[go: up one dir, main page]

RS60717B1 - Varijabilni domeni imunoglobulina - Google Patents

Varijabilni domeni imunoglobulina

Info

Publication number
RS60717B1
RS60717B1 RS20201034A RSP20201034A RS60717B1 RS 60717 B1 RS60717 B1 RS 60717B1 RS 20201034 A RS20201034 A RS 20201034A RS P20201034 A RSP20201034 A RS P20201034A RS 60717 B1 RS60717 B1 RS 60717B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
seq
acid residue
residues
domain
Prior art date
Application number
RS20201034A
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Ange Buyse
Carlo Boutton
Original Assignee
Ablynx Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ablynx Nv filed Critical Ablynx Nv
Publication of RS60717B1 publication Critical patent/RS60717B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšane pojedinačne varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina.
[0002] Pronalazak se posebno odnosi na poboljšane varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina koji imaju izložen C-terminalni region ili kraj (kako je ovde opisano u nastavku; takođe vidite WO 12/175741) ili se koriste (ili su namenjeni za korišćenje) u primenama gde imaju izložen C-terminalni region ili kraj (ponovo kako je ovde opisano u nastavku). U pronalasku, prvi su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (ovde se pominju i kao „ISV“ ili „ISVD“), kao što su nanotela (uključujući VHH, humanizovana VHH i kamelizovana VHH, kao što su kamelizovana humana VH), antitela (sa jednim domenom) koja su VH domeni ili izvedena iz VH domena, i dAb koja su VH domeni ili izvedena iz VH domena. Neki poželjni ali neograničavajući primeri za ove poslednje su VH domeni koji se koriste (ili su namenjeni za korišćenje) u jednolančanim FV (ScFv) ili dijatelima.
[0003] Pronalazak se takođe odnosi na proteine, polipeptide i druge konstrukte, molekule ili hemijske entitete koji sadrže ili se suštinski sastoje od (jednog ili više) poboljšanih pojedinačnih varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina iz pronalaska, kao što su ovde opisani; na postupke za ekspresiju/proizvodnju poboljšanih pojedinačnih varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina iz pronalaska i/ili za ekspresiju/proizvodnju proteina, polipeptida i drugih konstrukata, molekula ili hemijskih entiteta koji ih sadrže; na kompozicije i proizvode (kao što su farmaceutske kompozicije i proizvodi) koji sadrže poboljšane pojedinačne varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina iz pronalaska i/ili proteine, polipeptide i druge konstrukte, molekule ili hemijske entitete koji ih sadrže; na nukleotidne sekvence i nukleinske kiseline koje kodiraju poboljšane pojedinačne varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina iz pronalaska i/ili koje kodiraju proteine ili polipeptide koji ih sadrže; i na primene (a posebno dijagnostičku primenu) poboljšanih varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina iz pronalaska i proteina, polipeptida i drugih konstrukata, molekula ili hemijskih entiteta koji ih sadrže.
[0004] Dalji aspekti, otelotvorenja, prednosti, primene i upotrebe iz pronalaska biće jasne iz daljih opisa u ovom tekstu.
[0005] U predmetnoj primeni, aminokiselinski ostaci/pozicije u varijabilnom domenu teškog lanca imunoglobulina biće navedeni uz numeraciju prema Kabatu. Radi jednostavnosti, Slika 1 daje tabelu u kojoj se navode neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti posebno pomenute, i njihova numeracija prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT. Napomena: u predmetnom opisu i zahtevima, presudna je Kabatova numeracija; ostale numeracije su date samo kao referenca).
[0006] Takođe, u pronalasku se kaže da varijabilni domen imunoglobulina ima „izložen C-terminalni kraj ili region“ kada nije povezan sa konstantnim domenom (kao što je CH1 domen) ili za njega.
[0007] Posebno, kao što je opisano u WO 12/175741, C-terminalni region (kao što se ovaj termin takođe koristi ovde) deo je pretpostavljenog epitopa na ISV koji takođe uključuje, između drugih ostataka, aminokiselinski ostatak na poziciji 14 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u sekvenci aminokiselina, kao što su pozicije 11, 13 i 15), i takođe može da sadrži aminokiselinski ostatak na poziciji 83 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u sekvenci aminokiselina, kao što su pozicije 82, 82a, 82b i 84) i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 108 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u sekvenci aminokiselina, kao što su pozicije 107. Kao u WO 12/17574, ovaj pretpostavljeni epitop se ovde takođe zajednički pominje kao „C-terminalni region“, gde se podrazumeva da ovaj C-terminalni region sadrži barem C-terminalnu sekvencu VTVSS (tj. svaku od pozicija 109, 110, 111, 112 i 113) i aminokiselinski ostatak na poziciji 14, i takođe može da sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 83 i 108, i možda i aminokiselinske ostatke na pozicijama 13, 15, 82b, 83, 84 i 107.
[0008] Kao rezultat istraživanja jednolančanih FV ili „ScFv“ (koji su konstrukti koji sadrže varijabilne domene imunoglobulina koji, slično kao ISVD, nisu povezani sa konstantnim domenima), u struci je opisano da C-terminus varijabilnog domena imunoglobulina sadrži hidrofobnu zakrpu koja je na klasičnom antitelu kompletne veličine sakrivena u međupovršini između varijabilnog domena i konstantnog domena, ali postaje izložena rastvaraču kada varijabilni domen nije povezan sa konstantnim domenom (vidite, na primer, Nieba i sar., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997) i Harmsen i sar., Molecular Immunology (2000), 579-590).
[0009] Takođe je dobro poznato da epitopi koji su obično sakriveni u strukturi proteina (takođe se pominju kao „neo-epitopi“ ili „kriptični epitopi“) mogu da aktiviraju imunski sistem kada budu izloženi rastvaraču, na primer, usled degradacije, pogrešnog savijanja ili agregacije uključenog proteina. Na primer, u slučaju sakrivenih hidrofobnih delova biomolekula (takozvani „hipoi“), predloženo je da oni formiraju deo opšteg molekulskog obrasca povezanog sa oštećenjem koji dovodi do urođenog imunskog odgovora kada hipoi budu izloženi rastvaraču (vidite, na primer, Seong i Matzinger, Nature Reviews 2004, 469), i u struci su opisani razni primeri prethodno sakrivenih hidrofobnih zakrpa koje aktiviraju imunski odgovor (vidite, na primer, David i sar., JBC, 2001, 6370-6377; Matsuura i sar., International Immunology, 2000, 1183-1192; Rasheed i sar., Life Sciences 79 (2000), 2320-2328). Uopštenije, u struci je takođe poznato da su hidrofobne aminokiseline sklone tome da budu deo B-ćelijskih epitopa (vidite, na primer, WO 11/07586, strana 10; i Kolaskar, FEBS 276, 172-174 (1990)). Slično tome, opisano je da hidrofobna zakrpa na C-kraju varijabilnog domena teškog lanca (kao što su opisali Nieba i sar. i Harmsen i sar., supra) može da formira B-ćelijske epitope koji mogu da stvore antitela (u nastajanju i/ili postojeća) na lek (WO 11/07586) i/ili da stupe u interakciju sa njima. Iz tog razloga, predloženo je da se načine mutacije na nekim od aminokiselinskih ostataka koji sačinjavaju deo C-kraja varijabilnih domena da bi se smanjila hidrofobnost i/ili uklonili B-ćelijski epitopi. Na primer, Nieba i sar. predlažu da se mutiraju pozicije 11, 14, 41, 84, 87 i/ili 89 VH regiona (numeracija prema Kabatu), dok se u WO 11/07586 predlaže da se mutiraju pozicije 99, 101 i/ili 148 (AHo numeracija) VL domena, ili pozicije 12, 97, 98, 99, 103 i/ili 144 VH domena (ponovo AHo numeracija - te pozicije odgovaraju pozicijama 11, 83, 84, 85, 89 i 103 prema Kabatu). Slično tome, Harmsen i sar. predlažu da se mutiraju pozicije 12 i 101 (IMGT numeracija; to su pozicije 11 i 89 prema Kabatu) da bi se kompenzovalo odsustvo CH1 domena; i oni takođe identifikuju specifičnu subfamiliju VHH (nazvanu „VHH4“) koja sadrži aminokiseline koje su pogodni kandidati za supstitucije na tim pozicijama.
[0010] Takođe, u struci je opisano (vidite, na primer, WO 12/175741 i reference navedene u sledećim odeljcima) da biološki uzorci dobijeni od humanih ispitanika mogu da sadrže (već postojeće) proteine ili faktore koji mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region ili kraj varijabilnog domena imunoglobulina (na primer, C-terminalni region ili kraj ISVD ili VH ili VL domena u ScFv ili dijatelu).
[0011] Na primer, u WO 2013/024059 se kaže da „u serumu nekih zdravih naivnih humanih ispitanika, prisutna su postojeća anti-VH autoantitela koja mogu da vežu i antitela sa VH domenom i VHH molekule, kao i anti-VL (npr. V kapa (VK)) autoantitela koja mogu da vežu VL molekule“, i da „već postojeća ADA koja vezuju dAb su slična anti-šarka antitelima po tome što vezuju fragmente IgG, ali ne te iste sekvence nađene in situ ili netaknuti IgG“.
[0012] Holland i sar., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203 opisuju da krv oko polovine normalnih zdravih ljudi sadrži različite nivoe nove klase anti-IgG autoantitela koja mogu da se vežu za sekvence okvira kompletno humanih antitela sa VHdomenom (koja Holland i sar. takođe zovu „HAVH auto-antitela“). Holland i sar. dalje pominju da su ova autoantitela verovatno većinom IgG izotipa, pokazuju relativno veliki afinitet (oko 10<-10>M) prema sekvencama VH, i slobodni C-kraj je verovatno važan za vezivanje ovih HAVH autoantitela za VHdomene.
[0013] Problemi vezani za već postojeća antitela koja su bioterapeutski reaktivna na molekule bioterapeutika i njihov regulišući uticaj takođe su generalno razmatrani od strane Xue i sar., AAPS J.2013; 15(3):852-5.
[0014] Prethodno pomenuta postojeća saznanja u struci takođe su usredsređena na načine na koje sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina može da se modifikuje tako da se spreči ili smanji vezivanje takvih već postojećih antitela/faktora za varijabilne domene. U tom pogledu, WO 2011/07586 predlaže da se napravi jedna ili više mutacija u aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena na nekim specifičnim pozicijama domena (a te površine su površinski izložene). WO 12/175741 opisuje da vezivanje takvih već postojećih antitela/faktora može biti smanjeno dodavanjem nekoliko aminokiselinskih ostataka (i samo jednog ostatka alanina) na C-terminalni kraj VH-domena i/ili uvođenjem jedne ili više specifičnih supstitucija ili delecija u C-terminalnom regionu varijabilnog domena, koji je opisan u WO 12/175741 da sadrži barem C-terminalnu aminokiselinsku sekvencu VTVSS i aminokiselinski ostatak na poziciji 14 (a za tu poziciju WO 12/175741 kaže da prisustvo ostatka alanina obezbeđuje smanjeno vezivanje već postojećih antitela u poređenju sa prisustvom „humanog“ aminokiselinskog ostatka prolina), a možda i aminokiselinske ostatke na pozicijama 108 i 83 i aminokiselinske ostatke blizu pomenutih pozicija (WO 2013/024059 obezbeđuje suštinski istu pouku kao WO 12/175741).
[0015] Na primer, u istraživanju koje je sproveo podnosilac zahteva/zastupnik i koje je dovelo do podnošenja WO 12/175741, nađeno je da dodavanje jednog ostatka alanina u C-terminalni region ili kraj izloženog VH domena obično sprečava/uklanja (suštinski sve) vezivanje već postojećih antitela/faktora prisutnih u uzorcima dobijenim od većine humanih ispitanika (vidite, na primer, stranu 62, redove 20-25, i stranu 57, red 30 do strane 58, red 3, WO 12/175741); i ti nalazi su potvrđeni dodatnim rezultatima koje je dobio podnosilac zahteva/zastupnik nakon podnošenja WO 12/175741 kada je supstitucija C-terminalnog alanina WO 12/175741 primenjena na druga nanotela (podaci nisu prikazani).
[0016] Takođe, u WO 12/175741, kao i u WO 12/175400 od strane podnosioca zahteva/zastupnika, C-terminalne ekstenzije opisane u WO 12/175741 su primenjene na neka nanotela koja vezuju albumin iz seruma (vidite, na primer, WO 12/175741: SEQ ID NO: 37, 51-53 i 55-64 i konstrukte prikazane u SEQ ID NO: 41, 43 i 44; i WO 12/175400: SEQ ID NO: 6 do 11).
[0017] Slika 9 u WO 12/175741 takođe opisuje dve albumin-vezujuće sekvence koje se koriste kao referentne sekvence u Eksperimentalnom delu u nastavku. To su SEQ ID NO:37 sa Slike 9 u WO 12/175741 (koja se ovde takođe pominje kao „referenca B“; njena sekvenca je ovde data kao SEQ ID NO: 45) i „SEQ ID NO:37 bez dodatih C-terminalnih aminokiselinskih ostataka“ sa Slike 9 u WO 12/175741 (koja se ovde takođe pominje kao „referenca A“; njena sekvenca je ovde data kao SEQ ID NO:44). I referenca A i referenca B su izvedene iz sekvence humanizovanog anti-albuminskog nanotela „Alb-8“ koje je dato kao SEQ ID NO:62 u WO 06/122787 (i koje se ovde takođe pominje kao „Alb-11“); ali, u poređenju sa sekvencom Alb-11, referenca A sadrži N-terminalnu His oznaku; a referenca B sadrži N-terminalnu His oznaku i C-terminalni ostatak alanina. Referenca A, referenca B i Alb-8/Alb-11 sadrže CDR-e date u SEQ ID NO: 41 do 43, tim redosledom.
[0018] Drugi primeri nanotela i drugih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji imaju C-terminalne ekstenzije i/ili mutacije u C-terminalnom regionu mogu, na primer, da se nađu u sledećoj stručnoj literaturi: WO 06/129843 (vidite, na primer, SEQ ID NO: 4, 6, 8 i 10); WO 03/035695 (vidite, na primer, neke od sekvenci navedenih na strani 61-64); Vu i sar., Molecular Immunology, 1121-1131, 1997 (vidite, na primer, neke od sekvenci navedenih na Slici 2); WO 11/003622 (vidite, na primer, sekvence date kao SEQ ID NO: 10 do 27); WO09/058383 (vidite, na primer, sekvencu TAR2h-10-27 pomenutu na strani 51); WO 10/042815 (vidite, na primer, sekvence SEQ ID NO: 15, 17, 27 i 30); i WO 04/044204 (vidite, na primer, sekvence SEQ ID NO: 31, 35, 37, 47 i 49).
[0019] Neke od ovde navedenih referenci takođe daju primere sekvenci ISVD u kojima je poslednja C-terminalna aminokiselina ISVD aminokiselina koja nije serin (S), na primer, zato što je serin na poziciji 113 zamenjen drugom aminokiselinom i/ili zato što je serin na poziciji 113 izbačen i dodata je C-terminalna aminokiselina (u praksi, krajnji rezultat u pogledu sekvence C-terminalne aminokiseline će biti isti).
[0020] Neke od ovde navedenih referenci takođe daju primere nanotela i drugih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina u kojima je na poziciji 112 aminokiselina koja nije serin. Na primer, WO 12/175741 opisuje nanotela u kojima je na poziciji 112 glicin (G); Vu i sar. (supra) opisuju nanotela u kojima je na poziciji 112 alanin (A) ili izoleucin (I); WO 13/024059 daje primer supstitucije S112A; a dolenavedeni WO 08/020079 daje primer supstitucije S112F i takođe uopšteno tvrdi da u njemu opisana nanotela mogu da sadrže ograničen broj aminokiselinskih ostataka dodatih na karboksi-terminalnom kraju aminokiselinske sekvence nanotela.
[0021] U istraživanju koje je dovelo do predmetnog pronalaska, nakon utvrđivanja da dodavanje C-terminalne ekstenzije (koja može biti jednostavna, kao jedan C-terminalni ostatak alanina, vidite opet WO 12/175741, Primer 3) C-terminalnom regionu ili kraju nanotela suštinski sprečava/uklanja vezivanje već postojećih antitela/faktora u većini uzoraka humanih ispitanika/pacijenata, ispitano je da li uzorci dobijeni od humanih ispitanika (zdravih dobrovoljaca i/ili ispitanika koji imaju bolest ili poremećaj) možda sadrže (druga) već postojeća antitela ili faktore koji mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region nanotela (ili drugi VH domen) čak i kada postoji C-terminalna ekstenzija. Pri tome su predmetni pronalazači pronašli da, mada suštinski nije nađeno vezivanje takvih već postojećih antitela za C-terminalno produženi VH domen u krvi ili serumu zdravih dobrovoljaca ili u krvi ili serumu dobijenim od humanih pacijenata koji boluju od jedne od više različitih bolesti (uključujući neke inflamatorne bolesti ili autoimunske poremećaje - podaci nisu prikazani), neki uzorci krvi ili seruma koji su dobijeni od nekih (ali ne svih) humanih ispitanika koji boluju od nekih teških (auto)imunskih poremećaja (kao što je sistemski eritemski lupus; ovde se takođe koristi skraćenica „SLE“) izgleda sadrže neka već postojeća antitela/faktore koji mogu da se vežu za nanotela čak i kada pomenuta nanotela sadrže C-terminalnu ekstenziju.
[0022] Tako je, generalno, svrha predmetnog pronalaska da obezbedi poboljšane varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina (i konkretno poboljšane ISVD sa teškim lancem, i konkretnije poboljšana nanotela) koji, kada imaju izloženi C-terminalni region ili kraj, manje su skloni da se vežu od strane već postojećih antitela/faktora, kao što su oni nađeni u uzorcima krvi ili seruma humanih ispitanika.
[0023] Konkretno, svrha predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina koji, kada imaju izloženi C-terminalni region ili kraj, manje su skloni da se vežu od strane već postojećih antitela/faktora (ponovo, kao što su oni nađeni u uzorcima krvi ili seruma humanih ispitanika) koji još uvek mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region ili kraj varijabilnog domena teškog lanca kada pomenuti domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (na primer, kao što je opisano u WO 12/175741, WO 13/024059 i daljem ovde navedenom stanju tehnike).
[0024] Kao što je ovde pomenuto, predmetni pronalazači su utvrdili da su takva već postojeća antitela koja mogu da se vežu za varijabilni domen teškog lanca sa C-terminalnom ekstenzijom prisutna u uzorcima krvi ili seruma dobijenim od humanih ispitanika koji boluju od nekih (auto)imunskih bolesti ili poremećaja koji ozbiljno utiču na imunski sistem/aktiviraju ga (kao što je SLE).
[0025] Tako, konkretnije, svrha predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane ISVD sa teškim lancem (i konkretnije poboljšana nanotela) koji, kada imaju izloženi C-terminalni region ili kraj, manje su skloni da se vežu od strane već postojećih antitela/faktora, kao što su oni nađeni u uzorcima krvi ili seruma dobijenih od humanih ispitanika koji boluju od nekih (auto)imunskih bolesti ili poremećaja koji ozbiljno utiču na imunski sistem/aktiviraju ga (kao što je SLE).
[0026] Još konkretnije, svrha predmetnog pronalaska je da obezbedi poboljšane ISVD sa teškim lancem (i konkretnije poboljšana nanotela) koji, kada imaju izloženi C-terminalni region ili kraj, manje su skloni da se vežu od strane tih već postojećih antitela/faktora nađenih u uzorcima krvi ili seruma dobijenih od humanih ispitanika koji boluju od nekih (auto)imunskih bolesti ili poremećaja i koji još uvek mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region ili kraj VH domena kada VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju.
[0027] Sada je nađeno da vezivanje već postojećih antitela/faktora za varijabilni domen teškog lanca sa izloženim C-terminalnim krajem može (dodatno) biti smanjeno mutacijom serina na poziciji 112 (Kabatova numeracija) u lizin (K) ili glutamin (Q). Konkretno, nađeno je da takva S112K ili S112Q mutacija može (dodatno) da smanji ili suštinski da spreči/ukloni vezivanje već postojećih antitela/faktora koji mogu da se vežu za varijabilni domen teškog lanca koji sadrži C-terminalnu ekstenziju (ali ne mutaciju S112K ili S112Q), kao što su ona već postojeća antitela/faktori nađeni u uzorcima krvi ili seruma humanih ispitanika koji boluju od teških autoimunskih poremećaja, kao što je SLE.
[0028] Takođe, nađeno je da uvođenje ovde objavljenih specifičnih mutacija (konkretno sledećih mutacija L11V u kombinaciji sa V89L, i opciono dalje u kombinaciji sa T110K) može da poboljša, ili da doprinese (daljem) poboljšanju rastvorljivosti pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, kao što su ISVD koji su ovde generalno i specifično objavljeni (podaci nisu prikazani).
[0029] Tako, u prvom aspektu, otkriće se odnosi na varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 112 (Kabatova numeracija), ostatak lizina (K) ili ostatak glutamina (Q). Varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, kako je definisan putem zahteva, takođe se ovde naziva „VH domen iz pronalaska“. VH domen iz pronalaska je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, i ovde će se takođe pominjati kao „ISVD iz pronalaska“. Slično tome, kada je VH domen iz pronalaska nanotelo (što je čak poželjnije), ovde će se takođe pominjati kao „nanotelo iz pronalaska“.
[0030] Generalno, VH domeni iz pronalaska imaju izloženi C-terminalni kraj ili region, i/ili su prisutni u proteinu, polipeptidu, jedinjenju, entitetu ili konstruktu u kome imaju izloženi C-terminalni kraj ili region, i/ili su namenjeni za upotrebu u kojoj imaju izloženi C-terminalni region (na primer, za upotrebu u proteinu, polipeptidu, jedinjenju, entitetu ili konstruktu u kome su namenjeni da formiraju C-terminalni kraj ili region).
[0031] U pronalasku, VH domen iz pronalaska je pojedinačni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, što znači varijabilni domen teškog lanca koji može da formira funkcionalno antigen vezujuće mesto bez interakcije sa VL domenom. Na primer, VH domen iz pronalaska može biti nanotelo (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizovane VH, kao što su kamelizovani humani VH), antitelo sa (pojedinačnim) domenom koji je VH domen ili koji je dobijen od VH domena, ili dAb koje je VH domen ili koje je izvedeno iz VH domena. VH domen iz pronalaska je poželjno nanotelo (npr., VHH domen, humanizovani VHH domen ili kamelizovani VH domen, kao što je kamelizovani humani VH domen).
[0032] Prema drugom aspektu otkrića, VH domen iz otkrića može biti varijabilni domen teškog lanca kome je, u proteinu, polipeptidu, proteinu ili konstruktu u kome je prisutan, potrebna interakcija sa VL domenom da bi formirao antigen vezujuće mesto, i koji ima ili formira izloženi C-terminalni kraj ili region. Na primer, VH domen prema ovom aspektu otkrića može biti VH domen koji je prisutan u ScFv i ili dijatelu i/ili se u njemu koristi.
[0033] Prema specifičnijem aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska ima C-terminalnu sekvencu (pozicije 109 do 113 prema Kabatu) koja je VTVKS (SEQ ID NO:1) ili VTVQS (SEQ ID NO:2), ili sekvencu koja se razlikuje po jednoj aminokiselini (npr. na poziciji 109, 110, 111 ili 113) bilo sa sekvencom VTVKS i/ili VTVQS, i koja i dalje ima bilo lizin (K) ili glutamin (Q) na poziciji 112.
[0034] Takođe, kako je ovde dalje opisano, u jednom posebno poželjnom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska takođe sadrži C-terminalnu ekstenziju (npr. kako je opisano u WO 12/175741 i/ili u WO 13/024059) na svom C-terminalnom kraju (tj. povezan je sa ostatkom serina na kraju VTVKS-, VTVQS- ili sličnog motiva), posebno C-terminalnu ekstenziju koja je kao što je ovde dalje definisano. Međutim, kao što je ovde takođe dalje opisano, takođe je moguće da VTVKS-, VTVQS- ili sličan motiv formira C-terminalni kraj VH domena (mada je to obično manje poželjno) ili da je VH domen iz pronalaska vezan na svom C-terminalnom kraju (opciono putem pogodnog linkera) za drugu aminokiselinsku sekvencu, funkcionalni ostatak, domen ili vezujuću jedinicu. Na primer, VH domen može biti vezan na svom C-terminalnom kraju za drugi ISVD, opciono preko linkera (i pomenuti drugi ISVD onda može biti VH domen iz pronalaska).
1
[0035] Sve u svemu, kao što je dobro poznato za varijabilni domen imunoglobulina generalno, VH domeni iz pronalaska će sadržati 4 regiona okvira (FW1, FW2, FW3 i FW4) i 3 CDR-a (CDR1, CDR2 i CDR3). Kao kod varijabilnih domena imunoglobulina generalno, sekvenca CDR-a će zavisiti od antigena/mete(a) za koje su uzgajani VH domeni iz pronalaska i/ili su namenjeni da se vežu. Regioni okvira generalno mogu biti bilo koji pogodni regioni okvira za VH domene (iako će pozicija 112 i/ili pozicija 89 biti kao što je ovde dalje opisano). Kako je VH domen iz pronalaska ISVD, VH domen će imati sekvence okvira koje su pogodne za ISVD (opciono povezan sa jednim ili više CDR-a). Na primer, ako je VH domen iz pronalaska nanotelo, regioni okvira će generalno sadržati pogodan broj obeleženih ostataka VHH (za koje je, na primer, data referenca na WO 08/020079 i neke druge patentne prijave podnosioca zahteva/zastupnika koje su ovde navedene).
[0036] Tako, na primer, ako je VH domen iz pronalaska nanotelo, pomenuta nanotela iz pronalaska mogu da sadrže jedan ili više „obeleženih ostataka“ koji su karakteristični za VHH/nanotela (npr. na pozicijama 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 i/ili 108; vidite, na primer, Tabele A-3 i A-5 do A-8 iz WO 08/020079); jedan ili više drugih aminokiselinskih ostataka koji mogu biti prisutni u VHH/nanotelima (kao što je jedna ili više humanizujućih supstitucija koje su suštinski poznate za VHH i nanotela; data je, na primer, referenca na pouku iz WO 08/020079; ponovo vidite prethodno pomenute Tabele A-3 i A-5 do A-8) i/ili jedan ili više drugih pogodnih aminokiselinskih ostataka ili supstitucija za VHH/nanotela; ili bilo koju kombinaciju takvih aminokiselinskih ostataka/supstitucija.
