RS62410B1

RS62410B1 - Benzo[b]tiofenska jedinjenja kao agonisti sting

Info

Publication number: RS62410B1
Application number: RS20211230A
Authority: RS
Inventors: Michael D Altman; Brandon D Cash; Wonsuk Chang; Jared N Cumming; Andrew M Haidle; Timothy J Henderson; James P Jewell; Matthew A Larsen; Rui Liang; Jongwon Lim; Min Lu; Ryan D Otte; Tony Siu; Benjamin Wesley Trotter; Sriram Tyagarajan
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2016-10-04
Filing date: 2017-10-02
Publication date: 2021-10-29
Also published as: HRP20211617T1; MX386187B; PL3523287T3; HUE056502T2; US20190337918A1; EP3523287B1; PH12019500712A1; JP2019534876A; KR20190056432A; US20190337917A1; TW201817723A; GEAP202115066A; TWI796306B; KR102312721B1; US20180093964A1; SG10202008647TA; EA201990846A1; DOP2019000083A; ES2893532T3; AU2017339418A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetno otkriće se odnosi na jedinjenja i njihove derivate koji mogu da budu korisni kao agonisti STING (stimulator gena za interferon) koji aktiviraju signalni put STING. Predmetno otkriće takođe se odnosi na postupke za sintezu i na upotrebu takvih jedinjenja.

REFERENCA NA LISTE SEKVENCI KOJE SU PODNETE ELEKTRONSKIM PUTEM

[0002] Lista sekvenci predmetne prijave podneta je elektronski preko EFS-Web u vidu ASCII-formatirane liste sekvenci, sa nazivom datoteke "24170_SEQLIST-OCT2017", datumom kreiranja 24.08.2017, i veličinom od 25KB. Ova lista sekvenci podneta putem EFS-Web je deo specifikacije i ovde je u celosti uključena referencom.

OSNOV PRONALASKA

[0003] Imunološki sistem je evoluirao tako da prepoznaje i neutrališe različite vrste pretnji kako bi održao homeostazu domaćina, i uopšteno se deli na dve grane: adaptivnu i urođenu. Adaptivni imunološki sistem je specijalizovan za prepoznavanje kao stranih onih antigena koji se prirodno ne eksprimiraju u domaćinu i za uspostavljanje odgovora protiv antigena kroz koordinisano delovanje mnogih podgrupa leukocita. Zaštitni znak adaptivnih imunoloških odgovora je njihova sposobnost da obezbede "memoriju" ili dugotrajan imunitet protiv otkrivenog antigena. Iako je ovaj specifičan i dugotrajan efekat ključan za zdravlje i opstanak domaćina, adaptivnom imunološkom odgovoru je potrebno vreme za stvaranje potpunog odgovora.

[0004] Urođeni imunološki sistem kompenzuje ovo vremensko kašnjenje i specijalizovan je za brzo delovanje protiv različitih napada ili signala za opasnost. On pruža prvu liniju odbrane od bakterija, virusa, parazita i drugih infektivnih agenasa, ali takođe snažno reaguje na određene signale za opasnost povezane sa oštećenjem ćelija ili tkiva. Urođeni imunološki sistem nije antigen-specifičan, ali reaguje posredstvom mnogih različitih efektorskih mehanizama. Opsonizacija, fagocitoza, aktivacija sistema komplementa i proizvodnja rastvorljivih bioaktivnih molekula kao što su citokini ili hemokini predstavljaju mehanizme uključene u generisanje odgovora urođenog imunološkog sistema. Odgovarajući na gore opisane molekularne obrasce povezane sa oštećenjima (DAMP) ili molekularne obrasce povezane sa patogenima (PAMP), urođeni imunološki sistem je u stanju da pruži široku zaštitu od velikog spektra pretnji domaćinu.

[0005] Slobodna citosolna DNK i RNK su među ovim PAMP i DAMP. Nedavno je pokazano da je glavni senzor za citosolnu DNK cGAS (ciklična GMP-AMP sintaza). Po prepoznavanju citosolne DNK, cGAS katalizuje stvaranje cikličnog dinukleotida 2'3'-cGAMP, atipičnog sekundarnog glasnika koji se snažno vezuje za ER-transmembranski adapterski protein STING. STING koji je vezan za cGAMP podleže konformacionoj promeni i premešta se u perinuklearni odeljak, gde indukuje aktivaciju kritično važnih transkripcionih faktora IRF-3 i NF-κB. To dovodi do snažne indukcije interferona tipa I i proizvodnje proinflamatornih citokina kao što su IL-6, TNF-α i IFN-γ.

[0006] Važnost interferona tipa I i proinflamatornih citokina za različite ćelije imunološkog sistema je jasno ustanovljena. Konkretno, ovi molekuli snažno potenciraju aktivaciju T-ćelija povećavajući sposobnost dendritskih ćelija i makrofaga da preuzmu, obrade, prezentuju i unakrsno prezentuju antigene T-ćelijama. Sposobnost ovih antigen-prezentujućih ćelija da stimulišu T-ćelije pojačana je ushodnom regulacijom kritičnih kostimulatornih molekula, poput CD80 ili CD86. Konačno, interferoni tipa I mogu brzo da angažuju svoje srodne receptore i pokrenu aktivaciju gena koji reaguju na interferon i koji mogu značajno da doprinesu adaptivnoj aktivaciji imunskih ćelija.

[0007] Sa terapijske tačke gledišta, pokazano je da interferoni tipa I imaju antivirusna dejstva direktnom inhibicijom replikacije humanog virusa hepatitisa B i hepatitisa C, i stimulacijom imunoloških odgovora na ćelije zaražene virusom. Jedinjenja koja mogu da indukuju proizvodnju interferona tipa I koriste se u vakcinama, gde deluju kao adjuvansi, pojačavajući specifične imunološke odgovore na antigene i smanjujući neželjene efekte smanjenjem doze i proširivanjem imunološkog odgovora.

[0008] Osim toga, interferoni i jedinjenja koja mogu da indukuju proizvodnju interferona imaju potencijalnu upotrebu u lečenju kancera kod ljudi. Takvi molekuli su potencijalno korisni kao antikancerski agensi sa višestrukim puteva delovanja. Interferoni mogu direktno da inhibiraju proliferaciju tumorskih ćelija čoveka i mogu da deluju sinergistički sa različitim odobrenim hemoterapijkim agensima. Interferoni tipa I mogu značajno da pojačaju antitumorske imunološke odgovore indukovanjem aktivacije i adaptivnih i urođenih imunskih ćelija. Konačno, invazivnost tumora može da bude inhibirana interferonima moduliranjem ekspresije enzima povezanih sa remodeliranjem tkiva.

[0009] S obzirom na potencijal interferona tipa I i jedinjenja koja indukuju interferone tipa I kao antivirusnih i antikancerskih agenasa, ostaje potreba za novim agensima koji mogu da indukuju snažnu proizvodnju interferona tipa I. Sa sve većim brojem podataka koji pokazuju da cGAS-STING senzorni put za citosolnu DNK ima značajan kapacitet da indukuje interferone tipa I, razvoj agenasa koji aktiviraju STING brzo zauzima važno mesto u današnjim antitumorskim terapijama.

[0010] WO 2015/077354 opisuje jedinjenja koja su agonisti STING.

REZIME PRONALASKA

[0011] Predmetno otkriće odnosi se na nova jedinjenja opšte formule (Ia'). Konkretno, predmetno otkriće odnosi se na jedinjenja koja imaju opštu strukturnu formulu (Ia'):

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kao što je ovde opisano. Primeri izvođenja otkrića uključuju jedinjenja opšte formule (Ia') i njihove farmaceutski prihvatljive soli, kao i sintezu i izdvajanje jedinjenja opšte formule (Ia') i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Upotreba jedinjenja opšte formule (Ia') je takođe opisana.

[0012] Ostali primeri izvođenja, aspekti i svojstva predmetnog otkrića su ili dodatno opisani, ili će biti očigledni iz sledećeg opisa, primera i priloženih patentnih zahteva.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0013] Predmetno otkriće uključuje jedinjenja opšte formule (Ia') i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Ova jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da budu korisne kao agensi za indukciju imunoloških odgovora, za indukciju STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I, i/ili za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije.

[0014] Prvi primer izvođenja odnosi se na jedinjenja opšte formule (Ia'):

ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, gde

R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila;

R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila), SC1-C3alkila;

R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila), SC1-C3alkila;

R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C4alkila i C1-C3haloalkila;

R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, OR<6>, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila;

X<1>je C(O);

X<2>je CHR<8>CHR<8>;

X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>,

SO2R<6>i C(O)N(R<9>)2, gde je svaki R<9>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, COOR<6>i SO2R<6>;

svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog OC1-C3alkilom i C3-C6cikloalkila, i gde opciono 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten;

pri čemu kada X<1>-X<2>-X<3>predstavlja X<1>-CHR<8>CH2-X<3>, najmanje jedan od R<2>i R<3>nije izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila.

[0015] U prvom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad.

[0016] U drugom aspektu prvog primera izvođenja, R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom aspektu opisanom iznad.

[0017] U trećem aspektu prvog primera izvođenja, R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do drugom aspektu opisanom iznad.

[0018] U četvrtom aspektu prvog primera izvođenja, R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila. U posebnim slučajevima ovog aspekta, R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do trećem aspektu opisanom iznad.

[0019] U petom aspektu prvog primera izvođenja, R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila. U posebnim slučajevima ovog aspekta, R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do četvrtom aspektu opisanom iznad.

[0020] U sedmom aspektu prvog primera izvođenja, X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>i

U još konkretnijim slučajevima ovog aspekta, X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do šestom aspektu opisanom iznad.

[0021] U osmom aspektu prvog primera izvođenja, svaki R<9>je nezavisno H. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do sedmom aspektu opisanom iznad.

[0022] U devetom aspektu prvog primera izvođenja, X<2>je CH2CHR<8>, gde je R<8>odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog sa OC1-C4alkilom, i C3-C6cikloalkila. U specifičnim vidovima ovog prvog slučaja, X<2>je CH2CHR<8>, pri čemu je R<8>odabran iz grupe koja se sastoji od H, CH3, CH2OH, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, CH2OCH3i ciklopropila. U drugom slučaju ovog aspekta, X<2>je CHR<8>CHR<8>, gde je R<8>odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog sa OC1-C4alkilom, i C3-C6cikloalkila, i opciono 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten. U specifičnim vidovima ovog drugog slučaja, X<2>je CHR<8>CHR<8>, gde je R<8>odabran iz grupe koja se sastoji od H i C1-C4alkila, i opciono 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten. U specifičnim vidovima ovog drugog slučaja, X<2>je CHR<8>CHR<8>, gde 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3-člani fuzionisani prsten. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili u prvom do osmom aspektu opisanom iznad.

[0023] U desetom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CH2CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>,

SO2R<6>i C(O)N(R<9>)2, gde je svaki R<9>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, COOR<6>i SO2R<6>; i R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog sa OC1-C4alkilom, i C3-C6cikloalkila. U određenim slučajevima ovog aspekta, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CH2CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CH3, CH2OH, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, CH2OCH3i ciklopropila. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad.

[0024] U jedanaestom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, OR<6>, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>,

SO2R<6>i C(O)N(R<9>)2, gde je svaki R<9>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, COOR<6>i SO2R<6>; i svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog sa OC1-C4alkilom, i C3-C6cikloalkila, i gde opciono 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten. U određenim slučajevima ovog aspekta, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i C1-C4alkila. U dodatnim slučajevima ovog aspekta, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad.

[0025] U dvanaestom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila) i SC1-C3alkila; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, OR<6>, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CH2C(R<8>)2; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>,

SO2R<6>i C(O)N(R<9>)2, gde je svaki R<9>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, COOR<6>i SO2R<6>; i svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, OH, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog sa OC1-C4alkilom, i C3-C6cikloalkila, i gde opciono 2 R<8>uzeta zajedno, zajedno sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani spirocikl. U određenim slučajevima ovog aspekta, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CH2C(R<8>)2; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, OH i CH3. U dodatnim slučajevima ovog aspekta, R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C≡CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CH2C(R<8>)2; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3, i

i 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani spirocikl. U ovom aspektu, sve ostale grupe su kao što je dato u opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad.

[0026] Trinaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na farmaceutsku kompoziciju, gde navedena farmaceutska kompozicija sadrži (a) jedinjenje prema opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili prema prvom do dvanaestom aspektu opisanom iznad, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0027] Četrnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema opštoj formuli (Ia') drugog primera izvođenja iznad ili prema prvom do dvanaestom aspektu opisanom iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0028] Petnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na kompoziciju prema trinaestom aspektu opisanom iznad za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0029] Šesnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema opštoj formuli (Ia') prvog primera izvođenja iznad ili prema prvom do dvanaestom aspektu opisanom iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0030] Sedamnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na kompoziciju prema trinaestom aspektu opisanom iznad za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

1

[0031] Osamnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema opštoj formuli (Iaa) drugog primera izvođenja iznad ili prema prvom do dvanaestom aspektu opisanom iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

[0032] Devetnaesti aspekt prvog primera izvođenja odnosi se na kompoziciju prema trinaestom aspektu opisanom iznad za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina kod subjekta.

[0033] U svakom aspektu prvog primera izvođenja koji je ovde opisan, varijable R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<8>, R<9>, X<1>, X<2>i X<3>opšte formule (Ia'), i njihovi različiti aspekti i slučajevi, su svaki međusobno nezavisno odabrani, pod uslovom da najmanje jedan od R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<8>i R<9>nije H.

[0034] Drugi primer izvođenja odnosi se na jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od

i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. U aspektima ovog sedmog primera izvođenja, jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od

1

i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. U sledećim aspektima ovog primera izvođenja, jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od

i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0035] Prvi aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0036] Drugi aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na kompozicija koja sadrži jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0037] Treći aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0038] Četvrti aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0039] Peti aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

[0040] Šesti aspekt drugog primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema drugom primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

[0041] Treći primer izvođenja odnosi se na jedinjenje odabrano od ilustrativnih vrsta prikazanih u primerima 1 do 54 koji su prikazani ispod.

[0042] Prvi aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0043] Drugi aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

[0044] Treći aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0045] Četvrti aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0046] Peti aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili na njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

[0047] Šesti aspekt trećeg primera izvođenja odnosi se na kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema trećem primeru izvođenja iznad ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

[0048] Drugi primeri izvođenja predmetnog otkrića uključuju sledeće:

(b) Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu jedinjenja opšte formule (Ia'), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

1

(f) Farmaceutsku kompoziciju (b), koja dalje sadrži aktivni agens odabran iz grupe koja se sastoji od jedinjenja agonista STING, antivirusnih jedinjenja, antigena, adjuvanasa, antagonista signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 i drugih imunomodulatornih agenasa, lipida, lipozoma, peptida, antikancerskih i hemoterapijskih agenasa.

(j) Farmaceutsku kombinaciju koja je (i) jedinjenje opšte formule (Ia'), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i (ii) aktivni agens odabran iz grupe koja se sastoji od jedinjenja agonista STING, antivirusnih jedinjenja, antigena, adjuvanasa, antagonista signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 i drugih imunomodulatornih agenasa, lipida, lipozoma, peptida, antikancerskih i hemoterapijskih agenasa; pri čemu je svaki od jedinjenja opšte formule (Ia), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i aktivnog agensa uključen u količini koja kombinaciju čini efektivnom u indukciji imunološkog odgovora kod pacijenta.

(n) Jedinjenje opšte formule (Ia'), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

(t) Kompoziciju (b), kompoziciju (f), ili kombinaciju (j) za upotrebu u indukciji imunološkog odgovora.

(x) Jedinjenje opšte formule (Ia'), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

(d1) Kompoziciju (b), kompoziciju (f), ili kombinaciju (j) za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

(h1) Jedinjenje opšte formule (Ia'), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

(n1) Kompoziciju (b), kompoziciju (f), ili kombinaciju (j) za upotrebu u indukciji STING-zavisne proizvodnje citokina.

(s1) Jedinjenje opšte formule (Ia'), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju poremećaja ćelijske proliferacije kod subjekta;

(t1) Jedinjenje za upotrebu prema (s1), gde je poremećaj ćelijske proliferacije kancer. (e2) Kompoziciju (b), kompoziciju (f), ili kombinaciju (j) za upotrebu u lečenju poremećaja ćelijske proliferacije.

(f2) Primer izvođenja (e2), gde je poremećaj ćelijske proliferacije kancer.

[0049] Predmetno otkriće takođe uključuje jedinjenje predmetnog otkrića za upotrebu (i) u, (ii) kao lek za, ili (iii) u pripremi leka za: (a) indukciju imunološkog odgovora kod pacijenta, ili (b) indukciju STING-zavisne proizvodnje citokina kod pacijenta. U ovim upotrebama, jedinjenja

1

predmetnog otkrića mogu opciono da budu uključena u kombinaciju sa jednim ili više aktivnih agenasa odabranih od jedinjenja agonista STING, antivirusnih jedinjenja, antigena, adjuvanasa, antagonista signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 i drugih imunomodulatornih agenasa, lipida, lipozoma, peptida, antikancerskih i hemoterapijskih agenasa.

[0050] Dodatni primeri izvođenja otkrića uključuju farmaceutske kompozicije, kombinacije i postupke prikazane u (a) do (j2) iznad i upotrebe navedene u prethodnom pasusu, pri čemu je jedinjenje predmetnog otkrića koje je u njih uključeno jedinjenje prema jednom od primera izvođenja, aspekata, slučajeva, vidova, ili svojstava jedinjenja opisanih iznad. U svim ovim primerima izvođenja, jedinjenje može opciono da se koristi u obliku farmaceutski prihvatljive soli, ako je pogodno.

[0051] U primerima izvođenja gore navedenog jedinjenja, treba razumeti da svaki primer izvođenja može da se kombinuje sa jednim ili više drugih primera izvođenja, u meri u kojoj takva kombinacija daje stabilno jedinjenje i koja je konzistentna sa opisom primera izvođenja. Dalje treba razumeti da se podrazumeva da primeri izvođenja kompozicija i postupaka navedenih gore kao (a) do (j2) uključuju sve primere izvođenja jedinjenja, uključujući takve primere izvođenja koji su rezultat kombinacija primera izvođenja.

[0052] Pojam "subjekt" (alternativno "pacijent"), kako se ovde koristi, odnosi se na sisara koji je predmet lečenja, posmatranja, ili eksperimenta. Sisar može da bude mužjak ili ženka. Sisar može da bude jedno ili više odabrano iz grupe koja se sastoji od ljudi, goveda (npr., krave), svinja (npr., svinje), ovaca (npr., ovce), koza (npr., koze), konja (npr., konji), pasa (npr., domaći psi), mačaka (npr., kućne mačke), Lagomorpha (zečevi), glodara (npr., pacovi ili miševi), Procyon lotor (npr., rakuni). U specifičnim primerima izvođenja, subjekt je čovek.

[0053] Kako se ovde koristi, pojam "imunološki odgovor" odnosi se na bilo šta ili više od sledećeg: specifični imunološki odgovor, nespecifični imunološki odgovor, i specifični i nespecifični odgovor, urođeni odgovor, primarni imunološki odgovor, adaptivni imunitet, sekundarni imunološki odgovor, memorijski imunološki odgovor, aktivaciju imunskih ćelija, proliferaciju imunskih ćelija, diferencijaciju imunskih ćelija, i ekspresiju citokina. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljiva so gorenavedenog, primenjuje se zajedno sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa uključujući antivirusna jedinjenja, vakcine namenjene stimulaciji imunološkog odgovora na jedan ili više unapred određenih antigena, adjuvanse, antagoniste signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 i druge imunomodulatorne agense, lipide, lipozome, peptide, antikancerske agense i hemoterapijske agense, itd. U određenim primerima

1

izvođenja, jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljiva so gorenavedenog, primenjuje se zajedno sa jednom ili više dodatnih kompozicija uključujući antivirusna jedinjenja, vakcine namenjene stimulaciji imunološkog odgovora na jedan ili više unapred određenih antigena, adjuvanse, antagoniste signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 i druge imunomodulatorne agense, lipide, lipozome, peptide, antikancerske agense i hemoterapijske agense, itd.

Jedinjenja

[0054] Pojam "alkil" odnosi se na monovalentni, zasićeni alifatični ugljovodonični radikal ravnog ili granatog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu. Tako, na primer, "C1-6alkil" (ili "C1-C6alkil") se odnosi na bilo koji od heksil alkil i pentil alkil izomera, kao i na n-, izo-, sek- i terc-butil, n- i izo-propil, etil i metil. Kao drugi primer, "C1-4alkil" se odnosi na n-, izo-, sek- i terc-butil, n- i izopropil, etil i metil.

[0055] Kako se ovde koristi, pojam "alkilen" se odnosi na bivalentni zasićeni alifatični ugljovodonični radikal pravog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu.

[0056] Kako se ovde koristi, pojam "alkenil" se odnosi na monovalentni nezasićeni alifatični ugljovodonični radikal pravog ili granatog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu i uključuje jednu ili više dvostrukih veza.

[0057] Kako se ovde koristi, pojam "alkenilen" se odnosi na bivalentni nezasićeni alifatični ugljovodonični radikal pravog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu i uključuje jednu ili više dvostrukih veza.

[0058] Kako se ovde koristi, pojam "alkinil" se odnosi na monovalentni nezasićeni alifatični ugljovodonični radikal pravog ili granatog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu i uključuje jednu ili više trostrukih veza.

[0059] Kako se ovde koristi, pojam "alkinilen" se odnosi na bivalentni nezasićeni alifatični ugljovodonični radikal pravog lanca koji ima broj atoma ugljenika u navedenom opsegu i uključuje jednu ili više trostrukih veza.

[0060] Pojam "halogen" (ili "halo") odnosi se na fluor, hlor, brom i jod (alternativno označene kao fluoro, hloro, bromo i jodo ili F, Cl, Br i I).

[0061] Pojam "haloalkil" odnosi se na alkil grupu kao što je gore definisano u kojoj je jedan ili više atoma vodonika zamenjeno halogenom. Tako, na primer, "C1-6haloalkil" (ili "C1-C6haloalkil") se odnosi na C1to C6linearnu ili granatu alkil grupu, kao što je gore definisano, sa jednim ili više halogenih supstituenata. Pojam "fluoroalkil" ima analogno značenje, osim što su

1

halogeni supstituenti ograničeni na fluoro. Pogodni fluoroalkili uključuju serije (CH2)0-4CF3(tj., trifluorometil, 2,2,2-trifluoroetil, 3,3,3-trifluoro-n-propil, itd.).

[0062] Kako se ovde koristi, pojam "haloalkenil" se odnosi na alkenil grupu, kao što je gore definisano, u kojoj je jedan ili više atoma vodonika zamenjeno halogenom.

[0063] Kako se ovde koristi, pojam "haloalkinil" se odnosi na alkinil grupu, kao što je gore definisano, u kojoj je jedan ili više atoma vodonika zamenjeno halogenom.

[0064] Kako se ovde koristi, pojam "alkoksi", kako se ovde koristi, sam ili u kombinaciji, uključuje alkil grupu povezanu za oksi povezujući atom. Pojam "alkoksi" uključuje i alkil etar grupe, gde je pojam 'alkil' definisan iznad, a 'etar' označava dve alkil grupe sa atomom kiseonika između njih. Primeri pogodnih alkoksi grupa uključuju metoksi, etoksi, n-propoksi, i-propoksi, n-butoksi, s-butoksi, t-butoksi, metoksimetan (označen i kao 'dimetil etar') i metoksietan (označen i kao 'etil metil etar').

[0065] Kako se ovde koristi, pojam "cikloalkil" odnosi se na zasićeni ugljovodonik koji sadrži jedan prsten koji ima navedeni broj atoma ugljenika. Primeri cikloalkila uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil.

[0066] Kako se ovde koristi, pojam "heterocikl", "heterociklil", ili "heterociklični", kako se ovde koristi, predstavlja stabilni 3- do 6-člani monociklik koji je ili zasićen ili nezasićen, i koji se sastoji od atoma ugljenika i od jednog do dva heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od N, O i S. Heterociklični prsten može da bude vezan za bilo koji heteroatom ili atom ugljenika koji rezultuje stvaranjem stabilne strukture. Pojam uključuje heteroarilne fragmente. Primeri takvih heterocikličnih elemenata uključuju, ali nisu ograničeni na azepinil, benzimidazolil, benzizoksazolil, benzofurazanil, benzopiranil, benzotiopiranil, benzofuril, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, hromanil, cinolinil, dihidrobenzofuril, dihidrobenzotienil, dihidrobenzotiopiranil, dihidrobenzotiopiranil sulfon, 1,3-dioksolanil, furil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, indolinil, indolil, izohromanil, izoindolinil, izokvinolinil, izotiazolidinil, izotiazolil, izotiazolidinil, morfolinil, naftiridinil, oksadiazolil, 2-oksoazepinil, oksazolil, 2-oksopiperazinil, 2-oksopiperdinil, 2-oksopirolidinil, piperidil, piperazinil, piridil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolil, piridazinil, pirimidinil, pirolidinil, pirolil, kvinazolinil, kvinolinil, kvinoksalinil, tetrahidrofuril, tetrahidroizokvinolinil, tetrahidrokvinolinil, tiamorfolinil, tiamorfolinil sulfoksid, tiazolil, tiazolinil, tienofuril, tienotienil, triazolil i tienil.

[0067] Kako se ovde koristi, pojam "fuzionisani prsten" odnosi se na cikličnu grupu koju formiraju supstituenti na odvojenim atomima u ravnom ili granatom alkanu, ili na cikličnu grupu koju formiraju supstituenti na odvojenim atomima u drugom prstenu.

1

[0068] Kako se ovde koristi, pojam "spirocikl" ili "spirociklični prsten" odnosi se na bočnu cikličnu grupu koju formiraju supstituenti na jednom atomu.

[0069] Osim ako nije izričito navedeno suprotno, svi opsezi koji su ovde citirani su inkluzivni; tj., opseg uključuje vrednosti za gornje i donje granice opsega, kao i sve vrednosti između. Na primer, temperaturni opsezi, procenti, opsezi ekvivalenata, i slično opisano ovde uključuju gornje i donje granice opsega i bilo koju vrednost u kontinuumu između njih. Ovde navedene numeričke vrednosti, i upotreba pojma "oko", mogu da uključuju varijacije od ± 1%, ± 2%, ±3%, ± 4%, ± 5%, ± 10%, ± 15% i ± 20% i njihove numeričke ekvivalente.

[0070] Kako se ovde koristi, pojam "jedan ili više" elemenata uključuje jedan element odabran sa liste, kao i mešavine dva ili više elemenata odabranih sa liste.

[0071] U jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), i farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, atomi mogu pokazati svoju prirodnu izotopsku zastupljenost, ili jedan ili više atoma mogu biti veštački obogaćeni određenim izotopom koji ima isti atomski broj, ali atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se pretežno nalazi u prirodi. Predviđeno je da ovo otkriće uključi sve pogodne izotopske varijacije jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib') jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I') i farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog. Na primer, različiti izotopski oblici vodonika (H) uključuju protijum (<1>H), deuterijum (<2>H) i tricijum (<3>H). Protijum je dominantni izotop vodonika koji se nalazi u prirodi. Obogaćivanje deuterijumom može da donese određene terapijske prednosti, kao što je povećanje in vivo polu-života ili redukcija potrebnog doziranja, ili može da obezbedi jedinjenje korisno kao standard za karakterizaciju bioloških uzoraka. Izotopski obogaćena jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I') i farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog mogu da se pripreme bez nepotrebnog eksperimentisanja konvencionalnim tehnikama dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, ili postupcima analognim onima koji su ovde opisani u šemama i primerima upotrebom odgovarajućih izotopski-obogaćenih reagenasa i/ili intermedijera.

[0072] U specifičnim primerima izvođenja jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), i farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog, jedinjenja su izotopski obogaćena deuterijumom. U aspektima ovih primera izvođenja, jedan ili više od R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<8>i R<9>mogu da uključuju deuterijum.

2

[0073] Kao što je prikazano u opštim strukturnim formulama i strukturama specifičnih jedinjenja kako je ovde dato, ravna linija na hiralnom centru uključuje i (R) i (S) stereoizomere i njihove smeše. Takođe, osim ako nije drugačije navedeno (npr., 100% prečišćeno jedinjenje), pozivanje na određenu stereohemiju na određenom položaju obezbeđuje jedinjenje koje ima naznačenu stereohemiju, ali ne isključuje prisustvo stereoizomera koji imaju drugačiju stereohemiju na naznačenoj poziciji.

