MX2011013613A

MX2011013613A - Metodos mejorados para purificacion de vecotres de aav recombinantes.

Info

Publication number: MX2011013613A
Application number: MX2011013613A
Authority: MX
Inventors: Barbara A Thorne; Paulene Mclean Quigley Sheldon; Peter S Gagnon; Gina Nichols
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2012-01-19
Also published as: US10696952B2; RU2012101475A; MX375365B; US20240287467A1; KR20120047213A; RS62086B1; CN102803478B; JP2012529917A; HUE054940T2; ES2693194T3; EP3444335A1; PL2443233T3; EP3067417A3; DK3444335T3; EP2443233A1; IL260215A; PT3067417T; TR201815937T4; BRPI1015176A2; JP6788056B2

Abstract

Se proporcionan en este documento métodos para la purificación de vectores de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que pueden usarse para transferencia de genes y específicamente para terapia génica o vacunación. Los vectores de AAV recombinante de la invención están sustancialmente sin impurezas de proceso, incluyendo componentes de producción tales como ácidos nucleicos celulares, proteínas celulares, virus auxiliar y componentes del medio.

Description

MÉTODOS MEJORADOS PARA PURIFICACIÓN DE VECOTRES DE AAV RECOMBINANTES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 61/187.601 , presentada el 16 de junio de 2009, que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se- refiere en general al campo de purificación de vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que pueden usarse para trasferencia génica y específicamente para terapia génica o vacunación. Más específicamente, se refiere a métodos para purificación de vectores de rAAV recombinantes que están sustancialmente sin componentes de producción en el proceso tales como ácidos nucleicos celulares, proteínas celulares, virus auxiliares y componentes del medio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los virus adenoasociados (AAV) tienen características únicas que los hacen atractivos como vectores para terapia génica y vacunas genéticas. La infección por AAV de células en cultivo es no citopática y la infección natural de seres humanos y otros animales es silenciosa, asintomática y no está implicada en la etiología de ninguna enfermedad humana. Además, el AAV infecta una amplia serie de tipos celulares incluyendo muchas células de mamífero, lo que permite la posibilidad de dirigirse a muchos tejidos diferentes in vivo. El AAV infecta células de división lenta y no en división y puede persistir esencialmente durante el tiempo de vida de esas células como un episoma nuclear transcripcionalmente activo (elemento extracromosómico). Las copias integradas del vector rAAV en órganos tales como hígado o músculo son muy poco frecuentes. Se ha indicado transferencia génica a largo plazo eficaz en varios tipos celulares incluyendo ojo, SNC, y músculo. Véase, por ejemplo X. Xiao eí al. J. Virol. 70(11 ):8098-8108 (1996); R.R. Ali er a/. Hum. Mol. Genet. 5(5):591-94 (1996). Los estudios clínicos actuales se han centrado en gran medida en el uso de vectores de rAAV del serotipo 2, pero varios informes han demostrado que otros serotipos de AAV incluyendo rAAV-1 , rAAV-4, rAAV-5 y rAAV-8 tienen biodistribución in vivo única que los hace atractivos serotipos virales para ensayar en ensayos clínicos.

El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus deficiente en replicación, el genoma de ADN monocatenario del cual es de aproximadamente 4,7 kb de longitud incluyendo repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del genoma de serotipo 2 de AAV (AAV2) se presenta en Srivastava eí al., J. Virol., 45: 555-564 (1983) como se corrigió por Ruffing eí al., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994). Están contenidas secuencias de acción en cis que dirigen la replicación de ADN viral (rep), encapsidación/empaquetamiento e integración en el cromosoma de la célula hospedadora dentro de las ITR. Tres promotores de AAV, p5, p19 y p40 (nombrados por sus localizaciones relativas en el mapa), conducen la expresión de las dos fases abiertas de lectura internas de AAV que codifican los genes rep y cap. Los dos promotores de rep (p5 y p19), acoplados con el corte y empalme diferencial del intrón de AAV sencillo en los nucleótidos 2107 y 2227, da como resultado la producción de cuatro proteínas rep (rep78, rep68, rep52 y rep40) del gen rep. Las proteínas rep poseen múltiples propiedades enzimáticas que son responsables en última instancia de replicar el genoma viral. El gen cap se expresa del promotor p40 y codifica las tres proteínas de cápsida, VP1. VP2 y VP3. El corte y empalme alternativo y los sitios de comienzo de la traducción no de consenso son responsables de la producción de las tres proteínas de cápsida relacionadas. Un sitio de poliadenilación consenso sencillo se localiza en la posición del mapa 95 del genoma de AAV. El ciclo de vida y la genética de AAV se revisan en Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

Las partículas de AAV comprenden una cápsida proteica que tiene tres proteínas de cápsida, VP1 , VP2 y VP3, que incluyen un genoma de ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4,6 kb. Las partículas individuales empaquetan solamente una hebra de molécula de ADN, pero esta puede ser la hebra más o menos. Las partículas que contienen cualquiera de las cadenas son infecciosas y la replicación se produce por conversión de la hebra sencilla infecciosa parental a una forma de doble cadena, y posterior amplificación, de la que las hebras sencillas descendientes se desplazan y se empaquetan en cápsidas. Pueden insertarse copias bicatenarias o monocatenarias de genomas de AAV (en ocasiones denominados "ADN proviral" o "provirus") en plásmidos bacterianos o fagémidos y transfectarse en células infectadas con adenovirus. Véase Cárter, HANDBOOK OF PARVOVIRUSES, Vol. I, pág. 169-228 (1989), y Bems, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (1990) para una revisión general de AAV.

La producción de vector de rAAV generalmente requiere cuatro elementos habituales: 1 ) una célula hospedadora permisiva para replicación; 2) función de virus auxiliar que puede proporcionarse por virus auxiliares adecuados tales como adenovirus o herpes virus o como alternativa por construcciones plasmídicas que contienen las funciones auxiliares adenovirales mínimas; 3) una construcción rep-cap de empaquetamiento en trans; y 4) un medio de producción adecuado.

Las partículas de AAV recombinantes pueden producirse a partir de lisados celulares de empaquetamiento. Véase, por ejemplo, Chiricp y Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41. Sin embargo, el lisado celular contiene diversos componentes celulares tales como ADN de célula hospedadora, proteínas de célula hospedadora, componentes del medio y virus auxiliar o ADN plasmídico del virus auxiliar que deben separarse del vector de rAAV antes de que sea adecuado para uso in vivo. Recientes avances en la producción de rAAV incluyen el uso de procesos de suspensión celular no adherente en biorreactores de tanque agitados y condiciones de producción por las que los vectores de rAAV se liberan al medio o sobrenadante reduciendo la concentración de componentes celulares del hospedador presentes en el material de producción pero que aún contienen cantidades apreciables de impurezas del proceso. Véase Patente de Estados Unidos N° 6.566.118 y documento PCT WO 99/1 1764. Por lo tanto, pueden recogerse partículas de rAAV del medio y/o lisado celular y purificarse adicionalmente.

Los métodos que incluyen centrifugación de gradiente de densidad empleados para la purificación de vectores de rAAV y en particular rAAV-2 no son susceptibles de cambio de escala. Informes recientes para vectores de rAAV-2 han descrito métodos de purificación que emplean cromatografía de intercambio iónico incluyendo cromatografía de intercambio iónico de oposición (incluyendo cromatografía catiónica y aniónica). Véase por ejemplo Patente de Estados Unidos N° 6.566.1 18 y documento PCT WO 99/11764 que describen métodos para usar una combinación de cromatografía de intercambio iónico de oposición para purificar vectores de virus adenoasociados recombinantes de un sobrenadante de cultivo y/o un lisado celular. Mejoras adicionales en las preparaciones de reservas de rAAV incluyen el uso de tratamiento de desoxicolato del lisado celular, separación por gradiente de iodixanol antes de la cromatografía de afinidad, que ha dado como resultado rAAV-2 de alta titulación (Clark et al., Hum. Mol. Genet. 10(6):1031-39 (1999); Zolotukhin et al., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)). O'Riordan et al. (O'Riordan et al., J. Gene Mecí. 2:444-454 (2000); Patente de Estados Unidos N° 7.015.026) también indicaron un proceso de purificación cromatográfico redimensionable para vectores de virus adenoasociados recombinantes y como se ejemplifica particularmente, vectores de rAAV-2, usando cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de afinidad de sulfato de celufina y cromatografía de quelado de cinc.

Datos recientes indican que los serotipos de cápsida de rAAV tales como rAAV-1 , 4, 5 y 8 se unen débilmente a resinas aniónicas como reserva de virus purificada o en presencia de impurezas de producción del proceso tales como ADN de la célula hospedadora, proteínas de la célula hospedadora, albúmina del suero, componentes del medio y componentes de virus auxiliar. En consecuencia, la purificación de esos serotipos de cápsida típicamente implica cromatografía de intercambio aniónico en combinación con otros métodos de purificación, tales como centrifugación de gradiente de densidad de iodixinol. Véase, por ejemplo, Zolotukhin et al., Methods 28(2): 158-167 (2002) and Kaludov et al., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002); y publicación de Patente de Estados Unidos N° 2004/0110266 Al. Sin embargo, estos métodos no son fácilmente redimensionables a procesos de escala comercial.

En consecuencia, en el desarrollo de vectores de AAV recombinantes tales como los de uso en terapia génica y vacunas génicas, existe una necesidad de métodos para purificar vectores de rAAV de los componentes de producción del proceso incluyendo virus auxiliar, así como proteínas del virus auxiliar, proteínas celulares, ADN de la célula hospedadora y componentes del medio presentes en la reserva de producción de rAAV. Tales métodos deberían emplearse eficazmente en una escala que sea adecuada para la aplicación práctica de las técnicas de terapia génica. Además existe una necesidad de desarrollar procesos de purificación para vectores de rAAV que sean redimensionables para producir reservas comerciales altamente purificadas de alta titulación útiles para terapia génica con rAAV y vacunas génicas. Más particularmente, existe una necesidad de desarrollar procesos de purificación para vectores de rAAV que se unan débilmente a resinas cromatográficas y en particular resinas aniónicas.

Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en este documento por referencia como si se indicara que cada publicación, solicitud de patente o patente individual específicamente e individualmente se incorpora por referencia. En particular, todas las publicaciones citadas en este documento se incorporan expresamente en este documento por referencia con el fin de describir y desvelar composiciones y métodos que podrían usarse en relación con la invención. Aunque la invención proporcionada en este documento se ha descrito en algún detalle como ilustración y ejemplo para fines de claridad y entendimiento, resultará fácilmente evidente para los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas de la presente invención que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin separarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos para aislar una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) de cualquier serotipo de cápsida de impurezas del proceso capturando las partículas de rAAV en un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG). Los métodos de la invención implican procesamiento corriente arriba (tal como, por ejemplo, centrifugación, tratamiento con Benzonase®, filtración de intercambio aniónico y/o filtración de flujo tangencial) así como procesamiento corriente abajo (tal como, por ejemplo, inactivación por calor, filtración, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por exclusión de tamaño y/o cromatografía de intercambio aniónico). Los métodos corriente arriba y corriente abajo pueden usarse solos o en diversas combinaciones.

La invención proporciona métodos para aislar una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) de impurezas del proceso en un flujo de alimentación, que comprenden las etapas de: (a) poner en contacto un flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG), en la que las partículas de rAAV se unen al medio de cromatografía de apatita; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita con un tampón de elución que contiene menos de 3 % (p/v) de PEG. En ciertas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita es hidroxiapatita cerámica (CHT) o fluoroapatita cerámica (CFT). En ciertas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con un tampón de dilución que contiene menos del 3 % (p/v) de PEG. En ciertas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con un tampón de elución en ausencia de PEG.

En algunas realizaciones la unión específica del medio de cromatografía de apatita está entre 106 y 1016 partículas resistentes a DNasa (DRP) por mililitro. En algunas realizaciones, la unión específica del medio de cromatografía de apatita está entre 108 y 1016 partículas resistentes a DNasa (DRP) por mililitro. En algunas realizaciones, la unión específica del medio de cromatografía de apatita está entre 1010 y 1016 partículas resistentes a DNasa (DRP) por mililitro. En algunas realizaciones, la unión específica del medio de cromatografía de apatita está entre 10 y 10 partículas resistentes a DNasa (DRP) por mililitro. En algunas realizaciones, la unión específica del medio de cromatografía de apatita está entre 1014 y 1016 partículas resistentes a DNasa (DRP) por mililitro.

En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente una etapa de filtración de intercambio aniónico antes de la etapa de cromatografía de apatita,, en las que las partículas de rAAV están en el flujo continuo de la filtración de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente concentrar las partículas de rAAV del flujo continuo de la filtración de intercambio aniónico por filtración de flujo tangencial antes de la etapa de cromatografía de apatita. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente una etapa de unir las partículas de rAAV en el flujo de alimentación eluido del medio de cromatografía de apatita con un medio de cromatografía aniónica. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente una etapa de inactivación por calor para inactivar el virus auxiliar. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente una etapa de unir las partículas de rAAV en el flujo de alimentación con una cromatografía de interacción hidrófoba después de la cromatografía de apatita.

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG) y un tampón básico. En algunas realizaciones, el tampón básico está entre pH 7,2 y 10, entre pH 7,4 y 10, entre pH 7,6 y 10, entre pH 7,8 y 10, entre pH 8,0 y 10,0, entre pH 8,2 y 10,0, entre pH 8,4 y 10,0, entre pH 8,6 y 10,0, entre pH 8,8 y 10, entre pH 9,0 y 10,0, entre pH 9,2 y 10, entre pH 9,4 y 10,0, entré pH 9,6 y 10,0 o entre pH 9,8 y 10,0. En algunas realizaciones, el tampón básico tiene un pH de aproximadamente cualquiera de 7,2, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 y 10,0. Puede usarse cualquier tampón básico conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el tampón básico comprende borato. En algunas realizaciones, el tampón básico es borato.

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, puede usarse PEG entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG aproximadamente 3 % (p/v), aproximadamente 3,5 % (p/v), aproximadamente 4 % (p/v), aproximadamente 4,5 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 5,5 % (p/v), aproximadamente 6 % (p/v), aproximadamente 6,5 % (p/v), aproximadamente 7 % (p/v), aproximadamente 7,5 % (p/v), aproximadamente 8 % (p/v), aproximadamente 8,5 % (p/v), aproximadamente 9 % (p/v), aproximadamente 9,5 % (p/v) o aproximadamente 10 % (p/v).

En algunas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol, tal como, aproximadamente 5.000 gramos por mol (PEG5000), aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol, aproximadamente 7.000 (PEG7000) gramos por mol, aproximadamente 8.000 (PEG8000) gramos por mol, aproximadamente 9.000 (PEG9000) gramos por mol, aproximadamente 10.000 (PEG10000) gramos por mol, aproximadamente 11.000 (PEG 11000) gramos por mol, aproximadamente 12.000 (PEG12000) gramos por mol, aproximadamente 13.000 (PEG 13000) gramos por mol, aproximadamente 14.000 (PEG14000) gramos por mol, y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol. En ciertas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol. En ciertas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol. En ciertas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 8.000 (PEG8000) gramos por mol. En ciertas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10.000 (PEG 10000) gramos por mol. En ciertas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol.

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 6 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 7 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medió de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 9 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 10 % (p/v).

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 6 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 7 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 9 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG8000 aproximadamente 10 % (p/v).

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG 0000 entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG 10000 aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 6 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia PEG10000 de aproximadamente 7 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 9 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG10000 aproximadamente 10 % (p/v).

