RS59652B1 - Anti-n3pglu amiloid beta peptid antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela koja selektivno vezuju N3pGlu amiloid beta peptid i njihovu upotrebu u tretmanu bolesti povezanih sa amiloid beta (Aβ, takođe označen kao Abeta) peptidom.

[0002] Aβ peptid u cirkulišućem obliku sastavljen od 38-43 amino kiselina (uglavnom 38, 40 ili 42 amino kiselina) nastaje cepanjem prekursor proteina, amiloid prekursor proteina (APP). Konverzija Aβ iz rastvorljivih u nerastvorljive oblike sa visokim sadržajem β-nabranih ploča i formiranje naslaga ovih nerastvorljivih oblika kao neuritskih ili cerebrovaskularnih plakova u mozgu povezano je sa brojnim stanjima i bolestima, uključujući Alzheimer-ovu bolest (AD), Down-ov sindrom, i cerebralnu amiloidnu angiopatiju (CAA).

[0003] Naslage u plakovima se uglavnom sastoje od heterogene smeše Aβ peptida. N3pGlu Aβ, takođe označen kao N3pE ili Aβp3-42, je skraćeni oblik Aβ peptida koji se nalazi samo u plakovima. N3pGlu Aβ nema prva dva aminokiselinska ostatka na N-terminusu Aβ i ima piroglutamat koji je izveden iz glutaminske kiseline na trećoj aminokiselinskoj poziciji. Iako je N3pGlu Aβ peptid minorna komponenta Aβ naslaga u mozgu, studije su pokazale da N3pGlu Aβ peptid karakteriše agresivna agregacija i akumulira se rano u kaskadi formiranja naslaga.

[0004] Iako su poliklonska i monoklonska antitela koja se vezuju za N3pGlu Aβ peptid prethodno opisana (US 7,122,374 i WO2010/009987), i dalje postoji potreba za anti-N3pGlu Aβ monoklonskim antitelima visokog afiniteta koja vezuju ciljno mesto in vivo (tj. vezivanje za plak) i posledično smanjuju nivoe plaka. Dodatno, s obzirom da amino-terminalna i karboksi-terminalna anti-Aβ antitela dovode do povećanja mikrokrvarenja povezanih sa cerebralnom amiloidnom agiopatijom (CAA), postoji potreba za anti-N3pGlu Aβ antitelima koja ne dovode do povećanja mikrokrvarenja iako hronični tretman rezultuje u značajnom smanjenju naslaga plaka.

[0005] Predmet pronalaska je definisan priključenim patentnim zahtevima.

[0006] Antitela unutar obima ovog pronalaska su terapeutski korisni N3pGlu Aβ peptid antagonisti sa brojnim poželjnim osobinama. Antitela pronalaska vezuju humani N3pGlu Aβ peptid sa visokim afinitetom i pokazuju dozno-zavisno in vivo smanjenje plaka bez povećanja mikrokrvarenja kod cerebralne amiloidne angiopatije (CAA).

[0006] Antitela unutar obima predmetnog pronalaska su terapeutski korisni N3pGlu Aβ peptidn antagonisti koji poseduju brojne željene osobine. Predmetna antitela vezuju humani N3pGlu Aβ peptid sa visokim afinitetom i pokazuju dozno zavisno in vivo smanjivanje plaka bez povećanja mikrohemoragije povezane sa cerebralnom amiloidnom angiopatijom (CAA).

[0007] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je anti-N3pGlu Aβ antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCDRI je KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 je AVSKLX4S (SEQ ID NO:52), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) i HCDRI je GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), naznačeno time da XI je S ili T; X2 je Q ili R, X3 je G ili S, X4 je D ili G, X5 je D ili T, X6 je R ili D, i X7 je I, T, E, ili V, za upotrebu u prevenciji Alzheimer-ove bolesti.

[0008] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je anti-N3pGlu Aβ antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCDRI je KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 je AVSKLX4S (SEQ ID NO:52), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) i HCDRI je GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), naznačeno time da XI je S ili T; X2 je Q ili R, X3 je G ili S, X4 je D ili G, X5 je D ili T, X6 je R ili D, i X7 je I, T, E, ili V, za upotrebu u prevenciji stanja izabranog od kliničke ili pre-kliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, i kliničke ili pre-kliničke CAA.

