[go: up one dir, main page]

RS62685B1 - Sklerostin vezujuća sredstva - Google Patents

Sklerostin vezujuća sredstva

Info

Publication number
RS62685B1
RS62685B1 RS20211488A RSP20211488A RS62685B1 RS 62685 B1 RS62685 B1 RS 62685B1 RS 20211488 A RS20211488 A RS 20211488A RS P20211488 A RSP20211488 A RS P20211488A RS 62685 B1 RS62685 B1 RS 62685B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sclerostin
antibody
seq
binding
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20211488A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher Paszty
Martyn Kim Robinson
Kevin Graham
Alistair James Henry
Kelly Sue Hoffman
John Latham
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36992590&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62685(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma Sa, Amgen Inc filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of RS62685B1 publication Critical patent/RS62685B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na epitope humanog proteina sklerostina i vezujuća sredstva (kao što su antitela) koja su u stanju da se vezuju za sklerostin ili njegove fragmente.
STANJE TEHNIKE
Dve ili tri različite faze promena koštane mase dešavaju se tokom života pojedinca (vidi Riggs, West J. Med. 154:63-77 (1991)). Prva faza se dešava i kod muškaraca i kod žena i nastavlja se do dostizanja pika koštane mase. Ova prva faza se postiže posredstvom linearnog rasta endohondralnih ploča rasta i radijalnog rasta zbog obima periostalnog dodavanja. Druga faza započinje oko 30. godine za trabekularnu kost (pljosnate kosti, kao što su pršljenovi i karlica) i oko 40. godine za kortikalnu kost (npr., duge kosti koje se nalaze u ekstremitetima) i nastavlja se do starosti. Za ovu fazu je karakterističan spori gubitak kosti, a dešava se i kod muškaraca i kod žena. Kod žena, odvija se, takođe, i treća faza gubitka kosti, najverovatnije zbog deficijencija estrogena u postmenopauzi. Tokom samo ove faze, žene mogu izgubiti dodatnu koštanu masu iz kortikalne kosti i iz trabekularnog dela (vidi Riggs, supra).
Gubitak mineralnog sadržaja kosti može biti izazvan brojnim stanjima, a za posledicu može imati značajne medicinske probleme. Na primer, osteoporoza je, kod ljudi, bolest propadanja, karakterisana značajnim smanjenjem koštane mase i mineralne gustine skeleta, narušavanjem strukture kosti, uključujući degradaciju koštane mikroarhitekture i odgovarajuće povećanje koštane fragilnosti (t.j., smanjenje jačine kosti) i podložnost frakturi kod obolelih pojedinaca. Osteoporozi kod ljudi uopšteno prethodi klinička osteopenija (mineralna gustina kosti koja je više od jedne standardne devijacije, ali manje od 2.5 standardne devijacije, ispod srednje vrednosti za kost mladog adulta), stanje koje se nalazi kod približno 25 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. Ostalih 7-8 miliona pacijenata u Sjedinjenim Državama ima dijagnozu kliničke osteoporoze (definiše se kao mineralni sadržaj kosti koji je više od 2.5 standardne devijacije ispod mineralnog sadržaja kosti mladog zrelog adulta). Učestalost osteoporoze u ljudskoj populaciji raste sa godinama. Među kavkaskom populacijom, osteoporoza preovlađuje kod žena, koje, u Sjedinjenim Državama, čine 80% svih pacijenata sa osteoporozom. Povećana fragilnost i podložnost frakturi skeletne kosti kod starijih otežava se povećanim rizikom od slučajnih padova u ovoj populaciji. Prelomi kuka, članaka i pršljenova su među najčešćim povredama povezanim sa osteoporozom. Posebno su frakture kuka izuzetno neprijatne i skupe za pacijenta, a kod žena su povezane sa visokim stepenima mortaliteta i morbiditeta.
Iako se osteoporoza posmatra kao povećanje rizika od frakture zbog smanjene koštane mase, nekoliko trenutno raspoloživih tretmana za koštane poremećaje može povećati gustinu kosti kod odraslih, a najveći broj trenutno raspoloživih tretmana deluje prevashodno posredstvom sprečavanja dalje resorpcije kosti pre nego posredstvom stimulacije formiranja nove kosti. Za usporavanje gubitka kosti danas se prepisuje estrogen. Međutim, postoje neke kontroverze u vezi s tim da li su pacijenti na bilo kakvom dugotrajnom dobitku i da li estrogen ima bilo kakvog efekta kod pacijenata starijih od 75 godina. Pored toga, smatra se da upotreba estrogena povećava rizik od raka dojke i endometrijuma. Kalcitonin, osteokalcin sa vitaminom K, ili visoke doze kalcijuma iz hrane, sa ili bez vitamina D, takođe se preporučuju ženama u postmenopauzi. Visoke doze kalcijuma, međutim, često imaju neželjene sporedne efekte na gastrointetstinalni trakt, a koncentracije kalcijuma u serumu i urinu moraju se stalno pratiti (npr., Khosla i Riggs, Mayo Clin. Proc.70:978982, 1995).
Ostali trenutno raspoloživi terapeutski pristupi osteoporozi uključuju: bisfosfonate (npr., Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronat, neridronat, skelid, bonefos), paratiroidni hormon, kalcilitike, kalcimimetike (npr., cinakalcet), statine, anaboličke steroide, soli lantana i stroncijuma i natrijum fluorid. Takva terapeutska sredstva su, međutim, često povezana sa neželjenim sporednim efektima (vidi Khosla i Riggs, supra).
Sklerostin, proizvod SOST gena, je odsutan u sklerosteozi, bolesti skeleta, koja je karakterisana preteranim rastom kosti i kostima jake gustine (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68:577-589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10:537-543, 2001). Aminokiselinsku sekvencu humanog sklerostina prikazali su Brunkow et al. ibid a ovde je izložena kao SEQ ID NO:1.
WO 2005/014650 opisuje antitela specifična za sklerostin i postupke koji povećavaju mineralizaciju kosti, i WO 2005/003158 opisuje kompozicije i postupke za povećanje mineralizacije kostiju.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
Ovde su prikazane smeše i postupci koje se mogu koristiti za povećanje najmanje jednog od sledećih parametara: formiranje kosti, mineralna gustina kosti, mineralni sadržaj kosti, koštana masa, kvalitet kosti i jačina kostiju, te, sledstveno tome, mogu biti korišćeni za lečenje raznovrsnih stanja kod kojih je poželjno povećanje najmanje jednog od sledećih: formiranje kosti, mineralna gustina kosti, mineralni sadržaj kosti, koštana masa, kvalitet kosti i jačina kostiju. Ovaj pronalazak nudi, takođe, druge, s tim povezane prednosti, koje su ovde opisane. Pronalazak je definisan priloženim zahtevima.
Pronalazak se odnosi na regione (epitope) humanog sklerostina koje prepoznaju ovde izložena vezujuća sredstva, na postupke korišćenja ovih epitopa i postupke proizvodnje takvih epitopa.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na epitope koji su specifični za region sklerostina identifikovan kao Petlja 2, kao i na vezujuća sredstva koja se specifično vezuju za taj region.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na epitope koji su specifični za region cistinskog čvora sklerostina, kao i na vezujuća sredstva kao što su antitela koja se specifično vezuju za taj region.
Izlaganje se odnosi na vezujuća sredstva kao što su antitela koja se specifično vezuju za sklerostin. Vezujuća sredstva se mogu okarakterisati prema svojoj sposobnosti da unakrsno blokiraju vezivanje najmanje jednog, ovde opisanog antitela, za sklerostin i/ili da njihovo vezivanje za sklerostin bude unakrsno blokirano od strane najmanje jednog, ovde izloženog, antitela. Antitela i druga vezujuća sredstva se, takođe, mogu okarakterisati prema njihovom obrascu vezivanja za peptide humanog sklerostina u "kompetitivnom testu vezivanja za epitop peptida humanog sklerostina", kako je ovde prikazan.
Izlaganje se odnosi na vezujuća sredstva, kao što su antitela, koja mogu povećati najmanje jedno od sledećih: formiranje kosti, mineralnu gustinu kosti, mineralni sadržaj kosti, koštanu masu, kvalitet kost i jačinu kosti kod sisara.
Izlaganje se odnosi na vezujuća sredstva, kao što su antitela, koja mogu blokirati inhibitorni efekat sklerostina u testu mineralizacije na ćelijskoj bazi.
Izlaganje se dalje odnosi na polipeptidne konstrukcije koje sadrže dva, tri ili četiri polipeptidna fragmenta povezana najmanje jednim disulfidnim mostom, predstavljajući region jezgra cistinskog čvora sklerostina i, na antitela koja se mogu specifično vezati za njega.
Izlaganje se odnosi na postupke dobijanja epitopa pogodnih za korišćenje kao imunogena za stvaranje, kod sisara, vezujućih sredstava, kao što su antitela, a koja se mogu specifično vezati za sklerostin; u nekim aspektima generisana vezujuća sredstva mogu neutralisati aktivnost sklerostina in vivo.
Izlaganje se odnosi na smešu za izlaganje antitela specifičnog za sklerostin kada se smeša primeni životinji, smeša sadrži polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68 ili SEQ ID NO:69.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na smešu za izlaganje antitela specifičnog za sklerostin kada se smeša primeni životinji, smeša sadrži najmanje jedan polipeptid koji se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:5; smeša može sadržavati najmanje dve ili najmanje tri aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5 i, smeša može sadržavati sve četiri aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5.
Izlaganje se dalje odnosi na smešu za izlaganje antitela specifičnog za sklerostin kada se smeša primeni životinji, smeša sadrži polipeptid koji ima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5, pri čemu su SEQ ID NO:2 i 4 spojene disulfidnom vezom na aminokiselinskim položajima 57 i 111 kao u SEQ ID NO:1 i, SEQ ID NO:3 i 5 su spojene sa najmanje jednim od (a) disulfidnim mostom na aminokiselinskim položajima 82 i 142 kao u SEQ ID NO:1 i (b) disulfidnim mostom na aminokiselinskim položajima 86 i 144 kao u SEQ
ID NO:1; polipeptid može zadržati tercijernu strukturu odgovarajućeg polipeptidnog regiona humanog sklerostina u SEQ ID NO:1.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na polipeptid T20.6 koji se suštinski sastoji od višestruko skraćenog proteina humanog sklerostina koji ima sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu amino kiselina 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 i 150-190 u SEQ ID NO:1 nema u polipeptidu; ovaj polipeptid se može dobiti triptičnom digestijom humanog sklerostina, a protein se može izolovati putem HPLC frakcionisanja.
Izlaganje se dalje odnosi na imunogeni deo T20.6 humanog sklerostina, koji sadrži amino kiseline 51-64, 73-90, 101-117 i 138-149 iz SEQ ID NO:1, pri čemu imunogeni deo sadrži najmanje jedno od:
(a) disulfidnu vezu između amino kiselina 57 i 111;
(b) disulfidnu vezu između amino kiselina 82 i 142; i
(c) disulfidnu vezu između amino kiselina 86 i 144;
imunogeni deo može imati najmanje dve od ovih disulfidnih veza; imunogeni deo može imati sve tri disulfidne veze.
Izlaganje se dalje odnosi na imunogeni deo T20.6 koji je izveden iz humanog sklerostina, koji sadrži amino kiseline 57-64, 73-86, 111-117 i 138-144 iz SEQ ID NO:1, pri čemu imunogeni deo sadrži najmanje jedno od:
(a) disulfidnu vezu između amino kiselina 57 i 111;
(b) disulfidnu vezu između amino kiselina 82 i 142; i
(c) disulfidnu vezu između amino kiselina 86 i 144;
imunogeni deo može imati najmanje dve od ovih disulfidnih veza; imunogeni deo može imati sve tri disulfidne veze.
Izlaganje se opet dalje odnosi na polipeptid koji se suštinski sastoji od proteina humanog sklerostina sa SEQ ID NO:1 koji je skraćen na C-terminalnom i N- terminalnom kraju, pri čemu iz polipeptida izostaju amino kiseline 1-85 i 112-190 u SEQ ID NO:1.
Izlaganje se, takođe, odnosi na imunogenični deo humanog sklerostina, koji sadrži aminokiseline 86-111 SEQ ID NO:1; imunogenični deo može biti u suštini sastavljen od susednih aminokiselina CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:6).
Izlaganje se, dalje, odnosi na imunogenični deo sklerostina pacova, koji sadrži aminokiseline 92-109 SEQ ID NO:98; imunogenični deo može biti u suštini sastavljen od susednih aminokiselina PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:96).
Izlaganje se, u nastavku, odnosi na imunogenični deo sklerostina pacova, koji sadrži aminokiseline 99-120 SEQ ID NO:98; imunogenični deo može biti suštinski sastavljen od susednih aminokiselina KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97).
Izlaganje se odnosi na postupak proizvodnje imunogenog dela humanog sklerostina, koji obuhvata sledeće korake:
(a) obradu humanog sklerostina da bi se postigla potpuna triptična digestija;
(b) sakupljanje uzoraka triptične digestije koji imaju srednju molekulsku težinu od 7,122.0 Daltona (teoretska masa je 7121.5 Daltona) ili retenciono vreme od otprilike 20.6 minuta određeno eluacijom sa reverzno-fazne HPLC kolone sa linearnim gradijentom od 0.05% trifluorosirćetne kiseline do 90% acetonitrila u 0.05% TFA pri brzini protoka od 0.2ml/min; i
(c) prečišćavanje iunogenog dela.
Izlaganje se odnosi na postupak stvaranja antitela koje može da se specifično veže za sklerostin, koji obuhvata:
(a) imunizaciju životinje sa smešom koja sadrži polipeptid sa SEQ ID NO:6, SEQ
ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ
ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:96, ili SEQ ID NO:97;
(b) sakupljanje seruma od životinje; i
(c) izolovanje antitela iz seruma koje može specifično da se veže za sklerostin.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na postupak stvaranja antitela koje može da se specifično veže za sklerostin, a postupak obuhvata:
(a) imunizaciju životinje sa smešom koja sadrži polipeptid T20.6 ili derivat T20.6; (b) sakupljanje seruma od životinje; i
(c) izolovanje antitela iz seruma koje može specifično da se veže za sklerostin.
Izlaganje se dalje odnosi na postupak detekcije anti-sklerostin antitela u biološkom uzorku, koji obuhvata sledeće korake:
(a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa polipeptidom koji se suštinski sastoji od SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:96, ili SEQ ID NO:97 u uslovima koji omogućavaju da se formira kompleks između antitela i polipeptida; i
(b) detektovanje prisustva ili nepostojanja kompleksa, pri čemu prisustvo kompleksa ukazuje na to da biološki uzorak sadrži anti-sklerostin antitelo.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na postupak detekcije anti-sklerostin antitela u biološkom uzorku, koji obuhvata sledeće korake:
(a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa polipeptidom T20.6 ili derivatom T20.6 u uslovima koji omogućavaju da se formira kompleks između antitela i polipeptida; i
(b) detektovanje prisustva ili nepostojanja kompleksa, pri čemu prisustvo kompleksa ukazuje na to da biološki uzorak sadrži anti-sklerostin antitelo.
Izlaganje se dalje odnosi na sklerostin vezujuće sredstvo, kao što je antitelo, koje unakrsno blokira vezivanje najmanje jednog od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-C, ili Ab-D za protein sklerostina. Sklerostin vezujuće sredstvo može, isto tako,biti unakrsno blokirano da se veže za sklerostin najmanje sa jednim od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-C, ili Ab-D. Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himeričko antitelo i slično.
Izlaganje se dalje odnosi na sklerostin vezujuće sredstvo, kao što je antitelo, koje je unakrsno blokirano u vezivanju za sklerostin najmanje sa jednim od antitela Ab- A, Ab-B, Ab-C, ili Ab-D. Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himeričko antitelo i slično.
Izlaganje se, dalje, odnosi na sklerostin vezujuće sredstvo, kao što je izolovano antitelo koje unakrsno blokira vezivanje najmanje jednog antitela 1-24 (Ab-1 do Ab-24) za protein sklerostina. Sklerostin vezujućem sredstvu može, isto tako, biti unakrsno blokirano vezivanje za sklerostin pomoću barem jednog od antitela 1-24 (Ab-1 do Ab-24). Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo ili himerično antitelo.
Izlaganje se, pored navedenog, odnosi na sklerostin vezujuće sredstvo, kao što je izolovano antitelo, čije je vezivanje za sklerostin unakrsno blokirano od strane najmanje jednog od antitela 1-24 (Ab-1 do Ab-24); izolovano antitelo, ili njegov antigen- vezujući fragment, može biti poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo ili himerično antitelo.
Izlaganje se, dalje, odnosi na vezujuće sredstvo, kao što je izolovano antitelo, koje pokazuje obrazac vezivanja za peptide humanog sklerostina u "kompetitivnom testu vezivanja za peptidni epitop humanog sklerostina" koji je sličan onom koji pokazuje najmanje jedno od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-C ili Ab-D; izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo ili himerično antitelo.
Izlaganje se dalje odnosi na postupak lečenja koštanog poremećaja, povezanog sa najmanje jednim od sledećih stanja: slabo formiranje kosti, slaba mineralna gustina kosti, slab mineralni sadržaj kosti, mala koštana masa, slab kvalitet kosti i slaba jačina kostiju kod ispitanika sisara, koji se sastoji od davanja ispitaniku kome je takav tretman potreban one količine anti-sklerostin vezujućeg sredstva koja je dovoljna za povećanje barem jednog od sledećih: formiranje kosti, mineralna gustina kosti, mineralni sadržaj kosti, koštana masa, kvalitet kosti i jačina kosti, pri čemu anti-sklerostin vezujuće sredstvo obuhvata antitelo ili njegov sklerostin-vezujući fragment.
Izlaganje se, isto tako odnosi na izolovani polipeptid sklerostina ili njegovih fragmenata, pri čemu polipeptid sadrži 6 konzervisanih cisteinskih ostataka i njegovi fragmenti sadrže od 7 do 14 amino kiselina iz SEQ ID NO:2; 8 do 17 amino kiselina iz SEQ ID NO:3; 8 do 18 ostataka iz SEQ ID NO:4; i 6 do 12 ostataka iz SEQ ID NO:5, i, polipeptid i njegovi fragmenti su stabilizovani disulfidnim vezama između SEQ ID NO:2 i 4 i, između SEQ ID NO:3 i 5; polipeptid ili fragmenti mogu sadržavati 10-14 amino kiselina iz SEQ ID NO:2; 14 do 17 amino kiselina iz SEQ ID NO:3; 13 do 18 amino kiselina iz SEQ ID NO:4; i 8 do 12 ostataka iz SEQ ID NO:5; i polipeptid ili fragmenti mogu sadržavati SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, i SEQ ID NO:5.
Ovde su obezbeđena antitela koja se specifično vezuju za humani sklerostin. Antitela se karakteriču svojom sposobnosti da unakrsno blokiraju vezivanje najmanje jednog antitela, koje je ovde izloženo, za humani sklerostin i/ili da im vezivanje za humani sklerostin bude unakrsno blokirano od strane najmanje jednog antitela, koje je ovde izloženo.
Obezbeđeno je, takođe, izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji može povećati najmanje jedno od sledećih: formiranje kosti, mineralna gustina kosti, mineralni sadržaj kosti, koštana masa, kvalitet kosti i jačina kosti kod sisara.
Takođe je obezbeđeno izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji može blokirati inhibitorno dejstvo sklerostina u testu mineralizacije na ćelijskoj bazi.
Isto tako je obezbeđeno vezujuće sredstvo, kao što je antitelo, koje se specifično vezuje za humani sklerostin i ima najmanje jednu CDR sekvencu, koja je odabrana od SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 i 360, i njihovih varijanti, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment neutrališe sklerostin.
Takođe je obezbeđeno vezujuće sredstvo, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani sklerostin i ima najmanje jednu CDR sekvencu, koja je odabrana od: SEQ ID NO:39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 i 360, i njihovih varijanti.
Obezbeđeni su, takođe, regioni humanog sklerostina, koji su od značaja za in vivo aktivnost proteina.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje aminokiselinske sekvence zrelog oblika (otcepljeni signalni peptidi) lakog lanca (Slika 1A) (SEQ ID NO:23) i teškog lanca (Slika 1B) (SEQ ID NO:27) antitela At-A protiv humanog sklerostina i protiv mišjeg sklerostina.
Slika 2 prikazuje aminokiselinske sekvence zrelog oblika (otcepljeni signalni peptidi) lakog lanca (Slika 2A) (SEQ ID NO:31) i teškog lanca (Slika 2B) (SEQ ID NO:35) antitela At-B protiv humanog sklerostina i protiv mišjeg sklerostina.
Slika 3 prikazuje aminokiselinske sekvence zrelog oblika (otcepljeni signalni peptidi) lakog lanca (Slika 3A) (SEQ ID NO:15) i teškog lanca (Slika 3B) (SEQ ID NO:19) antitela At-C protiv humanog sklerostina i protiv mišjeg sklerostina.
Slika 4 prikazuje aminokiselinske sekvence zrelog oblika (otcepljeni signalni peptidi) lakog lanca (Slika 4A) (SEQ ID NO:7) i teškog lanca (Slika 4B) (SEQ ID NO:11) antitela At-D protiv humanog sklerostina i protiv mišjeg sklerostina.
Slika 5 prikazuje mineralnu gustinu kosti kod miševa, merenu na dva skeletna položaja (lumbalni pršljenovi i metafiza tibije) nakon 3 nedelje tretmana sa vehikulumom, PTH (1-34), At-A ili At-B.
Slika 6 prikazuje mineralnu gustinu kosti kod miševa, merenu na dva skeletna položaja (lumbalni pršljenovi i metafiza tibije), nakon 2 nedelje tretmana sa vehikulumom, PTH (1-34) ili At-C.
Slika 7 prikazuje mineralnu gustinu kosti kod miševa, merenu na dva skeletna položaja (lumbalni pršljenovi i metafiza tibije) nakon 3 nedelje tretmana sa vehikulumom ili At-D.
Slika 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog oblika (otcepljen signalni peptid) humanog sklerostina (SEQ ID NO:1). Takođe je opisana nukleotidna sekvenca kodirajućeg regiona humanog sklerostina, koja kodira zrelu formu humanog sklerostina. Osam cisteina je brojčano označeno sa C1 do C8. Cistinski čvor je obrazovan od tri disulfidne veze (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 i C6, takođe, obrazuju disufidnu vezu, međutim ovaj disulfid nije deo cistinskog čvora.
Slika 9 prikazuje šemu bazične strukture humanog sklerostina Postoji N-terminalni krak (od prvog Q do C1) i C-terminalni krak (od C8 do terminalnog Y). Između ovih krakova se nalazi struktura cistinskog čvora (koju obrazuju tri disulfida: C1- C5; C3-C7; C4-C8) i tri petlje koje su označene kao Petlja 1, Petlja 2 i Petlja 3. Distalni regioni Petlje 1 i Petlje 3 su povezani sa C2-C6 disulfidom. Potencijalni položaji otcepljivanja tripsinom su označeni (arginin=R i lizin=K). Neki od mogućih položaja cepanja pomoću AspN su označeni (prikazani su samo ostaci asparaginske kiseline (D)).
Slika 10 prikazuje HPLC peptidne mape humanog sklerostina nakon digestije ili sa tripsinom ili sa AspN. Peptidi humanog sklerostina, koji su proizvedeni tripsinskom digestijom, su označeni (T19.2, T20, T20.6 i T21-22) kao što su i peptidi humanog sklerostina, koji su proizvedeni digestijom pomoću AspN (AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5).
Slika 11 prikazuje podatke za sekvencu i masu disulfidom povezanih peptida izolovanog humanog sklerostina, koji su proizvedeni digestijom tripsinom. Seq. pos. = položaj sekvence. Obs. = zapaženo. Zapažena masa je utvrđena pomoću ESI-LC-MS analize.
Slika 12 prikazuje podatke za sekvencu i masu peptida izolovanog humanog sklerostina, koji su proizvedeni digestijom pomoću AspN. AspN22.7-23.5 peptid sadrži 4 disulfidne veze. Seq. pos. = položaj sekvence. Obs. = zapaženo. Zapažena masa je utvrđena uz pomoć ESI-LC-MS analize.
Slika 13 pruža linearni šematski prikaz četiri peptida humanog sklerostina (T19.2, T20, T20.6 i T21-22), koji su proizvedeni digestijom tripsinom.
Slika 14 pruža linearni šematski prikaz pet peptida humanog sklerostina (AspN14.6, AspN 18.6 i AspN22.7-23.5), koji su proizvedeni digestijom pomoću AspN. HPLC pik za AspN14.6 je sastavljen od tri peptida koji nisu povezani bilo kakvim disulfidnim vezama.
Slika 15 prikazuje signal rezonantne jedinice (Ru) iz "kompetitivnog testa vezivanja za epitop peptida humanog sklerostina" na Biacore-bazi. Utvrđeno je relativno vezivanje Mat za razne peptide humanog sklerostina (u rastvoru) u odnosu na vezivanje Mat za intaktni zreli oblik humanog sklerostina (imobilisan na Biacore čipu). Prikazani su podaci za At-A. Korišćeni su peptidi humanog sklerostina: T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5.
Slika 16 prikazuje signal rezonantne jedinice (Ru) iz "kompetitivnog testa vezivanja za epitop peptida humanog sklerostina" na Biacore-bazi. Utvrđeno je relativno vezivanje Mat za razne peptide humanog sklerostina (u rastvoru) u odnosu na vezivanje Mat za intaktni zreli oblik humanog sklerostina (imobilisan na Biacore čipu). Prikazani su podaci za At-B. Korišćeni su peptidi humanog sklerostina: T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5.
Slika 17 prikazuje signal rezonantne jedinice (Ru) iz "testa kompeticije vezivanja za epitop peptida humanog sklerostina" na Biacore-bazi. Utvrđeno je relativno vezivanje Mat za razne peptide humanog sklerostina (u rastvoru) u odnosu na vezivanje Mat za intaktni zreli oblik humanog sklerostina (imobilisan na Biacore čipu). Prikazani su podaci za At-C. Korišćeni su peptidi humanog sklerostina: T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5.
Slika 18 prikazuje signal rezonantne jedinice (Ru) iz "testa kompeticije vezivanja za epitop peptida humanog sklerostina" na Biacore-bazi. Utvrđeno je relativno vezivanje Mat za razne peptide humanog sklerostina (u rastvoru) u odnosu na vezivanje Mat za intaktni zreli oblik humanog sklerostina (imobilisan na Biacore čipu). Prikazani su podaci za At-D. Korišćeni su peptidi humanog sklerostina: T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5.
Slika 19 prikazuje dva Mat vezujuća epitopa humanog sklerostina. Slika 19A prikazuje sekvencu Petlja 2 epitopa za vezivanje At-A i At-B za humani sklerostin (SEQ ID NO:6). Slika 19B prikazuje sekvencu, disulfidno povezivanje i šemu epitopa T20.6 za vezivanje At-C i At-D za humani sklerostin (SEQ ID NO:2-5).
Slika 20 prikazuje HPLC mape peptida humanog sklerostina nakon digestije sa tripsinom. Slika 20A prikazuje digestiju kompleksa At-D humani sklerostin. Slika 20B prikazuje digestiju samog humanog sklerostina. Označeni su pikovi peptida: T19.2, T20, T20.6 i T21-22.
Slika 21 prikazuje sekvencu, disulfidno povezivanje i šemu epitopa "T20.6 derivat 1 (cistinski čvor 4 kraka)" za vezivanje At-D za humani sklerostin. (SEQ ID NO:70-73).
Slika 22 prikazuje rezultate testa mineralizacije ćelijske linije osteoblasta MC3T3-E1-BF, koji je korišćen za identifikaciju neutrališućih anti-sklerostin Mat. Korišćen je mišji sklerostin (Scl) u dozi od 1 ∞g/ml. Monoklonska antitela su korišćena u dozi od 10 i 5 ∞g/ml. Stepen mineralizacije (razne vrste nerastvorljivog kalcijum fosfata) je kvantitativno određen merenjem kalcijuma.
Slika 23 prikazuje rezultate testa mineralizacije ćelijske linije osteoblasta MC3T3-E1-BF, koji je korišćen za identifikaciju neutrališućih anti-sklerostin Mat. Korišćen je humani sklerostin (Scl) u dozi od 1 ∞g/ml. Monoklonska antitela su korišćena u dozi od 8 i 4 mg/ml. Stepen mineralizacije (razne vrste nerastvorljivog kalcijum fosfata) je kvantitativno određen merenjem kalcijuma.
Slika 24 prikazuje rezultate testa mineralizacije ćelijske linije osteoblasta MC3T3-E1-BF, koji je korišćen za identifikaciju neutrališućih anti-sklerostin Mat.
Korišćen je humani sklerostin (Scl) u dozi od 1 ∞g/ml. Monoklonska antitela su korišćena u dozi od 10 ∞g/ml. Stepen mineralizacije (razne vrste nerastvorljivog kalcijum fosfata) je kvantitativno određen merenjem kalcijuma.
Slika 25 prikazuje rezultate na SCID mišjem modelu inflamacijom indukovanog gubitka kosti. Tretman sa At-A je štitio miševe od gubitka kosti povezanog sa inflamacijom, a koji je u vezi sa kolitisom, kada se meri kao ukupna mineralna gustina kosti (Slika 25A), koštana gustina pršljenova (Slika 25B) i gustina kosti femura (Slika 25C).
DETALJAN OPIS
Tekuće izlaganje se odnosi na regione proteina humanog sklerostina, koji sadrže epitope, koje prepoznaju antitela, koja se, takođe, vezuju za sklerostin pune dužine, i na postupke izrade i korišćenja takvih epitopa. Izlaganje, isto tako, obezbeđuje vezujuća sredstva (kao što su antitela) koja se specifično vezuju za sklerostin ili delove sklerostina, i na postupke za upotrebu takvih antitela. Vezujuća sredstva su od koristi za blokiranje ili narušavanje vezivanja humanog sklerostina za jedan ili više liganada.
Rekombinantni humani sklerostin/SOST je komercijalno raspoloživ posredstvom R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1406-ST-025). Dodatno, rekombinantni mišji sklerostin/SOST je komercijalno dostupan posredstvom R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1589-ST-025). Sklerostin vezujuća monoklonska antitela istraživačkog stepena su komercijalno dostupna posredstvom R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; mišja monoklonska antitela: 2006 kat# MAB1406; pacovska monoklonska antitela: 2006 kat# MAB1589). U.S. Patenti Broj 6,395,511 i 6,803,453, i U.S. Patentne publikacije 20040009535 i 20050106683 se uopšteno odnose na anti-sklerostinska antitela.
Kako je ovde korišćen, izraz humani sklerostin treba da obuhvati protein SEQ ID NO:1 i njegove alelske varijante. Sklerostin se može prečistititi iz 293T domaćinskih ćelija, koje su transfektovane od strane gena koji kodira sklerostin, putem eluacije filtriranog supernatanta tečne kulture ćelija domaćina, koristeći Heparin HP kolonu, uz upotrebu gradijenta soli. Izrada i dalje prečišćavanje uz korišćenje katjon izmenjivačke hromatografije opisani su u Primerima 1 i 2.
