RS60084B1 - Antitela anti-antigen 2 dendritske ćelije krvi i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Osnova

[0001] Antigen 2 dendritske ćelije krvi (BDCA2) je lektin C-tipa eksprimiran na humanim plazmocitoidnim dendritskim ćelijama (pDC) (Dzionek et al., J. Immunol., 165:6037-6046 (2000)), specijalizovanoj populaciji ćelija izvedenih iz kostne srži koje sekretuju interferone tipa I (IFN) kao odgovor na ligande toll-sličnog receptora (TLR). BDCA2 se sastoji od jednog vanćelijskog domena za prepoznavanje ugljenih hidrata (CRD), koji pripada tipu II grupe lektina C-tipa, na njegovom C-terminusu, transmembranskog regiona, i kratkog citoplazmatskog repa na njegovom N-terminusu koji ne sadrži signalni motiv. BDCA2 prenosi unutarćelijske signale preko pripadajućeg transmembranskog adaptera, FcεRIγ, i indukuje B ćelijskom receptoru (BCR)-sličnu signalnu kaskadu.

[0002] WO 01/036487 obezbeđuje antigen-vezujuće fragmente specifične za BDCA-2.

Sažetak

[0003] Ova objava se zasniva, bar delimično, na identifikaciji i karakterizaciji antitela koja se vezuju za BDCA2. Takva antitela mogu redukovati ili inhibirati sekreciju inflamatornih citokina i hemokina. Ovde opisana anti-BDCA2 antitela su takođe sposobna da uklone pDC pomoću ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) ili citotoksičnosti posredovane komplementom (CDC). Pored toga, ovde opisana anti-BDCA2 antitela mogu smanjiti nivoe CD32a i/ili CD62L na površini pDC-a. Osim toga, anti-BDCA2 antitela ove objave mogu posredovati u internalizaciji BDCA2 sa ćelijske površine pDC-a. Najmanje iz ovih razloga, ovde opisana anti-BDCA2 antitela su korisna u lečenju ili sprečavanju autoimunskih i inflamatornih stanja. Ova objava takođe pokazuje da anti-BDCA2 antitela opisana ovde mogu biti kombinovana sa antimalarijskim agensom za poboljšane efekte.

[0004] Na osnovu ovde sadržane objave, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje vezuje humani antigen 2 dendritske ćelije krvi (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), pri čemu antitelo sadrži varijabilni teški (VH) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24; i pri čemu antitelo sadrži varijabilni laki (VL) domen koji je identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 23.

[0005] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovani antigen-vezujući fragment koji vezuje humani antigen 2 dendritske ćelije krvi (BDCA2) (SEQ ID NO: 1), pri čemu antigenvezujući fragment sadrži varijabilni teški (VH) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24; i pri čemu antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni laki (VL) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 23.

[0006] Ovaj pronalazak i njegovi poželjni primeri izvođenja izneti su u priloženim patentnim zahtevima.

[0007] U nekim primerima izvođenja, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opciono dodatno sadrži ili se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet, od sledećih karakteristika: EC50(humani BDCA2) od 0,5 do 3 µg/mL ili 4 nM do 10 nM; EC50(BDCA2 cinomolgusa) od 0,5 do 3 µg/mL ili 5 nM do 10 nM; pI od 7 do 7,5; ne vezuje Clec4b2 pacova, ili vezuje Clec4b2 pacova sa nižim afinitetom vezivanja u odnosu na humani BDCA2, BDCA2 cinomolgusa ili rezusa; inhibira proizvodnju ili sekreciju hemokina kao što su MIP-1-α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10. U nekim primerima izvođenja, izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment ima EC50 (humani BDCA2) od 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, 5,0 nM, 5,1 nM, 5,2 nM, 5,3 nM, 5,4 nM, ili 5,5 nM. U posebnom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment ima EC50 (humani BDCA2) od 4,9 nM. U nekim primerima izvođenja, izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment ima EC50 (BDCA2 cinomolgusa) od 4,0 nM, 4,1 nM, 4,2 nM, 4,3 nM, 4,4 nM, 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM, ili 5,0 nM. U posebnom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment ima EC50 (BDCA2 cinomolgusa) od 4,4 nM. U određenim primerima izvođenja ovog aspekta, antitelo ima humani konstantni region teškog lanca i lakog lanca. U određenim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH1 domen i region zgloba. U nekim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH3 domen. Ukoliko konstantni region teškog lanca uključuje supstitucije, takve supstitucije modifikuju svojstva antitela (npr. povećavaju ili smanjuju jedno ili više od: vezivanje za Fc receptor, glikozilaciju antitela, broj cisteinskih ostataka, funkciju efektorske ćelije, ili funkciju komplementa). U određenim primerima izvođenja, antitelo je IgG antitelo. U posebnim primerima izvođenja, antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 7 do 15 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 10 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 11 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 12 μg/mL.

[0008] Ova antitela (i) vezuju humani BDCA2 ili BDCA2 cinomolgus majmuna, ali ne vezuju značajno BDCA2 iz vrsta filogenetski ispod primata; i/ili (ii) inhibiraju TLR7/TLR9-indukovani interferon tipa I i proizvodnju drugih citokina ili hemokina od strane humanih pDC; i/ili (iii) posreduju u internalizaciji BDCA2 sa površine pDC; i/ili (iv) smanjuju CD32a i/ili CD62L sa površine pDC-a; i/ili (v) uklanjaju pDC in vitro pomoću ADCC ili CDC. U nekim primerima izvođenja ovog aspekta, antitelo ima humani konstantni region teškog lanca i lakog lanca.

[0009] U određenim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ima humani konstantni region teškog lanca i lakog lanca. U određenim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH1 domen i region zgloba. U nekim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH3 domen. Ukoliko konstantni region teškog lanca uključuje supstitucije, takve supstitucije modifikuju svojstva antitela (npr. povećavaju ili smanjuju jedno ili više od: vezivanje za Fc receptor, glikozilaciju antitela, broj cisteinskih ostataka, funkciju efektorske ćelije, ili funkciju komplementa). U određenim primerima izvođenja, antitelo je IgG antitelo. U posebnim primerima izvođenja, antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 7 do 15 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 10 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 11 μg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 12 μg/mL.

[0010] U određenim primerima izvođenja, teški lanac sadrži ili se sastoji od amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 4. U naročitom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži ili se sastoji od teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 4 i lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 3. Ovi primeri izvođenja se odnose na sve gore navedene aspekte i njihove primere izvođenja. U određenim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je humanizovano antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je monoklonalno antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je antitelo sa jednim lancem. U drugim primerima izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment je Fabfragment, F(ab')2fragment, Fab'fragment, Fscfragment, Fvfragment, scFv, sc(Fv)2, ili diatelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca.

[0011] U svim gore navedenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dodatno: (i) inhibira sekreciju interferona tipa I i/ili interferona tipa III pored drugih citokina i hemokina iz plazmocitoidnih dendritskih ćelija; ili (ii) indukuje ili pojačava uklanjanje plazmocitoidnih dendritskih ćelija in vitro. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo snižava CD32a i/ili CD62L na pDC (u odnosu na pDC koja nije u kontaktu sa anti-BDCA2 antitelom). U određenim primerima izvođenja, antitelo posreduje u internalizaciji BDCA2 sa površine pDC-a. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se za BDCA2 cinomolgusa (SEQ ID NO: 72) i BDCA2 rezusa (SEQ ID NO: 72). U određenim primerima izvođenja gornjih aspekata, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira sekreciju ili proizvodnju interferona tipa I, interleukina-6 (IL-6), faktora nekroze tumora-α (TNF-α), interferona tipa III, makrofagnog inflamatornog proteina-1 (MIP-1)-α/CCL3, MIP-1β/CCL4, hemokina (C-C motiv) liganda 5 (CCL5/RANTES), ili proteina-10 indukovanog interferonom γ (IP-10/CXCL10). U određenim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment je humanizovano antitelo. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je monoklonalno antitelo. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je antitelo sa jednim lancem. U drugim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ili antigen-vezujući fragment je Fabfragment, F(ab')2fragment, Fab'fragment, Fscfragment, Fvfragment, scFv, sc(Fv)2, ili diatelo. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ima IgG2 konstantni region teškog lanca. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo ima IgG4 konstantni region teškog lanca. U nekim primerima izvođenja gornjih aspekata, antitelo je hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca.

[0012] U određenim primerima izvođenja, objava obezbeđuje izolovanu ćeliju koja proizvodi bilo koje od gore opisanih antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmenate.

[0013] U drugim primerima izvođenja, objava obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koje od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata formulisanih u kompoziciji koja sadrži 10-25 mM citrata, 100-200 mM natrijum hlorida, i pH od 5,5-6,5. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija opciono uključuje Tween-80 (0,01 do 0,3%, npr. 0,03%). U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koje od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata formulisanih u kompoziciji koja sadrži 20 mM natrijum citrata, 150 mM natrijum hlorida, i pH od 6,0.

[0014] U drugom aspektu, objava obezbeđuje postupak za pravljenje anti-BDCA2 antitela. Postupak uključuje obezbeđivanje ćelije koja sadrži teški lanac i/ili laki lanac BDCA2 antitela, inkubiranje ćelije pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju antitela i izolovanje antitela. Postupak opciono sadrži prečišćavanje antitela. U određenim primerima izvođenja, ćelija je CHO ćelija. U drugim primerima izvođenja ćelija je 293 ćelija. U naročitom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059. U jednom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži ili se sastoji od sekvence iznete u SEQ ID NO: 4, i laki lanac sadrži ili se sastoji od sekvence iznete u SEQ ID NO: 3.

[0015] U drugom slučaju, objava obezbeđuje postupak za otkrivanje prisutnosti plazmocitoidne dendritske ćelije u tkivu. Postupak sadrži dovođenje u kontakt tkiva sa anti-BDCA2 antitelom. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima sistemski eritemski lupus. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima sklerodermu. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima morfeu. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima reumatoidni artritis. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima psorijazu. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima dermatomiozitis. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima polimiozitis. U određenim slučajevima, tkivo je biopsija kože od subjekta koji ima inflamatornu bolest creva. U posebnim slučajevima, sistemski eritemski lupus je lupus kože, diskoidni lupus, ili lupus nefritis. Anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti obeležen, npr. fluoroforom (npr. Alexa Fluor 647). U drugim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059. U ostalim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo je klon 124B3.13 (Dendritics). U određenim slučajevima, postupak dodatno sadrži dovođenje u kontakt tkiva sa anti-CD123 antitelom.

[0016] U drugom slučaju, objava obezbeđuje postupak indukovanja smrti plazmocitoidne dendritske ćelije kod subjekta kome je to potrebno. Postupak uključuje primenu subjektu, ili dovođenje u kontakt plazmocitoidne dendritske ćelije koja eksprimira BDCA2, sa bilo kojim od antitela ili njihovim antigen-vezujućim fragmenatima opisanim ovde.

[0017] U drugom slučaju, objava ističe postupak redukovanja proizvodnje inflamatornih citokina ili hemokina od strane plazmocitoidne dendritske ćelije kod subjekta kome je to potrebno. Postupak sadrži primenu subjektu, ili dovođenje u kontakt plazmocitoidne dendritske ćelije koja eksprimira BDCA2, sa efikasnom količinom bilo kog od antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata opisanih ovde. U određenim slučajevima, inflamatorni citokini ili hemokini su odabrani iz grupe koja se sastoji od: interferona tipa I, IL-6, ili TNF-α, interferona tipa III, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, i IP-10/CXCL10.

[0018] U drugom slučaju, objava ističe postupak smanjivanja ekspresije CD32a na površini plazmocitoidne dendritske ćelije. Postupak sadrži dovođenje u kontakt plazmocitoidne dendritske ćelije sa ovde opisanim anti-BDCA2 antitelom. U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG2 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG4 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo je hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca. U određenim slučajevima, antitelo je aglikozilovano. U posebnim slučajevima, antitelo je aglikozilovani hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca.

[0019] U drugom slučaju, objava ističe postupak smanjivanja ekspresije CD32a (FcγRIIa) na površini plazmocitoidne dendritske ćelije kod humanog subjekta kome je to potrebno. Postupak sadrži primenu humanom subjektu efikasne količine anti-BDCA2 antitela koje je ovde opisano. U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG2 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG4 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo je hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca. U određenim slučajevima, antitelo je aglikozilovano. U posebnom slučaju, antitelo je aglikozilovani hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca.

[0020] U drugom slučaju, objava ističe postupak inhibiranja stimulacije plazmocitoidne dendritske ćelije imunskim kompleksima kod humanog subjekta kome je to potrebno. Postupak sadrži primenu humanom subjektu efikasne količine anti-BDCA2 antitela koje je ovde opisano. U nekim slučajevima, primena redukuje nivo CD32a na površini pDC-a. U nekim slučajevima, subjekt ima hipersenzitivnost tipa III. U jednom slučaju, humani subjekt ima SLE. U drugom slučaju, humani subjekt ima reumatoidni artritis. U još jednom slučaju, subjekt ima Sjogrenov (Sjögren's) sindrom. U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG2 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo ima IgG4 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo je hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca.

[0021] U drugom slučaju, objava ističe postupak smanjivanja ekspresije (ili oslobađanja) CD62L (L-selektina) na površini plazmocitoidne dendritske ćelije kod humanog subjekta kome je to potrebno. Postupak sadrži primenu humanom subjektu efikasne količine anti-BDCA2 antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde. U posebnim slučajevima, primena anti-BDCA2 antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta povećava nivo jedne ili više metaloproteinaza. U određenim slučajevima, smanjivanje CD62L nastaje isecanjem metaloproteinazom. U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo ima IgG1 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, od gore navedenih pet aspekata, antitelo ima IgG2 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima od gore navedenih pet aspekata, antitelo ima IgG4 konstantni region teškog lanca. U nekim slučajevima, od gore navedenih pet aspekata, antitelo je hibrid IgG1 i IgG4 konstantnih regiona teškog lanca.

[0022] U dodatnom aspektu, objava ističe bilo koje od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja kod subjekta kome je to potrebno. Postupak uključuje primenu subjektu kome je to potrebno efikasne količine bilo kog od anti-BDCA2 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, inflamatorni poremećaj je odabran iz grupe koja se sastoji od sistemskog eritemskog lupusa (SLE), lupusa kože, diskoidnog lupusa, lupus nefritisa, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, sistemske skleroze, morfee, psorijaze, dijabetesa tipa I, dermatomiozitisa, polimiozitisa, i Sjogrenove bolesti. U jednom naročitom primeru izvođenja, inflamatorni poremećaj je SLE. U drugom naročitom primeru izvođenja, inflamatorni poremećaj je diskoidni lupus. U još jednom naročitom primeru izvođenja, inflamatorni poremećaj je lupus nefritis. U drugom naročitom primeru izvođenja, inflamatorni poremećaj je lupus kože. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima opšti SLE. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima umeren SLE. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima umeren SLE bez teškog aktivnog zahvatanja CNS-a i/ili teškog aktivnog zahvatanja bubrega. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima umeren SLE sa teškim aktivnim zahvatanjem CNS-a i/ili teškim aktivnim zahvatanjem bubrega. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima kožne manifestacije SLE (npr. malarni ili diskoidni osip). U određenim primerima izvođenja, subjekt ima težak SLE. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima težak SLE bez teškog aktivnog zahvatanja CNS-a i/ili teškog aktivnog zahvatanja bubrega. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima težak SLE sa teškim aktivnim zahvatanjem CNS-a i/ili teškim aktivnim zahvatanjem bubrega. Umereni ili težak lupus je određivanje stadijuma lupusa (videti npr. Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42(9):1785-1795 (1999); Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437 (1996); Kalunian et al., Definition, classification, activity and damage indices. U: Dubois' lupus erythematosus. 5<th>ed., Baltimore: Williams and Wilkins; pp.19-30 (1997)).

[0023] U drugom aspektu, objava ističe bilo koje od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata za upotrebu u postupku lečenja autoimunske bolesti kod subjekta kome je to potrebno. Postupak podrazumeva primenu subjektu kome je to potrebno efikasne količine bilo kog od anti-BDCA2 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata opisanih ovde.

[0024] U bilo kom od gore navedenih aspekata koji se odnose na postupke, u određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek. U bilo kom od gore navedenih aspekata koji se odnose na postupke, u određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili antigen-vezujući fragment primenjuje se u kombinaciji sa najmanje jednim od: antimalarijalom (npr. hidroksihlorokin), inhibitorom signalizacije TLR7, inhibitorom signalizacije TLR9, ili kortikosteroidom. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo dodatno sadrži Fc region koji se vezuje za CD32a sa EC50 od najmanje oko 7 do 15 μg/mL (npr. 10, 11, 12 μg/mL). U posebnom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059.

[0025] U drugom aspektu, objava ističe kombinaciju koja sadrži antimalarijal (npr. hidroksihlorokin) i anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo dodatno sadrži Fc region koji se vezuje za CD32a sa EC50 od najmanje oko 7 do 15 μg/mL (npr. 9, 10, 11, 12, 13, 14 μg/mL). U posebnom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059.

[0026] U drugom aspektu, objava ističe kombinaciju koja sadrži inhibitor signalizacije TLR7 i/ili TLR9 i anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo dodatno sadrži Fc region koji se vezuje za CD32a sa EC50 od najmanje oko 7 do 15 μg/mL (npr. 10, 11, 12 μg/mL). U posebnom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059.

[0027] U dodatnom aspektu, objava ističe kombinaciju koja sadrži kortikosteroid i anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo dodatno sadrži Fc region koji se vezuje za CD32a sa EC50 od najmanje oko 7 do 15 μg/mL (npr.9, 10, 11, 12, 13, 14 μg/mL). U posebnom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059.

[0028] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje kao što ih uobičajeno razume prosečan stručnjak tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu upotrebljavati u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, primerni postupci i materijali opisani su u nastavku. U slučaju sukoba, predmetna prijava, uključujući definicije, će imati kontrolu. Materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

[0029] Druge odlike i prednosti pronalaska biće vidljive iz sledećeg detaljnog opisa, i iz patentnih zahteva.

Kratak opis crteža

[0030]

SL. 1 je šematski prikaz BDCA2 signalizacije u plazmocitoidnoj dendritskoj ćeliji (videti, Geijtenbeek et al., Nature Reviews Immunology, 9:465-479 (2009)).

SL. 2 je grafikon koji pokazuje hu24F4 Hx/L1 varijante koje se vezuju za humani BDCA2.

SL. 3 je grafikon koji pokazuje hu24F4 Hx/L1 varijante koje se vezuju za BDCA2 cinomolgusa.

SL. 4 je šematska mapa plazmida pJP009 koji kodira laki lanac anti-BDCA2. Sekvenca nukleinske kiseline lakog lanca anti-BDCA2 je pod transkripcionom kontrolom hCMV IE promotora i sekvenci za poliadenilaciju hGH. Gen za aminoglikozid fosfotransferazu (rezistencija na neomicin) je pod transkripcionom kontrolom promotora murinske fosfoglicerin kinaze (muPGK) i sekvenci za poliadenilaciju. Preostale sekvence, uključujući gen za beta-laktamazu su za propagaciju i selekciju u E. coli.

SL. 5 je šematska mapa plazmida pJP010 koji kodira teški lanac anti-BDCA2. Sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca anti-BDCA2 je pod transkripcionom kontrolom hCMV IE promotora i sekvenci za poliadenilaciju humanog rasta hGH. Gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr) je pod transkripcionom kontrolom SV40E promotora i sekvenci za poliadenilaciju. Preostale sekvence, uključujući gen za beta-laktamazu su za propagaciju i selekciju u E. coli.

SL. 6 je linijski grafikon koji pokazuje vezivanje BIIB059 na plazmocitoidnu dendritsku ćeliju cinomolgusa (A) i humanu (B) plazmocitoidnu dendritsku ćeliju. Puna

1

krv cinomolgus majmuna (A) ili humana (B) puna krv inkubirana je sa različitim koncentracijama Alexa647 obeleženog BIIB059 antitela (krugovi), ili humanog IgG izotipa (kvadrati) na ledu. Podaci su dobijeni upotrebom LSRII-4 kolor FACS mašine, i analizirani upotrebom FlowJo i GraphPad Prism softvera.

SL. 7 je linijski grafikon koji pokazuje rezultate AlphaScreen testa za samo-asocijaciju. Ključ: dijamant = BIIB059; kvadrat = 5c8; i trougao = LT105.

SL. 8 je linijski grafikon koji pokazuje rezultate diferencijalne skenirajuće fluorometrije za testiranje stabilnosti BIIB059 u različitim uslovima. Ovaj grafikon pokazuje podatke sa 150 mM natrijum hlorida i 250 mM saharoze kao funkcije pH.

SL. 9 je linijski grafikon koji pokazuje uticaj agitacije na agregaciju tokom vremena. Agregacija je potisnuta dodavanjem Tween 80.

SL. 10 je linijski grafikon koji pokazuje direktno vezivanje AC144 za površinski humani BDCA2 i BDCA2 cinomolgusa.

SL. 11 je serija grafikona koji pokazuju rezultate analize ekskluzione hromatografije Fc fuzionih proteina.

SL. 12 je grafikon koji pokazuje uticaj kalcijuma na vezivanje BIIB059 za BDCA2. Vezivanje BIIB059 za BDCA2 je pojačano dodavanjem kalcijuma u odnosu na EDTA dajući dvostruko viši signal.

SL. 13 je grafikon koji pokazuje rezultate Octet vezivanja BIIB059 za ektodomene humanog BDCA2 i BDCA2 cinomolgus majmuna.

SL. 14 je grafikon koji pokazuje da BIIB059 potentno inhibira IFNα iz PBMC-a stimulisanih TLR9 agonistom. Svaki simbol predstavlja IC50iz nezavisnog eksperimenta i vertikalne linije označavaju SEM.

SL. 15A-C obezbeđuju seriju grafikona koji pokazuju da BIIB059 potentno inhibira citokine i hemokine iz pune krvi stimulisane TLR9 ligandom. Sl. 15A pokazuje inhibiciju IFNα upotrebom heparinizovane venske krvi zdravih davalaca. Sl. 15B pokazuje inhibiciju IFNα upotrebom pune krvi dva SLE pacijenta (gornji panel) u poređenju sa rezultatima koji upotrebljavaju punu krv 2 zdrava davaoca (donji panel).

Sl. 15C obezbeđuje seriju bar grafikona koji pokazuju da je lečenje BIIB059 dovelo do inhibicije velikog niza citokina i hemokina.

SL. 16 je grafikon koji pokazuje da BIIB059 inhibira ekspresiju interferona tipa I.

SL. 17 uključuje dva linijska grafikona koja pokazuju da ligacija BDCA2 sa BIIB059 inhibira proizvodnju citokina indukovanu TLR9 u prečišćenim pDC.

SL. 18 je bar grafikon koji pokazuje da ligacija BDCA2 suprimira indukciju proizvodnje IFN-α kod pDC koje su stimulisane SLE serumom.

SL. 19A je linijski grafikon koji pokazuje da se BDCA2 internalizuje nakon ligacije sa BIIB059. Sl. 19B je linijski grafikon koji pokazuje da internalizacija ne utiče na BIIB059-posredovanu inhibiciju proizvodnje IFN-α.

SL. 20 je serija linijskih grafikona koji pokazuju vezivanje BIIB059 za Fcγ receptore.

SL. 21 obezbeđuje rezultate C1q ELISA koji pokazuju vezivanje humanog C1q za rastuće koncentracije (0-15 µg/mL) obloženih antitela.

SL. 22A-D su serija grafikona koji pokazuju da BIIB059 posreduje u ubijanju ćelije putem ADCC. Kao ciljna ćelija upotrebljena je CHO ćelijska linija (EAG2456 T1F2 klon 34.16.7). Nivo ekspresije BDCA2 na površini CHO ćelija je određen pomoću FACS upotrebom APC-obeleženog anti-BDCA2 mAb (klon AC144, Miltenyi). NK ćelije su upotrebljene kao efektorske ćelije. ADCC je procenjen upotrebom Vybrant kompleta za testiranje citotoksičnosti (Invitrogen), sledeći uputstva proizvođača. Test otkriva G6PD iz oštećenih ćelija na osnovu redukcije resazurina zavisne od G6PD koja emituje fluorescenciju na 590 nm nakon ekscitacije na 530 nm. ADCC test prikazan na SL. 22A je izveden upotrebom CHO ćelija sa visokom BDCA2 ekspresijom (SL. 22C) dok je ADCC test na SL. 22B upotrebljavao CHO ćelije sa nižom BDCA2 ekspresijom (SL. 22D).

SL. 23 je linijski grafikon koji pokazuje da BIIB059 posreduje u ubijanje ćelije putem CDC. CHO ćelije (EAG2456 T1F2 klon 34.16.7) su zasejane pri 5x 10<4>ćelija u bunariće kolagen crne ploče sa 96 bunarića i inkubirane na 37°C tokom 48 sati. Ploče su zatim isprane i inkubirane sa komplementom zečjeg seruma i propidijum jodidom (PI) u prisustvu efektorski kompetentnih anti-BDCA2 mAb (24F4S i BIIB059), mAb sa nedostatkom efektorske funkcije (24F4S-Agly i 24F4A-Agly) ili IgG1 izotip kontrolom tokom 1 sata na 37°C. Negativna kontrola sastojala se od bunarića koji sadrže CHO ćelije, komplement zečjeg seruma, PI, bez antitela.

SL. 24 je serija grafikona upotrebljenih za određivanje EC50 BIIB059 vezivanja ("direktno") i kompetitivnog BIIB059-A647 vezivanja ("indirektno") na pDC-ma cinomolgus majmuna. Pre in vivo injekcije BIIB059, krv je uzimana od dvanaest cinomolgus majmuna jednom nedeljno, u ukupnom trajanju od tri nedelje. Protočna citometrija upotrebljena je za određivanje EC50 vezivanja BIIB059 za BDCA2 na ćelijskoj površini pDC ("direktni" postupak), kao i količine dostupnog BDCA2 receptora dostupnog u prisustvu BIIB059 ("indirektni" postupak). Krv je inkubirana sa titracijom BIIB059 u šest tačaka u rasponu od 40-0,04 μg/mL. Protočnom citometrijom su identifikovane pDC kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa bilo antihumanim IgG PE obeleženim sekundarnim, ili BIIB059-A647 obeleženim pri 10 μg/mL. MFI PE (otvoreni simboli, predstavljeni grafičkim putem na levoj y-osi) ili A647 (zatvoreni simboli, predstavljeni grafičkim putem na desnoj y-osi) izračunat je u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera (fitovana četvoroparametarska kriva nelinearne regresije log transformisanih podataka). Ovde su pokazani reprezentativni grafikoni od četiri od dvanaest cinomolgus majmuna.

SL. 25 je reprezentativan grafikon koji predstavlja plato vezivanja anti-BDCA2 antitela BIIB059 za BDCA2 ćelijske površine na pDC u punoj krvi cinomolgus majmuna. Krv je inkubirana sa titracijom BIIB059 u šest tačaka u rasponu od 40-0,04 μg/mL. Protočnom citometrijom su identifikovane pDC kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa anti-humanim IgG PE obeleženim sekundarnim. MFI PE je izračunat u FlowJo softveru, i računat je procenat maksimalnog vezivanja, upotrebom 40 μg/mL tačke kao 100%. Svaka linija predstavlja jedanog pojedinačnog cinomolgus majmuna, za ukupno dvanaest cinomolgus majmuna, i predstavljena je grafičkim putem

1

upotrebom GraphPad Prism softvera (fitovana četvoroparametarska kriva nelinearne regresije log transformisanih podataka). Bojenje je ponavljano jednom nedeljno tokom ukupno tri nedelje. Isprekidane linije demonstriraju da koncentracija od 10 µg/mL BIIB059 zasićuje vezivanje BDCA2 receptora za sve cinomolgus majmune.

SL. 26A-C adresira nivoe bojenja vezanog BIIB059 i slobodnog BDCA2 na cinomolgus majmunima koji su tretirani nosačem. SL. 26A je serija FACS histograma koji pokazuju pozadinsko PE bojenje na cinomolgus majmunima koji su tretirani nosačem. Cinomolgus majmunima 1, 4 i 12 je primenjena jedna IV injekcija kontrole nosača (natrijum citrat) u vremenu 0. Posle 1 sata, uzimana je puna krv, i pDC su identifikovane protočnom citometrijom kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa anti-humanim IgG PE (otvoreni histogrami) ili FACS puferom kao PE fluorescencija minus jedna (FMO) kontrola (ispunjeni histogrami). SL. 26B je grafikon PE bojenja na pDC-u iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani nosačem u naznačenim vremenskim tačkama. MFI PE je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera. SL.26C je grafikon A647 bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani nosačem u naznačenim vremenskim tačkama. BIIB059-A647 pri 10 µg/mL dodat je uzorcima krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani nosačem u svakoj od naznačenih vremenskih tačaka, i testiran na A647 bojenje na pDC. MFI A647 je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera.

SL. 27A-C pokazuju da vezani BIIB059 i BDCA2 receptor više nisu dostupni na ćelijskoj površini pDC nakon jedne doze BIIB05910 mg/kg kod cinomolgus majmuna.

SL. 27A je serija FACS histograma koji pokazuju BIIB059 bojenje kod cinomolgus majmuna koji su tretirani sa 10 mg/kg BIIB059. Cinomolgus majmunima 3, 8 i 10 je primenjena jedna IV injekcija BIIB059 pri 10 mg/kg u vremenu 0. Posle 1 sata, uzimana je puna krv, i pDC su identifikovane kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa anti-humanim IgG PE (otvoreni histogrami) ili FACS puferom kao PE FMO kontrolom (ispunjeni histogrami). SL. 27B je grafikon PE bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. MFI PE je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera. SL.27C je grafikon A647 bojenja na pDCma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. BIIB059-A647 pri 10 µg/mL dodat je uzorcima krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u svakoj od naznačenih vremenskih tačaka, i testiran na A647 bojenje na pDC. MFI A647 je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera.

SL. 28A-C pokazuju da vezani BIIB059 i BDCA2 receptor više nisu dostupni na ćelijskoj površini pDC nakon jedne doze BIIB0591 mg/kg kod cinomolgus majmuna.

SL. 28A je serija FACS histograma koji pokazuju BIIB059 bojenje kod cinomolgus majmuna koji su tretirani sa 1 mg/kg BIIB059. Cinomolgus majmunima 3, 8 i 10 je primenjena jedna IV injekcija BIIB059 pri 1 mg/kg u vremenu 0. Posle 1 sata, uzimana je puna krv i pDC su identifikovane kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa anti-humanim IgG PE (otvoreni histogrami) ili FACS puferom kao PE FMO kontrolom (ispunjeni histogrami). SL. 28B je grafikon PE bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. MFI PE je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera. SL.28C je grafikon A647 bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. BIIB059-A647 pri 10 µg/mL dodat je uzorcima krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u svakoj od naznačenih vremenskih tačaka, i testiran na A647 bojenje na pDC. MFI A647 je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera.

SL. 29A-C pokazuju da vezani BIIB059 i BDCA2 receptor više nisu dostupni na ćelijskoj površini pDC nakon jedne subkutane (SC) doze BIIB059 0,2 mg/kg kod cinomolgus majmuna. SL. 29A je serija FACS histograma koji pokazuju BIIB059 bojenje kod cinomolgus majmuna koji su tretirani SC sa 0,2 mg/kg BIIB059. Cinomolgus majmunima 4, 6 i 12 primenjena je jedna SC injekcija BIIB059 pri 0,2 mg/kg u vremenu 0. Posle 1 sata, uzimana je puna krv, i pDC su identifikovane kao CD20-CD14-CD123<+>HLA-DR<+>, i tretirane sa anti-humanim IgG PE (otvoreni histogrami) ili FACS puferom kao PE FMO kontrolom (ispunjeni histogrami). SL. 29B je grafikon PE bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. MFI PE je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera. SL. 29C

1

je grafikon A647 bojenja na pDC-ma iz uzoraka krvi tri od cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u naznačenim vremenskim tačkama. BIIB059-A647 pri 10 µg/mL dodat je uzorcima krvi od tri cinomolgus majmuna koji su tretirani BIIB059 u svakoj od naznačenih vremenskih tačaka, i testiran na A647 bojenje na pDC. MFI A647 je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom GraphPad Prism softvera.

SL. 30 je serija grafikona koji pokazuju uočene PK/PD korelacije za cinomolgus majmune koji su primili BIIB059 IV pri 1 mg/kg, i cinomolgus majmune koji su primili BIIB059 IV pri 10 mg/kg. Za svaki grafikon na ovoj slici, koncentracija BIIB059 u serumu je prikazana na levoj y-osi (otvoreni simboli), i gustina BDCA2 receptora je prikazana na desnoj y-osi (ispunjeni simboli). Ubrzani klirens uočen kod cinomolgus majmuna 5 verovatno je posledica imunogenosti na BIIB059.

SL. 31 je serija grafikona koji pokazuju uočene PK/PD korelacije za cinomolgus majmune koji su primili BIIB059 SC pri 0,2 mg/kg. Za svaki grafikon na ovoj slici, koncentracija BIIB059 u serumu je prikazana na levoj y-osi (otvoreni simboli), i gustina BDCA2 receptora je prikazana na desnoj y-osi (ispunjeni simboli).

SL. 32 je serija bar grafikona koji pokazuju rezultate ELISA ili multipleks testova za merenje koncentracija inflamatornih citokina i hemokina proizvedenih od strane pDC-a koji su tretirane sa CpG-A, CpG-A u prisustvu anti-BDCA2, i CpG-A u prisustvu izotip kontrole. Svaki bar predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće od reprezentativnog zdravog humanog davaoca od 5 testiranih. Vertikalne linije prikazuju SD.

SL. 33 je serija bar grafikona koji pokazuju rezultate ELISA ili multipleks testova za merenje koncentracija inflamatornih citokina i hemokina proizvedenih od strane pDC-a koji su tretirane sa Sm/RNP imunskim kompleksima, Sm/RNP imunskim kompleksima u prisustvu anti-BDCA2, i Sm/RNP imunskim kompleksima u prisustvu izotip kontrole. Svaki bar predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće od reprezentativnog zdravog humanog davaoca od 5 testiranih. Vertikalne linije prikazuju SD.

1

SL. 34 je serija bar grafikona koji pokazuju rezultate qPCR testova za određivanje uticaja BIIB059 na transkripciju podtipova IFN tipa I u Sm/RNP IC stimulisanim pDC-ma zdravih humanih davalaca. Svaki bar predstavlja srednju relativno-struku promenu nabora za kvadruplikatne bunariće od reprezentativnog davaoca od tri testirana (n=3), a vertikalne linije prikazuju standardnu devijaciju (SD).

SL. 35A pokazuje BIIB059-posredovanu dozno zavisnu inhibiciju TLR9-indukovanog IFNα od strane PBMC od jednog reprezentativnog zdravog humanog davaoca od 18 testiranih. Svaki simbol predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće. SL. 35B pokazuje BIIB059-posredovanu dozno zavisnu inhibiciju TLR9-indukovanog IFNα od strane PBMC od jednog reprezentativnog SLE pacijenta od 11 testiranih. Svaki simbol predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće. SL. 35C pokazuje IC50 vrednosti za BIIB059 inhibiciju TLR9-indukovane proizvodnje IFNα od strane PBMC kod zdravih humanih davalaca (HD) u poređenju sa SLE pacijentima (SLE). Svaki simbol predstavlja pojedinačnog davaoca i vertikalne linije prikazuju SD.

SL. 36A pokazuje BIIB059-posredovanu dozno zavisnu inhibiciju TLR9-indukovanog IFNα iz jednog reprezentativnog testa pune krvi od 12 testiranih. Svaki simbol predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće. SL.

36B pokazuje IC50 vrednosti za BIIB059 inhibiciju TLR9-indukovane proizvodnje IFNα u testovima pune krvi u poređenju sa PBMC testovima. Svaki simbol predstavlja pojedinačnog davaoca i vertikalne linije prikazuju SD.

SL. 37 PBMC od zdravih humanih davalaca su stimulisane sa 1 μM TLR3 liganda (Poli I:C) i tretirane koncentracijama BIIB059 u rasponu od 10 μg/mL do 0,5 ng/mL u ukupnoj zapremini testiranja od 250 μL/bunariću na ploči sa 96 bunarića. Ploče su inkubirane preko noći (18 sati) na 37°C i 5% CO2.200 μL supernatanata je prikupljeno za procenu nivoa IFNα pomoću ELISA. Svaki simbol predstavlja prosečne nivoe IFNα proizvedene pri svakom stanju tretmana. Pokazani su podaci od dva nezavisna davaoca. Vertikalne linije prikazuju standardnu devijaciju (SD).

SL. 38A pokazuje dozno zavisnu BIIB059-posredovanu BDCA2 internalizaciju od reprezentativnog zdravog humanog davaoca. Krugovi predstavljaju MFI 2D6 bojenja

1

pri različitim dozama BIIB059. Trougao predstavlja MFI 2D6 u prisustvu izotip kontrole (maksimalno bojenje). Dijamant predstavlja MFI FMO kontrole (pozadinsko bojenje). SL.38B pokazuje EC50 BIIB059-indukovane BDCA2 internalizacije na pDC-ma u testovima pune krvi od zdravih humanih davalaca (zatvoreni krugovi; n=10 davalaca). Prosečna EC50 je bila 0,017±0,005 µg/mL.

SL. 39 je grafički prikaz srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) 2D6-FITC bojenja ograđenih CD14-CD20-HLA-DR+CD123+ pDC. Izotip (izo) predstavlja maksimalno bojenje, FMO (fluorescencija minus jedna kontrola) se sastoji od FACS koktela za bojenje minus 2D6-FITC što predstavlja pozadinsko bojenje. Na ovoj slici pokazan je reprezentativan eksperiment 4 izvedena nezavisna eksperimenta.

SL. 40 su konfokalne slike humanih pDC-a prečišćenih iz periferne krvi i zatim inkubiranih sa 10 μg/mL BIIB059-AF647 (belo) na 4°C (levo) ili na 37°C u 5% CO2 (desno) tokom 15 min. Distribucija BIIB059 ćelija procenjena je konfokalnom mikroskopijom, i pokazana je reprezentativna slika za svako stanje.

SL. 41 je grafički prikaz efekta internalizacije BDCA2 na inhibiciju proizvodnje IFNα. Ova slika je reprezentativna od 3 nezavisna eksperimenta.

SL. 42 je grafički prikaz koji pokazuje da EC50 vrednosti BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2 koreliraju sa IC50 vrednostima BIIB059-posredovane inhibicije TLR9-indukovanog IFNα u testovima pune krvi (n=10). R2 vrednost 0,57.

SL. 43A pokazuje rezultate izražene kao srednja vrednost i standardna devijacija (SD) Mandersovih koeficijenata kolokalizacije za TLR9 lokalizaciju u LAMP1+ kompartmentu. SL. 43B pokazuje rezultate izražene kao srednja vrednost i SD Mandersovih koeficijenata kolokalizacije za BIIB059/BDCA2 lokalizaciju u TLR9+ kompartmentu. SL. 43C pokazuje rezultate izražene kao srednja vrednost i SD Mandersovih koeficijenata kolokalizacije za BIIB059/BDCA2 lokalizaciju u LAMP1+ kompartmentu. Svaki simbol predstavlja pojedinačnu ćeliju; horizontalne linije predstavljaju srednju vrednost, vertikalne linije predstavljaju SD.

