Crick碱基配对与靶序列结合。
募集部分
如本公开所述，工程化多核苷酸可包含募集部分。募集部分可以募集剪接体的一个或多个组分。在一些实施方案中，被配置为募集剪接体部分的募集部分是指与剪接体部分杂交的募集部分。在一些实施方案中，被配置为募集剪接体部分的募集部分是指与剪接体部分或剪接体部分的序列至少80％、90％或100％互补的募集部分。在一些实施方案中，“募集”是指在募集部分和剪接体部分之间形成至少一个氢键。在一些实施方案中，“募集”是指募集部分的至少一个核苷酸与剪接体部分的至少一个核苷酸之间的杂交。募集部分包含发夹结构。发夹可以是完整的发夹，也可以由内环间插。发夹结构可以由13至17个核苷酸组成。募集部分可以与U1 snRNA的茎环II相互作用。募集部分可以包含与茎环II的序列或部分互补的序列。例如，U1 snRNA的茎环II包含序列5’-GUAGGCCUCACGUUACCUAU-3’，并且募集部分可以包含5’-CCGGA-3’。U1-A也可以与U1 snRNA的茎环II结合。茎环II与发夹/内环区域的氢桥可以间接调节U1-A的聚腺苷酸化和乙酰化信号传导。募集部分可以不沉默茎环II中U1-A的锚定结构域。这种相互作用可以调节基因表达和乙酰化。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，募集部分包含与表2中所示的序列至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，募集部分包含与表2中所示的序列相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-2的任意序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或互补的核苷酸序列在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-2的任意序列至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-2的任意序列相同或互补的核苷酸序列。
表2.本文所述的工程化多核苷酸的示例募集部分
在本文所述的一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，募集部分)包含(例如，二级的)结构特点(见图2A-2D)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，募集部分)包含顶环、上茎、内环、下茎或其组合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，募集部分)包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，茎包含两个互补的茎序列。在一些实施方案中，茎(例如，下茎或上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，环为与茎(例如，下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环，另一茎包含两个互补的茎序列。在一些实施方案中，内环包含具有不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，另一茎(例如，上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，募集部分)还包含顶环。在一些实施方案中，顶环包含具有不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，募集部分包含约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、或约10至约20个核苷酸。
在一些实施方案中，募集部分与转录后调节部分(或调节部分)(例如，剪接体部分)部分地互补，转录后调节部分包含核糖核蛋白复合物。例如，募集部分可以与包含剪接体核糖核蛋白复合物的调节部分部分地互补，其中剪接体核糖核蛋白复合物包含小核核糖核酸(snRNA)。在一些实施方案中，募集部分与本文所述的靶序列不互补也不结合。例如，募集部分与本文所述的mRNA前体不互补也不结合。
结构构型
在各个方面，工程化多核苷酸包含一个或多个能够发挥功能的部分。这些一个或多个部分可以以各种结构构型存在于工程化多肽中，以允许工程化多核苷酸发挥给定功能(例如，募集调节部分或剪接体的组分，或结合mRNA前体)。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，第一和第二靶向部分中的一个位于募集部分的5’，且第一和第二靶向部分中的另一个位于募集部分的3’。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸具有从5’-末端到3’-末端如下的结构排列：第一靶向部分、募集部分和第二靶向部分。在一些实施方案中，工程化多核苷酸具有从5’-末端到3’-末端如下的结构排列：第二靶向部分、募集部分和第一靶向部分。
示例多核苷酸
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，工程化多核苷酸包含约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸或约10至约25个核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或更多个核苷酸的长度。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或更少个核苷酸的长度。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50个核苷酸或任意两个前述数值之间的范围的长度。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，募集部分包含与表3中所示的序列至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，募集部分包含与表3中所示的序列相同或互补的核苷酸序列。
表3.包含募集部分和靶向部分的工程化多核苷酸的示例序列
在一些实施方案中，工程化多核苷酸可以由工程化多核苷酸的前体产生。在一些情况下，工程化多核苷酸的前体可以为线性的。例如，工程化多核苷酸的前体可以为从质粒转录的线性多核苷酸。在另一个示例中，工程化多核苷酸的前体可被构建为具有允许工程化多核苷酸在细胞中环化的部分诸如核酶部分和连接部分的线性多核苷酸。具有连接和核酶部分的线性工程化多核苷酸可以转染到细胞中，在细胞中它可以被环化。在一些情况下，工程化多核苷酸可以为环状的。在一些情况下，工程化多核苷酸包含DNA、RNA或两者。在一些情况下，工程化多核苷酸的前体包含工程化多核苷酸的前体。在一些情况下，工程化多核苷酸的前体可用于产生工程化多核苷酸。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种二级结构(诸如本文任何地方描述的那些)。例如，工程化多核苷酸包含至少一种、两种、三种、四种或更多种二级结构，其中二级结构可以为顶环、茎、茎环或内环中的任一种或任意组合。一种或多种二级结构可以发挥多种不同的功能。例如，二级结构可以提供稳定性，或以其他方式帮助稳定工程化多核苷酸。二级结构可以与多肽或其他多核苷酸结合或相互作用。例如，二级结构可以与剪接体的组分相互作用。
在一些实施方案中，多核苷酸的募集部分包含至少一种、两种、三种、四种或更多种二级结构。在一些实施方案中，靶向部分不具有二级结构。在一些实施方案中，二级结构为包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个或更多个核苷酸的顶环。在一些实施方案中，顶环与调节部分互补且结合。在一些实施方案中，顶环与调节部分不互补也不结合。在一些实施方案中，二级结构为至少一个茎。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含两个茎，其中一个为靠近顶环的上茎，而另一个为更靠近靶向部分的下茎。在一些实施方案中，上茎包含至少两个、四个、六个、八个、10个或更多个核苷酸，其中核苷酸配对以形成上茎。在一些实施方案中，上茎与调节部分互补且结合。在一些实施方案中，上茎与调节部分不互补也不结合。在一些实施方案中，二级结构为下茎，其中下茎包含至少两个、四个、六个、八个、10个或更多个核苷酸，其中核苷酸配对以形成下茎。在一些实施方案中，下茎与调节部分互补且结合。在一些实施方案中，下茎与调节部分不互补也不结合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含上茎和下茎之间的内环。在一些实施方案中，内环包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，内环与调节部分互补且结合。在一些实施方案中，内环与调节部分不互补也不结合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含含有顶环、上茎、内环和下茎的二级结构，其中上茎和内环与调节部分至少部分地互补且结合。在一些实施方案中，上茎和内环与包含snRNA的调节部分互补且结合。在一些实施方案中，snRNA为U1 snRNA，诸如US-A snRNA。在一些实施方案中，snRNA为U2 snRNA。
在一些实施方案中，至少一种二级结构的核酸序列与包含核糖核蛋白复合物的调节部分部分地互补。在一些实施方案中，至少一种二级结构的核酸序列与靶标核酸序列为不互补的。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种核酸的二级结构。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含核酸的至少一种、两种、三种、四种或更多种二级结构。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加募集部分和调节部分之间的结合。在一些实施方案中，至少一种二级结构使调节部分的装配稳定化。在一些实施方案中，至少一种二级结构使调节部分与其他附加部分的装配稳定化。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加由靶序列编码的基因的表达或活性的调节效率。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加由靶序列编码的基因的表达或活性的调节特异性。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加工程化多核苷酸对水解降解的抗性。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加工程化多核苷酸对核酸酶消化降解的抗性。在一些实施方案中，至少一种二级结构增加工程化多核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，至少一种二级结构减少由工程化多核苷酸诱导的免疫原性。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸的特征在于二级结构。在一些实施方案中，二级结构包含一种或多种茎环结构。在一些实施方案中，二级结构包括顶环、上茎、内环和下茎。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种二级结构。在一些实施方案中，第一或第二靶向部分不是二级结构的一部分。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种、两种、三种、四种或更多种二级结构。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含二级结构，二级结构包含茎环、十字形、趾部(toe hold)、错配凸起或其任何组合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含二级结构，二级结构包含顶环、上茎、内环或下茎。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含二级结构，二级结构包含顶环、上茎、内环和下茎。在一些情况下，二级结构可包含茎、发夹环、假结、凸起、内环、多环、G-四联体、或其任何组合。在一些实施方案中，工程化多核苷酸可以采用A-形式、B-形式、Z-形式或其任何组合。在一些实施方案中，二级结构至少部分地基于工程化多核苷酸的核苷酸序列形成。在一些实施方案中，二级结构在工程化多核苷酸的核苷酸序列内形成。
在一些实施方案中，至少一种二级结构增加募集部分和调节部分之间的结合。在一些实施方案中，与没有二级结构的募集部分与调节部分之间的结合相比，至少一种二级结构使募集部分和调节部分之间的结合增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加募集部分和调节部分之间的结合。在一些实施方案中，与没有对调节部分进行化学修饰的募集部分之间的结合相比，至少一种化学修饰使募集部分和调节部分之间的结合增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，当调节部分与靶序列结合时，工程化多核苷酸的至少一种化学修饰使包含调节部分的剪接体的装配稳定化。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比多核苷酸相比，由包含化学修饰的工程化多核苷酸对包含调节部分的剪接体的装配稳定化至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。在一些实施方案中，调节部分为剪接体的U1(U1SNP)、U2(U2SNP)、U4、U5、U6、U11、U12、U14或U16。在一些实施方案中，调节部分为剪接体的U1SNP。在一些实施方案中，调节部分为剪接体的U1-A。在一些实施方案中，调节部分为剪接体的U2SNP。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少一种化学修饰使包含调节部分和至少一种附加部分的剪接体的装配稳定化。例如，工程化多核苷酸的至少一种化学修饰稳定剪接体的装配，剪接体包含含有U1-A的调节部分和至少一种含有U1-70K、UC-1、SmD1、SmD2、SmD3、SmE、SmF或SmG的附加部分。在一些实施方案中，至少一个附加部分为剪接体的U4、U5、U6、U11、U12、U14或U16。
在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比多核苷酸相比，至少一种化学修饰提高工程化多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的效率。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的效率相比，工程化多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的效率增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比多核苷酸相比，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的特异性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的效率相比，工程化多核苷酸调节由靶序列编码的基因的表达或活性的特异性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对水解降解(例如，通过核酸内切酶降解)的抗性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的抗性相比，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对水解降解的抗性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的抗性相比，其包含至少一种化学修饰的工程化多核苷酸对水解降解的抗性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对核酸酶消化降解的抗性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的抗性相比，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对核酸酶消化降解的抗性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的抗性相比，其包含至少一种化学修饰的工程化多核苷酸对核酸酶消化降解的抗性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的半衰期相比，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的半衰期相比，其包含至少一种化学修饰的工程化多核苷酸的半衰期增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。化学修饰增加工程化多核苷酸的半衰期。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰减少由工程化多核苷酸诱导的免疫原性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的免疫原性相比，至少一种化学修饰减少由工程化多核苷酸诱导的免疫原性。在一些实施方案中，与没有化学修饰的可比工程化多核苷酸的免疫原性相比，包含至少一种化学修饰的工程化多核苷酸的免疫原性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
化学修饰
在本文所述的一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。如本公开所述，化学修饰可赋予工程化多核苷酸结构或功能优势(例如，增加半衰期、降低免疫原性、增强对水解或酶促降解的抵抗力、改善与多肽(例如，剪接体的组分)或多核苷酸(例如，mRNA前体或剪接体的组分)的反应性或结合)。
在一些实施方案中，靶向部分的所有核苷酸均通过硫代磷酸酯键连接。在一些实施方案中，靶向部分的所有核苷酸均包含2’O-甲基修饰。2’修饰可以预防核酸酶降解并且/或者增加靶向部分与mRNA前体靶标的亲和力。
在一些实施方案中，募集部分的所有核苷酸均通过硫代磷酸酯键连接。在一些实施方案中，募集部分的三个核苷酸包含2’O-甲基修饰。2’修饰可以诱导募集部分的分子动力学变化，从而促进U1-snRNA的茎环II的构象改变以及募集部分与U1-snRNA的结合。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一种2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％核苷酸为化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％核苷酸为2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％、80％或90％核苷酸间键联为硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含核酸的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含核酸的至少一种、两种、三种、四种或更多种化学修饰。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加募集部分与调节部分之间的结合。在一些实施方案中，至少一种化学修饰使调节部分的装配稳定化。在一些实施方案中，至少一种化学修饰使调节部分与其他附加部分的装配稳定化。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加调节由靶序列编码的基因的表达或活性的效率。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加调节由靶序列编码的基因的表达或活性的特异性。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对水解降解的抗性。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸对核酸酶消化降解的抗性。在一些实施方案中，至少一种化学修饰增加工程化多核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，至少一种化学修饰减少由工程化多核苷酸诱导的免疫原性。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括工程化多核苷酸的磷酸二酯主链键联中的一个或两个非连接磷酸酯氧原子的至少一个取代。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少一种化学修饰包括工程化多核苷酸的磷酸二酯主链键联中的一个或多个连接的磷酸酯氧原子的取代。磷酸酯氧原子的化学修饰的非限制性示例为硫原子。附加的非限制性示例包括在表3中。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括对工程化多核苷酸的核苷酸的糖的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括对核苷酸的糖的至少一种化学修饰，其中化学修饰包括至少一种锁核酸(LNA)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括对包含至少一种解锁核酸(UNA)的工程化多核苷酸的核苷酸的糖的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括对糖的至少一种化学修饰，包括对糖的成分的修饰，其中糖为核糖的糖。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括对包含2’-O-甲基基团的工程化多核苷酸的核苷酸的核糖糖成分的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包含2’-F-RNA，而不是2’-O-甲基修饰。在这种情况下，2’-F-RNA和mRNA前体双链体不激活RNAse H(通过核酸酶消化降解)，并且通过比2’-O-甲基-RNA和mRNA前体双链体更高的解链温度(Tm)来确定其更稳定。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括至少一种化学修饰，化学修饰包括用去磷酸接头置换工程化多核苷酸的磷酸部分。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括工程化多核苷酸的磷酸酯主链的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含硫代磷酸酯基团。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括至少一种化学修饰，化学修饰包括对工程化多核苷酸的核苷酸碱基的修饰。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括至少一种化学修饰，化学修饰包含核苷酸的非天然碱基。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括至少一种化学修饰，化学修饰包含吗啉代基团、环丁基基团、吡咯烷基团或肽核酸(PNA)核苷替代物。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的化学修饰包括至少一种化学修饰，化学修饰包含至少一种立体纯核酸。在一些实施方案中，至少一种化学修饰可以位于工程化多核苷酸的5’端附近。在一些实施方案中，至少一种化学修饰可以位于工程化多核苷酸的3’端附近。在一些实施方案中，至少一种化学修饰可以位于工程化多核苷酸的5’和3’端二者附近。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少一种化学修饰包括任一项或任意组合的修饰：磷酸二酯主链键联中的一个或两个非连接磷酸酯氧的修饰；磷酸二酯主链键联中的一个或多个连接的磷酸酯氧的修饰；核糖糖成分的修饰；用“去磷酸”接头置换磷酸部分；天然存在的核碱基的修饰或置换；核糖-磷酸酯主链的修饰；多核苷酸5’端的修饰；多核苷酸3’端的修饰；脱氧核糖磷酸酯主链的修饰；磷酸酯基团的取代；核糖磷酸酯主链的修饰；对核苷酸糖的修饰；对核苷酸碱基的修饰；或核苷酸的立体纯。对工程化多核苷酸的示例化学修饰可见于表4。
表4.示例化学修饰
磷酸酯主链的修饰
