JPH11511326A - アデノウィルスおよびａａｖの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特に治療的適用において使用するために大規模な量の活性な（感染性の）アデノウィルスおよびＡＡＶの精製に関する。特に、本発明は、そのようなクロマトグラフィ材料との接触から生ずる、ウィルスに対する、特にウィルスの表面成分に対する何らかの損傷が最小にされるかまたは排除されるような様式で、そのようなウィルスを適当なクロマトグラフィ材料と接触させるための改良された方法を提供する。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入／治療処置において使用するために適当な活性な（感染性の）ウィルスの商業的水準の量を迅速に且つ有効に精製するその能力である。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウィルスおよびＡＡＶの精製 本願は１９９５年８月３０日に出願された米国法定特許出願シリアル第６０／ ００２，９６７号（このテキストを参照することにより本明細書に組み入れる） の部分継続出願である。発明の分野 本発明は、特に治療的適用における使用のための、活性な（感染性の）アデノ ウィルスおよびＡＡＶの大規模な量の精製に関する。特に、本発明は適当なクロ マトグラフ材料との接触から生ずる、ウィルスに対する、特にその表面成分に対 する何らかの損傷を最小にするかあるいは排除するような様式で、そのようなウ ィルスを適当なクロマトグラフ材料と接触させるための改良された方法を提供す る。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入／治療処置において使用するた めに適当な活性な（感染性の）ウィルスの商業的水準量を迅速に且つ効率的に精 製するその能力である。発明の背景 病気の分子治療は治療上の利益を与えるために関連者の細胞への核酸の投与を しばしば包含する。最も普通には、ウィルスの自然のままの感染性の利点を取り 入れそして細胞への異種核酸を移送する（遺伝子導入）それらの能力を取り入れ る組み換え体ウィルスが技術的に検討される。そのような組み換え体ウィルスベ クターの普及した使用は、そのようなウィルスのデザインおよび生産のための戦 略により左右される。 遺伝子治療のためにウィルスベクターを使用する大抵の試みは、主に細胞ゲノ ム中に組み込むレトロウィルスベクターの能力の故に、レトロウィルスベクター に依存していた。しかしながら、分裂する細胞のみに対するそれらの向性、細胞 ゲノム中への組み込みの際の挿入突然変異誘発の可能性、時間経過にわたっての 導入遺伝子の減少した発現、血清補体による急速な不活性化そして複製−応答能 ある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）レトロウイルスの生成の 可能性を包含する、レトロウィルスベクターの欠点が次第に明らかになって来て いる（Ｊｏｌｌｙ，ＤによるＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５ １−６４（１９９４）：Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．によるＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ １３：２２２−２２５（１９９５））。 アデノウィルスは古典的遺伝学および分子生物学における研究により十分に特 徴づけられた、約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウィルスである（１９９０ 年ニューヨークのＲａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ発行、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．等監修 のＶｉｒｏｌｏｇｙ第２版におけるＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．による“Ａｄｅｎ ｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”）。アデノ ウィルスをベースとするベクターは、とりわけ、分裂性細胞および非分裂性細胞 の両方に対する向性、最小の病原性、ベクター株の製造のために高い力価に複製 する能力および大きな挿入物を運ぶためのその能力を包含する、細胞への治療的 導入遺伝子の送り込みのための幾つかの特有な利点を提供する（Ｂｅｒｋｎｅｒ ，Ｋ．Ｌ．によるＣｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３ ９−６６（１９９２）；Ｊｏｌｌｙ，ＤによるＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ ｒａｐｙ １：５１−６４（１９９４））。 アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は感染細胞のゲノム中に組み込むことが出来る 一本鎖非病原性ＤＮＡウィルスである。ウィルス活性周期のこの特徴は、遺伝子 治療のための関連者（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に遺伝子を送り込むための（組み換え 体アデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）を生成する）遺伝子治療媒体（ｖｅｈｉｃｌ ｅ）としてＡＡＶの使用に注意を集中させた。細胞ゲノム中に治療遺伝子を挿入 するＡＡＶの能力は関連者（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の遺伝子の持続した発現を容易 にしそして遺伝子治療ベクターの繰り返しての投与の必要性を減少させる。 アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の精製のための現在の方 法は、治療的用途のためのウィルス株の大規模な生産を容易に可能にすることが 出来ない、密度勾配遠心分離の使用を包含する。ＡＡＶベクターの普及した使用 をさらに制限するのは、ＡＡＶベクター株の増殖のために必要とされる汚染性ア デノウィルスを除去する一方で、高い力価のＡＡＶを生ずる何らかの適当な精製 方法が一般に欠如していることである。 イオン交換、親和クロマトグラフィおよびゲル濾過は、たんぱく質精製におい て広く使用されているカラムクロマトグラフィ手段である。しかしながら、最近 まで、これらの方法はアデノウィルスの精製には適用不能であった。そのような 技術は、ウィルスに対して損傷を生じ、それにより標的細胞に結合し且つ感染さ せるそれらの能力を減少させた。１９９５年８月３０日に出願された法定米国特 許出願シリアル第６０／００２，９６７号は本明細書において一層十分に記載さ れるようなクロマトグラフィ分画化（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｆｒａ ｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）技術を使用する感染性アデノウィルスを精製するための パラメーターを記載している。最近の研究は組み換え体アデノウィルスの精製に おいてカラムクロマトグラフィが使用されることが出来ることを示した （Ｈｕｙｇｈｅ等によるＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３ −１４１６（１９９５））。 平均直径がアデノウィルスの直径（直径＝繊維を除いて約８０ｎｍそして繊維 分子を有して約１４０ｎｍ）とおおよそ同じである細孔を中に有するビーズから なる、いわゆる“マクロ細孔”樹脂のような他のシステムを用いるカラムクロマ トグラフィは、感染性のアデノウィルスの回収を生じなかった。これについての 最も確実と思われる理由は、そのような樹脂中をアデノウィルスが通過すると、 ウィルスがビーズ中の細孔と緊密に接触することによりウィルスの表面から繊維 を切り落とすからである。とりわけ、アデノウィルスの繊維分子は標的細胞に結 合しかつ感染するそのウィルスの能力に包含されるされるべきと信じられる。し たがって、そのような先行技術のカラム法による繊維分子（ならびに他の表面分 子）の損傷または損失は不活性（非感染性）ウィルスの回収を結果として生ずる ことになる。 当業界において周知であるように、ＡＡＶの増殖はアデノウィルスのようなヘ ルパーウィルスの使用を必要とする。ヘルパーウィルスについての要件はＡＡＶ の精製を複雑にする。ＡＡＶ精製に対する現在の方法は、凍結−解凍の繰り返し のサイクルを用いて、ＡＡＶ感染細胞を溶解（ｌｙｓｉｎｇ）し、次に細胞汚染 物質の存在しないそしてＡＡＶ増殖のために必要とされる（アデノウィルスのよ うな）ヘルパーウィルスが実質的に存在しない感染性ＡＡＶを得るために密度勾 配遠心分離を使用して細胞溶解産物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を分画化するこ とを包含する（Ｆｌｏｔｔｅ等によるＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：２９−３ ７（１９９５）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ等によるＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ ｐｙ ６：１５３１−１５４１（１９９５）；Ｆｉｓｈｅｒ等によるＪ．Ｖｉｒ ｏｌ．７０：５２０−５３２（１９９６））。標準の精製技術は、活性な（感染 性の）ウィルスの非常に低い収率（０．３〜５％）を一般に生ずる。さらに、ヘ ルパーウィルスの必要性の故に、ヘルパー（例えばアデノウィルス）の全く存在 しないＡＡＶを得ることは困難であった。発明の概要 本発明は、特に治療用途のための、感染性アデノウィルスおよびＡＡＶの商業 的に有用な量の精製のための方法に向けられている。 本発明は、感染性ウィルスを精製する先行技術の方法に伴う問題を避けそして 宿主への治療導入遺伝子の遺伝子導入において有用である感染性アデノウィルス の大規模な分離を提供するクロマトグラフィ分画化技術に依存している。したが って、本発明は、ウィルス、特に感染性のために必要とされると信じられるその 表面成分が、下記のような接触により損傷されないような様式でそしてそのよう な条件下に、治療的に有用なウィルスを、クロマトグラフィ分画化技術において 使用されるのに適当な材料と接触させるための改良された方法を提供する。 特に、アデノウィルス精製に関して、本発明はこれらの改良された方法論にお いて包含される幾つかのデザイン考慮を含む。これらのデザイン考慮はそれらが 同様な目的、即ち精製において使用される種々のクロマトグラフィ材料との接触 によるウィルスに対する損傷を最小にするかまたは排除すること、を達成する点 において関連している。特にそれらの方法は生物学的分子の分配において包含さ れるそのような材料中の開口または細孔の作用を避けるように意図される。 本発明の一つの面において、“回分式（ｂａｔｃｈ）”タイプの技術が使用さ れることが出来る。この面において、ウィルスは、“流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏ ｕｇｈ）”処置に付されるよりもむしろ適当なクロマトグラフィ材料と 混合される。この方法を用いて、ウィルス粒子はビーズ中の細孔に入りそして損 傷を受ける傾向が少なくなる。 本発明の第２の面は、支持体材料の細孔の寸法が、クロマトグラフィ分画化中 （例えばカラムまたは膜において）ウィルスが細孔に入ることが出来ないほどに 小さいクロマトグラフィ材料を用いることを包含する。そのようなクロマトグラ フィ材料の細孔寸法における減少は、例えば支持体マトリックスの増大させた架 橋により達成させることが出来る。細孔寸法における減少は、ウィルスが損傷さ れる可能性があるビーズ中の開口にウィルスが入るのを防止する。 別法として、マトリックス材料中の細孔にウィルスが近づくのを防止する構造 体、例えば、“触手（ｔｅｎｔａｃｌｅｓ）”を含有するクロマトグラフィ材料 が使用される。また、これはウィルス粒子に対する損傷を防止するかまたは最小 にするのに役に立つ。 本発明の第３の面において、クロマトグラフィ材料のマトリックスは寸法にお いて非常に大きい開口または細孔、即ちアデノウィルス粒子の直径よりかなり大 きい直径を有する細孔を含有するクロマトグラフィ材料が用いられる。かくして 、ウィルスは損傷されることなしにそのようなクロマトグラフィ材料中の細孔を 通過して分配されることが出来る。 これらのデザイン考慮に基づいて、本発明の精製方法は生物学的物質を分画化 するのに有用であると知られている広い種々の市販のクロマトグラフィ材料の使 用を可能にする。そのような材料の有用な支持体マトリックスは、とりわけ、セ ルロースのような重合体物質またはシリカゲルタイプの樹脂または膜あるいは架 橋多糖類（例えばアガロース）または他の樹脂を包含する。また、クロマトグラ フィ材料は生物学的分子を分離するのに有用である、マトリックス材料に結合さ れた種々の官能基または活性基をさらに含むことが出来る。 そのようなものとして、本発明の方法はまた、ウィルスが種々の非共有メカニ ズムを介して相互作用しそして後でそこから実質的に除去されることが出来る、 支持体材料に結合された親和性基の使用を利用する。本発明において提供される 好ましい方法はクロマトグラフィ分画化技術において有用なイオン交換（特に陰 イオン交換）タイプの相互作用を利用する。他の特定の親和性基は、とりわけ、 支持体マトリックスに結合されたヘパリンおよびウィルス−特異性抗体の使用を 包含することが出来る。本技術を介してのウィルス精製において親和性基の選択 における考慮の中で、ウィルスが選ばれた親和性基と相互作用する結合力および 感染性に包含されるウィルス表面分子を損傷することなしのその除去の容易さで ある。 活性（感染性）ウィルスの高い収率で比較的に高い分子量のウィルス種（例え ば、アデノウィルスおよびＡＡＶ）の商業的規模の生産はこれらの方法を用いて 達成される。