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG 5000 aproximadamente 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 6 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 7 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía dé apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 9 % (p/v). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG15000 aproximadamente 10 % (p/v).

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en un tampón que comprende borato aproximadamente 20 mM pH 9,0 y PEG aproximadamente 5 % (tal como PEG6000). En algunas realizaciones, el flujo de alimentación se mezcla en línea con un volumen igual de un tampón que comprende borato aproximadamente 40 mM a pH 9,0 y PEG aproximadamente 10 % para producir una concentración final de borato aproximadamente 20 mM a pH 9,0 y PEG aproximadamente 5 %.

En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita con las partículas de rAAV unidas al medio se lava para retirar las impurezas del proceso antes de eluir las partículas de rAAV. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene concentraciones decrecientes de PEG para retirar las impurezas del proceso. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene PEG aproximadamente cualquiera de 10 % (p/v), 9,5 % (p/v), 9 % (p/v), 8,5 % (p/v), 8 % (p/v), 7,5 % (p/v), 7 % (p/v), 6,5 % (p/v), 6 % (p/v), 5,5 % (p/v), 5 % (p/v), 4,5 % (p/v), 4 % (p/v), 3,5 % (p/v) y 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG6000 7,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG8000 7,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG10000 7,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG 15000 7,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG6000 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG8000 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG10000 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG 5000 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG6000 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG8000 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG10000 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG15000 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía se lava una o más veces con un tampón de lavado que no contiene PEG.

En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene tampones conocidos en la técnica. En alguna realización, el tampón de lavado comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-2-Hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCI. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es borato. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI. En algunas realizaciones, el tampón de lavado está a pH básico. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH entre pH 7,0 y pH 10,0, entre pH 7,2 y pH 10,0, entre pH 7,4 y pH 10,0, entre pH 7,6 y pH 10,0, entre pH 7,8 y pH 10,0, pH 8,0 y pH 10,0, pH 8,2 y pH 10,0, entre pH 8,4 y pH 10,0, entre pH 8,6 y pH 10,0, entre pH 8,8 y pH 10,0, entre pH 9,0 y pH 10,0, entre pH 9,2 y pH 10,0, entre pH 9,4 y pH 10,0, entre pH 9,6 y pH 10,0 o entre pH 9,8 y pH 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH a 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es borato a un pH entre 8,0 y 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es borato a pH 8,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es borato a pH 9,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es borato a pH 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES a un pH entre 7,0 y 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES a pH 7,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES a pH 8,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES a pH 9,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es HEPES a pH 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI a un pH entre 7,0 y 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI a pH 7,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI a pH 8,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI a pH 9,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende o es Tris-HCI a 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende adicionalmente fosfato entre 100 y 500 mM. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende adicionalmente NaCI entre 50 y 250 mM.

En algunas realizaciones, la etapa de lavado comprende un primer lavado con un tampón de lavado que comprende aproximadamente borato 30 mM a pH aproximadamente 9,0 y PEG aproximadamente 7,5 %; un segundo lavado con un tampón de lavado que comprende fosfato potásico aproximadamente 150, borato aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 9,0 y PEG aproximadamente 5 %; un tercer lavado con un tampón de lavado que comprende borato aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 9,0 y PEG aproximadamente 5 %; y un cuarto lavado con un tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 7,0 y NaC1 150 mM.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con un tampón de elución que contiene bajas concentraciones de PEG o en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG menos de aproximadamente 3 % (p/v), PEG menos de aproximadamente 2 % (p/v) o PEG menos de aproximadamente 1 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG aproximadamente 2,5 % (p/v), aproximadamente 2 % (p/v), aproximadamente 1 ,5 % (p/v), aproximadamente 1 % (p/v) o aproximadamente 0,5 % (p/v) o no contiene PEG. En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG6000 menos de aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG8000 menos de aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG10000 menos de aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de elución contiene PEG15000 menos de aproximadamente 3 % (p/v). En algunas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con un tampón de elución en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-2-Hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCI. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende o es borato. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende o es HEPES. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende o es Tris-HCI. En algunas realizaciones, el tampón de elución está a pH neutro. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende o es HEPES a pH neutro. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende o es Tris-HCI a pH neutro. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende además fosfato menos de 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende además fosfato menos de 50 mM. En algunas realizaciones, el tampón de elución comprende además NaCI entre 50 y 250 mM. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con tampón de elución que comprende fosfato potásico aproximadamente 50 mM, HEPES aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 7,0 y NaCI aproximadamente 150 mM.

En algunas realizaciones, el método de aislar las partículas de rAAV de las impurezas del proceso en un flujo de alimentación comprende las etapas de: (a) poner en contacto un flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG aproximadamente 5 % (p/v) en un tampón básico a pH aproximadamente 9,0, en el que las partículas de rAAV se unen al medio de cromatografía de apatita; (b) lavar el medio de cromatografía de apatita con un primer tampón de lavado que comprende borato aproximadamente 30 mM a pH 9,0 y PEG aproximadamente 7,5 %; (c) lavar el medio de cromatografía de apatita con un segundo tampón de lavado que comprende fosfato potásico aproximadamente 150, borato aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 9,0 y PEG aproximadamente 5 %; (d) lavar el medio de cromatografía de apatita con un tercer tampón de lavado que comprende borato aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 9,0 y PEG aproximadamente 5 %; (e) lavar el medio de cromatografía de apatita con un cuarto tampón de lavado que comprende HEPES aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 7,0 y NaCI 150 mM; y (f) eluir las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita con un tampón de elución que comprende fosfato potásico aproximadamente 50 mM, HEPES aproximadamente 20 mM a pH aproximadamente 7,0 y NaCI a aproximadamente 150 mM.

También se proporcionan en este documento métodos para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas del proceso en un flujo de alimentación, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en un tampón de alta salinidad, en el que las partículas de rAAV y las impurezas del proceso se unen al medio de HIC; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio de HIC con un tampón de salinidad media. En algunas realizaciones, el medio de HIC se selecciona del grupo que consiste en Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl y resina de Tosoh Has(butyl). En algunas realizaciones, el tampón de alta salinidad comprende o es citrato entre 0,5 M y 2,0 M (por ejemplo, citrato sódico). En algunas realizaciones, el tampón de alta salinidad comprende citrato de aproximadamente cualquiera de 0,5 M, 0,75 M, 1 ,0 M, 1 ,25 M, 1 ,5 M, 1 ,75 M y 2,0 M. En algunas realizaciones, el tampón de salinidad media comprende o es citrato menos de 0,5 M (por ejemplo, citrato sódico). En algunas realizaciones, él tampón de salinidad media comprende citrato entre 0,5 M y aproximadamente 0,3 M. En algunas realizaciones, el tampón de salinidad media comprende citrato de aproximadamente cualquiera de 0,45 M, 0,4 M, 0,35 M, 0,3 M y 0,25 M. En algunas realizaciones, el tampón de alta salinidad comprende adicionalmente fosfato entre 1 y 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón de salinidad media comprende adicionalmente fosfato entre 1 y 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón de salinidad media eluye las partículas de rAAV sin eluir partículas de rAAV con cápsidas vacías, cápsídas parcialmente desnaturalizadas, cápsidas menos infecciosas y/o cápsidas parcialmente completas.

En algunas de las realizaciones, descritas en este documento, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 , AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-4, AAV-5 y AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV de AAV-1. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV de AAV-4. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV de AAV-5. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV de AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de cápsida de AAV de un serotipo de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 , AAV-12, AAV- 3, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV que es un agente de unión aniónico débil. En algunas realizaciones, el serotipo de cápsida de AAV que es un agente de unión aniónico débil se selecciona del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-4, AAV-5 y AAV-8. En algunas realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV comprende adicionalmente contaminantes del cultivo de producción. En algunas realizaciones, los contaminantes del cultivo de producción comprenden partículas de rAAV dañadas, contaminantes de la célula hospedadora, contaminantes del virus auxiliar y/o contaminantes del cultivo celular. En algunas realizaciones, los contaminantes de la célula hospedadora comprenden ADN de la célula hospedadora, plásmidos o proteína de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, los contaminantes de virus auxiliar comprenden partículas de adenovirus, ADN de adenovirus o proteínas de adenovirus. En algunas realizaciones, los contaminantes de cultivo celular comprenden componentes del medio, albúmina de suero u otras proteínas del suero. En algunas realizaciones, los contaminantes de cultivo celular comprenden componentes del medio. En algunas realizaciones, los contaminantes del cultivo celular no comprenden albúmina de suero u otras proteínas del suero.

Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en este documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 presenta los resultados de digestión con Benzonase® del sobrenadante clarificado de recogida de cultivo de producción de rAAV. Los resultados demuestran que no estaba presente ADN de alto peso molecular después de digestión con Benzonase®.

La Figura 2 presenta un seguimiento espectrofotométrico típico para una resina típica explorada con respecto a afinidad de unión de rAAV como se describe en el Ejemplo 4. Se indicaron la absorbancia (UA) y la conductividad (mS/cm).

La Figura 3 presenta un análisis de capacidad de penetración con y sin PEG. Se usaron dos cultivos de producción de rAAV modelo para evaluar la capacidad de la resina de apatita (CFT de tipo I). Panel superior: penetración durante la carga de flujos de alimentación que contienen suero o sin suero en presencia o ausencia de PEG6000 aproximadamente 5 % (p/v) en la carga. Los volúmenes de carga se refieren al flujo de alimentación de partida, antes de la dilución en línea 1 :1 y se normalizaron por mi de volumen de resina. Panel inferior: volúmenes de carga (mi) a los que se observó penetración del 1 % y recuperación en fracción de elución. Las recogidas de TFF utilizadas en el experimento estuvieron a una concentración de aproximadamente 1016 DRP/ml para los vectores de rAAV. En presencia de PEG6000 aproximadamente 5 % (p/v), se cargaron 150 mi de la recogida de TFF en la resina CFT de 1 ,2 mi sin penetración, que se definió como la presencia de rAAV >1 % en el flujo continuo de columna, correspondiente a una carga de 1 ,6x104 DRP de rAAV total.

La Figura 4 presenta un cromatograma de CHT I típico. Se muestran las mediciones de absorbancia de UV A280 (UA, unidad de absorbancia) y conductividad (mS/cm) en línea por el Skid de 3 mm de Amersham. Los paréntesis marcan los segmentos principales del programa descritos en el Ejemplo 7. "NaOH" marca la etapa de descontaminación de columna.

La Figura 5 muestra la pureza relativa de los vectores de rAAV eluidos de las resinas de apatita. El panel A muestra la distribución de vector entre el flujo continuo/seguimiento (FT), lavado de alto fosfato/PEG6000 5 % (p/v) (P04), los lavados para retirar fosfato y PEG6000 (WII/WIII) y la elución. Ninguna de las diferencias entre los casos son significativas dentro de la precisión de los análisis y la falta de equilibrio de masas es típica. El panel B muestra los carriles relevantes de un SDS PAGE teñido de naranja Sypro con fracciones de dilución de la columna de apatita. Cada muestra se cargó a 2x1011 DRP/carril; la aparente diferencia de migración entre los carriles es un artefacto salino debido a tener que concentrar la elución de CFT por evaporación a un volumen que se ajustaría al gel. Las únicas bandas predominantes parecen ser proteínas de cápsida de AAV.

El panel C muestra los carriles relevantes de una transferencia de Western de Ad5 con los carriles reordenados para una mayor claridad, que demuestran aclaramiento comparable de proteínas de Ad5.

La Figura 6 muestra la evaluación de purificación a lo largo del proceso por SDS-PAGE. Se aplicaron muestras del proceso de una recogida de cultivo de producción representativa en un gel de poliacrilamida 10 % desnaturalizante/reductor y se tiñó con naranja Sypro. Todas las muestras después de recogida se cargaron a 1x1010 DRP/carril. Las dos muestras corriente arriba antes de la etapa de concentración de TFF (etapa de clarificación inicial y flujo continuo AEX) solo pudieron cargarse a 1x109 DRP/carril debido a restricciones de volumen en el gel. Se cargó beta galactosidasa (B-Gal) a 50 ng/carril para evaluar la sensibilidad y consistencia de la tinción a lo largo del gel. Se indican las tres proteínas de cápsida de AAV1 (VP1 , 2 y 3).

La Figura 7 muestra la recuperación por etapas para la purificación de rAAV como se describe en los Ejemplos 1-12. La DRP total presente eri el sobrenadante antes de la recogida se definió como el 100 %. La recuperación en cada etapa es la DRP total recuperada en relación con la DRP total procesada durante esa etapa. La recuperación global para el proceso completo fue de aproximadamente 28 %. D4 sup: cultivo de producción; AEX FT: flujo continuo de intercambio aniónico (Mustang® Q) captura: cromatografía de apatita; calor: inactivación por calor o muerte por calor; HIC: cromatografía de interacción hidrófoba; SEC: cromatografía de exclusión de tamaño; AEX: intercambio aniónico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Es un objeto de esta invención proporcionar métodos para aislar una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) de cualquier serotipo de cápsida de AAV de contaminantes de cultivo de producción tales como partículas de rAAV dañados, virus auxiliar, proteínas de virus auxiliar, plásmidos, proteínas celulares y ADN, componentes del medio, proteínas del suero y similares. Además, los métodos de la presente invención proporcionan procesos ortogonales comercialmente redimensionables coherentes con los requisitos reguladores para aislamiento de una población de partículas de rAAV de recogidas de cultivo de producción de rAAV de alta titulación o flujos de alimentación. Las poblaciones de partículas de rAAV aisladas por los métodos de la presente invención están sustancialmente sin contaminantes, incluyendo los contaminantes de cultivo de producción y/o contaminantes de proceso, tales como partículas de rAAV dañadas, virus auxiliar, proteínas de virus auxiliar, plásmidos, proteínas y ADN celulares, componentes del medio, proteínas del suero y glucanos. Los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para serotipos de vector de rAAV que son agentes de unión aniónicos débiles tales como, por ejemplo, rAAV-1 , rAAV-4, rAAV-5 y rAAV-8. La invención contempla adicionalmente un método para aislar una población de alta titulación de partículas de rAAV sustancialmente sin contaminantes, incluyendo contaminantes de cultivo de producción y/o contaminantes del proceso, adecuado para su uso en aplicaciones de terapia génica sin necesidad de realizar centrifugación de gradiente de densidad.

Definiciones El término "aislado" o "purificado" como se usa en este documento se refiere a una preparación de partículas de rAAV desprovistas de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes cuando las partículas de rAAV aparecen de forma natural o de las que se preparan inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, las partículas de rAAV aisladas pueden prepararse usando una técnica de purificación para enriquecerlas de una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o sobrenadante de cultivo de producción. El enriquecimiento puede medirse de una diversidad de maneras, tal como, por ejemplo, por la proporción de partículas resistentes a DNasa (DRP) presentes en una solución o por infecciosidad o puede medirse en relación con una segunda sustancia potencialmente de interferencia en la mezcla fuente, tal como contaminantes, incluyendo contaminantes de cultivo de producción o contaminantes de proceso, incluyendo virus auxiliar, componentes del medio y similares como se define posteriormente.