在一些实施方案中，化学修饰包括磷酸二酯主链键联中的一个或两个非连接磷酸酯氧的修饰或磷酸二酯主链键联中的一个或多个连接的磷酸酯氧的修饰。如本文所用，“烷基”意指直链或支链的饱和烃基。烷基基团示例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基或异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基或叔丁基)或戊基(例如，正戊基、异戊基或新戊基)。烷基基团可含有从1至约20、从2至约20、从1至约12、从1至约8、从1至约6、从1至约4、或从1至约3个碳原子。如本文所用，“芳基”是指单环或多环(例如，具有2、3或4个稠合环)芳族烃，例如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基或茚基。在一些实施方案中，芳基基团具有从6至约20个碳原子。如本文所用，“烯基”是指含有至少一个双键的脂族基团。如本文所用，“炔基”是指含有2-12个碳原子的直链或支链烃链，其特征在于具有一个或多个三键。炔基基团的示例可以包括乙炔基、炔丙基或3-己炔基。“芳基烷基”或“芳烷基”是指其中烷基氢原子被芳基基团置换的烷基部分。芳烷基包括其中多于一个氢原子被芳基基团置换的基团。“芳基烷基”或“芳烷基”的示例包括苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基。“环烷基”是指具有3至12个碳的环状、双环、三环或多环非芳族烃基。环烷基部分的示例包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。“杂环基”是指杂环系统的一价基团。代表性杂环基包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂基、氧氮杂基、硫氮杂基和吗啉基。“杂芳基”是指杂芳环系统的一价基团。杂芳基部分的示例可以包括咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、吲哚基、噻吩基吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基、喹啉基和蝶啶基。
在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸的磷酸酯基团可以通过用不同的取代基置换一个或多个氧来修饰。在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸可以包括用如本文所述的修饰的磷酸酯置换未修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的修饰可以包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷接头的改变。修饰的磷酸酯基团的示例可以包括硫代磷酸酯、硫代乙酸膦酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些实施方案中，磷酸酯主链部分中的非桥连磷酸酯氧原子的一个可以被以下任意基团置换：硫(S)、硒(Se)、BR3(其中R可以为，例如，氢、烷基或芳基)、C(例如烷基、芳基等)、H、NR2(其中R可以为，例如，氢、烷基或芳基)或OR(其中R可以为，例如，烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子可以为非手性的。然而，用上述原子或原子基团的一个置换非桥连氧的一个可以使磷原子具有手性。以这种方式修饰的磷酸酯基团中的磷原子为立体中心。立体异构磷原子可以具有“R”构型(本文中Rp)或“S”构型(本文中Sp)。在一些情况下，工程化多核苷酸包含立体纯核苷酸，立体纯核苷酸包含硫代磷酸酯的S构象或硫代磷酸酯的R构象。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以50％、60％、70％、80％、90％或更多的非对映体过量存在。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以95％的非对映体过量存在。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以96％的非对映体过量存在。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以97％的非对映体过量存在。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以98％的非对映体过量存在。在一些实施方案中，手性磷酸酯产物以99％的非对映体过量存在。在一些实施方案中，二硫代磷酸酯的两个非桥连氧均可被硫置换。二硫代磷酸酯中的磷中心可以是非手性的，这阻止寡核糖核苷酸非对映异构体的形成。在一些实施方案中，对一个或两个非桥连氧的修饰还可以包括用独立地选自S、Se、B、C、H、N和OR(R可以为，例如，烷基或芳基)的基团置换非桥连氧。在一些实施方案中，还可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换桥连氧(即，将磷酸酯连接至核苷的氧)来修饰磷酸酯接头。置换可以发生在一个或两个连接的氧上。
在某些实施方案中，核酸包含连接的核酸。核酸可以使用任何核酸间键联连接在一起。核酸间连接基团的两类主要由磷原子的存在或不存在来定义。代表性的含磷核酸间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-OC(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-OC(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；和N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些实施方案中，具有手性原子的核酸间键联可以制备为外消旋混合物、分开的对映体，例如，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有单一修饰。非天然核酸可以在一个部分内或不同部分之间含有多种修饰。
对核酸的主链磷酸酯修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，并且可以以任何组合使用。也可以使用其他非磷酸键联。
在一些实施方案中，主链修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键联)可以赋予修饰的核酸免疫以调节活性和/或增强其体内稳定性。
在一些情况下，磷衍生物(或修饰的磷酸酯基团)附接至糖或糖类似物部分，且可以为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
在一些情况下，主链修饰包括用替代部分诸如阴离子、中性或阳离子基团置换磷酸二酯键联。此类修饰的示例包括：阴离子型核苷酸间键联；N3’至P5’氨基磷酸酯修饰；硼烷磷酸酯DNA；寡核苷酸原；中性核苷酸间键联，诸如甲基膦酸酯；酰胺连接的DNA；亚甲基(甲基亚氨基)键联；甲缩醛和硫代甲缩醛键联；含有磺酰基基团的主链；吗啉代寡聚体；肽核酸(PNA)；和带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡聚体。修饰的核酸可以包含嵌合或混合主链，嵌合或混合主链包含一种或多种修饰，例如磷酸酯键联的组合，诸如磷酸二酯和硫代磷酸酯键联的组合。
磷酸酯的替代物包括，例如，短链烷基或环烷基核苷酸间键联、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键联、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键联。这些替代物包括具有吗啉代键联的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基亚肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分的其他项。还应当理解，在核苷酸替代物中，核苷酸的糖和磷酸酯部分两者都可以被例如酰胺型键联(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所置换。还可以将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物以增强例如细胞摄取。缀合物可以化学地与核苷酸或核苷酸类似物连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-S-H-膦酸酯、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括磷酸酯主链的修饰。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的磷酸酯主链。磷酸酯基团或主链的示例化学修饰可以包括用不同的取代基置换一个或多个氧。此外，存在于工程化多核苷酸中的修饰的核苷酸可以包括用本文所述的修饰的磷酸酯置换未修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的修饰可以包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷接头的改变。修饰的磷酸酯基团示例可以包括硫代磷酸酯、硫代乙酸膦酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些实施方案中，磷酸酯主链部分中的非桥连磷酸酯氧原子的一个可以被任何以下基团置换：硫(S)、硒(Se)、BR3(其中R可以为，例如，氢、烷基或芳基)、C(例如烷基基团、芳基基团等)、H、NR2(其中R可以是例如氢、烷基或芳基)或OR(其中R可以为，例如，烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团中的一个置换非桥连氧的一个可以使磷原子具有手性；也就是说，以这种方式修饰的磷酸酯基团中的磷原子为立体中心。立体异构磷原子可以具有“R”构型(本文中Rp)或“S”构型(本文中Sp)。在这种情况下，化学修饰的工程化多核苷酸可以是立体纯的(例如S或R确认)。在一些情况下，化学修饰的工程化多核苷酸包含立体纯的磷酸酯修饰。例如，化学修饰的工程化多核苷酸包含硫代磷酸酯的S构象或硫代磷酸酯的R构象。
硫代磷酸酯的两个非桥连氧均被硫置换。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，这阻止寡核糖核苷酸非对映体的形成。在一些实施方案中，对一个或两个非桥连氧的修饰还可以包括用独立地选自S、Se、B、C、H、N和OR(R可以为，例如，烷基或芳基)的基团置换非桥连氧。
磷酸酯接头也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换桥连氧(即，将磷酸酯连接至核苷的氧)来修饰。置换可发生在任一连接氧处或两个连接氧处。
磷酸酯部分的置换
在一些实施方案中，工程化多核苷酸的至少一个磷酸酯基团可以被化学修饰。在一些实施方案中，磷酸酯基团可以被不含磷的接头置换。在一些实施方案中，磷酸酯部分可以被去磷酸接头置换。在一些实施方案中，带电荷的磷酸酯基团可以被中性基团置换。在一些情况下，磷酸酯基团可以被甲基膦酸酯、羟基氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基、和亚甲基氧基甲基亚氨基置换。在一些实施方案中，本文所述的核苷酸类似物还可在磷酸酯基团处被修饰。修饰的磷酸酯基团可以包括用硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯)和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯的在两个核苷酸之间的键联处的修饰。两个核苷酸之间的磷酸酯或修饰的磷酸酯键联可以是通过3’-5’键联或2’-5’键联，并且该键联包含反向极性，如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。
磷酸酯基团的取代
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括通过磷酸酯基团的置换进行的修饰。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰，该化学修饰包括磷酸酯基团取代或置换。示例磷酸酯基团置换可以包括不含磷的接头。在一些实施方案中，磷酸酯基团取代或置换可以包括用中性部分置换带电荷的磷酸酯基团。可以置换磷酸酯基团的示例部分可以包括甲基膦酸酯、羟基胺基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。
核糖磷酸酯主链的修饰
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括修饰工程化多核苷酸的核糖磷酸酯主链。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的核糖磷酸酯主链。化学修饰的示例核糖磷酸酯主链可以包括可以模拟核酸也可以被构建的支架，其中磷酸酯接头和核糖糖被核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置换。在一些实施方案中，核碱基可以由替代主链束缚。示例可以包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
糖的修饰
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括糖的修饰。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的糖。示例化学修饰的糖可以包括用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或置换的2’羟基基团(OH)。在一些实施方案中，对2’羟基基团的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基不再能够被去质子化以形成2’-醇盐离子。2’-醇盐可以通过对接头磷原子的分子内亲核攻击来催化降解。“氧基”-2’羟基基团修饰的示例可以包括烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以为，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可以为，例如，H或任选取代的烷基，并且n可以为从0至20(例如，从0至4、从0至8、从0至10、从0至16、从1至4、从1至8、从1至10、从1至16、从1至20、从2至4、从2至8、从2至10、从2至16、从2至20、从4至8、从4至10、从4至16和从4至20)。在一些实施方案中，“氧基”-2’羟基基团修饰可以包括(LNA，其中2’羟基可以例如通过Ci-6亚烷基或Cj-6杂亚烷基桥连接至相同的核糖糖的4'碳，其中示例桥可以包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以为，例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可以为，例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施方案中，“氧基”-2’羟基基团修饰可以包括甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3，例如，PEG衍生物)。在一些情况下，脱氧修饰可以包括氢(即脱氧核糖，例如，在部分dsRNA的突出部分)；卤代(例如，溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以为，例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可以为，例如，如本文所述的)、NHC(O)R(其中R可以为，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地被例如本文所述的氨基取代。在一些情况下，糖基还可以含有一个或多个具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，修饰的核酸可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。核苷酸“单体”可以在糖上的Γ位处具有α键联，例如α-核苷。修饰的核酸还可以包括“脱碱基”糖，其在C-处缺乏核碱基。脱碱基糖还可以在一个或多个组成糖原子处被进一步修饰。修饰的核酸还可以包括一种或多种L形式的糖，例如L-核苷。在一些方面，本文所述的工程化多核苷酸包括糖基核糖，其是具有氧的5元环。示例修饰的核苷和修饰的核苷酸可以包括核糖中的氧的置换(例如用硫(S)、硒(Se)或亚烷基，例如亚甲基或亚乙基)；添加双键(例如，用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环收缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的环扩展(例如，形成具有另外的碳或杂原子的6元或7元环，例如脱水己糖醇、阿糖醇、甘露醇、环己基、环己烯基和还具有氨基磷酸酯主链的吗啉代)。在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以包括多环形式(例如，三环)和“解锁”形式，例如二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖被附接到磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸。在一些实施方案中，对工程化多核苷酸的糖的修饰包括修饰工程化多核苷酸以包括锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA)或桥连核酸(BNA)。
核糖糖成分的修饰
在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含核糖糖成分的至少一种化学修饰。在一些实施方案中，核糖糖成分的化学修饰可以包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基-乙基(2’-MOE)、2’-氟、2’-氨基乙基、2’-脱氧-2’-氟代阿拉伯核酸、2’-脱氧、2’-O-甲基、3’-硫代磷酸酯、3’-膦酰基乙酸酯(PACE)或3’-膦酰基硫代乙酸酯(thioPACE)。在一些实施方案中，核糖糖成分的化学修饰包含非天然核酸。在一些情况下，非天然核酸包括在糖环的5’-位和2’-位处的修饰，例如5’-CH2-取代的2’-O-保护的核苷。在一些情况下，非天然核酸包括已制备用于掺入寡核苷酸中的酰胺连接的核苷二聚体，其中二聚体中的3’连接核苷(5’至3’)包含2’-OCH3和5’-(S)-CH3。非天然核酸可以包括2’-取代的5’-CH2(或O)修饰的核苷。非天然核酸可以包括5’-亚甲基膦酸酯DNA和RNA单体和二聚体。非天然核酸可以包括具有2’-取代的5’-膦酸酯单体和其他修饰的5’-膦酸酯单体。非天然核酸可以包括5’-修饰的亚甲基膦酸酯单体。非天然核酸可以包括在5’和/或6'-位包含羟基基团的5’或6'-膦酸核糖核苷的类似物。非天然核酸可以包括具有5’-磷酸酯基团的5’-膦酸酯脱氧核糖核苷单体和二聚体。非天然核酸可以包括具有6'-膦酸酯基团的核苷，其中5’或/和6'-位未被取代或被硫代叔丁基基团(SC(CH3)3)(及其类似物)取代；亚甲基氨基基团(CH2NH2)(及其类似物)或氰基基团(CN)(及其类似物)。
在一些实施方案中，非天然核酸还包括糖部分的修饰。在一些情况下，核酸含有一种或多种核苷，其中糖基已被修饰。这种糖修饰的核苷可以赋予增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。在某些实施方案中，核酸包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的示例包括但不限于添加取代基(包括5’和/或2’取代基；桥连两个环原子以形成双环核酸；用S、N(R)、或C(R1)(R2)(R＝H、C1-C12烷基或保护基)置换核糖基环氧原子；及其组合。
在一些情况下，本文所述的工程化多核苷酸包含修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖之外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基基团。糖可以是吡喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可以是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以以[α]或[β]异头构型附接至各自的杂环碱基。糖修饰包括但不限于2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，糖修饰可以包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修饰包括2’-O-烷基取代的脱氧核糖核苷和2’-O-乙二醇样核糖核苷。
对糖部分的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及非天然修饰。糖修饰包括但不限于2’位的以下修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为从1至约10。在2’位处的其他化学修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。类似的修饰也可以在糖上的其他位置进行，特别是3’末端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位以及5’末端核苷酸的5’位。化学修饰的糖还包括在桥环氧处含有修饰例如CH2和S的糖。核苷酸糖类似物也可以具有糖模拟物如代替呋喃戊糖基糖的环丁基部分。具有修饰的糖部分的核酸的示例包括但不限于包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4'-S、2’-F、2’-OCH3和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核酸。在2’位处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C1-C10烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-ON(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，本文所述的核酸包括一种或多种双环核酸。在某些此类实施方案中，双环核酸包含4’和2’核糖基环原子之间的桥。在某些实施方案中，本文提供的核酸包括一种或多种双环核酸，其中桥包括4’至2’双环核酸。此类4’至2’双环核酸的示例包括但不限于下式之一：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’及其类似物；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物。
对核苷酸碱基的修饰
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括核苷酸碱基(例如，核碱基)的修饰。示例核碱基可以包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可以在本文所述的工程化多核苷酸中被修饰或置换。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可以为碱基的天然存在的或合成的衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括修饰尿嘧啶。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的尿嘧啶。示例化学修饰的尿嘧啶的可以包括假尿苷、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、尿苷5-氧基乙酸、尿苷5-氧基乙酸甲酯、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-甲基氨基甲基-尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷、5-氨基甲酰甲基-尿苷、5-羧甲基氨基甲基-尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、l-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、l-甲基-4-硫代-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基])-2-硫代-尿苷、a-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷、5,2’-O-二甲基-尿苷、2’-O-甲基-假尿苷、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷、3,2’-O-二甲基-尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷、l-硫代-尿苷、脱氧胸腺嘧啶、2’-F-ara-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-ara-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿苷、5-[3-(1E-丙烯基氨基)]尿苷、吡唑并[3,4-d]嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤。