図面の簡単な記載 図１は、Ａｃｔｉ−Ｍｏｄ^Rカートリッジ樹脂の概要図である。 図２は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^R樹脂からのアデノウィルスの溶離プロフィ ルを示すクロマトグラムである。アデノウィルスについての溶離ピークは標識さ れている。 図３は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００樹脂からのアデノウィルスの溶離プロフィ ルを示すクロマトグラムである。アデノウィルスについての溶離ピークは標識さ れている。 図４は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルス（レーン（Ｌａｎｅ）Ｂ）と比較し てのＤＥＡＥおよびゲル濾過クロマトグラフィにより精製されたアデノウィルス （レーンＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。 図５は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルス（レーンＡ）と比較してのヘパリン 、ＤＥＡＥおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ^Rクロマトグラフィにより精製されたアデノ ウィルス（レーンＢ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 図６は、ＣｓＣｌ勾配精製されたウィルスＡと比較してのヘパリン、ＤＥＡＥ およびＳｕｐｅｒｄｅｘ^Rクロマトグラフィにより精製されたアデノウィルスＢ の濃度計による濃度測定分析を示す。 図７は、（Ａ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００樹脂および（Ｂ）ＤＥＡＥ−Ｍｅｍ Ｓｅｐ^R樹脂からのＡＡＶの溶離プロフィルを示すクロマトグラムである。 図８は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^RおよびＤＥＡＥクロマトグラフィにより精製され たΛＡＶの２つの分画（レーンＡおよびＢ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 図９ＡはＡＡＶ／アデノウィルス−含有２９３細胞溶解産物のセラミックヒド ロキシアパタイトグロマトグラフィである。ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方 についての溶離ピークは標識されている。 図９ＢはヒドロキシアパタイトＡＡＶ含有溶離液のＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^R クロマトグラフィを示す。ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方についての溶離ピ ークは標識されている。 図９ＣはＡＡＶ−含有ＤＥＡＥ溶離液のＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートク ロマトグラフィを示す。樹脂から溶離されたＡＡＶピークは標識されている。 図１０は、種々のカラム、即ちレーン１：ヒドロキシアパタイト装入；レーン ２：ヒドロキシアパタィト溶離液；レーン３：ＤＥＡＥ溶離液；レーン４：Ｃｅ ｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート溶離液；そしてレーン５：Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサ ルフェート溶離液（１００μｌ）、から回収したＡＡＶ含有分画のクーマシー染 色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（ｋＤにおける）対照たんぱく質標準は左のカ ラムにおいて示される。 図１１は、セラミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉ ｎｅ^Rサルフェートクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶのＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析を示す。 図１２は、ＣｓＣｌ勾配精製されたＡＡＶ（レーン２〜４）と比較してのセラ ミックヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェー トクロマトグラフィにより精製されたＡＡＶ（レーン１）のクーマシー染色たん ぱく質ゲルを示す。 図１３は、Ｒｅｐ対照と比較しての、抗Ｒｅｐ抗体を用いる、セラミックヒド ロキシアパタイト、ＤＥＡＥおよびＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートクロマト グラフィにより精製されたＡＡＶ（レーンＡＡＶ）の免疫ブロットを示す。 図１４は、ｐＴＲｌａｃＺの概要図である。発明の詳細な記載 本発明は、特に遺伝子治療を包含する、遺伝子導入のような、治療適用におい て使用するための活性な（感染性の）アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス （ＡＡＶ）の精製のための大きな規模に適合することが出来るクロマトグラフィ 分画化方法に向けられている。本発明のクロマトグラフィ方法は、ウィルス精製 の密度勾配超遠心分離の現在の、大規模にすることが出来ない（ｎｏｎ−ｓｃａ ｌｅａｂｌｅ）方法に代わって使用されそして工業的規模で活性な（感染性の） ウィルスの生産を可能にすることが意図される。該２種のウィルスの精製のため のデザイン戦略は相互に関連している。上に記載したように、ＡＡＶの増殖は、 最も普通にはアデノウィルスによって提供されるヘルパーウィルス成分の存在を 必要とする。ＡＡＶの精製はアデノウィルスの汚染の故に問題があった。 本発明のクロマトグラフィ分画化技術は、もっぱら遠心分離に基づく先行技術 のウィルス精製方法以上の幾つかの利点を提供し；本方法は迅速であり；実験計 画は効率がよく、単一操作でミリグラム量のウィルスの分離を可能にし；ウィル スの完全性が危うくされず；そして高収量の感染性ウィルスが得られる。アデノウィルスの精製 上に記載したように、たんぱく質または他のウィルスの精製において日常的に 使用されているような慣用のクロマトグラフィ方法および材料をアデノウィルス の精製に適合させようとする先行技術の試みは成功しなかった。そのような方法 を適用するにあたって、損傷からアデノウィルスを保護するためにそして特に感 染性のために必要なそのマクロ分子成分に対して保護するために十分な注意が払 われなかったと信じられる。理論に関して制限されることなしに、“繊維”とし て知られているたんぱく質種を最も特定的に含む、特有のアデノウィルスたんぱ く質は、感染中に標的細胞へのアデノウィルスの結合において包含される。その ようなたんぱく質の多くのコピーが各々のアデノウィルス上に見い出されること が出来るけれども、ウィルス感染性は大抵の細胞タイプに対して相対的に低くそ してしたがって、例えば繊維分子または他のウィルスマクロ分子の小さい部分で さえ、それに対しての損傷は、首尾のよい感染の確立を実質的に防ぐ可能性があ る。それ故に、高い感染性を維持することは、遺伝子治療のためのような治療的 用途のために意図されるアデノウィルスベクターの商業的規模の生産に関してか なり重要なことである。 したがって、アデノウィルス粒子の脆い性質を適当に考慮に入れるために広い 種々のクロマトグラフィ方法が提供される。現在開示されるように、マトリック スまたは支持体材料、およびそれに通常カップリング結合される活性（結合性） 基を包含する広い種々の慣用のクロマトグラフィ材料は本発明の実施において有 用である。 本明細書に記載される方法は、アデノウィルスの成分に対しての損傷なしに水 性媒体中の高い濃度で精製されたアデノウィルス粒子の取り出しを可能にする。 同様に、本方法はミリグラム量のウィルスの製造に適している。 アデノウィルスはウィルス感染細胞、例えば２９３細胞から単離される。細胞 は収量を最適化するために高い感染の多重度（ＭＯＩ）で感染されることが出来 る。感染された細胞からウィルスを回収するために適当な任意の方法が利用され ることが出来る。感染された細胞からのウィルスの回収のための好ましい技術は 凍結−解凍およびミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）の使用を包 含する。しかしながら、大規模に出来る方法でウィルスを精製するために、繰り 返しての凍結−解凍を行うことなしにウィルス感染細胞を溶解する（ｌｙｓｅ） 方法を使用することそして遠心分離なしで細胞溶解産物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔ ｅ）から細胞破片を除去することが好ましい。活性ウィルスの放出のためのウィ ルス感染された２９３細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）のための最適の条件は、加圧セ ル、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ加圧セル（マサチューセッツ州ニュー トンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ製）を用いて達成されることが出来る。例え ば高分離能接線流動システム（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔａｎｇｅｎ ｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍ）を含む、Ｍｉｎｉｔａｎシステム（マサチ ューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いての溶解産物の限 外濾過は、クロマトグラフィ分画化技術の前にウィルス分画をさらに濃縮するた めに用いられることが出来る。 そのようにして得られたアデノウィルス含有溶解産物は、次に本発明のクロマ トグラフィ分画化技術に付されることが出来る。アデノウィルス精製に関して本 発明はこれらの改良された方法論に含まれる幾つかのデザイン考慮を包含する。 これらのデザイン考慮は、それらが同様な目的、即ち精製において使用される種 種のクロマトグラフィ材料との接触によるウィルスに対する損傷を最小にするか または排除することを達成する点で関連している。特に、その方法は生物学的分 子の分配に包含されるそのような材料における開口または細孔の作用を不要にす ることが意図される。 本発明の一面において、“回分式”タイプの技術が使用されることが出来る。 この面において、ウィルスは“流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）”方式に付さ れるよりもむしろ適当なクロマトグラフィ材料と混合される。この方法を用いて 、ウィルス粒子は、それらが損傷される可能性があるビーズ中の細孔に入る見込 みが少ない。 本発明の第２の面は、クロマトグラフィ分画化中（例えばカラムまたは膜にお いて）ウィルスが細孔に入ることが出来ないように、支持体材料の細孔寸法がウ ィルス粒子の寸法より小さいクロマトグラフィ材料を用いることを包含する。そ のようなクロマトグラフィ材料の細孔寸法における減少は、例えば支持体マトリ ックスの増大させた架橋により達成させることが出来る。細孔の寸法におけるそ の減少は、ウィルスが損傷される可能性があるビーズ中の開口にウィルスが入る ことを防止する。 別法として、マトリックス材料中の細孔にウィルスが近づくのを防止する構造 物、例えば“触手（ｔｅｎｔａｃｌｅｓ）”を含有するクロマトグラフィ材料が 使用されることが出来る。また、これはウィルス粒子に対する損傷を防止するか または最小にするのに役に立つ。 本発明の第３の面において、材料のマトリックスが寸法において非常に大きい 開口または細孔、即ちアデノウィルス粒子の直径よりかなり大きい直径を有する 細孔を含有するクロマトグラフィ材料が使用されることが出来る。したがって、 ウィルスは損傷されることなしに、そのようなクロマトグラフィ材料中の細孔を 通過して分配されることが出来る。 これらのデザイン考慮に基づいて、本発明の精製方法は生物学的物質を分画化 するのに有用であると知られている広い種々の市販のクロマトグラフィ材料の使 用を可能にする。そのような材料の有用な支持体マトリックスは、とりわけセル ロースのような重合体物質あるいはシリカゲルタイプの樹脂または膜あるいは架 橋された多糖類（例えばアガロース）または他の樹脂を包含することが出来る。 また、クロマトグラフィ材料は生物学的分子を分離するのに有用である、マトリ ックスに結合された種々の官能基または活性基をさらに含むことが出来る。 そのようなものとして、本発明の方法はまた、ウィルスが種々の非共有メカニ ズムを介して相互作用しそして後でそこから除去されることが出来る、支持体マ トリックスに結合された親和性基の使用を利用する。本発明において提供される 好ましい方法は、クロマトグラフィ分画化技術において有用なイオン交換（特に 、陰イオン交換）タイプの相互作用を利用する。他の特定の親和性基は、とりわ け支持体マトリックスに結合されたヘパリンおよびウィルス−特異性抗体の使用 を包含することが出来る。本技術を介してのウィルス精製おいての親和性基の選 択における考慮の中で、ウィルスが選ばれた親和性基と相互作用する結合力そし て感染性に包含されるウィルス表面分子を損傷することなしのその除去の容易さ である。 次のタイプのクロマトグラフィ材料は上に論じられた回分方式タイプのクロマ トグラフィ方法のために適している。 本開示の教示はまた、回分式形においてだけならば、他の市販のクロマトグラ フィ材料の使用を可能にする。本発明の好ましい態様ではないけれども、そのよ うなクロマトグラフィ材料と接触することによりアデノウィルスが損傷される可 能性があるといったん分かれば、精製方法はウィルスに対する損傷を最小にする ように再計画されることが出来る。