[0074] Navođenje ili prikazivanje specifičnog jedinjenja u patentnim zahtevima (tj., vrsta) bez označavanja specifične stereokonfiguracije, ili sa takvom oznakom koja se ne odnosi na sve hiralne centre, ima za cilj da, za takve neoznačene hiralne centre, obuhvati racemate, racemske smeše, svaki pojedinačni enantiomer, dijastereoizomernu smešu i svaki pojedinačni dijastereomer jedinjenja gde su takvi oblici mogući zbog prisustva jednog ili više asimetričnih centara. Razdvajanje smeša stereoizomera može da se sprovede na intermedijarnom koraku tokom sinteze jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, ili može da se sprovede na krajnjem racemskom proizvodu. Apsolutna stereohemija može da se odredi rendgenskom kristalografijom kristalnih proizvoda ili kristalnih intermedijera, koji se, ako je potrebno, derivatizuju pomoću reagensa koji sadrži stereogeni centar poznate konfiguracije. Alternativno, apsolutna stereohemija može da se odredi pomoću analize spektroskopije vibracionog kružnog dihroizma (VCD). Predmetni pronalazak uključuje sve takve izomere, kao i soli, solvate (uključujući hidrate), i solvatisane soli takvih racemata, enantiomera, dijastereomera, tautomera, i njihovih smeša.

[0075] Pronalazak uključuje sve moguće enantiomere i dijastereomere i smeše dva ili više stereoizomera, na primer smeše enantiomera i/ili dijastereomera, u svim odnosima. Prema tome, enantiomeri su predmet pronalaska u enantiomerno čistom obliku, i kao levorotacioni i kao desnorotacioni antipodi, u obliku racemata i u obliku smeša dva enantiomera u svim odnosima. U slučaju cis/trans izomerije, pronalazak uključuje i cis oblik i trans oblik, kao i smeše ovih oblika u svim odnosima. Priprema pojedinačnih stereoizomera može se, po želji, izvesti razdvajanjem smeše uobičajenim postupcima, na primer hromatografijom ili kristalizacijom, upotrebom stereohemijski ujednačenih polaznih materijala za sintezu ili stereoselektivnom sintezom. Opciono, derivatizacija može da se obavi pre razdvajanja stereoizomera. Razdvajanje smeše stereoizomera može da se sprovede u intermedijarnom koraku tokom sinteze jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I') ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, ili to može da se uradi na krajnjem racemskom proizvodu. Apsolutna stereohemija može da se odredi rendgenskom kristalografijom kristalnih proizvoda ili kristalnih intermedijera koji se, ako je potrebno, derivatizuju reagensom koji sadrži stereogeni centar poznate konfiguracije. Osim ako je naznačen određeni izomer, so, solvat (uključujući hidrate) ili solvatisana so takvog racemata, enantiomera ili dijastereomera, ovaj pronalazak uključuje sve takve izomere, kao i soli, solvate (uključujući hidrate) i solvatisane soli takvih racemata, enantiomera, dijastereomera i njihove smeše.

[0076] Pojam "jedinjenje" odnosi se na jedinjenje i, u određenim primerima izvođenja, i u meri u kojoj su stabilni, bilo koji njegov hidrat ili solvat. Hidrat je jedinjenje koje formira kompleks sa vodom, a solvat je jedinjenje koje formira kompleks sa rastvaračem, koji može da bude organski rastvarač ili neorganski rastvarač.

[0077] "Stabilno" jedinjenje je jedinjenje koje može da se pripremi i izdvoji i čija struktura i svojstva ostaju, ili se može dovesti do toga da ostanu suštinski neizmenjena tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući upotrebu jedinjenja u ovde opisane svrhe (npr., terapijska primena kod subjekta). Jedinjenja predmetnog pronalaska su ograničena na stabilna jedinjenja obuhvaćena opštom formulom (Ia), opštom formulom (Ia'), opštom formulom (Ib), opštom formulom (Ib'), opštom formulom (I), i opštom formulom (I'), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Soli

[0078] Kao što je gore navedeno, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da se koriste u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati te slučajeve u kojima jedinjenja pronalaska mogu da formiraju soli. Primeri takvih jedinjenja ovde su opisani pozivanjem na moguće soli. Takvo pozivanje ima samo ilustrativnu svrhu. Farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste sa jedinjenjima za lečenje pacijenata. Nefarmaceutske soli mogu, međutim, da budu korisne u pripremi intermedijera jedinjenja.

[0079] Pojam "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so (uključujući unutrašnju so kao što je cviterjon) koja poseduje efektivnost sličnu ishodnom jedinjenju i koja nije biološki ili drugačije nepoželjna (npr., nije toksična, niti na drugi način štetna za svog primaoca). Tako, primer izvođenja pronalaska obezbeđuje farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja pronalaska. Pojam "so(li)", kako se ovde koristi, označava bilo šta od sledećeg: kisele soli obrazovane sa neorganskim i/ili organskim kiselinama, kao i bazne soli obrazovane sa neorganskim i/ili organskim bazama. Soli jedinjenja pronalaska mogu da budu formirane postupcima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, na primer, reakcijom jedinjenje pronalaska sa određenom količinom kiseline ili baze, kao što je ekvivalentna količina, u medijumu kao što je onaj u kome se so taloži ili u vodenom medijumu, što je praćeno liofilizacijom.

[0080] Primeri kiselih adicionih soli uključuju acetate, askorbate, benzoate, benzensulfonate, bisulfate, borate, butirate, citrate, kamforate, kamforsulfonate, fumarate, hidrohloride, hidrobromide, hidrojodide, laktate, maleate, metansulfonate ("mezilate"), naftalensulfonate, nitrate, oksalate, fosfate, propionate, salicilate, sukcinate, sulfate, tartarate, tiocijanate, toluensulfonate (poznate i kao tozilati) i slično. Pogodne soli uključuju kisele adicione soli koje mogu, na primer, da budu obrazovane mešanjem rastvora jedinjenja sa rastvorom farmaceutski prihvatljive kiseline kao što je hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, sirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, ili benzojeva kiselina. Dodatno, kiseline koje se uopšteno smatraju pogodnim za obrazovanje farmaceutski korisnih soli iz baznih farmaceutskih jedinjenja razmatraju se, na primer, kod P. Stahl et al, Camille G. (eds.), Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et al, Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; i u The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. na njihovom sajtu).

[0081] Primeri baznih soli uključuju amonijumove soli, soli alkalnih metala kao natrijumove, litijumove i kalijumove soli, soli zemnoalkalnih metala kao kalcijumove i magnezijumove soli, soli sa organskim bazama (na primer, organskim aminima) kao dicikloheksilamin, t-butil amin, holin, i soli sa aminokiselinama kao arginin, lizin i slično. Bazne grupe koje sadrže azot mogu da budu kvarternizovane agensima kao što su niži alkil halidi (npr., metil, etil i butil hloridi, bromidi i jodidi), dialkil sulfati (npr., dimetil, dietil i dibutil sulfati), halidi dugog lanca (npr., decil, lauril i stearil hloridi, bromidi i jodidi), aralkil halidi (npr., benzil i fenetil bromidi), i drugi. Jedinjenja koja nose kiselinski fragment mogu da se mešaju sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim solima da bi se dobile, na primer, soli alkalnih metala (npr., natrijumove ili kalijumove soli), soli zemnoalkalnih metala (npr., kalcijumove ili magnezijumove soli), i soli obrazovane sa pogodnim organskim ligandima kao što su kvaternarne amonijumove soli. Takođe, u slučaju da je prisutna kiselinska (-COOH) ili alkoholna grupa, mogu da se koriste farmaceutski prihvatljivi estri za modifikovanje karakteristika rastvorljivosti ili hidrolize jedinjenja.

[0082] Predviđeno je da sve takve kisele soli i bazne soli budu farmaceutski prihvatljive soli u okviru obima pronalaska i sve kisele i bazne soli smatraju se ekvivalentnim slobodnim oblicima odgovarajućih jedinjenja u svrhu pronalaska.

2

[0083] Pored toga, kada jedinjenje pronalaska sadrži i bazni fragment, kao što je, ali bez ograničenja, alifatični primarni, sekundarni, tercijarni ili ciklični amin, aromatični ili heteroaril amin, piridin ili imidazol, i kiselinski fragment, kao što je, ali bez ograničenja, tetrazol ili karboksilna kiselina, mogu da se formiraju cviterjoni ("unutrašnje soli") i oni su obuhvaćeni pojmom "so(li)", kako se ovde koristi. Razume se da određena jedinjenja pronalaska mogu da postoje u obliku cviterjona, tako da imaju i anjonski i katjonski centar u okviru istog jedinjenja i neutralno neto naelektrisanje. Takvi cviterjoni su uključeni u pronalazak.

Postupci za pripremu jedinjenja

[0084] Nekoliko postupaka za pripremu jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), i farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog, opisano je na sledećim šemama i u primerima. Polazni materijali i intermedijeri nabavljeni su iz komercijalnih izvora, napravljeni prema poznatim procedurama, ili su drugačije ilustrovani. U nekim slučajevima, redosled izvođenja koraka reakcionih šema može da bude izmenjen kako bi se olakšala reakcija ili izbegli neželjeni proizvodi reakcije.

[0085] U postupcima i šemama koje slede, LG predstavlja odlazeću grupu, koja može da bude halidna ili triflatna grupa. Varijable R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<6>, R<8>i X<2>, imaju isto značenje kao što je gore opisano.

Postupak 1

[0086] Benzo[b]tiofen 2-karboksilne kiseline b, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, obično se pripremaju iz orto-halo benzaldehida. Reakcioni niz počinje obradom estrom alfa-tio sirćetne kiseline pod baznim uslovima. Estar u rezultujućem jedinjenju cepa se na karboksilnu kiselinu pod baznim uslovima kako bi se dobila željena supstituisana benzo[b]tiofen 2-karboksilna kiselina 1C.

Postupak 2

[0087] Drugi postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, detaljno je prikazan na šemi 2. Reakcioni niz počinje benzo[b]tiofenom koji je na poziciji 2 supstituisan odgovarajućom 1,3-dikarbonil grupom, kao što je beta-keto estar. On reaguje sa alfa-halo estrom pod baznim uslovima da bi se dobila supstitucija na poziciji 2 u lancu alkila. Zatim, oba estra se hidrolizuju upotrebom kiselih ili baznih uslova; nakon daljeg izlaganja baznim uslovima, karboksilna kiselina koja odgovara estru u polaznom materijalu podvrgava se dekarboksilaciji kako bi se dobila željena benzo[b]tiofen keto kiselina 2C.

Postupak 3

[0088] Još jedan postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, detaljno je prikazan na šemi 3. Reakcioni niz počinje benzo[b]tiofenom bez supstitucije na poziciji 2. On se podvrgava obradi terc-butillitijumom praćenim cikličnim anhidridom kiseline da bi se dobio željeni proizvod 4-keto karboksilne kiseline 3B.

Postupak 4

[0089] Još jedan postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, detaljno je opisan na šemi 4. Reakcioni niz počinje benzo[b]tiofenom supstituisanim karboksilnom kiselinom na poziciji 2. On se obrađuje oksalil hloridom/dihlorometanom. Rezultujući acil-hlorid reaguje sa alkil-cink reagensom, koji tipično sadrži estar, upotrebom prelaznog metala kao što je bakar ili paladijum za posredovanje u kuplovanju. Zatim, estar se cepa pod baznim ili kiselim uslovima da bi se dobila željena benzo[b]tiofen gama-keto kiselina 4D.

2

Postupak 5

[0090] Još jedan postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, detaljno je prikazan na šemi 5. Reakcioni niz počinje benzo[b]tiofenom supstituisanim na poziciji 2 gama-keto estrom i sa halidom ili triflatom na benzo[b]tiofenu. On se obrađuje estrom boronske kiseline, kiselinom, ili trifluoroboratnom soli i paladijumskim katalizatorom pod vodenim baznim uslovima. Zatim se estar u dobijenom jedinjenju cepa na karboksilnu kiselinu pod baznim uslovima kako bi se dobio željeni supstituisani benzo[b]tiofen 5C. Sledeća šema prikazuje uvođenje supstituenta R<2>, ali ovaj isti opšti postupak kuplovanja uvodi određene R<3>supstituente, kao i kada se koristi srodni supstrat sa odgovarajuće postavljenom LG.

Postupak 6

[0091] Još jedan postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, uključuje ciklizaciju cimetne kiseline u prisustvu tionil hlorida. Dobijeni acil-hlorid reaguje sa alkil-cink reagensom, koji tipično sadrži estar, upotrebom prelaznog metala kao što je bakar ili paladijum za posredovanje u kuplovanju. Zatim, estar se cepa pod baznim ili kiselim uslovima kako bi se dobila željena benzo[b]tiofen gama-keto kiselina 6D.

2

Postupak 7

[0092] Još jedan postupak za pripremu benzo[b]tiofen 2-karboksilnih kiselina, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, detaljno je prikazan na šemi 7. Reakcioni niz počinje Grinjarovom reakcijom sa Weinrebovim amidom 7A kako bi se dobio metil keton 7B. Deprotonacija ketona pomoću LDA praćena adicijom etil piruvata daje 7C.

Postupci za upotrebu

[0093] Jedinjenja opisana u ovom dokumentu koja imaju terapijske primene, kao što su jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), jedinjenja iz primera 1 do 54, i farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, mogu da se daju pacijentu u svrhu indukcije imunološkog odgovora, indukcije STING-zavisne proizvodnje citokina i/ili indukcije antitumorske aktivnosti. Pojam "primena" i njegove varijante (npr., "davanje" jedinjenja) znači obezbeđivanje jedinjenja pojedincu kome je lečenje potrebno. Kada je jedinjenje obezbeđeno u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih agenasa (npr., antivirusni agensi korisni za lečenje HCV infekcije ili antitumorski agensi za lečenje kancera), podrazumeva se da "primena" i njene varijante uključuju istovremenu i sekvencijalnu primenu jedinjenja ili soli i drugih agenasa.

2

[0094] Jedinjenja koja su ovde opisana mogu da budu agonisti STING. Ova jedinjenja su potencijalno korisna u lečenju bolesti ili poremećaja uključujući, ali bez ograničenja, poremećaje ćelijske proliferacije. Poremećaji ćelijske proliferacije uključuju, ali nisu ograničeni na kancere, benignu papilomatozu, gestacione trofoblastne bolesti i benigne neoplastične bolesti, kao što su papilomi kože (bradavice) i genitalni papilomi.

[0095] U specifičnim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj koji treba lečiti je poremećaj ćelijske proliferacije. U određenim primerima izvođenja, poremećaj ćelijske proliferacije je kancer. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera mozga i kičmene moždine, kancera glave i vrata, leukemije i kancera krvi, kancera kože, kancera reproduktivnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera jetre i žučnih puteva, kancera bubrega i bešike, kancera kostiju, kancera pluća, malignog mezotelioma, sarkoma, limfoma, kancera žlezda, tireoidnih kancera, tumora srca, tumora germinativnih ćelija, malignih neuroendokrinih (karcinoidnih) tumora, kancera srednje linije, i kancera nepoznatog primarnog porekla (tj., kancera kod kojih je nađen metastazirani kancer, ali nije poznato mesto početnog kancera). U konkretnim primerima izvođenja, kancer je prisutan kod odraslog pacijenta; u dodatnim primerima izvođenja, kancer je prisutan kod pedijatrijskog pacijenta. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je povezan sa AIDS-om.

[0096] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera mozga i kičmene moždine. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od anaplastičnih astrocitoma, glioblastoma, astrocitoma i estezioneuroblastoma (poznatih i kao olfaktorni blastomi). U konkretnim primerima izvođenja, kancer mozga je odabran iz grupe koja se sastoji od astrocitnog tumora (npr., pilocitni astrocitom, subependimalni astrocitom gigantskih ćelija, difuzni astrocitom, pleomorfni ksantoastrocitom, anaplastični astrocitom, astrocitom, glioblastom gigantskih ćelija, glioblastom, sekundarni glioblastom, primarni adultni glioblastom i primarni pedijatrijski glioblastom), oligodendroglijalnog tumora (npr., oligodendrogliom i anaplastični oligodendrogliom), oligoastrocitnog tumora (npr., oligoastrocitom i anaplastični oligoastrocitom), ependimoma (npr., miksopapilarni ependimom i anaplastični ependimom); meduloblastoma, primitivnog neuroektodermalnog tumora, švanoma, meningioma, atipičnog meningioma, anaplastičnog meningioma, adenoma hipofize, glioma moždanog stabla, cerebelarnog astrocitoma, cerebralnog astorcitoma/malignog glioma, glioma vizuelnog puta i hipotalmusa, i primarnog limfoma centralnog nervnog sistema. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer mozga je odabran iz grupe koja se sastoji od glioma, multiformnog glioblastoma, paraganglioma i supratentorijalnih primordijalnih neuroektodermalnih tumora (sPNET).

2

[0097] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera glave i vrata, uključujući nazofaringealne kancere, kancere nazalnih šupljina i paranazalnih sinusa, hipofaringealne kancere, kancere oralne šupljine (npr., karcinomi skvamoznih ćelija, limfomi i sarkomi), kancere usana, orofaringealne kancere, tumore pljuvačnih žlezda, kancere grkljana (npr., karcinomi skvamoznih ćelija grkljana, rabdomiosarkomi) i kancere oka ili okularne kancere. U konkretnim primerima izvođenja, okularni kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od intraokularnog melanoma i retinoblastoma.

[0098] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od leukemije i kancera krvi. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od mijeloproliferativnih neoplazmi, mijelodisplastičnih sindroma, mijelodisplastičnih /mijeloproliferativnih neoplazmi, akutne mijeloidne leukemije (AML), mijelodisplastičnog sindroma (MDS), hronične mijelogene leukemije (CML), mijeloproliferativne neoplazme (MPN), post-MPN AML, post-MDS AML, MDS visokog rizika ili AML povezanih sa del(5q), hronične mijelogene leukemije u blastnoj fazi, angioimunoblastnog limfoma, akutne limfoblastne leukemije, histiocitoze Langerhansovih ćelija, leukemije vlasastih ćelija i neoplazmi plazma ćelija uključujući plazmacitome i multiple mijelome. Leukemije na koje se ovde poziva mogu da budu akutne ili hronične.

[0099] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odbran od kancera kože. U konkretnim primerima izvođenja, kancer kože je odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera skvamoznih ćelija i kancera bazalnih ćelija.

[0100] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera reproduktivnog sistema. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera grlića materice, kancera vagine, kancera jajnika, kancera prostate, kancera penisa i kancera testisa. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer je kancer dojke odabran iz grupe koja se sastoji od duktalnih karcinoma i filodnih tumora. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer dojke može da bude kancer dojke kod muškarca ili kancer dojke kod žene. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer je kancer grlića materice odabran iz grupe koja se sastoji od karcinoma skvamoznih ćelija i adenokarcinoma. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer je kancer jajnika odabran iz grupe koja se sastoji od epitelijalnih kancera.

[0101] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera gastrointestinalnog sistema. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera jednjaka, gastričnih kancera (poznatih i kao kanceri želuca), gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, kancera pankreasa, kancera žučne kese, kolorektalnih kancera i analnog

2

kancera. U posebnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od karcinoma skvamoznih ćelija jednjaka, adenokarcinoma jednjaka, adenokarcinoma želuca, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, gastrointestinalnih stromalnih tumora, limfoma želuca, gastrointestinalnih limfoma, solidnih pseudopapilarnih tumora pankreasa, pankreatoblastoma, tumora ćelija ostrvaca, karcinoma pankreasa uključujući karcinome acinarnih ćelija i duktalne adenokarcinome, adenokarcinoma žučne kese, kolorektalnih adenokarcinome i karcinoma analnih skvamoznih ćelija.

[0102] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera jetre i žučnih puteva. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je kancer jetre (poznat i kao hepatocelularni karcinom). U konkretnim primerima izvođenja, kancer je kancer žučnih puteva (poznat i kao holangiokarcinom); u posebnim slučajevima ovih primera izvođenja, kancer žučnih puteva je odabran iz grupe koja se sastoji od intrahepatičnog holangiokarcinoma i ekstrahepatičnog holangiokarcinoma.

[0103] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera bubrega i bešike. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je kancer bubrega odabran iz grupe koja se sastoji od kancera renalnih ćelija, Wilmsovih tumora i kancera prelaznih ćelija. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je kancer bešike odabran iz grupe koja se sastoji od urotelijalnog karcinoma (karcinoma prelaznih ćelija), karcinoma skvamoznih ćelija i adenokarcinoma.

[0104] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera kostiju. U konkretnim primerima izvođenja, kancer kostiju je odabran iz grupe koja se sastoji od osteosarkoma, malignog fibroznog histiocitoma kosti, Ewingovog sarkoma, hordoma (kancer kosti duž kičme).

[0105] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera pluća. U konkretnim primerima izvođenja, kancer pluća je odabran iz grupe koja se sastoji od nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskih kancera pluća, tumora bronhija i pleuropulmonalnih blastoma.

[0106] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od malignog mezotelioma. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od epitelijalnog mezotelioma i sarkomatoida.

[0107] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od sarkoma. U konkretnim primerima izvođenja, sarkom je odabran iz grupe koja se sastoji od centralnog hondrosarkoma, centralnog i periostealnog hondroma, fibrosarkoma, sarkoma bistrih ćelija omotača tetiva, i Kapošijevog sarkoma.

[0108] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od limfoma. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od Hočkinovog limfoma (npr., Reed-Sternbergove ćelije), ne-Hočkinovog limfoma (npr., difuzni B-krupnoćelijski limfom, folikularni limfom, mycosis fungoides, Sezari sindrom, primarni limfom centralnog nervnog sistema), limfoma T-ćelija kože, primarnih limfoma centralnog nervnog sistema.

[0109] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera žlezda. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od adrenokortikalnog kancera (poznat i kao adrenokortikalni karcinom ili adrenalni kortikalni karcinom), feohromocitoma, paraganglioma, tumora hipofize, timoma i timusnih karcinoma.

[0110] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od tireoidnih kancera. U konkretnim primerima izvođenja, tireoidni kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od medularnih tireoidnih karcinoma, papilarnih tireoidnih karcinoma i folikularnih tireoidnih karcinoma.

[0111] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od tumora germinativnih ćelija. U konkretnim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od malignih tumora ekstrakranijalnih germinativnih ćelija i malignih tumora ekstragonadalnih germinativnih ćelija. U specifičnim slučajevima ovih primera izvođenja, maligni tumori ekstragonadalnih germinativnih ćelija su odabrani iz grupe koja se sastoji od neseminoma i seminoma.

[0112] U specifičnim primerima izvođenja, kancer je odabran od tumora srca. U konkretnim primerima izvođenja, tumor srca je odabran iz grupe koja se sastoji od malignog teratoma, limfoma, rabdomiosakroma, angiosarkoma, hondrosarkoma, infantilnog fibrosarkoma i sinovijalnog sarkoma.

[0113] U specifičnim primerima izvođenja, poremećaj ćelijske proliferacije je odabran od benigne papilomatoze, benignih neoplastičnih bolesti i gestacionih trofoblastnih bolesti. U konkretnim primerima izvođenja, benigna neoplastična bolest je odabrana od papiloma kože (bradavice) i genitalnog papiloma. U konkretnim primerima izvođenja, gestaciona trofoblastna bolest je odabrana iz grupe koja se sastoji od hidatidiformnih mola i gestacione trofoblastne neoplazije (npr., invazivne mole, horiokarcinomi, placentalni trofoblastni tumori i epitelioidni trofoblastni tumori).

[0114] Kako se ovde koriste, pojmovi "tretman" i "lečenje" odnose se na sve postupke u kojima može doći do usporavanja, narušavanja, prekidanja, kontrolisanja ili zaustavljanja napredovanja bolesti ili poremećaja opisanih ovde. Pojmovi ne ukazuju nužno na potpuno uklanjanje svih simptoma bolesti ili poremećaja.

1

[0115] Pojmove "primena" i ili "davanje" jedinjenja treba razumeti tako da uključuju davanje subjektu ovde opisanog jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i kompozicija gorenavedenog.

[0116] Količina jedinjenja koja se daje subjektu je količina dovoljna da indukuje imunološki odgovor i/ili da indukuje STING-zavisnu proizvodnju interferona tipa I kod subjekta. U jednom primeru izvođenja, količina jedinjenja može da bude "efektivna količina" ili "terapijski efektivna količina" tako da se predmetno jedinjenje daje u količini koja će izazvati biološki, odnosno, medicinski (tj., namenjen lečenju) odgovor tkiva, sistema, životinje, ili čoveka koji traže istraživač, veterinar, lekar, ili drugi kliničar. Efektivna količina ne uključuje nužno razmatranje toksičnosti i bezbednosti u vezi sa primenom jedinjenja.

[0117] Efektivna količina jedinjenja će varirati u zavisnosti od izabranog jedinjenja (npr., uzimajući u obzir jačinu, efikasnost, i/ili polu-život jedinjenja); izabranog puta primene; stanja koje se leči; ozbiljnosti stanja koje se leči; uzrasta, veličine, težine i fizičkog stanja subjekta koji se leči; istorije bolesti subjekta koji se leči; trajanja lečenja; prirode istovremene terapije; željenog terapijskog dejstva; i sličnih faktora, i stručnjak u oblasti može rutinski da je odredi.

[0118] Ovde opisana jedinjenja mogu da se primene bilo kojim pogodnim putem uključujući oralnu i parenteralnu primenu. Parenteralna primena je obično putem injekcije ili infuzije i uključuje intravensku, intramuskularnu i subkutanu injekciju ili infuziju.

[0119] Ovde opisana jedinjenja mogu da se primene jednom ili prema režimu doziranja gde se određeni broj doza primenjuje u različitim vremenskim intervalima tokom datog vremenskog perioda. Na primer, doze mogu da se primene jednom, dva, tri ili četiri puta dnevno. Doze mogu da se primenjuju dok se ne postigne željeno terapijsko dejstvo, ili na neodređeno vreme, da bi se održalo željeno terapijsko dejstvo. Pogodni režimi doziranja za jedinjenje koje je ovde opisano zavise od farmakokinetičkih svojstava tog jedinjenja, kao što su apsorpcija, distribucija i poluživot, koje može odrediti stručnjak. Pored toga, pogodni režimi doziranja, uključujući trajanje primene takvih režima, za jedinjenje koje je ovde opisano zavise od bolesti ili stanja koje se leči, težine bolesti ili stanja, starosti i fizičkog stanja subjekta koji se leči, istorije bolesti subjekta koji se leči, prirode istovremene terapije, željenog terapijskog dejstva i sličnih faktora koji su u okviru znanja i stručnosti stručnjaka u ovoj oblasti. Takvi stručnjaci će dalje razumeti da će odgovarajući režimi doziranja možda zahtevati prilagođavanje s obzirom na odgovor pojedinačnog subjekta na režim doziranja, ili tokom vremena, kako pojedinačni subjekt zahteva promenu. Tipične dnevne doze mogu da variraju u zavisnosti od izabranog načina davanja.

[0120] Jedan primer izvođenja predmetnog otkrića obezbeđuje postupak lečenja poremećaja ćelijske proliferacije koji obuhvata primenu terapijski efektivne količine jedinjenja opšte formule

2

(Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I') i farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog, kod subjekta kome je potrebno takvo lečenje. U primerima izvođenja, bolest ili poremećaj koji treba da se leči je poremećaj ćelijske proliferacije. U aspektima ovih primera izvođenja, poremećaj ćelijske proliferacije je kancer. U sledećim aspektima ovih primera izvođenja, kancer je odabran od kancera mozga i kičmene moždine, kancera glave i vrata, leukemije i kancera krvi, kancera kože, kancera reproduktivnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera jetre i žučnih puteva, kancera bubrega i bešike, kancera kostiju, kancera pluća, malignog mezotelioma, sarkoma, limfoma, kancera žlezda, tireoidnih kancera, tumora srca, tumora germinativnih ćelija, malignih neuroendokrinih (karcinoidnih) tumora, kancera srednje linije i kancera nepoznatog primarnog porekla.

[0121] U jednom primeru izvođenja, ovde je opisana upotreba jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, u terapiji. Jedinjenje može da bude korisno u postupku indukcije imunološkog odgovora i/ili indukcija STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I kod subjekta, kao što je sisar kome je potrebna takva inhibicija, koji obuhvata davanje efektivne količine jedinjenja subjektu.

[0122] U jednom primeru izvođenja, ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje opšte formule (Ia), najmanje jedno jedinjenje opšte formule (Ia'), najmanje jedno jedinjenje opšte formule (Ib), najmanje jedno jedinjenje opšte formule (Ib'), najmanje jedno jedinjenje opšte formule (I), najmanje jedno jedinjenje opšte formule (I'), ili najmanje jednu farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, za upotrebu u potencijalnom tretmanu za indukciju imunološkog odgovora i/ili za indukciju STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I.

