RS62086B1

RS62086B1 - Poboljšani postupci za prečišćavanje vektora rekombinantnog aav

Info

Publication number: RS62086B1
Application number: RS20210884A
Authority: RS
Inventors: Paulene Mclean Quigley Sheldon; Peter S Gagnon; Gina Nichols; Barbara A Thorne
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2021-08-31
Also published as: WO2010148143A1; SMT201800554T1; RU2012101475A; RU2016119739A; CA2764176A1; SG10201403290SA; PL3067417T3; JP2019083822A; BRPI1015176B1; SI3444335T1; US20190010468A1; PT3067417T; CY1121442T1; EP3067417A3; HRP20181743T1; IL216960A; MX352986B; PT2443233T; HRP20211120T1; LT3067417T

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetno obelodanjivanje odnosi se uopšteno na oblast prečišćavanja vektora rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) koje se može upotrebiti kod prenošenja gena i naročito kod genske terapije ili vakcinacije. Preciznije, odnosi se na postupke za prečišćavanje vektora rekombinantnog rAAV koji su suštinski slobodni od komponenata proizvodnje iz procesa kao što su ćelijske nukleinske kiseline, ćelijski proteini, pomoćni virus i komponente sredine.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Adeno asocirani virusi (AAV) imaju jedinstvena svojstva koja ih čine privlačnim kao vektori za gensku terapiju i genetičke vakcine. AAV inficiranje ćelija u kulturi nije citopatsko i prirodno inficiranje ljudi i drugih životinja je tiho, bez simptoma i nije ukazano u etiologiji bilo koje ljudske bolesti. Pored toga, AAV inficira široki opseg tipova ćelija uključujući mnoge ćelije sisara, omogućujući mogućnost ciljanja mnogo različitih tkiva in vivo. AAV polako inficira deobom ili bez deobe ćelija i može trajati suštinski za vreme života onih ćelije kao transkripcijski aktivni nuklearni epizom (ekstrahromozomalni element). Ugrađene kopije rAAV vektora u organima kao što su jetra ili mišići veoma su retke. Efikasno dugoročno prenošenje gena zabeleženo je kod više tipova ćelija uključujući one kod oka, CNS i mišića. Videti npr., X. Xiao i dr., J. Virol.70(11):8098-8108 (1996); R.R. Ali i dr., Hum. Mol. Genet.

5(5):591-94 (1996). Trenutna klinička ispitivanja uveliko su fokusirana na upotrebu serotip 2 rAAV vektora ali više izveštaja demonstriralo je da drugi AAV serotipovi, uključujući rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 i rAAV-8, imaju jedinstvenu in vivo biološku distribuciju koja ih čini privlačnim virusnim serotipovima za ispitivanje u kliničkim ogledima.

[0003] Adeno asocirani virus (AAV) je parvovirus deficijentan replikacijom, čiji je jednolančani DNK genom oko 4.7 kb u dužini uključujući 145 nukleotidnih inverznih terminalnih ponavljanja (ITR). Nukleotidna sekvenca AAV serotip 2 (AAV2) genoma predstavljena je u Srivastava i dr., J. Virol., 45: 555-564 (1983) kao što je ispravljeno od strane Ruffing i dr., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994). Cis-imitirajuće sekvence koje usmeravaju virusnu DNK replikaciju (rep), enkapsulaciju/pakovanje i integraciju hromozoma ćelija sadržane su u ITR. Tri AAV promotera, p5, p19 i p40 (nazvani po svojim relativnim mapiranim lokacijama), vode izražavanje dva AAV unutrašnja otvorena okvira za čitanje koji kodiraju rep i cap gene. Dva rep promotera (p5 i p19), spojena sa diferencijalnim spojevima jednog AAV introna pri nukleotidima 2107 i 2227, ispoljavaju se u proizvodnji četiri rep proteina (rep78, rep68, rep52 rep40) iz rep gena. Rep proteini poseduju više enzimskih svojstava koja su na kraju odgovorna za repliciranje virusnog genoma. Cap gen je izražen iz p40 promotera i kodira tri kapsidna proteina VP1, VP2 i VP3. Alternativni spoj i početna mesta za translaciju koja nisu konsenzusna odgovorni su za proizvodnji tri povezana kapsidna proteina. Pojedinačno mesto poliadenilacije sa konsenzusom nalazi se na mapiranom položaju 95 AAV genoma. Životni ciklus i genetika AAV razmatrana je u Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0004] AAV čestice sadrže proteinski kapsid koji ima tri kapsidna proteina, VP1, VP2 i VP3, koji zatvaraju ∼4.6 kb linearni jednolančani DNK genom. Pojedinačne čestice pakuju samo jedan lanac DNK molekula ali ovo može biti ili plus ili minus lanac. Čestice koje sadrže bilo koji lanac su infektivne i replikacija se odigrava konverzijom roditeljskog infektivnog pojedinačnog lanca u dvostruki oblik i posledično pojačavanje, iz kojeg su dobijeni pojedinačni lanci postavljeni i upakovani u kapside. Dvostruke ili jednolančane kopije AAV genoma (ponekada se nazivaju kao „provirusna DNK“ ili „provirus“) mogu biti uneti u bakterijske plazmide ili fagemide i preneti u ćelije inficirane sa adenovirusom. Videti Carter, HANDBOOK OF PARVOVIRUSES, Vol. I, pp.169-228 (1989), i Berns, VIROLOGY, pp.

1743-1764, Raven Press, (1990) za opšte razmatranje AAV.

[0005] Proizvodnja rAAV vektora obično zahteva četiri uobičajena elementa: 1) popustljivu ćeliju domaćina za replikaciju; 2) pomoćnu virusnu funkciju koja može biti obezbeđena sa pogodnim pomoćnim virusima kao što je adenovirus ili herpes virus ili alternativno plazmidnim konstruktima koji sadrže minimalne adenovirusne pomoćne funkcije; 3) rep-cap konstrukt za trans-pakovanje; i 4) pogodno okruženje za proizvodnju.

[0006] Rekombinantne AAV čestice mogu biti proizvedene iz pakovanja ćelijskih lizata. Videti npr., Chirico and Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41. Međutim, ćelijski lizati sadrže različite ćelijske komponente kao što su DNK ćelije domaćina, proteini ćelije domaćine, komponente okruženja i ili pomoćni virus ili DNK plazmida pomoćnog virusa što mora biti odvojeno od rAAV vektora pre nego što postane pogodan za in vivo upotrebu. Nedavna napredovanja u proizvodnji rAAV obuhvataju upotrebu procesa ćelijske suspenzije bez prianjanja u rezervoarima bioloških reaktora sa mešanjem i uslovima proizvodnje gde se rAAV vektori oslobađaju u okruženje ili supernatant snižavajući koncentraciju ćelijskih komponenata domaćina prisutnog u proizvedenom materijali ali i dalje održavajući značajne količine nečistoća u procesu. Videti patent SAD br.6,566,118 i PCT WO 99/11764. Stoga, čestice rAAV mogu biti sakupljene iz okruženja i/ili ćelijskog lizata i dalje prečišćene.

[0007] Postupci koji obuhvataju centrifugiranje gradijenta gustine koji se koriste za prečišćavanje rAAV vektora a naročito rAAV-2 nisu pogodni za pojačavanje. Nedavni izveštaji za rAAV-2 vektore opisali su postupke za prečišćavanje koji obuhvataju hromatografiju sa razmenom jona uključujući suprotnu hromatografiju sa razmenom jona (uključujući katjonsku i anjonsku hromatografiju). Videti na primer patent SAD br.

6,566,118 i PCT WO 99/11764 koji obelodanjuju postupke za upotrebu kombinovanja suprotne hromatografije sa razmenom jona za prečišćavanje vektora rekombinantnog adeno asociranog virusa iz kulture supernatanta i/ili ćelijskog lizata. Dodatna poboljšanja u pripremanju zaliha rAAV obuhvataju upotrebu tretiranje sa dezoksiholatom ćelijskog lizata, odvajanje gradijenta jodiksanola pre afinitetne hromatografije, što se ispoljilo u visokom titru rAAV2 (Clark i dr., Hum. Mol. Genet.10(6):1031-39 (1999); Zolotukhin i dr., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)). O'Riordan i dr. (O'Riordan i dr., J. Gene Med.2:444-454 (2000); patent SAD br.7,015,026) takođe je zabeležio prilagodljiv proces prečišćavanja sa hromatografijom za vektore rekombinantnog adeno asociranog virusa i kao što je naročito dato kao primer, rAAV-2 vektore, upotrebo hromatografijom sa razmenom jona, hidroksiapatit hromatografijom, afinitetnom celufin sulfat hromatografijom i cink helat hromatografijom.

[0008] Nedavni podaci ukazuju da se rAAV kapsidni serotipovi kao što su rAAV-1, 4, 5 i 8 slabo vezuju za anjonske smole ili kao prečišćeni virusni soj ili u prisustvu proizvedenih nečistoća za vreme procesa, kao što su DNK ćelije domaćina, proteini ćelije domaćina, serum albumin, komponente okruženja, i komponente pomoćnog virusa. Kao posledica, prečišćavanje ovih kapsidnih serotipova obično obuhvata hromatografiju sa razmenom jona u kombinaciji sa drugim postupcima za prečišćavanje, kao što su jodiksinol centrifugiranje sa gradijentom gustine. Videti npr., Zolotukhin i dr., Methods 28(2):158-167 (2002) i Kaludov i dr., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002); i objava patenta SAD br.2004/0110266 A1. Međutim, ovi postupci nisu lako prilagodljivi za procese na komercijalnom nivou.

[0009] U skladu sa time, pri razvijanju vektora rekombinantnog AAV kao što su oni za upotrebu u genskoj terapiji ili genskim vakcinama, ne postoji potreba za postupcima za prečišćavanje rAAV vektora iz komponenata proizvodnje za vreme trajanja procesa uključujući pomoćne viruse, kao i proteine pomoćnog virusa, ćelijske proteine, DNK ćelije domaćina i komponente okruženja prisutne u proizvedenom soju rAAV. Takvi postupci bi trebalo da budu efikasno upotrebljeni u meri koja je pogodna za praktičnu primenu tehnika genske terapije. Pored toga postoji potreba za razvijanjem procesa prečišćavanja za rAAV vektore koji su prilagodljivi da daju komercijalne sojeve sa višim titrom, prečišćenije i od koristi za rAAV gensku terapiju i genske vakcine. Preciznije, postoji potreba za razvijanjem procesa za prečišćavanje za rAAV vektore koji se slabo vezuju za hromatografske smole a naročito za anjonske smole.

[0010] Iako je ovde dato obelodanjivanje opisano detaljno putem ilustracija i primera radi pojašnjenja shvatanja, biće lako shvatljivo stručnima u ovoj oblasti u svetu učenja ovog obelodanjivanja da se određene izmene i modifikacije mogu izvršiti na njemu.

REZIME PRONALASKA

[0011] Obelodanjivanje pruža postupke za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) bilo kog serotipa kapsida iz nečistoća za vreme procesa zaustavljanjem čestica rAAV u okruženju hromatografije sa apatitom u prisustvu polietilen glikola (PEG). Postupci prema obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, zahtevaju uzvodnu obradu (kao što su, na primer, centrifugiranje, tretiranje sa Benzonase®, filtracija sa razmenom anjona i/ili filtracija tangencijalnog protoka) kao i nizvodnu obradu (kao što su, deaktivacija sa toplotom, filtracija, hromatografija sa hidrofobnom interakcijom, hromatografija sa isključivanjem po veličini i/ili hromatografija sa razmenom anjona).

Uzvodni i nizvodni postupci mogu biti korišćeni samostalno ili u različitim kombinacijama.

[0012] Obelodanjivanje pruža postupke za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) iz nečistoća iz procesa u dovodni tok koji se sastoji od koraka: (a) dovođenje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV u kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom u prisustvu polietilen glikola (PEG), gde se čestice rAAV vezuju za okruženje hromatografije sa apatitom; i (b) eluiranje čestica rAAV vezanih za okruženje hromatografije sa apatitom sa puferom za eluiranje koji sadrži manje od 3% (w/v) PEG. Na bazi otkrića koje je ovde sadržano, pronalazak pruža postupke za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) iz nečistoća iz procesa u dovodni tok, koji se sastoji od koraka: (a) (i) dovođenje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV u kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom u prisustvu polietilen glikola (PEG), gde se čestice rAAV vezuju za okruženje hromatografije sa apatitom; i (ii) eluiranje čestica rAAV vezanih za okruženje hromatografije sa apatitom sa puferom za eluiranje koji sadrži manje od 3% (w/v) PEG; i (b) vezivanja čestice rAAV u dovodnom toku eluirane iz okruženja hromatografije sa apatitom sa hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC). Dodatni aspekti i otelotvorenja pronalaska su dati u priloženim zahtevima. U određenim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom je keramički hidroksiapatit (CHT) ili keramički fluoroapatit (CFT). U određenim otelotvorenjima, čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom su eluirane sa puferom za eluiranje koji sadrži manje od 3% (w/v) PEG. U određenim otelotvorenjima, čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom su eluirane sa puferom za eluiranje u odsustvu PEG.

[0013] U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje okruženja hromatografije sa apatitom je između 10<6>i 10<16>čestica otpornih na DNazu (DRP) po mililitru. U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje okruženja hromatografije sa apatitom je između 10<8>i 10<16>čestica otpornih na DNazu (DRP) po mililitru. U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje okruženja hromatografije sa apatitom je između 10<10>i 10<16>čestica otpornih na DNazu (DRP) po mililitru. U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje okruženja hromatografije sa apatitom je između 10<12>i 10<16>čestica otpornih na DNazu (DRP) po mililitru. U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje okruženja hromatografije sa apatitom je između 10<14>i 10<16>čestica otpornih na DNazu (DRP) po mililitru.

[0014] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje sadrži korak filtracije sa razmenom anjona pre koraka hromatografije sa apatitom gde su čestice rAAV u protoku u filtraciji sa razmenom jona. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje sadrži koncentrovanje čestica rAAV iz protoka filtracije sa razmenom anjona sa filtracijom tangencijalnog protoka pre koraka hromatografije sa apatitom. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje sadrži korak vezivanja čestica rAAV u dovodnom toku eluirane iz okruženja hromatografije sa apatitom za okruženje anjonske hromatografije. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje sadrži korak deaktivacije sa toplotom za deaktiviranje pomoćnog virusa. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje sadrži korak vezivanja čestica rAAV u dovodnom toku za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom nakon hromatografije sa apatitom

[0015] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko polietilen glikola (PEG) i baznog pufera. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer je između pH 7.2 i 10, između pH 7.4 i10, između pH 7.6 i 10, između pH 7.8 i 10, između pH 8.0 i 10.0, između pH 8.2 i 10.0, između pH 8.4 i 10.0, između pH 8.6 i 10.0, između pH 8.8 i 10, između pH 9.0 i 10.0, između pH 9.2 i 10, između pH 9.4 i 10.0, između pH 9.6 i 10.0, ili između pH 9.8 i 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer ima pH vrednosti bilo koju od 7.2, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, i 10.0. Bilo koji bazni pufer poznat u struci može se koristiti. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži borate. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer je borat.

[0016] U nekim slučajevima predmetnog obelodanjivanja, uključujući predmetni pronalazak, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko polietilen glikola (PEG). Na primer, između oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG može se koristiti. U nekim otelotvorenjima, dovodni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom u prisustvu od oko 3% (w/v), oko 3.5% (w/v), oko 4% (w/v), oko 4.5% (w/v), oko 5% (w/v), oko 5.5% (w/v), oko 6% (w/v), oko 6.5% (w/v), oko 7% (w/v), oko 7.5% (w/v), oko 8% (w/v), oko 8.5% (w/v), oko 9% (w/v), oko 9.5% (w/v), ili oko 10% (w/v) PEG.

[0017] U nekim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu između oko 5,000 (PEG5000) grama po molu i oko 15,000 (PEG15000) grama po molu, kao što je, oko 5,000 grama po molu (PEG5000), oko 6,000 (PEG6000) grama po molu, oko 7,000 (PEG7000) grama po molu, oko 8,000 (PEG8000) grama po molu, oko 9,000 (PEG9000) grama po molu, oko 10,000 (PEG10000) grama po molu, oko 11,000 (PEG11000) grama po molu, oko 12,000 (PEG12000) grama po molu, oko 13,000 (PEG13000) grama po molu, oko 14,000 (PEG14000) grama po molu, i oko 15,000 (PEG15000) grama po molu. U određenim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu od oko 5,000 (PEG5000) grama po molu. U određenim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu od oko 6,000 (PEG6000) grama po molu. U određenim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu od oko 8,000 (PEG8000) grama po molu. U određenim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu od oko 10,000 (PEG10000) grama po molu. U određenim otelotvorenjima, PEG ima srednju molekulsku masu od oko 15,000 (PEG15000) grama po molu.