多くの重合体材料がすべての接触しているア デノウィルスを損傷する可能性がある細孔を含有する程度まで、そのような損傷 は、例えばカラム圧力を最小にし、それによりマトリックスの細孔中にアデノウ ィルスが入るのを制限することにより制限されることが出来る。その最も簡単な 例において、精製工程は単に回分形式で行われる。本発明のこの面に従って有用 な重合体材料はＰｈａｒｍａｃｉａの製品ヘパリン セファロース ハイ パー フォマンス；カリフォルニア州リッチモンド、ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏ−Ｐｒ ｅｐセラミックヒドロキシアパタイト；およびＡｍｉｃｏｎからのセルファイン （ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）サルフェートを包含する。 クロマトグラフィ材料は、そのすべての細孔空間とのアデノウィルスの相互作 用が最小となるように十分なマトリックス架橋を有し、またアデノウィルスに対 する親和性を有する（例えばイオン交換基またはヘパリンを包含する）多くの結 合基が存在する重合体からなる。本発明の実施において有用な代表的ヘパリン化 重合体はＨｅｐａｒｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ^R（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ ｅ製）、６％架橋化ヘパリンアガロースのような約６％またはそれ以上の架橋を 有するものを包含する。そのようなアガロースマトリックスは、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｇａｒｏｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製）のような４ ％架橋化生成物の排除限界よりずーっと低いと予想される約六百万ダルトンの排 除限界を有する。１つの実験において、感染性形でのアデノウィルスの回収は４ ％生成物よりもむしろ６％生成物が用いられた場合に実質的に改良された。本発 明の実施において有用であるヘパリン基を含有する追加の重合体は（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ製の）Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^RＣＬ６Ｂを包含する。 いったん注意深くコントロールされた架橋の利点が理解されたならば、当業者 は、アデノウィルスが、それとの接触により損傷されないように任意数の認識さ れたマトリックス材料および結合用基から構成される任意の数の重合体材料と置 き換えることが出来ることは明らかである。 提供された第２のデザイン考慮に関して代表的なクロマトグラフィ材料はアデ ノウィルスと有効に相互作用するがしかし、ウィルスそして特にその繊維たんぱ く質を損傷する可能性がある（約０．１ミクロンのような）そのすべての細孔ス ペースへのウィルスの接近を最小にするデザインを有する官能基を含有する。 同様に、種々の長さの重合化鎖が結合されておりそしてさらに官能基が結合さ れていてもよい芯領域を含有するいわゆる触手化重合体（ｔｅｎｔａｃｌｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）がある：例えばロードアイランド州ウェークフィールドのＥ． Ｍｅｒｃｋから市販のＦｒａｃｔｏｇｅｌ Ｔｅｎｔａｃｌｅ Ｉｏｎ Ｅｘｃ ｈａｎｇｅ Ｍｅｄｉａ。これらのクロマトグラフィ材料はＤＥＡＥ、第四級ア ミノエチル、第四級アンモニウム、ＤＭＡＥ、ＴＭＡＥ、等あるいは例えばＳＯ₃ ^- またはカルボキシルのようなイオン交換性基で終わっている、アクリルアミド 誘導体の重合化鎖がグラフトされている、オリゴエチレングリコール、グリシジ ルメタクリレートおよびペンタエリスロールジメタクリレート（ｐｅｎｔａ−ｅ ｒｙｔｈｒｏｌｄ−ｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）から共重合 された不溶性マトリックスを有するものとして記載されている。同様な“触手化 （ｔｅｎｔａｃｌｅｄ）”材料を使用することは本発明の実施内である。 第３のデザインに関して好ましいクロマトグラフィ材料は少なくとも約０．１ μｍ（アデノウィルスの寸法）、しかし好ましくは少なくとも約１μｍの細孔を 有するマトリックスを含む。 そのような材料は標的プロトマーに対して高い基質特異性により、非特異性た んぱく質の無視できる結合、および最も大きな既知の球状ウィルスの精製のため に十分である細孔寸法（〜１．２μｍ）により特徴づけられるセルロース膜また はシリカ膜カートリッジであることが出来る。低い結合性のセルロースまたはシ リカ膜フィルターのスタックからなる、カートリッジデザインは高い流速に適し ており、一方ではカートリッジの大きな細孔寸法はカラム中に詰められたビーズ ゲル樹脂を伴った拡散を排除する。 例えば、ＡＣＴＩ−ＭＯＤ^R（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉ ｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）カートリッジは、微細孔シリカ／ＰＶ Ｃのシートからなる。これらのシリカシートは多数の均一な細孔と共に大きな表 面積を有する（図１パネルＡ参照）。細孔は、異なる活性側鎖、例えばＤＥＡＥ またはヘパリン構造単位が結合されていてもよいシリカと列をなしている。クロ マトグラフィ中、ＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rの高度に多孔質のシリカ／ＰＶＣシート中 を通過する（または同様に有効なＭｅｍＳｅｐ^R（マサチューセッツ州ベッドフ ォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カートリッジ中の開口を通過する）ウィルスの 運動は、活性化シリカ表面とのウィルス粒子（ｖｉｒｉｏｎｓ）の直接接触を可 能にする（図１パネルＢ）。そのような接触は適当な分離を可能にする一方で、 同時に従来のビーズ化ゲルタイプの樹脂を用いて起こる、カプセル化されたウィ ルス粒子それ自体の寸法とおおよそ同じであるか又はそれよりやや小さい樹脂の ビーズ中の細孔とのウィルス粒子の有害な相互作用を避けることを可能にする。 そのような有害な相互作用は、例えば繊維たんぱく質を包含するウィルス粒子表 面成分に対して損傷して、それにより首尾よく標的細胞を感染するウィルス粒子 の能力を減少させることを包含するであろう。 本発明の実施において有用である追加の重合体製品はウィルス粒子を損傷しな いのに十分に大きい細孔を含有する重合体製品でありそして、とりわけ、Ｃｙｃ ｌｏＳｅｐ^Rモジュール（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．製）のようなスパ イラル プレパレーチブ クロマトグラフィ モジュールを包含する。該Ｃｙｃ ｌｏＳｅｐ^TMスパイラル精製カラムは、種々のスペース化形態に有効である一体 的リブデザインと共に、微細孔プラスチックシート（ＭＰＳ^R）からなるマトリ ックスを有する。そのマトリックスはらせん状に巻かれていてそしてシリカで被 覆されている。得られた親水性表面はヘパリンのような種々の親和性リガンドま たはＤＥＡＥおよびカルボキシメチルのようなイオン交換クロマトグラフィにお いて使用される親和性リガンドを用いて誘導化されることが出来る。 陰イオン交換クロマトグラフィはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ （第四級アミノエチル）およびＱ（第四級アンモニウム）を包含するが、しかし それらに限定されない、陰イオン交換技術についての当業界で知られている種々 の官能性部分を用いて行われることが出来る。これらの官能性部分は本明細書に 記載されたセルロースおよびシリカ樹脂を包含する、本発明において有用な任意 の適当な樹脂に結合されることが出来る。例えば、ＤＥＡＥは、ＤＥＡＥ−Ｍｅ ｍＳｅｐ^R（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）のよ うなカラムにおけるセルロース樹脂、Ｓａｒｔｂｉｎｄ^TM膜吸収剤（ニュージャ ージー州、エッジウッドのＳａｒｔｏｒｉｕｓ製）およびＡＣＴＩ−ＭＯＤ^R（ マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）のようなシリカ樹脂を包含する種々の樹脂に結合さ れることが出来る。 ＳＰ ＭｅｍＳｅｐ^R（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏ ｒｅ製）、ＣＭ ＭｅｍＳｅｐ^R（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌ ｌｉｐｏｒｅ製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^RＳＯ₃ ^-（ニュージャージー州ギブスタ ゥンのＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）、Ｍａｃｒｏｐ ｒｅｐ Ｓ^R（ニューヨーク州メルビルのＢｉｏＲａｄ製）のようなカラムなら びにヘパリンをベースとする樹脂の使用を包含するがしかしそれら に限定されない陽イオン交換クロマトグラフィがまた、アデノウィルスの精製の ために使用されることが出来る。Ｈｅｐａｒｉｎ ＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rカートリ ッジ（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）およびＰＯＲＯＳ^RＰｅｒｆｕｓｉｏｎクロ マトグラフィ媒体（ベーリンガー マンハイム製）は本発明のこの態様の追加の 例を表す。 アデノウィルスを精製するために使用されることが出来る他の親和性リガンド は、本明細書において提供されるような適当な樹脂に結合された抗アデノウィル ス抗体ならびに当業者に既知の他のものを包含する。 好ましくはアデノウィルスの精製は以下の工程を包含する：Ｔｗｅｅｎ−８０ のような洗浄剤の存在下に、アデノウィルスで感染された２９３細胞の加圧溶解 （ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｙｓｉｓ）および溶解産物（ｌｙｓａｔｅ）中のウィル スの回収；３μｍガラス繊維フィルターおよび０．８μｍ酢酸セルロースフィル ター中を通過させることによる溶解産物の清澄化；アデノウィルスが流通（ｆｌ ｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収されるＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rシリカカー トリッジを用いるヘパリンクロマトグラフィ；およびＭｅｍＳｅｐ^Rカートリッ ジを用いるＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィ。結合されたアデノウィルス は適当な緩衝液中５００〜７００ｍＭのＮａＣｌを用いてＤＥＡＥ−樹脂からの 溶離され；次に、ＤＥＡＥ溶離液のゲル濾過（サイズエクスクルージョン）クロ マトグラフィに付し、そこでアデノウィルスはカラム溶離液の空隙容量（ｖｏｉ ｄ ｖｏｌｕｍｅ）で回収される。 精製するために、例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ^R（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ製）のような樹脂を用いるゲル濾過クロマトグ ラフィはすべての汚染処理から離れた活性アデノウィルスを回収するために用い られることが出来る。そのような樹脂は、樹脂のビーズから完全に排出されそし てカラムの空隙容量で溶離するアデノウィルスを生ずる非常に小さな細孔寸法（ 排除限界二百万ダルトン）を有する。その分配は、たんぱく質脱塩カラムに対し て同様な様式で機能を果たす。 アデノウィルス精製は例えばウェスターンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いてウ ィルスたんぱく質についてアッセイすることにより調べられることが出来る。ア デノウィルスＤＮＡの確認（同定）は、例えばスロットブロット（ｓｌｏｔ ｂ ｌｏｔ）分析、サゥザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析 またはウィルスＤＮＡの制限酵素分析を用いて、ウィルス回収の指標として用い られることが出来る。精製はアッセイされたサンプル中のウィルスたんぱく質ま たは核酸の優勢性により証拠づけされる。 アデノウィルス粒子の確認（同定）はまた、例えば精製分画の２６０ｎｍでの 分光測光法的吸光度を用いてあるいは例えば電子顕微鏡によるウィルス粒子の観 察を用いて、ウィルス精製をアッセイするために用いられることが出来る。 感染性アデノウィルスの回収は、適当な宿主細胞系（例えば２９３細胞）をク ロマトグラフィに付されたサンプルで感染させることにより調べられることが出 来る。感染性のアデノウィルスはプラークアッセイにより確認（同定）され且つ 力価測定されることが出来る。別法として、感染された細胞は、豊富なアデノウ ィルスヘキソンたんぱく質に対して染色されることが出来る。そのような染色は 感染後７日に細胞をアセトン−メタノールで固定しそして多クローン性ＦＩＴＣ −標識化抗−ヘキソン抗体（カリフォルニァ州ＴｅｍｅｃｕｌａのＣｈｅｍｉｃ ｏｎ製）で染色することにより行われることが出来る。精製された分画の活性度 は、クロマトグラフィをかけるまえとそしてそれをかけた後とでの感染性を比較 することにより調べられることが出来る。 本発明の方法において他のカラムの使用はアデノウィルスの精製に向けられた 本発明の範囲内である。 上に論じられたように、ＡＡＶの増殖は、ＡＡＶ製剤と共に精製されてそして ＡＡＶ製剤を汚染する可能性がある、ヘルパーアデノウィルスを必要とするので ＡＡＶ精製は、ＡＡＶの精製において（例えばクロマトグラフィ材料の細孔との 接触により）アデノウィルスを損傷するクロマトグラフィ材料の利点を取り入れ る。