Vezujuća sredstva su poželjno antitela, kako su ovde definisana. Izraz "antitelo" se odnosi na intaktno antitelo, ili njegov vezujući fragment. Antitelo može uključivati potpuni molekul antitela (uključujući poliklonsko, monoklonsko, himerično, humanizovano antitelo, ili humane verzije, koje poseduju teške i/ili lake lanace pune dužine), ili obuhvata njegov antigen vezujući fragment. Fragmenti antitela obuhvataju: F(ab’)2, Fab, Fab’, Fv, Fc i Fd fragmente, a mogu biti ugrađeni u antitela s jednim domenom, jednolančana antitela, maksitela, minitela, intratela, diatela, triatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (Vidi npr., Hollinger i Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Polipeptidi antitela su, takođe, prikazani u U. S. Patentu No.6,703,199, uključujući fibronektin polipeptidna monotela. Drugi polipeptidi antitela koji su izloženi u U.S. Patentnoj publikaciji 2005/0238646, su jedno-lančani polipeptidi.
Antigen vezujući fragmenti, dobijeni iz antitela, mogu se proizvesti, primera radi, proteolitičkom hidrolizom antitela, na primer, digestijom celih antitela pomoću pepsina ili papaina, prema konvencionalnim postupcima. Primera radi, fragmenti antitela mogu se proizvesti enzimskim cepanjem antitela sa pepsinom, kako bi se dobio 5S fragment, nazvan F(ab’)2. Ovaj fragment se može, dalje cepati upotrebom tiolskog reduktivnog sredstva, kako bi se proizveli 3.5S Fab’ monovalentni fragmenti. Opciono, reakcija cepanja se može izvesti korišćenjem grupe za blokiranje sulfhidrilne grupe, koja proističe iz cepanja disulfidnih veza. Kao alternativa, enzimsko cepanje uz korišćenje papaina direktno proizvodi dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment. Ove postupke su opisali, primera radi, Goldenberg, U.S. Patent No.4,331,647, Nisonoff i saradnici, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J.73:119, 1959; Edelman i saradnici, u Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) i Andrews,
S.M. i Titus, J.A. u Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., i saradnici, eds), John Wiley & Sons, New York (2003), strane 2.8.1-2.8.10 i 2.10A. 1-2.10A.5. Takođe se mogu koristiti drugi postupci za cepanje antitela, kao što je razdvajanje teških lanaca, da bi se obrazovali monovalentni fragmenti lakog-teškog lanca (Fd), dalje cepanje fragmenata, ili druge enzimske, hemijske ili genetske tehnike, sve dotle dok se fragmenti vezuju za antigen, koji se prepoznaje od strane intaktnog antitela.
Fragment antitela može, isto tako, biti bilo koji sintetski ili genetski konstruisan protein. Na primer, fragmenti antitela obuhvataju izolovane fragmente, koji su sastavljeni od varijabilnog regiona lakog lanca, "Fv" fragmente, koji su sačinjeni od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, molekule rekombinantnog jednolančanog polipeptida, u kojima su varijabilni regioni lakih i teških lanaca povezani peptidnom spojnicom (scFv proteini).
Drugi oblik fragmenta antitela jeste peptid koji sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR-i) antitela. CDR-i (koji se, takođe, nazivaju "minimalnim jedinicama prepoznavanja" ili "hipervariabilnim regionom") mogu biti dobijeni konstruisanjem polinukleotida, koji kodiraju CDR od značaja. Takvi polinukleotidi se izrađuju, na primer, korišćenjem polimeraza lančane reakcije, da bi se sintetisao varijabilni region, koristeći mRNK ćelija koje proizvode antitela kao šablon (vidi, primera radi, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," u Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), strana 166 (Cambridge University Press 1995) i Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," u Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), strana 137 (Wiley-Liss, Inc.1995)).
Tako, vezujuće sredstvo može obuhvatiti najmanje jedan CDR, kako su ovde opisani. Vezujuće sredstvo može sadržavati najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR'a, kako su ovde opisani. Vezujuće sredstvo dalje može sadržavati najmanje jedan domen varijabilnog regiona antitela, kako je ovde opisano. Domen varijabilnog regiona može biti bilo koje veličine ili sastava amino kiselina i generalno će obuhvatiti najmanje jednu CDR sekvencu odgovornu za vezivanje za humani sklerostin, na primer, CDR-H1, CDR- H2, CDR-H3 i/ili laki lanac CDRa koji je specifično ovde opisan i koji je susedni ili je u okviru sa jednom ili više sekvenci okvira. U opštim crtama, domen varijabilnog (V) regiona može biti ma koji pogodan aranžman imunoglobulinskih varijabilnih domena tečkog (VH) i/ili lakog (VL) lanca. Tako na primer, domen V regiona može biti monomeran i biti VH ili VL domen, koji može nezavisno vezati humani sklerostin sa afinitetom koji je najmanje jednak 1x10<-7>M ili manjim, kako je ovde opisano. Alternativno, domen V regiona može biti dimeran i sadržavati VH-VH, VH-VLili VL-VL
dimere. Dimer V regiona sadrži najmanje jedan VHi najmanje jedan VLlanac, koji mogu biti nekovalentno povezani (ovde u nastavku označeni kao FV). Ukoliko se to želi, lanci mogu biti kovalentno kuplovani ili direktno, na primer preko disulfidne veze između dva varijabilna domena, ili preko spojnice, na primer, peptidne spojnice, da bi se obrazovao jednolančani Fv (scFV).
Domen varijabilnog regiona može biti svaki varijabilni domen koji postoji u prirodi ili njegova konstruisana verzija. Pod konstruisanom verzijom se misli na domen varijabilnog regiona, koji se izgrađuje korišćenjem tehnika rekombinantnog DNK inženjeringa. Takve konstruisane verzije uključuju one koje su konstruisane iz, primera radi, varijabilnog regiona specifičnog antitela, putem umetanja, delecija ili promena u ili na aminokiselinskim sekvencama specifičnog antitela. Posebni primeri uključuju konstruisane domene varijabilnog regiona koji sadrže najmanje jedan CDR i, opciono, jednu ili više okvirnih aminokiselina iz prvog antitela, a preostali deo domena varijabilnog regiona iz drugog antitela.
Domen varijabilnog regiona može biti kovalentno povezan na C-terminalnu aminokiselinu domena najmanje jednog drugog antitela ili njegovog fragmenta. Tako, primera radi, VH domen koji je prisutan u domenu varijabilnog regiona može biti vezan za CH1 domen imunoglobulina ili njegov fragment. Na sličan način VLdomen može biti vezan za CKdomen ili njegov fragment. Na ovaj način, na primer, antitelo može biti Fab fragment, u kome antigen vezujući domen sadrži udružene VHi VLdomene, koji su kovalentno povezani na svojim C-krajevima za CH1, odnosno CKdomen. CH1 domen može biti produžen drugim aminokiselinama, primera radi, kako bi se dobio zglobni region ili deo domena zglobnog regiona, kakav se nalazi u Fab’ fragmentu, ili kako bi se obezbedili drugi domeni, kao što su CH2 i CH3 domeni antitela.
Kako je ovde opisano, vezujuća sredstva sadrže najmanje jedan od ovih CDRa. Na primer, jedan ili više CDR-a mogu biti ugrađeni u okvirne regione poznatog antitela (IgG1, IgG2, itd.) ili mogu biti konjugovani sa pogodnim vehikulumom da bi se produžio njihov polu-život. Pogodni vehikulumi obuhvataju, ali se njima ne ograničavaju, Fc, polietilen glikol (PEG), albumin, transferin i slično. Ovi i drugi pogodni vehikulumi poznati su u struci. Takvi konjugovani CDR peptidi mogu biti u monomernom, dimernom, tetramernom ili drugom obliku. Jedan ili više, u vodi rastvorljivih, polimera se vezuje na jednom ili više specifičnih položaja, na primer, na amino kraju, vezujućeg sredstva.
Vezujuće sredstvo može da sadrži jedan ili više, u vodi rastvorljivih, polimernih dodataka, koji uključuju, ali bez ograničavanja istima, polietilen glikol, polioksietilen glikol ili polipropilen glikol. Vidi, npr., U.S. Pat. No. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 i 4,179,337. Derivat vezujućeg sredstva može da sadrži jedan ili više monometoksi-polietilen glikola, dekstrana, celuloze ili drugih polimera na bazi ugljenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikola, propilen glikol homopolimera, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimera, polioksietilovanih poliola (npr., glicerol) i polivinil alkohola, kao i mešavina takvih polimera. Jedan ili više, u vodi rastvorljivih, polimera može biti nasumično vezano za jedan ili više bočnih lanaca. PEG može delovati tako da poboljšava terapeutski kapacitet za vezivanje agensa, kao što je antitelo. Određeni takvi postupci razmotreni su, primera radi, u U.S. Pat. No.6,133,426 .
Proceniće se da vezujuće sredstvo može imati najmanje jednu aminokiselinsku suspstituciju, pod uslovom da vezujuće sredstvo zadržava specifičnost vezivanja. Sledstveno tome, modifikacije izvršene na strukturama vezujućeg sredstva, obuhvaćene su unutar okvira izlaganja. One mogu uključiti aminokiselinske supstitucije, koje mogu biti konzervativne ili ne-konzervativne, a koje ne narušavaju sklerostin vezujuću sposobnost vezujućeg sredstva. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu uključiti aminokiselinske ostatake koji u prirodi ne postoje, koji se uobičajeno ugrađuju pre hemijskom sintezom peptida nego sintezom u biološkim sistemima. One uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili inverzne oblike aminokiselinskih delova. Konzervativna aminokiselinska supstitucija može, takođe, uključiti supstituciju nativnog aminokiselinskog ostataka sa normativnim ostatakom, tako da to ima mali ili nikakav efekat na polaritet ili naelekstrisanje aminokiselinskog ostataka na tom položaju.
Ne-konzervativne supstitucije mogu uključiti zamenu člana jedne klase aminokiselina ili aminokiselinskih mimetika za člana druge klase sa različitim fizičkim karakteristikama (npr., veličina, polaritet, hidrofobičnost, naelektrisanje). Takvi supstituisani ostaci mogu biti uvedeni u regione humanog antitela koji su homologni sa nehumanim antitelima, ili u ne-homologne regione molekula.
Pored toga, lice stručno u ovoj oblasti može proizvesti test varijante koje sadrže pojedinačnu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostataku. Varijante, potom, mogu biti ispitane korišćenjem testova aktivnosti, koji su stručnjacima u ovoj oblasti poznati. Takve varijante bi mogle biti korišćene za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da je promena na pojedinom aminokiselinskom ostatku dovela do narušene, nepoželjno smanjene ili neodgovarajuće aktivnosti, varijante sa takvom promenom mogu biti izbegnute. Drugim rečima, na osnovu informacija, prikupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak u ovoj oblasti će jednostavno odrediti aminokiseline u kojima bi se dalje supstitucije izbegavale ili same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.
Stručnjak u ovoj oblasti moći će da utvrdi pogodne varijante polipeptida, kao što su ovde navedeni, korišćenjem dobropoznatih tehnika. Lice stručno u ovoj oblasti može da identifikuje pogodne regione molekula koji se mogu izmeniti bez narušavanja aktivnosti, ciljano birajući regione za koje se smatra da nisu od značaja za aktivnost. Mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula, koji su očuvani među sličnim polipeptidima. Čak i regioni koji mogu biti od značaja za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti podvrgnuti konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama, bez narušavanja biološke aktivnosti ili bez štetnih efekata na polipeptidnu strukturu.
Dodatno, lice stručno u ovoj oblasti može proceniti strukturno-funkcionalne studije, kojima se identifikuju ostaci u sličnim polipeptidima, koji su značajni za aktivnost ili strukturu. S obzirom na takva poređenja, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u proteinu, koji odgovaraju ostacima aminokiselina koji su značajni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručno lice u ovoj oblasti može izabrati hemijski slične aminokiselinske supstitucije za aminokiselinske ostatke, za koje se pretpostavlja da su od značaja.
Stručnjak u ovoj oblasti može, takođe, da analizira trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na takvu strukturu u sličnim polipeptidima. S obzirom na takve podatke, lice stručno u ovoj oblasti može predvideti raspored aminokiselinskih ostataka antitela s obzirom na njegovu trodimenzionalnu strukturu. Stručnjak u ovoj oblasti može izabrati da ne vrši radikalne izmene na aminokiselinskim ostacima, za koje se pretpostavlja da se nalaze na površini proteina, budući da takvi ostaci mogu biti uključeni u značajne interakcije sa drugim molekulima.
Brojne naučne publikacije su bile posvećene predviđanju sekundarne strukture. Vidi Moult J., Curr. Op. u Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Pored toga, trenutno su dostupni kompjuterski programi za ispomoć pri predviđanju sekundarne strukture. Jedan metod predviđanja sekundarne strukture je zasnovan na modeliranju homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koja poseduju istovetnost sekvenci veću od 30% ili sličnost veću od 40%, često imaju slične strukturne topologije. Skorašnje uvećanje baze podataka o strukturama proteina (PDB) obezbedilo je poboljšanje predvidljivosti sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj lanaca unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Vidi Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Pretpostavlja se (Brenner i saradnici, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničen broj lanaca u datom polipeptidu ili proteinu i da, jednom, kada je razrešen kritičan broj struktura, predviđanje strukture postaje značajno preciznije.
Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture uključuju "nizanje" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "analizu profila" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355- 4358 (1987)), i "evoluciono povezivanje" (Vidi Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)).
Varijante vezujućih sredstava uključuju glikozilacijske varijante, u kojima je broj i/ili vrsta glikozilacijskog položaja izmenjen u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama matičnog polipeptida. Varijante mogu da sadrže veći ili manji broj N-vezanih glikozilacijskih položaja nego nativni protein. Za N-vezani- glikozilacijski položaj je karakteristična sekvenca: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, pri čemu
aminokiselinski ostatak označen sa X može biti bilo koji ostatak aminokiseline izuzev prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka da bi se kreirala ova sekvenca obezbeđuje potencijalno novu poziciju za dodavanje N-vezanog lanca ugljenih hidrata. Alternativno, supstitucijom kojom se ukida ova sekvenca odstraniće se postojeći N-vezani lanac ugljenih hidrata. Takođe je obezbeđeno preuređenje N-vezanih lanaca ugljenih hidrata, kojim se jedan ili više N-vezanih glikozilacijskih položaja (obično onih koji postoje u prirodi) odstranjuje, a stvara se jedan ili više novih N-vezanih položaja. Dodatne poželjne varijante antitela obuhvataju cisteinske varijante, u kojima se jedan ili više cisteinskih ostataka odstranjuje ili supstituiše drugom aminokiselinom (npr., serin), u poređenju sa matičnom aminokiselinskom sekvencom. Cisteinske varijante mogu biti korisne kada se antitela moraju ponovno saviti u biološki aktivnu konformaciju kao, na primer, nakon izolovanja nerastvorljivih inkluzionih tela. Cisteinske varijante uopšteno imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina, a obično imaju paran broj ostataka, kako bi se interakcije proistekle od nesparenih cisteina svele na minimum.
Stručnjaci u ovoj oblasti mogu utvrditi željene aminokiselinske supstitucije (bez obzira da li su konzervativne ili ne-konzervativne) u momentu kada su takve supstitucije poželjne. Supstitucije aminokiselina se mogu upotrebiti kako bi se identifikovali ostaci antitela važni za sklerostin ili za povećanje ili smanjenje afiniteta, ovde opisanih, antitela prema sklerostinu.
Poželjne aminokiselinske supstitucije su one kojima se: (1) smanjuje podložnost proteolizi, (2) smanjuje sklonost oksidaciji, (3) menja afinitet vezivanja za obrazovanje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afiniteti vezivanja i/ili (4) prenose ili modifikuju druge fizikohemijske ili funkcionalne karakteristike takvih polipeptida. Pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu biti izvršene na sekvenci koja postoji u prirodi (npr., na delu polipeptida, koji se nalazi izvan domena koji formira intermolekularne kontakte). U naročitim ostvarenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija ne sme suštinski izmeniti strukturne karakteristike matične sekvence (npr., zamena aminokiseline ne bi imala tendenciju razbijanja heliksa, koji postoji u matičnoj sekvenci, ili cepanja drugih tipova sekundarne strukture, koji karakterišu matičnu sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida koji se prepoznaju u struci opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman i Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
Vezujuća sredstva mogu biti hemijski vezana sa polimerima, lipidima ili drugim delovima.
Vezujuća sredstva mogu da sadrže najmanje jedan od ovde opisanih CDR-a, koji su ugrađeni u biokompatibilnu strukturu kostura. U jednom primeru, biokompatibilna struktura kostura sadrži polipeptid ili njegov deo, koji je dovoljan za obrazovanje konformacijski stabilne strukturne potpore, ili konstrukcije, ili kostura, koji je u stanju da istakne jednu ili više sekvenci amino kiselina koje se vezuju za antigen (npr., CDR-e, varijabilni region, itd.) u lokalizovanom površinskom regionu. Takve strukture mogu biti polipeptid ili polipeptidni "struk" (strukturni motiv) koji postoji u prirodi ili mogu imati jednu ili više modifikacija, kao što su adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina, u odnosu na polipeptid ili lanac koji postoji u prirodi. Ovi kosturi mogu biti dobijeni iz polipeptida bilo koje vrste (ili iz više od jedne vrste), kao što su ljudi, drugi sisari, ostali kičmenjaci, beskičmenjaci, biljke, bakterije ili virusi.
Uobičajeno, biokompatibilne strukture kostura se baziraju na proteinskim okvirima ili skeletima koji se razlikuju od imunoglobulinskih domena. Na primer, mogu se koristiti one strukture koje se baziraju na fibronektinu, ankirinu, lipokalinu, neokarzinostainu, citohromu b, CP1 cink fingeru, PST1, namotanom kalemu, LACI-D1, Z domenu i tendramisat domenima (Vidi npr., Nygren i Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
Vezujuća sredstva uključuju humanizovana antitela koja su ovde opisana. Humanizovana antitela, kao što su ona antitela koja su ovde opisana, mogu biti proizvedena korišćenjem tehnika, poznatih stručnjacima u ovoj oblasti (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(1):35- 42, 2005; Dall’Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005 i Clark, M., Immunology
Today. 21 (8):397-402, 2000).
Osim toga, stručnolice u ovoj oblasti će prepoznati da pogodna vezujuća sredstva obuhvataju delove ovih antitela, kao što su jedan ili više od CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 kako je ovde specifično izloženo. Najmanje jedan od regiona CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 može imati najmanje jednu amino kiselinsku supstituciju, uz uslov da vezujuće sredstvo zadržava specifičnost vezivanja ne-supstituisanog CDR. Ne-CDR deo vezujućeg sredstva može biti ne-proteinski molekul, pri čemu vezujuće sredstvo unakrsno blokira vezivanje ovde izloženog antitela za sklerostin i/ili neutrališe sklerostin. Ne-CDR deo vezujućeg sredstva može biti ne-proteinski molekul u kom vezujuće sredstvo ispoljava slični profil vezivanja za peptide humanog sklerostina u "kompetitivnom testu vezivanja peptidnog epitopa humanog sklerostina" koje ispoljava barem jedno od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 i Ab-24, i/ili neutrališe sklerostin. Ne-CDR deo vezujućeg sredstva može biti sastavljen od amino kiselina, pri čemu je vezujuće sredstvo rekombinantni vezujući protein ili sintetski peptid i, rekombinantni vezujući protein unakrsno blokira vezivanje ovde izloženog antitela za sklerostin i/ili neutrališe sklerostin. Ne-CDR deo vezujućeg sredstva može biti sastavljen od amino kiselina, pri čemu je vezujuće sredstvo rekombinantni vezujući protein i, rekombinantni vezujući protein ispoljava slični profil vezivanja za peptide humanog sklerostina u kompetitivnom testu vezivanja peptidnog epitopa humanog sklerostina (opisan ovde u nastavku) kao što ispoljava barem jedno od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, i Ab-24, i/ili neutrališe sklerostin.
Kada antitelo sadrži jedan ili više CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, kako je prethodno opisano, može se dobiti putem ekspresije iz ćelije domaćina, koja sadrži DNK, koja kodira ove sekvence. DNK, koja kodira svaku CDR sekvencu, može se utvrditi na bazi aminokiselinske sekvence CDR-a i sintetisati zajedno sa bilo kojim kosturom varijabilnog regiona poželjnog antitela i DNK sekvencama konstantnog regiona, korišćenjem tehnika oligonukleotidne sinteze, tehnika mutageneze usmerene ka položaju i tehnika lančane polimeraza reakcije (PCR), kako je pogodno. DNK, koja kodira kosture varijabilnog regiona i konstantne regione, je u vekoj meri dostupna stručnjacima u ovoj oblasti iz baza podataka genetskih sekvenci, kao što je GenBank®. Svaki od gore pomenutih CDR-a obično će biti lociran na kosturu
varijabilnog regiona na položajima 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) i 95-102 (CDR-H3) teškog lanca i na položajima 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) i 89-97 (CDR-L3) lakog lanca, prema Kabat sistemu numeracije (Kabat i saradnici, 1987 u Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Čim je sintetisana, DNK, koja kodira antitelo ili njegov fragment, može se umnožavati i ekspresovati u skladu sa bilo kojom od brojnih dobropoznatih procedura za eksciziju, ligaciju, transformaciju i transfekciju nukleinske kiseline, koristeći bilo koji od brojnih poznatih ekspresionih vektora. Tako, može biti poželjna ekspresija fragmenta antitela u prokariotskom domaćinu, kao što je Escherichia coli (vidi, npr., Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). Može biti poželjna ekspresija antitela ili njegovog fragmenta u ćeliji domaćina eukariota, uključujući kvasce (npr., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe i Pichia pastoris), životinjske ćelije (uključujući ćelije sisara) ili ćelije biljaka. Primeri pogodnih životinjskih ćelija uključuju, ali bez ograničavanja na njih, ćelije mijeloma (kao što je mišji NSO niz), COS, CHO ili ćelije hibridoma. Primeri biljnih ćelija obuhvataju ćelije duvana, kukuruza, soje i pirinča.
Jedan ili više ekspresionih vektora koji se mogu replikovati, a koji sadrže DNK, koja kodira varijabilni i/ili konstantni region antitela, može se pripremiti i koristiti za transformaciju odgovarajućeg ćelijskog niza, na primer, ne-produkujućeg ćelijskog niza mijeloma, kao što je mišji NSO niz, ili bakterija, kao što je E. coli, u kojima će se odvijati proizvodnja antitela. Da bi se postigla efikasna transkripcija i translacija, sekvenca DNK u svakom vektoru uključivala bi odgovarajuće regulatorne sekvence, posebno promoter i lider sekvence, koje su operativno vezane za sekvence varijabilnog domena. Pojedini postupci za proizvodnju antitela na ovaj način generalno su dobro poznati i u rutinskoj su upotrebi. Primera radi, procedure bazične molekularne biologije opisali su Maniatis i saradnici (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; vidi, takođe, Maniatis i saradnici, 3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)). Sekvenciranje DNK može biti izvedeno kako su opisali Sanger i saradnici (PNAS 74:5463, (1977)) i priručnik Amersham International plc sequencing, a mutageneza usmerena ka položaju može se izvesti prema postupcima koji su poznati u struci (Kramer et al., Nucleic Acids Res.
12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); priručnik Anglian Biotechnology Ltd). Pored toga, brojne publikacije opisuju tehnike koje su pogodne za izradu antitela putem manipulacije sa DNK, kreiranje ekspresionih vektora i transformisanje i kultivisanje odgovarajućih ćelija (Mountain A i Adair, J R u Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Poglavlje 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York).
Kada je poželjno da se poboljša afinitet antitela koje uključuje jedan ili više prethodno pomenutih CDR-a, mogu se koristiti brojni protokoli razvijanja afiniteta, koji uključuju održavanje CDR-a (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mešanje lanaca (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), korišćenje mutacionih sojeva E. coli. (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), mešanje DNK (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), izlaganje faga (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) i polni PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Sve ove postupke razvijanja afiniteta razmotrili su Vaughan i saradnici (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Druga antitela se mogu dobiti uobičajenim postupcima imunizacije i ćelijske fuzije, kako su ovde opisani, a u struci poznati. Monoklonska antitela se mogu prozvesti korišćenjem brojnih poznatih postupaka. Uopšteno, monoklonska antitela, koja se vezuju sa specifičnim antigenima, mogu se dobiti postupcima, koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti (vidi, na primer, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); U.S. Patent No. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 i 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980) i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," u DNA Cloning 2: Expression Systems,
2. izdanje, Glover et al. (eds.), strana 93 (Oxford University Press 1995)). Fragmenti antitela mogu biti dobijeni iz njih korišćenjem bilo kojih pogodnih standardnih postupaka, kao što je proteolitička digestija, ili opciono, putem proteolitičke digestije (primera radi, upotrebom papaina ili pepsina), nakon koje bi sledila blaga redukcija disulfidnih veza i alkilacija. Alternativno, takvi fragmenti bi se, takođe, mogli proizvesti rekombinantnim postupcima genetskog inženjeringa, kako su ovde opisani.
Monoklonska antitela se mogu dobiti injicirajući životinjama, na primer, pacovu, hrčku, zecu, ili, poželjno, mišu, uključujući, primera radi, transgenskog ili knockout miša, poznatog u struci, imunogen, koji sadrži humani sklerostin sa sekvencom SEQ ID NO:1, ili njegov fragment, u skladu sa postupcima, poznatim u struci i opsanim ovde. Postojanje proizvodnje specifičnog antitela može se pratiti nakon inicijalne injekcije i/ili nakon booster injekcije, uzimanjem uzoraka seruma i detekcijom prisustva antitela koje se vezuje sa humanim sklerostinom ili peptidom, koristeći bilo koji od nekolicine postupaka imunodetekcije, koji su poznati u struci, a ovde su opisani. Životinjama, koje proizvode željena antitela, uzimaju se limfoidne ćelije, najčešće ćelije slezine ili limfnog čvora, kako bi se dobili B-limfociti. Zatim se vrši fuzija B limfocita sa fuzionim partnerom, lekom senzibilisanom ćelijom mijeloma, posebno onom koja je singenična sa imunizovanom životinjom, i opciono poseduje druge poželjne karakteristike (npr.. nemogućnost da ekspresuje proizvode gena endogenog Ig, npr., P3X63 - Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NSO, SP20), kako bi se proizveli hibridomi, koji su obesmrćeni eukariotski ćelijski nizovi. Limfoidne (npr., slezina) ćelije i ćelije mijeloma mogu biti sjedinjene tokom nekoliko minuta s agensom koji podstiče membransku fuziju, kao što je polietilen glikol ili nejonski deterdžent, a zatim se u maloj gustini postavljaju na selektivni medijum koji potpomaže rast hibridoma ćelija, ali ne i ćelija mijeloma bez fuzije. Poželjni selektivni medijum je HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin). Nakon dovoljno vremena, uglavnom oko jedne do dve nedelje, zapažaju se kolonije ćelija. Pojedinačne kolonije se izoluju, a antitelima koje ove ćelije proizvode, može biti ispitana aktivnost vezivanja za humani sklerostin, koristeći bilo koji od brojnih imunoloških terstova, koji su poznati u struci i ovde opisani. Hibridomi su klonirani (npr., ograničenim dilucionim kloniranjem ili izolovanjem plaka mekanog agara), a pozitivni klonovi koji proizvode antitelo specifično za sklerostin, odabrani su i kultivisani. Monoklonska antitela iz kultura hibridoma mogu se izolovati iz supernatanata kultura hibridoma. Alternativni postupak za proizvodnju mišjeg monoklonskog antitela jeste da se ćelije hibridoma injiciraju u peritonealnu šupljinu singeničnog miša, na
primer, miša koji je tretiran (npr., ispran pristanom), da bi se podstaklo formiranje ascitesne tečnosti, koja sadrži monoklonsko antitelo. Monoklonska antitela se mogu izolovati i prečistiti brojnim dobro utvrđenim tehnikama. Takve tehnike izolovanja uključuju afinitetnu hromatografiju sa protein-A sefarozom, hromatografiju sa isključivanjem prema veličini i jon izmenjivačku hromatografiju (vidi, primera radi, Coligan na stranama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," u Methods in Molecular Biology, Vol. 10, strane 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Monoklonska antitela se mogu prečistiti putem afinitetne hromatografije, koristeći pogodan ligand, odabran na osnovu posebnih svojstava antitela (npr., izotip teškog ili lakog lanca, specifičnost vezivanja, itd.). Primeri pogodnog liganda, imobilisanog na čvrstoj podlozi, uključuju Protein A, Protein G i antitelo protiv konstantnog regiona (lakog lanca ili teškog lanca), anti-idiotipsko antitelo i TGF-beta vezujući protein ili njegov fragment ili varijantu.
Antitelo tekućeg pronalaska može takođe biti humano monoklonsko antitelo. Humana monoklonska antitela mogu biti proizvedena bilo kojim od brojnih postupaka, koji će biti bliski licima uobičajene upućenosti u ovu oblast. Takvi postupci uključuju, ali bez ograničavanja na njih, transformaciju humanih perifernih krvnih ćelija sa Epstein Barr virusom (EBV) (npr., koje uključuju B limfocite), in vitro imunizaciju humanih B ćelija, fuziju ćelija slezine iz imunizovanih transgenskih miševa, koji nose insertovane gene humanih imunoglobulina, izolovanje iz biblioteke faga V regiona humanog imunoglobulina, ili druge procedure, koje su poznate u struci, a bazirane su na ovom izlaganju. Na primer, humana monoklonska antitela mogu se dobiti iz transgenskih miševa, koji su konstruisani kako bi proizvodili specifična humana antitela u odgovoru na podržaj antigenom. Postupci za dobijanje humanih antitela iz transgenskih miševa opisani su, na primer, u Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun.6:579, 1994; U.S. Patent No.5,877,397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.764:525-35. U ovom postupku, elementi lokusa humanog teškog i lakog lanca uvedeni su u sojeve miševa, koji su dobijeni iz embrionalnih stem ćelijskih nizova, koji sadrže ciljane rascepe lokusa endogenih teških lanaca i lakih lanaca (vidi, takođe, Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Primera radi, humani imunoglobulinski
transgeni mogu biti mini-genske konstrukcije ili translokusi na arteficijelnim hromosomima kvasca, koji se podvrgavaju preuređenju DNK, specifične za B ćelije, i hipermutaciji u mišjem limfoidnom tkivu. Humana monoklonska antitela mogu biti dobijena putem imunizacije transgenskih miševa, koji, zatim, mogu proizvoditi humana antitela, specifična za sklerostin. Limfoidne ćelije imunizovanih transgenskih miševa mogu se koristiti za proizvodnju hibridoma, koji sekretuju humana antitela, u skladu sa ovde opisanim postupcima. Poliklonski serumi, koji sadrže humana antitela, mogu se, takođe, dobiti iz krvi imunizovanih životinja.