Se dice que una preparación de rAAV está "sustancialmente sin" virus auxiliar si la relación de partículas de AW infecciosas con partículas de virus auxiliar infecciosas es de al menos aproximadamente 102:1 ; preferiblemente al menos aproximadamente 10 :1 , más preferiblemente al menos aproximadamente 106:1 , aún más preferiblemente al menos aproximadamente 108:1. Las preparaciones también están sustancialmente sin cantidades equivalentes de proteínas de virus auxiliar (es decir, proteínas como estarían presentes como resultado de un nivel tal de virus auxiliar si las impurezas de partículas de virus auxiliar indicadas anteriormente estuvieran presentes en forma rota). Puede observarse generalmente contaminación de proteína viral y/o celular como la presencia de bandas de tinción de Coomassie en geles de SDS (por ejemplo, la aparición de bandas distintas de las que corresponden a las proteínas de la cápsida de AAV, VP1 , VP2 y VP3).

La expresión "agente de unión aniónico débil" o "agente de unión aniónico de afinidad baja" como se usan en este documento se refieren de forma intercambiable a partícula , de rAAV que tiene un serotipo de cápsida que, en presencia de contaminantes (incluyendo contaminantes de cultivo de producción o contaminantes de proceso), no se unen con suficiente afinidad para permitir el aislamiento de las partículas de rAAV de otros contaminantes de cultivo de producción de rAAV. Tales serotipos de cápsida se conocen en la técnica e incluyen, sin limitación, AAV-1 , AAV-5, AAV-8 y AAV-4. Como se describe en la técnica, tales agentes de unión aniónicos débiles se purifican generalmente por métodos que incluyen al menos una etapa de centrifugación de densidad incluyendo iodixinol (vendido bajo el nombre comercial Optiprep®) o centrifugación de gradiente de cloruro de cesio.

Como se usa en este documento, la expresión "virus auxiliar" o "virus auxiliar contaminante" se refiere a un virus usado cuando se producen copias de un vector viral dependiente de virus auxiliar, tal como virus adenoasociado, que no tiene la capacidad de replicarse por sí mismo. El virus auxiliar se usa para coinfectar células junto con el vector viral y proporciona las proteínas necesarias para la replicación del genoma del vector viral. El término abarca partículas virales intactas, cápsidas vacías, ADN viral y similares. Los virus auxiliares habitualmente usados para producir partículas de rAAV incluyen adenovirus, virus del herpes simple, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y virus vaccinia.

La expresión "cultivo de producción" como se usa en este documento se refiere á un recipiente que contiene los componentes necesarios para producción de partículas de vector de rAAV. Los cultivos de producción incluyen, sin limitación, los siguientes componentes: 1 ) una célula hospedadora adecuada; 2) función de virus auxiliar; 3) genes rep y cap de AAV y productos génicos; 4) el transgén terapéutico flanqueado por secuencias ITR de AAV; y 5) medios adecuados, componentes del medio y complementos del medio, incluyendo sin limitación suero, proteínas derivadas del suero, vitaminas, aminoácidos esenciales y no esenciales y glucosa que se sabe que soportan la producción de rAAV.

Como se usa en este documento, las expresiones "contaminantes", "contaminantes de cultivo de producción", "contaminantes de proceso", "impurezas del proceso", "impurezas" o "contaminantes", como se usan de forma intercambiable en este documento, se refieren a, sin limitación, formulaciones de medio que se conoce en la técnica que ayudan a la producción de vectores de rAAV; complementos del medio tales como sales, suero de ternero, complementos de aminoácidos, complementos vitamínicos, factores de crecimiento, albúmina de suero y otras proteínas de bajo peso molecular presentes en formulaciones de medio conocidas en la técnica; células hospedadoras permisivas, proteínas de célula hospedadora o ADN de célula hospedadora; virus auxiliares, proteínas de virus auxiliar o ADN de virus auxiliar tal como proteínas de adenovirus o virus del herpes de tipo silvestre; y otros materiales de cultivo de producción de vector no de rAAV o de vector de rAAV introducidos durante el proceso de purificación tales como glucanos o tampones de cromatografía utilizados en la purificación de vectores de rAAV de flujos de alimentación.

La expresión "recogida de cultivo de producción" como se usa en este documento se define como una solución que comprende partículas de vector de rAAV producidas de cultivos de producción de vector de rAAV por medios conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación procesos de transfección, producción de línea celular estable, sistemas de producción Ad-híbrido o sistemas de producción de baculovirus. Además, la expresión "recogida de cultivo de producción" como se usa en este documento se refiere al material aislado del recipiente de cultivo de producción e incluye tanto materiales aislados por lisis de células productoras de rAAV por medios conocidos en la técnica como materiales aislados de cultivos de producción de rAAV mantenidos en condiciones de cultivo conocidas en la técnica para producir partículas de rAAV liberadas al medio de células intactas. Una recogida de cultivo de producción puede contener alguno o todos los siguientes, sin limitación: partículas de vector de rAAV, componentes de cultivo de producción, tales como, componentes del medio, proteínas de célula hospedadora, ADN de célula de hospedadora, células hospedadoras, virus auxiliar, proteínas de virus auxiliar, ADN de virus auxiliar, ADN plasmídico, ADN de virus vehículo, suero, proteínas derivadas del suero y complementos del medio.

La expresión "flujo de alimentación" como se usa en este documento se refiere a una fuente de partículas de vector de rAAV que se carga en, se pasa a través de o se aplica a la matriz cromatográfica. Los flujos de alimentación de la presente invención, incluyen recogidas de cultivo de producción y materiales aislados de etapas cromatográficas previas de la invención si el material estaba presente como flujo continuo de la etapa previa, unido y eluido en la etapa previa, presente en el volumen vacío de la etapa previa o presente en cualquier fracción obtenida durante la purificación de partículas de rAAV. Tales flujos de alimentación pueden incluir uno o más "contaminantes", "contaminantes de cultivo de producción", "contaminantes de proceso", "impurezas de proceso" o "impurezas" o "contaminantes" como se definen en este documento.

Los términos "captura", "unido", "une" o "uniendo" como se usan en este documento de forma intercambiable se refieren a la unión, adherencia o adhesión de un componente de un flujo de alimentación a un medio cromatográfico. Los componentes pueden unirse a un medio cromatográfico por cualquier fuerza o química conocida en la técnica, incluyendo sin limitación hidrófoba, iónica (incluyendo aniónica y catiónica), afinidad, quelación metálica y quélación. Los componentes pueden unirse a un medio cromatográfico por más de un tipo de química tal como en un medio cromatográfico de apatita.

Las expresiones "resina de apatita", "medio cromatográfico de apatita", "matriz de apatita" o "medio de apatita", como se usan en este documento de forma intercambiable se refieren a un medio cromatográfico comprendido por un mineral de fosfato cálcico e incluye sin limitación medio cromatográfico de hidroxiapatita cerámica (CHT) y fluoroapatita cerámica (CFT).

Las expresiones "modo mezclado" o "multimodal" se refieren a medios cromatográficos que tienen capacidad para más de una química de unión. Los medios cromatográficos de modo mezclado incluyen sin limitación medios cromatográficos de apatita, que son capaces de mostrar unión de afinidad metálica mediante los restos de calcio, enlace de hidrógeno mediante los grupos hidroxilo presentes en la cadena principal, repulsión de carga positiva y atracción de carga negativa mediante los restos de calcio y repulsión de carga negativa y atracción de carga positiva mediante los restos de fosfato presentes en el medio.

La referencia general a "la composición" o "composiciones" incluye y es aplicable a composiciones de la invención.

Como se usa en este documento, la forma singular de los artículos "un" y "el" incluye referencias plurales a no ser que se indique de otro modo. Por ejemplo, la frase "una partícula de virus" incluye una o más partículas de virus.

En referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en este documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí mismo. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye descripción de "X".

Se entiende que aspectos y realizaciones de la invención descritos en este documento incluyen los que consisten y/o que consisten esencialmente en aspectos y realizaciones.

Producción de vectores de rAAV Se conocen numerosos métodos en la técnica para producción de vectores de rAAV, incluyendo transfección, producción de línea celular estable y sistemas de producción de virus híbrido infeccioso que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de herpesvirus-AAV e híbridos de baculovirus-AAV. Los cultivos de producción de rAAV para la producción de partículas de virus de rAAV requieren todos: 1 ) células hospedadoras adecuadas, incluyendo, por ejemplo, líneas celulares derivadas de seres humanos tales como células HeLa, A549 o 293 o líneas celulares derivadas de insecto tales como SF-9, en el que caso de sistemas de producción de baculovirus; 2) función de virus auxiliar adecuada, proporcionada por adenovirus de tipo silvestre o muíante (tal como adenovirus sensible a temperatura), virus del herpes, baculovirus o una construcción plasmídica que proporcione funciones auxiliares; 3) genes rep y cap de AAV y productos génicos; 4) un transgén (tal como un transgén terapéutico) flanqueado por secuencias ITR de AAV; y 5) medio y componentes de medio adecuados para soportar la producción de rAAV. Pueden usarse medios adecuados conocidos en la técnica para la producción de vectores de rAW. Estos medios incluyen, sin limitación, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH incluyendo Medio de Eagle Modificado (MEM), Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), formulaciones adaptadas tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.566.118 y medio Sf-900 II SFM como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.723.551 , cada una de las cuales se incorpora en este documento por referencia en su totalidad, particularmente - con respecto a formulaciones de medio adaptado para su uso en producción de vectores de AAV recombinantes.

Los medios de cultivo de producción de rAAV adecuados de la presente invención pueden complementarse con suero o proteínas recombinantes derivadas de suero a un nivel de 0,5 %-20 % (v/v o p/v). Como alternativa, como se conoce en la técnica, pueden producirse vectores de rAAV en condiciones sin suero que también pueden denominarse medio sin productos. derivados de animal. Un experto en la materia puede apreciar que los medios comerciales o adaptados diseñados para soportar la producción de vectores de rAAV también pueden complementarse con uno o más componentes de cultivo celular conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación glucosa, vitaminas, aminoácidos y/o factores de crecimiento para aumentar la titulación de rAAV en cultivos de producción.

Los cultivos de producción de rAAV pueden dejarse crecer en una diversidad de condiciones (sobre un intervalo de temperaturas amplio, durante diversos periodos de tiempo y similares) adecuadas para la célula hospedadora particular que se utilice. Como se sabe en la técnica, los cultivos de producción de rAAV incluyen cultivos dependientes de unión que pueden cultivarse en recipientes dependientes de unión adecuados tales como, por ejemplo, frascos rotatorios, filtros de fibra hueca, microvehículos y biorreactores de lecho empaquetado o lecho fluido. Los cultivos de producción de vector de rAAV también pueden incluir células hospedadoras adaptadas a suspensión tales como células HeLa, 293 y SF-9 que pueden cultivarse de una diversidad de maneras incluyendo, por ejemplo, matraces de agitación, biorreactores de tanque de agitación y sistemas desechables tales como el sistema de bolsa Wave.

Pueden recogerse partículas de vector de rAAV de la invención de cultivos de producción de rAAV por lisis de las células hospedadoras del cultivo de producción o por recogida del medio usado del cultivo de producción, siempre que las células se cultiven en condiciones que se conoce en la técnica que provocan liberación de partículas de rAAV al medio de células intactas, como se describe en más detalle en la Patente de Estados Unidos N° 6.566.118. También se conocen en la técnica métodos adecuados para lisar células e incluyen por ejemplo múltiples ciclos de congelación/descongelación, sonicación, microfluidización y tratamiento con agentes químicos, tales como detergentes y/o proteasas.

Purificación de vectores de rAAV En la recogida, los cultivos de producción de rAAV de la presente invención pueden contener uno o más de los siguientes: (1 ) proteínas de célula hospedadora; (2) ADN de célula hospedadora; (3) ADN plasmídico; (4) virus auxiliar; (5) proteínas de virus auxiliar; (6) ADN de virus auxiliar; y (7) componentes del medio incluyendo, por ejemplo, proteínas de suero, aminoácidos, transferrinas y otras proteínas de bajo peso molecular. Además, los cultivos de producción de rAAV incluyen adicionalmente partículas de rAAV que tienen un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 , AAV-12, AAV- 3, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en ÁAV-1 , AAV-4, AAV-5 y AAV-8.

En algunas realizaciones, la recogida de cultivo de producción de rAAV se clarifica para retirar residuos de las células hospedadoras. En algunas realizaciones, la recogida de cultivo de producción se clarifica por filtración a través de una serie de filtros de profundidad que incluyen, por ejemplo, un Millipore Millistak+ HC Pod Filter de calidad DOHC, un Millipore Millistak+ HC Pod Filter de calidad A1 HC y un filtro de membrana hidrófila Filter Opticap XL 10 Millipore Express SHC de 0,2 µ?t?. La clarificación también puede conseguirse por una diversidad de otras técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como centrifugación o filtración a través de cualquier filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ?t? o mayor tamaño de poro conocido en la técnica.

En algunas realizaciones, la recogida de cultivo de producción de rAAV se trata adicionalmente con Benzonase® para digerir cualquier ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de producción. En algunas realizaciones, la digestión con Benzonase® se realiza en condiciones convencionales conocidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, una concentración final de 1-2,5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que varía de temperatura ambiente a 37 °C durante un periodo de 30 minutos a varias horas.

Las partículas de rAAV pueden aislarse o purificarse usando una o más de las siguientes etapas de purificación: filtración de intercambio aniónico de flujo continuo, filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar las partículas de rAAV, captura de rAAV por cromatografía de apatita, inactivación por calor del virus auxiliar, captura de rAAV por cromatografía de interacción hidrófoba, intercambio de tampón por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), nanofiltracion y captura de rAAV por cromatografía de intercambio aniónico. Estas etapas pueden usarse solas, en diversas combinaciones o en diferentes órdenes.

En algunas realizaciones, el método comprende todas las etapas en el orden que se describe posteriormente.

Filtración de intercambio aniónico Opcionalmente en algunas realizaciones, la recogida de cultivo de producción tratado con Benzonase® y clarificado se somete a filtración de intercambio aniónico en condiciones en las que el vector de rAAV está presente en el flujo continuo y se retiene virus auxiliar contaminante en el filtro cargado. A la fuerza iónica de la recogida de cultivo de producción de rAAV, las partículas de rAAV pueden distinguirse del virus auxiliar, por ejemplo, adenovirus por pase a través de un filtro aniónico tal como filtro Mustang® Q (Pall Corp., East Hills, NY). Un experto en la materia puede determinar el tamaño y número de filtros necesario para conseguir la reducción logarítmica óptima de adenovirus (LRV) y proteínas adenovirales presentes en el cultivo de producción clarificado, tratado con Benzonase® y filtrado aniónico. En algunas realizaciones, la LRV es al menos un log y mayor de diez log. En una realización preferida, la LRV es al menos dos y mayor de 8 log. En una realización más preferida la LRV es al menos seis log.

Concentración de filtración de flujo tangencial (TFF) En algunas realizaciones, el flujo continuo de la filtración aniónica del flujo de alimentación tratado con Benzonase® clarificado se concentra mediante filtración de flujo tangencial ("TFF") antes de aplicarse a un medio cromatográfico de apatita. La concentración a gran escala de virus que usa ultrafiltración de TFF se ha descrito por R. Paul et al. HUMAN GENE THERAPY, 4:609615 (1993). La concentración de TTF del flujo continuo permite que se someta un volumen técnicamente manejable de flujo continuo a las etapas cromatográficas de la presente invención y permite una selección de tamaño más razonable de las columnas sin necesidad de tiempos de recirculación largos. En algunas realizaciones, el flujo de alimentación de rAAV se concentra entre al menos dos veces y al menos diez veces. En algunas realizaciones, el flujo de alimentación se concentra entre al menos diez veces y al menos veinte veces. En algunas realizaciones, el flujo de alimentación se concentra entre al menos veinte veces y al menos cincuenta veces. Un experto en la materia también reconocerá que la TFF puede usarse también en cualquier etapa en el proceso de purificación cuando sea deseable intercambiar tampones antes de realizar la siguiente etapa de proceso de purificación.