[0123] Jedan ovde opisan primer izvođenja je upotreba jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, u proizvodnji leka za indukciju imunološkog odgovora i/ili za indukciju STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I. U primerima izvođenja, bolest ili poremećaj koji treba lečiti je poremećaj ćelijske proliferacije. U aspektima ovih primera izvođenja, poremećaj ćelijske proliferacije je kancer. U sledećim aspektima ovih primera izvođenja, kancer je odabran od kancera mozga i kičmene moždine, kancera glave i vrata, leukemije i kancera krvi, kancera kože, kancera reproduktivnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera jetre i žučnih puteva, kancera bubrega i bešike, kancera kostiju, kancera pluća, malignog mezotelioma, sarkoma, limfoma, kancera žlezda, tireoidnih kancera, tumora srca, tumora germinativnih ćelija, malignih neuroendokrinih (karcinoidnih) tumora, kancera srednje linije i kancera nepoznatog primarnog porekla.

Kompozicije

[0124] Pojam "kompozicija" kako se ovde koristi namenjen je da obuhvati dozni oblik koji sadrži navedeno jedinjenje u navedenoj količini, kao i bilo koji dozni oblik koji rezultuje, direktno ili indirektno, iz kombinacije navedenog jedinjenja u navedenoj količini. Taj pojam je namenjen da obuhvati dozni oblik koji sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Prema tome, kompozicije predmetnog otkrića obuhvataju bilo koju kompoziciju napravljenu mešanjem jedinjenja predmetnog otkrića i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Pod "farmaceutski prihvatljiv", podrazumeva se da su nosači ili ekscipijensi kompatibilni sa ovde opisanim jedinjenjem i sa drugim sastojcima kompozicije.

[0125] U svrhu indukcije imunološkog odgovora i/ili indukcije STING-zavisne proizvodnje interferona tipa I, jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, mogu da se primene na način koji izaziva kontakt aktivnog agensa sa mestom delovanja agensa. Jedinjenja se mogu primenjivati na uobičajen način koji je dostupan za upotrebu zajedno sa farmaceutskim proizvodima, bilo kao pojedinačni terapijski agensi ili u kombinaciji terapijskih agenasa. Jedinjenja mogu da se primene sama, ali se tipično primenjuju sa farmaceutskim nosačem odabranim na osnovu izabranog načina primene i standardne farmaceutske prakse.

[0126] U jednom primeru izvođenja, ovde je opisana kompozicija koja sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Kompozicija može da se pripremi i pakuje u obliku balka iz koga može da se izdvoji terapijski efektivna količina jedinjenja otkrića i zatim primeni kod subjekta, kao što su praškovi ili sirupi. Alternativno, kompozicija može da se pripremi i spakuje u jediničnom doznom obliku u kome svaka fizički odvojena jedinica sadrži terapijski efektivnu količinu jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'),

4

jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog.

[0127] Jedinjenja koja su ovde opisana i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens(i) obično će biti formulisani u dozni oblik prilagođen za davanje subjektu željenim putem primene. Na primer, dozni oblici uključuju one prilagođene za (1) oralnu primenu, kao što su tablete, kapsule, kaplete, pilule, trohe, praškovi, sirupi, eliksiri, suspenzije, rastvori, emulzije, kesice i skrobne kapsule; i (2) parenteralnu primenu, kao što su sterilni rastvori, suspenzije i praškovi za rekonstituciju. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi će varirati u zavisnosti od izabranog doznog oblika. Osim toga, pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi mogu da se izaberu za određenu funkciju koju mogu da imaju u kompoziciji. Na primer, određeni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi mogu da budu izabrani zbog njihove sposobnosti da olakšaju proizvodnju uniformnih doznih oblika. Određeni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi mogu da budu izabrani zbog njihove sposobnosti da olakšaju proizvodnju stabilnih doznih oblika. Određeni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi mogu da budu izabrani zbog njihove sposobnosti da olakšaju prenošenje ili transport jedinjenja opisanog u ovom tekstu, nakon što se daju subjektu, iz jednog organa ili dela tela u drugi organ ili drugi deo tela. Određeni farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi mogu da se izaberu zbog njihove sposobnosti da poboljšaju komplijansu pacijenata.

[0128] Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju sledeće vrste ekscipijenasa: razređivači, lubrikanti, vezivna sredstva, sredstva za raspadanje, punioci, glidansi, sredstva za granuliranje, sredstva za oblaganje, sredstva za vlaženje, rastvarači, ko-rastvarači, sredstva za suspendovanje, emulgatori, zaslađivači, arome, sredstva za maskiranje ukusa, sredstva za bojenje, sredstva protiv zgrudnjavanja, humektanti, helirajuća sredstva, plastifikatori, sredstva za povećanje viskoznosti, antioksidansi, konzervansi, stabilizatori, surfaktanti i puferi.

[0129] Stručnjak u ovoj oblasti poseduje znanje i veštinu u oblasti tehnike za odabir pogodnih farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenasa u odgovarajućim količinama za upotrebu u kompozicijama ovog otkrića. Pored toga, stručnjacima su dostupni brojni izvori koji opisuju farmaceutski prihvatljive nosače i ekscipijense i koji mogu da budu korisni u izboru odgovarajućih farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenasa. Primeri uključuju REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company), THE HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL ADDITIVES (Gower Publishing Limited), i THE HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press).

[0130] Kompozicije otkrića pripremaju se upotrebom tehnika i postupaka poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Neki postupci koji se uobičajeno koriste u ovoj struci opisani su u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company).

[0131] U jednom primeru izvođenja, otkriće je usmereno na čvrsti oralni dozni oblik kao što je tableta ili kapsula koja sadrži terapijski efektivnu količinu jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, i razblaživač ili punilac. Pogodni razblaživači i punioci uključuju laktozu, saharozu, dekstrozu, manitol, sorbitol, skrob (npr. kukuruzni skrob, krompirov skrob, preželatinizovani skrob), celulozu i njene derivate (npr. mikrokristalnu celulozu), kalcijum sulfat i dvobazni kalcijum fosfat. Čvrsti oralni dozni oblik može dalje da sadrži vezivno sredstvo. Odgovarajuća vezivna sredstva uključuju skrob (npr. kukuruzni skrob, krompirov skrob, preželatinizovani skrob) želatin, akaciju, natrijum alginat, alginsku kiselinu, tragakant, guar gumu, povidon, i celulozu i njene derivate (npr. mikrokristalnu celulozu). Čvrsti oralni dozni oblik može dalje da sadrži sredstvo za raspadanje. Pogodna sredstva za raspadanje uključuju krospovidon, natrijum skrob glikolat, kroskarmelozu, alginsku kiselinu i natrijum karboksimetil celulozu. Čvrsti oralni dozni oblik može dalje da sadrži lubrikant. Odgovarajući lubrikanti uključuju stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, kalcijum stearat i talk.

[0132] Tamo gde je prikladno, jedinične dozne formulacije za oralnu primenu mogu da se mikroinkapsuliraju. Kompozicija takođe može da se pripremi tako da prolongira ili održava oslobađanje, na primer, premazivanjem ili ugradnjom čestica u polimere, vosak ili slično.

[0133] Ovde opisana jedinjenja takođe mogu da budu povezana sa rastvorljivim polimerima kao ciljanim nosačima lekova. Takvi polimeri mogu da uključuju polivinilpirolidon, pirankopolimer, polihidroksipropilmetakrilamidfenol, polihidroksietilaspartamidfenol, ili polietilenoksidpolilizin supstituisan palmitoil ostacima. Nadalje, jedinjenja otkrića mogu da budu povezana sa klasom biorazgradivih polimera koji su korisni za postizanje kontrolisanog otpuštanja leka, na primer polimlečnom kiselinom, poliepsilon kaprolaktonom, polihidroksi buternom kiselinom, poliortoestrima, poliacetalima, polidihidropiranima, policijanakrilatima i umreženim ili amfipatičnim blok kopolimerima hidrogelova.

[0134] U jednom primeru izvođenja, otkriće je usmereno na tečni oralni dozni oblik. Oralne tečnosti, poput rastvora, sirupa i eliksira, mogu da se pripreme u obliku jedinične doze, tako da data količina sadrži unapred određenu količinu jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli kao što je ovde opisano. Sirupi mogu da se pripreme rastvaranjem jedinjenja otkrića u vodenom rastvoru sa odgovarajućim ukusom; eliksiri se pripremaju upotrebom netoksičnog alkoholnog nosača. Suspenzije mogu da se formulišu raspršivanjem ovde opisanog jedinjenja u netoksičnom nosaču. Mogu da se dodaju i sredstva za poboljšanje rastvorljivosti i emulgatori, kao što su etoksilisani izostearil alkoholi i polioksi etilen sorbitol etri, konzervansi, aditivi za aromu poput ulja nane, ili drugi prirodni zaslađivači ili saharin ili drugi veštački zaslađivači, i slično.

[0135] U jednom primeru izvođenja, otkriće je usmereno na kompozicije za parenteralnu primenu. Kompozicije prilagođene za parenteralnu primenu uključuju vodene i nevodene sterilne injekcione rastvore koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostatska sredstva i rastvorene supstance koje čine formulaciju izotoničnom u odnosu na krv primaoca; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da uključuju sredstva za suspendovanje i sredstva za zgušnjavanje. Kompozicije se mogu predstaviti u jednodoznim ili višedoznim posudama, na primer u zaptivenim ampulama i bočicama, i mogu da se skladište u obliku osušenom zamrzavanjem (liofilizovanom), koji zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer, vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Magistralni rastvori i suspenzije za injekcije mogu da se pripreme od sterilnih praškova, granula i tableta.

Kombinacije

[0136] Jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), i/ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, mogu da se primene u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih agenasa. U primerima izvođenja, jedno ili više jedinjenja opšte formule (Ia), jedno ili više jedinjenja opšte formule (Ia'), jedno ili više jedinjenja opšte formule (Ib), jedno ili više jedinjenja opšte formule (Ib'), jedno ili više jedinjenja opšte formule (I), jedno ili više jedinjenja opšte formule (I'), ili jedna ili više farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog, i jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa mogu da se primenjuju zajedno. Dodatni aktivni agens(i) mogu da se primene u jednom doznom obliku sa jedinjenjem opšte formule (Ia), jedinjenjem opšte formule (Ia'), jedinjenjem opšte formule (Ib), jedinjenjem opšte formule (Ib'), jedinjenjem opšte formule (I), jedinjenjem opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivom solju gorenavedenog, ili dodatni aktivni agens(i) mogu da se primene u posebnom doznom obliku/doznim oblicima u odnosu na dozni oblik koji sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog.

[0137] Dodatni aktivni agens(i) mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, kada je to pogodno.

[0138] Dodatni aktivni agens(i) mogu da budu jedan ili više agenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od jedinjenja agonista STING, antivirusnih jedinjenja, antigena, adjuvanasa, antikancerskih agenasa, antagonista signalnih puteva CTLA-4, LAG-3 i PD-1, lipida, lipozoma, peptida, citotoksičnih agenasa, hemoterapijskih agenasa, imunomodulatornih ćelijskih linija, inhibitora kontrolnih tačaka, inhibitora receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), inhibitora topoizomeraze II, inhibitora receptora „smoothen“, alkilirajućih agenasa, antitumorskih antibiotika, antimetabolita, retinoida i imunomodulatornih agenasa uključujući, ali bez ograničenja antikancerske vakcine. Podrazumeva se da takvi dodatni aktivni agens(i) mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so. Podrazumeva se da opisi gorenavedenih dodatnih aktivnih agenasa mogu da se preklapaju. Takođe se podrazumeva da su tretmanske kombinacije predmet optimizacije, i jasno je da će najbolja kombinacija za upotrebu jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivih soli gorenavedenog, i jednog ili više dodatnih aktivnih agenasa biti određena na osnovu individualnih potreba pacijenta.

[0139] Ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa, uključujući, ali bez ograničenja, druge antikancerske agense koji se koriste u prevenciji, lečenju, kontroli, ublažavanju, ili smanjenju rizika određene bolesti ili stanja (npr., poremećaja ćelijske proliferacije). U jednom primeru izvođenja, ovde opisano jedinjenje se kombinuje sa jednim ili više drugih antikancerskih agenasa za upotrebu u prevenciji, lečenju, kontroli, ublažavanju, ili smanjenju rizika određene bolesti ili stanja za koja su ovde opisana jedinjenja korisna. Takvi drugi aktivni agensi mogu da se primene, putem i u količini koji se uobičajeno koriste za njih, istovremeno ili sekvencijalno sa jedinjenjima predmetnog otkrića.

[0140] Kada se ovde opisano jedinjenje koristi istovremeno sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa, razmatra se kompozicija koja sadrži takve druge aktivne agense pored ovde opisanog jedinjenja. Prema tome, kompozicije predmetnog otkrića uključuju one koje takođe sadrže jedan ili više drugih aktivnih sastojaka, pored ovde opisanog jedinjenja. Ovde opisano jedinjenje može da se primeni ili istovremeno sa, ili pre ili posle, jednog ili više drugih aktivnih sastojaka. Ovde opisano jedinjenje može da se primeni odvojeno, istim ili drugačijim putem primene, ili zajedno u istoj farmaceutskoj kompoziciji kao drugi agens(i).

[0141] Proizvodi obezbeđeni kao kombinacije mogu da uključuju kompoziciju koja sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, i jedan ili više drugih aktivnih agenasa zajedno u istoj farmaceutskoj kompoziciji, ili mogu da uključuju kompoziciju koja sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, i kompoziciju koja sadrži jedan ili više drugih aktivnih agenasa u posebnom obliku, npr. u obliku kompleta ili u bilo kom obliku dizajniranom da omogući posebnu primenu bilo istovremeno, ili prema posebnim rasporedima doziranja.

[0142] Težinski odnos jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, prema drugom aktivnom agensu može da varira i zavisiće od terapijski efektivne doze svakog agensa. Uglavnom, biće korišćena terapijski efektivna doza svakog od njih. Kombinacije ovde opisanog jedinjenja i drugih aktivnih agenasa biće uglavnom takođe u okviru gorepomenutog opsega, ali u svakom slučaju, treba da bude upotrebljena terapijski efektivna doza svakog aktivnog agensa. U takvim kombinacijama, ovde opisano jedinjenje i drugi aktivni agensi mogu da se primene odvojeno ili zajedno. Pored toga, primena jednog elementa može da bude pre, istovremeno, ili posle primene drugog/drugih agenasa.

[0143] U jednom primeru izvođenja, otkriće obezbeđuje kompoziciju koja sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog, i najmanje jedan drugi aktivni agens kao kombinovani preparat za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji. U jednom primeru izvođenja, terapija je lečenje poremećaja ćelijske proliferacije, kao što je kancer.

[0144] U jednom primeru izvođenja, otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži dve ili više posebnih farmaceutskih kompozicija, od kojih najmanje jedna sadrži jedinjenje opšte formule (Ia), jedinjenje opšte formule (Ia'), jedinjenje opšte formule (Ib), jedinjenje opšte formule (Ib'), jedinjenje opšte formule (I), jedinjenje opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivu so gorenavedenog. U jednom primeru izvođenja, komplet sadrži način da se navedene kompozicije drže odvojene, kao što je posuda, podeljena boca, ili podeljeno pakovanje od folije. Primer takvog kompleta je blister pakovanje, kakvo se obično koristi za pakovanje tableta, kapsula, i slično.

[0145] Komplet prema ovom otkriću može da se koristi za primenu različitih doznih oblika, na primer, oralnih i parenteralnih, za primenu odvojenih kompozicija u različitim doznim intervalima, ili za međusobnu titraciju odvojenih kompozicija. Da bi se olakšala komplijansa, komplet prema otkriću obično sadrži uputstvo za primenu.

[0146] Ovde je opisana upotreba jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije, pri čemu se lek priprema za primenu sa drugim aktivnim agensom. Otkriće takođe obezbeđuje upotrebu drugog aktivnog agensa za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije, pri čemu se lek primenjuje sa jedinjenjem opšte formule (Ia), jedinjenjem opšte formule (Ia'), jedinjenjem opšte formule (Ib), jedinjenjem opšte formule (Ib'), jedinjenjem opšte formule (I), jedinjenjem opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivom solju gorenavedenog.

[0147] Otkriće takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja opšte formule (Ia), jedinjenja opšte formule (Ia'), jedinjenja opšte formule (Ib), jedinjenja opšte formule (Ib'), jedinjenja opšte formule (I), jedinjenja opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljive soli gorenavedenog, za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije, gde je pacijent prethodno (npr., tokom 24 časa) lečen drugim aktivnim agensom. Otkriće takođe obezbeđuje upotrebu drugog aktivnog agensa za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije, gde je pacijent prethodno (npr., tokom 24 časa) bio lečen jedinjenjem opšte formule (Ia), jedinjenjem opšte formule (Ia'), jedinjenjem opšte formule (Ib), jedinjenjem opšte formule (Ib'), jedinjenjem opšte formule (I), jedinjenjem opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivom solju gorenavedenog. Drugi agens može da se primeni nedelju dana, nekoliko nedelja, mesec dana, ili nekoliko meseci posle primene ovde opisanog jedinjenja.

[0148] Jedinjenja agonisti STING koja mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, opisanim u ovom dokumentu, uključuju, ali nisu ograničena na ciklična di-nukleotidna jedinjenja.

[0149] Antivirusna jedinjenja koja mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, opisanim u ovom dokumentu, uključuju inhibitore hepatitis B virusa (HBV), inhibitore proteaze hepatitis C virusa (HCV), inhibitore polimeraze HCV, inhibitore HCV NS4A, inhibitore HCV NS5A, inhibitore HCV NS5b i inhibitore humanog virusa imunodeficijencije (HIV). Takva antivirusna jedinjenja mogu da budu obezbeđena kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je to prikladno.

[0150] Antigeni i adjuvansi koji mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule

4

(Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, uključuju B7 kostimulatorni molekul, interleukin-2, interferon-γ, GM-CSF, antagoniste CTLA-4, OX-40/0X-40 ligand, CD40/CD40 ligand, sargramostim, levamisol, vakcinija virus, bacil Calmette-Guerin (BCG), lipozome, aluminijum sulfat, kompletni ili nekompletni Freund-ov adjuvans, detoksifikovane endotoksine, mineralna ulja, površinski aktivne supstance kao lipolecitin, poliole pluronika, polianjone, peptide i uljane ili ugljovodonične emulzije. Adjuvansi, kao aluminjum hidroksid ili aluminijum fosfat, mogu da se dodaju da povećaju sposobnost vakcine da izazove, pojača, ili produži imunološki odgovor. Dodatni materijali, kao citokini, hemokini i sekvence bakterijske nukleinske kiseline, kao CpG, agonist receptora sličnog toll-u (TLR) 9, kao i dodatni agonisti za TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR9, uključujući lipoprotein, LPS, monofosforillipid A, lipoteihoična kiselina, imikvimod, rezikvimod, i pored toga, agonisti inducibilnog gena I za retinoinsku kiselinu (RIG-I) kao poli I:C, upotrebljeni odvojeno ili u kombinaciji sa opisanim kompozicijama su takođe potencijalni adjuvansi. Takvi antigeni i adjuvansi mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, ako je primereno.

[0151] Signalni putevi CLTA-4 i PD-1 su značajni negativni regulatori imunološkog odgovora. Aktivirane T-ćelije ushodno regulišu CTLA-4, koji se vezuje sa antigen-prezentujućim ćelijama i inhibira stimulaciju T-ćelija, ekspresiju gena za IL-2 i proliferaciju T-ćelija; ova antitumorska dejstva zapažena su u mišjim modelima karcinoma debelog creva, metastatskom kanceru prostate i metastatskom melanomu. PD-1 se vezuje za aktivne T-ćelije i suprimira aktivaciju T-ćelija; antagonisti PD-1 su takođe pokazali antitumorska dejstva. Antagonisti signalnih puteva CTLA-4 i PD-1 koji mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, opisanim u ovom dokumentu, uključuju ipilimumab, tremelimumab, nivolumab, pembrolizumab, CT-011, AMP-224 i MDX-1106.

[0152] "Antagonist PD-1" ili "antagonist signalnog puta PD-1" označava bilo koje hemijsko jedinjenje ili biološki molekul koji blokira vezivanje PD-L1 eksprimiranog na kancerskoj ćeliji za PD-1 eksprimiran na imunskoj ćeliji (T-ćelija, B-ćelija, ili NKT-ćelija) i poželjno takođe blokira vezivanje PD-L2 eksprimiranog na kancerskoj ćeliji za PD-1 eksprimiran na imunskoj ćeliji. Alternativni nazivi ili sinonimi za PD-1 i njegove ligande uključuju: PDCD1, PD1, CD279 i SLEB2 za PD-1; PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 i B7-H za PD-L1; i PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc i CD273 za PD-L2. U bilo kom od postupaka lečenja, lekova i upotreba predmetnog otkrića u kojima se leči ljudsko biće, antagonist PD-1 blokira vezivanje humanog PD-L1 za humani PD-1, i poželjno blokira vezivanje oba, humanog PD-L1 i PD-L2 za humani PD-1. Aminokiselinske sekvence humanog PD-1 mogu da se nađu u NCBI lokus br.: NP_005009. Aminokiselinske sekvence humanog PD-L1 i PD-L2 mogu da se nađu u NCBI lokus br.: NP_054862, odnosno NP_079515.

[0153] Antagonisti PD-1 korisni u bilo kom od postupaka lečenja, lekova i upotreba predmetnog otkrića uključuju monoklonsko antitelo (mAb), ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za PD-1 ili PD-L1, i poželjno se specifično vezuje za humani PD-1 ili humani PD-L1. mAb može da bude humano antitelo, humanizovano antitelo, ili himerno antitelo i može da uključuje humani konstantni region. U nekim primerima izvođenja, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnih regiona IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, i u poželjnim primerima izvođenja, humani konstantni region je konstantni region IgG1 ili IgG4. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od fragmenata Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv i Fv.

[0154] Primeri mAb koja se vezuju za humani PD-1, i korisna su u postupku lečenja, lekovima i upotrebama predmetnog otkrića, opisana su u SAD patentima br. US7488802, US7521051, US8008449, US8354509 i US8168757, objavama PCT međunarodnih patentnih prijava br. WO2004/004771, WO2004/072286 i WO2004/056875, i objavi SAD patentne prijave br. US2011/0271358.

[0155] Primeri mAb koja se vezuju za humani PD-L1, i korisna su u postupku lečenja, lekovima i upotrebama predmetnog otkrića, opisana su u PCT međunarodnim patentnim prijavama br. WO2013/019906 i WO2010/077634 A1 i SAD patentu br. US8383796. Specifična anti-humana PD-L1 mAb korisna kao antagonist PD-1 u postupku lečenja, lekovima i upotrebama predmetnog otkrića uključuju MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C i antitelo koje sadrži varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca SEQ ID NO:24, odnosno SEQ ID NO:21, iz WO2013/019906.

[0156] Drugi antagonisti PD-1 korisni u bilo kom od postupka lečenja, lekovima i upotrebama predmetnog otkrića uključuju imuno-adheziju koja specifično podrazumeva vezivanje za PD-1 ili PD-L1, i poželjno specifično podrazumeva vezivanje za humani PD-1 ili humani PD-L1, npr., fuzioni protein koji sadrži vanćelijski ili deo koji vezuje PD-1 iz PD-L1 ili PD-L2 fuzionisan sa konstantnim regionom kao što je Fc region imunoglobulinskog molekula. Primeri imunoadhezionih molekula koji se specifično vezuju za PD-1 opisani su u objavama PCT međunarodnih patentnih prijava br. WO2010/027827 i WO2011/066342. Specifični fuzioni proteini korisni kao antagonist PD-1 u postupku lečenja, lekovima i upotrebama predmetnog otkrića uključuju AMP-224 (poznat i kao B7-DCIg), koji je fuzioni protein PD-L2-FC i vezuje se za humani PD-1.

[0157] Primeri citotoksičnih agenasa koji mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, uključuju, ali nisu ograničeni na arsenik trioksid (prodaje se pod trgovačkim imenom TRISENOX<®>), asparaginazu (poznatu i kao L-asparaginaza, i Erwinia L-asparaginaza, koja se prodaje pod zaštićenim imenima ELSPAR<®>i KIDROLASE<®>).

[0158] Hemoterapijski agensi koji mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima opšte formule (Ia), jedinjenjima opšte formule (Ia'), jedinjenjima opšte formule (Ib), jedinjenjima opšte formule (Ib'), jedinjenjima opšte formule (I), jedinjenjima opšte formule (I'), ili farmaceutski prihvatljivim solima gorenavedenog, opisanim u ovom dokumentu, uključuju abirateron acetat, altretamin, anhidrovinblastin, auristatin, beksaroten, bikalutamid, BMS 184476, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoksifenil) benzen sulfonamid, bleomicin, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-prolil-1-L-prolin-t-butilamid, kahektin, cemadotin, hlorambucil, ciklofosfamid, 3',4'-didehidro-4'deoksi-8'-norvin-kaleukoblastin, docetaksol, doksetaksel, ciklofosfamid, karboplatin, karmustin, cisplatin, kriptoficin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin (DTIC), daktinomicin, daunorubicin, decitabin dolastatin, doksorubicin (adriamicin), etopozid, 5-fluorouracil, finasterid, flutamid, hidroksiureu i hidroksiureu i taksane, ifosfamid, liarozol, lonidamin, lomustin (CCNU), MDV3100, mehloretamin (azotni iperit), melfalan, mivobulin izetionat, rizoksin, sertenef, streptozocin, mitomicin, metotreksat, taksane, nilutamid, nivolumab, onapriston, paklitaksel, pembrolizumab, prednimustin, prokarbazin, RPR109881, stramustin fosfat, tamoksifen, tasonermin, taksol, tretinoin, vinblastin, vinkristin, vindesin sulfat i vinflunin. Takvi hemoterapijski agensi mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0159] Primeri inhibitora receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) uključuju, ali nisu ograničeni na bevacizumab (prodaje se pod trgovačkim imenom AVASTIN kompanije Genentech/Roche), aksitinib (opisan u PCT međunarodnoj patentnoj objavi br. WO01/002369), Brivanib Alaninat ((S)-((R)-1-(4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloksi)-5-metilpirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-iloksi)propan-2-il)2-aminopropanoat, poznat i kao BMS-582664), motesanib (N-(2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-indol-6-il)-2-[(4-piridinilmetil)amino]-3-piridinkarboksamid, opisan u objavi PCT međunarodne patentne prijave br. WO02/068470), pasireotid (poznat i kao SO 230 i opisan u PCT međunarodnoj patentnoj objavi br. WO02/010192), i sorafenib (prodaje

4

se pod trgovačkim imenom NEXAVAR). Takvi inhibitori mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0160] Primeri inhibitora topoizomeraze II, uključuju ali nisu ograničeni na etopozid (poznat i kao VP-16 i etopozid fosfat, prodaje se pod trgovačkim imenima TOPOSAR, VEPESID i ETOPOPHOS) i tenipozid (poznat i kao VM-26, prodaje se pod trgovačkim imenom VUMON). Takvi inhibitori mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0161] Primeri alkilirajućih agenasa, uključuju, ali nisu ograničeni na 5-azacitidin (prodaje se pod trgovačkim imenom VIDAZA), decitabin (prodaje se pod trgovačkim imenom DECOGEN), temozolomid (prodaje se pod trgovačkim imenima TEMODAR i TEMODAL kompanije Schering-Plough/Merck), daktinomicin (poznat i kao aktinomicin-D i prodaje se pod trgovačkim imenom COSMEGEN), melfalan (poznat i kao L-PAM, L-sarkolizin, i fenilalanin iperit, prodaje se pod trgovačkim imenom ALKERAN), altretamin (poznat i kao heksametilmelamin (HMM), prodaje se pod trgovačkim imenom HEXALEN), karmustin (prodaje se pod trgovačkim imenom BCNU), bendamustin (prodaje se pod trgovačkim imenom TREANDA), busulfan (prodaje se pod trgovačkim imenima BUSULFEX<®>i MYLERAN<®>), karboplatin (prodaje se pod trgovačkim imenom PARAPLATIN<®>), lomustin (poznat i kao CCNU, prodaje se pod trgovačkim imenom CEENU<®>), cisplatin (poznat i kao CDDP, prodaje se pod trgovačkim imenima PLATINOL<®>i PLATINOL®-AQ), hlorambucil (prodaje se pod trgovačkim imenom LEUKERAN<®>), ciklofosfamid (prodaje se pod trgovačkim imenima CYTOXAN<®>i NEOSAR<®>), dakarbazin (poznat i kao DTIC, DIC i imidazol karboksamid, prodaje se pod trgovačkim imenom DTIC-DOME<®>), altretamin (poznat i kao heksametilmelamin (HMM) prodaje se pod trgovačkim imenom HEXALEN<®>), ifosfamid (prodaje se pod trgovačkim imenom IFEX<®>), prokarbazin (prodaje se pod trgovačkim imenom MATULANE<®>), mehloretamin (poznat i kao azotni iperit, mustin i mehloroetamin hidrohlorid, prodaje se pod trgovačkim imenom MUSTARGEN<®>), streptozocin (prodaje se pod trgovačkim imenom ZANOSAR<®>), tiotepa (poznat i kao tiofosfoamid, TESPA i TSPA, i prodaje se pod trgovačkim imenom THIOPLEX<®>. Takvi alkilirajući agensi mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0162] Primeri antitumorskih antibiotika uključuju, ali nisu ograničeni na doksorubicin (prodaje se pod trgovačkim imenima ADRIAMYCIN<®>i RUBEX<®>), bleomicin (prodaje se pod trgovačkim imenom LENOXANE<®>), daunorubicin (poznat i kao dauorubicin hidrohlorid, daunomicin i rubidomicin hidrohlorid, prodaje se pod trgovačkim imenom CERUBIDINE<®>), lipozomalni daunorubicin (daunorubicin citrat lipozom, prodaje se pod trgovačkim imenom DAUNOXOME<®>), mitoksantron (poznat i kao DHAD, prodaje se pod trgovačkim imenom NOVANTRONE<®>), epirubicin (prodaje se pod trgovačkim imenom ELLENCE™), idarubicin (prodaje se pod trgovačkim imenima IDAMYCIN<®>, IDAMYCIN PFS<®>) i mitomicin C (prodaje se pod trgovačkim imenom MUTAMYCIN<®>). Takvi antitumorski antibiotici mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0163] Primeri antimetabolita uključuju, ali nisu ograničeni na klaribin (2-hlorodeoksiadenozin, prodaje se pod trgovačkim imenom LEUSTATIN<®>), 5-fluorouracil (prodaje se pod trgovačkim imenom ADRUCIL<®>), 6-tioguanin (prodaje se pod trgovačkim imenom PURINETHOL<®>), pemetreksed (prodaje se pod trgovačkim imenom ALIMTA<®>), citarabin (poznat i kao arabinozilcitozin (Ara-C), prodaje se pod trgovačkim imenom CYTOSAR-U<®>), lipozomalni citarabin (poznat i kao Lipozomalni Ara-C, prodaje se pod trgovačkim imenom DEPOCYT™), decitabin (prodaje se pod trgovačkim imenom DACOGEN<®>), hidroksiureu (prodaje se pod trgovačkim imenima HYDREA<®>, DROXIA™ i MYLOCEL™), fludarabin (prodaje se pod trgovačkim imenom FLUDARA<®>), floksuridin (prodaje se pod trgovačkim imenom FUDR<®>), kladribin (poznat i kao 2-hlorodeoksiadenozin (2-CdA) prodaje se pod trgovačkim imenom LEUSTATIN™), metotreksat (poznat i kao ametopterin, natrijum metotreksat (MTX), prodaje se pod trgovačkim imenima RHEUMATREX<®>i TREXALL™) i pentostatin (prodaje se pod trgovačkim imenom NIPENT<®>). Takvi antimetaboliti mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

[0164] Primeri retinoida uključuju, ali nisu ograničeni na alitretinoin (prodaje se pod trgovačkim imenom PANRETIN<®>), tretinoin (sve-trans retinoinska kiselina, poznata i kao ATRA, prodaje se pod trgovačkim imenom VESANOID<®>), izotretinoin (13-c/s-retinoinska kiselina, prodaje se pod trgovačkim imenima ACCUTANE<®>, AMNESTEEM<®>, CLARA VIS<®>, CLARUS<®>, DECUTAN<®>, ISOTANE<®>, IZOTECH<®>, ORATANE<®>, ISOTRET<®>i SOTRET<®>) i beksaroten (prodaje se pod trgovačkim imenom TARGRETIN<®>). Takva jedinjenja mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutski prihvatljiva so, tamo gde je prikladno.