1

SL. 44A je histogram iz reprezentativnog eksperimenta pune krvi tretirane sa 10 µg/mL BIIB059 (zatamnjen histogram), 10 µg/mL izotip kontrole (isprekidana linija) ili punom krvlju koja je stimulisana TLR9 ligandom, CpG-A (puna linija). SL. 44B je grafički prikaz efekta BIIB059 tretmana pune krvi koji je rezultirao oslobađanjem CD62L (zatvoreni kvadrati). Otvoreni kvadrat predstavlja izotip tretman (10 µg/mL). Ova slika je reprezentativna od 3 nezavisna eksperimenta.

SL. 45 je grafički prikaz površinske ekspresije CD62L testirane protočnom citometrijom. Ekspresija CD62L je izmerena u prisustvu samo BIIB059, i sa rastućim koncentracijama GM6001 (krugovi). Otvoreni kvadrat predstavlja kontrolu tretiranu izotipom (10 µg/mL). Obrnuti trougao predstavlja DMSO kontrolu tretiranu BIIB059. Ova slika je reprezentativna od 2 nezavisna eksperimenta.

SL. 46A je grafički prikaz BIIB059 i 24F4A-Agly-posredovane dozno zavisne internalizacije BDCA2 na površini pDC-a od jednog reprezentativnog zdravog humanog davaoca (n=5). pDC-e od zdravih humanih davalaca izolovane su upotrebom dvostepene procedure odvajanja pomoću magnetnih perli (MACS komplet, Miltenyi Biotec). pDC-e su tretirane sa rastućim koncentracijama BIIB059 (krugovi) ili aglikozilovanog oblika antitela-24F4-Agly (kvadrati). Ćelije su takođe tretirane sa 10 μg/mL izotip kontrole (trougao) i inkubirane tokom 16 sati na 37°C. pDC-e su zatim obojene za površinsku ekspresiju BDCA2 i CD32. SL. 46B je histogram koji pokazuje nivoe CD32 na izolovanim pDC-ma koje su tretirane sa 10 µg/mL BIIB059 (osenčeno) ili izotip kontrolom (tačkano) (n=5). SL. 46C je histogram koji pokazuje nivoe CD32 na izolovanim pDC-ma koje su tretirane sa 10 µg/mL a-glikozilovanog oblika-24F4-A (osenčeno) ili izotip kontrolom (tačkano). Puna linija predstavlja neobojene ćelije (n=5).

SL. 46D je grafički prikaz BIIB059-posredovane dozno zavisne smanjene modulacije CD32 na površini pDC-a od jednog reprezentativnog zdravog humanog davaoca (n=5).

SL. 46E je histogram koji pokazuje nivoe CD32 na izolovanim pDC-ma koje su tretirane tokom 1 sata na 4°C u prisustvu 10 µg/mL BIIB059 (osenčeno), aglikozilovanog oblika (isprekidano), ili izotip kontrole (tačkano). Nakon inkubacije pDC-e su procenjene za površinsku ekspresiju CD32. Puna crna linija predstavlja neobojene ćelije (n=3). SL. 46F je histogram koji pokazuje nivoe CD32 na izolovanim pDC-ma koje su tretirane tokom 1 sata na 37°C u prisustvu 10 µg/mL BIIB059 (osenčeno), a-glikozilovanog oblika (isprekidano), ili izotip kontrole (tačkano). Nakon

1

inkubacije pDC-e su procenjene za površinsku ekspresiju CD32. Puna crna linija predstavlja neobojene ćelije (n=3).

SL. 47A je grafički prikaz nivoa IFNα iz izolovanih pDC-a koje su tretirane sa rastućim koncentracijama BIIB059 (kvadrati), rastućim koncentracijama a-glikozilovanog oblika antitela 24F4-A (krugovi) ili izotip kontrolom pri 10 µg/mL (trougao). pDC-e su stimulisane u prisustvu CpG-A (75 µg/mL) ili ostavljene nestimulisane (obrnuti trougao). pDC-e su inkubirane tokom 16 sati na 37°C i supernatanti su sakupljeni i testirani na IFNα pomoću ELISA. Pokazan je reprezentativni eksperiment od dva sprovedena. SL. 47B je grafički prikaz nivoa IFNα iz izolovanih pDC-a koje su tretirane sa rastućim koncentracijama BIIB059 (kvadrati), rastućim koncentracijama aglikozilovanog oblika antitela 24F4-A (krugovi), izotip kontrolom pri 10 µg/mL (trougao), ili anti-humanim CD32 mAb pri 10 µg/mL. Sm/RNP imunski kompleksi (IC) su pred-formirani mešanjem Sm-RNP iz timusa teleta i anti-RNP antitela prečišćenih iz seruma SLE pacijenata tokom 30 minuta u medijumu bez seruma. Izolovane ćelije su stimulisane sa imunskim kompleksima ili tretirane samo sa antigenom (nestimulisane). Ćelije su inkubirane tokom 16 sati na 37°C, i supernatanti su sakupljeni i testirani na IFNα pomoću ELISA. Pokazana je reprezentativna slika od 3 sprovedena. Svaki simbol predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju (SD) za duplikatne bunariće.

SL. 48A je bar grafikon koji pokazuje ekspresiju CD32 na izolovanim pDC-ma koje su tretirane sa imunskim kompleksima u prisustvu 10 µg/mL BIIB059, 24F4-A, anti CD32 mAb (klon AT10), humanizovanog anti CD40 antitela, ili izotip kontrole. Ćelije su inkubirane tokom 16 sati na 37°C. pDC su obojene za površinsku ekspresiju CD32 i CD40. SL. 48B je bar grafikon koji pokazuje nivoe IFNα izmerene pomoću ELISA u supernatantima prikupljenim od A. Pokazana je reprezentativna slika (n=3). SL. 48C je histogram koji pokazuje ekspresiju CD40 na površini pDC-a. Tačkasta linija predstavlja ekspresiju CD40 na ćelijskoj površini. Zatamnjen histogram predstavlja nivoe CD40 na pDC nakon tretmana sa anti-CD40 antitelom. Puna linija predstavlja neobojene ćelije.

SL. 49 prikazuje uticaj HCQ na potentnost BIIB059. Svaki simbol predstavlja koncentracije IFNα izmerene od pojedinačnog zdravog humanog davaoca, a vertikalne linije prikazuju SD. PBMC od zdravih humanih davalaca su tretirane različitim koncentracijama samo BIIB059, samo HCQ ili u kombinaciji (BIIB059+HCQ) u

2

ukupnoj testnoj zapremini od 250 μL/bunariću. Koncentracije BIIB059 bile su u rasponu od 10 μg/mL do 0,1 ng/mL. Koncentracije HCQ bile su u rasponu od 10 μM do 156 nM. 1x10<6>PBMC ćelija/bunariću je stimulisano sa 5 μM TLR7 liganda (R848). Ploče koje sadrže PBMC inkubirane se preko noći (18 sati) na 37°C i 5% CO2. 200 μL supernatanata je sakupljeno za procenu u IFNα ELISA (PBL InterferonSource).

SL. 50 prikazuje uticaj HCQ na potentnost BIIB059. Svaki simbol predstavlja koncentracije IFNα izmerene od reprezentativnog davaoca od 2 testirana zdrava davaoca i vertikalne linije prikazuju standardnu devijaciju (SD). PBMC iz heparinizovane venske krvi zdravih humanih davalaca ili SLE pacijenata su izolovane centrifugiranjem na diskontinuiranom gradijentu preko Ficoll-a, isprane u PBS i resuspendovane u kompletnom medijumu za kulturu (RPMI sa 3% FBS). PBMC su tretirane sa različitim koncentracijama samo BIIB059, samo HCQ ili u kombinaciji (BIIB059 HCQ) u ukupnoj testnoj zapremini od 250 μL/bunariću. Koncentracije BIIB059 bile su u rasponu od 10 μg/mL do 0,1 ng/mL. Koncentracije HCQ bile su u rasponu od 10 μM do 156 nM. 1x106 PBMC ćelija/bunariću je stimulisano sa 1 μM TLR9 liganda (CPG-A). Ploče koje sadrže PBMC inkubirane su preko noći (18 sati) na 37°C i 5% CO2. 200 μL supernatanata je sakupljeno za procenu u IFNα ELISA (PBL InterferonSource).

SL. 51 pokazuje raspodele procenta cirkulišuće pDC u punoj krvi zdravog cinomolgus majmuna, na izvornoj skali (levi panel) i na log skali (desni panel). Puna krv je uzimana iz dvanaest cinomolgus majmuna jednom nedeljno, tokom ukupno četiri nedelje. pDC su identifikovane upotrebom protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. pDC kao procenat CD20-CD14- ćelija izračunat je FlowJo softverom. Grafikon je dobijen upotrebom R jezika za statističko računanje.

SL. 52 je grafički prikaz procenta cirkulišuće pDC (na log skali) u punoj krvi zdravog cinomolgus majmuna u različitim vremenskim tačkama pre IV injektiranja BIIB059. U naznačenim vremenskim tačkama, puna krv je uzeta, i pDC su identifikovane pomoću protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Procenat pDC je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom R softvera.

SL. 53 je prikaz konačnog fitovanog modela za procenat cirkulišuće pDC (na log skali) u punoj krvi zdravog cinomolgus majmuna u različitim vremenskim tačkama pre IV injektiranja BIIB059. Model linearnih mešovitih efekata za vrednosti log (% pDC) sa različitim vremenskim tačkama kao fiksnim faktorima i cinosima kao slučajnim presretanjima ne pokazuje razlike među odnosima geometrijske srednje vrednosti % pDC izmerenih sa nedeljama razlike (p-vrednost zasnovana na F-testu za sve vremenske efekte jednakim nuli je 0,67). Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom R jezika za statističko računanje. Crna linija pokazuje konačni fitovani model, koji uključuje samo fiksno presretanje i slučajna presretanja za cinomolgus majmune. Lme4 paket u R upotrebljen je za fitovanje modela linearnih mešovitih efekata.

SL. 54 prikazuje procenat cirkulišuće pDC na log skali pre i posle IV doze natrijum citrat nosača, BIIB0591 mg/kg ili BIIB05910 mg/kg kod cinomolgus majmuna. Svaka dozna grupa je primenjena na tri cinomolgus majmuna u vremenu 0. U naznačenim vremenskim tačkama, uzeta je puna , i pDC su identifikovane pomoću protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Procenat pDC je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem upotrebom R softvera.

SL. 55 prikazuje konačni fitovani model za procenat cirkulišuće pDC na log skali pre i posle IV doze natrijum citrat nosača, BIIB059 1 mg/kg i BIIB059 10 mg/kg kod cinomolgus majmuna. Model linearnih mešovitih efekata za vrednosti log (% pDC) sa fiksnim faktorima za doznu grupu, vremenski nivoi 1 sat, 6 sati i više od 28 dana, i sa slučajnim presretanjem za cinomolgus majmune. Puna linija pokazuje fitovani model. Lme4 paket u R upotrebljen je za fitovanje modelu linearnih mešovitih efekata. Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom R jezika za statističko računanje.

SL. 56 pokazuje procenat cirkulišuće pDC posle SC doze BIIB059 0,2 mg/kg kod cinomolgus majmuna. Cinomolgus majmunima 4, 6 i 12 primenjena je jedna SC injekcija BIIB059 0,2 mg/kg u vremenu 0. Od tri cinomolgus majmuna, cinomolgus majmun 6 doziran je sa BIIB059 mg/kg u prethodnoj studiji. Cinomolgus majmuni 4 i 12 dozirani su sa nosačem u prethodnoj studiji. U naznačenim vremenskim tačkama, uzeta je puna krv, i pDC su identifikovane pomoću protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. Procenat pDC je izračunat u FlowJo softveru, i predstavljen grafičkim putem pomoću R softvera.

SL. 57 prikazuje konačni fitovani model za procenat cirkulišuće pDC posle SC doze BIIB059 0,2 mg/kg kod cinomolgus majmuna. Model linearnih mešovitih efekata je fitovan za vrednosti log (% pDC) sa fiksnim efektima za kontinuirano vreme i vreme od 1 sata, i sa cinomolgus majmunima kao slučajnim presretanjima. Puna linija pokazuje fitovani model. Lme4 paket u R upotrebljen je za fitovanje modelu linearnih mešovitih efekata. Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom R jezika za statističko računanje.

SL. 58 je šematsko predstavljanje eksperimentalnog dizajna PK/PD cinomolgus majmuna. Devet cinomolgus majmuna završilo je intravensku (IV) doznu studiju. Cinomolgus majmunima je uzeta krv pre i posle IV primene nosača, 1 mg/kg BIIB059, ili 10 mg/kg BIIB059 u skladu sa pokazanim rasporedom uzimanja krvi. Nakon završetka ove studije, 3 cinomolgus majmuna upućeni su da završe subkutanu (SC) doznu studiju, gde su primili jednu SC injekciju od 0,2 mg/kg BIIB059. U svakoj vremenskoj tački uzimanja krvi, izveden je test pune krvi u kome je puna krv cinomolgus majmuna razblažena 1: 4 sa kompletnim RPMI 1640 i stimulisana sa CPG-A do krajnje koncentracije od 200 μg/ml u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarića zaobljenog dna i inkubirana na 37°C, 5% CO2, tokom 18-20 sati. Na kraju kulture, stimulisana puna krv je centrifugirana da bi se dobio serum. U MxA biotestu, A549 ćelije su stimulisane dobijenim serumom tokom 19-20 sati, na 37°C, 5% CO2, da bi se indukovao MxA protein. Posle 20 sati, A549 ćelije su lizirane i izvedena je sendvič ELISA kako bi se detektovale koncentracije MxA proteina. Nivoi IFNα (jedinice/mL) su izračunati unazad na osnovu standardne krive stvorene tretiranjem A549 ćelija sa rastućim dozama rIFNα.

SL. 59 je grafičko predstavljanje trenda prema redukovanoj TLR9-indukovanoj proizvodnji IFNα kod cinomolgus majmuna koji primaju jednu intravensku dozu BIIB059 u odnosu na proseke pred-tretmana. Puna krv od cinomolgus majmuna koji su tretirani sa jednom intravenskom dozom nosača, 1 mg/kg BIIB059, ili 10 mg/kg BIIB059 razblažena je 1: 4 sa kompletnim RPMI 1640 i stimulisana sa CPG-A (2216) do krajnje koncentracije od 200 µg/ml u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarića zaobljenog dna i inkubirana na 37°C, 5% CO2 tokom 18-20 sati. Na kraju kulture, stimulisana puna krv je centrifugirana da bi se dobio serum. A549 ćelije su stimulisane

2

sa dobijenim serumom tokom 19-20 sati, na 37°C, 5% CO2, da bi se indukovao MxA protein. Posle 20 sati, A549 ćelije su lizirane i izvedena je sendvič ELISA kako bi se detektovale koncentracije MxA proteina. Nivoi IFNα (jedinice/mL) su izračunati unazad na osnovu standardne krive generisane tretiranjem A549 ćelija sa rastućim dozama rIFNα. Srednja vrednost koncentracije IFNα pre uzimanja krvi je izračunata za svakog majmuna svođenjem na prosek svih IFNα merenja iz vremenskih tačaka pre uzimanja krvi (Dani -21, -14, -7 i T0). Zatim je izračunat % IFNα za svaku vremensku tačku uzimanja krvi nakon primene BIIB059 do dana 14 deljenjem koncentracije IFNα u to vreme sa prosekom pred-uzimanja krvi za tu životinju i množenjem sa 100. Te vrednosti su zatim svedene na prosek za svaku grupu tretmana. Grafikon prikazuje srednju vrednost ± standardnu grešku srednje vrednosti. Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom Excel i GraphPad 6.0 softvera (GraphPad, San Diego, CA).

SL. 60 je grafički prikaz smanjene TLR9-indukovane proizvodnje IFNα u ex vivo testu pune krvi od cinomolgus majmuna koji su intravenski tretirani sa BIIB059. Puna krv od cinomolgus majmuna koji su tretirani sa jednom intravenskom dozom nosača (gornji panel), 1 mg/kg BIIB059 (srednji panel), ili 10 mg/kg BIIB059 (donji panel) razblažena je 1: 4 sa kompletnim RPMI 1640 i stimulisana sa CPG-A (2216) do krajnje koncentracije od 200 µg/ml u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarića zaobljenog dna i inkubirana na 37°C, 5% CO2 tokom 18-20 sati. Na kraju kulture, stimulisana puna krv je centrifugirana da bi se dobio serum. A549 ćelije su stimulisane sa dobijenim serumom tokom 19-20 sati, na 37°C, 5% CO2, da bi se indukovao MxA protein. Posle 20 sati, A549 ćelije su lizirane i izvedena je sendvič ELISA kako bi se detektovale koncentracije MxA proteina. Nivoi IFNα (jedinice/mL) su izračunati unazad na osnovu standardne krive generisane tretiranjem A549 ćelija sa rastućim dozama rIFNα. Dvofaktorska analiza varijanse (ANOVA) mešanih efekata bila je prikladna za log10 vrednosti izračunatih koncentracija IFNα. IFNα vrednosti su nacrtane (na log10 skali) naspram dana uzimanja krvi za svaku životinju unutar svake dozne grupe. Vertikalne linije označavaju grupisanje dana uzimanja krvi u pre doze, posle doze do dana 31, i posle doze više od dana 31. Kasniji dani uzimanja krvi od dana 31 nisu upotrebljeni u analizi. Procene zasnovane na modelu geometrijskih srednjih vrednosti IFNα vrednosti su predstavljene debelim crnim horizontalnim linijama unutar regiona pre i posle doze svakog panela. Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom R jezika za statističko računanje.

SL. 61 je grafički prikaz smanjene TLR9-indukovane proizvodnje IFNα u ex vivo testu pune krvi od cinomolgus majmuna koji su subkutano tretirani sa BIIB059. Puna krv od cinomolgus majmuna koji su tretirani sa jednom subkutanom dozom od 0,2 mg/kg BIIB059 razblažena je 1: 4 sa kompletnim RPMI 1640 i stimulisana sa CPG-A (2216) do krajnje koncentracije od 200 µg/ml u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarića zaobljenog dna i inkubirana na 37°C, 5% CO2 tokom 18-20 sati. Na kraju kulture, stimulisana puna krv je centrifugirana da bi se dobio serum. A549 ćelije su stimulisane sa dobijenim serumom tokom 19-20 sati, na 37°C, 5% CO2, da bi se indukovao MxA protein. Posle 20 sati, A549 ćelije su lizirane i izvedena je sendvič ELISA kako bi se detektovale koncentracije MxA proteina. Nivoi IFNα (jedinice/mL) su izračunati unazad na osnovu standardne krive generisane tretiranjem A549 ćelija sa rastućim dozama rIFNα. Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) sa nasumičnim efektima bila je prikladna za log10 vrednosti izračunatih koncentracija IFNα. IFNα vrednosti su plotirane (na log10 skali) naspram dana uzimanja krvi za svaku životinju. Vertikalne linije označavaju grupisanje dana uzimanja krvi u pre doze, posle doze do 33 dana, i posle doze više od 33 dana. Kasniji dani uzimanja krvi od dana 33 nisu upotrebljeni u analizi. Procene zasnovane na modelu geometrijskih srednjih vrednosti IFNα vrednosti su predstavljene debelim crnim horizontalnim linijama unutar regiona pre i posle doze svakog panela. Grafička i statistička analiza izračunate su upotrebom R jezika za statističko računanje.

Detaljan opis

[0031] BIIB059 je primerno monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za humani BDCA2. Ovde opisana anti-BDCA2 antitela inhibiraju pDC proizvodnju i/ili sekreciju inflamatornih citokina i hemokina. Pored toga, ovde opisana anti-BDCA2 antitela mogu smanjiti nivoe CD32a i/ili CD62L na površini pDC-a. Takođe, anti-BDCA2 antitela ove objave mogu posredovati u internalizaciji BDCA2 sa površine pDC. Pored toga, ovde opisana anti-BDCA2 antitela mogu se upotrebljavati da uklone pDC pomoću ADCC ili CDC i mogu se upotrebljavati za lečenje ili sprečavanje imunskih poremećaja kao što su inflamatorna i autoimunska stanja. Ova objava takođe pokazuje da kombinovanje antimalarijala sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde može dati bolje efekte u poređenju sa lečenjem sa bilo kojim sredstvom samostalno.

2

BDCA2

[0032] BDCA2 je lektin C-tipa tipa II koji se specifičnoi eksprimira na pDC. BDCA2 se sastoji od jednog vanćelijskog domena za prepoznavanje ugljenih hidrata (CRD) na njegovom C-terminusu, transmembranskog regiona, i kratkog citoplazmatskog repa na njegovom N-terminusu koji ne sadrži signalni motiv. BDCA2 prenosi unutarćelijske signale preko pripadajućeg transmembranskog adaptera, FcεRIγ (videti Sliku 1). Ligacija BDCA2 posredovana antitelom dovodi do regrutovanja tirozin kinaze slezine (SYK) do fosforiliranog imunoreceptorskog aktivacionog motiva na bazi tirozina (ITAM) na FcεRIγ. Syk aktivacija dovodi do aktivacije B ćelijskog linkera (Blnk), Bruton-ove tirozin kinaze (BTK), i fosfolipaze Cγ2 (PLCγ2), što dovodi do Ca2<+>mobilizacije.

[0033] Amino-kiselinska sekvenca humanog BDCA2 proteina (Genbank pristupni br. NP_569708.1) pokazana je ispod (transmembranski domen je u kurzivu; ektodomen je podvučen).

Amino-kiselinska sekvenca humanog FcεRIγ (Genbank pristupni br. NP_004097.1) pokazana je ispod.

[0034] Najbliži pacovski BDCA2 homolog, pacovski Clec4b2 (Genbank pristupni br. NM_001005896), deli samo 51,0% identičnosti sa humanim BDCA2. Nasuprot tome, BDCA2 cinomolgus i rezus majmuna dele 90,6% identičnosti sa humanim BDCA2. Pored toga, FcεRIγ proteinska sekvenca cinomolgus i rezus majmuna, koje su identične jedna sa drugom, dele 98,9% identičnosti sa humanim FcεRIγ proteinom.

[0035] Proteini humanog BDCA2, BDCA2 cinomolgus i rezus majmuna mogu se upotrebljavati kao imunogeni za pripremu anti-BDCA2 antitela. Za pripremu humanih anti-

2

BDCA2 antitela, humani BDCA2 protein može se upotrebljavati kao imunogen. Anti-humana BDCA2 antitela mogu se zatim pregledati kako bi se identifikovala antitela koja imaju jednu ili više karakteristika ovde opisanih (npr. redukovanje proizvodnje/sekrecije jednog ili više od interferona tipa I ili tipa III, IL-6, TNF-α, MIP-1-α, MIP-1β, CCL5, i IP-10/CXCL10; uklanjanje pDC; kompeticija za vezivanje za vanćelijski domen BDCA2 sa BIIB059; selektivno vezivanje ektodomena humanog BDCA2, BDCA2 cinomolgusa i rezusa, ali ne vezivanje Clec4b2 pacova; inhibicija razvoja bolesti u humanom psorijatičnom modelu ksenografta).

Anti-BDCA2 antitela

[0036] Ova objava uključuje sekvence monoklonalnog antitela, BIIB059, koje se vezuje za humani BDCA2, BDCA2 cinomolgusa i rezusa, ali ne i za Clec4b2 pacova. BIIB059 se ne vezuje ili ne pokazuje značajno vezivanje za BDCA2 poreklom od vrsta filogenetski ispod primata.

BIIB059

[0037] BIIB059 je humanizovano IgG1 antitelo koje specifično prepoznaje BDCA2 na površini plazmocitoidnih dendritskih ćelija. Ono je izvedeno iz antitela murina (24F4) koje vezuje BDCA2 na sledeći način. Plazmid koji kodira humani BDCA2 pune dužine injektiran je u miševe genskim pištoljem. Splenociti ovog miša fuzionisani su sa ćelijama mijeloma i rezultujući hibridom je proizveo antitelo 24F4. Antitelo 24F4 je konstruisano u region okvira humanog IgG1 divljeg tipa da bi se održala puna efektorska funkcija. Predviđene aminokiselinske sekvence zrelog teškog i lakog lanca BIIB059 pokazane su ispod. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) 1, 2, i 3 varijabilnog lakog lanca (VL) i varijabilnog teškog lanca (VH) pokazani su tim redom od N do C-terminusa zrelih VL i VH sekvenci i podvučeni su i podebljani. Antitelo koje se sastoji od zrelog teškog lanca (SEQ ID NO: 4) i zrelog lakog lanca (SEQ ID NO: 3) koji su navedeni ispod naziva se BIIB059.

Zreli laki lanac (LC) BIIB059

2

Varijabilni laki lanac (VL) BIIB059 ima sledeću amino-kiselinsku sekvencu:

Varijabilni teški lanac (VH) BIIB059 ima sledeću amino-kiselinsku sekvencu:

Amino-kiselinske sekvence VL CDR-a BII059 su navedene ispod:

VL CDR1: KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 5);

VL CDR2: AASTLES (SEQ ID NO: 6); i

VL CDR3: QQANEDPRT (SEQ ID NO: 7).

Amino-kiselinske sekvence VH CDR-a BII059 su navedene ispod:

VH CDR1: TYTMS (SEQ ID NO: 8) (Kabat CDR1) ili GFTFSTYTMS (SEQ ID NO: 9) (unapređena Chothia/AbM CDR1); VH CDR2: TISPGDSFGYYYPDSVQG (SEQ ID NO: 10);

VH CDR3: DIYYNYGAWFAY (SEQ ID NO: 11)

2

[0038] Kao što je navedeno iznad, unapređena Chothia/AbM CDR definicija VH CDR1 je 5 amino-kiselina duža od Kabat definicije ovog CDR-a. Pet dodatnih amino-kiselina unapređene Chothia/AbM VH CDR1 su GFTFS (SEQ ID NO: 12).

[0039] Anti-BDCA2 antitela ove objave mogu takođe sadržati "alternativne CDR-ove" BIIB059. Pod "alternativnim" CDR-ima podrazumevaju se CDR-i (CDR1, CDR2, i CDR3) definisani u skladu sa bilo kojom od Chothia od Abysis, unapređenim Chothia/AbM CDR, ili definicijom kontakta. Ovi alternativni CDR-i mogu se dobiti, npr. upotrebom baze podataka AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi). Amino-kiselinske sekvence "alternativnih" CDR-a 1, 2, i 3 varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca BIIB059 se upoređuju sa CDR-ima definisanim u skladu sa Kabatom u Tabeli ispod.

[0040] Anti-BDCA2 antitela mogu da obuhvate CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i lakog lanca u skladu sa Kabat definicijom, Chothia od Abysis definicijom, unapređenom Chothia/AbM CDR definicijom, ili definicijom kontakta. Ova antitela mogu imati, na primer,

2

1, 2 ili 3 supstitucije unutar jednog ili više (tj.1, 2, 3, 4, 5 ili 6) CDR-a. Ova antitela (i) vezuju humani BDCA2 ili BDCA2 cinomolgus majmuna, ali ne vezuju značajno BDCA2 vrsta filogenetski ispod primata; i/ili (ii) inhibiraju TLR7/TLR9-indukovanu proizvodnju interferona tipa I i drugih citokina ili hemokina od strane humanih pDC; i/ili (iii) posreduju u internalizaciji BDCA2 sa površine pDC; i/ili (iv) smanjuju CD32a i/ili CD62L sa površine pDC-a; i/ili (v) uklanjaju pDC in vitro pomoću ADCC ili CDC.

[0041] Humana IgG antitela su tetramerni molekuli koji sadrže dva laka lanca i dva teška lanca. Svaki laki lanac BIIB059 kovalentno je povezan sa teškim lancem preko međulančane disulfidne veze (LC Cys 218-HC Cys 225), i teški lanci su spareni jedan sa drugim pomoću dva međulančana disulfida (HC Cys 231-Cys 231 i Cys 234-Cys 234). Svi ostali cisteini formiraju unutarmolekulske disulfide koji stabilizuju konstantne i varijabilne domene.

[0042] U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitela uključuju humani konstantni region teškog lanca i lakog lanca. U određenim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH1 domen i region zgloba. U nekim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca sadrži CH3 domen. Ukoliko konstantni region teškog lanca uključuje supstitucije, takve supstitucije modifikuju svojstva antitela (npr. povećavaju ili smanjuju jedno ili više od: vezivanje za Fc receptora, glikozilaciju antitela, broj cisteinskih ostataka, funkciju efektorske ćelije, ili funkciju komplementa). U određenim primerima izvođenja, antitelo je IgG antitelo. U posebnim primerima izvođenja, antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa afinitetom od 7 µg/mL do 15 µg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRII (CD32a) sa EC50 od 10 µg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 11 µg/mL. U određenim primerima izvođenja, antitelo uključuje humani Fc region koji vezuje FcγRIIa (CD32a) sa EC50 od 12 µg/mL. Tabela 1 obezbeđuje listu svojstava BIIB059 antitela.

TABELA 1

[0043] BIIB059 pokazuje pogodna fizičko-hemijska svojstva za antitelo za terapiju. Ovo antitelo pokazuje niske nivoe agregacije. Region okvira IgG1 divljeg tipa sadrži jedno N-

1

vezano mesto glikozilacije u molekulu i BIIB059 i se vezuje za Fc receptore sa afinitetima tipičnim za ovu klasu molekula. Računata pI od 7,26 je ponešto niska za antitelo. Heterogenost naelektrisanja detektovana u BIIB059 sugeriše da značajna frakcija BIIB059 sadrži modifikacije. Nivoi glikacije do oko 10% detektovani u prečišćenim serijama BIIB059 barem su delimično odgovorni za ovu heterogenost naelektrisanja. Tm savijanja za BIIB059 je na donjem kraju tipičnih vrednosti uočenih za antitela, dok su one za domene CH2 i CH3 tipične za potpuno glikozilovano IgG1 mAb. Na osnovu merenja diferencijalne skenirajuće fluorimetrije i viskoziteta, BIIB059 se može formulisati, na primer, pri 50 mg/mL u 20 mM natrijum citratu, 150 mM NaCl, pH 6,0. Ovo antitelo se takođe može formulisati u mnogo većim koncentracijama, kao što su 150-300 mg/mL (npr. 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 300 mg/mL).

[0044] BIIB059 je potpuno humanizovano, IgG1 mAb kompetentno sa Fc funkcijom koje pokazuje visok afinitet za BDCA2 i jednako se dobro vezuje za nativni humani BDCA2 i BDCA2 cinomogulusa. BIIB059 je potentan inhibitor svih TLR9-indukovanih IFN-a tipa I kao i drugih citokina i hemokina iz pDC-a. BIIB059 je podjednako potentan u inhibiciji TLR9-indukovanog interferona tipa I iz pDC-a od zdravih humanih davalaca i SLE pacijenata. BIIB059 specifično inhibira TLR9-indukovani IFN tipa I iz pDC-a i ne utiče na proizvodnju IFN-a od strane drugih tipova ćelija pokrenutih sa različitim TLR ligandom. BIIB059 dovodi do brze internalizacije BDCA2 sa ćelijske površine. Nakon stimulacije, BDCA2 kolokalizuje sa TLR9 u endozomskom/lizozomskom kompartmentu što je izgleda neophodno za njegovu inhibiciju TLR9 signalizacije. Otkriveno je da BIIB059 prouzrokuje oslobađanje CD62L sa površine humanih pDC-a što može uticati na njihovo navođenje na ciljne organe. In vitro studije antitelo-zavisne ćelijski-posredovane citotoksičnosti (ADCC) i komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC) sugerišu da BIIB059 može imati aktivnost uklanjanja ćelija kod ćelijskih linija koje prekomerno eksprimiraju BDCA2. Međutim, činjenica da BIIB059 dovodi do brze i potpune internalizacije BDCA2 sa površine pDC-a čini ga manje verovatnim da bi BIIB059 uticao na održivo uklanjanje pDC in vivo. Kombinacija BIIB059 i hidroksihlorokina (HCQ) dovela je do aditivnog inhibitornog efekta na TLR7 i TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα od strane PBMC od zdravih humanih davalaca. Ovi podaci naglašavaju potencijalnu aditivnu terapijsku korist BIIB059 kada se primenjuje sa antimalarijalnim jedinjenjima kao što je HCQ.

[0045] Antitela, kao što je BIIB059, mogu se praviti, na primer, pripremanjem i ekspresijom sintetičkih gena koji kodiraju navedene amino-kiselinske sekvence ili mutiranjem gena humane germinativne linije kako bi se obezbedio gen koji kodira navedene amino-kiselinske

2

sekvence. Štaviše, ovo antitelo i druga anti-BDCA2 antitela se mogu dobiti, npr. upotrebom jednog ili više od sledećih postupaka.

Postupci za dobijanje anti-BDCA2 antitela

[0046] Na raspolaganju su brojni postupci za dobijanje antitela, naročito humanih antitela. Jedan primereni postupak uključuje pregledanje biblioteka ekspresije proteina, npr. prikazne biblioteke faga ili ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, u S.A.D. 5,223,409; Smith, Science 228:1315-1317 (1985); WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; i WO 90/02809. Prikaz Fab-a na fagu je opisan, na primer, u S.A.D. pat. br.5,658,727; 5,667,988; i 5,885,793.

[0047] Pored upotrebe prikaznih biblioteka, mogu se upotrebljavati i drugi postupci za dobijanje BDCA2-vezujućeg antitela. Na primer, BDCA2 protein ili njegov peptid može se upotrebljavati kao antigen kod ne-humane životinje, npr. glodara, npr. miša, hrčka, ili pacova. Pored toga, ćelije transfektovane sa cDNK koja kodira BDCA2 mogu se injektirati u nehumanu životinju kao način za proizvodnju antitela koja efikasno vezuju protein ćelijske površine BDCA2.

[0048] U jednom primeru izvođenja, ne-humana životinja uključuje najmanje deo humanog imunoglobulinskog gena. Na primer, moguće je konstruisati mišje sojeve deficitarne u proizvodnji antitela miša sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa. Upotrebom hibridomske tehnologije mogu se proizvesti i selektovati antigen-specifična monoklonalna antitela izvedena iz gena sa željenom specifičnošću. Pogledati npr. XENOMOUSE™, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994), S.A.D.2003-0070185, WO 96/34096, i WO 96/33735.

[0049] U drugom primeru izvođenja, monoklonalno antitelo se dobija od ne-humane životinje, a zatim modifikuje, npr. humanizuje ili deimunizuje. Vinter (Winter) opisuje primeni postupak CDR-graftovanja koji se može upotrebiti za pripremu humanizovanih antitela opisanih ovde (S.A.D.5,225,539). Svi ili neki od CDR-ova naročitih humanih antitela mogu biti zamenjeni sa najmanje delom ne-humanog antitela. Možda će samo biti neophodno zameniti CDR-ove koji su potrebni za vezivanje ili vezujuće determinante takvih CDR-ova da bi se došlo do korisnog humanizovanog antitela koje se vezuje za BDCA2.

[0050] Humanizovana antitela se mogu stvoriti zamenom sekvenci Fv varijabilnog regiona koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih regiona. Opšte postupke za stvaranje humanizovanih antitela obezbeđuju Morrison, S. L., Science, 229:1202-1207 (1985), Oi et al., BioTechniques, 4:214 (1986), i SAD 5,585,089; SAD 5,693,761; SAD 5,693,762; SAD 5,859,205; i SAD 6,407,213. Ti postupci uključuju izolovanje, manipulisanje, i ekspresiju sekvenci nukleinske kiselinske koje kodiraju sve ili deo Fv varijabilnih regiona imunoglobulina iz najmanje jednog od teškog ili lakog lanca. Izvori takve nukleinske kiseline su dobro poznati stručnjacima u oblasti i, na primer, mogu se dobiti od hibridoma koji proizvodi antitelo prema unapred određenom cilju, kao što je gore opisano, iz gena imunoglobulina germinativne linije, ili iz sintetičkih konstrukata. Rekombinantna DNK koja kodira humanizovano antitelo se može zatim klonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0051] Na primer, sekvence humane germinativne linije objavljene su u Tomlinson, I.A. et al., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol. Today, 16:237-242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992); i Tomlinson et al., EMBO J., 14:4628-4638 (1995). V BASE direktorijum obezbeđuje sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavili Tomlinson, I.A. et al. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK). Ove sekvence se mogu upotrebljavati kao izvor humane sekvence, npr. za regione okvira i CDR-e. Konsenzusni humani regioni okvira takođe se mogu upotrebljavati, npr. kao što je opisano u S.A.D. pat. br.6,300,064.

[0052] Ne-humano BDCA2-vezujuće antitelo može se takođe modifikovati specifičnom delecijom epitopa humane T ćelije ili "deimunizacijom" postupcima objavljenim u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, varijabilni regioni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T-ćelije (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T-ćelije, može se primeniti pristup računarskog modelovanja koji se naziva "peptidno nizanje (peptide threading)", i pored toga baza podataka humanih MHC klase II vezujućih peptida može se pretražiti za motive prisutne u VHi VLsekvencama, kako je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih DR alotipova MHC klase II, i tako čine potencijalne epitope T ćelije. Detektovani potencijalni epitopi T-ćelije mogu se eliminisati supstitucijom malog broja amino-kiselinskih ostataka u varijabilnim regionima, ili poželjno, supstitucijama jedne amino-kiseline. Ukoliko je moguće, vrši se konzervativna supstitucija. Često, ali ne isključivo, mogu se upotrebljavati aminokiseline uobičajene za poziciju u sekvencama antitela humane germinativne linije. Nakon što se identifikuju deimunizujuće promene, nukleinske kiseline koje kodiraju VHi VLse mogu konstruisati pomoću mutageneze ili drugim sintetičkim postupcima (npr. de novo sinteza, zamena kaseta, i tako dalje). Mutagenizovana varijabilna sekvenca može, opciono, biti fuzionisana za humani konstantni region, npr. humani IgG1 ili kapa konstantni region.

4

[0053] U nekim slučajevima, potencijalni epitop T ćelije će uključivati ostatke za koje je poznato ili za koje se predviđa da su važni za funkciju antitela. Na primer, potencijalni epitopi T ćelije su obično pristrasni prema CDR-ovima. Pored toga, potencijalni epitopi T ćelije se mogu zadesiti u ostacima regiona okvira važnim za strukturu i vezivanje antitela. Promene radi eliminisanja ovih potencijalnih epitopa će u nekim slučajevima zahtevati dodatni nadzor, npr. pravljenjem i testiranjem lanaca sa i bez promene. Gde je to moguće, potencijalni epitopi T ćelije koji se preklapaju sa CDR-ima mogu se eliminisati supstitucijama izvan CDR-a. U nekim slučajevima, alternacija unutar CDR-a je jedina opcija, pa se stoga mogu testirati varijante sa i bez ove supstitucije. U drugim slučajevima, supstitucija neophodna za uklanjanje potencijalnog epitopa T ćelije je na poziciji ostatka unutar regiona okvira koji bi mogao biti kritičan za vezivanje antitela. U tim slučajevima, testiraju se varijante sa i bez ove supstitucije. Stoga, u nekim slučajevima dizajnirano je nekoliko varijanti deimunizovanih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i testirane su različite kombinacije teškog/lakog lanca kako bi se identifikovalo optimalno deimunizovano antitelo. Izbor konačnog deimunizovanog antitela se tada može izvršiti razmatranjem afiniteta vezivanja različitih varijanti u kombinaciji sa stepenom deimunizacije, naročito, broja potencijalnih epitopa T ćelije koji su preostali u varijabilnom regionu. Deimunizacija se može upotrebljavati za modifikovanje bilo kog antitela, npr. antitela koje uključuje ne-humanu sekvencu, npr. sintetičko antitelo, antitelo murina, drugo ne-humano monoklonalno antitelo, ili antitelo izolovano iz prikazne biblioteke.