Captura de rAAV por cromatografía de apatita en presencia, de polietilenglicol (PEG) Los procesos aprobados por la FDA para purificación de proteínas y otros productos biológicos adecuados para su uso en ensayos clínicos humanos y productos farmacéuticos se basan en procesos ortogonales de escala comercial. Se considera que un esquema de purificación multietapa incluye un proceso ortogonal si emplea mecanismos de separación que son distintos entre sí, representado cada etapa un eje en el espacio cartesiano. Por ejemplo, un proceso de dos etapas que usa intercambio aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se consideraría ortogonal. Los procesos para retirar contaminantes, tales como contaminantes de cultivo de producción o contaminantes del proceso, de una recogida de cultivo de producción o flujo de alimentación descrito en este documento son procesos ortogonales que incluyen etapas tanto de captura como de flujo continuo en una diversidad de medios cromatográficos para el producto final (es decir, un vector de rAAV). Se ha demostrado en la técnica que los vectores de rAAV (específicamente rAAV-2) se unen a resinas aniónicas. Se ha demostrado que los vectores de rAAV tales como rAAV-1 , -5 y -8 se unen de forma mucho menos estrecha que rAAV-2 a medio de intercambio aniónico en presencia de componentes de producción tales como albúmina de suero, componentes de virus auxiliar, componentes del medio de producción y ADN de la célula hospedadora, dando como resultado un esquema de purificación menos eficaz y de menor calidad.

Las estrategias de purificación anteriores descritas en la técnica para agentes de unión aniónicos de menor afinidad tales como AAV-1 incluían un gradiente de etapa de ¡odixinol que reduce la concentración relativa de los contaminantes, tales como contaminantes del cultivo de producción e impurezas del proceso, para conseguir una unión más estrecha del vector de rAAV a agentes de intercambio aniónico. Los gradientes de etapa de ¡odixinol no son fácilmente redimensionables a procesos de escala comercial descritos en este documento.

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que pueden aislarse partículas del vector de rAAV de contaminantes, tales como contaminantes de cultivo de producción o contaminantes de proceso, mediante captura y elución de resinas de apatita. De este modo, además de capturar el producto de un flujo de alimentación en bruto, la columna de apatita elimina una diversidad de impurezas relacionadas con el proceso, incluyendo proteínas de adenovirus y de célula hospedadora, glucanos, y proteínas del suero, así como proporcionar factores de aclaramiento adicionales para virus auxiliar (tales como virus auxiliar Ad5).

Las resinas de apatita son medios de cromatografía que comprenden minerales de fosfato cálcico, incluyendo sin limitación hidroxiapatita cerámica (CHT) y fluoroapatita cerámica (CFT). Los medios cromatográficos de apatita también se denominan medios de modo mezclado o multimodo debido a que la apatita tiene grupos funcionales que proporcionan más de una química de unión. Sin desear quedado ligado a la teoría, los medios de apatita proporcionan la oportunidad de unión de afinidad metálica de calcio, unión de hidrógeno, repulsión de carga positiva, atracción de carga positiva, repulsión de carga negativa y atracción de carga negativa mediante una multitud de grupos químicos diferentes, incluyendo restos de hidroxilo presentes en la cadena principal, restos de calcio cargados positivamente y restos de fosfato cargados negativamente presentes en la resina. Cada química de unión se aplica a la unión de modo mezclado igual que a la cromatografía de modo sencillo. Sin embargo, a diferencia de la cromatografía de modo sencillo, las diversas químicas de unión y elución no son independientes y pueden funcionar de formas opuestas. Por ejemplo, el aumento de la fuerza iónica puede dirigir la unión hidrófoba. (T. Kawasaki, M. Niikura y Y. Kobayashi, J. Chrom. 515:125-148 (1990) y P.S. Gagnon, P. Ng, J. Zhen, C. Aberin y J. He, BioProcess Int'l 4:50-60 (2006)). Específicamente, CHT y CFT son formas macroporosas esféricas de hidroxiapatita (Ca5(P04)3OH)2 sinterizada a temperaturas altas para convertir el mineral de una forma cristalina a una cerámica. Esto produce un medio de cromatografía con una estructura macroporosa que proporciona una gran área de superficie, resistencia a transferencia de masa limitada, alta fuerza mecánica y resistencia básica. La sinterización a diferentes temperaturas y tiempos da como resultado diferentes estructuras físicas, tipos I y II, que son idénticas químicamente pero ofrecen diferentes capacidades para diferentes clases de moléculas. CFT difiere de CHT porque es un compuesto de fluoroapatita e hidroxiapatita preparado por reemplazo químico de los grupos hidroxilo con grupos de flúor para aumentar la estabilidad en condiciones ácidas. Las resinas de CFT y CHT están disponibles en el mercado (por ejemplo, de Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la presencia de polietilenglicol (PEG) en el tampón de carga aumenta drásticamente la capacidad y reproducibilidad (reduciendo la penetración variable de partículas de rAAV en el flujo continuo) de la unión de partículas del vector de rAAV a resinas de apatita. Sin desear quedar ligado a teoría, un atributo de los vectores de rAAV que los distingue de la mayoría de impurezas relacionadas con el proceso es el gran tamaño físico de las partículas. Esta diferencia de tamaño se explotó en las etapas de captura y lavado incluyendo polietilenglicol (PEG) en la unión de cromatografía y tampones de lavado para aumentar preferentemente los coeficientes de partición de moléculas mayores al estado unido basándose en la compartición energéticamente favorable de cubiertas de hidratacion. Aunque el uso de PEG en la purificación de vectores virales y bacteriófagos se ha descrito en la técnica, a diferencia de la presente invención, se usó principalmente como un agente de precipitación para agregar físicamente y retirar partículas virales de la solución. Puesto que se conoce en la técnica que el PEG facilita la agregación y precipitación de partículas virales y se ha descrito en la técnica que rAAV forma agregados a fuerza iónica por debajo de 200 m (Wright et al., Molecular Therapy 12:171 -178 (2005)), el efecto de PEG en la unión del vector de rAAV con resinas de apatita fue impredecible. Se conoce en la técnica que el PEG facilita la unión de moléculas de inmunoglobulina a resinas de intercambio iónico como se ha descrito, por ejemplo, en Gagnon, J. Chromtogr. 743A:51-55 (1996) y para resinas de modo mezclado cargadas hidrófobas como se ha descrito, por ejemplo, en Gagnon et al., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development, 4-6 de marzo de 2009.

Los inventores de la presente solicitud han determinado basándose en la experimentación con PEG6000 a lo largo de un intervalo de concentraciones entre 3 y 10 % (p/v) en el flujo de alimentación que una concentración relativa de PEG6000 de aproximadamente 5 % (p/v) era óptima. Un experto en la materia apreciará que otras especies y pesos moleculares de PEG pueden utilizarse incluyendo sin limitación PEG8000, PEG10000 y PEG15000 y que la concentración relativa de PEG en la concentración final de la solución de vector de rAAV puede determinarse empíricamente de modo que a la concentración apropiada de PEG, las partículas del vector de rAAV en la solución se dirigen a unirse a la resina de apatita pero no forman agregados ni precipitan físicamente.

En algunas realizaciones, las partículas de vector de rAAV se aislan de los contaminantes de cultivo de producción por captura en una resina de apatita en presencia de PEG y elución de la partícula de rAAV unida de la resina de apatita en un tampón de fosfato. En realizaciones preferidas, las partículas de vector de rAAV se aislan de contaminantes de cultivo de producción por captura en una resina de apatita en presencia de PEG y elución de la partícula de rAAV unida de la resina de apatita en un tampón en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV que comprenden cápsidas que son agentes de unión aniónicos débiles se aislan de contaminantes de cultivo de producción por captura en una resina de apatita en presencia de PEG y la partícula de rAAV unida eluyó de la resina de apatita en un tampón en ausencia de PEG. En realizaciones más preferidas, las partículas de rAAV que comprenden cápsidas de serotipo I (serotipo rAAV-1 ) se aislan de contaminantes de cultivo de producción por captura en una resina de apatita en presencia de PEG y la cápsida de serotipo rAAV-1 que contiene partículas unidas a la resina se eluyen en tampón en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, las partículas de vectores de rAAV se aislan de contaminantes de cultivos de producción de acuerdo con un método que comprende cargar un flujo de alimentación en un tampón de carga en ausencia de fosfato pero en presencia de PEG y eluir el rAAV unido de la resina de apatita en un tampón de elución que comprende fosfato y carece de PEG.

Aunque la cromatografía de apatita en presencia de PEG representa una estrategia de captura o unión eficaz para purificación de vectores de rAAV, muchas impurezas del proceso se retuvieron también por la resina de apatita a pH 7,0. Sin desear quedar ligado a teoría, las proteínas presentes en el flujo de alimentación a pH básico (pH mayor de 7,0) tendrían más probabilidad de tener una carga negativa neta y repelerse por los sitios de unión de fosfato negativos presentes en la resina de apatita, reduciendo de este modo la capacidad de unión de intercambio catiónico global de la resina cromatográfica. Dada la naturaleza de modo mixto de las resinas de apatita, sin embargo, la unión mediante atracción de carga positiva y afinidad metálica aún podría producirse.

Los tampones de borato se usan de forma rutinaria en la técnica como sistemas de tamponación básica debido a sus propiedades de fabricación deseables incluyendo sin limitación facilidad de preparación, solubilidad óptima, excelente capacidad de tamponamiento y bajo coste. Por lo tanto los tampones de borato como el sistema de tamponamiento básico modelo se evaluaron con respecto a captura de rAAV en resinas de apatita. Un experto en la materia puede apreciar que podrían evaluarse otros tampones básicos para determinar si redujeron el nivel de unión de impurezas del proceso a resinas de apatita en presencia de PEG. Otros tampones básicos pueden ensayarse y usarse para captura de rAAV. En algunas realizaciones, el tampón de carga de apatita en ausencia de PEG comprende un tampón de borato. En realizaciones preferidas, el tampón de borato se formula a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente pH 9,9. En una realización preferida, el tampón de borato se formula a un pH de aproximadamente 9,0. En alguna realización, el tampón de borato está a una concentración entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 500 mM. En más realizaciones preferidas, el tampón de borato se formula a borato aproximadamente 20 mM, pH 9,0. En algunas realizaciones, el tampón de borato 20 mM a pH 9,0 reduce específicamente la captura de impurezas del proceso de moléculas pequeñas en la resina de apatita.

En algunas realizaciones, el flujo de alimentación se carga en la resina de apatita en un tampón que contiene fosfato en presencia de PEG por mezcla en línea del flujo de alimentación con un tampón de fosfato que comprende PEG a dos veces la concentración final de PEG. En algunas realizaciones, el pH del tampón de fosfato está entre pH 6,5 y pH 7,0. En algunas realizaciones, el PEG es PEG6000. En algunas realizaciones, la concentración de PEG6000 en el tampón de carga está entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En realizaciones más preferidas, la concentración de PEG6000 en el tampón de carga es de aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, la concentración de fosfato en el tampón de carga para la resina de apatita está entre 5 mM y 500 mM.

En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatita en presencia de PEG se potencia en relación con la capacidad de unión de la resina de apatita en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatita para las partículas de vector de rAAV en un flujo de alimentación en presencia de PEG se potencia de aproximadamente la mitad de uno log a aproximadamente diez log en relación con la capacidad de unión de la resina de apatita en ausencia de PEG. En realizaciones preferidas, la capacidad de unión de la resina de apatita para partículas de rAAV presentes en un flujo de limitación en presencia de PEG se potencia ocho log. En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatita para partículas del vector de rAAV en un flujo de alimentación en presencia de PEG es al menos aproximadamente 106 partículas de rAAV por mi de resina a aproximadamente 10 partículas por mi de resina (tal como aproximadamente cualquiera de 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 partículas por mi de resina). En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la resina de apatita en presencia de PEG es aproximadamente 1014 partículas por mi de resina.

Aunque esta sorprendente capacidad de unión de aproximadamente 1012-1014 DRP de rAAV-1 por mi de resina de apatita en presencia de PEG permite un cambio de escala altamente eficaz, rentable de purificación de rAAV-1 comercial, un experto en la materia apreciará que la capacidad de unión representa el máximo número de rAAV-1 que se unirá por mi de resina y no se pretende que limite operativamente el alcance de la invención. De hecho los inventores aprecian que los cultivos de recogida de vector de rAAV-1 que contienen menos de 1014-1016 DRP de rAAV-1 /mi pueden purificarse por la presente invención.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV unidas al medio de apatita se lavan antes de eluir las partículas de rAAV de la resina. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene concentraciones decrecientes de PEG para retirar las impurezas del proceso. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v). En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene PEG de aproximadamente cualquiera de 10 % (p/v), 9,5 % (p/v), 9 % (p/v), 8,5 % (p/v), 8 % (p/v), 7,5 % (p/v), 7 % (p/v), 6,5 % (p/v), 6 % (p/v), 5,5 % (p/v), 5 % (p/v), 4,5 % (p/v), 4 % (p/v), 3,5 % (p/v) y 3 % (p/v). En algunas realizaciones, el medio de apatita se lava con un tampón de lavado que contiene PEG a una concentración mayor que la concentración de PEG usada para permitir la unión de las partículas de rAAV al medio de apatita. En algunas realizaciones, el medio de apatita se lava adicionalmente con concentración decreciente de PEG. En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene tampones conocidos en la técnica. En alguna realización, el tampón de lavado comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCI. En algunas realizaciones, el tampón de lavado está a pH básico. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH entre pH 7,0 y pH 10,0, entre pH 7,2 y pH 10,0, entre pH 7,4 y pH 10,0, entre pH 7,6 y pH 10,0, entre pH 7,8 y pH 10,0, pH 8,0 y pH 10,0, pH 8,2 y pH 10,0, entre pH 8,4 y pH 10,0, entre pH 8,6 y pH 10,0, entre pH 8,8 y pH 10,0, entre pH 9,0 y pH 10,0, entre pH 9,2 y pH 10,0, entre pH 9,4 y pH 10,0, entre pH 9,6 y pH 10,0 o entre pH 9,8 y pH 10,0. En algunas realizaciones el tampón de lavado tiene un pH a 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende adicionalmente fosfato entre 100 y 500 mM. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende adicionalmente NaCI entre 50 y 250 mM.

En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón en concentraciones bajas de PEG. En algunas realizaciones, las concentraciones bajas de PEG están entre aproximadamente 2,9 % (p/v) y aproximadamente 0,1 % (p/v) de PEG. En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón en ausencia de PEG. En realizaciones preferidas, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato en ausencia de PEG.

En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato. En algunas realizaciones, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón que contiene fosfato a una concentración entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM (tal como, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 250 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM). En realizaciones preferidas, los vectores de rAAV aislados de un flujo de alimentación por captura en una resina de apatita en presencia de PEG se eluyen en un tampón de fosfato 50 mM.