したがって、ＡＡＶの精製はアデノウィルス精製にとって好ましくないクロ マトグラフィ材料を使用する。例えばそのような材料は細孔の大きさがアデノウ ィルスのおおよその大きさである、上に論じられたいわゆる“マクロ細孔”樹脂 を包含する。一般に、精製中アデノウィルスを損傷してそれを不活性に導く細孔 寸法を有するマトリックスを選ぶことが有利である。 本発明はまた、カラムクロマトグラフィを用いて、細胞溶解産物中のアデノウ ィルスおよび細胞たんぱく質からＡＡＶの分離のための方法に関する。密度勾配 超遠心分離の現在の大規模に出来ない方法以上のカラムクロマトグラフィの利点 は多量のＡＡＶが生成されることが出来ることである。ＡＡＶの精製のためにカ ラムクロマトグラフィを用いる他の利点は、それがＡＡＶの生成においてヘルパ ーウィルスとして慣用的に用いられる汚染性アデノウィルスを有効に除去するこ とである。ＡＡＶの精製 ＡＡＶ−感染細胞の初期の溶解は、感染性ウィルス粒子を放出するために、細 胞を物理的に処理するよりもむしろ化学的にまたは酵素的に処理する方法を介し て行われることが出来る。そのような方法は、宿主細胞、非カプセル化または不 完全なアデノウィルスＤＮＡを酵素的に分解させるために（ベンゾナーゼ^R（ｂ ｅｎｚｏｎａｓｅ^R）：ＤＮＡｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼの略）のような ）ヌクレアーゼの使用を包含する。トリプシンのようなたんぱく質分解酵素は宿 主細胞、アデノウィルスまたは遊離のＡＡＶたんぱく質を酵素的に分解するため に使用されることが出来る。当業界に知られている洗浄剤、界面活性剤及び他の 化学剤はまた、単独で又は酵素処理と組み合わせて使用されることが出来る。 ＡＡＶ−感染細胞は、強化ポンプ送り込みシステムが短時間断続される一定圧 力の加圧様式を造るために促進吸引ストロークおよび長期スロー圧力ストローク を使用するミクロ流動化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）加圧セルのような 加圧セルに適用することによりさらに溶解されることが出来る。この圧力は、次 にＡＡＶの最大活性を穏やかに維持しながらＡＡＶ活性細胞を溶解するために使 用される。そのような加圧技術の使用の追加の利点は、そのような方法が微粒子 担体上での細胞の増殖を包含する、細胞培養の条件の規模を上昇させるために適 用されることが出来ることである。別法として、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）加圧 セル（イリノイ州ＤｅｅｒｆｉｅｌｄのＢａｘｔｅｒ製）、Ｍａｎｔｏｎ Ｇｏ ｕｌｉｎ均質化器（ホモジェナイザー）（イリノイ州Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄの Ｂａｘｔｅｒ製）またはＤｙｎｏｍｉｌｌが使用されることが出来る。得られた 溶解産物は次にガラス繊維フィルターまたは酢酸セルロースフィルターに通過さ せて濾過することにより清澄化されることが出来る。代わりのものは、Ｍｉｌｌ ｅｘ^RＤｕｒａｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏ ｒｅ製）フィルターおよびＧｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｕｆｆｒｙｎ^Rフ ィルター（ミシガン州アンアーバーのＧｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を包含 する。使用されることが出来るフィルターの寸法は、０．８μｍおよび０．４５ μｍを含む。もし真空濾過が使用されないならば、ガラスウールがまた、溶解産 物を清澄化するために使用されることが出来る。 ＡＡＶの大規模な精製のための、感染細胞溶解産物を分画化するための適当な カラムクロマトグラフィ方法は、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ−Ｓ（Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｈｉ Ｆｌｏｗ）（カリフォルニァ州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製） 、Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ−Ｓ（ネブラスカ州リンカーンのＩｓｃｏ製）、Ｃｅｌ ｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート（マサチューセッツ州ビバリーのＡｍｉｃｏｎ製） のようなサルフェート化樹脂の使用を包含する。そのようなサルフェート化樹脂 は、約４００〜５００ｍＭ、好ましくは約４７５ｍＭのＮａＣｌを含有する溶離 緩衝液を用いてＡＡＶから汚染性アデノウィルスを除去することが出来る。 ＡＡＶ精製において使用されるＤＥＡＥ含有樹脂はＰｕｒｅｓｙｎ ＤＥＡＥ （ペンシルベニア州マルバーンのＰｕｒｅｓｙｎ製）、ＥＭ Ｍｅｒｃｋ Ｔｅ ｎｔａｃｌｅ ＤＥＡＥ（ニュージャージー州ホワィトハウスステーションのＭ ｅｒｋ製）、Ｓｔｅｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＤＥＡＥ（カ リフォルニア州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、マクロ細孔ＤＥＡＥ 樹脂（ニューヨーク州メルビルのＢｉｏｒａｄ製）、ＤＥＡＥ ＡＣＴＩ−ＭＯ Ｄ^R（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ製）、ＤＥＡＥ ＭｅｍＳｅｐ^R（マサチューセッツ州ベッドフォー ドのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を包含するがしかしそれらに限定されなく、それら のすべては汚染性アデノウィルスを除去することが出来る。 Ｅｍ Ｍｅｒｃｋ Ｔｅｎｔａｃｌｅ ＤＥＡＥは長さで約１５〜５０単位の アクリルアミド誘導体の重合化鎖がグラフトされているオリゴエチレングリコー ル、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリトロイドから共重合されたマト リックスからなるイオン交換媒体である。Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆｌ ｏｗ Ｐｌｕｓ ＤＥＡＥは、ＤＥＡＥ反応性基が結合されている６％架橋アガ ロースからなる。マクロ細孔ＤＥＡＥ樹脂は、ＤＥＡＥ反応性基が親水性支持体 に結合されている、８０〜１００ｎｍの細孔寸法を有する剛性親水性支持体であ る。ＤＥＡＥ Ａｃｔｉ−Ｍｏｄ^Rカートリッジは、微細孔シリカ／ＰＶＣのシ ートからなる。これらのシリカシートは大きな均一な細孔と共に大きな表面積を 有する。細孔は、ＤＥＡＥのような活性な側鎖が結合されることが出来るシリカ と列をなしている。このタイプのマクロ細孔構造物は、幅で約１２，０００Å、 即ち１．２μｍの細孔を有している。ＤＥＡＥ ＭｅｍＳｅｐ^R樹脂において、 ＤＥＡＥ基は重合体マトリックスセルロースに共有的に結合されている。そのよ うな樹脂からのＡＡＶの回収のための適当な溶離緩衝液はｐＨ７．５の燐酸塩緩 衝液中に２００ｍＭのＮａＣｌを含む。 ＡＡＶの精製はまたＢｉｏｒａｄ（ニューヨーク州メルビル）販売のセラミッ クヒドロキシアパタイト樹脂を包含するヒドロキシアパタイト樹脂を使用する。 そのようなヒドロキシアパタイト樹脂からのＡＡＶの回収は１００〜１３５ｍＭ の燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．４、１０〜４００ｍＭの燐酸塩勾配）を用いての溶離 を使用する。そのカラムは、３０ｍＭの燐酸塩でまず洗浄されそして約１３５ｍ Ｍの燐酸塩でＡＡＶは溶離する）を用いての溶離を使用する。 本発明の特定の面において、セルロースまたはシリカ膜樹脂上でのクロマトグ ラフィはＡＡＶの有効な大規模の精製のためにマクロ細孔樹脂の使用と組み合わ せて使用される。マクロ細孔樹脂の例はＢｉｏＲａｄマクロ細孔シリーズ（ニュ ーヨーク州メルビル）またはＤＥＡＥ−Ｔｈｒｕｐｕｔ（６％架橋アガロース） （カリフォルニア州カールズバッドのＳｔｅｒｏｇｅｎｅ製）を包含する。シリ カまたはセルロース膜樹脂は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^TM１０１０ＨＰ（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ製）、ＡＣＴＩ−ＭＯＤ^RカートリッジまたはＣｙｃｌｏＳｅｐ^TM （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）らせ ん精製カラムを包含する。マクロ細孔樹脂 に関しての以前の研究は、ビーズでの８０ｎＭ細孔寸法が１４０ｎｍの直径を有 するアデノウィルスを排除するかまたは損傷するので、アデノウィルスの精製の ためにこれらが非常に有用であるとは示さなかった。しかしながら、この寸法制 限は、これらの樹脂がウィルス粒子の異なる寸法に基づいてＡＡＶ製剤から汚染 性アデノウィルスを除くことが出来るので、ＡＡＶ精製のためには有利である。 樹脂の細孔寸法の識別に基づいてアデノウィルスからＡＡＶを分離するために、 マクロ細孔樹脂の能力についてマクロ細孔樹脂を選択することは当業者の技術の 十分な範囲内にある。 本発明の特定の態様において、洗浄剤の存在下にＡＡＶ感染細胞の加圧溶解は 細胞溶解産物を生成し、これは濾過により清澄化される。次にその溶解産物は、 細胞たんぱく質および汚染性アデノウィルスからＡＡＶを分離するために一連の カラムに適用される。好ましい一連のカラム分離はセラミックヒドロキシアパタ イト、ＤＥＡＥイオン交換、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートおよび亜鉛キレ ートクロマトグラフィの使用を包含する。ＡＡＶは、次のとおりのカラムから回 収されることが出来る：（ｐＨ６．４の１００〜１３５ｍＭの燐酸塩で）ヒドロ キシアパタイト；（ｐＨ７．５の燐酸塩緩衝液中の２００ｍＭの塩で）ＤＥＡＥ イオン交換；（ｐＨ７．５の燐酸塩緩衝化食塩水中の４２５ｍＭの塩で）Ｃｅｌ ｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート；そして亜鉛キレートカラム（ｐＨ７．５のＨｅｐ ｅｓ緩衝液）からの流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）において。 ＡＡＶの精製のための特に好ましい態様は、以下の工程を包含する： Ｔｗｅｅｎ−８０およびトリプシンの存在下に、アデノウィルスでまた感染され ているＡＡＶ感染２９３細胞の加圧溶解および溶解産物中のウィルスの回収；０ ．４５μｍまたは０．８μｍの酢酸セルロースフィルターを通過させての濾過を 介して溶解産物の清澄化；セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、 そこで、結合されたＡＡＶはｐＨ６．４の１００〜１３５ｍＭの燐酸塩中の樹脂 から溶離される；ＭｅｍＳｅｐ^Rカートリッジを用いるＣＨＡ溶離液のＤＥＡＥ イオン交換クロマトグラフィ、そこで、結合されたＡＡＶは２００ｍＭの塩（ｐ Ｈ７．５の燐酸塩緩衝液）中の樹脂から溶離される；ＤＥＡＥ溶離液のＣｅｌｌ ｕｆｉｎｅ^Rサルフェートクロマトグラフィ、そこで、結合された ＡＡＶは４２５ｍＭの塩（燐酸塩緩衝化食塩水、ｐＨ７．５）中の樹脂から溶離 される；そして場合により亜鉛キレートクロマトグラフィ、そこでＡＡＶは流通 （ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画（Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５）において 回収される。 ＡＡＶはまた、低分子量汚染物質からＡＡＶを分離しそしてＡＡＶが空隙容量 （ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）で回収される、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００樹脂（ニ ューヨーク州ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ製）を用いてアデノウ ィルスから分離されることが出来る。 ここに記載された方法は、遠心分離ペレット化を行うことなしに、水性媒体中 で高い濃度で精製されたＡＡＶ粒子の回収を可能にする。同様に、その方法は密 度勾配遠心分離の使用なしでのミリグラム量のウィルスの生成に適している。 他のカラムの使用はＡＡＶの大規模な精製においてカラムクロマトグラフィを 使用することに向けられている本発明の範囲内である。 精製の実験計画の完全性を査定するために、当業者はＡＡＶウィルスが回収さ れるかどうかそして細胞たんぱく質および（アデノウィルスのような）汚染性ヘ ルパーウィルスが除去されたかどうかを調べるために任意の数の査定を使用する ことが出来る。ＡＡＶ回収および精製は種々のクロマトグラフィ工程からの回収 された分画におけるＡＡＶ ＤＮＡおよびＡＡＶたんぱく質の水準または感染性 ウィルスの力価からの水準を調べることにより監視されることが出来る。 ＡＡＶ ＤＮＡの水準はＡＡＶ−特異性プローブを用いて固定化ＤＮＡを検出 するスロットブロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ）装置を用いて調べられることが出 来る。ウィルス粒子の数は、既知の粒子数のサンプルから生成された標準曲線の 使用により調べられることが出来る。組み換え体ＡＡＶがβ−ガラクトシダーゼ のような標識遺伝子を含有する場合、回収されたウィルスの量は標識遺伝子生成 物（例えば、Ｘ−ｇａｌ）についての適当な査定によりあるいは遺伝子のＤＮＡ コピーを検出するアッセイ（例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応の略））により 調べられることが出来る。 