[0018] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 4% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 5% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 6% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 7% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 8% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 8% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 9% (w/v) PEG6000.

[0019] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 4% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 5% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 6% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 7% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 8% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 9% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 10% (w/v) PEG8000.

[0020] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 4% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 5% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 6% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 7% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 8% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 9% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 10% (w/v) PEG 10000.

[0021] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) PEG15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 4% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 5% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 6% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 7% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 8% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 9% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 10% (w/v) PEG 15000.

[0022] U nekim otelotvorenjima, ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi se u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u puferu koji sadrži oko 20 mM borata pH 9.0 i oko 5% (w/v) PEG (kao što je PEG6000). u nekim otelotvorenjima, dovodni tok je u liniji pomešan sa jednakom zapreminom pufera koji sadrži oko 40 mM borata pri pH 9.0 i oko 10% PEG kako bi se dobila krajnja koncentracija od oko 20 mM borata pri pH 9.0 i oko 5% PEG.

[0023] U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom sa česticama rAAV vezanim za okruženje isprano je kako bi se uklonile nečistoće iz procesa pre eluiranja sa česticama rAAV. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao opadajuće koncentracije PEG kako bi se uklonile nečistoće iz procesa. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži bilo koju vrednost od 10% (w/v), 9.5% (w/v), 9% (w/v), 8.5% (w/v), 8% (w/v), 7.5% (w/v), 7% (w/v), 6.5% (w/v), 6% (w/v), 5.5% (w/v), 5% (w/v), 4.5% (w/v), 4% (w/v), 3.5% (w/v), i 3% (w/v) PEG. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili

1

više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 7.5% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 7.5% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 7.5% (w/v) PEG10000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 7.5% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 5% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 5% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 5% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 5% (w/v) PEG15000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 3% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 3% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 3% (w/v) PEG 10000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između 3% (w/v) PEG 15000. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji nije sadržao PEG.

[0024] U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži pufere poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži pufer izabran iz grupe koju čine borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (HEPES) i Tris-HCl. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je borat. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer je pri baznoj pH. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje ima pH između pH 7.0 i pH 10.0, između pH 7.2 i pH 10.0, između pH 7.4 i pH 10.0, između pH 7.6 i pH 10.0, između pH 7.8 i pH 10.0, pH 8.0 i pH 10.0, pH 8.2 i pH 10.0, između pH 8.4 i pH 10.0, između pH 8.6 i pH 10.0, između pH 8.8 i pH 10.0, između pH 9.0 i pH 10.0, između pH 9.2 i pH 10.0, između pH 9.4 i pH 10.0, između pH 9.6 i pH 10.0, ili između pH 9.8 i pH 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer ima pH vrednost bilo koju od 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, ili 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je borat pri pH između 8.0 i 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je borat pri pH 8.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je borat pri pH 9.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je borat pri pH 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES pri pH između 7.0 i 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES pri pH 7.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES pri pH 8.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES pri pH 9.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je HEPES pri pH 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl pri pH između 7.0 i 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl pri pH 7.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl pri pH 8.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl pri pH 9.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer sadrži ili je Tris-HCl pri pH 10.0. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži između 100 i 500 mM fosfata. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži između 50 i 250 mM NaCl.

[0025] U nekim otelotvorenjima, korak ispiranja sadrži prvo ispiranje sa puferom za ispiranje koji sadrži oko 30 mM borata pri pH oko 9.0 i oko 7.5% PEG; drugo ispiranje sa puferom za ispiranje koji sadrži 150 kalijum fosfata, oko 20 mM borata pri pH oko 9.0, i oko 5% PEG; treće ispiranje sa puferom za ispiranje koji sadrži oko 20 mM borata pri pH oko 9.0 i oko 5% PEG; i četvrto ispiranje sa puferom za ispiranje koji sadrži oko 20 mM HEPES pri oH oko 7.0 i 150 mM NaCl.

[0026] U određenim slučajevima predmetnog obelodanjivanja, čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom su eluirane sa puferom za eluiranje koji sadrži niske koncentracije PEG ili je u odsustvu PEG. U nekim slučajevima, pufer za eluiranje sadrži manje od oko 3% (w/v) PEG, manje od oko 2% (w/v) PEG ili manje od oko 1% (w/v) PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži oko 2.5% (w/v), oko 2% (w/v), oko 1.5% (w/v), oko 1% (w/v) ili oko 0.5% (w/v) PEG ili ne sadrži PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži manje od oko 3% (w/v) PEG6000. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži manje od oko 3% (w/v) PEG8000. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži manje od oko 3% (w/v) PEG10000. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži manje od oko 3% (w/v) PEG15000. U određenim otelotvorenjima, čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom su eluirane sa puferom za eluiranje u odsustvu PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži pufer izabran iz grupe koju čine borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (HEPES) i Tris-HCl. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži ili je borat. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži ili je HEPES. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži ili je Tris-HCl. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje je pri neutralnoj pH. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži ili je HEPES pri neutralnoj pH. U nekim otelotvorenjima, pufer za eluiranje sadrži ili je Tris-HCL pri neutralnoj pH. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži manje od 100 mM fosfata. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži manje od 50 mM fosfata. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži između 50 i 250 mM NaCl. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom su eluirane sa puferom za eluiranje koji sadrži oko 50 mM kalijum fosfata, oko 20 mM HEPES pri pH oko 7.0 i oko 150 mM NaCl.

[0027] U nekim otelotvorenjima, postupak izolovanja čestica rAAV iz nečistoća iz procesa u dovodnom toku sastoji se iz koraka: (a) dovođenje dovodnog toka koji sadrži čestice AAV u kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom u prisustvu od oko 5% (w/v) PEG u baznom puferu pri pH oko 9.0, gde se čestice rAAV vezuju za okruženje hromatografije sa apatitom; (b) ispiranje okruženja hromatografije sa apatitom sa prvim puferom za ispiranje koji sadrži oko 30 mM borata pri pH oko 9.0 i oko 7.5% PEG; (c) ispiranje okruženja hromatografije sa apatitom sa drugim puferom za ispiranje koji sadrži oko 150 kalijum fosfata, oko 20 mM borata pri pH oko 9.0 i oko 5% PEG; (d) ispiranje okruženja hromatografije sa apatitom sa trećim puferom za ispiranje koji sadrži oko 20 mM borata pri pH oko 9.0 i oko 5% PEG; (e) ispiranje okruženja hromatografije sa apatitom sa četvrtim puferom za ispiranje koji sadrži oko 20 mM HEPES pri pH oko 7.0 i 150 mM NaCl; i (f) eluiranje čestica rAAV vezanih za okruženje hromatografije sa apatitom sa puferom za eluiranje koji sadrži oko 50 mM kalijum fosfata, oko 20 mM HEPES pri pH oko 7.0 i oko 150 mM NaCl.

[0028] Takođe su ovde obelodanjeni postupci za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) iz nečistoća iz procesa u dovodni tok koji se sastoji od koraka: (a) dovođenje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV u kontakt sa okruženjem hromatografije sa hidrofobnom interakcijom (HIC) u puferu sa visokim sadržajem soli, gde se čestice rAAV i nečistoće iz procesa vezuju za HIC okruženje; i (b)

1

eluiranje čestica rAAV vezanih za HIC okruženje sa puferom sa srednjim sadržajem soli. U nekim slučajevima, HIC okruženje izabrano je iz grupe koju čine Tosoh Butil 650M, Tosoh SuperButil 650C, Tosoh Fenil 650C, EMD Fracotogel Fenil i Tosoh Has (butil) smola. U nekim slučajevima, pufer sa visokim sadržajem soli sadrži ili je između 0.5 M i 2.0 M citrata (npr., natrijum citrat). U nekim slučajevima, pufer sa visokim sadržajem soli sadrži bilo koju vrednost oko 0.5 M, 0.75M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M i 2.0 M citrata. U nekim slučajevima, pufer sa srednjim sadržajem soli sadrži ili je manje od 0.5 M citrata (npr., natrijum citrat). U nekim slučajevima, pufer sa srednjim sadržajem soli sadrži između 0.5 M do oko 0.3 M citrata. U nekim slučajevima, pufer sa srednjim sadržajem soli sadrži bilo koju vrednost oko 0.45 M, 0.4 M, 0.35 M, 0.3 M i 0.25 M citrata. U nekim slučajevima, pufer sa visokim sadržajem soli dalje sadrži između 1 i 100 mM fosfata. U nekim slučajevima, pufer sa srednjim sadržajem soli dalje sadrži između 1 i 100 mM fosfata. U nekim slučajevima, pufer sa srednjim sadržajem soli eluira čestice rAAV bez eluiranja čestica rAAV sa praznim kapsidima, delimično denaturisanim kapsidima, manje infektivnim kapsidima i/ili delimično punim kapsidima.

[0029] U bilo kom od slučajeva iz predmetnog obelodanjivanja ili bilo kojih otelotvorenja ovde opisanih, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida izabran iz grupe koju čine AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 i AAV-16. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida izabran iz grupe koju čine AAV-1, AAV-4, AAV-5, i AAV-8. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida AAV-1. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida AAV-4. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida AAV-5. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida AAV-8. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže protein AAV kapsida iz AAV serotipa izabranog iz grupe koju čine AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 i AAV-16. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida koji je slab anjonski veznik. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida koji je slab anjonski veznik izabran iz grupe koju čine AAV-1, AAV-4, AAV-5, i AAV-8. U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži čestice rAAV dalje sadrži proizvodnju kulture zagađivača. U nekim otelotvorenjima, proizvodnja kulture zagađivača sadrži oštećene čestice rAAV, zagađivače ćelije domaćina, zagađivače pomoćnog virusa i/ili zagađivače ćelijske kulture. U nekim otelotvorenjima, zagađivači ćelije domaćina sadrže DNK ćelije domaćina, plazmide ili proteine ćelije domaćina. U nekim otelotvorenjima, zagađivači pomoćnog virusa sadrže čestice adenovirusa, DNK adenovirusa ili proteine adenovirusa. U nekim otelotvorenjima, zagađivači ćelijske kulture sadrže komponente okruženja, serum albumin ili druge proteine seruma. U nekim otelotvorenjima, zagađivači ćelijske kulture sadrže komponente okruženja. U nekim otelotvorenjima, zagađivači ćelijske kulture ne sadrže serum albumin ili druge proteine seruma.

[0030] Trebalo bi prihvatiti da se jedno, neka ili sva svojstva različitih otelotvorenja ovde opisanih mogu kombinovati kako bi se formirala druga otelotvorenja prema predmetnom pronalasku.

KRATAK OPIS SLIKA

[0031]

Slika 1 predstavlja rezultate razlaganja Benzonase® rastopljenog supernatanta iz prikupljanja kulture koja proizvodi rAAV. Rezultati demonstriraju da DNK visoke molekulske mase nije bila prisutna nakon razlaganja Benzonase®.

Slika 2 prikazuje uobičajeno spektrofotometrijsko praćenje za uobičajenu smolu proverenu za afinitet rAAV vezivanja kao što je opisano u Primeru 4. Apsorbancija (AU) i provodljivost (mS/cm) su ukazani.

Slika 3 predstavlja analizu kapaciteta probijanja sa i bez PEG. Dva modela kulture koja proizvodi rAAV su korišćena za procenjivanje kapaciteta apatit smole (CFT tip I). Gornji panel: Probijanje za vreme dovođenja dovodnog toka koji je sadržao serum ili je bio bez seruma u prisustvu ili odsustvu od oko 5% (w/v) PEG6000 pri dovođenju. Zapremine dovođenja odnose se na početni dovodni tok, pre 1:1 razblaživanja na liniji i normalizovane su po mL zapremine smole. Donji panel:

Zapremine dovođenja (ml) pri kojima je 1% probijanja osmotreno i vraćanje u frakciji eluiranja. TFF prikupljanja upotrebljena u eksperimentu su bila pri koncentraciji od približno 10<16>DRP/ml za vektore rAAV. U prisustvu od oko 5% (w/v) PEG6000, 150 mL TFF prikupljanja je dovedeno u 1.2 mL CFT smolu bez probijanja, što je definisano kao prisustvo >1% rAAV u protoku kolone, što odgovara dovođenju 1.8×10<14>ukupnog DRP rAAV.

Slika 4 predstavlja uobičajeni CHT I hromatogram. U liniji su prikazani, merenja UV apsorbancije A280(AU, jedinica apsorbancije) i provodljivosti (mS/cm) sa Amersham

1

3 mm Skid. Zagrade označavaju glavne segmente programa opisanog u Primeru 7. „NaOH“ označava korak dekontaminacije kolone.

Slika 5 prikazuje relativnu čistoću vektora rAAV eluiranih iz apatit smole. Panel A prikazuje raspored vektora između protoka/hvatanja (FT), ispiranja visoki sadržaj fosfata/5% PEG6000 (PO4), ispiranja za uklanjanje fosfata i PEG6000 (WII/WIII) i eluiranja. Ni jedna od razlika između slučajeva nije bila značajna u okviru preciznosti analize i nedostatak balansa mase je uobičajen. Panel B prikazuje značajne trake iz Sypro narandžasto-obeleženog SDS PAGE sa frakcijama eluiranja iz kolone sa apatitom. Svaki uzorak je napunjen pri 2×10<11>DRP/traci; očigledna razlika u migraciji između traka je so usled koncentrovanja CFT eluiranja sa evaporacijom do zapremine koja bi se poklopila sa gelom. Samo se pretežne trake pojavljuju u proteinima AAV kapsida. Panel C prikazuje značajne trake Ad5 Western blot-a sa trakama ponovno poređanim radi jasnoće, prikazujući uporedivo čišćenje Ad5 proteina.

Slika 6 prikazuje procenjivanje prečišćavanja u procesu sa SDS-PAGE. Uzorci iz procesa iz reprezentativnog prikupljanja kulture za proizvodnju su pušteni na 10% poliakrilamid gelu za denaturaciju/redukciju i obeleženi sa Sypro narandžastom. Svi uzorci nakon prikupljanja su napunjeni pri 1×10<10>DRP/traci. Dva uzvodna uzorka pre koraka TFF koncentrovanja (početni korak pojašnjenja i AEX protok) mogu se napuniti samo pri 1×10<9>DRP/traci usled ograničenja zapremine na gelu. Betagalaktosidaza (B-Gal) je napunjena pri 50 ng/traci kako bi se procenila osetljivost i konzistencija obeležavanja na gelu. Ukazana su tri proteina AVV1 kapsida (VP1, 2 i 3).

Slika 7 prikazuje postepeni oporavak prečišćavanja rAAV kao što je opisano u Primerima 1-12. Ukupni DRP prisutan u supernatantnu pre prikupljanja definisan je kao 100%. Vraćanje u svakom koraku je ukupan DRP dobijen relativno u odnosu na ukupni DRP obrađen u tom koraku. Ukupno vraćanje za ceo proces je približno 28%. D4 sup: kultura za proizvodnju; AEX FT: razmena anjona (Mustang® Q) protok; zahvatanje: hromatografija sa apatitom; toplota: deaktivacija sa toplotom ili ubijanje sa toplotom: hromatografija sa hidrofobnom interakcijom; SEC: hromatografija sa isključivanjem po veličini; AEX: razmena anjona.