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que los vectores de rAAV presentes en un flujo de alimentación pueden aislarse por captura en una resina de apatita en presencia de PEG. Sin embargo si están presentes virus auxiliares usados en el cultivo de producción (tal como adenovirus) en el flujo de alimentación aplicado a la resina de apatita, se capturan por la resina de apatita en presencia de PEG. Las partículas de vector de rAAV capturadas por la resina de apatita en presencia de PEG pueden aislarse fácilmente de adenovirus por su perfil de elución en tampones fosfato. Las partículas de vector de rAAV unidas a la resina de apatita en presencia de PEG eluyen, en ausencia de PEG, en tampones que contienen fosfato tan bajo como 0 mM; mientras que las partículas adenovirales de virus auxiliar se retienen en las resinas de apatita en concentraciones de fosfato usadas para eluir las partículas del vector de rAAV. Experimentalmente, se ha descubierto que los vectores de rAAV eluyen en un pico agudo sencillo en tan poco fosfato como 50 mM en ausencia de PEG, mientras que el virus auxiliar tal como adenovirus si está presente se retuvo en la resina. En estudios de adiciones en los que se añadieron a flujos de alimentación de rAAV 89 partículas resistentes a DNasa (DRP) de adenovirus infeccioso y se sometieron a cromatografía en resinas de apatita en presencia de PEG, los vectores de rAAV se capturaron en la resina de apatita y se eluyeron en tampón fosfato 50 mM en ausencia de PEG, mientras que se retuvieron aproximadamente 4 log de proteínas adenovirales en la resina de apatita. En consecuencia, en algunas realizaciones, los vectores de rAAV presentes en un flujo de alimentación se aislan de virus auxiliar contaminante por captura en una resina de apatita en presencia de PEG y elución en tampones fosfato en ausencia de PEG. En algunas realizaciones, los tampones fosfato se formulan a concentraciones que retienen virus auxiliar contaminante unido a la resina de apatita. En algunas realizaciones, se retienen de dos a ocho log de adenovirus por mi de resina de apatita. En algunas realizaciones, los vectores de rAAV presentes en un flujo de alimentación se aislan por elución de una resina de apatita en tampón fosfato 0-500 mM (tal como 0-400 mM, 0-300 mM, 0-200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) en condiciones que retienen virus auxiliar unido a la resina de apatita.

Los sistemas de producción conocidos en la técnica para producir vectores de rAAV pueden incluir medios de producción que contiene suero en el intervalo de 0,5 %-20 % (v/v) o pueden estar desprovistos de suero en su totalidad. Además, los esquemas de purificación descritos en la técnica pueden incluir una o más etapas de concentración que pueden dar como resultado un aumento de las proteínas del suero y otros componentes del suero en el flujo de alimentación aplicado a la resina de apatita. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo de producción como se describe en este documento que se formuló con suero 1 % (v/v) se concentró aproximadamente veinte veces en la etapa de TFF, de modo que el flujo de alimentación cargado en la resina de apatita contenía hasta 20 % de contaminantes de proteína de suero en comparación con un concentrado de flujo de alimentación de un cultivo de producción formulado sin suero. Los inventores de la presente solicitud ensayaron los métodos de captura de apatita proporcionados en este documento con concentrados de flujo de alimentación de cultivos de producción formulados en presencia o ausencia de suero. Se descubrió que la presencia de proteínas de suero en el flujo de alimentación no tenía efecto en el rendimiento de la etapa de cromatografía de apatita.

Inactivación por calor de virus auxiliar (muerte por calor) Si se usa adenovirus infeccioso como una fuente de virus auxiliar en los cultivos de producción para producción de rAAV, puede incorporarse una etapa de activación por calor (muerte por calor) opcional para inactivar cualquier partícula adenoviral residual que pueda estar presente en el flujo de alimentación. La etapa de muerte por calor aprovecha una de las principales diferencias entre AAV y los adenovirus: las partículas de adenovirus se inactivan a temperaturas de aproximadamente 54-56 °C, mientras que las partículas virales de AAV y rAAV son estables y no se ven afectadas por esas temperaturas. En la presente invención, los inventores han ajustado la etapa de inactivación por calor para adaptar la optimización del proceso a mayor escala tal como los cultivos de producción de escala de 250 I realizados en este documento. En particular, el eluato de apatita se inactivo por calor en una bolsa de bioprocesamiento de 5 I de uso sencillo estéril en una plataforma de balanceo con temperatura controlada ajustada a 53 °C a una velocidad de balanceo de 40 RPM, con un ángulo de 12° para la mezcla (placa de calentamiento Wave dé 20 I). El eluato de apatita se incubó en una plataforma hasta que alcanzó 53 °C y después se mantuvo a esa temperatura durante 10 minutos adicionales. Se añadió MgCI2 al eluato de apatita a una concentración final de 2 mM para estabilizar el vector de rAAV durante el calentamiento. Un experto habitual en la materia puede apreciar que la escala, punto establecido final para el calentamiento y tiempo de calentamiento pueden ensayarse empíricamente para encontrar las condiciones óptimas para inactivar partículas adenovirales manteniendo la infecciosidad e integridad de las partículas de rAAV. La etapa de inactivación por calor puede omitirse para purificación de partículas de rAAV de cultivos de producción que utilicen construcciones plasmídicas para proporcionar la función auxiliar.

Cromatografía de interacción hidrófoba La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es una técnica para separar biomoléculas basándose en diferencias en su hidrofobicidad de superficie. Por lo tanto la HIC se considera un método ortogonal a las otras etapas de purificación en el proceso de AAV. El medio cromatográfico de HIC contiene ligandos hidrófobos tales como hidrocarburos de cadena lineal (por ejemplo, propilo (C3), butilo (C4), hexilo (C6) u octilo (C8)) o compuestos aromáticos (por ejemplo, fenilo). En agua pura, el efecto hidrófobo es demasiado débil para interacción funcional entre el ligando y proteínas o entre las proteínas en sí mismas. Sin embargo, las sales liotrópicas potencian las interacciones hidrófobas y la adición de sales dirige la captura de proteínas al medio de HIC. Por esta razón, las resinas de HIC se cargan habitualmente en altas concentraciones salinas y se eluyen a concentraciones salinas menores. Como apreciará un experto en la materia, el sulfato de amonio [(NH4)2SO4] es la sal usada más habitualmente para controlar la captura de proteínas mediante cromatografía de HIC, debido a la alta clasificación liotrópíca de los iones tanto de amonio como de sulfato en la serie de Hofmeister y la alta solubilidad de la sal. En la presente invención, las partículas de rAAV presentes en un flujo de alimentación se cargaron en una resina de HIC por mezcla en línea de una relación 75:25 (volumen:volumen) de tampón de sulfato de amonio 2 M + Bis Tris 50 mM (pH 7,0):flujo de alimentación, respectivamente. La mezcla en línea del flujo de alimentación con el tampón de carga evita el riesgo de cualquier precipitación del vector de rAAV por la alta concentración de sulfato de amonio presente en el tampón. Como puede apreciar un experto habitual en la materia la concentración de sal (sulfato de amonio) puede manipularse para conseguir la concentración óptima para la unión de rAAV. En consecuencia, en algunas realizaciones, la concentración de sulfato de amonio está entre 1 M y 3 M. En algunas realizaciones preferidas, la concentración de sulfato de amonio en el tampón de carga es 2 mM. Como puede apreciar un experto en la materia, la mezcla en línea del sulfato de amonio y flujo de alimentación se realiza por conveniencia y flujo del funcionamiento unitario, pero podría fácilmente mezclarse el flujo de alimentación con la concentración apropiada de tampón de carga por cualquier medio conocido en la técnica y después cargar flujo de alimentación + solución de tampón de carga en el medio cromatográfico de HIC.

Los co-d ¡solventes también pueden afectar a la interacción hidrófoba. Por ejemplo, el etileno o propilenglicol puede reducir la interacción entre proteína y el ligando inmovilizado y de este modo ser útil para mejorar los perfiles de elución. En consecuencia, la columna de HIC se lavó con una mezcla 75:25 (v:v) de tampón de sulfato de amonio 2 M + Bis Tris 50 mM (pH 7,0): tampón de Bis Tris 50 mM (pH 7,0) + propilenglicol 10 % (v:v) (EMD BioSciences) y se diluyó rAAV en un tampón de baja salinidad más propilenglicol (sulfato de amonio 800 mM + tampón Bis Tris 50 mM (pH 7,0) + propilenglicol 4 %. En estas condiciones de elución, cualquier virus auxiliar residual y proteínas presentes en el flujo de alimentación · cargado en la columna permanecería unido a la columna. El propilenglicol en este ejemplo se añadió a los tampones para definir el perfil de elución, en comparación con el perfil de elución amplio del tampón sin propilenglicol, pero es opcional en el proceso.

Los ejemplos de resinas hidrófobas adecuadas incluyen sin limitación Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C y EMD Fractogel Phenyl (Tosoh Bioscience LLC, PA).

Los residuos de los procesos de producción de rAAV requieren descontaminación rigurosa antes de su evacuación por al menos dos razones: (1 ) el producto comprende un vector viral; y (2) los cultivos de producción habitualmente usan adenovirus vivo de tipo 5 (Ad5) como un virus auxiliar para la producción de rAAV. Los residuos líquidos de las operaciones de cromatografía se descontaminan típicamente primero con lejía en el punto de uso y después se someten a descontaminación adicional manteniendo a pH alto antes de neutralización y evacuación.

El sulfato de amonio presente en los tampones de HIC reacciona tanto con la lejía como con el hidróxido sódico para liberar cloro y gas de amoníaco peligrosos respectivamente. Por lo tanto, una consideración primaria para la optimización del proceso de la etapa de cromatografía de HIC fue el desarrollo de un sistema de tampón adecuado que podría descontaminarse de forma segura por métodos conocidos en la técnica.

Como apreciará un experto habitual en la materia, los tampones con altas concentraciones salinas usados en la cromatografía de interacción hidrófoba deben explorarse adicionalmente con respecto a problemas de viscosidad que pueden dar como resultado altas contrapresiones que pueden limitar los caudales o provocar problemas de mezcla, aumentado de este modo el riesgo de precipitación del producto por cristalización salina en los tampones que se producen a temperaturas usadas para almacenamiento u operación. Basándose en los datos de la Tabla 6 posteriormente y consideración de los factores descritos anteriormente, los inventores seleccionaron citrato sódico 1 M (pH 7,0) como el tampón óptimo para unión de los vectores de rAAV con el medio cromatográfico de HIC, aunque pueden usarse tampones de citrato en cromatografía de interacción hidrófoba a concentraciones que varían de 0,5 M a 2,0 M.

Intercambio de tampón por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) Se conocen en la técnica numerosos métodos para realizar el intercambio de tampón descrito en este documento, incluyendo TFF y diálisis. El uso de cromatografía de exclusión de tamaño tiene la ventaja adicional de proporcionar aclaramiento de proteína adicional de proteínas de tamaños seleccionados para pasar a través de los poros en las resinas y de ser relativamente rápido con respecto al tiempo necesario para intercambiar los tampones. El intercambio de tampón se realizó en esta etapa para asegurar, que el eluato de HIC de la etapa anterior se intercambiara con un tampón apropiado para unión de rAAV con la etapa de cromatografía de intercambio aniónico final en el proceso.

Agente adventicio (Aclaramiento viral) Opcionalmente, puede incorporarse una etapa adicional para eliminar contaminantes traza, tales como virus adventicios que pueden estar presentes en el flujo de alimentación, al proceso, produciendo de este modo un proceso ortólogo comercialmente razonable. De este modo, en algunas realizaciones, el proceso incluye adicionalmente un filtro de eliminación de virus. Se conocen en la técnica ejemplos de tales filtros e incluyen Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm) y Asahi 70 nm.

Cromatografía de intercambio aniónico Se realizó una etapa de captura de intercambio aniónico para el vector de rAAV sometido a cromatografía de apatita como una etapa de concentración y pulido final. Se conocen en la técnica medios de cromatografía de intercambio aniónico adecuados e incluyen sin limitación, Unosphere Q (Biorad, Hercules, California), y resinas amino o ¡mino cargadas en N tales como por ejemplo, POROS 50 Pl, o cualquier DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria o resinas basadas en PEI conocidas en la técnica (Patente de Estados Unidos N° 6.989.264; N. Brument ef a/„ Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); G. Gao et al., Hum. Gene Therapy 1 1 :2079-2091 (2000)). Un experto en la materia puede apreciar que pueden identificarse tampones de lavado de fuerza iónica adecuada de modo que el rAAV permanezca unido a la resina mientras que otras impurezas del proceso incluyendo sin limitación glucanos que pueden introducirse por lixiviación de diversos filtros utilizados en las etapas de purificación se separan. En algunas realizaciones, el tampón de lavado es NaCI 60 mM y el vector de rAAV se eluye de la columna con NaCI 130 mM, de modo que cualquier impureza de proceso traza residual presente, tal como albúmina de suero o virus auxiliar, se retiene en la columna.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : recogida de rAAV-1 de clarificación de medio de cultivo y digestión por Benzonase® Se clarificó el medio de producción de rAAV-1 usado (sobrenadante) de un cultivo de producción viral de rAAV-1 de 250 I producido por cualquier método conocido en la técnica que contiene el vector de rAAV-1 para retirar cualquier célula contenida en el sobrenadante. El sobrenadante se pasó a través de una serie de filtros conectados en serie, incluyendo: (1) un Millipore Millistak+® HC Pod Filter, calidad DOHC (Millipore Corp., Bedford, MA) (4 veces); (2) un Millipore Millistak+® HC Pod Filter, calidad A1HC; y (3) un filtro de membrana hidrófila Opticap® XL10 Millipore Express SHC de 0,2 µ?? a una velocidad de 5 litros por minuto (LPM) que se redujo por etapas a 4 LPM.

Todos los filtros se prelavaron en agua de osmosis inversa/desionizada ("RO/DI") según las especificaciones del fabricante. El flujo continuo se recogió en una bolsa de bioprocesamiento para digestión con Benzonase®. Se disolvió una concentración final de 2 unidades/ml de Benzonase® (EM Industries número de catálogo 1.01695.0002) en el medio de producción de rAAV-1 y se añadió al sobrenadante viral clarificado para conseguir una concentración final de 2,5 unidades/ml. El sobrenadante más Benzonase® se incubó a temperatura ambiente con recirculación constante a 4 LPM para permitir la digestión de ADN. Los datos de la digestión con Benzonase® se muestran en la Figura 1 , que demuestra que no estaba presente ADN de alto peso molecular después de digestión con Benzonase®.

Ejemplo 2: Retirada de contaminantes de producción mediante intercambio aniónico El sobrenadante clarificado de rAAV-1 y digerido con Benzonase® del Ejemplo 1 se pasó por una serie de filtros Pall Mustang® Q ("MQ") de 5,08 cm x 55,88 cm conectados en serie (Pall Corp., número de catálogo NP6MSTGQP1 ). Antes de la carga del sobrenadante viral de rAAV-1 los filtros se sanearon con 15 I de NaOH 0,5 M a 0,5 LPM con un tiempo de mantenimiento de 15 minutos, se cargaron con 15 I de TMEG + NaCI 2 M (TMEG: Tris-HCI 0,05 M, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 1 mM, Na2EDTA 1 mM, glicerol 10 % (v/v)) a una velocidad de 6 LPM y se equilibró con 15 I de medio de producción del vector a 6 LPM. El sobrenadante se bombeó después a una velocidad de aproximadamente 6 LPM a través de la serie de filtros y se recogió en una bolsa de bioprocesamiento. A la fuerza iónica del medio de producción, se demostró que el filtro MQ de intercambio aniónico eliminaba virus auxiliar y ADN residual, entre otras impurezas, del sobrenadante de rAAV-1 mediante unión de los contaminantes con la membrana cargada. A la fuerza iónica del cultivo de producción, sin embargo, el vector de rAAV-1 presente en el sobrenadante fluyó a través de la membrana de intercambio aniónico. Durante la optimización del proceso se determinó experimentalmente que el uso de un filtro MQ sencillo dio como resultado una penetración de los contaminantes en el proceso, incluyendo el virus auxiliar Ad5. En consecuencia se añadió un segundo filtro en serie o en tándem en el proceso.