別法として、ウィルスの存在は回収された分画に含有されるＡＡＶたんぱく質 の水準から調べられることが出来る。ウィルスたんぱく質はウェスターンブロッ ト（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈降反応、クーマシー染色ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥゲルあるいは当業者に知られているたんぱく質特徴づけおよび定量 化のための任意の他の方法によりアッセイされることが出来る。ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルがクーマシーで染色される場合、他の非−ＡＡＶたんぱく質の存在が、Ａ ＡＶ分画の濃度の指標として調べられることが出来る。 単離されたウィルス分画の純度は、分画中のたんぱく質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析、次にクーマシー染色そして濃度計を使っての濃度測定により調べされる。Ａ ＡＶウィルスのたんぱく質に関して、ＶＰ３は、通常、ウィルスたんぱく質の約 ８０％を表し、一方ではＶＰＩとＶＰ２とは一緒にして合計ウィルスたんぱく質 の約２０％を表す。純度はアッセイされたサンプル中の異種のたんぱく質の不存 在により査定される。 本発明の精製方法は天然に存在するウィルスまたは組み換え体ウィルスに適用 されることが出来る。 本発明の実施は、当業界の範囲にある分子生物学、たんぱく質分析および微生 物学の慣用の技術を使用する。そのような技術は、例えばニューヨークのＪｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９５年）発行Ａｕｓｂｅｌ等の監修のＣｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （この内容を参照することにより本明細書に組み入れる）に十分に説明されてい る。 本発明は以下の例に関して例示される。 例 １：２９３細胞からのアデノウィルスの抽出 Ａ．細胞からのアデノウィルスの抽出 ヒトの胎児細胞系（２９３）がアデノウィルスを増殖するために用いられた。 細胞単層が広範な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すまでウィルス感染細胞をインキ ュベートした。通常の感染時間は４８〜６０時間であった。燐酸塩緩衝化食塩水 （ＰＢＳ）中に細胞を収穫しそして１０００ｘｇでの遠心分離により収集した。 さらに使用するために細胞ペレットを−８０℃で凍結させるかまたは０．１％Ｔ ｗｅｅｎ−８０、１０％グリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ₂および５０μｍの ＺｎＣｌ₂を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。再懸濁の後に１０００ｐｓｉで ミクロ流動化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（マサチューセッツ州ニュー トンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ製のＭｏｄｅｌ ＨＣ５０００）を用いて細 胞を溶解しそして室温で１時間ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（２５００ 単位ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^R／１０⁸細胞）を用いて溶解産物をインキュベートした 。細胞破片を除くために、溶解産物は、それを（真空でなしに）ガラスウール中 に通過させることによりあるいは３．０μｍガラス繊維フィルター（カリフォル ニア州Ｓｉｅｒｒａ Ｃｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｒｃｏＦｉｌｔｒａｔｉ ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製＃Ｃ３００Ａ０９０Ｃ）中を通過させる真空濾過により 清澄化された。次にこれは０．８μｍ酢酸セルロースフィルター（カリフォルニ ア州ＳｉｅｒｒａＣｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製＃ＣＤ８０Ａ０９０Ｃ）を用いて濾過された。清澄化の後に 、溶解産物は直接にクロマトグラフィにかけられるか、あるいはクロマトグラフ ィにかける前に、Ｍｉｎｉｔａｎ限外濾過システム（マサチューセッツ州ベッド フォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製＃ＸＸ４２ＭＴ０６０）を用いて追加の濾過工 程に付された。Ｂ．限外濾過 （上記のとおりにして造られた）アデノウィルスで感染された２９３細胞から の溶解産物は以下の緩衝液（燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、０．０５％Ｔｗｅ ｅｎ−８０、１０％グリセロール、５０μＭのＺｎＣｌ₂）中で３００ｍｌ／分 から４００ｍｌ／分までの変化させる流速でＭｉｎｉｔａｎ限外濾過システム（ マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製＃ＸＸ４２ＭＴ０６ ０）中に通過された。限外濾過の後に感染性単位の回収を測定するために、再調 整物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）はウィルス力価アッセイを用いてアデノウィルス感 染性について検定し、一方では、再調整物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中のたんぱく 質の回収がＢＣＡアッセイ（イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｃｏ．の＃２３２２０）を用いて測定された。結果 表１はアデノウィルス感染された細胞についての溶解の方法としてミクロ流動 化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）加圧溶解および凍結−解凍の両方を用い ての活性アデノウィルスの回収間の比較を提供する。ミクロ流動化器（ｍｉｃｒ ｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）および洗浄剤含有緩衝液を用いて、凍結−解凍による溶 解と比較して加圧溶解で活性ウィルスの９６％回収があった。したがって、ミク ロ流動化器は多量の細胞を一回で処理させることを可能にする利点を有する、別 の有効な溶解法を提供する。また、ミクロ流動化基が微粒子担体に結合された細 胞を有効に溶解することが出来るので、微粒子担体上で細胞を増殖することを包 含する細胞培養条件の規模を上昇させるための方法が可能である。細胞の溶解は 、宿主細胞、カプセル化されていないかまたは不完全なアデノウィルスの核酸を 分解するヌクレアーゼであるＢｅｎｚｏｎａｓｅ^Rの存在下に起こった。 細胞の溶解の後に、得られた溶解産物は、ガラスウール中を通過させる濾過に より、あるいは３．０μｍガラス繊維フィルター（カリフォルニア州Ｓｉｅｒｒ ａ Ｃｏｕｒｔ−ＤｕｂｌｉｎのＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ ｍｓ製＃３００Ａ０９０Ｃ）中に通過させての真空濾過を用いることにより清澄 化されて、細胞破片を除去した。次に、０．８μｍ酢酸セルロースフィルター（ ＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いての追加の濾過工 程が行われた。典型的には８４％の活性アデノウィルスが最終の清澄化溶解産物 において回収される一方で、ほんの４３％だけの合計細胞溶解産物たんぱく質が 回収された。 次に、カラムクロマトグラフィにかける前に、清澄化された細胞溶解産物をさ らに精製するために限外濾過が用いられた。アデノウィルスの分子寸法は１５０ ｘ１０⁶ダルトンであり、一方では大半の宿主細胞汚染性たんぱく質の分子寸法 はより低いと予想される。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｎｉｔａｎ^R限外濾過 システム（３００ｋＤａの分子量カット膜）が使用された。表２は感染性アデノ ウィルス単位の最大回収が、膜中を通過する流速が２００ｍｌ／分でありそして 緩衝液がグリセロール及びトリプシンを含有したときに達成されたことを示す。 これらの条件下、１００％のアデノウィルス活性度が達成された一方で、５５％ の宿主細胞たんぱく質が除去された。（微粒子担体上で増殖されそして）アデノ ウィルスで感染された２９３細胞の攪拌培養がこれらの研究で用いられた。それ 故に、有効な細胞溶解および微粒子担体上で増殖された２９３細胞からの活性ア デノウィルスの放出はＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ^R加圧セルを用いて可能で ある。 例 ２： アデノウィルスのクロマトグラフィ精製 カラム樹脂がＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣを用いてそれらの分離特性につい て試験された。方法 １．ＤＥＡＥクロマトグラフィ Ａ．アデノウィルス １０％グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び５０μＭのＺｎＣｌ₂ を含有する燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１５０ｍ ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．５））を用いてＤＥＡＥ Ｍｅ ｍＳｅｐ^R１０１０ＨＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カラム（５ｍｌ）を平衡化さ せた。例１において造られたとおりのアデノウィルスで感染された２９３細胞か らの清澄化された溶解産物は、（ＰＢＳ、１０％グリセロール、０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０μＭのＺｎＣｌ₂中の）予め平衡化され たカラムに５ｍｌ／分の流速で適用された。そのカラムを、１０ｍＭのＮａ₂Ｈ ＰＯ₄、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＫＣｌで洗浄しそして１０ｍ ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅ ｎ−８０および５０μＭのＺｎＣｌ₂中のＫＣｌとＮａＣｌとの線形勾配（１０ ０ｍＭ〜１Ｍ）を５ｍｌ／分の流速で樹脂に適用した。結合されたたんぱく質を 樹脂から溶離しそして５ｍｌの分画で集めた。各々の分画を（下に記載されたと おりにして）（ａ）アデノウィルスＤＮＡおよび（ｂ）アデノウィルスたんぱく 質、について監視した。アデノウィルスのＤＮＡおよびたんぱく質の両方につい て陽性であった分画を、ウィルス力価アッセイを用いて活性についてさらにアッ セイした。 Ｂ．ＡＡＶ アデノ随伴ウィルスＡＡＶで感染された２９３細胞からの細胞溶解産物はまた 、上記のとおりにしてＤＥＡＥ ＭｅｍＳｅｐ^Rクロマトグラフィを用いてクロ マトグラフィにかけられた。しかしながら、細胞を溶解しそしてカラムを平衡化 するために用いられた緩衝液は５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％のＮＰ−４０を含 有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であった。結合されたたんぱく 質はアデノウィルス精製のために上に記載されたとおりの塩勾配を用いて樹脂か ら溶離された。樹脂から集められた分画は、スロットブロットアッセイ（ｓｌｏ ｔ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）を用いてＡＡＶ ＤＮＡについてアッセイされそし てＡＡＶの３種のキャプシドたんぱく質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対して の抗体（マサチューセッツ州ベルモントのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓのカタログ０３−６５１５８）を用いて免疫ブロットにより Ａ ＡＶたんぱく質についてアッセイされた。 ２．ゲル濾過クロマトグラフィ Ａ．アデノウィルス 次に、ＰＢＳ、１０％グリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０μＭのＺｎＣ ｌ₂およびし０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を用いて平衡化されたＳｕｐｅｒｄ ｅｘ^R２００ＨＲ２６／６０カラム（Ｐｈａｍａｃｉａ製）を用いてゲル濾過ク ロマトグラフィが行われた。アデノウィルスのたんぱく質およびＤＮＡの両方の 存在を示した、ＤＥＡＥ樹脂から溶離された分画は貯留され（ｐｏｏｌｅｄ）そ してかき混ぜセル（Ａｍｉｃｏｎ製）を用いて、１５ｍｌの容量に濃縮された。 １ｍｌ／分の流速でサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ^R樹脂に適用しそして溶離中に １．５ｍｌ分画を集めた。下に記載されたとおりにして分画をアデノウィルスの ＤＮＡおよびたんぱく質についてアッセイした。 Ｂ．ＡＡＶ （下に記載された）塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスは最終塩 化セシウムは最終塩化セシウム密度勾配遠心分離の後に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R樹 脂に直接適用された。これは、通常透析により除去された、サンプル中の塩化セ シウムの濃度を減少させるためであった。 幾つかの実験において、ＤＥＡＥカラム上でクロマトグラフィにかける前に、 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００ＨＲ２６／６０を用いてＡＡＶの全細胞溶解産物のゲ ル濾過クロマトグラフィが行われた。 