TW202510908A - 用於治療性蛋白質配製物的緩衝液製備方法 - Google Patents

Abstract

本揭露內容提供了用於製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液的材料和方法，該等方法包括 (a) 在等於或大於22°C的溫度下將鈣鹽、有機酸和二糖合併以產生混合物，以及 (b) 藉由團注添加將氫氧化鈉添加到 (a) 的混合物中。

Description

用於治療性蛋白質配製物的緩衝液製備方法

治療性蛋白質配製物係本領域已知的。然而，還需要以簡化和加速的方法來製備用於這樣的治療性蛋白質配製物的緩衝液，該方法還優化和平衡配製物組分的溶解度。

在一方面，本文描述了用於製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液的材料和方法，該等方法包括 (a) 在≥ 22°C（等於或大於22°C）的溫度下將鈣鹽、有機酸和二糖合併以產生混合物，以及 (b) 藉由團注添加將氫氧化鈉添加到 (a) 的混合物中。在一些實施方式中，鈣鹽係乙酸鈣。在一些實施方式中，有機酸係乙酸，如冰乙酸。在一些實施方式中，二糖係蔗糖。

除非另外說明，否則術語「包含（comprising）」、「具有（having）」、「包括（including）」和「含有（containing）」應被解釋為開放性術語（即，意指「包括但不限於」，並且允許存在一或多個另外的特徵或組分）。應理解，雖然說明書中的多個實施方式係使用「包含」語言呈現的，但在多種情況下，也可以使用「由……組成」或「基本上由……組成」語言來描述相關的實施方式。除非上下文另有指示，否則應注意，術語「一種/一個（a或an）」係指一種/一個或多種/多個，例如，「一種/一個免疫球蛋白分子」應理解為代表一種/一個或多種/多個免疫球蛋白分子。同樣地，術語「一種/一個」、「一或多種/一或多個」以及「至少一種/至少一個（at least one）」在本文中可互換地使用。此外，「和/或」在本文中使用的情況下應被視為具有或不具有另一個指定特徵或組分的兩個指定特徵或組分中的每一個的具體揭露內容。因此，如在本文中在諸如「A和/或B」的短語中使用的術語「和/或」旨在包括「A和B」、「A或B」、「A」（單獨）和「B」（單獨）。同樣，如在諸如「A、B和/或C」的短語中使用的術語「和/或」旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；以及C（單獨）。

還應理解，當描述值範圍時，所描述的特徵可為在該範圍內找到的單個值。例如，「從約pH 4至約pH 6的pH」可為但不限於，pH 4、4.2、4.6、5.1、5.5等，以及該等值之間的任何值。另外，「從約pH 4至約pH 6的pH」不應被解釋為意指所考慮製劑的pH在儲存期間在pH 4至pH 6的範圍內變化2個pH單位，而係指溶液的pH可以在該範圍內挑選值，並且pH在約該pH下保持緩衝。

在本文所述之任何範圍內，該範圍的端點包括在該範圍內。然而，該描述還考慮了排除較低和/或較高端點的相同範圍。從本申請的整體，包括附圖和具體實施方式，本發明之另外的特徵和變化對於熟悉該項技術者而言將是顯而易見的，並且所有該等特徵都旨在作為本發明之方面。同樣，本文所述之本發明之特徵可以重組成另外的實施方式，該等實施方式也旨在作為本發明之方面，無論該等特徵的組合是否在上文作為本發明之一個方面或實施方式特別提及。而且，只有本文所述之對本發明關鍵的限制才應被視為如此；本發明之缺少限制的變化（本文未描述為關鍵的那些）旨在作為本發明之方面。

除非本文另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本揭露內容所屬領域的普通技術者通常理解的相同含義。例如，以下通用詞典為技術者提供了在本揭露內容中使用的許多術語：Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology [生物醫學與分子生物學簡明詞典], Juo, Pei-Show, 第2版, 2002,CRC Press [CRC出版社]；Dictionary of Cell and Molecular Biology [細胞和分子生物學詞典], 第3版, 1999, Academic Press [美國學術出版社]；以及 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology [牛津生物化學與分子生物學詞典], 修訂版, 2000, Oxford University Press [牛津大學出版社]。

本文引用的所有參考文獻藉由引用以其整體特此併入。

藉由引用併入以電子方式提交的材料

藉由引用以其全文併入的是與本文同時提交的電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表，並且其標識如下：XML檔命名為「58404P_SeqListing.xml」，13,568位元組，創建於2023年7月19日。 藉由引用併入

以下申請藉由引用以其整體特此併入：於2012年8月2日提交的國際專利申請案號PCT/US2012/049331，其要求於2011年8月4日提交的美國臨時專利申請案號61/515,191的優先權；於2006年4月25日提交的美國專利申請案號11/410,540，其要求於2006年4月17日提交的美國臨時專利申請案號60/792,645、於2006年3月13日提交的美國臨時專利申請案號60/782,244、於2006年2月24日提交的美國臨時專利申請案號60/776,847、和於2005年5月3日提交的美國臨時專利申請案號60/677,583的優先權；以及於2006年4月25日提交的美國專利申請案號11/411,003（以美國專利案號7,592,429發佈），其要求於2006年4月17日提交的美國臨時專利申請案號60/792,645、於2006年3月13日提交的美國臨時專利申請案號60/782,244、於2006年2月24日提交的美國臨時專利申請案號60/776,847、和於2005年5月3日提交的美國臨時專利申請案號60/677,583的優先權。以下申請也藉由引用特此併入：於2008年9月17日提交的美國專利申請案號12/212,327，其要求於2007年9月17日提交的美國臨時專利申請案號60/973,024的優先權；以及於2010年6月29日提交的美國專利申請案號12/811,171，其係依照於2008年12月15日提交的國際專利申請案號PCT/US08/86864的35 U.S.C. § 371的美國國家階段申請，其要求於2007年12月14日提交的美國臨時專利申請案號61/013,917的權益。