Aktivnost: Biohemijska analiza kompetitivnog vezivanja [<3>H] cGAMP za STING

[0165] Pojedinačna jedinjenja opisana u primerima ovog dokumenta definisana su kao agonisti STING kao rezultat (i) vezivanja za protein STING, što je pokazano smanjenjem vezivanja liganda cGAMP obogaćenog tricijumom za protein STING za najmanje 20% pri 20 uM (koncentracija jedinjenja koje se ispituje) u biohemijskoj analizi kompetitivnog vezivanja [<3>H] cGAMP za STING i (ii) demonstracije proizvodnje interferona sa 6% ili većom indukcijom

4

sekrecije IFN-β pri 30 uM u analizi na ćelijama THP1 (gde indukcija izazvana pomoću cGAMP pri 30 uM predstavlja 100%).

[0166] Sposobnost jedinjenja da se vežu za STING kvantitativno se određuje preko sposobnosti da kompetiraju sa ligandom cGAMP obogaćenim tricijumom za vezivanje za membrane sa humanim receptorom STING upotrebom radioaktivnog testa vezivanja na filteru. Analiza vezivanja koristi receptor STING dobijen iz membrana Hi-Five ćelija koje prekomerno eksprimiraju HAQ STING cele dužine pripremljen u sopstvenoj laboratoriji i ligand cGAMP obogaćen tricijumom, takođe prečišćen u sopstvenoj laboratoriji.

[0167] Sledeće eksperimentalne procedure detaljno opisuju pripremu specifičnih primera ovog otkrića. Jedinjenja primera su nacrtana u svojim neutralnim oblicima u dole navedenim procedurama i tabelama. U nekim slučajevima jedinjenja su izolovana kao soli u zavisnosti od postupka koji se koristi za njihovo konačno prečišćavanje i/ili intrinzičkih molekulskih svojstava. Primeri su samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da na bilo koji način ograničavaju obim ovog otkrića.

PRIMERI

SKRAĆENICE

[0168]

(COCl)2Oksalil hlorid

<19>F NMR<19>F spektroskopija nuklearne magnetne rezonance

<1>H NMR<1>H (Proton) spektroskopija nuklearne magnetne rezonance 2',3'cGAMP, cGAMP 2',3'-ciklični guanozin monofosfat-adenozin monofosfat ACN, MeCN, CH3CN Acetonitril

AcOH, HOAc Sirćetna kiselina

AlCl3Aluminijum trihlorid

AMP Adenozin monofosfat

aq Vodeni

Ar Argon

ATP Adenozin 5'-trifosfat

BIIC Insekatska ćelija inficirana bakulovirusom

br Široki

4

Br2Brom

cat Kataloški broj

CD3OD Deuterijumom-obogaćeni metil alkohol, deuterijumom-obogaćeni metanol

CDCl3Deuterisani trihlorometan

cGAMP Ciklični GMP-AMP sintaza

CH2I2Dijodometan

CH3Cl Hlorometan, metil hlorid

CHCl3Trihlorometan

Ci Kiri, nestandardna jedinica radioaktivnosti; 1Ci = 3.7×10<10>Bq, gde je Bq bekerel, SI jedinica radioaktivnosti, ekvivalent 1 dezintegraciji po sekundi (dps)

CO2Ugljen dioksid

CPhos Pd G4 2-Aminobifenilpaladijum metansulfonat paladijum CPhos prekatalizator (4. generacija prekatalizatora)

Cs2CO3Cezijum karbonat

Cu-Cl Bakar(I) hlorid

Cu-I Bakar(I) jodid

Cy Cikloheksil

d Dublet

DCE 1,2-Dihloroetan

DCM, CH2Cl2Dihlorometan

ddd Dublet dubleta dubleta

ddt Dublet dubleta tripleta

DMAP 4-dimetilaminopiridin

DMEA N,N-dimetil etil amin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO Dimetil sulfoksid

DMTr 4,4'-dimetoksitritil

DMTrCl 4,4'-dimetoksitritil hlorid

dq Dublet kvarteta

4

EC50polovina maksimalne efektivne koncentracije; koncentracija leka, antitela, ili toksina koja indukuje odgovor na pola puta između početnog nivoa i maksimuma posle naznačenog vremena izlaganja EDC Etilen dihlorid

eq Ekvivalenti

ES Elektronski sprej

Et Etil

Et2O Dietil etar

Et2Z Dietil cink

EtOAc Etil acetat

EtOH Etil alkohol, etanol

g Gram

GMP Guanozin 5'-monofosfat

GTP Guanozin 5'-trifosfat

h Čas

H2Vodonik (gas)

H2SO4Sumporna kiselina

HAQ STING Uobičajena varijanta STING koja sadrži tri mutacije R71H-G230A-R293Q (DNK konstrukt koji je ovde upotrebljen:

STING(1-379)R71H,G230A, H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBAC1)

HCl Hlorovodonična kiselina

HEPES 2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]etansulfonska kiselina,

cviterjonski organski hemijski puferski agens

hept Heptet

Hex Heksani

HNO3Azotna kiselina

HPLC Tečna hromatografija visokih performansi

Hz Herc

IC50polovina maksimalne inhibitorne koncentracije; koncentracija leka, antitela, ili toksina potrebna za 50% inhibicije odgovora ili vezivanja

4

Inh Inhibicija

J NMR kuplujuća konstanta

K2CO3Kalijum karbonat

KCl Kalijum hlorid

KOH Kalijum hidroksid

LCMS Tečna hromatografija - masena spektroskopija

LDA Litijum di-izopropil amid

LiOH Litijum hidroksid

LiOH·H2O Litijum hidroksid monohidrat

m Multiplet

M Molarnost, molova po litru

m/z Odnos mase i naelektrisanja

M+H Protonovana masa, merenje mase proizvedeno spektrometrijom mase

mCi Milikiri

Me Metil

MeB(OH)2Metil boronska kiselina

MeMgBr Metil magnezijum bromid

MeOH, CH3OH Metanol

mg Miligram

MgCl2Magnezijum hlorid

MgSO4Magnezijum sulfat

MHz Megaherc

min Minut(i)

mL, ml Mililitar

mM Milimol po litru

mmol Milimol

MOI Multiplicitet infekcije

N2Azot (gas)

Na2CO3Natrijum karbonat

Na2SO4Natrijum sulfat

4

NaCl Natrijum hlorid

NaHCO3Natrijum bikarbonat

NaHSO3Natrijum bisulfit

NaHSO4Natrijum bisulfat, natrijum hidrogen sulfat NaOH Natrijum hidroksid

ng Nanogram(i)

NH3Amonijak

NH4Cl Amonijum hlorid

NH4OH Amonijum hidroksid

nL Nanolitar

nm Nanometar

nM Nanomolarni

NMP N-metil-2-pirolidon

Pd(Ph3P)4Tetrakis(trifenil fosfin) paladijum(0)

Pd/C Paladijum na ugljeniku

Pd2(dba)3Tris(dibenziliden aceton) dipaladijum(0)

PE Petrol-etar

pfu Jedinica formiranja plaka

prep-HPLC Preparativna tečna hromatografija visokih performansi prep-TLC Preparativna tankoslojna hromatografija

PSI Funti po kvadratnom inču

Py, py Piridin

q Kvartet

RPM, rpm Obrtaja u minutu

RT, rt Sobna temperatura, približno 25°C

s Singlet

sat Zasićen

SFC Hromatografija superkritičnih fluida

SiO2Silika, silicijum dioksid

SO2Cl2Sulfuril hlorid

SOCl2Tionil hlorid

t Triplet

t-BuLi t-Butil litijum, terc-butil litijum

TFA Trifluorosirćetna kiselina

THF Tetrahidrofuran

TLC Tankoslojna hromatografija

TMSCl Trimetilsilil hlorid

TRVreme zadržavanja

TrisCl Tris(hidroksimetil)aminometan hidrohlorid

v/v Zapremina/zapremina

WT STING Divlji tip (najzastupljenija) varijanta STING kod ljudi (DNK konstrukt koji je ovde upotrebljen: STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8/pBAC1)

X-Phos 2-Dicikloheksilfosfino-2',4',6'-triizopropilbifenil

λemTalasna dužina emisije

λexTalasna dužina ekscitacije

µg, ug Mikrogram

µL, uL, µl, ul Mikrolitar

µM, uM Mikromolarni

µm, um Mikrometar

Preparacija 1: CPhos Pd G4

[0169]

Korak 1: CPhos Pd G4

[0170]

1

[0171] Smeša dimera (2'-metilamino-1,1'-bifenil-2-il)metansulfonatopaladijuma (II) (439 mg, 0.573 mmol) i 2'-(dicikloheksilfosfino)-N2,N2,N6,N6-tetrametil-[1,1'-bifenil]-2,6-diamina (500 mg, 1.15 mmol) u DCM (6 mL) mešana je na rt tokom 2h. Rastvor je zatim razblažen sa Et2O (30 mL). Rastvor je filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je pretvoren u gustu suspenziju u pentanima i ponovo koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio CPhos Pd G4. Videti Bruno, N. C.; Niljianskul, N.; Buchwald, S. L. J. Org. Chem.2014, 79, 4161.

Preparacija 2: Metil-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0172]

[0173] U mešani rastvor 2-fluoro-4,5-dimetoksibenzaldehida (18.7 g, 102 mmol) u DMF (600 mL) dodat je metil 2-merkaptoacetat (11.9 g, 112 mmol) i K2CO3(42.1 g, 305 mmol). Rezultujuća smeša je zatim zagrevana na 60°C tokom 15h. Posle hlađenja do rt, reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je razblažen sa H2O (500 mL) i ekstrahovan sa DCM (600 mL). Organska faza je osušena nad Na2SO4, filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio metil 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat. LCMS (C12H13O4S) (ES, m/z): 253 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8.03 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 3.85 (s, 6H), 3.82 (s, 3H).

Preparacija 3: 5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0174]

[0175] U suspenziju metil 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata iz preparacije 2 (23 g, 91 mmol) u MeOH (200 mL), THF (200 mL) i H2O (200 mL) dodat je KOH (51 g, 910 mmol).

2

Rezultujuća suspenzija je zagrevana do 60°C tokom 30 min. Posle hlađenja do rt, reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. U dobijeni ostatak dodata je H2O (600 mL), a zatim je u rastvor dodata limunska kiselina da bi se pH podesio na 6. Staloženi materijal je sakupljen filtracijom da bi se dobila 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 7.94 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H).

Primer 1: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-etil-4-oksobutanska kiselina

[0176]

Korak 1: 1-Etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-etilsukcinat

[0177]

[0178] U mešani rastvor 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoata (komercijalno dostupan kod SPECS, 0.10 g, 0.32 mmol) u DMF (1.6 mL) dodat je metil 2-bromobutirat (37 uL, 0.32 mmol) i K2CO3(54 mg, 0.39 mmol) na rt. Reakciona smeša je mešana preko noći na rt i zatim razblažena sa H2O (3 mL) i DCM (6 ml). Faze su razdvojene, i vodeni sloj je opran dodatnim DCM (3x6 mL). Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom i osušeni preko noći pod visokim vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-etilsukcinat, koji je korišćen bez daljeg prečišćavanja. LCMS (C20H25O7S) (ES, m/z): 409 [M+H]<+>.

Korak 2: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-etil-4-oksobutanska kiselina

[0179]

[0180] U smešu 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-etilsukcinata (83 mg, 0.20 mmol) u THF (1.8 mL) i H2O (0.18 mL) dodat je LiOH (39 mg, 1.6 mmol). Reakciona smeša je mešana preko noći na rt pre nego što je smeša ugašena sa 2M vodenim rastvorom HCl (0.30 mL, 0.59 mmol), a zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5,6-dimetoksibenzo[b] tiofen-2-il)-2-etil-4-oksobutanska kiselina. Racemska smeša je razdvojena pomoću CHIRAL-SFC (CHIRACEL OJ-H (250 mm*21 mm), 25% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 3.65 min i 5.26 min. Koncentrovanje prvog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C16H19O5S) (ES, m/z): 323 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.15 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.35-3.27 (m, 1H), 3.00-2.94 (m, 1H), 2.73-2.67 (m, 1H), 1.58-1.50 (m, 2H), 0.85 (t, J = 7.3Hz, 3H).

Primer 2: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-izopropil-4-oksobutanska kiselina [0181]

Korak 1: 1-Etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-izopropilsukcinat [0182]

[0183] U mešanu smešu etil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoata (SPECS, 0.15 g, 0.49 mmol) u DMF (2.4 mL) dodat je metil 2-bromoizovalerat (73 uL, 0.49 mmol) i K2CO3(81 mg, 0.58 mmol) na rt. Reakciona smeša je mešana preko noći na rt i zatim razblažena sa H2O (3.0 mL) i DCM (6.0 ml). Faze su razdvojene, i vodeni sloj je opran dodatnim DCM (3x6.0 mL). Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom i osušeni preko noći pod visokim vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-izopropilsukcinat, koji je korišćen u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja. LCMS (C21H27O7S) (ES, m/z): 423 [M+H]<+>.

Korak 2: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-izopropil-4-oksobutanska kiselina

[0184]

4

[0185] U smešu 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-izopropilsukcinata (68 mg, 0.16 mmol) u THF (0.80 mL), MeOH (0.40 mL) i H2O (0.18 mL) dodat je LiOH (19 mg, 0.80 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 2h na rt pre nego što je smeša ugašena 2M vodenim rastvorom HCl (0.40 mL, 0.80 mmol) i zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobila 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-izopropil-4-oksobutanska kiselina. Racemska smeša je razdvojena pomoću CHIRAL-SFC (CHIRALPAK IC (250 mm*21 mm), 40% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 5.70 min i 7.05 min. Koncentrovanje drugog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C17H21O5S) (ES, m/z): 337 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.17 (1H, s), 7.49 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.35-3.25 (m, 1H), 3.05-2.85 (m, 1H), 2.67-2.61 (m, 1H), 1.95-1.87 (m, 1H), 0.88-0.82 (m, 6H).

Primer 3: 2-Ciklopropil-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0186]

Korak 1: Dietil 2-ciklopropil-3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)sukcinat

[0187]

[0188] U mešanu smešu etil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoata (SPECS, 0.30 g, 0.97 mmol) u DMF (4.9 mL) dodat je etil 2-bromo-2-ciklopropilacetat (0.20 g, 0.97 mmol) i zatim K2CO3(0.16 g, 1.2 mmol) na rt. Smeša je ostavljena da se meša preko noći i zatim razblažena sa H2O (3.0 mL) i DCM (6.0 mL). Faze su razdvojene, i vodeni sloj je opran sa DCM (3x6 mL). Kombinovane organske faze su koncentrovane pod sniženim pritiskom i osušene preko noći pod visokim vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio dietil 2-ciklopropil-3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)sukcinat. LCMS (C22H27O7S) (ES, m/z): 435 [M+H]<+>.

Korak 2: 2-Ciklopropil4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0190] U smešu dietil 2-ciklopropil-3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)sukcinata (90 mg, 0.21 mmol) u THF (1.0 mL), MeOH (0.50 mL) i H2O (0.50 mL) dodat je LiOH (25 mg, 1.0 mmol), i smeša je ostavljena da se meša 2h na rt. Posle 2h, smeša je acidifikovana pomoću 1N HCl (0.50 mL, 1.0 mmol) i zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobila 2-ciklopropil-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina kao racemska smeša. Racemska smeša je razdvojena pomoću CHIRAL-SFC (OJ-H kolona, 25% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 5.3 min i 6.9 min. Koncentrovanje prvog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C17H19O5S) (ES, m/z): 335 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.51-3.43 (m, 2H), 2.13-2.08 (m, 1H), 0.99-0.87 (m, 1H), 0.54-0.34 (m, 4H).

Primer 4: 2-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan karboksilna kiselina [0191]

Korak 1: 5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen

[0192]

[0193] U mešani rastvor 5, 6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (preparacija 3, 2.00 g, 8.39 mmol) u hinolinu (20 mL) dodat je bakar (0.907 g, 14.3 mmol) i zatim je smeša zagrevana na 190°C tokom 2h. Nakon hlađenja do rt, smeša je razblažena sa EtOAc i zatim sukcesivno oprana vodenim rastvorom HCl (2M), H2O, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen. LCMS (C10H11O2S) (ES, m/z): 195 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 7.54 (s, 1H), 7.51 (d, J = 5.3Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.29 (d, J = 5.3Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H).

Korak 2: 2-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan karboksilna kiselina [0194]

[0195] U mešani rastvor 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofena (500 mg, 2.57 mmol) u THF (12 mL) ukapavan je t-BuLi (3.0 mL, 3.9 mmol) (1.3M u n-pentanu) tokom 5 min na -78°C pod atmosferom N2. Smeša je mešana na -78°C tokom 1h, a zatim je ukapavan 3-oksabiciklo [3.1.0]heksan-2,4-dion (577 mg, 5.15 mmol) u THF (10 mL) tokom 10 min. Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i zatim mešana na rt tokom 12h pod atmosferom N2. U smešu je dodata H2O (15 mL), i smeša je zatim ekstrahovana sa EtOAc (10 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan dodatnim EtOAc (10 mL) i zatim podešen do pH = 5-6 vodenim rastvorom HCl (1.0M) i dodatno ekstrahovan pomoću EtOAc (3x30 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni nad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan karboksilna kiselina. Racemska smeša je razdvojena pomoću CHIRAL-SFC (Kolona AD (250 mm*30 mm), 40% (1:1 H2O (+0.1% NH3) i EtOH) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 5.61 min i 6.22 min. Koncentrovanje prvog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C15H15O5S) (ES, m/z): 307 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 11.35 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 3.01 (s, 3H), 3.00 (s, 3H), 2.20 (m, 1H), 1.46-1.38 (m, 1H), 0.72-0.63 (m, 1H), 0.51-0.43 (m, 1H).

[0196] Primeri 5 i 6, kao što je prikazano u tabeli 1 ispod, bili su, ili mogu da se pripreme prema procedurama analognim onim prikazanim iznad u primeru 4 upotrebom odgovarajućih polaznih materijala, opisanih kao preparacije ili dobijenih iz komercijalnih izvora.

Tabela 1

Primer 7: 4-(5-Hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0197]

Korak 1: 5-Hloro-2-fluoro-4-metoksibenzaldehid

[0198]

[0199] U mešani rastvor 2-fluoro-4-metoksibenzaldehida (1.00 g, 6.49 mmol) u AcOH (2 mL) dodat je SO2Cl2(1.05 mL, 13.0 mmol). Posle mešanja na rt tokom 12h, reakcija je bila završena. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (50 mL). Rezultujući talog je sakupljen vakuumskom filtracijom, opran sa H2O (3x20 mL) i osušen na vazduhu da bi se dobio 5-hloro-2-fluoro-4-metoksibenzaldehid. LCMS (C8H7ClFO2) (ES, m/z): 189 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 10.18 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.28Hz, 1H), 6.72 (d, J = 11.69Hz, 1H), 3.99 (s, 3H).<19>F NMR (376MHz, CDCl3): δ - 119.91 (dd, J = 7.15, 11.32Hz).

Korak 2: Metil 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0200]

[0201] Smeša 5-hloro-2-fluoro-4-metoksibenzaldehida (1.04 g, 5.51 mmol), metil 2-merkaptoacetata (0.740 mL, 8.27 mmol), K2CO3(2.29 g, 16.5 mmol) i DMF (50 mL) mešana je 12h na 80°C. Reakciona smeša je ohlađena do rt i sipana u 500 mL ledene vode. Vodeni rastvor HCl (1M) je dodat da bi se pH smeše podesio na 5. Talog je sakupljen filtracijom, opran sa H2O (3x100 mL), i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobio metil 5-hloro-6-metoksibenzo[b] tiofen-2-karboksilat, koji je upotrebljen direktno u sledećem koraku. LCMS (C11H10ClO3S) (ES, m/z): 257 [M+H]<+>.

Korak 3: 5-Hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0203] U mešanu suspenziju metil 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata (1.15 g, 4.46 mmol) u H2O (10 mL), THF (10 mL) i MeOH (10 mL) dodat je LiOH·H2O (0.562 g, 13.4 mmol). Rezultujuća smeša je zagrevana do 50°C tokom 3h. Reakciona smeša je zatim ohlađena do rt, i organski rastvarači su uklonjeni destilacijom pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen sa H2O (20 mL) i opran sa DCM (3x10 mL). Vodeni sloj je acidifikovan 1M vodenim rastvorom HCl do pH 5, i rezultujući talog je opran sa H2O (3x10 mL). Preostala čvrsta supstanca je osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C10H8ClO3S) (ES, m/z): 243 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 13.43 (br, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 3.94 (s, 3H).

Korak 4: 5-Hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0204]

[0205] U smešu 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (215 mg, 0.886 mmol) i THF (10 mL) dodat je (COCl)2(0.4 mL, 4.73 mmol) i DMF (4 uL, 0.055 mmol) na 0°C. Rezultujuća smeša je mešana na 80°C tokom 16h i zatim ohlađena do rt. Smeša je razblažena toluenom (20 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Koncentrovana reakciona smeša je zatim dva puta ponovo rastvarana u toluenu (20 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Rezultujuća koncentrovana reakciona smeša je osušena in vacuo na 50°C-80°C tokom 1h i zatim zaštićena gasovitim Ar za skladištenje. Tako dobijeni 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid je direktno upotrebljen u sledećem koraku.

Korak 5: Etil 4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0206]

[0207] Šlenkova boca osušena u sušnici opremljena štapićem za mešanje napunjena je ((tiofen-2-karbonil)oksi)bakrom (500 mg, 2.62 mmol) pod balonom sa Ar. Boca je osušena dok je pričvršćena na izvor visokog vakuuma zagrevanjem pomoću toplotnog pištolja 3 minuta. Posle hlađenja do 0°C, u bocu je pomoću šprica dodat (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromid (5.0 mL, 0.5M u THF, 2.5 mmol) da bi se formirala smeša. Posle mešanja na 0°C tokom 40 min, u smešu je dodat rastvor 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (272 mg, 0.885 mmol) u THF (5 mL). Rezultujuća smeša je postepeno zagrevana do rt i mešana 16h. Reakciona smeša je ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (20 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (3x30 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3(2x15 mL) i slanim rastvorom (10 mL), osušeni nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobio etil 4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C15H16ClO4S) (ES, m/z): 327 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.87 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 4.16 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.32 (t, J = 6.8Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.8Hz, 2H), 1.27 (t, J = 7.0Hz, 5H).

Korak 6: 4-(5-Hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0208]

[0209] U mešani rastvor etil 4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (62 mg, 0.19 mmol) u MeOH (6mL) i H2O (3 mL) dodat je LiOH·H2O (0.12 g, 5.0 mmol). Smeša je mešana na 45°C tokom 2h, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u H2O (15 mL) i opran sa DCM (2x15 mL). Vodeni sloj je acidifikovan koncentrovanim vodenim rastvorom HCl do pH~2 i zatim ekstrahovan sa DCM (5x10 mL). Kombinovane organske faze su osušene nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C13H12ClO4S) (ES, m/z): 299 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, MeOH-d4): δ 8.10 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.37 - 3.33 (m, 2H), 2.73 (t, J = 6.5Hz, 2H).

Primer 8: 4-(5-Metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0210]

Korak 1: Metil 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0211]

[0212] U mešani rastvor 4-bromo-2-fluoro-5-metoksibenzaldehida (5.00 g, 21.5 mmol) u DMF (100 mL) dodat je metil 2-merkaptoacetat (2.51 g, 23.6 mmol) i K2CO3(8.90 g, 64.4 mmol). Reakciona smeša je degasirana pomoću N23 puta. Rezultujuća smeša je zatim mešana na rt tokom 15h. EtOAc (500 mL) i H2O (1200 mL) su dodati u reakcionu smešu. Organski sloj je odvojen i opran slanim rastvorom (2x200 mL), osušen nad anhidrovanim Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u PE) da bi se dobio metil 6-bromo-5-metoksibenzo [b]tiofen-2-karboksilat. LCMS (C11H10BrO3S) (ES, m/z): 301, 303 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 8.01 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H).

Korak 2: 6-Bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0213]

[0214] U suspenziju metil 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata (1.45 g, 4.81 mmol) u MeOH (20 mL), THF (20 mL) i H2O (20 mL) dodat je NaOH (1.93 g, 48.1 mmol). Rezultujuća suspenzija je zagrevana do 50°C tokom 0.5h. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio rastvarač. U ostatak je dodata H2O (200 mL), i dodata je limunska kiselina da bi se rastvor podesio na pH = 6. Preostala vodena suspenzija je ekstrahovana pomoću EtOAc (3x50 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom (100 mL), osušeni nad Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobila 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina, koja je direktno upotrebljena u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 13.52 (br s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 3.90 (s, 3H).

Korak 3: 6-Bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0215]

[0216] U mešani rastvor 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (800 mg, 2.79 mmol) u anhidrovanom THF (6 mL) dodat je (COCl)2(1.06 g, 8.36 mmol) u kapima na 0°C. Smeša je zatim zagrevana na 75°C tokom 15h i zatim ohlađena do rt. Rastvarač je uklonjen pod

1

sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid, koji je direktno upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 4: Etil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0217]

[0218] Rastvor (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromida (19.6 mL, 0.5M u THF, 9.82 mmol) dodat je u bocu osušenu u sušnici koja sadrži ((tiofen-2-karbonil)oksi)bakar (1.87 g, 9.82 mmol) pod atmosferom Ar na 0°C. Reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C pod atmosferom Ar. Rastvor 6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (1.00 g, 3.27 mmol) u THF (20 mL) degasiran pomoću Ar je zatim dodat u reakcionu smešu na 0°C. Rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatna 3h. Reakciona smeša je zatim ohlađena do 0°C i ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (50 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana 10 min. Smeša je zatim filtrirana kako bi se uklonila bilo kakva staložena čvrsta supstanca, i filtrat je razblažen sa EtOAc (50 mL) i slanim rastvorom (20 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (50 mL), osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (DCM u PE) da bi se dobio etil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C15H16BrO4S) (ES, m/z): 371, 373 [M+H]<+>.