[0054] Takođe se mogu upotrebljavati i drugi postupci za humanizaciju antitela. Na primer, drugi postupci mogu biti odgovorni za trodimenzionalnu strukturu antitela, pozicije regiona okvira koje su u trodimenzionalnoj blizini vezujućih determinanti, i imunogenske peptidne sekvence. Videti, npr. WO 90/07861; SAD pat. br. 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; i 6,407,213; Tempest et al. (1991) Biotechnology 9:266-271. Još jedan postupak se naziva "humaniranje (humaneering)" i opisan je, na primer, u S.A.D.2005-008625.

[0055] Antitelo može uključivati humani Fc region, npr. Fc region divljeg tipa ili Fc region koji uključuje jednu ili više izmena. U jednom primeru izvođenja, konstantni region je izmenjen, npr. mutiran, da modifikuje svojstva antitela (npr. da poveća ili smanji jedno ili više od: vezivanje za Fc receptor, glikozilaciju antitela, broj cisteinskih ostataka, funkciju efektorske ćelije, ili funkciju komplementa). Na primer, humani konstantni region IgG1 može biti mutiran na jednom ili više ostataka, npr. jednom ili više od ostataka 234 i 237 (na osnovu Kabat numeracije). Antitela mogu imati mutacije u CH2 regionu teškog lanca koje redukuju ili menjaju efektorsku funkciju, npr. vezivanje za Fc receptor i aktivaciju komplementa. Na primer, antitela mogu imati mutacije kao što su one opisane u S.A.D. patentima br.5,624,821 i 5,648,260. Antitela takođe mogu imati mutacije koje stabilizuju disulfidnu vezu između dva teška lanca imunoglobulina, kao što su mutacije u regionu zgloba IgG4, kao što je objavljeno u struci (npr. Angal et al. (1993) Mol. Immunol.30:105-08). Videti takođe, npr. S.A.D. 2005-0037000.

Sazrevanje afiniteta

[0056] U jednom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je modifikovano, na primer, pomoću mutageneze, da obezbedi pul modifikovanih antitela. Modifikovana antitela se zatim procenjuju tako da se identifikuje jedno ili više antitela koja imaju izmenjena funkcionalna svojstva (npr. poboljšano vezivanje, poboljšanu stabilnost, redukovanu antigenost, ili povećanu stabilnost in vivo). U jednoj implementaciji, upotrebljava se tehnologija prikazne biblioteke za odabir ili pregled pula modifikovanih antitela. Antitela sa višim afinitetom se zatim identifikuju iz druge biblioteke, npr. upotrebom veće strogosti ili kompetitivnijih uslova vezivanja i ispiranja. Takođe se mogu upotrebljavati druge tehnike pregleda.

[0057] U nekim implementacijama, mutageneza je usmerena na regione za koje je poznato ili je verovatno da će biti na vezujućem interfejsu. Ukoliko su, na primer, identifikovani vezujući proteini antitela, tada se mutageneza može usmeriti na CDR regione teških ili lakih lanaca kako je ovde opisano. Dodatno, mutageneza se može usmeriti na regione okvire u blizini ili neposredno uz CDR-e, npr. regione okvira, naročito unutar 10, 5, ili 3 amino-kiseline od CDR spoja. U slučaju antitela, mutageneza se takođe može ograničiti na jedan ili nekoliko CDR-a, npr. kako bi se načinila poboljšanja korak po korak.

[0058] U jednom primeru izvođenja, mutageneza se upotrebljava da se antitelo učini sličnijim jednoj ili više sekvenci germinativne linije. Jedan primerni postupak germlinizacije može uključivati: identifikovanje jedne ili više sekvenci germinativne linije koje su slične (npr. najsličnija u određenoj bazi podataka) sekvenci izolovanog antitela. Tada se mogu napraviti mutacije (na nivou amino-kiseline) u izolovanom antitelu, bilo postepeno, u kombinaciji, ili oba. Na primer, napravljena je biblioteka nukleinske kiseline koja uključuje sekvence koje kodiraju neke ili sve moguće mutacije germinativne linije. Mutirana antitela se zatim procenjuju, npr. da bi se identifikovalo antitelo koje ima jedan ili više dodatnih ostataka germinativne linije u odnosu na izolovano antitelo i koje je još uvek korisno (npr. ima funkcionalnu aktivnost). U jednom primeru izvođenja, introdukuje se što je više moguće ostataka germinativne linije u izolovano antitelo.

[0059] U jednom primeru izvođenja, mutageneza se upotrebljava za supstituciju ili inserciju jednog ili više ostataka germinativne linije u CDR region. Na primer, ostatak CDR germinativne linije može biti iz sekvence germinativne linije koja je slična (npr. najsličnija) varijabilnom regionu koji se modifikuje. Posle mutageneze, aktivnost (npr. vezivanje ili druga funkcionalna aktivnost) antitela može se proceniti da bi se odredilo da li se ostatak ili ostaci germinativne linije tolerišu. Slična mutageneza se može izvesti u regionima okvira.

[0060] Odabir sekvence germinativne linije može se izvesti na različite načine. Na primer, sekvenca germinativne linije može se selektovati ukoliko ispunjava unapred određene kriterijume za selektivnost ili sličnost, npr. najmanje određeni procenat identičnosti, na primer, najmanje 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 9596, 97, 98, 99, ili 99,5% identičnosti, u odnosu na ne-humano antitelo davaoca. Odabir se može izvesti upotrebom najmanje 2, 3, 5, ili 10 sekvenci germinativne linije. U slučaju CDR1 i CDR2, identifikacija slične sekvence germinativne linije može uključivati odabir jedne takve sekvence. U slučaju CDR3, identifikacija slične sekvence germinativne linije može uključivati odabir jedne takve sekvence, ali može uključivati upotrebu dve sekvence germinativne linije koje zasebno doprinose amino-terminalnom delu i karboksi-terminalnom delu. U drugim implementacijama upotrebljavaju se više od jedne ili dve sekvence germinativne linije, npr. da formiraju konsenzus sekvence.

[0061] Izračunavanje "identičnosti sekvence" između dve sekvence se izvodi na sledeći način. Sekvence su poravnate u cilju optimalnog poređenja (npr. razmaci se mogu introdukovati u jednu ili obe od prve i druge sekvence amino-kiselina ili nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja i nehomologne sekvence se mogu zanemariti u cilju poređenja). Optimalno poravnanje se određuje kao najbolji rezultat upotrebom GAP programa u softverskom paketu GCG sa Blossum 62 matriksom za ocenjivanje sa penalom razmaka od 12, penalom produženog razmaka od 4, i penalom razmaka pomeranja okvira od 5. Amino-kiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim amino-kiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama se zatim porede. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim amino-kiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele.

[0062] U drugim primerima izvođenja, antitelo može biti modifikovano tako da ima izmenjen obrazac glikozilacije (tj. izmenjen od originalnog ili nativnog obrasca glikozilacije). Kako se upotrebljava u ovom kontekstu, "izmenjeno" označava deleciju jednog ili više ugljenohidratnih delova i/ili adiciju jednog ili više mesta glikozilacije originalnom antitelu.

Adicija mesta glikozilacije u sada objavljenim antitelima može se postići izmenom aminokiselinske sekvence tako da sadrži konsenzus sekvence mesta glikozilacije; takve tehnike su dobro poznate u struci. Drugi načini za povećanje broja ugljenohidratnih delova na antitelima je pomoću hemijskog ili enzimskog spajanja glikozida sa amino-kiselinskim ostacima antitela. Ovi postupci su opisani u, npr. WO 87/05330, i Aplin i Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22:259-306. Uklanjanje bilo kojih ugljenohidratnih delova prisutnih na antitelima može se izvršiti hemijski ili enzimski kako je opisano u struci (Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259:52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118:131; i Thotakura et al. (1987) Meth. Enzimol., 138:350). Pogledati, npr. S.A.D. pat. br. 5,869,046 za modifikaciju koja povećava in vivo poluživot obezbeđivanjem epitopa koji vezuje receptor za spašavanje.

[0063] U jednom slučaju, antitelo ima CDR sekvence (npr. Chothia ili Kabat CDR) koje se razlikuju od onih od BIIB059 monoklonalnog antitela. Sekvence CDR koje se razlikuju od onih od BIIB059 monoklonalnog antitela uključuju promene amino-kiselina, kao što su supstitucije 1, 2, 3, ili 4 amino-kiseline ukoliko je CDR dužine 5-7 amino-kiselina, ili supstitucije od 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 amino-kiselina u sekvenci CDR ukoliko je dužina CDR 10 amino-kiselina ili više. Amino-kiselina koja je supstituirana može imati slično naelektrisanje, hidrofobnost, ili stereohemijske karakteristike. U nekim slučajevima, amino-kiselinska supstitucija(e) je konzervativna supstitucija. U drugim slučajevima, amino-kiselinska supstitucija(e) je nekonzervativna supstitucija. Takve supstitucije su u okviru uobičajene veštine stručnjaka. Antitelo ili njegovi fragmenti antitela koji sadrže supstituisane CDR-ove mogu se pregledati da bi se identifikovala antitela koja imaju jednu ili više od ovde opisanih karakteristika (npr. smanjenje proizvodnje/sekrecije interferona tipa I ili tipa III, IL-6, TNF-α, MIP-1-α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5/RANTES, IP-10/CXCL10; uklanjanje pDC; kompeticija za vezivanje za vanćelijski domen BDCA2 sa BIIB059; selektivno vezivanje ektodomena humanog BDCA2, BDCA2 cinomolgusa i rezusa ali ne i vezivanje Clec4b2 pacova ili vezivanje za Clec4b2 pacova sa nižim afinitetom vezivanja nego za humani BDCA2, BDCA2 cinomolgusa ili rezusa; inhibicija razvoja bolesti u humanom psorijatičnom modelu ksenografta).

[0064] Za razliku od CDR-ova, značajnije promene u strukturi regiona okvira (FR) mogu da se naprave bez štetnog uticaja na svojstva vezivanja antitela. Promene na FR-ovima uključuju, ali nisu ograničene na, humanizovanje regiona okvira ne-humanog porekla ili konstrukciju određenih ostataka regiona okvira koji su važni za kontakt sa antigenom ili za stabilizaciju mesta vezivanja, npr. promenu klase ili podklase konstantnog regiona, promenu specifičnih amino-kiselinskih ostataka koji mogu izmeniti efektorsku funkciju kao što je vezivanje za Fc receptor (Lund et al., J. Immun., 147:2657-62 (1991); Morgan et al., Immunology, 86:319-24 (1995)), ili promene vrste iz koje je izveden konstantni region.

[0065] Anti-BDCA2 antitela mogu biti u obliku antitela pune dužine, ili u obliku oblika niske molekulske mase (npr. biološki aktivni fragmenti antitela ili minitela) anti-BDCA2 antitela, npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb, scFv, i sc(Fv)2. Druga anti-BDCA2 antitela obuhvaćena ovom objavom uključuju antitelo sa jednim domenom (sdAb) koje sadrži jedan varijabilni lanac kao što je, VH ili VL, ili njegov biološki aktivni fragment. Videti, npr. Moller et al., J. Biol. Chem., 285 (49):38348-38361 (2010); Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(1):13-22 (2007); S.A.D. 2005/0079574 i Davies et al. (1996) Protein Eng., 9(6):531-7. Kao i celo antitelo, i sdAb se može selektivno vezati za specifični antigen. Sa molekulskom masom od samo 12-15 kDa, sdAb su mnogo manja od uobičajenih antitela i čak manja od Fab fragmenata i jednolančanih varijabilnih fragmenata.

[0066] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže smešu anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i jednu ili više njegovih kiselih varijanti, npr. pri čemu je količina kisele varijante(i) manja od oko 80%, 70%, 60% , 60%, 50%, 40%, 30%, 30%, 20%, 10%, 5% ili 1%. Takođe su obezbeđene kompozicije koje sadrže anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrže najmanje jedno mesto deamidacije, pri čemu je pH kompozicije od oko 5,0 do oko 6,5, tako da, na primer, najmanje oko 90% anti-BDCA2 antitela nije deamidovano (tj. manje od oko 10% antitela je deamidovano). U određenim primerima izvođenja, manje od oko 5%, 3%, 2% ili 1% antitela je deamidovano. pH može biti od 5,0 do 6,0, kao što je 5,5 ili 6,0. U određenim primerima izvođenja, pH kompozicije je 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ili 6,5.

[0067] "Kisela varijanta" je varijanta polipeptida od interesa koji je kiseliji (npr. kao što je određeno katjonskom izmenjivačkom hromatografijom) od polipeptida od interesa. Primer kisele varijante je deamidovana varijanta.

[0068] "Deamidovana" varijanta polipeptidnog molekula je polipeptid gde je jedan ili više ostatak(a) asparagina originalnog polipeptida konvertovano u aspartat, tj. bočni lanac neutralnog amida konvertovan je u ostatak sa sveukupnim kiselim karakterom.

[0069] Termin "smeša" kako se ovde upotrebljava u vezi sa kompozicijom koja sadrži anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, označava prisustvo i željenog anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i jedne ili više njegove kisele varijante. Kisele varijante mogu sadržati pretežno deamidovano anti-BDCA2 antitelo, sa manjim količinama druge kiselih varijante(i).

[0070] U određenim primerima izvođenja, afinitet vezivanja (KD), stopa vezivanja (KDon) i/ili stopa disocijacije (KDoff) antitela koje je mutirano radi eliminisanja deamidacije je slična onom antitela divljeg tipa, npr. sa razlikom manjom od oko 5 puta, 2 puta, 1 puta (100%), 50%, 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% ili 1%.

[0071] U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili njegova antitela niske molekulske mase vezuju se za BDCA2 na pDC-a i inhibiraju ili redukuju proizvodnju i/ili sekreciju od strane pDC-a IFN tipa I i tipa III, IL-6, TNF-α, i drugih inflamatornih citokina i hemokina (npr. MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, CCL5, i IP-10/CXCL10); i/ili uklanjaju pDC-e pomoću ADCC ili CDC ili apoptoze; i/ili redukuju težinu simptoma kada se primenjuju na humane pacijente koji imaju jedno ili više od, ili životinjske modele: sistemskog eritemskog lupusa, lupusa kože, diskoidnog lupusa, lupus nefritisa, skleroderme, morfee, reumatoidnog artritisa, polimiozitis-dermatomiozitisa, psorijaze, Sjogrenovog sindroma, vaskulitisa, i dijabetesa tipa I. U jednom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili njegova antitela niske molekulske mase inhibiraju razvoj bolesti u humanom psorijatičnom modelu ksenografta (Nestle et al., J. Exp. Med., 202(1):135-143 (2005)). Ove karakteristike anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili njegovih antitela niske molekulske mase mogu se meriti u skladu sa postupcima opisanim u Primerima, kao i drugim postupcima poznatim u struci.

Fragmenti antitela

[0072] Fragmenti antitela (npr. Fab, Fab', F(ab')2, Facb, i Fv) mogu se pripremiti proteolitičkom digestijom intaktnih antitela. Na primer, fragmenti antitela se mogu dobiti tretiranjem celog antitela enzimom kao što je papain, pepsin, ili plazmin. Digestija celih antitela papainom proizvodi F(ab)2 ili Fab fragmente; digestija celih antitela pepsinom stvara F(ab')2 ili Fab'; digestija celih antitela plazminom stvara Facb fragmente.

[0073] Alternativno, fragmenti antitela se mogu proizvesti rekombinantno. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju fragmente antitela od interesa mogu biti konstruisane, introdukovane u ekspresioni vektor, i eksprimirane u odgovarajućim ćelijama domaćina. Videti, npr. Co, M.S. et al., J. Immunol., 152:2968-2976 (1994); Better, M. i Horwitz, A.H., Methods in Enzimology, 178:476-496 (1989); Plueckthun, A. i Skerra, A., Methods in Enzimology, 178:476-496 (1989); Lamoyi, E., Methods in Enzimology, 121:652-663 (1989); Rousseaux, J. et al., Methods in Enzimology, (1989) 121:663-669 (1989); i Bird, R.E. et al.,

4

TIBTECH, 9:132-137 (1991)). Fragmenti antitela se mogu eksprimirati i sekretovati iz E. coli, stoga omogućavajući laku proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela se mogu izolovati iz biblioteka antitela faga. Alternativno, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno povratiti iz E. coli i hemijski spojiti da bi formirali F(ab)2 fragmente (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). U skladu sa drugim pristupom, F(ab')2 fragmenti se mogu izolovati direktno iz rekombinantne ćelijske kulture domaćina. Fab i F(ab')2 fragment sa povećanim in vivo poluživotom koji sadrži ostatke epitopa koji vezuju receptor za spašavanje opisani su u S.A.D. pat. br.5,869,046.

Minitela

[0074] Minitela anti-BDCA2 antitela uključuju diatela, jednolančana (scFv), i jednolančana (Fv)2 (sc(Fv)2).

[0075] "Diatelo" je bivalentno minitelo konstruisano fuzijom gena (videti, na primer, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161). Diatela su dimeri koji se sastoje od dva polipeptidna lanca. VL i VH domen svakog polipeptidnog lanca dijatela su vezana pomoću linkera. Broj amino-kiselinskih ostataka koji čine linker može biti između 2 do 12 ostataka (npr. 3-10 ostataka ili pet ili oko pet ostataka). Linkeri polipeptida u diatelu su uobičajeno prekratki da bi se VL i VH mogli međusobno vezati. Stoga, VL i VH kodirani u istom polipeptidnom lancu ne mogu formirati jednolančani fragment varijabilnog regiona, već umesto toga formiraju dimer sa različitim jednolančanim fragmentom varijabilnog regiona. Kao rezultat, diatelo ima dva antigenavezujuća mesta.

[0076] scFv je jednolančano polipeptidno antitelo dobijeno povezivanjem VH i VL sa linkerom (videti npr. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988); i Plickthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol.113, Ed Resenburg i Moore, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994)). Redosled vezivanja VH-a i VL-a nije posebno ograničen, i mogu biti raspoređeni bilo kojim redosledom. Primeri aranžmana uključuju: [VH] linker [VL]; ili [VL] linker [VH]. V region H lanca i V region L lanca u scFv mogu biti izvedeni iz bilo kog anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji su ovde opisani.

[0077] Sc(Fv)2 je minitelo u kome su dva VH i dva VL povezani linkerom da bi formirali jedan lanac (Hudson, et al., J. Immunol. Methods, (1999) 231: 177-189 (1999) ). Sc(Fv)2 se može pripremiti, na primer, povezivanjem scFv-a sa linkerom. Sc(Fv)2 predmetnog pronalaska uključuje antitela poželjno u kojima su dva VH i dva VL raspoređena po redosledu: VH, VL, VH i VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]), počevši od N terminusa jednolančanog polipeptida; međutim redosled dva VH i dva VL nije ograničen na gore navedeni aranžman, i oni mogu biti raspoređeni bilo kojim redosledom. Niže su navedeni primeri aranžmana:

[VL] linker [VH] linker [VH] linker [VL]

[VH] linker [VL] linker [VL] linker [VH]

[VH] linker [VH] linker [VL] linker [VL]

[VL] linker [VL] linker [VH] linker [VH]

[VL] linker [VH] linker [VL] linker [VH]

[0078] Uobičajeno, tri linkera su neophodna kada se povezuju četiri varijabilna regiona antitela; upotrebljeni linkeri mogu biti identični ili različiti. Ne postoji posebno ograničenje za linkere koji povezuju VH i VL regione minitela. U nekim primerima izvođenja, linker je peptidni linker. Bilo koji proizvoljni jednolančani peptid koji sadrži oko tri do 25 ostataka (npr. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) može se upotrebljavati kao linker. Primeri takvih peptidnih linkera uključuju: Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 13); Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 14); Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 15); Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 16); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20); (Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 21)n, pri čemu je n ceo broj od jedan ili više; i (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 22)n, pri čemu je n ceo broj od jedan ili više.

[0079] U određenim primerima izvođenja, linker je sintetičko jedinjenje (hemijski agens za umrežavanje). Primeri agenasa za umrežavanje koji su dostupni na tržištu uključuju N-hidroksisukcinimid (NHS), disukcinimidilsuberat (DSS), bis(sulfosukcinimidil)suberat (BS3), ditiobis(sukcinimidilpropionat) (DSP), ditiobis(sulfosukcinimidilpropionat) (DTSSP), etilenglikol bis(sukcinimidilsukcinat) (EGS), etilenglikol bis(sulfosukcinimidilsukcinat) (sulfo-EGS), disukcinimidil tartrat (DST), disulfosukcinimidil tartrat (sulfo-DST), bis[2-(sukcinimidooksikarboniloksi)etil]sufon (BSOCOES), i bis[2-(sulfosukcinimidooksikarboniloksi)etil]sufon (sulfo-BSOCOES).

[0080] Amino-kiselinska sekvenca VH ili VL u minitelima može uključivati modifikacije kao što su supstitucije, delecije, adicije, i/ili insercije. Na primer, modifikacija može biti u jednom ili više CDR-a anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (npr. BIIB059). U određenim primerima izvođenja, modifikacija uključuje jednu, dve, ili tri amino-kiselinske supstitucije u jednom ili više CDR-a VH i/ili VL domena anti-BDCA2 minitela. Takve supstitucije su napravljene da poboljšaju vezivanje i/ili funkcionalnu aktivnost anti-BDCA2 minitela. U drugim primerima izvođenja može se izvršiti delecija ili adicija jedne, dve, ili tri amino-kiseline CDR-a anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (npr. BIIB059), sve dok postoji BDCA2 vezivanje i/ili funkcionalna aktivnost kada su VH i VL asocirani.

Bispecifična antitela

[0081] Bispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Primerna bispecifična antitela mogu da se vezuju za dva različita epitopa BDCA2 proteina. Druga takva antitela mogu kombinovati vezujuće mesto za BDCA2 sa vezujućim mestom za drugi protein. Bispecifična antitela mogu da se pripreme kao antitela pune dužine ili njihovi oblici niske molekulske mase (npr. F(ab')2bispecifična antitela, sc(Fv)2 bispecifična antitela, diatela bispecifična antitela).

[0082] Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine zasniva se na koekspresiji dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac, gde dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). U drugačijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja fuzionišu se za sekvence konstantnog domena imunoglobulina. DNK koje kodiraju teški lanac imunoglobulina fuzije i, po želji, laki lanac imunoglobulina, insertovane su u odvojene ekspresione vektore, i kotransfektuju se u odgovarajuću ćeliju domaćina. Ovo obezbeđuje veću fleksibilnost u podešavanju proporcija tri fragmenta polipeptida. Međutim, moguće je insertovati kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima dovodi do visokih prinosa.

[0083] U skladu sa drugim pristupom opisanim u S.A.D. pat. br. 5,731,168, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati tako da se maksimizira procenat heterodimera koji se izdvajaju iz kulture rekombinantne ćelije. Poželjni interfejs sadrži najmanje deo CH3domena. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca amino-kiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzatorne "šupljine" identične ili slične veličine onim velikog bočnog lanca(aca) su stvorene na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca amino-

4

kiselina manjim (npr. alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.

[0084] Bispecifična antitela uključuju umrežena ili antitela "heterokonjugate". Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može da se poveže sa avidinom, a drugo sa biotinom. Antitela heterokonjugati se mogu napraviti upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka umrežavanja.

[0085] "Diatelo" tehnologija obezbeđuje alternativni mehanizam za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže VH spojen za VL pomoću linkera koji je prekratak da bi omogućio sparivanje između dva domena u istom lancu. U skladu sa tim, VH i VL domeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spare sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, stvarajući time dva antigen-vezujuća mesta.

Multivalentna antitela

[0086] Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolisano) brže od bivalentnog antitela pomoću ćelije koja eksprimira antigen za koji se antitela vezuju. Ovde opisana antitela mogu biti multivalentna antitela sa tri ili više antigena-vezujuća mesta (npr. tetravalentna antitela), koja se mogu lako proizvesti rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može sadržati domen za dimerizaciju i tri ili više antigena-vezujuća mesta. Primerni domen za dimerizaciju sadrži (ili se sastoji od) Fc regiona ili regiona zgloba. Multivalentno antitelo može sadržati (ili se sastojati od) tri do oko osam (npr. četiri) antigena-vezujuća mesta. Multivalentno antitelo opciono sadrži najmanje jedan polipeptidni lanac (npr. najmanje dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanac(i) sadrži dva ili više varijabilna domena. Na primer, polipeptidni lanac(i) mogu sadržati VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je polipeptidni lanac Fc regiona, X1 i X2 predstavljaju amino-kiselinski ili peptidni spejser, a n je 0 ili 1.

Konjugovana antitela

[0087] Ovde objavljena antitela mogu biti konjugovana antitela koja su vezana za različite molekule uključujući makromolekulske supstance kao što su polimeri (npr. polietilen glikol (PEG), polietilenimin (PEI) modifikovan sa PEG (PEI-PEG), poliglutaminska kiselina (PGA) (N-(2-hidroksipropil) metakrilamid (HPMA) kopolimeri), hijaluronska kiselina, radioaktivni materijali (npr.<90>Y,<131>I) fluorescentne supstance, luminescentne supstance, hapteni, enzimi, metalni helati, lekovi, i toksini (npr. kalheamicin, Pseudomonas exotoxin A, ricin (npr. deglikozilovani lanac ricina A)).

[0088] U jednom primeru izvođenja, za poboljšanje citotoksičnih delovanja anti-BDCA2 antitela i posledično njihove terapijske efikasnosti, antitela se konjuguju sa visoko toksičnim supstancama, uključujući radioizotope i citotoksične agense. Ovi konjugati mogu isporučiti toksično opterećenje selektivno na ciljno mesto (tj. ćelije koje eksprimiraju antigen prepoznat antitelom), dok su ćelije koje antitelo ne prepoznaje pošteđene. Da bi se minimalizovala toksičnost, konjugati su uglavnom konstruisani na osnovu molekula sa kratkim poluživotom u serumu (stoga, upotreba murinskih sekvenci, i IgG3 ili IgG4 izotipova).

[0089] U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment su modifikovani delom koji poboljšava njihovu stabilizaciju i/ili zadržavanje u cirkulaciji, npr. u krvi, serumu, ili drugim tkivima, npr. najmanje za 1,5, 2, 5, 10, ili 50 puta. Na primer, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti povezan sa (npr. konjugovan za) polimerom, npr. suštinski ne-antigenim polimerom, kao što su polialkilenoksid ili polietilen oksid. Pogodni polimeri će se značajno razlikovati po masi. Mogu se upotrebiti polimeri koji imaju prosečnu molekulsku masu broja koja se kreće u rasponu od oko 200 do oko 35.000 Daltona (ili oko 1.000 do oko 15.000, i 2.000 do oko 12.500). Na primer, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu se konjugovati za polimer rastvorljiv u vodi, npr. hidrofilni polivinil polimer, npr. polivinilalkohol ili polivinilpirolidon. Primeri takvih polimera uključuju polialkilen oksid homopolimere kao što su polietilen glikol (PEG) ili polipropilen glikoli, polioksietilenizovani polioli, njihove kopolimere i njihove blok kopolimere, pod uslovom da se održava rastvorljivost u vodi blok kopolimera. Dodatni korisni polimeri uključuju polioksialkilene kao što su polioksietilen, polioksipropilen, i blok kopolimeri polioksietilena i polioksipropilena; polimetakrilate; karbomere; i razgranate ili nerazgranate polisaharide.

[0090] Gore opisana konjugovana antitela mogu se pripremiti izvođenjem hemijskih modifikacija na antitelima ili njihovim oblicima sa nižom molekulskom masom koja su ovde opisana. Postupci za modifikovanje antitela su dobro poznati u stanju tehnike (npr. SAD 5057313 i SAD 5156840).

Postupci proizvodnje antitela

4

[0091] Antitela se mogu proizvesti u bakterijskim ili eukariotskim ćelijama. Neka antitela, npr. Fabꞌs, mogu se proizvesti u bakterijskim ćelijama, npr. ćelijama E. coli. Antitela se takođe mogu proizvesti u eukariotskim ćelijama kao što su transformisane ćelijske linije (npr. CHO, 293E, COS). Pored toga, antitela (npr. scFv) se mogu eksprimirati u ćeliji kvasca kao što je Pichia (videti npr. Powers et al., J Immunol Methods.251:123-35 (2001)), Hanseula, ili Saccharomyces. Da bi se proizvelo antitelo od interesa, konstruisan je polinukleotid koji kodira antitelo, introdukovan je u ekspresioni vektor, i zatim eksprimiran u pogodnim ćelijama domaćina. Standardne tehnike molekularne biologije upotrebljavaju se za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, odabir transformanata, uzgoj ćelija domaćina i izdvajanje antitela.

[0092] Ukoliko antitelo treba da bude eksprimirano u bakterijskim ćelijama (npr. E. coli), ekspresioni vektor treba da ima karakteristike koje omogućavaju amplifikaciju vektora u bakterijskim ćelijama. Pored toga, kada se E. coli kao JM109, DH5α, HB101, ili XL1-Blue upotrebljava kao domaćin, vektor mora imati promotor, na primer, lacZ promotor (Ward et al., 341:544-546 (1989)), araB promotor (Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988)), ili T7 promotor koji mogu omogućiti efikasnu ekspresiju u E. coli. Primeri takvih vektora uključuju, na primer, vektore serije M13, vektore serije pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (QIAGEN), pEGFP, i pET (kada se upotrebljava ovaj ekspresioni vektor, domaćin je poželjno BL21 koji eksprimira T7 RNK polimerazu). Ekspresioni vektor može sadržati signalnu sekvencu za sekreciju antitela. Za proizvodnju u periplazmi E. coli, signalna sekvenca pelB (Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379 (1987)) može se upotrebiti kao signalna sekvenca za sekreciju antitela. Za bakterijsku ekspresiju, mogu se upotrebljavati kalcijum hloridni postupci ili postupci elektroporacije za introdukovanje ekspresionog vektora u bakterijsku ćeliju.

[0093] Ukoliko antitelo treba da bude eksprimirano u životinjskim ćelijama kao što su CHO, COS, i NIH3T3 ćelije, ekspresioni vektor uključuje promotor neophodan za ekspresiju u tim ćelijama, na primer, SV40 promotor (Mulligan et al., Nature, 277:108 (1979)), MMLV-LTR promotor, EF1α promotor (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)), ili CMV promotor. Pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin ili njegov domen, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. oridžin replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor introdukovan (videti npr. S.A.D. pat. br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Na primer, uobičajeno selektabilni marker gen obezbeđuje otpornost na lekove, kao što su G418,

4

higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor introdukovan. Primeri vektora sa selektabilnim markerima uključuju pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, i pOP13.

[0094] U jednom primeru izvođenja, antitela se proizvode u ćelijama sisara. Primerne ćelije domaćina sisara za ekspresiju antitela uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (uključujući dhfr CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, upotrebljene sa DHFR selektabilnim markerom, npr. kao što je opisano u Kaufman i Sharp (1982), Mol. Biol. 159:601-621), 293 ćelije bubrega humanog embriona (npr. 293, 293E, 293T), COS ćelije, NIH3T3 ćelije, limfocitne ćelijske linije, npr. NS0 mijeloma ćelije i SP2 ćelije, i ćeliju transgene životinje, npr. transgenog sisara. Na primer, ćelija je ćelija epitela sisara.

[0095] U primernom sistemu za ekspresiju antitela, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela anti-BDCA2 antitela (npr. BIIB059) introdukuje se u dhfr CHO ćelije kalcijum fosfat-posredovanom transfekcijom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela se operativno povezuju sa pojačivač/promotor regulatornim elemenatima (npr. izvedenim iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je CMV pojačivač/AdMLP promotor regulatorni element ili SV40 pojačivač/AdMLP promotor regulatorni element) radi pokretanja visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transfiktovane vektorom upotrebom metotreksat selekcije/amplifikacije. Odabrane transformantne ćelije domaćina se uzgajaju da bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela i antitelo se izdvaja iz medijuma za kulturu.

[0096] Antitela takođe mogu da proizvode transgene životinje. Na primer, S.A.D. pat. br.

5,849,992 opisuje postupak ekspresije antitela u mlečnoj žlezdi transgenog sisara. Konstruisan je transgen koji uključuje promotor specifičan za mleko i nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo od interesa i signalnu sekvencu za sekreciju. Mleko koje proizvode ženke takvih transgenih sisara uključuje, sekretovano u njemu, antitelo od interesa. Antitelo može da se prečisti iz mleka, ili za neke primene, direktno upotrebljava. Takođe su obezbeđene životinje koje sadrže jednu ili više ovde opisanih nukleinskih kiselina.

[0097] Antitela predmetne objave mogu biti izolovana iz unutrašnjosti ili spoljašnjosti (kao što je medijum) ćelije domaćina i prečišćena kao suštinski čista i homogena antitela. Postupci za izolovanje i prečišćavanje koji se uobičajeno upotrebljavaju za prečišćavanje antitela mogu se upotrebiti za izolovanje i prečišćavanje antitela, i nisu ograničeni na bilo koji određeni postupak. Antitela mogu biti izolovana i prečišćena odgovarajućim odabirom i

4

kombinovanjem, na primer, hromatografije na koloni, filtracije, ultrafiltracije, isoljavanja, taloženja rastvarača, ekstrakcije rastvarača, destilacije, imunoprecipitacije, SDS-poliakrilamid gel elektroforeze, izoelektričnog fokusiranja, dijalize, i rekristalizacije. Hromatografija uključuje, na primer, afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gel filtraciju, hromatografiju reverzne faze, i adsorpcionu hromatografiju (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Hromatografija se može izvršiti upotrebom hromatografije tečne faze, kao što su HPLC i FPLC. Kolone koje se upotrebljavaju za afinitetnu hromatografiju uključuju protein A kolonu i protein G kolonu. Primeri kolona koje upotrebljavaju protein A kolonu uključuju Hyper D, POROS i Sepharose FF (GE Healthcare Biosciences). Predmetna objava takođe uključuje antitela koja su visoko prečišćena upotrebom ovih postupaka prečišćavanja.

Karakterizacija antitela

[0098] BDCA2-vezujuća svojstva ovde opisanih antitela mogu se meriti bilo kojim standardnim postupkom, npr. jednim ili više od sledećih postupaka: OCTET<®>, rezonanca površinskog plazmona (Surface Plasmon Resonance-SPR), BIACORE™ analiza, enzim povezani imunosorbent test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA), EIA (enzimski imunotest (enzyme immunoassay)), RIA (radioimunotest (radioimmunoassay)), i fluorescentno rezonantni energetski transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer-FRET).

[0099] Interakcija vezivanja proteina od interesa (anti-BDCA2 antitelo) i cilja (npr. BDCA2) može se analizirati upotrebom OCTET<®>sistema. U ovom postupku, jedna od nekoliko varijacija instrumenata (npr. OCTET<®>QK<e>i QK), napravljeni od strane kompanije FortéBio, upotrebljava se za određivanje interakcija proteina, specifičnosti vezivanja, i mapiranja epitopa. OCTET<®>sistemi obezbeđuju jednostavan način praćenja vezivanja u realnom vremenu merenjem promena polarizovane svetlosti koja putuje niz prilagođeni vrh i zatim nazad do senzora.

[0100] Interakcija vezivanja proteina od interesa (anti-BDCA2 antitelo) i cilja (npr. BDCA2) može se analizirati upotrebom rezonance površinskog plazmona (SPR). SPR ili analiza biomolekulske interakcije (BIA) detektuju biospecifične interakcije u realnom vremenu, bez obeležavanja bilo kog učesnika interakcije. Promene u masi na vezujućoj površini (što ukazuje na događaj vezivanja) BIA čipa rezultuju u izmenama refraktivnog indeksa svetlosti u

4

blizini površine (optički fenomen rezonance površinskog plazmona (SPR)). Promene u refraktivnosti generišu signal koji se može detektovati, koji se meri kao pokazatelj reakcija u realnom vremenu između bioloških molekula. Postupci za upotrebu SPR opisani su, na primer, u S.A.D. pat. br. 5,641,640; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander i Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 i on-line resursima koje obezbeđuje BIAcore International AB (Uppsala, Švedska). Informacije iz SPR mogu se upotrebiti za obezbeđivanje tačne i kvantitativne mere ravnotežne konstante disocijacije (Kd), i kinetičkih parametara, uključujući Koni Koff, za vezivanje biomolekula za cilj.

[0101] Epitopi se takođe mogu direktno mapirati procenom sposobnosti različitih antitela da međusobno kompetiraju za vezivanje za humani BDCA2 upotrebom BIACORE hromatografskih tehnika (Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Epitope Mapping", Section 6.3.2, (maj 1994); videti takođe Johne et al. (1993) J. Immunol. Methods, 160:191-198).

[0102] Kada se koristi enzimski imunotest, uzorak koji sadrži antitelo, na primer, supernatant kulture ćelija koje proizvode antitelo ili prečišćeno antitelo dodaje se na ploču obloženu antigenom. Dodaje se sekundarno antitelo obeleženo enzimom kao što je alkalna fosfataza, ploča se inkubira, i posle ispiranja dodaje se enzimski supstrat kao što je p-nitrofenilfosfat, i meri se apsorbanca za procenu aktivnosti vezivanja antigena.

[0103] Dodatna opšta uputstva za procenu antitela, na primer, vestern blotovi i testovi imunoprecipitacije, mogu se pronaći u Antibodies: A Laboratory Manual, ed. Harlow i Lane, Cold Spring Harbor press (1988).

Depoziti

[0104] Hibridom koji proizvodi monoklonalno anti-BDCA2 antitelo određenog murinskog hibridoma BDCA2-1P24F4.1.1.1 deponovano je u Američkoj kolekciji tipa kultura (American Type Culture Collection-ATCC) pod uslovima iz Budimpeštanskog ugovora o međunarodnom priznavanju deponovanja mikroorganizama u svrhu patentnog postupka 15. januara 2013., i nosi pristupni broj PTA-13450. Podnosioci prijave priznaju svoju obavezu da zamene depozite ukoliko depozitar ne bude mogao da dostavi uzorak na zahtev usled stanja depozita pre isteka trajanja patenta izdatog ovde. Podnosioci prijave takođe priznaju svoju odgovornost da obaveste ATCC o izdavanju takvog patenta, u koje vreme će depozit postati dostupan javnosti. Pre tog vremena depozit će biti dostupan komesaru za patente pod uslovima iz 37 C.F.R. § 1.14 i 35 U.S.C. § 112.