1

DETALJNI OPIS

[0032] Predmet je ovog obelodanjivanja, uključujući predmetni pronalazak, da se pruže postupci za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) bilo kog serotipa AAV kapsida iz zagađivače kulture za proizvodnju kao što su oštećenje čestice AAV, pomoćni virus, proteini pomoćnog virusa, plazmidi, ćelijski proteini i DNK, komponente okruženja, proteini seruma i slično. U nastavku, postupci prema predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, pružaju komercijalno prilagodljive, ortogonalne procese koji su u skladu sa regulatornim zahtevima za izolovanje populacije čestica rAAV iz prikupljanja ili dovodnog toga kulture za proizvodnju rAAV sa visokim titrom. Populacije čestica rAAV izolovane sa postupcima prema predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, suštinski su slobodne od zagađivača, uključujući zagađivače kulture za proizvodnju i/ili zagađivače iz procesa, kao što su oštećene čestice rAAV, pomoćni virus, proteini pomoćnog virusa, plazmidi, ćelijski proteini i DNK, komponente okruženja, proteini seruma i glukani. Postupci prema predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, naročito su pogodni za serotipove vektora rAAV koji su slabi anjonski veznici kao što su, na primer, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5, i rAAV-8. Obelodanjivanje, uključujući predmetni pronalazak, dalje razmatra postupak za izolovanje populacije visokog titra čestica rAAV suštinski slobodnih od zagađivača, uključujući zagađivače kulture za proizvodnju i/ili zagađivače iz procesa, pogodne za primene genske terapije bez potrebe za vršenjem centrifugiranja gradijenta gustine.

Definicije

[0033] Termin „izolovan“ ili „prečišćen“ kao što se ovde koristi odnosi se na pripremanje čestica rAAV lišenih od bar dela drugih komponenata koje takođe mogu biti prisutne tamo gde se čestice rAAV prirodno javljaju ili su iz njih početno pripremljene. Stoga, na primer, izolovane čestice rAAV mogu biti pripremljene upotrebom tehnika za prečišćavanje kako bi se obogatile iz izvorne smeše, tako što je kultura lizata ili proizvodnja supernatanta kulture. Obogaćivanje može biti mereno na različite načine, kao što je, na primer, proporcija čestica otpornih na DNazu (DRP) prisutnih u rastvoru, ili sa infektivnošću, ili može biti mereno u vezi sa drugom, potencijalno supstancom koja potencijalno utiče u izvornoj smeši, kao što su zagađivači, uključujući zagađivače kulture za proizvodnju ili zagađivači iz procesa, uključujući pomoćni virus, komponente okruženja i slično, kao što je definisano ispod.

1

[0034] Pripremanje rAAV rečeno je da je „suštinski slobodno“ od pomoćnog virusa ukoliko je odnos infektivnih čestica AAV i infektivnih čestica pomoćnog virusa manji od oko 10<2>:1; poželjno bar oko 10<4>:1, još poželjnije bar oko 10<6>:1; čak još poželjnije bar oko 10<8>:1.

Pripremanja su takođe pogodno slobodna od ekvivalentnih količina proteina pomoćnog virusa (i.e., proteini koji bi bili prisutni kao rezultat takvog nivoa pomoćnog virusa ukoliko su nečistoće čestica pomoćnog virusa navedene iznad prisutne u poremećenom obliku).

Zagađenje virusa i/ili ćelijskog proteina može generalno biti posmatrano kao prisustvo Coomassie traka za obeležavanje na SDS gelovima (e.g., pojavljivanje traka različitih od onih koje odgovaraju proteinima AAV kapsida VP1, VP2 i VP3).

[0035] Termin „slab anjonski veznik“ ili „niski afinitet anjonskog vezivanja“ kao što se ovde koristi naizmenično se odnosi na česticu rAAV koja ima serotip kapsida koji, u prisustvu zagađivača (uključujući zagađivače kulture za proizvodnju ili zagađivače iz procesa) ne vezuje dovoljan afinitet kako bi se omogućilo izolovanje čestica rAAV iz drugih zagađivača kulture za proizvodnju rAAV. Takvi serotipovi kapsida poznati su u struci i uključuju, bez ograničenja, AAV-1, AAV-5, AAV-8 i AAV-4. Kao što je opisano u struci takvi slabo anjonski veznici su generalno prečišćeni sa postupcima koji obuhvataju bar jedan korak centrifugiranja gustine uključujući jodiksinol (prodaje se pod nazivom Optiprep®) ili cezijum hlorid centrifugiranje gradijenta.

[0036] Kao što se ovde koristi, termin „pomoćni virus“ ili „zagađivanje pomoćnog virusa“ odnosi se na virus koji se koristi pri proizvodnji kopija virusnog vektora zavisnog od pomoćnog virusa kao što je adeno asocirani virus, koji nema sposobnost da vrši replikaciju samostalno. Pomoćni virus se koristi da zajedno inficira ćelije sa virusnim vektorom i pruža neophodne proteine za vršenje replikacije genoma virusnog vektora. Termin obuhvata nepromenjene čestice virusa, prazne kapside, virusnu DNK i slično. Pomoćni virusi koji se obično koriste za proizvodnju čestica rAAV uključuju adenovirus, herpes simpleks virus, citomegalovirus, Epstein-Barr virus, i virus vakcinije.

[0037] Termin „kultura za proizvodnju“ kao što se ovde koristi odnosi se na sredstvo za prenošenje koje sadrži neophone komponente za proizvodnju čestica vektora rAAV. Kulture za proizvodnju uključuju, bez ograničenja, sledeće komponente: 1) pogodnu ćeliju domaćina; 2) funkciju pomoćnog virusa; 3) AAV rep i cap gene i proizvode gena; 4) terapeutski

1

transgen na ivicama AAV ITR sekvenci i 5) pogodno okruženje, komponente okruženja i suplemente okruženja, uključujući, bez ograničenja serum, proteine izvedene iz seruma, vitamine, esencijalne i ne-esencijalne amino kiseline i glukozu poznatu da podržava proizvodnju rAAV.

[0038] Kao što se ovde koristi, termini „zagađivači“, „zagađivači kulture za proizvodnju“, „zagađivači iz procesa“, „nečistoće iz procesa“, „nečistoće“ ili „zagađivači“ kao što se ovde naizmenično koriste, odnose se na, bez ograničenja, formulacije okruženja poznate u struci koje podržavaju proizvodnju vektora rAAV; suplemente okruženja kao što su soli, serum teleta, suplementi amino kiseline, vitamini suplementi, faktori rasta, serum albumin i drugi proteini sa niskom molekulskom masom prisutni u formulacijama okruženja poznatim u struci; popustljive ćelije domaćina, proteini ćelija domaćina i DNK ćelije domaćina; pomoćni virusi, proteini pomoćnog virusa ili DNK pomoćnog virusa kao što adenovirus divljeg tipa ili proteini herpes virusa; i drugi vektori koji nisu rAAV ili materijali kulture za proizvodnju rAAV uvedeni za vreme prečišćavanja kao što su glukani ili puferi za hromatografiju korišćeni pri prečišćavanju vektora rAAV iz dovodnog toka.

[0039] Termin „prikupljanje kulture za proizvodnju“ kao što se ovde koristi definisano je kao rastvor koji sadrži čestice vektora rAAV iz kultura za proizvodnju vektora rAAV putem sredstava poznatih u struci, uključujući bez ograničenja procese prenošenja, stabilnu proizvodnju ćelijskih linija, proizvodnju ad-hibrid sistema ili proizvodnju sistema bakulovirusa. U nastavku, termin „prikupljanje kulture za proizvodnju“ kao što se ovde koristi odnosi se na materijal izolovan iz sredstvo za prenošenje kulture za proizvodnju i obuhvata oba, materijale izolovane sa lizom ćelija koje proizvode rAAV putem poznatim u struci i materijali izolovane iz kultura za proizvodnju rAAV održavanih pod uslovima ćelijske kulture poznatim u struci kako bi se dobile čestice rAAV oslobođene u okruženje iz nepromenjenih ćelija. Prikupljanje kulture za proizvodnju može sadržati deo ili sve od sledećeg, bez ograničenja: čestice vektora rAAV, komponente kulture za proizvodnju, kao što su komponente okruženja, proteini ćelije domaćina, DNK ćelije domaćina, ćelije domaćina, pomoćni virus, proteine pomoćnog virusa, DNK pomoćnog virusa, DNK plazmida, DNK virusa nosača, serum, proteini izvedeni iz seruma i suplementi okruženja.

[0040] Termin „dovodni tok“ kao što se ovde koristi odnosi se na izvor čestica vektora rAAV koje se dovode, prolaze ili primenjuju na hromatografsku matricu. Dovodni tok prema

1

predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, uključuje prikupljanje kulture za proizvodnju i materijale izolovane iz prethodnih koraka hromatografije obelodanjivanja, gde je materijal bio prisutan kao protok iz prethodnog koraka, vezan i eluiran u prethodnom koraku, prisutan u praznoj zapremini prethodnog koraka ili prisutan u bilo kojoj frakciji dobijenoj za vreme prečišćavanja rAAV čestica. Takav dovodni tok može uključivati jedan ili više „zagađivač“, „zagađivač kulture za proizvodnju“, „zagađivač iz procesa“, „nečistoće iz procesa“ ili „nečistoće“ ili „zagađivače“ kao što je ovde definisano.

[0041] Termini „zahvaćen“, „vezan“, „vezuje“ ili „vezivanje“ kao što se ovde unakrsno koristi odnosi se na vezivanje, prianjanje ili lepljenje komponenata dovodnog toka u hromatografskom okruženju. Komponente mogu biti vezane za hromatografsko okruženje bilo kojom silom ili hemijom poznatom u struci, uključujući bez ograničenja, hidrofobno, jonski (uključujući anjonski i katjonski), afinitetno, metalno heliranje i helaciju. Komponente mogu biti vezane za hromatografsko okruženje sa više od jednim tipom hemije kao što je okruženje hromatografije sa apatitom.

[0042] Termini „apatit smola“, „okruženje hromatografije sa apatitom“, „matrica apatita“ ili „okruženje apatita“, kao što se ovde naizmenično koriste odnose se na okruženje hromatografije koje se sastoji od minerala kalcijum fosfata i uključuje bez ograničenja keramički hidroksiapatit (CHT) i keramički fluoroapatit (CFT) kao okruženje za hromatografiju.

[0043] Termini „pomešani režim“ ili „multimodalni“ odnose se na okruženje hromatografije koje ima kapacitet za više od jedne hemije vezivanja. Okruženje hromatografije sa pomešanim režimom uključuje, bez ograničenja, okruženje hromatografije sa apatitom, koje je u stanju da pokaže afinitet metalnog vezivanja preko kalcijum delova, vodonično vezivanje putem hidroksil grupa prisutnih na lancu, odbijanje pozitivnog naelektrisanja i privlačenje negativnog naelektrisanja putem kalcijum delova i odbijanje negativnog naelektrisanja i privlačenje pozitivnog naelektrisanja putem fosfatnih grupa prisutnih u okruženju.

[0044] Opšta referenca na „sastav“ ili „sastave“ uključuje i primenljiva je na sastave prema obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak.

2

[0045] Kao što se ovde koristi, oblik jednine članova „a“, „an“ i „the“ uključuje reference na množinu ukoliko nije drugačije ukazano. Na primer, fraza „čestica virusa“ uključuje jednu ili više čestica.

[0046] Referenca na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) otelotvorenja koja su usmerena na tu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X“.

[0047] Trebalo bi prihvatiti da aspekti i otelotvorenja prema pronalasku ovde opisani uključuju sadržanje i/ili se suštinski sastoje od aspekata i otelotvorenja.

Proizvodnja vektora rAAV

[0048] Brojni postupci za proizvodnju vektora rAAV poznati su u struci, uključujući transfekciju, proizvodnju stabilnih ćelijskih linija i sisteme za proizvodnju infektivnih hibridnih virusa koji uključuju adenovirus-AAV hibride, herpesvirus-AAV hibride i bakulovirus-AAV hibride. Kulture za proizvodnju rAAV za proizvodnju čestica virusa rAAV sve zahtevaju; 1) stabilne ćelije domaćina, uključujući, na primer, ćelijske linije izvedene iz ljudi kao što su HeLa, A549 ili 293 ćelije ili ćelijske linije izvedene iz insekata kao što su SF-9, u slučaju sistema za proizvodnju bakulovirusa; 2) stabilnu funkciju pomoćnog virusa, pruženu sa divljim tipom ili mutantom adenovirusa (kao što su adenovirusi osetljivi na temperaturu), herpes virusom, bakulovirusom ili plazmidnim konstruktom koji pruža pomoćne funkcije; 3) proizvode AAV rep i cap gena; 4) transgen (kao što je terapeutski transgen) na ivicama AAV ITR sekvenci; i 5) pogodno okruženje i komponente okruženja za podržavanje proizvodnje rAAV. Pogodna okruženja poznata u struci mogu biti korišćena za proizvodnju vektora rAAV. Ova okruženja uključuju, bez ograničenja, okruženja proizvedena od strane Hyclone Laboratories I JRH uključujući modifikovano okruženje Eagle (MEM), modifikovano kruženje Eagle od Dulbecco, formulacije po narudžbini kao što su one opisane u patentu SAD br.6,566,118, i Sf-900 II SFM okruženje kao što je opisano u patentu SAD br.

6,723,551, naročito u odnosu na formulacije okruženja po narudžbini za upotrebu u proizvodnji vektora rekombinantnog AAV.

[0049] Pogodna okruženja kulture za proizvodnju rAAV prema predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, mogu biti suplementisana sa serumom ili rekombinantnim proteinima izvedenim iz seruma pri nivou od 0.5%-20% (v/v ili w/v).

Alternativno, kao što je poznato u struci, vektori rAAV mogu biti proizvedeni u uslovima bez seruma koji se takođe mogu nazivati kao okruženje bez proizvoda životinjskog porekla. Stručna osoba u ovoj oblasti može ceniti da komercijalna ili okruženja po narudžbini mogu dizajnirati kako bi podržala proizvodnju vektora rAAV takođe mogu biti suplementisana sa jednom ili više komponenata ćelijske kulture poznate u struci, uključujući bez ograničenja, glukozu, vitamine, amino kiseline i/ili faktore rasta, kako bi se povećao titar rAAV u kulturama za proizvodnju.

[0050] Kulture za proizvodnju rAAV mogu biti gajene pod različitim uslovima (u širokom temperaturnom opsegu, za različita vremenska trajanja i slično) pogodnim za naročitu ćeliju domaćina koja se koristi. Kao što je poznato u struci, kulture za proizvodnju rAAV uključuju kulture zavisne od povezivanja koje mogu biti kultivisane u pogodnim sredstvima za prenošenje zavisnim od povezivanja kao što su, na primer, bočice sa kuglom, šuplji vlaknasti filteri, mikronosači i bioreaktori sa upakovanim slojem ili tečnim slojem. Kulture za proizvodnju vektora rAAV mogu takođe uključivati ćelije domaćina prilagođene za suspenziju kao što su HeLa, 293 i SF- 9 ćelije koje se mogu kultivisati na različite načine uključujući, na primer, boca za obrtanje, bioreaktori sa rezervoarom za mešanje i jednokratni sistemi kao što su Wave sistem sa vrećom.

[0051] Čestice vektora rAAV prema obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, mogu biti sakupljene iz kultura za proizvodnju rAAV putem lize ćelija domaćina kulture za proizvodnju ili putem sakupljanja potrošenog okruženja iz kulture za proizvodnju, ukoliko su ćelije kultivisane pod uslovima poznatim u struci radi izazivanja oslobađanja čestica rAAV u okruženje iz nepromenjenih ćelija, kao što je potpunije opisano u patentu SAD br.

6,566,118). Pogodni postupci za lizovanje ćelija takođe su poznati u struci i uključuju na primer, više ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, sonifikaciju, mikrofluidizaciju i tretiranje sa hemikalijama, kao što su deterdženti i/ili proteaze.

Prečišćavanje vektora rAAV

[0052] Pri prikupljanju, kulture za proizvodnju rAAV prema predmetnom obelodanjivanju, uključujući predmetni pronalazak, mogu sadržati jedno ili više od sledećeg: (1) proteini ćelije domaćina; (2) DNK ćelije domaćina; (3) DNK plazmida; (4) pomoćni virus; (5) proteini pomoćnog virusa; (6) DNK pomoćnog virusa; i (7) komponente okruženja uključujući, na primer, proteine seruma, amino kiseline, transferine i druge proteine sa niskom molekulskom masom. Dodatno, kulture za proizvodnju rAAV sadrže čestice rAAV koje imaju serotip kapsida AAV izabran iz grupe koju čine AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 i AAV-16. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV imaju serotip AAV kapsida izabran iz grupe koju čine AAV-1, AAV-4, AAV-5, i AAV-8.