Drugi postupak proizvodnje humanih antitela uključuje obesmrćenje humanih ćelija periferne krvi posredstvom EBV transformacije. Vidi, npr.,
U.S. Patent No. 4,464,456. Takav obesmrćeni B ćelijski niz (ili limfoblastoidni ćelijski niz), koji proizvodi monoklonsko antitelo, koje se specifično vezuje za sklerostin, može se identifikovati postupcima imunodetekcije, kako su ovde dati, na primer, ELISA testom, a zatim se izoluju standardnim tehnikama kloniranja. Stabilnost limfoblastoidnog ćelijskog niza koji proizvodi anti-sklerostin antitelo, može se poboljšati putem fuzije transformisanog ćelijskog niza sa mišjim mijelomom, kako bi se proizveo hibridni mišjehumani ćelijski niz prema postupcima, poznatim u struci (vidi, npr., Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Jedan drugi postupak za proizvodnju humanih monoklonskih antitela jeste in vitro imunizacija, koja uključuje ispiranje humanih B ćelija slezine sa humanim sklerostinom, a, nakon toga, fuziju ispranih B ćelija sa heterohibridnim fuzionim partnerom. Vidi, npr., Boerner et al., 1991 J. Immunol.147: 86-95.
Može biti odabrana B ćelija koja proizvodi antitelo protiv humanog sklerostina, a varijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca mogu biti klonirani iz B ćelije, u skladu sa postupcima molekularne biologije, poznatim u struci (WO 92/02551; US patent 5,627,052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) i opisanim ovde. B ćelije iz imunizovane životinje mogu se izolovati iz slezine, limfnog čvora ili uzorka periferne krvi, odabiranjem ćelije koja proizvodi antitelo koje se specifično vezuje za sklerostin. B ćelije mogu, isto tako, biti izolovane od ljudi, na primer, iz uzorka periferne krvi. Postupci za otkrivanje pojedinačnih B ćelija, koje proizvode antitelo sa željenom specifičnošću, dobro su poznati u struci, primera radi,
posredstvom formiranja plaka, ćelijskim razvrstavanjem aktiviranim fluorescencijom, in vitro stimulacijom, nakon koje je sledila detekcija specifičnog antitela i sličnim. Postupci za biranje B ćelija koje proizvode specifično antitelo, uključuju, primera radi, izradu pojedinačne ćelijske suspenzije B ćelija u mekanom agaru, koji sadrži humani sklerostin. Vezivanje specifičnog antitela, koga proizvode B ćelije, za antigen, dovodi do obrazovanja kompleksa, koji se može videti kao imunoprecipitat. Nakon što su B ćelije koje proizvode željeno antitelo, odabrane, geni specifičnog antitela se mogu klonirati, izolovanjem i amplifikovanjem DNK ili mRNK, u skladu sa, u struci poznatim i ovde opisanim, postupcima.
Dodatni postupak za dobijanje antitela je izlaganje faga. Vidi, npr., Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol.57:191-280. Kombinatorne biblioteke gena varijabilnih regiona humanog ili mišjeg imunoglobulina mogu se kreirati u vektorima fagima, koji se mogu skrinirati, da bi se odabrali fragmenti Ig (Fab, Fv, sFv ili njihovi multimeri), koji se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment. Vidi, npr., U.S. Patent No.5,223,409; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol.227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 i reference, navedene u njima. Na primer, biblioteka, koja sadrži mnoštvo polinukleotidnih sekvenci, koje kodiraju fragmente varijabilnog regiona Ig, mogu se umetnuti u genom filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili njegova varijanta, u okvir sa sekvencom koja kodira protein koji obmotava fag. Fuzioni protein može biti spoj omotačkog proteina sa domenom varijabilnog regiona lakog lanca i/ili sa domenom varijabilnog regiona teškog lanca. Fragmenti Fab imunoglobulina mogu, takođe, biti izloženi na čestici faga (vidi, npr., U.S. Patent No.5,698,426).
Ekspresione biblioteke cDNK teškog i lakog lanca imunoglobulina mogu, isto tako, biti pripremljene u lambda fagu, koristeći, na primer, λImmunoZap™(H) i λImmunoZap™(L) vektore (Stratagene, La Jolla, Kalifornija). Ukratko, mRNK se izoluje iz populacije B ćelija i koristi se za kreiranje ekspresionih biblioteka cDNK teškog i lakog lanca imunoglobulina u λImmunoZap(H) i λImmunoZap(L) vektorima. Ovi vektori mogu biti individualno skrinirani ili ko-ekspresovani, da bi obrazovali Fab fragmente ili antitela (vidi Huse et al., supra; vidi, takođe, Sastry et al., supra). Pozitivni plakovi mogu, nakon toga, biti konvertovani u ne-litički plazmid, koji omogućuje visok nivo ekspresije fragmenata monoklonskog antitela iz E. coli.
U hibridomima, varijabilni regioni monoklonskog antitela koje ekspresuje gen od značaja, mogu biti amplifikovati korišćenjem nukleotidnih prajmera. Ove prajmere može sintetisati lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti ili se može nabaviti iz komercijalno dostupnih izvora. (Vidi, npr., Stratagene (La Jolla, California), koja prodaje prajmere za mišje i humane varijabilne regione, uključujući, između ostalih, prajmere za VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VLi CLregione.) Ovi prajmeri mogu biti korišćeni za amplifikovanje varijabilnih regiona teškog ili lakog lanca, koji, potom, mogu biti umetnuti u vektore, kao što je Immuno-ZAP™H, odnosno ImmunoZAP™L (Stratagene). Ovi vektori mogu, nakon toga, biti uvedeni u E. coli, kvasce ili ekspresione sisteme na bazi sisara. Korišćenjem ovih postupaka mogu se proizvesti velike količine jednolančanih proteina koji uključuju fuziju VHi VLdomena (vidi Bird et al., Science 242:423-426, 1988).
Čim se, korišćenjem bilo koje od prethodno opisanih tehnika imunizacije ili drugih tehnika, dobiju ćelije koje proizvode antitela prema , geni specifičnog antitela mogu biti klonirani putem izdvajanja i amplifikovanja DNK ili mRNA iz njih, u skladu sa standardnim procedurama kako su ovde opisane. Tako proizvedena antitela mogu biti sekvencirana, CDR-i identifikovani, a sa DNK, koja kodira CDR-e, se može, na prethodno opisani način, upravljati, kako bi se proizvela druga antitela.
Poželjno se vezujuća sredstva specifično vezuju za sklerostin. Kao i sa svim vezujućim sredstvima i testovima vezivanja, lice stručno u ovoj oblasti prepoznaje da bi bilo zamorno i nepraktično navoditi razne delove za koje se vezujuće sredstvo ne bi trebalo detektabilno vezivati, da bi bilo terapeutski delotvorno i pogodno. Sledstveno tome, za ovde izloženo vezujuće sredstvo, izraz "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost vezujućeg sredstva da se vezuje za sklerostin, poželjno humani sklerostin, sa većim afinitetom, nego što se vezuje za nesrodni kontrolni protein. Poželjno, kontrolni protein je beli lizozim kokošjeg jajeta. Poželjno, vezujuća sredstva vezuju sklerostin sa afinitetom, koji je najmanje 50, 100, 250, 500, 1000 ili 10,000 veći od afiniteta za kontrolni protein. Vezujuće sredstvo može posedovati afinitet vezivanja za humani sklerostin koji je manji ili jednak 1 x 10<-7>M, manji ili jednak 1 x 10<-8>M, manji ili jednak 1 x 10<-9>M, manji ili jednak 1 x 10<-10>M, manji ili jednak 1 x 10<-11>M, ili manji ilo jednak 1x 10<-12>M.
Afinitet se može utvrditi putem afinitetnog ELISA testa. Afinitet se može odrediti uz pomoć BIAcore testa. Afinitet se može odrediti kinetičkim postupkom. Afinitet se može utvrditi pomoću ekvilibrijum/rastvor postupka. Ti postupci su detaljno opisani ovde ili su poznati u struci.
Sklerostinska vezujuća sredstva poželjno moduliraju funkciju sklerostina u, ovde opisanom, testu na ćelijskoj osnovi i/ili in vivo testu, koji je ovde opisan, i/ili se vezuju za jedan ili više epitopa koji su ovde opisani i/ili unakrsno blokiraju vezivanje jednog od, antitela opisanih u ovoj prijavi i/ili im je, pomoću jednog od antitela opisanih u ovoj prijavi, unakrsno blokirano vezivanje za sklerostin. Sledstveno tome, takva vezujuća sredstva se mogu identifikovati korišćenjem testova, koji su ovde opisani.
Vezujuća sredstva mogu se proizvesti najpre identifikovanjem antitela koja se vezuju za jedan ili više, ovde datih, epitopa, i/ili neutralizacijom na ćelijskoj bazi, i/ili in vivo testovima, koji su ovde opisani i/ili unakrsnim blokiranjem antitela koja su opisana u ovoj prijavi, i/ili unakrsnim blokiranjem vezivanja za sklerostin, pomoću jednog od antitela opisanih u ovoj prijavi. CDR regioni ovih antitela se, potom, koriste za umetanje u odgovarajuće biokompatibilne okvire, kako bi se proizvela sklerostin vezujuća sredstva. Ne-CDR deo vezujućeg sredstva može biti sastavljen od aminokiselina, ili može biti neproteinski molekul. Ovde opisani testovi omogućuju karakterizacija vezujućih sredstava. Poželjno, vezujuća sredstva su antitela, kako su ovde definisana.
Podrazumevaće se, od strane stručnog lica u ovoj oblasti, da neki proteini, kao što su antitela, mogu biti podvrgnuti raznovrsnim posttranslacijskim modifikacijama. Vrsta i stepen ovih modifikacija često zavise od ćelijskog niza domaćina, koji je korišćen za ekspresiju proteina, kao i od uslova kultivacije. Takve modifikacije mogu uključiti varijacije u glikozilaciji, oksidaciju metionina, obrazovanje diketopiperizina, izomeraciju aspartata i deamidaciju asparagina. Česta modifikacija je gubljenje karboksi-terminalnog bazičnog ostataka (kao što je lizin ili arginin), zbog delovanja karboksipeptidaza (kako je opisano u Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
Antitela, koja su označena kao At-A, At-B, At-C, At-D i At-1 opisana su u nastavku. "HC" se odnosi na teški lanac, a "LC" se odnosi na laki lanac. Za neka antitela u nastavku, CDR-i su pravougaono zasenčeni, a konstantni (C) regioni su prikazani u bold italiku.
At-D
Antitelo D (takođe, ovde označeno kao At-D i Mat-D) je mišije antitelo koje ima visok afinitet vezivanja za sklerostin. BIAcore profil vezivanja At-D je prikazan na Slici 18.
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) lakog lanca At-D:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) At-D LC je sledeća:
Amino kiselinska sekvenca At-D LC, uključujući signalni peptid, je sledeća:
Nukleinsko kiselinska sekvenca At-D LC, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) teškog lanca HC At-D je sledeća:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-D je:
Amino kiselinska sekvenca HC At-D, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-D, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-D su sledeće:
CDR-H1: DHYMS (SEQ ID NO:39)
CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID NO:40)
CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID NO:41)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-D su:
CDR-L1: QASQGTSINLN (SEQ ID NO:42)
CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID NO:43)
CDR-L3: LQHSYLPYT (SEQ ID NO:44)
At-C
Antitelo C (ovde, takođe, označeno kao At-C i Mat-C) je mišije antitelo koje ima visok afinitet vezivanja za sklerostin. BIAcore profil vezivanja At-C je prikazan na Slici 17. Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) lakog lanca At-C je sledeća:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-C je:
Amino kiselinska sekvenca LC At-C, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-C, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
Teški lanac At-C
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-C je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-C je sledeća:
Amino kiselinska sekvenca HC At-C, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-C, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-C su sledeće:
CDR-H1: DCYMN (SEQ ID NO:45)
CDR-H2: DINPFNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:46)
CDR-H3: SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID NO:47)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-C su sledeće:
CDR-L1: KASQSVDYDGDSYN (SEQ ID NO:48)
CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO:49)
CDR-L3: QQSNEDPWT (SEQ ID NO:50)
At-A
Antitelo A (ovde, takođe, označeno kao At-A i Mat-A) je zečije-mišije himerično antitelo koje ima visok afinitet vezivanja za sklerostin. BIAcore profil vezivanja At-A je prikazan na Slici 15.
Laki lanac At-A
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-A:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-A:
Amino kiselinska sekvenca LC At-A, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-A, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-A:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-A:
Amino kiselinska sekvenca HC At-A, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-A, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-A su sledeće:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO:51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO:52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO:53)
CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca At-A su:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO:54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO:55)
CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO:56)
At-A je humanizovano, a označava se kao Antitelo 1 (ovde, isto tako, označeno kao At-1) i ima sledeće sekvence:
Nukleinsko kiselinska sekvenca varijabilnog regiona LC At-1, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona LC At-1, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca varijabilnog regiona HC At-1, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
Amino kiselinska sekvenca HC varijabilnog regiona At-1, uključujući signalni peptid je:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-1 su sledeće:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO:51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO:52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO:53)
CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca At-1 su:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO:54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO:55)
CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO:56)
At-B
Antitelo B (ovde se, isto tako, označava kao At-B i Mat-B) je mišije antitelo koje ima visok afinitet vezivanja za sklerostin. BIAcore profil vezivanja At-B je prikazan na Slici 16.
Laki lanaca At-B
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-B je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-B je:
Amino kiselinska sekvenca LC At-B, uključujući signalni peptid, je:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-B, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu je:
Teški lanac At-B
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-B:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-B:
Amino kiselinska sekvenca HC At-B, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-B, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-B su sledeće:
CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO:57)
CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO:58)
CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO:59)
CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca At-B su:
CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO:60)
CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO:61)
CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO:62)
Antitela koja su ovde izložena, vezuju se za regione humanog sklerostina koji su važni za in vivo aktivnost proteina. Vezivanje antitela za sklerostin može da koreliše sa porastom, na primer, mineralne gustine kostiju, što se postiže korišćenjem antitela in vivo kako je opisano u Primerima 5 i 9 (miševi) i Primeru 12 (majmun). Porast najmanje jednog od : formiranja kosti, mineralnog sadržaja kostiju, koštane mase, kvaliteta kostiju i jačine kostiju, isto tako, može da se postigne korišćenjem antitela in vivo kako je opisano u Primerima 5 i 9 (miševi) i Primeru 12 (majmun). Kako je vezivanje antitela za sklerostin primerno određeno njegovim CDR sekvencama, antitelo može da se proizvede sa svim ili nekim prikazanim CDR sekvencama u odgovarajućoj gradivnoj konstrukciji, pri čemu antitelo zadržava sposobnost specifičnog vezivanja za sklerostin i, može se očekivati da se postigne, na primer, mineralna gustina kostiju. Takva antitela se koriste za lečenje stanja kod ljudi ili životinja koja su prouzrokovana, u vezi sa, ili rezultat najmanje jednog od: malog formiranja kosti, niske mineralne gustine kostiju, niskog mineralnog sadržaja u kostima, male koštane mase, niskog kvaliteta kostiju i male koštane jačine. Postupci konstruisanja i ekspresije antitela i njihovih fragmenata, koji sadrže CDR ovog izlaganja, dobro su poznati licima iz struke.
Ovo izlaganje se zbog toga odnosi u jedanom apektu na izolovano antitelo, uključujući Ab-A, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se specifično vezuje za sklerostin i pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:51 za CDR-H1, SEQ ID NO:52 za CDR-H2 i SEQ ID NO:53 za CDR-H3.
Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu sadržavati varijabilni domen teškog lanca u kom se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:51 za CDR-H1, SEQ ID NO:52 za CDR-H2 i SEQ ID NO:53 za CDR-H3.
Kada je u antitelima laki lanac prisutan, laki lanac može biti bilo koji pogodan komplementarni lanac i, naročito može biti odabran od lakog lanca u kome varijabilni domen sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:54 za CDR-L1, SEQ ID NO:55 za CDR-L2 i SEQ ID NO:56 za CDR-L3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen lakog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:54 za CDR-L1, SEQ ID NO:55 za CDR-L2 i SEQ ID NO:56 za CDR-L3.
Ovo izlaganje se dalje odnosi na izolovano antitelo, uključujući Ab-B, ili na njegovantigen vezujući fragment, koje se specifično vezuje za sklerostin i u kome varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:57 za CDR-H1, SEQ ID NO:58 za CDR-H2 i SEQ ID NO:59 za CDR-H3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen teškog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:57 za CDR-H1, SEQ ID NO:58 za CDR-H2 i SEQ ID NO:59 za CDR-H3.
Kada je u antitelima laki lanac prisutan, laki lanac može biti bilo koji pogodan komplementarni lanac i, naročito može biti odabran od lakog lanca u kome varijabilni domen sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:60 za CDR-L1, SEQ ID NO:61 za CDR-L2 i SEQ ID NO:62 za CDR-L3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen lakog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:60 za CDR-L1, SEQ ID NO:61 za CDR-L2 i SEQ ID NO:62 za CDR-L3.
Ovo izlaganje se dalje odnosi na izolovano antitelo, uključujući Ab-C, ili na njegovantigen vezujući fragment, koje se specifično vezuje za sklerostin i u kome varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:45 za CDR-H1, SEQ ID NO:46 za CDR-H2 i SEQ ID NO:47 za CDR-H3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen teškog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:45 za CDR-H1, SEQ ID NO:46 za CDR-H2 i SEQ ID NO:47 za CDR-H3.
Kada je u antitelima prisutan laki lanac , laki lanac može biti bilo koji pogodan komplementarni lanac i, naročito može biti odabran od lakog lanca u kome varijabilni domen sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:48 za CDR-L1, SEQ ID NO:49 za CDR-L2 i SEQ ID NO:50 za CDR-L3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen lakog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:48 za CDR-L1, SEQ ID NO:49 za CDR-L2 i SEQ ID NO:50 za CDR-L3.
Ovo izlaganje se, isto tako, odnosi na izolovano antitelo, uključujući Ab-D, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se specifično vezuje za sklerostin i u kome varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:39 za CDR-H1, SEQ ID NO:40 za CDR-H2 i SEQ ID NO:41 za CDR-H3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen teškog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:39 za CDR-H1, SEQ ID NO:40 za CDR-H2 i SEQ ID NO:41 za CDR-H3.
Kada je u antitelima prisutan laki lanac , laki lanac može biti bilo koji pogodan komplementarni lanac i, naročito može biti odabran od lakog lanca u kome varijabilni domen sadrži najmanje jedan CDR sa sekvencom datom u SEQ ID NO:42 za CDR-L1, SEQ ID NO:43 za CDR-L2 i SEQ ID NO:44 za CDR-L3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati varijabilni domen lakog lanca u kome se CDRi sastoje od najmanje jednog od peptida sa SEQ ID NO:42 za CDR-L1, SEQ ID NO:43 za CDR-L2 i SEQ ID NO:44 za CDR-L3.
Dodatna anti-sklerostin antitela su opisana u nastavku. Za neke od amino kiselinskih sekvenci, regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) su pravougaonozasenčeni, a konstantni regioni su u “bold-italiku”.
At-2 LC i HC sekvence antitela 2 (takođe označen kao At-2) su sledeće:
At-2 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-2: Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-2:
Amino kiselinska sekvenca LC At-2, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-2, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-2 teški lanac
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-2:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-2:
Amino kiselinska sekvenca HC At-2, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-2, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-3
LC i HC sekvence antitela 3 (takođe, ovde je označeno kao At-3) su sledeće:
At-3 laki lanac
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-3:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-3:
Amino kiselinska sekvenca LC At-3, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-3, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-3 teški lanac
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-3:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-3:
Amino kiselinska sekvenca HC At-3, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-3, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-4
LC i HC sekvence antitela 4 (takođe, ovde je označeno kao At-4) su kao što sledi:
At-4 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-4:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-4:
Amino kiselinska sekvenca LC At-4, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-4, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-4 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-4:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-4:
Amino kiselinska sekvenca HC At-4, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-4, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-4 je humanizovano kako bi se stvorilo At-5.
At-5
LC i HC sekvence antitela 5 (ovde, takođe označeno kao At-5) su sledeće:
At-5 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-5:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-5:
Amino kiselinska sekvenca LC At-5, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-5, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-5 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-5:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-5 bez karboksi-terminalnog lizina:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-5:
Amino kiselinska sekvenca HC At-5, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-5, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-5 varijabilni domeni:
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-5 (bez signalnih sekvenci):
DNK sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-5 (bez signalnih sekvenci):
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-5 (bez signalnih sekvenci):
DNK sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-5 (bez signalnih sekvenci):
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-5 su kao što sledi:
CDR-H1: DYNMH (SEQ ID NO:245)
CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID NO:246)
CDR-H3: LGYDDIYDDWYFDV (SEQ ID NO:247)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-5 su:
CDR-L1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO:78)
CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID NO:79)
CDR-L3: QQGDTLPYT (SEQ ID NO:80)
At-6
LC i HC sekvence antitela 6 (ovde se, takođe, označava kao At-6) su kao što sledi:
At-6 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-6:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-6:
Amino kiselinska sekvenca LC At-6, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-6, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-6 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-6:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-6:
Amino kiselinska sekvenca HC At-6, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-6, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-7
LC i HC sekvence antitela 7 (ovde, takođe označeno kao At-7) su sledeće:
At-7 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-7:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-7:
Amino kiselinska sekvenca LC At-7, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-7, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-7 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-7:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-7:
Amino kiselinska sekvenca HC At-7, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-7, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-8
LC i HC sekvence antitela 8 (ovde, takođe označeno kao At-8) su sledeće:
At-8 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-8:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-8:
Amino kiselinska sekvenca LC At-8, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-8, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-8 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-8:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-8:
Amino kiselinska sekvenca HC At-8, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-8, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-9
LC i HC sekvence antitela 9 (ovde, takođe označeno kao At-9) su sledeće:
At-9 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-9:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-9:
Amino kiselinska sekvenca LC At-9, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-9, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-9 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-9:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-9:
Amino kiselinska sekvenca HC At-9, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-9, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-10
LC i HC sekvence antitela 10 (ovde, takođe označeno kao At-10) su sledeće:
At-10 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-10:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-10:
Amino kiselinska sekvenca LC At-10, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-10, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-10 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-10:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-10:
Amino kiselinska sekvenca HC At-10, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-10, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-11
LC i HC sekvence antitela 11 (ovde isto tako, označeno kao At-11) su sledeće:
At-11 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-11:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-11:
Amino kiselinska sekvenca LC At-11, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-11, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-11 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-11:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-11:
Amino kiselinska sekvenca HC At-11, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-11, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-12
LC i HC sekvence antitela 12 (ovde isto tako, označeno kao At-12) su sledeće: At-12 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-12: Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-12:
Amino kiselinska sekvenca LC At-12, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-12, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-12 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-12:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-12:
Amino kiselinska sekvenca HC At-12, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-12, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-13
LC i HC sekvence antitela 13 (ovde isto tako, označeno kao At-13) su sledeće: At-13 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-13:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-13:
Amino kiselinska sekvenca of the At-13 LC uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-13, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-13 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-13:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-13:
Amino kiselinska sekvenca HC At-13, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-13, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-13 je humanizovano kako bi se generisalo At-14.
LC i HC sekvence antitela 14 (ovde isto tako, označeno kao At-14) su sledeće:
At-14 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-14:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-14:
Amino kiselinska sekvenca LC At-14, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-14, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-14 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-14:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-14 bez karboksi-terminalnog lizina:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-14:
Amino kiselinska sekvenca HC At-14, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-14, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-14 su:
CDR-H1: DYYMN (SEQ ID NO:296)
CDR-H2: DINPYNDDTTYNHKFKG (SEQ ID NO:297)
CDR-H3: ETAVITTNAMD (SEQ ID NO:298)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-14 su:
CDR-L1: RASSSVTSSYLN (SEQ ID NO:284)
CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO:285)
CDR-L3: QQYDFFPST (SEQ ID NO:286)
At-14 varijabilni domeni:
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-14 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-14 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-14 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-14 (bez signalne sekvence):
At-3 je humanizovano kako bi se generisalo At-15.
At-15
LC i HC sekvence antitela 15 (ovde, isto tako, označeno kao At-15) su kako sledi:
At-15 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-15: Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-15:
Amino kiselinska sekvenca LC At-15, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-15, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-15 teški lanac
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-15.
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-15 bez karboksi-terminalnog lizina:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-15:
Amino kiselinska sekvenca HC At-15, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-15, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-15 su:
CDR-H1: DFYLH (SEQ ID NO:290)
CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID NO:291)
CDR-H3: EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID NO:292)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-15 su:
CDR-L1: SVSSTISSNHLH (SEQ ID NO:278)
CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO:279)
CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID NO:280)
Varijabilni domeni At-15:
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-15 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-15 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-15 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-15 (bez signalne sekvence):
At-11 je humanizovano kako bi se generisalo At-16.
At-16
LC i HC sekvence antitela 16 (ovde, isto tako, označeno kao At-16) su kako sledi:
At-16 laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-16:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-16:
Amino kiselinska sekvenca LC At-16, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-16, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
At-16 teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-16:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-16 bez karboksi-terminalnog lizina:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-16:
Amino kiselinska sekvenca HC At-16, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-16, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-16 su:
CDR-H1: DYYIH (SEQ ID NO:293)
CDR-H2: RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID NO:294)
CDR-H3: EDYDGTYTWFPY (SEQ ID NO:295)
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-16 su:
CDR-L1: RASSSISYIH (SEQ ID NO:281)
CDR-L2: ATSNLAS (SEQ ID NO:282)
CDR-L3: QQWSSDPLT (SEQ ID NO:283)
At-16 varijabilni domeni:
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-16 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena lakog lanca At-16 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-16 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca varijabilnog domena teškog lanca At-16 (bez signalne sekvence):
Dodatna antitela su ovde obeležena kao antitela 17-22 (isto tako, ovde obeležena kao At-17, At-18, At-19, At-20, At-21 i At-22). Kappa konstantni region za sve VK regione u At-17, At-19 i At-21 je sledeći:
Teški konstantni region za sve VH regione u antitelima 17, 19 i 21 je sledeći: U sledećim amino kiselinskim sekvencama antitela, kvadratno zasenčene amino kiseline predstavljaju regione koji određuju komplement (CDRs), a potcrtane amino kiseline predstavljaju signalni peptid.
At-17
Amino kiselinska sekvenca LC At-17, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-17, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-17, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-17, uključujući signalni peptid:
At-17 je humanizovano da bi se generisalo At-18.
At-18
Amino kiselinska sekvenca LC At-18, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-18, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-18, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-18, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-18 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-18 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-18 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-18 (bez signalne sekvence):
At-19
Amino kiselinska sekvenca LC At-19, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-19, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-19, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-19, uključujući signalni peptid:
At-19 je humanizovano kako bi se generisalo antitelo 20 (ovde, isto tako, obeleženo kao At-20) i antitelo 23 (ovde, isto tako, obeleženo kao At-23).
At-20
IgG4 verzija
Amino kiselinska sekvenca LC At-20, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-20, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-20, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-20, uključujući signalni peptid:
At-23
IgG2 verzija
Laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-23: Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-23:
Amino kiselinska sekvenca LC At-23, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-23, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
Teški lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-23:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-23 bez karboksi-terminalnog lizina:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-23:
Amino kiselinska sekvenca HC At-23, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-23, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR (region koji određuje komplementarnost) sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-23 su sledeće:
CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO:269)
CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO:270)
CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO:271)
CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca At-23 su:
CDR-L1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO:239)
CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO:240)
CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO:241)
At-23 varijabilni domeni:
Amino kiselinska sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-23 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-23 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-23 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-23 (bez signalne sekvence): At-21
Amino kiselinska sekvenca LC At-21, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-21, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-21, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-21, uključujući signalni peptid:
At-21 je humanizovano kako bi se proizvelo At-22.
At-22
Amino kiselinska sekvenca LC At-22, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-22, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca HC At-22, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-22, uključujući signalni peptid:
Amino kiselinska sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-22 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca lakog lanca varijabilnog domena At-22 (bez signalne sekvence):
Amino kiselinska sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-22 (bez signalne sekvence):
DNK sekvenca teškog lanca varijabilnog domena At-22 (bez signalne sekvence):
Za At-18, At-20 i At-22, humani kappa konstantni region lakog lanca je kao što sledi:
a humani gama-4 konstantni region teškog lanca je kako sledi:
Zglobni region sadrži Ser-241-Pro mutaciju da bi se poboljšala stabilnost zgloba (Angal S et al, (1993), Mol Immunol, 30(1), 105-108).
At-24
Sekvence LC i HC antitela 24 (ovde, isto tako, označeno kao At-24) su sledeće:
Laki lanac:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) LC At-24:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) LC At-24:
Amino kiselinska sekvenca LC At-24, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca LC At-24, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
Teški lanac At-24:
Amino kiselinska sekvenca zrelog oblika (signalni peptid uklonjen) HC At-24:
Nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira zreli oblik (signalni peptid uklonjen) HC At-24:
Amino kiselinska sekvenca HC At-24, uključujući signalni peptid:
Nukleinsko kiselinska sekvenca HC At-24, uključujući signalni peptid, koja kodira sekvencu:
CDR sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca At-24 su sledeće:
CDR-L1: KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID NO:351) CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO:352)
CDR-L3: QQSNEDPFT (SEQ ID NO:353)
CDR sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca At-24 su sledeće:
CDR-H1: TYWMN (SEQ ID NO:358)
CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID NO:359) CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NO:360)
Tabela 1 u nastavku prikazuje SEQ ID NO i aminokiselinske sekvence CDR-a za At, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24. L1, L2 i L3 se odnose na CDR-e lakog lanca 1, 2 i 3, a H1, H2 i H3 se odnose na CDR-e teškog lanca 1, 2 i 3 u skladu sa Kabat sistemom numerisanja (Kabat et al., 1987 u: Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, SAD).
Oligopeptid ili polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična najmanje jednom od CDR-a iz prethodne Tabele 1; i/ili CDR-u sklerostin vezujućeg sradstava koje unakrsno blokira vezivanje najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24 za sklerostin, i/ili mu je vezivanje za sklerostin unakrsno blokirano posredstvom najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24; i/ili CDR-u sklerostin vezujućeg sredstva pri čemu vezujuće sredstvo može blokirati inhibitorno dejstvo sklerostina u testu mineralizacije na ćelijskoj osnovi (t.j., sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo); i/ili CDR-u sklerostin vezujućeg sredstva koje se vezuje za Loop 2 epitop; i/ili CDR-u sklerostin vezujućeg sredstva koje se vezuje za T20.6 epitop; i/ili CDR-u sklerostin vezujućeg sredstva koje se vezuje za epitop "derivat T20.6 (cistin-čvor 4 kraka)".