4

Antitela sa izmenjenom efektorskom funkcijom

[0105] Interakcija antitela i antitelo-antigen kompleksa sa ćelijama imunskog sistema pokreće različite odgovore, koji su ovde navedeni kao efektorske funkcije. Imunski-posredovane efektorske funkcije uključuju dva glavna mehanizma: ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Obe su posredovane konstantnim regionom proteina imunoglobulina. Fc domen antitela je, dakle, deo koji definiše interakcije sa mehanizmima imunskog efektora.

[0106] IgG antitela aktiviraju efektorske puteve imunskog sistema tako što se vezuju za članove porodice receptora ćelijske površine Fcγ i za C1q sistem komplementa. Ligacija efektorskih proteina klasterisanim antitelima pokreće različite odgovore, uključujući otpuštanje inflamatornih citokina, regulisanje proizvodnje antigena, endocitozu, i ubijanje ćelija. U nekim kliničkim primenama ovi odgovori su presudni za efikasnost monoklonalnog antitela. Kod drugih oni izazivaju neželjene sporedne efekte kao što su inflamacija i eliminacija ćelija koje nose antigen. U skladu sa tim, predmetni pronalazak se dodatno odnosi na BDCA2-vezujuće proteine, uključujući antitela, sa izmenjenim, npr. povećanim ili redukovanim efektorskim funkcijama.

[0107] Efektorska funkcija anti-BDCA2 antitela predmetnog pronalaska može se odrediti upotrebom jednog od mnogih poznatih testova. Efektorska funkcija anti-BDCA2 antitela može se povećati ili redukovati u odnosu na drugo anti-BDCA2 antitelo. U nekim primerima izvođenja, drugo anti-BDCA2 antitelo može biti bilo koje antitelo koje se specifično vezuje za BDCA2. U drugim primerima izvođenja, drugo antitelo specifično za BDCA2 može biti bilo koje od antitela iz ovog pronalaska, kao što je BIIB059. U drugim primerima izvođenja, gde je anti-BDCA2 antitelo od interesa modifikovano radi povećanja ili redukovanja efektorske funkcije, drugo anti-BDCA2 antitelo može biti nemodifikovana ili roditeljska verzija antitela.

[0108] Efektorske funkcije uključuju ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), pri čemu se antitela vezuju za Fc receptore na citotoksičnim T ćelijama, ćelijama prirodnim ubicama (NK), ili makrofagima što dovodi do ćelijske smrti i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), što je ćelijska smrt izazvana aktivacijom kaskade komplementa (pregledno izloženo u Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997); Ward i Ghetie, Therapeutic Immunol., 2:77-94 (1995); i Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.

9:457-492 (1991)). Takve efektorske funkcije uobičajeno zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr. varijabilni domen antitela) i može se proceniti upotrebom standardnih testova koji su poznati u struci (videti npr. WO 05/018572, WO 05/003175, i S.A.D.6,242,195).

[0109] Efektorske funkcije se mogu izbeći upotrebom fragmenata antitela kojima nedostaje Fc domen, kao što su Fab, Fab'2, ili jednolančani Fv. Alternativa je upotreba antitela IgG4 podtipa, koje se vezuje za FcγRI, ali koje se slabo vezuje za C1q i FcγRII i RIII. Podtip IgG2 takođe ima redukovano vezivanje za Fc receptore, ali zadržava značajno vezivanje za H131 alotip FcγRIIa i za C1q. Stoga, potrebne su dodatne promene u Fc sekvenci da bi se eliminisalo vezivanje za sve Fc receptore i za C1q.

[0110] Nekoliko efektorskih funkcija antitela, uključujući ADCC, posredovane su Fc receptorima (FcR), koji vezuju Fc region antitela. Afinitet antitela za određeni FcR, i samim tim i efektorska aktivnost posredovana antitelom, može se modulisati izmenom aminokiselinske sekvence i/ili post-translacionim modifikacijama Fc i/ili konstantnog regiona antitela.

[0111] FcR su definisani svojom specifičnošću za izotipove imunoglobulina; Fc receptori za IgG antitela se označavaju kao FcγR, za IgE kao FcεR, za IgA kao FcαR i tako dalje. Identifikovane su tri podklase FcγR: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). I FcγRII i FcγRIII imaju dva tipa: FcγRIIa (CD32a) i FcγRIIB (CD32b); i FcγRIIIA (CD16a) i FcγRIIIB (CD16b). Pošto je svaka FcγR podklasa kodirana sa dva ili tri gena, i alternativno splajsovanje RNK dovodi do višestrukih transkripata, postoji velika raznolikost u FcγR izoformama. Na primer, FcγRII (CD32) uključuje izoforme IIa, IIb1, IIb2 IIb3 i IIc.

[0112] Vezujuće mesto na humanim i murinskim antitelima za FcγR prethodno je mapirano do takozvanog "donjeg regiona zgloba" koji se sastoji od ostataka 233-239 (EU indeks numerisanja kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Woof et al., Molec. Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Canfield i Morrison, J. Exp. Med., 173:1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040 (1991)). Od ostataka 233-239, P238 i S239 su među onima koji su navedeni kao verovatno uključeni u vezivanje. Druge prethodno navedene oblasti koje su verovatno uključene u vezivanje za FcγR su: G316-K338 (humani IgG) za humani FcγRI (Woof et al., Mol. Immunol., 23:319-330 (1986)); K274-R301 (humani IgG1) za humani FcγRIII (Sarmay et al., Molec. Immunol. 21:43-51 (1984)); i Y407-R416 (humani IgG) za humani FcγRIII (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans. 12:739-743 (1984) i Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604 (2001), Lazar GA et al., Proc Natl Acad Sci 103:4005-4010 (2006). Ovi i drugi nizovi ili regioni amino-kiselinskih ostataka koji su uključeni u vezivanje za FcR mogu

1

da budu evidentni veštom stručnjaku iz ispitivanja kristalnih struktura Ig-FcR kompleksa (videti npr. Sondermann et al., 2000 Nature 406(6793): 267-73 i Sondermann et al., 2002 Biochem Soc Trans. 30(4): 481-6). U skladu sa tim, anti-BDCA2 antitela predmetnog pronalaska uključuju modifikacije jednog ili više gore pomenutih ostataka (da bi se povećala ili smanjila efektorska funkcija prema potrebi).

[0113] Drugi pristup za izmenu efektorske funkcije monoklonalnog antitela uključuje mutiranje amino-kiselina na površini monoklonalnog antitela koje su uključene u interakcije efektorskog vezivanja (Lund, J. et al. (1991) J. Immunol. 147(8): 2657-62; Shields, R. L. et al., (2001) J. Biol. Chem.276 (9):6591-604).

[0114] Postupci povećanja efektorske funkcije antitela su dobro poznati u struci (videti, na primer, Kelley et al., Methods Mol. Biol., 901:277-93 (2012); Natsume et al., Drug Des Devel Ther., 3:7-16 (2009); SAD 8,188,231, SAD 7,960,512). U jednom primeru izvođenja, BDCA2 antitela imaju jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, ili više amino-kiselinskih supstitucija na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, i 337, pri čemu je numerisanje ostataka u Fc regionu po EU indeksu kao u Kabatu. U određenim primerima izvođenja, BDCA2 antitela imaju jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, ili više amino-kiselinskih supstitucija odabranih iz grupe koja se sastoji od: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, P238H, P238I, P238K, P238L, P238M, P238N, P238Q, P238R, P238S, P238T, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239E, S239F, S239G, S239H, S239I,

2

S239K, S239L, S239M, S239N, S239P, S239Q, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241L, F241R, F241S, F241W, F241Y, F243E, F243H, F243L, F243Q, F243R, F243W, F243Y, P244H, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262A, V262E, V262F, V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P, L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334L, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337H, i S337N, pri čemu je numerisanje ostataka u Fc regionu po EU indeksu kao u Kabatu. U naročitom primeru izvođenja, BDCA2 antitela sadrže jednu, dve, ili tri od sledećih mutacija: S239D, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S239D/I332E/G236A, S298A, A330L I332E, E333A, i K334A.

[0115] Prisustvo oligosaharida - specifično, N-vezanog oligosaharida za asparigin-297 u CH2 domenu IgG1 - je važno za vezivanje za FcγR, kao i C1q. Redukcija sadržaja fukoze u antitelima poboljšava efektorsku funkciju (videti, npr. SAD 8,163,551). U određenim primerima izvođenja BDCA2 antitela imaju redukovanu fukozilaciju i amino-kiselinske supstitucije koje povećavaju efektorsku funkciju (npr. jednu, dve, ili tri od sledećih mutacija: S298A; E333A, i K334A). Efektorska funkcija se takođe može postići pripremanjem i ekspresijom anti-BDCA2 antitela opisanih ovde u prisustvu inhibitora alfa-manozidaze I (npr.

4

kifunensina) pri koncentraciji inhibitora od oko 60-200 ng/mL (npr.60 ng/mL, 75 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL). Antitela eksprimirana u prisustvu inhibitora alfa-manozidaze I sadrže uglavnom glikane tipa oligomanoze i uobičajeno pokazuju povećanu ADCC aktivnost i afinitet za FcγRIIIA, ali redukovano vezivanje C1q.

[0116] Anti-BDCA2 antitela predmetne objave sa povećanom efektorskom funkcijom uključuju antitela sa povećanim afinitetom vezivanja za jedan ili više Fc receptora (FcR) u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno anti-BDCA2 antitelo. U skladu sa tim, anti-BDCA2 antitela sa povećanim afinitetom vezivanja za FcR uključuju anti-BDCA2 antitela koja pokazuju 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3 puta, 4 puta, ili 5 puta ili veće povećanje afiniteta vezivanja za jedan ili više Fc receptora u poređenju sa roditeljskim ili ne-varijantnim anti-BDCA2 antitelom. U nekim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa povećanom efektorskom funkcijom vezuje se za FcR sa oko 10 puta većim afinitetom u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno antitelo. U drugim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa povećanom efektorskom funkcijom vezuje se za FcR sa oko 15 puta većim afinitetom ili sa oko 20 puta većim afinitetom u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno antitelo. FcR receptor može biti jedan ili više od FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), i FcγRIII, i njihove izoforme, i FcεR, FcµR, FcδR, i/ili FcαR. U naročitim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa povećanom efektorskom funkcijom pokazuje 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3 puta, 4 puta, ili 5 puta ili veće povećanje afiniteta vezivanja za FcγRIIa.

[0117] Da bi se redukovala efektorska funkcija, može se upotrebljavati kombinacija segmenata sekvence različitog podtipa (npr. kombinacije IgG2 i IgG4) da bi se postigla veća redukcija vezivanja za Fcγ receptore nego bilo kog podtipa samog (Armour et al., Eur. J. Immunol., 29:2613-1624 (1999); Mol. Immunol., 40:585-593 (2003)). Pored toga, mesta N-vezane glikozilacije mogu se ukloniti kao način za redukovanje efektorske funkcije. Veliki broj Fc varijanti koje imaju izmenjene i/ili redukovane afinitete za neke ili sve podtipove Fc receptora (a time i za efektorske funkcije) je poznat u struci. Videti, npr. SAD 2007/0224188; SAD 2007/0148171; SAD 2007/0048300; SAD 2007/0041966; SAD 2007/0009523; SAD 2007/0036799; SAD 2006/0275283; SAD 2006/0235208; SAD 2006/0193856; SAD 2006/0160996; SAD 2006/0134105; SAD 2006/0024298; SAD 2005/0244403; SAD 2005/0233382; SAD 2005/0215768; SAD 2005/0118174; SAD 2005/0054832; SAD 2004/0228856; SAD 2004/132101; SAD 2003/158389; videti takođe SAD 7,183,387; 6,737,056; 6,538,124; 6,528,624; 6,194,551; 5,624,821; 5,648,260.

[0118] Anti-BDCA2 antitela predmetnog pronalaska sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju antitela sa redukovanim afinitetom vezivanja za jedan ili više Fc receptora (FcR) u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno anti-BDCA2 antitelo. U skladu sa tim, anti-BDCA2 antitela sa redukovanim afinitetom vezanja za FcR uključuju anti-BDCA2 antitela koja pokazuju 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3 puta, 4 puta, ili 5 puta ili veće smanjenje afiniteta vezivanja za jedan ili više Fc receptora u poređenju sa roditeljskim ili ne-varijantnim anti-BDCA2 antitelom. U nekim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa redukovanom efektorskom funkcijom vezuje se za FcR sa oko 10 puta manjim afinitetom u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno antitelo. U drugim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa redukovanom efektorskom funkcijom vezuje se za FcR sa oko 15 puta manjim afinitetom ili sa oko 20 puta manjim afinitetom u odnosu na roditeljsko ili ne-varijantno antitelo. FcR receptor može biti jedan ili više od FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), i FcγRIII, i njihove izoforme, i FcεR, FcµR, FcδR, i/ili FcαR. U naročitim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo sa redukovanom efektorskom funkcijom pokazuje 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3 puta, 4 puta, ili 5 puta ili veće smanjenje afiniteta vezivanja za FcγRIIa.

[0119] U CDC-u, antitelo-antigen kompleks vezuje komplement, što rezultira aktiviranjem kaskade komplementa i stvaranjem membranskog napadačkog kompleksa. Aktivacija klasičnog puta komplementa započinje vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitela (odgovarajuće potklase) koja su vezana za svoj kognitivni antigen; stoga je aktivacija kaskade komplementa delom regulisana afinitetom vezivanja imunoglobulina za C1q protein. Za aktiviranje kaskade komplementa, neophodno je da se C1q veže za najmanje dva molekula IgG1, IgG2, ili IgG3, ali samo jedan molekul IgM, prikačen na antigenski cilj (Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) p. 80). Za procenu aktivacije komplementa može biti izveden CDC test, npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0120] Predloženo je da različiti ostaci IgG molekula učestvuju u vezivanju za C1q uključujući Glu318, Lys320 i Lys322 ostatke na CH2 domenu, amino-kiselinski ostatak 331 koji se nalazi na krivini u neposrednoj blizini istog beta lanca, Lys235 i Gly237 ostaci koji se nalaze u donjem regionu zgloba, i ostaci 231 do 238 koji se nalaze u N-terminalnom regionu CH2 domena (videti npr. Xu et al., J. Immunol. 150: 152A (Apstrakt) (1993), WO94/29351; Tao et al., J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24:2542-47 (1994); Burton et al; Nature, 288:338-344 (1980); Duncan i Winter, Nature 332:738-40 (1988); Idusogie et al., J. Immunol.164:4178-4184 (2000; SAD 5,648,260 i SAD 5,624,821).

[0121] Anti-BDCA2 antitela sa poboljšanim vezivanjem C1q mogu da sadrže aminokiselinsku supstituciju na jednoj, dve, tri, ili četiri amino-kiselinske pozicije 326, 327, 333 i 334 humanog IgG Fc regiona, gde je numerisanje ostataka u Fc regionu IgG po EU indeksu kao u Kabatu. U jednom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitela uključuju sledeće aminokiselinske supstitucije: K326W/E333S, za koje se zna da povećavaju vezivanje IgG1 antitela za C1q (Steurer W. et al., J Immunol., 155(3):1165-74 (1995)).

[0122] Anti-BDCA2 antitela sa redukovanim C1q vezivanjem mogu da sadrže aminokiselinsku supstituciju na jednoj, dve, tri, ili četiri amino-kiselinske pozicije 270, 322, 329 i 331 humanog IgG Fc regiona, gde je numerisanje ostataka u Fc regionu IgG po EU indeksu kao u Kabatu. Kao primer kod IgG1, dve mutacije u COOH terminalnom regionu CH2 domena humanog IgG1- K322A i P329A - ne aktiviraju CDC put i pokazalo se da rezultuju većim od 100 puta smanjenjem vezivanja C1q (SAD 6,242,195).

[0123] U skladu sa tim, u određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo predmetnog pronalaska pokazuje povećano ili redukovano vezivanje za protein komplementa u odnosu na drugo anti-BDCA2 antitelo. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo pronalaska pokazuje povećano ili redukovano vezivanje za C1q sa faktorom od oko 1,5 puta ili više, oko 2 puta ili više, oko 3 puta ili više, oko 4 puta ili više, oko 5 puta ili više, oko 6 puta ili više, oko 7 puta ili više, oko 8 puta ili više, oko 9 puta ili više, oko 10 puta ili više, ili oko 15 puta ili više, u odnosu na drugo anti-BDCA2 antitelo.

[0124] Stoga, u određenim primerima izvođenja pronalaska, jedan ili više ovih ostataka mogu biti modifikovani, supstituisani, ili uklonjeni ili jedan ili više amino-kiselinskih ostataka mogu biti insertovani tako da povećaju ili smanje CDC aktivnost anti-BDCA2 antitela koja su ovde obezbeđena.

[0125] U određenim drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-BDCA2 antitelo koje pokazuje redukovano vezivanje za jedan ili više FcR receptora, ali koje zadržava svoju sposobnost vezivanja komplementa (npr. u sličnoj ili, u nekim primerima izvođenja, u manjoj meri od nativnog, ne-varijantnog, ili roditeljskog anti-BDCA2 antitela). U skladu sa tim, anti-BDCA2 antitelo predmetnog pronalaska može da vezuje i aktivira komplement dok pokazuje redukovano vezivanje za FcR, kao što je, na primer, FcγRIIa (npr. FcγRIIa eksprimiran na krvnim pločicama). Takvo antitelo sa redukovanim ili nikakvim vezivanjem za FcγRIIa (kao što je FcγRIIa eksprimiran na krvnim pločicama, na primer), ali da može da vezuje C1q i aktivira kaskadu komplementa barem do nekog stepena, redukovaće rizik od tromboembolijskih događaja uz održavanje moguće poželjnih efektorskih funkcija. U alternativnim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo predmetnog pronalaska pokazuje redukovano vezivanje za jedan ili više FcR, ali održava svoju sposobnost da vezuje jedan ili više drugih FcR. Pogledati, na primer, SAD 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856, i 2004-0191244, koji opisuju različite amino-kiselinske modifikacije koje stvaraju antitela sa redukovanim vezivanjem za FcRI, FcRII, i/ili FcRIII, kao i aminokiselinske supstitucije koje rezultuju povećanim vezivanjem za jedan FcR, ali smanjenim vezivanjem za drugi FcR.

[0126] U skladu sa tim, efektorske funkcije koje uključuju konstantni region anti-BDCA2 antitela mogu biti modulisane putem izmene svojstava konstantnog regiona, i posebno Fc regiona. U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo koje ima povećanu ili smanjenu efektorsku funkciju upoređuje se sa drugim antitelom sa efektorskom funkcijom i koje može biti ne-varijantno, nativno, ili roditeljsko antitelo koje sadrži nativni konstantni ili Fc region koji posreduje u efektorskoj funkciji.

[0127] Nativna sekvenca Fc ili konstantnog regiona sadrži amino-kiselinsku sekvencu identičnu amino-kiselinskoj sekvenci Fc ili konstantnog regiona lanca koji se nalazi u prirodi. Poželjno, kontrolni molekul upotrebljen za procenu relativne efektorske funkcije sadrži isti tip/podtip Fc regiona kao i test ili varijantno antitelo. Varijantni ili izmenjeni Fc ili konstantni region sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one nativne sekvence regiona teškog lanca po najmanje jednoj amino-kiselinskoj modifikaciji (kao što su, na primer, posttranslaciona modifikacija, amino-kiselinska supstitucija, insercija, ili delecija). U skladu sa tim, varijantni konstantni region može sadrži jednu ili više amino-kiselinske supstitucije, delecije, ili insercije što rezultira izmenjenim post-translacionim modifikacijama, uključujući, na primer, izmenjeni obrazac glikozilacije. Roditeljsko antitelo ili Fc region je, na primer, varijanta koja ima normalnu efektorsku funkciju koja se upotrebljava za konstruisanje konstantnog regiona (tj. Fc) koji ima izmenjenu, npr. povećanu efektorsku funkciju.

[0128] Antitela sa izmenjenom (npr. povećanom) efektorskom funkcijom(ama) mogu se stvoriti inženjeringom ili proizvodnjom antitela sa regionima varijantnog konstantnog, Fc, ili teškog lanca. Rekombinantna DNK tehnologija i/ili ćelijska kultura i uslovi ekspresije mogu se upotrebljavati za proizvodnju antitela sa izmenjenom funkcijom i/ili aktivnošću. Na primer, rekombinantna DNK tehnologija može se upotrebljavati za inženjering jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili insercija u regionima (kao što su, na primer, Fc ili konstantni regioni) koji utiču na funkciju antitela, uključujući efektorske funkcije. Alternativno, promene u post-translacionim modifikacijama, kao što su npr. obrasci glikozilacije, mogu se postići manipulisanjem ćelije domaćina i ćelijskom kulturom i uslovima ekspresije u kojima se antitelo proizvodi.

[0129] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-BDCA2 antitelo koje sadrži CDR sekvence teškog lanca odabrane od VH CDR1 od SEQ ID NO: 9, VH CDR2 od SEQ ID NO: 10, i VH CDR3 od SEQ ID NO: 11; i CDR sekvence lakog lanca odabrane od VL CDR1 od SEQ ID NO: 5, VL CDR2 od SEQ ID NO: 6, i VL CDR3 od SEQ ID NO: 7. Ova anti-BDCA2 antitela i) inhibiraju sekreciju interferona tipa I i/ili interferona tipa III pored drugih citokina i hemokina iz plazmocitoidnih dendritskih ćelija; i/ili (ii) indukuju ili pojačavaju uklanjanje plazmocitoidnih dendritskih ćelija in vitro.

[0130] Pronalazak se odnosi na anti-BDCA2 antitelo koje sadrži VL sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 23, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje redukovanu efektorsku funkciju u poređenju sa nativnim ili roditeljskim Fc regionom. Pronalazak se odnosi na anti-BDCA2 antitelo koje sadrži VH sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 24, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje redukovanu efektorsku funkciju u poređenju sa nativnim ili roditeljskim Fc regionom.

[0131] Postupci za stvaranje bilo koje od gore pomenutih varijanti anti-BDCA2 antitela koja sadrže amino-kiselinske supstitucije su dobro poznati u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, pripremu pomoću mutageneze usmerene na mesto (ili posredovanu oligonukleotidom), PCR mutageneze, i kasetne mutageneze pripremljenog molekula DNK koji kodira antitelo ili najmanje konstantni region antitela. Mutageneza usmerena na mesto je dobro poznata u struci (videti, na primer, Carter et al., Nucleic Acids Res., 13:4431-4443 (1985) i Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1987)). PCR mutageneza je takođe pogodna za pravljenje varijanti amino-kiselinske sekvence polaznog polipeptida. Videti Higuchi, u PCR protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990); i Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989). Drugi postupak za pripremu varijanti sekvence, kasetna mutageneza, je zasnovana na tehnici koju su opisali Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985).

Anti-BDCA2 antitela sa izmenjenom glikozilacijom

[0132] Različite glikoforme mogu duboko uticati na svojstva terapeutika, uključujući farmakokinetiku, farmakodinamiku, interakciju sa receptorom i tkivno specifično usmeravanje (Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3:285-297). Konkretno, za antitela, oligosaharidna struktura može uticati na svojstva relevantna za rezistenciju na proteazu, poluživot antitela u serumu koji je posredovan FcRn receptorom, fagocitozu i povratnu informaciju antitela, pored efektorskih funkcija antitela (npr. vezivanje za kompleks komplementa C1, koji indukuje CDC, i vezivanje za FcγR receptore, koji su odgovorni za modulaciju ADCC puta) (Nose i Wigzell, 1983; Leatherbarrow i Dwek, 1983; Leatherbarrow et al., 1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, PNAS, 89: 4285-4289).

[0133] U skladu sa tim, drugi načini za modulaciju efektorske funkcije antitela uključuju izmenu glikozilacije konstantnog regiona antitela. Izmenjena glikozilacija uključuje, na primer, smanjenje ili povećanje broja glikozilovanih ostataka, promenu obrasca ili lokacije glikozilovanih ostataka, kao i promenu strukture(a) šećera. Oligosaharidi koji se nalaze na humanim IgG utiču na njihov stepen efektorske funkcije (Raju, T.S. BioProcess International, april 2003.44-53); mikroheterogenost humanih IgG oligosaharida može uticati na biološke funkcije kao što su CDC i ADCC, vezivanje za različite Fc receptore, i vezivanje za C1q protein (Wright A. i Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32; Shields et al., J Biol Chem 2001276(9):6591-604; Shields et al., J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40; Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 278(5):3466-73; Umana et al., Nat. Biotechnol, 1999. feb; 17(2):176-80). Na primer, sposobnost IgG da vezuje C1q i aktivira kaskadu komplementa može zavisiti od prisustva, odsustva ili modifikacije ugljenohidratnog dela smeštenog između dva CH2 domena (koji je normalno usidren na Asn297) (Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995).

[0134] Mesta glikozilacije u polipeptidu koji sadrži Fc, na primer antitelo kao što je IgG antitelo, mogu se identifikovati pomoću standardnih tehnika. Identifikacija mesta glikozilacije može biti eksperimentalna ili zasnovana na analizi sekvence ili modelovanim podacima. Opisani su konsenzus motivi, to jest, amino-kiselinska sekvenca koju prepoznaju različite glikozil transferaze. Na primer, konsenzus motiv za N-vezani glikozilacioni motiv je često NXT ili NXS, gde X može biti bilo koja amino-kiselina izuzev prolina. Takođe je opisano nekoliko algoritama za lociranje potencijalnog motiva glikozilacije. U skladu sa tim, da bi se identifikovala potencijalna mesta glikozilacije unutar antitela ili fragmenta koji sadrži Fc, ispituje se sekvenca antitela, na primer, upotrebom javno dostupnih baza podataka kao što je web lokacija koju pruža Centar za analizu biološke sekvence (Center for Biological Sequence Analysis) (videti NetNGlyc servise za predviđanje mesta N-vezane glikozilacije i NetOGlyc servise za predviđanje mesta O-vezane glikozilacije).

[0135] In vivo studije su potvrdile redukciju efektorske funkcije aglikozil antitela. Na primer, aglikozil anti-CD8 antitelo nije u stanju da ukloni ćelije koje nose CD8 kod miševa (Isaacs, 1992 J. Immunol. 148: 3062) i aglikozil anti-CD3 antitelo ne indukuje sindrom oslobađanja citokina kod miševa ili ljudi (Boyd 1995, supra; Friend, 1999 Transplantion 68:1632). Aglikozilovani oblici BDCA2 antitela takođe imaju redukovanu efektorsku funkciju.

[0136] Važno je da iako uklanjanje glikana u CH2 domenu izgleda da ima značajan efekat na efektorsku funkciju, druga funkcionalna i fizička svojstva antitela ostaju neizmenjena. Specifično, pokazano je da uklanjanje glikana ima malo do nimalo efekta na poluživot u serumu i vezivanje za antigen (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Imunol.29:949).

[0137] Anti-BDCA2 antitela predmetnog pronalaska mogu biti modifikovana ili izmenjena tako da izazovu povećanu ili smanjenu efektorsku funkciju(e) (u poređenju sa drugim antitelom specifičnim za BDCA2). Postupci za izmenu mesta glikozilacije antitela su opisani, npr. u SAD 6,350,861 i SAD 5,714,350, WO 05/18572 i WO 05/03175; ovi postupci se mogu upotrebljavati za proizvodnju anti-BDCA2 antitela ovog pronalaska sa izmenjenom, redukovanom, ili bez glikozilacije.

Indikacije

[0138] Ovde opisano anti-BDCA2 antitelo može se upotrebljavati za lečenje ili sprečavanje raznih imunskih poremećaja, kao što su inflamatorni i autoimunski poremećaji. Anti-BDCA2 antitela su korisna za lečenje ili sprečavanje takvih poremećaja najmanje zbog toga što onemogućavaju ili uklanjaju pDC-e, i/ili inhibiraju inflamatorne citokine i hemokine proizvedene od strane pDC-a, i/ili smanjuju CD32a, i/ili inhibiraju stimulaciju imunskog kompleksa pDC-a, i/ili smanjuju ili izazvaju oslobađanje CD62L. Anti-BDCA2 antitela ove objave mogu se kombinovati sa antimalarijskim agensom (npr. HCQ) za poboljšane terapijske efekte u lečenju inflamatornih i autoimunskih poremećaja. Anti-BDCA2 antitela se mogu upotrebljavati za redukciju nivoa citokina i hemokina kao što su: interferoni tipa I, interferoni tipa III, IL-6, TNF-α, MIP1-α i MIP1-β, CCL5, i IP-10. IFN-i tipa I čine višečlanu porodicu citokina, uključujući 13 podtipova IFN-α, IFN-β, -ε, -κ, -ω, -δ i -τ. (Theofilopoulos, Annu. Rev. Immunol., 23:307-36 (2005)). Interferoni tipa III se sastoje od tri IFN-λ molekula zvana IFN- λ1, IFN- λ2 i IFN- λ3 (takođe označeni kao IL29, IL28A i IL28B, respektivno). Uklanjanjem i/ili prigušivanjem pDC funkcije, ovde opisana anti-BDCA2 antitela obezbeđuju robusniji pristup lečenju od tretmana koji pokušavaju da redukuju specifične IFN podtipove neutrališućim antitelima. Pored toga, pristup lečenja anti-BDCA2 antitelima fokusiran na pDC je selektivniji i potencijalno bezbedniji od globalne blokade IFN odgovora. Na primer, ovde opisana anti-BDCA2 antitela efikasno eliminišu IFN-e tipa I poreklom od pDC dok zadržavaju druge izvore IFN-a koji bi mogao da bude neophodan u slučaju virusnih infekcija.

[0139] Termin "lečenje" označava primenu ovde opisane kompozicije u količini, na način, i/ili modus koji je efikasan da poboljša stanje, simptom, ili parametar povezan sa poremećajem ili da spreči progresiju ili pogoršanje poremećaja (uključujući sekundarno

1

oštećenje izazvano poremećajem) do bilo statistički značajnog stepena ili do stepena koji stručnjak u oblasti može detektovati.

[0140] Bolesti ili stanja koja se mogu lečiti ovde opisanim anti-BDCA2 antitelom uključuju, na primer, sistematski eritemski lupus (SLE) (npr. umereni ili težak lupus), lupus kože, diskoidni lupus, lupus nefritis, sistemsku sklerozu (skleroderma), morfeu, psorijazu, reumatoidni artritis, inflamatornu bolest creva (IBD), dermatomiozitis, polimiozitis, i dijabetes tipa I.

[0141] SLE je hronična autoimunska bolest kod koje je više organa oštećeno imunskim kompleksima i tkivo-vezujućim autoantitelima (videti, Guidelines for Referral and Management of Systemic Lupus Erythematosus in Adults, Arthritis & Rheumatism, 42(9):1785-1795 (1999)). Autoantitela su prisutna u SLE i mogu prethoditi razvoju kliničke bolesti (Arbuckle et al., N. Engl. J. Med., 349(16):1526-33 (2003)). Internalizacija imunskih kompleksa koji sadrže autoantitela posredstvom Fc receptora dovodi do proizvodnje interferona tipa I koji zauzvrat promoviše gubitak tolerancije, nastavljajući začarani krug autoimunosti (Means et al., Ann N Y Acad Sci., 1062:242-51 (2005)). SLE je heterogen u pogledu svoje kliničke prezentacije, toka, prognoze i genetike. Afroamerikanci dele povećan rizik za SLE koji je često teži u poređenju sa belim pacijentima. Nedostaci komplementa prepoznati su rano kao faktori rizika za razvoj SLE. U novije vreme genetski polimorfizmi povezani sa putevima interferona tipa I su opisani da daju podložnost. Na primer, antidvolančana DNK i anti-Ro auto-antitela bila su povezana sa određenim haplotipom transkripcionog faktora interferon regulatornog faktora 5 (IRF5). Haplotip je takođe predvideo visoke nivoe IFN-α u serumu pacijenata sa SLE (Niewold et al., Ann. Rheum. Dis., 71(3):463-8 (2012)). Viši nivoi IFN-α koreliraju sa većim stepenom uključenosti više organa kod pacijenata sa SLE (Bengtsson et al., Lupus, 9(9):664-71 (2000)). Osim toga, čini se da je takozvani "potpis interferona" istaknut u SLE. Potpis interferona predstavlja obrazac ekspresije iRNK interferon inducibilnih gena. Potpis interferona tipa I nalazi se kod više od polovine pacijenata sa SLE i povezan je sa većom aktivnošću bolesti (Baechler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(5):2610-5 (2003)). IFN-α monoklonalna antitela sada su ušla u klinike i rezultati faze 1 sifalimumaba i rontalizumaba su pokazali redukciju zavisnu od doze kod potpisa IFN tipa I u punoj krvi pacijenata sa SLE (McBride et al., Arthritis Rheum., 64(11):3666-76 (2012); Yao et al., Arthritis Rheum., (6):1785-96 (2009)). Validirani pokazatelji razvijeni su za procenu aktivnosti bolesti i težine bolesti (npr. umerena, teška) (videti npr. Gladman, Prognosis and treatment of systemic lupus erythematosus, Curr. Opin. Rheumatol., 8:430-437 (1996); Kalunian et al., Definition, classification, activity and damage

2

indices. U: Dubois' lupus erythematosus. 5<th>ed., Baltimore: Williams and Wilkins; pp. 19-30 (1997)).

[0142] Sistemska skleroza ili sistemska skleroderma je sistemska autoimunska bolest ili sistemska bolest vezivnog tkiva koja je podtip skleroderme. Karakterišu je depozicije kolagena u koži i, ređe, u bubrezima, srcu, plućima i želucu. Odnos žena prema muškarcima za ovu bolest je 4:1. Pik starosti za početak bolesti je između 30-50 godina.

[0143] Psorijaza je autoimunska bolest koja pogađa kožu. Javlja se kada imunski sistem pogrešno vidi ćelije kože kao patogen, i šalje pogrešne signale koji ubrzavaju ciklus rasta ćelija kože. Psorijaza je povezana sa povećanim rizikom od moždanog udara, i lečenje visokog nivoa lipida u krvi može dovesti do poboljšanja. Postoji pet tipova psorijaze: plak, gutatna, inverzna, pustularna, i eritrodermijska. Najčešći oblik, plak psorijaza, uobičajeno se vidi kao crvena i bela nijansa ljuskavih površina koje se pojavljuju na gornjem prvom sloju epiderma. Međutim, neki pacijenti nemaju dermatološke znakove ili simptome.

[0144] Reumatoidni artritis je hronični inflamatorni poremećaj koji pogađa mnoga tkiva i organe, ali uglavnom napada fleksibilne zglobove. Proces uključuje inflamatorni odgovor kapsule oko zglobova sekundarno na bubrenje sinovijalnih ćelija, višak sinovijalne tečnosti, i razvoj vlaknastog tkiva (panus) u sinovijumu. Patologija procesa bolesti često dovodi do uništavanja zglobne hrskavice i ankiloze zglobova. Reumatoidni artritis takođe može proizvesti difuznu inflamaciju u plućima, membrani oko srca (perikardijum), membranama pluća (pleura), i beonjači oka (skleri), kao i nodularne lezije, najčešće u potkožnom tkivu. Iako je uzrok reumatoidnog artritisa nepoznat, autoimunost igra ključnu ulogu i u hroničnosti i u progresiji, i RA se smatra sistemskom autoimunskom bolešću. Prekomerna ekspresija TNFα i drugih proinflamatornih citokina je uošena kod pacijenata sa artritisom (Feldmann et al., Prog Growth Factor Res., 4:247-55 (1992)). Osim toga, transgene životinje koje prekomerno eksprimiraju humani TNFα razvijaju erozivni poliartritis sa mnogim karakteristikama povezanim sa bolešću (Keffer et al., EMBO J., 10(13):4025-31 (1991)). Analgezija i antiinflamatorni lekovi, uključujući steroide, upotrebljavaju se za suzbijanje simptoma, dok su antireumatski lekovi koji menjaju bolest (DMARD) potrebni da inhibiraju ili zaustave imunski proces koji leži u osnovi i spreče dugoročno oštećenje. U novije vreme, terapija anti-TNFα antitelom (Rituximab) je upotrebljena za upravljanje bolešću (Edwards, et al., N. Engl. J. Med., 350(25):2572-81 (2004)).

[0145] Inflamatorna bolest creva (IBD) je grupa inflamatornih stanja debelog i tankog creva. Glavni tipovi IBD su Kronova (Chrohn ꞌs) bolest i ulcerozni kolitis (UC). Glavna razlika između Kronove bolesti i UC je lokacija i priroda inflamatornih promena: Kronova bolest može pogoditi bilo koji deo gastrointestinalnog trakta, od usta do anusa (diskontinuitetne lezije), iako većina slučajeva započinje u završnom delu ileuma; dok je UC ograničen na debelo crevo i rektum. U zavisnosti od stepena težine, IBD može zahtevati imunosupresiju za kontrolu simptoma, kao što su prednizon, TNF inhibicija, azatioprin (imuran), metotreksat, ili 6-merkaptopurin. Češće, lečenje IBD zahteva oblik mesalazina.

[0146] Dermatomiozitis (DM) je tip autoimunske bolesti vezivnog tkiva koja se odnosi na polimiozitis (PM) koji je okarakterisan inflamacijom mišića i kože. Iako DM najčešće pogađa kožu i mišiće, to je sistemski poremećaj koji može zahvatiti i zglobove, jednjak, pluća i, ređe, srce.

[0147] Polimiozitis (PM) ("inflamacija mnogih mišića") je tip hronične inflamacije mišića (inflamatorne miopatije) povezane sa dermatomiozitisom i miozitisom sa inkluzionim telima.

[0148] Dijabetes tipa I je oblik dijabetes melitusa koji je rezultat autoimunske destrukcije beta ćelija pankreasa koje proizvode insulin. Naknadni nedostatak insulina dovodi do povećanja glukoze u krvi i urinu. Klasični simptomi su poliurija, polidipsija, polifagija, i gubitak telesne težine.

[0149] Primeri drugih bolesti pogodnih za lečenje anti-BDCA2 antitelima koja su ovde opisana uključuju astmu, Behčetovu (Behcetꞌs) bolest, CREST sindrom, Kronovu bolest, dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, dijabetes melitus, diskoidni eritemski lupus, plućnu fibrozu, autoimunski glomerulonefritis, membransku glomerulopatiju, juvenilni reumatoidni artritis (juvenilni hronični artritis), mešovitu bolest vezivnog tkiva, multipla sklerozu, nefrotski sindrom, panikulitis, pemfigoid, pemfigus, eritematozni pemfigus, pemfigus foliaceus, pemfigus vulgaris, reumatsku polimialgiju, sistemsku sklerozu, progresivnu sistemsku sklerozu (skleroderma), morfeu (lokalizovanu skleroderma), multipla sklerozu, psorijazu, psorijazni artritis, plućnu fibrozu, Rejnoov (Raynaudꞌs) fenomen/sindrom, Sjogrenov sindrom, i ulcerozni kolitis.