[0037] Nanotela iz otkrića kod kojih je na poziciji 112 K ili Q (tj. sa C-terminalnom ekstenzijom ili bez nje) poželjno sadrže aminokiselinu na poziciji 11 koja je izabrana od L (najčešći aminokiselinski ostatak koji se sreće u VHH), E, K, M, S, V,W ili Y; poželjnije od L, E, K, V ili Y, i čak još poželjnije od L, K ili V (gde je V najpoželjniji). Na primer i bez ograničenja, u poređenju sa ostatkom leucina koji se najčešće sreće u VHH, ona mogu da sadrže mutaciju L11K ili L11V. Ona takođe, bez ograničenja, mogu na primer da sadrže mutaciju Q108L (poznatu humanizujuću supstituciju za VHH/nanotela). Drugi aminokiselinski ostaci koji mogu biti prisutni (opet bez ograničenja i na primer, ostali aminokiselinski ostaci koji se u prirodi javljaju na ovoj poziciji u humanim VH ili VHH takođe mogu biti prisutni na tim pozicijama) su, na primer, jedan ili više alanina (A) na poziciji 14 (to je aminokiselinski ostatak koji se veoma često javlja na ovoj poziciji u prirodnim VHH), prolin na poziciji 14 (koji je najčešća aminokiselina na ovoj poziciji u humanim VH domenima), kao i mutacije koje su predložili Harmsen i sar. (konkretno, one koje su predložili Harmsen i sar. na osnovu sekvence VHH4 klase VHH, kao što je V89M ili V89T) i/ili (druge) mutacije na pozicijama koje predlaže Nieba (na primer, na jednoj ili više pozicija 11, 87 i/ili 89, vidite Nieba, strana 437, desna kolona). Druga pogodna mutacija je, na primer, T110K ili T110Q. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) Takođe, pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A)
[0038] Prema specifičnijem aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska (koji je kao što je ovde dalje opisano) ima okvir 4 (sekvenca FW4) koji je:
a) jedna od sekvenci FW4 SEQ ID NO: 3 do 20 pomenutih u Tabeli 1 ispod
Tabela 1: Sekvence FW4
ili:
b) sekvenca koja ima najviše od tri, poželjno najviše dve različite aminokiseline sa najmanje jednom od sekvenci FW4 SEQ ID NO 3 do 20 u kojima (i) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije je K ili Q; i u kojima (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 Kabatove numeracije je poželjno W ili R, (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 104 Kabatove numeracije je poželjno G; (iv) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 106 Kabatove numeracije je poželjno G; (v) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 107 Kabatove numeracije je poželjno T; (vi) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 108 Kabatove numeracije je poželjno Q ili L (i u humanizovanim nanotelima poželjno L); (vii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 109 Kabatove numeracije je poželjno V; (viii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 110 Kabatove numeracije je poželjno T (ili alternativno može biti K ili Q); (ix) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 111 Kabatove numeracije je poželjno V. Tabela 2 u nastavku prikazuje neke neograničavajuće primere aminokiselinskih ostataka koji mogu biti prisutni na različitim pozicijama (numerisani prema Kabatu) takvih sekvenci FW4.
Tabela 2: Primeri aminokiselinskih ostataka koji mogu biti prisutni u sekvencama FW4 VH domena iz pronalaska.
1
[0039] Poželjno, VH domen iz pronalaska ima okvir 4 (sekvenca FW4) koji je:
a) WGQGTQVTVKS (SEQ ID NO:3) ili WGQGTQVTVQS (SEQ ID NO:12); ili
b) sekvenca koja ima najviše tri, poželjno najviše dve različite aminokiseline (kao što je samo jedna različita aminokiselina) sa SEQ ID NO:3 i/ili SEQ ID NO: 12 u kojima (i) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije je K ili Q; i u kojima (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 Kabatove numeracije je poželjno W ili R, (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 104 Kabatove numeracije je poželjno G; (iv) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 106 Kabatove numeracije je poželjno G; (v) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 107 Kabatove numeracije je poželjno T; (vi) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 108 Kabatove numeracije je poželjno Q ili L (i u humanizovanim nanotelima poželjno L); (vii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 109 Kabatove numeracije je poželjno V; (viii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 110 Kabatove numeracije je poželjno T (ili alternativno može biti K ili Q); (ix) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 111 Kabatove numeracije je poželjno V. Ponovo, Tabela 2 u nastavku prikazuje neke neograničavajuće primere aminokiselinskih ostataka koji mogu biti prisutni na različitim pozicijama (numerisani prema Kabatu) takvih sekvenci FW4.
[0040] Kao što je ovde dalje opisano, prema poželjnom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska koji sadrži sekvencu FW4 kao što je opisana iznad takođe poželjno sadrži Cterminalnu ekstenziju (kao što je ovde dalje opisana). Međutim, kao što je ovde takođe dalje opisano, takođe je moguće da sekvenca FW4 formira C-terminalni kraj VH domena (mada je to obično manje poželjno) ili da je VH domen iz pronalaska vezan na svom C-terminalnom kraju (opciono putem pogodnog linkera) za drugu aminokiselinsku sekvencu, funkcionalni ostatak, domen ili vezujuću jedinicu. Na primer, VH domen može biti vezan na svom C-terminalnom kraju za drugi ISVD, opciono preko linkera (i pomenuti drugi ISVD onda može biti VH domen iz pronalaska).
[0041] Kao što je ovde naznačeno, prema poželjnom ali neograničavajućem aspektu pronalaska, VH domeni iz pronalaska sadrže C-terminalnu ekstenziju koja je kao što je opisana u WO 12/175741 i/ili u WO 13/024059, i posebno kao što je opisana u WO 12/175741
[0042] Tako, prema ovom aspektu, VH domen iz pronalaska je varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) u kome: (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 (Kabatova numeracija) nije ostatak serina, i poželjno je ostatak lizina (K) ili ostatak glutamina (Q); i (ii) na svom C-terminalnom kraju (tj. vezan za aminokiselinski ostatak na poziciji koja je, ili koja odgovara poziciji 113 prema Kabatovoj numeraciji) je vezan za dodatnu aminokiselinsku sekvencu (tj. „C-terminalnu ekstenziju“) koja sadrži od 1 do 5 (kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, i poželjno 1, 2 ili 3, i najpoželjnije samo 1 ili 2, kao što je samo 1) aminokiselinskih ostataka koji su svaki nezavisno izabrani od pogodnih aminokiselinskih ostataka, i poželjno koji je svaki nezavisno izabran od prirodnih aminokiselina, i poželjnije svaki nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (međutim, kao što se vidi iz podataka prikazanih u WO 12/17574, drugi aminokiselinski ostaci, kao što je serin, prolin, treonin i/ili lizin se takođe mogu koristiti kao deo C-terminalne ekstenzije).
[0043] Prema jednom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska poželjno ima C-terminalnu sekvencu koja je VTVKS(X)n(SEQ ID NO:21) ili VTVQS(X)n(SEQ ID NO:22) (ili koja je aminokiselinska sekvenca koja, na pozicijama motiva VTVKS ili motiva VTVQS, ima jednu različitu aminokiselinu bilo sa sekvencom VTVKS i/ili VTVQS i koja i dalje ima lizin (K) ili glutamin (K) na poziciji 112), u kojoj (i) aminokiselinski ostaci motiva VTVKS ili VTVQS (ili motiva nalik na VTVKS ili VTVQS) odgovaraju pozicijama 109 do 113 VH domena prema Kabatovoj numeraciji; (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno
1
izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
[0044] Konkretnije, prema ovom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska može da ima, kao svoju sekvencu FW4, jednu od sekvenci FW4 SEQ ID NO 3 do 20 (ili amino sekvencu koja ima najviše tri, poželjno najviše dve različite aminokiseline sa najmanje jednom od sekvenci FW4 SEQ ID NO 3 do 20, u kojima aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije je K ili Q), u kojoj je pomenuta sekvenca FW4 povezana, na svom C-terminalnom kraju, sa C-terminalnom ekstenzijom (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
[0045] Prema tome, u ovom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska može da ima, na svom C-terminalnom kraju:
a) jednu od aminokiselinskih sekvenci datih kao SEQ ID NO: 23 do 40 u Tabeli 3;
Tabela 3: Sekvenca FW4 sa C-terminalnom ekstenzijom
1
u kojoj (i) aminokiselinski ostaci sekvenci FW4 koji prethode C-terminalnoj ekstenziji (X)nu SEQ ID NO: 23 do 40 odgovaraju aminokiselinskim pozicijama FW4 VH domena (tj. pozicijama 103 do 113 prema Kabatovoj numeraciji); (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I); ili
b) aminokiselinsku sekvencu koja ima najviše tri, poželjno najviše dve različite aminokiseline sa najmanje jednom od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO 23 do 40 (u kojima su pomenute različite aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju aminokiselinskim pozicijama FW4 VH domena, tj. pozicijama 103 do 113 prema Kabatovoj numeraciji, zanemarujući bilo koje različite aminokiseline u C-terminalnoi ekstenziji (X)n), u kojoj: (i) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije je K ili Q; (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I). Ponovo, nadalje prema karakteristikama (i) do (iii) kako je pomenuto u prethodnoj rečenici, u takvoj aminokiselinskoj sekvenci: (iv) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 Kabatove numeracije je poželjno W ili R, (v) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 104 Kabatove numeracije je poželjno G; (vi) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 106 Kabatove numeracije je poželjno G; (v) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 107 Kabatove numeracije je poželjno T; (viii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 108 Kabatove numeracije je poželjno Q ili L (i u humanizovanim nanotelima poželjno L); (ix) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 109 Kabatove numeracije je poželjno V; (x) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 110 Kabatove numeracije je poželjno T (ili alternativno može biti K ili Q); (xi) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 111 Kabatove
1
numeracije je poželjno V; i ponovo se upućuje na Tabelu 2 za moguće aminokiselinske ostatke koji mogu biti prisutni na svakoj poziciji.
[0046] Poželjno, prema ovom aspektu pronalaska, VH domen iz pronalaska ima, na svom C-terminalnom kraju:
(a) aminokiselinsku sekvencu koja je WGQGTQVTVKS(X)n(SEQ ID NO:23) ili WGQGTQVTVQS(X)n(SEQ ID NO:32), u kojoj (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I); ili
b) aminokiselinsku sekvencu koja ima najviše tri, poželjno najviše dve različite aminokiseline sa najmanje jednom od aminokiselinskih sekvenci WGQGTQVTVKS(X)n(SEQ ID NO:23) ili WGQGTQVTVQS(X)n(SEQ ID NO:32) (u kojima su pomenute različite aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju aminokiselinskim pozicijama FW4 VH domena, tj. pozicijama 103 do 113 prema Kabatovoj numeraciji, zanemarujući bilo koje različite aminokiseline u C-terminalnoi ekstenziji (X)n), u kojoj: (i) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije je K ili Q; (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I). Ponovo, na takve aminokiselinske sekvence se poželjno takođe primenjuju karakteristike (vi) do (xi) kao što je opisano u prethodnim odeljcima.
[0047] Takođe, kao što je ovde pomenuto, VH domeni iz pronalaska kao što su definisani zahtevima takođe mogu da sadrže druge aminokiselinske ostatke ili supstitucije koji su suštinski poznati u oblasti VH domena i konkretno za ISVD (i konkretnije za nanotela) na relevantnim pozicijama. Neki neograničavajući primeri mogu biti kao što je ovde pomenuto i, na primer, uključuju jedan ili više od „obeleženih ostataka“ koji su karakteristika VHH/nanotela (uključujući, na primer, leucin (L) na poziciji 11), druge aminokiselinske ostatke koji se prirodno nalaze u VHH (kao što je alanin (A) na poziciji 14), humanizujuće suštinski poznate supstitucije za VHH/nanotela (kao što je Q108L i A14P), jednu ili više mutacija koje predlaže Harmsen (kao što je V89M ili V89T) i/ili na pozicijama koje predlaže Nieba (npr.11, 87 ili 89); ili bilo koju njihovu pogodnu kombinaciju; i/ili, na primer, mutaciju T110K, T110Q ili V89L.
1
[0048] Kada VH domen iz pronalaska sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, prema nekim poželjnim ali neograničavajućim primerima takvih ekstenzija, X i n mogu biti sledeći:
(a) n = 1 i X = Ala;
(b) n = 2 i svaki X = Ala;
(c) n = 3 i svaki X = Ala;
(d) n = 2 i najmanje jedan X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(e) n = 3 i najmanje jedan X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(f) n = 3 i najmanje dva X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(g) n = 1 i X = Gly;
(h) n = 2 i svaki X = Gly;
(i) n = 3 i svaki X = Gly;
(j) n = 2 i najmanje jedan X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(k) n = 3 i najmanje jedan X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(l) n = 3 i najmanje dva X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
(m) n = 2 i svaki X = Ala ili Gly;
(n) n = 3 i svaki X = Ala ili Gly;
(o) n = 3 i najmanje jedan X = Ala ili Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile); ili
1
(p) n = 3 i najmanje dva X = Ala ili Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);
gde su aspekti (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) posebno poželjni, aspekti u kojima je n =1 ili 2 su poželjni i aspekti u kojima je n =1 su posebno poželjni.
[0049] Treba takođe napomenuti da, poželjno, nijedna C-terminalna ekstenzija prisutna u VH domenu iz pronalaska ne sadrži (slobodan) ostatak cisteina (osim ako pomenuti ostatak cisteina nije upotrebljen ili nameravan za dalju funkcionalizaciju, na primer, za pegilovanje).
[0050] Takođe, poželjnosti navedene na stranama 35 do 41 WO 12/175741 za C-terminalne ekstenzije upotrebljenu prema WO 12/175741 (koje su takođe poželjne C-terminalne ekstenzije koje se koriste u VH domenu prema predmetnom pronalasku) takođe se primenjuju na C-terminalne ekstenzije koje se koriste u VH domenima pronalazaka, i te poželjnosti prema WO 12/175741.
[0051] Poželjno, kada VH domen iz pronalaska sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, n = 1, 2 ili 3, i svaki X je Ala ili Gly. Poželjnije, svaki X je Ala, i n = 1 ili 2, i poželjno 1.
[0052] Kada VH domeni iz pronalaska sadrže C-terminalnu ekstenziju, oni će obično biti prisutni na C-terminalnom kraju (i često ga formiraju) proteina, polipeptida, jedinjenja, konstrukta ili drugog hemijskog entiteta u kome je prisutan. Ponovo, takav protein, polipeptid, jedinjenje, konstrukt ili drugi hemijski entitet može da sadrži jedan ili više drugih VH domena iz otkrića (tj. ne na C-terminalnom kraju); u takvom slučaju, pomenuti drugi VH domeni iz otkrića mogu da sadrže lizin (K) ili glutamin (Q) na poziciji 112 (i da budu kao što je ovde opisano), ali neće sadržati C-terminalnu ekstenziju (umesto toga, mogu biti povezani (opciono preko jednog ili više pogodnih linkera) na svom C-terminusu sa jednom ili više drugih aminokiselinskih sekvenci, funkcionalnih ostataka, vezujućih domena ili vezujućih jedinica prisutnih u proteinu, polipeptidu, jedinjenju, konstruktu ili drugom hemijskom entitetu, kao što je VH domen iz pronalaska sa C-terminalnom ekstenzijom koja je prisutna na C-terminalnom kraju).
[0053] Pošto su VH domeni iz pronalaska (i proteini, polipeptidi, jedinjenja, konstrukti i drugi hemijski entiteti koji ga sadrže, kako je ovde dalje opisano) posebno korisni (i namenjeni) za
2
farmaceutske primene (kao što je prevencija, lečenje i/ili dijagnoza bolesti i poremećaja kod humanih ispitanika kojima je to potrebno), oni poželjno imaju veliki stepen homologije sekvenci u svojim regionima okvira sa sekvencama okvira humanih VH domena. Konkretno, VH domeni iz pronalaska poželjno imaju ukupni stepen identičnosti sekvence (određen kao što je ovde dalje opisano, i uzimajući u obzir samo regione okvira a ne CDR-e, i takođe ne uzimajući u obzir supstituciju na poziciji 112 i bilo koju C-terminalnu ekstenziju ako postoji) sa najmanje jednom humanom sekvencom germinativne linije (kao što je DP-47, DP-51 ili DP-29) od najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, kao što je 90% ili više. Konkretnije, VH domeni iz pronalaska poželjno imaju ukupni stepen identičnosti sekvence (određen kao što je ovde dalje opisano, i uzimajući u obzir samo regione okvira a ne CDR-e, i takođe ne uzimajući u obzir supstituciju na poziciji 112 i bilo koju C-terminalnu ekstenziju ako postoji) od najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, kao što je 90% ili više, sa najmanje jednom od sledećih sekvenci germinativne linije: DP-47, DP-51 i/ili DP-29.
[0054] Kao što je ovde dalje opisano, prema jednom aspektu otkrića, VH domen iz otkrića može biti varijabilni domen teškog lanca koji, u proteinu, polipeptidu, proteinu ili konstruktu u kome je prisutan, interaguje/vezuje se (ili je namenjen da interaguje/vezuje se) sa VL domenom da bi formirao antigen vezujuće mesto, u kome barem VH domen ima izloženi C-terminalni kraj ili region. Na primer, VH domen prema ovom aspektu otkrića može biti VH domen koji je prisutan u ScFv i ili dijatelu i/ili se u njemu koristi, gde se vezuje za VL domen i formira antigen vezujuće mesto.
[0055] Međutim, VH domen iz pronalaska je pojedinačni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina ili „ISVD“, što znači varijabilni domen teškog lanca koji može da formira funkcionalno antigen vezujuće mesto bez interakcije sa VL domenom. Na primer, VH domen iz pronalaska može biti nanotelo (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizovane VH, kao što su kamelizovani humani VH), antitelo (sa pojedinačnim domenom) je VH domen ili dobijeno od VH domena, ili dAb koje je VH domen ili koje je izvedeno iz VH domena. VH domen iz pronalaska je poželjno nanotelo (i poželjnije, VHH domen, humanizovani VHH domen ili kamelizovani VH domen, kao što je kamelizovani humani VH domen).
[0056] U predmetnoj specifikaciji:
termin „nanotelo“ je kao što je definisano u WO 08/020079 ili WO 09/138519, i tako u specifičnom aspektu generalno označava VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH (kao što su kamelizovani humani VH) ili generalno VHH sa optimizovanom sekvencom (kao što je, npr., optimizovana hemijska stabilnost i/ili rastvorljivost, maksimalno preklapanje sa poznatim humanim regionima okvira i maksimalna ekspresija). Napominje se da su termini nanotelo ili nanotela registrovani zaštitni znaci kompanije Ablynx N.V. i zato se takođe mogu pominjati kao Nanobody® i/ili Nanobodies®);
termin „ISVD“(ili „ISV“) kao što se ovde koristi u svom najširem smislu takođe uključuje „biološke agense na bazi ISVD“, i kada je ISVD nanotelo, „biološke agense na bazi nanotela“. „Biološki agens na bazi ISVD“ je ovde definisan kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koji sadrži ili se suštinski sastoji od najmanje jednog (kao što je jedan, dva ili tri) ISVD. Slično tome, „biološki agens na bazi nanotela“ je ovde definisan kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koji sadrži ili se suštinski sastoji od najmanje jednog (kao što je jedan, dva ili tri) nanotela. Kao kod termina „ISVD“, kad god se koristi termin „biološki agens na bazi ISVD“, treba shvatiti da je takav biološki agens na bazi ISVD poželjno biološki agens na bazi nanotela. U okviru konteksta predmetnog pronalaska, „biološki agens na bazi ISVD“ i „biološki agens na bazi nanotela“ može, na primer, biti jednovalentan, dvovalentan (ili polivalentan), bispecifičan (ili multispecifičan) ili biparatopan (ili poliparatopan) konstrukt ISVD, odnosno konstrukt nanotela. Takođe, svi biološki agensi na bazi ISVD i biološki agensi na bazi nanotela mogu, na primer, pored jednog ili više (kao što je jedan, dva ili tri) ISVD ili nanotela, mogu opciono dalje da sadrže jedan ili više (kao što je jedan ili dva) drugih ostalih terapeutskih funkcionalnih ostataka i/ili jedan ili više (kao što je jedan ili dva) drugih funkcionalnih ostataka koji utiču na farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva bioloških agenasa na bazi ISVD ili na bazi nanotela (kao što je njegov poluživot). Pogodni primeri za takve ostale terapeutske ili druge funkcionalne ostatke biće jasni stručnjaku, i, na primer, generalno mogu da uključuju svaki terapeutski aktivan protein, polipeptid ili drugi vezujući domen ili vezujuću jedinicu, kao i, na primer, modifikacije kao što su one opisane na stranama 149 do 152 u WO 09/138159. Biološki agensi na bazi ISVD i biološki agens na bazi nanotela je poželjno terapeutsko sredstvo ili je namenjen za upotrebu kao terapeutsko sredstvo (što uključuje profilaksu i dijagnozu) i u tu svrhu poželjno sadrži najmanje jedan ISVD za terapeutski relevantnu metu (kao što je, na primer, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukini, itd.). Za neke specifične ali neograničavajuće primere za takve biološke agense na bazi ISVD ili biološke agense na bazi nanotela, upućuje se na primere 8 do 18, i takođe, na primer, na različite primene od strane kompanije Ablynx N.V. (kao što je, na primer i bez ograničenja, WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao na primer (i bez ograničenja) na primene kao što je WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 i WO 07/085814. Takođe, kao što je ovde dalje opisano, ISVD ili nanotelo kao što je ovde opisano može biti usmereno na protein iz (humanog) seruma kao što je albumin iz (humanog) seruma, i takav ISVD ili nanotelo može takođe naći terapeutsku primenu, konkretno u i/ili za produženje poluživota terapeutskih funkcionalnih ostataka (kao u ovde opisanim biološkim agensima na bazi ISV ili za njih). Na primer, upućuje se na WO 2004/041865, WO 2006/122787 i WO 2012/175400, koji generalno opisuju upotrebu nanotela koja vezuju albumin iz seruma radi produžetka poluživota. Takođe, u predmetnoj specifikaciji, osim ako ovde izričito nije rečeno drugačije, svi ovde pomenuti termini imaju značenje dato u WO 09/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 08/020079). Takođe, kada postupak ili tehnika nisu ovde posebno opisani, mogu se izvesti kao što je opisano u WO 09/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 08/020079).
[0057] Takođe, kada se koriste u predmetnoj specifikaciji ili zahtevima, sledeći termini imaju isto značenje kao što je dato na stranama 62-75 u WO 09/138519, i/ili gde je primenljivo mogu da se odrede na način koji je tu opisan: „agonist“, „antagonist“, „inverzni agonist“, „nepolarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni, naelektrisani aminokiselinski ostatak“, „identičnost sekvence“, „potpuno isti“ i „različita aminokiselina“ (kada se govori o poređenju sekvenci dve aminokiselinske sekvence), „(u) suštinski izolovan(om obliku)“, „domen“, „vezujući domen“, „antigenska determinanta“, „epitop“, „na“ ili „usmeren na“ (antigen), „specifičnost“ i „poluživot“. Pored toga, termini „modulišući“ i „modulisati“, „mesto interakcije“, „specifično za“, „unakrsna blokada“, „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje“ i „suštinski nezavisno od pH“ su kao što je definisano (i/ili može da se odredi kao što je opisano) na stranama 74-79 u WO 10/130832 podnosioca prijave. Takođe, kada se odnosi na konstrukt, jedinjenje, protein ili polipeptid iz pronalaska, termini kao „jednovalentni“, „dvovalentni“ (ili „polivalentni“), „bispecifični“ (ili „multispecifični“) i „biparatopni“ (ili „multiparatopni“) mogu imati značenje dato u WO 09/138.519, WO 10/130832 ili WO 08/020079.
[0058] Termin „poluživot“ kao što se ovde koristi u odnosu na ISVD, nanotelo, biološki agens na bazi ISVD i biološki agens na bazi nanotela ili bilo koja druga aminokiselinska sekvenca, jedinjenje ili polipeptid na koje se ovde upućuje može generalno biti definisano kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 WO 08/020079 i kao što je ovde opisano odnosi se na vreme
2
potrebno da koncentracija u serumu aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida bude smanjena za 50% in vivo, na primer, usled degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. Poluživot aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida iz pronalaska in vivo može biti određen na bilo koji suštinski poznat način, kao što je farmakokinetička analiza. Pogodne tehnike će biti jasne stručnoj osobi, i mogu, na primer, generalno biti kao što je opisano u odeljku o) na strani 57 WO 08/020079. Kao što je takođe opisano u odeljku o) na strani 57 WO 08/020079, poluživot može biti izražen koristeći parametre kao što je t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U ovom pogledu treba napomenuti da se termin „poluživot“ kao što se ovde koristi posebno odnosi na t1/2-beta ili terminalni poluživot (u kome se t1/2-alfa i/ili AUC ili oba mogu izostaviti iz razmatranja). Na primer, upućuje se na Eksperimentalni deo u nastavku, kao i na standardne priručnike, kao što je Kenneth, A i sar: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, i Peters i sar, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Takođe, upućuje se na „Pharmacokinetics“, M Gibaldi i D Perron, izdavač Marcel Dekker, 2. prer. izdanje (1982). Slično, termini „produženje poluživota“ i „produženi poluživot“ su takođe kao što je definisano u odeljku o) na strani 57 WO 08/020079, i posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, sa povećanjem ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.
[0059] Kada termin ovde nije specifični definisan, on ima svoje uobičajeno značenje u struci, koje će biti jasno stručnjaku. Na primer, upućuje se na standardne priručnike, kao što je Sambrook i sar, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ (2. izd.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel i sar, izd., „Current protocols in molecular biology“, Green Publishing i Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, „Genes II“, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old i sar., „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering“, 2. izdanje, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt i sar., „Immunology“ (6. izd.) Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt i sar., Roitt's Essential Immunology, 10. izd. Blackwell Publishing, UK (2001); i Janeway i sar., „Immunobiology“ (6. izd.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), kao i opšte osnove koje su u njima navedene.
[0060] Takođe, kao što je ovde već napomenuto, aminokiselinski ostaci nanotela su nabrojani prema opštoj numeraciji za VH domene koju su dali Kabat i sar. („Sequence of proteins of immunological interest“, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kao što je primenjeno na VHH domene kamelida u članku Riechmann i Muyldermans, J.
Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili je ovde pomenuto. Prema ovoj numeraciji, FR1 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 36-49, CDR2 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, i FR4 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113. [U ovom pogledu, treba napomenuti da, kao što je dobro poznato u struci za VH domene i VHH domene, ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom CDR može da varira i može da se ne poklapa sa ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabatovom numeracijom (to jest, može da se desi da jedna ili više pozicija prema Kabatovoj numeraciji nije popunjena u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog prema Kabatovoj numeraciji). To znači da, generalno, numeracija prema Kabatu može, ali ne mora da odgovara stvarnoj numeraciji aminokiselinskih ostataka u stvarnoj sekvenci. Međutim, generalno se može reći da, prema Kabatovoj numeraciji i nezavisno od broja aminokiselinskih ostataka u CDR-ima, pozicija 1 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR1 i obrnuto, pozicija 36 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR2 i obrnuto, pozicija 66 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR3 i obrnuto, i pozicija 103 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR4 i obrnuto.].
[0061] Alternativni postupci za numeraciju aminokiselinskih ostataka VH domena, koji se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene kamelida i na nanotela, su postupak koji su opisali Chothia i sar. (Nature 342, 877-883 (1989)), takozvana „AbM definicija“, i takozvana „kontaktna definicija“. Međutim, u predmetnom opisu, aspektima i slikama, biće korišćena numeracija prema Kabatu kao što su je na VHH domene primenili Riechmann i Muyldermans, ako nije drugačije naznačeno.
[0062] Takođe treba napomenuti da su slike, sve liste sekvenci i Eksperimentalni deo/Primeri dati samo kao dodatna ilustracija pronalaska, i ne treba ih interpretirati ili tumačiti kao da ograničavaju obim pronalaska i/ili priključenih zahteva ni na koji način, osim ako ovde izričito nije drugačije naznačeno.
[0063] VH domeni iz pronalaska mogu biti usmereni na bilo koji pogodan ili željeni antigen ili metu, uključujući svaku farmaceutski i/ili terapeutski relevantnu metu, kao što je ovde opisana.