本揭露內容基於用於製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液的改進方法的發現，該改進方法包括以恒定混合速度和在恒定溫度下的固定混合時間，以及用氫氧化鈉團注添加替代NaOH滴定，以產生用於治療性蛋白質配製物的緩衝液製劑。該方法旨在優化和平衡不同配製物組分的溶解度。本文提供的方法的另外的益處係減少組分的添加步驟、限定固定混合速度、減少總混合時間以及最大限度的減少樣本收集和分析。

因此，在一方面，文本描述了製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液之方法，該方法包括 (a) 在≥ 22°C的溫度下將鈣鹽、有機酸和二糖合併以產生混合物，以及 (b) 藉由團注添加將氫氧化鈉添加到 (a) 的混合物中。在一方面，鈣鹽係乙酸鈣。在一方面，有機酸係乙酸，如冰乙酸。在一方面，二糖係蔗糖。

在一些實施方式中，步驟 (a) 包括 (i) 將鈣鹽和有機酸與水（例如，注射用水或無菌水）混合≤ 20分鐘（例如，範圍係16-20分鐘）的時間段，以產生 (i) 的混合物，以及 (ii) 將二糖添加到 (i) 的混合物中並進一步混合≤ 20分鐘（例如，範圍係16-20分鐘）以產生 (ii) 的混合物。步驟 (a) 在≥ 22°C的溫度下進行。在一方面，步驟 (a) 的步驟 (i) 和 (ii) 在相同的溫度下進行。在另一方面，步驟 (a) 的步驟 (i) 和 (ii) 在不同的溫度下進行。在一些實施方式中，步驟 (a) 在22°C與32°C之間的溫度下進行。在一些實施方式中，步驟 (a) 在27°C下進行。在一些實施方式中，鈣鹽係乙酸鈣。在一些實施方式中，有機酸係乙酸，如冰乙酸。在一些實施方式中，二糖係蔗糖。

在步驟 (b) 中，藉由團注添加將氫氧化鈉（NaOH）添加到 (a) 的混合物中以產生 (b) 的混合物。在一些實施方式中，步驟 (b) 進一步包括在團注添加氫氧化鈉後混合≤ 4分鐘的時間段（例如，範圍從約2至約4分鐘的時間段）。在一些實施方式中，步驟 (b) 包括在團注添加氫氧化鈉後將混合物混合約2分鐘、約3分鐘或約4分鐘。

在一些實施方式中，步驟 (b) 在≥ 22°C的溫度下進行。在一些實施方式中，步驟 (b) 在約22°C與約32°C之間的溫度下進行。在一些實施方式中，步驟 (b) 在22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C或32°C的溫度下進行。在一些實施方式中，步驟 (b) 在約27°C的溫度下進行。

在一些實施方式中，用於步驟 (a)（包括步驟 (i) 和 (ii)）和步驟 (b) 的混合速度範圍係從約135 rpm至約170 rpm。在一些實施方式中，用於步驟 (a) 和步驟 (b) 的混合速度範圍係從約135 rpm至約155 rpm或從約140 rpm至約150 rpm。在一些實施方式中，用於步驟 (a) 和步驟 (b) 的混合速度範圍係約145 rpm。在一方面，步驟 (a) 和步驟 (b) 具有相同的混合速度。在另一方面，步驟 (a) 的步驟 (i) 和 (ii) 具有相同的混合速度。在又其他方面，步驟 (a) 的步驟 (i) 和 (ii) 和步驟 (b) 具有相同的混合速度。在一些實施方式中，混合速度係約135 rpm、或約140 rpm、或約145 rpm、或約150 rpm、或約155 rpm、或約160 rpm、或約165 rpm、或約170 rpm。在一些實施方式中，混合速度係135 rpm、136 rpm、137 rpm、138 rpm、139 rpm、140 rpm、141 rpm、142 rpm、143 rpm、144 rpm、145 rpm、146 rpm、147 rpm、148 rpm、149 rpm、150 rpm、151 rpm、152 rpm、153 rpm、154 rpm、155 rpm、156 rpm、157 rpm、158 rpm、159 rpm、160 rpm、161 rpm、162 rpm、163 rpm、164 rpm、165 rpm、166 rpm、167 rpm、168 rpm、169 rpm、或170 rpm。

在一些實施方式中，該方法包括將水添加到步驟 (b) 的混合物中，較佳的是在混合後添加。為了獲得（最終）緩衝液中不同組分的所希望的濃度，可能需要此步驟。在一些實施方式中，該方法包括將水添加到步驟 (b) 的混合物中並混合。在一些實施方式中，該方法包括將水添加到步驟 (b) 的混合物中並在冷卻步驟前混合。在一些實施方式中，該方法包括將水添加到步驟 (b) 的混合物中並混合≤ 4分鐘（例如，約2至約4分鐘）。在一些實施方式中，該方法包括將水添加到步驟 (b) 的混合物中並混合約2分鐘、約3分鐘或約4分鐘。在一方面，水係注射用水或無菌水。