[0150] Subjektu koji je u riziku za, kome je dijagnostifikovan, ili koji ima neki od ovih poremećaja može se primeniti anti-BDCA2 antitelo u količini i tokom vremena da se obezbedi opšti terapijski efekat. Anti-BDCA2 antitelo može se primeniti samostalno (monoterapija) ili u kombinaciji sa drugim agensima (kombinovana terapija). U jednom primeru izvođenja, agens za upotrebu u kombinovanoj terapiji sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde je antimalarijski agens. U jednom primeru izvođenja, agens za upotrebu u kombinovanoj terapiji sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde je inhibitor signalizacije TLR7 i/ili TLR9. U drugom primeru izvođenja, agens za upotrebu u kombinovanoj terapiji sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde je kortikosteroid. U određenim primerima izvođenja,

4

agens za upotrebu u kombinovanoj terapiji sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde je antimalarijski lek i/ili inhibitor kinaze (npr. BTK inhibitor (npr. ibrutinib (PCI-32765), AVI-292, ONO-WG-307), JAK1 inhibitor, JAK2 inhibitor, JAK3 inhibitor, Tyk2 inhibitor). U posebnom primeru izvođenja, agens za upotrebu u kombinovanoj terapiji sa anti-BDCA2 antitelom opisanim ovde je hidroksihlorokin. Količine i vremena primene za kombinovane terapije mogu biti one koje obezbeđuju, na primer, aditivni ili sinergistički terapijski efekat. Dodatno, primena anti-BDCA2 antitela (sa ili bez drugog agensa) može se upotrebljavati kao primarno, npr. prva linija lečenja, ili kao sekundarno lečenje, npr. kod subjekata koji imaju neadekvatan odgovor na prethodno primenjenu terapiju (tj. terapija drugačija od one sa anti-BDCA2 antitelom). U nekim primerima izvođenja, kombinovana terapija uključuje upotrebu anti-BDCA2 antitela i jednog ili više od sledećih agenasa: glukokortikoid, NSAID, prednizon, hidroksihlorokin, hlorokin, amodiakin, pirimetamin, proguanil, meflokin, dapson, primakin, metotreksat, mikofenolat mofetil, azatioprin, talidomid, ciklofosfamid, ciklosporin A, rapamicin, prostaciklin, inhibitor fosfodiesteraze, antagonisti endotelina, statin, ACE inhibitor, i blokatori kalcijumovog kanala. U drugim primerima izvođenja, kombinovana terapija uključuje upotrebu anti-BDCA2 antitela i bilo kog ili više od: sulfasalazina, doksiciklina, minociklina, penicilamina, tofacitiniba, i leflunomida.

Farmaceutske kompozicije

[0151] Anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde, može se formulisati kao farmaceutska kompozicija za primenu subjektu, npr. za lečenje poremećaja opisanog ovde. Tipično, farmaceutska kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, oblažuće materije, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Kompozicija može uključivati farmaceutski prihvatljivu so, npr. kiselu adicionu so ili baznu adicionu so (videti npr. Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sci., 66:1-19).

[0152] Farmaceutska formulacija je dobro uspostavljena struka i dodatno je opisana, na primer, u Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7<th>Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); i Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3<rd>ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

[0153] Farmaceutske kompozicije mogu biti u različitim oblicima. One uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr. rastvori za injektiranje i infuziju), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Poželjni oblik može zavisiti od planiranog načina primenjivanja i terapijske primene. Tipično kompozicije za ovde opisane agense su u obliku rastvora za injektiranje ili infuziju.

[0154] U jednom primeru izvođenja, anti-BDCA2 antitelo opisano ovde je formulisano sa ekscipijentnim materijalima, kao što su natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum dibazični fosfat heptahidrat, natrijum monobazični fosfat, Tween-80, i stabilizator. Može se obezbediti, na primer, u puferisanom rastvoru u odgovarajućoj koncentraciji i može se skladištiti na 2-8°C. U nekim drugim primerima izvođenja, pH kompozicije je između oko 5,8 i 6,6 (npr.5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6).

[0155] Farmaceutske kompozicije mogu takođe uključivati agense koji redukuju agregaciju BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kada je formulisano. Primeri agenasa za redukovanje agregacije uključuju jednu ili više amino-kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od metionina, arginina, lizina, asparaginske kiseline, glicina, i glutaminske kiseline. Ove amino-kiseline se mogu dodati u formulaciju do koncentracije od oko 0,5 mM do oko 145 mM (npr. 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Farmaceutske kompozicije mogu takođe uključivati šećer (npr. saharozu, trehalozu, manitol, sorbitol, ili ksilitol) i/ili modifikator toničnosti (npr. natrijum hlorid, manitol, ili sorbitol) i/ili surfaktant (npr. polisorbat-20 ili polisorbat-80).

[0156] Takve kompozicije mogu se primenjivati parenteralnim modelom (npr. intravenska, subkutana, intraperitonealna ili intramuskularna injekcija). U jednom slučaju, kompozicije anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se primenjuju subkutano. U jednom slučaju, kompozicije anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se primenjuju intravenski. Fraze "parenteralna primena" i "primenjeno parenteralno" kako se ovde upotrebljavaju podrazumevaju modele primene druge nego enteralnu i topikalnu primenu, uobičajeno injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0157] Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom, ili druga naručena struktura pogodna za stabilno skladištenje u visokoj koncentraciji. Sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti tako što će se uključiti ovde opisan agens u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, po potrebi, praćeno filtriranom sterilizacijom. Uobičajeno, disperzije se pripremaju tako što se ovde opisani agens uključuje u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzni medijum i druge potrebne sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci za pripremu su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koji daju prašak ovde opisanog agensa plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora. Ispravna fluidnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom oblažućih materija kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija injekcione kompozicije može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.

[0158] U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se pripremiti sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implantate, i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri se mogu upotrebljavati, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati. Videti, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978).

[0159] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr. BIIB059) u koncentraciji od oko 0,5 mg/mL do 300 mg/mL (npr. 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL), formulisan sa natrijum citratom, natrijum hloridom i opciono Tween-80 (0,01-0,1%, npr. 0,03%, 0,05%, ili 0,7%). pH formulacije može biti između 5,5 i 7,5 (npr. 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,97,0, 7,1, 7,3).

Primenjivanje

[0160] Anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primenjivati subjektu, npr. subjektu kome je to potrebno, na primer, humanom subjektu, raznim postupcima. Za mnoge primene, put primenjivanja je jedan od: intravenske injekcije ili infuzije (IV), subkutane injekcije (SC), intraperitonealno (IP), ili intramuskularne injekcije. Takođe je moguće upotrebljavati intraartikularnu isporuku. Takođe se mogu upotrebljavati i drugi modeli parenteralnog primenjivanja. Primeri takvih modela uključuju: intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, transtrahealnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, i epiduralnu i intrasternalnu injekciju. U nekim slučajevima, primenjivanje može biti oralna.

[0161] Put i/ili model primenjivanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta takođe se mogu prilagoditi za pojedinačni slučaj, npr. praćenjem subjekta, npr. upotrebom tomografskog snimanja, npr. za vizualizaciju tumora.

[0162] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti kao fiksna doza, ili u mg/kg dozi. Doza se takođe može izabrati da redukuje ili izbegne proizvodnju antitela prema anti-BDCA2 antitelu. Režimi doziranja se podešavaju tako da obezbede željeni odgovor, npr. terapijski odgovor ili kombinatorni terapijski efekat. Uopšteno, doze anti-BDCA2 antitela (i opciono drugog agensa) mogu se upotrebljavati da bi se subjektu obezbedio agens u bioraspoloživim količinama. Na primer, doze u rasponu od 0,1-100 mg/kg, 0,5-100 mg/kg, 1 mg/kg -100 mg/kg, 0,5-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg, ili 1-10 mg/kg mogu se primeniti. Takođe se mogu upotrebljavati i druge doze. U specifičnim slučajevima, subjektu kome je potrebno lečenje anti-BDCA2 antitelom primenjuje se antitelo u dozi 2 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, ili 40 mg/kg.

[0163] Kompozicija može sadržati oko 1 mg/ml do 100 mg/ml ili oko 10 mg/ml do 100 mg/ml ili oko 50 do 250 mg/ml ili oko 100 do 150 mg/ml ili oko 100 do 250 mg/ml anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0164] U određenim primerima izvođenja, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u kompoziciji je pretežno u monomernom obliku, npr. najmanje oko 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 98,5% ili 99% u monomernom obliku. Određene kompozicije anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta mogu sadržati manje od oko 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3 ili 0,1% agregata, kao što je detektovano, npr. pomoću UV na A280 nm. Određene kompozicije anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta sadrže manje od oko 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 ili 0,1% fragmenata, kao što je detektovano, npr. pomoću UV na A280 nm.

[0165] Oblik dozne jedinice ili "fiksna doza" kako se ovde upotrebljava označava fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji treba da se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat udruženu sa potrebnim farmaceutskim nosačem i opciono udruženu sa drugim agensom. Može se dati jedna ili višestruke doze. Alternativno, ili pored toga, antitelo se može primeniti kontinuiranom infuzijom.

[0166] Doza anti-BDCA2 antitelo ili njegovog antigen-vezujućeg fragment može se primenjivati, npr. u periodičnom intervalu tokom vremenskog perioda (trajanje lečenja) koji je dovoljan da obuhvati najmanje 2 doze, 3 doze, 5 doza, 10 doza, ili više, npr. jednom ili dva puta dnevno, ili oko jedan do četiri puta nedeljno, ili poželjno nedeljno, dvonedeljno (svake dve nedelje), svake tri nedelje, mesečno, npr. tokom između oko 1 do 12 nedelja, poželjno između 2 do 8 nedelja, poželjnije između oko 3 do 7 nedelja, i još poželjnije tokom oko 4, 5, ili 6 nedelja. Faktori koji mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje subjekta uključuju, na primer, težinu bolesti ili poremećaja, formulaciju, put isporuke, prethodna lečenja, opšte zdravstveno stanje i/ili starost subjekta, i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje subjekta sa terapijski efikasnom količinom jedinjenja može uključivati pojedinačni tretman ili, poželjno, može uključivati seriju tretmana.

[0167] Ukoliko je subjekt u riziku od razvoja imunskog poremećaja koji je ovde opisan, antitelo se može primeniti pre punog početka imunskog poremećaja, npr. kao preventivna mera. Trajanje takvog preventivnog tretmana može biti jedna doza antitela ili se tretman može nastaviti (npr. višestruke doze). Na primer, subjekt koji je u riziku od poremećaja ili koji ima predispoziciju za poremećaj može biti tretiran antitelom danima, nedeljama, mesecima, ili čak godinama tako da spreči da se poremećaj pojavi ili ispuni.

[0168] Farmaceutska kompozicija može uključivati "terapijski efikasnu količinu" ovde opisanog agensa. Takve efikasne količine mogu se odrediti na osnovu efekta primenjenog agensa, ili kombinatornog efekta agenasa ukoliko se upotrebljava više od jednog agensa. Terapijski efikasna količina agensa može takođe varirati u skladu sa faktorima kao što su stadijum bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinca, npr. poboljšanje najmanje jednog parametra poremećaja ili poboljšanje najmanje jednog simptoma poremećaja. Terapijski efikasna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti kompozicije nadjačani terapijski povoljnim efektima.

[0169] U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje subkutano u koncentraciji od oko 1 mg/mL do oko 300 mg/mL (npr.1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL). U jednom slučaju, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje subkutano u koncentraciji od 50 mg/mL. U drugom slučaju, anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje intravenski u koncentraciji od oko 1 mg/mL do oko 300 mg/mL. U naročitom slučaju, antiBDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje intravenski u koncentraciji od 50 mg/mL.

Uređaji i kompleti za terapiju

[0170] Farmaceutske kompozicije koje uključuju anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment mogu se primeniti medicinskim uređajem. Uređaj može biti dizajniran sa karakteristikama kao što su prenosivost, skladištenje na sobnoj temperaturi, i jednostavna upotreba tako da se može upotrebljavati u hitnim situacijama, npr. od strane neobučenog subjekta ili od strane osoblja hitne službe na terenu, udaljeno od medicinskih ustanova i druge medicinske opreme. Uređaj može uključivati, na primer, jedno ili više kućišta za čuvanje farmaceutskih preparata koji uključuju anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, i može biti konfigurisan za isporuku jedne ili više jediničnih doza antitela. Uređaj može biti dodatno konfigurisan za primenu drugog agensa, npr. hemioterapijskog agensa, bilo kao pojedinačne farmaceutske kompozicije koja takođe uključuje anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili kao dve odvojene farmaceutske kompozicije.

[0171] Farmaceutska kompozicija se može primeniti špricom. Farmaceutska kompozicija se takođe može primeniti uređajem za hipodermijsko injektiranje bez igle, kao što su uređaji objavljeni u SAD 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula uključuju: SAD 4,487,603, koji objavljuje mikro-infuzijsku pumpu koja se može implantirati za izdavanje medikamenta kontrolisanom stopom; SAD 4,486,194, koji objavljuje terapijski uređaj za primenu medikamenata kroz kožu; SAD 4,447,233, koji objavljuje pumpu za infuziju medikacije za isporuku medikacije preciznom stopom infuzije; SAD 4,447,224, koji objavljuje infuzijski aparat sa varijabilnim protokom koji se može implantirati za kontinuiranu isporuku leka; SAD 4,439,196, koji objavljuje osmotski sistem za isporuku leka koji ima kompartmente sa više komora; i SAD 4,475,196, koji objavljuje osmotski sistem za isporuku leka. Takođe su poznati mnogi drugi uređaji, implantati, sistemi za isporuku, i moduli.

[0172] Anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se obezbediti u kompletu. U jednom primeru izvođenja, komplet uključuje (a) kontejner koji sadrži kompoziciju koja uključuje anti-BDCA2 antitelo, i opciono (b) informativni materijal. Informativni materijal može biti opisni, instruktivni, marketinški ili drugi materijal koji se odnosi na ovde opisane postupke i/ili upotrebu agenasa u terapijsku korist.

[0173] U primeru izvođenja, komplet takođe uključuje drugi agens za lečenje poremećaja koji je ovde opisan (npr. BTK inhibitor, anti-malarijal, glukokortikoid, NSAID, prednizon, hidroksiklorokin, amodiakin, pirimetamin, proguanil, sulfonamide, meflokin, atovakon, primakin, artemisinin i derivate, halofantrin, doksiciklin, klindamicin, metotreksat, mikofenolat mofetil, azatioprin, ciklofosfamid, sulfasalazin ili leflunomid). Na primer, komplet uključuje prvi kontejner koji sadrži kompoziciju koja uključuje anti-BDCA2 antitelo, i drugi kontejner koji uključuje drugi agens.

[0174] Informativni materijal kompleta nije ograničen u svom obliku. U jednom primeru izvođenja, informativni materijal može uključivati informacije o proizvodnji jedinjenja, molekulskoj masi jedinjenja, koncentraciji, datumu isteka, informacijama o seriji ili mestu proizvodnje, i tako dalje. U jednom primeru izvođenja, informativni materijal se odnosi na postupke primene anti-BDCA2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, npr. u pogodnoj dozi, doznom obliku, ili modelu primene (npr. doza, dozni oblik, ili model primene opisani ovde), za lečenje subjekta koji je imao ili koji je pod rizikom za imunski poremećaj opisan ovde. Informacije se mogu obezbediti u različitim formatima, uključuju štampan tekst, materijal čitljiv računarom, video snimak, ili audio snimak, ili informacije koje obezbeđuju link ili adresu do suštinskog materijala, npr. na internetu.

[0175] Pored antitela, kompozicija u kompletu može uključivati i druge sastojke, kao što su rastvarač ili pufer, stabilizator, ili konzervans. Antitelo može biti obezbeđeno u bilo kom obliku, npr. tečni, osušeni ili liofilizovani oblik, poželjno suštinski čist i/ili sterilan. Kada su agensi obezbeđeni u tečnom rastvoru, tečni rastvor je poželjno vodeni rastvor. Kada su agensi obezbeđeni u osušenom obliku, rekonstitucija uglavnom ide dodavanjem pogodnog rastvarača. Rastvarač, npr. sterilna voda ili pufer, mogu opciono biti obezbeđeni u kompletu.

[0176] Komplet može uključivati jedan ili više kontejnera za kompoziciju ili kompozicije koje sadrže agense. U nekim primerima izvođenja, komplet sadrži odvojene kontejnere, razdelnike ili kompartmente za kompoziciju i informativni materijal. Na primer, kompozicija se može nalaziti u boci, bočici, ili špricu, i informativni materijal može biti u plastičnom omotaču ili pakovanju. U drugim primerima izvođenja, zasebni elementi kompleta su smešteni u jednom, nepodeljenom kontejneru. Na primer, kompozicija se nalazi u boci, bočici ili špricu koji na sebi imaju prikačen informativni materijal u obliku etikete. U nekim primerima izvođenja, komplet uključuje mnoštvo (npr. pakovanje) pojedinačnih kontejnera, od kojih svaki sadrži jednu ili više jediničnih doznih oblika (npr. ovde opisani dozni oblik) agenasa. Kontejneri mogu uključivati kombinovanu jediničnu dozu, npr. jedinicu koja uključuje i anti-BDCA2 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i drugi agens, npr. u

1

željenom odnosu. Na primer, komplet uključuje mnoštvo špriceva, ampula, pakovanja sa folijom, blister pakovanja, ili medicinskih uređaja, npr. svaki sadrži jednu kombinovanu jediničnu dozu. Kontejneri kompleta mogu biti nepropusni za vazduh, vodootporni (npr. nepropustljiv za promene vlage ili isparavanje), i/ili nepropusni za svetlost.

[0177] Komplet opciono uključuje uređaj pogodan za primenu kompozicije, npr. špric ili drugi odgovarajući uređaj za isporuku. Uređaj se može obezbediti već napunjen sa jednim ili oba agensa ili može biti prazan, ali pogodan za punjenje.

Dijagnostičke upotrebe

[0178] Anti-BDCA2 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se upotrebljavati u dijagnostičkom postupku za detektovanje prisustva BDCA2, in vitro (npr. biološki uzorak, kao što je tkivo, biopsija) ili in vivo (npr. in vivo snimanje u subjektu). Na primer, humana ili efektivno humana anti-BDCA2 antitela mogu se primeniti subjektu da detektuju BDCA2 unutar subjekta. Na primer, antitelo se može obeležiti, npr. MRI obeleživačem koji se može detektovati ili radio-obeleživačem. Subjekt se može proceniti upotrebom sredstva za detekciju obeleživača koji se može detektovati. Na primer, subjekt se može skenirati kako bi se procenila lokalizacija antitela unutar subjekta. Na primer, subjekt se snima, na primer, pomoću NMR ili drugim tomografskim sredstvima.

[0179] Primeri obeleživača korisnih za dijagnostičko snimanje uključuju radio-obeleživače kao što su<131>I,<111>In,<123>I,<99m>Tc,<32>P,<33>P,<125>I,<3>H,<14>C, i<188>Rh, fluorescentne obeleživače kao što su fluorescein i rodamin, aktivne obeleživače nuklearne magnetne rezonance, izotope koji emituju pozitron koji se detektuje pomoću skenera pozitron emisione tomografije ("PET"), hemiluminescere kao što je luciferin, i enzimske markere kao što je peroksidaza ili fosfataza. Takođe se mogu primenjivati emiteri zračenja kratkog dometa, kao što su izotopi koje detektuju detektor probe kratkog dometa. Proteinski ligand se može obeležiti takvim reagensima upotrebom poznatih tehnika. Na primer, videti Wensel i Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York za tehnike koje se odnose na radio-obeležavanje antitela i Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol., 121:802-816.

[0180] Subjekt se može "snimati" in vivo upotrebom poznatih tehnika kao što je radionuklearno skeniranje upotrebom npr. gama kamere ili emisione tomografije. Videti npr. A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65-85 (Academic Press 1985). Alternativno, skener pozitron emisione transaksijalne tomografije, kao što je određeni Pet VI

2

koji se nalazi u Brookhaven National Laboratory, može se upotrebljavati tamo gde radioobeleživač emituje pozitrone (npr.<11>C,<18>F,<15>O, i<13>N).

[0181] Snimanje magnetnom rezonancom (Magnetic Resonance Imaging-MRI) upotrebljava NMR za vizuelizaciju unutrašnjih karakteristika živog subjekta, i korisna je za prognozu, dijagnozu, lečenje, i operaciju. MRI se može upotrebljavati bez radioaktivnih jedinjenja praćenja za očiglednu korist. Neke MRI tehnike sumirane su u EP0 502 814 A. Uopšteno, razlike koje se odnose na konstante vremena relaksacije T1 i T2 vodenih protona u različitim sredinama upotrebljavaju se za stvaranje slike. Međutim, ove razlike mogu biti nedovoljne za obezbeđivanje oštrih slika visoke rezolucije.

[0182] Razlike u ovim konstantama vremena relaksacije mogu se povećati kontrastnim agensima. Primeri takvih kontrastnih agenasa uključuju brojne magnetne agense, paramagnetne agense (koji pre svega menjaju T1) i feromagnetne ili superparamagnetne agense (koji pre svega menjaju T2 odgovor). Helati (npr. EDTA, DTPA i NTA helati) se mogu upotrebljavati za prikačinjanje (i redukovanje toksičnosti) nekih paramagnetnih supstanci (npr. Fe<3+>, Mn<2+>, Gd<3+>). Drugi agensi mogu biti u obliku čestica, npr. prečnika manjeg od 10 μm do oko 10 nm. Čestice mogu imati feromagnetna, anti-feromagnetna ili superparamagnetna svojstva. Čestice mogu uključivati, na primer, magnetit (Fe3O4), γ-Fe2O3, ferite, i druga magnetna mineralna jedinjenja prelaznih elemenata. Magnetne čestice mogu uključivati jedan ili više magnetnih kristala sa i bez nemagnetnog materijala. Nemagnetni materijal može uključivati sintetičke ili prirodne polimere (kao što su sefaroza, dekstran, dekstrin, skrob i slično).

[0183] Anti-BDCA2 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu takođe biti obeleženi indikacionom grupom koja sadrži NMR-aktivan<19>F atom, ili mnoštvo takvih atoma pošto (i) su suštinski svi prirodno obilno zastupljeni atomi fluora<19>F izotop i prema tome, suštinski sva jedinjenja koja sadrže fluor su NMR-aktivna; (ii) mnogo hemijski aktivnih polifluorizovanih jedinjenja kao što je trifluorsirćetni anhidrid komercijalno je dostupno po relativno niskoj ceni, i (iii) pronađeno je da su mnoga fluorisana jedinjenja medicinski prihvatljiva za upotrebu kod ljudi kao što su perfluorizovani polietri koji se upotrebljavaju da prenose kiseonik kao zamene hemoglobina. Nakon dozvoljavanja vremena za inkubaciju, MRI čitavog tela se vrši upotrebom aparata kao što je jedan od onih koje je opisao Pykett (1982) Scientific American, 246:78-88 da bi se locirala i snimila distribucija BDCA2.

[0184] U drugom aspektu, objava obezbeđuje postupak za detekciju prisustva BDCA2 u uzorku in vitro (npr. biološki uzorak, kao što su serum, plazma, tkivo, biopsija). Predmetni postupak se može upotrebljavati za dijagnostiku poremećaja, npr. autoimunskog poremećaja (npr. SLE) ili za detekciju nivoa pDC-a u uzorku. Postupak uključuje: (i) dovođenje u kontakt uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-BDCA2 antitelom; i (ii) procenu uzorka na prisustvo BDCA2, na primer, detekcijom formiranja kompleksa između anti-BDCA2 antitela i BDCA2, ili detekcijom prisustva antitela ili BDCA2. Na primer, antitelo se može imobilizovati, npr. na podlozi, i detektuje se zadržavanje antigena na podlozi, i/ili obrnuto. Antitelo koje se upotrebljava može biti obeleženo npr. fluoroforom. Kontrolni uzorak se može uključiti. Pozitivna kontrola može biti uzorak za koji se zna da ima bolest ili poremećaj koji se procenjuje, i negativna kontrola može biti uzorak od subjekta koji nema bolest ili poremećaj koji se procenjuje. Statistički značajna promena u formiranju kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak može ukazivati na prisustvo BDCA2 u uzorku. Uopšteno, anti-BDCA2 antitelo se može upotrebljavati u primenama koje uključuju fluorescentnu polarizaciju, mikroskopiju, ELISA, centrifugiranje, hromatografiju, i sortiranje ćelija (npr. sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom). U određenim slučajevima, anti-BDCA2 antitelo je BIIB059 ili Dendritics klon 124B3.13. U nekim slučajevima, postupak dodatno uključuje imunobojenje uzorka tkiva sa anti-CD 123 antitelom. Uzorak tkiva može biti, na primer, biopsija kože humanog pacijenata sa autoimunskim stanjem, npr. SLE.

[0185] Slede praktični primeri pronalaska. Oni ne treba da se tumače kao ograničavanje obima pronalaska ni na koji način.

PRIMERI

[0186] Sledeći primeri su obezbeđeni da bolje ilustruju zahtevani pronalazak i ne treba ih interpretirati kao ograničavanje obima pronalaska. U meri u kojoj su navedeni konkretni materijali, oni su samo radi ilustracije i nisu namenjeni da ograniče pronalazak. Stručnjak u oblasti može da razvije ekvivalentna sredstva ili reaktante bez upotrebe kapaciteta pronalaska i bez odstupanja od obima pronalaska.

Primer 1: Kloniranje teških i lakih lanaca murinskog anti-BDCA2 antitela

[0187] 24F4 murinski hibridom (IgG1, kapa) je izveden iz Balb/c miša imunizovanog pomoću Gene Gun sa plazmidom pEAG2456, ekspresionim vektorom sisara koji koeksprimira cDNK humanih BDCA2 i FcεRIγ pune dužine (videti Primer 17).

4

[0188] Ukupna ćelijska RNK iz ćelija 24F4 murinskog hibridoma je pripremljena upotrebom Qiagen RNeasy mini kompleta prateći preporučeni protokol proizvođača. cDNK koje kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca su klonirane pomoću RT-PCR iz ukupne ćelijske RNK upotrebom GE Healthcare First Strand cDNA Synthesis kompleta prateći preporučeni protokol proizvođača upotrebom nasumičnih heksamera za prajmiranje.

[0189] Za PCR amplifikaciju varijabilnih domena murinskog imunoglobulina sa intaktnim signalnim sekvencama upotrebljen je koktel degenerativnih forward prajmera koji hibridizuju na višestruke signalne sekvence murinske imunoglobulinske porodice gena i jedan back prajmer specifičan za 5' kraj konstantnog domena murina kako je opisano u Current Protocols in Immunology (Wiley and Sons, 1999). Varijabilni domen 24F4 teškog lanca je amplifikovan sa sledećim prajmerima: 5' ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT 3' (R=A/G i Y=C/T) (SEQ ID NO: 25) i 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (R=A/G i Y=C/T) (SEQ ID NO: 26). Varijabilni domen 24F4 lakog lanca sa svojim signalnim sekvencama je amplifikovan sa sledećim prajmerima: 5' ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT 3' (W=A/T i Y=C/T) (SEQ ID NO: 27) i 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 28).

[0190] PCR proizvodi su prečišćeni na gelu upotrebom Qiagen Qiaquick kompleta gela za ekstrakciju, prateći preporučeni protokol proizvođača. Prečišćeni PCR proizvodi subklonirani su u Invitrogenov pCR2.1TOPO vektor upotrebom njihovog TOPO kompleta za kloniranje prateći preporučeni protokol proizvođača. Inserti iz više nezavisnih subklonova su sekvencionisani da bi se uspostavila konsenzus sekvenca (iz klona teškog lanca označenog pYL647 i klona lakog lanca pYL651).

[0191] Varijacija u sekvencama među klonovima bila je konzistentna sa pozicijama degeneracije prajmera. BLAST analiza sekvenci varijabilnog domena potvrdila je njihovu imunoglobulinsku identičnost. Dedukovane N-terminalne sekvence zrelog lakog i teškog lanca odgovaraju onima iz autentičnih 24F4 lanaca izvedenih iz Edmanovih degradacionih podataka. Dedukovane intaktne mase iz hipotetičkih sekvenci sastavljenih adicijom cDNK dedukovanih sekvenci konstantnog domena iz kloniranog Balb/c IgG1 teškog lanca i kapa lakog lanca na dedukovane sekvence zrelog varijabilnog domena bile su konzistentne sa onima iz prečišćenog 24F4 izvedenog iz hibridoma utvrđenih masenom spektroskopijom.

[0192] Varijabilni domen teškog lanca (VH) murinskog 24F4 član je murinske podgrupe III (D). Sekvenca varijabilnog domena zrelog teškog lanca murinskog 24F4 sa CDR H1, CDR H2, i CDR H3 podvučenim tim redosledom je pokazana ispod:

Varijabilni domen lakog lanca (VL) murinskog 24F4 član je murinske kapa podgrupe III. Sekvenca varijabilnog domena zrelog lakog lanca murinskog 24F4 sa CDR L1, CDR L2, i CDR L3 podvučenim tim redosledom je pokazana ispod:

Nespareni cistein je prisutan na ostatku 95 u CDRL3 u murinskoj 24F4 VL sekvenci iznad (u Kabat nomenklaturi ovaj Cys je ostatak 91).

Primer 2. Himerizacija murinskog 24F4 antitela

[0193] cDNK koje kodiraju varijabilne domene murinskog 24F4 upotrebljene su za konstrukciju vektora za ekspresiju murin-humanih himera (ch24F4) u kojima su mu24F4 varijabilni regioni povezani sa humanim IgG1 i kapa konstantnim regionima.

[0194] Varijabilni domeni su prvo konstruisani pomoću PCR da dodaju 5' Kozak sekvencu i da introdukuju humane sekvence i nova restrikciona mesta na spojevima FR4/konstantni domen za fuziju sa konstantnim domenima humanog imunoglobulina. cDNK sekvence varijabilnog regiona u rezultujućim plazmidima potvrđene su DNK sekvenciranjem. Varijabilni domen teškog lanca u plazmidu pYL647 upotrebljen je kao templat za PCR sa prajmerima 5' GAT CCG CGG CCG CAC CAT GGA CTT TGG GTT CAG CTT G 3' (SEQ ID NO: 31) (dodaje NotI mesto i Kozak sekvencu) i 5' GAT GGG CCC TTG GTG GAA GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA G 3' (SEQ ID NO: 32) (dodaje humane IgG1 CH1 sekvence na spoju FR4/konstantni domen i ApaI mesto), amplifikujući 0,45 kb fragment koji je prečišćen i subkloniran u Invitrogen pCRBluntIITOPO vektor za kloniranje, stvarajući pYL668. Za konstruisanje himere teškog lanca, 0,45 kb NotI-ApaI fragment iz konstrukta pYL668 varijabilnog domena teškog lanca 24F4 i 0,98 kb ApaI-BamHI fragment iz pEAG1325 (plazmid koji sadrži cDNK potvrđene sekvence huIgG1 konstantnog domena teškog lanca (sa genetski uklonjenim C-terminalnim ostatakom lizina IgG1) su subklonirani u vektorsku okosnicu ekspresionog vektora pV90 (u kome je heterologna ekspresija gena kontrolisana CMV-IE promotorom i signalom za poliadenilaciju humanog hormona rasta i koji nosi dhfr marker koji se može selektovati, videti SAD patent 7,494,805), da bi se proizveo ekspresioni vektor pYL672. cDNK sekvenca teškog lanca u rezultujućem plazmidu pYL672 potvrđena je DNK sekvenciranjem. Dedukovana proteinska sekvenca zrelog ch24F4-huIgG1 teškog lanca kodirana pomoću pYL672 pokazana je ispod:

[0195] Aglikozilni oblik ch24F4 sa niskom efektorskom funkcijom takođe je konstruisan subkloniranjem 0,45 kb NotI-ApaI fragmenta iz konstrukta pYL668 varijabilnog domena teškog lanca 24F4 i 0,98 kb ApaI-BamHI fragmenta iz pEAG2412 (plazmid koji sadrži cDNK potvrđene sekvence S228P/N299Q huIgG4/IgG1 hibridni konstantni domen teškog lanca (sa genetski uklonjenim C-terminalnim ostatakom lizina IgG1) subklonirani su u vektorsku okosnicu ekspresionog vektora pV90, stvarajući plazmid pYL670. cDNK sekvenca teškog lanca u rezultujućem plazmidu pYL670 potvrđena je DNK sekvenciranjem. Dedukovana proteinska sekvenca zrelog agly ch24F4-huIgG4/G1 hibridnog teškog lanca kodirana pomoću pYL670 pokazana je ispod:

[0196] Varijabilni domen kapa lakog lanca u plazmidu pYL651 upotrebljen je kao templat za PCR sa prajmerima 5' GAT CCG CGG CCG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG 3' (SEQ ID NO: 35) (dodaje 5' NotI mesto i Kozak sekvencu) i 5' CCA CCG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC 3' (SEQ ID NO: 36) (dodaje sekvence humanog kapa konstantnog domena na spoju FR4/konstantni domen i 3' BsiWI mesto), amplifikujući 0,4 kb fragment koji je prečišćen i subkloniran u Invitrogen pCRBluntIITOPO vektor za kloniranje, stvarajući pYL669. cDNK sekvence varijabilnog regiona u plazmidu pYL669 potvrđene su DNK sekvenciranjem. Za konstruisanje himere lakog lanca, 0,4 kb NotI-BsiWI fragment varijabilnog domena lakog lanca iz pYL669 i 0,34 kb BsiWI-BamHI fragment iz plazmida pEAG1572 (koji sadrži cDNK potvrđene sekvence konstantnog domena humanog kapa lakog lanca) su subklonirani u vektorsku okosnicu pV100 (u kome je heterologna ekspresija gena kontrolisana CMV-IE promotorom i signalom za poliadenilaciju humanog hormona rasta i koji nosi neomicin marker koji se može selektovati), da bi se proizveo ekspresioni vektor pYL671. cDNK sekvenca lakog lanca u rezultujućem plazmidu pYL671 potvrđena je DNK sekvenciranjem. Dedukovana proteinska sekvenca zrelog ch24F4 humanog kapa lakog lanca kodirana pomoću pYL671 pokazana je ispod:

[0197] Ekspresioni vektori (vektori ch24F4 teškog lanca pYL670 ili pYL672 i vektor ch24F4 lakog lanca pYL671) kotransfektovani su u 293-EBNA ćelije i transfektovane ćelije su testirane na sekreciju antitela i specifičnost (ćelije koje su transfektovane praznim vektorom i vektorom sa molekularno kloniranim i relevantnim mAb služile su kao kontrola). Vestern blot analiza (razvijena sa antitelima anti-humanog teškog i lakog lanca) kondicioniranog medijuma ukazivala je da ch24F4-transfektovane ćelije sintetišu i efikasno sekretuju teške i lake lance. Direktno FACS vezivanje za površinski humani BDCA2 potvrdilo je specifičnost ch24F4. EC50 vezivanja obe varijante ch24F4 bila je ekvivalentna vezivanju murinskog 24F4 mAb pomoću direktnog vezivanja za površinski eksprimirani humani BDCA2 pomoću titracije razblaženja FACS testom. Stabilne CHO ćelijske linije koje sekretuju ch24F4-huIgG1, kapa mAb i agly ch24F4-huIgG4/G1 hibridna kapa mAb proizvedene su kotransfekcijom sa pYL672/pYL671 i pYL670/pYL671, respektivno.

Primer 3. Uklanjanje nesparenih ostataka cisteina u CDRL3 himernog 24F4 antitela

[0198] Kako nespareni cisteini u izloženom CDR-u mogu proizvesti heterogenost ili nestabilnost proizvoda, ch24F4 varijante C95S i C95T su konstruisane mutagenezom usmerenom na mesto upotrebom ekspresionog vektora ch24F4 lakog lanca plazmida pYL671 kao templata.

[0199] Mutageneza usmerena na mesto izvedena je upotrebom Agilentovog kompleta za mutagenezu QuikChange II, prateći preporučeni protokol proizvođača. Varijanta C95S konstruisana je upotrebom mutagenog prajmera 5' GCA ACC TAT TAC TGT CAA CAA AGT AAT GAG GAT CCT CGG AC 3' (SEQ ID NO: 38) i njegovog reverznog komplementa, koji je introdukovao novo HincII mesto, proizvodeći plazmid pEAG2678. Varijanta C95T konstruisana je upotrebom mutagenog prajmera 5' CAA CCT ATT ACT GTC AGC AAA CTA ATG AAG ATC CTC GGA CGT TCG 3' (SEQ ID NO: 39) i njegovog reverznog komplementa, koji je uklonio BamHI mesto, proizvodeći plazmid pEAG2679. Mutirani plazmidi su identifikovani pregledanjem na introdukovane promene restrikcionog mesta. cDNK sekvence lakog lanca pune dužine u rezultujućim plazmidima potvrđene su DNK sekvenciranjem. ch24F4 divljeg tipa i C95S i C95T varijante mAb-a prolazno su eksprimirane u 293E ćelijama kotransfekcijom pYL672 i pYL671, pEAG2678 ili pEAG2679. Kondicionirani medijum je sakupljen dva dana nakon transfekcije. Titri (testirani pomoću Octet na anti-humanim Fc vrhovima) obe varijante bili su slični onom ch24F4 divljeg tipa, i vestern blotovi neredukujuće SDS-PAGE ukazuju da nema krupne agregacije ili očiglednog klipinga u odnosu na ch24F4 mAb divljeg tipa. Direktno vezivanje pomoću FACS na površinski BDCA2 ukazivalo je da dok je očigledna EC50 za vezivanje od strane C95S varijante ekvivalentna vezivanju ch24F4 divljeg tipa, EC50 vezivanja za C95T varijantu je redukovana nekoliko puta. Kondicionirani medijum koji sadrži ch24F4 i C95 varijantu mAb-a je testiran pomoću Octet za vezivanje za ektodomen humanog BDCA2. Antitela iz kondicioniranog medijuma iz prolazno transfektovanih ćelija bila su vezana za anti-humane Fc vrhove, zatim je monomerni huBDCA2 postavljen da teče preko Octet vrhova, da bi se ispitalo vezivanje i disocijacija. Octet kinetika vezivanja i disocijacije za ch24F4 divljeg tipa i C95S varijantu bile su ekvivalentne, dok je stopa disocijacije C95T varijante bila brža od one za ch24F4 divljeg tipa. Na osnovu ovih rezultata, C95S je inkorporiran u CDRL3 lakog lanca humanizovanog 24F4.

Primer 4. Primerni teški i laki lanci humanizovanog 24F4

[0200] Primeri sedam teških lanaca humanizovanog (hu) 24F4 (huIGHV3-21*01 okvir/24F4 VH CDR) i njihove odgovarajuće DNK sekvence pokazani su ispod. CDR 1, 2, i 3 u svakom teškom lancu su podvučeni tim redosledom. Bekmutacije okvira pokazane su malim slovima podebljanim fontom. Promene na CDR ostacima iz murinskog 24F4 pokazane su senčenjem unutar CDR sekvenci. CDR1 varijabilnog teškog lanca (CDR H1) je definisan u skladu sa Chothia definicijom, koja je 5 amino-kiselina duža od Kabat definicije; ostaci u kurzivu u CDR H1 identifikuju dodatnih 5 amino-kiselina (tj. GFTFS (SEQ ID NO: 12)) koje formiraju Chothia CDR H1. Većina amino-kiselina N-terminusa (tj. glutaminska kiselina u verzijama H0, H1, H2, H3 i asparaginska kiselina u verzijama H4, H5, i H6) varijabilnog domena teškog lanca mogu direktno kontaktirati antigen i uticati na afinitet vezivanja. Zakopani ostatak na Kabat poziciji 49 može uticati na konformaciju CDR2 teškog lanca (serin u verzijama H0, H1, H2, i H3; i alanin u verzijama H4, H5 i H6). Ostatak na Kabat poziciji 93 može imati uticaj na sparivanje teški-laki lanac (alanin u verzijama H0, H1, H2, i H3; i treonin u verzijama H4, H5 i H6. Amino-kiselinski ostaci u CDR H1, H2, i H3 regionima koji se razlikuju od CDR H1, H2, i H3 murinskog 24F4 su osenčene.