[0009] Poželjno, anti-N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu uskladu sa predmetnim pronalaskom sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da pomenuti LCVR sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3 polipeptide i HCVR sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 polipeptide koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od:

a) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10); ili

e) LCDR1 je KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGVTVY (SEQ ID NO: 46).

[0010] Aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima Kd na 25°C manji od 1 x 10<-9>M za humani N3pGlu Aβ peptid. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment koje ima Kd na 25°C manji od 9 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima Kd na 25°C manji od 7 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima Kd na 25°C između 9 x 10<-10>M i 1 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima Kd na 25°C između 9 x 10<-10>M i 1 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid.

[0011] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje humano inženjeringom stvoreno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment koji ima Kdna 25°C manju od 1 x 10<-9>M, ili manju od 9 x 10<-10>M, ili manju od 7 x 10<-10>M, ili između 9 x 10<-10>M i 1 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid i smanjuje plak in vivo. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koje ima Kd na 25°C manji od 1 x 10<-9>M, ili manji od 9 x 10<-10>M, ili manji od 7 x 10-10 M, ili između 9 x 10<-10>M i 1 x 10<-10>M za humani N3pGlu Aβ peptid i smanjuje plak in vivo bez povećanja mikrokrvarenja povezanih sa CAA.

[0012] Prema sledećem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđenoje humano inženjeringom dobijeno anti- N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR naznačeno time da LCDR1 je KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 je AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) i HCDR1 je GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), naznačeno time da X1 je S ili T; X2 je Q ili R, X3 je G ili S, X4 je D ili G, X5 je D ili T, X6 je R ili D, i X7 je I, T, E, ili V.

[0013] Aspekt ovog pronalaska obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde pomenuti LCVR sadrži LCDR1, LCDR2, LCDR3 polipeptide i HCVR sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3 polipeptide koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od:

a) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10); i

e) LCDR1 je KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGVTVY (SEQ ID NO: 46).

[0014] U primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti- N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži LCVR i an HCVR naznačeno time da LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 4 , LCDR3 je SEQ ID NO: 5 , HCDR1 je SEQ ID NO: 6, HCDR2 je SEQ ID NO: 8, i HCDR3 je SEQ ID NO: 9. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno Anti-N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR naznačeno time da LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5 , HCDR1 je SEQ ID NO: 7, HCDR2 je SEQ ID NO: 8, i HCDR3 je SEQ ID NO: 10. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno Anti-N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR naznačeno time da LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 40, HCDR2 je SEQ ID NO: 8, i HCDR3 je SEQ ID NO: 41. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti-N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR naznačeno time da LCDR1 je SEQ ID NO: 3, LCDR2 je SEQ ID NO: 35, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 7, HCDR2 je SEQ ID NO: 8, i HCDR3 je SEQ ID NO: 10. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti- N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR i HCVR gde LCDR1 je SEQ ID NO: 45, LCDR2 je SEQ ID NO: 4, LCDR3 je SEQ ID NO: 5, HCDR1 je SEQ ID NO: 40, HCDR2 je SEQ ID NO: 8, i HCDR3 je SEQ ID NO: 46.

[0015] U sledećem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno anti- N3pGlu Aβ antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde su pomenuti LCVR i HCVR polipeptidi izabrani iz grupe koja se sastoji od:

a. LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 12;

b. LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 13;

c. LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 42;

d. LCVR iz SEQ ID NO: 36 i HCVR iz SEQ ID NO: 37; i

e. LCVR iz SEQ ID NO: 47 i HCVR iz SEQ ID NO: 48.

[0016] U primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 12. U primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 13. U primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR iz SEQ ID NO: 11 i HCVR iz SEQ ID NO: 42. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR iz SEQ ID NO: 36 i HCVR iz SEQ ID NO: 37. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji sadrži LCVR iz SEQ ID NO: 47 i HCVR of SEQ ID NO: 48.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monklonsko anitetlo koje sadrži laki lanac (LC) i težak lanac (HC), gde su LC i HC polipeptidi izabrani iz grupe koja se sastoji od:

a) LC iz SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 15;

b) LC iz SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 16;

c) LC iz SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 44;

d) LC iz SEQ ID NO: 38 i HC iz SEQ ID NO: 39; i

e) LC iz SEQ ID NO: 49 i HC iz SEQ ID NO: 50.