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括修饰胞苷。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的胞苷。示例化学修饰的胞苷可以包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲酰基-胞苷、N4-甲基-胞苷、5-甲基-胞苷、5-卤代-胞苷、5-羟甲基-胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖氨酸、a-硫代-胞苷、2’-O-甲基-胞苷、5,2’-O-二甲基-胞苷、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷、N4,2’-O-二甲基-胞苷、5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷、1-硫代-胞苷、2’-F-ara-胞苷、2’-F-胞苷和2’-OH-ara-胞苷。
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括修饰腺嘌呤。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的腺嘌呤。示例化学修饰的腺嘌呤可以包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷、2-甲基-腺嘌呤、N6-甲基-腺苷、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基-腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基-腺苷、N6,N6-二甲基-腺苷、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷、N6-乙酰基-腺苷、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、a-硫代-腺苷、2’-O-甲基-腺苷、N6,2’-O-二甲基-腺苷、N6-甲基-2’-脱氧腺苷、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷、l,2’-O-二甲基-腺苷、2’-O-核糖基腺苷(磷酸盐)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-ara-腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-ara-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，本文所述的化学修饰包括修饰鸟嘌呤。在一些实施方案中，本文所述的工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰的鸟嘌呤。示例化学修饰的鸟嘌呤可以包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、甲基怀俄苷、4-去甲基-怀俄苷、异怀俄苷、怀丁苷、过氧怀丁苷、羟基怀丁苷、未脱碘的羟基怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、辫苷、环氧辫苷、半乳糖基-辫苷、甘露糖基-辫苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷、古嘌苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、N2,7-二甲基-鸟苷、N2,N2,7-二甲基-鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲硫基-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、a-硫代-鸟苷、2’-O-甲基-鸟苷、N2-甲基-2’-O-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷、1-甲基-2’-O-甲基-鸟苷、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷、2’-O-甲基-肌苷、l,2’-O-二甲基-肌苷、6-O-苯基-2’-脱氧肌苷、2’-O-核糖基鸟苷、1-硫代-鸟苷、6-O-甲基鸟苷、O6-甲基-2’-脱氧鸟苷、2’-F-ara-鸟苷和2’-F-鸟苷。
在一些情况下，工程化多核苷酸的化学修饰可以包括将核酸类似物或非天然核酸引入或取代到工程化多核苷酸中。在一些实施方案中，核酸类似物可以是本文所述的任何一种化学修饰的核酸。示例核酸类似物可见于PCT/US2015/025175、PCT/US2014/050423、PCT/US2016/067353、PCT/US2018/041503、PCT/US18/041509、PCT/US2004/011786或PCT/US2004/011833，所有这些都明确地通过引用整体并入。本文所述的化学修饰的核苷酸可以包括鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷和胞嘧啶的变体，包括已被化学改变(例如通过乙酰化、甲基化、羟基化)的任何天然存在的或非天然存在的鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷或胞苷。示例化学修饰的核苷酸可以包括1-甲基-腺苷、1-甲基-鸟苷、1-甲基-肌苷、2,2-二甲基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、2’-氨基-2’-脱氧腺苷、2’-氨基-2’-脱氧胞苷、2’-氨基-2’-脱氧鸟苷、2’-氨基-2’-脱氧尿苷、2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷、2-氨基嘌呤-核糖苷、2’-ara腺苷、2’-ara胞苷、2’-ara尿苷、2’-叠氮基-2’-脱氧腺苷、2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷、2’-叠氮基-2’-脱氧鸟苷、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷、2-氯腺苷、2’-氟-2’-脱氧腺苷、2’-氟-2’-脱氧胞苷、2’-氟-2’-脱氧鸟苷、2’-氟-2’-脱氧尿苷、2’-氟胸苷、2-甲基-腺苷、2-甲基-鸟苷、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基-腺苷、2’-O-甲基-2-氨基腺苷、2’-O-甲基-2’-脱氧腺苷、2’-O-甲基-2’-脱氧胞苷、2’-O-甲基-2’-脱氧鸟苷、2,-O-甲基-2’-脱氧尿苷、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基肌苷、2’-O-甲基假尿苷、2-硫代胞苷、2-硫代-胞苷、3-甲基-胞苷、4-乙酰基-胞苷、4-硫代尿苷、5-(羧基羟基甲基)-尿苷、5,6-二氢尿苷、5-氨基烯丙基胞苷、5-氨基烯丙基脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-氯-ara胞苷、5-氟-尿苷、5-碘尿苷、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、6-氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、6-氯-7-脱氮-鸟苷、6-氯嘌呤核糖苷、6-巯基-鸟苷、6-甲基-巯基嘌呤-核糖苷、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷、7-脱氮腺苷、7-甲基-鸟苷、8-氮杂腺苷、8-溴-腺苷、8-溴-鸟苷、8-巯基-鸟苷、8-氧代鸟苷、苯并咪唑-核糖苷、β-D-甘露糖基-辫苷、二氢-尿苷、肌苷、N1-甲基腺苷、N6-([6-氨基己基]氨基甲酰甲基)-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N7-甲基-黄苷、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、嘌呤霉素、辫苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、怀丁苷、黄苷和木糖-腺苷。在一些实施方案中，本文所述的化学修饰的核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖苷-5’-三磷酸、2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5’-三磷酸、2-硫尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-肌苷-5’-三磷酸、4-硫尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5’-三磷酸、7-脱氮腺苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸、8-叠氮腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、6-甲基鸟苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、嘌呤霉素-5’-三磷酸或黄苷-5’-三磷酸。在一些实施方案中，本文所述的化学修饰的核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施方案中，本文所述的人工核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在一些实施方案中，本文所述的化学修饰的核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其他实施方案中，本文所述的化学修饰的核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在某些实施方案中，本文所述的化学修饰的核酸包含选自以下的至少一种化学修饰的核苷酸：6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。
非天然核酸的修饰碱基包括但不限于尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)、2-氨基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。某些非天然核酸，如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、那些增加双链体形成稳定性的核酸、通用核酸、疏水性核酸、混杂核酸、尺寸扩展的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基、其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、三环嘧啶、吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹、吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环置换的那些核酸、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶、2-吡啶酮、氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羟基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶、2-氨基-腺嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、2-硫代-胸腺嘧啶、4-硫代-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮鸟嘌呤、5-羟基胞嘧啶、2’-脱氧尿苷或2-氨基-2’-脱氧腺苷。
在一些情况下，至少一种化学修饰可以包括化学修饰工程化多核苷酸的5’或3’端，例如5’帽或3’尾。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含含有3’核苷酸的化学修饰，其可以例如通过掺入本文所述的一种或多种修饰的核苷酸而稳定以防止降解。在这个实施方案中，尿苷可以被修饰的尿苷例如5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴尿苷或本文所述的任何修饰的尿苷置换；腺苷和鸟苷可以被修饰的腺苷和鸟苷置换，例如具有在8位处的修饰，例如8-溴鸟苷，或用本文所述的任何修饰的腺苷或鸟苷替代。在一些实施方案中，脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷，可以掺入gRNA中。在一些实施方案中，O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷，可以掺入gRNA中。在一些实施方案中，可以掺入糖修饰的核糖核苷酸，例如，其中2’OH-基团被选自H、-OR、-R(其中R可以是，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、卤素、-SH、-SR(其中R可以是，例如，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氨基(其中氨基可以是，例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氰基(-CN)的基团置换。在一些实施方案中，磷酸酯主链可以如本文所述被修饰，例如用硫代磷酸酯基团修饰。在一些实施方案中，gRNA突出端区中的核苷酸可以各自独立地为修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2’-糖修饰，诸如2-F 2’-O-甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)或其任何组合。
在一些实施方案中，靶向部分的所有核苷酸都具有2’O-甲基修饰。2’O-甲基修饰被认为增加工程化多核苷酸对其mRNA前体靶标的亲和力和/或防止工程化多核苷酸被核酸酶降解。在一些实施方案中，靶向部分的所有核苷酸均具有硫代磷酸酯修饰。
调节部分
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，转录后调节部分(或调节部分)(例如，剪接体部分)选自剪接体核糖核蛋白复合物、剪接体小核核糖核酸(snRNA)、剪接体蛋白、其功能变体或其功能片段。在一些实施方案中，剪接体部分包含U1 snRNA和剪接体蛋白。在一些实施方案中，剪接体部分包含U2 snRNA和剪接体蛋白。在一些实施方案中，剪接体snRNA选自U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U14atac、U6atac及其组合。在一些实施方案中，剪接体snRNA为U1或U2。在一些实施方案中，剪接体蛋白选自Sm、U1-70k、U1A、U1C及其组合。剪接体部分的非限制性示例包括SmD1、SmD2、SmD3、SmE、SmF、SmG、U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U14或U16。
在本文所述的一些实施方案中，当与工程化多核苷酸和RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)结合时，剪接体部分切割或剪接靶序列中的RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)。在一些实施方案中，剪接体部分还促进对切割的RNA(例如，切割的mRNA，诸如切割的mRNA前体)的修饰。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸通过碱基配对诸如Watson-Crick碱基配对与靶序列结合。工程化多核苷酸与本文提供的募集部分的结合可用于调节靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，工程化多核苷酸与募集部分的结合使得募集部分能够以增加的特异性剪接编码靶基因的mRNA前体，从而调节靶基因。在一些实施方案中，工程化多核苷酸与募集部分的结合使得募集部分能够以增加的效率剪接编码靶基因的mRNA前体，从而调节靶基因。调节可以指增加或减少靶基因的表达或活性。靶基因的非限制性示例可以包括微管相关蛋白TAU(MAPT)。在一些实施方案中，与不存在与募集部分结合的工程化多核苷酸的情况下靶基因的表达或活性相比，当工程化多核苷酸与募集部分结合时，靶基因的表达或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。在一些实施方案中，与不存在与募集部分结合的工程化多核苷酸的情况下靶基因的表达或活性相比，当工程化多核苷酸与募集部分结合时，靶基因的表达或活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10或更低。
在一些实施方案中，靶标的表达或活性的调节包括纠正由于剪接变体导致的靶基因的异常表达。在一些实施方案中，与不存在与募集部分结合的工程化多核苷酸的情况下由于异常剪接变体导致的错误折叠靶基因或蛋白质的表达或活性相比，当工程化多核苷酸与募集部分结合时，由于异常剪接变体导致的错误折叠靶基因或蛋白质的表达或活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10或更低。在一些实施方案中，与不存在与募集部分结合的工程化多核苷酸的情况下由于异常剪接变体导致的错误折叠蛋白质聚集体的量相比，当工程化多核苷酸与募集部分结合时，由于异常剪接变体导致的错误折叠蛋白质聚集体的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10或更低。在一些实施方案中，与不存在与募集部分结合的工程化多核苷酸的情况下由于异常剪接变体导致的包含错误折叠蛋白质的噬斑的量相比，当工程化多核苷酸与募集部分结合时，由于异常剪接变体导致的包含错误折叠蛋白质的噬斑的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10或更低。
分子相互作用
在本公开的各个方面，工程化多核苷酸可能能够参与与多肽(例如，U1-C)或其他多核苷酸(例如，mRNA前体、U1 snRNA)的分子相互作用。工程化多核苷酸可以被配置为或以其他方式能够通过一个或多个靶向部分或募集部分与其他多肽或多核苷酸相互作用。在本文所述的一些实施方案中，靶向部分包含与组成型剪接供体的保守位点相互作用的游离5’和3’端。这种相互作用可以沉默U1 snRNA RNA结合结构域。在一些实施方案中，靶向部分包含增加对mRNA前体靶标的亲和力的2’修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，靶向部分与mRNA前体的结合通过U1-C与mRNA前体剪接接合区域周围的mRNA前体主链之间的氢键和静电相互作用来稳定。在这些实施方案中，U1-C可以不与mRNA前体进行特异性碱基接触。2’核苷酸修饰可以有利于靶向部分与U1-C之间的氢键结合。因此，靶向部分(游离5’和3’端)与mRNA前体双链体的结合使得U1-C的靶向相互作用能够识别和稳定化。
U1-C可以稳定剪接体中央核心。U1-C通过U1-70KD与Sm环之间的相互作用桥增强不相容5’-剪接的亲和力并稳定剪接体机制的中央核心。
在一些实施方案中，靶向部分可以与U1-C的锌指相互作用。靶向部分中的硫代磷酸酯核苷酸间键联可以促进靶向部分与锌指的相互作用。工程化多核苷酸可以在与锌指相互作用的具体或特定位置处包含硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施方案中，募集部分与U1-A的茎环II形成氢键。这种相互作用可以调节U1-A的聚腺苷酸化和乙酰化信号传导，因为U1-A的茎环II不能被募集部分沉默。
在本文所述的一些实施方案中，工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，当与工程化多核苷酸和剪接体部分结合时，RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)基本上不表现出与U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)的碱基配对。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，当与工程化多核苷酸和剪接体部分结合时，RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性地相互作用。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用，例如，其包含氨基酸序列：YYCDYCDTYLTHDSPSVRKTHCTGRKHRDNVKF(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，其5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指共价地相互作用(例如，通过二硫键)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，其5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指非共价地相互作用(例如，通过氢键)。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，本文所述的ASMO1)包含与U1 snRNA互补的核苷酸序列。在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，工程化多核苷酸包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的茎环结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，部分序列包含与U1 snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列。在一些实施方案中，部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，锚定序列包含对应于5’-CACGUUA-3’的序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的内环基本上不表现出与U1snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的下茎基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。