[0053] U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, prikupljanje kulture za proizvodnju rAAV je prečišćeno kako bi se uklonio talog ćelije domaćina. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, prikupljanje kulture za proizvodnju je prečišćeno filtracijom kroz niz dubokih filtera uključujući, na primer, visokog kvaliteta D0HC Millipore Millistak+ HC Pod Filter, visokog kvaliteta A1HC Millipore Millistak+ HC Pod Filter, i 0.2 µm Filter Opticap XL10 Millipore Express SHC hidrofilni membranski filter. Prečišćavanje može biti postignuto sa različitim drugim standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što je centrifugiranje ili filtriranje kroz celuloza acetat filter sa porama od 0.2 µm ili većim poznatim u struci.

[0054] U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, prikupljanje kulture za proizvodnju rAAV je dalje tretirano sa Benzonase® kako bi se razgradila bilo koja DNK sa visokom molekulskom masom prisutna u kulturi za proizvodnju. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, Benzonase® razgradnja izvršena je pod standardnim uslovima poznatim u struci, uključujući, na primer, krajnju koncentraciju od 1-2.5 jedinica/ml Benzonase® pri temperaturama u rasponu od okruženja do 37°C u vremenskom periodu od 30 minuta do nekoliko sati.

[0055] Čestice rAAV mogu biti izolovane ili prečišćene upotrebom jednog ili više od sledećih koraka prečišćavanja: protok kroz filtraciju sa razmenom anjona, filtracija tangencijalnog protoka (TFF) za koncentrovanje čestica rAAV, rAAV hvatanje sa hromatografijom sa apatitom, deaktivacija sa toplotom pomoćnog virusa, rAAV hvatanje sa hromatografija sa hidrofobnom interakcijom, razmena pufera sa hromatografijom sa isključivanjem po veličini (SEC), nanofiltracija i hvatanje rAAV sa hromatografijom sa razmenom anjona. Ovi koraci mogu biti izvršeni samostalno, u različitim kombinacijama ili u

2

različitom poretku. U nekim otelotvorenjima, postupak sadrži sve korake u poretku kao što je opisano ispod.

Filtracija razmene anjona

[0056] Opciono u nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, prečišćeno prikupljanje kulture za proizvodnju i tretirano sa Benzonase® izloženo je filtraciji sa razmenom anjona pod uslovima gde je vektor rAAV prisutan u protoku i zagađujući pomoćni virus je zadržan u naelektrisanom fileru. Pri jonskoj snazi prikupljanja kulture za proizvodnju rAAV, čestice rAAV mogu se razlikovati od pomoćnog virusa, na primer, adenovirusa prolaženjem kroz anjonski filter kao što je Mustang® Q filter (Pall Corp., East Hills, NY). Stručna osoba u ovoj oblasti može odrediti veličinu i broj filtera neophodnih za postizanje optimalne log redukcije adenovirusa (LRV) i proteina adenovirusa prisutnih u prečišćenoj kulturi za proizvodnju sa anjonskim filterom i tretiranoj sa Benzonase®. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, LRV je bar jedan log i veći od deset log-ova. U poželjnom slučaju ili otelotvorenju, LRV je bar dva i više od osam log-ova. U još poželjnijem slučaju ili otelotvorenju LRV je bar šest log-ova.

Koncentrovanje filtracije tangencijalnog protoka (TFF)

[0057] U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, protok od anjonske filtracije prečišćenog, Benzonase® tretiranog dovodnog toka koncentrovan je putem filtracije tangencijalnog toka („TFF“) pre nego što je primenjen na okruženje hromatografije sa apatitom. Koncentrovanje virusa u velikoj razmeri koje koristi TFF ultrafiltraciju opisano je od strane R. Paul i dr., HUMAN GENE THERAPY, 4:609-615 (1993). TFF koncentrovanje dovodnog toka omogućava zapreminu dovodnog toka kojom se može tehnički upravljati da bude izložena koracima hromatografije prema predmetnom pronalasku, uključujući predmetni pronalazak, i omogućava pogodnije dimenzionisanje kolona bez potrebe za dugačkim vremenima recirkulacije. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, dovodni tok rAAV koncentrovan je između bar dva puta ili bar deset puta. U nekim slučajevima ili otelotvorenjima, dovodni tok koncentrovan je između bar deset puta ili bar dvadeset puta. U nekim slučajevima ili otelotvorenjima, dovodni tok koncentrovan je između bar dvadeset puta ili bar pedeset puta. Stručna osoba u ovoj oblasti će takođe prepoznati da TFF takođe može biti korišćen u bilo kom koraku procesa prečišćavanja gde je poželjno izvršiti razmenu pufera pre vršenja sledećeg koraka u procesu prečišćavanja.

Hvatanje rAAV sa hromatografijom sa apatitom u prisustvu polietilen glikola (PEG)

[0058] FDA-odobreni procesi za prečišćavanje proteina i drugih bioloških proizvoda pogodnih za upotrebu kod ljudskih kliničkih ispitivanja i farmaceutskih proizvoda zavise od komercijalne razmere ortogonalnih procesa. Šema prečišćavanja sa više koraka smatra se da uključuje ortogonalni proces ukoliko upotrebljava mehanizme za razdvajanje koji se razlikuju jedni od drugih, gde svaki korak predstavlja osu u Dekartovom prostoru. Na primer, proces sa dva koraka koji koristi razmenu anjona i hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom (HIC) bi se smatrao ortogonalnim. Procesi za uklanjanje zagađivača, kao što zagađivači kulture za proizvodnju ili zagađivači iz procesa, od prikupljanja kulture za proizvodnju ili dovodnog toga ovde opisanih su ortogonalni procesi uključujući oba, korake hvatanja i protoka na više okruženja hromatografije za krajnji proizvod (tj., rAAV vektor). Vektori rAAV (naročito rAAV-2) su pokazali u struci da vezuju anjonske smole. rAAV vektori kao što su rAAV-1, -5 i -8 pokazali su da se mnogo uže vezuju od rAAV-2 za okruženje sa razmenom anjona u prisustvu komponenta proizvoda kao što je serum albumin, komponente pomoćnog virusa, komponente okruženja za proizvodnju i DNK ćelije domaćina, što se ispoljava u manje efikasnoj i šemi prečišćavanja nižeg kvaliteta.

[0059] Prethodne strategije prečišćavanja opisane u struci za anjonske veznike nižeg afiniteta kao što je AAV-1 uključene u gradijentu koraka jodoksinola što smanjuje relativnu koncentraciju zagađivača, kao što su zagađivači kulture za proizvodnju i nečistoće iz procesa, kako bi se postiglo uže vezivanje vektora rAAV za anjonske razmenjivače. Gradijent koraka jodoksinola nije lako prilagodljiv za procese komercijalne razmere ovde opisane.

[0060] Pronalazači predmetne prijave otkrili su da se čestice vektora rAAV mogu izolovati iz zagađivača, kao što su zagađivači kulture za proizvodnju ili zagađivači iz procesa, hvatanjem i eluiranjem iz apatit smola. Stoga, dodatno hvatanju proizvoda iz sirovog dovodnog toka, apatit kolona prečišćava različite nečistoće vezane za proces, uključujući proteine ćelije domaćina i adenovirusa, glukane i proteine seruma, kao i pružanje dodatnog faktora čišćenja za pomoćni virus (kao što je Ad5 pomoćni virus).

2

[0061] Apatit smole su okruženje za hromatografiju koje sadrži minerale kalcijum fosfata, uključujući bez ograničenja keramički hidroksiapatit (CHT) i keramički fluoroapatit (CFT). Okruženje hromatografije sa apatitom takođe se naziva kao okruženje sa pomešanim režimom ili više režima zato što apatit ima funkcionalne grupe koje pružaju više od jedne hemije vezivanja. Bez želje za ograničavanjem sa teorijom, okruženje apatita pruža mogućnost za afinitetno metalno vezivanje kalcijuma, vodonično vezivanje, odbijanje pozitivnog naelektrisanja, privlačenje pozitivnog naelektrisanja, odbijanje negativnog naelektrisanja i privlačenje negativnog naelektrisanja putem domaćina iz druge hemijske grupe, uključujući hidroksil ostatke prisutne na lancu, pozitivno naelektrisane kalcijum delove i negativno naelektrisane fosfatne delove prisutne u smoli. Svaka hemija vezivanja primenjuje se na pomešani režim isto kao i za hromatografiju sa jednim režimom. Međutim, za razliko od hromatografije sa jednim režimom, hemije različitog vezivanja i eluiranja nisu nezavisne i mogu funkcionisati suprotno. Na primer, pojačavanje jonske snage može voditi hidrofobno vezivanje. (T. Kawasaki, M. Niikura, and Y. Kobayashi, J. Chrom.515:125-148 (1990) i P.S. Gagnon, P. Ng, J. Zhen, C. Aberin, i J. He, BioProcess Int'l 4:50-60 (2006)). Naročtio, CHT i CFT su sferni, makroporozni oblici hidroksiapatita (Ca5(PO4)3OH)2sinterovani pri visokim temperaturama kako bi se mineral pretvorio iz kristala u keramički oblik. Ovo daje okruženje za hromatografiju sa makroporoznom strukturom što pruža veliku površinu, ograničenu otpornost na maseno prenošenje, visoku mehaničku snagu i osnovnu otpornost. Sinterovanje pri različitim temperaturama i vremenima ispoljava se u različitim fizičkim strukturama-tipovima I i II- koji su identični hemijski ali nude različite kapacitete za različite klase molekula. CFT se razlikuje od CHT u tome zato što je kompozit fluoroapatita i hidroksiapatita pripremljenog hemijskim zamenjivanjem hidroksil grupe sa fluor grupom kako bi se povećala stabilnost pri kiselim uslovima. CFT i CHT smole su komercijalno dostupne (npr., od Bio-Rad Laboratories, Inc.).

[0062] Pronalazači predmetnog pronalaska neočekivano su otkrili da prisustvo polietilen glikola (PEG) u puferu za dodavanje značajno povećava kapacitet i reproduktivnost (smanjivanjem promenjivog probijanja čestica rAAV u protoku) čestica vektora rAAV koje se vezuju za apatit smolu. Bez želje za ograničavanjem sa teorijom, jedan atribut vektora rAAV koji ih razlikuje od većine nečistoća povezanih sa procesom je velika fizička veličina čestica. Razlika u veličini korišćena je u koracima hvatanja i ispiranja uključivanjem polietilen glikola (PEG) u hromatografskom vezivanju i puferima za ispiranje kako bi se poželjno povećali koeficijenti particionisanja većih molekula do vezanog stanja na osnovu

2

energetski pogodnog deljenja omotača hidratacije. Dok je upotreba PEG pri prečišćavanju vektora virusa i bakteriofaga opisana u struci, za razliku od predmetnog pronalaska, korišćeni su primarno kao sredstva za taloženje kako bi se fizički izvršila agregacija i uklonile virusne čestice iz rastvora. Kako je u struci poznato da PEG upotrebljava agregaciju i taloženje virusnih čestica i rAAV je opisan u struci da formira agregate pri jonskoj snazi ispod 200mM (Wright i dr., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)), uticaj PEG na vezivanje vektora rAAV za apatit smolu je nepredvidiv. U struci je poznato da PEG upotrebljava vezivanje molekula imunoglobulina za smole za razmenu jona kao što je opisano, na primer, u Gagnon, J.

Chromtogr. 743A:51-55 (1996), i smole za naelektrisane hidrofobne pomešane režime su opisane, na primer, u Gagnon i dr., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development, March 4-6, 2009.

[0063] Pronalazači predmetne prijave odredili su na osnovu eksperimenata sa PEG6000 u opsegu koncentracija između 3-10% (w/v) u dovodnom toku da je relativna koncentracija od oko 5% (w/v) PEG6000 bila optimalna. Stručna osoba u ovoj oblasti ceniće da se druge vrste i molekulske mase PEG mogu upotrebiti uključujući bez ograničenja PEG8000, PEG10000 i PEG15000, i da relativna koncentracija PEG pri krajnjoj koncentraciji u rastvoru vektora rAAV može biti empirijski određena tako da se pri odgovarajućim koncentracijama PEG, čestice vektora rAAV u rastvoru vode do vezivanja za apatit smolu ali ne formiraju agregate ili fizički talog.

[0064] U nekim slučajevima, čestice vektora rAAV su izolovane iz zagađivača kulture za proizvodnju hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG i eluiranjem vezanih čestica rAAV iz apatit smole u fosfatni pufer. U poželjnim otelotvorenjima, čestice vektora rAAV su izolovane iz zagađivača kulture za proizvodnju hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG i eluiranjem vezanih čestica rAAV iz apatit smole u pufer u odsustvu PEG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV koje sadrže kapside koji su slabi anjonski veznici su izolovane iz zagađivača kulture za proizvodnju hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG i vezivanjem čestica rAAV eluiranih iz apatit smole u puferu u odsustvu PEG. U još poželjnijim otelotvorenjima, čestice rAAV koje sadrže kapside serotipa 1 (rAAV-1 serotip) su izolovane iz zagađivača kulture za proizvodnju hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG i rAAV-1 serotip kapsida koji sadrži čestice vezane za smolu je eluiran u puferu u odsustvu PEG. U nekim otelotvorenjima, čestice vektora rAAV izolovane su iz zagađivača kulture za proizvodnju u skladu sa postupkom koji sadrži vođenje dovodnog toka u pufer za punjenje u

2

odsustvu fosfata ali u prisustvu PEG i eluiranjem vezanog rAAV iz apatit smole u pufer za eluiranje koji sadrži fosfat a nema PEG.

[0065] Dok hromatografija sa apatitom u prisustvu PEG predstavlja efikasnu strategiju hvatanja ili vezivanja za prečišćavanje vektora rAAV, mnoge nečistoće iz procesa su takođe zadržane sa apatit smolom pri pH 7.0. Bez želje za ograničavanjem sa teorijom, proteini prisutni u dovodnom toku pri baznoj pH (pH većoj od 7.0) bi imali veću verovatnoću da imaju neto negativno naelektrisanje i da budu odbijeni od strane negativno naelektrisanih mesta fosfatnog vezivanja prisutnih na apatit smoli, time smanjujući ukupni kapacitet vezivanja sa razmena katjona hromatografske smole. Uz datu prirodu pomešanog režima apatit smola, međutim, vezivanje putem privlačenja pozitivnog naelektrisanja i metalnog afiniteta i dalje se može dogoditi.

[0066] Boratni puferi su rutinski korišćeni u struci kao bazni puferski sistemi zbog njihovih poželjnih svojstava proizvodnje uključujući bez ograničenja lakoću pripremanja, optimalnu rastvorljivost, odličan puferski kapacitet i niske troškove. Stoga boratni pufer kao model baznog puferskog sistema procenjeni su za rAAV hvatanje na apatit smolama. Stručna osoba u ovoj oblasti može ceniti da se drugi bazni puferi mogu proceniti radi određivanja toga da li redukuju nivo vezivanja nečistoća iz procesa za apatit smole u prisustvu PEG. Drugi bazni puferi mogu biti testirani i upotrebljeni za rAAV hvatanje. U nekim slučajevima obelodanjivanja, pufer za punjenje apatita u odsustvu PEG sadrži boratni pufer. U poželjnim slučajevima ili otelotvorenjima, boratni pufer je formulisan pri pH između oko 8.0 i oko pH 9.9. U poželjnom slučaju ili otelotvorenju, boratni pufer je formulisan pri pH od oko 9.0. U poželjnim slučajevima ili otelotvorenjima, boratni pufer je pri koncentraciji između oko 5mM i oko 500mM. U još poželjnim slučajevima ili otelotvorenjima, boratni pufer je formulisan pri oko 20mM borata, pH 9.0. U nekim slučajevima ili otelotvorenjima, 20 mM boratni pufer pri pH 9.0 naročito redukuje hvatanje malih molekula nečistoća iz procesa na apatit smoli.

[0067] U nekim otelotvorenjima, dovodni tok je doveden u apatit smolu u puferu koji sadrži fosfat u prisustvu PEG mešanjem u liniji dovodnog toka sa fosfatnim puferom koji sadrži PEG pri dvostrukoj krajnjoj koncentraciji PEG. U nekim otelotvorenjima, pH fosfatnog pufera je između pH 6.5 i pH 7.0. U nekim otelotvorenjima, PEG je PEG6000. u nekim otelotvorenjima, koncentracija PEG6000 u puferu za dovođenje je između 3% (w/v) i oko 10% (w/v). U poželjnijim otelotvorenjima, koncentracija PEG6000 u puferu za dovođenje je

2

oko 5% (w/v). U nekim otelotvorenjima, koncentracija fosfata u puferu za dovođenje za apatit smolu je između 5mM i 500 mM.