<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 8.05 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 4.18 (q, J = 7.2Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.34 (t, J = 6.7Hz, 2H), 2.80 (t, J = 6.7Hz, 2H), 1.28 (t, J = 7.1Hz, 3H).

Korak 5: Etil 4-(5-metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0219]

[0220] U mešanu smešu etil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (40.0 mg, 0.108 mmol), 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioksaborolana (33.2 mg, 0.215 mmol) i Cs2CO3(105 mg, 0.323 mmol) u 1,4-dioksanu (1.0 mL) i H2O (0.2 mL) dodat je 1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen dihlorid (12 mg, 0.022 mmol). Reakciona smeša je degasirana smeštanjem pod sniženi pritisak i ponovnim punjenjem sa N23 puta. Reakciona smeša je mešana na 90°C pod atmosferom N2tokom 2h, ohlađena do rt, i filtrirana kako bi se uklonili bilo kakvi

2

čvrsti ostaci. Filtrat je razblažen sa EtOAc (5 mL) i slanim rastvorom (5 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (5 mL), osušen nad anhidrovanim Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio etil 4-(5-metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat, koji je upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS (C17H19O4S) (ES, m/z): 319 [M+H]<+>.

Korak 6: 4-(5-Metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0221]

[0222] U mešanu suspenziju etil 4-(5-metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (25 mg, 0.079 mmol) u MeOH (0.5 mL), THF (0.5 mL) i H2O (0.5 mL) dodat je LiOH (18.8 mg, 0.785 mmol). Rezultujuća suspenzija je zagrevana do 50°C tokom 2h i zatim ohlađena do rt. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom kako bi se uklonio rastvarač i ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5-metoksi-6-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H15O4S) (ES, m/z): 291 [M+H]<+>.

<1>H NMR (400MHz, MeOH-d4): δ = 8.10 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.09 (dd, J = 11.3, 17.8Hz, 1H), 5.87 (br d, J = 17.4Hz, 1H), 5.32 (br d, J = 11.2Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.37-3.32 (m, 2H), 2.71 (br t, J = 6.5Hz, 2H).

Primer 9: 4-(6-Bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0223]

[0224] U suspenziju etil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata iz primera 8, korak 4 (20 mg, 0.054 mmol) u MeOH (0.5 mL), THF (0.5 mL) i H2O (0.5 mL) dodat je LiOH (1.3 mg, 0.054 mmol). Rezultujuća suspenzija je zagrevana do 50°C tokom 2h i zatim ohlađena do rt. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom kako bi se uklonio rastvarač i ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C13H12BrO4S) (ES, m/z): 343, 345 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, MeOH-d4): δ = 8.12 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.36 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.74 (t, J = 6.4Hz, 2H).

Primer 10: 4-(6-Metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0225]

Korak 1: 2-Fluoro-4-metoksi-5-nitrobenzaldehid

[0226]

[0227] U mešani rastvor 2-fluoro-4-metoksibenzaldehida (1.00 g, 6.49 mmol) u koncentrovanoj H2SO4(5.88 mL, 110 mmol) na -15°C dodata je koncentrovana HNO3(0.414 mL, 6.49 mmol) u koncentrovanoj H2SO4(0.795 mL, 14.9 mmol) u kapima tokom 5 min. Posle 1h mešanja na temperaturi ispod -10°C, reakciona smeša je sipana u 50 mL ledene vode. Precipitat je sakupljen filtracijom. Filter kolač je opran sa H2O (3x100 mL) i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobio 2-fluoro-4-metoksi-5-nitrobenzaldehid, koji je direktno upotrebljen u sledećem koraku. LCMS (C8H7FNO4) (ES, m/z): 200 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 10.22 (s, 1H), 8.47 (d, J = 7.24Hz, 1H), 6.88 (d, J = 11.54Hz, 1H), 4.07 (s, 3H).

Korak 2: Metil 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0228]

[0229] Smeša 2-fluoro-4-metoksi-5-nitrobenzaldehida (1.14 g, 5.72 mmol), metil 2-merkaptoacetata (0.77 mL, 8.6 mmol) i K2CO3(2.37 g, 17.2 mmol) u DMF (50 mL) mešana je 12h na 60°C. Reakciona smeša je ohlađena do rt i zatim sipana u 500 mL ledene vode. Vodeni rastvor HCl (1M) dodat je kako bi se pH podesio do 5. Precipitat je sakupljen filtracijom, opran sa H2O (3x100 mL) i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobio metil 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilat, koji je direktno upotrebljen u sledećem koraku. LCMS (C11H10NO5S) (ES, m/z): 268 [M+H]<+>.

Korak 3: 6-Metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

4

[0231] U suspenziju metil 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilata (1.50 g, 5.61 mmol) u H2O (10 mL), THF (10 mL) i MeOH (10 mL) dodat je LiOH·H2O (0.707 g, 16.8 mmol). Rezultujuća smeša je zagrevana do 50°C tokom 5h i zatim ohlađena do rt. Organski rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, ostatak je razblažen sa 20 mL H2O i smeša je ekstrahovana pomoću DCM (3x10 mL). Vodeni sloj je acidifikovan vodenim rastvorom HCl (1M) do pH 5. Precipitat je sakupljen filtracijom i zatim opran sa H2O (3x10 mL). Rezultujući čvrsti ostatak je osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobila 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina, koja je direktno upotrebljena u sledećem koraku. LCMS (C10H8NO5S) (ES, m/z): 254 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 13.93-13.26 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 3.98 (s, 3H).

Korak 4: 6-Metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0232]

[0233] U mešani rastvor 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (400 mg, 1.58 mmol) u anhidrovanom THF (15 mL) dodat je (COCl)2(1.20 g, 9.48 mmol) u kapima na 0°C. Smeša je zagrevana na 75°C tokom 15h i zatim ohlađena do rt. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid, koji je bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku.

Korak 5: Etil 4-(6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0234]

[0235] Rastvor (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromida (17.7 mL, 0.5M u THF, 8.83 mmol) dodat je u bocu osušenu u sušnici koja sadrži ((tiofen-2-karbonil)oksi)bakar (1.69 g, 8.83 mmol) pod atmosferom Ar na 0°C. Reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C pod atmosferom Ar. Rastvor 6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (800 mg, 2.94 mmol) u THF (10 mL) degasiran pomoću Ar je zatim dodat u reakcionu smešu na 0°C; rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatnih 8h. Reakciona smeša je zatim ohlađena do 0°C i ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (30 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana 10 min. Smeša je filtrirana i filtrat je razblažen sa EtOAc (50 mL) i slanim rastvorom (30 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (50 mL), osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak je prečišćen pomoću prep-TLC (SiO2, DCM u PE) da bi se dobio etil 4-(6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C15H16NO6S) (ES, m/z): 338 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 8.36 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.24-4.16 (m, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.34 (t, J = 6.6Hz, 2H), 2.81 (t, J = 6.5Hz, 2H), 1.33-1.27 (m, 3H).

Korak 6: Etil 4-(5-amino-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0236]

[0237] U rastvor etil 4-(6-metoksi-5-nitrobenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (140 mg, 0.415 mmol) u EtOH (2 mL), THF (2 mL) i H2O (2 mL) dodato je Fe (116 mg, 2.08 mmol) i NH4Cl (222 mg, 4.15 mmol). Smeša je zagrevana do 80°C tokom 1h, ohlađena do rt i filtrirana. U filtrat je dodata H2O (10 mL), i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću EtOAc (3x5 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom (5 mL), osušeni nad MgSO4i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio etil 4-(5-amino-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat, koji je direktno upotrebljen za sledeći korak bez prečišćavanja. LCMS (C15H18NO4S) (ES, m/z): 308 [M+H]<+>.

Korak 7: Etil 4-(6-metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0238]

[0239] U mešani rastvor etil 4-(5-amino-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (55 mg, 0.18 mmol), MeB(OH)2(16.1 mg, 0.268 mmol) i piridina (56.6 mg, 0.716 mmol) u 1,4-dioksanu (2.0 mL) dodat je diacetoksibakar (48.8 mg, 0.268 mmol). Reakciona smeša je mešana na 120°C tokom 2h i zatim ohlađena do rt. Smeša je filtrirana, i filtrat je razblažen sa EtOAc (5.0 mL) i slanim rastvorom (5.0 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (5 mL), osušen nad anhidrovanim Na2SO4, i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio etil 4(6-metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat, koji je direktno upotrebljen za sledeći korak bez prečišćavanja. LCMS (C16H20NO4S) (ES, m/z): 322 [M+H]<+>.

Korak 8: 4-(6-Metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0240]

[0241] U suspenziju etil 4-(6-metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (30 mg, 0.093 mmol) u MeOH (0.5 mL), THF (0.5 mL) i H2O (0.5 mL) dodat je LiOH (44.7 mg, 1.87 mmol). Rezultujuća suspenzija je zagrevana do 50°C tokom 2h i zatim ohlađena do rt. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom kako bi se uklonio rastvarač, i ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(6-metoksi-5-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H16NO4S) (ES, m/z): 294 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, MeOH-d4): δ 8.07 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.36-3.33 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.73 (t, J = 6.4Hz, 2H).

Primer 11: (S)-4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0242]

Korak 1: 5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0243]

[0244] U mešani rastvor 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline iz preparacije 3 (5.0 g, 21 mmol) u THF (200 mL) na 0°C pod Ar dodat je (COCl)2(5.5 ml, 63 mmol) što je praćeno dodavanjem DMF (0.1 ml, 1.3 mmol). Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 1h i zatim ostavljena da se zagreje do rt i mešana preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, i rezultujući 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid je upotrebljen u sledećem koraku bez prečišćavanja.<1>H NMR (600MHz, CH3CN-d3): δ 8.25 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.88 (s, 3H).

Korak 2: Metil (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0246] U balon okruglog dna osušen u sušnici, pročišćen pomoću Ar, koji sadrži bakar (I) tiofen-2-karboksilat (797 mg, 4.2 mmol) na 0°C dodat je u kapima (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromid (7.8 mL, 0.5M u THF, 3.9 mmol). Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 20 min. U reakcionu smešu je ukapana suspenzija 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (777 mg, 3.0 mmol) u THF (15 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana 6h. Reakciona smeša je razblažena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (15 mL), praćenim sa DCM (30 mL). Precipitati su uklonjeni filtracijom pre ekstrakcije. Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću DCM (3x30 mL). Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela ((25% EtOH u EtOAc) u heksanima) da bi se dobio metil (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C16H19O5S) (ES, m/z): 323 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CHCl3-d): δ 7.89 (s, 1H), 7.26 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.48 (dd, J = 16.9, 7.6Hz, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 3.05 (dd, J = 16.9, 6.0Hz, 1H), 1.31 (d, J = 7.2Hz, 3H).

Korak 3: (S)-4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0247]

[0248] U rastvor metil (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (200 mg, 0.62 mmol) u H2O (1.2 mL) i THF (5 mL) dodat je LiOH (59 mg, 2.5 mmol). Reakciona smeša je mešana preko noći na rt. Reakciona smeša je podešena do ~pH 2 upotrebom dodatnog 1M vodenog rastvora HCl. U reakcionu smešu je dodat DCM (15 mL), i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela ((25% EtOH u EtOAc) u heksanima) da bi se dobila (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H17O5S) (ES, m/z): 309 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, CH3OH-d4,): δ 8.06 (s, 1H), 7.41 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.46 (dd, J = 17.1, 8.3Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 17.2, 5.3Hz, 1H), 3.04-2.98 (m, 1H), 1.26 (d, J = 7.1Hz, 3H).

[0249] Primeri 12 do 16, kao što je prikazano u tabeli 2 ispod, pripremljeni su, ili mogu da se pripreme prema procedurama analognim onim koje su opisane iznad u primeru 11 upotrebom odgovarajućih polaznih materijala, opisanih kao preparacije ili dobijenih iz komercijalnih izvora.

Tabela 2

Primer 17: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-(metoksimetil)-4-oksobutanska kiselina [0250]

Korak 1: 1-Etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-(metoksimetil) sukcinat

[0251]

[0252] U mešani rastvor etil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]thien-2-il)-3-oksopropanoata (SPECS, 231 mg, 0.75 mmol) u DMF (2.5 mL) dodat je metil 2-bromo-3-metoksipropanoat (125 µl, 0.93 mmol) na rt. Reakciona smeša je mešana preko noći na rt. Zatim, reakciona smeša je razblažena sa H2O (3 mL) i DCM (6 ml). Faze su razdvojene, i vodeni sloj je opran sa DCM (3x6 mL). Kombinovane organske faze su koncentrovane pod sniženim pritiskom i osušene preko noći in vacuo. Proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela ((25% EtOH u EtOAc) u heksanima) da bi se dobio 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-(metoksimetil)sukcinat, koji je korišćen bez daljeg prečišćavanja. LCMS (C20H25O8S) (ES, m/z): 425 [M+H]<+>.

Korak 2: 4-(5,6-Dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-(metoksimetil)-4-oksobutanska kiselina [0253]

[0254] U mešani rastvor 1-etil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-(metoksimetil)sukcinata (200 mg, 0.5 mmol) u EtOH (3 ml) dodat je vodeni rastvor HCl (490 µl, 6M, 2.9 mmol) na rt. Reakciona smeša je zagrevana do 100°C u zapečaćenoj bočici za zagrevanje mikrotalasima tokom 2h. Nakon hlađenja, vodeni rastvor KOH (490 µl, 10M, 4.9 mmol) dodat je u mešanu reakcionu smešu, i reakciona smeša je vraćena na zagrevanje na 100°C tokom 1h. pH reakcione smeše podešen je na ~2 vodenim rastvorom HCl (1M) kako je pokazano test-trakama za pH. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio EtOH, zatim razblažena sa DCM (10 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću DCM (3x10 mL). Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela ((25% EtOH u EtOAc) u heksanima). Frakcije koje sadrže proizvod su koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobila 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-(metoksimetil)-4-oksobutanska kiselina. Racemska smeša je razdvojena pomoću hiralne-SFC (CHIRACEL OJ-H (250 mm*21 mm), 25% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 3.12 min i 3.96 min. Koncentrovanje prvog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C16H19O6S) (ES, m/z): 339 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 12.32 (1H, br s), 8.18 (1H, s), 7.56 (1H, s), 7.44 (1H, s), 3.83 (3H, s), 3.80 (3H, s), 3.58-3.51 (2H, m), 3.46-3.40 (1H, m), 3.22 (3H, s), 3.09-3.07 (2H, m).

Primer 18: 4-(6-Metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0255]

Korak 1: 5-Bromo-2-fluoro-4-metoksibenzaldehid

[0256]

[0257] 2-Fluoro-4-metoksibenzaldehid (9.0 g, 58 mmol) je polako dodat (u porcijama) u rastvor Br2(6.0 mL, 120 mmol) u MeOH (40 mL) na 0°C. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 2h. Rastvor NaHSO3(24.3 g, 234 mmol) u H2O (300 mL) je polako dodat u reakcionu smešu na 0°C. Rezultujuća suspenzija je zatim mešana 30 min na 0°C. Reakciona smeša je filtrirana, i filtrat je opran dodatnom H2O (3x25 mL). Filtrat je zatim osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobio 5-bromo-2-fluoro-4-metoksibenzaldehid. Proizvod je upotrebljen bez prečišćavanja.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 10.02 (s, 1H), 7.98 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.26 (d, J = 13.0Hz, 1H), 3.97 (s, 3H).

Korak 2: terc-Butil 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0258]

[0259] K2CO3(19.0 g, 137 mmol) je polako dodat (u porcijama) u rastvor 5-bromo-2-fluoro-4-metoksibenzaldehida (10.7 g, 45.8 mmol) i terc-butil 2-merkaptoacetata (6.65 mL, 45.8 mmol) u DMF (50 mL) na 20°C pod atmosferom Ar. Reakciona smeša je mešana i zagrevana do 100°C tokom 16h. Reakciona smeša je zatim ohlađena do rt i razblažena sa Et2O (1000 mL). Smeša je zatim oprana sa H2O (500 mL, zatim 2x250 mL), i kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani pomoću Et2O (2x200 mL). Organski slojevi su zatim kombinovani i oprani slanim rastvorom (50 mL). Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim

1

pritiskom da bi se dobio terc-butil 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat. Proizvod je upotrebljen bez prečišćavanja.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.26 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 1.55 (s, 9H).

Korak 3: 5-Bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0260]

[0261] HCl (56 mL, 4.0M u 1,4-dioksanu, 230 mmol) je dodata u rastvor terc-butil 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata (15.5 g, 45.0 mmol) u DCM (200 mL) na 20°C. Reakciona smeša je mešana na 20°C tokom 3 dana. Reakciona smeša je zatim razblažena ukapavanjem heksana (500 mL). Rezultujuća suspenzija je mešana dodatna 2h posle dodavanja na rt. Reakciona smeša je filtrirana, i sakupljena čvrsta materija je oprana heksanima (2x50 mL) i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila 5-bromo-6-metoksibenzo [b]tiofen-2-karboksilna kiselina, koja je upotrebljena bez prečišćavanja.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 13.42 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 3.93 (s, 3H).

Korak 4: 5-Bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0262]

[0263] DMF (0.049 mL, 0.63 mmol) je polako dodat (u kapima) u rastvor 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (6.0 g, 21 mmol) i (COCl)2(5.5 mL, 63 mmol) u THF (100 mL) na 0°C pod atmosferom Ar. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 2h i zatim ostavljena da se zagreje do rt. Reakciona smeša je mešana 18h na rt. Reakciona smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid. Proizvod je upotrebljen bez prečišćavanja.

Korak 5: Etil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0264]

[0265] Rastvor (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromida (13.8 mL, 0.50M u THF, 6.9 mmol) dodat je u bocu osušenu u sušnici koja sadrži ((tiofen-2-karbonil)oksi)bakar (1.31 g, 6.87 mmol)

2

pod atmosferom Ar na 0°C. Reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C pod atmosferom Ar. Rastvor 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (1.52 g, 4.98 mmol) u THF (25.0 mL) degasiran pomoću Ar je zatim dodat preko kanile u reakcionu smešu na 0°C; rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatna 3h. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C i ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (50 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatnih 10 min. Smeša je filtrirana, i filtrat je razblažen sa EtOAc (500 mL) i slanim rastvorom (50 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (25 mL), osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u DCM) da bi se dobio etil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C15H16BrO4S) (ES, m/z): 371, 373 [M+H]<+>.

<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.27 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 4.07-4.02 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.35-3.25 (m, 2H), 2.68-2.64 (m, 2H), 1.20-1.14 (m, 3H).

Korak 6: Etil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0266]

[0267] U smešu etil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (100 mg, 0.269 mmol), 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioksaborolana (50 mg, 0.32 mmol), Pd2(dba)3(12 mg, 0.013 mmol), X-phos (13 mg, 0.027 mmol) i Cs2CO3(263 mg, 0.808 mmol) degasiranu pomoću Ar dodat je 1,4-dioksan (3 mL) i H2O (0.3 mL) na rt uz degasiranje pomoću Ar. Reakciona smeša je mešana 5 min uz degasiranje pomoću Ar (barbotiranjem ispod površine), nakon čega je smeša zagrevana do 90°C pod atmosferom Ar tokom 2h. Reakciona smeša je zatim ohlađena do rt i razblažena sa EtOAc (20 mL). Rezultujuća suspenzija je filtrirana kroz fritu koja sadrži MgSO4. Organski sloj (filtrat) je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod prečišćen je hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u DCM) da bi se dobio etil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C17H19O4S) (ES, m/z): 319 [M+H]<+>.

Korak 7: 4-(6-Metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0268]

[0269] Vodeni rastvor NaOH (0.33 mL, 1.0M, 0.33 mmol) dodat je u rastvor etil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (21 mg, 0.066 mmol) u MeOH (4.0 mL). Reakciona smeša je mešana na rt tokom 18h. Reakciona smeša je ugašena vodenim rastvorom HCl (0.33 mL, 1.0M, 0.33 mmol) i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H15O4S) (ES, m/z): 291 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.21 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.00 (dd, J = 17.5, 11.5Hz, 1H), 5.87 (d, J = 17.5Hz, 1H), 5.33 (d, J = 11.5Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.30-3.24 (m, 2H), 2.63-2.56 (m, 2H).

Primer 19: 4-(5-Bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0270]

[0271] Vodeni rastvor NaOH (0.54 mL, 1.0M, 0.54 mmol) dodat je u rastvor etil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata iz primera 17, korak 5 (40 mg, 0.11 mmol) u MeOH (2.0 mL). Reakciona smeša je mešana na 20°C tokom 24h. Reakciona smeša je ugašena vodenim rastvorom HCl (0.54 mL, 1.0M, 0.54 mmol). Smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C13H12BrO4S) (ES, m/z): 343, 345 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.23 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.29-3.24 (m, 2H), 2.62-2.57 (m, 2H).

Primer 20: 4-((S)-4-(5,6-Dihlorobenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0272]

Korak 1: 5,6-Dihlorobenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0273]

4

[0274] U rastvor 4,5-dihloro-2-fluorobenzaldehida (V-Pharma, 386 mg, 2.00 mmol), terc-butil 2-merkaptoacetata (356 mg, 2.40 mmol) i toluena (5 ml) dodat je Cs2CO3(1.30 g, 4.00 mmol), i reakcija je zagrevana na refluksu 2h. Reakciona smeša je zatim filtrirana i filtrat je opran toluenom (5 mL). U filtrat je zatim dodata TFA (10 mL) i smeša je mešana 1h. Reakciona smeša je filtrirana, oprana toluenom i heksanima i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila 5,6-dihlorobenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C9H3Cl2O2S) (ES, m/z): 245 [M-H]-.

Korak 2: (S)-4-(5,6-Dihlorobenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0275]

[0276] U smešu 5,6-dihlorobenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (0.049 g, 0.20 mmol) i DCM (2 ml) dodat je DMF (4 uL, 0.055 mmol). Zatim je dodat (COCl)2(0.175 ml, 2.00 mmol), i reakcija je mešana na rt tokom 1h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u THF (2.0 ml), dodat je CPhos Pd G4 iz preparacije 1 (0.033 g, 0.040 mmol), i smeša je mešana dok je (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromid (0.40 mL, 0.5M u THF, 0.20 mmol) dodat odjednom. Reakcija je mešana 2h, i zatim su dodati LiOH (0.048 g, 2.0 mmol), H2O (1 mL) i MeOH (1 mL). Reakciona smeša je mešana dodatna 2h, i zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen putem prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5,6-dihlorobenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C13H11Cl2O3S) (ES, m/z): 317 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 8.45 (s, 1 H), 8.31 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 3.38 (dd, J = 17.4, 8.5Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 17.6, 5.0Hz, 1H), 2.90-2.84 (m, 1H), 1.16 (d, 3H).

Primer 21: (S)-4-(6-Etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0277]

Korak 1: 6-Etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0278]

[0279] U mešani rastvor 4-etil-2-fluoro-5-metoksibenzaldehida (Biogene Organics, 364 mg, 2.00 mmol), terc-butil 2-merkaptoacetata (356 mg, 2.40 mmol) i toluena (5 ml) dodat je Cs2CO3(1.30 g, 4.00 mmol) i reakcija je zagrevana na refluksu 2h. Reakciona smeša je zatim filtrirana i filtrat je opran toluenom (5 mL). U filtrat je zatim dodata TFA (10 mL) i smeša je mešana 1h. Reakciona smeša je filtrirana, oprana toluenom i heksanima i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila 6-etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C12H11O3S) (ES, m/z): 236 [M-H]-.

Korak 2: (S)-4-(6-Etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0280]

[0281] U smešu 6-etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (0.047 g, 0.20 mmol), i DCM (2 ml) dodat je DMF (4 uL, 0.055 mmol). Zatim je dodat (COCl)2(0.175 mL, 2.00 mmol), i reakcija je mešana na rt tokom 1h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u THF (2.0 ml), Dodat je CPhos Pd G4 iz preparacije 1 (0.033 g, 0.040 mmol), i smeša je mešana dok je (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromid (0.40 ml, 0.5M u THF, 0.20 mmol) dodat odjednom. Reakcija je mešana 2h, i zatim su dodati LiOH (48 mg, 2.0 mmol), H2O (1 mL) i MeOH (1 mL). Reakciona smeša je mešana dodatna 2h, a zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim prečišćen putem prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(6-etil-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C16H19O4S) (ES, m/z): 307 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 8.21 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.38 (dd, J = 17.4, 8.5Hz, 1H), 3.07 (dd, J = 17.4, 5.1Hz, 1H), 2.87-2.84 (m, 1H), 2.65 (q, J = 7.5Hz, 2H), 1.16-1.14 (m, 6H).

Primer 22: (S)-4-(5-metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0282]

Korak 1: 5-Metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0283]

[0284] U mešani rastvor 2-fluoro-5-metoksi-4-metilbenzaldehida (Biogene Organics, 336 mg, 2.00 mmol), terc-butil 2-merkaptoacetata (356 mg, 2.40 mmol) i toluena (5 ml) dodat je Cs2CO3(1.30 g, 4.00 mmol), i reakcija je zagrevana na refluksu 2h. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je opran toluenom (5 mL). Zatim je u filtrat dodat TFA (10 mL) i smeša je mešana 1h. Reakciona smeša je filtrirana, oprana toluenom i heksanima i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila 5-metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C11H9O3S) (ES, m/z): 221 [M-H]-.

Korak 2: (S)-4-(5-metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0285]

[0286] U smešu 5-metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (0.044 g, 0.20 mmol) i DCM (2 ml) dodat je DMF (4 uL, 0.055 mmol). Zatim je dodat (COCl)2(0.175 mL, 2.00 mmol), i reakcija je mešana na rt tokom 1h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u THF (2.0 ml), dodat je CPhos Pd G4 (0.033 g, 0.040 mmol), i smeša je mešana dok je (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromid (0.40 ml, 0.5M u THF, 0.20 mmol) dodat odjednom. Reakcija je mešana 2h, a zatim su dodati LiOH (48 mg, 2.0 mmol), H2O (1 mL) i MeOH (1 mL). Reakciona smeša je mešana dodatna 2h, a zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim prečišćen putem prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5-metoksi-6-metilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H17O4S) (ES, m/z): 293 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 8.21 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.38 (dd, J = 17.4, 8.5Hz, 1H), 3.06 (dd, J = 17.4, 5.2Hz, 1H), 2.88-2.83 (m, 1H), 2.24 (s, 3H), 1.15 (d, J = 7.2Hz, 3H).

Primer 23: 4-(6-Hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0287]

Korak 1: 6-Hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0289] U mešani rastvor 4-hloro-2-fluoro-5-metoksibenzaldehida (38 mg, 0.20 mmol), terc-butil 2-merkaptoacetata (54 mg, 0.30 mmol) i 1,4-dioksana (2 ml) dodat je Cs2CO3(326 mg, 1.00 mmol), i reakcija je zagrevana na refluksu 4h. Reakciona smeša je zatim filtrirana, oprana 1,4-dioksanom (2 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Koncentrat je pretvoren u gustu suspenziju u DCM (1 mL) i dodat je TFA (1 mL). Zatim, reakcija je mešana na rt tokom 2h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobila 6-hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C10H6ClO3S) (ES, m/z): 241 [M-H]-.

Korak 2: 4-(6-Hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0290]

[0291] U smešu 6-hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (0.045 g, 0.20 mmol) i DCM (2 ml) dodat je DMF (4 uL, 0.055 mmol). Zatim je dodat (COCl)2(0.175 mL, 2.00 mmol). Reakcija je mešana na rt tokom 1h, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u THF (2.0 ml), dodat je CPhos Pd G4 iz preparacije 1 (0.033 g, 0.040 mmol), i smeša je mešana dok je 3-terc-butoksi-3-oksopropilcink bromid (0.40 ml, 0.5M u THF, 0.20 mmol) dodat odjednom. Reakcija je mešana 2h, a zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Zatim su dodati DCM (1 mL) i TFA (1 mL). Reakciona smeša je mešana dodatna 2h, a zatim je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim prečišćen putem prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(6-hloro-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C13H12ClO4S) (ES, m/z): 299 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6): δ 8.23 (s, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 3.89 (s, 3 H), 3.23 (t, J = 6.6Hz, 2 H), 2.52 (t, J = 6.4Hz, 2 H).