在本文所述的工程化多核苷酸的一些实施方案中，工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。在一些实施方案中，当将所描述的剪接体部分募集至靶序列(诸如靶mRNA前体)时，工程化多核苷酸不表现出与剪接体部分(诸如U1snRNA)的RNA结合结构域(RBD)碱基配对。图4示出了工程化多核苷酸和剪接体部分的RBD之间碱基配对的这种缺乏，其中U1snRNA的RBD位点具有以下序列：3’-GUCCAUCAUA-5’并与靶序列形成碱基配对。在一些情况下，当工程化多核苷酸和剪接体部分结合时，工程化多核苷酸基本上不表现出与U1-C剪接体部分的碱基特异性地相互作用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指或U1-1剪接体部分特异性地相互作用。图10C示出了含有145个氨基酸的U1-C snRNP的代表性序列，其中突出显示的36个氨基酸(YYCDYCDTYLTHDSPSVRKTHCTGRKHRDNVKF(SEQ ID NO:5))包含锌指结构域。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指或U1-1剪接体部分共价地相互作用(例如，通过二硫键)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指或U1-1剪接体部分非共价地相互作用(例如，通过氢键)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，本文所述的ASMO1)包含与U1 snRNA互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含与U1snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的茎环二级结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，部分序列包含与U1 snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列。在一些实施方案中，部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列。在一些实施方案中，工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些情况下，工程化多核苷酸的内环基本上不表现出与U1snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些方面，工程化多核苷酸的下茎基本上不表现出与U1snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些方面，锚定序列包含对应于5’-CACGUUA-3’的序列。在一些情况下，工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对，其中工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。例如，图2A示出了由于采用硫代磷酸酯型核苷酸间键的化学修饰的存在而导致分子内二硫键的缺乏。U1 snRNP复合物的稳定化可以通过U1-C锌指的强离子吸引力观察到，这是由在5’-或/和3’-端处的工程化多核苷酸(ASMO)靶向部分的硫醇的二硫桥诱导的。mRNA前体/工程化多核苷酸(ASMO)双链体键可以通过U1-C与缝接点周围的mRNA前体主链之间的氢键和静电相互作用来稳定，但U1-C不会与mRNA前体碱基特异性接触。该结构表明，由U1 snRNP对5’-剪接核苷酸的选择主要是通过茎5’/3’与mRNA前体之间的相互作用来实现的。同时，U1-C通过U1-70KDa与Sm环之间的相互作用桥调整5’-剪接不相容位点的相对亲和力并稳定剪接体机制的中央核心(参见图7-9)。在U1snRNP特异性蛋白中，U1-70K和U1-C在帮助识别mRNA前体转录物方面发挥着重要作用。U1-70K具有虽然高度保守但预计为非结构化的N末端(残基约2-60)；介导其与U1 snRNA茎环的相互作用的RNA结合结构域(或RBD)(残基92-202)；以及富含精氨酸和丝氨酸残基(RS“结构域”)以及R-(D/E)残基重复序列的C末端。尽管该C末端结构域并不保守，但RS“结构域”对于与非snRNP剪接因子(诸如ASF/SF2)的相互作用非常重要。该区域的丝氨酸经受翻译后修饰(磷酸化)且对于剪接活性非常重要。U1-C由N末端锌指结构域和富含RG残基重复序列的C末端区域组成。U1-C的该区域中的精氨酸经受翻译后修饰(甲基化)。与U1-70K相比，U1-C不与游离U1 snRNA结合，但需要Sm蛋白与U1-70K事先结合。U1-C锌指区域中的突变对U1 snRNP识别5’剪接位点具有显著影响，表明该蛋白在此活性中发挥直接作用。U1snRNP的装配和功能最初通过冷冻电子显微镜研究以及最近通过X射线晶体学阐明其三维结构而得到极大增强。此前，七个Sm蛋白中的四个的晶体结构导致了对其余三个(Sm-F、Sm-E和Sm-G)的建模，并提出了它们一起将会相互作用以形成七元环。完全重组的人U1snRNP的晶体结构揭示，Sm蛋白确实形成七聚环，该环由每个Sm蛋白的单个拷贝组成，穿过其中心的是U1 snRNA的Sm位点。在晶体结构中，U1-C所处的位置能够识别当U1 snRNA的5’端与5’剪接位点碱基配对时形成的双链体。U1-70K的N末端从RBD延伸并包裹Sm环的一个面，穿过Sm-D2和Sm-D3/B，这一发现因此可以确保用于与U1 snRNA：5’剪接位点双链体相互作用的U1-C的正确结构和定位(图9)。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸当与本文所述的剪接体部分结合时，mRNA前体基本上不表现出与U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)碱基配对。在一些情况下，工程化多核苷酸当与剪接体部分结合时，mRNA前体基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性相互作用。图4示出了在不存在工程化多核苷酸的情况下，U1 snRNA的RBD结合在组成型供体的保守区域中。同时，在存在工程化多核苷酸的情况下，茎5’/3’阻断U1 snRNA与mRNA前体的RBD相互作用(图3和图6)。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指共价地相互作用(例如，通过二硫键)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指非共价地相互作用(例如，通过氢键)。与U1-C锌指的氨基酸残基相互作用的mRNA前体/工程化多核苷酸(ASMO)双链体的形成稳定了5；区域(图9)。然后，可以观察到通过由U1-C锌指的主链和侧链中的原子与工程化多核苷酸的茎5’形成的二硫键的形成的有利分子动力学。当ASMO与U1-C锌指中存在的所有半胱氨酸相互作用时，也可以形成强离子键(图9和图10)。在存在或不存在本文所述的工程化多核苷酸的情况下U1-C与mRNA前体之间的附加相互作用示例显示在表5中。
表5.由工程化多核苷酸的存在介导的U1-C与mRNA前体之间的示例相互作用
在一些实施方案中，工程化多核苷酸(例如，本文所述的ASMO1)包含与U1 snRNA互补的核苷酸序列。在一些方面，工程化多核苷酸包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在其他方面，本文描述的为工程化多核苷酸的茎环结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。在一些情况下，部分序列包含与U1snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列，其中部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列，并且其中工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些方面，工程化多核苷酸包含工程化多核苷酸的内环，其基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含工程化多核苷酸的下茎，其基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。在一些实施方案中，锚定序列包含对应于5’-CACGUUA-3’的序列，其中然后工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对。
工程化多核苷酸组
在一些实施方案中，本文所述包括各自独立地本文所述的工程化多核苷酸组。例如，该多核苷酸组可独立地包含：(i)一个或多个靶向部分(诸如本文所述)，靶向部分被配置为在靶序列(诸如本文所述)处结合核糖核酸(RNA)(诸如本文所述)(例如，信使核糖核酸(mRNA)，诸如信使核糖核酸前体(mRNA前体))，和(ii)募集部分(诸如本文所述)，募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)(诸如本文所述)，其中该工程化多核苷酸组被配置为在包含靶序列(诸如本文所述)的多个靶序列处特异性地结合RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)。
载体
本文所述的一些实施方案中包括包含编码本文所述的工程化多核苷酸的核酸序列的载体或质粒。
本文所述的一些实施方案中包括多个载体或多个质粒，其包含各自编码本文所述的工程化多核苷酸的多个核酸序列。在一些实施方案中，多个载体或多个质粒包含编码多于一种本文所述的工程化多核苷酸的多个核酸序列。在一些实施方案中，多个载体或多个质粒包含编码多个工程化多核苷酸(各自独立地在本文中描述)的多个核酸序列。
药物组合物
在一些实施方案中，本文描述的是药物组合物，其包含本文所述的工程化多核苷酸、或质粒、载体或编码其序列的分离DNA。如本文所用的药物组合物是指至少一种工程化多核苷酸或编码至少一种工程化多核苷酸的载体与其他化学组分(即药学上可接受的非活性成分)的混合物，该其他化学组分是诸如例如载剂、赋形剂、黏合剂、填充剂、混悬剂、矫味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、湿润剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。任选地，组合物包括两种或更多种本文讨论的药物组合物。在实施本文提供的治疗方法或用途中，将治疗有效量的本文所述的药物组合物以药物组合物形式施用于患有待治疗的疾病、病症或病况的哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物为人类。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、对象的年龄和相对健康状况、所用药物组合物的效力和其他因素而广泛变化。药物组合物可以单独使用或与一种或多种作为混合物组分的药物组合物组合使用。本文所述的药物组合包括工程化多核苷酸、组合物、与工程化多核苷酸接触的细胞或与包含工程化多核苷酸的组合物接触的细胞、或其组合。
本文所述的药物制剂通过适当的施用途径施用于对象，包括但不限于静脉内、鞘内、动脉内、肿瘤内、口服、局部、透皮、直肠、肌内、皮下、骨内、透粘膜、吸入或腹膜内施用途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉剂、即释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及即时和控释混合制剂。
包括药物组合物的药物组合物以常规方式制造，诸如，仅作为示例，通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、磨细、乳化、包封、包埋或压缩工艺。
试剂盒
在一些实施方案中，本文描述的是用于使用本文所述的工程化多核苷酸、组合物或药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于治疗对象的疾病或病况。在一些实施方案中，试剂盒包含除工程化多核苷酸、组合物或药物组合物之外的材料或组分的集合。在一些实施方案中，试剂盒包含用于测定和选择用于治疗疾病或病况的合适寡核苷酸的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含用于进行诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)、PCR或qPCR等测定的组分。试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期用途。例如，一些实施方案被配置为治疗对象中本文公开的疾病或病况的目的。在一些实施方案中，试剂盒被特别地配置用于治疗哺乳动物对象的目的。在一些实施方案中，试剂盒被特别配置用于治疗人类对象的目的。
试剂盒中可包含使用说明。在一些实施方案中，试剂盒包含用于向有需要的对象施用组合物的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含用于进一步对工程化多核苷酸进行工程化的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含解冻或以其他方式恢复工程化多核苷酸的生物活性的说明书，该工程化多核苷酸可以在储存或运输期间被冷冻保存或冻干。在一些实施方案中，试剂盒包含用于测量其预期目的功效的说明书(例如，如果用于治疗对象，则为治疗功效)。
任选地，试剂盒还包含其他有用的组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载剂、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或其他有用的用具。组装在试剂盒中的材料或组分可以以保持它们的可操作性和实用性的任何方便且合适的方式存储来提供给从业者。例如，工程化多核苷酸、组合物或药物组合物可为溶解的、脱水的或冻干的形式。这些组分通常包含在合适的包装材料中。
方法
本文描述的是利用工程化多核苷酸(诸如本文所述)的方法，诸如用于改变在细胞中的核糖核酸(RNA)(例如，信使核糖核酸(mRNA)，诸如信使核糖核酸前体(mRNA前体))的方法。方法可以包括使细胞与包含一个或多个靶向部分和募集部分的工程化多核苷酸(诸如本文所述)接触。一个或多个靶向部分可与RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)(诸如本文所述)中的靶序列(诸如本文所述)处与RNA结合，并且募集部分募集在RNA(例如，mRNA，例如mRNA前体)的靶序列附近内的转录后调节部分(例如，剪接体部分)(诸如本文所述)以改变细胞中的RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)，从而产生一种或多种改变的RNA(例如，一种或多种改变的mRNA，诸如一种或多种改变的mRNA前体)。在一些实施方案中，方法改变靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，在接触之前，细胞表现出对应于靶基因的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶基因(例如，微管相关蛋白TAU(MAPT))的靶序列中的共有序列足够相同或互补。
本文所述的方法包括用于改变在细胞中多个位置处的核糖核酸(RNA)(例如，信使核糖核酸(mRNA)，诸如信使核糖核酸前体(mRNA前体))。方法可以包括使细胞与工程化多核苷酸组(诸如各自独立地在本文中描述)接触。工程化多核苷酸可包含一个或多个靶向部分和募集部分。一个或多个靶向部分可在RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)(诸如本文所述)中的多个靶序列(诸如本文所述)处结合至RNA。每个募集部分可以募集RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)靶序列附近内的转录后调节部分(例如，剪接体部分)(诸如本文所述的)以改变细胞中的RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)，从而产生一种或多种改变的RNA(例如，一种或多种改变的mRNA，诸如一种或多种改变的mRNA前体)。在一些实施方案中，该方法通过在多个位置处改变(例如，切割或/和化学修饰)RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)来改变靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，在接触之前，细胞表现出对应于靶基因的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分中的一个或每个靶向部分与靶基因(例如，微管相关蛋白TAU(MAPT))的靶序列中的共有序列足够相同或互补。
在一些实施方案中，方法包括将工程化多核苷酸递送至细胞中。在一些实施方案中，该方法包括将编码工程化多核苷酸的多核苷酸递送至细胞中并随后表达工程化多核苷酸以调节由本文所述的靶序列编码的基因的表达或活性。在一些实施方案中，方法包括使用工程化多核苷酸来治疗有需要的对象的疾病或病况。疾病或病况可与由RNA(例如mRNA，诸如mRNA前体)编码的靶基因的异常表达或活性相关。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA，诸如mRNA前体)对应于靶基因(例如，微管相关蛋白TAU(MAPT))。
图1示出了用于鉴定剪接供体和受体以设计工程化多核苷酸的核苷酸序列的示意图，其中本文所述的工程化多核苷酸或方法呈现出相对于目前可用的用于调节基因的表达或活性以治疗疾病或病况的方法的改进。在一些实施方案中，本文所述的方法通过靶向造成疾病或病况的基因的转录物的工程化多核苷酸来调节基因的表达或活性。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向有需要的对象施用本文所述的工程化多核苷酸。在一些情况下，本文所述的方法包括利用工程化多核苷酸来募集调节部分来调节造成疾病或病况的基因的表达或活性，从而治疗疾病或病况。在一些方面，本文所述的方法包括利用工程化多核苷酸来稳定调节部分的装配，以调节造成疾病或病况的基因的表达或活性，从而治疗疾病或病况。
在一些实施方案中，本文描述了将本文所述的工程化多核苷酸递送至细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括将工程化多核苷酸直接或间接递送至细胞。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与包含本文所述的工程化多核苷酸的组合物接触。在一些实施方案中，该方法包括在细胞中表达本文所述的工程化多核苷酸。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体可以通过本文所述的任何转染方法递送至细胞中。在一些实施方案中，可以通过使用表达载体将工程化多核苷酸递送至细胞中。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法容易地将载体引入本文所述的细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移至细胞中。
用于将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体引入细胞的物理方法可以包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法适用于本文的方法。用于将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
用于将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体引入细胞的化学方法可以包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、球形核酸(SNA)、脂质体或脂质纳米颗粒。用作体外和体内递送载体的示例胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。其他最先进的核酸靶向递送方法是可用的，例如用靶标纳米颗粒递送工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体。
在利用非病毒递送系统的情况下，递送媒介物示例是脂质体。考虑使用脂质制剂将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体引入细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体可以与脂质结合。与脂质结合的工程化多核苷酸或编码与脂质结合的工程化多核苷酸的载体可以封装在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，通过与脂质体和工程化多核苷酸两者结合的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，含有胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体结合组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，在一些实施方案中，它们以双层结构存在，如胶束，或具有“塌陷”结构。或者，它们只是散布在溶液中，可以形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其在一些实施方案中是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质是从商业来源获得的。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液通常储存在约-20℃。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载剂。脂质体通常特征在于具有带有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质。然而，也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，在一些实施方案中，脂质呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑脂转染试剂-核酸复合物。
在一些情况下，非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、外泌体、聚阳离子或脂质:货物缀合物(或聚集体)、裸多肽(例如，重组多肽)、裸DNA、人工病毒颗粒，以及多肽或DNA的药物增强摄取。在一些实施方案中，递送方法包括将本文所述的组合物或工程化多核苷酸与至少一种聚合物如天然聚合物或合成材料缀合或封装。该聚合物可以是生物相容的或可生物降解的。合适的生物相容性、可生物降解的合成聚合物的非限制性示例可以包括脂族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含有胺基团的聚氧杂酯和聚(酸酐)。此类合成聚合物可以是多种不同单体的均聚物或共聚物(例如无规则的、区段、片段、接枝)，例如，两个或更多个乳酸、丙交酯、乙醇酸、乙交酯、ε-己内酯、三亚甲基碳酸酯、p-二噁烷酮等。在示例中，支架可以由包含乙醇酸和乳酸的聚合物组成，诸如乙醇酸与乳酸的比例为90/10或5/95的那些。天然存在的生物相容性、可生物降解聚合物的非限制性示例可以包括糖蛋白、蛋白多糖、多糖、糖胺聚糖(GAG)和衍生自这些组分的片段、弹性蛋白、层粘连蛋白、decrorin、纤维蛋白原/纤维蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、腱蛋白、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、ORC、羧甲基纤维素和几丁质。
在一些情况下，本文所述的工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体可被包装并经由细胞外囊泡递送至细胞。细胞外囊泡可以是任何膜结合颗粒。在一些实施方案中，细胞外囊泡可以是由至少一种细胞分泌的任何膜结合颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是体外合成的任何膜结合颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是无需细胞合成的任何膜结合颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是外来体、微囊泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡小体、凋亡体、癌小体、exopher、包膜病毒、exomeres或其他非常大的细胞外囊泡。
在一些方面，本文描述了用于调节或改变由细胞中的靶序列编码的基因的表达或活性的方法。在一些实施方案中，靶序列是细胞中的信使核糖核酸前体(mRNA前体)。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与包含一个或多个靶向部分和募集部分的工程化多核苷酸接触。在一些实施方案中，一个或多个靶向部分在mRNA前体中的靶序列处结合至mRNA前体。在一些实施方案中，募集部分募集mRNA前体的靶序列附近内的转录后调节部分(例如，剪接体部分)以改变细胞中的mRNA前体，从而产生一种或多种改变的mRNA前体。在一些实施方案中，mRNA前体对应于靶基因，例如微管相关蛋白TAU(MAPT)。在一些实施方案中，当工程化多核苷酸结合剪接体部分并将其募集至靶序列时，该方法增加靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，当工程化多核苷酸结合剪接体部分并将其募集至靶序列时，该方法减少靶基因的表达或活性。在一些实施方案中，当工程化多核苷酸结合剪接体部分并将其募集至靶序列时，该方法纠正对应于靶基因的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质。
在一些实施方案中，该方法包括将两个或更多个工程化多核苷酸接触或递送到单个细胞中，其中工程化多核苷酸各自包含一个或多个被配置为结合两个或更多个靶序列的靶向部分。两个或更多个靶序列可以位于编码靶基因的mRNA前体的同一链上。两个或更多个靶序列可以位于编码相同靶基因的mRNA前体的不同链上。两个或更多个靶序列可以位于mRNA前体的不同链上，其中mRNA前体的每条链可以编码不同的靶基因。在一些实施方案中，方法包括两个或更多个工程化多核苷酸，其被配置为在包含靶序列的多个靶序列处特异性地结合mRNA前体。