[0068] U nekim otelotvorenjima, kapacitet vezivanja apatit smole u prisustvu PEG je pojačan relativno u odnosu na kapacitet vezivanja apatit smole u odsustvu PEG. U nekim otelotvorenjima, kapacitet vezivanja apatit smole za čestice vektora rAAV u dovodnom toku u prisustvu PEG pojačan je od oko jedan i po log do oko 10 log-ovo relativno u odnosu na kapacitet vezivanja apatit smole u odsustvu PEG. U poželjnim otelotvorenjima, kapacitet vezivanja apatit smole za čestice rAAV prisutne u dovodnom toku u prisustvu PEG je pojačan osam log-ova. U nekim otelotvorenjima, kapacitet vezivanja apatit smole za čestice vektora rAAV u dovodnom toku u prisustvu PEG je bar oko 10<6>čestica rAAV po ml smole do oko 10<16>čestica po ml smole (kao što je oko 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, 10<12>, 10<13>, 10<14>, 10<15>, 10<16>čestica po ml smole). U nekim otelotvorenjima, kapacitet vezivanja apatit smole u prisustvu PEG je oko 10<14>čestica po ml smole.

[0069] Dok ovaj iznenađujući kapacitet vezivanja približno od 10<12>-10<14>DRP rAAV-1 po ml apatit smole u prisustvu PEG omogućava visoko efikasno, ekonomično, prilagođavanje komercijalnog rAAV-1 prečišćavanja, stručnjak u ovoj oblasti će ceniti da kapacitet vezivanja predstavlja maksimalni broj rAAV-1 koji će se vezati po ml smole i nije namenjen da operativno ograničava okvir pronalaska. Zaista pronalazači cene da prikupljanje kultura vektora rAAV-1 koja sadrži manje od 10<14>-10<16>DRP rAAV-1 /ml može biti prečišćena sa predmetnim pronalaskom.

[0070] u nekim otelotvorenjima, čestice rAAV vezane za apatit okruženje isprane su pre eluiranja čestica rAAV iz smole. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao opadajuće koncentracije PEG kako bi se uklonile nečistoće iz procesa. U nekim otelotvorenjima, okruženje hromatografije sa apatitom isprano je jednom ili više puta sa puferom za ispiranje koji je sadržao između oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži bilo koju vrednost od 10% (w/v), 9.5% (w/v), 9% (w/v), 8.5% (w/v), 8% (w/v), 7.5% (w/v), 7% (w/v), 6.5% (w/v), 6% (w/v), 5.5% (w/v), 5% (w/v), 4.5% (w/v), 4% (w/v), 3.5% (w/v), i 3% (w/v) PEG. U nekim otelotvorenjima, apatit okruženje isprano je sa puferom za ispiranje koji sadrži PEG pri koncentraciji većoj od PEG koncentracije korišćene za omogućavanje vezivanja rAAV čestica za apatit okruženje. U nekim otelotvorenjima,

2

apatit okruženje je dalje isprano sa opadajućom koncentracijom PEG. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži pufere poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje sadrži pufer izabran iz grupe koju čine borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (HEPES) i Tris-HCl. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer je pri baznoj pH. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje ima pH između pH 7.0 i pH 10.0, između pH 7.2 i pH 10.0, između pH 7.4 i pH 10.0, između pH 7.6 i pH 10.0, između pH 7.8 i pH 10.0, pH 8.0 i pH 10.0, pH 8.2 i pH 10.0, između pH 8.4 i pH 10.0, između pH 8.6 i pH 10.0, između pH 8.8 i pH 10.0, između pH 9.0 i pH 10.0, između pH 9.2 i pH 10.0, između pH 9.4 i pH 10.0, između pH 9.6 i pH 10.0, ili između pH 9.8 i pH 10.0. U nekim otelotvorenjima, bazni pufer ima pH vrednost bilo koju od 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, ili 10.0. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži između 100 i 500 mM fosfata. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje dalje sadrži između 50 i 250 mM NaCl.

[0071] U nekim slučajevima obelodanjivanja, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u puferu pri niskim koncentracijama PEG. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, niske koncentracije PEG su između oko 2.9 (w/v) i oko 0.1% (w/v) PEG. U nekim slučajevima, uključujući neka otelotvorenja, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u puferu u odsustvu PEG. U nekim slučajevima ili otelotvorenjima, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u puferu u puferu koji sadrži fosfat u odsustvu PEG.

[0072] U nekim otelotvorenjima, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u puferu koji sadrži fosfat. U nekim otelotvorenjima, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u puferu koji sadrži fosfat pri koncentraciji između 0.1 mM do oko 500 mM (kao što je između 1 mM do oko 250 mM, između oko 10 mM do oko 100 mM). U nekim otelotvorenjima, vektori rAAV izolovani iz dovodnog toka hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG su eluirani u 50mM fosfatnom puferu.

[0073] Pronalazači predmetne prijave otkrili su da vektori rAAV prisutni u dovodnom toku mogu biti izolovani hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG. Međutim ukoliko su pomoćni virusi korišćen u kulturi za proizvodnju (kao što je adenovirus) prisutan u dovodnom toku primenjen na apatit smolu, oni su uhvaćeni sa apatit smolom u prisustvu PEG. Čestice vektora rAAV uhvaćene sa apatit smolom u prisustvu PEG mogu biti lako izolovane iz adenovirusa sa njihovim profilom eluacije u fosfatnim puferima. Čestice vektora rAAV vezane za apatit smolu u prisustvu PEG, eluiraju se, u odsustvu PEG u puferima koji sadrže ono liko malo kao što je 0 mM fosfata; gde su adenovirusne čestice pomoćnog virusa zadržane na apatit smolama pod koncentracijama fosfata korišćenim za eluiranje čestica vektora rAAV. Eksperimentalno, vektori rAAV su pronađeni da eluiraju jedan oštri maksimum u onoliko malo kao što je 50 mM fosfata u odsustvu PEG, gde je pomoćni virus kao što je adenovirus ukoliko je prisutan zadržan na smoli. U spike-in ispitivanjima u kojima su dovodni tokovi ubrizgani sa 8<9>čestica otpornih na DNazu (DRP) infektivnog adenovirusa i izloženi hromatografiji na apatit smoli u prisustvu PEG, rAAV vektori su uhvaćeni na apatit smoli i eluirani u 50 mM fosfatnog pufera u odsustvu PEG; dok je približno 4 log-ova adenovirusnih proteina zadržano na apatit smoli. U skladu sa time, u nekim otelotvorenjima, vektori rAAV prisutni u dovodnom toku su izolovani iz zagađujućeg pomoćnog virusa hvatanjem na apatit smoli u prisustvu PEG eluiranjem u fosfatnim puferima u odsustvu PEG. U nekim otelotvorenjima, fosfatni puferi su formulisani pri koncentracijama koje zadržavaju zagađujući pomoćni virus vezan za apatit smolu. U nekim otelotvorenjima, dva do osam logova adenovirusa je zadržano po ml apatit smole. U nekim otelotvorenjima, vektori rAAV prisutni u dovodnom toku izolovani su eluiranjem iz apatit smole u 0-500 mM fosfatnom puferu (kao što je 0-400 mM, 0-300 mM, 0-200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) pod uslovima koji zadržavaju pomoćni virus u apatit smoli.

[0074] Sistemi za proizvodnju poznati u struci za proizvodnju vektora rAAV mogu uključivati okruženje za proizvodnju koje sadrži serum u opsegu od 0.5%-20% (v/v) ili mogu biti lišeni seruma u potpunosti. U nastavku, šeme prečišćavanja opisane u struci mogu uključivati jedan ili više koraka koncentrovanja što se može ispoljiti u povećanju proteina seruma i drugih komponenata seruma u dovodnom toku primenjenom na apatit smolu. Na primer, supernatant kulture za proizvodnju kao što je ovde opisano koji je formulisan sa 1% (v/v) serumom je koncentrovan približno dvadeset puta u TFF koraku, tako da je dovodni tok napunjen u apatit smolu koja je sadržala onoliko mnogo kao što je 20% zagađivača proteina seruma u poređenju sa koncentratom dovodnog toka iz kulture za proizvodnju formulisanog bez seruma. Pronalazači predmetnog pronalaska testirali su postupke hvatanja na apatitu ovde date sa koncentracijama dovodnog toka iz kultura za proizvodnju formulisanim u prisustvu ili

1

odsustvu seruma. Prisustvo proteina seruma u dovodnom toku je pronađeno da nema uticaj na performanse koraka hromatografije sa apatitom.

Deaktivacija sa toplotom pomoćnog virusa (ubijanje sa toplotom)

[0075] Ukoliko se infektivni adenovirus koristi kao pomoćni virus kod kultura za proizvodnju za proizvodnju rAAV, opcioni korak deaktivacije sa toplotom (ubijanje sa toplotom) može biti uključen kako bi se deaktivirale bilo koje preostale adenovirusne čestice koje mogu biti prisutne u dovodnom toku. Korak ubijanja sa toplotom uzima prednost jedne od glavnih razlika između AAV i adenovirusa: čestice adenovirusa su deaktivirane pri temperaturi od približno 54-56°C, dok su čestice virusa AAV i rAAV stabilne i nepogođene sa tim temperaturama. U predmetnom obelodanjivanju, uključujući otelotvorenje predmetnog pronalaska, pronalazači su podesili korak deaktivacije sa toplotom kako bi se prilagodila optimizacija procesa u većoj razmeri kao što je 250L razmera kultura za proizvodnju koja se ovde vrši. Naročito, apatit eluat je deaktiviran sa toplotom u sterilnoj, kesi za bioprocesiranje od 5 L za jednu upotrebu na platformi koja se trese sa kontrolisanom temperaturom postavljenom na 53°C pri brzinama potresa između 40 RPM sa 12° uglom za mešanje (20L Wave posuda za zagrevanje). Apatit eluat je inkubiran na platformi dok nije dostigao 52°C i zatim je držan na toj temperaturi dodatnih 10 minuta. MgCl2je dodat u apatit eluat pri krajnjoj koncentraciji od 2 mM kako bi se stabilizovao vektor rAAV za vreme zagrevanja. Stručnjak u ovoj oblasti može ceniti da se razmera, krajnja postavljena tačka za zagrevanje i vreme zagrevanja mogu empirijski testirati kako bi se pronašli optimalni uslovi za deaktiviranje adenovirusnih čestica dok se održava neefikasnost i integritet čestica rAAV. Korak deaktivacija sa toplotom može biti izostavljen za prečišćavanje čestica rAAV iz kultura za proizvodnju koje koriste plazmidne konstrukte kako bi se pružile pomoćne funkcije.

Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom

[0076] Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC) je tehnika za odvajanje biomolekula zasnovana na razlikama u njihovoj površinskoj hidrofobnosti. Stoga, HIC se smatra ortogonalnim postupkom u odnosu na druge korake prečišćavanja u AAV procesu. Okruženje HIC hromatografije sadrži hidrofobne ligande kao što su ugljeni hidrati pravog lanca (npr., propil (C3), butil (C4), heksil (C6), ili oktil (C8)) ili aromatici (npr., fenil). U

2

čistoj vodi, hidrofobni uticaj je previše slab za funkcionalnu interakciju između liganda i proteina ili između proteina samih po sebi. Međutim, liotropne soli pojačavaju hidrofobne interakcije i dodavanje soli vodi hvatanje proteina za HIC okruženje. Iz ovog razloga, HIC smole su obično napunjene pod visokim koncentracijama soli i eluirane pri nižim koncentracijama soli. Kao što bi stručna osoba u ovoj struci cenila amonijum sulfat [(NH4)2SO4] je najčešće korišćena so za kontrolisanje hvatanja proteina putem HIC hromatografije, zbog visokog liotropnog rangiranja oba, amonijumovih i sulfatnih jona u Hofmeister nizu i visoke rastvorljivosti soli. U predmetnom obelodanjivanju, čestice rAAV prisutne u dovodnom toku napunjene su u HIC smolu mešanjem u liniji sa odnosom 75:25 (zapremina:zapremina) 2 M amonijum sulfat 50 mM BisTris pufer (pH 7.0):dovodni tok, respektivno. Mešanje u liniji dovodnog toka sa dovođenjem pufera izbegava rizik da se bilo kakav talog vektora rAAV sa visokom koncentracijom amonijum sulfata pojavi u puferu. Kao što će stručna osoba u ovoj oblasti ceniti koncentracija soli (amonijum sulfat) može biti manipulisana kako bi se postigla optimalna koncentracija vezivanja rAAV. U skladu sa time, u nekim slučajevima, koncentracija amonijum sulfata je između 1 M i 3 M. U nekim poželjnim slučajevima, koncentracija amonijum sulfata u dovedenom puferu je 2 mM. Kao što stručna osoba u ovoj oblasti može ceniti, mešanje u liniji amonijum sulfata i dovodni tok vrše se radi pogodnosti i protoka jedinične radnje, ali bi se lako mogao pomešati dovodni tok sa odgovarajućom koncentracijom pufera za dovođenje bilo kojim sredstvom poznatim u struci i zatim vođenje dovodnog toka pufer za dovođenje u okruženje HIC hromatografije.

[0077] Ko-solvati takođe mogu uticati na hidrofobnu interakciju. Na primer, etilen ili propilen glikol mogu smanjiti interakciju između proteina i imobilizovanog liganda i time biti od koristi pri poboljšanju profila eluiranja. U skladu sa time, HIC kolona je isprana sa 75:25 (v:v) smešom 2M amonijum sulfata 50mM BisTris pufera (pH 7.0):50mM BisTris (pH 7.0) 10% Propilen Glikol (v:v) pufer (EMD BioSciences) i rAAV je eluiran u puferu sa niskim sadržajem soli plus propilen glikol (800 mM amonijum sulfat 50mM BisTris pufer (pH 7.0) 4% propilen glikol. Pod ovim uslovima eluiranja, bilo koji preostali pomoćni virusi i proteini prisutni u dovodnom toku napunjeni u koloni bi ostali vezani za kolonu. Propilen Glikol u ovom primeru dodat je u pufere kako bi pooštrio profil eluiranja, u poređenju sa širokim profilom eluiranja pufera bez Propilen Glikola, ali ovo je opciono u procesu.

[0078] Primeri pogodnih hidrofobnih smola uključuju bez ograničenja Tosoh Butil 650 M, Tosoh SuperButil 650C, Tosoh Fenil 650C i EMD Fraktogel Fenil (Tosoh Bioscience LLC, PA)

[0079] Otpad iz procesa proizvodnje rAAV zahteva strogu dekontaminaciju pre odlaganja iz bar dva razloga: (1) proizvod sadrži virusni vektor; i (2) kulture za proizvodnju obično koriste živi adenovirus tipa 5 (Ad5) kao pomoćni virus za rAAV proizvodnju. Tečni otpad iz rada hromatografije obično se prvo dekontaminira sa izbeljivačem do tačke upotrebe a zatim prolazi dalju dekontaminaciju držanjem pri visokoj pH pre neutralizacije i odlaganja.

[0080] Prisutni amonijum sulfat u HIC puferima reaguje sa oba, izbeljivačem i natrijum hidroksidom kako bi se oslobodili opasni gasovi hlor i amonijak, respektivno. Stoga, primarno razmatranje za optimizaciju procesa koraka HIC hromatografije je razvijanje pogodnog sistema pufera koji bi se mogao bezbedno dekontaminirati sa postupcima poznatim u struci.

[0081] Kao što stručna osoba u ovoj oblasti može ceniti, puferi sa visokim koncentracijama soli korišćeni u hromatografija sa hidrofobnom interakcijom moraju biti dalje provereni za probleme viskoznosti što se može ispoljiti u visokim zaostalim pritiscima koji mogu ili ograničiti protok ili izazvati probleme pri mešanju, time povećavajući rizik taloženja proizvoda sa kristalizacijom soli u puferima što se dešava pri temperaturama korišćenim za skladištenje ili rad. Na osnovu podataka u Tabeli 6 ispod i razmatranja faktora opisanih iznad, pronalazači su izabrali 1 M natrijum citrat (pH 7.0) kao optimalni pufer za vezivanje vektora rAAV za okruženje HIC hromatografije, iako citratni puferi mogu biti korišćeni u hromatografija sa hidrofobnom interakcijom pri koncentracijama u rasponu od 0.5 M do 2.0 M.