在一方面，混合添加的水（以上部分中提及）在≥ 22°C的溫度下進行。在另一方面，混合該水在22°C與32°C之間的溫度下進行。在一些實施方式中，混合該水在22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C或32°C的溫度下進行。在一些實施方式中，混合該水在約27°C的溫度下進行。

在一方面，混合添加的水（在以上兩部分中提及）在範圍從約135 rpm至約155 rpm或從約140 rpm至約150 rpm的混合速度下進行。在一些實施方式中，混合速度係約145 rpm。在一些實施方式中，混合速度係約135 rpm、或約140 rpm、或約145 rpm、或約150 rpm、或約155 rpm。在一些實施方式中，混合速度係135 rpm、136 rpm、137 rpm、138 rpm、139 rpm、140 rpm、141 rpm、142 rpm、143 rpm、144 rpm、145 rpm、146 rpm、147 rpm、148 rpm、149 rpm、150 rpm、151 rpm、152 rpm、153 rpm、154 rpm或155 rpm。

在一些實施方式中，該方法包括小於約60分鐘（即，約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘或約60分鐘）的總混合時間（即，用於步驟 (a)、用於步驟 (b) 和用於在步驟 (b) 後混合所添加的水的混合時間）。在一些實施方式中，該方法包括範圍從約36分鐘至約48分鐘的總混合時間。在一些實施方式中，該方法包括約36分鐘、或約37分鐘、或約38分鐘、或約39分鐘、或約40分鐘、或約41分鐘、或約42分鐘、或約43分鐘、或約44分鐘、或約45分鐘、或約46分鐘、或約47分鐘、或約48分鐘、或約49分鐘、或約50分鐘、或約51分鐘、或約52分鐘、或約53分鐘、或約54分鐘、或約55分鐘、或約56分鐘、或約57分鐘、或約58分鐘、或約59分鐘或約60分鐘的總混合時間。在一些實施方式中，該方法包括約36-48分鐘或約38-46分鐘或約40-44分鐘或約42分鐘的總混合時間。

在一些實施方式中，該方法包括將根據本文揭露的方法製備的緩衝液（即，在步驟 (b) 後或在將水添加到步驟 (b) 的混合物中後）冷卻至範圍從約2°C至約8°C的溫度。在一些實施方式中，該方法包括將緩衝液冷卻至2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C或8°C的溫度。在一些實施方式中，該方法包括將緩衝液冷卻至約5°C的溫度。

在一些實施方式中，緩衝液中二糖（例如，蔗糖）的最終濃度高於緩衝液中鈣鹽（例如，乙酸鈣）的最終濃度。在一些實施方式中，在緩衝液的所有組分中，二糖（例如，蔗糖）具有最高的最終濃度（無論隨後可以添加到最終緩衝液中的治療性蛋白質的濃度如何）。在一些實施方式中，將二糖（例如，蔗糖）以一定量[例如，以每1 kg緩衝液/最終緩衝液的克數表示]添加到混合物中，該量係添加到混合物中的鈣鹽（例如，乙酸鈣）的量的至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。

本文揭露的緩衝液製備方法包括將鈣鹽、有機酸和二糖合併，隨後添加NaOH。在一些實施方式中，鈣鹽（例如，乙酸鈣）以每1 kg最終緩衝液約0.2 g至約20 g、或約0.4 g至約15 g、或約0.6 g至約12 g、或約0.8 g至約10 g、或約1 g至約5 g、或約1.5 g至約4 g、或約1.7 g至約3 g、或約2 g的量添加。還考慮了具有前述端點的組合的任何範圍。

在一些實施方式中，二糖（例如，蔗糖）以每1 kg最終緩衝液約6 g至約180 g、約10 g至約150 g、約10 g至約120 g、約20 g至約100 g、約30 g至約90 g、約40 g至約80 g、約50 g至約70 g、約55 g至約65 g、約59 g或約60 g的量添加。還考慮了具有前述端點的組合的任何範圍。

在一些實施方式中，有機酸（例如，冰乙酸）以每1 kg最終緩衝液約0.2 g至約20 g、或約0.4 g至約15 g、或約0.6 g至約12 g、或約0.5 g至約5 g、或約0.8 g至約3 g、或約1 g至約2.5 g、或約1.2 g至約2.2 g、或約1.4 g至約2 g、或約1.7 g的量添加。還考慮了具有前述端點的組合的任何範圍。