在一些实施方案中，本文公开了通过调节细胞中靶基因的表达或活性来治疗疾病或病况的方法，从而治疗疾病或病况。在一些实施方案中，方法包括通过纠正对应于靶基因的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质来治疗疾病或病况。在一些实施方案中，疾病或病况与本文所述的任一靶基因的表达或活性增加相关。在一些实施方案中，疾病或病况与本文所述的任一靶基因的表达或活性减少相关。在一些实施方案中，疾病或病况与对应于本文所述的任一靶基因的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质的剪接相关。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物可以单独施用于对象(例如，独立治疗)。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物与附加药剂组合施用。在一些情况下，本文所用的附加药剂单独施用。工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸和附加药剂的药物组合物可以一起或顺序施用。组合疗法可以在同一天内施用，或者可以间隔一天或多天、周、月或年施用。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以至少0.25μM的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以至少0.5μM的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以至少0.75μM的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以至少为1μM的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以至少0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM或更高的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以不超过0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM或更低的浓度施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物以约0.25μM至1μM的浓度施用。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物是疾病或病况的一线治疗。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物是二线、三线或四线治疗。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、20个、30个或更多个寡核苷酸。一般而言，本文公开的方法包括通过口服施用来施用工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物。然而，在一些情况下，该方法包括通过腹膜内注射施用工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物。在一些情况下，该方法包括通过静脉内(“i.v.”)施用来施用工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物。在一些情况下，该方法包括通过肿瘤内施用来施用工程化多核苷酸或包含工程化多核苷酸的药物组合物。可以设想，还可以通过其他途径施用本文公开的工程化多核苷酸或包含该工程化多核苷酸的药物组合物，例如皮下注射、肌内注射、皮内注射、透皮注射经皮施用、鼻内施用、淋巴管内注射、鞘内施用、肺部施用、直肠施用胃内施用或任何其他合适的肠胃外施用。在一些实施方案中，与全身途径相比，优选更接近损伤或炎症部位的局部递送途径。可以调整施用治疗剂的途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施方案中，治疗剂的施用是在疾病或病况的急性和慢性症状之一或两者发作之前或之后。
施用于对象的合适剂量(dose/dosage)由包括但不限于以下的因素确定：具体的工程化多核苷酸、组合物或药物组合物、疾病状况及其严重程度、合并症、需要治疗的对象的身份(例如体重、性别、年龄)，并且可以根据病例周围的具体情况来确定，包括例如所施用的具体药剂、施用途径、所治疗的病况和所治疗的对象。
本文描述了使用工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体治疗有需要的对象的癌症的方法。工程化多核苷酸可以是PCT/US2022/037391中描述的工程化多核苷酸，该文献的全部内容通过引用并入本文。
本文描述了治疗有需要的对象的癌症的方法，这些方法包括向对象施用包含工程化多核苷酸的药物组合物。在一些实施方案中，工程化多核苷酸包含：(i)一个或多个靶向部分，一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和(ii)募集部分，募集部分被配置为募集剪接体部分，其中，当与mRNA前体和工程化多核苷酸结合时，剪接体部分在靶序列中或附近处改变mRNA前体。
在一些实施方案中，癌症选自：脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌和肝癌。在一些实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是乳腺腺癌。在一些实施方案中，癌症是神经母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是前列腺腺癌。在一些实施方案中，癌症是肾癌。在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是肾腺癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种方法，该方法包括：使细胞与本文所述的工程化多核苷酸或编码该工程化多核苷酸的载体接触。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞毒性或细胞抑制作用。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞活力改变。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致工程化多核苷酸被细胞内化。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致线粒体活性降低。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞增殖减少。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞周期阶段分布发生变化，其中细胞周期阶段由以下组成：Sub/G1：非增殖状态(静止)；G1/G0：细胞生长；S：DNA复制；G2/M：DNA分离和有丝分裂。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞处于G2/M期的倾向性增加。
在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞凋亡或坏死增加。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致MAPT表达降低。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致TAU的量减少。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致线粒体膜电位发生变化。
在一些实施方案中，本文提供了一种方法，所述方法包括：使多个细胞与本文所述的工程化多核苷酸或编码该工程化多核苷酸的载体接触。在一些实施方案中，使多个细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致细胞周期阶段分布发生变化，其中细胞周期阶段由以下组成：Sub/G1：非增殖状态(静止)；G1/G0：细胞生长；S：DNA复制；G2/M：DNA分离和有丝分裂。在一些实施方案中，使多个细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致处于G2/M期的细胞数量增加。在一些实施方案中，使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触会导致处于坏死期或凋亡期的细胞数量增加。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗对象的肿瘤的方法。在一些实施方案中，使对象的肿瘤与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触导致肿瘤进展的减缓。在一些实施方案中，肿瘤是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体通过静脉内施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体通过肿瘤内施用。在一些实施方案中，工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体通过皮下施用。在一些实施方案中，将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体施用一次。在一些实施方案中，将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体每日施用一次。在一些实施方案中，将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体每日施用一次，持续1至21天。在一些实施方案中，将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体施用于有需要的对象导致肿瘤体积减小。在一些实施方案中，将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体施用于有需要的对象导致肿瘤体积比率减小。
在一些实施方案中，细胞是胶质母细胞瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是乳腺腺癌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经母细胞瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是前列腺腺癌细胞。在一些实施方案中，细胞是肾癌细胞。在一些实施方案中，细胞是肝细胞癌细胞。在一些实施方案中，细胞是肾腺癌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元。在一些实施方案中，细胞来自被诊断患有癌症的对象。在一些实施方案中，细胞是来自被诊断患有癌症的对象的神经元。
在一些实施方案中，工程化多核苷酸是ASMO1。在一些实施方案中，ASMO1与U1-C和U1-70K直接或间接相互作用。在一些实施方案中，ASMO1与U1复合物以及MAPT mRNA前体直接或间接相互作用。
在各种实施方案中，如先前已施用紫杉烷类药物一样，向对象施用、共同施用紫杉烷类药物。紫杉烷类药物可以包括对治疗癌症有功效的紫杉烷类药物。在施用工程化多核苷酸后，对象的预后可能会改善，例如，与施用工程化多核苷酸之前相比，或与施用紫杉烷类药物但未施用工程化多肽的另一名对象相比。工程化多肽可导致对象中存在的TAU的量发生改变。紫杉烷类药物可能能够结合TAU，从而导致能够结合细胞中的其他靶标的紫杉烷类药物减少。通过减少TAU的量，紫杉烷类药物的“脱靶”结合可能会减少，并可能提高其功效。在各种实施方案中，如先前已施用紫杉烷类药物一样，对象未施用、未共同施用紫杉烷类药物。
在各种实施方案中，向对象施用工程化多核苷酸而不施用另一种抗癌药物或癌症治疗剂。
在各种实施方案中，如先前已施用另一种癌症疗法(例如，药物、新辅助疗法、辅助疗法)一样，向对象施用、共同施用另一种癌症疗法。与仅施用其他疗法相比，施用工程化多核苷酸可以改善对象的预后，或提高治疗功效。
使用绝对或者顺序的术语，例如，“将(will)”、“将不(will not)”、“会(shall)”、“不会(shall)”、“必须(must)”、“必须不(must not)”、“第一(first)，”、“最初(initially)”、“下一个(next)”、“随后(subsequently)”、“之前(before)”、“之后(after)”、“最后(lastly)”和“最终(finally)”，并不意味着限制本文所公开的本实施实施方案的范围，而是作为示例。
如本文所用的，除非上下文清楚地另有说明，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”也旨在包括复数形式。此外，就详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体而言，这些术语旨在是包容性的方式，类似于术语“包含(comprising)”。
如本文所用的，短语“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”为开放式表达，其在操作中既是合取的又是析取的。例如，表述“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”是指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或者A、B和C一起。
如本文所用的，“或”可以指“和”、“或”或“和/或”且均可以排他地和包含地使用。例如，术语“A或B”可以指“A或B”、“A但不是B”、“B但不是A”以及“A和B”。在一些情况下，上下文可以决定特定的含义。
本文所述的任何系统、方法、软件和平台都是模块化的。因此，诸如“第一”和“第二”的术语不一定意味着优先级、重要性顺序或行为顺序。
当提及数字或数值范围时，术语“约”意味着所提及的数字或数值范围是实验变异性内(或统计实验误差内)的近似值，并且该数字或数值范围可以在例如规定数字或数值范围的1％至15％变化。在示例中，术语“约”是指规定数字或值的±10％。
如本文所用的，术语“增加(increased/increasing/increase)”通常意指静态显著量的增加。在一些方面，术语“增加”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，或高达并包括100％的增加或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他示例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
如本文所用的，术语“减少(decreased/decreasing/decrease)”通常意指统计地显著量的减少。在一些方面，“减少”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的减少(例如，不存在水平或与参考水平相比不可检测的水平)，或10-100％之间的任何减少。在标志物或症状的背景下，这些术语意味着这种水平的统计地显著减少。减少可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选减少至对于没有给定疾病的个体的正常范围内所接受的水平。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。本发明并不意在受说明书中提供的具体示例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但本文中实施方案的描述和说明并不意味着被解释为限制意义。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实施本发明时可以采用对本文描述的本发明实施方式的各种替代方案。因此设想到本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等价物。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
实施方案列表
实施方案1.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和募集部分，所述募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)，其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述转录后调节部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
实施方案2.根据实施方案1所述的工程化多核苷酸，其中所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的工程化多核苷酸，其中所述一个或多个靶向部分包括(1)第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第一靶标序列，和(2)第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第二靶标序列。
实施方案4.根据实施方案3所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶标序列包含所述靶序列中的共有序列。
实施方案5.根据实施方案3或4所述的工程化多核苷酸，其中所述第二靶标序列包含所述靶序列中的共有序列。
实施方案6.根据实施方案3至5中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述第一和第二靶标序列在所述靶序列中相隔不超过五个核苷酸(例如，一个或两个核苷酸)的间隔序列。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶序列包含所述mRNA前体中的外显子-内含子边界。
实施方案8.根据实施方案7所述的工程化多核苷酸，其中所述第一和第二靶标序列均位于所述外显子-内含子边界的5’或3’。
实施方案9.根据实施方案7所述的工程化多核苷酸，其中所述第一和第二靶标序列中的一个位于所述外显子-内含子边界的5’；并且其中所述第一和第二靶标序列中的另一个位于所述外显子-内含子边界的3’。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述靶序列包含所述mRNA前体中的剪接位点。
实施方案11.根据实施方案10所述的工程化多核苷酸，其中所述第一或第二靶标序列包含所述mRNA前体中的剪接位点(例如，5’ss)。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述第一和第二靶向部分中的一个位于所述募集部分的5’，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个位于所述募集部分的3’。
实施方案13.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与表1中所示的序列相同或互补的序列。
实施方案14.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分包含与选自表1的外显子序列栏的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的内含子序列栏中所示的序列相同或互补的序列。
实施方案15.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分包含与表1的内含子序列栏中所示的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的外显子序列栏中所示的序列相同或互补的序列。
实施方案16.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与内含子供体位点的共有序列(例如，选自GU、GT、GC和CA)相同或互补的序列。
实施方案17.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与外显子供体位点的共有序列(例如，G)相同或互补的序列。
实施方案18.根据实施方案12所述的工程化多核苷酸，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与选自GU、GC、G和CA的共有序列相同或互补的序列。
实施方案19.根据实施方案1至18中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述剪接体部分选自剪接体核糖核蛋白复合物、剪接体小核核糖核酸(snRNA)、剪接体蛋白、其功能变体或其功能片段。
实施方案20.根据实施方案19所述的工程化多核苷酸，其中所述剪接体部分包含U1 snRNA和剪接体蛋白。
实施方案21.根据实施方案19至20中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述剪接体snRNA选自U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U14atac、U6atac及其组合。
实施方案22.根据实施方案19至21中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述剪接体蛋白选自Sm、U1-70k、U1A、U1C及其组合。
实施方案23.根据实施方案1至22中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述募集部分包含与SEQ ID NO:1-2中任一个至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。
实施方案24.根据实施方案23所述的工程化多核苷酸，其中所述募集部分包含与SEQ ID NO:1-2中任一个相同或互补的核苷酸序列。
实施方案25.根据实施方案1至24中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含(例如，二级)结构特征。
实施方案26.根据实施方案25所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含顶环、上茎、内环、下茎或其组合。
实施方案27.根据实施方案25所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，所述茎包含两个互补的茎序列。
实施方案28.根据实施方案27所述的工程化多核苷酸，其中所述茎(例如，所述下茎或所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
实施方案29.根据实施方案27或28所述的工程化多核苷酸，其中所述环是与包含两个互补茎序列的所述茎(例如，所述下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环。
实施方案30.根据实施方案29所述的工程化多核苷酸，其中所述内环包含不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。
实施方案31.根据实施方案29或30所述的工程化多核苷酸，其中所述另一茎(例如，所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
实施方案32.根据实施方案29至31中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸还包含顶环。
实施方案33.根据实施方案32所述的工程化多核苷酸，其中所述顶环包含不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。
实施方案34.根据实施方案1至33中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。
实施方案35.根据实施方案1至34中任一项所述的工程化多核苷酸，其中，当与所述工程化多核苷酸和所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)碱基配对。
实施方案36.根据实施方案1至35中任一项所述的工程化多核苷酸，其中，当与所述工程化多核苷酸和所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性相互作用。
实施方案37.根据实施方案1至36中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。
实施方案38.根据实施方案37所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。
实施方案39.根据实施方案37或38所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸(例如，其所述5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指共价地相互作用(例如，通过二硫键)。