Polipeptidi i antitela sklerostin vezujućeg sredstva mogu imati aminokiselinske sekvence koje su najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične varijabilnom regionu najmanje jednog od antitela: At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At- 5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24, i unakrsno blokiraju vezivanje najmanje jednog od antitela: At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24 za sklerostin, i/ili im je vezivanje za sklerostin unakrsno blokirano pomoću najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24; i/ili mogu blokirati inhibitorno dejstvo sklerostina u testu mineralizacije na ćelijskoj osnovi (t.j., sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo); i/ili se vezuje za Petlja 2 epitop; i/ili se vezuju za T20.6 epitop; i/ili se vezuju za epitop "derivat T20.6 (cistin-čvor 4 kraka)".
Polinukleotidi koji kodiraju sklerostin vezujuća sredstva mogu imati polinukleotidne sekvence koje su najmanje 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične polinukleotidu koji kodira varijabilni region najmanje jednog od antitela: At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21; At-22, At-23 i At-24, i pri čemu kodirana sklerostin vezujuća sredstva unakrsno blokiraju vezivanje najmanje jednog od antitela: At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24 za sklerostin, i/ili im je vezivanje za sklerostin unakrsno blokirano od strane najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-C, At-D, At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-11, At-12, At-13, At-14, At-15, At-16, At-17, At-18, At-19, At-20, At-21, At-22, At-23 i At-24; i/ili mogu blokirati inhibitorno dejstvo sklerostina u testu mineralizacije na ćelijskoj osnovi (t.j., sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo); i/ili se vezuju za Petlja 2 epitop; i/ili se vezuju za T20.6 epitop; i/ili se vezuju za epitop "deruvat T20.6 (cistin-čvor 4 kraka)".
Antitela mogu imati afinitet vezivanja za humani sklerostin, koji je manji ili jednak 1 x 10<-7>M, manji ili jednak 1 x 10<-8>M, manji ilijednak 1 x 10<-9>M, manji ili jednak 1 x 10<-10>M, manji ili jednak 1 x 10<-11>M, ili manji ili jednak 1 x 10<-12>M.
Afinitet vezujućeg sredstva, kao što je antitelo ili partner u vezivanju, kao i stepen do koga vezujuće sredstvo (kao što je antitelo) inhibira vezivanje, lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti može utvrditi koristeći konvencionalne tehnike, na primer, one koje su opisali Scatchard i saradnici (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) ili posredstvom površinske plazmon rezonance (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Za površinsku plazmon rezonancu, cilnji molekuli su imobilisani na čvrstoj fazi i izloženi su ligandima u mobilnoj fazi, koja se kreće duž protočne ćelije. Ukoliko se odvija vezivanje liganda za ciljnu imobilisanu fazu, lokalni refraktivni indeks se menja, dovodeći do promene SPR ugla, što može biti praćeno u realnom vremenu detekcijom promena intenziteta reflektovanog svetla. Mogu biti ispitane brzine promene SPR signala, kako bi se dobile očigledne konstante brzine za asocijacijske i disocijacijske faze reakcije vezivanja. Odnos ovih vrednosti pruža očiglednu konstantu ravnoteže (afiniteta) (vidi, npr., Wolff et al., Cancer Res.53:2560-65 (1993)).
Antitelo u skladu sa tekućim pronalaskom može pripadati bilo kojoj klasi imunoglobulina, na primer IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA. Antitelo se može dobiti ili može poticati od životinje, na primer, živine (npr., pilići) i sisara, koji uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, miša, pacova, hrčka, zeca ili drugog glodara, kravu, konja, ovcu, kozu, kamilu, čoveka ili drugog primata. Anitelo može biti unutrašnje antitelo. Proizvodnja antitela je uopšteno prikazana u U.S. Patent Publication No.2004/0146888 A1.
Testovi karakterizacije
U prethodno opisanim postupcima za proizvodnju antitela, koji uključuju uvođenje CDR-a specifičnih At-A, At-B, At-C, At-D i Antitela 1-24 (At-1 do At-24) u nove kosture i/ili konstantne regione, raspoloživi su pogodni testovi za selekciju željenih vezujućih sredstava (t.j., testovi za određivanje afiniteta vezivanja za sklerostin; testovi unakrsnog blokiranja; "test kompetitivnog vezivanja za peptidni epitop humanog sklerostina" na Biacore-bazi; test na bazi ćelija MC3T3-E1; in vivo testovi).
Testovi vezivanja za epitop
Zreli oblik humanog sklerostina je glikoprotein sa 190 aminokiselina sa strukturom cistinskog čvora (Slike 8 i 9). Pored strukture cistinskog čvora, protein je naznačen posedovanjem tri petlje, koje su označene kao Petlja 1, Petlja 2 i Petlja 3. Humani sklerostin se podvrgava proteolitičkoj digestiji, da bi se proizveli fragmenti. Ukratko, korišćenjem različitih proteaza, koje obuhvataju tripsin, aspN i lysC, proizvedeni su fragmenti sa različitim položajima cepanja i veličinama. Utvrđene su
sekvence i masa raznih peptida humanog sklerostina. Procenjena je zaštita antitela, da bi se odredio uticaj na pristupačnost proteolizi, uključujući maskiranje pričvrćenog položaja i premeštanje peptida. Na kraju je izvršen "test kompetitivnog vezivanja za peptidni epitop humanog sklerostina" na BIAcore-bazi.
Izlaganje sklerostina cepanju pomoću tripsina imala je za posledicu obrazac peptidnih fragmenata, kako je sažeto prikazan na Slici 13. Fragmenti su označeni kao T19.2, T20, T20.6 i T21-22. Kako je šematski prikazano na na Slici 19B, epitop T20.6 je kompleks od četiri zasebne peptidne sekvence, koje su spojene pomoću tri disulfidne veze regiona cistinskog čvora. Dva peptida su povezana pomoću dve disulfidne veze. Ostala dva peptida su povezana uz pomoć jedne disulfidne veze koja, šematski, deli na dva dela prva dva polipeptida.
Epitop T20.6, koji je proizveden digestijom pomoću tripsina, zadržava strukturu cistinskog čvora nativnog polipeptida, a prepoznaju ga antitela At-C i At-D. Derivat epitopa T20.6 sastoji se od regiona cistinskog čvora i aminokiselina na položajima 58-64, 73-81, 112-117 i 138-141 u sekvenci u odnosu na SEQ ID NO:1. Ovaj derivat epitopa je prikazan na Slici 21. Epitop koji sadrži region cistinskog čvora može posedovati jednu ili više aminokiselina, koje su prisutne u epitopu T20.6 (Slika 19B), ali nisu prisutne u derivatu epitopa T20.6 (Slika 21).
Drugi region koji sadrži epitop je identifikovan u Petlja 2 regionu humanog sklerostina (Slika 19A), a prepoznat je od strane antitela At-A i At-B. Epitop Petlja 2 sadrži aminokiseline 86-111 SEQ ID NO:1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID NO:6). Sterički, u odnosu na sklerostin pune dužine SEQ ID NO:1, struktura koja sadrži Petlju 2 je definisana na jednom kraju disulfidnom vezom između cisteina na položaju 86 (C4) i cisteina na položaju 144 (C8), a na drugom kraju disulfidnom vezom između cisteina na položaju 111 (C5) i cisteina na položaju 57 (C1).
Peptidi, koji su proizvedeni cepanjem humanog sklerostina pomoću aspN-a prikazani su na Slici 12. Na Slici, ovi peptidi su označeni kao AspN14.6, AspN18.6 i AspN22.7-23.5, a ovde su, isto tako, označeni kao N14.6, N18.6, odnosno N22.7-23.5.
Jedna grupa antitela pokazuje specifičan obrazac vezivanja za određene epitope, kako je dokazano posredstvom "testa kompetitivnog vezivanja za peptidni epitop humanog sklerostina" na Biacore-bazi. Ukratko, antitelo se pre-inkubira sa epitopom koji se ispituje, u koncentracijama koje će zasititi epitop-vezujuće položaje na antitelu. Antitelo se, potom, izlaže sklerostinu, koji je vezan na površinu čipa. Nakon odgovarajuće inkubacije i postupaka ispiranja, uspostavlja se model kompetitivnog vezivanja. Kako je prikazano na Slici 18, primerno antitelo At-D, vezivalo se za molekule sklerostina, pričvršćene na površinu čipa. Preinkubacijom antitela At-D sa sklerostinom smanjilo se vezivanje antitela za sklerostin na čipu do blizu nule. Preinkubacija sa peptidom, koji je sačinjen od epitopa T19.2, pokazala je da T19.2 nije ulazio u kompeticiju sa sklerostinom za vezivanje antitela. Međutim, preinkubacijom sa bilo kojim od epitopa, koji su označeni sa T20, T20.6, T21-22 ili N22.7-23.5 ukinuta je velika srazmera vezivanja antitela za sklerostin na čipu. Suprotno tome, preinkubacijom antitela sa bilo kojim od epitopa, koji su označeni kao T19.2, N14.6 ili N18.6 nije ukinuta sposobnost antitela da se vezuje za sklerostin. Drugo primerno antitelo sa ovim profilom vezivanja (Slika 17) jeste At-C.
Antitelo At-D, prema tome, jeste primer i predstavnik grupe antitela koja se vezuju za epitope T20, T20.6, T21-22 i N22.7-23.5, a imaju minimalno detektibilno vezivanje za epitope T19.2, N14.6 i N18.6, kako je utvrđeno posredstvom sposobnosti da blokiraju vezivanje antitela za sklerostin. Antitela koja poseduju ovaj karakterističan obrazac vezivanja mogu ali ne moraju deliti aminokiselinsku sekvencu u jednom ili više regiona molekula antitela. Sličnost antitela je utvrđena funkcionalno, kao na primer, prema sposobnosti da se vezuju za sklerostin, nakon preinkubacije sa svakim od, prethodno opisanih, epitopa. Antitela koja ispoljavaju obrasce vezivanja slične ili identične onima koje ima antitelo At-D su obuhvaćena pronalaskom. Pod "sličnošću sa" podrazumeva se, na primer, da će antitelo pokazivati vezivanje za svaki od polipeptida T20, T20.6, T21-22 i N22.7-23.5, čime će ovo vezivanje ulaziti u specifičnu kompeticiju sa najmanje 50% vezivanja antitela za sklerostin, koje bi se odvijalo na drugačiji način u odsustvu preinkubacije sa sklerostinom ili peptidom sklerostina. Antitelo će, takođe, pokazivati malo ili nedetektibilno vezivanje za polipeptide T19.2, N14.6 i N18.6, što dovodi do smanjenja od 30% ili manje, vezivanja koje bi se odvijalo u odsustvu preinkubacije sa sklerostinom ili peptidom sklerostina.
Na primer, ne vezujući se za određeni mehanizam, obrazac vezivanja antitela sa Slike 18 sugeriše da je prostor epitopa za koji se vezuje antitelo At-D i druga antitela koja poseduju obrazac vezivanja za epitop antitela At-D, sačinjen od polipeptida koji sadrži region cistinskog čvora sklerostina.
Stoga, kao što je izloženo ovde, a vezano za Sliku 19B, primerni epitop T20.6 sadrži četiri peptidna lanca vezana preko tri zasebne disulfidne veze. Peptidni lanac SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID NO:3) je povezan na peptidni lanac LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO:5) disulfidnim vezama od C3 do C7, i od C4 do C8. Peptidni lanac DVSEYSC1RELHFTR (SEQ ID NO:2) je vezan za peptidni lanac WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ ID NO:4) pomoću disulfidne veze od C1 do C5. Polipeptidi SEQ ID NO:3 i 5 ostaju uduženi sa polipeptidima SEQ ID NO:2 i 4 preko steričke konstrukcije, pri čemu veza C1-C5 prelazi površinu veza C4-C8 i C3-C7 i locirana je između njih, kako je ilustrativno prikazano na Slici 19B.
Kako je prikazano ovde, a u odnosu na Sliku 21, primerni derivat epitopa T20.6 sadrži četiri peptidna lanca vezana preko tri zasebne disulfidne veze. Peptidni lanac SAKPVTELVC3 SGQC4 (SEQ ID NO:70) je vezan za peptidni lanac LVASC7KC8 (SEQ ID NO:71) posredstvom disulfidnih veza od C3 do C7, i od C4 do C8. Peptidni lanac C1RELHFTR (SEQ ID NO:72) je vezan za peptidni lanac C5IPDRYR (SEQ ID NO:73) preko disulfidne veze od C1 do C5. Polipeptidi SEQ ID-NO:70 i 71 ostaju udruženi sa polipeptidima SEQ ID NO:72 i 73 preko steričke konstrukcije, pri čemu veza C1-C5 prelazi površinu veza C4-C8 i C3-C7 i locirana je između njih, kako je ilustrativno prikazano na Slici 21.
Antitelo At-A jeste primer i predstavnik druge grupe antitela koja poseduju karakteristični obrazac vezivanja za peptide humanog sklerostina, koji se razlikuje od onog dobijenog za antitela At-C i At-D. At-A i grupa antitela koju ono predstavlja vezuju se za epitop N22.7-23.5 i imaju minimalno detektibilno vezivanje za epitope T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 ili N18.6, kako je utvrđeno prema sposobnosti da blokiraju vezivanje antitela za sklerostin (Slika 15). Drugo primerno antitelo sa ovim profilom vezivanja (Slika 16) jeste At-B. Antitela koja poseduju ovaj karakterističan obrazac vezivanja mogu ali ne moraju deliti aminokiselinsku sekvencu u jednom ili više regiona molekula antitela. Sličnost antitela je utvrđena funkcionalno, kao na primer prema
sposobnosti da se vezuju za sklerostin, nakon preinkubacije sa svakim od, prethodno opisanih, epitopa. Antitela mogu ispoljavati obrasce vezivanja slične ili identične onima koje ima antitelo At-A. Pod "sličnošću sa" podrazumeva se, na primer, da će antitelo pokazivati vezivanje za polipeptid N22.7-23.5 pri čemu će ovo vezivanje ulaziti u specifičnu kompeticiju sa najmanje 50% vezivanja antitela za sklerostin, koje bi se odvijalo na drugačiji način u odsustvu preinkubacije sa sklerostinom ili peptidom sklerostina. Antitelo će, takođe, pokazivati malo ili nedetektibilno vezivanje za polipeptide T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 i N18.6, što dovodi do smanjenja od 30% ili manje, vezivanja koje bi se odvijalo u odsustvu preinkubacije sa sklerostinom ili peptidom sklerostina.
Na primer, ne vezujući se za određeni mehanizam, obrazac vezivanja antitela sa Slike 15 sugeriše da je prostor epitopa za koji se vezuje antitelo At-A i druga antitela koja poseduju obrazac vezivanja epitopa antitela At-A, sačinjen od polipeptida koji sadrži Petlja 2 region sklerostina. Tako, kako je izloženo ovde, a vezano za Sliku 19A, Petlja 2 region se može opisati kao linearni peptid, ali on dobija tercijarnu strukturu kada je prisutan u nativnom sklerostinu ili delu sklerostina koji sadrži cistinski čvor, u kome je održana nativna struktura disulfidne veze. Linearna ili tercijarna struktura Petlja 2 epitopa može uticati na vezivanje antitela za njega, kako je razmotreno u Primerima. Petlja 2 region može sadržavati sledeću aminokiselinsku sekvencu: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID NO:6). "C4" se odnosi na ostatak cisteina, koji se nalazi na položaju 86 u odnosu na SEQ ID NO:1. "C5" se odnosi na ostatak cisteina, koji se nalazi na položaju 111 u odnosu na SEQ ID NO:1. U nativnom proteinu sklerostina, C4 je vezan za cistein na položaju 144 (C8) posredstvom disulfidne veze, a C5 je vezan za cistein na položaju 57 (C1) preko disulfidne veze. Epitopi, dobijeni iz Petlja 2 regiona uključuju CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO:63); GPARLLPNAIGRGKWWRPSG (SEQ ID NO:64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO:65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO:66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO:67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO:68) i LPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:69).
TESTOVI UNAKRSNOG BLOKIRANJA
Izrazi "unakrsna blokada", "unakrsno blokiran" i "unakrsno blokiranje" ovde su korišćeni kao zamena jedan drugom, da bi označavali sposobnost antitela ili drugog vezujućeg sredstva da interferira sa vezivanjem drugih antitela ili drugih vezujućih sredstava za sklerostin.
Stepen do kog je antitelo ili drugo vezujuće sredstvo u stanju da interferira sa vezivanjem drugog antitela za sklerostin, i, sledstveno tome, da li se to može nazvati unakrsnim blokiranjem, može se utvrditi korišćenjem kompetitivnih testova vezivanja. Jedan posebno pogodan kvantitativni test koristi Biacore mašinu, koja može izmeriti stepen interakcija koristeći tehnologiju površinske plazmon rezonance. Drugi pogodan kvantiativni test unakrsnog blokiranja koristi pristup na bazi ELISA-testa, da bi se utvrdila kompeticija između antitela ili drugih vezujućih sredstava posredstvom njihovog vezivanja za sklerostin.
BIACORE TEST UNAKRSNOG BLOKIRANJA
Tekst koji sledi uopšteno opisuje pogodan Biacore test za utvrđivanje da li antitelo ili drugo vezujuće sredstvo vrši unakrsno blokiranje ili je u stanju da unakrsno blokira. Iz praktičnih razloga, poređenje je napravljeno sa dva antitela, ali shvatiće se da se test može izvesti sa bilo kojim od sklerostin vezujućih sredstava koja su ovde opisana. Biacore mašinom (na primer, Biacore 3000) se rukuje u skladu sa preporukama proizvođača.
Tako je u jednom testu unakrsnog blokiranja, sklerostin kuplovan na CM5 Biacore čip, korišćenjem standardnih hemijskih postupaka kuplovanja amina, da bi se proizvela površina presvučena sklerostinom. Obično bi se 200-800 rezonantnih jedinica sklerostina kuplovalo na čip (količina koja pruža lako merljive nivoe vezivanja, koji se lako mogu zasititi koncentracijama test reagensa koji su korišćeni).
Dva antitela (označena sa A* i B*) kojima se određuje sposobnost da unakrsno blokiraju jedan drugoga su pomešana u molarnom odnosu vezujućih položaja jedan prema jedan, u pogodnom puferu, da bi se dobila test mešavina. Kada se
izračunavaju koncentracije na bazi položaja vezivanja, uzima se da je molekulska težina antitela ukupna molekulska težina antitela podeljena brojem sklerostin vezujućih položaja na antitelu.
Koncentracija svakog antitela u test mešavini bi bila dovoljno velika da se lako zasite vezujući položaji za to antitelo na molekulima sklerostina koji su vezani na Biacore čip. Antitela u mešavini su u istoj molarnoj koncentraciji (na bazi vezivanja), a ta koncentracija bi obično bila između 1.00 i 1.5 mikromola (na bazi vezujućih položaja).
Takođe su pripremljeni posebni rastvori koji sadrže samo antitelo A* i samo antitelo B*. Antitelo A* i antitelo B* u ovim rastvorima bi bili u istom puferu i u istoj koncentraciji kao u test mešavini.
Test mešavina se propušta preko Biacore čipa presvučenog sklerostinom i beleži se ukupna količina vezivanja. Čip se, zatim, obrađuje na takav način da se uklanjaju vezana antitela bez oštećivanja čipa sa presvučenim sklerotinom. Ovo se obično izvodi obradom čipa sa 30 mM HCl, tokom 60 sekundi.
Rastvor sa samim antitelom A* se, nakon toga, propušta preko površine presvučene sklerostinom i beleži se količina vezivanja. Čip se, ponovno, obrađuje, kako bi se odstranila sva vezana antitela bez oštećivanja čipa sa presvučenim sklerostinom.
Rastvor sa samim antitelom B* se, nakon toga, propušta preko površine presvučene sklerostinom i beleži se količina vezivanja.
Nakon toga se izračunava maksimalno teoretsko vezivanje mešavine antitela A* i antitela B*, a to je zbir vezivanja svakog antitela kada se propušta preko površine sklerostina samo. Ukoliko je trenutno zabeleženo vezivanje mešavine manje od ovog teoretskog maksimuma, tada dva antitela unakrsno blokiraju jedno drugo.
Stoga, uopšteno, unakrsno blokirajuće antitelo ili drugo vezujuće sredstvo jeste ono koje će se vezivati za sklerostin u prethodnom Biacore testu unakrsnog blokiranja, tako da je tokom testa i u prisustvu drugog antitela ili drugog vezujućeg sredstva prema izlaganju zabeleženo vezivanje između 80% i 0.1% (npr., 80% do 4%) maksimalnog teoretskog vezivanja, određenije između 75% i 0.1% (npr., 75% do 4%) maksimalnog teoretskog vezivanja, a još određenije između 70% i 0.1% (npr., 70% do 4%) maksimalnog teoretskog vezivanja (kako je neposredno iznad definisano) dva antitela ili vezujuća sredstva u kombinaciji.
Prethodno opisani Biacore test je prvenstveno test koji se koristi da bi se odredilo da li antitela ili druga vezujuća sredstva unakrsno blokiraju jedan drugoga. U retkim slučajevima, određena antitela ili druga vezujuća sredstva se ne moraju vezivati za sklerostin, kuplovan posredstvom hemije amina na CM5 Biacore čip (ovo se obično dešava kada je relevantni vezujući položaj na sklerostinu maskiran ili uništen kuplovanjem na čip). U takvim slučajevima, unakrsno blokiranje se može utvrditi korišćenjem verzije sklerostina sa priključenim delovima, na primer sklerostina sa N- terminalnim His priveskom (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA; 2005 kat# 1406- ST-025). U ovom posebnom formatu, anti-His antitelo bi bilo kuplovano na Biacore čip, a nakon toga bi sklerostin sa Hispriveskom bio propuštan preko površine čipa i bio prihvaćen od strane anti-His antitela. Analiza unakrsnog blokiranja bi se izvodila u suštini kao što je prethodno opisano, s izuzetkom što bi nakon svakog ciklusa regeneracije čipa, novi sklerostin sa His-priveskom ponovno bio nanesen na površinu presvučenu anti-His antitelom. Pored datog primera uz upotrebu sklerostina sa N- terminalnim His-priveskom, alternativno bi se mogao koristiti sklerostin sa C- terminalnim His-priveskom. Dalje, razni drugi privesci i kombinacije privesaka sa vezujućim proteinom, koji su poznati u struci, mogli bi biti korišćeni za takve analize unakrsnog blokiranja (npr., HA privesak sa anti-HA antitelima; FLAG privesak sa anti- FLAG antitelima; biotin privesak sa streptavidinom).
TEST UNAKRSNOG BLOKIRANJA NA BAZI ELISA-TESTA
Sledeći tekst uopšteno opisuje ELISA test za utvrđivanje da li anti-sklerostin antitelo ili drugo sklerostin-vezujuće sredstvo unakrsno blokira ili je u stanju da unakrsno blokira. Iz praktičnih razloga, podaci se odnose na dva antitela (At-X i At-Y) ali shvatiće se da se test može izvesti sa bilo kojim od sklerostin vezujućih sredstava koja su ovde opisana.
Opšti princip testa jeste da su reakcione čašice ELISA ploče presvučene antisklerostin antitelom. Količina u višku drugog, potencijalno unakrsno blokirajućeg antisklerostin antitela se dodaje u rastvoru (t.j., nije vezana na ELISA ploču). Zatim se u reakcione čašice dodaje ograničena količina sklerostina. Antitelo kojim je presvučena ploča i antitelo u rastvoru ulaze u kompeticiju za vezivanje ograničenog broja molekula sklerostina. Ploča se ispire kako bi se odstranio sklerostin koji nije vezan od strane antitela kojim je presvučena ploča, i, isto tako, da bi se uklonilo drugo antitelo iz faze rastvora, kao i bilo kakvi kompleksi koji se obrazuju između drugog antitela iz faze rastvora i sklerostina. Količina vezanog sklerostina se, potom, određuje, korišćenjem odgovarajućeg reagensa za detekciju sklerostina. Antitelo u rastvoru, koje je u stanju da unakrsno blokira antitelo kojim je presvučena ploča, moći će da izazove smanjenje broja molekula sklerostina koje presvučeno antitelo može da veže u odnosu na broj molekula sklerostina koje vezano antitelo, kojim je ploča presvučena, može da vezuje u odsustvu drugog antitela iz faze rastvora.
Ovaj test je mnogo detaljnije opisan u nastavku za At-X i At-Y. U slučaju kada je antitelo At-X odabrano da bude imobilisano antitelo, njime su presvučene čašice ELISA ploče, nakon čega su ploče blokirane pogodnim rastvorom za blokiranje, kako bi se na minimum svelo nespecifično vezivanje reagenasa koji se nakon toga dodaju. Zatim je količina u višku antitela At-Y dodata na ELISA ploču, tako da su molovi At-Y vezujućih položaja za sklerostin po reakcionoj čašici najmanje 10 puta veći od molova At-X sklerostin vezujućih položaja po reakcionoj čašici, koji su korišćeni tokom oblaganja ELISA ploče. Potom se dodaje sklerostin na takav način da su molovi sklerostina dodatog po reakcionoj čašici najmanje 25-puta manji od molova At-X vezujućih položaja za sklerostin, koji su korišćeni za oblaganje svake reakcione čašice. Nakon odgovarajućeg inkubacionog perioda, ELISA ploča je isprana i dodat je reagens za detekciju sklerostina, da bi se odredila količina sklerostina, koji je specifično vezan od strane anti-sklerostin antitela kojim je presvučena ploča (u ovom slučaju At-X). Pozadinski signal za test definiše se kao signal, koji se dobija u reakcionim čašicama sa presvučenim antitelom (u ovom slučaju At-X), drugim antitelom iz faze rastvora (u ovom slučaju At-Y), samim sklerostin puferom (t.j., bez sklerostina) i reagensima za detekciju sklerostina. Signal pozitivne kontrole za test definiše se kao signal, koji se dobija u reakcionim čašicama sa presvučenim antitelom (u ovom slučaju At-X), samim puferom za drugo antitelo iz faze rastvora (t.j., bez drugog antitela iz faze rastvora), sklerostinom i reagensima za detekciju sklerostina. Zahtevi za izvođenje ELISA test su da signal pozitivne kontrole bude najmanje 6 puta veći od pozadinskog signala.
Da bi se izbegli bilo kakvi artefakti (npr., značajne razlike u afinitetima za sklerostin između At-X i At-Y), koji se javljaju pri izboru koje antitelo da se koristi kao antitelo za presvlačenje ploče, a koje da se koristi kao drugo (kompetitivno) antitelo, neophodno je da se test unakrsnog blokiranja izvodi u dva formata:
1) format 1 je kada je At-X antitelo kojim je presvučena ELISA ploča, a At-Y je kompetitivno antitelo koje je u rastvoru
i
2) format 2 je kada je At-Y antitelo kojim je presvučena ELISA ploča, a At-X je kompetitivno antitelo koje je u rastvoru.
At-X i At-Y se definišu kao unakrsno blokirajuća antitela ukoliko je, ili u formatu 1 ili u formatu 2, anti-sklerostin antitelo iz faze rastvora u stanju da izazove redukciju između 60% i 100%, specifično između 70% i 100%, a još određenije između 80% i 100%, signala za detekciju sklerostina (t.j., količine sklerostina koja je vezana od strane antitela kojim je presvučena ploča) u poređenju sa signalom za detekciju sklerostina, koji se dobija u odsustvu anti-sklerostin antitela iz faze rastvora (t.j., reakcionih čašica sa pozitivnom kontrolom).
Primer takvog testa unakrsnog blokiranja na bazi ELISA-testa može se naći u Primeru 7 ("test unakrsnog blokiranja na bazi ELISA-testa").
TEST NEUTRALIZACIJE NA ĆELIJSKOJ OSNOVI
Mineralizacija posredstvom ćelija osteoblastnog porekla u kulturi, ili primarnih ćelija ili ćelijskih nizova, korišćena je kao in vitro model formiranja kosti. Mineralizaciji je potrebno od oko jedne do šest nedelja za odvijanje, počevši sa indukcijom diferencijacije ćelija osteoblastnog porekla uz pomoć jednog ili više sredstava za diferencijaciju. Celokupan sled dešavanja obuhvata: ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju, proizvodnju ekstracelularnog matriksa, sazrevanje matriksa i završno deponovanje minerala, koje se odnosi na kristalizaciju i/ili taloženje kalcijum fosfata. Ovaj sled dešavanja, koji započinje ćelijskom proliferacijom i diferencijacijom, a
završava deponovanjem minerala, naziva se mineralizacija. Merenje kalcijuma (minerala) predstavlja rezultat testa.
MC3T3-E1 ćelije (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S.
1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol.96:191-198) i supklonovi originalnog ćelijskog niza mogu u kulturi obrazovati mineral ako rastu u prisustvu sredstava za diferencijaciju. Takvi supklonovi uključuju MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275:19992-20001). U slučaju supklona MC3T3-E1-BF, kao i originalnih MC3T3-E1 ćelija, sklerostin može inhibirati jedan ili više od niza dešavanja koje dovode do i uključuju deponovanje minerala (t.j., sklerostin inhibira mineralizaciju). Anti-sklerostin antitela, koja mogu neutralisati inhibitornu aktivnost sklerostina, omogućuju mineralizaciju kulture u prisustvu sklerostina, tako da postoji statistički značajno povećanje deponovanja kalcijum fosfata (merenog kao kalcijum) u poređenju sa količinom kalcijuma koja je izmerena u tretman grupi sa samim sklerostinom (t.j., bez antitela). Antitela, korišćena u eksperimentima testa mineralizacije na ćelijskoj osnovi, koja su prikazana na Slikama 22, 23 i 24 imaju molekulske težine od oko 145 Kd i imaju 2 vezujuća položaja za sklerostin po molekulu antitela.
Kada se test izvodi sa ciljem utvrđivanja da li pojedino anti-sklerostin antitelo ili anti-sklerostin vezujuće sredstvo može da neutrališe sklerostin (tj., da li je to sklerostinneutrališuće antitelo ili njegov derivat ili, da li je to sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo), neophodno je da količina sklerostina koja se koristi u testu bude minimalna količina sklerostina koja izaziva najmanje 70%-tno, statistički značajno smanjenje deponovanja kalcijum fosfata (merenog kao kalcijum) u grupi tretiranoj samim sklerostinom, u poređenju sa količinom kalcijuma, koja je izmerena u grupi bez sklerostina. Anti-sklerostin neutrališuće antitelo ili anti-sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo se definiše kao ono antitelo koje izaziva statistički značajno povećanje deponovanja kalcijum fosfata (merenog kao kalcijum) u poređenju sa količinom kalcijuma, koja je izmerena u tretman grupi sa samim sklerostinom (t.j., bez antitela, bez vezujućeg sredstva). Da bi se utvrdilo da li je anti-sklerostin antitelo ili anti-sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo neutrališuće ili ne, potrebno je da količina anti-sklerostin
antitela ili anti-sklerostin neutrališućeg vezujućeg sredstva, korišćena u testu, bude takva da postoji višak molova sklerostin vezujućih položaja po reakcionom položaju u poređenju sa brojem molova sklerostina po reakcionom položaju. U zavisnosti od jačine antitela, višak koji se može zahtevati može biti 24, 18, 12, 6, 3 ili 1.5 puta veći, a stručnom licu je bliska rutinska praksa izvođenja testa više nego sama koncentracija vezujućeg sredstva. Na primer, veoma moćno anti-sklerostin neutrališuće antitelo ili anti- sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo će biti u stanju da neutrališe sklerostin čak i kada je višak molova sklerostin vezujućih položaja po reakcionom položaju manji od 6 puta u poređenju sa brojem molova sklerostina po reakcionom položaju. Manje snažno anti-sklerostin neutrališuće antitelo ili anti-sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo će moći da neutrališe sklerostin samo pri višku od 12, 18 ili 24 puta. Sklerostinska vezujuća sredstva unutar ovog punog raspona jačine pogodna su kao neutrališuća sklerostinska vezujuća sredstva. Primeri testova mineralizacije na ćelijskoj osnovi detaljno su opisani u Primeru 8.