[0018] U primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LC of SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 15. U primeru izvođenja pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LC iz SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 16. U primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LC iz SEQ ID NO: 14 i HC iz SEQ ID NO: 44. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LC iz SEQ ID NO: 38 i HC iz SEQ ID NO: 39. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LC iz SEQ ID NO: 49 i HC iz SEQ ID NO: 50.

[0019] U poželjnom primeru izvođenja, anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaki LC je polipeptid iz SEQ ID NO: 14 i svaki HC je polipeptid iz SEQ ID NO: 15. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaki LC je polipeptid iz SEQ ID NO: 14 i svaki HC je polipeptid iz SEQ ID NO: 16. U poželjnom primeru izvođenja, anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaki LC je polipeptid iz SEQ ID NO: 14 i svaki HC je polipeptid iz SEQ ID NO: 44. U poželjnom primeru izvođenja, anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaki LC je polipeptid iz SEQ ID NO: 38 i svaki HC je polipeptid iz SEQ ID NO: 39. U poželjnom primeru izvođenja, anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca gde svaki LC je polipeptid iz SEQ ID NO: 49 i svaki HC je polipeptid iz SEQ ID NO: 50.

[0020] Prema dodatnom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompoziciju koja sadrži anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ovog pronalaska ili njegov antigen-vezujući fragment. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ovog pronalaska ili njegov antigen-vezujući fragment i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija dodatno sadrži jedan ili više terapeutskih sastojaka.

[0021] U sledećem aspektu, ovaj opis opisuje postupak za tretiranje stanja povezanog sa aktivnošću Aβ peptida, koji sadrži primenu na humanog pacijenta kojem je to potrebno anti-N3pGlu Aβ monoklonskog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta ovog pronalaska.

[0022] U sledećem aspektu, ovaj opis obezbeđuje postupak za tretiranje stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od kliničke ili prekliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, Down-ovog sindroma, ili kliničke ili prekliničke CAA, koji sadrži primenu na čoveka kom je to potrebno anti- N3pGlu Aβ monoklonskog antitela ovog pronalaska ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U poželjnom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za tretiranje Alzheimer-ove bolesti.

[0023] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti- N3pGlu Aβ monoklonsko anitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, za upotrebu u terapiji. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, za upotrebu u tretmanu stanja izabranih od kliničke ili prekliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, Down-ovog sindroma, ili kliničke ili prekliničke CAA. U poželjnijem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, za upotrebu u tretmanu Alzheimer-ove bolesti. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti- N3pGlu Aβ monoklonsko anitelo ili njegov antigen vezujući fragment, za upotrebu u prevenciji stanja izabranog od kliničke ili prekliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, Down-ovog sindroma, ili kliničke ili prekliničke CAA. U poželjnijem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti- N3pGlu Aβ monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, za upotrebu u prevenciji Alzheimer-ove bolesti.

[0024] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu anti- N3pGlu Aβ monoklonskog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, u proizvodnji medikamenta za tretman stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od kliničke ili prekliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, Down-ovog sindroma, ili kliničke ili prekliničke CAA. U poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu anti- N3pGlu Aβ monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u proizvodnji medikamenta za tretman Alzheimer-ove bolesti.

[0025] Antitelo pune dužine je molekul imunoglobulina koji sadrži 2 teška (H) lanca i 2 laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Amino terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100-110 aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena preko regiona koji određuju komplementarnost (CDR) sadržanih u njima. Karboksi terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju.

[0026] CDR su raspoređeni naizmenično sa konzervativnim regionima, označeni kao okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR) sastavljen je od 3 CDR i 4 FRs, raspoređenih od amino-terminusa do karboskiterminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDR lakog lanca označavaju se kao "LCDR1, LCDR2, i LCDR3" i 3 CDR teškog lanca označavaju se kao "HCDR1, HCDR2, i HCDR3." CDR sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Broj i pozicioniranje CDR aminokiselinskih ostataka unutar LCVR i HCVR regiona je u skladu sa dobro poznatom Kabat konvencijom numerisanja.