2
[0064] Prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, VH domeni iz pronalaska su usmereni na protein iz seruma, i konkretno protein iz humanog seruma. Prema poželjnom aspektu, kada je VH domen iz pronalaska usmeren na protein iz seruma, on je usmeren na albumin iz seruma, i posebno albumin iz humanog seruma. Tako, pronalazak se takođe odnosi na VH domen iz pronalaska (kao što je ovde definisan, uključujući poželjnosti definisane za VH domene iz pronalaska) koji mogu specifično da se vežu za protein iz seruma, konkretno protein iz humanog seruma, i koji može poželjno specifično da se veže za albumin iz seruma, i poželjnije albumin iz humanog seruma. Takođe, takav VH domen je poželjno ISVD (kao što je ovde opisan) i poželjnije nanotelo.
[0065] Na primer, VH domen iz pronalaska na albumin iz seruma može biti jedno od nanotela na albumin iz (humanog) seruma koja su opisana u WO 2004/041865, i posebno u WO 2006/122787 i WO 2012/175400 (sve su prijave podnosioca zahteva/zastupnika), kao što je definisano zahtevima, u kome je aminokiselina na poziciji 112 supstituisana sa K ili Q, i koje opciono ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (i takođe, na primer, može takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K i/ili T110K; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 110 često neće biti potrebno kada je na poziciji 112 K ili Q, kada je pozicija 110 poželjno T). Nadalje, predviđeno je da predmetni pronalazak takođe može da se primeni na druge ISVD sa teškim lancem koji vezuju albumin iz seruma, kao što su ona opisana u WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804WO 10/108937 ili US 2013/0129727, tj. pogodnim uvođenjem supstitucija definisanih zahtevima (i opciono najmanje jedne S112K i/ili S112Q, i opciono jedne ili više drugih ovde opisanih aminokiselinskih ostataka/supstitucija) i opciono (i obično poželjno, kao što je ovde naznačeno) dodavanje C-terminalne ekstenzije (kao što je ovde dalje opisano).
Neki poželjni ali neograničavajući primeri takvih nanotela koja vezuju albumin iz seruma iz pronalaska su humanizovane varijante aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 (nazvana „Alb-1“ u WO 2006/122787) kao što je definisana zahtevima, u kojima je aminokiselina na poziciji 112 opciono supstituisana od strane K ili Q (i koja opciono ima C-terminalnu ekstenziju, kao što je ovde opisana), kao što su humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO: 57 do 64 u WO 2006/122787 (u svakom slučaju, opciono sa supstitucijom S112K ili S112Q, i opciono sa C-terminalnom ekstenzijom) ili humanizovane
2
varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO 3 do 11 u WO 2012/175400 (opet, u svakom slučaju, opciono sa supstitucijom S112K ili S112Q), od kojih SEQ ID NO 3, 4 i 5 mogu opciono da sadrže C-terminalnu ekstenziju, i SEQ ID NO 6 do 11 već sadrže C-terminalnu ekstenziju (i opet takve varijante mogu da sadrže jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K i/ili T110K; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 110 često neće biti potrebno kada je na poziciji 112 K ili Q, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0066] Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je opciono K ili Q;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K i/ili T110K; mada obično prisustvo dodatne
2
supstitucije na poziciji 110 često neće biti potrebno kada je na poziciji 112 K ili Q, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0067] U konkretnom aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje je humanizovana varijanta SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je opciono K ili Q;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K i/ili T110K; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 110 često neće biti potrebno kada je na poziciji 112 K ili Q, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih
2
ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0068] U konkretnom aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 ovde) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom tekstu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali ne i C-terminalnu ekstenziju), u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 112 opciono K ili Q, i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K i/ili T110K; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 110 često neće biti potrebno kada je na poziciji 112 K ili Q, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj.
2
humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0069] Takvo nanotelo iz pronalaska je opet poželjno humanizovana varijanta Alb-1 (ali sa supstitucijama kao što su definisane zahtevima i opciono sa supstitucijom S112K ili S112Q), i poželjnije ima najmanje jedan, konkretno bilo koja dva, i najkonkretnije sva tri od CDR1, CDR2 i/ili CDR3 data u SEQ ID NO 41 do 43, redom.
[0070] Prema jednom specifičnom aspektu, svako nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma takođe može imati aminokiselinske ostatke koji su karakteristični za Alb-23 i njegove varijante, kao što je opisano u WO 12/175400 (tj. aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45, aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76 i poželjno G na poziciji 16 i opciono takođe R na poziciji 83).
[0071] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz otkrića koji su usmereni na albumin iz humanog seruma dati su u Tabeli 4 i Primeru 20.
Tabela 4: Neograničavajući primeri VH domena iz pronalaska usmereni na albumin iz humanog seruma.
SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca
ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
1 SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
2 SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
4 SEQ Naziv Aminokiselina C- Sekvenca
ID: sekvence na poziciji 112 terminalna
u kojoj (i) aminokiselinski ostaci sekvenci FW4 koji prethode C-terminalnoj ekstenziji (X)nu SEQ ID NO: 23 do 40 odgovaraju aminokiselinskim pozicijama FW4 VH domena (tj. pozicijama 103 do 113 prema Kabatovoj numeraciji); (ii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iii) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I); ili
c) aminokiselinsku sekvencu koja ima najviše tri, poželjno najviše dve, različite aminokiseline sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 99 do 106 (u kojima su pomenute različite aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju aminokiselinskim pozicijama FW4 VH domena, tj. pozicijama 103 do 113 prema Kabatovoj numeraciji, zanemarujući bilo koje različite aminokiseline u C-terminalnoj ekstenziji (X)n) u kojoj: (i) kada je aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 112 Kabatove numeracije K ili Q, pomenute različite aminokiseline su na aminokiselinskoj poziciji koja nije 112, i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 VH domena je poželjno izabran od V, T ili L (i najpoželjnije je V); (i) kada je aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 110 Kabatove numeracije K ili Q, pomenute različite aminokiseline su na aminokiselinskoj poziciji koja nije 110, i pozicija 89 VH domena je L; (iii) n je 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i (iv) svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I). Ponovo, nadalje prema karakteristikama (i) do (iv) kako je pomenuto u prethodnoj rečenici, u takvoj aminokiselinskoj sekvenci: (v) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 Kabatove numeracije je poželjno S, (vi) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 104 Kabatove numeracije je poželjno S; (vii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 106 Kabatove numeracije je poželjno G; (viii) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 107 Kabatove numeracije je poželjno T; (ix) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 108 Kabatove numeracije je poželjno Q ili L (i u humanizovanim nanotelima poželjno L); (ix) aminokiselinski ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 109 Kabatove numeracije je poželjno V; i ponovo se upućuje na Tabelu 2 za moguće aminokiselinske ostatke koji mogu biti prisutni na svakoj poziciji.
[0073] Ponovo, u takvim VH domenima iz pronalaska: (a) aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V; aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno jedan od A ili P; aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno jedan od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L. Takođe, takav VH domen iz pronalaska je ISVD, i poželjnije nanotelo; i ponovo može biti usmeren na albumin iz humanog seruma (u tom slučaju, on poželjno ima CDR1, CDR2, odnosno CDR3, koji odgovaraju sekvencama SEQ ID NO 41, 42, odnosno 43). Takođe, kada su pomenuti VH domeni ISVD ili nanotela na albumin iz humanog seruma, oni dalje mogu biti kao što su ovde opisani za nanotela iz pronalaska koja su usmerena na albumin iz humanog seruma.
[0074] VH domeni iz pronalaska koji su usmereni na albumin iz seruma mogu se koristiti da se produži poluživot terapeutski aktivnih jedinjenja, (poli)peptida, proteina, vezujućih domena, vezujućih jedinica ili drugih terapeutski aktivnih entiteta ili funkcionalnih ostataka, suštinski na način opisan u WO 2004/041865, WO 2006/122787 i/ili WO 2012/175400 za upotrebu nanotela koja vezuju albumin iz seruma koja su opisana u pomenutim referencama (tj.
pogodnim povezivanjem ISVD koji vezuju albumin iz seruma sa proteinom, polipeptidom, jedinjenjem ili drugim entitetima opciono putem pogodnog linkera. Na primer, WO 12/175400 na stranama 12 i 13 navodi neke primere načina na koji mogu biti konstruisani pogodni fuzioni proteini).
[0075] U drugom aspektu, otkriće se odnosi na varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 (Kabatova numeracija) treonin (T), i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je ostatak serina (S), lizina (K) ili ostatak glutamina (Q). Takvi varijabilni domeni teškog lanca imunoglobulina (VH domen) sa T na poziciji 89 su obuhvaćeni terminom „VH domeni iz otkrića“ kao što se ovde koristi u svom najširem smislu, i mogu dalje biti kao što je ovde opisano za VH domene iz otkrića koji sadrže K ili Q na poziciji 112. Prema tome, takav varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) može da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde dalje opisana (uključujući naznačene poželjnosti za takvu C-terminalnu ekstenziju); može biti ISVD i posebno nanotelo kao što je ovde dalje opisano.
[0076] Ponovo, ako takav VH domen iz otkrića ima izložen C-terminalni region (na primer, jer formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog konstrukta u kome je prisutan), on poželjno sadrži C-terminalnu ekstenziju (upućuje se na podatke prikazane u Tabeli C ispod).
[0077] Takođe, nanotela iz otkrića kod kojih je na poziciji 89 T (tj. sa C-terminalnom ekstenzijom ili bez nje) poželjno sadrže aminokiselinu na poziciji 11 koja je izabrana od L (najčešći aminokiselinski ostatak koji se sreće u VHH), E, K, M, S, V, W ili Y; poželjnije od L, E, K, V ili Y, i čak još poželjnije od L, K ili V (gde je V najpoželjniji). Na primer, ona mogu da sadrže supstituciju L11K ili L11V, kao i, na primer, supstituciju P14A ili A14P, supstituciju Q108L, i/ili supstituciju T110K, T110Q, S112K i/ili S112Q (mada obično prisustvo jedne ili dve dodatne supstitucije na poziciji 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 T, i u tom slučaju na poziciji 110 je poželjno T, a na poziciji 112 je poželjno S).
[0078] Konkretno, varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) iz otkrića prema ovom posebnom aspektu ima T na poziciji 89 (Kabat) i C-terminalni kraj koji je jedna od VTVSS (SEQ ID NO:76), VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77), VTVKS (SEQ ID NO:1), VTVKS(X)n (SEQ ID NO:21), VTVQS (SEQ ID NO:2), VTVQS(X)n (SEQ ID NO:22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)n (SEQ ID NO:97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, u kojoj je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q) ili VZVZSX(n) (SEQ ID NO: 108, u kojoj je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q) (i posebno jedna od VTVKS (SEQ ID NO:1), VTVQS (SEQ ID NO:2), VTVSS (SEQ ID NO:76), VTVKS(X)n(SEQ ID NO:21), VTVQS(X)n(SEQ ID NO:22) ili VTVSS(X)n(SEQ ID NO:77), i konkretnije može biti VTVSS (SEQ ID NO:76) ili VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77)), u kojima su n i X kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K (i u kojima je svaka C-terminalna ekstenzija poželjno kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K). Takođe, kao što je slučaj sa VH domenima iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K, kada je takav VH domen koji ima T na poziciji 89 nanotelo, pozicija 11 je poželjno leucin (L), pozicija 14 može posebno biti alanin (A) ili prolin (P), i pozicija 108 može posebno biti Q ili L (i kod humanizovanih nanotela poželjno L); i takvo nanotelo koje ima T na poziciji 89 može da sadrži jedan ili više obeleženih ostataka nanotela i/ili može biti pogodno humanizovano. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0079] Takav VH domen iz otkrića koji ima T na poziciji 89 ponovo može biti nanotelo za albumin iz seruma, kao što je ovde dalje opisano. Na primer, takvo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma može biti jedna od sekvenci SEQ ID NO: 46 do 75, ali sa T na poziciji 89; ili drugo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma sa T na poziciji 89 koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom dokumentu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom dokumentu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali nijednu C-terminalnu ekstenziju). Neki drugi primeri takvih nanotela koja imaju T na poziciji 89 dati su u SEQ ID NO: 78 do 91 (to su dodatne varijante Alb-1/Alb-8 ili Alb-23 sa T na poziciji 89 i S na poziciji 112).
[0080] Na primer, VH domen na albumin iz seruma prema ovom aspektu otkrića može biti jedno od nanotela na albumin iz (humanog) seruma koja su opisana u WO 2004/041865, i posebno u WO 2006/122787 i WO 2012/175400 (sve su prijave podnosioca zahteva/zastupnika), u kome je aminokiselina na poziciji 89 treonin (T), i koje opciono ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (i takođe, na primer, može takođe pogodno da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, S112K i/ili S112Q; mada obično prisustvo dodatnih supstitucija na pozicijama 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je T prisutan na poziciji 89, u kom slučaju je na poziciji 110 poželjno T a na poziciji 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Nadalje, predviđeno je da predmetno otkriće takođe može da se primeni na druge ISVD sa teškim lancem koji vezuju albumin iz seruma, kao što su ona opisana u WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804WO 10/108937 ili US 2013/0129727, tj. pogodnim uvođenjem treonina (T) na poziciju 89, i opciono jedne ili više drugih ovde opisanih aminokiselinskih ostataka/supstitucija) i opciono (i obično poželjno, kao što je ovde naznačeno) dodavanje C-terminalne ekstenzije (kao što je ovde dalje opisano).
[0081] Neki poželjni ali neograničavajući primeri takvih nanotela koja vezuju albumin iz seruma iz otkrića su humanizovane varijante aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 (nazvana „Alb-1“ u WO 2006/122787), u kojima je aminokiselina na poziciji 89 T (i koja opciono ima C-terminalnu ekstenziju, kao što je ovde opisana), kao što su humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO: 57 do 64 u WO 2006/122787 (u svakom slučaju, sa supstitucijom V89T, i opciono sa C-terminalnom ekstenzijom) ili humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO 3 do 11 u WO 2012/175400 (opet, u svakom slučaju, sa supstitucijom V89T), od kojih SEQ ID NO 3, 4 i 5 mogu opciono da sadrže C-terminalnu ekstenziju, i SEQ ID NO 6 do 11 već sadrže C-terminalnu ekstenziju (i opet takve varijante mogu da sadrže jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112Q i/ili S112K; mada obično prisustvo jedne ili dve dodatne supstitucije na poziciji 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 T, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T i pozicija 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0082] Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz otkrića (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T;
i koje opciono sadrži na svom C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i
4
ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112Q i/ili S112K; mada obično prisustvo jedne ili dve dodatne supstitucije na poziciji 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 T, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T i pozicija 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0083] U konkretnom aspektu, otkriće se odnosi na nanotelo iz otkrića (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje je humanizovana varijanta SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T;
i koje opciono sadrži na svom C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112Q i/ili S112K; mada obično prisustvo jedne ili dve dodatne supstitucije na poziciji 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 T, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T i pozicija 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0084] U konkretnom aspektu, otkriće se odnosi na nanotelo iz otkrića (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom tekstu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom tekstu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali ne i C-terminalnu ekstenziju), u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 T, i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112Q i/ili S112K; mada obično prisustvo jedne ili dve dodatne supstitucije na poziciji 110 i/ili 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 T, u kom slučaju je pozicija 110 poželjno T i pozicija 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0085] Prema jednom specifičnom aspektu, svako nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma sa T na poziciji 89 takođe može imati aminokiselinske ostatke koji su karakteristični za Alb-23 i njegove varijante, kao što je opisano u WO 12/175400 (tj. aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45, aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76 i poželjno G na poziciji 16 i opciono takođe R na poziciji 83).
[0086] Kao kod VH domena iz otkrića koja sadrže Q ili K na poziciji 112, VH domeni iz otkrića koji imaju T na poziciji 89 (opciono sa Q ili K na poziciji 112 i/ili zajedno sa C-terminalnom ekstenzijom) prikazuju smanjeno vezivanje od strane takvih već postojećih antitela (kao što se, na primer, nalaze u uzorcima dobijenim od SLE pacijenata) koja mogu da se vežu za VH domene i nanotela u prisustvu C-terminalne ekstenzije.
[0087] U još jednom drugom aspektu, otkriće se odnosi na varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) kao što je definisan zahtevima u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 (Kabatova numeracija) leucin (L), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je ostatak lizina (K) ili ostatak glutamina (Q). Takvi varijabilni domeni teškog lanca imunoglobulina (VH domen) kao što su definisani zahtevima sa L ostatak na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 su takođe obuhvaćeni terminom „VH domeni iz pronalaska“ kao što se ovde koristi u svom najširem smislu, i mogu dalje biti kao što je ovde opisano za druge VH domene iz otkrića (tj. one koji sadrže K ili Q na poziciji 112 ili koji sadrže T na poziciji 89). Prema tome, takav varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) može da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde dalje opisana (uključujući naznačene poželjnosti za takvu C-terminalnu ekstenziju); može biti ISVD i posebno nanotelo kao što je ovde dalje opisano.
4
[0088] Ponovo, ako takav VH domen iz pronalaska ima izložen C-terminalni region (na primer, jer formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog konstrukta u kome je prisutan), on poželjno sadrži C-terminalnu ekstenziju (upućuje se na podatke prikazane u Tabeli C ispod).
[0089] Takođe, nanotela iz pronalaska kao što su definisana zahtevima u kojima je L ostatak na poziciji 89, a K ili Q na poziciji 110 (tj. sa C-terminalnom ekstenzijom ili bez nje) poželjno sadrže aminokiselinu na poziciji 11 koja je izabrana od L (najčešći aminokiselinski ostatak koji se sreće u VHH), E, K, M, S, V,W ili Y; poželjnije od L, E, K, V ili Y, i čak još poželjnije od L, K ili V (gde je V najpoželjniji). Na primer, ona mogu da sadrže supstituciju L11K ili L11V, kao i, na primer, supstituciju P14A ili A14P, i/ili supstituciju Q108L, (takođe mogu pogodno sa sadrže mutaciju S112K i/ili S112Q, mada obično prisustvo dodatne supstitucije na pozicijama 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L i na poziciji 110 je K ili Q, i u tom slučaju na poziciji 112 je poželjno S). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0090] Takođe, u jednom aspektu, u takvim VH domenima iz pronalaska kao što su definisani zahtevima u kojima je 89 L i 110 je K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je serin (S). Konkretnije, C-terminalni kraj takvog VH domena može biti jedan od (i poželjno je jedan od) VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)n(SEQ ID NO:97) ili VQVSS(X)n(SEQ ID NO: 98), u kome su n i X kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K (i u kome je svaka C-terminalna ekstenzija poželjno kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K). Takođe, kao što je slučaj sa VH domenima iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K ili je pozicija 89 T, kada je takav VH domen koji ima L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 nanotelo, pozicija 11 je poželjno leucin (L), pozicija 14 može posebno biti alanin (A) ili prolin (P), i pozicija 108 može posebno biti Q ili L (i kod humanizovanih nanotela poželjno L); i takvo nanotelo koje ima L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 može da sadrži jedan ili više obeleženih ostataka nanotela i/ili može biti pogodno humanizovano. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0091] Takav VH domen iz pronalaska kao što je definisan zahtevima koji ima L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 može ponovo takođe da bude nanotelo za albumin iz seruma, kao što je ovde dalje opisano. Na primer, takvo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma može biti jedna od sekvenci SEQ ID NO: 46 do 75, ali sa L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110; ili drugo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, sa L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom dokumentu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom dokumentu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali nijednu C-terminalnu ekstenziju).
[0092] Uopštenije, VH domen iz pronalaska na albumin iz seruma prema ovom aspektu pronalaska može biti jedno od nanotela na albumin iz (humanog) seruma koja su opisana u WO 2004/041865, i posebno u WO 2006/122787 i WO 2012/175400 (sve su prijave podnosioca zahteva/zastupnika), kao što je definisano zahtevima, u kome je aminokiselina na poziciji 89 leucin (L) i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q, i koje opciono ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (i takođe, na primer, može takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L, kao i S112K ili S112Q, mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L a pozicija 110 je
4
K ili Q, i u tom slučaju je pozicija 112 poželjno S). Nadalje, predviđeno je da predmetni pronalazak takođe može da se primeni na druge ISVD sa teškim lancem koji vezuju albumin iz seruma, kao što su ona opisana u WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804WO 10/108937 ili US 2013/0129727, tj. pogodnim uvođenjem leucina (L) na poziciju 89, i bilo K ili Q na poziciju 110, i opciono jedne ili više drugih ovde opisanih aminokiselinskih ostataka/supstitucija) i opciono (i obično poželjno, kao što je ovde naznačeno) dodavanje C-terminalne ekstenzije (kao što je ovde dalje opisano). U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0093] Neki poželjni ali neograničavajući primeri takvih nanotela koja vezuju albumin iz seruma iz pronalaska su humanizovane varijante aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 (nazvana „Alb-1“ u WO 2006/122787) kao što je definisana zahtevima, u kojima je aminokiselina na poziciji 89 L a aminokiselina na poziciji 110 je K ili Q (i koja opciono ima C-terminalnu ekstenziju, kao što je ovde opisana), kao što su humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO: 57 do 64 u WO 2006/122787 (u svakom slučaju, sa supstitucijom V89L i supstitucijom T110Q ili T110K, i opciono sa C-terminalnom ekstenzijom) ili humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO 3 do 11 u WO 2012/175400 (opet, u svakom slučaju, sa supstitucijom V89L i supstitucijom T110Q ili T110K), od kojih SEQ ID NO 3, 4 i 5 mogu opciono da sadrže C-terminalnu ekstenziju, i SEQ ID NO 6 do 11 već sadrže C-terminalnu ekstenziju (i opet takve varijante mogu da sadrže jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L; kao i S112K ili S112Q; mada obično prisustvo dodatne
4
supstitucije na poziciji 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L i na poziciji 110 je K ili Q, u kom slučaju je pozicija 112 poželjno S). U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0094] Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L;
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L, kao i S112K ili S112Q; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L i na poziciji 110 K ili Q, u kom slučaju je pozicija 112 poželjno S). U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina
4
na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0095] U konkretnom aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje je humanizovana varijanta SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L;
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L, kao i S112K ili S112Q; mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L i na poziciji 110 je K ili Q, u kom slučaju je pozicija 112 poželjno S)). U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer,
4
biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0096] U konkretnom aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska kao što je definisano zahtevima koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom tekstu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom tekstu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali ne i C-terminalnu ekstenziju), u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 L, a aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je opciono K ili Q, i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L, kao i S112K ili S112Q, mada obično prisustvo dodatne supstitucije na poziciji 112 često neće biti potrebno kada je na poziciji 89 L a pozicija 110 je K ili Q, u kom slučaju je pozicija 112 poželjno S). Takvo nanotelo iz pronalaska je opet poželjno humanizovana varijanta Alb-1 (ali sa supstitucijom V89L i T110K ili T110Q), kao što je definisano zahtevima, i poželjnije ima najmanje jedan, konkretno najmanje bilo koja dva, i još konkretnije sva tri od CDR1, CDR2 i/ili CDR3 data u SEQ ID NO 41 do 43, redom. U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-
4
terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0097] Prema jednom specifičnom aspektu, svako takvo nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma kao što je definisano zahtevima sa L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 takođe može imati aminokiselinske ostatke koji su karakteristični za Alb-23 i njegove varijante, kao što je opisano u WO 12/175400 (tj. aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45, aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76 i poželjno G na poziciji 16 i opciono takođe R na poziciji 83). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0098] Kao kod VH domena iz otkrića koja sadrže Q ili K na poziciji 112 ili koji imaju T na poziciji 89, VH domeni iz otkrića kao što su definisani pronalaskom koji imaju L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110 pokazuju smanjeno vezivanje od strane već postojećih antitela, a konkretno od strane takvih već postojećih antitela (kao što se, na primer, nalaze u uzorcima dobijenim od SLE pacijenata) koja mogu da se vežu za VH domene i nanotela u prisustvu C-terminalne ekstenzije.
[0099] Neki neograničavajući primeri VH domena iz pronalaska kao što su definisani zahtevima koji imaju L na poziciji 89 i K na poziciji 110 i pored toga V na poziciji 11 dati su na Slici 2 kao SEQ ID NO: 123-136. To su VH domeni koji se vezuju za albumin iz humanog seruma i imaju ovde naznačene CDR kao poželjne VH domene iz pronalaska za vezivanje albumina iz seruma.
[0100] U još jednom drugom aspektu, otkriće se odnosi na varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) kao što je definisan zahtevima u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 (Kabatova numeracija) leucin (L), i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je valin (V). Takvi varijabilni domeni teškog lanca imunoglobulina (VH domen) sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11 su takođe obuhvaćeni terminom „VH domeni iz pronalaska“ kao što se ovde koristi u svom najširem smislu i mogu dalje biti kao što je ovde opisano za druge ovde opisane VH domene iz pronalaska (npr. one koji sadrže K ili Q na poziciji 112, koji sadrže T na poziciji 89, ili koji sadrže L na poziciji 89 i K ili Q na poziciji 110; iako će za VH domene prema tekućem aspektu aminokiselinski ostatak na poziciji 89 biti L, i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 će biti V, i aminokiselinski ostaci na poziciji 110, odnosno 112, mogu biti bilo koji aminokiselinski ostatak pogodan za takve pozicije). Prema tome, takav varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH domen) može da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde dalje opisana (uključujući naznačene poželjnosti za takvu C-terminalnu ekstenziju); može biti ISVD i posebno nanotelo kao što je ovde dalje opisano.
[0101] Ponovo, ako takav VH domen iz pronalaska ima izložen C-terminalni region (na primer, jer formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog konstrukta u kome je prisutan), on poželjno sadrži C-terminalnu ekstenziju (upućuje se na podatke prikazane u Tabeli C ispod).
[0102] Takođe, nanotela iz pronalaska u kojima je L na poziciji 89 i V na poziciji 11 (tj. sa C-terminalnom ekstenzijom ili bez nje): (i) poželjno sadrže aminokiselinu na poziciji 110 koja je odabrana od T, I, A, K ili Q (i poželjno od T, K ili Q, i koja posebno može biti T); (ii) poželjno sadrže aminokiselinu na poziciji 112 koja je odabrana od S, F, K ili Q (i poželjnije S, K ili Q, i koja posebno može biti S); i (iii) mogu, na primer, takođe da sadrže supstituciju P14A ili A14P i/ili supstituciju Q108L. Prema jednom specifičnom otelotvorenju, u VH domenu prema
1
ovom aspektu pronalaska, aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S, i poželjnije C-terminalni kraj je VTVSS (SEQ ID NO: 76), ili VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 77), u kome su n i X kao što je ovde definisano za C-terminalnu ekstenziju drugih VH domena iz pronalaska. Takođe, u VH domenima prema ovom aspektu pronalaska: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0103] Tako, na primer, u takvim VH domenima iz pronalaska u kojima je 89 L i 11 je V, C-terminalni kraj takvog VH domena može biti jedna od sekvenci (i poželjno je jedna od) VTVSS (SEQ ID NO:76), VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77), VTVKS (SEQ ID NO:1), VTVKS(X)n (SEQ ID NO:21), VTVQS (SEQ ID NO:2), VTVQS(X)n (SEQ ID NO:22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)n (SEQ ID NO:97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, u kojoj je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q) ili VZVZSX(n) (SEQ ID NO:108, u kojoj je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q) (i posebno je jedna od VTVSS , VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)n(SEQ ID NO:97) ili VQVSS(X)n(SEQ ID NO: 98), i može posebno biti VTVSS (SEQ ID NO:76) ili VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77)), u kome su n i X kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K (i u kome je svaka C-terminalna ekstenzija poželjno kao što je ovde u nastavku opisano za VH domene iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K). Takođe, kao što je slučaj sa VH domenima iz otkrića u kojima je pozicija 112 Q ili K ili je pozicija 89 T, kada je takav VH domen koji ima L na poziciji 89 i V na poziciji 11 nanotelo, pozicija 14 može posebno biti alanin (A) ili prolin (P), i pozicija 108 može biti Q ili L (i kod humanizovanih nanotela poželjno L); i takvo nanotelo koje ima L na poziciji 89 i V na poziciji 11 može da sadrži jedan ili više obeleženih ostataka nanotela i/ili može biti pogodno humanizovano. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od
2
aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0104] Takav VH domen iz pronalaska koji ima L na poziciji 89 i V na poziciji 11 može ponovo takođe da bude nanotelo za albumin iz seruma, kao što je ovde dalje opisano. Na primer, takvo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma može biti jedna od sekvenci SEQ ID NO: 46 do 75, ali sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11; ili drugo nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11 koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom dokumentu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom dokumentu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali nijednu C-terminalnu ekstenziju).