Razmena pufera sa hromatografijom sa isključivanjem po veličini (SEC)

[0082] Brojni postupci poznati su u struci za vršenje ovde opisane razmene pufera, uključujući TFF i dijalizu. Upotreba hromatografije sa isključivanjem po veličina ima dodatne prednosti pružanja dodatnog čišćenja proteina onih proteina veličine koji mogu proći kroz pore u smoli i koji su relativno brzi u pogledu neophodnog vremena za razmenu pufera. Razmena pufera je izvršena u ovom koraku kako bi se osiguralo da je HIC eluat iz

4

prethodnog koraka razmenjen u odgovarajući pufer za vezivanje rAAV za krajnji korak hromatografija sa razmenom anjona u procesu.

Pomoćno sredstvo (virusno čišćenje)

[0083] Opciono, sledeći korak za uklanjanje tragova zagađivača, kao što su sporedni virusi koji mogu biti prisutni u dovodnom toku, može biti uključen u proces, time dajući komercijalno razuman ortogonalni proces. Stoga, u nekim slučajevima ili otelotvorenjima, proces dalje uključuje filter za virusno čišćenje. Primeri takvih filtera poznati su u struci i uključuju Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm), i Asahi 70 nm.

Hromatografija sa razmenom anjona

[0084] Korak hvatanja sa razmenom anjona za vektore rAAV izložene hromatografiji sa apatitom izvršen je kao krajnja koncentracija i korak usavršavanja. Pogodna okruženja za hromatografija sa razmenom anjona poznata su u struci i obuhvataju bez ograničenja, Unosphere Q (Biorad, Hercules, California), i N-naelektrisane amino ili imino smole kao što su npr., POROS 50 PI, ili bilo koji od DEAE, TMAE, tercijarnih ili kvaternarnih amina ili PEI-zasnovane smole poznate u struci (patent SAD br.6,989,264; N. Brument i dr., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); G. Gao i dr., Hum. Gene Therapy 11:2079-2091 (2000)). Stručnjak u ovoj oblasti može ceniti da se puferi za ispiranje pogodne jonske snage mogu identifikovati tako da rAAV ostaje vezan za smolu dok su druge nečistoće iz procesa uključujući bez ograničenja glukane koji mogu biti uvedeni ispiranjem iz različitih filtera korišćenih u koracima prečišćavanja uklonjene. U nekim otelotvorenjima, pufer za ispiranje je 60 nM NaCl i vektor rAAV je eluiran iz kolone sa 130 mM NaCl tako da su preostali prisutni tragovi nečistoća iz procesa , kao što su serum albumin ili pomoćni virus zadržani na koloni.

PRIMERI

Primer 1: Prikupljanje rAAV-1 iz čišćenja okruženja kulture & Benzonase® razlaganja

[0085] Potrošeno rAAV-1 okruženje za proizvodnju (supernatant) iz 250 L kulture za proizvodnju virusnog rAAV-1 proizvedeno sa bilo kojim postupkom poznatom u struci koja sadrži rAAV-1 vektor je prečišćena kako bi se uklonile bilo kakve ćelije sadržane u supernatantu. Supernatant je pušten kroz niz filtera spojenih u niz, uključujući: (1) Millipore Millistak+® HC Pod Filter, Grade D0HC (Millipore Corp., Bedford, MA)(4 puta); (2) a Millipore Millistak+® HC Pod Filter, Grade A1HC; i (3) Opticap® XL10 Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane 0.2 µm Filter pri brzini od 5 litara po minutu (LPM) što je postepeno redukovano do 4 LPM.

[0086] Filteri su prethodno isprani u vodi sa reverznom osmozom/de-jonizacijom („RO/DI") prema uputstvima proizvođača. Protok je sakupljen u kesu za bioprocesiranje za Benzonase® razlaganje. Krajnja koncentracija od 2 jedinice/ml Benzonase® (EM Industries kataloški broj 1.01695.0002) je rastvorena u okruženju za proizvodnju rAAV-1 i dodata u prečišćeni virusni supernatant kako bi se dostigla krajnja koncentracija od 2.5 jedinica/ml. Supernatant plus Benzonase® su inkubirani pri temperaturi okoline sa konstantnom recirkulacijom pri 4 LPM kako bi se omogućilo razlaganje DNK. Podaci iz Benzonase® razlaganja prikazani su na Slici 1, što prikazuje da DNK sa visokom molekulskom masom nije bila prisutna nakon Benzonase® razlaganja.

Primer 2: Uklanjanje zagađivača proizvoda putem anjonske razmene

[0087] rAAV-1 prečišćeni i Benzonase® razgrađeni supernatant iz Primera 1 pušten je kroz niz dva inča sa dvadeset dva inča Pall Mustang® Q („MQ“) filtera povezanih u nizu (Pall Corp., kataloški broj NP6MSTGQP1). Pre punjenja rAAV-1 virusnog, supernatanta filteri su sanirani sa 15 L 0.5 M NaOH pri 0.5 LPM sa vremenom zadržavanja od 15 minuta, naelektrisani sa ispiranjem sa 15 L TMEG 2M NaCl (TMEG: 0.05 M Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM 2-merkaptoetanol, 1 mM Na2EDTA, 10% (v/v) glicerol) pri brzini od 6 LPM, i uravnoteženi sa 15 L okruženjem za proizvodnju vektora pri 6 LPM. Supernatant je zatim pumpan pri brzini približno od 6 LPM kroz niz filtera i sakupljen je u kese za bioprocesiranje. Pri jonskoj snazi okruženja za proizvodnju, MQ filter sa anjonskom razmenom pokazan je da čisti pomoćni virus i preostalu DNK, između ostalih nečistoća iz rAAV-1 supernatanta vezivanjem zagađivača za naelektrisanu membranu. Pri jonskoj snazi kulture za proizvodnju, međutim, rAAV-1 vektor prisutan u supernatantu proticao je kroz membranu sa razmenom anjona. Za vreme trajanja procesa optimizacije određeno je eksperimentalno da se upotreba pojedinačnog MQ filtera ispoljila u probijanju zagađivača iz procesa, uključujući Ad5 pomoćni virus. Kao posledica, drugi filter je dodat u nizu ili zajedno u procesu.

Primer 3: Koncentrovanje supernatanta vektora rAAV-1

[0088] Potpuni supernatant za proizvodnju vektora rAAV-1 obrađen u Primerima 1 i 2 je koncentrovan približno 20 puta putem filtracije tangencijalnog protoka („TFF“) iz početne zapremine od približno 250 L do zapremine od približno 12.5 L. Kertridž polietersulfon filtera tangencijalnog protoka sa 100 kD prekidanjem molekulske mase, C sitom i 5 m<2>ukupnom površinom (Millipore Pellicon® 2 Biomax, kataloški br. P2B 100C05) je ispran sa 50 L RO/DI vodom, saniran sa 15 L 0.5 M NaOH sa 15 minuta korakom zadržavanja, opet ispran sa 100 L WIFI (HyPure™ WFI prečišćena voda; HyClone, Logan, UT), ispran sa 15 L TMEG 2M NaCl i na kraju uravnotežen 15 L okruženja za proizvodnju rAAV-1.

Supernatant je pušten kroz TFF kertridž pri protoku od približno 3 LPM sa brzinom recirkulacije od 16 LPM. TFF materijal zadržan na filteru („retentat“) je koncentrovan do približno 10.5 L i prenet je u rezervoar. Filter je ispran sa približno 2 L okruženja za proizvodnju. Sredstvo za ispiranje i koncentrat su objedinjeni kako bi se dobila krajnja zapremina od približno 12.5 L.

[0089] Koncentrovanje rAAV-1 do zapremine od 12.5 L sa TFF takođe je koncentrovalo preostale zagađivače proizvodnje rAAV-1 u rastvoru približno 20 puta. Stoga, korak zadržavanja proizvodnje je uveden nakon TFF koraka, za vreme koga je TFF koncentrat filtriran kroz Opticap 0.22 µM filtersku membranu od 4 inča (Millipore Opticap® kataloški br. KVSC04HB3). Ovaj dodatni korak filtracije omogućava TFF koncentratu koji sadrži rAAV-1 da dođe do sledećeg koraka u procesu bez potrebe za diafiltracijom i razmenom pufera. Post-TFF materijal može biti skladišten pri 2-8°C za bilo koji vremenski period uključujući kao što je 24 do kao što je 3 meseci ili više, pre daljeg procesiranja bez gubitka u stabilnosti kao što je mereno sa prinosom vektora ili neefikasnosti procenjenom sa testovima poznatim u struci. Alternativno, TFF izvršen kao što je ovde opisano može se koristiti u bilo kom koraku u procesu prečišćavanja kako bi se izvršila koncentracija ili razmena pufera rAAV-1 vektora.

Primer 4: Proveravanje smole za vektor rAAV-1 u poređenju sa vezivanjem nečistoća procesa

[0090] Komercijalni FDA-odobreni procesi za prečišćavanje proteina i drugih bioloških proizvoda oslanjaju se na inkorporaciju ortogonalnih procesa u komercijalnoj razmeri.

Ortogonalni procesi su procesi koji imaju jedan ili više korak ili procesa za uklanjanja nečistoća iz procesa, uključujući oba koraka, hvatanje i protok za krajnju proizvod kao što je, na primer, rAAV-1 vektor. Vektori rAAV (naročito rAAV-2) su pokazali u struci da vezuju anjonske smole. rAAV vektori kao što su rAAV-1, -5 i -8 pokazali su da se mnogo uže vezuju od rAAV-2 za okruženje sa razmenom anjona u prisustvu komponenta proizvoda kao što je serum albumin, komponente pomoćnog virusa, komponente okruženja za proizvodnju i DNK ćelije domaćina, što se ispoljava u manje efikasnoj i šemi prečišćavanja nižeg kvaliteta.

[0091] Prethodne strategije prečišćavanja opisane u struci za anjonske veznike nižeg afiniteta kao što je AAV-1 uključene u gradijentu koraka jodoksinola što smanjuje relativnu koncentraciju kao što su zagađivači kulture za proizvodnju i nečistoće iz procesa, kako bi se postiglo uže vezivanje vektora rAAV za anjonske razmenjivače. Gradijent koraka jodoksinola nije lako prilagodljiv za procese komercijalne razmere kao što su oni ovde opisani. Stoga, u cilju optimizovanja prečišćavanja vektora rAAV za anjonske veznike niskog afiniteta kao što je rAAV-1 bez potrebe za vršenjem ultra centrifugiranja i koraka gradijenata, više smola je provereno za njihovu sposobnost da vežu vektore rAAV ili isključe vektore rAAV u protoku u poređenju sa sposobnošću da se vežu ili teku kroz obično osmotrene nečistoće procesa uključujući DNK ćelije, pomoćni virus, serum albumin, proteine seruma (ukoliko je serum uključen u okruženje za proizvodnju) i druge proteine sa niskom molekulskom masom koji se pronalaze u kulturama za proizvodnju u cilju razvijanja efikasnog procesa za prečišćavanje rAAV, ortogonalnog i u komercijalnim razmerama.

[0092] Proveravanje smole je izvršeno upotrebom 1 ml (sloj visine 5 cm) kolone sa linearnim protokom preporučenom od strane prodavca za svaki smolu pri značajno manjim kapacitetima relativno u odnosu na preporuke proizvođača. Spektrofotometrijsko praćenje ultraljubičaste apsorbancije pri 280 nanometara (A280) je sakupljeno za vezivanje za i eluiranje iz svake smole. Vrhovi su analizirani sa odgovarajućim testom za oba rAAV-1 vektor i reprezentativne nečistoće procesa. Podaci prikazani na Slici 2 predstavljaju obično spektrofotometrijsko praćenje za običnu smolu na listi. Tabela 2 nabraja neke od smola proverenih kao i relativne afinitete smola za rAAV vektore i različite nečistoće procesa.

Tabela 2: Proveravanje smola za vezivanje rAAV-1 u poređenju sa vezivanjem zagađivača iz procesa.

Primer 5: Razvijanje hromatografije sa apatitom u prisustvu polietilen glikola („PEG“) za hvatanje rAAV-1

[0093] Na osnovu rezultata proveravanja smole izvršenog u Primeru 4, apatit smola ili keramička apatit smola izabrana je kao smola za hvatanje rAAV-1. Početni eksperimenti izvršeni su upotrebom CFT II smola ali za kasnije prečišćavanje smola je promenjena u CHT I, kao što je detaljno razmatrano ispod. Podaci ukazuju da su se obe hromatografske smole pokazale jednako. Eksperimenti su izvršeni kako bi se dalje povećao kapacitet vezivanja rAAV-1 apatit smole i poboljšala sposobnost smole da se diskriminiše između rAAV-1 čestica i drugih nečistoća iz procesa. Dva ključna poboljšanja funkcije apatit smola su dalje razvijena kao što je ovde opisano: 1) dodavanje PEG; i 2) razvijanje uslova za punjenje pufera.

[0094] Na osnovu varijabilnog probijanja apatit kolone usled problema sa kapacitetom kod komercijalno razumnih veličina kolona, PEG je pomešan sa TFF koncentratom (videti Primer 3 iznad) pre punjenja u apatit smolu u cilju povećanja vezivanja vektora rAAV-1 relativno u odnosu na nečistoće iz procesa kao što su serum albumin, pomoćni virus i druge nečistoće proteina koje su završile vektor rAAV-1 za vezivanje za kolonu u Primeru 4.

[0095] Hromatografija sa apatitom u prisustvu PEG predstavlja efikasnu strategiju hvatanja ili vezivanja za prečišćavanje vektora rAAV, mnoge nečistoće iz procesa su takođe zadržane sa apatit smolom pri pH 7.0.

4

[0096] Izvršeni su eksperimenti za određivanje ukoliko modifikovanje uslova puferisanja može poboljšati ponovno rastvaranje rAAV-1 iz drugih nečistoća iz procesa. Eksperimenti u maloj razmeri izvršeni su upotrebom AKTAexplorer FPLC sistema (GE Healthcare, Piscataway, NJ) opremljenog sa 1.2 mL Tricorn 5 kolonama (GE Healthcare) pakovanih pri sloju visine 6 cm sa CFT smolom, i pušteni u rad sa protokom od 150 cm/h. Ove kolone procenjene su za hvatanje vektora rAAV-1 u poređenju sa vezivanjem goveđeg serum albumina („BSA“), model malih molekula nečistoća iz procesa, u različitim sistemima pufera u prisustvu ili odsustvu 5% PEG6000.

[0097] rAAV-1 ili BSA je ubrizgan u malim zapreminama (<5% ukupne zapremine) na CFT koloni u puferskom sistemu koji se testira ili u prisustvu ili odsustvu 5% (w/v) PEG6000. Male zapremine korišćene su u cilju uklanjanja potrebe za razmenom pufera kod uzoraka. Proizvodi su eluirani duž 500 mM PO4gradijenta.50 mM 2-(N-morfolino) etansulfonska kiselina („MES“) je korišćena za puferisanje sistema pri pH=6.50, i 20 mM borat je korišćen za puferisanje sistema pri pH 9.0.

[0098] Podaci predstavljeni u Tabeli 3 demonstriraju da je vezivanje vektora rAAV-1 za apatit smolu suštinski isto pri pH 6.5 ili pH 9.0 u prisustvu 5% (w/v) PEG6000 dok je vezivanje BSA, model malih molekula nečistoća iz procesa, bilo dramatično redukovano pri pH 9.0 u prisustvu ili odsustvu 5% (w/v) PEG6000 kao što je ukazano sa spektrofotometrijskim obeležavanjem (podaci nisu prikazani). Dalja analiza redukovanog kapaciteta BSA za vezivanje za apatit kolonu pri osnovnim uslovima punjenja pufera (tj., pH=9.0) sa testom imunosorbenta vezanog sa enzimom („ELISA“) pokazala je da je većina BSA (∼78%) bilo prisutno u protoku pri uslovima pufera pH 9.0, dok bi dodatni nivoi čišćenja ili redukovanja BSA vezivanja mogli biti postignuti za vreme sledećeg koraka ispiranja (-19%), što ostavlja samo ∼0.1 % BSA napunjenog u kolonu koja se stvarno vezuje za apatit smolu i ko-eluira sa vektorom rAAV-1. Čestice rAAV-1 su stabilne pri pH=9.0, kao što je ukazano sa ne manje od neefikasnosti ili smanjenja broja čestica otpornih na DNazu („DRP“) koje su eluirane.