[0027] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda, i karakterišu se određenim konstantnim regionom kao što je poznato u tehnici. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE, respektivno. IgG antitela mogu se dalje podeliti u potklase, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. Svaki tip teškog lanca karakteriše se određenim konstantnim regionom sa sekvencom koja je dobro poznata u tehnici.

[0028] Kao što je ovde korišćeno, termin "monoklonsko antitelo" (Mab) odnosi se na to antitelo koje je izvedeno ili izolovano iz jedne kopije ili klona uključujući, na primer, bilo koji eukariotski, prokariotski, ili fagni klon, i ne postupak sa kojim je proizvedeno. Mab ovog pronalaska poželjno postoje u homogenoj ili suštinski homogenoj populaciji. Kompletna Mab sadrže 2 teška lanca i 2 laka lanca. Fraza "antigen-vezujući fragmenti" uključuju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2 fragmente, i jednolančane Fv fragmente. Monoklonska antitela ovog pronalaska i njegovi antigen-vezujući fragmenti mogu se proizvesti, na primer, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, sintetičkih tehnologija, npr., CDR-graftovanje, ili kombinacijom takvih tehnologija, ili drugih tehnologija poznatih u tehnici. Na primer, miševi se mogu imunizovati sa humanim Anti-N3pGlu Aβ ili njegovim fragmentima, rezultujuća antitela se mogu rekuperovati i prečistiti, i određivanje da li poseduju vezujuće i funkcionalne osobine slične ili iste kao jedinjenja antitela opisana ovde može se proceniti postupcima suštinski kao što su opisani u Primerima u nastavku. Antigen-vezujući fragmenti mogu se takođe pripremiti konvencionalnim postupcima. Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata dobro su poznati u tehnici i mogu se naći, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0029] Fraza "humana inženjeringom dobijena antitela" odnosi se na monoklonska antitela koja imaju vezujuće ii funkcionalne osobine prema pronalasku, i koja imaju okvirne regione koji su suštinski humani ili potpuno humani koji okružuju CDR izvedene iz ne-humanih antitela. "Antigen-vezujući fragmenti" takvih humanih inženjeringom dobijenim antitela uključuju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2 fragmente, i jednolančane Fv fragmente. "Okvirni region" ili "okvirna sekvenca" odnosi se na bilo koji od okvirnih regiona 1 do 4. Humana inženjeringom dobijena antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti obuhvaćena ovim pronalaskom uključuju molekule gde bilo koji ili više od okvirnih regiona 1 do 4 je suštinski ili potpuno human, tj., gde bilo koja od mogućih kombinacija pojedinačnih suštinski ili potpuno humanih okvirnih regiona 1 do 4, je prisutna. Na primer, ovo uključuje molekule u kojima je okvirni region 1 i okvirni region 2, okvirni region 1 i okvirni region 3, okvirni region 1, 2, i 3, itd., su suštinski ili potpuno humani. Suštinski humani okvirni regioni su oni koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa poznatom humanom okvirnom sekvencom klicine linije. Poželjno, suštinski humani okvirni regioni imaju najmanje oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% identičnosti sekvence sa poznatom humanom okvirnom sekvencom klicine linije.

[0030] Potpuno humani okvirni regioni su oni koji su identični poznatoj humanoj okvirnoj sekvenci klicine linije. Humane okvirne sekvence klicine linije mogu se dobiti od ImMunoGeneTics (IMGT) preko njihovog veb sajta http://imgt.cines.fr, ili od The Inmunoglobulin FactsBook od Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press,

1

2001, ISBN 012441351. Na primer, okvirne sekvence lakog lanca klicine linije mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, O2, i O8, i okvirni regioni teškog lanca klicine linije mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, i VH5-5I.