[0105] Uopštenije, VH domen iz pronalaska na albumin iz seruma prema ovom aspektu pronalaska može biti jedno od nanotela na albumin iz (humanog) seruma koja su opisana u WO 2004/041865, i posebno u WO 2006/122787 i WO 2012/175400 (sve su prijave podnosioca zahteva/zastupnika), u kome je aminokiselina na poziciji 89 leucin (L) i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V, i koje opciono ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (i takođe, na primer, može takođe pogodno da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, V110K, V110Q, S112K i/ili S112Q). Nadalje, predviđeno je da predmetni pronalazak takođe može da se primeni na druge ISVD sa teškim lancem koji vezuju albumin iz seruma, kao što su ona opisana u WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804WO 10/108937 ili US 2013/0129727, tj. pogodnim uvođenjem leucina (L) na poziciju 89, i valina na poziciju 11, i opciono jedne ili više drugih ovde opisanih aminokiselinskih ostataka/supstitucija) i opciono (i obično poželjno, kao što je ovde naznačeno) dodavanje C-terminalne ekstenzije (kao što je ovde dalje opisano). U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0106] Neki poželjni ali neograničavajući primeri takvih nanotela koja vezuju albumin iz seruma iz pronalaska su humanizovane varijante aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 (nazvana „Alb-1“ u WO 2006/122787), u kojima je aminokiselina na poziciji 89 L, a aminokiselina na poziciji 11 je V (i koja opciono ima C-terminalnu ekstenziju, kao što je ovde opisana), kao što su humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO: 57 do 64 u WO 2006/122787 (u svakom slučaju, sa supstitucijom V89L i supstitucijom L11V, i opciono sa C-terminalnom ekstenzijom) ili humanizovane varijante Alb-1 koje su date u SEQ ID NO 3 do 11 u WO 2012/175400 (opet, u svakom slučaju, sa supstitucijom V89L i L11V), od kojih SEQ ID NO 3, 4 i 5 mogu opciono da sadrže C-terminalnu ekstenziju, i SEQ ID NO 6 do 11 već sadrže C-terminalnu ekstenziju (i opet, takve varijante mogu pogodno da sadrže jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, T110K, T110Q, S112K i/ili S112Q). U tim VH domenima na albumin iz seruma, sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11, aminokiselina na poziciji 110 je poželjno T i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi
4
ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0107] Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L;
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V;
u kome poželjno
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K, Q ili T, i poželjnije T;
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K, Q ili S, i poželjnije S;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe pogodno da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L). Ponovo, u tim VH domenima na albumin iz seruma, sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11, aminokiselina na poziciji 110 je poželjno T i aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0108] U konkretnom aspektu, otkriće se odnosi na nanotelo iz otkrića (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje je humanizovana varijanta SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787 u kome:
CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43);
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L;
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V;
i poželjno:
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K, Q ili T, i poželjnije T; aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K, Q ili S, i poželjnije S;
i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L i/ili Q108L). U tim VH domenima na albumin iz seruma, sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11, aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno T i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0109] U konkretnom aspektu, pronalazak se odnosi na nanotelo iz pronalaska (kao što je ovde definisano) koje može da se veže (i posebno da se specifično veže) za albumin iz seruma (i posebno albumin iz humanog seruma) koje ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46 u ovom tekstu) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61 u ovom tekstu) (uzimajući u obzir i sekvence okvira i CDR-e, ali ne i C-terminalnu ekstenziju), u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 L i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V, i koje opciono sadrži na svom na C-terminalnom kraju C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ponovo, takva C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku, i ponovo takvo nanotelo može takođe, na primer, takođe pogodno da sadrži jedan ili više drugih ovde pomenutih specifičnih aminokiselinskih ostataka/supstitucija, kao što je 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, T110K, T110Q, S112K i/ili S112Q). Takvo nanotelo iz pronalaska je opet poželjno humanizovana varijanta Alb-1 (ali sa supstitucijom V89L i L11V), i poželjnije ima najmanje jedan, konkretno najmanje bilo koja dva, i još konkretnije sva tri od CDR1, CDR2 i/ili CDR3 data u SEQ ID NO 41 do 43, redom. U tim VH domenima na albumin iz seruma, aminokiselina na poziciji 112 je poželjno S, i pomenuti VH domeni poželjno imaju C-terminalni kraj koji je jedna od SEQ ID NO: 95 do 98. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0110] Prema jednom specifičnom aspektu, svako takvo nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma sa L na poziciji 89 i V na poziciji 11 takođe može imati aminokiselinske ostatke koji su karakteristični za Alb-23 i njegove varijante, kao što je opisano u WO 12/175400 (tj. aminokiselinski motiv GP na pozicijama 44 i 45, aminokiselinski motiv SKN na pozicijama 74 do 76 i poželjno G na poziciji 16 i opciono takođe R na poziciji 83). Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0111] Kao kod VH domena iz pronalaska koja sadrže Q ili K na poziciji 112 ili koji imaju T na poziciji 89, VH domeni iz pronalaska koji imaju L na poziciji 89 i V na poziciji 11 pokazuju smanjeno vezivanje od strane već postojećih antitela, a konkretno od strane takvih već postojećih antitela (kao što se, na primer, nalaze u uzorcima dobijenim od SLE pacijenata) koja mogu da se vežu za VH domene i nanotela u prisustvu C-terminalne ekstenzije. Još jedna stvar koju treba zapaziti kod VH domena iz pronalaska kod kojih je na poziciji 89 L i na poziciji 11 je V, je da se te supstitucije dešavaju sa određenom učestalošću u humanim VH domenima (vidite Tabelu A-5 iz WO 08/020079 za poziciju 11 i Tabelu A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 89).
[0112] Neki neograničavajući primeri VH domena iz pronalaska koji imaju V na poziciji 11 i T na poziciji 89 dati su na Slici 2 kao SEQ ID NO: 109-136. Od tih VH domena, sekvence date kao SEQ ID NO: 123-136 sadrže, pored mutacija L11V i V89L, i mutaciju T110K. To su VH domeni koji se vezuju za albumin iz humanog seruma i imaju ovde naznačene CDR kao poželjne VH domene iz pronalaska za vezivanje albumina iz seruma.
[0113] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
i u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Poželjno, u VH domenima prema ovom odeljku, aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S. Ponovo, kao sa drugim VH domenima iz pronalaska, takav VH domen može biti usmeren na bilo koju pogodnu metu (i posebno terapeutski bitnu metu). Prema jednom specifičnom aspektu, takav VH domen je usmeren na albumin iz seruma.
[0114] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q; i/ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T; i/ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q; i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i
u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0115] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L (i poželjno je V), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); i/ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno V; i u kome VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nu kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0116] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q; ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T; ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q; i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i
u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0117] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
2
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L (i poželjno je V), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno V; i u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0118] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je V, i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T; ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S, i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T; ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0119] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
4
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q; i/ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T; i/ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q; i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i
u kome pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0120] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L (i poželjno je V), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); i/ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); i/ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno V; i u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0121] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q; ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T; ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q; i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i
u kome pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0122] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L (i poželjno je V), i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q (i poželjno je T); ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno V; i u kome pomenuti VH domen opciono sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0123] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je V, i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T; ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T, aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S, i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T; ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q, i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je S (i poželjno je S); i (iv) u svakom od slučajeva (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V; i u kome pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I) (ta C-terminalna ekstenzija je poželjno kao što je ovde opisana u nastavku). Takođe: (i) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (ii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A). Drugi aspekt pronalaska se odnosi na VH domen (i konkretno VH domen koji je ISVD, i konkretnije VH domen koji je nanotelo) koji je kao što je opisano u ovom paragrafu, u kome aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je K ili Q (i u kome aminokiselinski ostaci na pozicijama 14, 41, 89, 108 i 112 mogu biti kao što je navedeno u gornjim nabrajanjima, aminokiselinski ostaci na pozicijama 42 i 87 mogu, na primer, biti kao što je opisano u ovom odeljku, i VH domen može opciono da sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)nkao što je opisana u ovom odeljku).
[0124] Ponovo, VH domeni iz pronalaska kao što su ovde definisani, aminokiselinski ostaci koji ovde nisu izričito definisani mogu biti bilo koji aminokiselinski ostatak koji je pogodan na takvoj poziciji za VH domene, i posebno za ISVD, i konkretnije za nanotela (uključujući humanizovane VHH domene). Ponovo se navodi ovde citirano stanje tehnike, kao što su, na primer, Tabele A-3 i A-5 do A-8 iz WO 08/020079. Poželjno, u svakom slučaju, aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je L ili V, i poželjnije je V. Takođe: (i) pozicija 41 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 41, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) prolina (P), serina (S), treonina (T), alanina (A) ili leucina (L), koji su neki od aminokiselinskih ostataka koji se najčešće sreću na ovoj poziciji kod ljudi ili lama, i može konkretnije biti bilo prolin (P) ili alanin (A); i/ili (ii) pozicija 42 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-6 iz WO 08/020079 za poziciju 42 i može konkretno biti (ili biti izabrana od) glicina (G) ili glutaminske kiseline (E); i/ili (iii) pozicija 87 može, na primer, biti jedan od aminokiselinskih ostataka (tj. humani VH3 ostaci i/ili kamelidni VHH ostaci) pomenutih u Tabeli A-7 iz WO 08/020079 za poziciju 87, i može konkretno biti (ili biti izabrana od) treonina (T) ili alanina (A).
[0125] Takođe, pomenuti VH domen iz pronalaska može biti usmeren na bilo koju pogodnu metu, i posebno na terapeutsku metu. U jednom aspektu, usmereni su na protein iz humanog seruma, kao što je albumin iz humanog seruma.
[0126] Otkriće se takođe odnosi na proteine, polipeptide, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske entitete koji sadrže najmanje jedan VH domen iz pronalaska (takođe se zajednički nazivaju „jedinjenja iz pronalaska“).
[0127] Kao što je ovde dalje opisano, prema jednom specifičnom aspektu, u jedinjenju iz pronalaska, VH domen iz pronalaska je prisutan u njemu/formira njegov C-terminalni kraj. U takvom slučaju, VH domen iz pronalaska koji formira/prisutan je na C-terminalnom kraju jedinjenja iz pronalaska poželjno ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana.
[0128] Kao što je ovde dalje opisano, jedinjenje iz pronalaska može biti ScFv, dijatelo ili drugi protein, polipeptid ili konstrukt u kome je jedan ili više VH domena iz pronalaska povezan sa jednim ili više VH domena dajući jedno ili više funkcionalnih antigen vezujućih mesta.
[0129] Međutim, VH domeni iz pronalaska su ISVD, i jedinjenja iz pronalaska su proteini, polipeptidi, konstrukti, jedinjenja ili drugi hemijski entiteti koji sadrže ili se suštinski sastoje od najmanje jednog ISVD iz jedinjenja i opciono jednu ili više dodatnih aminokiselinskih sekvenci, funkcionalnih ostataka, vezujućih domena ili vezujućih jedinica (pogodno povezanih jedni sa drugima, opciono putem jednog ili više linkera). Konkretno, takva jedinjenja iz pronalaska mogu da sadrže ili se suštinski sastoje od jednog ili više ISVD, od kojih je najmanje jedan ISVD iz pronalaska. Takvo jedinjenje iz pronalaska može konkretno da ima ISVD iz pronalaska na svom C-terminalnom kraju, i u tom slučaju ISVD iz pronalaska takođe poželjno ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana. Takođe, ako takvo jedinjenje iz pronalaska sadrži dva ili više ISVD, dva ili više ili suštinski sva prisutna ISVD mogu biti ISVD iz pronalaska (tj. svako ima najmanje jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka/supstitucija: kombinaciju V89L sa L11V). Takođe, u takvom jedinjenju iz pronalaska, ISVD iz pronalaska je poželjno nanotelo iz pronalaska, i sva ili suštinski sva prisutna ISVD mogu biti (i poželjno su) nanotela iz pronalaska, tj. svako ima najmanje jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka/supstitucija: kombinaciju V89L L11V). Primer za takva jedinjenja iz pronalaska će biti jasan stručnjaku na osnovu daljeg otkrića koje je ovde izneto.
[0130] Neki neograničavajući primeri proteina, polipeptida, konstrukata, jedinjenja ili drugih hemijskih entiteta koji sadrže jedan ili više ISVD (uključujući najmanje jedan ISVD iz pronalaska) su polivalentni, multispecifični (kao što su bispecifični) ili multiparatopni (kao što su biparatopni) konstrukti koji sadrže dva ili više ISVD povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera. Ponovo, ISVD su poželjno antitela. Neke neograničavajuće primere takvih kostrukata i opštu pouku o tome kako mogu da se naprave konstrukti (posebno na bazi nanotela) možete potražiti npr. u Conrath i sar., JBC 276, 10(9), 7346 (2001), kao i u revijalnom članku koji je objavio Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).
[0131] Na primer, takvo jedinjenje iz pronalaska koje sadrži dva ili više ISVD (od kojih je najmanje jedno ISVD iz pronalaska) može biti dvovalentni, trovalentni, četvorovalentni ili petovalentni konstrukt i/ili može biti monospecifični, bispecifični, trispecifični konstrukt i/ili može biti biparatopni ili triparatopni konstrukt. Ponovo upućujemo na stanje tehnike vezano za biološke agense na bazi ISVD i nanotela koja se ovde pominju. Takođe, takvo jedinjenje iz pronalaska može da ima produžen poluživot putem funkcionalizacije i/ili uključivanja u konstrukt funkcionalnog ostatka ili vezujuće jedinice koja produžava poluživot konstrukta. Primeri za takvu funkcionalizaciju, funkcionalne ostatke ili vezujuće jedinice biće jasni stručnjaku, i mogu, na primer, da budu kao što su ovde opisani, i, na primer, mogu da uključuju pegilovanje, fuziju sa albuminom iz seruma ili fuziju sa peptidom ili vezujućom jedinicom koja može da se veže za protein iz seruma, kao što je albumin iz seruma. Takav peptid koji vezuje albumin iz seruma ili vezujući domen, može biti bilo koji pogodan peptid koji vezuje albumin iz seruma ili vezujući domen koji može da poveća poluživot konstrukta (u poređenju sa istim konstruktom bez peptida koji vezuje albumin iz seruma ili vezujućeg domena), i mogu konkretno biti peptidi koji vezuju albumin iz seruma, kao što je opisano u WO 2008/068280 podnosioca zahteva (i posebno WO 2009/127691 i neobjavljenoj prijavi US application 61/301,819, oba od podnosioca zahteva), ili ISV koji vezuje albumin iz seruma (kao što je nanotelo koji vezuje albumin iz seruma; na primer, Alb-1 ili humanizovana verzija Alb-1, kao što je Alb-8, koje se, na primer, pominje u WO 06/122787), ili ISVD iz pronalaska usmereno
1
na protein iz (humanog) seruma kao što je albumin iz (humanog) seruma (kao što je ovde opisan u nastavku). Generalno, svako jedinjenje iz pronalaska sa produženim poluživotom će poželjno imati poluživot (kao što je ovde definisan) kod humanih ispitanika koji iznosi najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana.
[0132] Kada jedinjenje iz pronalaska sadrži najmanje jedan (i poželjno jedan) ISVD iz pronalaska (i posebno nanotelo iz pronalaska) koji je usmeren na protein iz (humanog) seruma, a posebno albumin iz (humanog) seruma, jedinjenje iz pronalaska će obično dalje sadržati jednu ili više terapeutski aminokiselinskih sekvenci, funkcionalnih ostataka, vezujućih domena ili vezujućih jedinica (tj. usmerenih na terapeutski bitan cilj, put ili mehanizam), i ISVD iz pronalaska će funkcionisati tako da produži njihov poluživot (kao i celog jedinjenja). Ponovo, pomenuti jedan ili više funkcionalnih ostataka su poželjno ISVD (i poželjnije nanotela), i mogu takođe biti ISVD iz pronalaska (i poželjnije nanotela iz pronalaska). U takvim jedinjenjima iz pronalaska, ISVD iz pronalaska usmeren na albumin iz humanog seruma ponovo može biti prisutan/formirati C-terminalni kraj jedinjenja, i u tom slučaju može da sadrži (i poželjno će sadržati) C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana. Kada jedinjenje iz pronalaska sadrži ISVD iz pronalaska koji je usmeren na albumin iz (humanog) seruma, pomenuto jedinjenje iz pronalaska poželjno ima poluživot (kao što je ovde definisan) od najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana kod humanog ispitanika na kome se primenjuje ili je primenjen. Neki neograničavajući primeri ISVD iz pronalaska na albumin iz humanog seruma koji mogu da se koriste za ovu svrhu dalje su ovde opisani.
[0133] U jednom aspektu, svi ISVD ili nanotela prisutna u pomenutom jedinjenju iz pronalaska si ISVD iz pronalaska (što znači da imaju aminokiselinske ostatke/supstitucije koje su karakteristične za ISVD iz pronalaska kao što su definisani u zahtevima, tj. barem 89L u kombinaciji sa 11V). Kada su svi ISVD u jedinjenju ISVD iz pronalaska, oni mogu da imaju iste opcione supstitucije (na primer, svi imaju supstituciju S112K ili S112Q) ili različite opcione supstitucije (na primer, jedan može da ima supstituciju S112K ili S112Q, a drugi može da ima T110K ili T110Q). Takođe, obično će samo ISVD na C-terminalnom kraju jedinjenja iz pronalaska imati C-terminalnu ekstenziju (jer će drugi verovatno biti povezani na svom C-terminalnom kraju sa drugim ISVD prisutnim u jedinjenju).
2
[0134] Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži ili se suštinski sastoji od ISVD iz pronalaska (kao što je definisan zahtevima).
[0135] Pronalazak se dalje odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži najmanje jedan ISVD iz pronalaska i najmanje jedan drugi terapeutski ostatak ili entitet (povezan direktno ili putem pogodnog linkera).
[0136] Pronalazak se dalje odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži najmanje jedan ISVD iz pronalaska koji je usmeren na protein iz (humanog) seruma (a poželjno albumin iz humanog seruma) i najmanje jedan drugi terapeutski ostatak ili entitet (povezan direktno ili putem pogodnog linkera).
[0137] Pronalazak se dalje odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži najmanje dva (kao što je dva, tri ili četiri) pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera), od kojih je najmanje jedan ISVD iz pronalaska. U ovom aspektu: (i) prisutni ISVD mogu biti isti ili različiti; i kada su različiti, mogu biti usmereni na istu metu (na primer, mogu imati različite sekvence i/ili biti usmereni na različite epitope na istoj meti) ili na dve ili više različitih drugih meta (tj. tako da je rezultujući protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul bi- ili multispecifični konstrukt); i/ili (ii) ISDV prisutan na C-terminalnom kraju proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili molekula može ili ne mora biti ISVD iz pronalaska (ali poželjno jeste); i/ili (iii) kada je ISVD iz pronalaska prisutan na C-terminalnom kraju proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili molekula, on poželjno ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana; i/ili (iv) suštinski svi ISVD prisutni u proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili molekulu mogu biti ISVD iz pronalaska. Takođe, kada su ISVD usmereni na različite mete (od kojih je najmanje jedna terapeutski agens), prema jednom daljem aspektu najmanje jedan od prisutnih ISVD mora biti usmeren na protein iz (humanog) seruma, kao što je albumin iz humanog seruma (i taj ISVD može ili ne mora biti ISVD iz pronalaska; i kada jeste ISVD iz pronalaska, poželjno je nanotelo na albumin iz humanog seruma koje je kao što je ovde dalje opisano).
[0138] Pronalazak se dalje odnosi na takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži ili se suštinski sastoji od dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera).
[0139] Pronalazak se dalje odnosi na takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži ili se suštinski sastoji od tri pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera).
[0140] Pronalazak se dalje odnosi na takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži ili se suštinski sastoji od četiri pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera).
[0141] Pronalazak se dalje odnosi na takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji dalje sadrži najmanje jedan funkcionalni ostatak, vezujući domen ili vezujuću jedinicu koja dodeljuje produžen poluživot takvom proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili molekulu (tj. u poređenju sa odgovarajućim proteinom, polipeptidom ili drugim jedinjenjem ili molekulom bez pomenutog funkcionalnog ostatka, vezujućeg domena ili vezujuće jedinice). Prema specifičnijem aspektu, pomenuti najmanje jedan funkcionalni ostatak, vezujući domen ili vezujuća jedinica koja dodeljuje produžen poluživot takvom proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili molekulu je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, konkretnije pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji je usmeren na protein iz seruma (kao što je albumin iz seruma), i konkretno na protein iz humanog seruma (kao što je albumin iz humanog seruma); i kao što je ovde opisano može konkretno biti ISVD sa teškim lancem iz pronalaska. Pomenuti ISVD na protein iz seruma može biti na N-terminalnom kraju proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili molekula, i (ako protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul sadrži više od dva ISVD) u sredini molekula.
[0142] Pronalazak se dalje odnosi na takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul koji sadrži ili se suštinski sastoji od:
dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera), tj. (pomenuti) jedan pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (kao što je nanotelo) koji dodeljuje produženi poluživot i jedan drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (kao što je nanotelo) koji konkretno može biti usmeren na terapeutski agens; tri pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera), tj. (pomenuti) jedan pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (kao što je nanotelo) koji dodeljuje produženi poluživot i dva druga pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (kao što su dva druga nanotela) koji konkretno može biti usmeren na
4
terapeutski agens (u kome pomenuta dva druga pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina mogu biti usmereni na istu metu, na dve različite mete ili na dva različita epitopa na istoj meti); ili
četiri pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (povezana direktno ili putem pogodnog linkera), tj. (pomenuti) jedan pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (kao što je nanotelo) koji dodeljuje produženi poluživot i dva druga pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina (kao što su dva druga nanotela) koji konkretno mogu biti usmereni na terapeutski agens (u kome pomenuta tri druga pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina mogu biti usmereni na istu metu, na dve ii tri različite mete i/ili na dva ili tri različita epitopa na istoj meti).
[0143] Ponovo, u takvom proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili molekulu: (i) prisutni ISVD mogu biti isti ili različiti; i kada su različiti, mogu biti usmereni na istu metu (na primer, mogu imati različite sekvence i/ili biti usmereni na različite epitope na istoj meti) ili na dve ili više različitih drugih meta (tj. tako da je rezultujući protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili molekul bi- ili multispecifični konstrukt); i/ili (ii) ISDV prisutan na C-terminalnom kraju proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili molekula može ili ne mora biti ISVD iz pronalaska (ali poželjno jeste); i/ili (iii) kada je ISVD iz pronalaska prisutan na C-terminalnom kraju proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili molekula, on poželjno ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana; i/ili (iv) suštinski svi ISVD prisutni u proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili molekulu mogu biti ISVD iz pronalaska.
[0144] Pronalazak se dalje odnosi na postupke za ekspresiju/proizvodnju/izradu ISVD iz pronalaska i jedinjenja iz otkrića (kao što su ovde dalje opisani). Na primer, ISVD iz pronalaska može biti eksprimiran/proizveden pogodnom ekspresijom nukleinske kiseline koja ga kodira u pogodnom organizmu domaćinu. Pogledajte, na primer, WO 08/020079 (kao i neke od drugih patentnih prijava podnosioca zahteva/zastupnika koje su tu navedene), koje generalno opisuje pogodne postupke i tehnike za ekspresiju/proizvodnju nanotela, i ti postupci takođe mogu pogodno da se koriste za ekspresiju/proizvodnju nanotela iz pronalaska. Postupci za ekspresiju ISVD iz pronalaska koji nisu nanotela će takođe biti jasan stručnjaku na osnovu otkrića i stanja tehnike koje je tu navedeno. Jedinjenja iz otkrića mogu pogodno da budu izrađena/proizvedena pogodnim povezivanjem (obično putem kovalentne veze) jednog ili više ISVD iz pronalaska za jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (i/ili drugih grupa ili funkcionalnih ostataka) koji će biti prisutni u finalnom jedinjenju iz pronalaska, opciono preko jednog ili više linkera ili spejsera. Alternativno, kada je jedinjenje iz pronalaska protein ili polipeptid, ono može da bude izrađeno/proizvedeno pogodnom ekspresijom nukleinske kiseline koja ga kodira u pogodnom organizmu domaćinu. Ponovo se navode, na primer, opšti postupci opisani u WO 08/020079 i u nekim drugim patentnim prijavama podnosioca zahteva/zastupnika koje su tu navedene.
[0145] Otkriće se takođe odnosi na nukleotidnu sekvencu i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira ISVD iz pronalaska ili jedinjenje iz pronalaska. Takva nukleinska kiselina može biti DNK ili RNK, i poželjno je RNK, i može biti u obliku plazmida ili vektora. Ponovo se navodi, na primer, WO 08/020079 i neke druge patentne prijave podnosioca zahteva/zastupnika koje su tu navedene.
[0146] Pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje koje sadrži najmanje jedan ISVD iz pronalaska, jedinjenje iz pronalaska ili nukleinsku kiselinu koja ih kodira.
[0147] Otkriće se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ISV (i poželjno terapeutski ISV) ili protein ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan ISV (i poželjno najmanje jedan terapeutski ISV), pri čemu pomenuti ISV, protein ili polipeptid kao što je ovde dalje opisan (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, i posebno prema jednom ili više aspekata koji su opisani na prethodnim stranama; i konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koji je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata), i najmanje jedan pogodan nosač, razblaživač ili ekscipijens (tj. pogodan za farmaceutsku primenu), i opciono jednu ili više drugih aktivnih supstanci. Takve kompozicije, nosači, razblaživači ili ekscipijensi mogu, na primer, biti kao što je opisano u WO 08/020079 za farmaceutske kompozicije koje sadrže nanotelo ili protein ili polipeptid koji sadrži najmanje jedno nanotelo (i, kao što je već pomenuto, prema predmetnom pronalasku, ISV je takođe poželjno nanotelo).
[0148] Otkriće se dalje odnosi na ISV ili protein ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan ISV za primenu u lečenju bolesti kod čoveka (tj. pacijenta kome je takva terapija potrebna), pri čemu pomenuti ISV, protein ili polipeptid kao što je ovde dalje opisan (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, i posebno prema jednom ili više aspekata koji su opisani na prethodnim stranama; i konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koji je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).