Verzija H0

Verzija H2

Verzija H4

1

Verzija H6

Poravnanje amino-kiselinske sekvence verzija H0 do H6 je pokazano ispod:

[0201] Primeri tri laka lanca humanizovanog 24F4 (huIGKV1-13*02 okvir /24F4 VL CDR) i njihove odgovarajuće DNK sekvence pokazane su ispod. CDR 1, 2, i 3 u svakom lakom lancu su podvučeni tim redosledom. Ser91 (u skladu sa Kabat numeracijom) koji je zamenjen za Cys91 u svim lakim lancima, je istaknut senčenjem. Većina amino-kiselina N-terminusa (tj. alanin u verziji L0 i asparaginska kiselina u verzijama L1 i L2) varijabilnog domena lakog lanca mogu direktno kontaktirati antigen i uticati na afinitet vezivanja. Bekmutacije okvira pokazane su malim slovima podebljanim fontom. Prva verzija (L0) sadrži najmanje bekmutacija, a treća verzija (L2) sadrži najviše bekmutacija (tj. najmanje "humanizovana").

Verzija L0

2

Verzija L2

Poravnanje amino-kiselinske sekvence verzija L0 do L2 je pokazano ispod:

[0202] Gornje amino-kiselinske sekvence humanizovanog VH i VL ne sadrže nijedno potencijalno mesto N-vezane glikozilacije ili Asn-Gly mesta deamidacije. Metionini i u VH i u VL domenima su uočeni u sekvencama germinativne linije, i nisu izloženi na površini, pa se čini da je rizik od oksidacije metionina minimalan.

[0203] Rastvorljivost proteina može biti u korelaciji sa njihovom pI. pI dizajniranih konstrukata izračunate su upotrebom pK amino-kiselina u Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14:1023-31 (1993); Electrophoresis, 15:529-39 (1994)). Vrednosti pokazane ispod izračunate su upotrebom teških lanaca humanog IgG1. Svako od humanizovanih antitela ima pI značajno iznad 7 i stoga se očekuje da imaju značajno pozitivno naelektrisanje pri neutralnom pH. Svaki unos u tabelu je izračunata vrednost pI celokupnog kombinovanog antitela, sa neto naelektrisanjem u zagradama.

Molekul Izračunata pI (neto naelektrisanje)

Himerno 24F4 6.94 (-2)

Humanizovano H4L1 7.26 (0)

Primer 5. Vezivanje Hx/L1 za BDCA2

[0204] Svih 21 mogućih varijanti teških i lakih lanaca hu24F4 (opisanih u Primeru 4) i ch24F4 prolazno su eksprimirane u 293E ćelijama kotransfekcijom plazmida teškog lanca i lakog lanca. Sve verzije hu24F4 su sklopljene i sekretovane, sa titrima koji prevazilaze one od ch24F4 (određeni kvantizacijom mAb u kondicioniranom medijumu pomoću Octet vezivanja za anti-humane Fc vrhove). Vestern blotovi neredukujuće SDS-PAGE analize himernih i humanizovanih 24F4 mAb-a nisu pokazale dokaze krupne agregacije ili očiglednog klipinga u odnosu na ch24F4.

[0205] Kondicionirani medijum je testiran direktnim vezivanjem FACS na stabilno transfektovanim DG44 CHO ćelijama koje koeksprimiraju cDNK BDCA2 i FcεRIγ pune dužine (humani ili cinomolgus majmuna), (relevantni ekspresioni vektori su humani BDCA2/FcεRIγ: pEAG2456, cino BDCA2/FcεRIγ: pEAG2668). Pri direktnom vezivanju za površinski humani BDCA2 ili BDCA2 cinomolgus majmuna, uočen je potpuni gubitak vezivanja za H0, H1 i H2 serije hu24F4, uočen je značajan gubitak afiniteta vezivanja za H3 seriju hu24F4, dobro zadržavanje afiniteta za obe i H4 i H5 serije hu24F4 i umereni gubitak vezivanja za H6 serije hu24F4 varijanti (Slike 2 i 3). Na osnovu titra i očiglednih EC50 vrednosti u FACS analizi direktnog vezivanja, H4/L1 i H5/L1 su određene kao "najbolje" varijante hu24F4.

[0206] Kondicionirani medijum koji sadrži ch24F4 i sve hu24F4 varijante mAb-a testiran je pomoću Octet za vezivanje za ektodomen humanog BDCA2. Monomerni ektodomen huBDCA2 pripremljen je proteolitičkim odvajanjem iz prečišćenog muIgG2a Fc-huBDCA2 fuzionog proteina (relevantan plazmid: pEAG2423). Antitela iz kondicioniranog medijuma iz

4

prolazno transfektovanih ćelija bila su vezana za anti-humane Fc vrhove, i zatim je monomerni huBDCA2 postavljen da teče preko Octet vrhova, da bi se ispitalo vezivanje i disocijacija. H4 i H5 serije hu24F4 varijanti pokazale su najbolje afinitete za huBDCA2.

Primer 6. Pojačavanje afiniteta hu24F4

[0207] Da bi se istražila mogućnost pojačavanja afiniteta hu24F4 supstitucijom na poziciji 24F4 verzije L1 CDR L3 nesparnog cisteina (C95S u ekspresionom vektoru hu24F4 lakog lanca pYL740), konstruisane su brojne verzije L1 varijanti pomoću mutageneze usmerene na mesto. Bekmutacija na nesparni cistein, tj. S95C, konstruisana je pomoću mutageneze usmerene na mesto proizvodeći plazmid pYL749. Varijante S95T, S95A, i S95V su konstruisane pomoću mutageneze usmerene na mesto proizvodeći plazmide pYL750, pYL751, i pYL752, respektivno. cDNK sekvence lakog lanca pune dužine u rezultujućim plazmidima potvrđene su DNK sekvenciranjem. C95 varijanta hu24F4 mAb-a prolazno su eksprimirane u 293E ćelijama kotransfekcijom hu24F4 H4 teškog lanca pYL746 ili hu24F4 H5 teškog lanca pYL747 sa hu24F4 L1 varijantom lakih lanaca C95S pYL740, S95C pYL749, S95T pYL750, S95A pYL751 ili S95V pYL752 plazmidima. Kondicionirani medijum je sakupljen dva dana nakon transfekcije. Titri (testirani pomoću Octet na antihumanim Fc vrhovima) svih varijanti su bili slični, i vestern blotovi neredukujuće SDS-PAGE ukazuju da nema krupne agregacije ili očiglednog klipinga. Kondicionirani medijum koji sadrži C95 varijantu mAb-a je testiran pomoću Octet za vezivanje za ektodomen humanog BDCA2. Antitela iz kondicioniranog medijuma iz prolazno transfektovanih ćelija bila su vezana za anti-humane Fc vrhove, zatim je monomerni huBDCA2 postavljen da teče preko Octet vrhova, da bi se ispitalo vezivanje i disocijacija. Varijante C95A imale su najsporije stope disocijacije.

[0208] Na osnovu ovih rezultata proizvedene su stabilne CHO ćelijske linije za varijante hu24F4 H4/L1 C95T i C95A i varijante H5/L1 C95T i C95A, koje su imale najsporije očigledne stope disocijacije. Octet studije vezivanja su ponovljene za prečišćena hu24F4 mAb-a. Kao vodeći kandidat odabrana je varijanta hu24F4 H4/L1 C95A. Sekvence plazmida pYL746 (hu 24F4 H4 teški lanac) i pYL751 (hu 24F4 L1 laki lanac) upotrebljene su za rekodiranje i konstruisanje ekspresionih vektora za stvaranje CHO proizvodne ćelijske linije.

[0209] Dedukovana amino-kiselinska sekvenca zrelog hu24F4 L1 C95A lakog lanca kodirana pomoću pYL751 pokazana je ispod (CDR L1, CDR L2, i CDR L3 su podvučeni):

[0210] Dedukovana amino-kiselinska sekvenca zrelog hu24F4 H4-hulgG1 teškog lanca kodirana pomoću pYL746 pokazana je ispod (CDR H1, CDR H2, i CDR H3 su podvučeni):

[0211] Antitelo koje se sastoji od zrelog teškog lanca (SEQ ID NO: 4) i zrelog lakog lanca (SEQ ID NO: 3) koji su navedeni iznad naziva se BIIB059.

Primer 7. Rekodiranje gena teškog i lakog lanca

[0212] Da bi potencijalno poboljšali ekspresiju, nukleotidna sekvenca gena lakog i teškog lanca je rekodirana bez promene amino-kiselinske sekvence. Modifikovana DNK sekvenca za gen lakog lanca anti-BDCA2 pokazana je ispod. Amino-kiseline 1-240 sadrže sekvencu lakog lanca. Amino-kiseline 1-22 (nukleotidi označeni malim slovom) sadrže nativni signalni peptid lakog lanca. Zreli N-terminus počinje sa amino-kiselinom 23 (D).

[0213] Modifikovana DNK sekvenca za gen teškog lanca anti-BDCA2 pokazana je ispod. Amino-kiseline 1-470 sadrže sekvencu teškog lanca. Amino-kiseline 1-19 (nukleotidi označeni malim slovom) sadrže nativni signalni peptid teškog lanca. Zreli N-terminus počinje sa amino-kiselinom 20 (D).

Primer 8. Ekspresione kasete i vektori

[0214] Gen teškog lanca i geni lakog lanca su isečeni i ligirani u odvojene ekspresione vektore. Svaki gen je pod transkripcionom kontrolom neposrednog ranog promotora humanog citomegalovirusa i sekvence za poliadenilaciju gena humanog hormona rasta.

[0215] Plazmid koji eksprimira laki lanac, pJP009, takođe sadrži ekspresionu kasetu za gen neomicin fosfotransferaze (neo) koji sadrži rani promotor murinske fosfoglicerat kinaze (muPGK) i muPGK sekvencu za poliadenilaciju (Slika 4). Plazmid koji eksprimira teški lanac, pJP010, takođe sadrži ekspresionu kasetu za dhfr gen koji je upotrebljen kao marker koji se može selektovati i amplifikovati metotreksatom. Ključne karakteristike plazmida pJP009 i pJP010 su sumirane ispod.

[0216] Kompletna nukleotidna sekvenca plazmida pJP009 pokazana je ispod. Tri otvorena okvira čitanja su laki lanac 24F4, neomicin fosfotransferaza, i beta-laktamaza.

1

�

�

[0217] Kompletna nukleotidna sekvenca plazmida pJP010 (Slika 5) pokazana je ispod. Tri otvorena okvira čitanja su teški lanac 24F4, murinska dihidrofolat reduktaza, i betalaktamaza.

Primer 9. Konstruisanje ćelijske linije

[0218] Upotrebljena ćelija domaćina bila je linija ćelija domaćina jajnika kineskog hrčka deficijentna u dihidrofolat reduktazi (dhfr), CHO-DG44. Banka ćelija domaćina DG44 je testirana i otkriveno je da je negativna na prisustvo sporednih agenasa pre upotrebe. Domaćin DG44 (CER-00-05-01) upotrebljen je za konstruisanje ćelijskih linija koje eksprimiraju anti-BDCA2.

[0219] Plazmidi pJP009 i pJP010 koji eksprimiraju rekodirani laki lanac i teški lanac anti-BDCA2, respektivno, transfektovani su elektroporacijom u ćelijsku liniju domaćina. Transfektovane ćelije koje eksprimiraju dhfr su odabrane upotrebom medijuma koji je deficijentan u α nukleozidima. Nakon selekcije u gore opisanom medijumu bez αMEM nukleozida, transfektovani pul je obogaćen za ćelijske linije sa visokom ekspresijom upotrebom kombinacije sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom i Genetix Clonepix FL instrumenta (CER-00-09-03). Ćelijske kolonije izolovane pomoću ClonePix FL prebačene su iz polučvrstog medijuma u ploče sa 96 bunarića. Pojedinačni bunarići su umnoženi i procenjena je produktivnost. Ćelijska linija koja pokazuje najviši titar u fed-batch analizi u erlenmajeru (shake flask fed-batch analysis) (#49) preneta je u Research Animal Fermentation radi rasta u bioreaktoru od 10L za generisanje materijala za karakterizaciju.

[0220] Nakon inicijalnog pregleda ćelijskih linija, ćelijske linije koje najviše proizvode odabrane su za amplifikaciju. Najbolje ćelijske linije su podvrgnute amplifikaciji metotreksatom (MTX). Amplifikovani pulovi subklonirani su upotrebom graničnog razblaženja pri teoretskoj gustini od 0,5 ćelija po bunariću u pločama sa 384 bunarića. Pojedinačni bunarići ploča sa 384 bunarića su snimljeni upotrebom Cellavista instrumenta (Innovatis) za prisustvo jedne ćelije po bunariću i provereno da je klonalna.

1

[0221] Najbolje četiri amplifikovane, klonalne ćelijske linije su odabrane na osnovu umanjene fed-batch analize u erlenmajeru i analize kvaliteta proizvoda. Pre-master ćelijske banke (Pre-MCB) su napravljene od ove najbolje 4 ćelijske linije koje su procenjene u bioreaktorima. Odabran je jedan vodeći subklon na osnovu performansi u bioreaktoru i analize kvaliteta proizvoda. Pre-MCB bočica sa vodećom ćelijskom linijom prebačena je u proizvodnju za stvaranje Master ćelijske banke.

Primer 10. Post-translacione modifikacije anti-BDCA2 antitela, BIIB059

a) Oksidacija

[0222] Mapiranje peptida Endo-Lys C anti-BDCA2 BIIB059 antitela otkrilo je da su teški lanac Met-257, Met-433 i Trp-163 podložna mesta za oksidaciju. Nivoi su bili u rasponu od 4 do 7%. Eksperimentalni podaci ukazuju da je veliki deo oksidacije povezan sa pripremom uzorka.

b) Deamidacija

[0223] Analiza mape Endo-Lys-C peptida BIIB059 antitela pokazala je da je ~ 2,5% svakog od Asn-389, Asn-394 i Asn-395 u teškom lancu bilo deamidovano (kombinovana deamidacija i formiranje sukcinimida), i da je ~ 2,5% Asn-320 u teškom lancu bilo deamidovano (u obliku sukcinimida). Ukupna količina sukcinimidnih oblika za Asp-32 i Asp-34 u lakom lancu bila je ~ 3%. Kombinovana izomerizacija Asp-32 i Asp-34 u lakom lancu bila je ~ 5%. Slično oksidaciji, neke od ovih modifikacija mogu biti povezane sa pripremom uzorka.

c) Glikacija

[0224] Glikacija je neenzimska modifikacija izazvana reakcijom amino grupa na proteinima sa glukozom, komponentom medijuma za kulturu. Glikacija se rutinski detektuje u proteinima i nivoi široko variraju u zavisnosti od uslova kulture ćelije. U BIIB059 antitelu, nivo glikacije, mereno analizom intaktne mase neredukovanog proteina, bio je ~ 10%. Analiza mapiranja peptida otkrila je ~ 0,46% glikacije na Lys-107 lakog lanca, 0,28% na Lys-103 lakog lanca i ~ 0,2% na Lys-295 teškog lanca O-vezanog

1 1

d) Glikozilacija

[0225] Nije bilo detektovane O-vezane glikozilacije BIIB059.

e) Druge modifikacije (npr. hidroksilizin, itd.)

[0226] Analize su pokazale da je <1% teškog lanca BIIB059 antitela u aglikozil obliku. Analiza nije pokazala Asn-u-Ser supstitucije i nije bilo nepoznatih modifikacija ili mutacija na nivou od ≥1% u antitelu.

Primer 11. Direktno vezivanje BIIB059 za ćelijsku površinu plazmocitoidnih dendritskih ćelija

[0227] Test protočne citometrije pune krvi razvijen je za procenu vezivanja BIIB059 za BDCA2 na humanim plazmocitoidnim dendritskim ćelijama (pDC) ili plazmocitoidnim dendritskim ćelijama (pDC) cinomolgusa. Periferna krv cinomolgus majmuna (Toxikon, Inc, Bedford, MA) ili humana periferna krv (Biogen Idec) sakupljana je u epruvete za sakupljanje sa natrijum heparinom i održavana na sobnoj temperaturi. FACS koktel antitela za bojenje za identifikaciju pDC-a je dodat u svaki alikvot pune krvi, inkorporišući CD20, CD14, CD123 i HLA-DR antitela. Alexa647 obeleženo BIIB059 (Biogen Idec, Lot# 17073-057) ili Alexa647 obeleženo hIgG izotip kontrola je dodata u FACS koktel za bojenje, u koncentraciji od 0 do 40 µg/mL. Krv je inkubirana na ledu, zaštićena od svetlosti, tokom 30 minuta. Nakon 30 minuta, svaki alikvot od 500 µL pune krvi (cino) ili 100 µL (humana) je tretiran sa 10 mL (cino) ili 2 mL (humana) 1X Easy Lyse pufera (Leinco Technologies) koji je inkubiran na 37 °C najmanje jedan sat. Posle 10-15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, uzorci su centrifugirani na 1400 o/min tokom 5 minuta. Supernatant je dekantovan, ostavljajući samo pelet belih krvnih zrnaca (WBC). Svaki pelet WBC je ispran sa 5 ml FACS pufera (1% BSA 0,002% NaAzid 1 mM CaCl2+ 1 mM MgCl2u PBS), i centrifugiran na 1400 o/min tokom 5 minuta. Supernatant je dekantovan, i svaki pelet WBC je resuspendovan u 200 µL FACS pufera i prebačen na ploču sa 96 bunarića zaobljenog dna (Fisher Scientific). Ploča je centrifugirana na 1400 o/min tokom 5 min. Supernatant je izbačen iz ploče, a svaki pelet WBC je ispran sa 200 µL FACS pufera. Ploča je centrifugirana na 1400 o/min tokom 5 minuta, i supernatant je izbačen iz ploče. Nakon ispiranja (kao iznad), WBC su resuspendovane u 200 µL 1% paraformaldehida (PFA) u PBS, i fiksirane na 4 °C preko noći,

1 2

zaštićene od svetlosti. Neposredno pre analize protočnom citometrijom, WBC su filtrirane upotrebom najlonske mrežaste filter ploče sa otvorima od 60 mikrona (Millipore). Svaki pelet je zatim prenesen na novu ploču sa 96 bunarića zaobljenog dna i centrifugiran na 1400 o/min tokom 5 minuta. Svaki pelet WBC resuspendovan je u 250 µL FACS pufera i intenzitet fluorescencije je izmeren na LSRII 4-color FACS mašini. Kompenzacija pojedinačne boje dobijena je upotrebom anti-mišjeg Ig kompenzacionog seta sa perlama (BD Biosciences). Analiza je izvršena upotrebom FlowJo i GraphPad Prism softvera. BIIB059 se vezalo slično cinomolgus i humane ćelije sa EC50vrednostima 1-2 µg/mL (7-13nM) (Slika 6).

Primer 12. Procena samo-asocijacije za BIIB059

[0228] AlphaScreen test je test homogene blizine koji upotrebljava glutation perle davaoca i primaoca (Perkin Elmer) za vezivanje humanog FcRIIa (CD32a) GST. U ovu smešu su dodate različite koncentracije antitela koja se testiraju. Pošto je vezivanje antitela za FcRIIa monovalentno, jedini način da se generiše signal je ukoliko perle davaoca i primaoca obe imaju vezano antitelo koje zatim asociraju dovodeći perle unutar 200 nm što omogućava proizvodnju singlet kiseonika i posledičnu emisiju svetlosti. Nivo emisije detektovan pomoću instrumenta Envision (Perkin Elmer) je proporcionalan stepenu samo-asocijacije.

[0229] Slika 7 pokazuje Alpha Screen rezultate za BIIB059 u poređenju sa 5c8 (negativna kontrola) i LT105 (pozitivna kontrola sa jakom samo-asocijacijom).

Primer 13. Procena nespecifičnog vezivanja BIIB059

[0230] Hromatografija unakrsne interakcije (Cross-interaction chromatography-CIC) je postupak visoke propusne moći za preliminarnu procenu lepljivosti mAb kandidata (Jacobs et al., Pharm Res., 27(1):65-71 (2010)). U ovom postupku, glavni deo poliklonalnog humanog IgG hemijski je povezan sa NHS-aktiviranom hromatografskom smolom. Vremena zadržavanja BIIB059 na nederivatizovanim i IgG-derivatizovanim kolonama su zatim upoređena sa kontrolnim panelom mAb koja se dobro ponašaju i mAb koja se loše ponašaju. BIIB059 nije pokazalo nikakve dokaze o nespecifičnom vezivanju ovim postupkom, kako dokazuje svojim malim vremenima zadržavanja i K' vrednostima.

CIC podaci pokazuju rastvorljivost i nespecifično vezivanje

1

Primer 14. Procena stabilnosti BIIB059

[0231] Diferencijalna skenirajuća fluorometrija upotrebljena je za testiranje stabilnosti BIIB059 u raznim puferskim uslovima za početnu formulaciju istraživanja. Odvijanje proteina je praćeno na PCR sistemu u realnom vremenu Mx3005p (Agilent Technologies) u formatu sa 96 bunarića, upotrebom 10 µg proteina u 50 µL PBS (pri pH 7,0) sa dodatkom SYPRO narandžaste fluorofore u krajnjoj koncentraciji od 10X (na osnovu Invitrogen štok oznaka od 1000X). Uzorci su zagrevani od 25 °C do 95 °C na 1 °C/min sa intenzitetom fluorescencije izmerenim tri puta na svaki 1 °C. Intenziteti fluorescencije su nacrtani kao funkcija temperature. Tm su izvedene iz ovih krivih uzimanjem negativnog derivata ("-R'(T)" u Mx3005p softveru) i selekcijom lokalnih minimuma nacrta derivata. Upotrebom baznog pufera od 20 mM natrijum citrata, pH je varirao od 5,0 do 7,5 i koncentracije NaCl i saharoze su varirale od 50 do 250 mM. Stabilnost je bila slična u svim rasponima pufera. Slika 8 pokazuje podatke sa 150 mM NaCl i 250 mM saharoze kao funkciju pH. Kao istraživačka formulacija nad saharozom izabrana je 20 mM natrijum citrat, 150 mM NaCl pH 6,0 zbog teškoća u postizanju visokih koncentracija sa saharozom upotrebom istraživačkih centrifugalnih koncentratora.

Primer 15. Procena agitacione stabilnosti BIIB059

[0232] Zapremina od 0,2 mL rastvora BIIB059 mAb pri 1 mg/mL u 20 mM natrijum citrata, pH 6,0, 150 mM NaCl podvrgnuta je recipročnom mućkanju na sobnoj temperaturi u

1 4

staklenim bočicama od 2 mL (Waters, WAT270946C) upotrebom Lab-Line Instruments model 4626 Titer Plate Shaker postavljenog na 600 o/min. Agregacija je procenjena praćenjem povećanja zamućenosti na 320 nm upotrebom Beckman DU640 spektrofotometra. BIIB059 je pokazivalo agregaciju zavisnu od vremena. Normalno humana IgG1 antitela divljeg tipa ne agregiraju u ovim uslovima agitacije. Kao što je pokazano na Slici 9, agregacija je potpuno potisnuta dodavanjem 0,03% Tween 80, uobičajenog formulacionog ekscipijenta. Agregacija izazvana agitacijom ponekad može biti visoko zavisna od pH. Aglikozil IgG4/IgG1 pokazalo je bržu i obimniju agregaciju od BIIB059. Agregacija aglikozil IgG4/IgG1 je takođe potisnuta dodavanjem Tween 80.

Primer 16. Procena viskoznosti BIIB059

[0233] Stabilnost i viskoznost BIIB059 uzoraka mereni su na visokim koncentracijama od 150 mg/mL i višim, da bi se podržao potencijalni razvoj proizvoda za subkutanu primenu. Rastvori BIIB059 su centrifugirani u ultra-koncentrator epruvetama kako bi se ograničile zapremine i postignute koncentracije su određene UV skenovima. Stabilnost je određena ekskluzionom hromatografijom nakon skladištenja na 2-8 °C tokom jedne i dve nedelje. Koncentracije proteina veće od 200 mg/mL lako su postignute za male količine proteina u 20 mM citratu, pH 6, 150 mM NaCl puferu i agregat je ostao nizak (0.68%) posle dve nedelje na 2-8 °C. Viskoznost je merena upotrebom instrumenta Viscopro2000 (Cambridge Viscosity). Viskoznost pri 150 mg/ml bila je samo 8 cP u citratnom/fiziološki rastvor puferu. Ovi rezultati pokazuju da bi formulacija sa visokom koncentracijom BIIB059 trebalo da je dostižna.

Primer 17. Kloniranje humanog BDCA2 gena

[0234] cDNK humanog BDCA2 (huBDCA2) pune dužine je subklonirana u Invitrogen pCR4TOPO vektor za kloniranje od Open Biosystems: ovaj plazmid je označen sa pEAG2367. DNK sekvenciranje potvrdilo je da je njegova cDNK identična sa cDNK humanog BDCA2 pune dužine u referentnom Genbank pristupnom broju NM_130441. Otvoreni okvir čitanja huBDCA2 pune dužine kodiran pomoću pEAG2420 pokazan je ispod, sa podvučenim TM-HMM-predviđenim transmembranskim domenom:

1

[0235] Otvoreni okvir čitanja HuFcεRIγ pune dužine kodiran pomoću pEAG2413, koji je identičan referentnoj sekvenci u Genbank pristupnom broju NP_004097, pokazan je ispod:

[0236] CHO ekspresioni vektor koji koeksprimira cDNK i humanih BDCA2 i FcεRIγ u tandem transkripcionim jedinicama konstruisan je subkloniranjem 2,11 kb SpeI fragmenta iz pEAG2413 u linearizovanu, fosfataziranu 6,71 kb SpeI vektorsku okosnicu pEAG2420, što rezultira u "univektoru" označenom sa pEAG2456. cDNK humanih BDCA2 i FcεRIγ u pEAG2420 su potvrđene sekvencom. Stabilna CHO ćelijska linija koja stabilno koeksprimira cDNK BDCA2 i FcεRIγ proizvedena je pomoću transfekcije sa pEAG2456.

Primer 18. Kloniranje cino i rezus BDCA2 gena

[0237] Dedukovani otvoreni okvir čitanja BDCA2 makakija kodiran pomoću pEAG2384 i jednim od SNP oblika uočen u pEAG2383 pokazan je ispod. Ovaj SNP oblik se u ispod označava kao E73 SNP oblik cino BDCA2. Kod rezusa, uočena je jedna sekvenca identična E73 SNP obliku cino BDCA2.

[0238] U drugom SNP obliku cino BDCA2, ostatak 73 (GAA = Glu, E) koji je gore istaknut senčenjem je lizin (AAA = Lys, K). Ovaj drugi SNP oblik označava se kao K73 SNP oblik BDCA2 cinomolgus majmuna. U humanom BDCA2, ostatak 73 je glutaminska kiselina. Poravnanje sa umetnutim razmacima humane BDCA2 sekvence (gornja) i BDCA2 sekvence makakija (donja), koje dele 90,6% identičnosti, pokazano je ispod. Potencijalna mesta N-vezane glikozilacije su osenčena. Kod BDCA2 makakija nedostaje jedno potencijalno mesto

1

N-vezane glikozilacije prisutno u humanom (NSS na 137-139 u humanom nasuprot NSA kod makakija).

[0239] Konsenzus otvoreni okvir čitanja FcεRIγ cinomolgus majmuna pokazan je ispod:

[0240] cDNK sekvenca FcεRIγ cinomolgus majmuna se savršeno podudara sa predviđenom cDNK rezusa (zasnovano na genomskim kratkim čitanjima) opisanom u Genbank pristupnom broju XM_001115585 i cino sekvencom deponovanom kao Genbank pristupni broj AF485816 od strane naučnika u Genentech-u. Proteinska sekvenca cino FcεRIγ deli 98,9% identičnosti sa humanim FcεRIγ proteinom, razlikujući se samo jednom, konzervativnom supstitucijom. Poravnanje između humane (gornja) i cino (donja) FcεRIγ pokazano je ispod:

1

[0241] CHO ekspresioni vektor koji koeksprimira cDNK i cino E73 SNP oblik BDCA2 i FcεRIγ u tandem transkripcionim jedinicama konstruisan je subkloniranjem 2,11 kb SpeI fragmenta iz pCN652 u linearizovanu, fosfataziranu 6,72 kb SpeI vektorsku okosnicu pCN654, što rezultira u "univektoru" označenom sa pEAG2668. cDNK cino BDCA2 i FcεRIγ u pEAG2668 su potvrđene sekvencom. Stabilna CHO ćelijska linija koja stabilno koeksprimira cDNK BDCA2 i FcεRIγ proizvedena je pomoću transfekcije sa pEAG2668.

Primer 19. Unakrsna reaktivnost između humanog i cino BDCA2

[0242] Da bi se odredilo da li je E73/K73 BDCA2 SNP cinomolgus majmuna uticao na vezivanje anti-BDCA2, 293E ćelije su kotransfektovane sa ekspresionim vektorima koji nose cDNK EGFP reportera (pEAG1458) i BDCA2 i FcεRIγ (humani BDCA2: pEAG2420 i FcεRIγ: pEAG2413; cino E73 BDCA2: pCN652 ili K73 BDCA2: pCN656 i cino FcεRIγ: pCN652) u molarnim odnosima 1:1:1. Ćelije su sakupljene 3 dana nakon transfekcije, i obojene PE-konjugovanim Miltenyi anti-humanim BDCA2 AC144 mAb (Miltenyi Biotec kataloški broj 130-090-511) u direktnom vezivanju titracije razblaženja FACS, ograđivanjem na zelene EGFP-pozitivne ćelije. Slika 10 pokazuje direktno vezivanje AC144 za površinske humane i cino BDCA2.

[0243] Očigledne EC50 su u suštini ekvivalentne za humani BDCA2 i oba i E73 i K73 SNP oblik BDCA2 cinomolgus majmuna. S obzirom na ovaj rezultat, generisani su CHO stabilni transfektanti za površinski BDCA2 pune dužine, upotrebom ekspresionog vektora humanog BDCA2/FcεRIγ pEAG2456 i ekspresionog vektora cino E73 SNP BDCA2/FcεRIγ pEAG2668. Ove linije su upotrebljene za trijažu human/cino unakrsno-reaktivnih anti-BDCA2 antitela.

Primer 20. Fc fuzioni konstrukti ektodomena humanog BDCA2 i ektodomena BDCA2 cinomolgusa

[0244] Pet Fc fuzionih konstrukata humanog i cino BDCA2 ECD je konstruisano. U tri konstrukta, BDCA2 je prikačen preko G4S linker sekvence na C-terminus humanog IgG1 zgloba i Fc. U dva konstrukta, G4S linker je zamenjen sa mestom odvajanja TEV proteaze ENLYFQC.

[0245] Kako je BDCA2 membranski protein tipa II (C-terminus je van ćelije), dizajn rastvorljivih Fc fuzionih proteina uključivao je dodavanje C-terminalnog ektodomena

1

BDCA2 (ostaci 45-213 za humani BDCA2) na C-terminus konstruisanog IgG Fc čiju sekreciju pokreće signalna sekvenca unutar okvira murinskog kapa lakog lanca. Konstrukt huBDCA2 pune dužine pEAG2367 upotrebljen je kao templat za PCR sa prajmerima 5' CAG TGT CTG TTT CAC TCC CGG GGG TGG CGG TGG TAG CAA TTT TAT GTA TAG C

3' (SEQ ID NO: 74) (za dodavanje 5' XmaI (Pro-Gly) i Gly4Ser linkera neposredno pre 5' kraja ektodomena huBDCA2) i 5' CCA GGG AGA ATA GGA TCC TTA TAT GTA GAT CTT 3' (SEQ ID NO: 75) (za dodavanje 3' BamHI mesta neposredno nakon terminatora huBDCA2). 0,56 kb PCR proizvod je prečišćen i subkloniran u Invitrogen pCRBluntIITOPO vektor za kloniranje, proizvodeći pEAG2417, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena. 0,53 kb XmaI-BamHI fragment iz pEAG2417 i 0,75 kb NotI-XmaI fragment iz pEAG1397 (koji nosi konstruisani huIgG1 Fc čiju sekreciju pokreće signalna sekvenca unutar okvira konstruisanog murinskog kapa lakog lanca) ligirani su sa 1,89 kb BamHI-XbaI i 4,17 kb XbaI-NotI fragmentima vektorske okosnice iz ekspresionog vektora pV90, proizvodeći ekspresioni vektor huIgG1 Fc-huBDCA2 fuzionog proteina pEAG2421, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena. Dedukovani otvoreni okvir čitanja kodiran od strane pEAG2421 pokazan je ispod:

signalna sekvenca kapa lakog lanca: ostaci 1-19 iznad (kurziv)

humani IgG1 Fc: ostaci 20-250 iznad

G4S linker: ostaci 251-255 iznad (podebljano)

ektodomen huBDCA2: ostaci 256-424 iznad (podvučeno)

[0246] Da bi se konstruisao ekspresioni vektor za muIgG2a Fc-huBDCA2 fuzioni protein, 0,53 kb XmaI-BamHI fragment iz pEAG2417 i 0,75 kb NotI-XmaI fragment iz pEAG1442 (koji nosi konstruisani murinski IgG2a Fc, čiju sekreciju pokreće signalna sekvenca unutar okvira konstruisanog murinskog kapa lakog lanca) ligirani su sa 1,89 kb BamHI-XbaI i 4,17 kb XbaI-NotI fragmentima vektorske okosnice iz ekspresionog vektora pV90, proizvodeći

1

pEAG2423, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena. Dedukovani otvoreni okvir čitanja kodiran od strane pEAG2423 pokazan je ispod:

signalna sekvenca kapa lakog lanca: ostaci 1-19 iznad (kurziv)

murinski IgG2a Fc: ostaci 20-251 iznad

G4S linker: ostaci 252-256 iznad (podebljano)

ektodomen huBDCA2: ostaci 257-425 iznad (podvučeno)

[0247] Stabilne CHO ćelijske linije koje proizvode Fc-huBDCA2 fuzione proteine proizvedene su transfekcijom sa ekspresionim vektorima pEAG2421 i pEAG2423. Ovi fuzioni proteini upotrebljeni su u ELISA i Octet testovima vezivanja za trijažu antitela tokom pregleda kandidata.

[0248] Da bi se konstruisao BDCA2 cinomolgusa (cino) da napravi Fc fuzioni protein, E73 SNP varijanta pune dužine cino BDCA2 u konstruktu pCN648 podvrgnuta je mutagenezi usmerenoj na mesto sa prajmerima 5' CTC TGT GTC TGT TTC ACT CCC GGG GGT GGC GGT GGT AGC AAT TTT ATG TAT AGC 3' (SEQ ID NO: 78) i njegovim reverznim komplementom, da bi se dodao 5' XmaI (Pro-Gly) i Gly4Ser linker neposredno pre 5' kraja ektodomena huBDCA2, proizvodeći konstrukt pEAG2675, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena. Da bi se konstruisao ekspresioni vektor za muIgG2a Fc-cino BDCA2 fuzioni protein, 0,53 kb XmaI-BamHI fragment iz pEAG2675 i 0,75 kb NotI-XmaI fragment iz pEAG1442 (koji nosi konstruisani murinski IgG2a Fc, čiju sekreciju pokreće signalna sekvenca unutar okvira konstruisanog murinskog kapa lakog lanca) ligirani su sa 1,89 kb BamHI-XbaI i 4,17 kb fragmentima vektorske okosnice iz ekspresionog vektora pV90, proizvodeći pEAG2677, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena. Dedukovani otvoreni okvir čitanja kodiran od strane pEAG2677 pokazan je ispod:

11

signalna sekvenca kapa lakog lanca: ostaci 1-19 iznad (kurziv)

murinski IgG2a Fc: ostaci 20-251 iznad

G4S linker: ostaci 252-256 iznad (podebljano)

ektodomen cino BDCA2: ostaci 257-424 iznad (podvučeno)

[0249] Stabilna CHO ćelijska linija koja proizvodi Fc-cino BDCA2 fuzioni protein proizvedena je transfekcijom sa ekspresionim vektorom pEAG2677.

[0250] Fuzioni proteini muIgG2a Fc-BDCA2 podvrgnuti su ograničenoj proteolizi, da bi se izolovali monomerni proteini ektodomena BDCA2. Da bi se olakšala izolacija rekombinantnog rastvorljivog ektodomena BDCA2, konstruisani su novi Fc fuzioni konstrukti u kojima je mesto odvajanja TEV proteaze insertovano između C-terminusa Fc i N-terminusa ektodomena BDCA2. Singene koji nosi konstruisane humane ili cino ektodomene BDCA2 sa 5' XmaI mestom (Pro-Gly) za fuziju na Fc C-terminus nakon čega sledi mesto odvajanja TEV unutar okvira (ENLYFQG) fuzionisano na ostatak 45 sekvence BDCA2 i 3' BamHI mestom koje sledi terminator BDCA2 dizajnirao je i isporučio GeneWiz kao XmaI-BamHI inserte u njihovom vlasničkom pUC57-amp vektoru za kloniranje. Sekvence inserata u konstruisanim cDNK konstruktima ektodomena XmaI-BamHI TEV-BDCA2, pEAG2917 (humani) i pEAG2918 (cino), su potvrđene. Da bi se konstruisali CHO ekspresioni vektori zasnovani na pV90-IRES-dhfr za huIgG1 Fc-TEV-BDCA2 fuzione proteine, 0,75 kb NotI-XmaI fragment pEAG1397 i 0,54 kb XmaI-BamHI fragmenti iz bilo pEAG2917 ili pEAG2918 su subklonirani u 5,4 kb BglII-NotI fragment vektorske okosnice pXJC194, proizvodeći pEAG2937 (Fc-huBDCA2) ili pEAG2938 (Fc-cino BDCA2). cDNK inserta u pEAG2937 i pEAG2938 su potvrđene sekvence. Stabilne CHO ćelijske linije su stvorene pomoću transfekcije sa pEAG2937 i pEAG2938. Dedukovani otvoreni okvir čitanja huFc-TEV-hu BDCA2 fuzionog proteina kodiran od strane pEAG2937 pokazan je ispod:

signalna sekvenca kapa lakog lanca: ostaci 1-19 iznad (kurziv)

humani IgG1 Fc: ostaci 20-250 iznad

TEV mesto odvajanja: ostaci 251-257 iznad (podebljano)

ektodomen huBDCA2: ostaci 258-426 iznad

[0251] Dedukovani otvoreni okvir čitanja huFc-TEV-cino BDCA2 fuzionog proteina kodiran od strane pEAG2938 pokazan je ispod:

signalna sekvenca kapa lakog lanca: ostaci 1-19 iznad (kurziv)

humani IgG1 Fc: ostaci 20-250 iznad

TEV mesto odvajanja: ostaci 251-257 iznad (podebljano)

ektodomen cino BDCA2: ostaci 258-425 iznad (podvučeno)

Primer 21. Vezivanje BIIB059 za BDCA2-Fc fuzione proteine

[0252] Sposobnost BIIB059 da vezuje huBDCA2-Fc u rastvoru procenjena je pomoću SEC (Slika 11). Kada se analiziraju sami, BIIB059 (gornji panel) i huBDCA2 (srednji panel) eluirali su kao pojedinačni oštri pikovi sa molekulskim masama od ∼150 kDa. Kada su BIIB059 i huBDCA2-Fc pomešani i analizirani (donji panel), došlo je do pomaka BIIB059 i huBDCA2-Fc na veće mase od >550 kDa, što je vidljivo iz njihove elucije na ranijim pozicijama na hromatogramu. Heterogenost u piku elucije verovatno je uzrokovana činjenicom da i BIIIB059 i BDCA2-Fc svaki sadrže 2 mesta vezivanja i posledično se formira veliki broj kompleksa BIIB059 i BDCA2 sa različitim stehiometrijama.