[0031] Humana inženjeringom dobijena antitela dodatno onima opisanim ovde koja pokazuju slične funkcionalne osobine prema ovom pronalasku mogu se stvoriti korišćenjem nekoliko različitih postupaka. Specifična jedinjenja antitela opisana ovde mogu se koristiti kao šabloni ili ishodna jedinjenja antitela za pripremu dodatnih jedinjenja antitela. U jednom pristupu, CDR ishodnog jedinjenja antitela graftovani su u humani okvirni region koji ima visoku identičnost sekvence sa okvirnim regionom ishodnog jedinjenja antitela. Identičnost sekvence novog okvirnog regiona generalno će biti najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identičnosti sa sekvencom odgovarajućeg okvirnog regiona u ishodnom jedinjenju antitela. Ovo graftovanje može rezultovati u redukciji afiniteta vezivanja u poređenju sa onim kod ishodnog antitela. Ukoliko je to slučaj, okvirni region može biti povratno mutiran u ishodni okvirni region na određenim pozicijama na osnovu specifičnih kriterijuma opisanih od strane Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Dodatna literatura koja opisuje postupke korisne u humanizovanju antitela miša uključuju SAD Patent br. 4,816,397; 5,225,539, i 5,693,761; kompjuterski programi ABMOD i ENCAD kao što je opisano u Levitt (1983) J. Mol. Biol.168:595-620; i postupak od Winter i saradnika (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; i Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

[0032] Identifikacija ostataka koji se mogu razmatrati za povratne mutacije može se izvesti kao što sledi:

Kada aminokiselina spada u sledeću kategoriju, okvirne aminokiseline sekvence humane klicine linije koja se koristi ("akceptorski okvirni region") zamenjen je sa aminokiselinom okvirnog regiona iz okvirnog regiona ishodnog jedinjenja antitela ("donor okvirni region"): (a) aminokiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvirnog regiona je netipična za humane okvirne regione u tom položaju, dok je odgovarajuća aminokiselina u donor imunoglobulinu tipična za humane okvirne regione u tom položaju;

(b) položaj aminokiseline je neposredno pored jednog od CDR; ili

(c) bilo koji atom bočnog lanca aminokiseline okvirnog lanca je unutar oko 5-6 angstrema (centar-do-centra) bilo kog atoma CDR aminokiseline u trodimenzionalnim modelom imunoglobulina.

[0033] Kada je svaka aminokiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvirnog regiona i odgovarajuća aminokiselina u donor okvirnom regionu generalno netipična za humane okvirne regione u tom položaju, takva aminokiselina se može zameniti sa aminokiselinom tipičnom za humane okvirne regione u tom položaju. Ovaj kriterijum za povratnu mutaciju omogućava rekuperaciju aktivnosti ishodnog jedinjenja antitela.

[0034] Drugi pristup za stvaranje humanih inženjeringom dobijenih antitela koja prikazuju slične funkcionalne osobine jedinjenjima antitela opisanim ovde uključuje mutiranje aminokiselina po principu slučajnosti unutar graftovanih CDR bez promene okvirnih regiona, i skrining rezultujućih molekula u odnosu na afinitet vezivanja i druge funkcionalne osobine koje su iste kao ili bolje od onih kod ishodnih jedinjenja anitela. Takođe se mogu uvesti pojedinačne mutacije na svaku aminokiselinsku poziciju unutar svakog CDR, nakon čega se procenjuju efekti takvih mutacija na afinitet vezivanja i druge funkcionalne karakteristike. Pojedinačne mutacije koje proizvode poboljšanje osobine mogu se kombinovati da bi se porcenio njihov kombinovani efekat

[0035] Dodatno, moguća je kombinacija oba prethodna pristupa. Nakon CDR graftovanja, mogu se povratno mutirati specifični okvirni regioni dodatno uvođenju aminokiselinskih promena u CDR. Ova metodologija je opisana u Wu et al. (1999) J. Mol. Biol.294:151-162.