[0149] Otkriće se dalje odnosi na primenu ISV ili proteina ili polipeptida koji sadrži najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutske kompozicije, pri čemu pomenuti ISV, protein ili polipeptid kao što je ovde dalje opisan (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, i posebno prema jednom ili više aspekata koji su opisani na prethodnim stranama; i konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koji je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).
[0150] Otkriće se dalje odnosi na postupak lečenja koji obuhvata primenu na humanom ispitaniku (npr. pacijentu kome je takvo lečenje potrebno) ISV ili proteina ili polipeptida koji sadrži najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutske kompozicije, pri čemu pomenuti ISV, protein ili polipeptid kao što je ovde dalje opisan (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više aspekata koji su ovde opisani, i posebno prema jednom ili više aspekata koji su opisani na prethodnim stranama; i konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koji je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata), ili farmaceutsku kompoziciju (kao što je gore opisana) koji sadrža najmanje jedan ISV, protein ili polipeptid.
[0151] S obzirom na gorepomenuto, biće jasno da je terapeutska primena ovde opisanih ISV, proteina i polipeptida veoma značajan aspekt pronalaska, jer takva terapeutska primena (ili klinički razvoj takvih ISV, proteina i polipeptida za takvu terapeutsku primenu) može da uključi upotrebu ADA testa da se odredi da li je pomenuti ISV, protein ili polipeptid imunogen (tj. može da stvori ADA kada se daje humanom ispitaniku). U vezi sa tim, takođe će biti jasno da pitanja o mogućoj imunogenosti moraju posebno da budu rešena kada se terapeutski agens koristi u dužim periodima (u trajanju od više nedelja, meseci ili godina), i/ili ima poluživot (poželjno izražen kao t1/2-beta) kod humanog ispitanika od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jednu nedelju, i do 10 dana ili više.
[0152] Tako, prema jednom specifičnom aspektu, pronalazak se odnosi na ISV, protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul kao što je ovde opisan (ili njegovu farmaceutsku kompoziciju) koja je namenjena za lečenje hronične bolesti kod čoveka, i/ili je takav ISV, protein, polipeptid kao što je ovde opisan namenjen da bude prisutan u krvotoku ispitanika (tj. na farmaceutski aktivnom nivou) kome se daje (tj. u terapeutski aktivnoj dozi) najmanje tokom jedne nedelje, poželjno najmanje dve nedelje, kao što je najmanje mesec dana; i/ili je takav ISV, protein, polipeptid kao što je ovde opisan takav da ima poluživot (poželjno izražen kao t1/2-beta) kod humanog ispitanika od najmanje 3 dana, kao što je najmanje nedelju dana, i do 10 dana ili više; i/ili je takav ISV, protein, polipeptid, ili farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisano namenjen za primenu na čoveku kao dve ili više doza koje se daju u periodu od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedna nedelja, na primer najmanje dve nedelje ili najmanje jedan mesec, ili duže (npr. najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci ili najmanje jednu godinu), ili se čak primenjuje hronično.
[0153] Takođe, kao što će biti jasno stručnjaku na osnovu ovog otkrića, ovde opisani poboljšani VH domeni će naći posebnu primenu kod proteina, polipeptida ili drugih jedinjenja ili molekula koji su namenjeni za primenu na humanim ispitanicima (a posebno pacijentima) čija krv/serum sadrže (ili se sumnja da sadrže) već postojeća antitela takve vrste koja, prema predmetnom pronalasku, nađena u uzorcima dobijenim od pacijenata koji imaju SLE, tj. već postojeća antitela koja mogu da se vežu za C-terminalni region VH domena čak u prisustvu C-terminalne ekstenzije kao što je ovde opisano. Konkretno, ovde opisana poboljšanja VH domena i rezultujući poboljšani VH domeni će naći posebnu primenu kod proteina, polipeptida ili drugih jedinjenja ili molekula koji su namenjenu za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja kod takvih pacijenata. To može biti bilo koja bolest ili poremećaj, ali može posebno biti bolest ili poremećaj koja ima za rezultat i/ili je povezana sa prisustvom ili nastajanjem takvih već postojećih antitela (jedan primer je SLE, ali je očekivano da drugi ozbiljni (auto)imunski poremećaji takođe mogu dovesti do već postojećih antitela. To može lako da se utvrdi ispitivanjem uzoraka dobijenih od relevantne populacije ispitanika na prisustvo takvih već postojećih antitela, suštinski na način analogan testovima obavljenim na uzorcima pacijenata sa SLE u Eksperimentalnom delu ispod).
[0154] Tako, prema jednom specifičnom aspektu, pronalazak se odnosi na ISV, koji je namenjen za primenu na humanom ispitaniku čija krv sadrži već postojeća antitela koja mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region VH domena čak i kada pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (ili gde je C-terminalni kraj VH domena povezan sa drugim proteinom ili polipeptidom, kao što je drugi ISV, opciono putem pogodnog linkera).
[0155] Konkretno, pronalazak se odnosi na ISV, protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul kao što je ovde opisan (ili njegovu farmaceutsku kompoziciju) koji je namenjen za primenu u lečenju bolesti ili poremećaja kod humanog ispitanika čija krv sadrži već postojeća antitela koja mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region VH domena čak i kada pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (ili gde je C-terminalni kraj VH domena povezan sa drugim proteinom ili polipeptidom, kao što je drugi ISV, opciono putem pogodnog linkera). Pomenuta bolest ili poremećaj može biti bilo koja bolest ili poremećaj, ali može posebno biti bolest ili poremećaj koji dovodi do, ili je na drugi način povezan sa prisustvom takvih već postojećih antitela u krvi takvog pacijenta, kao što je SLE ili druga (ozbiljna) autoimunska bolest.
[0156] Tako, prema specifičnijem aspektu, pronalazak se odnosi na ISV, protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul kao što je ovde opisan (ili njegovu farmaceutsku kompoziciju) za primenu u lečenju bolesti ili poremećaja kod humanog ispitanika/pacijenta, pri čemu je pomenuta bolest ili poremećaj, bolest ili poremećaj koji dovodi do, ili je na drugi način povezan sa prisustvom takvih već postojećih antitela u krvi takvog ispitanika/pacijenta koja mogu da se vežu za izloženi C-terminalni region VH domena čak i kada pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana (ili gde je C-terminalni kraj VH domena povezan sa drugim proteinom ili polipeptidom, kao što je drugi ISV, opciono putem pogodnog linkera). Na primer, takav ISV, protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul kao što je ovde opisan (ili njegova farmaceutska kompozicija) za primenu u lečenju SLE ili druge (ozbiljne) autoimunske bolesti kod humanog ispitanika/pacijenta.
[0157] Kao što će biti jasno stručnjaku, kada je protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul namenjen za prevenciju ili lečenje takve bolesti ili poremećaja, sadržaće najmanje jedan (kao što je jedan, dva, tri ili četiri) domen, vezujuću jedinicu ili funkcionalni ostatak ili entitet koji je terapeutski aktivan protiv relevantne bolesti ili poremećaja (npr. usmeren na cilj ili put koji je terapeutski relevantan za odgovarajuću bolest ili poremećaj). Ponovo, takvi vezujući domeni ili vezujuće jedinice mogu, na primer, biti (drugi) ISVD, i prema jednom aspektu mogu posebno biti ISVD iz pronalaska. Drugi opšti primer takvog proteina, polipeptida, jedinjenja ili molekula je protein, polipeptid, jedinjenje ili molekul u kome pomenuti jedan ili više terapeutskih domena, vezujućih jedinica ili funkcionalnih ostataka ili entiteta ne moraju biti ISDV (ali su, na primer, izvedeni iz druge strukture), ali koji sadrži ISVD iz pronalaska radi produženja njegovog poluživota (kao što je vezivač albumina iz seruma kao što je ovde opisan).
[0158] U daljem aspektu, ISVD iz pronalaska ili jedinjenja iz otkrića (kao što su ovde opisana) usmerena su prema jonskom kanalu Kv1.3. Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih ISVD ili jedinjenja su dati u Primeru 7, i ISVD prema Kv1.3. opisani u takvom primeru čine dalji aspekt predmetnog pronalaska, sve dok je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 L, i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V.
[0159] Na primer i bez ograničenja, jedinjenje iz pronalaska koje je usmereno prema Kv1.3 može da sadrži ili se suštinski sastoji od jednog ISVD, i poželjno nanotela, iz pronalaska koje je usmereno na Kv1.3 ili može da sadrži ili se suštinski sastoji od najmanje dva (kao što su dva ili tri) ISVD, i poželjno nanotela, iz pronalaska usmerena na Kv1.3. Kada takav polipeptid sadrži dva ili više ISVD iz pronalaska usmerena na Kv1.3, ti ISVD mogu biti isti ili različiti, i kada su različiti, mogu da budu usmereni na isti epitop na Kv1.3 ili podjedinici na Kv1.3 ili na različite epitope ili jedinice.
[0160] Ponovo, kao što je ovde uopšteno opisano za jedinjenja iz pronalaska, takva jedinjenja mogu pogodno da sadrže jedan ili više linkera, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (tj. kao što je ovde dalje opisana) i takođe mogu da sadrže jednu ili više dodatnih vezujućih jedinica ili vezujućih domena (ili druge aminokiselinske sekvence ili funkcionalne ostatke), kao što je dodatni ISVD usmeren na metu različitu od one za Kv1.3. Na primer i bez ograničenja, jedinjenje iz pronalaska može (takođe) da sadrži vezujući domen ili vezujuću jedinicu koja obezbeđuje produženi poluživot, kao što je ISVD na protein iz seruma kao što je albumin iz seruma (na primer, nanotelo na albumin iz humanog seruma, kao što je nanotelo iz pronalaska na albumin iz humanog seruma).
[0161] U daljim aspektima, pronalazak se odnosi na (sintetičke) biblioteke sekvenci varijabilnih domena imunoglobulina koje su kao što je definisano zahtevima (tj. sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije/supstitucije kao što su definisani zahtevima). Takve biblioteke obično sadrže najmanje 100 različitih sekvenci, kao što je najmanje 1000 različitih sekvenci, konkretno više od 10<5>različitih sekvenci, konkretnije više od 10<6>, kao što je 10<8>do 10<10>ili više različitih sekvenci (značenje u najširem smislu, sa najmanje jednom različitom aminokiselinom između sekvenci), obično sve sa (suštinski) istim sekvencama okvira (pri čemu pomenute sekvence okvira sadrže ovde navedene aminokiselinske ostatke/mutacije) i različitim CDR (što znači da svaka sekvenca u biblioteci ima najmanje „jednu različitu aminokiselinu“ u najmanje jednom od svojih CDR-a u poređenju sa drugim sekvencama u biblioteci).
[0162] Sintetičke biblioteke sekvenci pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina (na primer, na bazi humanih VH sekvenci ili VHH sekvenci izvedenih od kamelida) i postupci za njihovo stvaranje/konstruisanje (uključujući biblioteke na bazi prethodno određenih struktura i/ili koji sadrže jedan ili više specifičnih aminokiselinskih ostataka/mutacija u regionima okvira) poznate su u struci. Reference su, na primer, Tanha i sar., J. Biol. Chem., Vol.276, str.24774-24780, 2001; Bond i sar., J. Mol. Biol. (2003) 332, 643-655; Mandrup i sar., PLOS One, October 2013, Volume 8, Issue 10, e76834; Goldman i sar., Anal. Chem., 2006, 78, 8245-8255; Hussak i sar., Protein Engineering, Design & Selection vol.25 br.6 str.313-318, 2012; i Chen i sar., Methods Mol. Biol., 2009, 525, 81. Tehnike koje su u njima opisane (i slične poznate tehnike) mogu pogodno da se koriste ili prilagode za stvaranje biblioteka pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina prema pronalasku.
[0163] ISVD koji se nalaze u takvim bibliotekama mogu pogodno da sadrže svaki pogodni CDR iz svakog pogodnog izvora, kao što su CDR-i dobijeni/stvoreni polazeći od imunskog repertoara od „naivnog“ sisara (kao što je vrsta kamelida ili humane sekvence), CDR-i dobijeni/stvoreni polazeći od imunskog repertoara životinje (kao što je vrsta kamelida) koja je pogodno imunizovana antigenom; kompletno sintetički repertoar CDR; ili repertoar koji je dobijen tehnikama kao što je mutageneza (na primer, nasumična mutageneza ili mutageneza specifična za mesto). Takva biblioteka može, na primer, takođe biti biblioteka koja je stvorena tokom poznatih postupaka afinitetnog sazrevanja.
[0164] Regioni okvira u ISVD prisutnim u takvim bibliotekama mogu se pogodno izvesti iz svake pogodne polazne sekvence/strukture, na primer, na bazi strukture koji je izveden polazeći od VH sekvence (kao što je humana VH sekvenca) ili polazeći od sekvence nanotela (kao što je VHH sekvenca ili humanizovane VH sekvence). Takođe je moguće da biblioteka sadrži ISVD koji su dobijeni iz dva ili više različitih izvora ili su na bazi dva ili više različitih struktura (na primer, jer je biblioteka dobijena kombinovanjem dve ili više biblioteka dobijenih iz različitih izvora ili na bazi različitih struktura).
[0165] Takođe, biblioteke (ISVD prisutni u) mogu biti u obliku proteina ili u obliku DNK ili RNK koje kodiraju relevantni ISVD. Na primer, biblioteke mogu biti u obliku ekspresione biblioteke pogodne za pretraživanje i/ili tehnike selekcije, i mogu u tu svrhu, na primer, biti u obliku koji može biti prikazan koristeći pogodne tehnike prikaza kao što je biblioteka prikaza faga, biblioteka prikaza kvasaca ili biblioteka prikaza ribozoma.
1
[0166] Tako, uopšteno, pronalazak se takođe odnosi na biblioteke (kao što su ovde opisane) koje sadrže VH domene iz pronalaska (kao što su dalje opisani). Poželjno, prema jednom specifičnom aspektu takve biblioteke, prisutni VH domeni svi imaju iste (ili suštinski iste) sekvence okvira, ali različite sekvence CDR (ponovo, kao što je pomenuto, to znači da svaki od pomenutih VH domena u biblioteci ima najmanje jednu različitu aminokiselinu u najmanje jednom CDR-u u poređenju sa drugim VH domenima u biblioteci).
[0167] U jednom aspektu, takva biblioteka iz pronalaska je biblioteka ISVD iz pronalaska (kao što je ovde dalje opisano, uključujući biblioteku pogodnih nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenute ISVD) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je jedan od L, V ili K; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od T, V ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
u kome (i) aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od K ili Q; i/ili (ii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je T; i/ili (iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q; i (iv) u svim slučajevima (i) do (iii), aminokiselina na poziciji 11 je poželjno V. Opciono, ISVD prisutni u takvoj biblioteci takođe mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (kao što je ovde dalje opisana za VH domene iz pronalaska) i/ili pogodno sadrži pogodnu oznaku (kao što je histidinska oznaka).
[0168] U drugom aspektu, takva biblioteka iz pronalaska je biblioteka ISVD iz pronalaska (kao što je ovde dalje opisano, uključujući biblioteku pogodnih nukleinkih kiselina koje kodiraju pomenute ISVD) u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je jedan od L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
2
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q;
[0169] Opciono, ISVD prisutni u takvoj biblioteci takođe mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (kao što je ovde dalje opisana za VH domene iz pronalaska) i/ili pogodno sadrže pogodnu oznaku (kao što je histidinska oznaka).
[0170] Biblioteke iz pronalaska mogu da se koriste za svaku pogodnu/nameravanu svrhu koja je poznata. Na primer, one mogu, na primer, da se koriste za pretraživanje i/ili selekciju (ili kao deo postupka pretraživanja i/ili selekcije), da se koriste za/kao deo afinitetnog sazrevanja ili druge postupke nameravane da daju poboljšane VH domene, ili, na primer, skeniranje alanina. U praksi, obično, veličina, dizajn i druge karakteristike biblioteke će biti prilagođene njenoj nameravanoj upotrebi, što stručnjak može da izvede.
[0171] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika. ISVD opisani u primerima i slikama, u kojima je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 L i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V, kao što je definisano zahtevima iz pronalaska.
Slika 1 je tabela u kojoj se navode neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti posebno pomenute, i njihova numeracija prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT);
Slika 2 navodi sekvence koje se ovde pominju;
Slika 3 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 4 kada je 96 uzoraka seruma testirano na vezivanje reprezentativnog nanotela sa mutacijom S112K (referenca A S 112K C-terminalni alanin, naznačen kao (2) na Slici 3), u poređenju sa referentnim nanotelom bez mutacije S112K (referenca A, SEQ ID NO: 44, naznačeno kao (1) na Slici 3); Slika 4 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 4 kada je 129 uzoraka seruma testirano na vezivanje reprezentativnog nanotela sa mutacijom V89T (referenca A L11V V89T C-terminalni alanin, naznačen kao (2) na Slici 4), u poređenju sa referentnim nanotelom bez mutacije V89T (referenca A, SEQ ID NO: 44, naznačeno kao (1) na Slici 4); Slika 5 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 5 kada je 100 uzoraka seruma testirano na vezivanje reprezentativnog nanotela sa mutacijom V89L, T110K i/ili T110Q (referenca A L11V V89L C-terminalni alanin, naznačen kao (2) na Slici 5; referenca A L11V V89L T110K C-terminalni Ala, naznačen kao (3) na Slici 5; referenca A L11V V89L T110Q C-terminalni Ala, naznačen kao (4) na Slici (5) i referenca A L11V T87A V89L C-terminalni Ala, naznačen kao (5) na Slici 5), u poređenju sa referentnim nanotelom bez ijedne od ovih mutacija (referenca A, SEQ ID NO: 44, naznačeno kao (1) na Slici 5).
Slika 6 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 6 kada je 98 uzoraka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca testirano na vezivanje konstrukata reprezentativnog trovalentnog nanotela. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 98 uzoraka seruma. Legenda: (1) = referenca X (nanotelo A-35GS-nanotelo A-35GS-nanotelo B); (2) = referenca X C-terminalni Ala; (3) = referenca X L11V V89L C-terminalni Ala; (4) = referenca X L11V T87A V89L C-terminalni Ala; (5) = referenca X L11V V89L T110K C-terminalni Ala; (6) = referenca X L11V V89L T110Q C-terminalni Ala.
Slika 7 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 6 kada je 30 uzoraka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca (uzorci izabrani zbog visokog titra već postojećih antitela ili prisustva već postojećih antitela sa visokim stepenom vezivanja čak i u prisustvu ekstenzije C-terminalnog alanina) testirano na vezivanje konstrukata reprezentativnog trovalentnog nanotela. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 30 uzoraka seruma. Legenda: (1) = referenca X C-terminalni Ala; (2) = referenca X L11V V89L C-terminalni Ala; (4) = referenca X L11V T87A V89L C-terminalni Ala; (4) = referenca X L11V V89L T110K C-terminalni Ala.
Slika 8 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 6 kada je 98 uzoraka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca testirano na vezivanje konstrukata reprezentativnog dvovalentnog nanotela. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 30 uzoraka seruma. Legenda: (1) = referenca Y (nanotelo A-35GS-nanotelo B); (2) = referenca Y C-terminalni Ala; (3) = referenca Y L11V V89L C-terminalni Ala; (4) = referenca Y L11V T87A V89L C-terminalni Ala; (5) = referenca Y L11V V89L T110K C-terminalni Ala; (6) = referenca Y L11V V89L T110Q C-terminalni Ala;
Slike 9A i 9B prikazuju neograničavajuće primere jednovalentnih nanotela iz pronalaska (Slika 9A) i trovalentnih bispecifičnih jedinjenja sa produženim poluživotom iz pronalaska (Slika 9B) prema jonskom kanalu Kv1.3; i Slika 9C navodi neke poželjne CDR-e (klasifikacija prema Kabatu, odnosno Abm), za ISVD prema Kv1.3.
Slika 10 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 7 kada je 47 uzoraka seruma dobijenog od dijabetičnih humanih ispitanika testirano na vezivanje reprezentativnih
4
trovalentnih bispecifičnih jedinjenja sa produženim poluživotom prema Kv1.3. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 47 uzoraka seruma. SEQ ID NO se odnose na relevantne sekvence navedene na Slici 9;
Slika 11 je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 7 kada je 90 uzoraka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca testirano na vezivanje reprezentativnih trovalentnih bispecifičnih jedinjenja sa produženim poluživotom prema Kv1.3. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 47 uzoraka seruma. SEQ ID NO se odnose na relevantne sekvence navedene na Slici 9.
Slike 12A i 12B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na IL-23 koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 8;
Slike 13 navodi CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na OX40-L koji su na bazi naznačene referentne sekvence. Vidite i Primer 9;
Slike 14 navodi CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na IgE koji su na bazi naznačene referentne sekvence. Vidite i Primer 10;
Slike 15A i 15B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na CXCR-4 koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 11;
Slike 16A i 16B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na HER-3 koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 12;
Slike 17A i 17B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na TNF koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primere 13 i 14;
Slike 18A i 18B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na c-Met koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 15;
Slika 19 navodi CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na RANK-L koji su na bazi naznačene referentne sekvence. Vidite i Primer 16;
Slike 20A do 20C navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na CXCR-7 koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 17;
Slike 21A i 21B navode CDR-e i aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera nanotela iz pronalaska na A-beta koji su na bazi naznačenih referentnih sekvenci. Vidite i Primer 18;
Slika 22 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na IL-23;
Slika 23 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na OX40-L;
Slika 24 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na IgE;
Slika 25 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na CXCR-4;
Slika 26 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na HER-3;
Slika 27 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na TNF;
Slike 28A i 28B daju aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na c-Met;
Slika 29 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na RANK-L;
Slika 30 daje aminokiselinske sekvence nekih poželjnih, ali neograničavajućih primera jedinjenja iz pronalaska na A-beta;
Slika 31A je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 19 kada je 92 uzorka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca testirano na vezivanje reprezentativnih trovalentnih bispecifičnih jedinjenja sa produženim poluživotom na A-beta. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 92 uzoraka seruma. Referentni brojevi su kao što je prikazano u Tabeli CC-1. Slično tome, Slika 30B je dijagram koji prikazuje tačke sa podacima dobijene u Primeru 19 kada je 92 uzorka seruma dobijenog od zdravih dobrovoljaca testirano na vezivanje (jednovalentnih) C-terminalnih nanotela koja su prisutna u konstruktima ispitanim na Slici 31A. Svaka tačka predstavlja podatak prikupljen testiranjem naznačenih konstrukata u odnosu na jedan od 92 uzoraka seruma. Referentni brojevi su kao što je prikazano u Tabeli CC-2.
Eksperimentalni deo
[0172] Humani uzorci upotrebljeni u Eksperimentalnom delu u nastavku dobijeni su iz komercijalnih izvora ili od humanih dobrovoljaca (nakon dobijanja svih potrebnih saglasnosti i odobrenja) i korišćeni su u skladu sa važeći zakonskim i regulatornim zahtevima (uključujući, bez ograničenja, one koji se odnose na lekarsku tajnu i privatnost pacijenta)
[0173] U primerima u nastavku, vezivanje već postojećih antitela koja su prisutna u upotrebljenim uzorcima (tj. od zdravih dobrovoljaca, pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA) i pacijentima sa SLE) za testirana nanotela određeno je pomoću sistema ProteOn na sledeći način: Vezivanje već postojećih antitela za nanotela uhvaćena na albuminu iz humanog seruma (HSA) određeno je pomoću ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, pH 7,4, 0,005% Tween20) korišćen je kao radni pufer, i eksperimenti su obavljeni na 25°C. Trake liganda na GLC senzorskom čipu ProteOn aktivirane su pomoću (protok 30µl/min) i HSA je injektovan pri 10µg/ml i ProteOn acetatnom puferu pH 4,5 (protok 100 µl/min) da bi se dobio nivo imobilizacije od oko 3200 RU. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane pomoću etanolamin HCl (protok 30 µl/min). Nanotela su injektovana tokom 2 minuta na 45 µl/min preko površine HSA da se dobije nivo hvatanja nanotela od oko 200 RU. Uzorci koji sadrže već postojeća antitela su centrifugirani tokom 2 minuta na 14.000 o/min i supernatant je razblažen 1:10 u PBS-Tween20 (0,005%) pre nego što je injektovan tokom 2 minuta pri 45 µl/min, nakon čega je sledio korak disocijacije od 400 sekundi. Nakon svakog ciklusa (tj. pre hvatanja novog nanotela i koraka injektovanja uzorka krvi) površine HSA su regenerisane pomoću 2 minuta injektovanja HCl (100mM) pri 45 µl/min. Obrada senzorgrama i analiza podataka je izvedena pomoću uređaja ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzorgrami koji pokazuju vezivanje već postojećih antitela su dobijeni nakon dvostruke korekcije oduzimanjem 1) disocijacije nanotela-HSA i 2) nespecifičnog vezivanja za traku referentnog liganda. Nivoi vezivanja već postojećih antitela su određeni postavljanjem tački za izveštavanje na 125 sekundi (5 sekundi po završetku asocijacije). Procenat smanjenja vezivanja već postojećih antitela je izračunat u odnosu na nivoe vezivanja na 125 sekundi za referentno antitelo.
Primer 1: Mutacija S112K inhibira vezivanje već postojećih antitela
[0174] Uticaj supstitucije na poziciji 112 na vezivanje već postojećih antitela u humanim uzorcima za nanotela određen je i upoređen sa uticajem C-terminalne ekstenzije alanina, kao što je opisano u WO 12/175741.
[0175] Dva referentna jedinjenja (referenca A bez C-terminalne ekstenzije alanina i referenca B sa C-terminalnom ekstenzijom alanina) i varijante tih referentnih jedinjenja sa različiti mutacijama na poziciji 112 ispitana su na serumima šest različitih pacijenata sa RA i osam seruma dobijenih od različitih zdravih humanih ispitanika. Vezivanje već postojećih antitela u uzorcima za ispitana nanotela izmereno je na sistemu ProteOn prema opštom protokolu koji je gore prikazan. Rezultati su prikazani u Tabeli A ispod.
[0176] Kao što se vidi, od mutacija na poziciji 112 koje su ispitane, mutacija S112K je dala smanjenje vezivanja već postojećih antitela koja su bila prisutna u testiranim serumima koje je bilo uporedivo sa onim kod C-terminalne ekstenzije alanina (čak i bez C-terminalne ekstenzije alanina prisutne u varijanti S112K). Slični rezultati su dobijeni sa tri uzorka humane plazme (podaci nisu prikazani).
Tabela A: poređenje mutacija na poziciji 112 sa C-terminalnom ekstenzijom alanina na vezivanje već postojećih antitela prisutnih u serumu pacijenata sa RA i humanim dobrovoljcima
Primer 2: Uticaj mutacije S112K na vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima ljudi sa SLE
[0177] Iste varijante nanotela kao što su korišćene u Primeru 1 testirane su na vezivanje već postojećih antitela iz 7 uzoraka seruma dobijenih od pacijenata koji su potvrđeno pozitivni na sistemski eritemski lupus (SLE). Radi poređenja, uključeni su uzorci plazme dva zdrava dobrovoljca.
[0178] Vezivanje već postojećih antitela u uzorcima za ispitana nanotela izmereno je na sistemu ProteOn prema opštom protokolu koji je gore prikazan. Rezultati su prikazani u Tabeli B ispod.
[0179] Kao što se vidi na osnovu poređenja podataka vezivanja za referencu A i referencu B i nanotela iz pronalaska, uzorci dobijeni od nekih pacijenata sa SLE sadrže neka već postojeća antitela koja još uvek mogu da se vežu za nanotela čak i u prisustvu C-terminalnog ostatka alanina (C-terminalni ostatak alanina je suštinski sprečio/otklonio (delimično ili suštinski u potpunosti) svako vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima plazme zdravih dobrovoljaca).