Primer 24: (S)-4-(5-Bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0292]

Korak 1: Metil (S)-4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat [0293]

[0294] Rastvor (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromida (57.7 mL, 0.50M) u THF (28.9 mmol) dodat je u bocu osušenu u sušnici koja sadrži ((tiofen-2-karbonil)oksi)bakar (5.50 g, 28.9 mmol) pod atmosferom Ar na 0°C. Reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C pod atmosferom Ar. Rastvor degasiran pomoću Ar 5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida iz primera 18, korak 4 (6.39g, 20.9 mmol) u THF (100 mL) je zatim dodat pomoću kanile u reakcionu smešu na 0°C. Rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatna 3h. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C i dodata pomoću kanile u mešanu smešu zasićenog vodenog rastvora NH4Cl (300 mL) i EtOAc (500 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatnih 16h. Smeša je filtrirana, i filtrat je razblažen sa EtOAc (1000 mL) i slanim rastvorom (100 mL). Organski sloj je odvojen, opran dodatnim slanim rastvorom (50 mL), osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u DCM) da bi se dobio metil (S)-4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C15H16BrO4S) (ES, m/z): 371, 373 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.27-8.24 (m, 2H), 7.80 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.23-3.16 (m, 1H), 3.01-2.93 (m, 1H), 1.19 (d, J = 7.0Hz, 3H).

Korak 2: (S)-4-(5-Bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0295]

[0296] Vodeni rastvor NaOH (0.61 mL, 1.0M, 0.61 mmol) dodat je u rastvor metil (S)-4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (50 mg, 0.14 mmol) u THF (4.0 mL). Reakciona smeša je mešana na rt tokom 18h. Reakciona smeša je ugašena vodenim rastvorom HCl (0.61 mL, 1.0M, 0.61 mmol). Smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod, koji je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H14BrO4S) (ES, m/z): 357, 359 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.22 (s, 1H), 8.27-8.24 (m, 2H), 7.81 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.44-3.35 (m, 1H), 3.14-3.06 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 1.18 (d, J= 7.5Hz, 3H).

Primer 25: 4-(4-Fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0297]

Korak 1: Metil 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0298]

[0299] U smešu metil 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata iz preparacije 2 (50 mg, 0.20 mmol) u ACN (1 ml) na rt dodat je 1-hlorometil-4-fluoro-1,4-diazoniabiciklo[2.2.2]oktanbis (tetrafluoroborat) (SELECTFLUOR™, 77 mg, 0.22 mmol). Rezultujuća smeša je mešana na 45°C tokom 15h. Smeša je ohlađena do rt, razblažena zasićenim vodenim NaHCO3(10 mL) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3x10 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom (10 mL), osušeni nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću prep-TLC (SiO2, EtOAc u PE) da bi se dobio metil 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat. LCMS (C12H12FO4S) (ES, m/z): 293 [M+H]<+>.

<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.05 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.94 (s, 3H). Korak 2: 4-Fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0300]

[0301] LiOH·H2O (71.4 mg, 1.70 mmol) je dodat u porcijama u smešu metil 4-fluoro-5, 6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilata (46 mg, 0.170 mmol) u THF (3 ml), MeOH (1 ml) i H2O (1 ml) na rt. Zatim, smeša je mešana 15h. Smeša je podešena na pH=5 pomoću 1N HCl i ekstrahovana pomoću EtOAc (3x10 ml). Kombinovani organski slojevi su oprani slanim rastvorom (10 mL), osušeni nad anhidrovani Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina. LCMS (C11H9FO4S) (ES, m/z): 257 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.12 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H). Korak 3: 4-Fluoro-5, 6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0302]

[0303] U mešani rastvor 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (153 mg, 0.60 mmol) u anhidrovanom THF (5 mL) dodat je (COCl)2(0.21 mL, 2.40 mmol) u kapima na 0°C. Smeša je mešana na 0°C tokom 1h i zatim na rt tokom 1h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid, koji je korišćen bez daljeg prečišćavanja.

Korak 4: Etil 4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0304]

[0305] Suspenzija bakar(I) tiofen-2-karboksilata (125 mg, 0.65 mmol) barbotirana je sa N2tokom 5 min i zatim ohlađena do 0°C. Rastvor (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromida (17.7 mL, 0.5M u THF, 8.83 mmol) dodat je pod atmosferom N2na 0°C, i reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C. Rastvor 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida (130 mg, 0.47 mmol) u THF (3 mL) barbotiran sa N2je zatim dodat u reakcionu smešu na 0°C. Rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatnih 8h. Reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor NH4Cl (20 mL) uz mešanje. Smeša je ekstrahovana pomoću EtOAc (2x20 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa H2O i slanim rastvorom, osušeni nad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio etil 4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C16H18FO5S) (ES, m/z): 341 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J = 0.7Hz, 1H), 7.10 (t, J = 1.0Hz, 1H), 4.19 (q, J = 7.2Hz, 2H), 4.05-3.97 (m, 6H), 3.36 (t, J = 6.7Hz, 2H), 2.81 (t, J = 6.7Hz, 2H), 1.29 (t, J = 7.2Hz, 3H). Korak 5: 4-(4-Fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0306]

1

[0307] U rastvor etil 4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (124 mg, 0.36 mmol) u MeOH (1.5 mL) i THF (1.5 mL) dodat je 1N vodeni rastvor LiOH (1.5 mL, 1.5 mmol). Reakciona smeša je mešana na rt tokom 1h, i zatim je dodat 1N vodeni rastvor HCl (1.5 mL, 1.5 mmol). Rezultujući precipitat je sakupljen sukcionom filtracijom i prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b] tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H14FO5S) (ES, m/z): 313 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 12.19 (s, 1H), 8.33 (d, J = 0.7Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1.2Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.35-3.28 (m, 2H), 2.64-2.57 (m, 2H).

Primer 26: (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0308]

Korak 1: Metil (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat [0309]

[0310] Suspenzija bakar(I) tiofen-2-karboksilata (125 mg, 0.65 mmol) je barbotirana sa N2tokom 5 min i zatim ohlađena do 0°C. Rastvor (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromida (1.21 mL, 0.5M u THF, 0.606 mmol) je dodat pod atmosferom N2, i reakciona smeša je mešana 20 min na 0°C. Zatim je dodat rastvor 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorida iz primera 25, korak 3 (130 mg, 0.47 mmol) u THF (3 mL) barbotiran sa N2, i rezultujuća suspenzija je ostavljena da se zagreje do rt i mešana dodatnih 8h. Reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor NH4Cl (20 mL) uz mešanje i zatim ekstrahovana pomoću EtOAc (2x20 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa H2O i slanim rastvorom, osušeni nad Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio metil (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C16H18FO5S) (ES, m/z): 341

2

[M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.98 (d, J = 0.7Hz, 1H), 7.09 (t, J = 1.0Hz, 1H), 4.04-3.95 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.50 (dd, J = 17.0, 7.9Hz, 1H), 3.23-3.12 (m, 1H), 3.06 (dd, J = 17.0, 5.7Hz, 1H), 1.32 (d, J = 7.2Hz, 3H).

Korak 2: (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0311]

[0312] U rastvor metil (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (90 mg, 0.26 mmol) u MeOH (1.5 mL) i THF (1.5 mL) dodat je 1N vodeni rastvor LiOH (1.5 mL, 1.5 mmol). Reakciona smeša je mešana na rt tokom 1h, a zatim je dodat 1N vodeni rastvor HCl (1.5 mL, 1.5 mmol). Rezultujući precipitat je sakupljen sukcionom filtracijom i prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H16FO5S) (ES, m/z): 327 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 12.21 (s, 1H), 8.33 (d, J = 0.7Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1.1Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.48 (dd, J = 17.6, 8.7Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 17.6, 5.0Hz, 1H), 2.95-2.84 (m, 1H), 1.19 (d, J = 7.3Hz, 3H).

Primer 27: 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0313]

Korak 1: 3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0314]

[0315] U reakcionu smešu (E)-3-(3,4-dimetoksifenil)akrilne kiseline (5.7 g, 27 mmol) u hlorobenzenu (40 mL) polako je dodat SOCl2(9.0 mL, 120 mmol). Posle 30 min na rt, polako je dodat piridin (0.58 mL, 7.1 mmol). Smeša je zatim zagrevana do refluksa tokom 24h. Nakon hlađenja do rt, smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio 3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonilhlorid koji je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja. Korak 2: etil 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0316]

[0317] U balon okruglog dna osušen u sušnici dodat je Cu-Cl (510 mg, 5.2 mmol). Reakciona boca je pročišćena pomoću Ar. Dodat je (3-etoksi-3-oksopropil)cink(II) bromid (0.5M u THF, 12 mL, 6.2 mmol) na rt. Posle 30 min na rt, dodata je smeša 3-hloro-5,6-dimetoksibenzo [b]tiofen-2-karbonil hlorida (1.5 g, 5.2 mmol) u THF (10 mL). Nakon 30 min, smeša je ugašena zasićenim rastvorom NH4Cl (6.0 mL) i razblažena sa EtOAc. Organski sloj je odvojen i zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio etil 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo [b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C16H18ClO5S) (ES, m/z): 357 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, Aceton-d6) δ 7.56 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 4.13 (q, J = 7.1Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.47 (t, J = 6.3Hz, 2H), 2.75 (t, J = 6.3Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.1Hz, 3H).

Korak 3: 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0318]

[0319] Smeša etil 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (58 mg, 0.16 mmol) i LiOH (23 mg, 0.98 mmol) u THF (1.5 mL), H2O (0.40 mL) i MeOH (1.0 mL) je ostavljena da se meša na rt tokom 1.5h. Reakciona smeša je podešena na pH između 3 i 4 pomoću HCl (1.0N u H2O) i zatim razblažena sa DCM. Organski sloj je odvojen, a zatim je H2O sloj re-ekstrahovan pomoću DCM (2X20 mL). Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep HPLC (ACN/H2O u 0.1% TFA). Tečne frakcije koje sadrže čist proizvod su kombinovane i zatim osušene zamrzavanjem pomoću liofilizatora kako bi se dobila 4-(3-hloro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H14ClO5S) (ES, m/z): 329 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 12.22 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.34 (t, J = 5.0Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.2Hz, 2H).

Primer 28: (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0320]

4

Korak 1: terc-butil 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat

[0321]

[0322] U smešu 5-hloro-2-fluoro-4-metoksibenzaldehida (0.055 g, 0.3 mmol), Cs2CO3(0.49 g, 1.5 mmol) i dioksana (1.5 mL) dodat je terc-butil 2-merkaptoacetat (0.053 g, 0.36 mmol). Reakcija je zagrevana na refluksu 6h. Posle 6h, smeša je ostavljena da se ohladi do rt i zatim razblažena dioksanom (2.0 mL). Dodat je izocijanat vezan za makroporozni polistiren (1.59 mmol/g-0.50 g), i reakcija je mućkana na rt tokom 1h. Posle 1h, smeša je filtrirana, oprana dioksanom i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobila sirova smeša koja sadrži tercbutil 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat koji je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja ili karakterizacije.

Korak 2: 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina

[0323]

[0324] U sirovi ostatak koji sadrži terc-butil 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilat dodati su DCM (1.0 mL) i TFA (1.0 mL). Posle 1h, smeša je razblažena heksanima (2.0 mL) i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobila 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilna kiselina koja je preneta u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja ili karakterizacije. Korak 3: 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid

[0325]

[0326] U sirovi ostatak koji sadrži 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilnu kiselinu dodata je smeša DMF u DCM (0.05M DMF u DCM, 1.5 mL). U reakcionu smešu polako je dodat (COCl)2(0.13 mL, 1.5 mmol), i smeša je ostavljena da se meša 1h. Posle 1h, smeša je razblažena heksanima, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid koji je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja ili karakterizacije.

Korak 4: metil (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0327]

[0328] U sirovi ostatak koji sadrži 5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil hlorid i (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink(II) bromid (0.5M u THF, 1.2 mL, 0.60 mmol) dodat je katalizator difenilfosfin-Pd(II) vezan za organosilikatnu matricu (([O3Si]n(CH2)yDPP-Pd), komercijalno dostupnu kao SILIACAT<®>DPP-Pd R390-100, kompanije Silicycle, 0.25 mmol/g, 0.23 g, 0.060 mmol), i reakcija je mešana na rt tokom 18h. Smeša je zatim razblažena sa THF (4 mL) i dodat je N,N-dietanolaminometil polistiren (1.6 mmol/g, 0.50 g). Smeša je ostavljena da se meša 1h. Posle 1h, smeša je filtrirana, čvrsti ostatak je opran sa THF (3.5 mL), i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio metil (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat koji je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja ili karakterizacije.

Korak 5: (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0329]

[0330] U sirovu reakcionu smešu koja sadrži metil (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat dodat je THF (1.0 mL), MeOH (0.3 0mL) i vodeni rastvor LiOH (1.0M u H2O, 1.0 mL, 1.0 mmol). Posle 3h na rt, smeša je ugašena sa AcOH (0.20 mL), i smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u DMSO (1.5 mL) i smeša je prečišćena pomoću reverzno-fazne HPLC (ACN/H2O 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5-hloro-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H13ClO4S) (ES, m/z): 313 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.26 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.41 (dd, J= 17.2, 8.4Hz, 1H), 3.09 (dd, J = 17.4, 5.0Hz, 1H), 2.94 - 2.85 (m, 1H), 1.19 (d, J = 7.2Hz, 3H).

[0331] Primeri 29 do 34, prikazani u tabeli 3 ispod, su pripremljeni, ili mogu da budu pripremljeni prema procedurama analognim onim prikazanim iznad u primeru 28, upotrebom odgovarajućih polaznih materijala, opisanih kao preparacije ili dobijenih iz komercijalnih izvora.

Tabela 3

Primer 35: 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0332]

Korak 1: terc-butil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoat

[0333]

[0334] U bocu koja sadrži THF (10 mL) na -78°C dodat je LDA (2.0M u smeši THF/heptan/benzen, 4.2 mL, 8.4 mmol). Ukapan je terc-butil acetat (1.1 mL, 8.3 mmol). Nakon završenog dodavanja, smeša je ostavljena da se meša na -78°C tokom 15 min. Ukapana je smeša N,5,6-trimetoksi-N-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksamida (1.9 g, 6.9 mmol) u THF (15 mL). Nakon završenog dodavanja, smeša je ostavljena da se meša na -78°C tokom 1h. Smeša je zatim ostavljena da se zagreje do rt. Posle zagrevanja do rt, smeša je ohlađena do 5°C i zatim ugašena vodenim rastvorom HCl (1N) do dostizanja pH=2. Smeša je ekstrahovana pomoću izopropil acetata (2x20 mL). Kombinovane organske faze su oprane zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i slanim rastvorom, osušene nad MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio terc-butil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoat. LCMS (C17H21O5S - C4H8) (ES, m/z): 281 [M+H]<+>. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 1.36 (s, 9H).

Korak 2: 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0335]

[0336] Et2Zn (1.0M u heksanima, 6.0 mL, 6.0 mmol) dodat je u DCM (20 mL) na 0°C pod atmosferom N2. Zatim je ukapan CH2I2(0.50 mL, 6.0 mmol). Nakon toga, smeša je ostavljena da se meša na 0°C tokom 10 min, dodat je terc-butil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoat (0.50 g, 1.5 mmol) praćen sa TMSCl (20 µL, 0.15 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i zatim mešana 18h. Reakciona smeša je zatim ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl i ekstrahovana pomoću DCM (3x20 mL). Kombinovane organske faze su koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je rekonstituisan u DCM (30 mL) i dodat je TFA (0.50 mL, 6.0 mmol). Nakon mešanja reakcione smeše tokom 20 min, reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Proizvod je prečišćen pomoću reverzno-fazne prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H16O5S) (ES, m/z): 309 [M+H]<+>.<1>H NMR (CD3OD, 600MHz): δ 8.06 (s, 1H), 7.43-7.40 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.46 (dd, J = 17, 8Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 17, 5Hz, 1H), 3.02 (sekstet, J = 7.0Hz, 1H), 1.26 (d, J = 7Hz, 3H) Primer 36: 4-(5-Etinil-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0337]

Korak 1: Etil 4-(6-metoksi-5-((trimetilsilil)etinil)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat [0338]

[0339] U smešu etil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (100 mg, 0.269 mmol), Pd(Ph3P)4(78 mg, 0.067 mmol) i Cu-I (51 mg, 0.27 mmol) degasiranu pomoću Ar dodat je DMF (1.0 mL) praćen trietilaminom (0.188 mL, 1.35 mmol) i etiniltrimetilsilanom (0.192 L, 1.35 mmol) na rt uz degasiranje pomoću Ar. Smeša je mešana 5 min uz degasiranje pomoću Ar (barbotiranje ispod površine), nakon čega je smeša mešana pod Ar na 20°C tokom 18h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc (50 mL) i filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio etil 4-(6-metoksi-5-((trimetilsilil)etinil)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C20H25O4SSi) (ES, m/z): 389 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.25 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.34-3.30 (m, 2H), 2.68-2.64 (m, 2H), 1.17 (t, J = 7.0Hz, 3H), 0.24 (s, 9H).

Korak 2: 4-(5-Etinil-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina

[0340]

[0341] U suspenziju etil 4-(6-metoksi-5-((trimetilsilil)etinil)benzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (61 mg, 0.16 mmol) u MeOH (5.0 mL) dodat je NaOH (1.0M u H2O, 1.0 mL, 1.0 mmol). Rezultujuća suspenzija je mešana na 20°C tokom 2.5h. Reakciona smeša je ugašena sa HCl (37% u H2O, 0.083 mL, 1.0 mmol). Smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod prečišćen je pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(5-etinil-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H13O4S) (ES, m/z): 289 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.22 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 4.33 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.30-3.24 (m, 2H), 2.63-2.57 (m, 2H).

Primer 37: (S)-4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0342]

Korak 1: (S)-metil 4-(6-((terc-butoksikarbonil)(metil)amino)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0343]

[0344] U smešu (S)-metil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b] tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (40 mg, 0.11 mmol), terc-butil metilkarbamata (21 mg, 0.16 mmol), Pd2(dba)3(5 mg, 5 µmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (XANTPHOS, 9 mg, 0.02 mmol) i Cs2CO3(70 mg, 0.22 mmol) degasiranu pomoću Ar dodat je dioksan (0.50 mL) na rt uz degasiranje pomoću Ar. Smeša je mešana 5 min uz degasiranje pomoću Ar (barbotiranje ispod površine), nakon čega je smeša zagrevana do 95°C pod atmosferom Ar tokom 12h. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena sa EtOAc (20 mL). Rezultujuća suspenzija je filtrirana kroz fritu koja sadrži celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio (S)-metil 4-(6-((terc-butoksikarbonil)(metil) amino)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C21H28NO6S) (ES, m/z): 422 [M+H]<+>.

Korak 2: (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0345]

[0346] TFA (0.34 mL, 4.4 mmol) je dodata u smešu (S)-metil 4-(6-((tercbutoksikarbonil)(metil)amino)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (37 mg, 0.088 mmol) u DCM (2.0 mL) na 20°C. Reakciona smeša je mešana na 20°C tokom 2h. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat kao ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je upotrebljen bez obrade ili prečišćavanja u sledećem koraku. LCMS (C16H20NO4S) (ES, m/z): 322 [M+H]<+>.

Korak 3: (S)-4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0347]

[0348] NaOH (2.0M u H2O, 0.35 mL, 0.70 mmol) je dodat u smešu (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (28 mg, 0.087 mmol) u DMSO (0.50 mL) i MeOH (2.0 mL) na 20°C. Reakciona smeša je mešana na 20°C tokom 18h. Reakciona smeša je ugašena sa HCl (0.057 mL, 37% u H2O, 0.70 mmol) i zatim razblažena dodatnim DMSO (1.0 mL). Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod prečišćen je pomoću reverzno-fazne prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5-metoksi-6-(metilamino)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H18NO4S) (ES, m/z): 308 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.07 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.34-3.29 (m, 1H), 3.04-2.96 (m, 1H), 2.90-2.82 (m, 1H), 2.79 (s, 3H), 1.16 (d, J = 7.0Hz, 3H).

Primer 38: (S)-4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0349]

Korak 1: (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

1

[0351] DMSO (1.00 mL) je dodat u smešu (S)-metil 4-(6-bromo-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (95 mg, 0.26 mmol), Cu-I (12 mg, 0.064 mmol) i cink acetata (94 mg, 0.51 mmol). Rezultujuća smeša je zagrevana do 120°C tokom 20h pod N2. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena sa EtOAc (50 mL), a zatim filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobio (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C16H19O4S2) (ES, m/z): 339 [M+H]<+>.

Korak 2: (S)-4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0352]

[0353] U rastvor (S)-metil 4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (32 mg, 0.095 mmol) u DMSO (1.00 mL) dodat je NaOH (2.0M u H2O, 0.19 mL, 0.38 mmol) na 20°C. Rezultujuća smeša je mešana na 20°C tokom 15 min pod N2. Reakciona smeša je zatim ugašena sa HCl (0.035 mL, 37% u H2O, 0.43 mmol). Reakciona smeša je filtrirana i prečišćena pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(5-metoksi-6-(metiltio)benzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C15H17O4S2) (ES, m/z): 325 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.23 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.45-3.37 (m, 1H), 3.13-3.07 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.47 (s, 3H), 1.18 (d, J = 7.0Hz, 3H).

Primer 39: (1S,2R)-2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina

[0354]

Korak 1: (1S,2R)-metil 2-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil) ciklopropankarboksilat

[0355]

2

[0356] TMS-diazometan (2.0M u heksanima, 1.4 mL, 2.8 mmol) je dodat u smešu (1S,2R)-2-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropankarboksilne kiseline (891 mg, 2.51 mmol) u DCM (20 mL) i MeOH (20 mL) na 0°C. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 1h. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio (1S,2R)-metil 2-(5-bromo-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil) ciklopropankarboksilat. LCMS (C15H14BrO4S) (ES, m/z): 369, 371 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.30 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.44-2.39 (m, 1H), 1.60-1.57 (m, 1H), 1.42-1.39 (m, 1H).

Korak 2: (1S,2R)-metil 2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil) ciklopropankarboksilat [0357]

[0358] U smešu (1S,2R)-metil 2-(5-bromo-6-metoksibenzo[b] tiofen-2-karbonil) ciklopropankarboksilata (100 mg, 0.271 mmol), 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioksaborolana (50 mg, 0.33 mmol), Pd2(dba)3(12 mg, 0.014 mmol), X-Phos (12 mg, 0.027 mmol) i Cs2CO3(176 mg, 0.542 mmol) degasiranu pomoću Ar dodat je dioksan (1.50 ml) i H2O (0.2 ml) na rt uz degasiranje pomoću Ar. Smeša je mešana 5 min uz degasiranje pomoću Ar (barbotiranje ispod površine), posle čega je smeša zagrevana do 90°C pod atmosferom Ar tokom 16h. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena sa EtOAc (20 mL). Rezultujuća suspenzija je filtrirana kroz fritu koja sadrži MgSO4. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio (1S,2R)-metil 2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropankarboksilat. LCMS (C17H17O4S) (ES, m/z): 317 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.31 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.05-6.97 (m, 1H), 5.88 (d, J = 17.5Hz, 1H), 5.34 (d, J = 11.5Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 3.20-3.13 (m, 1H), 2.46-2.38 (m, 1H), 1.62-1.56 (m, 1H), 1.44-1.36 (m, 1H).

Korak 3: (1S,2R)-2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina

[0359]

[0360] Trimetil-kalaj hidroksid (34 mg, 0.19 mmol) je dodat u smešu (1S,2R)-metil 2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropankarboksilata (30 mg, 0.095 mmol) u 1,2-dihloroetanu (2.0 mL) na 20°C. Reakciona smeša je mešana i zagrevana do 85°C tokom 2 dana. Reakciona smeša je ohlađena do rt i ugašena sa NaHSO4(2.0M u H2O, 0.19 mL, 0.378 mmol) i zatim razblažena sa EtOAc (100 mL) i H2O (25 mL). Organski sloj je odvojen, opran slanim rastvorom (10 mL), osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (1S,2R)-2-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina. LCMS (C16H15O4S) (ES, m/z): 303 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.22 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.05-6.96 (m, 1H), 5.88 (d, J = 17.5Hz, 1H), 5.33 (d, J = 11.5Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.10-3.02 (m, 1H), 2.30-2.25 (m, 1H), 1.56-1.50 (m, 1H), 1.34-1.30 (m, 1H).

[0361] Primer 40, prikazan u tabeli 4 ispod, pripremljen je, ili može da bude pripremljen prema procedurama analognim onim prikazanim iznad u primeru 39, upotrebom odgovarajućih polaznih materijala, opisanih kao preparacije ili dobijenih iz komercijalnih izvora.

Tabela 4

Primer 41: (S)-4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0362]

Korak 1: (S)-metil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0363]

4

[0364] U smešu (S)-metil 4-(5-bromo-6-metoksibenzo[b] tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (122 mg, 0.329 mmol), 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioksaborolana (61 mg, 0.39 mmol), Pd2(dba)3(15 mg, 0.016 mmol), X-Phos (15 mg, 0.033 mmol) i Cs2CO3(321 mg, 0.986 mmol) degasiranu pomoću Ar dodati su dioksan (3.0 mL) i H2O (0.30 mL) na rt uz degasiranje pomoću Ar. Smeša je mešana 5 min uz degasiranje pomoću Ar (barbotiranje ispod površine), nakon čega je smeša zagrevana do 90°C pod atmosferom Ar tokom 2h. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena sa EtOAc (20 mL). Rezultujuća suspenzija je filtrirana kroz fritu koja sadrži MgSO4. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod prečišćen je pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio (S)-metil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b] tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C17H19O4S) (ES, m/z): 319 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.28 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.05-6.96 (m, 1H), 5.86 (d, J = 17.5Hz, 1H), 5.34 (d, J = 11.5Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.47-3.40 (m, 1H), 3.24-3.16 (m, 1H), 3.00-2.93 (m, 1H), 1.19 (d, J = 6.5Hz, 3H).

Korak 2: (S)-4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0365]

[0366] NaOH (1.0M u H2O, 0.41 mL, 0.41 mmol) je dodat u rastvor (S)-metil 4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (26 mg, 0.082 mmol) u THF (3.0 mL). Rezultujuća suspenzija je mešana na 20°C tokom 18h. Reakciona smeša je ugašena sa HCl (1.0M u H2O, 0.41 mL, 0.41 mmol). Reakciona smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio ostatak koji predstavlja sirovi proizvod. Ostatak koji predstavlja sirovi proizvod je prečišćen pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (S)-4-(6-metoksi-5-vinilbenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C16H17O4S) (ES, m/z): 305 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.21 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.06-6.96 (m, 1H), 5.92-5.81 (m, 1H), 5.38-5.30 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.44-3.36 (m, 1H), 3.14-3.05 (m, 1H), 2.93-2.85 (m, 1H), 1.18 (bs, 3H).

Primer 42: (S)-(4R,5R)-5-hidroksi-1,2-ditian-4-il 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0367]

[0368] U mešani rastvor (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanske kiseline (81 mg, 0.26 mmol) i EDC (50 mg, 0.26 mmol) u DCM (2.0 mL) dodati su (4R,5R)-1,2-ditian-4,5-diol (30 mg, 0.20 mmol) i DMAP (1.6 mg, 0.013 mmol). Rastvor je ostavljen da se meša 3 dana i prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima). Željene frakcije su kombinovane, koncentrovane i ponovo prečišćene pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobio (S)-(4R,5R)-5-hidroksi-1,2-ditian-4-il 4-(5,6-dimetoksibenzo[b] tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C19H23O6S3) (ES, m/z): 443 [M+H]<+>.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.22 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 5.49 (d, J= 5.6Hz, 1H), 4.66 (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.60 (m, 1H), 3.40 (dd, J= 17.3, 8.3Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 17.3, 5.1Hz, 1H), 3.15-3.09 (m, 2H), 2.98 (m, 1H), 2.89-2.83 (m, 2H), 1.21 (d, J = 7.1Hz, 3H).

Primer 43: (S)-4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0369]

Korak 1: (S)-4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0370]

[0371] U mešani rastvor (S)-4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanske kiseline (47 mg, 0.15 mmol) u DCM (2.0 mL) dodat je AlCl3(140 mg, 1.10 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se meša 2h, koncentrovana i prečišćena pomoću prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA). Smeša (S)-4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanske kiseline i (S)-4-(5-hidroksi-6-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanske kiseline je ponovo prečišćena pomoću hiralne-SFC (kolona AD-H (21x250 mm), 40% MeOH sa 0.25% DMEA u CO2) da bi se dobio proizvod (vreme zadržavanja 6.2 min) u vidu DMEA soli. So je rastvorena u H2O i acidifikovana pomoću 1N HCl do pH 2. Precipitat je filtriran, opran sa H2O i osušen pod visokim vakuumom da bi se dobio proizvod. LCMS (C14H15O5S) (ES, m/z): 295 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 12.19 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.37 (m, 1H), 3.05 (dd, J = 17.1, 5.1Hz, 1H), 2.88 (m, 1H), 1.17 (d, J = 7.1Hz, 3H).