Ejemplo 3: concentración del sobrenadante del vector de rAAV-1 El sobrenadante de producción de rAAV-1 completo procesado en los Ejemplos 1 y 2 se concentró aproximadamente 20 veces mediante filtración de flujo tangencial ("TFF") de un volumen inicial de aproximadamente 250 I a un volumen de aproximadamente 12,5 I. se lavaron abundantemente cartuchos de filtro de polietersulfona de flujo tangencial con un punto de corte de peso molecular de 100 kD, pantalla C y un área de superficie total de 5 m2 (Millipore Pellicon® 2 Biomax, número de catálogo P2B100C05) con 50 I de agua RO/DI, saneada con 15 I de NaOH 0,5 con una etapa de mantenimiento de 15 minutos, se lavó abundantemente de nuevo con 100 I de WIFI (agua purificada WFI HyPure™; HyClone, Logan, UT), se lavó abundantemente con 15 I de TMEG + NaCI 2 M y finalmente se equilibró con 15 I de medio de producción de rAAV-1. El sobrenadante se pasó a través del cartucho de TFF a un caudal de aproximadamente 3 LPM con una velocidad de recirculación de 16 LPM. El material de TFF retenido en el filtro ("retenido") se concentró a aproximadamente 10,5 I y se transfirió a un depósito. El filtro se lavó abundantemente con aproximadamente 2 I de medio de producción. El lavado y concentrado se agruparon después para producir un volumen final de aproximadamente 12,5 I.

La concentración de rAAV-1 a un volumen de 12,5 I por TFF también concentró los contaminantes de producción de rAAV-1 restantes en la solución aproximadamente 20 veces. De este modo, se introdujo una etapa de mantenimiento de fabricación después de la etapa de TFF, durante la que el concentrado de TFF se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 µ? Opticap de 10,16 centímetros (Millipore Opticap® número de catálogo KVSC04HB3). Esta etapa de filtración extra permite que el concentrado de TFF que contiene rAAV-1 continúe a la siguiente etapa en el proceso sin requerir diafiltración e intercambio de tampón. El material post-TFF puede almacenarse a 2-8 °C durante cualquier periodo de tiempo, incluyendo desde tan poco como 24 horas hasta tanto como 3 meses o más, antes de procesamiento adicional sin pérdida de estabilidad según se mide por rendimiento del vector o infecciosidad evaluada por ensayos conocidos en la técnica. Como alternativa, la TFF realizada como se ha descrito en este documento podría usarse en cualquier etapa en el proceso de purificación para concentrar o intercambiar el tampón del vector de rAAV-1.

Ejemplo 4: exploración de resina con respecto a vector de rAAV-1 frente a unión de impureza del proceso Los procesos comerciales aprobados por la FDA para purificación de proteínas y otros productos biológicos se basan en la incorporación a escala comercial de procesos ortogonales. Los procesos ortogonales son procesos que tienen más de una etapa o proceso para retirada de impurezas de proceso, incluyendo etapas tanto de captura como de flujo continuo para el producto final tal como, por ejemplo un vector de rAAV-1. Se ha demostrado en la técnica que los vectores de rAAV (específicamente rAAV-2) se unen a resinas aniónicas. Se ha demostrado que los vectores de rAAV tales como rAAV-1 , -5 y -8 se unen de forma mucho menos estrecha que rAAV-2 con agentes de intercambio aniónico en presencia de componentes de producción tales como albúmina de suero, componentes de virus auxiliar, componentes de medio de producción y ADN de célula hospedadora dando como resultado un esquema de purificación de menor calidad y menos eficaz.

Las estrategias de purificación previas descritas en la técnica para agentes de unión aniónica de menor afinidad tales como AAV-1 incluyen un gradiente de etapa de iodixinol que reduce la concentración relativa de los componentes de producción para conseguir una unión más estrecha del vector de rAAV con agentes de intercambio aniónico. Los gradientes de etapa de iodixinol no son fácilmente redimensionables a procesos de escala comercial tales como los descritos en este documento. Por lo tanto, para optimizar la purificación del vector de rAAV para agentes de unión aniónicos de baja afinidad tales como rAAV-1 sin la necesidad de realizar ultracentrifugación y gradientes de etapa, se exploraron varias resinas con respecto a su capacidad para unirse a vectores de rAAV o excluir los vectores de rAAV en el flujo continuo en comparación con la capacidad para unirse o fluir de forma continua impurezas del proceso habitualmente observadas incluyendo ADN de la célula hospedadora, virus auxiliar, albúmina de suero, proteínas de suero (si se incluye suero en el medio de producción) y otras proteínas de bajo peso molecular halladas en los cultivos de producción para desarrollar un proceso de purificación de rAAV comercialmente redimensionable, ortogonal y eficaz.

La exploración de las resinas se realizó usando una columna de 1 mi (altura del lecho de 5 cm) con caudales lineales recomendados por el proveedor para cada resina a capacidades de carga gravemente reducidas en relación con las recomendaciones del fabricante. Se recogieron seguimientos espectrofotométricos de absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros (A2eo) con respecto a unión a y dilución de cada resina. Los picos se analizaron por el ensayo apropiado tanto para vector de rAAV-1 como para impurezas del proceso representativas. Los datos presentados en la Figura 2 representan un seguimiento espectrofotométrico típico para una resina típica en la lista. La Tabla 2 enumera algunas de las resinas exploradas así como las afinidades de unión relativas de la resina por el vector de rAAV-1 y diversas impurezas de proceso.

Tabla 2: Exploración de resinas con respecto a unión de rAAV-1 en comparación con unión de contaminantes de proceso Resina Tipo de rAAV-1 Virus ADN de Albúmina Proteínas Resina Auxiliar Célula de Suero de Suero Hospedad ora UnoS pH 5,5 Intercambio + 0 + + Catiónico UnoS pH 7,0 Intercambio - - - - - Catiónico UnoS pH 8,5 Intercambio + ++ ++++ ++ ++ Aniónico UnoS pH 7,0 Intercambio + +++ ++++ ++ ++ Aniónico Fractogel E D Intercambio + ++ - 0 0 S03 Catiónico CHT Apatita + 0 ++ + + CFT Apatita + 0 ++ + + Resina Tipo de rAAV-1 Virus ADN de Albúmina Proteínas Resina Auxiliar Célula de Suero de Suero Hospedad ora HIC Fenilo Intercambio - - - 0 0 Hidrófobo HIC Butilo Intercambio + ++ 0 0 Hidrófobo HIC Hexilo Intercambio + ++ 0 0 Hidrófobo HIC PPG Intercambio - - 0 0 Hidrófobo Fuente S Intercambio + 0 0 ++ 0 Iónico Fuente Q Intercambio + 0 0 ++ 0 Iónico TMAE Intercambio + 0 0 ++ 0 Iónico IMAC FeCI3 0 0 + + Superdex 200 Filtración en vacío vacío seguimien seguimien seguimien Gel to to to HW55 Filtración en vacío vacío seguimien seguimien seguimien Gel to to to HW65 Filtración en vacío vacío seguimien seguimient seguimien Gel to o to Resina Tipo de rAAV-1 " Virus ADN de Albúmina Proteínas Resina Auxiliar Célula de Suero de Suero Hospedad ora HW75 Filtración en vacío vacío · seguimien seguimient seguimien Gel to 0 to Clave: (-) = presente en flujo continuo (sin unión); + = débilmente unido (eluido muy temprano en el gradiente); ++ a ++++ = unión más fuerte (eluido más tarde a lo largo del gradiente).

Ejemplo 5: desarrollo de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol ("PEG") para captura de rAAV-1 Basándose en los resultados de la exploración de resina realizada en el Ejemplo 4, se seleccionó una resina de apatita o resina de apatita cerámica como una de las resinas de captura para rAAV-1. Se realizaron experimentos iniciales usando resinas CFT II, pero para purificación posterior la resina se cambió a CHT I, como se analiza en detalle posteriormente. Los datos indicaron que ambas resinas cromatográficas rindieron de forma equivalente. Se realizaron experimentos para aumentar adicionalmente la capacidad de unión de rAAV-1 de la resina de apatita y mejorar la capacidad de la resina para diferenciar entre partículas de rAAV-1 y otras impurezas del proceso. Se desarrollaron adicionalmente dos mejoras clave para la función de las resinas de apatita como se describe en este documento: 1) la adición de PEG y 2) desarrollo de las condiciones del tampón de carga.

Basándose en la penetración variable de la columna de apatita debido a problemas de capacidad en tamaños de columna comercialmente razonables, se mezcló PEG con el concentrado de TFF (véase Ejemplo 3 anterior) antes de cargar en la resina de apatita para aumentar la unión del vector de rAAV-1 en relación con otras impurezas del proceso tales como albúmina de suero, virus auxiliar y otras impurezas de proteína que superaron por competición al vector de rAAV-1 con respecto a unión a la columna en el Ejemplo 4.

La cromatografía de apatita en presencia de PEG representa una estrategia de captura o unión eficaz para purificación de vectores de rAAV-1 , aunque también se retuvieron muchas impurezas del proceso por la resina de apatita a pH 7,0.

Se realizaron experimentos para determinar si la modificación de las condiciones de tamponamiento podría mejorar la resolución de rAAV-1 de otras impurezas del proceso. Se realizaron experimentos a pequeña escala usando un sistema AKTAexplorer FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equipado con 1 ,2 mi de columnas Tricorn 5 (GE Healthcare) empaquetadas a una altura de lecho de 6 cm con resina CFT, ejecutadas a un caudal de 150 cm/h. Esas columnas se evaluaron con respecto a captura de vector de rAAV-1 frente a unión de albúmina de suero bovino ("BSA"), una impureza de proceso de molécula pequeña modelo, en diversos sistemas de tampón en presencia o ausencia de PEG6000 5 %.

Se inyectó rAAV-1 o BSA en volúmenes pequeños (<5 % del volumen total) en la columna de CFT en el sistema de tampón para ensayarse, en presencia o ausencia de PEG6000 5 % (p/v). Se usaron volúmenes pequeños para obviar la necesidad de intercambio de tampón de las muestras. Los productos se eluyeron junto con un gradiente de P04 500 m . Se usó ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico ("MES") 50 mM para tamponar el sistema a pH = 6,50 y se usó borato 20 mM para tamponar el sistema a pH 9,0.

Los datos presentados en la Tabla 3 demuestran que la unión en el vector de rAAV-1 a la resina de apatita fue esencialmente la misma a pH 6,5 o pH 9,0 en presencia de PEG6000 5 % (p/v), mientras que la unión de BSA, la molécula pequeña modelo impureza del proceso, se redujo drásticamente a pH 9,0 en presencia o ausencia de PEG6000 5 % (p/v), como se indica por los seguimientos espectrofotométricos (datos no mostrados). El análisis adicional de la capacidad reducida de BSA para unirse a la columna de apatita en condiciones de carga de tampón básicas (es decir pH = 9,0) por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima ("ELISA") demostró que la mayoría de la BSA (aproximadamente 78 %) estaba presente en el flujo continuo a condiciones de tampón de pH 9,0, mientras que pudieron conseguirse niveles adicionales de eliminación o reducción de unión de BSA durante etapas de lavado posteriores (aproximadamente 19 %), dejando solamente aproximadamente 0,1 % de la BSA cargada en la columna unida de hecho a la resina de apatita y co-eluyendo con el vector de rAAV-1. Las partículas de rAAV-1 fueron estables a pH 9,0, como se indica por la falta de pérdida de infecciosidad o reducción en el número de partículas resistentes a DNasa ("DRP") eluidas.

Tabla 3: Fuerza relativa de unión de rAAV-1 y BSA a resina de apatita a pH=6,5 o pH=9,0, con o sin PEG6000 5 % (p/v) Condiciones de unión BSA PEG6000 5 % (p/v) pH=6,50 ++ + pH=6,50 + PEG6000 5 % ++ ++++ (p/v) pH=9,0 + + pH=9,00 + PEG6000 5 % + ++++ (p/v) Clave: + = unión débil; ++ = unión media; ++++ = unión 1 uerte.

Ejemplo 6: efecto de suero en el cultivo de recogida de rAAV-1 sobre la captura de rAAV-1 mediante cromatografía de apatita en presencia de PEG Los cultivos de producción de vector de rAAV-1 o flujos de alimentación que contienen rAAV-1 a purificar por los métodos descritos en este documento pueden contener suero y proteínas del suero si los cultivos de producción se dejaron crecer en medio que contenía suero. Aunque se ha descrito producción del vector de rAAV-1 que usa concentraciones muy bajas de suero (es decir, 1 % o menos) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.995.006), la concentración del cultivo de producción o flujo de alimentación como se describe en el Ejemplo 3 pueden producir un flujo de alimentación que contiene de hecho suero 20 % y proteínas de suero como resultado de la concentración 20 veces de la recogida de cultivo de producción. Para evaluar el efecto de los componentes del suero en el rendimiento de la cromatografía de apatita, se realizaron experimentos en cultivos de producción producidos en presencia o ausencia de suero, en presencia o ausencia de PEG6000.

Se usaron cultivos de producción de rAAV-1 de dos modelos para evaluar la capacidad de la resina de apatita (CFT de tipo I) por análisis de penetración tradicional en un total de cuatro experimentos de carga de columna. En un experimento, los cultivos de producción contenían suero; y en el segundo experimento, el cultivo de producción no contenía suero. Ambos flujos de alimentación se ensayaron en presencia de PEG6000 5 % (p/v) o en ausencia de PEG. Los flujos de alimentación fueron representativos del proceso de recogida y se clarificaron sobrenadantes de cultivo que se habían pasado sobre un filtro de intercambio aniónico y se concentraron 20 veces por filtración de flujo tangencial como se describe en este documento. Las columnas de CFT de tipo I se cargaron por mezcla en línea 1 :1 del flujo de alimentación con un tampón de borato a pH=9,0. El tampón contenía PEG6000 0 % o 10 % (p/v) (para conseguir una concentración final de PEG6000 5 % (p/v)). A medida que se cargaban las columnas, el flujo continuo se recogió en una serie de fracciones que se analizaron con respecto a producto por DRP-PCR. La capacidad funcional se definió como el punto en el que la concentración de producto en la salida de la columna alcanzó solamente el 1 % de la concentración que entraba en la columna, después de haber observado la dilución en línea. Para cargas de columna que contienen PEG, el resto del proceso de cromatografía se ejecutó después para evaluar la recuperación del vector en las fracciones de elución.