在一些實施方式中，NaOH以每1 kg最終緩衝液約0.2 mL至約20 mL、或約0.4 mL至約15 mL、或約0.6 mL至約12 mL、或約0.5 mL至約5 mL、或約0.8 mL至約3 mL、或約1 mL至約2.5 mL、或約1.2 mL至約2.2 mL、或約1.4 mL至約2 mL、或約1.65 mL的量添加。還考慮了具有前述端點的組合的任何範圍。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液中鈣的濃度範圍係從1 mM至130 mM。在一些實施方式中，緩衝液中鈣的濃度範圍係從1 mM至30 mM或範圍係從5 mM至20 mM或範圍係從10 mM至15 mM。在一些實施方式中，鈣以至少1 mM、至少2 mM、至少3 mM、至少4 mM、至少5 mM、至少6 mM、至少7 mM、至少8 mM、至少9 mM、至少10 mM、至少11 mM、或至少12 mM的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，緩衝液中鈣的濃度係約13 mM。在某些實施方式中，緩衝液中鈣的濃度不大於約13 mM、不大於約14 mM、不大於約15 mM、不大於約16 mM、不大於約17 mM、不大於約18 mM、不大於約19 mM、不大於約20 mM、不大於約21 mM、不大於約22 mM、不大於約23 mM、不大於約24 mM、不大於約25 mM、不大於約26 mM、不大於約27 mM、不大於約28 mM、不大於約29 mM或不大於約30 mM。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍，該範圍包括但不限於從約5 mM至約30 mM、或從約10 mM至約20 mM。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液中乙酸鹽的濃度範圍係從約5 mM至約100 mM。在一些實施方式中，緩衝液中乙酸鹽的濃度範圍係從約10 mM至約90 mM、或從約20 mM至約80 mM、或從約30 mM至約70 mM、或從約35 mM至約75 mM、或從約40 mM至約70 mM、或從約45 mM至約65 mM。在一些實施方式中，緩衝液中乙酸鹽的濃度範圍係從約50 mM至約60 mM。在一些實施方式中，乙酸鹽以至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、或至少約50 mM的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，緩衝液中乙酸鹽的濃度不大於約60 mM、不大於約65 mM、不大於約70 mM、不大於約75 mM、不大於約80 mM、不大於約85 mM、不大於約90 mM、不大於約100 mM、不大於約110 mM、不大於約120 mM、或不大於約130 mM。在一些實施方式中，緩衝液中乙酸鹽的濃度係約55 mM。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍，該範圍包括但不限於從約45 mM至約65 mM。

在一些方面，根據本文所述之方法製備的緩衝液包含總濃度係至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少55 mM、至少60 mM或至少65 mM的乙酸鹽。在一些實施方式中，乙酸鹽的濃度不大於約30 mM、不大於約35 mM、不大於約40 mM，不大於約45 mM、不大於約50 mM、不大於約55 mM、不大於約60 mM、不大於約65 mM、不大於約70 mM、不大於約75 mM、不大於約80 mM、不大於約85 mM或不大於約90 mM。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍，該範圍包括但不限於：約10 mM至約55 mM、約20 mM至約55 mM、約20 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、或約30 mM至約75 mM。藉由非限制性實例的方式，含有10 mM乙酸鈣的溶液將具有20 mM乙酸鹽陰離子和10 mM鈣陽離子（因為鈣陽離子具有二價的性質），而含有10 mM乙酸鈉的溶液將具有10 mM鈉陽離子和10 mM乙酸鹽陰離子。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液中離子（陽離子和陰離子）的總濃度係至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、或至少約85 mM。在一些實施方式中，緩衝液中離子的總濃度不大於約30 mM、不大於約35 mM、不大於約40 mM、不大於約45 mM、不大於約50 mM、不大於約55 mM、不大於約60 mM、不大於約65 mM、不大於約70 mM、不大於約75 mM、不大於約80 mM、不大於約85 mM、不大於約90 mM、不大於約95 mM、不大於約100 mM、不大於約110 mM、不大於約120 mM、不大於約130 mM、不大於約140 mM、不大於約150 mM、不大於約160 mM、不大於約170 mM、不大於約180 mM、不大於約190 mM或不大於約200 mM。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍，該範圍包括但不限於：約30 mM至約60 mM、或約30 mM至約70 mM、或約30 mM至約80 mM、或約40 mM至約150 mM、或約50 mM至約150 mM。藉由非限制性實例的方式，10 mM乙酸鈣的溶液將具有30 mM總濃度的離子（10 mM陽離子和20 mM陰離子）。

本文揭露的緩衝液製備方法包括將二糖與鈣鹽和有機酸合併。示例性鈣鹽包括但不限於乙酸鈣、碳酸鈣、和氯化鈣。在一些實施方式中，鈣鹽係乙酸鈣。

本文揭露的緩衝液製備方法包括將二糖與鈣鹽和有機酸合併。示例性二糖包括但不限於蔗糖、海藻糖、乳糖、和麥芽糖。在一些實施方式中，二糖係蔗糖。

本文揭露的緩衝液製備方法包括將二糖與鈣鹽和有機酸合併。示例性有機酸包括但不限於乙酸、檸檬酸、麩胺酸、組胺酸、乳酸、琥珀酸、和天冬胺酸。在一些實施方式中，有機酸係乙酸，如冰乙酸。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液包含總濃度係約0.1%至約30% w/v、或約0.5%至約20% w/v、或約1%至約10% w/v的二糖（根據本發明之一個方面，其可為蔗糖）。在一些實施方式中，二糖以約1%至約12% w/v的濃度存在於緩衝液中。在另一個實施方式中，二糖以約2%至約10%的濃度存在於緩衝液中。在另一個實施方式中，二糖以約3%至約9%的濃度存在於緩衝液中。在另一個實施方式中，二糖以約4%至約8%的濃度存在於緩衝液中。在另一個實施方式中，二糖以約5%至約7%的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，二糖以約6% w/v的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，二糖以至少0.5、至少1% w/v、至少2% w/v、至少3% w/v、至少4% w/v、至少5% w/v、或至少6% w/v的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，二糖以不超過30% w/v、不超過25% w/v、不超過20% w/v、不超過15% w/v、不超過14% w/v、不超過13% w/v、不超過12% w/v、不超過11% w/v、不超過10% w/v、不超過9% w/v、不超過8% w/v、不超過7% w/v、或不超過6% w/v的濃度存在於緩衝液中。在一些實施方式中，二糖以約1% w/v、約2% w/v、約3% w/v、約4% w/v、約5% w/v、約6% w/v、約7% w/v、約8% w/v、約9% w/v、約10% w/v、約11% w/v、約12% w/v、約13% w/v、約14% w/v或約15% w/v的濃度存在於緩衝液中。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍。在一些實施方式中，二糖係蔗糖，並且上述範圍和值同樣適用於蔗糖。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液包含13 mM鈣、55 mM乙酸鹽和6%（w/v）蔗糖。在一方面，混合物的pH係5.2。