[0180] Dalje se može videti da vezivanje tih već postojećih antitela iz uzoraka sa SLE može biti mnogo smanjeno mutacijama na poziciji 11 i 112 (a u slučaju pozicije 112, posebno S112K).
Tabela B: poređenje mutacija na poziciji 11 i 112 sa C-terminalnom ekstenzijom alanina na vezivanje već postojećih antitela prisutnih u serumu pacijenata sa SLE
Primer 3: Uticaj kombinovanih mutacija okvira i C-terminalnih ekstenzija na vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima ljudi sa SLE
[0181] Četiri različita nanotela (sa specifičnim mutacijama okvira i sa C-terminalnim ekstenzijama alanina ili bez njih) testirana su na vezivanje već postojećih antitela iz 5 uzoraka seruma dobijenih od pacijenata koji su potvrđeno pozitivni na sistemski eritemski lupus (SLE). Radi poređenja, uključen je jedan uzorak plazme zdravog humanog dobrovoljca.
[0182] Vezivanje već postojećih antitela u uzorcima za ispitana nanotela izmereno je na sistemu ProteOn prema opštom protokolu koji je gore prikazan. Rezultati su prikazani u Tabeli C i D ispod.
[0183] Kao što se vidi na osnovu poređenja podataka vezivanja za referencu A i referencu B, uzorci dobijeni od pacijenata sa SLE sadrže neka već postojeća antitela koja još uvek mogu da se vežu za nanotela čak i u prisustvu C-terminalnog ostatka alanina (C-terminalni ostatak alanina je suštinski sprečio/otklonio svako vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima plazme zdravog dobrovoljca).
[0184] Dalje se može videti da vezivanje tih već postojećih antitela iz uzoraka sa SLE može biti mnogo smanjeno mutacijama na poziciji 11 i 112 (a u slučaju pozicije 112, posebno S112K).
Primer 4: uticaj mutacije V89T na vezivanje već postojećih antitela u uzorcima pacijenata sa SLE.
[0185] Kao što je ovde opisano, uzorci dobijeni od nekih pacijenata sa SLE sadrže već postojeća antitela koja mogu da se vežu za izloženi C-terminalni kraj VH domena, čak i kada je prisutna C-terminalna ekstenzija. Ispitivano je da li mutacija V89T može da smanji ili spreči/otkloni takvo vezivanje, u prisustvu ili bez prisustva C-terminalne ekstenzije. Rezultati su takođe prikazani u Tabeli C i E ispod.
[0186] Kao što se vidi, mutacija V89T suštinski može da smanji ili spreči/otkloni vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima dobijenim od pacijenata sa SLE, u sličnoj meri kao mutacija S112K. Međutim, kao što se vidi iz poređenja podataka datih u Tabeli C i E za nanotela sa mutacijom V89T bez C-terminalne ekstenzije sa sličnim nanotelima sa mutacijom S112K i bez C-terminalne ekstenzije, mutacija na poziciji 112 u nanotelu bez C-terminalne ekstenzije generalno smanjuje vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima dobijenim od zdravog dobrovoljca u većoj meri nego mutacija V89T (tj. 100%, 85% i 64% S112K nanotela u odnosu na 9%, 11% i 16% za V89T nanotela, tim redosledom). Iz tog razloga, upotreba mutacije na poziciji 112 (i posebno S112K ili S112K) često će biti poželjnije od upotrebe mutacije na poziciji 89 (kao što je V89T).
[0187] Međutim, kao što se takođe može videti iz podataka u Tabeli C i D, dodavanje C-terminalnog alanina na V89T nanotelo u potpunosti sprečava/otklanja vezivanje već postojećih antitela prisutnih u uzorcima dobijenim od zdravog dobrovoljca, i iz tog razloga će obično biti poželjna kombinacija mutacije V89T i C-terminalne ekstenzije kao što je ovde opisana (tj. u odnosu na upotrebu V89T bez C-terminalne ekstenzije) ako V89T nanotelo ili VH domen ima, ili je nameravano da ima, izložen C-terminalni region u proteinu ili polipeptidu u kome će biti prisutan (na primer, jer formira njegov C-terminalni kraj).
1
�
�
[0188] Da bi se potvrdilo da su rezultati/nalazi iz gornje tabele široko primenljivi, reprezentativna nanotela sa mutacijama S112K i/ili V89T su ispitana u odnosu na test panel sa 96 (S112k) i 129 (V89T) uzoraka humanog seruma. Vezivanje je određeno na sistemu ProteOn prema protokolu naznačenom iznad.
[0189] Rezultati su sažeti na Slici 3 i u Tabeli F (reprezentativno nanotelo sa mutacijom S112K) i na Slici 4 i u Tabeli G (reprezentativno nanotelo sa mutacijom V89T).
[0190] Na Slici 3, nanotelo sa mutacijom S112K (referenca A S112K C-terminalni alanin - vidi Tabelu C iznad) upoređeno je sa referentnim nanotelom (referenca A; SEQ ID NO:44). Nanotelo sa mutacijom S112K i referenca A su ispitani u odnosu na svaki od uzoraka seruma, i određen je nivo vezivanja na 125 sekundi (RU). Podaci su zatim prikazani na Slici 3, gde svaka tačka predstavlja vezivanje izmereno u jednom uzorku za referencu A (naznačena kao (1) na Slici 3) ili za mutant S112K (naznačen kao (2) na Slici 3). Tačkasta linija označava izmereni nivo vezivanja od 20 RU.
[0191] Isti podaci su takođe prikazani numerički u Tabeli F, u kojoj se pominje za referencu A, odnosno mutant S112K, ukupan broj ispitanih uzoraka koji daje nivo vezivanja na 125 sekundi od više od 20 RU, manje od 20 RU (tj. od 0 do 20 RU) i manje od 10 RU.
[0192] Kao što se vidi iz podataka predstavljenih na Slici 3 i prikazanih u Tabeli F, za referencu A, više od polovine od 96 ispitanih uzoraka dali su nivo vezivanja od više od 20 RU (u nekim slučajevima, čak 150-200 RU), što ukazuje da se već postojeća antitela prisutna u uzorku vezuju za referencu A. Poređenja radi, kod mutanta S112K, nijedan uzorak nije dao nivo vezivanja veći od 20 RU (a većina manje od 10 RU), što ukazuje da mutacija S122K suštinski može da smanji/spreči vezivanje već postojećih antitela kod svih 96 testiranih uzoraka.
[0193] Sličan prikaz i slični podaci su prikazani na Slici 4, odnosno u Tabeli G, za reprezentativno nanotelo sa mutacijom V89T (referenca A L11V V89T C-terminalni alanin; vidi Tabelu E iznad), ispitano u odnosu na 129 uzoraka seruma i ponovo upoređeno sa referencom A (označena kao (1) na Slici 4; mutant V89T je označen kao (2) na Slici 4). Ponovo, iz prikaza na Slici 4 i podataka u Tabeli G, vidi se da je, uz nekoliko izuzetaka (tj. manje od 10% ispitanih uzoraka, od kojih je onda svaki dao apsolutnu vrednost vezivanja nakon 125 sekundi od oko 100 RU ili manje), mutacija V89T mogla da smanji/spreči vezivanje već postojećih antitela u većini od 129 ispitanih uzoraka, pri čemu je referenca bez mutacija V89T vezana od strane već postojećih antitela u većini ispitanih uzoraka.
Tabela F: ispitivanje reprezentativnog nanotela sa mutacijom S112K u odnosu na 96 uzoraka iz seruma.
Ispitivano nanotelo Nivo vezivanja na Nivo vezivanja na Nivo vezivanja na 125 sekundi < 10 125 sekundi < 20 125 sekundi > 20
Tabela G: ispitivanje mutantnih nanotela sa mutacijom V89L i/ili T100K/Q u odnosu na 129 uzoraka iz seruma.
Ispitivano nanotelo Nivo vezivanja na Nivo vezivanja na Nivo vezivanja na 125 sekundi < 10 125 sekundi < 20 125 sekundi > 20
Primer 5: uticaj mutacije V89L kombinovane sa mutacijom T110K ili T110Q na vezivanje već postojećih antitela u uzorcima pacijenata sa SLE.
[0194] Kao što je ovde opisano, uzorci dobijeni od nekih pacijenata sa SLE sadrže već postojeća antitela koja mogu da se vežu za izloženi C-terminalni kraj VH domena, čak i kada je prisutna C-terminalna ekstenzija. Ispitivano je da li mutacija V89L i/ili T110Q ili T110K (ili njihova kombinacija) može da smanji ili spreči/otkloni takvo vezivanje, u prisustvu ili bez prisustva C-terminalne ekstenzije. Rezultati su takođe prikazani u Tabelama H i I, koje predstavljaju podatke dva odvojena eksperimenta (Tabela D iznad takođe prikazuje podatke za mutaciju S112Q iz otkrića kombinovanu sa mutacijom V89L). Nanotela korišćena u Tabeli I su takođe korišćena za generisanje podataka prikazanih na Slici 5 i Tabeli J.
[0195] Da bi se potvrdilo da su rezultati/nalazi iz gornje tabele široko primenljivi, reprezentativna nanotela sa mutacijama V89L, T110K i/ili T110Q ponovo su ispitana u odnosu na test panel sa 99 uzoraka humanog seruma. Podaci vezivanja su ponovo dobijeni i prikazani kao što je naznačeno u Primeru 4 za rezultate i podatke prikazane na Slici 3 i 4 i Tabeli F i G.
[0196] Ispitana nanotela su bila (brojevi odgovaraju numeraciji korišćenoj na Slici 5): (1) Referenca A; (2) Referenca A L11V V89L C-terminalni Ala; (3) Referenca A L11V V89L T110K C-terminalni Ala; (4) Referenca A L11V V89L T110Q C-terminalni Ala; (5) Referenca A L11V T87A V89L C-terminalni Ala. Rezultati su prikazani na Slici 5 i u Tabeli I.
[0197] Kao što se može videti, uvođenje ispitivanih mutacija je ponovo jako smanjilo broj uzoraka u kojima su već postojeća antitela mogla da vežu ispitivana nanotela. Takođe se vidi da, kod nanotela (2) na Slici 5 (referenca A L11V V89L C-terminalni Ala), neki uzorci još uvek pokazuju vezivanje već postojećih antitela nakon 125 sekundi na nivou većem od 20 RU (ali već mnogo manjem od 100 RU). Međutim, kada je mutacija V89L kombinovana sa mutacijom T110K (nanotelo (3)) ili mutacijom T100Q (nanotelo (4)), onda je suštinski svih 99 uzoraka pokazalo nivo vezivanja manji od 20 RU (i zapravo, manji od 10 RU, vidi Tabelu J).
Tabela J: ispitivanje reprezentativnih nanotela sa mutacijom V89L, T110K i/ili T110Q u odnosu na 99 uzoraka iz seruma.
Ispitivano nanotelo Nivo vezivanja Nivo vezivanja Nivo vezivanja na 125 sekundi < na 125 sekundi < na 125 sekundi >
Primer 6: ispitivanje polivalentnih konstrukata za vezivanje već postojećih antitela
[0198] Napravljeni su polivalentni konstrukti na bazi sledećih nanotela:
Nanotelo A (usmereno na terapeutski cilj):
Nanotelo B (usmereno na albumin iz seruma):
Nanotelo C (usmereno na terapeutski cilj):
[0199] Napravljeni konstrukti su navedeni u Tabeli K ispod (u svakom slučaju, uvedena supstitucija (supstitucije) u relevantnom nanotelu (ako postoji) pomenuta je u zagradi. „HIS6“ označava N-terminalnu his oznaku 6 ostataka histidina, a „-Ala“ označava C-terminalnu ekstenziju 1 ostatka alanina).
Tabela K: ispitivani polivalentni konstrukti
1
o o -
11
12
[0200] Reprezentativni polivalentni konstrukti su ispitani na vezivanje od strane već postojećih antitela koja su prisutna u uzorcima krvi ili seruma dobijenim od pacijenata sa SLE i zdravih dobrovoljaca. U oba slučaja je za određivanje korišćen ProteOn, suštinski kako je gore opisano.
[0201] Ispitivani reprezentativni polivalentni konstrukti su navedeni u Tabeli L (trovalentni konstrukti) i M (dvovalentni konstrukti), i rezultati su prikazani na Slikama 6-8 i u Tabelama N-Q. Ispitivani trovalentni konstrukti su dobijeni od referentnog konstrukta Nanotelo A-35GS-Nanotelo A-35GS-Nanotelo B („referenca X“) a dvovalentni konstrukti su dobijeni od referentnog konstrukta Nanotelo A-35GS- Nanotelo B („referenca X“). Svi konstrukti (osim referentnih konstrukata) su imali, naznačeno je, C-terminalni ostatak alanina kao i, u svakom gradivnom elementu od „Nanotela A“ i „Nanotela B“, naznačene mutacije.
1
�� Tabela N: rezultati ispitivanja trovalentnih konstrukata za vezivanje od strane već postojećih antitela prisutnih u 98 uzoraka seruma dobijenih od zdravih humanih dobrovoljaca. Rezultati su takođe prikazani na Slici 6 kao prikaz u kome svaka tačka predstavlja tačku sa podacima prikupljenim ispitivanjem navedenih konstrukata u odnosu na jedan od 98 uzoraka seruma.
Tabela O: rezultati ispitivanja trovalentnih konstrukata za vezivanje od strane već postojećih antitela prisutnih u 30 odabranih uzoraka seruma dobijenih od zdravih humanih dobrovoljaca. 30 upotrebljenih uzoraka je prvo odabrano na osnovu toga što
1
dokazano imaju visok titar već postojećih antitela, ili zato što je poznato da već postojeća antitela prisutna u uzorku još uvek imaju visok stepen vezivanja čak i ako je prisutan C-terminalni ostatak alanina. Rezultati su takođe prikazani na Slici 7 kao prikaz u kome svaka tačka predstavlja tačku sa podacima prikupljenim ispitivanjem navedenih konstrukata u odnosu na jedan od odabranih 30 uzoraka seruma.
Tabel a P: rezultati ispitivanja dvovalentnih konstrukata za vezivanje od strane već postojećih antitela prisutnih u 98 uzoraka seruma dobijenih od zdravih humanih dobrovoljaca. Rezultati su takođe prikazani na Slici 8 kao prikaz u kome svaka tačka predstavlja tačku sa podacima prikupljenim ispitivanjem navedenih konstrukata u odnosu na jedan od 98 uzoraka seruma.
1
[0202] Tri reprezentativna trovalentna konstrukta su takođe ispitana u odnosu na uzorke seruma dobijene od pacijenata sa SLE. Rezultati su prikazani u Tabeli Q.
1
Primer 7: Nanotela i konstrukti nanotela usmerena na jonski kanal Kv1.3.
1
[0203] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska (i konkretnije, nanotela iz pronalaska) i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na jonski kanal Kv.1.3.
[0204] Privremena zavisna prijava u SAD USSN 62/014,023 (naslov: "Kv1.3 binding immunoglobulins"; podnosilac prijave: Ablynx N.V.; datum ponošenja: 18. jun 2014.) kao i nakon toga podneta privremena prijava u SAD istog naslova podneta 16. marta 2015. (podnosilac prijave: Ablynx N.V.) između ostalog opisuje pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina (a posebno nanotela) koji su usmereni na jonski kanal Kv1.3 selektivan prema kalijumu, gejtovan naponom, kao i proteine, polipeptide i druge konstrukte na bazi nanotela koji sadrže najmanje jedno takvo nanotelo usmereno na Kv1.3.
[0205] Mutacija opisana u predmetnoj aplikaciji (opciono pogodno kombinovana sa C-terminalnom ekstenzijom kao što je ovde opisana i/ili u WO 12/175741) takođe mogu pogodno biti primenjeni na nanotela, proteine, polipeptide i druge konstrukte na bazi nanotela usmerene na Kv1.3 koji su opisani u ove dve patentne prijave za SAD.
[0206] Tako, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na VH domen koji je usmeren na Kv1.3 i koji je ovde dalje opisan za ISVD iz pronalaska (tj. sadrži aminokiselinske ostatke/mutacije kao što su definisani zahtevima).
[0207] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na Kv1.3 opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspektu/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst zahteva drugačije.
[0208] U konkretnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na VH domen koji je usmeren na Kv1.3, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima na Kv1.3:
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0209] ISVD na Kv1.3 pomenuti u ovom primeru mogu konkretno da imaju CDR-e koji su kao što je opisano na stranama 5-10 USSN 62/014,023 (uključujući sve poželjne aspekte/otelotvorenja takvih CDR-a) ili njihove verzije sa optimizovanim sekvencama, kao što je opisano u drugim patentnim prijavama pomenutim iznad.
[0210] Posebno, ISVD na Kv 1.3 koji se pominju u ovom primeru mogu posebno da imaju kombinaciju CDR1, CDR2 i CDR3 koja je odabrana od jedne od kombinacija CDR1, CDR2 i CDR3 navedenih kao poželjni aspekti na spisku na stranama 9 i 10 USSN 62/014,023.
[0211] U nekim poželjnim, ali neograničavajućim aspektima pronalazaka:
u ISVD iz pronalaska: (i) CDR1 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:166 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:166; (ii) CDR2 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:167 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:167; i (iii) CDR3 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:168 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:168; i čak poželjnije: (i) CDR1 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:166; (ii) CDR2 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:167; i (iii) CDR3 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:168; i/ili u ISVD iz pronalaska: (i) CDR1 (prema Abm-u) je sekvenca SED ID NO:169 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:169; (ii) CDR2 (prema Abm-u) je sekvenca SED ID NO:170 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:170;
11
i (iii) CDR3 (prema Abm-u) je sekvenca SED ID NO:171 ili aminokiselinska sekvenca koja ima jednu ili dve različite aminokiseline u odnosu na sekvencu SEQ ID NO:171; i čak poželjnije: (i) CDR1 (prema Abm-u) je sekvenca SED ID NO:169; (ii) CDR2 (prema Abm-u) je sekvenca SED ID NO:170; i (iii) CDR3 (prema Kabatu) je sekvenca SED ID NO:178.
[0212] VH domen iz pronalaska usmeren na Kv1.3 je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na Kv1.3. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0213] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0214] Na primer, i bez ograničenja, ISVD iz pronalaska usmereni na Kv1.3 može biti jedna od sekvenci navedenih u Tabeli A-1 USSN 62/014,023 (SEQ ID NO: 1 do 123 u USSN 62/014,023) ili jedna od sekvenci navedenih u Tabeli A-1 US privremene patentne prijave pod nazivom „Kv1.3 binding immunoglobulins“ (podnosilac prijave: Ablynx N.V.; datum ponošenja: 16. mart 2015.) (SEQ ID NO: 1 do 123, 495, 498 do 513 ili 523 do 540 u pomenutoj US privremenoj prijavi; i posebno sekvenca SEQ ID NO: 495), ali pogodno sa mutacijama/specifičnim aminokiselinskim ostacima ovde opisanim za ISVD iz pronalaska, i opciono takođe sa C-terminalnom ekstenzijom.
[0215] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz pronalaska usmereno na Kv1.3 je varijanta nanotela iz SEQ ID NO:137 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:137), u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0216] Neki posebno poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na Kv1.3 i jedinjenja iz otkrića koja ih sadrže navedeni su na Slici 9A (jednovalentna nanotela: SEQ ID NO: 138 do 155) i Slici 9B (trovalentni bispecifični konstrukti sa produženim poluživotom: SEQ ID NO: 156 do 164). Jedinjenja koja sadrže ili se suštinski sastoje od najmanje jednog (kao što su jedno, dva ili tri) anti-Kv1.3 nanotela izabranog od anti-Kv1.3 nanotela SEQ ID NO: 138 do 155 čine dalji aspekt otkrića. Takođe, svako od jedinjenja SEQ ID NO: 156 do 164 čini dalji aspekt otkrića. U jednom specifičnom aspektu, takva jedinjenja sadrže dva takva nanotela iz pronalaska usmerena na Kv1.3 i jedno nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma (koje je poželjno takođe nanotelo iz pronalaska). Takođe, ponovo, takav konstrukt može da sadrži pogodne linkere i C-terminalnu ekstenziju.
[0217] Jednovalentna anti-Kv1.3 nanotela SEQ ID NO: 138 do 155 stvorena su uvođenjem mutacija L11V i V89L iz pronalaska u početnu sekvencu SEQ ID NO: 137 (referenca). Pored toga, uvedene su različite kombinacije humanizujućih mutacija (ili drugih mutacija za optimizaciju sekvence), poput E1D, A14P, G19R, M53A ili M53Q ili M53Y, T62S, A74S, K83R, S94G i/ili T97E). Specifične mutacije uvedene u svaku od sekvenci SEQ ID NO: 138 do 155 date su na Slici 9A.
[0218] Neka od jednovalentnih anti-Kv .3 nanotela sa Slike 9A takođe su formatirana kao trovalentni bispecifični konstrukti koji sadrže dva nanotela iz pronalaska usmerena na Kv1.3 i jedno nanotelo iz pronalaska koje produžava poluživot usmereno na albumin iz humanog seruma (SEQ ID NO:109, naziva se i „ALB-82“ na Slici 9B). Korišćeni su 35GS linkeri i svi konstrukti imaju C-terminalnu ekstenziju (jedan C-terminalni ostatak alanina). Sekvence dobijenih konstrukata su date u SEQ ID NO 156 do 164. Od toga, tri konstrukta (SEQ ID NO: 156, 157 i 160) su testirana za vezivanje od strane već postojećih antitela u uzorcima dobijenim od 47 ljudskih ispitanika sa dijabetesom i 90 zdravih ljudskih ispitanika, koristeći opšti protokol koji je ovde opisan. Vezivanje od strane već postojećih antitela iz ova dva skupa upoređeno je sa referentnim konstruktom SEQ ID NO:165, koji je odgovarajući trovalentni bispecifični konstrukt na bazi gradivnog elementa referentnog anti-KV1.3 vezivnog bloka SEQ ID NO:137 i vezivača albumina iz seruma Alb-8 (SEQ ID NO:46), ponovo u kombinaciji sa C-terminalnom ekstenzijom alanina. Rezultati su prikazani na Slici 10 (uzorci od 47 pacijenata sa dijabetesom) i Slici 11 (uzorci od 90 zdravih volontera). U svakom slučaju, konstrukti sa mutacijama L11V i V89L iz pronalaska pokazali su smanjeno vezivanje od strane već postojećih antitela u poređenju sa referentnim konstruktom.
Primer 8: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na IL-23, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0219] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz opisa mogu biti usmerena na IL-23.
[0220] ISVD iz pronalaska usmeren na IL-23 uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju VH domenu iz pronalaska da se specifično vezuje za IL-23. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na IL-23 može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kome je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0221] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na IL-23 opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0222] U konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na IL-23, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v)
11
pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na IL-23:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0223] VH domen iz pronalaska usmeren na IL-23 je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na IL-23. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0224] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0225] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmeren na IL-23 sadrži (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 173 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 173; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 174 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 174; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 175 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 175.
[0226] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na IL-23 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO:173; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 174; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 175.
[0227] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na IL-23 je varijanta nanotela iz SEQ ID NO:172 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence, sa SEQ ID NO:172), u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0228] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na IL-23 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 191 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 191; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 192 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 192; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 193 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 193.
[0229] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na IL-23 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 191; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 192; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 193.
11
[0230] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na IL-23 je varijanta nanotela iz SEQ ID NO:172 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence, sa SEQ ID NO:190), u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0231] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri takvih nanotela iz pronalaska usmerenih na IL-23 navedeni su na Slici 12A kao SEQ ID NO: 183 do 185, odnosno Slici 12B kao SEQ ID NO: 201 do 203; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0232] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na IL-23 koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 183 do 185 i/ili 201 do 203. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na IL-23 mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako, na primer, mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisana, i mogu da imaju produženi poluživot (na primer, zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli R ispod.
[0233] Kao što je opisano, na primer, u WO 2009/068627, WO 2010/142534 i WO2011/135026, posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na IL-23 su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na IL-23 je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 172 ili (poželjno) ISV iz otkrića koji je dobijen od SEQ ID NO:172 (kao što je opisano u ovom
11
Primeru 8) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 190 ili (poželjno) ISV iz otkrića koji je dobijen od SEQ ID NO: 190 (kao što je opisano u ovom Primeru 8), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz otkrića. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma). Neki specifični primeri takvih biparatopnih konstrukata dati su u SEQ ID NO: 514 do 549.
[0234] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na IL-23 dati su na Slici 22 kao SEQ ID NO: 514 do 549; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na IL-23 i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 514 do 549. Uopštenije, jedinjenja usmerena na IL-23 mogu da budu kao što je opisano u WO 2009/068627, WO 2010/142534 i WO2011/135026, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2009/068627, WO 2010/142534 i WO2011/135026.
Tabela R: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na IL-23.
Poli e tid/konstrukt<1>O šta formula Gradivni elementi ISV i
11
11
11 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
12
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Legenda:
P
-o
-
N
( „ I
( „ I
d i „ n š I
U
p I
T
t p
( z u
( n l
12
Primer 9: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na OX40-L, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0235] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz opisa mogu biti usmerena na OX40-L.
[0236] ISVD iz pronalaska usmeren na OX40-L uopšteno će sadržati: (i) pogodne sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako je definisano zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju VH domenu iz pronalaska da se specifično vezuje za OX40-L. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na OX40-L može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili formira C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kome je pomenuti ISVD prisutan (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0237] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na OX40-L opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0238] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na OX40-L, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na OX40-L:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0239] VH domen iz pronalaska usmeren na OX40-L je ISVD (a konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na OX40-L. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0240] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0241] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na OX40-L sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 209 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 209; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 210 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 210; i
12
(iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 211 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 211.
[0242] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na OX40-L prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO:209; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 210; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 211.
[0243] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na OX40-L je varijanta nanotela iz SEQ ID NO:208 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence, sa SEQ ID NO:208), u kome:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0244] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na OX40-L nabrojani su na Slici 13 kao SEQ ID NO: 219 do 221; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0245] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na OX40-L koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 219 do 221. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na OX40-L mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli S ispod.
12
[0246] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na OX40-L dati su na Slici 23 kao SEQ ID NO: 550 do 585; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na OX40-L i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 550 do 585. Uopštenije, jedinjenja usmerena na OX40-L mogu da budu kao što je opisano u WO 2011/073180, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2011/073180.
Tabela S: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na OX40-L.
12
12
12
1
11
- [SA] je ISV usmeren na albumin iz (humanog) seruma, poželjno ISV iz pronalaska usmeren na albumin iz (humanog) seruma, poželjnije jedna od SEQ ID NO: 46 ili 61 ili još poželjnije jedan od ISVD iz pronalaska SEQ ID NO: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 ili 496 do 513.
1 2
1
Primer 10: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na IgE, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0247] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz otkrića mogu biti usmerena na IgE.
[0248] ISVD iz pronalaska usmeren na IgE uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju VH domenu iz pronalaska da se specifično vezuje za IgE. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na IgE može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni VH domen (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0249] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na IgE opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute
1 4
specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0250] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na IgE, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na IgE:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0251] VH domen iz pronalaska usmeren na IgE je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na IgE. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0252] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
1
[0253] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na IgE sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 227 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 227; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 228 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 228; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 229 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 229.
[0254] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na IgE prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 227; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 228; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 229.