Anti-sklerostin antitela i njihovi derivati, koja mogu neutralisati humani sklerostin i sklerostin-vezujuća sredstva koja mogu neutralisati humani sklerostin mogu biti od koristi u lečenju stanja/poremećaja kod ljudi, koji su uzrokovani, povezani sa, ili su posledica najmanje jednog od sledećih: slabo formiranje kosti, mala mineralna gustina kosti, slab mineralni sadržaj kosti, mala koštana masa, slab kvalitet kosti i slaba jačina kosti.
IN VIVO TEST NEUTRALIZACIJE
Povećanje raznih parametara koji su povezani sa ili su posledica stimulacije formiranja nove kosti može se utvrditi kao rezultat in vivo ispitivanja sklerostinskih vezujućih sredstava, kako bi se identifikovala ona vezujuća sredstva koja mogu neutralisati sklerostin, pa su, sledstveno tome, u stanju da izazovu stimulaciju formiranje nove kosti. Takvi parametri obuhvataju razne serumske anaboličke markere [npr., osteokalcin, P1NP (n-terminalni propeptid tipa 1 prokolagen)], histomorfometrijske markere formiranja kosti (npr., površina osteoblasta/površina kosti; brzina formiranja kosti/površina kosti; trabekularna debljina), mineralnu gustinu kosti, mineralni sadržaj
kosti, koštanu masu, kvalitet kosti i jačinu kosti. Sklerostin neutrališuće vezujuće sredstvo se definiše kao ono antitelo koje može da izazove statistički značajno povećanje, u poređenju sa životinjama koje su tretirane vehikulumom, bilo kog parametra, koji je povezan sa, ili je posledica stimulacije formiranja nove kosti. Takvo in vivo ispitivanje može se izvršiti na bilo kom pogodnom sisaru (npr., miš, pacov, majmun). Primer takvog in vivo ispitivanja može se naći u Primeru 5 ("In vivo testiranje anti-sklerostin monoklonskih antitela").
Premda aminokiselinska sekvenca sklerostina nije 100% identična kod raznih vrsta sisara (npr., mišji sklerostin nije 100% identičan humanom sklerostinu), stručnjak u ovoj oblasti će proceniti da sklerostinsko vezujuće sredstvo koje može neutralisati, in vivo, sklerostin određenih vrsta (npr., miša), i koje, takođe, može vezivati humani sklerostin in vitro, vrlo verovatno može da neutrališe i humani sklerostin in vivo. Tako, takvo sklerostin vezujuće sredstvo (npr., anti-humani sklerostin antitelo) mogu biti od koristi za lečenje stanja/poremećaja kod ljudi, koji su uzrokovani, povezani sa, ili su posledica najmanje jednog od sledećih: slabo formiranje kosti, mala mineralna gustina kosti, slab mineralni sadržaj kosti, mala koštana masa, slab kvalitet kosti i slaba jačina kosti. Miševi, kod kojih je homologna rekombinacija korišćena da bi se uklonio mišji gen za sklerostin, a na njegovo mesto je umetnut humani gen za sklerostin (t.j., humani sklerostin gen umetnut u miševe ili humani SOST umetnut u miševe) bili bi primer dodatnog in vivo sistema.
Obezbeđene su farmaceutske smeše koje sadrže jedno od gore opisanih vazujućih sredstava kao što su bar jedno antitelo At-A, At-B, At-C, At-D i At-1 do At-24 za humani sklerostin, zajedno sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim nosačem, podlogom ili diluentom. Farmaceutske smeše i postupci lečenja izloženi su u prijavi koja je u toku serijskog broja 10/868,497, koja je podneta 16. juna 2004., koja zahteva prioritet u odnosu na serijski broj 60/478,977.
Razvoj pogodnih režima doziranja i tretmana za korišćenje pojedinih smeša, koje su ovde opisane, u brojnim režimima lečenja, uključujući npr., supkutanu, oralnu, parenteralnu, intravensku, intranazalnu i intramuskularnu primenu i formulaciju, dobro je poznat u struci, pri čemu su neki od njih ukratko razmotreni u nastavku kod opštih sadržaja ilustracije.
U određenim aplikacijama, ovde izložene farmaceutske smeše mogu biti oslobođene posredstvom oralne primene životinji. Kao takve, ove smeše mogu biti formulisane sa inertnim razblaživačem ili jestivim prilagodljivim nosačem, ili one mogu biti zatvorene u želatinskoj kapsuli tvrde ili meke opne, ili mogu biti kompresovane u tablete, ili se mogu uključiti direktno sa obrocima ishrane.
U određenim okolnostima, može biti poželjno da se farmaceutske smeše, koje su ovde prikazane, oslobađaju supkutano, parenteralno, intravenski, intramuskularno ili, čak, intraperitonealno. Takvi pristupi su dobro poznati stručnjaku, a neki od njih su dalje opisani, na primer, u U.S. Patentu No.5,543,158; U.S. Patentu No.5,641,515 i U.S. Patentu No. 5,399,363. Rastvori aktivnih jedinjenja u vidu slobodne baze ili farmakološki prihvatljivih soli, mogu biti pripremljeni u vodi, pogodno pomešani sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Takođe mogu biti pripremljene disperzije u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim mešavinama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i korišćenja, ovi preparati će uopšteno sadržavati konzervans da bi se sprečio rast mikroorganizama.
Ilustrativni farmaceutski oblici pogodni za injekciono korišćenje uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ex tempore pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija (na primer, vidi U.S. Patent No. 5,466,468). U svim slučajevima, forma mora biti sterilna i mora biti tečna do tog stepena da se može lako ubrizgati. Mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminacijskog delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarački ili disperzivni medijum, koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne mešavine i/ili biljna ulja. Mora se održavati odgovarajuća fluidnost, na primer, korišćenjem omotača, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestie u slučaju disperzije i/ili korišćenjem surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može se olakšati raznim antibakterijskim i protugljivičnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i sličnim. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih smeša može se omogućiti korišćenjem u smešama sredstava za odlaganje apsorpcije, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, rastvor bi bio pogodno puferisan ako je to potrebno, a tečni razblaživač bi najpre trebao biti učinjen izotoničnim sa dovoljno slanog rastvora ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramuskularnu, supkutanu i intraperitonealnu primenu. S obzirom na navedeno, sterilni vodeni medijum koji se može koristiti, biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu tekućeg izlaganja. Na primer, jedna dozaža može biti rastvorena u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i dodata u 1000 ml hipodermoklizne tečnosti ili injicirana na mesto planirano za infuziju (vidi, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15. izdanje, pp.1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju će se neizbežno dešavati u zavisnosti od stanja ispitanika koji se leči. Pored toga, za primenu ljudima, preparati će naravno prvenstveno zadovoljavati standarde sterilnosti, pirogeničnosti i opšte bezbednosti i čistoće, kako se to zahteva prema standardima FDA Office of Biologics.
Ovde izložene smeše mogu biti formulisane u neutralnom ili slanom obliku. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (obrazuju se sa slobodnim amino grupama proteina) i one koje se obrazuju sa neorganskim kiselinama, kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama kao što je sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slične kiseline. Soli koje se obrazuju sa slobodnim karboksilnim grupama, takođe mogu biti dobijene iz neorganskih baza, kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi, i organskih baza, kao što su, izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slični. Posle formulisanja, rastvori će se primenjivati tako da budu kompatibilni sa formulacijom dozaže i u količini koja je terapeutski delotvorna.
Nosači dalje mogu sadržavati bilo koje i sve rastvarače, disperzivne medijume, vehikulume, omotače, razblaživače, antibakterijske i protugljivične agense, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, pufere, nosive rastvore, suspenzije, koloide i slične. Korišćenje takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznato u struci. S izuzetkom u slučajevima kada je bilo koji od konvencionalnih medijuma ili sredstava inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegovo korišćenje u terapeutskim smešama je razmotreno. Suplementarni aktivni sastojci takođe mogu biti uključeni u smeše. Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na molekulske entitete i smeše koji ne proizvode alergijske ili slične nepovoljne reakcije kada se primenjuju ljudima.
Lipozomi, nanokapsule, mikročestice, lipidne čestice, vezikule i slično, mogu biti korišćeni za uvođenje smeša ovde izloženih u pogodne domaćinske ćelije/organizme. Određenije, smeše mogu biti formulisane kako bi se oslobađale inkapsulirane u lipidnoj čestici, liposomu, vezikuli, nanosferi ili nanočestici ili sličnom. Alternativno, smeše mogu biti vezane, ili kovalentno ili ne-kovalentno, za površinu takvih nosivih vehikuluma.
Formiranje i upotreba liposoma i preparata sličnih liposomu kao potencijalnih nosača leka uopšteno su poznati stručnjacima u ovoj oblasti (vidi na primer, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol.35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.
12(2-3):233-61, 1995; U.S. Patent No.5,567,434; U.S. Patent No.5,552,157; U.S. Patent No. 5,565,213; U.S. Patent No.5,738,868 i U.S. Patent No.
5,795,587). Ne čini se da je korišćenje liposoma povezano sa autoimunim odgovorima ili neprihvatljivom toksičnošću nakon sistemskog oslobađanja. Liposomi mogu biti obrazovani iz fosfolipida, koji se raspršuju u vodenom medijumu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (koje se, takođe, nazivaju multilamelarne vezikule (MLV)).
Alternativno, izložene su farmaceutski prihvatljive nanokapsularne formulacije ovde izloženih kompozicija. Nanokapsule mogu uopšteno obuhvatiti jedinjenja na stabilan i reproducibilan način (vidi, na primer, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm.
24(12):1113-28, 1998). Da bi se izbegli sporedni efekti zbog intraćelijskog preopterećenja polimerima,
takve ultrafine čestice (veličine oko 0.1 ∞m) mogu biti dizajnirane korišćenjem polimera, koji se mogu razgraditi in vivo. Takve čestice mogu biti izrađene kako je opisano, na primer u Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.5(1):1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm.45(2):149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998; i U.S. Patentu No.5,145,684.
Pored toga, farmaceutske smeše mogu biti stavljene unutar kontejnera zajedno sa zapakovanim materijalom, koji pruža uputstva koja se odnose na korišćenje takvih farmaceutskih smeša. Uopšteno, takva uputstva će uključiti jasan prikaz koji daje opis koncentracije reagensa, kao i u okviru određenih aspekata, relativne količine sastojaka ekscipijenata ili razblaživača (npr., vode, slanog rastvora ili PBS), koji mogu biti neophodni za rekonstitusanje farmaceutske smeše.
Primenjena doza se može kretati u rasponu od 0.01 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine. Kao što će stručnjaku u ovoj oblasti biti očigledno, količina i učestalost primene zavisiće, naravno, od faktora kao što su priroda i ozbiljnost indikacije koja se leči, željeni odgovor, stanje pacijenta i tako dalje. Uobičajeno, smeše se mogu primenjivati brojnim postupcima, kako su prethodno navedeni.
Povećanje mineralnog sadržaja kosti i/ili mineralne gustine kosti može se utvrditi direktno korišćenjem X-zraka (npr., Dual Energy X-ray Absorptometry ili "DEXA"), ili izvođenjem zaključaka posredstvom merenja 1) markera formiranja kosti i/ili aktivnosti osteoblasta, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, alkalna fosfataza specifična za osteoblaste, osteokalcin, propeptid tipa 1 prokolagena C’ (PICP), ukupna alkalna fosfataza (vidi Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243(1995)) i N-terminalni propeptid serumskog prokolagena 1 (P1NP) i/ili 2) markera resorpcije kosti i/ili aktivnosti osteoklasta, koji uključuju, ali ne ograničavajući se njima, piridinolin, deoksipriridinolin, N-telopeptid, urinarni hidroksiprolin, plazmatske kisele fosfataze rezistentne na tartarat i galaktozil hidroksilizin; (vidi Comier, id), serumski TRAP 5b (5b izoforma tartaratrezistentne kisele fosfataze) i serumski unakrsno povezani C-telopeptid (sCTXI). Količina koštane mase takođe se može izračunati iz telesnih težina ili korišćenjem drugih postupaka (vidi Guinness-Hey, MetAt. Bone Dis. Relat. Res.5:177- 181, 1984). Životinje i određeni životinjski modeli koriste se u struci za ispitivanje dejstva ovde izloženih smeša i postupaka, na primer, parametre gubitka kosti, resorpcije
kosti, formiranja kosti, jačine kosti ili mineralizacije kosti, koji oponašaju stanja bolesti čoveka, kao što su osteoporoza i osteopenije. Primeri takvih modela uključuju model pacova sa ovariektomijom (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15:175-192 (1991); Frost, H.M. i Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoponosis. Bone and Mineral 18:227-236 (1992) i Jee, W.S.S. i Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact.1:193-207 (2001)).
Naročita stanja koja se mogu lečiti izloženim smešama obuhvataju displazije, u kojima je rast ili razvoj kosti abnormalan i širok je varijetet uzroka ostepenije, osteoporoze i gubitka kosti. Reprezentativni primeri takvih stanja uključuju: ahondroplaziju, kleidokranijalnu disostozu, enhondromatozu, fibroznu displaziju, Gaucherovu bolest, hipofosfatemijski rahitis, Marfanov sindrom, multiple hereditarne egzostoze, neurofibromatozu, osteogenesis imperfecta, osteopetrozu, osteopoikilozu, sklerotske lezije, pseudoartrozu i pijogeni osteomijelitis, periodontalnu bolest, gubitak kosti indukovan antiepileptičnim lekovima, primarni i sekundarni hiperparatiroidizam, familijarne hiperparatiroidne sindrome, gubitak kosti indukovan bestežinskim stanjem, osteoporozu kod muškaraca, gubitak kosti u postmenopauzi, osteoartritis, renalnu osteodistrofiju, infiltrativne poremećaje kosti, gubitak oralne kosti, osteonekrozu vilice, juvenilnu Pagetovu bolesti, meloreostozu, metaboličke koštane bolesti, mastocitozu, anemiju/bolest srpastih ćelija, gubitak kosti povezan sa transplantacijom organa, gubitak kosti povezan sa translantacijom bubrega, sistemski lupus eritematozus, ankilozirajući spondilitis, epilepsiju, juvenilni artritis, talasemiju, mukopolisaharidozu, Fabrijevu bolest, Turnerov sindrom, Downov sindrom, Klinefelterov sindrom, gubu, Perthesovu bolest, adolescentnu idiopatsku skoliozu, multisistemsku inflamatornu bolest s početkom u detinjstvu, sindrom Winchester, Menkesovu bolest, Wilsonovu bolest, ishemijsku bolest kosti (kao što je Legg-Calve- Perthesova bolest, regionalna migratorna osteoporoza), anemična stanja, stanja izazvana steroidima, gubitak kosti indukovan glukokortikoidima, gubitak kosti indukovan heparinom, poremećaje koštane srži, skorbut, malnutriciju, deficijenciju kalcijuma, idiopatsku osteopeniju ili osteoporozu, kongenitalnu osteopeniju ili osteoporozu, alkoholizam, hroničnu bolest jetre, stanje posle menopauze, hronična inflamatorna stanja, reumatoidni artritis, inflamatornu bolest creva, ulcerozni kolitis, inflamatorni kolitis,
Crohnovu bolest, oligomenoreju, amenoreju, trudnoću, šećernu bolest, hipertireozu, poremećaje štitne žlezde, paratiroidne poremećaje, Cushingovu bolest, akromegaliju, hipogonadizam, imobilizaciju ili nekretanje, sindrom refleksne simpatičke distrofije, regionalnu osteoporozu, osteomalaciju, gubitak kosti povezan sa zamenom zgloba, gubitak kosti povezan sa HIV-om, gubitak kosti povezan sa nedostatkom hormona rasta, gubitak kosti povezan sa cističnom fibrozom, fibroznu displaziju, gubitak kosti povezan sa hemioterapijom, gubitak kosti indukovan tumorom, gubitak kosti povezan sa malignom bolešću, hormon ablativni gubitak kosti, multipli mijelom, gubitak kosti izazvan lekovima, anoreksiju nervozu, gubitak facijalne kosti povezan sa bolešću, gubitak kranijalne kosti povezan sa bolešću, gubitak vilične kosti povezan sa bolešću, gubitak kosti lobanje povezan sa bolešću i gubitak kosti povezan sa svemirskim putovanjem. Ostala stanja se odnose na gubitak kosti povezan sa starenjem uključujući gubitak facijalne kosti povezan sa starenjem, gubitak kranijalne kosti povezan sa starenjem, gubitak kosti vilice povezan sa starenjem i gubitak kosti lobanje povezan sa starenjem.
Antitela prikazanog pronalaska mogu, takođe, biti od koristi za poboljšanje ishoda u ortopedskim procedurama, dentalnim procedurama, implant hirurgiji, zameni zgloba, stavljanju koštanih graftova, kozmetičkoj hirurgiji kosti i obnovi kosti, kao što je zaceljivanje frakture, zaceljivanje bez šava, odloženo zaceljivanje sa šavom i facijalna rekonstrukcija. Jedna ili više antitela može se primenjivati pre, tokom i/ili nakon procedure, zamene, grafta, hirurgije ili obnove.
Takođe je izložen dijagnostički komplet koji sadrži najmanje jedno antisklerostin vezujuće sredstvo. Vezujuće sredstvo može biti antitelo . Pored toga, takav komplet može, opciono, sadržavati jedno ili više od sledećih:
(1) uputstva za korišćenje jednog ili više vezujućih sredstava za skrining, dijagnostiku, prognozu, terapeutsko praćenje ili bilo koju kombinaciju ovih primena;
(2) obeleženi partner u vezivanju anti-sklerostin vezujućem sredstvu (sredstvima); (3) čvrsta faza (kao što je reagens traka) na kojoj je anti-sklerostin vezujuće sredstvo(sredstva) imobilizirano; i
(4) oznaka ili umetak koji označava regulatorno odobrenje za skrining, dijagnostiku, prognozu, ili terapeutsko korišćenje ili bilo koju njihovu kombinaciju.
Ukoliko nije obezbeđen obeleženi vezujući partner vezujućem sredstvu (sredstvima), samo vezujuće sredstvo (sredstva) može biti obeležen sa jednim ili više detektibilnih markera, npr., hemiluminiscentnim, enzimskim, fluorescentnim ili radioaktivnim delom.
Primeri koji slede su pruženi kao ilustracija, a ne da bi bili ograničenje.
PRIMERI
PRIMER 1
Rekombinantna ekspresija sklerostina
Rekombinantni humani sklerostin/SOST komercijalno se može nabaviti od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 cat# 1406-ST-025). Sem toga, rekombinantni mišiji sklerostin/SOST komercijalno se može nabaviti od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 cat# 1589-ST-025).
Alternativno, različite vrste sklerostina mogu prolazno da se ekspresuju u suspenziji bez seruma adaptiranih 293T ili 293EBNA ćelija. Transfekcije se mogu izvesti u vidu 500 mL-skih ili 1L-skih kultura. Sledeći reagensi i materijali su nabavljeni od Gibco BRL (sada Invitrogen, Carlsbad, CA). Kataloški brojevi su u zagradama: DMEM bez seruma (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); 1X insulin-transferin- selenijum saplement (51500-056); 1X Pen Strep Glut (10378-016); 2mM I-glutamin (25030-081); 20 mM HEPES (15630-080); 0.01% pluronik F68 (24040-032). Ukratko,
ćelijski inokulum (5.0-10.0 X 10<5>ćelija/mL X zapremina kulture) je centrifugiran na 2,500 RPM u toku 10 minuta na 4°C da bi se uklonio kondicioni medijum.
Ćelije su resuspendovane u DMEM bez seruma i centrifugirane ponovo na 2,500 RPM u toku 10 minuta na 4°C. Posle aspiriranja rastvora za ispiranje, ćelije su resuspendovane u medijumu za rast [DMEM/F12 (3:1) 1X insulin-transferin-selenijum saplement 1X Pen Strep Glut 2mM L-glutamin 20 mM HEPES 0.01% pluronik F68] u 1L-skom ili 3L-skom sudu za kulture. Sud za kulture se stavlja na magnetsku ploču za mućkanje na 125 RPM, a on je postavljena u inkubatoru uz održavanje
temperature na 37°C, vlage i 5% CO2. Ekspresioni plazmid DNK sisara (npr. pcDNK3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), koji sadrži kompletni kodirajući region (i stop kodon) sklerostina sa Kozak consenzus sekvencom (npr., CCACC) direktno 5’ startnog mesta ATG, sastavlja se sa transfekcionim reagensom u 50 mL-skoj konusnoj epruveti.
Kompleks DNK-transfekcionog reagensa se može pripremiti u 5-10% konačnog volumena kulture u DMEM bez seruma ili OPTI-MEM. Transfekcioni reagensi koji se mogu koristiti za ove namene obuhvataju X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), FuGene6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA).1-5 ∞g plazmid DNK/mL kulture se prvo doda u DMEM bez seruma, a zatim 1-5 ∞l transfekcionog reagensa/mL kulture. Kompleksi se mogu inkubirati na sobnoj temperaturi tokom otprilike 10-30 minuta i zatim dodati ćelijama u sud za kulture. ransfekcija/ekspresija se može izvesti tokom 4-7 dana, nakon čega se sakuplja kondicioni medijum (CM) centrifugiranjem na 4,000 RPM u toku 60 minuta na 4°C.
PRIMER 2
PREČIŠĆAVANJE REKOMBINANTNOG SKLEROSTINA
Rekombinantni sklerostin je prečišćen iz ćelija domaćina sisara na sledeći način. Svi procesi prečišćavanja su izvedeni na sobnoj temperaturi. Jedna šema prečišćavanja je iskorišćena za prečišćavanje različitih vrsta sklerostina, uključujući mišiji i humani sklerostin. Šema prečišćavanja koristi afinitetnu hromatografiju a zatim, katjonizmenjivačku hromatografiju.
Heparin hromatografija
Kondicioni medijum za ćelije domaćina sisara (CM) je centrifugiran u Beckman J6-M1 centrifugi na 4000 rpm u toku 1sata na 4°C da bi se uklonio ćelijski otpad. CM supernatant je zatim filtriran kroz sterilni 0.2 ∞m filter. (U ovom momentu, sterilni filtrirani CM se može eventualno čuvati zamrznut do prečišćavanja.) Ukoliko je CM bio zamrznut, otopi se na sledećim temperaturama, ili njihovoj kombinaciji: 4°C, sobna temperatura ili topla voda. Posle topljenja CM se filtrira kroz sterilni 0.2 ∞m filter i eventualno ukoncentriše putem ultrafiltracije sa tangencijalnim tokom (TFF), korišćenjem membrane sa odstranjivanjem 10 kD molekulske težine. CM koncentrat je filtriran kroz sterilni 0.2 ∞m filter i zatim napunjen na kolonu Heparin High Performance (Heparin HP) (GE Healthcare, prethodno Amersham Biosciences) uravnoteženu sa PBS. Alternativno, filtrirani CM supernatant može direktno da se napuni na Heparin HP kolonu uravnoteženu sa PBS.
Posle punjenja, Heparin HP kolona je ispirana sa PBS sve dok se apsorbcija protoka na 280 nm nije vratila na baznu liniju (tj., absorpcija izmerena pre punjenja CM supernatanta). Sklerostin je onda eluiran sa kolone korišćenjem linearnog gradijenta od 150 mM do 2M natrijum hlorida u PBS. Praćena je absorpcija eluata na 280 nm i sakupljane su frakcije koje su sadržavale protein. Frakcije su zatim ispitane pomoću SDS-PAGE sa Coomassie-bojenjem radi identifikacije frakcija koje sadrže polipeptid koji migrira u veličinu glikozilovanog sklerostina. Odgovarajuće frakcije sa kolone su sjedinjene kako bi se načinio Heparin HP “pool”.
Katjon-izmenjivačka hromatografija
Sklerostin koji je eluiran sa Heparin HP kolone je dalje prečišćen katjonizmenjivačkom hromatografijom korišćenjem SP High Performance (SPHP) hromatografskog medijuma (GE Healthcare, formerly Amersham Biosciences). Izmenjen je pufer Heparin HP “pool-u” u PBS dijalizom, uz upotrebu 10,000 MWCO membrana (Pierce Slide-A-Lyzer). Dijalizirani Heparin HP “pool” je zatim napunjen na SPHP kolonu uravnoteženu sa PBS. Posle punjenja, kolona je ispirana sa PBS sve dok se apsorbcija protoka na 280 nm nije vratila na baznu liniju. The Sklerostin je onda eluiran sa SPHP kolone korišćenjem linearnog gradijenta od 150 mM do 1 M natrijum hlorida u PBS. Praćena je absorpcija eluata na 280 nm i sklerostin je sakupljan u frakcijama. Frakcije su zatim ispitane pomoću SDS-PAGE sa Coomassie-bojenjem radi identifikacije
frakcija koje sadrže polipeptid koji migrira u veličinu glikozilovanog sklerostina.
Odgovarajuće frakcije sa kolone su sjedinjene kako bi se načinio SPHP “pool”.
Formulacije
Posle prečišćavanja, SPHP “pool” je formulisan u PBS dijalizom, korišćenjem 10,000 MWCO membrana (Pierce Slide-A-Lyzer). Ukoliko je bila neophodna koncentracija sklerostina, korišćen je centrifugalni uređaj (Amicon Centricon ili Centriprep) sa 10,000 MWCO membranom. Posle formulisanja, sklerostin je filtriran kroz sterilni 0.2 ∞m filter i čuvan na 4°C ili je zamrznut.
PRIMER 3
PEPTIDNO VEZIVANJE - ELISA
Serije preklapajućih peptida (svaki peptid je dugačak otprilike 20-25 amino kiselina) sintetisani su na bazi poznate amino kiselinske sekvence sklerostina pacova (SEQ ID NO:98). Peptidi su dizajnirani tako da svi sadrže redukovani cisteinski ostatak; dodatni cistein je priključen na C-terminusu svakog peptida koji već nije sadržavao jedan u svojoj sekvenci. Ovo peptidima omogućava da budu vezani za test ploče kovalentnim kuplovanjem, korišćenjem sulfhidril vezujućih ploča koje se mogu komercijalno nabaviti (Costar), u koncentraciji od 1 ∞g/ml, u fosfatno puferovanom slanom rastvoru (PBS: pH 6.5) koji sadrži 1 mM EDTA. Posle inkubacije od 1 sata na sobnoj temperaturi, ploče su isprane tri puta sa PBS koji sadrži 0.5% Tween 20. Ploče se blokiraju inkubacijom sa PBS rastvorom koji sadrži 0.5% želatina riblje kože (Sigma) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi i zatim su isprane tri puta u PBS koji sadrži 0.5% Tween 20.
Antitela koja treba testirati su razblažena na 1 ∞g/ml u PBS koji sadrži 0.5% želatina riblje kože i inkubirana su u peptidom obloženim pločama tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Višak antitela je uklonjen pomoću tri ispiranja sa PBS, 0.5% Tween 20. Ploče su zatim inkubirane sa odgovarajućim drugim antitelom koje je konjugovano sa “horseradish” peroksidazom (odgovarajuće razblaženim u PBS koji sadrži 0.5% Tween 20) i može da se veže za antitelo koje se ispituje. Ploče se zatim ispiraju tri puta: jednom sa PBS koji sadrži 0.5% Tween 20, a dva puta sa PBS. Konačno, ploče se inkubiraju sa hromogenim substratom “horseradish” peroksidaze (TMB-Stable Stop, RDI) u toku 5 minuta na sobnoj temperaturi, razvijanje boje se zaustavlja kiselinom i, optička gustina u pločama se meri na 450nm.
Materijali
Sulfhidrilno vezujuće ploče od Costar-a (VWR # 29442-278)
Pufer za oblaganje: 1XPBS PH 6.5 1mM EDTA
Blokirajući pufer: 1X PBS 0.5% želatin riblje kože (PBS od CS; FSG od Sigma# G 7765)
Pufer za ispiranje: 1X PBS 0.5% Tween 20
Sklerostinski peptidi pacova
Uzorci antitela: tranzientno At, prečišćeno rekombinantno At, zečiji serum, i td.
Odgovarajuće drugo At: kozije-anti-zečije/mišije-HRP (Jackson Immuno Research, 115-036-072)
TMB-Stable Stop (RDI# RDI-TMBSX-1L)
0.5M HCl
Postupci su bili sledeći:
1. Ploče obložiti sa 100 ∞l/reakcionom mestu sklerostinskog peptida pacova razblaženog u 1XPBS PH 6.5 1mM EDTA kao 1 ∞g/ml. Ploče inkubirati 1 sat na sobnoj temperaturi. (Ploče treba upotrebiti u toku 30 minuta od otvaranja).
2. Ploče isprati 3X sa puferom za ispiranje.
3. Ploče blokirati sa 200ul/reakcionom mestu blokirajućeg pufera. Ploče inkubirati 30 minuta na sobnoj temp.
4. Ponoviti ispiranje kako je opisano u (2).
5. Ploče inkubirati sa 50ul/reakcionom mestu uzorka razblaženog u blokirajućem puferu – titar seruma polazi od 1:100; tranzientno rekombinantno At se koristi čisto; prečišćeno rekombinantno At se koristi kao 1 ∞g/ml (svi uzorci su rađeni u duplikatima). Ploče se inkubiraju 1h na sobnoj temp.
6. Ploče isprati kao u (2).
7. Inkubirati ploče sa 50 ∞l/reakcionom mestu sa odgovarajućim drugim antitelom (HRP obeleženo) razblaženim 1:1600 u blokirajućem puferu. Ploče se inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi.
8. Ploče isprati 1X sa puferom za ispiranje, 2x sa PBS
9. Inkubirati ploče sa 50 ∞l/reakcionom mestu TMB, 5 minuta na sobnoj temp.
10. Reakciju zaustaviti sa 50 ∞l/reakcionom mestu 0.5M HCl.
11. Ploče pročitati na talasnoj dužini od 450 nm.
Sledeće peptidne sekvence su skrinirane kako je prethodno opisano:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP(SEQ ID NO:82) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO:83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO:84)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:85)
CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO:86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO:87) CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO:88) CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:89) RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO:90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO:91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO:92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO:93)
SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO:94) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:95) PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:96) KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97).
Neutrališuće antitelo visokog afiniteta (At-19) vezano je za dve preklapajuće peptidne sekvence: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:96) i KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97).