实施方案40.根据实施方案37至39中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸(例如，其所述5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指非共价地相互作用(例如，通过氢键)。
实施方案41.根据实施方案1至40中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。
实施方案42.根据实施方案41所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的茎环结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。
实施方案43.根据实施方案41或42所述的工程化多核苷酸，其中所述部分序列包含与U1 snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列。
实施方案44.根据实施方案41至43中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列。
实施方案45.根据实施方案1至44中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。
实施方案46.根据实施方案45所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的内环基本上不表现出与U1 snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。
实施方案47.根据实施方案45或46所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的下茎基本上不表现出与U1 snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。
实施方案48.根据实施方案45至47中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述锚定序列包含与5’-CACGUUA-3’对应的序列。
实施方案49.根据实施方案1至48中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对。
实施方案50.根据实施方案1至49中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。
实施方案51.根据实施方案50所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。
实施方案52.根据实施方案50或51所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是化学修饰的核苷酸。
实施方案53.根据实施方案50或51所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是2’-修饰的(例如2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。
实施方案54.根据实施方案50至53中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
实施方案55.根据实施方案50至54中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。
实施方案56.根据实施方案50至54中任一项所述的工程化多核苷酸，其中至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联为硫代磷酸酯。
实施方案57.根据实施方案1至56中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约10至约25个核苷酸。
实施方案58.根据实施方案1至57中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述募集部分包含约10至约30个核苷酸、或约10至约20个核苷酸。
实施方案59.根据实施方案1至58中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述一个或多个靶向部分各自独立地包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸、或约2个核苷酸至约8个核苷酸。
实施方案60.根据实施方案1至59中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述第一和第二靶向部分中的一个包含约2个核苷酸，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个包含约5或6个核苷酸。
实施方案61.根据实施方案1至60中任一项所述的工程化多核苷酸，其中，当与所述工程化多核苷酸和所述mRNA前体结合时，所述剪接体部分切割或剪接所述靶序列中的所述mRNA前体。
实施方案62.根据实施方案1至61中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述剪接体部分进一步促进对切割的mRNA前体的修饰。
实施方案63.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-4中任一个至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列，所述工程化多核苷酸的特征在于(例如，二级)结构特征。
实施方案64.根据实施方案63所述的工程化多核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQID NO:1-4中任一个相同或互补。
实施方案65.根据实施方案63或64所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包含一个或多个茎环结构。
实施方案66.根据实施方案63或64所述的工程化多核苷酸，其中所述结构特征包括顶环、上茎、内环、下茎或其组合。
实施方案67.根据实施方案63至66中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，所述茎包含两个互补的茎序列。
实施方案68.根据实施方案67所述的工程化多核苷酸，其中所述茎(例如，所述下茎或所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
实施方案69.根据实施方案63至68中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述环是与包含两个互补茎序列的所述茎(例如，所述下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环。
实施方案70.根据实施方案69所述的工程化多核苷酸，其中所述内环包含不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。
实施方案71.根据实施方案69或70所述的工程化多核苷酸，其中所述另一茎(例如，所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
实施方案72.根据实施方案69至71中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸还包含顶环。
实施方案73.根据实施方案72所述的工程化多核苷酸，其中所述顶环包含不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。
实施方案74.根据实施方案63至73中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸还包含与靶基因的靶序列足够相同或互补的一个或多个靶向部分。
实施方案75.根据实施方案74所述的工程化多核苷酸，其中所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与所述靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。
实施方案76.根据实施方案74所述的工程化多核苷酸，其中所述靶基因是微管相关蛋白TAU(MAPT)。
实施方案77.根据实施方案63至75中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。
实施方案78.根据实施方案77所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。
实施方案79.根据实施方案77所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。
实施方案80.根据实施方案77所述的工程化多核苷酸，其中至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联为硫代磷酸酯。
实施方案81.根据实施方案77至80中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。
实施方案82.根据实施方案77至80中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是化学修饰的核苷酸。
实施方案83.根据实施方案77至80中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是2’-修饰的(例如，2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基或2’-甲氧基乙基)核苷酸。
实施方案84.根据实施方案64至84中任一项所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包含约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约10至约25个核苷酸。
实施方案85.一种用于改变细胞中信使核糖核酸前体(mRNA前体)的方法，所述方法包括使所述细胞与包含一个或多个靶向部分和募集部分的工程化多核苷酸接触，其中所述一个或多个靶向部分在所述mRNA前体中的靶序列处结合所述mRNA前体，并且所述募集部分募集所述mRNA前体的所述靶序列附近内的转录后调节部分(例如，剪接体部分)以改变所述细胞中的所述mRNA前体，从而产生一个或多个改变的mRNA前体。
实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。
实施方案87.根据实施方案85或86所述的方法，其中所述mRNA前体与靶基因对应。
实施方案88.根据实施方案87所述的方法，其中所述靶基因是微管相关蛋白TAU(MAPT)。
实施方案89.根据实施方案85至88中任一项所述的方法，其中所述方法改变所述靶基因的表达或活性。
实施方案90.根据实施方案85至89中任一项的实施方案所述的方法，其中，在所述接触之前，所述细胞表现出与所述靶基因相对应的异常信使核糖核酸(mRNA)或蛋白质。
实施方案91.一组工程化多核苷酸，每个工程化多核苷酸独立地包含：(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在靶序列处结合信使核糖核酸前体(mRNA前体)，和(ii)募集部分，所所述募集部分被配置为募集转录后调节部分(例如，剪接体部分)，其中所述工程化多核苷酸组被配置为在包括所述靶序列的多个靶序列处特异性地结合所述mRNA前体。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的刺激、系统和方法的实施方案，且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.用工程化多核苷酸调节靶基因的表达
将从细胞样(例如，HEK293细胞系)获得的细胞培养并维持在细胞培养基中。然后可以使细胞与工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体接触，以通过本文所述的任意一种递送方法将工程化多核苷酸或编码工程化多核苷酸的载体递送至细胞中。在将工程化多核苷酸递送至细胞中后，可以将细胞培养一段时间以使工程化多核苷酸调节靶基因的表达或活性。然后可以收获并裂解细胞以测量靶基因的表达或活性。例如，可以收获并裂解细胞并用于检查由工程化多核苷酸调节的靶基因的mRNA前体、mRNA或蛋白质的丰度。在其他情况下，可以将细胞固定并准备用于显微镜检查。例如，针对与本文所述的任意一个靶基因相关的包含体或淀粉样斑块(例如，由MAPT靶基因编码的TAU斑块)的存在或丰度变化，可以在显微镜下检查细胞。
实施例2.体外评估ASMO1(也称为“APT20TTMG”或“ASMO AP20TTMG”)对一组人类癌细胞系的细胞毒性作用
将细胞系在含有10％胎牛血清(FBS)的生长培养基中维持，直至实验时间。通过胰蛋白酶消化并将细胞悬浮液分装到新鲜的烧瓶中并补充新鲜培养基而对细胞进行传代培养。为了进行测定，将细胞用胰蛋白酶消化，用完全培养基(10％ FBS)中和，离心，借助血细胞计数器计数，并接种到含有10％ FBS的相应培养基中。除SH-SY5Y细胞系以2.5x 104个的密度接种外，其他细胞系以每孔1x 10 4个细胞的密度接种。不同实验组的准备均采用0.1％ FBS(U87MG、MCF-7、SH-SY5Y和786-O)和1％ FBS(PC-3)。将未处理的细胞用作阴性对照(仅培养基)。孵育24、48、72和96小时后，通过MTT测定来确定ASMO1和对照对细胞的细胞毒性的影响。
简而言之，取出板，并将20μl的5mg/ml的MTT3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物溶液添加到所有孔中。将细胞在37℃下孵育3小时。该时段之后，吸出上清液，并且每孔添加100μlDMSO以溶解甲臜晶体。然后使用Synergy HT微孔板读数仪在540nm下读取每孔的吸光度。
使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行图形生成。
图11A-D示出了ASMO1 APT20TTMG在U-87MG细胞系中孵育的效果。在24小时处，它似乎发挥了细胞毒性作用，因为与阴性对照组和媒介物组相比，细胞活力有下降的趋势。在48小时内，吸光度值降低，这可能表明存在细胞毒性和/或细胞抑制作用。然而，在72和96小时处，这些值与媒介物组的值相似，也就是说，降低活力的作用似乎已经结束。将细胞接种，并用7种不同浓度(0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μM)的APT20TTMG与培养基(0.1％ FBS)处理。在4个不同时间进行MTT测定，并且以吸光度(540nm)表示图表。(A)孵育24小时。(B)孵育48小时。(C)孵育72小时。(D)孵育96小时。
如图12A-D所示，在MCF-7细胞系中，ASMO1 APT20TTMG似乎未发挥细胞毒性或细胞抑制作用。将细胞接种，并用7种不同浓度(0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μM)的APT20TTMG与培养基(0.1％ FBS)处理。在4个不同时间进行MTT测定，并且以吸光度(540nm)表示图表。(A)孵育24小时。(B)孵育48小时。(C)孵育72小时。
(D)孵育96小时。
如图13A-D所示，ASMO1 APT20TTMG从1μM的浓度开始，在长达72小时内似乎具有细胞毒性作用。在96小时处，情况略有不同，并且0.3μM的浓度似乎开始产生一些作用。将细胞接种，并用7种不同浓度(0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μM)的APT20TTMG与培养基(0.1％FBS)处理。在4个不同时间进行MTT测定，并且以吸光度(540nm)表示图表。(A)孵育24小时。(B)孵育48小时。(C)孵育72小时。(D)孵育96小时。
如图14A-C所示，在PC-3细胞系中，ASMO1 APT20TTMG似乎未发挥细胞毒性或细胞抑制作用。将细胞接种，并用7种不同浓度(0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μM)的APT20TTMG与培养基(1％ FBS)处理。在3个不同时间进行MTT测定，并以吸光度(540nm)表示图表。(A)孵育24小时。(B)孵育48小时。(C)孵育72小时。
如图15A-C所示，在24小时内，ASMO1 APT20TTMG似乎可以改变786-O细胞系中的细胞活力。然而，在另外2个时间，与对照组(媒介物组)相比没有差异，仅在最高浓度(30μM)下才观察到差异。将细胞接种，并用7种不同浓度(0.03、0.1、0.3、1、3、10和30μM)的APT20TTMG与培养基(0.1％ FBS)处理。在3个不同时间进行MTT测定，并以吸光度(540nm)表示图表。(A)孵育24小时。(B)孵育48小时。(C)孵育72小时。
该研究的结果表明，ASMO1的作用取决于所用细胞系的类型、时间和浓度，其中对胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤有提高的功效。
实施例3.评估ASMO1在乳腺癌细胞系(MCF-7)中的抗肿瘤潜力
将MCF-7细胞在Roswell Park Memorial Institute 1640培养基(RPMI 1640)中维持，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素溶液。将细胞在75cm2的细胞培养瓶中培养，并在37℃、5％CO2和可控湿度下孵育。在达到80-90％汇合后，将细胞用10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％/0.03％)从烧瓶中分离，然后用完全培养基中和。随后，将细胞转移至锥形管中，并以1000rpm转速离心5分钟。将沉淀物重悬于培养基中，并用0.4％台盼蓝染料染色细胞，以便随后计数并在TC20TM自动计数仪(BioRad,Hercules,CA,USA)中测定细胞活力。预期细胞活力值大于90％。
由于ASMO APT20TTMG的分子靶标位于细胞核内，所以APT20TTMG会被细胞吸收以启动其预期作用。细胞对寡核苷酸的吸收尚不明确，但预计分两个步骤发生：吸附和内化。被硫代磷酸酯修饰的反义寡核苷酸吸附到细胞表面被认为是快速的，并且不需要能量。吸附后，不同的内吞途径(包括微胞饮作用)可以将此类寡核苷酸内化。细胞表面蛋白可以通过非常规内吞途径或通过依赖网格蛋白或小窝蛋白的内吞途径引导寡核苷酸的内化。此外，不同细胞类型具有不同的寡核苷酸结合能力，并且快速生长的细胞(包括恶性肿瘤细胞)比缓慢生长的细胞更有效地吸收寡核苷酸。
为了研究MCF-7细胞系对ASMO APT20TTMG的内化，通过流式细胞术测量细胞内荧光的定量。为此目的，使ASMO APT20TTMG与荧光染料羧基荧光素缀合。据推测，内化的ASMO分子的百分比可能与细胞内检测到的定量荧光信号成正比。将细胞系在24孔板中培养24小时，每孔5x10 4个细胞。之后，将细胞与在不含FBS的培养基中制备的浓度为1μM的ASMO1一起孵育0.5、1、2、4和6小时。将未处理的细胞用作阴性对照。在处理孵育后，将细胞用1mLPBS/孔洗涤两次，然后与200μL/孔的胰蛋白酶/EDTA溶液一起孵育大约3分钟，以解聚贴壁细胞。通过添加完全培养基中和胰蛋白酶，并将细胞以1500rpm离心5分钟。随后，将细胞用2mL/样品的PBS洗涤，并再次以1500rpm离心5分钟。最后，弃去上清液，并将细胞悬浮于200μL PBS中。通过采集每个样品的10.000个门控事件，使用BD FACSCANTO II流式细胞仪(BDBiosciences,NJ,USA)分析细胞的荧光，该荧光对应于细胞对羧基荧光素标记的APT20TTMG的摄取。
进行MTT测定，以评估用ASMO APT20TTMG处理后MCF-7细胞系的细胞活力，并由此推断ASMO1的细胞毒性。四唑鎓盐还原(MTT)法通过评估线粒体的完整性来评估细胞活力。活细胞能够将黄色且水溶性MTT试剂还原成不溶性的紫色甲臜产物。甲臜的定量可以通过分光光度计在560nm处的吸光度来测量。甲臜的量与培养物中活细胞的数量成正比。
为了进行该测定，将MCF-7细胞以1x104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并培养24小时以进行粘附，随后与八种浓度(0.0078-1μM)的APT20TTMG(在含有2％ FBS的培养基中制备)一起孵育48小时的时间段。然后，将细胞用150μL/孔的PBS洗涤，并与100μL/孔的MTT溶液(在培养基中制备，浓度为0.5mg/mL)一起在培养箱中孵育3小时。之后，从板中去除MTT溶液，将产生的甲臜晶体用100μL/孔的二甲基亚砜(DMSO)溶解并以300rpm在定轨摇床上混合20分钟。最后，在读板仪分光光度计(Multiskan Spectrum,Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)中在560nm波长下测量样品的吸光度。将每个样品的吸光度用于确定每种处理条件后的细胞活力。
细胞周期由DNA复制(S期)、有丝分裂(M期)和胞质分裂组成，中间间隔两个间隙期(G1和G2)。G1期期间也可能出现非增殖状态，称为G0(或静止期)。这些间隙期对于细胞周期调节以及与在G1期进入细胞周期或在G2期启动DNA分离过程相关的决定至关重要。细胞周期进程以这种方式调节细胞增殖，并且其功能障碍在癌症(主要是恶性肿瘤)的发展中起着关键作用。通过触发细胞周期停滞来控制细胞周期进程可能是癌症治疗的一个重要特征。
为了解ASMO APT20TTMG如何影响MCF-7细胞系的细胞周期及其潜在作用机制，进行了细胞周期测定。首先，将细胞以5x104个细胞/孔的密度接种于12孔板中，并培养24小时进行粘附，然后用三种不同浓度的APT20TTMG(0.25、0.5和1.0μM)处理48小时。然后，使用胰蛋白酶/EDTA溶液收集细胞，并用2.0mL PBS缓冲液洗涤，然后以1500rpm离心5分钟。然后，将细胞用冰冷的70％乙醇固定，并在4℃下孵育过夜。之后，将细胞再次用2.0mL PBS洗涤，并与碘化丙啶溶液(50μg/mL)和RNAse(200μg/mL)一起在室温下避光孵育1小时。最后，通过每个样品采集10.000个门控事件，在流式细胞仪(BD FACSCanto II,BD Biosciences)中对细胞进行分析。
尽管细胞死亡有多种形式和不同途径，但两种不同的过程，即细胞凋亡(也称为程序性细胞死亡)或坏死(不受控制的细胞死亡)仍然是主要过程。细胞凋亡的特征是细胞结构发生几种特征性的形态变化，同时伴随几种酶依赖性的生化过程。结果是细胞从体内清除，而对周围组织的损害最小。癌细胞通常通过表达抑制凋亡过程的蛋白质或通过激活促进细胞存活的信号传导通路来逃避凋亡。此外，癌细胞通常会表现出控制细胞周期和细胞增殖的信号传导通路异常，这可能导致其不受控制的生长和增殖。凋亡过程失调可能促进癌症的发展和进展，但同时，诱导癌细胞凋亡可以成为一种有效的癌症治疗策略。
使用采用Annexin V和碘化丙啶对细胞进行双重标记的方法，评估了ASMOAPT20TTMG的凋亡诱导潜力。Annexin V是一种对磷脂酰丝氨酸具有高亲和力的肽，磷脂酰丝氨酸是一种在生理条件下不对称分布于质膜的脂质双层内叶中的磷脂。在细胞凋亡导致的细胞死亡过程中，磷脂的不对称分布会消失，并且磷脂酰丝氨酸会通过外化过程转移到质膜的外叶。对磷脂酰丝氨酸的暴露量的测量可以通过与荧光染料缀合的Annexin V来检测。在另一方面，碘化丙啶是一种DNA嵌入剂，只有在质膜的选择性渗透性受损(这显然会在细胞死亡的几个过程中发生)的情况下才能穿透细胞内部。
使用Annexin V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒(eBioScience)，评估APT20TTMG在MCF-7细胞系中的促凋亡潜力。首先，将细胞以1x10 5个细胞/孔的密度在24孔板中培养24小时，以进行粘附。然后，将细胞用三种浓度的APT20TTMG(0.25、0.5和1μM)处理24小时，然后用0.05％胰蛋白酶溶液收集。处理后，将细胞用2mL的冰冷PBS洗涤一次，并用该试剂盒提供的结合缓冲液再洗涤一次。将样品用缀合FITC的Annexin V标记15分钟，并用结合缓冲液再次洗涤。最后，将样品用碘化丙啶标记，并通过采集10.000个门控事件/样品，在流式细胞仪(BD FACSCanto II,BD Biosciences)中进行分析。
线粒体对于细胞的存活至关重要，并且在癌症中，它可能导致这些细胞不受控制地生长和增殖。癌细胞中的线粒体与正常细胞中的线粒体具有不同的功能和结构。主要区别之一是，与健康细胞相比，癌细胞的膜电位发生了改变，并以不同的方式为细胞产生能量。线粒体膜电位代表跨过线粒体内膜的电荷的差异，并且对于通过氧化磷酸化进行ATP合成至关重要。线粒体膜电位的消除是细胞凋亡期间的一个早期事件，细胞凋亡是肿瘤细胞对治疗有响应的一种常见细胞死亡类型。
使用MitoTracker Red染料评估ASMO1 APT20TTMG对MCF-7细胞系的线粒体膜电位的影响。MitoTracker Red是一种在线粒体基质中积累的阳离子荧光团，指示该细胞器的活力和完整性。