[0255] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na IgE je varijanta nanotela SEQ ID NO: 226 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 226), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0256] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na IgE nabrojani su na Slici 14 kao SEQ ID NO: 237 do 239; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0257] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na IgE koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 237 do 239. Takva jedinjenja iz
1
otkrića usmerena na IgE mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli T ispod.
[0258] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na IgE dati su na Slici 24 kao SEQ ID NO: 586 do 594; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na IgE i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 586 do 594.
[0259] Uopštenije, jedinjenja usmerena na IgE mogu da budu kao što je opisano u WO 2012/175740 i relevantnim delovima WO2012/175400, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2012/175740.
Tabela T: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na IgE.
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
1
1 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
14
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Primer 11: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na CXCR4, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0260] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz otkrića mogu biti usmerena na CXCR4.
[0261] ISVD iz pronalaska usmeren na CXCR4 uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se
14
specifično vezuje za CXCR4. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na CXCR4 može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kome je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0262] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na CXCR4 opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0263] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na CXCR4, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na CXCR4:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0264] VH domen iz pronalaska usmeren na CXCR4 je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na CXCR4. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0265] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0266] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na CXCR4 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 245 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 245; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 246 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 246; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 247 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 247.
[0267] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na CXCR4 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 245; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 246; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 247.
[0268] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na CXCR4 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 244 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 244), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i
14
pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0269] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na CXCR4 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 263 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 263; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 264 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 264; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 265 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 265.
[0270] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na CXCR-4 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 263; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 264; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 265.
[0271] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na IL-23 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 262 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 262), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0272] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na CXCR4 nabrojani su na Slici 15A kao SEQ ID NO: 255 do 257, i Slici 15B kao SEQ ID NO: 273 do 275; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
14
[0273] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na CXCR4 koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 255 do 257 i/ili 273 do 275. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na CXCR4 mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli U ispod.
[0274] Kao što je opisano u, na primer WO 2009/138519, WO 2011/042398 i WO 2011/161266, jedna posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na CXCR4 su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na CXCR4 je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 244 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 244 (kao što je opisano u ovom Primeru 11) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 262 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 262 (kao što je opisano u ovom Primeru 11), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz pronalaska. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma). Neki specifični primeri takvih biparatopnih konstrukata dati su u SEQ ID NO: 595 do 603.
[0275] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na CXCR-4 dati su na Slici 25 kao SEQ ID NO: 595 do 603; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na CXCR-4 i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 595 do 603. Uopštenije, jedinjenja usmerena na CXCR-4 mogu da budu kao što je opisano u WO 2009/138519, WO 2011/042398 i WO 2011/161266WO 2011/144749, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2009/138519, WO 2011/042398 i WO 2011/161266.
Tabela U: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na CXCR-4.
14
14
14
1
11
12
1
14
Primer 12: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na HER-3, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0276] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz otkrića mogu biti usmerena na HER-3.
[0277] ISVD iz pronalaska usmeren na HER-3 uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se specifično vezuje za HER-3. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na HER-3 može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0278] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na HER-3 opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0279] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na HER-3, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na HER-3:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0280] VH domen iz pronalaska usmeren na HER-3 je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na HER-3. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0281] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0282] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na HER-3 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 281 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 281; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 282 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 282; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 283 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 283.
1
[0283] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na HER-3 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 281; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 282; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 283.
[0284] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na HER-3 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 280 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 280), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0285] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na HER-3 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 299 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 299; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 300 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 300; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 301 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 301.
[0286] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na HER-3 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 299; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 300; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 301.
[0287] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na HER-3 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 298 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 298), u kojoj:
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0288] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na HER-3 nabrojani su na Slici 16A kao SEQ ID NO: 291 do 293, odnosno Slici 16B kao SEQ ID NO: 309 do 311; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0289] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na HER-3 koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 291 do 293 i/ili 309 do 311. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na HER-3 mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli V ispod.
[0290] Kao što je opisano u, na primer WO 2011/144749, jedna posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na HER-3 su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na HER-3 je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 280 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 280 (kao što je opisano u ovom Primeru 12) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 298 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 298 (kao što je opisano u ovom Primeru 12), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz pronalaska. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi
1
poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma). Neki specifični primeri takvih biparatopnih konstrukata dati su u SEQ ID NO: 604 do 639.
[0291] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na HER-3 dati su na Slici 26 kao SEQ ID NO: 604 do 639; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na HER-3 i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 604 do 639. Uopštenije, jedinjenja usmerena na HER-3 mogu da budu kao što je opisano u WO 2011/144749, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2011/144749.
Tabela V: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na HER-3.
1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1 1
12 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
14
1
Primer 13: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na TNF, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0292] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na TNF.
[0293] ISVD iz pronalaska usmeren na TNF uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se specifično vezuje za TNF. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na TNF može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0294] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na TNF opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0295] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na TNF, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na TNF:
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0296] VH domen iz pronalaska usmeren na TNF je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na TNF. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0297] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0298] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na TNF sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 317 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 317; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 318 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 318; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 319 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 319.
1
[0299] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na TNF prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 317; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 318; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 319.
[0300] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na TNF je varijanta nanotela SEQ ID NO: 316 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 316), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0301] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na TNF nabrojani su na Slici 17A kao SEQ ID NO: 327 do 329; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0302] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na TNF koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 327 do 329. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na TNF mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli W ispod. Uopšteno, pošto je TNF polivalentan cilj, poželjna su jedinjenja iz otkrića koja sadrže dva ili tri anti-TNF ISV (i linkere odgovarajuće dužine, vidite WO 06/122786).
1
[0303] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na TNF dati su na Slici 27 kao SEQ ID NO: 640 do 675; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na TNF i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 640 do 675. Uopštenije, jedinjenja usmerena na TNF mogu da budu kao što je opisano u WO 2006/122786, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2006/122786.
Tabela W: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na TNF.
1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1 1
12
1
14
Primer 14: Dalji VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na TNF, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0304] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na TNF.
[0305] ISVD iz pronalaska usmeren na TNF uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju VH domenu iz pronalaska da se specifično vezuje za TNF. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na TNF može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni VH domen jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni VH domen (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
1
[0306] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na TNF opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0307] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na TNF, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na TNF:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0308] VH domen iz pronalaska usmeren na TNF je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na TNF. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
1
[0309] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0310] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na TNF sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 335 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 335; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 336 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 336; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 337 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 337.
[0311] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na TNF prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 335; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 336; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 337.
[0312] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na TNF je varijanta nanotela SEQ ID NO: 334 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 334), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
1
[0313] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na TNF nabrojani su na Slici 17B kao SEQ ID NO: 345 do 347; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0314] Pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje iz otkrića usmereno na TNF koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 345 do 347. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na TNF mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli X ispod. Uopšteno, pošto je TNF polivalentan cilj, poželjna su jedinjenja iz otkrića koja sadrže dva ili tri anti-TNF ISV.
Tabela X: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na TNF.
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
1 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1 1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1 2
1
Primer 15: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na c-Met, i jedinjenja iz pronalaska koja ih sadrže.
[0315] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na c-Met.
1 4
[0316] ISVD iz pronalaska usmeren na c-Met uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju VH domenu iz pronalaska da se specifično vezuje za c-Met. Pored toga, takav VH domen iz pronalaska usmeren na c-Met može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni VH domen jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni VH domen (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0317] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na c-Met opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0318] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na c-Met, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na c-Met:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0319] VH domen iz pronalaska usmeren na c-Met je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na c-Met. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje
1
ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0320] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0321] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na c-Met sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 353 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 353; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 354 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 354; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 355 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 355.
[0322] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na c-Met prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 353; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 354; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 355.
[0323] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na c-Met je varijanta nanotela SEQ ID NO: 352 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 352), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i
1
aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0324] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na c-Met sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 371 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 371; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 372 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 372; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 373 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 373.
[0325] Poželjnije, u takvom ISVD iz pronalaska koji je usmeren na c-Met prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 371; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 372; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 373.
[0326] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na c-Met je varijanta nanotela SEQ ID NO: 370 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 370), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
1
[0327] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na c-Met nabrojani su na Slici 18A kao SEQ ID NO: 363 do 365, i Slici 18B kao SEQ ID NO: 381 do 383; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0328] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje iz otkrića usmereno na c-Met koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 363 do 365 i/ili 381 do 383. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na c-Met mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli Y ispod.
[0329] Kao što je opisano u, na primer WO 2013/045707, jedna posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na c-Met su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na c-Met je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 352 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 352 (kao što je opisano u ovom Primeru 15) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 370 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 370 (kao što je opisano u ovom Primeru 15), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz pronalaska. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma). Neki specifični primeri takvih biparatopnih konstrukata dati su u SEQ ID NO: 676 do 693. Takođe, bispecifični konstrukti usmereni na c-Met mogu takođe da sadrže ISV usmeren na VEGF ili EGFR. Ponovo se upućuje na podatke prikazane u WO 2014/341309.
[0330] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na c-Met dati su na Slikama 28A i 28B kao SEQ ID NO: 676 do 694; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na c-Met i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 676 do 694. Uopštenije, jedinjenja usmerena na c-Met mogu da budu kao što je opisano u WO 2013/045707, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2013/045707.
Tabela Y: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na c-Met.
1
1
1
11 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1 2
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
1
14
Primer 16: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na RANK-L, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0331] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na RANK-L.
[0332] ISVD iz pronalaska usmeren na RANK-L uopšteno će sadržati: (i) pogodne sekvence okvira koja pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako je definisano
1
zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se specifično vezuje za RANK-L. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na RANK-L može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili formira C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je pomenuti VH domen prisutan (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0333] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na RANK-L opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0334] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na RANK-L, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na RANK-L:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0335] VH domen iz pronalaska usmeren na RANK-L je ISVD (a konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na RANK-L. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na
1
primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0336] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0337] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na RANK-L sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 389 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 389; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 390 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 390; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 391 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 391.
[0338] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na RANK-L prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 389; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 390; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 391.
[0339] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na RANK-L je varijanta nanotela SEQ ID NO: 388 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 388), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
1
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0340] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na RANK-L nabrojani su na Slici 19 kao SEQ ID NO: 399 do 401; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0341] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na RANK-L koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 399 do 401. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na RANK-L mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli Z ispod.
[0342] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na RANK-L dati su na Slici 29 kao SEQ ID NO: 694 do 729; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na RANK-L i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 694 do 729.
[0343] Uopštenije, jedinjenja usmerena na RANK-L mogu da budu kao što je opisano u WO 2008/142164, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2008/142164.
Tabela Z: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na RANK-L.
P
J
1
1 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
2
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
2 1
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i linkeri
2 2
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
2
i
z Q
,
e a
a
24
n a
a o a
e n a z
d i z a a
o u
m i
4 u a
2
m
Primer 17: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na CXCR-7, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0344] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na CXCR-7.
[0345] ISVD iz pronalaska usmeren na CXCR-7 uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se specifično vezuje za CXCR-7. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na CXCR-7 može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0346] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na CXCR-7 opisan u ovom primeru) „prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0347] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na CXCR-7, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na CXCR-7:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i
2
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0348] VH domen iz pronalaska usmeren na CXCR-7 je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na CXCR-7. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0349] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0350] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na CXCR-7 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 407 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 407; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 408 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 408; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 409 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 409.
[0351] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na CXCR-7 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 407; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 408; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 409.
2
[0352] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na CXCR-7 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 406 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 406), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0353] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na CXCR-7 sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 425 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 425; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 426 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 426; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 427 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 427.
[0354] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na CXCR-7 prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 425; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 426; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 427.
[0355] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na CXCR-7 je varijanta nanotela SEQ ID NO: 424 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 424), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i
2
aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0356] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz pronalaska usmerenih na CXCR-7 nabrojani su na Slici 20A kao SEQ ID NO: 417 do 419, i Slici 20B kao SEQ ID NO: 435 do 437; i svako od ovih nanotela čini dalji aspekt pronalaska.
[0357] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na CXCR-7 koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz pronalaska SEQ ID NO: 417 do 419 i/ili 435 do 437. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na CXCR-7 mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli AA ispod.
[0358] Kao što je opisano u, na primer WO2012/130874, jedna posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na CXCR7 su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na CXCR-7 je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 406 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 406 (kao što je opisano u ovom Primeru 17) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 424 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 424 (kao što je opisano u ovom Primeru 17), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz pronalaska. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma).
2
[0359] Uopštenije, jedinjenja usmerena na CXCR-7 mogu da budu kao što je opisano u WO2012/130874, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO2012/130874.
Tabela AA: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na CXCR-7.
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
21
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
21
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
21
21
Primer 18: VH domeni (a naročito nanotela) usmereni na A-beta, i jedinjenja koja ih sadrže.
[0360] U jednom specifičnom aspektu, ISVD iz pronalaska i konkretnije, nanotela iz pronalaska, i jedinjenja iz pronalaska mogu biti usmerena na A-beta.
[0361] ISVD iz pronalaska usmeren na A-beta uopšteno će sadržati: (i) odgovarajuće sekvence okvira koje pogodno sadrže aminokiselinske ostatke/mutacije iz pronalaska kako su definisane zahtevima; kao i (ii) sekvence CDR koje omogućavaju ISVD iz pronalaska da se specifično vezuje za A-beta. Pored toga, takav ISVD iz pronalaska usmeren na A-beta može takođe pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, naročito kada je navedeni ISVD jednovalentan ili gradi C-terminalni kraj jedinjenja iz otkrića u kojem je prisutan navedeni ISVD (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0362] Ponovo, kao kod drugih aspekata i otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana, kada se kaže da je specifični ISVD (kao što je ISVD usmeren na A-beta opisan u ovom primeru)
21
„prema pronalasku“ ili „kao što je ovde dalje opisan“, poželjni aspekti/otelotvorenja i preferencije koji su ovde generalno opisani za ISVD iz pronalaska takođe se specifično primenjuju na pomenute specifične ISVD, ako nije izričito drugačije rečeno ili ako specifični tehnički kontekst ne zahteva drugačije.
[0363] Tako, u konkretnom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na VH domen (a naročito na ISVD) koji je usmeren na A-beta, u kome (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Posebno, u takvim VH domenima usmerenim na A-beta:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v).
[0364] VH domen iz pronalaska usmeren na A-beta je ISVD (i konkretnije nanotelo) kao što je definisano zahtevima usmeren na A-beta. Ovde je opisan protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji sadrži najmanje jedan takav ISVD. Takav protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt može takođe da bude kao što je ovde dalje opisano, i može, na primer, da ima produženi poluživot (tj. kao što je ovde opisano, npr. poluživot izražen kao t1/2 beta, kod humanih ispitanika ili kod humanih ispitanika za najmanje 1 dan, poželjno najmanje 3 dana, poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana), i u tu svrhu može, na primer, da sadrži nanotelo koje vezuje albumin iz seruma, koje takođe može biti nanotelo iz pronalaska koje vezuje albumin iz seruma (ponovo, kao što je definisano zahtevima).
[0365] Takođe, takav ISVD može pogodno da ima C-terminalnu ekstenziju (kao što je dalje opisano ovde i u WO 12/175741), posebno kada pomenuti ISVD formira C-terminalni kraj
21
proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji ga sadrži (ponovo, kao što je ovde dalje opisano).
[0366] U jednom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na A-beta sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 461 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 461; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 462 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 462; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 463 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 463.
[0367] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na A-beta prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 461; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 462; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 463.
[0368] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na A-beta je varijanta nanotela SEQ ID NO: 460 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 460), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0369] U drugom poželjnom aspektu, ISVD iz pronalaska usmereni na A-beta sadrže (i) sekvencu CDR1 koja je sekvenca SEQ ID NO: 479 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu različitu aminokiselinu od sekvence SEQ ID NO: 479; (ii) sekvencu CDR2 koja je sekvenca SEQ ID NO: 480 (što je poželjno) ili je aminokiselinska
21
sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 480; i (iii) sekvencu CDR3 koja je sekvenca SEQ ID NO: 481 (što je poželjno) ili je aminokiselinska sekvenca koja ima samo jednu ili dve različite aminokiseline od sekvence SEQ ID NO: 481.
[0370] Poželjnije, u ISVD iz pronalaska koji je usmeren na A-beta prema ovom aspektu: (i) CDR1 je SEQ ID NO: 479; (ii) CDR2 je SEQ ID NO: 480; i (iii) CDR3 je SEQ ID NO: 481.
[0371] U jednom specifičnom aspektu, nanotelo iz otkrića usmereno na A-beta je varijanta nanotela SEQ ID NO: 478 (sa najmanje 90% identičnosti sekvence, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 478), u kojoj:
aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno odabran od L, V ili K (i najpoželjnije je V); i
aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno odabran od A ili P; i aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno odabran od T, V ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno odabran od Q ili L; i aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno odabran od T, K ili Q; i aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno odabran od S, K ili Q;
tako da (i) pozicija 112 je K ili Q; ili (ii) pozicija 110 je K ili Q i pozicija 11 je V; ili (iii) pozicija 89 je T; ili (iv) pozicija 89 je L i pozicija 110 je K ili Q; ili (v) pozicija 11 je V i pozicija 89 je L; ili bilo koja pogodna kombinacija od (i) do (v). Ponovo, CDR takvog ISV su poželjno kako je definisano u prethodna dva paragrafa.
[0372] Neki specifično poželjni, ali neograničavajući primeri nanotela iz otkrića usmerenih na A-beta nabrojani su na Slici 21A kao SEQ ID NO: 464 do 477, i Slici 21B kao SEQ ID NO: 482 do 495.
[0373] Otkriće se takođe odnosi na jedinjenje usmereno na A-beta koje sadrži najmanje jedno (kao što je jedno, dva ili tri) od nanotela iz otkrića SEQ ID NO: 464 do 477 i/ili 482 do 495. Takva jedinjenja iz otkrića usmerena na A-beta mogu ponovo da budu kao što je ovde dalje opisano, i tako na primer mogu da sadrže pogodne linkere, mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano i mogu da imaju produženi poluživot (na primer zato što sadrže nanotelo usmereno na albumin iz humanog seruma, kao što je (poželjno) nanotelo iz
22
pronalaska usmereno na albumin iz humanog seruma). Upućuje se na podatke prikazane u Tabeli BB ispod.
[0374] Kao što je opisano u, na primer WO 2006/040153 i naročito kao što je opisano u EP2542579, jedna posebno poželjna klasa jedinjenja zasnovanih na nanotelima koja su usmerena na A-beta su biparatopna jedinjenja. Tako, u jednom aspektu otkrića, jedinjenje iz otkrića usmereno na A-beta je biparatopni konstrukt koji sadrži jedan ISV koji je SEQ ID NO: 460 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 460 (kao što je opisano u ovom Primeru 17) i jedan ISV koji je SEQ ID NO: 478 ili (poželjno) ISV iz pronalaska koji je dobijen od SEQ ID NO: 478 (kao što je opisano u ovom Primeru 17), pod uslovom da najmanje jedan (a poželjno oba) od ovih ISV predstavlja ISV iz pronalaska. Takvi biparatopni konstrukti takođe mogu imati produženi poluživot (tj. putem ISV koji vezuje albumin iz seruma). Neki specifični primeri takvih biparatopnih konstrukata dati su u SEQ ID NO: 730 do 766.
[0375] Neki specifično poželjni primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na A-beta dati su na Slici 30 kao SEQ ID NO: 730 do 766; i svako od ovih jedinjenja čini dalji aspekt otkrića. Tako, u drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid koji je usmeren na A-beta i koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 730 do 766. Uopštenije, jedinjenja usmerena na A-beta mogu da budu kao što je opisano u WO 2006/040153 i naročito kao što je opisano u EP2542579, ali sadrže ISV iz pronalaska. Ona takođe mogu da se koriste za namene koje su opisane u WO 2006/040153 i naročito u EP2542579.
Tabela BB: Primeri jedinjenja iz otkrića usmerenih na A-beta.
Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
22
22 Polipeptid/konstrukt(<1>) Opšta formula Gradivni elementi ISV i
22
22
Primer 19: Testiranje anti-A-beta konstrukata za vezivanje od strane već postojećih antitela.
[0376] Tri anti-A-beta konstrukta sa produženim poluživotom (sa opštom formulom [A-beta-1]-9GS-ALB8-9GS-[A-beta-2]-A) testirana su i upoređena prema vezivanju od strane već postojećih antitela, koristeći opšti protokol koji je ovde opisan. Dva konstrukta su imala navedene mutacije iz pronalaska (kao što je definisano zahtevima) u sva tri gradivna elementa (tj. u dva anti-A-beta nanotela i u nanotelu koje vezuje albumin iz seruma). Referentni konstrukt (SEQ ID NO:766) nije imao mutacije iz pronalaska (kao što je definisano zahtevima) u bilo kom od gradivnih elemenata. Svi testirani konstrukti su imali C-terminalni alanin. Rezultati su dati u Tabeli CC-1 i na Slici 31A
Tabela CC-1: testiranje anti-A-beta konstrukata na vezivanje od strane već postojećih antitela
22
[0377] Anti-A-beta nanotela koja su prisutna na C-terminalnom kraju konstrukata takođe su odvojeno testirana kao jednovalentni konstrukti (sa C-terminalnim alaninom). Rezultati su dati u Tabeli CC-2 i na Slici 31A.
Tabela CC-2: testiranje jednovalentnih anti-A-beta nanotela na vezivanje od strane već postojećih antitela
22
N
n
s
i
(
a
Primer 20: Pregled vezivača albumina iz seruma
[0378] Tabele DD i EE u nastavku daju neke poželjne, ali neograničavajuće primere nanotela koja vezuju albumin iz seruma, zasnovanih na Alb-8 (Tabela DD), odnosno Alb-23 (Tabela EE).
[0379] Kao što je pomenuto, otkriće se takođe odnosi na polipeptid, protein, jedinjenje ili konstrukt (i naročito na jedinjenje iz otkrića) koji sadrži jedno od nanotela koja vezuju albumin iz seruma, navedenih u Tabeli DD ili EE u nastavku. Takav polipeptid, protein, jedinjenje ili konstrukt (i naročito jedinjenje iz otkrića) može dalje da sadrži najmanje jedan (kao što je jedan, dva ili tri) vezujući domen ili vezujuću jedinicu (kao što je ISVD, i naročito ISV iz pronalaska) koji je usmeren na najmanje jedan terapeutski cilj. Takav polipeptid, protein, jedinjenje ili konstrukt može ponovo pogodno biti monospecifičan, bispecifičan ili trispecifičan u odnosu na terapeutski cilj (ciljeve), i može biti dvovalentan, trovalentan, četvorovalentan ili više valence. Uobičajeno će takođe sadržati pogodne linkere, i može da sadrži C-terminalnu ekstenziju kao što je opisano ovde.
[0380] Naročito, takav polipeptid, protein, jedinjenje ili konstrukt može biti jedinjenje iz otkrića (kao što je ovde opisano) i/ili može biti kao što je ovde dalje opisano za jedinjenja iz otkrića (uključujući poželjna otelotvorenja za jedinjenja iz otkrića. Tako su posebno poželjna jedinjenja koja sadrže ISVD, a naročito nanotela). Shodno tome, jedinjenja iz otkrića koja sadrže jedno od nanotela koja vezuju albumin iz seruma navedenih u Tabeli DD ili EE čine dalje aspekte otkrića.
Tabela DD: Alb-8 (referenca) i varijante Alb-8
2
SEQ Varijanta Sekvenca
21 SEQ Varijanta Sekvenca
Tabela EE: Alb-23 (referenca) i varijante Alb-23 prema pronalasku
2 2
2
24

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Pojedinačni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (ISVD), u kome je aminokiselinski ostatak na poziciji 89 L i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V, pri čemu, aminokiselinski ostaci/pozicije su naznačeni Kabatovom numeracijom.
2. ISVD teškog lanca prema zahtevu 1 koji (i) sadrži aminokiselinu na poziciji 110 koja je odabrana od T, I, A, K ili Q; (ii) sadrži aminokiselinu na poziciji 112 koja je odabrana od S, F, K ili Q; i (iii) opciono sadrži supstituciju P14A ili A14P i/ili supstituciju Q108L.
3. ISVD teškog lanca prema zahtevu 2 koji (i) sadrži aminokiselinu na poziciji 110 koja je odabrana od T, K ili Q; (ii) sadrži aminokiselinu na poziciji 112 koja je odabrana od S, K ili Q; i (iii) opciono sadrži supstituciju P14A ili A14P i/ili supstituciju Q108L.
4. ISVD teškog lanca prema zahtevu 3 koji (i) sadrži aminokiselinu na poziciji 110 koja je T; (ii) sadrži aminokiselinu na poziciji 112 koja je odabrana od S; i (iii) opciono sadrži supstituciju P14A ili A14P i/ili supstituciju Q108L.
5. ISVD teškog lanca prema zahtevu 3 koji (i) sadrži aminokiselinu na poziciji 110 koja je odabrana od K ili Q; (ii) sadrži aminokiselinu na poziciji 112 koja je S; i (iii) opciono sadrži supstituciju P14A ili A14P i/ili supstituciju Q108L.
6. ISVD teškog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 5, u kome pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
7. ISVD teškog lanca prema zahtevu 4, odnosno 6, u kome je C-terminalni kraj VTVSS (SEQ ID NO: 76), odnosno VTVSS(X)n(SEQ ID NO: 77), u kome su X i n kao što je definisano u zahtevu 6.
8. ISVD teškog lanca prema zahtevu 1, u kome je C-terminalni VH domen jedan od: VTVSS (SEQ ID NO:76), VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77), VTVKS (SEQ ID NO:1), VTVKS(X)n (SEQ
2
ID NO:21), VTVQS (SEQ ID NO:2), VTVQS(X)n (SEQ ID NO:22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)n (SEQ ID NO:97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107,u kome je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q) ili VZVZSX(n) (SEQ ID NO:108, u kome je svaki aminokiselinski ostatak Z nezavisno K ili Q), u kome je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
9. ISVD teškog lanca prema zahtevu 8, u kome je C-terminalni kraj VH domena jedan od VTVSS (SEQ ID NO:76), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)n (SEQ ID NO:97) ili VQVSS(X)n (SEQ ID NO: 98), u kome su X i n kao što je definisano u zahtevu 8.
10. ISVD teškog lanca prema zahtevu 8 ili 9, u kome je C-terminalni kraj VH domena jedan od VTVSS (SEQ ID NO:76) ili VTVSS(X)n (SEQ ID NO:77), u kome su X i n kao što je definisano u zahtevu 8.
11. ISVD teškog lanca, u kome:
- aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je jedan od A ili P; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je jedan od A ili P; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je jedan od Q ili L; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od T, K ili Q; i
- aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je jedan od S, K ili Q, pri čemu, aminokiselinski ostaci/pozicije su naznačeni Kabatovom numeracijom.
12. ISVD teškog lanca prema zahtevu 11, u kome, aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je T.
13. ISVD teškog lanca prema zahtevu 11, u kome, aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je jedan od K ili Q.
14. ISVD teškog lanca prema bilo kom od zahteva 11 do 13, u kome pomenuti VH domen sadrži C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).
15. ISVD teškog lanca prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji je VHH domen ili kamelizovani VH domen.
16. ISVD teškog lanca prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji može specifično da se veže za albumin iz humanog seruma.
17. ISVD teškog lanca prema zahtevu 16, u kome, aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je L i aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je V, koji može specifično da se veže za albumin iz humanog seruma, i taj ISVD teškog lanca ima najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, kao što je najmanje 95% identičnosti sekvence sa najmanje jednim Alb-1 (SEQ ID NO: 52 iz WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46) i/ili Alb-23 (SEQ ID NO:61).