在一些實施方式中，根據本文所述之方法製備的緩衝液的pH範圍係從約4至約6。在一些實施方式中，緩衝液的pH範圍係從約4.5至約6或從約4.8至約5.6。在一些實施方式中，緩衝液的pH範圍係從約5.0至約5.4或從約5.1至約5.3。在一些實施方式中，緩衝液的pH係4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6。在一些實施方式中，緩衝液的pH係5.2。

治療性蛋白質

「治療性蛋白質」係一種基於蛋白質的藥物。該術語可以包括天然存在的蛋白質（例如，人蛋白質）的基因工程化形式的藥物。治療性蛋白質可用於替代特定疾病中異常或缺陷的蛋白質。它們還可以增加對身體有益的蛋白質的供應，以幫助減少疾病或化療的影響。基因工程化的蛋白質可以與它們所替代的天然蛋白質非常相似，或者可以藉由添加糖或延長蛋白質活性持續時間的其他分子來增強它們。

在一些實施方式中，治療性蛋白質係傳訊蛋白、細胞介素、酶或酶替代物、CD蛋白或其胞外結構域、生長因子、生長因子受體或其胞外結構域、細胞黏附分子或其胞外結構域、激素或激素類似物、凝血因子、凝血相關蛋白、群落刺激因子、其受體、或前述任一種的生物活性片段或類似物或變體或受體或受體片段。

在一些實施方式中，將治療性蛋白質添加到製備的緩衝液中以獲得濃度係至少約10 mg/ml、至少約15 mg/ml、至少約20 mg/ml、至少約25 mg/ml、至少約30 mg/ml、至少約35 mg/ml、至少約40 mg/ml、至少約45 mg/ml、至少約50 mg/ml、至少約55 mg/ml、至少約60 mg/ml、至少約65 mg/ml、至少約70 mg/ml、至少約75 mg/ml、至少約80 mg/ml、至少約81 mg/ml、至少約82 mg/ml、至少約83 mg/ml、至少約84 mg/ml、至少約85 mg/ml、至少約86 mg/ml、至少約87 mg/ml、至少約88 mg/ml、至少約89 mg/ml、或至少約90mg/ml的治療性蛋白質。在一些實施方式中，將治療性蛋白質添加到製備的緩衝液中以獲得濃度係不超過約90 mg/ml、不超過約91 mg/ml、不超過約92 mg/ml、不超過約93 mg/ml、不超過約94 mg/ml、不超過約95 mg/ml、不超過約96 mg/ml、不超過約97 mg/ml、不超過約98 mg/ml、不超過約99 mg/ml、不超過約100 mg/ml、不超過約105 mg/ml、不超過約110 mg/ml、不超過約115 mg/ml、不超過約120 mg/ml、不超過約125 mg/ml、不超過約130 mg/ml、不超過約135 mg/ml、不超過約140 mg/ml、不超過約145 mg/ml、不超過約150 mg/ml、不超過約155 mg/ml、不超過約160 mg/ml、不超過約165 mg/ml、不超過約170 mg/ml、不超過約175 mg/ml、或不超過約180 mg/ml的治療性蛋白質。在一些實施方式中，將治療性蛋白質添加到製備的緩衝液中以獲得濃度係高達例如，約300 mg/ml、約290 mg/ml、約280 mg/ml、約270 mg/ml、約260 mg/ml、約250 mg/ml、約240 mg/ml、約230 mg/ml、約220 mg/ml、約210 mg/ml、約200 mg/ml、或約190 mg/ml的治療性蛋白質。考慮了具有前述端點的組合的任何範圍，該範圍包括但不限於：約50 mg/ml至約150 mg/ml、約60 mg/ml至約120 mg/ml、約65 mg/ml至約115 mg/ml、約70 mg/ml至約110 mg/ml、約75 mg/ml至約105 mg/ml、約80 mg/ml至約100 mg/ml、或約85 mg/ml至約95 mg/ml。在一些實施方式中，將治療性蛋白質添加到製備的緩衝液中以獲得濃度係約90 mg/ml的治療性蛋白質。

在一些實施方式中，治療性蛋白質係抗原結合蛋白。「抗原結合蛋白」係指特異性結合指定抗原的蛋白。抗原結合蛋白之實例包括但不限於抗體、肽體、抗體片段、抗體構建體、多特異性（如雙特異性或三特異性）抗體或抗體構建體、BiTE®分子和融合蛋白。該術語涵蓋包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈的完整抗體（包括完整雙特異性抗體），以及其衍生物、變體、片段及突變。抗原結合蛋白還包括結構域抗體，如奈米抗體和scFv。