[0036] Primenom navedenog iz ovog pronalaska, stručnjak može koristiti uobičajene tehnike, npr., mutagenezu usmerenu na mesto, da bi se zamenile aminokiseline unutar ovde opisanih CDR i okvirnih sekvenci i time generisati dodatne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona izvedene iz ovih sekvenci. Sve alternativne aminokiseline koje se javljaju u prirodi mogu se uvesti na specifično mesto supstitucije. Ovde opisani postupci se zatim mogu koristiti za skrining ovih dodatnih aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona da bi se identifikovale sekvence koje imaju naznačene in vivo funkcije. Na taj način, mogu se identifikovati dodatne sekvence pogodne za pripremanje humanih inženjeringom dobijenih antitela i njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa ovim pronalaskom. Poželjno, supstitucija aminokiseline unutar okvirnih regiona ograničena je na jednu, dve, ili tri pozicije unutar bilo kog ili više od okvirnih regiona 4 laka lanca i/ili teška lanca opisana ovde. Poželjno, aminokiselinska supstitucija unutar CDR ograničena je na jednu, dve, ili tri pozicije unutar bilo kog ili više od CDR 3 laka lanca i/ili teška lanca. Takođe su moguće kombinacije različitih promena unutar ovih prethodno opisanih okvirnih regiona i CDR.

[0037] Termin "tretiranje" (ili "tretirati" ili "tretman") odnosi se na postupke koji uključuju usporavanje, prekidanje, zaustavljanje, kontrolisanje, stopiranje, smanjenje, ili vraćanje u prvobitno stanje progresije ili težine postojećeg simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti, ali ne uključuju obavezno potpunu eliminaciju svih simptoma povezanih sa bolešću, stanjem, ili poremećajem povezanim sa anti- N3pGlu Aβ antitelom.

[0038] Antitela ovog pronalaska mogu se koristiti kao medikamenti u humanoj medicini, primenjeni na različite načine. Najpoželjnije, takve kompozicije su za parenteralnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije mogu se pripremiti postupcima koji su dobro poznati u tehnici (Videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i obuhvataju antitelo kao što je ovde opisano ili njegov antigen-vezujući fragment, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent.

[0039] Rezultati sledećih testova pokazuju da su monoklonska antitela i njegovi antigenvezujući fragmenti ovog pronalaska korisni za tretiranje stanja povezanog sa aktivnošću Aβ peptida kao što je Alzheimer-ova bolest, Down-ov sindrom, i CAA.

Primer 1: Proizvodnja antitela

[0040] Inicijalno stvaranje antitela: FVB transgeni miševi su imunizovani sa N-terminalno skraćenim i piroglutamat-modifikovanim humanim amiloid β peptidom 3-42 (N3pGlu) pretretiranim na 37°C preko noći da bi se formirao agregat. Ćelije slezine miševa sakupljene su i Aβ1-40 reaktivne B ćelije istrošene su sa MACS. Preostale ćelije su sortirane za vezivanje sa agregiranim N3pGlu Aβ peptidom. RNK je izolovana iz izabranih B-ćelija i pretvorena u cDNK upotrebom oligo dT. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca antitela su dobijeni sa PCR upotrebom prajmera signalne sekvence antitela i klonirani u fagni vektor preko Kunkel mutageneze da bi se formirala Fab biblioteka. Izvršen je skrining Fab biblioteke u odnosu na vezivanje agregiranog N3pGlu peptida preko Single-Point ELISA (SPE) i izvršen je suprotni skrining protiv Aβ1-40. Pozitivni klonovi su okarakterisani sekvenciranjem DNK, ekspresijom fab, i vezivanjem sa N3pGlu Aβ peptidom, i nedostatkom vezivanja za rastvorljivi Aβ1-40 ili Aβ1-42 peptid.

[0041] Konstruisane su biblioteke mutanata u odnosu na pojedinačnu aminokiselinu i izvršen je skrining sa SPE za vezivanje za agregirani N3pGlu Aβ peptid, ali ne za Aβ1-42. Korisne mutacije su kombinovane u kombinatorne biblioteke. Kombinatorne varijante sa optimizovanim afinitetom su izabrane i pretvorene u mišji IgG1 za merenje afiniteta sa BIACORE® i vezivanje za Aβ plak preko imunohistohemije. Od identifikovanog klona, mAb

1

protein je napravljen i u mišjim IgG1 (mE8) i u IgG2a (mE8c) izotipovima za studije in vivo efikasnosti. mE8 se ne vezuje za mišju N3pGlu Aβ sekvencu (mpE3-16) ili humani Aβ1-42.