Los datos presentados en la Figura 3 demuestran que la adición de PEG6000 aumenta la capacidad de la resina de apatita para unión del vector de rAAV-1 independientemente de si está presente el suero en el cultivo de producción. Sin desear quedar ligado a la teoría, el sobrenadante post TFF en presencia de PEG une preferentemente rAAV-1 a la resina de apatita frente a otras impurezas del proceso mediante una interacción aniónica con los restos de fosfato que puede superarse por competición por la presencia de fosfato en el tampón de elución. Además, la unión de rAAV-1 con la resina de apatita se diferencia adicionalmente de las impurezas del proceso mediante la interacción metálica que puede superarse por competición por la presencia de sal. También de rAAV-1 con los restos de fosfato no está dirigida principalmente por hidrofobicidad, puesto que los tampones de captura y elución se formulan para ser principalmente de naturaleza iónica (es decir, el tampón de elución contiene fosfato 50 mM, en comparación con tampones de elución que contienen fosfato 150 mM o mayor usados habitualmente en la elución de composiciones unidas por interacciones principalmente hidrófobas). En estas condiciones de alta salinidad, baja elución de fosfato, el virus auxiliar residual, ADN de la célula hospedadora y otras proteínas de bajo peso molecular contenidas en el sobrenadante de los cultivos de producción se conservarían, si estuvieran presentes, en la resina. Sorprendentemente, los datos demuestran que en presencia de PEG6000, los vectores de rAAV-1 producidos en medio que contiene suero o sin suero demuestran una capacidad de unión para las resinas de apatita de al menos 1 ,2x1012 DRP/ml (una carga de 1 mi) a más de 1 ,5x104 DRP/ml de resina (150 mi).

En ausencia de PEG6000 5 % (p/v), la capacidad de unión de la resina de apatita para la recogida de TFF fue menor de 2,4x1012 DRP/ml para vectores producidos en medio que contiene suero y 7,2x1012 DRP/ml para vectores producidos en medio sin suero, puesto que no se recuperó vector de rAAV-1 en el eluato de CFT. Ejemplo 7: purificación de rAAV-1 mediante cromatografía de apatita La columna de CHT de tipo I se empaquetó con NaCI 2 M y se saneó con NaOH 1 M. Antes de cargar, la columna se equilibró con 6 volúmenes de columna ("CV") de borato 20 mM (pH = 9) + PEG6000 5 % (p/v). El concentrado de flujo de alimentación de TFF se cargó mediante un BioProcess Skid de 3 mm (GE Healthcare) a una columna de CHT de 923 mi (14 cm de diámetro x 6 cm de altura de lecho) preparada como se ha descrito previamente a un caudal de 96 cm/h. El concentrado de flujo de alimentación de TFF se mezcló en línea con un volumen igual de borato 40 mM (pH = 9) + tampón de PEG6000 10 % (p/v) para producir una concentración final de borato 20 mM (pH = 9) + PEG6000 5 % (p/v).

Se realizó una serie de 4 lavados secuenciales para retirar impurezas del proceso conservando a la vez el vector de rAAV-1 en la columna. El lavado 1 ("el seguimiento") se realizó por mezcla en línea de 5 CV de borato 20 mM (pH = 9,0) + PEG6000 5 % (p/v):borato 40 mM (pH = 9,0) + PEG6000 10 % (p/v) 50:50 (volumen:volumen) para seguir todas las líneas de carga con PEG6000. Además, se descubrió que esta etapa aumentaba preferentemente la afinidad de unión de los vectores de rAAV-1. El lavado 2 se realizó con 15 CV de fosfato potásico 150 mM + borato 20 mM (pH = 9) + PEG6000 5 % (p/v) para retirar la mayoría de la albúmina se suero y otras impurezas del proceso de proteína de bajo peso molecular conservando a la vez rAAV-1 en la columna. El lavado 3 ("WM" en la Figura 5) se realizó con 15 CV de borato 20 mM (pH = 9) + PEG6000 5 % (p/v) para retirar cualquier fosfato residual de modo que el rAAV-1 permaneciera unido a la columna una vez que se había retirado el PEG6000. El lavado 4 ("WIN" en la Figura 5) se realizó con 5 CV de tampón de HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCI 150 mM para retirar el PEG6000 y ajustar la concentración salina, permitiendo de este modo la diferenciación entre rAAV-1 y cualquier virus auxiliar residual u otras impurezas del proceso, tales como contaminantes proteicos, que pueden permanecer unidos a la columna.

El vector de rAAV-1 se eluyó de la columna por 6 CV de un tampón de fosfato potásico 50 mM + HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCI 150 mM. La Figura 4 muestra un rastro espectrofotométrico típico de absorbancia UV a 280 nm (A2eo) y conductividad para el procedimiento cromatográfico de CHT I. La Figura 5 muestra la pureza relativa de los vectores de rAAV-1 eluidos de la resina de apatita.

Eliminación de glucano por cromatografía de apatita Los glucanos son carbohidratos similares a la celulosa que se lixivian en el proceso del filtro de profundidad basado en celulosa usado para recoger partículas de rAAV-1 de cultivos de producción. Los glucanos a concentraciones por encima de aproximadamente 1 ng/ml pueden interferir con los ensayos de lisado de amebocito de Limulus convencionales ("LAL") para contaminación de endotoxina bacteriana. Como se demuestra en la Tabla 4 a continuación, la columna de CHT de tipo I de apatita eliminó aproximadamente 2,5 log de glucanos del cultivo de producción. En las condiciones de tampón descritas en este documento, la amplia mayoría de los glucanos estaban presentes en el flujo continuo y no se unieron a la columna.

Tabla 4: Eliminación de glucano en el proceso Concentración Etapa de Cantidad total por lote de glucano procesamiento (ng) (escala de 250 I) (ng/ml) Clarificación 10,4 2.600.000 TFF 136 1.541.016 elución de CHT 1 ,9 4.769 Post HIC y SEC 0,2 662 Eluato de Intercambio 0,1 71 Aniónico Final Se ensayaron muestras con respecto a glucano usando un ensayo cromogénico cinético basado en LAL específico para glucanos (Glucatell®, Cape Cod, MA).

Eliminación de virus auxiliar Ad5 por cromatografía de apatita Para confirmar que la cromatografía de CHT eliminaba Ad5 del flujo de alimentación, se realizó un estudio de adición preliminar usando flujo de alimentación del proceso corriente arriba final. Los niveles de adición de Ad5 se establecieron basándose en datos obtenidos del estudio de eliminación viral de fase I con resinas de CFT II y se usaron tres relaciones de carga diferentes del flujo de alimentación: 6,6 mi; 13,5 mi; y 33 mi de flujo de alimentación post TFF por mi de resina de CHT.

Los datos presentados en la Tabla 5, la eliminación de Ad5 por CHT, fue comparable a la eliminación de 4 LRV, demostró aproximadamente 4 log de eliminación viral de Ad5 y parecía ser independiente del volumen de flujo de alimentación cargado, dentro del intervalo de 5 veces evaluado. La baja recuperación de Ad5 es coherente con datos anteriores que indican que en las condiciones de tampón utilizadas el Ad5 se une de forma más estrecha que rAAV-1 a la resina de apatita.

Tabla 5: Unidades infecciosas totales de Ad5 en fracciones de columna de CHT T^raccjón de relación de 6,6 mi 13,5 mi 33 mi Carga Carga 9,0x10a 1 ,3x109 9,0x108 Flujo continuo + <2,5x105 <3,6x105 <6,9x105 seguimiento Lavado con P04 2,9x10b 2,7x10b <2,6x10b Lavados II y III 3,6x106 2,2x10 2,8x10e Elución <6,9x104 <6,9x104 <3,5x10& Valor de reducción log >4,1 >4,3 >3,4 (LRV) Se añadió un total de 8x10 partículas infecciosas de Ad5 (es decir, partículas totales con una P:l de aproximadamente 10) a diferentes volúmenes de flujo de alimentación post TFF para aplicarse en columnas de CHT de 1 ,2 mi. Las columnas se ejecutaron a 100 cm/h y se recogieron fracciones para ensayar con respecto a vector por DRP y Ad5 por ensayo de titulación infecciosa. Se usó una versión de adición controlada del ensayo de infecciosidad de Ad5 puesto que se sabe que altas concentraciones de las muestras tanto de carga como de elución de CHT interfieren en el ensayo basado en células. La eliminación de Ad5 se determinó como el valor de reducción logarítmico ("LRV"), calculado como el logaritmo de la cantidad total de Ad5 cargado dividido por la cantidad total de Ad5 recuperado en la fracción de elución (Valor de Reducción Logarítmico).

Ejemplo 8: Inactivación por calor de virus auxiliar residual Se realizó una etapa de inactivación por calor para inactivar y retirar cualquier virus auxiliar residual presente en el eluato de CHT I. Para experimentos de menor escala, el eluato de CHT I se dividió entre dos frascos de PETG de 1 I (Nalgene®) y se añadió gC a una concentración final de 2 mM para aumentar la estabilidad del vector de rAAV-1. Los frascos se incubaron en un baño de agua a 53,5 °C con mezcla hasta que la temperatura en el frasco alcanzó aproximadamente 52 °C. Los frascos se enfriaron después por transferencia a un baño de agua a temperatura ambiente y se mezcló hasta que la temperatura en el frasco no fue mayor de 5 °C por encima de la temperatura ambiente. La mezcla con muerte por calor se filtró a través de una membrana de filtro 0,22 µ? Opticap® de 10,16 centímetros (Millipore Opticap® número de catálogo KVSC04HB3). Como alternativa, para experimentos a mayor escala el eluato de CHT I se inactivo por calor en una bolsa de bioprocesamiento de uso sencillo estéril (Bolsa de 5 I Hyclone 5 L adaptada, película CX5-14) en una plataforma con balanceo con temperatura controlada con un punto de temperatura de referencia de 53 °C a una velocidad de balanceo de 40 RPM y un ángulo de mezcla de 12° (placa de calentamiento Wave de 20 I). El eluato de CHT I se incubó en la plataforma hasta que la temperatura alcanzó 52 °C y después se mantuvo durante 10 minutos adicionales. Para estabilizar el rAAV-1 durante el calentamiento, se añadió MgC a una concentración final de 2 mM. Después de calentar, el producto se filtró a través de un filtro de 0,2 µp? y se mantuvo durante una noche a temperatura ambiente para minimizar los posibles efectos de la temperatura en la columna de interacción hidrófoba posterior.

Ejemplo 9: captura de rAAV-1 mediante cromatografía de interacción hidrófoba ("HIC") La HIC es una técnica para separar biomoléculas basándose en diferencias de su hidrofobicidad de superficie. Como tal, la HIC se considera un método ortogonal a las otras etapas de purificación en el proceso de rAAV-1. El medio de HIC contiene ligandos hidrófobos tales como hidrocarburos de cadena lineal (por ejemplo, propilo (C3), butilo (C4), hexilo (C6) u octilo (C8)) o hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, fenilo). En agua pura, el efecto hidrófobo es demasiado débil para la interacción funcional entre el ligando y las proteínas o entre las proteínas en sí mismas. Sin embargo, las sales líotrópicas potencian las interacciones hidrófobas y la adición de tales sales dirige la adsorción de proteínas a medios de HIC. Por esta razón, las resinas de HIC se cargan habitualmente a altas concentraciones salinas y se eluyen a menores concentraciones salinas. Cromatografía de HIC con tampones de sulfato de amonio Brevemente, se saneó una columna de butilo de HIC de 170 mi (diámetro de 6 cm x altura de lecho de 6 cm) (Toyopearl® Butyl 650 M; Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA; número de catálogo 14702) con varios volúmenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibró con una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de sulfato de amonio 2 M + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0): Bis Tris 50 mM (pH = 7,0). El eluato de apatita de vector de rAAV-1 muerto por calor se cargó a una velocidad de 3,3 l/h con mezcla en línea a una relación 75:25 (volumen:volumen) de sulfato de amonio 2 M + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0):eluato de apatita de rAAV-1. La mezcla en línea evita el riesgo de cualquier precipitación del vector de rAAV-1 por el sulfato de amonio presente en el tampón. La columna se lavó con uno o más volúmenes de columna de una relación 75:25 (volumen:volumen) de un tampón de sulfato de amonio 2 M + Bis Tris 50 mM pH = 7,0:tampón de Bis Tris 50 mM pH = 7,0 + Propilenglicol 10 % (volumen:volumen) (EMD Biosciences). El propilenglicol en este ejemplo se añadió a los tampones para definir el perfil de elución, en comparación con el perfil de elución amplio del tampón sin propilenglicol, aunque es opcional en el proceso. El vector de rAAV-1 se eluyó de la columna con tampón de sulfato de amonio 800 mM + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0) + propilenglicol 4 %. Con las condiciones de elución utilizadas, cualquier virus auxiliar residual y proteínas presentes en la carga permanecerían unidas a la columna.

Los residuos de los procesos de producción de rAAV-1 requieren descontaminación rigurosa antes de su evacuación, debido tanto a que el producto es un vector viral como al uso de adenovirus vivo de tipo 5 (Ad5) como un virus auxiliar para la producción. Los residuos líquidos de operaciones de cromatografía se descontaminan típicamente primero con lejía en el punto de uso y después se descontamina adicionalmente manteniendo un pH alto antes de su neutralización y evacuación. El sulfato de amonio presente en los tampones de HIC reacciona tanto con la lejía como con el hidróxido sódico para liberar cloro y gas de amoníaco peligrosos respectivamente. Por lo tanto, una consideración principal para la optimización del proceso de la etapa de cromatografía de HIC fue el desarrollo de un sistema de tampón adecuado que pudiera descontaminarse fácilmente por métodos conocidos en la técnica.

Exploración con respecto a tampones adecuados para unión de rAAV-1 con la columna de HIC El vector de rAAV-1 se cargó en columnas en una diversidad de diferentes condiciones de tampón y se determinó la eficacia de unión relativa midiendo la cantidad de vector de rAAV-1 presente en la fracción de flujo continuo (Tabla 6). Los tampones evaluados incluyeron tanto sales liotrópicas de alta concentración utilizadas tradicionalmente con procesos cromatográficos de HIC como varios tampones de pH bajo en los que podría producirse potencialmente interacción de modo mezclado (HIC/intercambio catiónico). Las resinas tanto de Tosoh Butyl 650 M como de E D Phenyl se unieron al vector en varios de los tampones alternativos.

Los tampones con altas concentraciones salinas usados en la cromatografía de interacción hidrófoba deben explorarse adicionalmente con respecto a problemas de viscosidad que pueden dar como resultado altas contrapresiones que pueden limitar los caudales o provocar problemas de mezclado y el riesgo de precipitación del producto debido a cristalización salina en almacenamiento o temperaturas de funcionamiento de los tampones. Basándose en los datos de la Tabla 6 a continuación y después de considerar los factores descritos anteriormente, se seleccionó citrato sódico 1 M, pH = 7,0 como el tampón óptimo para unión de los vectores de rAAV-1 con el medio cromatográfico de HIC.

Tabla 6: Exploración con respecto a unión de AAV1 en tampones alternativos Sistema de Tampones Ensayado Butyl 650 M ( EMD-Phenyl ( % % en flujo en flujo continuo) continuo) Sulfato Sódico 1 ,1 M (pH = 7) 0 % 0 % Citrato Sódico 1 M (pH = 7) 0 % 0 % Fosfato Potásico 1 ,3 M (pH = 7) 3 % 3 % NaCI 2,9 M, Citrato Sódico 50 mM (pH = 4) 0 % 28 % Glicina 1 M, Citrato Sódico 50 mM (pH = 4) 4 % 1 % Fosfato Potásico 50 mM (pH = 4,5) 3 % NT Citrato Sódico 50 mM (pH 4) 4 % NT NaCI 2,9 M, Fosfato Potásico 50 mM (pH 4,5) 17 % NT Se realizaron experimentos a temperatura ambiente en columnas Tricorn 5/50 (altura de lecho 6 cm, volumen de columna 1 ,2 mi) usando vector de rAAV-1 purificado. Las columnas se equilibraron con los tampones enumerados y se cargaron aproximadamente 2x1011 DRP de rAAV-1 en la columna. Se eluyó rAAV-1 a lo largo de un gradiente lineal de 20 CV de Bis Tris 145 mM (pH = 7,0), propilenglicol 10 % (v/v). El flujo continuo se recogió y ensayó por análisis de DRP con respecto a la fracción de rAAV-1 aplicada a la columna que fluyó a través de ella o no se unió.