Tabela 3: Relativna snaga vezivanja rAAV-1 i BSA za apatit smolu pri pH=6.5 ili pH=9.0, sa ili bez 5% (w/v) PEG6000

Primer 6: Uticaj seruma u rAAV-1 kulturu za prikupljanje na rAAV-1 hvatanju putem hromatografije sa apatitom u prisustvu PEG

[0099] Kulture za proizvodnju rAAV-1 vektora ili dovodni tok koji sadrži rAAV-1 koji se prečišćava sa postupcima ovde opisanim može sadržati serum i proteine seruma ukoliko su kulture za proizvodnju gajene u okruženju koje sadrži serum. Dok je proizvodnja vektora rAAV-1 koja koristi veoma niske koncentracije seruma (tj., 1% ili manje)(videti, npr., patent SAD. br.6,995,006) opisana, koncentracija kulture za proizvodnju ili dovodnog toka kao što je opisano u Primeru 3 može proizvesti dovodni tok koji efikasno sadrži 20% seruma i proteina seruma kao rezultat koncentrovanja 20 puta prikupljanja kulture za proizvodnju. U cilju procenjivanja uticaja komponenata seruma na performanse hromatografije sa apatitom izvršeni su eksperimenti na kulturama za proizvodnju proizvedenim u prisustvu ili odsustvu seruma, u prisustvu ili odsustvu PEG6000.

[0100] Dva modela kultura za proizvodnju rAAV-1 su korišćena za procenjivanje kapaciteta apatit smole (CFT tip I) sa tradicionalnom analizom probijanja u ukupno četiri eksperimenta punjenja kolone. U jednom eksperimentu, kulture za proizvodnju sadržale su serum; i u drugom eksperimentu kultura za proizvodnju nije sadržala serum. Oba dovodna toka su testirana u prisustvu 5% (w/v) PEG6000 ili u odsustvu PEG. Dovodni tokovi su reprezentativni za proces prikupljanja i bili su supernatanti prečišćene kulture koja je puštena kroz filter sa razmenom anjona i koncentrovana 20 puta filtracijom sa tangencijalnim protokom kao što je ovde opisano. Kolone CFT tip I su napunjene sa 1:1 mešanjem na liniji sa dovodnim tokom sa boratnim puferom pri pH=9.0. Pufer koji je sadržao ili 0% ili 10% (w/v) PEG6000 (kako bi se dostigla krajnja koncentracija od 5% (w/v) PEG6000). Kako su kolone napunjene, protok je sakupljen u nizu frakcija koje su analizirane za proizvod sa DRP-PCR. Funkcionalni kapacitet je definisan kao tačka pri kojoj je koncentracija proizvoda na izlazu iz kolone tek dostigla 1% koncentracije na ulazu u kolonu, nakon razblaženja na liniji. Za punjenja kolone koja su sadržala PEG, preostali deo procesa hromatografije je zatim pokrenut kako bi se procenilo vraćanje vektora u frakcijama eluiranja.

[0101] Podaci prikazani na Slici 3 demonstriraju da dodavanje PEG6000 povećava kapacitet apatit smole za vezivanje vektora rAAV-1 bez obzira da li je serum prisutan u kulturi za proizvodnju. Bez želje za ograničavanjem sa teorijom, post-TFF supernatant u prisustvu PEG poželjno vezuje rAAV-1 za apatit smolu preko drugih nečistoća iz procesa putem anjonske interakcije sa fosfatnim delovima koji mogu biti izrađeni u prisustvu fosfata u puferu za eluiranje. Dodatno, vezivanje rAAV-1 za apatit smolu je dalje diskriminisano iz nečistoća iz procesa putem metalne interakcije što se može izraditi sa prisustvom soli. Vezivanje rAAV-1 za fosfatne delove nije primarno vođeno sa hidrofobnosti, kako su hvatanje i puferom za eluiranje formulisani da budu primarno jonski u prirodu (tj., pufer za eluiranje sadrži 50 mM fosfata, u poređenju sa puferima za eluiranje koji sadrže 150 mM fosfata ili više koji se obično koriste u sastavima za eluiranje vezanim primarno sa hidrofobnim interakcijama). Pod ovim uslovima sa visokim sadržajem soli, niskim sadržajem fosfata, preostali pomoćni virus, DNK ćelije domaćina i drugi proteini sa niskom molekulskom masom sadržani u supernatantu kulture za proizvodnju bi, ukoliko su prisutni, bili zadržani na smoli.

Iznenađujuće, podaci demonstriraju da prisustvo PEG6000, vektora rAAV-1 proizvedenih ili sa sadržajem seruma ili bez seruma demonstrira kapacitet vezivanja za apatit smole od bar 1.2×10<12>DRP/mL (1mL punjenje) do više od 1.5×10<14>DRP/mL smole (150mL). U odsustvu 5% (w/v) PEG6000, kapacitet vezivanja apatit smole za TFF prikupljanje je manji od 2.4×10<12>DRP/mL za vektore proizvedene u okruženju koji sadrži serum i 7.2×10<12>DRP/ml za vektore proizvedene u okruženju koje ne sadrži serum, kako vektor rAAV-1 nije dobijen u CFT eluatu.

Primer 7: Prečišćavanje rAAV-1 putem hromatografije sa apatitom

[0102] Kolona CHT tipa I je napunjena sa 2 M NaCl i sanirana sa 1 M NaOH. Pre punjenja, kolona je uravnotežena sa 6 zapremina kolone 20 mM borata (pH = 9) 5% (w/v) PEG6000. TFF koncentrat dovodnog toka je napunjen preko 3mm BioProcess Skid (GE Healthcare) u 923 ml (14 cm prečnik × 6 cm visina sloja) CHT kolonu pripremljenu kao što je prethodno opisano pri protoku 96 cm/h. Koncentrat dovodnog toka je pomešan u liniji sa

4

jednakom zapreminom 40 mM boratnog (pH = 9) 10% (w/v) PEG6000 pufera kako bi se dobila krajnja koncentracija od 20 mM borata (pH = 9) 5% (w/v) PEG6000.

[0103] Niz od 4 uzastopna ispiranja je izvršen kako bi se uklonile nečistoće iz procesa dok se zadržavao vektor rAAV-1 u koloni. Sredstvo za ispiranje 1 („razblaženje“) je izvršeno mešanjem u liniji 5 CV 50:50 (zapremina:zapremina) 20 mM borata (pH = 9.0) 5% (w/v) PEG6000:40 mM borat (pH = 9.0) 10% (w/v) PEG6000 kako bi se razblažile sve linije za punjenje sa PEG6000. U nastavku, ovaj korak je pronađem da poželjno povećava afinitet vezivanja vektora rAAV-1. Sredstvo za ispiranje 2 je izvršeno sa 15 CV 150 mM kalijum fosfatom 20 mM borat (pH = 9) 5% (w/v) PEG6000 kako bi se uklonila većina serum albumina i drugih proteina niske molekulske mase nečistoća iz procesa dok se zadržava rAAV-1 u koloni. Sredstvo za ispranje 3 („WII“ na Slici 5) je izvršeno sa 15 CV 20 mM borata (pH = 9) 5% (w/v) PEG6000 kako bi se uklonio preostali fosfat tako da je rAAV-1 ostao vezan za kolonu nakon što je PEG6000 uklonjen. Sredstvo za ispiranje 4 („WIII“ na Slici 5) je izvršeno sa 5 CV 20 mM HEPES (pH = 7.0) 150 mM NaCl pufer kako bi se uklonio PEG6000 i kako bi se podesila slana koncentracija, time omogućujući diskriminaciju između rAAV-1 i bilo kog preostalog pomoćnog virusa ili drugih nečistoća iz procesa, kao što su zagađivači proteini, koji mogu ostati vezani za kolonu.

[0104] Vektor rAAV-1 je eluiran iz kolone sa 6 CV of a 50 mM kalijum fosfatom 20 mM HEPES (pH = 7.0) 150 mM NaCl puferom. Slika 4 prikazuje uobičajeni spektrofotometrijski trag UV apsorbancije pri 280 nm (A280) i provodljivosti za CHT I hromatografsku proceduru. Slika 5 prikazuje relativnu čistoću vektora rAAV eluiranih iz apatit smole.

Prečišćavanje glukana sa hromatografijom sa apatitom

[0105] Glukani su ugljeni hidrati slični celulozi koji ulaze u proces iz dubokog filtera zasnovanog na celulozi korišćenog za sakupljanje čestica rAAV-1 iz kultura za proizvodnju. Glukani pri koncentracijama iznad ∼1 ng/mL mogu reagovati sa standardnim Limulus amoebocit lizat („LAL“) testovima za bakterijsko zagađenje endotoksinom. Kao što je prikazano na Tabeli 4 ispod, apatit CHT tip I kolona je uklonila ∼2.5 log-ova glukana iz kulture za proizvodnju. Pod uslovima pufera ovde opisanim, velika većina glukana je prisutna u protoku i nije se vezala za kolonu.

Tabela 4: Prečišćavanje glukana u procesu

Uzorci su testirani za glukan upotrebom LAL-zasnovanog testa kinetičke hromatografije specifičnog za glukane (Glucatell®, Cape Cod, MA).

Prečišćavanje Ad5 pomoćnog virusa sa hromatografijom sa apatitom

[0106] Za potvrđivanje da je CHT hromatografija ispraznila Ad5 iz dovodnog toka, preliminarno in-spike ispitivanje je izvršeno upotrebom dovodnog toka iz krajnjeg uzvodnog procesa. Nivoi ubrizgavanja Ad5 su postavljeni na osnovu podataka dobijenih iz faze I ispitivanja virusnog čišćenja sa CFT II smolama, i tri različita odnosa punjenja dovodnog toka su korišćena: 6.6 mL; 13.5 mL; i 33 mL post-TFF dovodnog toka po mL CHT smole.

[0107] Podaci predstavljeni u Tabeli 5, Ad5 čišćenje sa CHT je uporedivo sa 4 LRV čišćenjem demonstriranim približno 4 log-ova Ad5 virusnog čišćenja i deluju da su nezavisni od zapremine napunjenog dovodnog toka, u granicama procenjenog okvira od 5 puta. Nisko vraćanje Ad5 je u skladu sa prethodnim podacima što ukazuje da se pod korišćenim uslovima pufera Ad5 uže vezuje od rAAV-1 za apatit smolu.

Tabela 5: Ukupan broj infektivnih jedinica Ad5 u frakcijama CHT kolone

4

[0108] Ukupno 8×10<9>infektivnih čestica Ad5 (tj., ukupno čestica sa P:I ∼10) je ubrizgano u različite zapremine post-TFF dovodnog toka kako bi se pustile na 1.2 mL CHT kolonama. Kolone su puštene pri 100 cm/h i frakcije su sakupljene kako bi se testirao vektor sa DRP i Ad5 sa infektivnim testom titracije. Verzija kontrolisana ubrizgavanjem Ad5 infektivnog testa je korišćena kako su visoke koncentracije oba, uzorka punjenja i CHT eluiranja poznate da reaguju u test zasnovanom na ćeliji. Čišćenje Ad5 je određeno kao Log redukovana vrednost („LRV“) izračunata kao logaritam ukupne količine napunjenog Ad5 podeljen sa ukupnim brojem dobijenog Ad5 u frakciji eluiranja (Log redukovana vrednost).

Primer 8: Deaktivacija sa toplotom preostalog pomoćnog virusa

[0109] Korak deaktivacije sa toplotom je izvršen u cilju deaktiviranja i uklanjanja bilo kojim preostalih pomoćnih virusa prisutnih u CHT I eluatu. Za eksperimente manje razmere, CHT I eluat je podeljen između dve 1 L PETG (Nalgene®) flaše i MgCl2je dodat do krajnje koncentracije od 2 mM u cilju povećanja stabilnosti vektora rAAV-1. Boce su inkubirane u 53.5°C vodenoj kupki uz mešanje dok temperatura nije dostigla približno 52°C. Flaše su zatim ohlađene prenošenjem u vodenu kupku na temperaturi okoline i mešane dok temperatura u flaši nije bila veća od 5°C iznad temperature okoline. Smeša ubijena sa toplotom je filtrirana kroz 4-inča Opticap® 0.22 µM filtersku membranu (Millipore Opticap® kataloški broj KVSC04HB3). Alternativno, za eksperimente veće razmere, CHT I eluat je deaktiviran toplotom u sterilnoj kesi za bioprocesiranje za jednu upotrebu (Custom Hyclone 5 L kesa, CX5-14 film) na platformi koja se trese sa kontrolisanom temperaturom sa temperaturom podešenom na 53°C pri brzini potresa od 40 RPM i uglom mešanja od 12° (20 L wave posuda za zagrevanje). CHT I eluat je inkubiran na platformi dok nije dostigao 52°C i zatim je držan na toj temperaturi dodatnih 10 minuta. Radi stabiliziranja rAAV-1 za vreme zagrevanja, MgCl2je dodat do 2 mM krajnje koncentracije. Nakon zagrevanja, proizvod je filtriran kroz 0.2 µm filter i držan preko noći pri temperaturi okoline kako bi se minimizirali mogući uticaji temperature na sledeću kolonu sa hidrofobnom interakcijom.

4

Primer 9: Hvatanje rAAV-1 putem hromatografija sa hidrofobnom interakcijom

[0110] HIC je tehnika za odvajanje biomolekula zasnovana na razlikama u njihovoj površinskoj hidrofobnosti. Kao takva, HIC se smatra ortogonalnim postupkom u odnosu na druge korake prečišćavanja u rAAV-1 procesu. Okruženje HIC hromatografije sadrži hidrofobne ligande kao što su ugljeni hidrati pravog lanca (npr., propil (C3), butil (C4), heksil (C6), ili oktil (C8)) ili aromatici (npr., fenil). U čistoj vodi, hidrofobni uticaj je previše slab za funkcionalnu interakciju između liganda i proteina ili između proteina samih po sebi. Međutim, liotropne soli pojačavaju hidrofobne interakcije i dodavanje soli vodi adsorpciju proteina za HIC okruženje. Iz ovog razloga, HIC smole su obično napunjene pod visokim koncentracijama soli i eluirane pri nižim koncentracijama soli.

HIC hromatografija sa amonijum sulfat puferima

[0111] Ukratko, 170 ml (6 cm prečnik × 6 cm visina sloja) HIC butil kolona (Toyopearl® Butil 650M; Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA; Kataloški broj 14702) je sanirana sa nekoliko zapremina kolone 0.5 M NaOH i uravnotežena sa 75:25 (zapremina:zapremina) smešom 2 M amonijum sulfata 50 mM Bis Tris (pH = 7.0):50 mM Bis Tris (pH = 7.0). Apatit eluat vektora rAAV-1 ubijen sa toplotom je napunjen pri brzini od 3.3 L/h sa mešanjem u liniji pri 75:25 (zapremina:zapremina) odnosom 2 M amonijum sulfata 50 mM Bis Tris (pH = 7.0):rAAV-1 apatit eluata. Mešanje u liniji izbegava rizik da se bilo kakav vektora rAAV istaloži sa amonijum sulfatom u puferu. Kolona je isprana sa jednom ili više zapremina kolone 75:25 (zapremina:zapremina) 2 M amonijum sulfata 50 mM Bis Tris pH = 7.0 pufer:50 mM Bis Tris pH = 7.0 10% Propilene Glikol (zapremina:zapremina) (EMD Biosciences) pufer. Propilen glikol u ovom primeru dodat je u pufere kako bi pooštrio profil eluiranja, u poređenju sa širokim profilom eluiranja pufera bez propilen glikola, ali ovo je opciono u procesu. Vektor rAAV-1 je eluiran iz kolone sa 800 mM amonijum sulfata 50 mM Bis Tris (pH = 7.0) pufer+ 4% propilen glikol. Pod upotrebljenim uslovima eluiranja , bilo koji preostali pomoćni virusi i proteini prisutni u dovodnom toku napunjeni u koloni bi ostali vezani za kolonu.

[0112] Otpad iz procesa proizvodnje rAAV-1 zahteva strogu dekontaminaciju pre odlaganja, usled oba, toga što je proizvod virusni vektor i upotrebe život adenovirusa tipa 5 (Ad5) kao

4

pomoćnog virusa za proizvodnju. Tečni otpad iz rada hromatografije obično se prvo dekontaminira sa izbeljivačem do tačke upotrebe a zatim prolazi dalju dekontaminaciju držanjem pri visokoj pH pre neutralizacije i odlaganja. Prisutni amonijum sulfat u HIC puferima reaguje sa oba, izbeljivačem i natrijum hidroksidom kako bi se oslobodili opasni gasovi hlor i amonijak, respektivno. Stoga, primarno razmatranje za optimizaciju procesa koraka HIC hromatografije je razvijanje pogodnog sistema pufera koji bi se mogao bezbedno dekontaminirati sa postupcima poznatim u struci.