本発明のこの面に従って有用な追加の重合体材料は、Ｓｕｌｆａｔｅ Ｓｐｈ ｅｒｉｌｏｓｅ（ＩＳＣＯ製）のような、架橋されたセルロース重合体を包含す る。結果 図２はアデノウィルスを含有する２９３細胞溶解産物のクロマトグラフィの後 に、ＤＥＡＥ ＭｅｍＳｅｐ^R樹脂からのアデノウィルスの典型的な溶離プロフ ィルを示す。すべてのアデノウィルスは該ＤＥＡＥ樹脂に結合しそして（傾斜線 により表される）樹脂に適用された塩勾配を用いて溶離された。溶離プロフィル 上に示されるように、アデノウィルスは５００〜７００ｍＭのＮａＣｌ間で樹脂 から溶離した。このピークは初期全細胞溶解産物中の１０％未満の合計たんぱく 質を含有した一方で、典型的には６０〜１００％のアデノウィルス活性が回収さ れた。この溶離された分画の追加の精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００樹脂を用 いてゲル濾過クロマトグラフィにより達成された。最も高い力価を有した、ＤＥ ＡＥカラムからの分画が貯留され、Ａｍｉｃｏｎかき混ぜセルを用いて濃縮され そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ^R樹脂に適用された。アデノウィルスは、樹脂の空隙容 量（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）で溶離した（図３）。この分画において約５０〜 ７０％のアデノウィルス活性が回収された。カラムから溶離されたすべての分画 についてのたんぱく質評価（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．）は、ゲル濾過工程が約７０％の汚染性たんぱく質を除去したことを示した。 図４は先行技術の塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスと比較された 、ＤＥＡＥおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィの組み合わせにより精製され たアデノウィルスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。カラムクロマトグラフィによ り精製されたアデノウィルスにおいて存在するいくらかの追加のたんぱく質バン ドがあった。アデノウィルスの追加の精製を達成させるために、他の樹脂が、こ れらの汚染性たんぱく質を除去するそれらの能力について評価された。例 ３： 疎水性クロマトグラフィ 方法 ４種のことなるタイプの疎水性樹脂が、例２のアデノウィルス製剤からの汚染 物質を除くそれらの能力について試験された：ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏｐｒｅ ｐ^Rカラム（ブチルおよびメチル）およびＴｏｓｏｈａｕｓ^R６５０Ｍ（６５μｍ ）（フェニルおよびエーテル）。２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭの燐酸塩緩 衝液（ｐＨ７．５）中の各々の疎水性樹脂にアデノウィルスを適用した。０．１ ５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７ ．５）を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。結果 流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析は、これらの樹脂を用いて、他の細胞成分からのアデノウィルスの分離が殆 どなかったことを示した。例 ４ ：陽イオン交換樹脂 方法 ＣＭおよびＳＰ ＭｅｍＳｅｐ^Rカートリッジ（マサチューセッツ州ベッドフ ォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^RＳＯ₃（ＥＭ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ製の触手イオン交換樹脂）およびＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｓ^R は、２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０％グリセロールおよび０． ０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７ ．５）中で、別々に平衡化された。０．２５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する同 じ緩衝液中の樹脂の各々にアデノウィルスで感染された２９３細胞からの細胞溶 解産物を適用した。それらのカラムを１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭのＮ ａＣｌ及び１００ｍＭのＫＣｌで洗浄しそして１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７ ．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０及び５０μＭのＺ ｎＣｌ₂中のＫＣｌとＮａＣｌの線形勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて、結合 されたたんぱく質を該樹脂から溶離した。Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｓ^Rクロマトグ ラフィの結果を表５に示す。例 ５： Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂（マサチューセッツ州ビバリーのＡｍｉ ｃｏｎ製）を用いてのすべての実験のために、アデノウィルスで感染された２９ ３細胞からの細胞溶解産物は、また１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０５％ のＴｗｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ₂および５０μＭのＺｎＣｌ₂を含有する ２５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の溶液中の 該樹脂に適用された。１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．５）、１０％のグリセ ロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０および５０μＭのＺｎＣｌ₂中のＮａＣ ｌとＫＣｌの線形塩勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて、結合されたたんぱく質 を樹脂から溶離した。流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画 の両方はアデノウィルスＤＮＡについてアッセイされそして下に記載 されたとおりにして抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットされた。結果 たいていは有意義な精製を提供して来た樹脂、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェ ートは、しかしながら、殆どのアデノウィルスが、活性形で存在する精製された 生成物には導かなかった。Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートは、繰り返しグル コース下位単位の第６炭素でエステル化されたスルホネート基を有するセルロー スマトリックスからなる（Ｐ．Ｆ．Ｏ’Ｎｅｉｌ等によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ １１（１９９３）ｐｐ１７３〜１７８）。この樹脂へのたんぱく質の結 合はその多糖類部分を介して生ずると考えられる。アデノウィルスは表面糖たん ぱく質を有しない、膜で包まれていないウィルスなので、それはこの樹脂に結合 する筈がなく、一方では殆どの細胞の糖たんぱく質は汚染物質として存在するで あろうと考えられた。 表３はＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート上でのクロマトグラフィにかけた後 のアデノウィルスの活性の回収についての結果を示す。アデノウィルスのたんぱ く質およびＤＮＡは予期されたように、流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）容量 で回収されたがしかしこの分画において約１０％未満のアデノウィルス活性が回 収された。Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート上のクロマトグラフィにかけてい る間のウィルスの不活性化は、約８０ｎｍの平均直径を有する、樹脂のビーズの 細孔を包含する有害な相互作用／分配の結果であった可能性がある。例 ６ ：ヘパリン樹脂 方法 以下のヘパリン樹脂の各々がアデノウィルスを精製するそれらの能力について 評価された：Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^RＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ（４％架橋、Ｓｉｇｍａ製）、Ｈｉ Ｔｒａｐ^RＨｅｐａｒｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｕｐ ｅｒｆｌｏｗ Ｐｌｕs^R（６％架橋、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ製）、Ｈｅｐａｒｉｎ ＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rカートリッジ^R（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ． 製）。 ヘパリン樹脂を用いてのすべての実験のためにアデノウィルスで感染された２ ９３細胞からの細胞溶解産物は、また１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０５ ％Ｔｗｅｅｎ−８０、２ｍＭのＭｇＣｌ₂および５０μＭのＺｎＣｌ₂を含有する 、２５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の溶液中 の樹脂に適用された。結合されたたんぱく質は、１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ ７．５）、１０％グリセロール、０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０および５０μＭ のＺｎＣｌ₂中のＮａＣｌとＫＣｌの線形塩勾配（１００ｍＭ〜１Ｍ）を用いて 樹脂から溶離された。流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および溶離された分画 の両方は、アデノウィルスのＤＮＡについてアッセイされそして下に記載された とおりにして抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットされた。結果 Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートの落胆する性能についての原因をさらに理 解するためにヘパリン化重合体（樹脂）の性能がまた調べられた。 Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートと同様に、ヘパリンはスルホン化多糖類であ りそして共通している或る結合特性を有すると予想される。しかしながら、Ｃｅ ｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートとは異なって、それは種々の細孔寸法の種々の異 なるビーズ化された樹脂に架橋された１種またはそれ以上の形で市販されている 。表３は種々のヘパリン−結合樹脂のスクリーニングの結果を示す。試験された 樹脂のすべてはウィルスサンプルを汚染した細胞たんぱく質（ＢＣＡにより測定 されたものとして）の＞４０％を結合したが、しかし活性ウィルスの１００％回 収を提供した唯一の樹脂は６％架橋されたアガロースであるＳｔｅｒｏｇｅｎｅ^R ヘパリンアガロースである。一般的に言えば、約６百万ダルトンの排除限界を 有する６％アガロースマトリックスは、例えば４％架橋および約２千万ダルトン の排除限界を有するアガロースゲルよりも小さな細孔を有するであろう。その平 均細孔寸法の故に、該６％架橋アガロースはクロマトグラフィ中にアデノウィル スを完全に排除した可能性がある。結果として、活性アデノウィルスは流通（ｆ ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収された。 アデノウィルスで感染された２９３細胞からの溶解産物は、上に記載されたと おりのヘパリンＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rデスクを用いてクロマトグラフィにかけられ た。アデノウィルスは流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画において回収され そしてＤＥＡＥイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィの組み合わせを用い てさらに精製された。ＧＦカラムからのアデノウィルス分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析は、（カラムクロマトグラフィにより精製された）アデノウィルスの純度が 、ＣｓＣｌ遠心分離により精製された対照アデノウィルスと同程度に純粋であっ たことを示した（図５）。図６は図５において分析された分画の濃度計による濃 度測定分析を示す。