为此，将细胞以1x105个细胞/孔的密度在24孔板中培养过夜，目的是使细胞粘附。之后，将细胞用三种浓度的APT20TTMG(0.25、0.5和1μM)处理24小时。用ASMO1处理后，使用0.05％胰蛋白酶溶液收集细胞，并用2.0mL PBS缓冲液洗涤两次。最后，将样品与500μL浓度为50nM的MitoTracker Red荧光染料溶液一起在培养箱中孵育15分钟。然后将细胞用2mLPBS再洗涤两次，随后通过采集10.000个门控事件/样品，在流式细胞仪(BD FACSCantoII,BD Biosciences)中进行分析。
数值以平均值±平均值的标准误差表示。为了评估组间统计学差异，进行了单因素方差分析检验，随后进行了Dunnett多重比较检验。P值小于0.05被认为具有显著性。使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行统计学分析。
如图16所示，ASMO APT20TTMG的内化值相当高，在与MCF-7细胞系一起孵育后前半小时内达到75.3±1.4％。孵育1小时后，内化程度在随后的评估期期间保持不变，近似值约为80％。
如图17所示，孵育48小时后，浓度为0.5和1μM时细胞活力降低，分别为86.4±1.6％(p＝0.0235)和85±2.7％(p＝0.0120)。在确定可能具有抗肿瘤作用的浓度范围后，对0.25、0.5和1μM的浓度进行了新的测试。这种细胞活力评估可能代表线粒体活性，但也间接地代表细胞增殖。在测试的两个最高浓度下，细胞数量可能有所减少。
如图18所示，唯一具有统计学意义的改变是在S期，即发生DNA合成的阶段，在与0.25和0.5μM一起孵育后，细胞浓度较低，这表明它们没有保留在这个阶段。
如图19所示，任何评估参数均没有变化，也就是说，在活细胞比例、近期/晚期凋亡或坏死方面，所有处理均显示出与阴性对照(未处理细胞)相似的概况。
如图20所示，线粒体膜电位没有变化，也就是说，所有处理均显示出与阴性对照(未处理细胞)相似的概况。
研究完成后，发现ASMO1被乳腺癌细胞系MCF-7有效内化。此外，其在较高浓度下显示降低的细胞活力，这可能与细胞增殖减少有关。结果显示，线粒体膜电位和细胞凋亡没有变化，但APT20TTMG似乎减少了细胞周期的S期中的细胞数量。
实施例4.评估ASMO1 APT20TTMG在神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y和SK-N-SH)中的抗肿瘤潜力
在生理条件下，TAU蛋白是一种促进细胞内微管组装及其稳定的磷蛋白。TAU在染色质结构、信号转导和核酸保护方面也发挥着重要作用。事实上，该蛋白被描述为具有广泛的相互作用组，包括与癌症相关激酶蛋白、PI3K/AKT(与多种癌症中的细胞存活和增殖相关)以及Rho-ROCK信号传导(参与细胞迁移和侵袭表型)相互作用。因此，尽管TAU因其在神经退行性疾病中的作用而广为人知，但最近的研究表明，它也可能参与多种癌症的进展以及细胞迁移和侵袭。此外，作为一种微管结合蛋白，TAU可能干扰紫杉烷类药物(微管稳定药物)与微管蛋白的结合，因而牵涉癌症治疗中使用的紫杉烷类药物的耐药性。以这种方式，抗TAU分子也可以成为改善基于紫杉烷类药物的化疗的效果的一种策略。因此，在mRNA和蛋白质水平上调节TAU的表达可以用于癌症化疗。
将细胞用冰冷的PBS冲洗一次，收集细胞，并在4℃下通过以2500g离心5分钟而使其沉淀。将每个样品重新悬浮，并在4℃下在50μl冰冷的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(Thermo Fisher Scientific,USA)中裂解20分钟，该缓冲液含有不含EDTA的Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific,USA)。为了提高蛋白质产量，使用29GX13mm针头和注射器将每个样品均质化。将细胞裂解物在4℃下通过以17,000g离心15分钟而使其澄清。收集上清液，并根据制造商的说明，使用BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific,USA)测定总蛋白质浓度。使细胞裂解物中的15μg总蛋白质在NuPAGELDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific,USA)与NuPAGE样品还原剂(DTT；ThermoFisher Scientific,USA)中变性，并在90℃下煮沸5分钟。将样品使用XCell SureLockMini-cell系统(Thermo Fisher Scientific,USA)在NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisher Scientific,USA)上进行分离，并在NuPAGE MESSDS运行缓冲液(Thermo FisherScientific,USA)中以120V电泳。在4℃下以120V，将解离的蛋白质转移到含有20％甲醇的NuPAGE转移缓冲液(Thermo Fisher Scientific,USA)中的聚偏氟乙烯(PVDF)0.45μm膜(Thermo Fisher Scientific,USA)上，持续75分钟。将PVDF膜在含有5％(w/v)干奶粉的TBS-T中在室温封闭1小时，然后在4℃下与总TAU一抗(Cell Signaling Technology，目录号46687，或Abcam，目录号ab80579)一起孵育过夜，该一抗在含有2％(w/v)BSA的TBS-T中稀释。然后将膜在TBS-T中洗涤，然后在室温下与TBS-T中的1:5000稀释度的HRP缀合二抗一起孵育1小时。将膜在TBS-T中再洗涤一次，使用增强化学发光(ECL)试剂(Thermo FisherScientific,USA)可视化蛋白质，并使用Jess Simple WesternImaging套件捕获图像。使用Image J(v1.48k；NIH)进行密度测定，并将所有定量针对黏着斑蛋白水平进行标准化。
在所有时间点，将细胞用PBS冲洗一次，然后使用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)提取RNA。按照制造商的说明，使用SuperScript IV第一链合成系统(Thermo Fisher)将RNA(0.1-1μg)转化为cDNA。去除RNA后，通过qPCR扩增5-10ng的cDNA。使用以下Taqman探针(Thermo Fisher)：总TAU(MAPT，测定ID：Hs00902193_m1)、GAPDH(GAPDH，测定ID：Hs99999905_m1)。使用Applied Biosystems QuantStudioTM12K Flex实时PCR系统分析基因表达。相对于仅用Lipofectamine 3000处理的细胞，使用可比较阈值循环(2^-ΔΔCT)Livak方法对基因表达进行定量。将基因表达相对于参考基因GAPDH进行归一化。
数值以平均值±平均值的标准误差表示。为了评估组间统计学差异，进行了单因素方差检验，随后进行了Dunnett多重比较检验。最终实验的Western Blot和qPCR分析采用双尾t检验进行，并且与MOCK(仅用对照Lipofectamine 3000处理的细胞)相比，p值<0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行图形生成。
如图21所示，ASMO1 APT20TTMG被内化，在所有评估时间内均表现50％左右。如图22A-B所示，在任何评估浓度和时间下，细胞活力均无变化。如图23所示，在任何评估浓度下，细胞周期阶段均无变化。如图24所示，与ASMO1 APT20TTMG(0.25μM)一起孵育24小时后，坏死细胞增加。如图25所示，线粒体膜电位无变化，即所有处理均与阴性对照(未处理细胞)显示出相似的概况。如图26所示，在0.5μM的APT20TTMG ASMO1之后，活细胞数量在4个分析时间内几乎保持不变，这表明存在细胞抑制作用。如图27A-B所示，除了在24小时处观察到的短暂性增加外，对于两个最长时间内MAPT表达的调节概况，在96和144小时的时间处分别降低了82±1.2％和74±4.3％。对于蛋白质定量值中的两个最高浓度观察到了类似的概况，分别降低了40±13.3％和46±14.3％。
ASMO1被神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y内化。然而，细胞活力或增殖、细胞周期和线粒体膜电位均未变化。基于坏死细胞的轻微变化，可能指示存在细胞毒性或细胞抑制潜力。
对于SK-N-SH神经母细胞瘤细胞系，APT20TTMG具有以时间依赖性方式降低TAU蛋白水平和MAPT基因表达的潜力，并且活细胞数量在4个分析时间内几乎保持不变(细胞抑制作用)。
实施例5.评估ASMO APT20TTMG在胶质母细胞瘤细胞系(U87-MG)中的抗肿瘤潜力
本实施例的方法与实施例4中所示相同。由于用5种不同人类肿瘤系进行的初步研究表明与ASMO1一起孵育后有抗肿瘤潜力，因此对三种最有希望的肿瘤系(包括胶质母细胞瘤)进行了进一步评估。
还分别通过MTT和BrdU测定评估了APT20TTMG对人类癌细胞系U87MG(人胶质母细胞瘤)的活力和增殖的体外影响。将细胞用不同浓度的APT20TTMG和参考物处理，技术重复三次(实验分3个不同的组进行)，处理48小时、96小时和144小时。每48小时后读取一次APT20TTMG和参考物。
数值以平均值±平均值的标准误差表示。为了评估组间统计学差异，进行了单因素方差分析检验，随后进行了Dunnett多重比较检验。使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行图形生成。
如图28所示，在最长的评估时间内，ASMO1的内化作用有所增加。获得的数值分别为：1小时(47.45±4.7％)、2小时(45.45±3.9％)、4小时(58±4.8％)和6小时(63.65±3.2％)。将细胞暴露于浓度为1μM的荧光染料缀合化合物FAM，通过采集10,000个门控事件，利用流式细胞术技术，在1、2、4和6小时对细胞内荧光进行定量。以两次技术重复进行的两次独立实验的数据。
如图29所示，APT20TTMG在浓度为0.25μM时，在细胞周期的两个阶段(G1/G0期和G2/M期)表现出显著变化。在第一个阶段，滞留减少(p＝0.0036)，并且在G2/M期，滞留增加(p＝0.0425)，这表明ASMO1阻止了来自该细胞系的细胞的增殖。将细胞接种并用3种不同浓度(0.25、0.5和1μM)的APT20TTMG处理，并在孵育48小时后评估细胞周期阶段。细胞增殖受细胞周期进程的调节。阶段：Sub/G1：非增殖状态(静止)；G1/G0：细胞生长；S：DNA复制；G2/M：DNA分离和有丝分裂。结果表示为三次独立实验的平均值±标准误差。
如图30所示，与APT20TTMG一起孵育后的凋亡测定表明，两个最高浓度均降低了细胞活力并明显标示晚期凋亡，而0.25μM浓度则刚好显示出趋向于这种状态的趋势。如图31所示，除了在细胞周期和凋亡中获得的结果外，ASMO1还改变了线粒体膜电位，降低了对0.25和0.5μM浓度的标记。将细胞接种并用3种不同浓度(0.25、0.5和1μM)的APT20TTMG处理，并在孵育48小时后评估细胞周期阶段。细胞增殖受细胞周期进程的调节。阶段：Sub/G1：非增殖状态(静止)；G1/G0：细胞生长；S：DNA复制；G2/M：DNA分离和有丝分裂。结果表示为三次独立实验的平均值±SEM。
如图32-33所示，用另外五种不同浓度的APT20TTMG(0.003、0.03、0.3、3和30μM)并在孵育48、96和144小时进行MTT测定(图32)。孵育48小时后，仅观察到30μM浓度的APT20TTMG降低了细胞活力，而孵育96和144小时后，三个最高浓度的APT20TTMG(0.3、3和30μM)也表现出这种能力，这表明其具有细胞毒性和/或细胞抑制潜力。最后，为了确认APT20TTMG在特定浓度下鉴于其降低细胞活力的能力是细胞毒性分子还是细胞抑制分子，还在与MTT测定相同的条件下，用U87-MG细胞系进行了细胞增殖测定(图33)。在最低浓度(0.003和0.03μM)的APT20TTMG下，尽管在0.03μM浓度下孵育的前48小时内观察到细胞增殖增加，但在该测定的最后144小时内观察到增殖的统计学显著下降。这种下降概况以及细胞活力没有改变表明，APT20TTMG在其最低浓度(0.003和0.03μM)下具有细胞抑制作用。在APT20TTMG的最高浓度(0.3、3和30μM)下，除了在测定的前48小时内观察到细胞增殖短暂增加外，在孵育144小时内还观察到细胞增殖显著减少。在APT20TTMG的最高浓度(0.3、3和30μM)下，除了在测定的前48小时内观察到细胞增殖短暂增加(这可能与星形胶质增生激活途径中的星形胶质细胞数量的有利增加有关)外，在孵育144小时内还观察到细胞增殖显著减少。该数据(图33)以及MTT结果(图32)表明，APT20TTMG在最高测试浓度下具有细胞毒性。将细胞接种并用5种不同浓度(0.003、0.03、0.3、3和30μM)处理。孵育48、96或144小时后进行BrdU测定。将数据以与阴性对照组(媒介物)相比的细胞活力百分比(％)绘制成图。结果以三次独立实验的平均值±SEM表示，这些实验以三次技术重复进行。统计学分析采用单因素方差分析然后是Dunnett多重比较检验进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
在胶质母细胞瘤细胞系U87-MG中与ASMO1一起孵育获得的结果强烈表明其具有抗肿瘤潜力，因为它们显示出活细胞和线粒体膜电位降低，此外还增加了细胞在G2/M期的滞留，从而阻止了细胞分裂的进程。此外，APT20TTMG增强了对晚期凋亡细胞的标记。总体而言，GBM细胞系(U87-MG)的体外结果表明，APT20TTMG可有效内化，并根据测试条件表现出细胞毒性和细胞抑制特性。
实施例6.在无胸腺裸小鼠中使用人类胶质母细胞瘤癌(U-87MG)异种移植模型评估APT20TTMG的体内抗肿瘤潜力
在无胸腺裸小鼠中皮下接种致瘤性人类胶质母细胞瘤癌细胞系(U-87MG)导致实体瘤形成。在无病原体条件下，肿瘤保留其自身特性并利用宿主动物提供的生长因子生长。所施用的ASMO1的抑制肿瘤生长的能力可作为评估其为抗肿瘤药物的功效的重要工具。以确定的时间间隔测量肿瘤大小生成数据，这些数据可用于计算来自肿瘤的各种终点参数，并了解测试化合物的效力。
在37℃和5％ CO2下，将人类胶质母细胞瘤癌细胞(U-87MG)在补充有10％胎牛血清(FBS)的EMEM(Eagle最小必需培养基)中培养并扩增。通过胰蛋白酶消化收集处于对数期生长的细胞，并以800rpm离心3分钟以形成沉淀物。用PBS进一步洗涤沉淀物。制备细胞悬浮液原液以获得所需的细胞计数。在细胞接种之前，使用台盼蓝测定细胞活力。用25μL台盼蓝对25μL细胞悬浮液进行染色，并使用Neubauer计数板计数活细胞。通过添加无血清培养基来调节细胞数量以达到所需浓度，即10x107个/mL。
将细胞稀释，使得细胞的浓度为1000万个细胞/100μL无血清培养基。将过夜解冻的Matrigel和细胞与培养基以1:1的比例混合，并将总体积200μL皮下注射到供体动物(n＝5)的侧腹区域。
监测供体动物的实体肿瘤生长至少3-4周。使用数字卡尺(MITUTOYO,Japan,CP-15Mx)测量肿瘤大小，并通过使用公式：(L*W2)/2计算体积。一旦肿瘤达到所需大小(约500mm3)，就人道处死供体动物，收获肿瘤并使其破碎成约30mg大小，并使用该装置将其皮下植入实验动物(n＝50)体内。每隔一天监测所有动物的肿瘤生长/大小。
一旦肿瘤大小达到约100mm3时，就选择动物并根据肿瘤大小通过分层法随机分为三组(G1-G3)。在此阶段开始G1-G3组的处理。每组由8只动物组成。
表6.实验设计
●G1用作媒介物对照组，并每日通过静脉内用5mL/kg剂量的生理盐水处理，持续3周。
●G2用作参考物处理组，并每日通过p.o.用5mg/kg剂量的TMZ处理，持续3周。
●每隔三天(q3d)通过静脉内用20mL/kg剂量的APT20TTMG处理G3，持续3周。
每周两次使用数字卡尺测量体重和肿瘤大小。结束时，通过眼眶后途径采集血液。分离血清/血浆并储存在深冻冰箱(-20℃)中。采血后，根据CPCSEA发布的最新指南，通过CO2窒息法人道处死动物。解剖出所有重要器官(脑、肾、肝、肺、心脏)和肿瘤。将重要器官固定于10％NBF中并储存。解剖出肿瘤组织，称重，并将一部分肿瘤组织固定于10％NBF中，将另一部分快速冷冻并储存在深冻冰箱(-80℃)中。
将固定的组织进行常规石蜡包埋处理，随后切片(3-6微米)。将切片用苏木精和伊红染色。研究病理学家在显微镜下检查制备好的载玻片，以记录肿瘤样品的组织病理学发现，这些组织病理学发现与以下有关：包膜形成、细胞类型、结缔组织基质、细胞凋亡、坏死、脂质含量、核质比率(N:C)、细胞核有丝分裂象、肿瘤分级和分化水平。每项组织病理学发现和肿瘤体积均分配范围1至4的评分(表7)。使用每个样品的这些评分的总和来推断肿瘤的侵袭性。
表7.肿瘤样品的组织病理学评分
缩写：N:C，核质比率。
还对肿瘤样品中的Ki67进行了免疫组织化学分析。切片中Ki67的定量通过肉眼评估(Ki67+ve)，采用以下两种方法进行：Ki-67阳性肿瘤细胞计数和Ki67总面积。此过程使用ImageJ公共软件完成。在Ki67总面积评估情况下，使用ImageJ阈值函数，并将每幅图像拆分成其组分红、蓝和绿的灰度图像。另外，选择其中一幅图像并进行阈值处理。对值进行选择以便突出显示相关区域(在本例中为Ki67+ve细胞)，并测量所选阈限值所占面积的百分比。
为了通过ELISA评估cAMP、AKT、GFAP和TAU等生物标志物，根据试剂盒说明，将从动物体内解剖出的U-87MG肿瘤组织匀浆化。将匀浆离心，收集上清液并分别使用人AKT蛋白ELISA试剂盒(MyByoSouce)、环AMP完全酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(MyByoSouce)、人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)ELISA试剂盒(Cusabio)和人TAU蛋白(TAU)ELISA试剂盒(MyByoSouce)进行免疫测定，以定量测定cAMP、AKT、GFAP和TAU蛋白。
各参数的数据均以表格和图形两种形式汇总。所有参数的结果均以所有组的平均值±SEM表示或以中位数表示。组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或双因素方差分析，随后是适当的事后检验来进行；例外是组织病理学发现和肿瘤体积的评分评估采用Kruskal-wallis检验，随后是适当的事后检验来进行。统计学分析采用PRISM软件5.01版进行。‘p’值<0.05被认为具有统计学意义。
在无胸腺裸小鼠中使用人GBM癌(U-87MG)异种移植模型评估APT20TTMG的体内抗肿瘤潜力(图34)对于以下至关重要：确认APT20TTMG的抗肿瘤作用是否也存在于动物模型中，以及验证APT20TTMG通过静脉内施用而穿透和渗透GBM异种移植动物模型中的肿瘤的能力。与媒介物组相比，APT20TTMG(剂量为20mg/kg，i.v.，每三天一次，持续3周)和TMZ(剂量为5mg/kg，p.o.，每日一次，持续3周)均能从第16天起抑制肿瘤生长，这种减少的概况维持至测定结束。值得注意的是，与阴性对照相比，APT20TTMG在第20天使肿瘤缩小了46.7±10.7％(p＝0.0002)，在第22天使肿瘤缩小了42±13.2％(p<0.0001)，而TMZ在相同的天数仅使肿瘤缩小了41.3±11.1％(p＝0.0013)和31.1±13.4％(p＝0.0039)。尽管APT20TTMG组和TMZ组之间在肿瘤体积(图34A)和最终肿瘤重量(图34C)方面没有统计学差异，但这些结果可能表明，在更长的治疗时间下，APT20TTMG可以实现比金标准GBM治疗更好的治疗概况。还需要强调的是，用APT20TTMG治疗使动物在整个实验过程中体重增加，这表明ASMO对动物是安全的。对肿瘤样品中的Ki67(细胞增殖的标志物)进行免疫组织化学分析(Ki-67阳性肿瘤细胞计数和Ki67总面积-图35)未检测到处理组和非处理对照之间该标志物的任何统计学差异。在另一方面，病理学家观察到的组织病理学发现表明，与G1(媒介物对照组)相比，G3(APT20TTMG；20mg/kg，i.v.)组和G2(TMZ；5mg/kg，p.o.)组显示间变性特征(较低分级)和细胞异形性较少，有丝分裂象数量较少(表8)。对这些组织病理学发现和肿瘤体积的总评分进行分析表明，G3组(APT20TTMG；20mg/kg，i.v.)的评分在统计学上低于G1组(媒介物对照)，这表明APT20TTMG处理导致更少的侵袭性肿瘤特征(图36)。
如图34A-C所示，将来自U-87MG细胞系的肿瘤碎片植入动物体内，并且一旦肿瘤大小达到约100mm3，就将动物随机分为3个实验组(G1、G2和G3)。G1：媒介物，(G2)参考物替莫唑胺，和(G3)APT20TTMG，持续共22天。(A)每周两次测量动物的肿瘤体积。(B)在整个实验过程中对动物进行称重，并将与处理前重量相比的重量增加的变化绘制成图。(C)动物安乐死后，取出肿瘤并称重。
如图35A-B所示，图呈现来自8只动物的肿瘤的蛋白质定量的个体值。(A)Ki-67面积，(B)Ki-67阳性肿瘤细胞计数。
如图36所示，该图呈现从每组6至8只动物的组织病理学发现和肿瘤体积给出的评分获得的总分值。
为了进一步了解APT20TTMG在GBM异种移植小鼠模型中激活的信号传导通路，我们通过ELISA测定分析了从动物体内解剖出然后均质化的U-87MG肿瘤组织中的一些重要生物标志物(cAMP、AKT、GFAP和TAU的评估)(图37)。由于cAMP蛋白可能与更高的功能障碍剪接活性和更高的ATP产生有关，因此针对APT20TTMG进行了cAMP的评估(图37A)，尽管与阴性对照相比其总表达量较低，未观察到统计学差异。对AKT的评估(图37B)很有意义，因为AKT蛋白与上游PI3K信号传导通路相关，负责调节细胞存活、增殖、分化和迁移。与TMZ类似，与阴性对照相比，APT20TTMG降低AKT蛋白的表达，这表明癌细胞生长和存活机制可能受到破坏。除了AKT表达外，在胶质来源的脑肿瘤(如星形细胞瘤和GBM)中也常见到较高的GFAP表达，GFAP是星形胶质细胞谱系和反应性星形胶质增生的最重要标志物之一，并且具有促肿瘤作用。值得注意的是，对GFAP的评估(图37C)显示，与未处理的对照相比，用APT20TTMG处理后这种生物标志物减少，这表明也通过星形胶质细胞反应性的可能降低而具有抗肿瘤潜力。最后，与其他细胞系中观察到的情况类似，对TAU的评估(图37D)显示，在APT20TTMG处理后TAU表达显著降低，根据最近的研究，这可能表明在GBM的背景下，它是癌症迁移和进展的一个关键干扰因素。
如图37A-D所示，这些图呈现来自6只动物的肿瘤的蛋白质定量的个体值。(A)cAMP、(B)AKT、(C)GFAP和(D)TAU。
表8.观察到的肿瘤样品的组织病理学发现
缩写：NSA，未指定评分；N:C，核质比率。
这项体内研究表明，与媒介物组和金标准治疗药物TMZ相比，APT20TTMG显著抑制无胸腺裸小鼠的人胶质母细胞瘤(GBM)癌异种移植模型中的肿瘤生长(肿瘤体积)。值得注意的是，在第20天和第22天，APT20TTMG显示比TMZ更明显的肿瘤大小缩小。尽管APT20TTMG在缩小肿瘤大小方面具有明显优越功效，但APT20TTMG组和TMZ组与媒介物组之间在最终肿瘤重量方面并无统计学差异。在另一方面，对组织病理学发现和肿瘤体积评分的评估表明，APT20TTMG处理产生了侵袭性较少的肿瘤。此外，参与GBM中的重要信号传导通路的蛋白质(AKT、GFAP和TAU)显示在APT20TTMG处理后表达降低，这表明APT20TTMG可能减少了反应性星形胶质增生，并破坏了癌细胞的生长、迁移、进展和存活机制。所有这些结果相互印证，并使得更好地理解与APT20TTMG处理的体内模型中观察到的肿瘤体积缩小相关的途径。此外，APT20TTMG处理在肿瘤生长抑制方面表现出优于TMZ的潜在优势，并且与动物重量增加相关，这表明其安全性良好。这些发现表明APT20TTMG可以用作GBM的有效治疗选择。
尽管出于清楚和理解的目的已经对前述公开内容进行了一些详细的描述，但对于本领域技术人员通过阅读本公开内容将清楚的是，在不背离本公开内容的真实范围的情况下，可以做出形式和细节上的多种改变。例如，上述所有技术和装置可以以多种组合来使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件均通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件单独地且分别地通过引用并入用于所有目的。

Claims (132)

1.一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含工程化多核苷酸的药物组合物，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
2.一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括：向所述对象施用包含(a)紫杉烷类药物和(b)工程化多核苷酸的药物组合物，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中与施用所述紫杉烷类药物但未施用工程化多核苷酸的对象相比，所述方法改善所述对象的预后。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法降低所述对象中的tau的总水平，从而减少与所述紫杉烷类药物结合的tau的量。