Ova procedura omogućava prepoznavanje epitopa za antitela koja reaguju sa prividnim linearnim epitopima. Peptidi koji sadrže sve delove vezujućeg mesta antitela, vezaće antitelo i na taj način ga detektovati.
PRIMER 4
IDENTIFIKACIJA EPITOPA HUMANOG SKLEROSTINA
Struktura sklerostina
Zreli oblik (signalni peptid uklonjen) humanog sklerostina jeste protein sa 190 amino kiselina (Slika 8). Slika 9 prikazuje šematski generalnu strukturu sklerostina sa N-terminalnim krakom (od N-terminalnog Q do cisteina1) i C-terminalnim krakom (od cisteina8 do terminalnog Y). Između ova dva kraka umetnuta je struktura sa cistinskim čvorom i tri petlje koje su označene sa Loop1, Loop2 i Loop 3. Četiri disulfidne veze u sklerostinu su Cys1 sa sekvencionim položajem 57 povezanim sa Cys5 na sekvencionom položaju 111 (koja se označava kao C1-C5), Cys2 na sekvencionom položaju 71 povezanim sa Cys6 na sekvencionom položaju 125 (koja se označava kao C2-C6), Cys3 na sekvencionom položaju 82 povezanim sa Cys7 na sekvencionom položaju 142 (koja se označava kao C3-C7), Cys4 na sekvencionom položaju 86 povezanim sa Cys8 na sekvencionom položaju 144 (koja se označava kao C4-C8). Osmočlana prstenasta struktura se formira preko C3-C7 i C4-C8 disulfidnog vezivanja. Ova prstenasta struktura, zajedno sa C1-C5 disulfidnom vezom koja prolazi kroz prsten, obrazuje tipični cistinski čvor. C2-C6, koja nije deo cistinskog čvora, nosi dve velike omčaste strukture, petlju 1 (ostaci 57 do 82) i petlju 3 (ostaci 111 do 142) koje su bliske jedna drugoj. Petlja 2 ide od C4 (ostatak 86) do C5 (ostatak 111).
Eksperimentalni deo
Opšti pristup opisivanju epitopa, koje vezuju anti-sklerostinska monoklonska antitela, obuhvata fragmentisanje humanog sklerostina u peptide sa različitim proteazama, određivanje sekvence različitih humanih sklerostinskih peptida, izolovanje ovih peptida i testiranje svakog od njih na sposobnost vezivanja za naročito monoklonsko antitelo korišćenjem "kompeticionog testa vezivanja epitopa humanog sklerostinskog peptida " na bazi Biacore. Dobijeni podaci omogućavaju lociranje vezujućeg epitopa kog treba odrediti.
Peptidni lizati se podvrgavaju HPLC peptidnom mapiranju; sakupe se pojedinačni pikovi i peptidi se identifikuju i mapiraju pomoću masene spektrometrije laserske desorpcije koja je matriksno potpomognuta (MALDI-MS) i analize elektrosprej jonizacije LC-MS (ESI-LC-MS) i/ili putem N-terminalnog sekvenciranja. Sve HPLC analize za ova ispitivanja se izvode upotrebom reverzno-fazne C8 kolone (2.1 mm i.d. x 15 cm dužine). HPLC peptidno mapiranje se izvodi sa linearnim gradijentom od 0.05% trifluorosirćetne kiseline (mobilna faza A) do 90% acetonitrila u 0.05% trifuorosirćetnoj kiselini. Kolone se razvijaju u toku 50 minuta pri brzini protoka od 0.2 ml/min.
Digestija tripsinom i AspN endoproteinazom
Zreli oblik humanog sklerostina se svari sa tripsinom, koji cepa posle arginina i lizina, ili sa AspN. Otprilike 200 ∞g sklerostina pri 0.5-1.0 mg/ml se inkubira u PBS (pH 7.2) tokom 20 hrs na 37°C sa 8 ∞g ili tripsina ili AspN.
Digestija tripsinom
HPLC hromatografija tripsinskih lizata daje nekoliko glavnih pikova (Sl.10A). Sekvenciona analiza je izvedena na peptidnim pikovima dobijenim sa HPLC posle digestije tripsinom. “On-line” ESI LC-MS analiza peptidnog lizata je, takođe, izvedena da bi se odredila precizna masa peptida koji su razdvojeni putem HPLC. Na taj način je određen identitet peptida prisutnih u peptidnim pikovima (Sl. 11). Slika 13 prikazuje označene različite peptidne sekvence (T19.2, T20, T20.6, T21-22) duž sekvence sklerostina. Broj iza svakog T (npr., T19.2) odražava retenciono vreme. T19.2 sadrži dva peptida (jedan iz petlje 1 i jedan iz petlje 3) koji su povezani putem C2-C6 disulfidne veze. T20 sadrži dva peptida koja se zajedno drže putem strukture cistinskog čvora, sa intaktnim petljama 1 i 3 koje se zajedno drže pomoću C2-C6 disulfida i bez glavnice petlje 2. T20.6 sadrži četiri sekvence koje se zajedno drže strukturom cistinskog čvora, ali nedostaje deo petlje 1 i 3 (T19.2 deo) i nedostaje glavnica petlje 2. T21-22 je praktično identičan sa T20, ali ima 3 dodatne amino kiseline u regionu petlje 2.
AspN digestija
HPLC hromatografija AspN lizata daje nekoliko glavnih pikova (Sl. 10B). Sekvenciona analiza je izvedena na peptidnim pikovima dobijenim sa HPLC. “On-line” ESI LC-MS analiza peptidnog lizata je, takođe, izvedena da bi se odredila precizna masa peptida koji su razdvojeni putem HPLC. Na taj način je određen identitet peptida prisutnih u peptidnim pikovima nakon AspN digestije (Sl.12). Slika 14 prikazuje označene različite peptidne sekvence (AspN14.6, AspN18.6, AspN22.7-23.5) duž sekvence sklerostina. Broj iza svakog AspN (npr. AspN18.6) odražava retenciono vreme. AspN14.6 sadrži tri kratka peptida sa oba, i sa N- i sa Cterminalnog kraka sklerostina, dok je AspN18.6 veći peptid sa N-terminalnog kraka sklerostina. AspN22.7-23.5 sadrži jedan peptidni fragment od 104 amino kiseline koje obuhvataju svih osam cisteina (četiri disulfidne veze), cistinski čvor i sve petlje 1, 2 i 3.
Strategija opisivanja epitopa je bila da se iskoriste ovi različiti peptidi humanog sklerostina stvoreni sa tripsinom i AspN i da se odredi koje peptide bi još uvek mogla da vežu različita antitela (At-A, At-B, At-C i At-D). Specifično, ovo je testirano "kompeticionim testom vezivanja epitopa humanog sklerostinskog peptida " na bazi Biacore u kome se vezivanje naročitog monoklonskog antitela za humani sklerostin imobilisan na Biacore čipu određuje u prisustvu ili odsustvu svake od raznih izolovanih tripsinskih i AspN HPLC peptidnih frakcija. U odsustvu i jednog kompeticionog peptida, naročito monoklonsko antitelo je bilo u mogućnosti da se veže za humani sklerostin na čipu i proizvede odgovor rezonantne jedinice, RU. Preinkubacija naročitog monoklonskog antitela sa intaktnim humanim sklerostinom u rastvoru, praćena
testiranjem vezivanja za čip, pokazuje da vezivanje MAt za humani sklerostin u rastvoru sprečava vezivanje MAt za humani sklerostin na čipu, čime se potvrđuje opšti princip ovog kompeticionog testa.
Ova opšta procedura se ponavlja pojedinačno za svaki peptid. Uzima se da snažan RU odgovor ukazuje na to da se naročiti peptid, koji se testira ne može vezati za MAt u rastvoru (prema tome MAt je bio slobodan da se veže za humani sklerostin koji je imobilisan na čipu). Suprotno, odsustvo snažnog RU odgovora ukazuje na to da je MAt bio u stanju da se veže za sklerostinski peptid u rastvoru. Ovi profili vezivanja u kombinaciji sa poznatim identitetom različitih sklerostinskih peptida, korišćeni su za određivanje epitopa sklerostina koji su vezani putem anti-sklerostinskih antitela At-A, At-B, At-C i At-D.
KOMPETICIONI TEST VEZIVANJA EPITOPA HUMANOG SKLEROSTINSKOG PEPTIDA NA BAZI BIACORE
Priprema površine sa humanim sklerostinom:
Imobilizacija zrelog oblika humanog sklerostina na površinu BIAcore senzorskog čipa (CM5) se izvodi u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, karboksilne grupe na površinama senzorskog čipa se aktiviraju injektovanjem 60 ∞L mešavine sastavljene od 0.2 M N-etil-N’-(dimetilaminopropil)karbodiimida (EDC) i 0.05 M N-hidroksisukcinimida (NHS). Humani sklerostin se razblaži u 10 mM natrijum acetatu, pH 4.0 u koncentraciji od 20 ∞g/mL a zatim se injektuje preko aktivirane CM5 površine. Višak reaktivnih grupa na površinama se deaktivira injektovanjem 60 ∞l 1 M etanolamina. Konačni imobilisani nivoi su bili ~5000 rezonantnih jedinica (RU) za površinu humanog sklerostina. Blank, lažno-kuplovana referentna površina je, takođe, pripremljena na senzorskim čipovima.
Analiza specifičnosti vezivanja:
1X fosfatno puferovani slani rastvor bez kalcijum hlorida ili magnezijum hlorida je nabavljena od Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. Goveđi serum albumin, frakcija V, bez IgG je nabavljen od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Svako MAt (2 nM) je zasebno inkubirano sa 20 nM humanog sklerostina ili sa naročitim humanim sklerostinskim peptidom (zapaziti: postoji 3 nepovezana peptida u AspN14.6) u puferu za uzorak (1X PBS 0.005% P-20 0.1 mg/mL BSA) pre nego što je injektovano preko humanog sklerostina imobilisanog na površini. Brzina protoka injekcije uzorka je bila 5 ∞L/min a, zatim je sledila regeneracija korišćenjem 1 M NaCl u 8 mM glicina, pH 2.0 na 30 ∞L/min u toku 30 sekundi. Podaci su analizirani korišćenjem programa BIAevaluation 3.2, a predstavljeni su na Slici 15 (At-A), Slici 16 (At-B), Slici 17 (At-C) i Slici 18 (At-D).
Loop 2 i T20.6 epitopi:
Profili vezivanja sklerostinskog peptida za dva reprezentativna antitela (At-A i At-B) bili su virtuelno jednaki (Sl.15 i Sl. 16) i pokazuju da bi oba ova antitela mogla da vežu samo AspN22.7-23.5 peptid. Jedinstvena razlika između AspN22.7-23.5 i svih drugih sklerostinskih peptida je ta što AspN22.7-23.5 sadrži intaktnu petlju 2. Ovo pokazuje da At-A i At-B vezuju region petlje 2 sklerostina na koji način definišu epitop petlje 2 (Sl.
19A). Profili vezivanja sklerostinskog peptida za At-C i At-D bili su virtuelno jednaki jedan u odnosu na drugi (Sl.17 i Sl.18) ali u potpunosti različiti od onih koji se viđaju za At-A i At-B. Od peptida koji su testirani u ovom Primeru, najmanji peptid koji je mogao da se veže za At-C i At-D, bio je T20.6 peptid. Ovaj rezultat definiše T20.6 epitop (Sl.
19B).
Test zaštite od proteaza:
Opšti princip ovog testa je da vezivanje MAt za sklerostin može dovesti do zaštite izvesnih mesta otcepljivanja specifičnim proteazama, a ova informacija se može iskoristiti za određivanje regiona na sklerostinu za koje se MAt vezuje.
Epitop "T20.6 derivata 1 (cistinski čvor 4 kraka)":
Slika 20 prikazuje HPLC peptidne mape za humani sklerostin At-D kompleks (Sl 20A: humani sklerostin je preinkubiran pri 1:1 molarnom odnosu sa At-D pre digestije sa tripsinom kako je prethodno opisano) i sam humani sklerostin (Sl 20B: humani sklerostin je svaren sa tripsinom kako je gore opisano). Peptidni pikovi T19.2 i T20.6 na Slici 20A pokazuju jasno smanjenje njihovih pojedinačnih visina pikova, u poređenju sa Slikom 20B. Ovo smanjenje u visini pikova povezano je sa povećanjem visine pikova za peptide T20 i T21-22. Ovi podaci ukazuju na to da su bazni amino kiselinski ostaci u petlji 1 i petlji 3, koji su u odsustvu At-D otcepljeni tripsinom kako stvaraju peptide T19.2 i T20.6, otporni na otcepljivanje tripsinom kada je At-D prethodno vezan za sklerostin. Prisustvo T20, T20.6 i T21-22 ukazuje na to da se petlja 2 još uvek efikasno otcepljuje kada je At-D prethodno vezan za sklerostin. Ovi podaci ukazuju na to da se At-D vezuje za stranu T20.6 epitopa petlje 1 i petlje 3 na koji način se definiše manji epitop "T20.6 derivata 1 (cistinski čvor 4 kraka)" prikazan na Slici 21.
PRIMER 5
IN VIVO TESTIRANJE ANTI-SKLEROSTINSKIH MONOKLONSKIH ANTITELA NA MIŠEVIMA
Četiri nedelje stari BDF1 mužjaci miševa dobijeni su od Charles River Laboratories (Raleigh, NC) i držani su u čistim kavezima, pet životinja po kavezu. Temperatura u prostoriji je održavana između 68 i 72°F, a relativna vlažnost je održavana na između 34 i 73%. Laboratorijski boravak u kavezima je bio regulisan u 12-časovnim svetlo/mrak ciklusima i ispunjavao je sve AAALAC specifikacije. Klinička posmatranja svih miševa iz studije su vršena jednom u toku dana.
Prečišćena anti-sklerostinska monoklonska antitela (At-A Sl.1; At-B Sl.2; At-C Sl.3; At-D Sl.4) su razblažena sa sterilnim Dulbeccovim fosfatno puferovanim slanim rastvorom. Miševima su injektovana anti-sklerostinska antitela ili PBS vehikulum subkutano kao 21 ∞l po gramu telesne težine, dva puta nedeljno (ponedeljak i četvrtak) kao 25 mg/kg. Humani PTH (1-34) je razblažen sa PTH puferom (0.001 N HCl, 0.15 M NaCl, 2% BSA) i, subkutano doziran kao 21 ∞l po gramu telesne težine pet puta nedeljno (ponedeljak, utorak, sreda, četvrtak, petak) kao 100 ∞g/kg kao pozitivna kontrola (Slike 5 i 6). Broj miševa po grupi je bio N=5 na Sl 5 i 6 i, N=6 na Slici 7.
PIXImus in vivo denzitometrija kostiju
Mineralna gustina kostiju (BMD) je određivana nedeljno na proksimalnim tibialnim metafizama i lumbalnoj kičmi putem periferne apsorptometrije dual energije X-zraka (pDEXA) sa PIXImus2 sistemom od GE/Lunar Medical Systems, Madison, WI. A Posmatrana oblast od 25mm<2>(ROI) se tako postavlja da obuhvati proksimalnu artikularnu površinu, epifizu i proksimalni kraj na metafizi tibije. Posmatrana oblast (ROI) se tako postavlja da obuhvati lumbalnu kičmu (L1-L5). Proksimalna tibia i lumbani regioni su analizirani radi određivanja ukupne mineralne gustine kostiju. Srednje vrednosti po grupama su predstavljene ± standardna devijacija i, upoređene su sa grupom tretiranom vehikulumom radi statističke analize.
Statistička analiza
Statistička analiza je izvedena pomoću Dunnett i Tukey-Kramera (korišćenjem MS Excel i JMP v.5.0. za BMD podatke). Srednje vrednosti grupa za svaki set podataka su smatrane značajno različitim kada je P vrednost bila manja od 0.05 (P < 0.05).
Sklerostin neutrališuća aktivnost antitela
Statistički značajan porast BMD u poređenju sa tretmanom vehikulumom zapaženo je za svako od sledećih: At-A (Slika 5), At-B (Slika 5), At-C (Slika 6) i At-D (Slika 7), što pokazuje da su ova četiri antitela sklerostin neutrališuća antitela. Sem toga, ovi podaci pokazuju da se, anti-sklerostinska antitela koja vezuju mišiji sklerostin, tretman i analiza miševa je kako je opsana prethodno, mogu da se koriste za identifikaciju sklerostin neutrališućih antitela.
PRIMER 6
SKRINING TEST ZA ANTITELA KOJA BLOKIRAJU VEZIVANJE ANTITELA ZA HUMANI SKLEROSTIN
Humani sklerostin se kupluje sa CM5 Biacore čipom korišćenjem standardne hemije aminskog kuplovanja da bi se generisala sklerostinom obložena površina. Na površinu se kupluje 300 rezonantnih jedinica sklerostina.
Antitela koja treba testirati se razblaže do koncentracije od 200ug/ml u HBS-EP puferu (što je 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% (v/v) surfaktant P20) i zatim se pomešaju u jedan prema jedan molarnom odnosu (na bazi mesta vezivanja) kako bi se stvorila test mešavina. Ova test smeša tako sadrži svako antitelo u koncentraciji od 100ug/ml (1.3um na bazi mesta vezivanja). Isto tako, pripreme se i zasebni rastvori koji sadrže svako antitelo iz smeše samo. Ovi rastvori sadrže pojedinačna antitela u HBS-EP puferu u koncentraciji od 100ug/ml (1.3um na bazi mesta vezivanja).
20 ∞L test smeše se propušta preko sklerostinom obloženog čipa pri brzini protoka od 10 ∞L/min i beleži se količina vezivanja. Čip se onda tretira sa dva 60 sekundna pulsa 30 mM HCl kako bi se uklonila sva vezana antitela. Rastvor koji sadrži samo jedno od antitela iz test smeše (od 1.3 ∞M u istom puferu kao test smeša na bazi mesta vezivanja) se zatim propušta preko čipa na isti način kao test smeša i beleži se količina vezivanja. Čip se ponovo tretira da bi se uklonila sva vezana antitela i konačno, rastvor koji sadrži drugo samo antitelo iz test mešavine (od 1.3 ∞M u istom puferu kao test smeša na bazi mesta vezivanja) propušta se preko čipa i beleži se količina vezivanja.
Tabela u nastavku prikazuje rezultate testa unakrsnog-blokiranja za raspon različitih antitela. Vrednosti u svakom kvadratu tabele predstavljaju količinu vezivanja (u RU) koja se viđa kada se antitela (od 1.3 ∞M na bazi mesta vezivanja) ili pufer, naznačeni u gornjem redu tabele, pomešaju sa antitelima (od 1.3uM na bazi mesta vezivanja) ili puferom koji su naznačeni u prvoj koloni tabele.
Korišćenjem srednje vrednosti vezivanja (u RU) za svaku kombinaciju antitela u gornjoj tabeli (kako se svaka kombinacija javlja dva puta) moguće je izračunati procenat teorijskog vezivanja prikazan svakom kombinacijom antitela. Teoretsko vezivanje se izračunava kao zbir srednjih vrednosti za sastojke svake test mešavine kada se testira sama (tj., antitelo i pufer).
Iz gornjih podataka jasno je da At-4, At-A i At-19 unakrsno blokiraju jedno drugo. Slično, At-13 i At-3 unakrsno blokiraju jedno drugo.
PRIMER 7
TEST UNAKRSNOG BLOKIRANJA NA BAZI ELISA
Tečni volumeni koji se koriste u ovom Primeru bi bili oni koji se uobičajeno koriste za ELISA ploče sa 96 reakcionih mesta (npr.50-200 ∞l/reakcionom mestu). Uzima se da At-X i At-Y, u ovom primeru, imaju molekularne težine od oko 145 Kd i da imaju 2 sklerostinska vezujuća mesta po molekulu antitela. Anti-sklerostinsko antitelo (At-X) je oblagano (npr.50 ∞ od 1 ∞g/ml) na ELISA ploči u 96 reakcionih mesta [npr.
Coming 96 Well EIA/RIA Flat Bottom Microplate (Product # 3590), Coming Inc., Acton, MA] tokom najmanje jednog sata. Posle ovog koraka oblaganja, rastvor antitela se uklanja, ploča se ispira jednom ili dva puta sa rastvorom za ispiranje (npr., PBS i 0.05% Tween 20) i zatim se blokira korišćenjem odgovarajućeg blokirajućeg rastvora (npr., PBS, 1% BSA, 1% koziji serum i 0.5% Tween 20) procedurama koje su u struci poznate. Blokirajući rastvor se zatim uklanja sa ELISA ploče i dodaje se drugo anti-sklerostinsko antitelo (At-Y), koje se testira na mogućnost da unakrsno blokira obloženo antitelo, u višku (npr.50 ∞l od 10 ∞g/ml) u blokirajućem rastvoru u odgovarajuća reakciona mesta ELISA ploče. Posle ovoga, ograničena količina (npr.50 ∞l od 10 ng/ml) sklerostina u blokirajućem rastvoru se onda dodaje u odgovarajuća reakciona mesta i, ploča se inkubira najmanje jedan sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploča se zatim ispira 2-4 puta sa rastvorom za ispiranje. Odgovarajuća količina detekcionog reagensa za sklerostin [npr., biotinizovano antisklerostinsko poliklonsko antitelo koje je prethodno kompleksovano sa odgovarajućom količinom konjugata streptavidin-“horseradish” peroksidaze (HRP)] u blokirajućem rastvoru se dodaje na ELISA ploču i inkubira se najmanje jedan sat na sobnoj temperaturi. Ploča se onda ispira najmanje 4 puta sa rastvorom za ispiranje i razvija sa odgovarajućim reagensom [npr. HRP substrati kao što je TMB (kolorimetrija) ili različiti HRP luminescentni substrati]. Pozadinski signal za test se definiše kao signal koji se dobija u reakcionim mestima sa obloženim antitelom (u ovom slučaju At-X), drugim antitelom iz faze rastvora (u ovom slučaju At-Y), samim sklerostinskim puferom (tj. bez sklerostina) i reagensom za detekciju sklerostina. Signal pozitivne kontrole za test se definiše kao signal koji se dobija u reakcionim mestima sa obloženim antitelom (u ovom slučaju At-X), samim puferom drugog antitela iz faze rastvora (tj. bez drugog antitela iz faze rastvora), sklerostinom i reagensom za detekciju sklerostina. ELISA test treba da se izvede na takav način da signal pozitivne kontrole bude najmanje 6 puta veći u odnosu na pozadinski signal.
Da bi se izbegli svaki artefakti (npr. značajno različite afinitete između At-X i At-Y za sklerostin) kao rezultat izbora koje antitelo koristiti kao oblažuće antitelo i koje koristiti kao drugo (kompetitor) antitelo, test unakrsnog blokiranja zahteva da se izvodi u dva formata:
1) format 1 je gde je At-X antitelo kojim se oblaže ELISA ploča i At-Y je kompetitor antitelo koje je u rastvoru
i
2) format 2 je gde je At-Y antitelo kojim se oblaže ELISA ploča i At-X je kompetitor antitelo koje je u rastvoru.
At-X i At-Y su definisana kao unakrsno blokirajuća ukoliko je, bilo u formatu 1 bilo u formatu 2, faza rastvora anti-sklerostinskog antitela u stanju da dovede do smanjenja od između 60% i 100%, specifično između 70% i 100%, a preciznije između 80% i 100%, sklerostinskog detekcionog signala (tj. količine sklerostina koju vezuje obloženo antitelo) u poređenju sa sklerostinskim detekcionim signalom koji se dobija u odsustvu faze rastvora anti-sklerostinskog antitela (tj. reakciona mesta sa pozitivnom kontrolom).
U slučaju da se koristi tagovana verzija sklerostina u ELISA-i, kao što je N-terminalno His-tagovan sklerostin (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; 2005 cat# 1406-ST-025), onda će odgovarajući tip reagensa za detekciju sklerostina uključiti HRP obeleženo anti-His antitelo. Osim korišćenja N-terminalno His-tagovanog sklerostina, može se upotrebiti i C-terminalno His-tagovani sklerostin. Dalje, mogu se koristiti različiti drugi tagovi i kombinacije vezanih tagova i proteina, koje su poznate u struci za ovaj test unakrsnog blokiranja na bazi ELISA (npr., HA tag sa anti-HA antitelima; FLAG tag sa anti-FLAG antitelima; biotin tag sa streptavidinom).
PRIMER 8
TEST MINERALIZACIJE NA BAZI ĆELIJA ZA IDENTIFIKOVANJE SREDSTAVA KOJA MOGU ANTAGONIZOVATI AKTIVNOST SKLEROSTINA
Uvod
Mineralizacija ćelijama poreklom od osteoblasta u kulturi, bilo primarnim ćelijama bilo ćelijskim linijama, koristi se kao in vitro model formiranja kosti. Mineralizacija se odvija u toku otprilike jedne do šest nedelja otpočinjući sa indukcijom diferencijacije osteoblastne ćelijske linije sa jednim ili više sredstava za indukciju. Ukupni redosled događaja obuhvata ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju, produkciju ekstracelularnog matriksa, sazrevanje matriksa i konačno, depoziciju minerala, što predstavlja kristalizaciju i/ili depoziciju kalcijum fosfata. Ovaj sled događaja počinjući od ćelijske proliferacije i diferencijacije i, završavajući sa depozicijom minerala ovde je označen kao mineralizacija. Merenje kalcijuma (mineral) je rezultat testa.
Depozicija minerala ima jake biofizičke karakteristike, u tome što kada jednom "semena" minerala počnu da se formiraju, ukupna količina minerala koja će se odložiti u celokupnoj kulturi može ponekad da se odlaže veoma brzo, kao recimo tokom nekoliko dana od tada. Na vreme i stepen odlaganja minerala u kulturi utiču, delom, naročite ćelije poreklom od osteoblasta/ćelijska linija koja se koristi, uslovi rasta, izbor sredstava za diferencijaciju i potreban broj lotova seruma koji se koristi u medijumu kulture ćelija. Za kulture mineralizacije ćelija poreklom od osteoblasta/ćelijske linije, potrebno je testirati najmanje osam do petnaest serumskih lotova od više nego jednog snabdevača u cilju identifikovanja naročitog serumskog lota koji omogućava da se mineralizacija odvija.
MC3T3-E1 ćelije (Sudo H et al., In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol.96:191-198) i subklonovi originalne ćelijske linije mogu obrazovati mineral u kulturi u toku rasta u prisustvu sredstava za diferencijaciju. Ovi subklonovi uključuju MC3T3-E1- BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B.2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275:19992-20001).
Identifikacija sklerostin neutrališućih antitela
MC3T3-E1-BF ćelije su korišćene za test mineralizacije. Askorbinska kiselina i B-glicerofosfat su korišćeni za indukciju MC3T3-E1-BF ćelijske diferencijacije dovodeći do odlaganja minerala. Specifični skrining protokol, u formatu 96 reakcionih mesta, uključuje zasejavanje ćelija u sredu, a zatim sedam izmena medijuma (kako je opisano u nastavku) u toku 12-dnevnog perioda pri čemu se glavnina depozicije minerala
odvija u poslednjih otprilike osamnaest sati (npr. nedelja noć na ponedeljak). Za svaki dati tretman, koriste se 3 reakciona mesta (N=3). Specifično podešavanje vremena, kao i stepen, depozicije minerala može varirati u zavisnosti od, delom, naročitog broja serumskog lota koji se koristi. Kontrolni eksperimenti će omogućiti da se takva variranja uračunaju, kao što je generalno dobro poznato u oblasti izvođenja ogleda sa kulturom ćelija.
U ovom test sistemu sklerostin inhibira jedan ili više u redosledu događaja koji dovode do i uključuju depoziciju minerala (tj., sklerostin inhibira mineralizaciju). Antisklerostinska antitela, koja su mogla da neutrališu sklerostinsku inhibitornu aktivnost, omogućila su mineralizaciju u kulturi u prisustvu sklerostina u tolikoj meri da je postojao statistički značajan porast u odlaganju kalcijum fosfata (mereno kao kalcijum) u poređenju sa količinom kalcijuma koji je izmeren u grupi sa samim sklerostinom (tj., bez antitela). U statističkoj analizi (korišćen MS Excel i JMP) korišćen je 1- parametarska-ANOVA a zatim Dunnett poređenje kako bi se odredile razlike između grupa. Srednje vrednosti po grupama za svaki set podataka smatrane su značajno različite kada je P vrednost bila manja od 0.05 (P < 0.05). Reprezentativni rezultat izvođenja ovog testa je prikazan na Slici 22. U odsustvu rekombinantnog mišijeg sklerostina, redosled događaja dovodi do toga da se odlaganje minerala odvija normalno. Nivoi kalcijuma u svakoj tretiranoj grupi su prikazani kao srednje vrednosti ± standardna greška srednje vrednosti (SEM). U ovom ogledu datom primera radi, nivoi kalcijuma u testu kalcijuma su bili ~31 ∞g/ml. Međutim, dodavanje rekombinantnog mišijeg sklerostina dovodi do inhibicije mineralizacije i kalcijum je bio snižen za ~85%. Dodavanje anti-sklerostinskog monoklonskog antitela At-19 ili At-4 zajedno sa rekombinantnim sklerostinom dovodi do statistički značajnog porasta odlaganja minaerala, u poređenju sa grupom samo sa sklerostinom, jer je inhibitorna aktivnost sklerostina bila neutralisana nekim od antitela. Rezultati iz ovog elsperimenta ukazuju na to da su At-19 i At-4 sklerostin neutrališuća monoklonska antitela (MAts).
Slika 23 pokazuje veoma sličan rezultat korišćenjem rekombinantnog humanog sklerostina i dva humanizovana anti-sklerostinska MAts. Slika 24, isto tako, prikazuje veoma sličan rezultat korišćenjem rekombinantnog humanog sklerostina i mišijeg i humanizovanog antisklerostinskog MAt kako je navedeno.
Antitela korišćena za eksperimente prikazane na Sl 22, 23 i 24 imaju molekulske težine od oko 145 Kd i imaju 2 sklerostinska mesta vezivanja po molekulu antitela.
Detaljan protokol MC3T3-E1-BF ćelijske kulture je opisan u nastavku.
Reagensi i medijumi
Reagensi Kompanija Kataloški #
Alfa-MEM Gibco-Invitrogen 12571-048 Askorbinska kiselina Sigma A4544
Beta-glicerofosfat Sigma G6376
100X PenStrepGlutamin Gibco-Invitrogen 10378-016 Dimetilsulfoksid (DMSO) Sigma D5879 ili D2650 Fetalni goveđi serum (FBS) Cansera CS-C08-500 (lot # SF50310) ili Fetalni goveđi serum (FBS) TerraCell Int. CS-C08-1000A (lot # SF-20308) Alfa-MEM se obično proizvodi sa rokom trajanja od 1 godine. Za ćelijsku kulturu je korišćen Alfa-MEM koji nije bio stariji od 6-meseci posle datuma proizvođenja.
Ekspanzioni medijum (Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu) je pripremljen na sledeći način:
500 ml-ska boca FBS je otopljena i sterilisana filtracijom kroz 0.22 mikronski filter.
100 ml ovog FBS je dodato u 1 litar Alpha-MEM a zatim je dodato 10 ml 100x PenStrepGlutamina.