[0042] Okvirni regioni humane klicine linije VH1-69/JH6 i Vk-A18/JK2 upotrebljeni su za inicijalnu humanizaciju. CDR mE8 antitela (sa četiri afinitetne mutacije) graftovani su u humani okvirni region čime se dobija hE8-C6 antitelo. Dodatna optimizacija afiniteta izvedena je na hE8-C6 osnovnom lancu, i korisne mutacije su kombinovane da bi se stvorila visoko afinitetna, huimanizovana, varijanta R5, R17, R24 i 2420.

[0043] Druga runda optimizacije da bi se poboljšalo razvijanje leka: Dve hunanizovane varijante, hE8-C6 i R17, su izabrane kao osnovni lanac za drugu rundu optimizacije da bi se poboljao polu-život antitela u serumu smanjenjem nespecifičnog vezivanja za ćelije i da bi se povećao afinitet antitela za rastvorljivi N3pGlu Aβ peptid. Biotinilovani rastvorljivi peptid koji se sastoji od 14 N-terminalnih aminokiselina N3pGlu Aβ (pE3-16B) sintetisan je i procenjen kao ekvivalentan sa N3pGlu Aβ peptidom za vezivanje mE8 antitela. Razvijen je test visoke produktivnosti sa podizanjem filtera sa upotrebom pE3-16B i primenjen je na sve naknadne skrininge bibilioteke. Svi pogoci sa skrininga sa podizanjem filtera potvrđeni su vezivanjem sa agregiranim N3pGlu Aβ.

[0044] Izvršen je ponovni skrining biblioteke hE8-C6 varijanti korišćenjem testa sa podizanjem filtera i identifikovana je grupa korisnih mutacija. Njihova podgrupa je korišćena da bi se napravila kombinatorna biblioteka. Četiri kombi varijante (CoII-E10, CoII-G2, CoII-G8 i CoII-E2) su izabrane za ovaj pristup.

[0045] Upotrebljeno je kompjutersko modelovanje da bi se stvorili strukturni modeli V-regiona hE8-C6, R17, R24 i drugih varijanti. Analiza strukturnog modela identifikuje pozitivna naelektrisanja uvedena za klasterovanje optimizacije afiniteta na mestu vezivanja, potencijalnog uzroka nespecifičnog vezivanja antitela za ćelije. Na osnovu modelovanja, nekoliko pozicija je izabrano za uvođenje promena da bi se balansirao površinski elektrostatički potencijal. Kombinatorna biblioteka je sintetisana kombinovanjem nekih korisnih mutacija iz skrininga biblioteke i promene su definisane strukturnim modelovanjem. Tri varijante (R17m-B4, R17m-A12 i R17m-B12) izabrane su na osnovu ovoga za dalja istraživanja.

[0046] Analiza strukturnog modela takođe otkriva sterički sudar između ostatka Y36 okvirnog regiona lakog lanca i ostataka u CDR3 teškog lanca. Uvedena je mutacija Y36L u hE8-C6 laki lanac da bi se proizvela varijanta hE8L. Nađeno je da samo ova promena okvirnog regiona ima značajan uticaj i na povećanje afiniteta antitela i smanjivanje nespecifičnog vezivanja ćelije.

[0047] Drugi deo bio je da se testira različiti humani okvirni region u odnosu na humanizaciju. CDR iz mE8 antitela graftovani su na okvirne regione VH5-51/VKO2 i VH3-23/VKA2. Humanizovani Fab sa VH5-51/VKO2 (hE8-51O2) je određen kao ekvivalentan, ukoliko ne bolji, sa hE8-C6 u N3pGlu Aβ vezivanju. Uvođenje dodatnih korisnih mutacija u hE8-51O2 stvara kombi varijante CI-A1, CI-B6, CI-C7 i CI-B8.

[0048] Nakon prolaska svih in vitro testova, uključujući ELISA i BIACORE® za specifičnost za antigen i afinitet, nespecifično vezivanje ćelija, i IHC bojenje, izabrano je pet vartijanti mAb, B12L, CI-C7, hE8L, R17L, i R17.