Primer 44: (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0372]

Korak 1: metil (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat [0373]

[0374] Anhidrovani Na2CO3(16 mg, 0.15 mmol) je zagrevan do 125°C pod visokim vakuumom u zatvorenoj bočici za mikrotalasno zagrevanje tokom 1h pre upotrebe. Ova bočica je premeštena u izolator sa rukavicama. Unutar izolatora sa rukavicama, degasirani dimetoksietan (7.0 mL) je dodat u bočicu od 7.39 mL koja sadrži kompleks nikl(II) hlorid/etilen glikol dimetil etar (5.8 mg) i 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridin (8.0 mg). Rezultujuća smeša je mešana 25 min na rt da bi se pripremio rastvor A.

[0375] U drugoj bočici, degasirani dimetoksietan (2.4 mL) je dodat u Ir(2-(2,4-difluorofenil)-5-(trifluorometil)piridin)2(4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridin)PF6(7.2 mg). Rezultujuća smeša je mešana 10 min na rt da bi se pripremio rastvor B.

[0376] U trećoj bočici, degasirani dimetoksietan (0.38 mL) dodat je u smešu metil (2S)-4-(6-bromo-5-metoksi-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata (28 mg, 0.075 mmol), i tris(trimetilsilil)silana (23 µL, 0.075 mmol). U ovu bočicu dodat je rastvor A (101 µL), rastvor B (280 µL), 1-bromopropan (28 mg, 0.23 mmol) i Na2CO3(16 mg, 0.15 mmol). Bočica je zatvorena i zapečaćena parafinskim filmom (PARAFILM). Reakciona smeša je izneta iz izolatora sa rukavicama, mešana i ozračena sa dve plave LED lampe od 34W tokom 4h. Treba napomenuti da su lampe bile postavljene na odgovarajućem rastojanju od reakcione posude kako bi se obezbedilo zračenje bez zagrevanja reakcione smeše znatno iznad rt. Sirova reakciona smeša koja sadrži metil (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoat upotrebljena je u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja ili karakterizacije.

Korak 2: (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina [0377]

[0378] U sirovu smešu metil (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanoata u dimetoksietanu (0.76 mL), dodati su MeOH (0.76 mL), H2O (0.19 mL) i LiOH (22 mg, 0.91 mmol) na rt. Rezultujuća smeša je mešana 1.5h na rt, i zatim podešena na pH=5 pomoću vodenog rastvora HCl (2.0N) i filtrirana. Filtrat je prečišćen pomoću reverzno-fazne prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila (2S)-4-(5-metoksi-6-propil-1-benzotiofen-2-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C17H21O4S) (ES, m/z): 321 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 8.25 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.45-3.39 (m, 1H), 3.12-3.07 (m, 1H), 2.92-2.87 (m, 1H), 2.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.60 (sekstet, J = 7.4Hz, 2H), 1.18 (d, J = 7.5Hz, 3H), 0.91 (t, J = 7.3Hz, 3H).

[0379] Primeri 45 do 47, prikazani u tabeli 5 ispod, su pripremljeni, ili mogu da budu pripremljeni prema procedurama analognim onim prikazanim iznad u primeru 44, upotrebom odgovarajućih polaznih materijala, opisanih kao preparacije ili dobijenih iz komercijalnih izvora.

Tabela 5

Primer 48: Etil 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-hidroksi-2-metil-4-oksobutanoat [0380]

Korak 1: N,5,6-trimetoksi-N-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksamid

[0381]

[0382] U smešu 5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (2.0 g, 8.4 mmol) u THF (17 mL) na 0°C dodat je N,O-dimetilhidroksilamin hidrohlorid (1.6 g, 17 mmol), EDC (3.2 g, 17 mmol) i zatim Hunigova baza (5.9 mL, 34 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do rt i mešana 18h. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio željeni proizvod. LCMS (C13H16NO4S) (ES, m/z): 282 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.05 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.30 (s, 3H).

Korak 2: 1-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)etan-1-on

[0383]

[0384] U smešu N,5,6-trimetoksi-N-metilbenzo[b]tiofen-2-karboksamida (0.20 g, 0.71 mmol) u THF (3.6 mL) na 0°C polako je dodat MeMgBr (3.0M u THF, 0.36 mL, 1.1 mmol). Posle 30 min na 0°C, dodato je još MeMgBr (3.0M u THF, 0.10 mL, 0.28 mmol). Posle 15 min na 0°C, dodato je još MeMgBr (3.0M u THF, 0.19 mL, 0.57 mmol). Posle 45 min na 0°C, smeša je polako ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl i zatim razblažena sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio željeni proizvod. LCMS (C12H13O3S) (ES, m/z): 237 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.58 (s, 3H).

Korak 3: etil 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-hidroksi-2-metil-4-oksobutanoat [0385]

[0386] U smešu 1-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)etanona (50 mg, 0.21 mmol) u THF (4.2 mL) na -78°C dodat je LDA (2.0M u smeši THF/heptan/benzen, 0.50 mL, 1.0 mmol). Posle 45 min na -78°C, dodat je etil piruvat (78 µl, 0.70 mmol) i smeša je mešana 30 min na -78°C. Posle 30 min, smeša je ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl i ostavljena da se zagreje do rt. Dodat je EtOAc i organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio željeni proizvod kao racemska smeša. Prečišćena racemska smeša je zatim prečišćena pomoću hiralne-SFC (ES Industries, ChromegaChiral CCC, kolona 21x250 mm, 40% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2), što je dalo dva jedinjenja sa vremenima zadržavanja od 3.9 min i 6.3 min. Koncentrovanje prvog eluiranog pika dalo je proizvod. LCMS (C17H21O6S) (ES, m/z): 353 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.16 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.08 (q, J = 6.8Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.47 (d, J = 16.0Hz, 1H), 3.35 (d, J = 15.0Hz, 1H), 1.40 (s, 3H), 1.16 (t, J = 7.1Hz, 3H).

Primer 49: 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil)pentanska kiselina

[0387]

Korak 1: 1-(terc-butil) 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-propilsukcinat [0388]

[0389] U smešu terc-butil 3-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoata (0.15 g, 0.45 mmol) u DMF (4.5 mL) dodat je Cs2CO3(0.29 g, 0.89 mmol), i smeša je mešana 20 min. Nakon

1

20 min, dodat je metil 2-bromopentanoat (0.17 g, 0.89 mmol), i smeša je mešana 30 min. Nakon 30 min, smeša je razblažena sa EtOAc i slanim rastvorom. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobio 1-(terc-butil) 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-propilsukcinat kao smeša izomera. LCMS (C23H31O7S) (ES, m/z): 451 [M+H]<+>. Korak 2: metil 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil)pentanoat

[0390]

[0391] U 1-terc-butil 4-metil 2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)-3-propilsukcinat (0.16 g, 0.35 mmol) u CH2Cl2(0.94 mL) dodata je TFA (0.47 mL), i smeša je mešana preko noći na rt. Smeša je razblažena sa EtOAc i zasićenim NaHCO3. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobio metil 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil)pentanoat. LCMS (C18H23O5S) (ES, m/z): 351 [M+H]<+>.

Korak 3: 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil)pentanska kiselina

[0392]

[0393] U smešu metil 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil) pentanoata (69 mg, 0.20 mmol) u THF (1.0 mL), MeOH (0.50 mL) i H2O (0.50 mL) dodat je LiOH (24 mg, 0.99 mmol), i smeša je mešana 2h na rt. Posle 2h, smeša je ugašena vodenim rastvorom HCl (2.0N, 0.50 mL, 1.0 mmol) i zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hiralne-SFC (CHIRALCEL, OJ-H, 21X250 mm, 20% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2) da bi se dobili razdvojeni enantiomeri sa vremenima zadržavanja od 4.2 min i 6.7 min. Frakcije koje sadrže prvi pik su kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim rastvoren u H2O i osušen zamrzavanjem putem liofilizacije da bi se dobila 2-(2-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-2-oksoetil)pentanska kiselina. LCMS (C17H21O5S) (ES, m/z): 337 [M+H]<+>.<1>H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 12.02 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.79 (s, 3H),

1 1

3.36-3.31 (m, 1H), 3.04 (dd, J = 17.2, 4.3Hz, 1H), 2.82-2.76 (m, 1H), 1.59-1.51 (m, 1H), 1.51-1.42 (m, 1H), 1.36-1.26 (m, 2H), 0.85 (t, J = 7.2Hz, 3H).

Primer 50: 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0394]

Korak 1: terc-butil 3-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoat

[0395]

[0396] U smešu 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (290 mg, 1.1 mmol) u 7.5 mL THF dodat je 1,1'-karbonildiimidazol (220 mg, 1.4 mmol). Posle 2h, dodat je magnezijum 3-(terc-butoksi)-3-oksopropanoat (0.58 g, 1.7 mmol), i reakciona smeša je ostavljena da se meša 18h. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Surovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio terc-butil 3-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoat. LCMS (C17H20FO5S-C4H8) (ES, m/z): 299 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.32 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 4.13 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 1.40 (s, 9H).

Korak 2: metil 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0397]

[0398] U smešu terc-butil 3-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-3-oksopropanoata (0.12 g, 0.34 mmol) u DMF (1.0 mL) dodat je Cs2CO3(0.22 g, 0.68 mmol), i smeša je mešana 20 min. Zatim je dodat metil 2-bromobutirat (78 µl, 0.68 mmol), i smeša je ostavljena da se meša 3h na rt. Posle 3h, smeša je razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4,

1 2

filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. U sirovi ostatak dodat je CH2Cl2(1.7 mL) i TFA (0.85 mL), i smeša je zagrevana do 50°C tokom 4h. Nakon hlađenja do rt, smeša je razblažena sa EtOAc i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio metil 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C17H20FO5S) (ES, m/z): 355 [M+H]<+>. Korak 3: 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0399]

[0400] U smešu metil 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (57 mg, 0.16 mmol) u THF (1.0 mL), MeOH (0.50 mL) i H2O (0.50 mL) dodat je LiOH (19 mg, 0.80 mmol), i smeša je mešana 2h na 40°C. Posle 2h, smeša je ohlađena do rt i zatim ugašena vodenim rastvorom HCl (2.0M, 0.40 mL, 0.80 mmol) i zatim razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen pomoću hiralne-SFC (Lux-4, 21x250 mm, 45% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2) da bi se dobili razdvojeni enantiomeri sa vremenima zadržavanja od 2.8 min i 5.3 min. Frakcije koje sadrže drugi pik su kombinovane i koncentrovane. Ostatak je zatim rastvoren u H2O i osušen zamrzavanjem putem liofilizacije da bi se dobila 2-etil-4-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C16H18FO5S) (ES, m/z): 341 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.52-3.42 (m, 1H), 3.15-3.07 (m, 1H), 2.81-2.71 (m, 1H), 1.68-1.55 (m, 2H), 0.92 (t, J = 7.3Hz, 3H).

Primer 51 i 52: (1R,2S)-2-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina i (1S,2R)-2-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina

[0401]

Korak 1: 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen

[0402]

1

[0403] U smešu 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (0.090 g, 0.35 mmol) u hinolinu (0.83 mL, 7.0 mmol) dodat je bakar (0.038 g, 0.60 mmol), i smeša je zagrevana do 190°C tokom 2h. Posle 2h, smeša je ostavljena da se ohladi do rt i zatim razblažena sa EtOAc i 2N HCl. Smeša je filtrirana, a zatim je odvojen organski sloj. Organski sloj je zatim opran redom sa H2O, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Smeša je prečišćena pomoću hromatografije na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen. LCMS (C10H10FO2S) (ES, m/z): 213 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, Hloroform-d) δ 7.33 (d, J = 5.4Hz, 1H), 7.27 (d, J = 5.2Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.95 (s, 3H).

Korak 2: 2-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina [0404]

[0405] U smešu 4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofena (45 mg, 0.21 mmol) u CH2Cl2(2.0 mL) na 0°C dodat je AlCl3(37 mg, 0.28 mmol) i zatim 3-oksabiciklo[3.1.0] heksan-2,4-dion (48 mg, 0.42 mmol). Smeša je mešana 1h na 0°C i zatim ostavljena da se zagreje do rt i mešana 18h. Posle 18h, smeša je razblažena sa EtOAc i H2O. Organski sloj je odvojen, osušen nad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobila racemska smeša željenog proizvoda. Enantiomeri su zatim razdvojeni hiralnom-SFC (Lux-4, 21x250 mm, 45% MeOH (+0.25% DMEA) u CO2) da bi se dobila (1R,2S)-2-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina i (1S,2R)-2-(4-fluoro-5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-karbonil)ciklopropan-1-karboksilna kiselina sa vremenima zadržavanja od 4.0 min i 4.9 min. Frakcije koje sadrže prvi pik (vreme zadržavanja 4.0 min) su kombinovane i koncentrovane. Ostatak je rastvoren u H2O i osušen zamrzavanjem putem liofilizacije da bi se dobio jedan od čistih enantiomera. LCMS (C15H14FO5S) (ES, m/z): 325 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.15 (q, J = 8.0Hz, 1H), 2.33-2.28 (m, 1H), 1.58-1.48 (m, 1H), 1.34-1.27 (m, 1H). Frakcije koje sadrže drugi pik (vreme zadržavanja 4.9 min) su kombinovane i koncentrovane. Ostatak je

1 4

rastvoren u H2O i osušen zamrzavanjem putem liofilizacije da bi se dobio jedan od čistih enantiomera. LCMS (C15H14FO5S) (ES, m/z): 325 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 12.18 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.14 (q, J = 7.9Hz, 1H), 2.29 (q, J = 8.0Hz, 1H), 1.57-1.49 (m, 1H), 1.34-1.27 (m, 1H).

Primer 53: 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0406]

Korak 1: etil 4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0407]

[0408] U smešu etil 4-(5,6-dimetoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (0.45 g, 1.4 mmol) i DCM (12 mL) dodat je AlCl3(0.56 g, 4.2 mmol) na 25°C. Smeša je mešana na 25°C tokom 15h. Posle 15h, u smešu je dodato još AlCl3(1.0 g, 7.5 mmol). Rezultujuća smeša je mešana na 25°C tokom 16h. Posle 16h, smeša je ugašena vodenim rastvorom HCl (1.0N, 20 mL, 20 mm) i ekstrahovana pomoću DCM (3x30 mL). Kombinovane organske faze su oprane slanim rastvorom (20 mL), osušene nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirane i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc u PE) da bi se dobio sirovi etil 4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. Sirovi proizvod je zatim prečišćen pomoću hiralne-SFC da bi se dobio etil 4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C15H17O5S) (ES, m/z): 309.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.88 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.08 (s, 1H), 4.17 (q, J = 7.3Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.31 (t, J = 6.7Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.8Hz, 2H), 1.27 (t, J = 7.0Hz, 3H).

Korak 2: etil 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoat

[0409]

1

[0410] U smešu etil 4-(6-hidroksi-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (25 mg, 0.081 mmol) u DMF (1.5 ml) dodat je natrijum 2-bromo-2,2-difluoroacetat (48 mg, 0.24 mmol) i Cs2CO3(79 mg, 0.24 mmol) na 30°C. Rezultujuća smeša je zagrevana do 100°C tokom 3h. Nakon hlađenja do rt, smeša je razblažena sa H2O (10 mL) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3x10 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa H2O (20 mL) i slanim rastvorom (20 mL), osušeni nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirov proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću reverzno-fazne prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobio etil 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b] tiofen-2-il)-4-oksobutanoat. LCMS (C16H17F2O5S) (ES, m/z): 359 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.90 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.60 (t, J = 74Hz, 1H), 4.15 (q, J = 7.2Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.31 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.2Hz, 3H).

Korak 3: 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina [0411]

[0412] U smešu etil 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanoata (5.0 mg, 0.014 mmol) u MeOH (0.50 mL), THF (0.50 mL) i H2O (0.50 mL) dodat je LiOH (3.3 mg, 0.14 mmol). Smeša je zagrevana do 50°C tokom 2h. Posle 2h, smeša je ostavljena da se ohladi do rt i dodat je vodeni rastvor HCl (1.0M) dok smeša nije dostigla pH=6. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u DMF (2 mL) i prečišćen pomoću reverzno-fazne prep-HPLC (ACN/H2O sa 0.1% TFA) da bi se dobila 4-(6-(difluorometoksi)-5-metoksibenzo[b]tiofen-2-il)-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C14H13F2O5S) (ES, m/z): 331 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.15 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.83 (t, J= 75Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.36 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.73 (t, J = 6.0Hz, 2H).

Primer 54: (S)-4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0413]

1

Korak 1: 4-fluoro-2-metoksi-6-nitrofenol

[0414]

[0415] U balon okruglog dna od 50 mL dodat je 4-fluoro-2-metoksifenol (3.7 mL, 32 mmol) i EtOAc (90 mL). Smeša je ohlađena do 0°C i mešana. U mešanu smešu ukapavana je azotna kiselina (2.1 mL, 33 mmol) tokom 5 min. Reakcija je mešana na ovoj temperaturi 30 min. Smeša je razblažena sa EtOAc (30 mL), oprana sa H2O (100 mL), osušena nad anhidrovanim Na2SO4, filtrirana i uparena pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni silika gela (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 4-fluoro-2-metoksi-6-nitrofenol.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 10.60 (s, 1H), 7.41 (dd, J = 8.4, 2.7Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 9.2, 2.4Hz, 1H), 3.97 (s, 3H).

Korak 2: 2-amino-4-fluoro-6-metoksifenol

[0416]

[0417] U balon okruglog dna od 100 mL dodat je 4-fluoro-2-metoksi-6-nitrofenol (826 mg, 4.41 mmol), Pd/C (235 mg, 0.221 mmol), i EtOAc (30 mL). Smeša je mešana. Smeša je degasirana pomoću N2, a zatim stavljena pod H2. Posle mešanja tokom 16h, reakcija je filtrirana kroz celit i filter kolač je opran sa EtOAc. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio 2-amino-4-fluoro-6-metoksifenol koji je upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS (C7H9FNO2) (ES, m/z): 158 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 6.23-6.01 (m, 2H), 3.85 (s, 3H).

Korak 3: 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol

[0418]

[0419] U bočicu od 20 mL dodat je 2-amino-4-fluoro-6-metoksifenol (0.58 g, 3.7 mmol) i 1,1,1-trimetoksietan (4.0 mL, 31 mmol). Smeša je mešana i zagrevana do 70°C. Posle 10 min, smeša je ostavljena da se ohladi do rt, i rastvarači su upareni pod sniženim pritiskom da bi se dobio

1

sirovi ostatak koji je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol. LCMS (C9H9FNO2) (ES, m/z): 182 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 7.05 - 6.90 (m, 1H), 6.61 (d, J = 11.1Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 2.66 (s, 3H).

Korak 4: 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol-4-karbaldehid

[0420]

[0421] U bočicu od 20 mL dodat je 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol (423 mg, 2.33 mmol), 1,3,5,7-tetraazaadamantan (556 mg, 3.97 mmol) i TFA (0.50 mL). Smeša je mešana i zagrevana do 90°C tokom 3h. Reakcija je ostavljena da se ohladi do rt, razblažena sa EtOAc (40 mL) i raspodeljena zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(100 mL). Organski sloj je osušen nad anhidrovanim Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi ostatak koji je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol-4-karbaldehid. LCMS (C10H9FNO3) (ES, m/z): 210 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 10.42 (s, 1H), 6.60 (d, J = 12.7Hz, 1H), 4.05 (s, 3H), 2.68 (s, 3H).

Korak 5: 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-karboksilna kiselina [0422]

[0423] U bočicu od 4 mL dodat je 5-fluoro-7-metoksi-2-metilbenzo[d]oksazol-4-karbaldehid (185 mg, 0.884 mmol) i DMSO (4.0 mL). Smeša je mešana. U smešu je dodat Et3N (1.2 mL, 8.8 mmol) i metil 2-merkaptoacetat (0.79 mL, 8.8 mmol). Smeša je zagrevana do 100°C tokom 15 min. Smeša je ostavljena da se ohladi do rt. Dodat je vodeni rastvor KOH (10M, 1.8 mL, 18 mmol), i smeša mešana 10 min. Reakcija je acidifikovana do pH 3 vodenim rastvorom HCl (6M). Precipitat je sakupljen filtracijom, opran sa H2O (2x20 mL) i zatim MeOH (2x2 mL), čime je dobijena 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo [1,2-d]oksazol-7-karboksilna kiselina. LCMS (C12H10NO4S) (ES, m/z): 264 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 8.05 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.47 (s, 3H).

Korak 6: 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-karbonil hlorid

1

[0425] U bočicu od 20 ml dodati su 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-karboksilna kiselina (106 mg, 0.404 mmol), CH2Cl2(1.0 mL) i DMF (6.3 µL, 0.081 mmol). Smeša je mešana i ohlađena do 0°C. Dodat je (COCl)2(0.074 mL, 0.85 mmol). Posle 5 min, reakcija je zagrejana do rt i mešana 35 min. Reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6] benzo[1,2-d]oksazol-7-karbonil hlorid koji je upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 7: metil (S)-4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanoat

[0426]

[0427] U bočicu od 20 mL dodat je Cu-Cl (14 mg, 0.15 mmol). Bočica je ispražnjena, a zatim ponovo napunjena sa N23 puta. U bočicu je dodat THF (0.25 mL). Smeša je ohlađena do 0°C. U mešanu smešu ukapavan je (R)-(3-metoksi-2-metil-3-oksopropil)cink (II) bromid (0.5M u THF, 1.5 mL, 0.73 mmol) tokom 2 min. Smeša je zatim mešana 10 min. U smešu je ukapavan 4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-karbonil hlorid (41 mg, 0.15 mmol) kao rastvor u NMP (2.0 mL) tokom 2 min. Smeša je mešana 20 min. Reakcija je razblažena sa EtOAc (15 mL) i oprana vodenim rastvorom NH4OH (3M, 30 mL, 90 mmol). Organski sloj je osušen nad anhidrovanim Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (EtOAc u heksanima) da bi se dobio metil (S)-4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6] benzo [1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanoat. LCMS (C17H18NO5S) (ES, m/z): 348 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, CDCl3): δ 8.36 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 4.11 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.54 (dd, J = 16.6, 7.5Hz, 1H), 3.20-3.09 (m, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0Hz, 3H).

Korak 8: (S)-4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina

[0428]

1

[0429] U bočicu od 4 mL dodat je (S)-metil 4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6] benzo[1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanoat (48 mg, 0.14 mmol), vodeni rastvor KOH (0.5M, 0.55 mL, 0.28 mmol) i 2-propanol (1.4 mL) na rt. Posle 30 min, smeša je acidifikovana do pH 3 vodenim rastvorom HCl. Precipitat je sakupljen filtracijom i opran sa H2O (2x5 mL) i MeOH (2 mL). Precipitat je dalje prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (MeOH u DCM) čime je dobijena (S)-4-(4-metoksi-2-metiltieno[2',3':5,6]benzo[1,2-d]oksazol-7-il)-2-metil-4-oksobutanska kiselina. LCMS (C16H16NO5S) (ES, m/z): 334 [M+H]<+>.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.20 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 4.04 (s, 3H), 3.51 (dd, J = 17.4, 8.6Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 17.5, 4.9Hz, 1H), 2.95-2.85 (m, 1H), 2.71 (s, 3H), 1.20 (d, J = 7.2Hz, 3H).

BIOLOŠKA OCENA

[0430] Pojedinačna jedinjenja opisana u primerima ovog dokumenta definisana su kao agonisti STING kao rezultat (i) vezivanja za protein STING, što je pokazano smanjenjem vezivanja liganda cGAMP obogaćenog tricijumom za protein STING za najmanje 20% pri 20 uM (koncentracija jedinjenja koje se ispituje) u biohemijskoj analizi kompetitivnog vezivanja [<3>H] cGAMP za STING i (ii) demonstracije proizvodnje interferona sa 6% ili većom indukcijom sekrecije IFN-β pri 30 uM u analizi na ćelijama THP1 (gde indukcija izazvana pomoću cGAMP pri 30 uM predstavlja 100%).

Sinteza [<3>H]-cGAMP

[0431] U plastičnu AMICON epruvetu od 50 mL dodato je 2.3 mL puferskog rastvora koji sadrži 80 mM TrisCl, 200 mM MgCl2i 20 mM NaCl, a zatim 0.32 mL 10 mM vodenog rastvora GTP. Zatim je dodat rastvor [<3>H]ATP (21 Ci/mmol, 45 mCi) u 0.5 mL H2O praćen sa 1 mL rastvora DNK od 1 mg/mL (aktivator DNK iz testisa haringe, Sigma, br. D6898) i 53 uL rastvora enzima cGAS od 47 mM. Dodato je još H2O kako bi ukupna zapremina bila 10 mL.

[0432] Reakcija je mešana 2h na 37°C i zatim dodata direktno u Amicon Ultra-1510K epruvetu za centrifugiranje i centrifugirana 1h na 4 000g. Sakupljeni rastvor je zatim prečišćen na polupreparativnoj koloni Mono Q, upotrebom sledećih mobilnih faza:

A: 0.05M TrisCl pH 8.5 podešen sa 1M NaOH

B: 0.05M TrisCl, 0.5M NaCl pH 8.5 podešen sa 1M NaOH

11

Gradijent: 100% A tokom 5 min praćen linearnim gradijentom do 50:50 (A:B) tokom 25 min, 3 mL/min, 254 nm.

[0433] Sakupljene frakcije proizvoda su spojene i podešene na ukupnu zapreminu od 30 mL puferom A. Ukupni prinos od 15.5 mCi [<3>H]cGAMP je izdvojen sa radiohemijskom čistoćom od 98.0% pri specifičnoj aktivnosti od 21.5 Ci/mmol.

Enzim cGAS

[0434] Rekombinantni DNK vektor je hemijski sintetisan tako da eksprimira skraćeni humani enzim cGAS (ostaci 161-522). Za pomoć pri ekspresiji i prečišćavanju, amino-terminalni kraj sadrži heksahistidinsku oznaku, SUMO oznaku i mesto isecanja TEV. Rekombinantni enzim je prekomerno eksprimiran u kompetentnim ćelijama ROSETTA™ 2(DE3) Single (Novagen). Afinitetno prečišćavanje sprovedeno je upotrebom nikl-afinitetnog gela HIS-Select HF Nickel Affinity Gel (Sigma) što je praćeno ekskluzionom hromatografijom upotrebom preparativne kolone Hi-Load 26/60 SUPERDEX200 (GE Healthcare). Frakcije su spojene, koncentrovane, brzo smrznute u tečnom azotu i skladištene na -80°C do upotrebe.

Primer 55: Filtracioni test vezivanja<3>H-cGAMP (HAQ STING)

[0435] Sposobnost jedinjenja da se vežu za STING kvantitativno se određuje njihovom sposobnošću da kompetiraju sa ligandom cGAMP obogaćenim tricijumom za vezivanje za membranu sa humanim receptorima STING upotrebom radioaktivnog testa vezivanja na filteru. U testu vezivanja koristi se receptor STING dobijen iz ćelijskih membrana Trichoplusia ni (T.ni; Expression Systems, kat br. 94-002F, www.expressionsystems.com) koje prekomerno eksprimiraju HAQ STING cele dužine i ligand cGAMP obogaćen tricijumom.

[0436] Osnovni protokol filtracionog testa HAQ STING je sledeći:

Jedinjenja su serijski titrovana pomoću Hamilton STARPlus CORE u ploči sa 96 bunarčića (Greiner, br. 651201) upotrebom formata doza-odgovor 1:3 u deset tačaka. Nakon pripreme jedinjenja, radna koncentracija STING membrane od 2.2 ug/ml (SEQ. ID. No.1) je pripremljena razblaživanjem koncentrovane membrane u analitičkom puferu (1xPBS; Invitrogen br. SH30028.02) i homogenizovanjem 7x pomoću ručnog homogenizera tkiva (Wheaton, br.

357546). Zatim je u svaki bunarčić polipropilenske ploče sa 96 dubokih bunarčića (Fisher Scientific, br. 12-566-121) ručno dodato 148 uL pripremljene membrane. Nakon dodavanja membrane, u odgovarajuće bunarčiće dodato je pomoću BIOMEK FX po 2 uL titrovanog ispitivanog jedinjenja, DMSO kontrole (Sigma br. 276855) ili hladne cGAMP kontrole. Jedinjenje i membrana su zatim pre-inkubirani 60 minuta na RT da bi se omogućila ekvilibracija vezivanja jedinjenja. Nakon dostizanja ravnoteže, 8 nM liganda [<3>H]c-GAMP je pripremljeno razblaživanjem u analitičkom puferu, i 50 uL ovog radnog štoka je zatim ručno dodato u svaki bunarčić analitičke ploče. Ploče su zatim inkubirane na RT 60 minuta, i sadržaj svake analitičke ploče je zatim filtriran kroz GF/B filter ploču sa 96 bunarčića (PerkinElmer, br. 6005250) pomoću uređaja za sakupljanje ćelija TOMTEC MACH III sa 20 mM HEPES pufera (Fisher Scientific, br. BP299500). Filter ploče su zatim osušene na 55°C tokom 30 minuta u sušnici pod pritiskom pre nego što je u svaki bunarčić dodato 30 uL scintilata ULTIMA GOLD F. Nivoi tricijuma u svakom reakcionom bunarčiću su zatim izmereni pomoću čitača ploča PerkinElmer TopCount.