5.一种改善患有癌症并已施用紫杉烷类药物的对象的预后的方法，其中所述方法包括：向所述对象施用包含工程化多核苷酸的药物组合物，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法降低对象中的tau的总水平，从而减少对象中与紫杉烷类药物结合的tau的量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidney cancer)、肺癌和肝癌。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞癌、肺癌、乳腺腺癌、人前列腺腺癌、肾细胞癌和肾腺癌。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法降低肿瘤体积比率。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法减缓肿瘤进展。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法改变tau的表达。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法降低TAU的表达。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述对象中的TAU的总量。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法降低AKT的表达。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法降低胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸通过肿瘤内施用。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸通过静脉内施用。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸通过鞘内施用。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸通过皮下注射、肌内注射、皮内注射、透皮注射经皮施用、鼻内施用、淋巴管内注射、鞘内施用、肺部施用、直肠施用胃内施用或任何其他合适的肠胃外施用进行施用。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述对象的一种或多种转录物的过早聚腺苷酸化。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述对象的一种或多种转录物的隐蔽剪接。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法提高与组织病理学发现相关的评分。
24.根据权利要求23中任一项所述的方法，其中所述组织病理学发现包括肿瘤分级、脂质含量、坏死或核质比率(N:C)。
25.一种降低细胞活力的方法，所述方法包括：向细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
26.一种降低细胞增殖率的方法，所述方法包括：向细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中可能为保守剪接位点序列的靶标处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
27.根据权利要求25至26中任一项所述的方法，其中所述方法增加细胞坏死或细胞凋亡。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述细胞处于G2/M期的倾向。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肿瘤细胞包括胶质瘤、神经母细胞瘤或癌。
31.一种改变多个细胞的细胞周期阶段分布的方法，所述方法包括：向所述多个细胞施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：
(i)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中方法增加处于G2/M期的细胞的数量。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法增加处于坏死期或凋亡期的细胞的数量。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括肿瘤细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤细胞包括胶质瘤、神经母细胞瘤或癌。
36.一种降低神经元的tau表达的方法，所述方法包括：向所述神经元施用工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包含：
(ii)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的靶序列处特异性地结合所述mRNA前体；和
(ii)募集部分，所述募集部分被配置为募集剪接体部分，
其中，当与所述mRNA前体和所述工程化多核苷酸结合时，所述剪接体部分在所述靶序列中或附近处改变所述mRNA前体。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述神经元来自患有癌症的个体。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述方法减少所述神经元的一种或多种转录物的隐蔽剪接。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述方法调节U1 snRNP复合物的形成。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中以至少0.25μM的浓度施用所述工程化多核苷酸。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中以至少0.5μM的浓度施用所述工程化多核苷酸。
42.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中以约0.25μM至约1μM的浓度施用所述工程化多核苷酸。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述一个或多个靶向部分中的靶向部分与靶基因的所述靶序列中的共有序列足够相同或互补。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中靶向部分与所述靶序列互补和/或杂交。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中靶向部分与所述靶序列的所述共有序列互补和/或杂交。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含剪接位点。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述剪接位点是保守剪接位点。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述剪接位点包含5'-GU-3'。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述mRNA前体由所述靶基因编码。
50.根据权利要求49中任一项所述的方法，其中所述方法改变所述靶基因的表达或活性。
51.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述一个或多个靶向部分包括(1)第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第一靶标序列，和(2)第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为特异性地结合所述mRNA前体的所述靶序列中的第二靶标序列。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一靶标序列包含所述靶序列中的共有序列。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述第二靶标序列包括所述靶序列中的共有序列。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶标序列在所述靶序列中相隔不超过五个核苷酸(例如，一个或两个核苷酸)的间隔序列。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含所述mRNA前体中的外显子-内含子边界。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第一和第二靶标序列均位于所述外显子-内含子边界的5’或3’。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述第一和第二靶标序列中的一个位于所述外显子-内含子边界的5’；并且其中所述第一和第二靶标序列中的另一个位于所述外显子-内含子边界的3’。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含所述mRNA前体中的剪接位点。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第一或第二靶标序列包含所述mRNA前体中的剪接位点(例如，5’ss)。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶向部分中的一个位于所述募集部分的5’，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个位于所述募集部分的3’。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与表1中所示的序列相同或互补的序列。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分包含与选自表1的外显子序列栏的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的内含子序列栏中所示的序列相同或互补的序列。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分包含与表1的内含子序列栏中所示的序列相同或互补的序列；并且其中所述第二靶向部分包含与表1的外显子序列栏中所示的序列相同或互补的序列。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与内含子供体位点的共有序列(例如，选自GU、GT、GC和CA)相同或互补的序列。
65.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与外显子供体位点的共有序列(例如，CAG或AGG)相同或互补的序列。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一靶向部分或所述第二靶向部分包含与选自GU、GT、GC、G和CA的共有序列相同或互补的序列。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的方法，其中所述第一靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述第二靶向部分包含与剪接体snRNA(例如，U1 snRNA)的核糖体结合位点至少80％、90％或相同的序列。
69.根据权利要求67或68中任一项所述的方法，其中与所述核糖体结合位点至少80％、90％或相同的所述序列可以是约2个核苷酸至约10个核苷酸。
70.根据权利要求1至69中任一项所述的方法，其中所述剪接体部分选自剪接体核糖核蛋白复合物、剪接体小核核糖核酸(snRNA)、剪接体蛋白、其功能变体或其功能片段。
71.根据权利要求67所述的方法，其中所述剪接体部分包含U1snRNA和剪接体蛋白。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述剪接体snRNA选自U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U14atac、U6atac及其组合。
73.根据权利要求67至72中任一项所述的方法，其中所述剪接体蛋白选自Sm、U1-70k、U1A、U1C及其组合。
74.根据权利要求1至73中任一项所述的方法，其中所述募集部分包含与SEQ ID NO:1或2中任一个至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述募集部分包含与SEQ ID NO:1或2中任一个相同或互补的核苷酸序列。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含二级结构特征。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含顶环、上茎、内环、下茎或其组合。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含与茎(例如，下茎或上茎)相邻的环(例如，内环)，所述茎包含两个互补的茎序列。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述茎(例如，所述下茎或所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
80.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述环是与包含两个互补茎序列的所述茎(例如，所述下茎)和另一茎(例如，上茎)相邻的内环。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述内环包含不超过10、9或8个核苷酸的核酸序列。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述另一茎(例如，所述上茎)的茎序列包含不超过约五个、四个或三个核苷酸。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸还包含顶环。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述顶环包含不超过10、9、8、7、6或5个核苷酸的核酸序列。
85.根据权利要求1至84中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸不包含任何分子内二硫键。
86.根据权利要求1至85中任一项所述的方法，其中当与所述工程化多核苷酸和所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1 snRNA的RNA结合结构域(RBD)碱基配对。
87.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中当与所述工程化多核苷酸和所述剪接体部分结合时，所述mRNA前体基本上不表现出与U1-C蛋白的碱基特异性相互作用。
88.根据权利要求1至87中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的5’-靶向部分被配置为与U1-C蛋白的锌指特异性地相互作用。
90.根据权利要求88或89所述的方法，其中所述工程化多核苷酸(例如，其所述5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指共价地相互作用(例如，经由二硫键)。
91.根据权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸(例如，其所述5’-靶向部分)被配置为与U1-C蛋白的锌指非共价地相互作用(例如，经由氢键)。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的方法，其中aid募集部分包含含有与U1-C锌指结合的硫代磷酸酯核苷酸间键联的核苷酸序列。
93.根据权利要求1至92中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含与U1snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的茎环结构的一侧包含与U1 snRNA的茎环II(SL2)的部分序列互补的核苷酸序列。
95.根据权利要求93或94所述的方法，其中所述部分序列包含与U1 snRNA的SL2的5’-GGCCU-3’对应的序列。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的方法，其中所述部分序列不包含与U1 snRNA的SL2的5’-CACGUUA-3’对应的序列。
97.根据权利要求1至96中任一项所述的方法，其中所述募集部分与snRNA例如U1snRNA的茎环-II区互补。
98.根据权利要求1至97中任一项所述的方法，其中所述募集部分与snRNA例如U1snRNA的茎环-II区杂交。
99.根据权利要求1至98中任一项所述的方法，其中所述募集部分包含AGGCC。
100.根据权利要求1至99中任一项所述的方法，其中所述募集部分包含与表2-3中所示序列的至少五个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列。
101.根据权利要求1至100中任一项所述的方法，其中所述募集部分包含与表2-3中所示序列的约5至约10个连续核苷酸至少80％、90％或相同的核苷酸序列。
102.根据权利要求1至101中任一项所述的方法，其中所述募集核苷酸序列包含：(i)与U1 snRNA的所述茎环II(SL2)的至少4个核苷酸互补的核苷酸序列。
103.根据权利要求1至102中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的SL2的锚定序列碱基配对。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的内环基本上不表现出与U1 snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。
105.根据权利要求103或104所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的下茎基本上不表现出与U1 snRNA的所述SL2的所述锚定序列碱基配对。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述锚定序列包含与5’-CACGUUA-3’对应的序列。
107.根据权利要求1至106中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸基本上不表现出与U1 snRNA的H螺旋碱基配对。
108.根据权利要求1至107中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含至少一种化学修饰。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是化学修饰的核苷酸。
110.根据权利要求108或109所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个2’-修饰的核苷酸。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸是2’-修饰的核苷酸。
112.根据权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述2’-修饰的核苷酸包括2’-甲氧基、2’-甲氧基甲基、2’-甲氧基乙基、2’氟或2’-氨基乙基核苷酸。
113.根据权利要求108至112中任一项所述的方法，所述工程化多核苷酸包括通过核苷酸间键联连接的核苷酸，并且所述核苷酸间键联中的至少一个不包含磷酸酯。
114.根据权利要求108至113所述的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸包括通过核苷酸间键联连接的核苷酸，并且所述核苷酸间键联中的至少一个包含硫(S)；硒(Se)；BR3，其中每个R独立地选自氢、烷基和芳基；碳或NR2，其中每个R独立地选自氢、烷基和芳基。
115.根据权利要求108至114中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。
116.根据权利要求108至112中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联被化学修饰。
117.根据权利要求108至116中任一项所述的方法，其中至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸间键联是硫代磷酸酯。
118.根据权利要求108至117中任一项所述的方法，其中所述核苷酸间键联包含甲基膦酸酯、羟基氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基或亚甲基氧基甲基亚氨基。
119.根据权利要求1至118中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、或约10至约25个核苷酸。
120.根据权利要求1至119中任一项所述的方法，其中所述募集部分包含约10至约30个核苷酸、或约10至约20个核苷酸。
121.根据权利要求1至120中任一项所述的方法，其中所述一个或多个靶向部分各自独立地包含约2至约15个核苷酸、约2个核苷酸至约10个核苷酸、或约2个核苷酸至约8个核苷酸。
122.根据权利要求1至121中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶向部分中的一个包含约2个核苷酸，并且所述第一和第二靶向部分中的另一个包含约5或6个核苷酸。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的方法，其中当与所述工程化多核苷酸和所述mRNA前体结合时，所述剪接体部分切割或剪接所述靶序列中的所述mRNA前体。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的方法，其中所述剪接体部分进一步促进对切割的mRNA前体的修饰。
125.根据权利要求1至124中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含与SEQId NO:1-4中任一个至少70％、80％、85％或90％相同或互补的核苷酸序列。
126.根据权利要求1至125中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含与SEQId NO:3或4中任一个相同或互补的核苷酸序列。
127.根据权利要求1至126中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸包含：
(i)第一靶向部分，所述第一靶向部分被配置为在信使核糖核酸前体(mRNA前体)中的第一靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体，其中所述第一靶向部分包含与5’-GTCCA-3’相同或互补的序列，
(ii)募集部分，所述募集部分包含与SEQ ID NO:1至少90％相似或互补的序列，并且被配置为募集包含U1 snRNA和U1-C蛋白的剪接体部分，其中所述募集部分包含顶环、与所述顶环相邻的上茎、下茎以及位于所述上茎和所述下茎之间的内环，和
(iii)第二靶向部分，所述第二靶向部分被配置为在所述mRNA前体中的第二靶标序列处特异性地结合所述mRNA前体，其中所述第二靶向部分包含与5’-CG-3’相同或互补的序列。
128.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的工程化多核苷酸。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的所有核苷酸间键均包含硫代磷酸酯键联。
130.根据权利要求128至129中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸的位置1-5和20-24处的核苷酸包含2’-O-甲基部分。
131.根据权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用紫杉烷类药物。
132.一种治疗患有癌症的对象的方法，其中所述对象已施用紫杉烷类药物，所述方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(i)具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的工程化多核苷酸，其中所述工程化多核苷酸的核苷酸间键包含硫代磷酸酯键联，并且其中所述工程化多核苷酸的位置1-5和20-24处的核苷酸包含2’-O-甲基部分，从而降低所述对象中的TAU蛋白水平和TAU与所述紫杉烷类药物的结合。
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