Se realizó caracterización adicional sobre la eliminación de impurezas del proceso en la columna de HIC en los diversos tampones demostrando buena unión de rAAV-1 en el experimento anterior. Los datos de la Tabla 7 posterior con respecto a unión de contaminante modelo demuestran que tanto el adenovirus como el ADN si están presentes en el flujo de alimentación se diferencian eficazmente por la etapa cromatográfica de HIC.

Tabla 7: Unión relativa de rAAV-1 frente a impurezas del proceso modelo en diferentes tampones de HIC Sistema de Tampón rAAV-1 Ad5 ADN sulfato sódico 0,1 M + tampón bis tris, pH = + ++ - 7,0 sulfato sódico 0,8 M, tampón bis tris, pH = 7,0 + ++ 0 Sistema de Tampón rAAV-1 Ad5 ADN citrato sódico 1 M, pH = 7,0 + ++ 0 NaCI 2,9 M (citrato sódico 50 mM para tamponar tampón a pH = 4,0) 0 Clave: "0" = sin material de unión presente en el flujo "continuo"; "-" = unión muy débil; "+" = unión fuerte; "++" = unión más fuerte.

Se realizaron experimentos a temperatura ambiente en columnas Tricorn 5/50 (altura de lecho 6 cm, volumen de columna 1 ,2 mi). Las columnas se equilibraron con los tampones enumerados y las muestras indicadas se cargaron en la columna. Cada muestra se eluyó a lo largo de un gradiente lineal de 20 CV. Las muestras se recogieron y se ensayaron con respecto al material de carga relevante.

Cromatografía de HIC con tampones de citrato sódico El eluato de apatita del vector de rAAV-1 muerto por calor se cargó posteriormente en una columna de butilo de HIC para reducir adicionalmente cualquier impureza del proceso residual y como una etapa de concentración y desalinización. Se saneó una columna de butilo de HIC de 373 mi (diámetro 6 cm x altura de lecho 8,9 cm) (Tosoh Biosciences ToyopearI® Butyl 650 M número de catálogo 14702) con varios volúmenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibró con 5 CV de una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de citrato 1 M + fosfato sódico 20 mM:fosfato sódico 20 mM. El eluato de CHT I del vector de rAAV-1 muerto por calor se cargó a una velocidad de 106 cm/h con mezcla en línea a una relación 75:25 (volumen.volumen) de citrato 1 M + fosfato sódico 20 mM.eluato de CHT I. La mezcla en línea evita el riesgo de cualquier precipitación del vector de rAAV-1. La columna se lavó con 5 CV de una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de citrato 1 M + fosfato sódico 20 mM:tampón de fosfato sódico 20 mM. El vector de rAAV-1 se eluyó de la columna con 6 CV de citrato 0,35 M más fosfato sódico 20 mM. La columna se lavó después con 3,5 CV de tampón de fosfato sódico 20 mM. Este lavado de baja salinidad (sodio 20 mM) eluye una fracción de partículas del vector de rAAV-1 que son hidrofóbicamente distintas en su perfil de elución de las partículas del vector de rAAV-1 que eluyen en el tampón de elución de mayor salinidad. De hecho, si la fracción eluida con baja salinidad se aislaba y volvía a aplicar la columna de HIC en las condiciones descritas, esa población del vector aún éluía solamente en la fracción de baja salinidad, lo que indica que la fracción no era el resultado de un avance en la capacidad de la columna. El análisis de infecciosidad sugiere que esta fracción de rAAV-1 probablemente representa una población que comprende cápsidas vacías, cápsidas parcialmente desnaturalizadas, material de cápsida menos infeccioso y cápsidas parcialmente completas. Por lo tanto, esta observación puede conducir a mejoras en la separación de partículas de rAAV-1 que son menos infecciosas y por lo tanto menos deseables como material de producto. En las condiciones de elución utilizadas cualquier virus auxiliar residual y proteínas presentes en la carga permanecerían unidas a la columna y por lo tanto deberían estar presentes en la tira de baja salinidad.

Ejemplo 10: intercambio de tampón por cromatografía de exclusión de tamaño ("SEC") El intercambio de tampón por cromatografía de exclusión de tamaño proporciona eliminación de proteína adicional de proteínas seleccionadas por tamaño para pasar a través de los poros en las resinas y es relativamente rápida con respecto al tiempo necesario para intercambiar los tampones. El intercambio de tampón realizado en esta etapa fue para asegurar que el eluato de HIC de la etapa anterior se intercambiaba a un tampón apropiado para unión de rAAV-1 con la etapa de cromatografía de intercambio aniónico final en el proceso. Se empaquetó una resina de uso en 200 prep de 3,2 I (diámetro de 14 cm x altura de lecho de 21 cm) Amersham Superdex® (Amersham/GE Healthcare, Piscataway, NJ; número de catálogo 17-1043-04) y se preparó saneando con NaCI 2 M + NaOH 1 y se equilibró con 2,8 CV de NaCI 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0). La elución de HIC se subdividió para procesar en la SEC en tres ciclos secuenciales de aproximadamente 400 mi cada uno, cargando no más del 12,5 % del volumen de columna de la SEC para cada ciclo. Los picos de producto (contenidos en los volúmenes huecos) de los tres ciclos de SEC se recogieron en una bolsa de bioprocesamiento sencilla. El eluato de HIC se cargó en |a columna a un caudal de 49 cm/h. La columna se siguió y se lavó abundantemente con 1 ,4 CV de NaCI 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0) y el vector de rAAV-1 presente en el eluato de HIC estaba presente en el volumen hueco de la columna. Después de la recogida del volumen hueco como se ha descrito, la segunda y tercera fracciones se cargaron y recogieron en la misma columna de forma secuencial como se ha descrito anteriormente para la primera fracción.

Ejemplo 11 : agente adventicio (eliminación viral) Como un proceso opcional para eliminar virus adventicios que pueden estar presentes como contaminantes traza y producir de este modo un proceso ortogonal comercialmente razonable, se introdujo un filtro de eliminación viral en el proceso. Los ejemplos de tales filtros se conocen en la técnica e incluyen Millipore Viresolve® NFR (50 nm), Pall Ultipore® VF (50 nm) y Asahi 70 nm. Se preparó un filtro de eliminación viral Millipore Viresolve® NFR (filtro Virosolve NFR de 10,16 cm Millipore número de catálogo KZRV 04T C3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se lavó abundantemente con NaCI 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0) y la elución de la SEC se filtró a través de la membrana. El filtro se lavó abundantemente con varios volúmenes de NaCI 20 mM + Tris-HCI 20 mM (pH 8,0) y se agrupó con el eluato de SEC filtrado.

Ejemplo 12: cromatografía de intercambio aniónico Se realizó una segunda etapa de captura de intercambio aniónico para el vector de rAAV-1 como una etapa de concentración y pulido final en una resina Unosphere® Q (Biorad, Hercules, CA). Se saneó una columna de 373 mi (diámetro 8,9 cm x altura de lecho de 6 cm) con varios volúmenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibró con 7 CV de NaCI 20 mM + tampón de Tris 20 mM (pH = 8,0). La fracción del volumen hueco de SEC u opcionalmente el eluato filtrado viral se cargó a una velocidad de 309 cm/h. la columna se lavó con 10 CV de NaCI 60 mM. La fuerza iónica de la solución de lavado se seleccionó para retener rAAV-1 unido a la resina mientras que se separaba cualquier otra impureza del proceso, tales como glucanos que pueden introducirse por lixiviación de diversos filtros utilizados en las etapas de purificación. El vector de rAAV-1 se eluyó de la columna con 6 CV de NaC1 130 mM. La fuerza iónica de la elución salina de NaCI 130 mM separará rAAV-1 de la columna mientras que cualquier impureza traza residual del proceso, tal como albúmina de suero o virus auxiliar permanecería unida.

La Figura 6 compara el grado de purificación a lo largo de las diversas etapas del proceso por SDS-PAGE. Se aplicaron muestras del proceso de una recogida de cultivo de producción representativa en un gel de poliacrilamida 10 % desnaturalizante/reductor y se tiñó con naranja Sypro. Todas las muestras post recogida se cargaron a 1x1010 DRP/carril. Las dos muestras corriente arriba antes de la etapa de concentración de TFF (etapa de clarificación inicial y flujo continuo de intercambio aniónico ("AEX")) solo pudieron cargarse a 1x109 DRP/carril debido a restricciones de volumen en el gel. Se cargó beta-galactosidasa (B-Gal) a 50 ng/carril para evaluar la sensibilidad y consistencia de la tinción a lo largo del gel. Las tres proteínas de cápsida de AAV-1 (VP1 , 2 y 3) se indican.

Ejemplo 13: porcentaje de recuperación de rAAV durante la purificación Los datos presentados en la Figura 7 muestran el porcentaje de recuperación de partículas de rAAV-1 infecciosas después de cada etapa de proceso del esquema de purificación de un cultivo de producción representativo de un vector de rAAV-1. El porcentaje de recuperación se calculó basándose en las DRP totales del vector de rAAV-1 recuperado de cada etapa del proceso dividido por el número total de DRP cargadas o sometidas a esa etapa de purificación. Los datos demuestran que en cada etapa en el proceso de purificación, se consiguieron recuperaciones de aproximadamente 60 % o más. En numerosos experimentos, el intervalo dé recuperación de cada etapa del proceso fue de al menos 60 % a 90 %. Es particularmente digno de atención que el intervalo de recuperación en la etapa de captura (es decir, la etapa de cromatografía de apatita) en experimentos individuales varió de 57 % a más de 90 %. Además, el intervalo de recuperación en la etapa de HIC varió del 60 % al 80 %.

Aunque la anterior invención se ha descrito en algún detalle como ilustración y ejemplo para fines de claridad y entendimiento, resulta evidente para los expertos en la materia que se realizarán ciertos cambios y modificaciones menores. Por lo tanto, la descripción y ejemplos no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas de proceso en un flujo de alimentación, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG), uniéndose las partículas de rAAV al medio de cromatografía de apatita; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita con un tampón de elución que contiene PEG menos de 3 % (p/v).

2. El método de la reivindicación 1 , en el que el medio de cromatografía de apatita es hidroxiapatita cerámica (CHT).

3. El método de la reivindicación 1 , en el que el medio de cromatografía de apatita es fluoroapatita cerámica (CFT).

4. El método de la reivindicación 1 , en el que la unión específica del medio de cromatografía de apatita con las partículas de rAAV está entre 1014 y 1016 partículas resistentes a DNasa por mililitro (DRP/ml).

5. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una etapa de unir las partículas de rAAV en el flujo de alimentación eluido del medio de cromatografía de apatita con un medio de cromatografía aniónica.

6. El método de la reivindicación 1 , en el que el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV en la etapa (a) se pone en contacto con un medio de cromatografía de apatita en presencia de polietilenglicol (PEG) y un tampón básico.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el tampón básico está entre pH 7,6 y 10.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el tampón básico está entre pH 8,0 y 10,0.

9. El método de la reivindicación 6, en el que el tampón básico está entre pH 9,0 y 10,0.

10. El método de la reivindicación 6, en el que el tampón básico comprende borato.

11. El método de la reivindicación 1 , en el que el PEG tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol.

12. El método de la reivindicación 11 , en el que el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol.

13. El método de la reivindicación 1 , en el que el flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV en la etapa (a) se pone en contacto con el medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG entre aproximadamente 3 % (p/v) y aproximadamente 10 % (p/v).

14. El método de la reivindicación 13, en el que el flujo de alimentación se pone en contacto con el medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 5 % (p/v).

15. El método de la reivindicación 13, en el que el flujo de alimentación se pone en contacto con el medio de cromatografía de apatita en presencia de PEG6000 aproximadamente 10 % (p/v).

16. El método de la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente una etapa de lavar el medio de cromatografía de apatita con un tampón de lavado después de haberse puesto en contacto el flujo de alimentación con el medio de cromatografía de apatita pero antes de eluir las partículas de rAAV del medio de cromatografía de apatita.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el medio de cromatografía de apatita se lava una o más veces con un tampón de lavado que contiene PEG aproximadamente 7,5 % (p/v) y/o un tampón de lavado que contiene PEG aproximadamente 5 % (p/v).

18. El método de la reivindicación 17, en el que el medio de cromatografía de apatita se lava adicionalmente con un tampón de lavado que contiene PEG menos de aproximadamente 3 % (p/v) y/o un tampón de lavado que no contiene PEG.

19. El método de la reivindicación 16, en el que el tampón de lavado comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCI.

20. El método de la reivindicación 16, en el que el tampón de lavado tiene un pH básico.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el tampón de lavado comprende borato a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 10,0.

22. El método de la reivindicación 21 , en el que el tampón de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente 8,0.

23. El método de la reivindicación 21 , en el que el tampón de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente 9,0.

24. El método de la reivindicación 21 , en el que el tampón de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente 10,0.

25. El método de la reivindicación 20, en el que el tampón de lavado comprende adicionalmente entre 100 y 500 mM de un fosfato.

26. El método de la reivindicación 20, en el que el tampón de lavado comprende adicionalmente NaCI entre 50 y 250 mM.

27. El método de la reivindicación 1, en el que las partículas de rAAV unidas al medio de cromatografía de apatita se eluyen con un tampón de elución que contiene bajas concentraciones de PEG o en ausencia de PEG.

28. El método de la reivindicación 27, en el que el tampón de elución comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en borato, ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) y Tris-HCI a pH neutro.

29. El método de la reivindicación 27, en el que el tampón de elución contiene PEG6000 menos de aproximadamente 3 % (p/v).

30. El método de la reivindicación 29, en el que el tampón de elución comprende fosfato menos de 100 mM.

31. El método de la reivindicación 30, en el que el tampón de elución comprende adicionalmente fosfato 50 mM.

32. El método de la reivindicación 31 , en el que el tampón de elución comprende adicionalmente NaCI entre 50 y 250 mM.

33. Un método para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas de proceso en un flujo de alimentación, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un flujo de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en un tampón de alta salinidad, en el que las partículas de rAAV y las impurezas, del proceso se unen al medio de HIC; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio de HIC con un tampón de salinidad media.

34. El método de la reivindicación 33, en el que el medio de HIC se selecciona del grupo que consiste en Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl y resina Tosoh Has(butyl).

35. El método de la reivindicación 33, en el que el tampón de alta salinidad comprende citrato entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 2,0 M.

36. El método de la reivindicación 35, en el que el tampón de alta salinidad comprende adicionalmente fosfato entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM.

37. El método de la reivindicación 33, en el que el tampón de salinidad media comprende citrato menos de 0,5 M.

38. El método de la reivindicación 37, en el que el tampón de salinidad media comprende adicionalmente fosfato entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM.

39. El método de la reivindicación 37, en el que el tampón de salinidad media comprende citrato de 0,2 M a 0,5 M.

40. El método de la reivindicación 39, en el que una población de partículas de rAAV con cápsidas vacías, cápsidas parcialmente desnaturalizadas, material de cápsida menos infeccioso y/o cápsidas parcialmente completas se unen al medio de HIC después de la elución con el tampón de salinidad media.

41. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 33, en el que las partículas de rAAV comprenden una proteína de cápsida de AAV de un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 , AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16.

42. El método de la reivindicación 41 , en el que las partículas de rAAV comprenden una proteína de cápsida de AAV de un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1 , AAV-4, AAV-5 y AAV-8.