[0437] Posle normalizacije prema kontrolama, procenat aktivnosti za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je merenjem količine preostale radioaktivnosti. Grafikon zavisnosti procenta aktivnosti od log koncentracije jedinjenja aproksimiran je pomoću 4-parametarske jednačine doza-odgovor za izračunavanje vrednosti EC50.

[0438] Finalni uslovi reakcije bili su:

[0439] Ispitivane koncentracije jedinjenja bile su 20.000, 637.00, 2.200, 0.740, 0.247, 0.082, 0.027, 0.009, 0.003 i 0.001 µM sa 1.0% rezidualnog DMSO.

Generisanje virusa STING (HAQ) cele dužine

[0440] Virus STING je generisan upotrebom sistema insekatska ćelija - bakulovirus. Ćelije Spodoptera frugiperda Sf21 (Kempbio, Inc.) su razblažene do 5x10<5>ćelija/ml u Sf-900II SFM medijumu (LifeTechnologies br. 10902088) bez antibiotika. Ćelijska suspenzija je dodata u svaki bunarčić tretirane ploče sa 6 bunarčića (2 mL po bunarčiću, ukupno 1x10<6>ćelija), i ćelije su ostavljene da se zalepe za podlogu najmanje 30 min. U međuvremenu, sastavljen je 1 mL mešavine za ko-transfekciju kombinovanjem 500 ng DNK HAQ STING [STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBAC1] (prilagođena sinteza Genewiz) sa 1 mL medijuma Sf-900II SFM koji sadrži 10 µL reagensa Cellfectin® II (Invitrogen br. 10362100) i 100 ng linearizovane DNK bakulovirusa sa delecijom v-cath/chiA virusnog osnovnog lanca BestBac 2.0 (Expression Systems br.91-002). Smeše za transfekciju su ostavljene da se inkubiraju 30 min. Posle inkubacije, medijum je pažljivo uklonjen sa zalepljenih ćelija u ploči sa 6 bunarčića, dodat je 1 mL smeša za transfekciju (1 mL po bunarčiću), i ploča je stavljena u inkubator sa ovlaživačem na 27°C. Sledećeg dana, 1 mL medijuma Sf-900II SFM (bez antibiotika) dodat je u svaki bunarčić ploče sa 6 bunarčića. Posle dodavanja medijuma, ćelije su ostavljene da se inkubiraju sa DNK (SEQ. ID. No. 2) na 27°C tokom 5-7 dana kako bi se dobio virusni štok P0. Za generisanje virusnih štokova P1, 0.5 mL virusnog supernatanta P0 dodato je u 50 mL neinficiranih ćelija Sf21 (zasejanih dan pre infekcije pri gustini od 5x10<5>ćelija/mL kako bi se omogućilo jedno dupliranje preko noći) u medijumu Sf-900II SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina (Invitrogen br. 15710072). Inficirane ćelije su zatim inkubirane na 27°C 3 dana uz mućkanje na 110 obr/min (ATR Biotech Multitron Infors HT br. AJ118). Trećeg dana, kulture P1 su izbrojane upotrebom ViCell XR (Beckman Coulter Life Sciences br.383556) da bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 um veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost približno 85-95%). Kulture su sakupljene u konusne epruvete od 50 mL i centrifugirane na 2000xg 10 min na 4°C. Virusni supernatanti P1 su sipani u čiste centrifugirke od 50 ml, i preostali talozi P1 ćelija su upotrebljeni za generisanje insekatskih ćelija inficiranih bakulovirusom (BIIC). Pripremljen je medijum za krioprezervaciju koji sadrži medijum Sf-900II SFM sa 10% FBS inaktivisanog toplotom, 10% DMSO (Sigma br. D2650) i 5 µg/ml gentamicina i sterilisan kroz filter od 0.22 µM neposredno pre upotrebe. Talozi P1 ćelija su resuspendovani do gustine od 2x10<7>ćelija/ml i alikvotirani u krio-bočice (1 mL po bočici). Kriobočice su smeštene u zamrzivače za ćelije MR. FROSTY™ O/N na -80°C i narednog dana prenete u tečni azot za dugotrajno skladištenje. Za generisanje virusnog štoka P2, 0.5 mL virusnog supernatanta P1 dodato je u 50 mL neinficiranih ćelija Sf21 (zasejanih dan pre infekcije pri gustini od 5x10<5>ćelija/mL kako bi se omogućilo jedno dupliranje preko noći) u medijumu Sf-900II SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina. Ove ćelije su inkubirane na 27°C 3 dana uz mućkanje na 110 obr/min pre sakupljanja P2 štoka centrifugiranjem na 2000xg 10 min na 4°C. Virusni supernatanti P2 su odliveni i odbačeni, dok su talozi P2 ćelija upotrebljeni za dobijanje P2 BIIC prema protokolu istom kao što je onaj opisan iznad. Protokol generisanja bakulovirusa je validiran da konzistentno proizvodi P1/P2 BIIC sa titrovima od 2x10<9>pfu/mL (2x10<7>ćelija/mLx100 pfu/ćeliji).

Ekspresija STING (HAQ) cele dužine

11

[0441] Za generisanje membrana sa STING, P1/P2 BIIC su umnožene preko noći dodavanjem odmrznutih BIIC ćelijama Sf21 zasejanim pri gustini od 1.0x10<6>ćelija/mL. Zapremina BIIC upotrebljenih za infekciju kulture izračunata je upotrebom pretpostavljenog titra BIIC od 2x10<9>pfu/ml kako bi se postigao MOI od 10 pri amplifikaciji tokom noći. Posle kultivacije preko noći, ćelije su izbrojane pomoću ViCell XR kako bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 µm veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost od približno 80-90%). Zapremina inficiranih ćelija Sf21 posle amplifikacije preko noći upotrebljena za infekciju za ekspresiju većeg obima Trichoplusia ni (T.ni; Expression Systems, kat br. 94-002F, www.expressionsystems.com) zasejanih pri gustini od 1.0x10<6>u ćelijskom medijumu (ESF921 SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina) na MOI = 2.0 izračunata je na osnovu (100 pfu/inficiranoj Sf21 ćeliji). Ekspresija u ćelijama odvijala se 48h na 27°C pre sakupljanja ćelijskog taloga centrifugiranjem na 3 400xg 10 min na 4°C. T. ni ćelije su izbrojane pomoću ViCell XR kako bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 µm veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost od približno 80-90%) pre sakupljanja.

Generisanje membrana sa STING (HAQ) cele dužine

Štok reagensi pufera:

[0442]

1) 1M HEPES pH 7.5, Teknova, kat br. H1035

2) 5M NaCl, Sigma Aldrich, kat br. S5150-1L

3) KCl, Sigma Aldrich, kat br.319309-500ML

4) Tablete sa kompletnim inhibitorom proteaza bez EDTA, Roche Diagnostics, kat br.

11873580001

5) Benzonaza, Universal Nuclease, Pierce, kat br.88702

[0443] Pufer za lizu [25 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl, (benzonaza 1:5000, tableta sa kompletnim inhibitorom proteaza/50 mL)] dodat je talogu ćelija koje eksprimiraju STING (HAQ) cele dužine pripremljenom iznad u količini od 5 mL pufera za lizu po g ćelijskog taloga. Talog je resuspendovan i homogeniziran dvadeset puta upotrebom uređaja Wheaton Dounce Homogenizer da bi se raskinule ćelijske membrane. Homogenizovani lizat je zatim propušten kroz mikrofluidizer EMULSIFLEX-C5 na pritisku blizu 5000 PSI. Resuspendovani talog je centrifugiran na 36 000 obr/min (100 000xg) u ultrabrzoj centrifugi sa rotorom 45Ti tokom 45 min na 4°C. Supernatant je uklonjen. Talog je zatim resuspendovan u puferu za pranje [(25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM MgCl2, 20 mM KCl, 1M NaCl (tableta sa kompletnim inhibitorom proteaza/50mL)] na zapreminu od 50 mL taloga/centrifugirki. Smeša talog/pufer za pranje je zatim homogenizovana, upotrebom staklenog homogenizera na ledu (20 ciklusa), praćenim centrifugiranjem na 36 000 obr/min 45 min na 4°C. Supernatant je uklonjen. Korak pranja je ponovljen još jednom. Rezultujuće membrane su resuspendovane u 20 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerola, proteaznih inhibitora bez EDTA (1 tableta/50 mL). Koncentracija proteina izmerena je Bradfordovim testom (Bio-Rad Protein Assay, kat br. 500-0006), i obogaćivanje proteinom određeno je metodom SDS-PAGE i potvrđeno Western blotom. Resuspendovane membrane su skladištene na -80°C.

Aminokiselinska sekvenca HAQ STING [STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8]cele dužine:

Sekvenca plazmidne DNK HAQ [STING(1-379)R71H,G230A,H232R,R293Q-GG-AviTag-GS-HRV3C-HIS8/pBAC1] cele dužine:

11

[0444] Određena jedinjenja otkrića ocenjena su u analizi in vitro vezivanja HAQ STING, kao što je opisano iznad. U sledećoj tabeli prikazani su biološki podaci za jedinjenja kao vrednosti EC50.

Tabela 6: Filtracioni test vezivanja<3>H-cGAMP za HAQ STING

11

Primer 56: Filtracioni test vezivanja<3>H-cGAMP (WT STING)

[0445] Sposobnost jedinjenja da se vežu za STING kvantitativno se određuje njihovom sposobnošću da kompetiraju sa ligandom cGAMP obogaćenim tricijumom za vezivanje za membranu sa humanim receptorima STING upotrebom radioaktivnog testa vezivanja na filteru. U testu vezivanja koristi se receptor STING dobijen iz ćelijskih membrana Trichoplusia ni (T.ni; Expression Systems, kat br. 94-002F, www.expressionsystems.com) koje prekomerno eksprimiraju WT STING cele dužine i ligand cGAMP obogaćen tricijumom.

[0446] Osnovni protokol filtracionog testa WT STING je sledeći:

16 nM liganda [<3>H] c-GAMP pripremljeno je razblaživanjem u analitičkom puferu, i 50 uL ovog radnog štoka je ručno dodato u svaki bunarčić analitičke ploče. Posle dodavanja liganda, 2uL ispitivanog jedinjenja, DMSO kontrole (Sigma br. 276855), ili hladne cGAMP kontrole dodato je u odgovarajuće bunarčiće upotrebom uređaja BIOMEK FX. Serijski titrovano jedinjenje pripremljeno je pomoću Hamilton STARPlus CORE u ploči sa 96 bunarčića (Greiner, br.

651201) upotrebom formata doza-odgovor 1:3 u deset tačaka. Nakon dodavanja jedinjenja, radna koncentracija STING membrane (SEQ. ID. No. 3) od 2.2 ug/ml je pripremljena razblaživanjem koncentrovane membrane u analitičkom puferu (1xPBS; Invitrogen br. SH30028.02) i homogenizovanjem 7x pomoću ručnog homogenizera tkiva (Wheaton, br. 357546). Zatim je u svaki bunarčić polipropilenske ploče sa 96 dubokih bunarčića (Fisher Scientific, br.12-566-121) ručno dodato 148 uL pripremljene membrane. Jedinjenje, ligand i membrana su zatim inkubirani 60 minuta na RT pre nego što je sadržaj svake analitičke ploče filtriran kroz GF/B filter ploču sa 96 bunarčića (PerkinElmer, br. 6005250) pomoću uređaja za sakupljanje ćelija TOMTEC MACH III sa 20 mM HEPES pufera (Fisher Scientific, br. BP299500). Filter ploče su zatim osušene na 55°C tokom 30 minuta u sušnici pod pritiskom VWR pre nego što je u svaki bunarčić dodato 30 uL scintilata ULTIMA GOLD F. Nivoi tricijuma u svakom reakcionom bunarčiću su zatim izmereni pomoću čitača ploča PerkinElmer TopCount.

[0447] Posle normalizacije prema kontrolama, procenat aktivnosti za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je merenjem količine preostale radioaktivnosti. Grafikon zavisnosti procenta

12

aktivnosti od log koncentracije jedinjenja aproksimiran je pomoću 4-parametarske jednačine doza-odgovor za izračunavanje vrednosti EC50.

[0448] Finalni uslovi reakcije bili su:

[0449] Ispitivane koncentracije jedinjenja bile su 20.000, 637.00, 2.200, 0.740, 0.247, 0.082, 0.027, 0.009, 0.003 i 0.001 µM sa 1.0% rezidualnog DMSO.

Generisanje virusa STING (WT) cele dužine

[0450] Virus STING je generisan upotrebom sistema insekatska ćelija - bakulovirus. Ćelije Spodoptera frugiperda Sf21 (Kempbio, Inc.) su razblažene do 5x10<5>ćelija/ml u Sf-900II SFM medijumu (LifeTechnologies br. 10902088) bez antibiotika. Ćelijska suspenzija je dodata u svaki bunarčić tretirane ploče sa 6 bunarčića (2 mL po bunarčiću, ukupno 1x10<6>ćelija), i ćelije su ostavljene da se zalepe za podlogu najmanje 30 min. U međuvremenu, sastavljen je 1 mL mešavine za ko-transfekciju kombinovanjem 500 ng DNK WT STING[STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8/pBAC1] (prilagođena sinteza Genewiz) sa 1 mL medijuma Sf-900II SFM koji sadrži 10 µL reagensa Cellfectin® II (Invitrogen br. 10362100) i 100 ng linearizovane DNK bakulovirusa sa delecijom v-cath/chiA virusnog osnovnog lanca BestBac 2.0 (Expression Systems br. 91-002). Smeše za transfekciju su ostavljene da se inkubiraju 30 min. Posle inkubacije, medijum je pažljivo uklonjen sa zalepljenih ćelija u ploči sa 6 bunarčića, dodat je 1 mL smeša za transfekciju (1 mL po bunarčiću), i ploča je stavljena u inkubator sa ovlaživačem na 27°C. Sledećeg dana, 1 mL medijuma Sf-900II SFM (bez antibiotika) dodat je u svaki bunarčić ploče sa 6 bunarčića. Posle dodavanja medijuma, ćelije su ostavljene da se inkubiraju sa DNK [(SEQ. ID. No. 4) i linearizovanim virusnim osnovnim lancem BestBac 2.0] na 27°C tokom 5-7 dana kako bi se dobio virusni štok P0. Za generisanje virusnih štokova P1, 0.5 mL virusnog supernatanta P0 dodato je u 50 mL neinficiranih ćelija Sf21 (zasejanih dan pre infekcije pri gustini od 5x10<5>ćelija/mL kako bi se omogućilo jedno dupliranje preko noći) u medijumu Sf-900II SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina (Invitrogen br. 15710072). Inficirane ćelije su zatim inkubirane na 27°C 3 dana uz mućkanje na 110 obr/min (ATR Biotech Multitron Infors HT br. AJ118). Trećeg dana, kulture P1 su izbrojane upotrebom ViCell XR (Beckman Coulter Life Sciences br. 383556) da bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 um veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost približno 85-95%). Kulture su sakupljene u konusne epruvete od 50 mL i centrifugirane na 2000xg 10 min na 4°C. Virusni supernatanti P1 su sipani u čiste centrifugirke od 50 ml, i preostali talozi P1 ćelija su upotrebljeni za generisanje insekatskih ćelija inficiranih bakulovirusom (BIIC). Pripremljen je medijum za krioprezervaciju koji sadrži medijum Sf-900II SFM sa 10% FBS inaktivisanog toplotom, 10% DMSO (Sigma br. D2650) i 5 µg/ml gentamicina i sterilisan kroz filter od 0.22 µM neposredno pre upotrebe. Talozi P1 ćelija su resuspendovani do gustine od 2x10<7>ćelija/ml i alikvotirani u krio-bočice (1 mL po bočici). Krio-bočice su smeštene u zamrzivače za ćelije MR. FROSTY™ O/N na -80°C i narednog dana prenete u tečni azot za dugotrajno skladištenje. Za generisanje virusnog štoka P2, 0.5 mL virusnog supernatanta P1 dodato je u 50 mL neinficiranih ćelija Sf21 (zasejanih dan pre infekcije pri gustini od 5x10<5>ćelija/mL kako bi se omogućilo jedno dupliranje preko noći) u medijumu Sf-900II SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina. Ove ćelije su inkubirane na 27°C 3 dana uz mućkanje na 110 obr/min pre sakupljanja P2 štoka centrifugiranjem na 2000xg 10 min na 4°C. Virusni supernatanti P2 su odliveni i odbačeni, dok su talozi P2 ćelija upotrebljeni za dobijanje P2 BIIC prema protokolu istom kao što je onaj opisan iznad. Protokol generisanja bakulovirusa je validiran da konzistentno proizvodi P1/P2 BIIC sa titrovima od 2x10<9>pfu/mL (2x10<7>ćelija/mLx100 pfu/ćeliji).

Ekspresija STING (WT) cele dužine

[0451] Za generisanje membrana sa STING, P1/P2 BIIC su umnožene preko noći dodavanjem odmrznutih BIIC ćelijama Sf21 zasejanim pri gustini od 1.0x10<6>ćelija/mL. Zapremina BIIC upotrebljenih za infekciju kulture izračunata je upotrebom pretpostavljenog titra BIIC od 2x10<9>pfu/ml kako bi se postigao MOI od 10 pri amplifikaciji tokom noći. Posle kultivacije preko noći, ćelije su izbrojane pomoću ViCell XR kako bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 µm veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost od približno 80-90%). Zapremina inficiranih ćelija Sf21 posle amplifikacije preko noći upotrebljena za infekciju za ekspresiju većeg obima Trichoplusia ni (T.ni; Expression Systems, kat br. 94-002F, www.expressionsystems.com) zasejanih pri gustini od 1.0x10<6>u ćelijskom medijumu (ESF921 SFM koji sadrži 5 µg/mL gentamicina) na MOI = 2.0 izračunata je na osnovu (100 pfu/inficiranoj Sf21 ćeliji). Ekspresija u ćelijama odvijala se 48h na 27°C pre sakupljanja ćelijskog taloga centrifugiranjem na 3 400xg 10 min na 4°C. T. ni ćelije su izbrojane pomoću ViCell XR kako bi se potvrdilo da je došlo do infekcije (veličina ćelija ≥3 µm veća nego kod neinficiranih ćelija i vijabilnost od približno 80-90%) pre sakupljanja.

Generisanje membrana sa STING (WT) cele dužine

Štok reagensi pufera:

[0452]

1) 1M HEPES pH 7.5, Teknova, kat br. H1035

2) 5M NaCl, Sigma Aldrich, kat br. S5150-1L

3) KCl, Sigma Aldrich, kat br.319309-500ML

11873580001

5) Benzonaza, Universal Nuclease, Pierce, kat br.88702

[0453] Pufer za lizu [25 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl, (benzonaza 1:5000, tableta sa kompletnim inhibitorom proteaza/50 mL)] dodat je talogu ćelija koje eksprimiraju STING (WT) cele dužine pripremljenom iznad u količini od 5 mL pufera za lizu po g ćelijskog taloga. Talog je resuspendovan i homogenizovan dvadeset puta upotrebom uređaja Wheaton Dounce Homogenizer da bi se raskinule ćelijske membrane. Homogenizovani lizat je zatim propušten kroz mikrofluidizer emulsiflex-C5 na pritisku blizu 5000 PSI. Resuspendovani talog je centrifugiran na 36 000 obr/min (100000xg) u ultrabrzoj centrifugi sa rotorom 45Ti tokom 45 min na 4°C. Supernatant je uklonjen. Talog je zatim resuspendovan u puferu za pranje [(25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM MgCl2, 20 mM KCl, 1M NaCl (tableta sa kompletnim inhibitorom proteaza/50mL)] na zapreminu od 50 mL taloga/centrifugirki. Smeša talog/pufer za pranje je zatim homogenizovana, upotrebom staklenog homogenizera na ledu (20 ciklusa), praćenim centrifugiranjem na 36 000 obr/min 45 min na 4°C. Supernatant je uklonjen. Korak pranja je ponovljen još jednom. Rezultujuće membrane su resuspendovane u 20 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerola, proteaznih inhibitora bez EDTA (1 tableta/50 mL). Koncentracija proteina izmerena je Bradfordovim testom (Bio-Rad Protein Assay, kat br. 500-0006), i obogaćivanje proteinom određeno je metodom SDS-PAGE i potvrđeno Western blotom. Resuspendovane membrane su skladištene na -80°C.

Aminokiselinska sekvenca STING WT [STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8] cele dužine:

12

Sekvenca plazmida WTSTING [STING(1-379)H232R-gg-AviTag-gs-HRV3C-HIS8/pBAC1]cele dužine:

��

[0454] Određena jedinjenja otkrića ocenjena su u analizi in vitro vezivanja WT STING, kao što je opisano iznad. U sledećoj tabeli prikazani su biološki podaci za jedinjenja kao vrednosti EC50.

Tabela 7: Filtracioni test vezivanja<3>H-cGAMP za WT STING

12

Primer 57: Sekrecija IFN-β u ćelijskoj kulturi THP1 (5h)

[0455] Sposobnost jedinjenja da stimulišu sekreciju interferona-beta u ćelijama THP1 merena je upotrebom kompleta AlphaLISA za humani IFN-β (Perkin Elmer, kat. br. AL265F). Osnovni protokol je sledeći:

Akustični dozator Labcyte Echo 550 upotrebljen je za prenošenje 120 nL jedinjenja rastvorenog u DMSO u bunarčiće prazne, sterilne mikroploče sa 384 bunarčića, (Corning, kat. br. 3712). Ćelije THP1 (Američka kolekcija tipova kultura, kat br. TIB202) prethodno zamrznute u medijumu za oporavak (Life Technologies, kat br.12648-010) su odmrznute i odmah razblažene 10 puta u analitičkom medijumu (RPMI 1640 L-Glutamin i fenol crveno, Life Technologies, kat br.11875-085; 0.5% fetalnog goveđeg seruma inaktivisanog toplotom, Sigma Aldrich, kat br. F4135; 1 mM natrijum piruvata, Life Technologies, kat br. 11360-070; 1x neesencijalne aminokiseline; Life Technologies, kat br. 11140-050) na 37°C. Vijabilnost i brojnost ćelija ocenjene su upotrebom brojača ćelija Beckman Coulter V-Cell XR. Ćelijska suspenzija je centrifugirana na 200xg 5 min na rt. Ćelije su resuspendovane do gustine od 0.8x10<6>/mL u analitičkom medijumu na 37°C. Zatim su za prenošenje tečnosti upotrebljeni elektronska višekanalna pipeta Matrix ili automatizovana platforma za rukovanje tečnostima Agilent Bravo.

[0456] Analiza je započela raspoređivanjem 40 µL prethodno pripremljene ćelijske suspenzije u bunarčiće ploče koji sadrže jedinjenje. Posle 5h inkubacije na 37°C, 5% CO2u ovlaženoj atmosferi, ploča sa ćelijama i jedinjenjem je centrifugirana na 200xg 5 min na rt. Iz svakog bunarčića, 5µL supernatanta je preneto u odgovarajuće bunarčiće bele ploče sa 384 bunarčića (Perkin Elmer, kat br. 6005620). U ove bunarčiće koji sadrže supernatant dodato je 10 µL 5x akceptorskih perli sa antitelom protiv analita (50 µg/mL pufera AlphaLISA HiBlock) i inkubirano 30 min na rt uz mućkanje na orbitalnom šejkeru. U svaki bunarčić dodato je 10 µL 5x biotinilisanog antitela protiv analita (5 nM u puferu AlphaLISA HiBlock) i inkubirano na orbitalnom šejkeru 60 min na rt ili preko noći na 4°C. U svaki bunarčić dodato je 25µL 2x SA-donorskih perli (80µg/mL u puferu AlphaLISA HiBlock) i inkubirano 30-45 min na rt u mraku uz mućkanje na orbitalnom šejkeru. Ploča je zatim očitana pomoću Perkin Elmer Envision (λex=

12

680 nm, λem= 570 nm). Procenat dejstva signala AlphaLISA za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je na osnovu 30 uM cGAMP pozitivnih kontrola i 0.3% DMSO negativnih kontrola. Grafikon zavisnosti procenta aktivnosti od log koncentracije jedinjenja aproksimiran je pomoću 4-parametarske jednačine doza-odgovor za izračunavanje vrednosti EC50. Ispitivana jedinjenja su ispitivana na koncentracijama 30000, 10000, 3333, 1111, 370.4, 123.4, 41.2, 13.7, 4.6 i 1.5 nM sa 0.3% rezidualnog DMSO. Kontrolno jedinjenje, cGAMP ispitivano je na koncentracijama 100000, 33333, 11111, 3704, 1235, 412, 137, 46 i 15 nM sa 0.3% rezidualnog DMSO.

[0457] Jedinjenja otkrića su ocenjivana za sekreciju IFN-β u ćelijskoj kulturi THP1 kao što je opisano iznad. Sledeća tabela prikazuje biološke podatke za jedinjenja kao procenat aktivacije u odnosu na 2'3'-cGAMP pri koncentraciji od 30 µM.

Tabela 8: Sekrecija IFN-β u ćelijskoj kulturi THP1 (5h)

1

11

12

�

14

�

1

�

1

��

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule (Ia'):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time, što; R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila), SC1-C3alkila; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, C1-C3alkila, C1-C3haloalkila, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C2-C3alkenila, C2-C3alkinila, N(C1-C3alkila)2, NH(C1-C3alkila), SC1-C3alkila; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, C1-C4alkila i C1-C3haloalkila; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, F, Cl, OR<6>, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOR<6>,

SO2R<6>i C(O)N(R<9>)2, gde je svaki R<9>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, COOR<6>i SO2R<6>; svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, C1-C4alkila supstituisanog sa OH, C1-C4alkila supstituisanog OC1-C3alkilom i C3-C6cikloalkila, i gde opciono 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten; pri čemu kada X<1>-X<2>-X<3>predstavlja X<1>-CHR<8>CH2-X<3>, najmanje jedan od R<2>i R<3>nije odabran iz grupe koja se sastoji od halogena, OC1-C3alkila, OC1-C3haloalkila, OH, C1-C3alkila i C1-C3haloalkila.
2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time, što; R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C=CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C=CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i; svaki R<8>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i C1-C4alkila.
3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time, što; R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C=CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od Br, Cl, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2F, CH=CH2, C=CH, OH, OCH3, OCH2CH3, OCHF2, SCH3i NHCH3; R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i F; R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Cl; svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila; X<1>je C(O); X<2>je CHR<8>CHR<8>; X<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od COOH, COOC(CH3)3i

i; 2 R<8>uzeta zajedno, sa atomima za koje su vezani, formiraju 3- do 6-člani fuzionisani prsten.
4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od:

14

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time, što je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. Jedinjenje koje je:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od

i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog.
8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, koje je: 14
9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od
i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog. 10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 9, odabrano iz grupe koja se sastoji od
11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od
i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog. 12. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 11 koje je:
13. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od
i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog. 14. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 13 koje je:
15. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od 14
i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog. 16. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 15 koje je:
17. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, odabrano iz grupe koja se sastoji od
i farmaceutski prihvatljivih soli navedenog. 18. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 17 koje je:
19. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.
20. Farmaceutska kompozicija, gde navedena farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje kao što je definisano u bio kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
21. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju poremećaja ćelijske proliferacije.
22. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, naznačeno time, što je poremećaj ćelijske proliferacije kancer.
23. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20 za upotrebu u lečenju poremećaja ćelijske proliferacije. 14
24. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, naznačena time, što je poremećaj ćelijske proliferacije kancer.
25. Kombinacija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa.
26. Kombinacija prema patentnom zahtevu 25, naznačena time, što je navedeni jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa odabran iz grupe koja se sastoji od jedinjenja agonista STING, antivirusnih jedinjenja, antigena, adjuvanasa, antikancerskih agenasa, antagonista signalnih puteva CTLA-4, LAG-3 i PD-1, lipida, lipozoma, peptida, citotoksičnih agenasa, hemoterapijskih agenasa, imunomodulatornih ćelijskih linija, inhibitora kontrolnih tačaka, inhibitora receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), inhibitora topoizomeraze II, inhibitora receptora „smoothened“, alkilirajućih agenasa, antitumorskih antibiotika, antimetabolita, retinoida i imunomodulatornih agenasa, uključujući, ali bez ograničenja antikancerske vakcine.
27. Kombinacija prema patentnom zahtevu 25, naznačena time, što je dodatni aktivni agens pembrolizumab.
28. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 25 do 27, naznačena time, što se navedeno jedinjenje ili so i navedeni jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa primenjuju odvojeno. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1