例 ７： ＢｉｏＲａｄセラミックヒドロキシアパタイト（８０μｍ細孔寸法） ２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂および１０％のグリセロールを含有 する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いてＢｉｏＲａｄヒドロキシ アパタイトカラムを平衡化した。アデノウィルスまたはＡＡＶを同じ緩衝液中の 樹脂に適用した。すべてｐＨ７．５で、燐酸ナトリウムの１０ｍＭから３００ｍ Ｍに増加させている線形塩勾配を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離 した。例 ８： 分配用（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）重合体 一連の分配用重合体（樹脂）が活性なアデノウィルスを精製するその能力につ いてスクリーニングされた（表４）。試験された重合体の大半は有意義な精製を 提供したが、しかしほんの僅かのものだけが活性形で精製されたアデノウィルス の回収に導いたことが見い出された。一般に、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｅｍ Ｓｅｐ^RカートリッジまたはＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rカートリッジ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のような、膜−ベースカー トリッジ重合体（樹脂）は活性なウィルスの良好な回収を与えた。これらの製品 の優れた性能はこれらのカートリッジにおける膜マトリックスの開いているマク ロ細孔構造に起因している可能性があると信じられる（これらの好ましい例にお いて、ＤＥＡＥ基は、ＭｅｍＳｅｐ^Rの場合において重合体マトリックスセルロ ースに共有出来に結合されており、あるいはＡＣＴＩ−ＭＯＤ^Rの場合において シリケートに共有結合されている）。（幅において約１２，０００Å、即ち、１ ．２μｍの開口（細孔）を有する）このタイプのマクロ細孔構造は、（繊維を含 む）約１４０ｎｍの直径を有するアデノウィルス粒子の迅速な通過を可能にする 。 表５はアデノウィルス精製のための種々のクロマトグラフィ方法の概要表であ る。 例 ９： アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の精製 遺伝子治療におけるベクターとしてＡＡＶを用いて伴う主な問題の一つは、十 分な量のウィルスの生成である。現在、ＡＡＶは、一般に活性なウィルスの非常 に低い収率（０．３〜５％）を生ずる、密度勾配超遠心分離技術により精製され ている。しかしながら密度勾配超遠心分離は、２９３細胞においてＡＡＶを増殖 するのにヘルパーウィルスとして使用されるアデノウィルスから、ＡＡＶを分離 するのに非常に有効である。本発明はＡＡＶの収率を増大させるために、感染細 胞からのＡＡＶの抽出のための改良された方法をカラムクロマトグラフィ工程と 組み合わせることを提供する。 感染された２９３細胞からのＡＡＶの改良された抽出は洗浄剤（Ｔｗｅｅｎ− ８０）の存在下の細胞の加圧溶解により達成された。例１において上に提供され たとおりの溶解産物の清澄化の後に、ＡＡＶはゲル濾過クロマトグラフィにより 他の細胞のたんぱく質から分離された。図７ａはＡＡＶ感染された２９３細胞溶 解産物をクロマトグラフィにかけた後の、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^R２００樹脂（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ製）からの溶離プロフィルを示す。空隙容量ピークは、この分画 のスロットブロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ）分析および免疫ブロットにより検出 されたものとして、大部分のＡＡＶを含有する。 このピークの追加の精製は、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^Rカートリッジを用いて イオン交換クロマトグラフィにより達成された。ＤＥＡＥカラムはアデノウィル スからＡＡＶを分離するのに非常に有効であった。使用された条件（２５ｍＭの ＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有す る１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５））下、ＡＡＶおよびアデノウィルス の両方は、ＤＥＡＥ−樹脂に結合した。線形塩（ＫＣｌおよびＮａＣｌ）勾配が 樹脂に適用されたとき、ＡＡＶは２００ｍＭの塩で溶離し（図７、パネルＢ）、 一方ではアデノウィルスは樹脂にかなりしっかりと結合したままの状態であって そして後に５００〜７００ｍＭのＮａＣｌでの勾配で溶離された（図７、パネル Ｂ）。それ故に、ＡＡＶおよびアデノウィルスはＤＥＡＥイオン交換クロマトグ ラフィを用いてお互いから有効に分離されることが出来る。ＡＡＶを含有する２ つのＤＥＡＥ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は図８において示される。ＤＥＡＥ分 画＃７におけるＡＡＶの活性度は６．５ ｘ １０⁷ｉ．ｕ．／ｍｌ又は３．８ ｘ １０⁸ｉ．ｕ．の合計であった。ＤＥＡＥ貯留分画におけるＡＡＶの活性 度は１．３８ ｘ １０⁷ｉ．ｕ．／ｍｌまたは２．７６ ｘ １０⁸ｉ．ｕ．の 合計であった。総合して、これらの分画はＤＥＡＥ樹脂に適用されたＡＡＶ感染 性単位のおおよそ１００の回収を提供する。例 １０： ２９３細胞からのＡＡＶの抽出 ヒトの胎児細胞系（２９３）はまた、ＡＡＶを増殖するために用いられた。ウ ィルス感染された細胞は、細胞単層が広範な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すまで インキュベートされた。細胞を収穫しそして１０００ ｘ ｇでの遠心分離によ り集めた。細胞ペレットはさらに使用するために−８０℃で凍結されるかあるい は１０ｍＭのＮａＰｉ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２ｍＭの ＭｇＣｌ₂（ｐＨ６．４）中に再懸濁された。 再懸濁の後に、細胞を室温で１時間ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^Rで処理し、次に１％ Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下にトリプシン処理を行った。次に、１０００ｐｓｉで Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（マサチューセッツ州ニュートンのＭｉｃｒｏｆ ｌｕｄｉｃｓ製）を用いて細胞を溶解した。得られた溶解産物は、クロマトグラ フィにかける前に、３．０μｍガラスフィルター中を通しての真空濾過により清 澄化されて細胞破片を除き、次に０．８μｍの酢酸セルロースフィルター（Ｍｉ ｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて濾過工程を行うかあ るいは０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ^RＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）フィルター ユニット中を通過させて濾過された。例 １１： ＡＡＶのクロマトグラフィ精製 ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣを用いて、有効なＡＡＶ精製特性について種々 のクロマトグラフィ樹脂が試験された。以下のシリーズのクロマトグラフィ工程 は特に有用であることが分かった。 ａ）ＢｉｏＲａｄセラミックヒドロキシアパタイト（８０μｍ細孔寸法） （アデノウィルスの存在下に）ＡＡＶで感染された２９３細胞からの細胞溶解 産物（例１０）は、１０ｍＭのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールを含有する １０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ６．４）で予め平衡化されたＢｉｏＲａｄヒドロ キシアパタイトカラム上でクロマトグラフィにかけられた。ＡＡＶを同じ緩衝液 中の該樹脂に適用した。ｐＨ６．４で１０ｍＭから４００ｍＭまでの増大させて いる燐酸ナトリウムの勾配を用いて樹脂から結合たんぱく質を溶離した。樹脂か ら集められた分画はスロットブロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ）アッセイを用いて ＡＡＶ ＤＮＡについてアッセイされそしてＡＡＶの３種のキャプシドたんぱく 質のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対する抗体（マサチューセッツ州ベルモント のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓからのカタログ０３ −６５１５８）を用いて免疫ブロットによりＡＡＶたんぱく質についてアッセイ された。樹脂から溶離された分画はまた、抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブ ロットによりアデノウィルス汚染性たんぱく質について分析された。 図９Ａは、ＡＡＶおよびアデノウィルスを含有する２９３細胞溶解産物をクロ マトグラフィにかけた後の、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）の典型 的な溶離プロフィルを示す。ＡＡＶおよびアデノウィルスのすべてはＣＨＡ樹脂 に結合しそして燐酸塩勾配を樹脂に適用したときに溶離された。ＡＡＶは溶離プ ロフィルについて示されるように、１２５ｍＭの燐酸塩で樹脂から溶離した。こ のピークは、初期全細胞溶解産物中の２０％未満の合計たんぱく質を含有する一 方で、典型的に８０％のＡＡＶ活性が回収された。溶離されたＡＡＶピークはま た、免疫ブロットによりおよび力価分析により測定されたとき、若干の汚染性ア デノウィルスたんぱく質を含有した（表５）。 ｂ）ＤＥＡＥクロマトグラフィ（陰イオン交換） アデノウィルスからＡＡＶを分離するために、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^Rカラ ムを用いるイオン交換クロマトグラフィが使用された。ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^R １０１０ＨＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）カラム（５ｍｌ）は、５０ｍＭのＮａ Ｃｌ、１０％のグリセロールを含有する１０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５） で平衡化された。（上記）ヒドロキシアパタイトカラムから溶離されたＡＡＶ含 有分画は貯留されそしてＤＥＡＥ樹脂の平衡化のために用いられ たと同じ緩衝液中に透析された。１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．５）および １０％のグリセロール中のＫＣｌおよびＮａＣｌの線形塩勾配（５０ｍＭ〜２Ｍ ）が５ｍｌ／分の流速で樹脂に適用された。結合されたたんぱく質は、樹脂から 溶離されそして２．５ｍｌ分画に集められた。ＡＡＶは２００ｍＭの塩で溶離し た一方で、アデノウィルスは５００〜７００ｍＭ塩で溶離した。各分画は、ａ） ＡＡＶたんぱく質（クーマシーブルー染色および免疫ブロット）；ｂ）ＡＡＶ ＤＮＡ；ｃ）汚染性アデノウィルスたんぱく質およびｄ）感染性、について監視 された。 使用された条件（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび０．０５ ％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５））下 に、ＡＡＶおよびアデノウィルスの両方は、ＤＥＡＥ−樹脂に結合した。線形塩 勾配が樹脂に適用されたとき、ＡＡＶは２００ｍＭ塩で溶離した（図９Ｂ）一方 で、アデノウィルスは樹脂にいっそうしっかりと結合した状態のままでありそし て後に、５００〜７００ｍＭのＮａＣｌでの塩勾配で溶離された（図９Ｂ）。そ れ故に、ＡＡＶとアデノウィルスとは陰イオン交換（ＤＥＡＥ）クロマトグラフ ィを用いて有効に分離されることが出来る。ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ^RからのＡ ＡＶの活性の回収は７５％であった（表５）。ＤＥＡＥ樹脂からの貯留されたＡ ＡＶ含有分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１０、レーン３）は、いぜんとして若 干の汚染性たんぱく質の存在があったことを示したので、この分画はＣｅｌｌｕ ｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂を用いてさらに精製された。レーン１〜４は、等し いパーセンテージの各々の分画（０．５％）を表しそして精製を通じてのＡＡＶ たんぱく質の回収を示す。レーン５は最終ＡＡＶ含有分画の大きなパーセンテー ジを表しそしてＡＡＶたんぱく質のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の一層強い着色 を提供する。ＡＡＶのＤＮＡおよびたんぱく質の両方について陽性であった分画 を貯留しそしてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂を用いてさらにクロマト グラフィにかけた（下記）。 ｃ）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂（Ａｍｉｃｏｎ製） １０％グリセロールを含有するＰＢＳを用いてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェ ート樹脂を平衡化した。