[0253] Vezivanje cinoBDCA2 ECD na BIIB059 je takođe procenjeno pomoću SEC i slično je dovelo do kvantitativnog pomaka na komplekse više molekulske mase.

Primer 22. Kalcijum pojačava vezivanje BIIB059 za BDCA2

[0254] Vezivanje BIIB059 za humani BDCA2 fuzionisan na murinski Fc (huBDCA2-muFc) u prisustvu kalcijuma ili EDTA proučavano je u Octet testu vezivanja. HuBDCA2-muFc protein je zarobljen na anti-murin Fc biosenzoru, praćeno asocijacijom BIIB059 i korakom disocijacije. Svi koraci su izvedeni u 50 mM HEPES, pH 7, 100 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 0,02% Tween 20 i 0,001% azidu koji sadrži bilo 10 mM CaCl2 ili 10 mM EDTA.

[0255] Slika 12 pokazuje da se vezivanje za BIIB059 pojačava dodavanjem kalcijuma u odnosu na EDTA što dovodi do približno dvostruko višeg signala. Kalcijum je uticao i na stopu asocijacije i disocijacije.

Primer 23. Merenja vezivanja

[0256] Octet je upotrebljen za praćenje vezivanja BIIB059 za BDCA2-Fc fuzioni protein i BDCA2 ECD. Slika 13 pokazuje Octet eksperiment u kome je BIIB059 nanet na anti-humane Fc Octet vrhove u koncentraciji od 20 µg/mL. Za korak asocijacije, dodat je humani BDCA2 ECD i BDCA2 ECD cinomolgusa u koncentraciji od 2 µg/mL. Pufer za ovaj eksperiment bio je 50 mM HEPES, pH 7, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA, 0,02% Tween 20 i 0,001% azid. Pod ovim uslovima, vezivanje BIIB059 za humani i cino BDCA2 ECD je bilo uporedivo.

Primer 24. PBMC test za određivanje IC50 vrednosti za BIIB059 za inhibiciju TLR9-indukovane proizvodnje IFNα

[0257] Pokazano je da ligacija BDCA2 aktivira BCR-sličnu signalnu kaskadu, koja potentno potiskuje sposobnost pDC-a da proizvode IFN tipa I i druge citokine kao odgovor na TLR ligande (Cao W. et al., PLoS Biol., 5(10):e248 (2007)). Inhibicija TLR9-indukovane proizvodnje IFNα od strane PBMC upotrebljena je kao primarni ćelijski test za pregled.

11

[0258] PBMC iz heparinizovane venske krvi zdravih davalaca su izolovane centrifugiranjem na diskontinuiranom gradijentu preko Ficoll, isprane PBS-om i resuspendovane u kompletni medijum kulture (RPMI sa 3% FBS). 1x10<6>ćelija je zasejano/bunariću i stimulisano sa 10 μg/mL TLR9 liganda (CpG-A ODN 2216) u prisustvu doza BIIB059 i 24F4A-Agly (Fc osakaćena verzija BIIB059), ili mAb izotip kontrole u rasponu od 10 μg/mL do 1 pg/mL u ukupnoj testnoj zapremini od 200 μL/bunariću. Ploče su inkubirane preko noći (18 sati) na 37°C, i supernatanti su sakupljeni za procenu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource). Testovi su izvedeni u skladu sa protokolom proizvođača. Titracije BIIB059 i 24F4A agly su testirane da se odredi IC50za inhibiciju TLR9-indukovane proizvodnje IFNα. Ukupno dvanaest nezavisnih eksperimenata dalo je prosečnu IC50od 0,001 µg/mL za BIIB059. Aglikozilovano mAb je bilo manje potentno, sa prosečnom IC50od 0,007 µg/mL (Slika 14).

[0259] Takođe je testirana sposobnost anti-BDCA2 mAb da inhibira proizvodnju IFNα nakon stimulacije fiziološki relevantnim ligandom, naime, serumima od pacijenata sa SLE. Smatra se da SLE serumi indukuju IFN tipa I kroz komplekasa anti-DNK autoantitela i imunostimulirajuće hipometilovane DNK koji stimulišu TLR9. PBMC su stimulisane serumima od SLE pacijenta (obezbedio ih dr Gregg Silverman, NYU) i upotrebljeni su u konačnom razblaženju od 1/5. Antitelo 24F4S H4 /L1C95S, koje se razlikuje od BIIB059 po 1 amino-kiselinskom ostatku, potpuno je ukinulo proizvodnju IFNα iz pDC-a stimulisanih SLE serumom (Slika 18).

Primer 25. TLR9-indukovana proizvodnja IFNα u testu pune krvi

[0260] Aktivnost BIIB059 je takođe procenjena u testu pune krvi TLR9-indukovane proizvodnje IFNα.

[0261] Puna krv je uzeta iz heparinizovane venske krvi zdravih davalaca. Doze BIIB059 i 24F4A-Agly bile su u rasponu od 10 μg/mL do 1 pg/mL u ukupnoj testnoj zapremini od 200 μl/bunariću. CpG-A je dodat pri 200 μg/mL, što je određeno da je optimalno za stimulaciju proizvodnje IFNα u punoj krvi. Ploče su inkubirane tokom 18 sati na 37°C, i supernatanti sakupljeni za upotrebu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource). Testovi su izvedeni u skladu sa protokolom proizvođača. Pokazan na Slici 15A je reprezentativni eksperiment od 6 nezavisno izvedenih eksperimenata. Inhibitorna potentnost BIIB059 u TLR9-indukovanom IFNα testu u punoj krvi bila je slična potentnosti viđenoj u PBMC testovima. Pored inhibicije pDC-izvedenih citokina (IFNα, IL-6), BIIB059 tretman takođe je doveo do inhibicije velikog niza citokina i hemokina (Slika 15C).

[0262] Sledeći eksperiment je izveden da bi se odredilo da li BIIB059 može inhibirati TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα u punoj krvi od SLE pacijenata slično zdravim dobrovoljcima. U tu svrhu, puna krv od 2 SLE pacijenta ili 2 zdrave kontrole je stimulisana sa 200 µg/ml CpGA u prisustvu 10 µg/ml BIIB059 i proizvodnja IFNα je procenjena pomoću ELISA. Konkretno, Bioreclamation LLC je obezbedio punu krv od 2 SLE pacijenta ili 2 zdrava davaoca putem pošiljke danas za sutra. Po dolasku, krv je tretirana sa 10 μg/mL BIIB059 ili izotip kontrolom i stimulisana sa 200 μg/mL CpG-A i premeštena u ploču sa 96 bunarića. Ploče su inkubirane tokom 18 sati na 37°C i supernatanti sakupljeni za upotrebu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource). Testovi su izvedeni u skladu sa protokolom proizvođača.

[0263] Kao što je pokazano na Slici 15B, BIIB059 je pokazao sličnu potentnost u punoj krvi od SLE pacijenata u poređenju sa zdravim dobrovoljcima.

Primer 26. Procena BIIB059-posredovane inhibicije interferona tipa I

[0264] Inhibitorna aktivnost BIIB059 takođe je potvrđena upotrebom prečišćenih pDC stimulisanih sa bilo sintetičkim TLR agonistima (CpG-A) ili više fiziološkim stimulusom (SLE serumi). Takođe je određen inhibitorni efekat umrežavanja BDCA2 na ostale pDC izvedene citokine (IL-6). Aktivnost BIIB059 je potvrđena upotrebom različitih pristupa kao što su kvalitativna lančana reakcija polimeraze i ELISA.

a) Q-PCR

[0265] Trinaest podtipova IFNα i jedan član IFNβ postoji kod ljudi. Stimulacija sa TLR9 agonistom rezultira u povećanju većine IFN tipa I (Ito T. et al., Blood, 107(6):2423-31 (2006)). Inhibicija pojedinačnih gena IFN tipa I procenjena je upotrebom testova kvalitativne lančane reakcije polimeraze (Q-PCR).

[0266] pDC su prečišćene upotrebom dvostepene procedure odvajanja magnetnim perlama (MACS komplet, Miltenyi Biotec). 5x10<4>pDC-a/bunariću stimulisano je sa 5 μM CPG-A u prisustvu ili odsustvu rastućih koncentracija BIIB059 ili 10 µg/mL izotip kontrole. Ukupna testna zapremina bila je 200 μl/bunariću. Ploče su inkubirane 18 sati na 37°C, i RNK je ekstrahovana iz ćelija upotrebom Trizol reagensa (Invitrogen corporation) i dodatno

11

prečišćena upotrebom RNeasy mini kolone (Qiagen Sciences). Svi prajmeri i probe su nabavljene od kompanije Applied Biosystems Inc. Relativne količine transkripta određene su za svaki uzorak upoređivanjem sa standardnom krivom oligonukleotida upotrebom softvera za detekciju sekvence (Applied Biosystems Inc.) i normalizovane na kontrolu (GAPDH).

[0267] Tretman sa BIIB059 inhibirao je transkripciju svih ispitivanih IFN tipa I, rekapitulirajući prethodne podatke upotrebom klona anti-BDCA2 antitela AC144 (Cao W. et al., PLoS Biol., 5(10):e248 (2007)).

b) ELISA

[0268] Efekat BIIB059 na inhibiciju pDC citokina testiran je na nivou proteina upotrebom ELISA. 5x10<4>prečišćenih pDC-a/bunariću stimulisano je sa 5 μM CPG-A u prisustvu ili odsustvu rastućih koncentracija BIIB059 ili 10 μg/mL izotip kontrole. Na Slici 17 pokazane su količine sekretovanog IFNα i IL-6 merene od reprezentativnog davaoca od tri testirana zdrava davaoca.

[0269] Ligacija BDCA2 sa BIIB059 potentno inhibira proizvodnju IFNα i u velikoj meri redukuje proizvodnju IL-6 indukovanu pomoću CpG-A stimulacije.

Primer 27. BIIB059-posredovana internalizacija receptora

[0270] Pokazano je da ligacija BDCA2 sa anti-BDCA2 mAb (klon AC144, Miltenyi) brzo indukuje internalizaciju receptora (Dzionek A. et al., J. Immunol., 165(11):6037-46 (2000)). Sledeći eksperiment bio je usmeren na određivanje kinetike BIIB059-posredovane BDCA2 internalizacije.

[0271] Humana puna krv je tretirana sa 10, 1, 0,1 ili 0,01 μg/mL BIIB059 ili izotip kontrolom (10 μg/ml) na 37°C tokom naznačenih perioda i zatim inkubirana 30' na 4°C sa FITC-obeleženim neunakrsno blokirajućim anti-BDCA2 mAb (klon 2D6), anti-HLADR, anti-CD123, anti-CD14 i anti-CD20. Crvena krvna zrnca (RBC) su lizirana upotrebom 1X Easylyze pufera (BD Bioscience) i preostale ćelije su fiksirane. Pokazane na Slici 19A su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bojenja 2D6-FITC ograđenih CD14-CD20-HLA-DR+CD123+ pDC-a. FMO (fluorescenca minus jedna kontrola) se sastojala od FACS koktela za bojenje minus 2D6-FITC. Podaci na ovoj slici predstavljaju reprezentativni eksperiment od 3 nezavisno izvedena eksperimenta.

11

[0272] Kao što je pokazano na slici 19A, nakon inkubacije sa BIIB059 pri 1 µg/ml, intenzitet FITC-obeleženog 2D6 bojenja brzo se smanjuje dostižući pozadinske nivoe u roku od jednog sata inkubacije na 37°C. Desetostruko niža koncentracija BIIB059 (0,1 µg/ml) uticala je na kinetiku endocitoze odloživši je za 2 sata. Ovo pokazuje da je BDCA2 internalizovan nakon ligacije sa BIIB059 sa kinetikom zavisnom od doze.

[0273] Sledeći eksperiment je sproveden da se odredi da li je BIIB059-posredovana internalizacija receptora uticala na inhibiciju IFN. Puna krv je sakupljena iz heparinizovane venske krvi zdravih davalaca i pre-inkubirana je sa BIIB059 (kako bi se omogućila internalizacija receptora) ili izotopom tokom naznačenog trajanja. U svakoj vremenskoj tački posle pre-inkubacije, ćelije su izazivane sa 200 μg/mL CpGA i inkubirane dodatnih 18 sati na 37 °C. Supernatanti su sakupljeni za upotrebu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource). Testovi su izvedeni u skladu sa protokolom proizvođača. Slika 19B je reprezentativni eksperiment od 3 nezavisno izvedena eksperimenta. Kao što je pokazano na Slici 19B, nakon 9 sati preinkubacije sa BIIB059 pre stimulacije - što odgovara maksimalnoj internalizaciji - nije uticalo na inhibiciju IFN što sugeriše da su BDCA2 endocitoza i TLR9 inhibicija potencijalno povezane. Za testiranje ove hipoteze upotrebljena su anti-BDCA2 mAb koji nisu bila sposobna da posreduju u IFN inhibiciji i pokazala su nedostatak internalizacije. Pored toga, ranije smo pokazali da je bivalentno vezivanje bilo neophodno za anti-BDCA2-posredovanu IFN inhibiciju. U stvari, Fab fragment nije doveo do internalizacije ili IFN inhibicije. Uzeto zajedno, ovi podaci povećavaju mogućnost da BDCA2-posredovana TLR9 inhibicija zahteva endocitozu i lokalizaciju u endozomskim kompartmentima koji sadrže TLR9. Ova hipoteza se može testirati upotrebom snimanja u živom sistemu radi praćenja BDCA2 internalizacije i prometa u ćeliji posle BIIB059 ligacije.

Primer 28. Efektorska funkcija antitela

[0274] Fc domen BIIB059 je potpuno glikozilovano humano IgG1, i kompetentno je da vezuje i ćelijske Fcγ receptore i komplement, i da indukuje ćelijske odgovore efektorske imunske ćelije, kako putem citotoksičnosti zavisne od antigena (ADCC) tako i citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Da bi se potvrdilo vezivanje BIIB059 za Fc receptore, mereni su relativni afiniteti vezivanja upotrebom tehnologije homogenog testa amplifikovane luminescentne blizine (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay-ALPHA) od Perkin Elmera (Slika 20). Test je izveden u kompetitivnom formatu u kom su serijska razblaženja testnih antitela inkubirana sa receptor-GST fuzionim proteinima i anti-GST

11

akceptorskim perlama preko noći na 4°C u ploči sa 96 bunarića. Streptavidin donorske perle i biotinizovano IgG1 divljeg tipa su takođe inkubirani preko noći na 4°C u posebnoj epruveti i zatim su dodati u test ploču sledećeg dana. Ploče su inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje i očitane u Envision čitaču ploča (Perkin Elmer). Podaci su nacrtani kao fitovana kriva sa 4 parametra upotrebom softvera Graphpad Prism za izračunavanje IC50 vrednosti kako bi se odredili relativni afiniteti vezivanja. Izračunate su IC50 vrednosti BIIB059 za FcγRl: 0,03 µg/mL, FcγR11a: 11 µg/mL FcγR11b: 17 µg/mL FcγR111a: i 3 µg/mL. Ove vrednosti su u skladu sa onima koje su uočene za druga humana IgG1 antitela u ovom testu. Takođe su određene IC50 vrednosti za verziju G4P/G1 agly niske efektorske funkcije 24F4 koja je upotrebljena kod cino studija. Kao što se očekivalo, nije detektovano vezivanje za FcγR11a, FcγR11b, i FcγR111a i vezivanje za FcγR1 je smanjeno 100 puta. Antitelo 5c8 i u IgG1 DT i G4P/G1 agly okvirima bili su uključeni u testove kao komparatori.

Primer 29. Fiksacija komplementa

[0275] Oblaganje cilja antitelom pokazalo je da posreduje u potentnim mehanizmima ubijanja putem ADCC ili CDC. Ove efektorske funkcije antitela su posredovane Fc regionom antitela. Ovaj eksperiment je usmeren na testiranje sposobnosti BIIB059 da regrutuje komplement testiranjem njegovog vezivanja za C1q pomoću ELISA.

[0276] Test C1q vezivanja je izveden u ELISA formatu sa 96 bunarića upotrebom Maxisorb ELISA ploča. Testno antitelo je obloženo u serijama 3-strukog razblaživanja u PBS počevši od 15 μg/mL preko noći na 2-8 °C i bunarići su zatim isprane sa PBS, 0,05% Tween 20 i blokirani sa 200 μl 0,1 M Na fosfata pH 7,2, 0,1 M NaCl, 0,1% želatina, 0,05% Tween 20. Nakon toga, dodato je 50 μl/bunariću 2 μg/ml humanog C1q iz Complement Technology (A099) razblaženog u blok/razblaživač puferu i inkubirano tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon aspiracije i ispiranja kao iznad, dodato je 50 μl/bunariću pilećeg IgY anti-humanog C1q (proizvodnja po narudžbini Aves Labs, Inc upotrebom Sigma humanog C1q, C0660) razblaženog 8.000 puta u blok/razblaživač puferu. Posle inkubacije tokom 1,5 h na sobnoj temperaturi, bunarići su aspirirani i isprani kao iznad. Magareći F(ab')2 anti-pileći IgY HRP konjugat (Jackson ImmunoResearch 703-030-155) razblažen do 5000 puta u blok/razblaživaču zatim je dodat pri 50 μl/bunariću i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon aspiracije i ispiranja kao iznad, dodato je 100 μl TMB supstrata (420 μM TMB, 0.004% H2O2u 0,1 M natrijum acetat/limunska kiselina puferu, pH 4,9) i inkubirano 2 min pre zaustavljanja sa 100 μl 2 N sumporne kiseline. Apsorbanca je očitana na 450 nm sa

11

Softmax PRO instrumentom i Softmax softver je upotrebljen za određivanje relativnog afiniteta vezivanja (C vrednost) sa fitovanjem 4 parametra.

[0277] Slika 21 pokazuje da iako je BIIB059 sposobno da vezuje C1q, 24F4A IgG4.P/IgG1 agly je u suštinski lišen C1q vezivanja.

Primer 30. Studije uklanjanja ćelije

[0278] BIIB059 potentno inhibira proizvodnju IFN tipa I i IL-6 nakon ligacije BDCA2. Pored njegove agonističke aktivnosti, ovi eksperimenti su sprovedeni da bi se procenilo da li BIIB059 može da ukloni pDC-e koje nose BDCA2 zahvaljujući svom funkcionalnom Fc. Za ispitivanje citotoksične potentnosti BIIB059 testirana je njegova aktivnost u ADCC i CDC testovima.

a) ADCC test

[0279] ADCC je mehanizam kojim efektorska ćelija imunskog sistema aktivno lizira ciljnu ćeliju, čiji su površinski receptori vezani antitelom (Slika 22).

[0280] CHO ćelijska linija (EAG2456 T1F2 klon 34.16.7) je upotrebljena kao ciljna ćelija. Nivo ekspresije BDCA2 na površini CHO ćelija određen je pomoću FACS upotrebom APC-obeleženog anti-BDCA2 mAb (klon AC144, Miltenyi). NK ćelije su upotrebljene kao efektorske ćelije i odvojene su iz pune krvi negativnom selekcijom upotrebom RosetteSep™ koktela za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stem Cell Technologies). Posle 20 minuta inkubacije sa koktelom na sobnoj temperaturi, NK ćelije su izolovane centrifugiranjem na diskontinuiranom gradijentu preko ficoll. CHO ćelije i humane NK ćelije su zasejane u odnosu 5:1 (NK:CHO) u prisustvu efektorski kompetentnih anti-BDCA2 mAb (24F4S i BIIB059), Fc osakaćenih mAb (24F4S-Agly i 24F4A-Agly) ili IgG1 izotip kontrole i inkubirane 4 sata na 37°C. Negativna kontrola sastojala se od bunarića koji sadrže CHO i NK ćelije bez antitela. NK i CHO ćelije lizirane sa Tx-100 upotrebljene su za određivanje maksimalnog ubijanja. ADCC je procenjena upotrebom Vybrant kompleta za testiranje citotoksičnosti (Invitrogen), sledeći uputstva proizvođača. Test detektuje G6PD iz oštećenih ćelija na osnovu G6PD-zavisne redukcije resazurina koji emituje fluorescenciju na 590 nm nakon ekscitacije na 530 nm. ADCC test prikazan na Slici 22 panel A izveden je upotrebom visoko BDCA2 eksprimirajućih CHO ćelija (panel C) dok je ADCC test na Slici 22 panel B upotrebljavao CHO ćelije sa nižom BDCA2 ekspresijom (panel D).

11

[0281] 24F4S je dovelo do 100% ubijanja CHO ćelija koje nose BDCA2 slično triton X liziranju. Kao što se očekivalo aglikozilovana verzija mAb (24F4S-agly) nije dovela do ADCC (Slika 22A). U poređenju sa 24F4S, BIIB059 je imao identičnu ADCC aktivnost (Slika 22B). Treba napomenuti da je efikasnost ubijanja bila u korelaciji sa nivoom BDCA2 ekspresije na CHO ćelijama (Slika 22C i Slika 22D).

b) CDC test

[0282] U citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC), C1q vezuje antitelo koje pokreće kaskadu komplementa i dovodi do ćelijske lize (Slika 23). Kao što je pokazano u odeljku Primer 29, BIIB059 može efikasno vezati komplement komponentu C1q. Ovaj eksperiment je izveden da bi se potvrdilo da BIIB059 može posredovati u CDC.

[0283] CHO-BDCA2/FcεRIγ stabilne transfektantne ćelije (EAG2456 T1F2 klon 34.16.7) zasejane su pri 5x10<4>ćelija u kolagen crne ploče sa 96 bunarića i inkubirane na 37°C tokom 48 sati. Ploče su zatim isprane i inkubirane sa komplementom zečjeg seruma i propidijum jodidom (PI) u prisustvu efektorski kompetentnih anti-BDCA2 mAb (24F4S i BIIB059), mAb deficijentnim u efektorskoj funkciji (24F4S-Agly i 24F4A-Agly) ili IgG1 izotip kontrole tokom 1 h na 37°C. Negativna kontrola sastojala se od bunarića koji sadrže CHO ćelije, komplement zečjeg seruma, i PI, bez antitela. NK i CHO ćelije lizirane sa T-100x upotrebljene su za određivanje maksimalnog ubijanja. Ploče su očitane upotrebom čitača ploča Cytoflour Fluorescence (ex530/em645). Anti-BDCA2 mAb (BIIB059 i 24F4S) dovela su do ubijanja ćelija CDC-om slično Triton lizi. Kao što se očekivalo aglikozilovana mAb deficijentna u efektorskoj funkciji (24F4S-Agly i 24F4A-Agly) nisu posredovala u CDC (Slika 23). BIIB059 ima potencijal da ukloni pDC-e koje nose BDCA2 zahvaljujući svom funkcionalnom IgG1 Fc regionu. Iako je BIIB059 sposobno za citotoksičnu aktivnost u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju BDCA2, ne očekuje se da se uklone in vivo zbog brze, održavane i skoro potpune internalizacije receptora posle BIIB059 ligacije.

Primer 31. Kloniranje pacovskog BDCA2 homologa i pregled za vezivanje od strane BIIB059

[0284] Kada je cDNK sekvenca humanog BDCA2 BLASTed prema pacovskoj sekvenci u NCBI bazi podataka, najbliži homolog je pacovski Clec4b2, opisan u Genbank pristupnom broju NM_001005896. Da bi se odredilo da li je vodeće hu24F4 H4/L1 C95A mAb sposobno

12

da se vezuje za pacovski homolog humanog BDCA2, klonirane su cDNK i konstruisani ekspresioni vektori za pacovski Clec4b2 i pacovski FcεRIγ. Proteinska sekvenca pacovskog Clec4b2 pune dužine deli samo 51,0% identičnosti sa humanim BDCA2. Poravnanje sa umetnutim razmacima humanog BDCA2 (gornja) i pacovskog Clec4b2 (donja) pokazano je ispod:

[0285] Pacovski Clec4b2 je kloniran pomoću RT-PCR iz prvog lanca cDNK slezine pacova sa prajmerima 5' GAC CTT CTG AAT ATA TGC GGC CGC CAT GAT GCA GGA AAA AC 3' (SEQ ID NO: 83) (koji dodaje 5' NotI mesto i Kozak sekvencu neposredno pre Clec4b2 inicijatorskog metionina) i 5' CCC ACA GCC ATG GAG GAC AGG ATC CTC ATA AGT ATA TTT TC 3' (SEQ ID NO: 84) (koji dodaje 3' BamHI mesto neposredno nakon Clec4b2 terminatora). 0,64 kb RT-PCR proizvod je prečišćen i subkloniran u Invitrogen pCR2.1TOPO vektor za kloniranje, proizvodeći konstrukt pCN815, čiji je insert sekvencioniran. Mutageneza usmerana na mesto je izvedena na templatu pCN815 sa prajmerima 5' CAG GAT TTC ATC AAC GGA ATC CTA GAC ACT CGT TGG G 3' (SEQ ID NO:85) i njegovim reverznim komplementom, da ispravi PCR grešku, što je rezultiralo konstruktom pCN822, za čiju je Clec4b2 dedukovanu proteinsku sekvencu potvrđeno da je identična onoj u NM_001005896. Ekspresioni vektor sisara za cDNK pacovskog Clec4b2 pune dužine konstruisan je ligacijom 0,64 kb NotI-BamHI fragmenta iz pCN822 sa 1,89 kb BamHI-XbaI i 4,17 XbaI-NotI fragmenata vektorske okosnice iz ekspresionog vektora pV90, da bi se proizveo ekspresioni vektor pCN834, čija je insert cDNK sekvenca potvrđena.

[0286] cDNK pacovskog FcεRIγ opisana je u Genbank pristupnom broju NM_001131001. Proteinska sekvenca pacovskog FcεRIγ deli 90,7% identičnosti sa humanim FcεRIγ: poravnanje, sa humanom (gornja) i pacovskom (donja) je pokazano ispod:

[0287] cDNK pacovskog FcεRIγ je klonirana pomoću RT-PCR iz prvog lanca cDNK slezine pacova sa prajmerima 5' CCC AGC GCT GCA GCC CGC GGC CGC CAT GAT CCC AGC GGT 3' (SEQ ID NO: 87) (koji dodaje NotI mesto i Kozak sekvencu neposredno pre FcεRIγ inicijatorskog metionina) i 5' GAA CAC GTG TTG GGA TCC TAT TGG GGT GGT TTC TC 3' (SEQ ID NO: 88) (koji dodaje 3' BamHI mesto neposredno nakon FcεRIγ terminatora).

0,27 kb RT-PCR proizvod je prečišćen i subkloniran u Invitrogen pCR2.1TOPO vektor za kloniranje, proizvodeći konstrukt pCN816, čiji je insert sekvencioniran i potvrđen da je identičan onome u NM-001131001. 0,27 kb NotI-BamHI fragment iz pCN816 je ligiran na 0,66 kb BamHI-XhoI i 4,16 kb XhoI-NotI fragmente vektorske okosnice iz pBHS103, da bi se konstruisao ekspresioni vektor sisara pCN844, čija je insert cDNK sekvenca pacovskog FcεRIγ potvrđena.

[0288] Da bi se odredilo da li je vodeće hu24F4 H4/L1 C95A mAb sposobno da se vezuje za površinski pacovski Clec4b2, 293E ćelije su prolazno kotransfektovane sa reporterskim ekspresionim vektorom EGFP (pEAG1458) i bilo humanim BDCA2/FcεRIγ vektorima (pEAG2420 i pEAG2413) ili pacovskim Clec4b2/FcεRIγ vektorima (pCN834 i pCN844) u molarnim odnosima 1:1:1. Tri dana posle transfekcije ćelije su sakupljene i obojene sa vodećim hu24F4 H4/L1 C95A mAb u FACS testu direktnog vezivanja titracije razblaženja, ograđivanjem na žive EGFP-pozitivne ćelije. Iako je uočeno visoko afinitetno vezivanje hu24F4 za površinski humani BDCA2, nije detektovano vezivanje za površinski pacovski Clec4b2. Ovo ukazuje da hu24F4 nema unakrsnu reaktivnost sa najbližim pacovskim homologom humanog BDCA2.

Primer 32. Primena BIIB059 zdravim cinomolgus majmunima rezultira u gubitku BDCA2 sa površine plazmocitoidne dendritske ćelije, verovatno putem internalizacije

[0289] Da bi se procenilo da li su se površinski nivoi BDCA2 promenili nakon primene BIIB059 cinomolgus majmunima, upotrebljena su dva testa. Prvi test, takozvani "direktni" postupak, detektuje površinski vezano BIIB059 sa anti-humanim PE-obeleženim sekundarnim antitelom. U idealnom slučaju, ne-unakrsno blokirajuće antitelo na BDCA2 upotrebilo bi se za detektovanje ukupnog BDCA2; međutim, takvo antitelo ne postoji. Stoga, u drugom testu, takozvanom "indirektnom" postupku, nezaposednut BDCA2 je detektovan preko dodavanja BIIB059 konjugovanog na A647.

[0290] Pre primene bilo kog testnog predmeta, za svakog cinomolgus majmuna, utvrđena je maksimalna srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje BIIB059 za pDC u 3 različite vremenske tačke (nedelje -3, -2, i -1 pre pojedinačne injekcije BIIB059). U svakoj vremenskoj tački dodata je titracija neobeleženog BIIB059 (40 do 0,04 µg/mL krajnje koncentracije) u alikvote krvi, i BIIB059 je detektovan upotrebom PE-obeleženog sekundarnog antitela ("direktni" postupak), ili je slobodni BDCA2 procenjen sa BIIB059-647 ("indirektni" postupak). Maksimalne vrednosti uzete su iz vrednosti na platou u svakom testu (Slike 24 i 25). Procena vrednosti otkrila je vrlo skromne fluktuacije u maksimalnim MFI za svakog cinomolgus majmuna, sa više varijacija između cinomolgus majmuna, pokazujući da je gustina BDCA2 na pDC kod cinomolgus majmuna varijabilna (Tabela 2).

12

Tabela 2. Sažetak prosečnog EC50 vezivanja BIIB059 na BDCA2 ćelijske površine na pDC u punoj krvi cinomolgus majmuna

Puna krv je uzeta iz dvanaest cinomolgus majmuna, jednom nedeljno u trajanju od tri nedelje ukupno. Krv je inkubirana sa različitim koncentracijama BIIB059 humanog IgG1 (0,04 do 40 ug/mL, kriva sa 6 tačaka, 1:4 puta razblaženja). pDC su identifikovane upotrebom protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i tretirane sa anti-humanim IgG PE obeleženim sekundarnim za detekciju BIIB059 vezanog za BDCA2 receptor na pDC. MFI PE je izračunat sa FlowJo softverom, i EC50 krive su generisane u GraphPad Prism softveru.

* prosek od 2-3 eksperimenta

[0291] Posle primene nosača, kao što se očekivalo nije pronađen BIIB059, i nije pronađena značajna promena u BDCA2 nivoima kako je procenjeno vezivanjem BIIB059-A647 (10 µg/ml) (Slika 26).

[0292] Posle intravenske (IV) primene BIIB059 pri bilo 10 mg/kg ili 1 mg/kg, nije detektovano BIIB059 na površini, ni tako rano kao 1 sat nakon injekcije BIIB059 (Slike 27 i 28). Takođe, nije bilo slobodnog BDCA2 kako je procenjeno nedostatkom BIIB059-A647 tokom 38 dana za sve tretirane cinomolgus majmune, sa izuzetkom cinomolgus majmuna 5; koncentracije u serumu kod ovog cinomolgus majmuna brzo su opale 10. dana, verovatno zbog imunogenosti razvijene prema BIIB059.

[0293] Posle subkutane primene niže doze BIIB059 (0,2 mg/kg), BIIB059 je kratko uočen na površini pDC (za sat 1, nestao je do 6 sati). U istoj vremenskoj tački (1 h) uočeno je nešto slobodnog BDCA2 (13%, 74%, 72% od početne vrednosti MFI). Opet, nije detektovan lek tokom ostatka studije, i nije detektovan slobodan BDCA2 receptor do 14. dana nakon injekcije BIIB059 (Slika 29).

[0294] Kod svih cinomolgus majmuna, ponovna pojava slobodnog BDCA2 poklopila se sa padom nivoa leka u serumu ispod 1 µg/ml (Slike 30 i 31). Stoga, čini se da je 1 µg/ml minimalna koncentracija BIIB059 potrebna za posredovanje u internalizaciji svih površinskih BDCA2.

[0295] Tabela 3 sumira EC10, EC50, i EC90internalizaciju BDCA2 receptora na pDC nakon ligacije sa BIIB059 u punoj krvi cinomolgus majmuna. EC10-50-90krive su generisane u GraphPad Prism softveru upotrebom četvoroparametarskog fitovanja.

12

[0296] Da sumiramo, eksperimenti opisani u ovom primeru pokazuju da: in vivo IV primena visokih doza (10, i 1 mg/kg) BIIB059 dovela je do brzog nestanka i raspoloživog BDCA2 i vezanog leka sa ćelijske površine, što sugeriše internalizaciju receptora. Subkutana primena male doze (0,2 mg/kg) BIIB059 rezultirala je vrlo prolaznom (za sat 1) detekcijom BIIB059 na površini pDC. Do 6 sati, nije bilo BIIB059 koji se mogao detektovati na ćelijskoj površini pDC-a. Ponovno pojavljivanje raspoloživog BDCA2 na ćelijskoj površini dogodio se kada je izloženost leku pala ispod 1 µg/mL.

Primer 33: BIIB059 inhibira pro-inflamatorne medijatore pored svih tipova IFN tipa I

[0297] Ligacija BDCA2 suzbija sposobnost pDC-a da proizvode IFN tipa I kao odgovor na TLR ligande (videti Sliku 16). Da bi se potvrdila inhibitorna aktivnost anti-BDCA2 mAb, BIIB059, prečišćene pDC-e od zdravih humanih davalaca stimulisane su sa sintetičkim TLR9 ligandom, CpG-A, u prisustvu 10 µg/mL BIIB059 ili izotip kontrolnim mAb. Konkretno, pDC od zdravih humanih davalaca izolovane su upotrebom dvostepene procedure odvajanja magnetnim perlama (MACS komplet, Miltenyi Biotec). 5 x10<4>prečišćenih humanih pDC-a/bunariću je ostavljeno netretirano (medijum) ili je stimulisano sa 1 μM TLR9 ligandom (CPG-A) u prisustvu ili 10 µg/mL BIIB059 (CpG-A BIIB059) ili izotip kontrole (CpG-A Izo). Ploče koje sadrže pDC inkubirane su tokom 18 sati na 37°C i supernatanti su prikupljeni za upotrebu u ELISA ili multipleks testovima za merenje koncentracija inflamatornih citokina i hemokina. Ovi eksperimenti su pokazali da BIIB059 potentno inhibira TLR9-indukovani IFNα i druge pDC-izvedene citokine kao što su TNFα i IL-6 kao i TLR-9 indukovane hemokine kao što su CCL3, CCL4, CCL5 (Slika 32).

[0298] Takođe je ispitivana sposobnost BIIB059 da inhibira proizvodnju IFNα i proinflamatornih medijatora nakon stimulacije sa fiziološki relevantnim ligandom, imunskim kompleksima. Konkretno, Sm/RNP imunski kompleksi (IC) su pred-formirani mešanjem sm-

12

RNP iz timusa teleta i anti-RNP antitela prečišćenih iz seruma SLE pacijenata tokom 1 sata u medijumu bez seruma. pDC od zdravih humanih davalaca izolovane su upotrebom dvostepene procedure odvajanja magnetnim perlama (MACS komplet, Miltenyi Biotec). 5 x10<4>pDC/bunariću je ostavljeno netretirano (medijum) ili je stimulisano sa pred-formiranim Sm/RNP IC u prisustvu bilo 10 μg/mL BIIB059 (IC BIIB059) ili izotip kontrole (IC Izo). Ploče koje sadrže pDC inkubirane su tokom 18 sati na 37°C i supernatanti su prikupljeni za upotrebu u ELISA ili multipleks testovima za merenje koncentracija inflamatornih citokina i hemokina. Ove studije su pokazale da BIIB059 potentno inhibira Sm/RNP imunskim kompleksima-indukovane IFNα i druge pDC-izvedene citokine kao što su TNFα i IL-6. BIIB059 takođe inhibira hemokine indukovane Sm/RNP imunskim kompleksima, kao što su CCL3 i CCL4 (Slika 33).

Primer 34: BIIB059 inhibira Sm/RNP IC-indukovanu transkripciju podtipova IFN tipa I od strane prečišćenih humanih pDC

[0299] Trinaest podtipova IFNα i jedan član IFNβ postoji kod ljudi. Efekat BIIB059 na transkripciju podtipova IFN tipa I u Sm/RNP IC stimulisanim pDC od zdravih humanih davalaca procenjen je upotrebom testova kvalitativne lančane reakcije polimeraze (qPCR).

[0300] Sm/RNP imunski kompleksi (IC) su pred-formirani mešanjem sm-RNP iz timusa teleta i anti-RNP antitela prečišćenih iz seruma SLE pacijenata tokom 30 minuta u medijumu bez seruma. pDC od zdravih humanih davalaca izolovane su upotrebom dvostepene procedure odvajanja magnetnim perlama (MACS komplet, Miltenyi Biotec). 7,5 x10<5>prečišćenih humanih pDC/bunariću je osvljeno netretirano (medijum) ili je stimulisano sa predformiranim Sm/RNP IC u prisustvu ili 10 µg/mL BIIB059 (IC BIIB059) ili izotip kontrole (IC Izo). Ploče koje sadrže pDC inkubirane su tokom 16 sati na 37°C i 5% CO2. pDC ćelije su sakupljene i RNK iz pDC je izolovana za procenu u qPCR reakciji.

[0301] Ovaj eksperiment je pokazao da je tretman sa BIIB059 inhibirao nivo transkripta svih testiranih podtipova IFN tipa I (Slika 34).

Primer 35. BIIB059 inhibira TLR9-indukovanu proizvodnju INFα od strane humanih PBMC od zdravih davalaca i SLE pacijenata

[0302] pDC su glavni proizvođači IFN kao odgovor na stimulaciju TLR7 i TLR9. pDC mogu proizvesti hiljadu puta više IFN nego bilo koji drugi tip ćelije. Ovaj eksperiment istražuje da li

12

BIIB059 može inhibirati TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα u kulturama mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) bez potrebe za izolacijom pDC. PBMC od zdravih humanih davalaca ili SLE pacijenata stimulisane su sa 1 ili 5 μM TLR9 liganda (CpG-A) i tretirane sa koncentracijama BIIB059 u rasponu od 10 μg/mL do 2 ng/mL u ukupnoj testnoj zapremini od 250 μL/bunariću. Ploče su inkubirane preko noći (18 sati) na 37°C i 5% CO2. Supernatanti su sakupljeni za procenu u IFNα ELISA testovima.