在一些實施方式中，抗原結合蛋白係抗體。如本文所用，術語「抗體」係指具有常規免疫球蛋白形式、包含重鏈及輕鏈且包含可變區及恒定區的蛋白質。抗體具有可變區和恒定區。在IgG形式中，可變區通常是約100個至110個或更多個胺基酸，包含三個互補決定區（CDR），主要負責抗原識別，並且與結合不同抗原的其他抗體差異很大。恒定區允許抗體募集免疫系統的細胞和分子。可變區由每條輕鏈和重鏈的N末端區域構成，而恒定區由每條重鏈和輕鏈的C末端部分構成。（Janeway等人, 「Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes [抗體分子和免疫球蛋白基因的結構]」, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease [免疫生物學：健康與疾病的免疫系統], 第4版 Elsevier Science Ltd./Garland Publishing [愛思唯爾科學有限公司/加蘭出版社], (1999)）。

本領域已經描述了抗體CDR的一般結構和特性。簡言之，在抗體支架中，CDR嵌埋於重鏈及輕鏈可變區中的框架內，在這裡其構成主要負責抗原結合及識別的區域。可變區包含至少三個重鏈或輕鏈CDR（Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學關注的蛋白質序列], Public Health Service [美國公共衛生署] N.I.H., 貝塞斯達, 馬里蘭州；還參見Chothia和Lesk, 1987, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 196:901-917；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342: 877-883），位於框架區內（由Kabat等人, 1991指定框架區1-4、FR1、FR2、FR3、和FR4；還參見Chothia和Lesk, 1987, 同上）。

人輕鏈分類為κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限於IgM1和IgM2。本發明之實施方式包括抗體的所有這樣的類別或同種型。輕鏈恒定區可為例如κ型或λ型輕鏈恒定區，例如人κ型或λ型輕鏈恒定區。重鏈恒定區可為例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重鏈恒定區，例如人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重鏈恒定區。因此，在示例性實施方式中，抗體係同種型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗體，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一種。IgG抗體以及特別是IgG2抗體代表本揭露內容的一個較佳的實施方式。

抗體可為單株抗體或多株抗體。在一些實施方式中，抗體包含與由哺乳動物（例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等）產生的天然存在的抗體基本上相似的序列。在這方面，抗體可以被認為是哺乳動物抗體，例如小鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、馬抗體、雞抗體、倉鼠抗體、人抗體等。在某些方面，單株抗體係人類抗體。在某些方面，單株抗體係嵌合抗體或人源化抗體。術語「嵌合抗體」在本文中用於指含有來自一個物種的恒定結構域和來自第二物種的可變結構域，或更一般而言，含有來自至少兩個物種的胺基酸序列區段的抗體。術語「人源化」在關於抗體使用時係指至少具有來自經工程化以具有比原始來源抗體更類似於真人抗體的結構和免疫學功能的非人來源CDR區的抗體。例如，人源化可涉及將來自非人抗體（例如小鼠抗體）的CDR接枝到人抗體中。人源化也可涉及選擇胺基酸取代以使非人類序列看起來更類似人類序列。

有利地，本文揭露的用於製備用於治療性蛋白質配製物（如抗體配製物）的緩衝液之方法不受限於抗體的抗原特異性。相應地，抗體（或抗體片段或抗體蛋白產物）可以對幾乎任何抗原都具有任何結合特異性。在示例性方面，抗體與激素、生長因子、細胞介素、細胞表面受體或其任何配體結合。

在一些實施方式中，抗體係抗硬骨素抗體。「抗硬骨素抗體」或「與硬骨素結合的抗體」係與SEQ ID NO: 1的硬骨素結合的抗體或其部分。重組人硬骨素/SOST可從例如，R&D系統公司（R&D Systems）（明尼阿波里斯市，明尼蘇達州，美國；2006目錄號1406-ST-025）商購。美國專利案號6,395,511和6,803,453、以及美國專利公開案號2004/0009535和2005/0106683（藉由引用特此併入）通常係指抗硬骨素抗體。適用於本揭露內容上下文的抗硬骨素抗體之實例也描述在美國專利公開案號2007/0110747和2007/0072797中，將其藉由引用特此併入。合適的抗硬骨素抗體（包括命名為Ab-5的抗體）進一步描述於US 8,715,663和US 7,592,429（藉由引用特此併入）中。關於產生硬骨素抗體的材料和方法的另外的資訊可以在美國專利公開案號20040158045（藉由引用特此併入）中找到。在一些實施方式中，抗硬骨素抗體係洛莫索珠單抗（romosozumab）、布索組單抗（blosozumab）或塞曲單抗（setrusumab）。在一些實施方式中，抗硬骨素抗體係洛莫索珠單抗。

如本文所用，「特異性結合」意指抗體優先結合抗原而不是其他蛋白質。在一些實施方式中，「特異性結合」意指抗體對抗原的親和力高於對其他蛋白質的親和力。

在一些或任何實施方式中，抗體與SEQ ID NO: 1的硬骨素或其天然存在的變體以小於或等於1 × 10 ^-7M、小於或等於1 × 10 ^-8M、小於或等於1 × 10 ^-9M、小於或等於1 × 10 ^-10M、小於或等於1 × 10 ^-11M、或小於或等於1 × 10 ^-12M的親和力（Kd）進行結合。使用多種技術確定親和力，其中一個實例係親和力ELISA測定。在多種實施方式中，藉由BIAcore測定來測定親和力。在多種實施方式中，藉由動力學方法確定親和力。在多種實施方式中，藉由平衡/溶液方法確定親和力。美國專利公開案號2007/0110747（其揭露內容藉由引用併入本文）含有適用於確定抗體對硬骨素的親和力（Kd）的親和力測定的另外的描述。