ＡＡＶのたんぱく質およびＤＮＡを含有するＤＥＡＥ樹 脂から溶離された分画を貯留しそして１ｍｌ／分の流速で樹脂に適用した。樹脂 を２５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄しそしてＰＢＳ／グリセロール中の０．２５〜１ ＭのＮａＣｌの線形塩勾配を適用した。この塩勾配を用いて樹脂から溶離された 物質および流通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画の両方は、ａ）ＡＡＶたんぱ く質（免疫ブロット）；ｂ）ＡＡＶ感染性（力価分析）；ｃ）アデノウィルスた んぱく質（免疫ブロット）；およびｄ）アデノウィルス感染性（力価分析）につ いて分析された。使用された緩衝液条件下、ＡＡＶは樹脂に結合しそして４７５ ｍＭの塩で溶離された（図９Ｃ）。アデノウィルスのたんぱく質およびＤＮＡは 流通分画において回収された。 表５は幾つかの精製操作からのＡＡＶ活性の回収を示す。図１０は各カラムか らの精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。上に記載された ３種のカラム精製処理は４８％のＡＡＶ収率および＞９０％純粋の純度を提供し た（図１１）。図１２は、ＣｓＣｌ勾配法を用いて精製されたＡＡＶと本発明の カラム精製処理を用いて精製されたＡＡＶとを比較する、クーマシー染色ゲルで ある。このゲルは両方の方法を用いて精製されたＡＡＶが比較し得る純度のもの であることを示す。また、上記方法により精製されたＡＡＶはＲｅｐたんぱく質 が存在しないことが示された（図１３）。図１３は、既知のＲｅｐ標準と一緒に 、カラム精製されたＡＡＶの（抗Ｒｅｐ抗体を用いる）免疫ブロットを示す。Ａ ＡＶ活性の約７１％がＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート溶離液において回収さ れる一方で、１％未満のアデノウィルス活性が同じ分画で回収される。 したがって、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェートは２つの主要な用途を有し、 即ち、ａ）それはＡＡＶ製剤中の汚染性アデノウィルスの水準を減少させる、そ してｂ）それはＡＡＶ含有分画を濃縮する。しかしながらＣｅｌｌｕｆｉｎｅ^R サルフェートクロマトグラフィにかけた後に、汚染性アデノウィルスの水準が減 少される事実にもかかわらず、いぜんとして若干の低水準のアデノウィルス活性 （６．７３ ｘ １０³ＩＵ／ｍｌ）が残っている。 ｄ）亜鉛キレートクロマトグラフィ 汚染性アデノウィルスのすべてを完全に除去するために、亜鉛キレートクロマ トグラフィを用いる追加のクロマトグラフィ工程が使用された。金属とのウィル ス粒子（ｖｉｒｉｏｎｓ）の相互作用はウィルスおよびバクテリアファージの研 究から推論された。本発明者の実験室からの以前の研究はアデノウィルスが亜鉛 金属親和性カラムに吸着することが出来ることを示した。 Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂から回収された精製ＡＡＶの最終の分 画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、次に抗アデノウィルス抗体を用いる免疫ブロッ トにより分析された。これは最終ＡＡＶ含有分画中のアデノウィルスの汚染の水 準を調べるためであった。免疫ブロットは、検出出来るアデノウィルスたんぱく 質が存在しなかったことを示した一方で、力価分析はアデノウィルス活性が全体 活性のほんの１％を表したにすぎなかったけれども、この分画における若干のア デノウィルス活性があったことを示した（表６）。 その固定化された亜鉛カラムは、１容量の１００ｍＭのＥＤＴＡおよび１容量 の０．２ｍＭのＮａＯＨで順次カラムを洗浄することにより金属装入のために造 られた。そのマトリックスは、氷酢酸で酸性化された水中の１００ｍＭのＺｎＣ ｌ₂で洗浄することにより亜鉛が装入された。次にそのカラムは、水で洗浄され そして４５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂および０．０５％のＴｗｅｅ ｎ−８０を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）で平衡化された。Ｃｅ ｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂から溶離されたＡＡＶ含有分画を亜鉛キレー ト樹脂に適用した。装入の後に、４５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、 １０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍＭ のＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）から、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０％のグリセロールおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍ ＭのＨｅｐｅｓまでの、１０カラム容量線形勾配を用いて、カラムを洗浄した。 溶離は、１０カラム容量にわたって、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨｅｐ ｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂中の線形（０〜５００ｍＭ）グリシン 勾配を用いて行われた。 Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ^Rサルフェート樹脂から溶離されたＡＡＶ含有分画は４５ ０ｍＭのＮａＣｌ中の亜鉛キレート樹脂に適用された。流通分画が集められそし て結合されたたんぱく質はグリシン勾配を用いて溶離された。流通分画のＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析は、ＡＡＶのすべてが流通で回収されたことを示した一方で、抗 アデノウィルス抗体を用いての免疫ブロットは、アデノウィルスが亜鉛キレート 樹脂に結合しそしてグリシンの増大させる勾配の存在下に溶離されたことを示し た。亜鉛キレートクロマトグラフィを用いる初期の実験は、それがＡＡＶとアデ ノウィルスの分離のために有用な樹脂であり得ることを示した。 その精製方法は３０％〜４０％の全体的収率と共に７０％より大きい純度があ ったＡＡＶを生成した。 例 １２： ウィルスの密度勾配精製 標準の組み換え体アデノウィルスまたはＡＡＶウィルスは、３工程遠心分離方 法により造られた。感染された細胞は、ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^Rの存在下に凍結− 解凍の３サイクルにより溶解された。溶解産物は４℃で３５００ｒｐｍで１５分 間、卓上遠心分離機において遠心分離された。ペレットは捨てられそして上澄液 は、１．２７ｇ／ｃｍ³のＣｓＣｌおよび１．４ｇ／ｃｍ³のＣｓＣｌ不連続ス テップ勾配上に層状に置かれそして１．５時間２６，０００ｒｐｍで遠心分離さ れた。ウィルスバンドを集め、１．３４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌと混合しそして６０ ，０００ｒｐｍで少なくとも２時間遠心分離した。この第１平衡勾配からのウィ ルスバンドを集め、１．３４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌと混合しそして一夜３０，００ ０ｒｐｍで再遠心分離した。この工程からの最終のウィルスのプールは１％のス クロースを補充した燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対して広範に透析された。 別法として、上に記載されたようなＳｕｐｅｒｄｅｘ^R樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ製）上でのゲル濾過によりＣｓＣｌを除去した。例 １３： アガロースゲルを用いてのアデノウィルスＤＮＡの検出 カラム分画を、先ず１５分間０．１％のＳＤＳで処理し、次に室温で１時間プ ロナーゼ（Ｓｉｇｍａ製）で消化した。消化が完了した後に、フェノール：ＣＨ Ｃｌ₃：イソアミルアルコールの１容量で２回抽出し、次に−２０℃で２０分間 氷冷９５％エタノールの２容量で沈殿させた。沈殿物を４℃で２０分間１３，０ ００ ｘ ｇでペレット化した。サンプルをＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ） 中に再懸濁させた。アデノウィルスＤＮＡの制限酵素消化を行いそして４時間、 １２０Ｖでまたは一夜３５Ｖで０．８％アガロースゲル上の診断アデノウィルス 断片についてその消化物を分析した。例 １４： ＡＡＶ ＤＮＡの検出のためのカラム分画のスロットブロット分析 カラム分画を、スロットブロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ）分析によりＡＡＶ ＤＮＡについてアッセイした（ＡＡＶ ＤＮＡは、またリポーター遺伝子として ｌａｃＺを含有する、マィアミのフロリダ大学のＤｒ．Ｎ．Ｍｕｚｙｃｚｉａに より提供されたベクター構成体中に存在した：図１４参照）。サンプルはアデノ ウィルスを不活性化するために２０分間５６℃でインキュベートし、次に１５分 間３７℃でＤＮａｓｅＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩの略）で処理して非ウィ ルス粒子ＤＮＡを分解させた。次にＤＮａｓｅＩは１０分間６８℃での熱処理に より不活性化された。サンプルのたんぱく質分解酵素Ｋ処理の後に、フェノール ／クロロホルムを用いてＤＮＡを抽出しそして３ＭのＮａＯＡｃで沈殿させた。 ＤＮＡをＧｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ膜に適用しそして予備ハィブリッド 形成およびハィブリッド工程形成の後に、Ｐ³²ランダム標識ＣＭＶ β−ｇａｌ Ｐｖｕ II 断片を用いて膜をプローブした。サンプル中のＡＡＶの粒子の数は 、ｐＴＲｌａｃＺ ＤＮＡ標準曲線を用いて計算された。例 １５： ウィルスたんぱく質検出 ４〜２０％勾配または１０〜２０％勾配（Ｄａｉｉｃｈｉ製）ゲルのいずれか を用いて一次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クーマシーブルーを用いてゲル中 のたんぱく質を検出した。免疫ブロットのために、ＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ製） はメタノールで再湿潤されそして１０％メタノールを含有する１０ｍＭのＣＡＰ Ｓ（ｐＨ１１）中に浸された。ゲルは１０分間この転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）緩 衝液中で平衡化されそして次にＮｏｖｅｘ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ中で１時間 ３０Ｖでブロットされた。転移の後に、膜が１時間ＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣ ｌを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中の１％乾燥ミルク でブロックされた。ブロックの後に、膜は、抗アデノウィルス抗体（Ｌｅｅ Ｂ ｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ製）でプローブされるかまたは２時間０．１％のＢＳＡ を含有する、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５ ）および０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０（ＴＢＳＴ）中の抗−ＶＰ１、ＶＰ２、 ＶＰ３（ＡＡＶ）抗体でプローブされた。膜は、２０分間、ホースラデイシュペ ルオキシダーゼ（またの名は、わさびだいこんペルオキシダーゼ）標識化抗マウ スＩｇＧでインキュベートされそして免疫反応性バンドは、ＢＭ Ｃｈｅｍｉｌ ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎＳｙｓｔｅｍ（ベーリングマンハイム製）を用いて化学発光により可視化され た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＢ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ (72)発明者 スミス，アラン イー. アメリカ合衆国 02030 マサチューセッ ツ州 ドーバー，ミル ストリート １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．活性なそして感染性のアデノウィルスを、このウィルスに対して親和性を 有する結合性基を有するクロマトグラフィマトリックス材料と接触させる工程を 含み、しかも前記結合性基は、損傷されない形で前記ウィルスを通過させるのに 十分大きい、前記マトリックス中の細孔中に閉じ込められている、活性なそして 感染性のアデノウィルスを精製する方法。 ２．活性なそして感染性のアデノウィルスを、細孔を含みそして前記ウィルス に対しての親和性を有する結合性基を有するクロマトグラフィマトリックス材料 と接触させる工程を含み、しかも前記マトリックスは、該ウィルスがその前記細 孔と接触するのを実質的に防止するのに十分な架橋または触手をさらに含む、活 性なそして感染性のアデノウィルスを精製する方法。 ３．アデノウィルスをも含有するサンプルからアデノ随伴ウィルスを精製する 方法において、前記サンプルを、アデノウィルスを損傷することが出来るクロマ トグラフィ材料と接触させる工程を含み、しかも前記損傷されたアデノウィルス は非感染性となる、前記方法。 ４．本明細書中の開示と実質的に一致するアデノ随伴ウィルスを精製する方法 。