Proveravanje za pogodne pufere za rAAV-1 vezivanje za HIC kolonu

[0113] Vektor rAAV-1 je napunjen u kolone pri različitim uslovima pufera i efikasnost relativnog vezivanja određena je merenjem količine prisutnog vektora rAAV-1 u frakciji protoka (Tabela 6). Oba procenjena pufera sadržala su visoku koncentraciju liotropnih soli koje se obično koriste kod HIC hromatografskih procesa i nekoliko pufera sa niskom pH gde se interakcija pomešanog režima (HIC/razmena katjona) potencijalno može pojaviti. Oba, Tosoh Butil 650M i EMD Fenil smola su vezali vektore u nekoliko alternativnih smola.

[0114] Puferi sa visokim koncentracijama soli korišćeni u hromatografija sa hidrofobnom interakcijom moraju biti dalje provereni za probleme viskoznosti što se može ispoljiti u visokim zaostalim pritiscima koji mogu ili ograničiti protok ili izazvati probleme pri mešanju, time povećavajući rizik taloženja proizvoda sa kristalizacijom soli u puferima što se dešava pri temperaturama korišćenim za skladištenje ili rad. Na osnovu podataka u Tabeli 6 ispod, i nakon uzimanja u obzir faktora opisanih iznad, 1 M natrijum citrata, pH = 7.0 je izabrano kao opcioni pufer za vezivanje vektora rAAV-1 za okruženje HIC hromatografije.

4

Tabela 6: Proveravanje AAV1 vezivanja u alternativnim puferima

[0115] Eksperimenti su izvršeni pri temperaturi okoline na Tricorn 5/50 kolonama (visina sloja 6 cm, 1.2 mL zapremina kolone) upotrebom prečišćenih rAAV-1 vektora. Kolone su uravnotežene sa navedenim puferima i ∼2×10<11>DRP ili rAAV-1 su napunjeni u kolonu. rAAV-1 je eluiran preko 20 CV linearnog gradijenta iz 145 mM Bis Tris (pH = 7.0), 10% (v/v) propilen glikol. Protok je sakupljen i analiziran sa DRP analizom za frakcije rAAV-1 primenjene na kolonu koje su protekle ili se nisu vezale.

[0116] Dalja karakterizacija izvršena je na čišćenju nečistoća iz procesa na HIC koloni u različitim puferima koji su pokazali dobro vezivanje rAAV-1 u prethodnom eksperimentu. Podaci na Tabeli 7 ispod za model vezivanja zagađivača pokazuju da se oba, adenovirus i DNK ukoliko su prisutni u dovodnom toku efikasno diskriminišu sa korakom HIC hromatografije.

4

Tabela 7: Relativno vezivanje rAAV-1 u poređenju sa modelom nečistoća iz procesa u različitim HIC puferima

[0117] Eksperimenti su izvršeni pri temperaturi okoline na Tricorn 5/50 kolonama (visina sloja 6 cm, 1.2 mL zapremina kolone). Kolone su uravnotežene sa navedenim puferima i ukazani uzorci su napunjeni u kolone. Svaki uzorak je eluiran sa 20 CV linearnim gradijentom. Uzorci su sakupljeni i procenjeni za relevantni materijal za punjenje.

HIC hromatografija sa natrijum citrat puferima

[0118] Apatit eluat vektora rAAV-1 ubijen sa toplotom je zatim napunjen u HIC butil kolonu u cilju daljeg redukovanja bilo kojih preostalih nečistoća iz procesa i kao korak koncentrovanja i uklanjanja soli.373 ml (6 cm prečnik × 8.9 cm visina sloja) HIC butil kolona (Tosoh Biosciences Toyopearl® Butil 650M kataloški broj 14702) je sanirana sa nekoliko zapremina kolone 0.5 M NaOH i uravnotežena sa 5 CV 75:25 (zapremina:zapremina) smešom 1 M Citrat 20 mM natrijum fosfat:20mM natrijum fosfat. CHT I eluat vektora rAAV-1 ubijen sa toplotom je napunjen pri brzini od 106 cm/h sa mešanjem u liniji pri 75:25 (zapremina:zapremina) odnosom 1 M citrat 20mM natrijum fosfat:CHT I eluat. Mešanje u liniji izbegava rizik taloženja bilo kakvog vektora rAAV-1. Kolona je isprana sa 5 CV 75:25 (zapremina:zapremina) smešom 1 M citrata 20mM natrijum fosfat:20 mM natrijum fosfat pufer. Vektor rAAV-1 je eluiran iz kolone sa 6 CV 0.35 M citrat 20 mM natrijum fosfat. Kolona je zatim isprana sa 3.5 CV 20 mM natrijum fosfat puferom. Ovo sredstvo za ispiranje sa niskim sadržajem soli (20mM natrijum) eluira frakciju čestica vektora rAAV-1 koje se hidrofobno razlikuju u svojim profilima eluiranja od čestica vektora rAAV-1 koje se eluiranju i puferu za eluiranje sa visokim sadržajem soli.

Zapravo, ukoliko je eluirana frakcija sa niskim sadržajem soli izolovana i ponovo primenjena na HIC kolonu pod opisanim uslovima, ta populacija vektora se i dalje eluirana samo u frakciji sa niskim sadržajem soli, što ukazuje da frakcija nije bila rezultat probijanja kapaciteta kolone. Neefikasnost analize ukazuje da ova frakcija rAAV-1 verovatno predstavlja populaciju koja sadrži prazne kapside, delimično denaturisane kapside, manje infektivni kapsidni materijal i delimično pune kapside. Stoga, ovo osmatranje može dovesti do poboljšanja u razdvajanju čestica rAAV-1 koje su manje infektivne i time manje poželjne kao materijal za proizvodnju. Pod upotrebljenim uslovima eluiranja bilo koji preostali pomoćni virusi i proteini prisutni u punjenju bi ostali vezani za kolonu i time bi trebalo da budu prisutni u traci sa niskim sadržajem soli.

Primer 10: Razmena pufera sa hromatografijom sa isključivanjem po veličini („SEC“)

[0119] Upotreba hromatografije sa isključivanjem po veličina ima dodatne prednosti pružanja dodatnog čišćenja proteina onih proteina veličine koji mogu proći kroz pore u smoli i koji su relativno brzi u pogledu neophodnog vremena za razmenu pufera. Razmena pufera je izvršena u ovom koraku kako bi se osiguralo da je HIC eluat iz prethodnog koraka razmenjen u odgovarajući pufer za vezivanje rAAV za krajnji korak hromatografija sa razmenom anjona u procesu.3.2 L (14 cm prečnik × 21 cm visina sloja) Amersham Superdex® 200 prep kvaliteta smola (Amersham/GE Healthcare, Piscataway, NJ; kataloški broj 17-1043-04) napunjena je i pripremljena saniranjem sa 2 M NaCl 1 M NaOH i uravnotežena sa 2.8 CV of 20 mM NaCl 20 mM Tris (pH = 8.0). HIC eluiranje je podeljeno na proces preko SEC u tri redna ciklusa gde je svaki približno 400 ml, gde se ne vrši punjenje veće od 12.5% zapremine SEC kolone za svaki ciklus. Maksimumi proizvoda (sadržan u obe prazne zapremine) iz tri SEC ciklusa su sakupljeni u jednoj kesi za bioprocesiranje. HIC eluat je napunjen u kolone pri protoku od 49 cm/h. Kolona je razblažena i isprana sa 1.4 CV 20 mM NaCl 20mM Tris (pH = 8.0) i rAAV-1 vektor prisutan u HIC eluati je prisutan u praznoj zapremini kolone. Nakon sakupljanja prazne zapremine kao što je opisano, druga i treća frakcija su napunjene i sakupljene na istoj koloni redom kao što je prethodno opisano za prvu frakciju.

1

Primer 11: Pomoćno sredstvo (virusno čišćenje)

[0120] Kao opcioni proces za čišćenje pogodnih virusa koji mogu biti prisutni kao zagađivači u tragovima i time dati komercijalno prihvatljiv ortogonalni proces, filter za čišćenje virusa je uveden u proces. Primeri takvih filtera poznati su u struci i uključuju Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm), i Asahi 70 nm. Millipore Viresolve® NFR (Millipore 4" Virosolve NFR filter kataloški broj KZRV 04T C3) filter za čišćenje virusa je pripremljen u skladu sa uputstvima proizvođača, ispran sa 20 mM NaCl 20 mM Tris (pH = 8.0) i SEC eluiranje je filtrirano kroz membranu. Filter je ispran sa nekoliko zapremina 20 mM NaCl 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) i objedinjen sa filtriranim SEC eluatom.

Primer 12: Hromatografija sa razmenom anjona

[0121] Drugi korak hvatanja razmena anjona za vektor rAAV-1 je izvršen kako krajnji korak koncentrovanja i usavršavanja na Unosphere® Q resin (Biorad, Hercules, CA).373 ml (8.9 cm prečnik × 6 cm visina sloja) kolona je sanirana sa nekoliko zapremina kolona 0.5 M NaOH i uravnotežena sa 7 CV 20 mM NaCl 20 mM Tris (pH = 8.0) puferom. SEC frakcija prazne zapremine ili opciono virusno filtrirani eluat je napunjen pri brzini od 309 cm/h. Kolona je isprana sa 10 CV 60 mm NaCl. Jonska snaga rastvora za ispiranje je izabrana kako bi se rAAV-1 zadržao vezan za smolu pri odvajanju drugih nečistoća iz procesa, kao što su glukani koji mogu biti uvedeni ispiranjem iz različitih filtera korišćenih u koracima prečišćavanja. Vektor rAAV-1 je eluiran iz kolone sa 6 CV 130 mM NaCl. Jonska snaga 130 mM NaCl soli eluiranja će ukloniti rAAV-1 iz kolone dok bi bilo koji preostali tragove nečistoća iz procesa, kao što je serum albumin ili pomoćni virus ostali vezani.

[0122] Slika 6 poredi stepen prečišćavanja u različitim koracima procesa sa SDS-PAGE. Uzorci iz procesa iz reprezentativnog prikupljanja kulture za proizvodnju su pušteni na 10% poliakrilamid gelu za denaturaciju/redukciju i obeleženi sa Sypro narandžastom. Svi uzorci nakon prikupljanja su napunjeni pri 1×10<10>DRP/traci. Dva uzvodna uzorka pre koraka TFF koncentrovanja (početni korak pojašnjenja i AEX protok) mogu se napuniti samo pri 1×10<9>DRP/traci usled ograničenja zapremine na gelu. Beta-galaktosidaza (B-Gal) je napunjena pri 50 ng/traci kako bi se procenila osetljivost i konzistencija obeležavanja na gelu. Ukazana su tri proteina AVV1 kapsida (VP1, 2 i 3).

2

Primer 13: Procenat vraćanja rAAV za vreme prečišćavanja

[0123] Podaci predstavljeni na Slici 7 prikazuju procenat vraćanja infektivnih čestica rAAV nakon svakog koraka šeme prečišćavanja iz reprezentativne kulture za proizvodnju vektora rAAV-1. Procenat vraćanja izračunat je na osnovu ukupnog broja DRP vektora rAAV-1 vraćenog iz svakog koraka procesa podeljenog sa ukupnim brojem DRP napunjenog ili izloženog tom koraku prečišćavanja. Podaci demonstriraju da se pri svakom koraku prečišćavanja, ostvaruje vraćanje približno 60% ili veće. U brojnim eksperimentima, opseg vraćanja iz svakog koraka procesa je bar 60% do 90%. Naročito vredno pomena, opseg vraćanja koraka za hvatanje (tj., korak hromatografije sa apatitom) u pojedinačnim eksperimentima je bio u opsegu od 57% do više od 90%. U nastavku, opseg vraćanja pri HIC koraku bio je u opsegu od 60% do 80%.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za izolovanje populacije čestica rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) iz nečistoća iz procesa, koji se sastoji od koraka:

(a)

(i) dovođenje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV u kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom u prisustvu polietilen glikola (PEG), gde se čestice rAAV vezuju za okruženje hromatografije sa apatitom; i

(ii) eluiranje čestica rAAV vezanih za okruženje hromatografije sa apatitom sa puferom za eluiranje koji sadrži manje od 3% (w/v) PEG; i

(b) vezivanja čestica rAAV u dovodnom toku eluirane iz okruženja hromatografije sa apatitom sa hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC).

2. Postupak prema zahtevu 1, gde je okruženje hromatografije sa apatitom keramički hidroksiapatit (CHT) ili keramički fluoroapatit (CFT).

3. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-2, gde se ulazni tok koji sadrži čestice rAAV u koraku (i) dovodi u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu polietilen glikola (PEG) i baznog pufera.

4. Postupak prema zahtevu 3, gde je bazni pufer između pH 8.0 i 10.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 3-4, gde bazni pufer sadrži borat.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-5, gde PEG ima srednju molekulsku masu između oko 5,000 (PEG5000) grama po molu i oko 15,000 (PEG15000) grama po molu.

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-6, gde se ulazni tok koji sadrži čestice rAAV dovodi u kontakt sa hromatografskim okruženjem apatita u prisustvu od oko 3% (w/v) i oko 10% (w/v) PEG.

8. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-7 koji dalje sadrži korak ispiranja okruženja hromatografije sa apatitom sa puferom za ispiranje nakon što je dovodni tok doveden u

4

kontakt sa okruženjem hromatografije sa apatitom ali pre eluiranja čestica rAAV iz okruženja hromatografije sa apatitom.

9. Postupak prema zahtevu 8, gde je okruženje hromatografije sa apatitom isprano jednom ili više puta sa puferom za ispiranje sa baznim pH koji je sadržao između oko 7.5% (w/v) i oko 5% (w/v) PEG.

10. Postupak prema zahtevu 9, gde je okruženje hromatografije sa apatitom isprano sa puferom za ispiranje sa baznim pH koji je sadržao manje od 3% (w/v) PEG i/ili puferom za ispiranje koji nije sadržao PEG.

11. Postupak prema zahtevu 8-10, gde pufer za ispiranje sadrži borat pri pH između 8.0 i oko 10.0.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-11, gde su čestice rAAV vezane za okruženje hromatografije sa apatitom eluirane sa puferom za eluiranje koji sadrži pufer izabran iz grupe koju čine borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (HEPES) i Tris-HCl pri neutralnoj pH.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-12, koji se sastoji od:

(i) podvrgavanja dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV protočnoj filtraciji razmene jona pre koraka (a);

(ii) podvrgavanja dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV filtraciji sa tangencijalnim protokom (TFF) pre koraka (a); i/ili

(iii) koraka deaktivacije toplotom radi deaktivacije pomoćnog virusa.

14. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-13, pri čemu korak (b) sadrži HIC okruženje, gde je HIC okruženje izabrano iz grupe koju čine Tosoh Butil 650M, Tosoh SuperButil 650C, Tosoh Fenil 650C, EMD Fracotogel Fenil i Tosoh Has(butil) smola.

15. Postupak prema zahtevu 1, gde korak (b) sadrži vezivanje čestica rAAV sa okruženjem hromatografije sa hidrofobnom interakcijom (HIC) u puferu sa visokim sadržajem soli, gde se čestice rAAV i nečistoće iz procesa vezuju za HIC okruženje, i

eluiranje čestica rAAV vezanih za HIC okruženje sa okruženjem slanog pufera, gde pufer sa velikim sadržajem soli sadrži između oko 0.5 M i oko 2.0 M citrata.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, gde pufer sa srednjim sadržajem soli sadrži manje od 0.5 M citrata, opciono gde pufer sa srednjim sadržajem soli sadrži oko 0.45 M, 0.4 M, 0.35 M, 0.3 M ili 0.25 citrata.

17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 15-16, koji dalje obuhvata podvrgavanje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV eluirane iz okruženja HIC hromatografiji na molekulskim sitima (SEC).

18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 15-17, koji dalje obuhvata podvrgavanje dovodnog toka koji sadrži čestice rAAV eluirane iz HIC okruženja hromatografiji sa razmenom anjona.