Nekorišćeni FBS je podeljen u alikvote i zamrznut za kasniju upotrebu.
Medijum za diferencijaciju (Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu, 50 mg/ml askorbinska kiselina, 10 mM beta-glicerofosfat) pripremljen je na sledeći način:
100 ml medijuma za diferencijaciju je pripremljeno obogaćivanjem 100 ml ekspanzionog medijuma sa askorbinskom kiselinom i beta-glicerofosfatom kako sledi:
Matična konc. (vidi ispod) Zapremina Konačna konc.
Askorbinska 10 mg/ml 0.5 ml 100 mg/ml
kiselina (50ug/ml+50ug/ml)
®-glicerofosfat<1 M 1.0 ml 10 mM>
Medijum za diferencijaciju je napravljen obogaćivanjem ekspanzionog medijuma samo onog dana kada će se medijum za diferencijaciju koristiti za ćelijsku kulturu. Konačna koncentracija askorbinske kiseline u medijumu za diferencijaciju je 100 ∞g/ml zbog toga što Alfa-MEM već sadrži 50 ∞g/ml askorbinske kiseline. Napravljen je matični rastvor askorbinske kiseline (10 mg/ml) i podeljen u alkivote za zamrzavanje na -80°C. Svaki alikvot se upotrebljava samo jednom (tj. ne zamrzava se ponovo). Matični rastvor betaglicerofosfata (1 M) je napravljen i podeljen u alkivote za zamrzavanje na -20°C. Svaki alikvot je zamrznut i otopljen maksimalno 5 puta pre odbacivanja.
Ćelijska kultura za ekspanziju MC3T3-E1-BF ćelija.
Ćelijska kultura je napravljena na 37°C i sa 5% CO2. Ćelijska banka je generisana u svrhu skrininga na sklerostinska neutrališuća antitela. Ćelijska banka je kreirana na sledeći način:
Jedna bočica zamrznutih MC3T3-E1-BF ćelija je otopljena mućkanjem na 37°C u vodenom kupatilu. Otopljene ćelije se stavljaju u 10 ml ekspanzionog medijuma (Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu) u 50 ml-sku epruvetu i pažljivo se 5 minuta spuštaju. Ćelije se zatim resuspenduju u 4 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija upotrebom tripan plavog i hemacitometra, 1 x 10<6>ćelija se zaseje u 50 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu medijuma u jednom T175 balonu.
Kada se ovaj sadržaj sjedini (otprilike 7. dana), ćelije se podvrgnu tripsinu sa tripsin/EDTA (0.05% tripsin; 0.53 mM EDTA), pažljivo u toku 5 minuta spuste na dole i zatim resuspenduju u 5 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija korišćenjem, tripan plavog i hemacitometra, ćelije se zaseju u količini 1 x 10<6>ćelija u 50 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu medijuma po jednom T175 sudu. Broj T175 sudova korišćenih za zasejavanje u ovoj tački zavisi od ukupnog broja ćelija koje su na raspoloženju i od broja sudova koji se želi preneti u sledeći korak. Višak ćelija se zamrzne u količini 1-2x10<6>živih ćelija/ml u 90%FBS/10%DMSO.
Kada se ovaj sadržaj sjedini (otprilike 3-4 dana), ćelije se podvrgnu tripsinu sa tripsin/EDTA (0.05% tripsin; 0.53 mM EDTA), pažljivo u toku 5 minuta spuste na dole i zatim resuspenduju u 5 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija korišćenjem, tripan plavog i hemacitometra, ćelije se zaseju u količini 1 x 10<6>ćelija u 50 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu medijuma po jednom T175 sudu. Broj T175 sudova korišćenih za zasejavanje u ovoj tački zavisi od ukupnog broja ćelija koje su na raspoloženju i od broja sudova koji se želi preneti u sledeći korak. Višak ćelija se zamrzne u količini 1-2x10<6>živih ćelija /ml u 90%FBS/10%DMSO.
Kada se ovaj sadržaj sjedini (otprilike 3-4 dana), ćelije se podvrgnu tripsinu sa tripsin/EDTA (0.05% tripsin; 0.53 mM EDTA), pažljivo u toku 5 minuta spuste na dole i zatim resuspenduju u 5 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija korišćenjem, tripan plavog i hemacitometra, ćelije se zaseju u količini 1 x 10<6>ćelija u 50 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu medijuma po jednom T175 sudu. Broj T175 sudova korišćenih za zasejavanje u ovoj tački zavisi od ukupnog broja ćelija koje su na raspoloženju i od broja sudova koji se želi preneti u sledeći korak. Višak ćelija se zamrzne u količini 1-2x10<6>živih ćelija /ml u 90%FBS/10%DMSO.
Kada se ovaj sadržaj sjedini (otprilike 3-4 dana), ćelije se podvrgnu tripsinu sa tripsin/EDTA (0.05% tripsin; 0.53 mM EDTA), pažljivo u toku 5 minuta spuste na dole i zatim resuspenduju u 5 ml Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija korišćenjem, tripan plavog i hemacitometra, ćelije se zamrznu u količini 1-2x10<6>živih ćelija/ml u 90%FBS/10%DMSO. Ovaj "konačni sadržaj" zamrznutih ćelija je bio sadržaj koji je korišćen za skriniranje.
Ćelijska kultura za mineralizaciju MC3T3-E1-BF ćelija.
Ćelijska kultura je napravljena na 37°C i uz 5% CO2. Poželjno je minimizovati fluktuaciju temperaure i % CO2tokom procedure mineralizacije ćelijske kulture. Ovo se može postići minimizovanjem vremena koje ploče provedu izvan inkubatora u toku hranjenja i, isto tako, minimizovanjem vremena, tj., broja kada se vrata
inkubatora otvaraju i zatvaraju tokom procedure mineralizacije ćelijske kulture. U ovom pogledu, može biti od pomoći posedovanje inkubatora za kulturu tkiva koji je tako isključivo namenjen mineralizaciji kulture tkiva (i tako se ne otvara i zatvara više nego što je to neophodno).
Odgovarajući broj "final passage" bočica pripremljenih kako je gore opisano otopljene su uz mućkanje na 37°C u vodenom kupatilu. Otopljene ćelije se stavljaju u 10 ml ekspanzionog medijuma (Alfa-MEM/10%FBS/PenStrepGlu) u 50 ml-sku epruvetu i pažljivo se spuštaju u toku 5 minuta. Ćelije su onda resuspendovane u 4 ml Alfa-NEM/10%FBS/PenStrepGlu. Posle određivanja broja ćelija pomoću tripan plavog i hemacitometra, 2500 ćelija se stavlja u 200 mikrolitara ekspanzionog medijuma po reakcionom mestu na pločama sa 96 reakcionih mesta obloženih kolagenom I (Becton Dickinson LAtware, cat # 354407).
Kako bi se izbegao efekat mineralizacije ivica ploče, ćelije se ne zasejavaju u poslednji red/kolonu svuda oko ploče. Umesto, 200 mikrolitara PBS se dodaje u ova rekciona mesta.
Procedura kulture ćelija kao primer
U sledećoj proceduri, polazni dan za zasejavanje ćelija je naznačen da je to sreda. Ukoliko se koristi drugi dan u nedelji kao polazni za zasejavanje ćelija, od tog dana počinje dnevni profil uklanjanja i dodavanja medijuma tokom celokupnog procesa kako je u nastavku prikazano. Na primer, ukoliko se ćelije zasejavaju u utorak, medijum ne treba ukloniti i dodati prvog petka i subote, niti drugog petka ni subote. Sa utorkom kao početkom, ploče će se za testiranje kalcijuma pripremiti poslednje nedelje. Ćelije su zasejane u sredu pri 2500 ćelija u 200 ∞l ekspanzionog medijuma.
U četvrtak, sav ekspanzioni medijum je uklonjen i dodato je 200 ∞l medijuma za diferencijaciju.
U petak, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
U ponedeljak, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
U utorak, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
U sredu, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
U četvrtak, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
U petak, 100 ∞l medijuma je uklonjeno i dodato je 100 ∞l svežeg medijuma za diferencijaciju.
Sledećeg ponedeljka, ploče su pripremljene za testiranje kalcijuma na sledeći način:
Ploče su isprane jednom sa 10 mM Tris, HCl pH 7-8.
Izvodeći pod odvodom pare, 200 ∞l 0.5 N HCl je dodato po reakcionom mestu. Ploče su zatim zamrznute na -80°C.
Neposredno pre merenja kalcijuma, ploče su zamrznute-otopljene dva puta, i zatim je pomoću višekanalne pipete izvršena trituracija za dispergovanje sadržaja u ploči. Sadržaj ploče je zatim ostavljen da stoji na 4°C u toku 30 minuta kada se uklanja odgovarajuća količina supernatanta za merenje kalcijuma pomoću komercijalno nabavljenog kalcijum kita. Kao primer i bez ograničavanja na isti, kit je: Calcium (CPC) Liquicolor, Cat. No.0150-250, Stanbio LAtoratory, Boerne, TX.
U ovom testu na ćelijskoj osnovi, sklerostin inhibira jedan ili više iz redosleda događaja koji vode do i uključuju odlaganje minerala (tj. sklerostin inhibira mineralizaciju). Tako, u ogledima u kojima je bio uključen sklerostin, u naročitim eksperimentima na kulturi ćelija, rekombinantni sklerostin je dodavan u medijum počinjući prvo od četvrtka i, posle toga svakog dana sa hranom. U slučajevima gde je testirano antisklerostinsko monoklonsko antitelo (MAt) na mogućnost da neutrališe sklerostin, tj. omogući mineralizaciju neutralisanjem sklerostinske mogućnosti da se inhibiše mineralizacija, MAt je dodavan u medijum počevši prvo od četvrtka i, posle toga svakog dana sa hranom. U skladu sa protokolom, ovo je postignuto na sledeći način: MAt je prethodno inkubirano sa rekombinantnim sklerostinom u medijumu za
diferencijaciju u toku 45-60 minuta na 37°C i onda je ovaj medijum korišćen za ishranu ćelija.
Prethodno je opisan 12-dnevni protokol mineralizacije za MC3T3-E1-BF ćelije. Korišćenjem istih reagenasa i protokola uzgoja, originalnim MC3T3-E1 ćelijama (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96: 191-198) koje su dobijene od RIKEN banke ćelija (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukubashi, Ibaraki 305-0074 Japan) bilo je potrebno duže da se mineralizuju (20 dana ukupno za mineralizaciju) u odnosu na MC3T3-E1-BF ćelije. Mineralizacija originalnih MC3T3-E1 ćelija je inhibisana rekombinantnim sklerostinom i ova inhibicija je blokirana korišćenjem sklerostinskog neutrališućeg antitela.
PRIMER 9
ANTI-SKLEROSTINSKO ANTITELO ŠTITI OD INFLAMACIJOM INDUKOVANOG GUBITKA KOSTI U CD4 CD45RBHI TRANSFER MODELU KOLITISA NA SCID MIŠEVIMA
Kratko izlaganje modela
Injekcija CD45RB<high>pod-seta CD4+ T ćelija u C.B-17 scid miševe dovodi do hronične intestinalne inflamacije koja je sličnih karakteristika kao kod upalne bolesti creva (IBD) kod čoveka. 3-5 nedelja nakon ćelijskog transfera zapažaju se dijareja i bolest mršavljevanja sa teškom leukocitnom infiltracijom u kolonu udruženom sa hiperplazijom epitelijelnih ćelija i formiranjem granuloma. C.B-17 scid miševi koji su primili reciprocitni pod-set CD4+ ćelija, onih koje ekspresuju CD45RB<low>, nemaju kolitis i imaju težinu koja se ne može razlikovati od one kod scid miševa. Osim simptoma kolitisa, model CD4+ CD45RB<high>T ćelijskog transfera kolitisa je praćen i smanjenjem mineralne gustine kostiju (BMD), koja je primarno posledica inflamatornih mehanizama pre nego malapsorpcije ishrane (Byrne, F. R. et al., Gut 54:78-86, 2005).
Indukcija kolitisa i gubitak kosti uzrokovan inflamacijom
Od ženki balb/c miševa su uzete slezine i razorene su kroz 70mm ćelijsku presu. Populacija CD4+ je onda obogaćena negativnom selekcijom sa Dyna-zrncima korišćenjem antitela protiv B220, MAC-1, CD8 i I-Ad. Obogaćena populacija je zatim obojena sa FITC konjugovanim anti-CD4 i PE konjuguvanim anti-CD45RB i frakcionisana u CD4+CD45RB<high>i CD4+CD45RB<low>populaciji putem dvo-kolornog sortiranja na Moflo (Dakocytomation). CD45RB<high>i CD45RB<low>populacije su definisane sa najsjajnijim bojenjem 40% odnosno, najslabijim bojenjem 20% CD4+ ćelija. 5x10<5>ćelija su zatim injektovane i.p. u C.B-17 scid miševe na dan 0 i praćen je razvoj kolitisa preko pojave mekih stolica ili dijareje i gubitka težine. Merenja mineralne gustine kosti su izvedena na kraju ispitivanja (dan 88).
Efekat anti-sklerostinskog tretmana na simptome kolitisa i BMD
At-A IgG je dozirano kao 10mg/kg s.c. od dana pre CD4+CD45RB<high>ćelijskog transfera i izvršeno je poređenje sa miševima koji su primili negativnu kontrolu antitela 101.4, isto tako doziranu kao 10mg/kg s.c.. Od tada, antitela su dozirana nedeljno. Grupa miševa koja je primila ne-patogene CD4+CD45RB<low>ćelije i koja je dozirana sa 10mg/kg 101.4, ispitivana je kao kontrola. Na kraju ispitivanja (dan 88), izmerena je mineralna gustina kosti i uzeti su isečci kolona za analizu ćelijske infiltracije i određivanja histološkog oštećenja.
a) Bez efekta na simptome kolitisa
Uobičajeni simptomi kolitisa, kao što su gubitak težine i infiltracija inflamatornih ćelija u kolonu, nisu bili ublaženi tretmanom sa At-A. Slično, nije bilo poboljšanja histološkog oštećenja na kolonu nakon lečenja sa At-A.
b) Inhibicija inflamacijom prouzrokovanog gubitka mineralne gustine kosti.
Na dan 88 nakon transfera ćelija u C.B-17 scid miševe, izmerena je mineralna gustina kosti (ukupna BMD, BMD kičme i BMD femura). U poređenju sa kontrolnim miševima koji su primili CD4+CD45RB<low>ne-patogene ćelije, miševi koji su primili CD4+ CD45RB<high>T ćelije i negativno kontrolno antitelo 101.4, imali su smanjenu mineralnu gustinu kosti, kako je prikazano na Slici 25. Suprotno, nije bilo smanjenja BMD nakon tretmana sa At-A. Ukupno, merenja BMD kičme i femura bila su značajno veća kod miševa koji su primali CD4+ CO45RB<high>T ćelije i bili lečeni sa At-A u odnosu na miševe koji su primali CD4+ CD45RB<high>T ćelije i bili lečeni sa 101.4 (P<0.001 putem Bonferroni višestrukog testa poređenja).
PRIMER 10
ODREĐIVANJE AFINITETA (KD) ANTI-SKLEROSTINSKIH ANTITELA PREMA HUMANOM SKLEROSTINU NA BAZI KINEXA
Ispitan je afinitet nekoliko anti-sklerostin antitela prema humanom sklerostinu analizom vezivanja uravnoteženog rastvora korišćenjem KinExA® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Za ova merenja, Reacti-Gel 6x zrnca (Pierce, Rockford, IL) su prethodno obložena sa 40 ∞g/ml humanog sklerostina u 50 mM Na2C03, pH 9.6 na 4°C, preko noći. Zrnca su zatim blokirana sa 1 mg/ml BSA u 1 M Tris-HCl, pH 7.5 na 4°C tokom dva sata. 10 pM, 30 pM ili 100 pM antitela je pomešano sa različitim koncentracijama humanog sklerostina, opsega koncentracija od 0.1 ∞M do 1 nM i, zatim je vršeno uravnotežavanje na sobnoj temperaturi u toku 8 sati u PBS sa 0.1 mg/ml BSA i 0.005% P20. Smeše su onda propuštene preko zrnaca obloženih humanim sklerostinom. Količina anti-sklerostin antitela vezanih za zrnca je izmerena upotrebom fluorescentnog Cy5-obeleženog kozijeg anti-mišijeg-IgG ili fluorescentnog Cy5-obeleženih kozijih antihuman-IgG antitela (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) za uzorke antitela miša odnosno, čoveka. Izmerena količina fluorescentnog signala bila je proporcionalna koncentraciji slobodnog anti-sklerostinskog antitela u svakoj reakcionoj smeši u ravnoteži. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je dobijena nelinearnom regresijom kompeticionih krivih korišćenjem n-krive modela homogenog vezivanja na jednom
mestu, koji je obezbeđen u KinExA Pro softveru. Rezultati KinExA testova za odabrana antitela su zbirno prikazana u tabeli u nastavku.
Antitela Antigen KD(pM) Interval 95% pouzdanosti At-13 Humani sklerostin 0.6 0.4 ~ 0.8 pM
At-4 Humani sklerostin 3 1.8 ~ 4 pM
At-19 Humani sklerostin 3 1.7 ~ 4 pM
At-14 Humani sklerostin 1 0.5 ~ 2 pM
At-5 Humani sklerostin 6 4.3 ~ 8 pM
At-23 Humani sklerostin 4 2.1 ~ 8 pM
PRIMER 11
BIACORE-ov POSTUPAK ZA ODREĐIVANJE AFINITETA HUMANIZOVANIH ANTI-SKLEROSTINSKIH ANTITELA PREMA HUMANOM SKLEROSTINU.
BIAcore tehnologija prati vezivanje između biomolekula u realnom vremenu i bez potrebe obeležavanja. Jedan od među-reaktanata, nazvan ligand, je ili direktno imobilisano ili zarobljeno na imobilisanoj površini dok drugi, nazvan analit, pliva u rastvoru preko zarobljavajuće površine. Senzor detektuje promene u masi na površini senzora kako se analit vezuje za ligand čime se obrazuje kompleks na površini. Ovo odgovara procesu asocijacije. Proces disocijacije se prati kada se analit zamenjuje puferom. U afinitetnom BIAcore testu, ligand je anti-sklerostinsko antitelo, a analit je sklerostin.
Instrument
Biacore ® 3000, Biacore AT, Uppsala, Sweden
Čip senzora
CM5 (istraživački stepen) kataloški broj: BR-1001-14, Biacore AT, Uppsala, Sweden. Čipovi se čuvaju na 4°C.
Rastvor za BIAnormalizaciju
70% (tež/tež) glicerol. Deo BIAmaintenance pakovanja, kataloški broj: BR-1002-51, Biacore AT, Uppsala, Sweden. Pakovanja BIAmaintenance su čuvana na 4°C.
Pakovanje za aminsko kuplovanje
Kataloški broj: BR-1000-50, Biacore AT, Uppsala, Sweden.
Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid (EDC). Napravi se u 75 mg/mL destilovane vode i čuva u 200 ∞L-skim alikvotima na -70°C.
N-Hidroksisukcinimid (NHS). Napravi se u 11.5 mg/mL destilovane vode i čuva u 200 ∞L-skim alikvotima na -70°C.
1 M Etanolamin hidrohlorid-NaOH pH 8.5. Čuva se u 200 ∞L alikvotima na -70°C.
Puferi
Radni pufer za imobilizaciju zarobljavajućeg antitela: HBS-EP (jeste 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % surfaktant P20). Kataloški broj: BR-1001-88, Biacore AT, Uppsala, Sweden. Pufer se čuva na 4°C. Imobilizacioni pufer: acetat 5.0 (jeste 10 mM natrijum acetat pH 5.0). Kataloški broj: BR-1003-51, Biacore AT, Uppsala, Sweden. Pufer se čuva na 4°C.
Radni pufer za test vezivanja: HBS-EP (jeste 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % surfaktant P20, kataloški broj: BR-1001-88, Biacore AT, Uppsala, Sweden) sa CM-dekstranom koji se dodaje u konc. od 1 mg/mL (kataloški broj 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Switzerland). Pufer se čuva na 4°C.
Ligandno zarobljavanje
Afinitetno-čist F(At’)2 fragment kozijeg anti-humanog IgG, Fc fragment specifičan. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA) kataloški broj: 109-006-098. Reagens se čuva na 4°C.
Ligand
Humanizovana anti-humana sklerostinska antitela At5, At14i At20.
Analit
Rekombinantni humani sklerostin. Alikvoti se čuvaju na -70°C i jednom tope za svaki test.
Regeneracioni rastvor
40 mM HCl pripremljena rastvaranjem sa destilovanom vodom od matičnog 11.6 M rastvora (BDH, Poole, England. Catalogue number: 101254H).
5 mM NaOH pripremljen rastvaranjem sa destilovanom vodom od matičnog 50 mM rastvora. Kataloški broj: BR-1003-58, Biacore AT, Uppsala, Sweden.
Postupak testa
Test format je bilo zarobljavanje anti-sklerostin antitela pomoću imobilisanog anti-humanog IgG-Fc i zatim, titracija sklerostina preko zarobljavajuće površine.
Primer procedure je dat u nastavku:
BIA (Biamolecular Interaction Analysis) je izvedena korišćenjem BIAcore 3000 (BIAcore AB). Afinitetno-čist F(at’)2fragment kozijeg anti-humanog IgG, Fc fragment specifičan (Jackson ImmunoResearch) je imobilisan na CM5 senzor čipu putem hemije aminskog kuplovanja kako bi se zarobio nivo od ≈4000 jedinica odgovora (RUs). HBS-EP pufer (10mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA,
0.005 % surfaktant P20, BIAcore AB) koji sadrži 1 mg/mL CM-dekstrana korišćen je kao radni pufer sa brzinom protoka od 10 ∞l/min. Korišćena je 10 ∞l-ska injekcija antisklerostinskog antitela u koncentraciji od ~5 ∞g/mL za zarobljavanje na imobilisan antihumani IgG-Fc. Nivoi zarobljenog antitela obično su oko 100-200 RU. Sklerostin je titriran preko zarobljenih anti-sklerostinskih antitela u različitim koncentracijama pri brzini protoka od 30 ∞L/min. Površina je regenerisana pomoću dve 10 ∞L-ske injekcije od 40 mM HCl, a zatim sa 5 ∞L-skom injekcijom od 5 mM NaOH pri brzini protoka od 10 ∞L/min.
Krive vezivanja uz oduzet bekgraund su analizirane korišćenjem BIAevaluacionog softvera (verzija 3.2) prema standardnim procedurama. Kinetički parametri su određeni podešavanjem algoritma.
Kinetički podaci i i izračunate konstante disocijacije su prikazani u Tabeli 2.
TABELA 2: Afinitet anti-sklerostinskih antitela za sklerostin
PRIMER 12
IN VIVO TESTIRANJE ANTI-SKLEROSTINSKIH MONOKLONSKIH ANTITELA NA CYNOMOLGOUS MAJMUNIMA
Korišćeno je trideset tri, starosti otprilike 3-5 godina, ženki cynomolgus majmuna (Macaca fascicularis) u ovoj 2-mesečnoj studiji. Ispitivanje je obuhvatilo 11 grupa:
Grupa 1: vehikulum (N=4)
Grupa 2: At-23 (N=2, doza 3 mg/kg)
Grupa 3: At-23 (N=3, doza 10 mg/kg)
Grupa 4: At-23 (N=3, doza 30 mg/kg)
Grupa 5: At-5 (N=3, doza 3 mg/kg)
Grupa 6: At-5 (N=3, doza 10 mg/kg)
Grupa 7: At-5 (N=3, doza 30 mg/kg)
Grupa 8: At-14 (N=3, doza 3 mg/kg)
Grupa 9: At-14 (N=3, doza 10 mg/kg)
Grupa 10: At-14 (N=3, doza 30 mg/kg)
Grupa 11: Paratiroidni hormon (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, doza 10 ug/kg)
Sve doze su bile subkutane. PTH (1-34) je doziran svakodnevno, monoklonska antitela (MAts) su dozirana dva puta (prva doza na početku ispitivanja i druga doza u jednomesečnoj tački). Radi ispitivanja koštanih parametara (npr. mineralna gustina kostiju) izvedena su skeniranja pQCT (periferna kvantitativna kompjuterizovana tomografija) i DXA (apsorpciometrija dual energije X-zraka) pre otpočinjanja ispitivanja (da bi se dobile bazne vrednosti) i posle mesec dana (pre druge doze MAt) i, konačno na kraju ispitivanja (2-mesečna vremenska tačka) kada je nad majmunima izvršena autopsija za dalje analiziranje (npr. histomorfometrijska analiza). Životinje su obeležene fluorohromom (dani 14, 24, 47 i 57) radi dinamske histomorfometrije. Serum je sakupljan u različitim vremenskim tačkama u toku ispitivanja [dan 1 pre-dozirnja (dan prve MAt doze), dan 1 dvanaest sati posle doziranja, dan 2, dan 3, dan 5, dan 7, dan 14, dan 21, dan 28, dan 29 dvanaest sati posle doziranja (dan 29 je bio dan druge i poslednje MAt doze), dan 30, dan 31, dan 33, dan 35, dan 42, dan 49 i dan 56].
Merena su tri serumska biomarkera koja su u vezi sa kostima, korišćenjem komercijalno nabavljenih pakovanja:
Osteokalcin (OC) (DSL Osteocalcin Radioimmunoassay Kit; Diagnostic Systems LAtoratories, Inc.,Webster, TX, USA)
N-terminalni propeptid tip I prokolagen (P1NP) (P1NP Radioimmunoassay Kit; Orion Diagnostica, Espoo, Finland)
C-telopeptidni fragmenti kolagena tip I al lanaca (sCTXI) (Serum CrossLaps® ELISA; Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Herlev, Denmark).
pQCT i DXA skeniranja daju podatke u vezi sa različitim koštanim parametrima (uključujući mineralnu gustinu kosti (BMD) i mineralni sadržaj kostiju) duž brojnih tačaka na skeletu (uključujući tibialne metafize i dijafize, radijalne metafize i dijafize, vrat femura, lumbalnu kičmu). Analiza ovih koštanih podataka (procentualna promena od bazne linije za svaku životinju) i podataka o anaboličkim (OC, P1NP) serumskim biomarkerima (procentualna promena od bazne linije za svaku životinju) pokazuje statistički značajan porast, u odnosu na vehikulum grupu, za neke parametre u nekim od vremenskih tačaka i doza za svaki MAt. Ovi podaci koštanih parametara, podaci serumskih biomarkera, kao i histomorfometrijski podaci, ukazuju na to da je svako od 3 MAt-a (At-23, At-5 i At-14) bilo u mogućnosti da neutrališe sklerostin kod cynomolgous majmuna. Ova aktivnost je bila najjača za At-23 i At-5, naročito pri višim dozama (30 mg/kg), sa jasnim porastom u formiranju kosti (anabolički efekat) kao i ukupnim poboljšanjima na kostima (npr. BMD). Statistički značajan porast koštanih parametara i anaboličkih histomorfometrijskih parametara je, takođe, nađen kod pozitivne kontrolne grupe (PTH (1-34)).
Serumski markeri formiranja kosti (P1NP, osteokalcin) su povećani (p<0.05 vs vehikulum (VEH)) u različitim vremenskim tačkama i pri različitim dozama, ali naročito u grupi 30 mg/kg za At-23 i At-5. Histomorfometrijske analize pokazuju dramatične poraste (p<0.05 vs VEH) u pogledu brzine formiranja kosti u poroznim kostima na lumbalnoj kičmi i proksimalnoj tibiji (povećanje do 5-puta), kao i na endokortikalnoj površini srednje osovine femura (povećanje do 10-puta) pri višim dozama At-23 i At-5. Trabekularna debljina je uvećana pri višim dozama At-23 i At-5 u lumbalnoj kičmi (>60%, p<0.05 vs VEH). Kako se ispitivanje završavalo (2 meseca), površina BMD, kao procentualna promena od bazne linije, povećana je (p<0.05 vs VEH) na vratu femura, ultra-distalnom radiusu (At-23, 30 mg/kg), kao i lumbalnoj kičmi (At-5, 30 mg/kg). Porast površine BMD na lumbalnoj kičmi udružen je sa porastom snage kičme (97% porast u pogledu maksimalnog opterećenja kičme za At-23, 30 mg/kg; p<0.05 vs VEH); početne vrednosti (bazna linija, prim. prev.) lumbalne površine BMD pre doziranja MAt bile su statistički slične u svim grupama. U zaključku, kratkotrajno primenjivanje sklerostin-neutrališućih MAt-a kod cynomolgous majmuna dovodi delom do porasta formiranja kosti, BMD i koštane snage kičme.
<212> PRT 179
<400> 216

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Monoklonsko antitelo koje vezuje humani sklerostin; povećava bar jedno obrazovanje kosti, mineralnu gustinu kosti, koštanu masu, kvalitet kosti i jačinu kosti kod sisara ; i vezuje se za deo humanog sklerostina koji se sastoji od aminokiselina 51-64, 73-90, 101-117, i 138-149 SEQ ID NO: 1, gde pomenuti deo ima sva tri od :
(a) disulfidnu vezu između aminokiselina 57 i 111;
(b) disulfidnu vezu između aminokiselina 82 i 142; i
(c) disulfidnu vezu između aminokiselina 86 i 144.
2. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, gde se deo humanog sklerostina sastoji od aminokiselina 57-64, 73-86, 111-117, i 138-144 SEQ ID NO: 1 i ima sve tri pomenute disulfidne veze .
3. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1 ili 2 koje je F(ab’)2, Fab, Fab’ ili Fv fragment.
4. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koje je humanizovano antitelo ili humano antitelo .
5. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koje se vezuje za humani sklerostin sa afinitetom, koji je određen površinskom plazmon rezonancom, koji je bar 50, 100, 250, 500, 1000 ili 10,000 puta veći od afiniteta lizozima kokošijeg belanca.
6. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju osteroporoze ili osteopenije.
7. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu u poboljšanju ishoda u ortopedskim postupcima, stomatološkim postupcima, implantnoj hirurgiji, zameni zgloba, graftovanju kosti, kozmetičkoj hirurgiji kosti ili obnavljanju kosti kao što je zarastanje preloma, zaceljivanje bez šava, odloženo zaceljivanje sa šavom ili facijalna rekonstrukcija.