18. ISVD teškog lanca prema zahtevu 16 ili 17, koji može specifično da se veže za albumin iz humanog seruma, u kom ISVD teškog lanca:
- CDR1 je aminokiselinska sekvenca SFGMS (SEQ ID NO:41);
- CDR2 je aminokiselinska sekvenca SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);
- CDR3 je aminokiselinska sekvenca GGSLSR (SEQ ID NO:43).
19. Biblioteka ISVD teškog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 15.
20. Biblioteka ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju ISVD teškog lanca prema bilo kom od zahteva 1 do 15.
21. Biblioteka prema zahtevu 20, koja je ekspresiona biblioteka.
22. Biblioteka prema bilo kom od zahteva 19 do 21, koja je sintetička biblioteka.
2
23. Biblioteka prema bilo kom od zahteva 19 do 22, koja sadrži najmanje 100 različitih sekvenci, kao što je najmanje 1000 različitih sekvenci, konkretno više od 10<5>različitih sekvenci, konkretnije više od 10<6>različitih sekvenci, kao što je 10<8>do 10<10>različitih sekvenci.
2
RS20201034A 2014-05-16 2015-05-13 Varijabilni domeni imunoglobulina RS60717B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461994552P 2014-05-16 2014-05-16
US201461014015P 2014-06-18 2014-06-18
US201462014015P 2014-06-18 2014-06-18
US201462040167P 2014-08-21 2014-08-21
US201462047560P 2014-09-08 2014-09-08
US201562133600P 2015-03-16 2015-03-16
EP15722211.8A EP3143042B1 (en) 2014-05-16 2015-05-13 Immunoglobulin variable domains
PCT/EP2015/060643 WO2015173325A2 (en) 2014-05-16 2015-05-13 Improved immunoglobulin variable domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60717B1 true RS60717B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=91193230

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201034A RS60717B1 (sr) 2014-05-16 2015-05-13 Varijabilni domeni imunoglobulina
RS20220328A RS63085B1 (sr) 2014-05-16 2015-05-13 Varijabilni domeni imunoglobulina

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220328A RS63085B1 (sr) 2014-05-16 2015-05-13 Varijabilni domeni imunoglobulina

Country Status (24)

Country Link
US (10) US12180268B2 (sr)
EP (4) EP3143042B1 (sr)
JP (6) JP7325928B2 (sr)
KR (5) KR20170002645A (sr)
CN (3) CN109053885A (sr)
AU (6) AU2015261536B2 (sr)
BR (2) BR122018009619B1 (sr)
CA (2) CA2948076A1 (sr)
DK (2) DK3143042T3 (sr)
ES (2) ES2912069T3 (sr)
HR (2) HRP20220400T1 (sr)
HU (2) HUE050007T2 (sr)
IL (6) IL295534B2 (sr)
LT (2) LT3248986T (sr)
MX (4) MX383560B (sr)
PH (1) PH12016502282B1 (sr)
PL (2) PL3143042T3 (sr)
PT (2) PT3248986T (sr)
RS (2) RS60717B1 (sr)
RU (1) RU2746738C2 (sr)
SG (3) SG11201609162SA (sr)
SI (2) SI3143042T1 (sr)
WO (1) WO2015173325A2 (sr)
ZA (5) ZA201607587B (sr)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
SG10201605048XA (en) * 2011-06-23 2016-07-28 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR20250099289A (ko) 2014-05-16 2025-07-01 아블린쓰 엔.브이. 개선된 면역글로불린 가변 도메인
AU2015261536B2 (en) 2014-05-16 2020-05-07 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
CN114478753A (zh) 2015-01-21 2022-05-13 英伊布里克斯公司 非免疫原性单结构域抗体
JP7403224B2 (ja) 2015-11-12 2023-12-22 アブリンクス エン．ヴェー． 改良されたｐ２ｘ７受容体結合剤およびこれを含むポリペプチド
NO2768984T3 (sr) * 2015-11-12 2018-06-09
RS62857B1 (sr) 2015-11-13 2022-02-28 Ablynx Nv Unapređeni varijabilni domeni imunoglobulina koji vezuju serumski albumin
EA038179B1 (ru) * 2015-11-18 2021-07-20 Мерк Шарп И Доум Корп. Ctla4-связывающие вещества
RU2755724C2 (ru) 2015-11-18 2021-09-20 Мерк Шарп И Доум Корп. Pd1/ctla4-связывающие вещества
JP7046804B2 (ja) * 2015-11-18 2022-04-04 アブリンクス エン．ヴェー． 改良された血清アルブミン結合剤
UA121914C2 (uk) 2015-11-18 2020-08-10 Мерк Шарп І Доум Корп. Молекула, що зв'язує pd1 і lag3
EP3414268A1 (en) 2016-02-12 2018-12-19 Ablynx NV Method for the production of immunoglobulin single variable domains
CN107400166A (zh) * 2016-05-19 2017-11-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
US20190195866A1 (en) 2016-06-23 2019-06-27 Ablynx N.V. Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains
CN117700549A (zh) 2016-11-16 2024-03-15 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合CD123和TCRα/β的T细胞募集多肽
KR20230061582A (ko) 2016-12-07 2023-05-08 아블린쓰 엔.브이. 개선된 혈청 알부민 결합성 면역글로불린 단일 가변 도메인
SG10202108973SA (en) 2017-01-17 2021-09-29 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
CN117285623A (zh) 2017-01-17 2023-12-26 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合物
RS66191B1 (sr) 2017-06-02 2024-12-31 Merck Patent Gmbh Imunoglobulini koji vezuju adamts
WO2019016237A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Vib Vzw AGENTS FOR CONNECTING TO SERUM ALBUMIN
US11873347B2 (en) 2017-10-31 2024-01-16 Vib Vzw Antigen-binding chimeric proteins and methods and uses thereof
US12465640B2 (en) 2019-02-25 2025-11-11 The University Of Chicago Methods and compositions for treating inflammatory and autoimmune conditions with ECM-affinity peptides linked to anti-inflammatory agents
WO2020221888A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Vib Vzw Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator stabilizing agents
WO2021105438A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
MX2022006881A (es) 2019-12-06 2022-07-11 Ablynx Nv Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina dirigidos a tnf alfa y ox40l.
WO2021110816A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Ablynx Nv POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TNFα AND IL-23
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
TWI861302B (zh) 2019-12-09 2024-11-11 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向il-13及tslp之免疫球蛋白單可變域的多肽
US20240027467A1 (en) 2019-12-20 2024-01-25 Vib Vzw Nanobody Exchange Chromatography
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
EP4110794A1 (en) 2020-02-25 2023-01-04 Vib Vzw Leucine-rich repeat kinase 2 allosteric modulators
CA3175873A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Ablynx Nv Method for the production and purification of multivalent immunoglobulin single variable domains
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
US20230272094A1 (en) * 2020-08-05 2023-08-31 Synthekine, Inc. Il2rb/il2rg synthetic cytokines
TW202229338A (zh) 2020-09-25 2022-08-01 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向ｉｌ－１３和ｏｘ４０ｌ的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
WO2022117572A2 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv An ltbr agonist in combination therapy against cancer
PH12023500013A1 (en) 2020-12-04 2024-03-11 Tidal Therapeutics Inc Ionizable cationic lipids and lipi nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
TW202239763A (zh) 2020-12-18 2022-10-16 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
MX2023007299A (es) 2020-12-18 2023-07-04 Ablynx Nv Polipeptidos de reclutamiento de celulas t basados en la reactividad de tcr alfa/beta.
AU2021399955A1 (en) 2020-12-18 2023-08-03 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting glypican-3 and t cell receptor
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
AU2022216460A1 (en) 2021-02-05 2023-09-21 Universiteit Gent Sarbecovirus binders
US20250263490A1 (en) 2021-02-19 2025-08-21 Vib Vzw Cation-Independent Mannose-6-Phosphate Receptor Binders
CN117043184A (zh) * 2021-04-01 2023-11-10 南京再明医药有限公司 抗人血清白蛋白（hsa）的纳米抗体及其应用
WO2023016828A2 (en) 2021-07-30 2023-02-16 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
TW202330596A (zh) * 2021-11-29 2023-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 經修飾的蛋白或多肽
EP4448574A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Ablynx N.V. Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting tcralphabeta, cd33 and cd123
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
EP4508082A1 (en) 2022-04-13 2025-02-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
AU2023265474A1 (en) 2022-05-06 2024-10-31 Numab Therapeutics AG Antibody variable domains and antibodies having decreased immunogenicity
EP4273162A1 (en) * 2022-05-06 2023-11-08 Numab Therapeutics AG Antibody variable domains and antibodies having decreased immunogenicity
WO2023222825A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw Sarbecovirus spike s2 subunit binders
EP4536627A1 (en) 2022-06-08 2025-04-16 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
AU2023290487A1 (en) 2022-06-14 2025-01-30 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
AU2023313033A1 (en) 2022-07-27 2025-03-13 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
EP4594348A1 (en) 2022-09-27 2025-08-06 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus
WO2024083843A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Confo Therapeutics N.V. Amino acid sequences directed against the melanocortin 4 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of mc4r-related diseases and disorders
CN120380024A (zh) 2022-12-21 2025-07-25 建新公司 抗pd-1×4-1bb结合蛋白
US20240415974A1 (en) 2022-12-23 2024-12-19 Ablynx N.V. Protein-based conjugation carriers
CN120529914A (zh) 2023-01-09 2025-08-22 奥德赛治疗股份有限公司 抗tnfr2抗原结合蛋白及其用途
CN121013866A (zh) 2023-02-10 2025-11-25 阿穆尼克斯制药公司 靶向前列腺特异性膜抗原（psma）的组合物及其制备和使用方法
KR20250151445A (ko) 2023-02-17 2025-10-21 아블린쓰 엔.브이. 신생아 fc 수용체에 결합하는 폴리펩티드
WO2024175787A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Vrije Universiteit Brussel Anti-inflammatory pannexin 1 channel inhibitors
CN121263437A (zh) 2023-03-14 2026-01-02 奥德赛治疗股份有限公司 抗cd25抗原结合蛋白及其用途
WO2024208816A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Vib Vzw Blood-brain barrier crossing antibodies
AU2024267410A1 (en) 2023-05-08 2026-01-08 Sanofi Glycosylation of immunoglobulin single variable domains
AR132699A1 (es) 2023-05-17 2025-07-23 Odyssey Therapeutics Inc Anticuerpos de dominio único modificados
WO2024261235A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Ablynx Nv Chimeric proteins for modulating cytokine receptor activity
AU2024308381A1 (en) 2023-06-29 2025-11-20 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-trailr2 antigen-binding proteins and uses thereof
AR133188A1 (es) 2023-07-05 2025-09-03 Ablynx Nv ANTAGONISTAS DE FcRn MEJORADOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y TRASTORNOS RELACIONADOS CON IgG
TW202525843A (zh) 2023-09-04 2025-07-01 法商賽諾菲公司 用於治療表現磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3之腫瘤的多肽
TW202532432A (zh) 2023-09-22 2025-08-16 比利時商艾伯霖克斯公司 二及多價白蛋白結合劑
TW202530265A (zh) 2023-10-13 2025-08-01 美商奧迪希治療公司 抗cdh17抗原結合蛋白及其用途
AR134267A1 (es) 2023-11-08 2025-12-17 Sanofi Sa Degradador lisosómico basado en cd25 y usos del mismo
WO2025109176A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Exevir Bio Bv Optimized sarbecovirus spike s2 subunit binders and compositions comprising the same
WO2025114529A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Ablynx Nv Multispecific antibodies recognising human serum albumin, tcr and a tumor antigen recognising moiety
WO2025125577A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 Vib Vzw Antibodies against influenza b virus
WO2025133166A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Ablynx Nv Protein-based carriers for site-specific amine conjugation
TW202543670A (zh) 2023-12-22 2025-11-16 比利時商艾伯霖克斯公司 用於核內投予之基於蛋白質的接合載劑
TW202543581A (zh) 2024-02-12 2025-11-16 美商艾伊拉醫療公司 遞送組成物
WO2025181155A1 (en) 2024-02-26 2025-09-04 Vib Vzw Human beta-glucocerebrosidase binders and uses thereof
WO2025217240A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-tnfr2 antigen-binding proteins and uses thereof
US12459994B2 (en) 2024-04-12 2025-11-04 Paragon Therapeutics, Inc. Albumin binding proteins and methods of use
WO2025219231A1 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Vib Vzw Computer-implemented means and methods for the de novo design of antibodies targeting a specific epitope
WO2025255558A2 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-thymic stromal lymphopoietin (tslp) antigen-binding proteins and uses thereof
WO2025255435A2 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Odyssey Therapeutics, Inc. Antigen-binding proteins against serum albumin and uses thereof
US20260007757A1 (en) 2024-06-18 2026-01-08 Ablynx Nv Antibody-recruiting molecules
WO2026006809A1 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Odyssey Therapeutics, Inc. Multispecific molecules binding tnfr2 and cd25 and uses thereof
WO2026006708A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-cd25 antigen-binding proteins and uses thereof
WO2026008664A1 (en) 2024-07-01 2026-01-08 Vib Vzw Allosteric modulators of inhibitory immune receptor complexes
WO2026024863A2 (en) 2024-07-24 2026-01-29 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Compositions targeting prostate-specific membrane antigen (psma) in combination with androgen receptor antagonists

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1545106C3 (de) * 1963-07-16 1979-05-31 Union Carbide Corp., New York, N.Y. (V.St.A.) Verfahren zur Herstellung von linearen Polyarylenpolyäthern
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5248775A (en) 1989-12-11 1993-09-28 The Trustees Of Princeton University Pyrrolo(2,3-d)pyrimidines
KR0162654B1 (ko) 1989-12-11 1998-11-16 알렌 제이. 시니스갤리 N-(피롤로[2,3-d]피리미딘-3-일아크릴)-글루타민산 유도체
US5028608A (en) 1989-12-11 1991-07-02 The Trustees Of Princeton University N-(6-Amino-(pyrrolo(2,3-d)pyrimidin-3-ylacyl) )-glutamic acid derivatives
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
ATE420178T1 (de) 1992-08-21 2009-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichtkette
CA2321199A1 (en) 1998-02-19 1999-08-26 William A. Brady Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US7943129B2 (en) * 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
EP1412390A2 (en) 2001-07-26 2004-04-28 Tanox, Inc. Agents that activate or inhibit toll-like receptor 9
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
EP1600459A3 (en) 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
JP2006520584A (ja) 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
AU2003286004A1 (en) 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
WO2004062551A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Ablynx N.V. RECOMBINANT VHH SINGLE DOMAIN ANTIBODY FROM CAMELIDAE AGAINST VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) OR AGAINST COLLAGEN
EP1737890A2 (en) * 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
JP2008500830A (ja) 2004-06-01 2008-01-17 ドマンティス リミテッド 増加した血清半減期を有する二重特異性融合抗体
BRPI0518151A2 (pt) 2004-10-13 2009-06-16 Ablynx Nv polipetìdeos contra amiloide-beta, ácido nucléico que codifica tal polipetìdeo, composição compreendendo tal polipetìdeo, método para produzir um polipetìdeo e uso do mesmo
CA2588892A1 (en) 2004-12-02 2006-06-08 Dormantis Limited Anti-il-1r1 single domain antibodies and therapeutic uses
RU2428431C2 (ru) 2004-12-02 2011-09-10 Домантис Лимитед Слитые конструкции лекарственного средства и конъюгаты
EP3613767A1 (en) * 2005-05-18 2020-02-26 Ablynx N.V. Improved nanobodiestm against tumor cecrosis factor-alpha
KR101414438B1 (ko) 2005-05-20 2014-07-10 아블린쓰 엔.브이. 폰 빌레브란트 인자에 대한 단일 도메인 ｖｈｈ 항체
WO2006129843A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
JP2009519011A (ja) 2005-12-01 2009-05-14 ドマンティス リミテッド インターロイキン１受容体１型に結合する非競合ドメイン抗体フォーマット
CN101466734A (zh) 2005-12-01 2009-06-24 杜门蒂斯有限公司 与白细胞介素-1受体1型结合的竞争性域抗体形式
FR2894741B1 (fr) 2005-12-08 2009-12-04 Centre Nat Etd Spatiales Chaine de reception par satellite
CA2640066A1 (en) 2006-01-24 2007-08-02 Roland Beckmann Fusion proteins that contain natural junctions
JP2010500876A (ja) 2006-08-18 2010-01-14 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６媒介性シグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療のための、ｉｌ−６ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
JP2010511397A (ja) 2006-12-05 2010-04-15 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合可能なペプチド
AU2007331672A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
CN101796072B (zh) 2007-05-24 2014-09-24 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
NZ581468A (en) * 2007-06-25 2012-09-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
AU2008328781A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
WO2009121804A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
EP2268668A1 (en) 2008-04-17 2011-01-05 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
WO2009138494A2 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against toll-like receptors and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases related to toll-like receptors
DE102008023620A1 (de) 2008-05-15 2009-11-19 Mettler-Toledo (Albstadt) Gmbh Funktionseinheit mit einer aufrufbaren Funktion und Verfahren zu deren Aufruf
BRPI0911984A2 (pt) 2008-05-16 2016-09-20 Ablynx Nv sequências de aminoácidos direncionadas contra cxcr4 e outros compostos gpcrs compreendendo os mesmos
EP2143735A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010042815A2 (en) 2008-10-09 2010-04-15 Duke University Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
NZ595344A (en) 2009-03-27 2013-09-27 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
EP3828201A1 (en) 2009-04-30 2021-06-02 Ablynx N.V. Method for the production of domain antibodies
WO2010130832A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions
EP2435480A1 (en) 2009-05-27 2012-04-04 Ablynx N.V. Biparatopic protein constructs directed against il-23
CN102458471A (zh) 2009-05-28 2012-05-16 葛兰素集团有限公司 用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合
US9150640B2 (en) 2009-07-10 2015-10-06 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
US8306355B2 (en) 2009-07-13 2012-11-06 Sharp Laboratories Of America, Inc. Methods and systems for reducing compression artifacts
WO2011042398A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
US8962807B2 (en) * 2009-12-14 2015-02-24 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use
CA2777527C (en) 2009-12-23 2020-06-23 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Method for decreasing immunogenicity
CA2788275A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopic abeta binding polypeptides
WO2011117423A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7
AU2011247612A1 (en) 2010-04-30 2012-12-06 Ablynx Nv Amino acid sequences of nanobodies directed against p19 subunit of the heterodimeric cytokine IL-23
EP3546483A1 (en) 2010-05-20 2019-10-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
WO2011161266A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
JP2013145769A (ja) 2010-08-04 2013-07-25 Kri Inc 異方性希土類ボンド磁石とその製造方法
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
WO2012104227A1 (en) 2011-02-02 2012-08-09 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
JP6181040B2 (ja) 2011-03-28 2017-08-16 アブリンクス エン．ヴェー． 二特異性抗ｃｘｃｒ７免疫グロブリン単一可変ドメイン
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
WO2012175740A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains directed against ige
SI2723771T1 (sl) 2011-06-23 2019-12-31 Ablynx Nv Proteini, ki vežejo serum albumin
SG10201605048XA (en) 2011-06-23 2016-07-28 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20130019175A1 (en) 2011-07-14 2013-01-17 Microsoft Corporation Submenus for context based menu system
TW201321405A (zh) * 2011-08-17 2013-06-01 Glaxo Group Ltd 經修飾之蛋白質及肽
JP6219287B2 (ja) 2011-09-30 2017-10-25 アブリンクス エン．ヴェー． ｃ−Ｍｅｔに関連する生物学的物質
LT2627773T (lt) 2011-10-17 2017-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės iškirpta sunkioji imunoglobulino grandinė
US20130129727A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corporation Methods and systems for increasing protein stability
WO2013116296A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-asic1 antibodies and uses thereof
JP6608698B2 (ja) 2012-06-01 2019-11-27 アブリンクス エン．ヴェー． Ｐ２ｘ７受容体アンタゴニスト及びアゴニスト
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
EP2895510A2 (en) * 2012-09-13 2015-07-22 Novartis AG Single domain antibody with c-terminal modification
US9667316B2 (en) 2013-05-17 2017-05-30 The Boeing Company Aircraft data transmission using phase separation
AU2015261536B2 (en) 2014-05-16 2020-05-07 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
RU2018119732A (ru) 2015-10-30 2019-12-03 Аблинкс Нв Полипептиды против il-23
JP7403224B2 (ja) 2015-11-12 2023-12-22 アブリンクス エン．ヴェー． 改良されたｐ２ｘ７受容体結合剤およびこれを含むポリペプチド
NO2768984T3 (sr) 2015-11-12 2018-06-09
RS62857B1 (sr) 2015-11-13 2022-02-28 Ablynx Nv Unapređeni varijabilni domeni imunoglobulina koji vezuju serumski albumin
JP7046804B2 (ja) 2015-11-18 2022-04-04 アブリンクス エン．ヴェー． 改良された血清アルブミン結合剤
EA038179B1 (ru) 2015-11-18 2021-07-20 Мерк Шарп И Доум Корп. Ctla4-связывающие вещества
UA121914C2 (uk) 2015-11-18 2020-08-10 Мерк Шарп І Доум Корп. Молекула, що зв'язує pd1 і lag3
RU2755724C2 (ru) 2015-11-18 2021-09-20 Мерк Шарп И Доум Корп. Pd1/ctla4-связывающие вещества
SG10202108973SA (en) 2017-01-17 2021-09-29 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
WO2021110816A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Ablynx Nv POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TNFα AND IL-23
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
TW202239763A (zh) 2020-12-18 2022-10-16 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的免疫球蛋白單可變結構域的多肽

Also Published As

Publication number Publication date
MX383560B (es) 2025-03-14
CA3175002A1 (en) 2015-11-19
AU2018204226A1 (en) 2018-07-05
IL299282B2 (en) 2024-09-01
AU2020202855A1 (en) 2020-05-21
RU2018120744A3 (sr) 2022-01-28
IL295534B2 (en) 2025-03-01
US20210261653A1 (en) 2021-08-26
US11312764B2 (en) 2022-04-26
US12180268B2 (en) 2024-12-31
RU2021107470A (ru) 2021-05-17
US20220332807A1 (en) 2022-10-20
IL281755A (en) 2021-05-31
DK3248986T3 (da) 2022-04-04
IL248636A0 (en) 2017-01-31
RU2746738C2 (ru) 2021-04-20
ZA202004759B (en) 2022-08-31
SI3143042T1 (sl) 2020-08-31
IL311293B2 (en) 2025-07-01
US11319364B2 (en) 2022-05-03
PT3248986T (pt) 2022-04-05
MX2016014926A (es) 2017-05-09
US20210087261A1 (en) 2021-03-25
SG10201810124PA (en) 2018-12-28
IL259972B (en) 2021-04-29
SG11201609162SA (en) 2016-12-29
CN109053885A (zh) 2018-12-21
IL281755B1 (en) 2023-01-01
NZ726448A (en) 2023-02-24
HRP20200966T1 (hr) 2020-10-16
HUE050007T2 (hu) 2020-11-30
JP2024041939A (ja) 2024-03-27
IL299282B1 (en) 2024-05-01
CN106661100A (zh) 2017-05-10
IL311293A (en) 2024-05-01
JP2021130681A (ja) 2021-09-09
AU2022279374B2 (en) 2026-01-15
US20210269514A1 (en) 2021-09-02
KR102827683B1 (ko) 2025-06-30
MX2023010731A (es) 2023-09-20
US20200231662A1 (en) 2020-07-23
EP3693386A1 (en) 2020-08-12
ZA202100742B (en) 2022-09-28
EP3248986B1 (en) 2022-01-26
JP7471987B2 (ja) 2024-04-22
PH12016502282B1 (en) 2024-05-22
RU2016149463A (ru) 2018-06-19
US11312765B2 (en) 2022-04-26
US20220135657A9 (en) 2022-05-05
HRP20220400T1 (hr) 2022-05-27
EP3143042B1 (en) 2020-06-10
AU2022279374A1 (en) 2023-01-19
ES2815572T3 (es) 2021-03-30
BR112016026773A2 (pt) 2017-12-12
US11220539B2 (en) 2022-01-11
KR20170002645A (ko) 2017-01-06
PL3248986T3 (pl) 2022-05-16
ZA201607587B (en) 2022-05-25
US20220119512A1 (en) 2022-04-21
AU2020202855B2 (en) 2022-12-08
RU2016149463A3 (sr) 2018-07-04
ZA202004757B (en) 2022-08-31
EP3702369A1 (en) 2020-09-02
HUE058008T2 (hu) 2022-06-28
US20220251183A1 (en) 2022-08-11
IL295534A (en) 2022-10-01
KR20230145503A (ko) 2023-10-17
CA2948076A1 (en) 2015-11-19
SI3248986T1 (sl) 2022-04-29
US11708404B2 (en) 2023-07-25
MX2018007581A (es) 2020-11-12
LT3143042T (lt) 2020-07-27
RU2018120744A (ru) 2018-11-15
JP7325928B2 (ja) 2023-08-15
IL259972A (en) 2018-07-31
RS63085B1 (sr) 2022-04-29
EP3248986A2 (en) 2017-11-29
JP2017518072A (ja) 2017-07-06
AU2015261536B2 (en) 2020-05-07
AU2022279373A1 (en) 2023-01-19
JP2024069377A (ja) 2024-05-21
JP2018162297A (ja) 2018-10-18
PL3143042T3 (pl) 2020-11-16
SG10201805288QA (en) 2018-07-30
IL281755B2 (en) 2023-05-01
US20170121399A1 (en) 2017-05-04
LT3248986T (lt) 2022-03-25
JP2021006563A (ja) 2021-01-21
ES2912069T3 (es) 2022-05-24
WO2015173325A2 (en) 2015-11-19
US11485777B2 (en) 2022-11-01
AU2020202570B2 (en) 2022-12-08
KR102769509B1 (ko) 2025-02-17
PT3143042T (pt) 2020-09-01
KR20180091115A (ko) 2018-08-14
DK3143042T3 (da) 2020-08-31
US20220332806A1 (en) 2022-10-20
AU2015261536A1 (en) 2016-11-17
US11485778B2 (en) 2022-11-01
CN113717280A (zh) 2021-11-30
ZA202004758B (en) 2022-08-31
IL295534B1 (en) 2024-11-01
EP3143042A2 (en) 2017-03-22
KR20230053002A (ko) 2023-04-20
IL299282A (en) 2023-02-01
JP7454525B2 (ja) 2024-03-22
IL311293B1 (en) 2025-03-01
JP7098439B2 (ja) 2022-07-11
MX2021007020A (es) 2021-08-05
KR20230054503A (ko) 2023-04-24
EP3248986A3 (en) 2017-12-20
US20210269515A1 (en) 2021-09-02
IL248636B2 (en) 2023-04-01
WO2015173325A8 (en) 2016-12-29
PH12016502282A1 (en) 2017-02-13
IL248636B (en) 2022-12-01
AU2020202570A1 (en) 2020-05-07
WO2015173325A3 (en) 2016-02-18
BR122018009619B1 (pt) 2024-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7454525B2 (ja) 改善された免疫グロブリン可変ドメイン
USRE50682E1 (en) Immunoglobulin variable domains
RU2845084C2 (ru) Улучшенные вариабельные домены иммуноглобулина
RU2809788C2 (ru) Улучшенные вариабельные домены иммуноглобулина
HK40035363A (en) Immunoglobulin variable domains