在多個方面，抗硬骨素抗體包含與選自CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3的CDR具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的至少一個CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO: 2中給出的序列，CDR-H2具有SEQ ID NO: 3中給出的序列，CDR-H3具有SEQ ID NO: 4中給出的序列，CDR-L1具有SEQ ID NO: 5中給出的序列，CDR-L2具有SEQ ID NO: 6中給出的序列，並且CDR-L3具有SEQ ID NO: 7中給出的序列。在多個方面，抗硬骨素抗體包含三個CDR、四個CDR、五個CDR或六個CDR。

在較佳的實施方式中，抗硬骨素抗體包含如下六個CDR的組：SEQ ID NO: 2的CDR-H1、SEQ ID NO: 3的CDR-H2、SEQ ID NO: 4的CDR-H3、SEQ ID NO: 5的CDR-L1、SEQ ID NO: 6的CDR-L2、和SEQ ID NO: 7的CDR-L3。

在一些或任何實施方式中，抗硬骨素抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列。在多個方面，與SEQ ID NO: 8或9相比，序列的差異位於對應序列中的CDR區域之外。在一些或任何實施方式中，抗硬骨素抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列。

在一些或任何實施方式中，抗硬骨素抗體包含重鏈（例如，兩條重鏈）的全部或部分和輕鏈（例如，兩條輕鏈）的全部或部分，該重鏈包含與SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列，該輕鏈包含與SEQ ID NO :11中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列。

在一些或任何實施方式中，抗硬骨素抗體包含重鏈（例如，兩條重鏈）的全部或部分和輕鏈（例如，兩條輕鏈）的全部或部分，該重鏈包含與SEQ ID NO: 12中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列，該輕鏈包含與SEQ ID NO 13中所示的胺基酸序列具有至少75%同一性（例如，至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的胺基酸序列。

其他抗硬骨素抗體之實例包括但不限於如下國際專利公開案號中揭露的抗硬骨素抗體：WO 2008/092894、WO 2008/115732、WO 2009/056634、WO 2009/047356、WO 2010/100200、WO 2010/100179、WO 2010/115932和WO 2010/130830（將其各自藉由引用以其全文併入本文）。

熟悉該項技術者將理解，一些蛋白質（如抗體）可以經歷多種翻譯後修飾。該等修飾的類型和程度通常取決於用於表現蛋白質的宿主細胞系以及培養條件。此類修飾可包括糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌𠯤形成、天冬胺酸異構化、和天冬醯胺脫醯胺的變化。頻繁的修飾係由於羧肽酶的作用而喪失羧基末端鹼性殘基（例如離胺酸或精胺酸）（如描述在Harris, RJ. Journal of Chromatography[層析學雜誌] 705:129-134, 1995中）。

其他修飾包括對脯胺酸和離胺酸的羥基化，對絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基基團的磷酸化，對離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質：結構和分子特性], W. H. Freeman & Co. [W.H.弗裡曼公司], 三藩市, 第79-86頁 [1983]，藉由引用整體併入），對N末端胺的乙醯化，和對任何C末端羧基基團的醯胺化。

可以將如上所述之治療性蛋白質添加到根據本文所述之方法製備的緩衝液中，從而產生藥物組成物。可以將這樣的藥物組成物與提供關於使用這樣的藥物組成物的說明書的包裝材料和/或材料一起放置在容器（例如，小瓶或注射器）內。通常，這樣的說明書將包括描述治療性蛋白質濃度，以及在某些實施方式中，可能是重構藥物組成物所必需的賦形劑成分或稀釋劑（例如，水、鹽水或PBS）的相對量的明確表現。 實例

本實例描述了用於治療性蛋白質配製物的代表性緩衝液製備方法。將乙酸鈣和冰乙酸與注射用水（WFI）合併以產生第一混合物，將該第一混合物在27°C ± 5°C下以145 ± 10 rpm混合16-20分鐘。然後，添加蔗糖以產生第二混合物，然後將該第二混合物在27°C ± 5°C下以145 ± 10 rpm再混合16-20分鐘。接下來，添加團注量的氫氧化鈉（NaOH），得到第三混合物，然後將該第三混合物在27°C ± 5°C下以145 ± 10 rpm混合2-4分鐘。最後，添加注射用水並在27°C ± 5°C下以145 ± 10 rpm混合2-4分鐘，得到最終緩衝液。然後將緩衝液冷卻至5°C ± 3°C。

本實例中的緩衝液製備方法共混了2.012 g/kg的乙酸鈣、1.704 g/kg的冰乙酸、58.708 g/kg的蔗糖和1.65 mL/kg的氫氧化鈉（所示量均指1 kg的緩衝液）。本實例的最終緩衝液包含13 mM鈣、55 mM乙酸鹽和6%（w/v）蔗糖，pH為5.2。在成分的添加和混合期間，溫度保持恒定在27°C ± 5°C。同樣地，在整個過程中，混合速度保持恒定在145 ± 10 rpm。