RS20211488A 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva RS62685B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67758305P 2005-05-03 2005-05-03
US77684706P 2006-02-24 2006-02-24
US78224406P 2006-03-13 2006-03-13
US79264506P 2006-04-17 2006-04-17
US11/411,003 US7592429B2 (en) 2005-05-03 2006-04-25 Sclerostin-binding antibody
EP19211623.4A EP3670528B1 (en) 2005-05-03 2006-04-28 Sclerostin binding agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62685B1 true RS62685B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=36992590

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150373A RS54049B1 (sr) 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva
RS20130358A RS52919B (sr) 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva
RS20211488A RS62685B1 (sr) 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150373A RS54049B1 (sr) 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva
RS20130358A RS52919B (sr) 2005-05-03 2006-04-28 Sklerostin vezujuća sredstva

Country Status (43)

Country Link
US (8) US7592429B2 (sr)
EP (7) EP3985015A1 (sr)
JP (4) JP5462484B2 (sr)
KR (4) KR101624809B1 (sr)
CN (4) CN107446043A (sr)
AR (1) AR053266A1 (sr)
AU (2) AU2006242476B2 (sr)
BE (1) BE2020C508I2 (sr)
BR (2) BRPI0610197B8 (sr)
CA (2) CA2607197C (sr)
CR (1) CR9524A (sr)
CY (4) CY1114350T1 (sr)
DK (3) DK2325199T3 (sr)
EA (2) EA037044B1 (sr)
ES (4) ES2412857T3 (sr)
FR (1) FR20C1010I2 (sr)
GE (2) GEP20125594B (sr)
GT (1) GT200600186A (sr)
HR (3) HRP20130803T1 (sr)
HU (3) HUE057097T2 (sr)
IL (3) IL187106A (sr)
LT (2) LT3670528T (sr)
LU (1) LUC00151I2 (sr)
MA (1) MA29528B1 (sr)
ME (2) ME02085B (sr)
MX (3) MX2007013759A (sr)
MY (1) MY163480A (sr)
NL (1) NL301034I2 (sr)
NO (4) NO346914B1 (sr)
NZ (2) NZ591636A (sr)
PE (1) PE20070317A1 (sr)
PH (1) PH12015501848A1 (sr)
PL (3) PL1891101T3 (sr)
PT (3) PT2325199E (sr)
RS (3) RS54049B1 (sr)
SG (1) SG10201403400UA (sr)
SI (3) SI2325199T1 (sr)
TN (1) TNSN07406A1 (sr)
TW (5) TWI778444B (sr)
UA (1) UA123695C2 (sr)
UY (2) UY29514A1 (sr)
WO (1) WO2006119107A2 (sr)
ZA (1) ZA200709480B (sr)

Families Citing this family (223)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
CA2352532C (en) 1998-11-27 2014-10-14 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
WO2003106657A2 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
NZ544618A (en) 2003-06-16 2009-02-28 Celltech R & D Inc Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
ITTO20050905A1 (it) * 2005-12-23 2007-06-24 Univ Degli Studi Torino Leganti sintetici capaci di legare l'ocratossina e relativi usi
WO2008133722A2 (en) * 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
EP2097450A2 (en) * 2006-11-10 2009-09-09 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2009131553A2 (en) 2006-12-29 2009-10-29 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
EA018204B1 (ru) 2007-03-20 2013-06-28 Эли Лилли Энд Компани Антитела против склеростина
US20130195881A1 (en) * 2007-04-27 2013-08-01 Sanjaya Singh Potent, stable and non-immunosuppressive anti-cd4 antibodies
US7977313B2 (en) * 2007-04-27 2011-07-12 Affinergy, Inc. Methods and compositions for promoting localization of pharmaceutically active agents to bone
JP5570989B2 (ja) * 2007-08-31 2014-08-13 アムジエン・インコーポレーテツド 固体タンパク質製剤
US7981415B2 (en) * 2007-09-07 2011-07-19 Cisthera, Inc. Humanized PAI-1 antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
JP2011506483A (ja) * 2007-12-14 2011-03-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた骨折の治療方法
EP2708559B1 (en) 2008-04-11 2018-03-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
JP5646457B2 (ja) * 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
JP2011523853A (ja) * 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
US8822645B2 (en) * 2008-07-08 2014-09-02 Abbvie Inc. Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP5782385B2 (ja) * 2009-02-17 2015-09-24 ユーシービー ファーマ ソシエテ アノニム ヒトｏｘ４０に対する特異性を有する抗体分子
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
RU2011148918A (ru) * 2009-05-01 2013-06-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулин с двумя вариабельными доменами и его применение
US9775819B2 (en) 2009-09-16 2017-10-03 R.P. Scherer Technologies, Llc Oral solid dosage form containing nanoparticles and process of formulating the same using fish gelatin
PE20121531A1 (es) * 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
EP2490957B1 (en) 2009-10-23 2016-11-23 Amgen, Inc Vial adapter and system
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MX2012011629A (es) 2010-04-07 2013-03-05 Abbvie Inc Proteinas de union a tnf-alfa.
US20130138221A1 (en) 2010-04-16 2013-05-30 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
SMT202000095T1 (it) 2010-05-14 2020-03-13 Amgen Inc Formulazioni di anticorpi anti-sclerostina ad alta concentrazione
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
RS54291B2 (sr) 2010-06-07 2023-12-29 Amgen Inc Uređaj za isporuku lekova
US9617323B2 (en) * 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
US9403882B2 (en) * 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
BR112013002578A2 (pt) 2010-08-03 2019-05-14 Abbvie Inc. imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
MX2013002270A (es) 2010-08-26 2013-05-14 Abbvie Inc Inmonoglubinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
US9879072B2 (en) 2010-10-27 2018-01-30 Amgen Inc. DKK1 antibodies and methods of use
EP2635694A4 (en) * 2010-11-02 2015-11-11 Abbott Lab VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF
PT3111954T (pt) 2010-11-05 2019-07-10 Novartis Ag Métodos de tratamento da espondilite anquilosante usando anticorpos anti-il-17
TWI654204B (zh) 2010-11-30 2019-03-21 中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
PT2654790T (pt) * 2010-12-22 2019-05-16 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticorpo modificado com semivida melhorada
CN103649118A (zh) 2011-03-01 2014-03-19 安进公司 双特异性结合剂
SG193610A1 (en) * 2011-03-25 2013-11-29 Amgen Inc Anti - sclerostin antibody crystals and formulations thereof
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
US20140127192A1 (en) 2011-04-19 2014-05-08 Amgen Inc Method for treating osteoporosis
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
PH12013502201A1 (en) 2011-04-25 2014-01-13 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antibody
EP2702408A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Novartis AG Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
ES2667554T3 (es) * 2011-08-04 2018-05-11 Amgen Inc. Método para el tratamiento de los defectos de espacio óseo
IL308846B2 (en) 2011-10-14 2025-03-01 Amgen Inc Injector and assembly method
WO2013063110A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
BR112014009799A2 (pt) 2011-10-24 2017-06-13 Abbvie Inc imunoligantes dirigidos conra tnf
SG11201401791WA (en) * 2011-10-24 2014-08-28 Abbvie Inc Immunobinders directed against sclerostin
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
MX354270B (es) 2011-12-28 2018-02-21 Amgen Inc Uso de un anticuerpo antiesclerostina en el tratamiento de la pérdida ósea alveolar. .
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
AU2013232266A1 (en) 2012-03-14 2014-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP2869844B2 (en) 2012-07-05 2023-06-21 UCB Pharma S.A. Treatment for bone diseases
TW202210507A (zh) 2012-11-01 2022-03-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
EP3081249B1 (en) 2012-11-21 2020-12-30 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
EP2970459A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-1beta and il-17
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
AU2014238546C1 (en) 2013-03-18 2019-01-17 Biocerox Products B.V. Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof
SI2976359T2 (sl) * 2013-03-20 2022-05-31 Genzyme Corporation Postopki zdravljenja imperfektne osteogeneze
KR102287687B1 (ko) 2013-03-22 2021-08-06 암젠 인크 인젝터 및 조립 방법
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
EP3789064B1 (en) 2013-10-24 2024-11-27 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US10758683B2 (en) 2013-10-24 2020-09-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN110642944B (zh) * 2014-03-07 2021-06-11 神州细胞工程有限公司 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途
JP6759104B2 (ja) 2014-04-04 2020-09-23 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 精密分子質量を用いた免疫グロブリンのアイソタイピング
CA2945026C (en) 2014-05-07 2023-10-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
EP4362039A3 (en) 2014-06-03 2024-08-07 Amgen Inc. Controllable drug delivery system and method of use
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
ES2964713T3 (es) 2014-10-23 2024-04-09 Amgen Inc Reducción de la viscosidad de formulaciones farmacéuticas
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
ES2898469T3 (es) 2014-12-19 2022-03-07 Amgen Inc Dispositivo de administración de medicamentos con sensor de proximidad
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
KR102584953B1 (ko) 2015-03-13 2023-10-04 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항 스클레로스틴 항체, 이의 항원 결합 단편 및 의학적 용도
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MY197218A (en) 2015-07-06 2023-06-02 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US20190135929A1 (en) 2015-08-28 2019-05-09 The General Hospital Corporation Agonistic anti-tumor necrosis factor receptor 2 antibodies
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
KR102812377B1 (ko) 2016-03-01 2025-05-23 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 인간 폴리오바이러스 수용체(ｐｖｒ)에 특이적인 항체
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
EP4035711B1 (en) 2016-03-15 2025-06-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
HUE052869T2 (hu) * 2016-03-17 2021-05-28 Tillotts Pharma Ag TNF-ellenes alfa-antitestek és ezek funkcionális fragmentjei
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
ES2959783T3 (es) 2016-05-13 2024-02-28 Amgen Inc Conjunto de cubierta protectora de vial
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
KR20190037261A (ko) 2016-08-08 2019-04-05 암젠 인크 항-스클레로스틴 항체를 사용한 결합 조직 부착 개선 방법
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
JP6918808B2 (ja) * 2016-08-31 2021-08-11 栄研化学株式会社 異なる方式で抗原を固定化した抗原担持不溶性担体粒子を用いる抗体測定法、抗体測定用試薬
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
US11414482B2 (en) 2016-11-08 2022-08-16 University Of Miami Anti-secretogranin III (SCG3) antibodies and uses thereof
JP2020502218A (ja) 2016-12-21 2020-01-23 メレオ バイオファーマ ３ リミテッド 骨形成不全症の処置における抗スクレロスチン抗体の使用
CN110325548B (zh) * 2016-12-21 2023-11-17 美莱奥生物制药第三有限公司 抗硬化蛋白抗体在治疗成骨不全症中的用途
US20190358411A1 (en) 2017-01-17 2019-11-28 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
US11608374B2 (en) * 2017-01-30 2023-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
JP7064501B2 (ja) 2017-02-17 2022-05-10 アムジエン・インコーポレーテツド 無菌流体流路を備える薬物送達デバイスおよび関連する組立方法
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7377596B2 (ja) 2017-02-22 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
CA3052310A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7672196B2 (ja) 2017-03-14 2025-05-07 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
HUE063805T2 (hu) 2017-03-28 2024-01-28 Amgen Inc Dugattyúrúd és fecskendõ összeállító rendszer és eljárás
NZ759517A (en) * 2017-04-27 2025-02-28 Tesaro Inc Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
US12103979B2 (en) 2017-04-28 2024-10-01 Amgen Inc. N-acetylated and non-acetylated dipeptides containing arginine to reduce the viscosity of viscous compositions of therapeutic polypeptides
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
EP3641857A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
CN109952093B (zh) 2017-07-27 2022-02-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种sost抗体药物组合物及其用途
US12104995B2 (en) 2017-08-01 2024-10-01 Amgen Inc. Systems and methods for performing a real-time assay of a sample
EP3662288B1 (en) 2017-08-01 2024-02-28 Amgen Inc. Systems and methods for performing a real-time glycan assay of a sample
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019051047A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T-LYMPHOCYTES EXPRESSING THE INTERLEUKIN-8 RECEPTOR
US11946937B2 (en) 2017-09-13 2024-04-02 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of apoptosis inhibitor of macrophage
US12153052B2 (en) 2017-09-13 2024-11-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of immunoglobulin J chains
US11759565B2 (en) 2017-10-04 2023-09-19 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP3691716B1 (en) 2017-10-06 2023-11-29 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
EP3694578B1 (en) 2017-10-09 2025-09-24 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
MX2020004736A (es) 2017-11-10 2020-08-13 Amgen Inc Embolos para dispositivos de administracion de farmacos.
SG11202002772VA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection
WO2019099324A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
EP3765856B1 (en) 2018-03-13 2023-09-27 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
MA52015A (fr) 2018-03-13 2021-01-20 Amgen Inc Digestion séquentielle de polypeptides pour une analyse par spectrométrie de masse
IL276910B2 (en) 2018-03-26 2025-11-01 Amgen Inc Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JP7405764B2 (ja) 2018-03-30 2023-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド Ｃ末端抗体改変体
JP7328990B2 (ja) 2018-04-30 2023-08-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｈｅｒ２及び／またはａｐｌｐ２に結合する抗体及び二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらのコンジュゲート及び使用
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
MY208638A (en) 2018-07-02 2025-05-21 Amgen Inc Anti-steap1 antigen-binding protein
CN112469454B (zh) 2018-07-24 2024-01-26 安进公司 用于施用药物的输送装置
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
EP3833327A1 (en) 2018-08-10 2021-06-16 Amgen Inc. Method of preparing an antibody pharmaceutical formulation
JP7713880B2 (ja) * 2018-08-20 2025-07-28 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アンタゴニスト性抗腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチド
CA3106452A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
AR116703A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administración de fármacos
EA202191037A1 (ru) 2018-10-15 2021-08-05 Эмджен Инк. Устройство доставки лекарственного средства, имеющее демпферный механизм
JP7548584B2 (ja) 2018-10-30 2024-09-10 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 抗ｃｄ７９ｂ抗体およびキメラ抗原レセプターおよびそれらの使用方法
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
IL281908B2 (en) 2018-11-01 2025-06-01 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN113302205B (zh) 2018-11-15 2024-12-06 综合医院公司 激动性肿瘤坏死因子受体超家族多肽
JP7769544B2 (ja) 2018-12-14 2025-11-13 アムジエン・インコーポレーテツド 勾配によるタンパク質濃度定量を伴う使用のためのシステム適合性方法
EP4397977A3 (en) 2019-02-14 2024-09-11 Amgen Inc. Systems and methods for preparing a sample and performing a real-time assay of the sample
ES2997116T3 (en) 2019-02-20 2025-02-14 Amgen Inc Methods of determining protein stability
WO2020180967A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 Amgen Inc. In vivo reversibility of high molecular weight species
CN109897105B (zh) * 2019-03-22 2022-05-20 天承南运(天津)科技有限公司 Ev71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条
CA3133459A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Amgen Inc. Methods of fingerprinting therapeutic proteins via a two-dimensional (2d) nuclear magnetic resonance technique at natural abundance for formulated biopharmaceutical products
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
US20220260584A1 (en) 2019-06-05 2022-08-18 Amgen Inc. Methods of identifying attributes of therapeutic proteins
CN114630677A (zh) 2019-08-12 2022-06-14 安进公司 抗硬骨素抗体配制品
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CN110499287B (zh) * 2019-08-30 2021-07-23 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
EP4034556A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
US20230183371A1 (en) * 2020-04-30 2023-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd79b antibodies and chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CN111537737B (zh) * 2020-05-18 2023-05-12 巴迪泰（广西）生物科技有限公司 降钙素原与c-反应蛋白联合检测试剂盒
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
WO2022061092A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Amgen Inc. Methods of processing a sample for peptide mapping analysis
CN118146382A (zh) * 2020-09-28 2024-06-07 安济盛生物医药有限公司 抗硬骨抑素构建体及其用途
CA3197930A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AU2021376246A1 (en) 2020-11-05 2023-06-08 Amgen Inc. Materials and methods for protein processing
KR102255372B1 (ko) 2020-11-24 2021-05-25 (주)발맥스기술 간편 제작 설치 가능 bog 열교환장치
EP4341161A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
EP4430174A1 (en) 2021-11-09 2024-09-18 Amgen Inc. Production of therapeutic proteins
CN118139882A (zh) * 2022-03-24 2024-06-04 安济盛生物医药有限公司 骨骼肌肉系统疾病的治疗
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2024259275A1 (en) 2023-06-14 2024-12-19 Bristol-Myers Squibb Company Near real time sialic acid quantitation of glycoproteins
TW202510908A (zh) 2023-07-19 2025-03-16 美商安進公司 用於治療性蛋白質配製物的緩衝液製備方法
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025101602A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Amgen Inc. Methods of analyzing amino acid content of a therapeutic protein
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025255028A1 (en) 2024-06-03 2025-12-11 Amgen Inc. High-throughput liquid chromatography-mass spectrometry-based peptide mapping

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US32011A (en) 1861-04-09 Coffee-pot
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) * 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4427115A (en) * 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
USRE32011E (en) * 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58117537A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Toray Ind Inc 感光性樹脂組成物
JPS5955608A (ja) * 1982-09-24 1984-03-30 Hitachi Ltd 増幅器
US4543439A (en) * 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US6054561A (en) * 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) * 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US4902614A (en) * 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) * 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) * 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3218637B2 (ja) * 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) * 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) * 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) * 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) * 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
EP0554376A4 (en) 1990-10-22 1994-08-24 Fox Chase Cancer Center Dna construct for providing rna therapy
US5145684A (en) * 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US5399363A (en) * 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
AU668349B2 (en) * 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
NZ267838A (en) * 1993-06-07 1997-12-19 Genentech Inc Preparation of an hiv gp 120 subunit vaccine involving determining a neutralising epitope in the v2 and/or c4 domains
US5543158A (en) * 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) * 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) * 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
JPH10511840A (ja) 1994-04-29 1998-11-17 クリエイティブ バイオモレキュールズ，インコーポレイテッド 形態形成タンパク質特異細胞表面レセプターおよびその使用
DE4427221A1 (de) 1994-08-01 1996-02-08 Gsf Forschungszentrum Umwelt Retrovirus-induzierte Osteoklasten-Modulation für die Osteoporose-Therapie
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) * 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) * 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
EP0871705A4 (en) * 1995-06-05 2000-01-26 Human Genome Sciences Inc CCN TYPE HUMAN GROWTH FACTOR
US5738868A (en) * 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US6207153B1 (en) * 1996-05-22 2001-03-27 Viventia Biotech, Inc. Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers
WO2000075317A2 (en) 1999-06-09 2000-12-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor
US6133426A (en) * 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6541212B2 (en) * 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
US6117911A (en) * 1997-04-11 2000-09-12 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
DE69839147T2 (de) * 1997-06-12 2009-02-19 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Künstliche antikörperpolypeptide
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
WO1999006554A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN MUSCLE AND OTHER MESODERMAL TISSUES
US6815201B2 (en) * 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
GB9818881D0 (en) * 1998-08-28 1998-10-21 Glaxo Group Ltd Compounds
US6544485B1 (en) * 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
CA2352532C (en) * 1998-11-27 2014-10-14 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2000044777A1 (en) * 1999-01-29 2000-08-03 Imclone Systems Incorporated Antibodies specific to kdr and uses thereof
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
JP2003525611A (ja) 2000-03-02 2003-09-02 アムジェン インコーポレーテッド コルディン様−２分子およびその使用
CA2410912A1 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
JP2004520005A (ja) 2000-06-19 2004-07-08 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー オステオレビン遺伝子多型性
CA2421056A1 (en) 2000-09-01 2002-03-28 Genentech, Inc. A polypeptide for use as a diagnostic marker for the presence of colon tumours
PT1324776E (pt) 2000-10-12 2009-12-23 Genentech Inc Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) * 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
DE10145772A1 (de) * 2001-09-17 2003-04-10 Bayer Cropscience Ag DELTA·1·-Pyrroline
EP1436329A4 (en) * 2001-09-20 2005-04-27 Alexion Pharma Inc ANTI-PDGF ANTIBODIES AND METHODS FOR PRODUCING FOCUSED ANTIBODIES
AUPR837201A0 (en) 2001-10-19 2001-11-15 BUKILIC, Aleksandar Method and apparatus for cleaning and disinfecting a toothbrush
JP4467304B2 (ja) 2001-12-06 2010-05-26 バイオコントロール システムズ，インコーポレイティド サンプル収集および試験システム
US20030186915A1 (en) * 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
JP4662714B2 (ja) * 2002-03-01 2011-03-30 セルテック アール アンド ディー インコーポレイテッド 骨密度を増減させる方法
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
FR2838379B1 (fr) 2002-04-12 2005-06-24 Valeo Climatisation Dispositif de purification de l'air de l'habitacle d'un vehicule automobile
US7893218B2 (en) * 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
WO2003106657A2 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
EP1572122A4 (en) 2002-11-01 2008-04-09 Us Gov Health & Human Serv METHOD FOR PREVENTING INFECTIONS OF BIOTERRORISM AGENTS WITH IMMUNOSTIMULATING CPG OLIGONUCLEOTIDES
DE10255152A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Von Langen Ursula Lang Schadstoffsauger
US7642238B2 (en) * 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20040141875A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
JP4660471B2 (ja) 2003-03-14 2011-03-30 セルテック アール アンド ディー， インコーポレイテッド ＴＧＦβ結合タンパク質のリガンドおよびその使用
US20050158303A1 (en) 2003-04-04 2005-07-21 Genentech, Inc. Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations
CU23403A1 (es) * 2003-04-23 2009-08-04 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores
NZ544618A (en) 2003-06-16 2009-02-28 Celltech R & D Inc Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
WO2005018912A1 (de) * 2003-07-21 2005-03-03 Alpla-Werke Alwin Lehner Gmbh & Co. Kg Verfahren zur herstellung eines preformlings für kunststoffflaschen
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US7371381B2 (en) * 2003-12-12 2008-05-13 Amgen Inc. Anti-galanin antibodies and uses thereof
US20050267233A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Joshi Ashok V Anti-microbial handle system
US7709611B2 (en) 2004-08-04 2010-05-04 Amgen Inc. Antibodies to Dkk-1
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EP1981910B1 (en) 2006-01-13 2013-06-26 A Chan Holding B.V. Method for identifying inhibitor of the glypican-sclerostin interaction
EP2097450A2 (en) 2006-11-10 2009-09-09 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2008133722A2 (en) 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
WO2009131553A2 (en) 2006-12-29 2009-10-29 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
CA2675639A1 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Novartis Ag Modulators of sclerostatin biniding partners for treating bone-related disorders
EA018204B1 (ru) 2007-03-20 2013-06-28 Эли Лилли Энд Компани Антитела против склеростина
CL2008002775A1 (es) * 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
BRPI0820327A2 (pt) 2007-11-02 2020-10-06 Novartis Ag moléculas e métodos para modulação de proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 6 (lrp6)
JP2011506483A (ja) 2007-12-14 2011-03-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた骨折の治療方法
JP2011523853A (ja) 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
AR075715A1 (es) 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
WO2010100179A2 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Novartis Ag Self-forming gel system for sustained drug delivery
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
SMT202000095T1 (it) * 2010-05-14 2020-03-13 Amgen Inc Formulazioni di anticorpi anti-sclerostina ad alta concentrazione
WO2012028683A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Novartis Ag Antibody gel system for sustained drug delivery
US9879072B2 (en) 2010-10-27 2018-01-30 Amgen Inc. DKK1 antibodies and methods of use
CN103649118A (zh) * 2011-03-01 2014-03-19 安进公司 双特异性结合剂
SG193610A1 (en) * 2011-03-25 2013-11-29 Amgen Inc Anti - sclerostin antibody crystals and formulations thereof
ES2667554T3 (es) * 2011-08-04 2018-05-11 Amgen Inc. Método para el tratamiento de los defectos de espacio óseo
MX354270B (es) * 2011-12-28 2018-02-21 Amgen Inc Uso de un anticuerpo antiesclerostina en el tratamiento de la pérdida ósea alveolar. .
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP7405764B2 (ja) * 2018-03-30 2023-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド Ｃ末端抗体改変体

Also Published As

Publication number Publication date
NO346914B1 (no) 2023-02-27
CA2607197A1 (en) 2006-11-09
WO2006119107A2 (en) 2006-11-09
TW200716667A (en) 2007-05-01
HK1108705A1 (en) 2008-05-16
CN103819558B (zh) 2016-08-24
NO2021014I1 (no) 2021-03-24
BRPI0610197B8 (pt) 2021-05-25
FR20C1010I1 (sr) 2020-05-01
EP2264063B1 (en) 2018-06-27
IL224968B (en) 2018-03-29
EP2336163A1 (en) 2011-06-22
WO2006119107A3 (en) 2006-12-28
NO20076046L (no) 2008-01-30
MX2007013759A (es) 2008-04-29
PT2325199E (pt) 2015-07-10
CY2020009I2 (el) 2020-11-25
CY2020009I1 (el) 2020-11-25
HUS2000007I1 (hu) 2020-03-30
JP2014012001A (ja) 2014-01-23
AU2006242476B2 (en) 2012-05-31
TWI888751B (zh) 2025-07-01
DK3670528T3 (da) 2021-12-06
EP2264063A1 (en) 2010-12-22
NO345294B1 (no) 2020-11-30
AR053266A1 (es) 2007-04-25
US20160168241A1 (en) 2016-06-16
TWI494320B (zh) 2015-08-01
PE20070317A1 (es) 2007-04-27
US8383801B2 (en) 2013-02-26
GT200600186A (es) 2007-02-09
MY163480A (en) 2017-09-15
EP2325199B1 (en) 2015-03-04
ES2412857T3 (es) 2013-07-12
UY38207A (es) 2020-11-30
US20200048338A1 (en) 2020-02-13
LTC1891101I2 (lt) 2020-09-25
JP5462484B2 (ja) 2014-04-02
HRP20211904T1 (hr) 2022-03-04
JP2014061000A (ja) 2014-04-10
CR9524A (es) 2008-05-21
TWI712613B (zh) 2020-12-11
SI3670528T1 (sl) 2022-01-31
CN103435698B (zh) 2018-08-31
GEP20166454B (en) 2016-04-11
US9296812B2 (en) 2016-03-29
TW201323438A (zh) 2013-06-16
NO20201120A1 (no) 2008-01-30
DK2325199T3 (da) 2015-05-26
SI2325199T1 (sl) 2015-07-31
UA123695C2 (uk) 2021-05-19
TW201741332A (zh) 2017-12-01
KR20140037293A (ko) 2014-03-26
LUC00151I2 (sr) 2021-02-15
IL187106A0 (en) 2008-02-09
AU2006242431A1 (en) 2006-11-09
JP5391360B2 (ja) 2014-01-15
US20110097342A1 (en) 2011-04-28
EA037044B1 (ru) 2021-01-29
MX2018005512A (es) 2021-11-16
EP2325200A1 (en) 2011-05-25
PT3670528T (pt) 2021-12-09
NL301034I2 (nl) 2020-05-13
KR101450888B1 (ko) 2014-10-16
BE2020C508I2 (sr) 2025-12-10
NO20230084A1 (no) 2008-01-30
ME02247B (me) 2015-10-30
CA2607197C (en) 2016-12-13
KR20130126752A (ko) 2013-11-20
TW202108605A (zh) 2021-03-01
LUC00151I1 (sr) 2020-03-16
CY1114350T1 (el) 2016-08-31
JP2013249303A (ja) 2013-12-12
JP5409952B2 (ja) 2014-02-05
ES2902548T3 (es) 2022-03-28
US7872106B2 (en) 2011-01-18
BRPI0610197A2 (pt) 2010-06-01
HUE025530T2 (en) 2016-04-28
DK1891101T3 (da) 2013-08-26
AU2006242476A1 (en) 2006-11-09
CN103435698A (zh) 2013-12-11
KR101653122B1 (ko) 2016-08-31
US20240270835A1 (en) 2024-08-15
EP1891101B1 (en) 2013-05-22
US20130203965A1 (en) 2013-08-08
SG10201403400UA (en) 2014-10-30
NZ563539A (en) 2011-04-29
RS54049B1 (sr) 2015-10-30
PL2325199T3 (pl) 2015-08-31
EP2325199A1 (en) 2011-05-25
GEP20125594B (en) 2012-08-10
LTPA2020506I1 (lt) 2020-04-27
SI1891101T1 (sl) 2013-10-30
EA021539B1 (ru) 2015-07-30
HUE057097T2 (hu) 2022-04-28
ME02085B (me) 2014-02-28
US20090304713A1 (en) 2009-12-10
HRP20150597T1 (hr) 2015-09-11
LT3670528T (lt) 2021-12-27
JP5789652B2 (ja) 2015-10-07
KR101624809B1 (ko) 2016-05-26
EA200702402A1 (ru) 2008-04-28
UY29514A1 (es) 2006-11-30
CN101287756A (zh) 2008-10-15
BRPI0610197B1 (pt) 2021-05-11
JP2008539726A (ja) 2008-11-20
TNSN07406A1 (en) 2009-03-17
US10562964B2 (en) 2020-02-18
NZ591636A (en) 2012-10-26
US8637643B2 (en) 2014-01-28
US7592429B2 (en) 2009-09-22
CA2947080A1 (en) 2006-11-09
PL3670528T3 (pl) 2022-01-31
US11939372B2 (en) 2024-03-26
CY1124802T1 (el) 2022-11-25
RS52919B (sr) 2014-02-28
AU2006242431B2 (en) 2012-11-08
ES2689143T3 (es) 2018-11-08
CN103819558A (zh) 2014-05-28
EA201400933A1 (ru) 2015-04-30
MA29528B1 (fr) 2008-06-02
US20130121997A1 (en) 2013-05-16
IL224967B (en) 2019-03-31
TW202323271A (zh) 2023-06-16
IL187106A (en) 2015-10-29
ES2537278T3 (es) 2015-06-05
EP3985015A1 (en) 2022-04-20
ZA200709480B (en) 2010-07-28
US20070110747A1 (en) 2007-05-17
NO348331B1 (no) 2024-11-25
EP1891101B8 (en) 2013-06-26
MX358705B (es) 2018-08-31
HRP20130803T1 (hr) 2013-11-08
CN101287756B (zh) 2014-06-25
TWI778444B (zh) 2022-09-21
PT1891101E (pt) 2013-08-23
BR122020023315B1 (pt) 2021-06-08
EP3670528A1 (en) 2020-06-24
KR20080011420A (ko) 2008-02-04
KR20150117302A (ko) 2015-10-19
HK1198444A1 (en) 2015-04-24
HK1151803A1 (zh) 2012-02-10
WO2006119107A9 (en) 2007-09-20
CN107446043A (zh) 2017-12-08
PL1891101T3 (pl) 2013-11-29
FR20C1010I2 (fr) 2021-03-05
CY1116525T1 (el) 2017-03-15
EP1891101A2 (en) 2008-02-27
PH12015501848A1 (en) 2020-07-06
EP3670528B1 (en) 2021-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7361086B2 (ja) スクレロスチンエピトープ
EP3670528B1 (en) Sclerostin binding agents
HK1153762B (en) Sclerostin epitopes
HK1152954A (en) Sclerostin binding agents
HK1149771B (en) Sclerostin epitopes
HK1149276B (en) Sclerostin binding antibodies
HK1145330B (en) Sclerostin epitopes
HK1153762A (en) Sclerostin epitopes
HK1149276A (en) Sclerostin binding antibodies
HK1145330A (en) Sclerostin epitopes
HK1146068B (en) Sclerostin binding antibody
HK1149771A (en) Sclerostin epitopes
HK1149021A (en) Sclerostin epitopes
HK1108705B (en) Sclerostin binding agents
HK1151544A (en) Sclerostin binding agents
HK1149021B (en) Sclerostin epitopes
HK1146068A (en) Sclerostin binding antibody