[0303] Ovaj eksperiment je pokazao da BIIB059 inhibira TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα od strane PBMC od zdravih davalaca sa prosečnom IC50od 0,04 /- 0,05 µg/mL (Slike 35A i 35C). BIIB059 je pokazao sličnu potentnost kod inhibiranja TLR9-indukovane proizvodnje IFNa od strane PBMC od SLE pacijenata sa prosečnom IC50od 0,03 /-0,01 µg/mL (Slike 35B i 35C).

Primer 36: BIIB059 inhibira proizvodnju INFα u punoj krvi koja je stimulisana sa TLR9 ligandom

[0304] Aktivnost BIIB059 takođe je procenjena u testovima pune krvi (WBA). Puna krv od zdravih humanih davalaca stimulisana je sa TLR9 ligandom u prisustvu rastućih koncentracija BIIB059 i IC50 inhibicije je izračunata za svakog pojedinačnog davaoca. Konkretno, puna krv od zdravih humanih davalaca inkubirana je sa rastućim koncentracijama BIIB059 u rasponu od 10 μg/mL do 2 ng/mL ili izotip kontrolom u ukupnoj testnoj zapremini od 200 μl/bunariću. CpG-A je dodat pri 75 µg/mL (otvoreni kvadrat), što je određeno da je optimalno za stimulaciju proizvodnje IFNα u punoj krvi. Ploče su inkubirane tokom 18 sati na 37°C i supernatanti su sakupljeni za upotrebu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource).

[0305] BIIB059 je pokazao dozno zavisnu inhibiciju TLR9-indukovane proizvodnje IFNα u testovima pune krvi i pokazao je sličnu IC50 onoj koja je viđena kod PBMC kultura (Slika 36).

Primer 37: BIIB059 ne inhibira TLR3-indukovanu proizvodnju IFNα od strane humanih PBMC od zdravih humanih davalaca

[0306] Ovaj eksperiment je izveden da bi se odredilo da li su drugi tipovi ćelija pokrenuti različitim TLR ligandima još uvek u stanju da proizvedu IFN tipa I čak u prisustvu BIIB059. TLR3 nije eksprimiran u pDC-a i stoga TLR3 ligand ne indukuje proizvodnju IFN od strane pDC-a. PBMC od zdravih humanih davalaca stimulisane su sa poli:IC, koji je TLR3 ligand

12

koji može potentno indukovati IFN tipa I pretežno od strane monocita. Konkretno, PBMC od zdravih humanih davalaca stimulisane su sa 1 μM TLR3 liganda (Poli I:C) i tretirane sa koncentracijama BIIB059 u rasponu od 10 μg/mL do 0,5 ng/mL u ukupnoj testnoj zapremini od 250 μL/bunariću u ploči sa 96 bunarića. Ploče su inkubirane preko noći (18 sati) na 37°C i 5% CO2.200 μL supernatanta je sakupljeno za procenu nivoa IFNα pomoću ELISA. Kao što je pokazano na Slici 37, BIIB059 nije uticalo na TLR3-indukovanu proizvodnju IFNα od strane PBMC od zdravih humanih davalaca.

[0307] Da sumiramo, Primeri 33-37 pokazuju da BIIB059 može potentno inhibirati TLR9-stimulisani interferon tipa I od strane prečišćenih pDC, PBMC, i kultura pune krvi. BIIB059 je podjednako potentno za inhibiranje TLR9-indukovanog interferona tipa I od strane pDC-a od zdravih humanih davalaca i SLE pacijenata. Pored inhibicije IFN tipa I, BIIB059 može inhibirati proizvodnju drugih pDC-izvedenih citokina i hemokina. BIIB059 specifično inhibira TLR9-indukovani IFN tipa I od strane pDC-a i ne utiče na proizvodnju IFN od strane drugih tipova ćelija pokrenutih sa različitim TLR ligandom. Stoga, in vitro podaci obezbeđeni ovde podržavaju farmakološku aktivnost i potentnost BIIB059 pored njegove specifičnosti za TLR7/9-indukovani IFN tipa I od strane pDC-a.

Primer 38: BIIB059 posreduje u BDCA2 internalizaciji na humanim pDC-a

[0308] Da bi se odredilo da li BIIB059 indukuje internalizaciju BDCA2, humana puna krv od 10 zdravih humanih davalaca inkubirana je sa rastućim koncentracijama BIIB059 na 37°C tokom 16 sati. Preostala BDCA2 ćelijske površine detektovana su upotrebom FITC-obeleženog ne-unakrsno blokirajućeg anti-BDCA2 mAb (klon 2D6).

[0309] Konkretno, puna krv od 10 zdravih humanih davalaca inkubirana je sa rastućim koncentracijama BIIB059 ili 10 µg/ml izotip kontrolnog antitela tokom 16 sati na 37°C i 5% CO2, a zatim je inkubirana tokom 30 minuta na 4°C sa FITC-obeleženim ne-unakrsno blokirajućim anti-BDCA2 mAb (klon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 i anti-CD20. Puna krv je zatim inkubirana tokom 30 minuta na 4°C sa 50 μL rastvora za bojenje, koji je uključivao sledeća mAb: FITC-obeleženo ne-unakrsno blokirajuće anti-BDCA2 mAb (klon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 i anti-CD20. Crvena krvna zrnca (RBC) su lizirana upotrebom 1X Lyse/fix pufera (BD Bioscience).

[0310] Kao što je pokazano na Slici 38, BIIB059 je dovelo do dozno zavisnog smanjenja intenziteta FITC-obeleženog 2D6 bojenja sa prosečnom EC50od 0,017 ± 0,005 µg/mL.

12

Primer 39: BDCA2 se brzo internalizuje nakon ligacije sa BIIB059

[0311] Da bi se odredila kinetika BIIB059-indukovane internalizacije BDCA2, humana puna krv je inkubirana sa različitim koncentracijama BIIB059 na 37°C tokom različitih perioda. Konkretno, puna krv je tretirana sa 10, 1, 0,1 ili 0,01 μg/mL BIIB059 ili izotip kontrolnim antitelom (10 μg/ml) na 37°C tokom naznačenih perioda. Puna krv je zatim inkubirana tokom 30 minuta na 4°C sa 50 μL rastvora za bojenje koji je uključivao sledeća mAb: FITC-obeleženo ne-unakrsno blokirajuće anti-BDCA2 mAb (klon 2D6), anti-HLA-DR, anti-CD123, anti-CD14 i anti-CD20. Crvena krvna zrnca (RBC) su lizirana i fiksirana upotrebom 1X Lyse/fix pufera (BD Bioscience). Kao što je pokazano na Slici 39, nakon inkubacije sa BIIB059 pri 1 µg/ml, intenzitet FITC-obeleženog 2D6 bojenja brzo se smanjuje dostižući pozadinske nivoe u roku od jednog sata od inkubacije. Inkubacija sa desetostruko nižom koncentracijom BIIB059 (0,1 µg/ml) odložila je internalizaciju BDCA2 za 2 sata. Ovi podaci pokazuju da stopa internalizacije BDCA2 zavisi od doze BIIB059.

Primer 40: BIIB059 indukuje internalizaciju BDCA2 u humanim plazmocitoidnim dendritskim ćelijama

[0312] Da bi se vizualizovala internalizacija BDCA2 posle ligacije sa BIIB059, prečišćene pDC-e su inkubirane sa A647-obeleženim BIIB059 i analizirane konfokalnom mikroskopijom. Kao što se očekivalo, BDCA2 je lokalizovan na ćelijskoj površini pDC-a na 4°C. Nakon kratke inkubacije na 37°C, BDCA2 je jasno detektovan unutar ćelija (Slika 40).

Primer 41: Internalizacija ne menja BIIB059-posredovanu inhibiciju proizvodnje INFα

[0313] Ovaj eksperiment je istraživao da li internalizacija BDCA2 menja sposobnost BIIB059 da inhibira TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα od strane pDC. Ćelije su pred-inkubirane sa BIIB059 na 37°C tokom različitih perioda koji odgovaraju maksimalnoj internalizaciji BDCA2 i zatim stimulisane sa TLR9 ligandom tokom dodatnih 18 sati. Konkretno, puna krv je sakupljena iz heparinizovane venske krvi zdravih davalaca i pret-inkubirana sa BIIB059 ili izotip kontrolnim antitelom tokom naznačenog trajanja. U svakoj vremenskoj tački posle pred-inkubacije, ćelije su stimulisane sa 200 μg/mL TLR9 liganda (CpG-A) i inkubirane tokom dodatnih 18 sati na 37°C. Supernatanti su sakupljeni za upotrebu u IFNα ELISA testovima (PBL InterferonSource). Kao što je pokazano na Slici 41, pred-inkubacija sa

1

BIIB059 (do 9 sati) nije izmenila sposobnost BIIB059 da inhibira TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα u testovima pune krvi od zdravih humanih davalaca. Ovi podaci sugeršu da bi internalizacija BDCA2 mogla biti potrebna za inhibiciju TLR9 signalizacije.

Primer 42: EC50 BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2 na pDC-a korelira sa IC50 BIIB059-posredovane inhibicije TLR9-indukovanog INFα od strane pDC-a u testovima pune krvi

[0314] Da bi se dodatno istražila veza između internalizacije BDCA2 i inhibicije TLR9 signalizacije, potentnost BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2 na pDC-a i inhibicije TLR-posredovane proizvodnje IFNα od strane pDC-a poređena je kod 10 zdravih humanih davalaca.

[0315] Za procenu BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2, puna krv je inkubirana sa BIIB059 tokom 16 sati. Puna krv je zatim sakupljena, lizirana, i ekspresija BDCA2 je procenjena protočnom citometrijom upotrebom FITC-konjugovanog ne-unakrsno blokirajućeg antitela 2D6. Da bi se procenila BIIB059-posredovana inhibicija TLR9-indukovanog IFNα od strane pDC-a, puna krv je inkubirana sa rastućim koncentracijama BIIB059 tokom 16 sati u prisustvu TLR9 liganda. Supernatanti su sakupljeni i procenjeni na IFNα pomoću ELISA. EC50 BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2 bila je 0,02 µg/mL. IC50 BIIB059 posredovane inhibicije TLR9-indukovanog IFNα bila je 0,07 µg/mL. Uočena je korelacija između EC50 BIIB059-posredovane internalizacije BDCA2 i IC50 BIIB059 inhibicije IFNα sa R kvadratnom vrednošću od 0,57 (Slika 42).

Primer 43: TLR9 aktivacija indukuje BDCA2 kolokalizaciju sa TLR9 i sa lizozomskim markerom LAMP1

[0316] Da bi se testirala hipoteza da BIIB059-posredovana TLR9 inhibicija zahteva internalizaciju i lokalizaciju BDCA2 u endozomske/lizozomske kompartmente koji sadrže TLR9, upotrebljena je konfokalna mikroskopija da bi se pratila unutarćelijska distribucija BDCA2 nakon BIIB059 ligacije. Prečišćene humane pDC-e su kultivisane tokom 7 dana i inkubirane sa A647-obeleženim BIIB059 tokom 15 minuta na 37°C. Tokom poslednjih 10 minuta inkubacije, ćelije su tretirane sa 1 μM TLR9 ligandom CpG-A ili ostavljene netretirane. Ćelije su obojene fluorescentno obeleženim antitelima na TLR9 i marker kasnog endozoma/lizozoma, LAMP1, i analizirane konfokalnom mikroskopijom.

1 1

[0317] TLR9 je regrutovan u kasni endozomski/lizozomski kompartment nakon stimulacije sa TLR9 ligandom, što je dokazano povećanom kolokalizacijom TLR9 sa LAMP1 (Slika 43). Stimulacija TLR9 takođe je značajno povećala udeo BDCA2 kolokalizacije sa TLR9 i LAMP1. Ovi rezultati sugerišu da se BIIB059, kada je vezano za BDCA2, poželjno lokalizuje u unutarćelijske kompartmente gde je prisutan aktivirani TLR9.

[0318] Ukratko, Primeri 38-43 pokazuju da BIIB059, humanizovano monoklonalno antitelo prema BDCA2, angažuje BDCA2 i dovodi do njegove internalizacije. Nakon stimulacije, BDCA2 kolokalizuje se TLR9 u endozomskom/lizozomskom kompartmentu gde posreduje u inhibiciji TLR9 signalizacije. Ovi podaci sugerišu da je internalizacija BDCA2 neophodan korak za posredovanje u inhibiciji TLR9-indukovanih pro-inflamatornih medijatora od strane pDC-a.

Primer 44: Efekat BIIB059 na nivoe CD62L

[0319] Cirkulišuće pDC eksprimiraju visoke nivoe CD62L (L-selektin) i navodi na limfoidno tkivo koje sadrži venule visokog endotela (HEV). PNAd je ligand za CD62L koji se konstitutivno eksprimira na HEV i posreduje u navođenju ćelija koje eksprimiraju CD62L ka organizovanom limfoidnom tkivu. Pronađeno je da se PNAd eksprimira u dermalnim endotelskim ćelijama u kožnim lezijama eritemskog lupusa. Zahvaljujući svojoj CD62L ekspresiji, pDC mogu biti regrutovane u inflamirana periferna tkiva koja eksprimiraju PNAd.

[0320] Da bi se odredilo da li BIIB059 utiče na ekspresiju CD62L na površini humanih pDC-a, puna krv je tretirana sa različitim koncentracijama BIIB059 tokom 1 sata na 37°C bez stimulacije. Konkretno, puna krv od zdravih humanih davalaca tretirana je sa rastućim koncentracijama BIIB059 tokom 1 sata na 37°C i 5% CO2. MFI CD62L je određen ograđivanjem na pDC kako je definisano pomoću CD14-, CD20-, HLA-DR+ i CD123+.

[0321] BIIB059 je uzrokovalo dozno zavisno smanjenje CD62L ekspresije na površini humanih pDC-a, kako je procenjeno protočnom citometrijom (Slika 44). Stimulacija pDC-a sa TLR ligandom nije uticala na ekspresiju CD62L (Slika 44A).

Primer 45: Tretman PBMC sa GM6001 inhibira BIIB059 posredovano oslobađanje CD62L sa površine humanih pDC

[0322] Poznato je da metaloproteinaze indukuju oslobađanje CD62L sa površine imunskih ćelija. Da bi se istražilo da li su metaloproteinaze uključene u BIIB059-posredovano

1 2

smanjenje površinskog CD62L, PBMC su pripremljene od zdravih humanih davalaca i predtretirane sa GM6001 (inhibitorom metaloproteinaze) tokom 30 minuta na 37°C i 5% CO2, praćeno dodavanjem 10 μg/mL BIIB059 tokom 1 sata. Površinska ekspresija CD62L testirana je pomoću protočne citometrije. GM6001 je inhibirao BIIB059-posredovano smanjenje modulacije CD62L na dozno-zavisan način (Slika 45). Ovi podaci sugerišu da BIIB059 indukuje oslobađanje CD62L na način zavisan od metaloproteinaze.

[0323] Ukratko, Primeri 44 i 45 pokazuju da BIIB059 smanjuje ekspresiju CD62L na površini humanih pDC. BIIB059-posredovano smanjenje modulacije CD62L je inhibirano pomoću inhibitora metaloproteinaze (GM6001), što ukazuje da BIIB059 indukuje oslobađanje CD62L sa površine humanih pDC preko, najmanje delom, aktivacije metaloproteinaza. Stoga se očekuje da će lečenje sa BIIB059 smanjiti ili sprečiti prenošenje pDC do ciljnih organa u SLE.

Primer 46: Uticaj Fc regiona BIIB059 na proizvodnju IFN posredovanu imunskim kompleksom od strane plazmocitoidnih dendritskih ćelija

[0324] Fc gama receptor IIA (CD32a) je protein ćelijske površine koji vezuje IgG sa niskim afinitetom. Isključivo humane plazmocitoidne dendritske ćelije eksprimiraju Fc gama receptor IIA, CD32a. Pokazano je da stimulacija pDC-a imunskim kompleksima zavisi od CD32. Imunski kompleksi se internalizuju pomoću CD32 i stimulišu endozomski TLR7/9 da indukuje proizvodnju IFN od strane pDC.

[0325] Da bi se odredio uticaj BIIB059 na površinsku ekspresiju CD32a, izolovane pDC-e su tretirane sa rastućim koncentracijama BIIB059 ili aglikozilovanim oblikom antitela, 24F4-A, i inkubirane tokom 16 sati na 37°C. pDC-e su zatim bojene sa FITC-obeleženim BDCA2 i PE-obeleženim anti-CD32 (klon AT10) i površinska ekspresija BDCA2 i CD32 je procenjena pomoću protočne citometrije. BIIB059 i agly verzija, 24F4-A, bila su podjednako potentna u svojoj sposobnosti da indukuju internalizaciju BDCA2 (Slika 46A). Samo je BIIB059 bilo u stanju da indukuje smanjivanje modulacije CD32 na ćelijskoj površini pDC-a na šta ukazuje dozno-zavisno smanjenje srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) CD32 (Slika 46B-D). Tretman sa efektorski kompetentnom izotip kontrolom nije imao uticaja na površinske nivoe CD32 (Slika 46). Ovi podaci ukazuju da je BIIB059-posredovano smanjivanje modulacije nivoa CD32a na površini pDC-a specifično za vezivanje Fc regiona BIIB059.

[0326] Da bi se osiguralo da vezivanje Fc regiona BIIB059 ne dovodi samo do maskiranja epitopa CD32 koga prepoznaje FITC-obeleženo anti-CD32 mAb, pDC-e su tretirane sa 10

1

µg/mL BIIB059 tokom 1 sata na 4°C ili 37°C i potom obojene sa obeleženim anti-CD32. Kao što je pokazano na Sl. 46E, tretman sa BIIB059 na 4°C nije smanjio CD32 MFI što ukazuje da tretman sa BIIB059 ne ometa vezivanje obeleženih anti-CD32 mAb. Činjenica da je smanjivanje modulacije CD32a nastalo samo nakon inkubacije sa BIIB059 na 37°C sugeriše da se CD32a može izgubiti sa ćelijske površine pDC-a.

[0327] Da bi se odredilo da li smanjivanje modulacije CD32a pomoću BIIB059 ima biološki uticaj, pDC-e su inkubirane u prisustvu rastućih koncentracija BIIB059 ili aglikozilovanog oblika, 24F4A-Agly, i stimulisane sa ili imunskim kompleksima ili sintetičkim TLR9 ligandom (CPG-A). Kao što se očekivalo, BIIB059 i 24F4A-Agly nisu se razlikovala u svojoj sposobnosti da inhibiraju CPG-A-indukovani IFNα od strane pDC-a, što je nezavisno od CD32 (Slika 47A). Postojalo je jasno razdvajanje u potentnosti između BIIB059 i 24F4A-agly kada su pDC-e stimulisane sa imunskim kompleksima. BIIB059 je inhibiralo imunskim kompleksom-indukovan IFNα sa IC50 od 0,04 u poređenju sa IC50 od 1,4 µg/mL pomoću 24F4A-Agly (Slika 47B). Ovi podaci ukazuju da BIIB059 smanjuje modulaciju CD32a zahvaljujući svom funkcionalnom Fc i stoga inhibira stimulaciju pDC-a imunskim kompleksima.

[0328] Da bismo potvrdili da je smanjivanje modulacije CD32a jedinstveno za BIIB059, istražili smo uticaj potpuno humanizovanog anti-CD40 antitela na CD32 nivoe i imunskimkompleksom posredovanu proizvodnju IFNα od strane pDC-a. CD40 je protein ćelijske površine eksprimiran na pDC-ma. Anti-CD40 antitelo sa potpuno funkcionalnim Fc ima sposobnost da aktivira CD40 i veže CD32 na površini pDC-a. Tretman sa anti-CD40 mAb nije imao uticaja na površinsku ekspresiju CD32 i nije značajno uticao na proizvodnju IFNα iz pDC-a stimulisanih imunskim kompleksom (Slike 48A i B). Vezivanje anti CD40mAb je potvrđeno demonstriranjem maksimalnog aktiviranja CD40 u ćelijama tretiranim sa anti-CD40 (Slika 48C).

[0329] Kao što je prethodno pokazano, ligacija BDCA2 sa BIIB059 ili aglikozilovanim oblikom 24F4A-Agly dovodi do internalizacije receptora i inhibicije TLR9-indukovanog IFNα od strane pDC-a. U ovoj studiji pokazujemo da BIIB059 uzrokuje smanjivanje modulacije CD32a na pDC-a i inhibiciju imunskim kompleksom stimulisane proizvodnje IFNα od strane pDC-a na Fc zavisan način. Smanjena modulacija CD32a koju pokreće BIIB059 ne rezultuje od samo bilo kog antitela sa funkcionalnim Fc koji može da se vezuje za molekule ćelijske površine eksprimirane na pDC-a. Ova studija naglašava novi terapijski potencijal efektorski kompetentnog anti-BDCA2 mAb, koje može da priguši pDC odgovore preko svojih i Fab'2 i Fc regiona što dovodi do povećane efikasnosti.

1 4

Primer 47: Interakcija BIIB059 sa hidroksihlorokinom (HCQ)

[0330] Antimalarijski agensi, kao što je hidroksihlorokin (HCQ) upotrebljavaju se u lečenju SLE. pDC-e od SLE pacijenata lečenih sa HCQ imaju oslabljenu sposobnost proizvodnje IFNα nakon stimulacije sa TLR7 i TLR9 ligandima. Pošto i BIIB059 i HCQ utiču na TLR7/9 indukovani IFNα u pDC-a, ispitano je da li uticaj BIIB059 i HCQ može biti suvišan.

[0331] Da bi se rešilo ovo pitanje, humane PBMC su pripremljene iz krvi od zdravih davalaca i stimulisane bilo sa TLR7 ili TLR9 ligandima u prisustvu različitih koncentracija samog BIIB059, samog HCQ, ili BIIB059 u kombinaciji sa HCQ. Supernatanti su sakupljeni nakon 18 sati i testirani na IFNα pomoću ELISA. Dodavanje HCQ povećalo je potentnost BIIB059 i dovelo do aditivnog inhibitornog uticaja na TLR7 i TLR9-indukovanu proizvodnju IFNα od strane PBMC od zdravih humanih davalaca. Ovi podaci demonstriraju da aktivnost BIIB059 i HCQ nije suvišna i ističu dodatnu terapijsku korist BIIB059 kada se primenjuje sa antimalarijskim jedinjenjima kao što je HCQ.

Primer 48: Uticaj BIIB059 na BDCA2-eksprimirajuće pDC-e In Vivo

[0332] Cilj ove studije bio je da se odredi da li primena BIIB059 cinomolgus majmunu posreduje u uklanjanju pDC-a u perifernoj krvi.

[0333] Četiri uzimanja krvi pre doziranja BIIB059 sakupljena su u nedeljnim intervalima od dvanaest cinomolgus majmuna kako bi se utvrdila početna vrednost učestalosti pDC za svaku životinju (Tabela 3).

Tabela 3. Sažetak prosečnih učestalosti cirkulišućih pDC u punoj krvi zdravih cinomolgus majmuna

Puna krv uzeta je od dvanaest cinomolgus majmuna jednom nedeljno, tokom četiri nedelje ukupno. pDC-e su identifikovane upotrebom protočne citometrije kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+. pDC kao procenat CD20-CD14- ćelija izračunata je FlowJo softverom.

1

[0334] U svim statističkim analizama učestalosti pDC su log-transformisane da bi se redukovala iskošenost (Slika 51). Originalna distribucija učestalosti pDC na levom panelu Slike 51 bila je oštro iskošena na desno. Međutim, nakon log-transformacije, distribucija transformisanih učestalosti pDC (Slika 51, desni panel) približno je pratila normalnu distribuciju. Ovi log-transformisani podaci upotrebljeni su za sve postupke statističke analize. Slika 52 pokazuje nivoe pDC na log skali za svakog cinomolgus majmuna tokom četiri vremenske tačke pre IV injekcije. Upotrebom linearnog modela mešovitih uticaja sa četiri vremenske tačke kao fiksnim faktorima i slučajnim presretanjima za cino, zaključili smo da su geometrijske srednje vrednosti procenata pDC za sve majmune bile jednake tokom 4 vremenske tačke pre-doziranja (Slika 53, p-vrednost za vreme zasnovano na F testu: 0,67). Ova analiza je ukazala da je geometrijska srednja vrednost procenta cirkulišućih pDC-a bila relativno stabilna tokom vremena za cinomolgus majmune.

[0335] Devet od ovih dvanaest cinomolgus majmuna podeljeno je u 3 grupe (3/grupi), i nasumično raspoređeno da uključe jednaku zastupljenost gustine BDCA2 i procenta pDC u

1

svakoj grupi. Cinomolgus majmuni su primili jednu intravensku injekciju bilo nosača (natrijum citrat), 10 mg/kg BIIB059, ili 1 mg/kg BIIB059. Protočna citometrija je upotrebljena za identifikaciju cirkulišućih pDC-a u punoj krvi kao CD20-CD14-CD123+HLA-DR+, i učestalost pDC (na log-skali) u svakoj vremenskoj tački je predstavljena grafičkim putem u R softveru (Slika 54). Linearni model mešovitih uticaja fitovan je za log (pDC) učestalosti upotrebom slučajnih presretanja za cinomolgus majmune i fiksnih uticaja za doznu grupu i vremenski period: 1 sat, 6 sati, 1-27 dana, i duže od 28 dana. Da bi se procenilo da li se pDC menjala između različitih doznih grupa u različitim vremenskim periodima, preliminarni model je takođe uključio uslove interakcije za doznu grupu i različite vremenske periode. p-vrednost zasnovana na F-testu za testiranje svih uslova interakcije koji su jednaki 0 je 0,81, što ukazuje da nema razlike za pDC promene između različitih doznih grupa. Dakle, konačni fitovani model uključio je samo statistički značajne uticaje za vremenski period i faktore dozne grupe (Tabela 4).

Tabela 4. Procene fitovanog modela za vremenske tačke posle jedne intravenske injekcije BIIB059 ili nosača

Procene za fiksne uticaje upotrebom linearnog modela mešovitih uticaja upotrebom nasumičnih presretanja za cinomolgus majmune, i fiksne faktore za doznu grupu i vremenske nivoe 1 sat, 6 sati, i duže od 28 dana, za procenat cirkulišućih pDC na log skali pre i posle IV doze natrijum citrat nosača, BIIB059 1 mg/kg, ili BIIB059 od 10 mg/kg kod cinomolgus majmuna.

1

[0336] Procene parametara za fiksne faktore su eksponencionirane da bi se protumačile kao odnosi učestalosti pDC u tim vremenskim periodima u poređenju sa pre doziranja BIIB059. Sveukupno, odnos je bio značajno manji od onog kada se porede učestalosti pDC na 1 sat nakon IV injekcije sa učestalostima pDC pre doziranja (95% CI: 0,43-0,77, p-vrednost: 0,0003). Odnos je bio značajno veći od onog kada se porede učestalosti pDC na 6 sati nakon IV injekcije sa učestalostima pDC pre doziranja (95% CI: 1,18-2,12, p-vrednost: 0,003). Odnos se nije značajno razlikovao od onog kada se porede učestalosti pDC perioda 1-28 dana nakon IV injekcije sa učestalostima pDC pre doziranja. Odnos je bio značajno manji od onog kada se porede učestalosti pDC nakon 28 dana nakon IV injekcije sa učestalostima pDC pre doziranja (95% CI: 0,55-0,70, p-vrednost: <0,0001). Konačni fitovani model je nacrtan na Slici 55. Rezultati su otkrili da je došlo do značajnog in vivo uklanjanja cirkulišućih pDC-a kod cinomolgus majmuna na 1 sat, značajno povećanje cirkulišućih pDC-a na 6 sati i značajnog uklanjanja cirkulišućih pDC-a nakon 28 dana nakon IV injekcije, ali promene u procentu pDC tokom vremena bile su iste za sve grupe tretmana.

[0337] Pored toga, nakon završetka vremenskih tačaka IV studije, tri od ovih cinomolgus majmuna (4, 6, i 12) su primila jednu subkutanu dozu BIIB059 od 0,2 mg/kg, kako bi se procenio uticaj manje doze na učestalosti cirkulišuće pDC. Učestalost pDC (na log-skali) u svakoj vremenskoj tački je predstavljena grafičkim putem u R softveru (Slika 56). Linearni model mešovitih efekata je fitovan, upotrebom kontinuiranog vremena i vremena na 1 satu kao fiksnih faktora, i cinomolgus majmuna kao nasumičnih presretanja. Rezultati su pokazani u Tabeli 5.

Tabela 5. Procene fitovanog modela za vremenske tačke posle jedne subkutane injekcije BIIB059.

Procene za fiksne uticaje upotrebom linearnog modela mešovitih uticaja upotrebom kontinuiranog vremena i vremena na 1 sat kao fiksnih faktora, i cinomolgus majmune kao nasumična presretanja za procenat cirkulišuće pDC na log skali, pre i posle jedne subkutane injekcije BIIB0590,2 mg/kg kod cinomolgus majmuna

1

[0338] Slično prethodnim rezultatima, uočili smo značajno in vivo uklanjanje cirkulišućih pDC-a kod cinomolgus majmuna na 1 sat nakon IV injekcija (95% CI: 0,34-0,55, p-vrednost <0,0001), ali geometrijska srednja vrednost % pDC za tri cinomolgus majmuna postojano se povećavala kako se vreme povećavalo (95% CI: 1,00-1,03 struka promena po danu, pvrednost <0,0001). Fitovani model je nacrtan na Slici 57.

[0339] Kao zaključak, ovi podaci pokazuju da BIIB059 ne posreduje u kontinuiranom uklanjanju pDC-a u krvi cinomolgus majmuna kada se primenjuje u testiranim dozama. To je verovatno zbog internalizacije BDCA2.

Primer 49: Primena BIIB059 cinomolgus majmunima rezultira inhibicijom TLR9-indukovane proizvodnje IFNα u Ex Vivo testu pune krvi

[0340] Cilj ove studije bio je da se odredi da li BIIB059, kada se primenjuje cinomolgus majmunima in vivo, može izmeniti proizvodnju IFNα kao odgovor na TLR9 stimulaciju u ex vivo testu pune krvi (WBA).

[0341] Intravenski i subkutani putevi doziranja procenjeni su na njihovu sposobnost da utiču na indukciju IFNα, koja je merena upotrebom MxA biološkog testa u skladu sa eksperimentalnim planom prikazanim na Slici 58. TLR9 ligand (CpG-A) je indukovao merljive količine IFNα u kulturama pune krvi u svim vremenskim tačkama i kod svih cinomolgus majmuna, dok u kontrolnim kulturama tretiranim PBS-om nije detektovan IFNα (podaci nisu pokazani).

[0342] Za intravenski dozirane cinomolgus majmune, vrednosti IFNα nakon tretmana izračunate su kao procenti srednje vrednosti pre doze za svaku životinju. Podaci za uzimanje krvi nakon 14. dana isključeni su iz analize pošto test pune krvi nije izveden za grupu od10 mg/kg BIIB059 nakon tog vremena. Trend ka redukovanju % IFNα u odnosu na srednju vrednost pre doze uočen je nekoliko dana nakon primene leka u doznim grupama od 1 mg/kg i 10 mg/kg BIIB059 u poređenju sa grupom nosača (Slika 59).

1

[0343] Sveobuhvatnija analiza podataka obavljena je upotrebom dvofaktorske analize varijanse (ANOVA) mešovitih uticaja da bi se procenila srednja vrednost IFNα i razlike posle u odnosu na pre za svaku doznu grupu u IV studiji. Podaci tokom prva 24 sata nakon doziranja su isključeni zbog uočenog smanjenja procenata plazmatocitoidnih dendritskih ćelija periferne krvi. Podaci za uzimanje krvi nakon 31. dana nakon doze isključeni su iz analize zbog povratka BDCA2 ekspresije uočene u ovom vremenu. Za grupu koja je dozirana nosačem, geometrijska srednja vrednost IFNα bila je 362 jedinica/mL (U/mL) pre doze, i 314 U/mL posle doze; za grupu doziranu sa 1 mg/kg, geometrijska srednja vrednost bila je 399 U/mL pre doze, i 237 U/mL posle doze; za grupu od 10 mg/kg, geometrijska srednja vrednost IFNα bila je 211 U/mL pre doze, i 102 U/mL posle doze (Slika 4). Razlike posle-pre u srednjoj vrednosti log10 IFNα bile su -0,061 (p=0.511) za grupu nosača, -0,226 (p=0,016) za grupu od 1 mg/kg, i -0,317 (p=0,004) za grupu od 10 mg/kg. Nakon anti-log10 transformacije, ovi rezultati su otkrili da je grupa nosača imala 10^(-0,061)=87% (95% CI: 57%-133%) koncentracije IFNα posle doze u poređenju sa pre doze; grupa od 1 mg/kg imala je 10^(-0,226)=59% (95% CI: 39%-91%) koncentracije IFN posle doze u poređenju sa pre doze; i grupa od 10 mg/kg imala je 10^(-0,317)=48% (95% CI: 29%-79%) koncentracije IFN posle doze u poređenju sa pre doze (Slika 60).

[0344] Za kohortu subkutano-doziranih cinomolgus majmuna, upotrebljena je jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) sa nasumičnim efektima da bi se procenila srednja vrednost IFNα i razlike posle nasuprot pre za čitavu grupu. Podaci tokom prva 24 sata nakon doziranja su isključeni zbog uočenog smanjenja procenata plazmatocitoidnih dendritskih ćelija periferne krvi. Podaci za uzimanje krvi nakon 33. dana nakon doze isključeni su iz analize zbog oporavka BDCA2 ekspresije uočene u ovom vremenu. Za subkutano doziranu grupu, geometrijska srednja vrednost IFNα bila je 1243 U/mL pre doze i 812 U/mL posle doze, čime je dobijen odnos posle/pre od 65%. Razlika posle-pre u srednjoj vrednosti log10 procenjena je na -0,185 (p=0,059), koja posle anti-log10 transformacije odgovara 10^(-0,185)=65% geometrijske srednje vrednosti pre doze; 95% CI ovog efekta je 41% -102% (Slika 61).

[0345] Kako je u eksperimentu bio upotrebljen samo mali broj cinomolgus majmuna, koncentracija IFNα određena za svakog majmuna izuzetno utiče na rezultate za tu grupu. Udeo varijacije zbog razlika u životinjama u intravenskoj studiji bio je 69% ukupne varijabilnosti, a ostatak je prvenstveno posledica razlika između vremenskih tačaka unutar cinomolgus majmuna (26%), i mala količina (<6%) zbog izvora varijacija testa. Varijacija između cinomolgus majmuna je mnogo veća od varijacije između vremenskih tačaka unutar cinomolgus majmuna, što sugeriše da bi dodavanje cinomolgus majmuna ovom eksperimentu

14

za razliku od više vremenskih tačaka uzimanja krvi bolje ojačalo ovu studiju. Udeo varijacije zbog razlika u cinomolgus majmunima u subkutanoj studiji bio je 45% ukupne varijabilnosti, a ostatak je uglavnom posledica razlika između vremenskih tačaka unutar cinomolgus majmuna, i zanemarljiva količina (<2%) zbog izvora varijacija testa.

[0346] Varijabilnost uočena duž cinomolgus majmuna i unutar cinomolgus majmuna može biti posledica niza faktora, uključujući fluktuacije u fiziološkim uslovima cinomolgus majmuna, ćelijsku kompoziciju krvi, molekulsku kompoziciju ćelija, i preciznost funkcionalnog testa.

[0347] Iako je došlo do određene fluktuacije u procentima plazmocitoidnih dendritskih ćelija u svakoj životinji tokom vremena, na % pDC-a u krvi nije uticalo lečenje sa BIIB059 (videti Rsch-2013-046) i % pDC-a nije pokazao konzistentnu korelaciju sa proizvodnjom IFNα. Pored toga, uočen je brz i održiv gubitak BDCA2 sa ćelijske površine na pDC-a nakon IV i SC primene BIIB059, što sugeriše visok nivo zaposednutosti receptora (videti Rsch-2013-043). Uzimajući u obzir visok nivo varijabilnosti u odzivnosti pDC-a od cinomolgus majmuna na TLR9 stimulaciju, postojao je trend ka prigušenim IFNα odgovorima nakon intravenske i subkutane primene BIIB059, sa najvećom redukcijom u IV doznoj grupi od 10 mg/kg, nakon koje sledi SC-grupa od 0,2 mg/kg i zatim IV grupa od 1 mg/kg.

[0348] Kao zaključak, kada se BIIB059 doziralo in vivo cinomolgus majmunima, pokazalo je trend ka inhibiranoj TLR9-indukovanoj proizvodnji IFN u ex vivo WBA.

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo koje vezuje humani antigen 2 dendritske ćelije krvi (BDCA2) (SEQ ID NO: 1),

naznačeno time što antitelo sadrži varijabilni teški (VH) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24; i

pri čemu antitelo sadrži varijabilni laki (VL) domen koji je identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 23.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, i pri čemu teški lanac sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 i laki lanac sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je antitelo antitelo koje ima konstantni region teškog lanca IgG1.

4. Izolovan antigen-vezujući fragment koji vezuje humani antigen 2 dendritske ćelije krvi (BDCA2) (SEQ ID NO: 1),

naznačen time što antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni teški (VH) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 24; i

pri čemu antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni laki (VL) domen koji je identičan amino-kiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 23.

5. Antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što je antigenvezujući fragment:

(a) jednolančano antitelo;

(b) Fab fragment;

(c) F(ab')2 fragment;

(d) Fab' fragment;

(e) Fsc fragment;

(f) Fv fragment;

(g) scFv;

(h) sc(Fv)2; ili

(i) diatelo.

6. Izolovana ćelija koja proizvodi antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili koja proizvodi antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5, za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja ili autoimunske bolesti kod humanog subjekta kojem je to potrebno.

9. Antitelo ili antigen-vezujući fragment za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što:

(a) inflamatorni poremećaj odabran je iz grupe koja se sastoji od sistemskog eritemskog lupusa, diskoidnog lupusa, lupus nefritisa, lupusa kože, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, sistemske skleroze (skleroderma), psorijaze, dijabetesa tipa I, dermatomiozitisa, i polimiozitisa;

(b) inflamatorni poremećaj je umeren do težak lupus sa aktivnim zahvatanjem centralnog nervnog sistema (CNS) i/ili bubrega; ili

(c) inflamatorni poremećaj je umeren do težak lupus bez aktivnog zahvatanja centralnog nervnog sistema (CNS) i/ili bubrega.

10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što je inflamatorni poremećaj sistemski eritemski lupus (SLE).

11. In vitro postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 ili antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5, naznačen time što postupak sadrži:

(a) konstruisanje polinukleotida koji kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment; (b) introdukovanje polinukleotida u ekspresioni vektor; i

(c) ekspresiju polinukleotida u ćeliji domaćinu.

14