在本實例中製備的最終緩衝液適用於例如抗體，特別是IgG同種型的抗體，如IgG2抗體或特異性洛莫索珠單抗。

與製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液的標準實踐相比，本文所述之方法具有若干益處，這將在下文中討論。

先前技術係在低溫或室溫下產生緩衝液。在較高溫度下產生緩衝液，然後在添加治療性蛋白質前將其冷卻至可接受的溫度並不是標準實踐。本文揭露的緩衝液製備溫度確保固體賦形劑在混合過程中的溶解。在較高溫度下製備緩衝液需要專門瞭解不同組分如何溶解在液體中。較高溫度下的緩衝液製備主要影響的組分係乙酸鈣和蔗糖。蔗糖的溶解度隨著溫度升高而增加，而乙酸鈣的溶解度則降低。然而，緩衝液中單位量最高的成分係蔗糖，並且蔗糖構成其溶解度極限的最高百分比，使其成為緩衝液中確保溶解的最重要的賦形劑，同時也旨在減少混合時間。目前在保證乙酸鈣溶解度的同時，獲得了對於蔗糖溶解度的最佳溫度。換言之，在指定溫度下而不是通常使用的較低溫度下製備緩衝液有利於蔗糖（即，具有最高最終濃度的賦形劑）在水性緩衝溶液中的溶解度，而不影響乙酸鈣的溶解度（其隨著溫度增量而降低），從而與先前的緩衝液製備方法相比，以減少的混合時間成功地配製了緩衝溶液。平均總混合時間減少了30%，從60分鐘減至42分鐘。

由於溫度升高，還可以限定用於所有組分的添加和混合的固定混合速度。無需在添加蔗糖後調節（例如，增加）混合速度或在添加NaOH後再次調節（例如，降低）混合速度。

一次混合一種成分亦為標準實踐，與本揭露內容相比，這對應於效率較低的方法。如本文所述之緩衝液製備方法減少了賦形劑添加步驟，因為乙酸鈣和冰乙酸在單一步驟中合併。

在（先前的）標準方法中，添加各個緩衝劑組分後的混合時間係不同的，取決於該等組分的實際溶解。新揭露的方法以不需要目視確認（例如，控制賦形劑溶解完成）的方式進行平衡和優化，這也允許設置固定混合時間。

此外，NaOH團注量添加加快了緩衝液製備過程，因為無需在多步驟過程中滴定NaOH，從而減少了NaOH添加後所需的混合時間（從約20分鐘減少至約2-4分鐘），同時在單個步驟中將緩衝液pH調節至所希望的值（這裡為5.2）。

本文揭露的方法有效地利用了資源，因為它最大限度地減少了採樣收集和分析。

無

無

無

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Claims (15)

1. 一種製備用於治療性蛋白質配製物的緩衝液之方法，該方法包括 (a)  在等於或大於22°C的溫度下將鈣鹽、有機酸和二糖合併以產生混合物，以及 (b) 藉由團注添加將氫氧化鈉添加到 (a) 的該混合物中。
2. 如請求項1所述之方法，其中該方法在範圍從約22°C至約32°C的溫度下，較佳的是在約27°C的溫度下進行。
3. 如請求項1或2所述之方法，其中步驟 (a) 包括 (i)  將該鈣鹽和該有機酸與水混合約16-20分鐘以產生 (i) 的混合物，以及 (ii) 將該二糖添加到 (i) 的該混合物中，並進一步混合約16-20分鐘。
4. 如請求項1-3中任一項所述之方法，其中步驟 (b) 進一步包括在團注添加氫氧化鈉後混合約2-4分鐘。
5. 如請求項3或4所述之方法，其中用於步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的混合速度範圍在約135 rpm與約155 rpm之間，較佳的是其中用於步驟 (a) 和/或步驟 (b) 的該混合速度係約145 rpm。
6. 如請求項1-5中任一項所述之方法，其中在步驟 (b) 之後添加水。
7. 如請求項6所述之方法，該方法進一步包括在添加該水後混合約2-4分鐘。
8. 如請求項7所述之方法，其中用於步驟 (a)、步驟 (b) 和混合該所添加的水的總混合時間小於約60分鐘，較佳的是在約36分鐘至約48分鐘的範圍內。
9. 如請求項1-8中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該緩衝液冷卻至範圍從約2°C至約8°C的溫度，較佳的是冷卻至約5°C的溫度。
10. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中將該二糖以一定量添加到該混合物中，該量係該鈣鹽的量的至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。
11. 如請求項1-10中任一項所述之方法，其中該二糖選自由以下組成之群組：蔗糖、海藻糖、乳糖和麥芽糖，較佳的是其中該二糖係蔗糖。
12. 如請求項1-11中任一項所述之方法，其中該鈣鹽選自由以下組成之群組：乙酸鈣、碳酸鈣和氯化鈣，較佳的是其中該鈣鹽係乙酸鈣。
13. 如請求項1-12中任一項所述之方法，其中該有機酸選自由以下組成之群組：乙酸、檸檬酸、麩胺酸、組胺酸、乳酸、琥珀酸和天冬胺酸，較佳的是其中該有機酸係乙酸。
14. 如請求項1-13中任一項所述之方法，其中該緩衝液的pH範圍係從約5.0至約5.4。
15. 如請求項1-14中任一項所述之方法，其中該緩衝液包含13 mM鈣、55 mM乙酸鹽和6%（w/v）蔗糖，pH為5.2。