[0049] Antitela se mogu napraviti i prečistiti suštinski kao što sledi. Odgovarajuća ćelija domaćin, kao što je HEK 293 EBNA ili CHO, je bilo prolazno ili stabilno transficirana sa ekspresionim sistemom za izlučivanje antitela korišćenjem optimalnog predeterminisanog HC:LC vektor odnosa ili sistema sa jednim vektorom koji kodira i HC, kao što je SEQ ID NO: 56, i SEQ ID NO: 43, i LC, kao što je SEQ ID NO: 55. Bistri medijum, u koje je izlučeno antitelo, prečišćen je upotrebom bilo koje od mnogih uobičajeno korišćenih tehnika. Na primer, medijum se može pogodno primeniti na Protein A ili G Sefaroza FF kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferovani slani rastvor (pH 7.4). Kolona je isprana da bi se uklonile nespecifične vezujuće komponente. Vezano antitelo je eluirano, na primer, sa pH gradijentom (kao što je 0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 2.5). Detektovane su frakcije antitela, kao preko SDS-PAGE, i zatim su pulovane. Dalje prečišćavanje je izborno, u zavisnosti od nameravane upotrebe. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregati i multimeri mogu se efikasno ukloniti uobičajenim tehnikama, uključujući ekskluzionu, sa hidrofobnom interakcijom, jono-izmenjivačku, ili hidroksiapatitnu hromatografiju. Čistoća antitela nakon ovih hromatografskih koraka veća je od 99%. Proizvod može biti trenutno smrznut na -70°C ili se može liofilizovati. Aminokiselinske sekvence za ova antitela ovog pronalaska obezbeđena su u nastavku.

Tabela 1- SE ID Nos Antitela

1

Primer 2: Afinitet vezivanja za rastvorljivi N3pGlu

[0050] Površinska plazmon rezonaca merena sa BIACORE® 2000 instrumentom korišćena je za merenje vezivanja N3pGlu Aβ sa anti-N3pGlu antitelom. Osim gde je naznačeno, svi reagensi i materijali su od BIACORE® AB (Upsala, Švedska). Sva merenja su izvršena na 25°C. Uzorci su rastvoreni u HBS-EP puferu (150 mM natrijum hlorid, 3 mM EDTA, 0.005% (tež/zapr) surfaktant P-20, i 10 mM HEPES, pH 7.4).

[0051] Serija Abeta peptida sa pozicionim promenama (mutanti glicina) sintetisana je da bi se procenio uticaj datog ostatka na vezivanje antitela i time identifikovale karakteristike i sekvenca potrebna za prepoznavanje antitela:

Ime peptida Abeta 3-16 sekvenca

pE3-16 Pyr-EFRHDSGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 25 E3-16 EFRHDSGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 26 pEG4 Pyr-EGRHDSGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 27 mpE3-16 Pyr-EFGHDSGFEVHHQK-biotin (glodar) SEQ ID NO: 28 pEG6 Pyr-EFRGDSGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 29 pEG7 Pyr-EFRHGSGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 30 pEG8 Pyr-EFRHDGGYEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 37 pEF10 Pyr-EFRHDSGFEVHHQK-biotin SEQ ID NO: 39

Značaj skraćenog (des 1,2) i modifikovanog oblika glutaminske kiseline (3 pyr-E ili 3 pyr-Glu) procenjen je poređenjem Aβ 1-42 vezivanja nasuprot Aβ 3-16 nasuprot pE3-16 (SEQ ID NO:1 nasuprot SEQ ID NO:26 nasuprot SEQ ID NO:25, respektivno). Peptidi su rastvoreni u PBS sa 5mg/ml pre razblaživanja za eksperimente vezivanja.

[0052] Vezivanje je procenjeno korišćenjem višestrukih analitičkih ciklusa hvatanja antitela, injekscije/asocijacije peptida, produženog protoka pufera za disocijaciju, i površinsku regeneraciju. Za korak hvatanja antitela, u zavisnosti od tipa antitela koje se hvata, CM5 čip je imobilisan ili sa proteinom A ili kozjim anti-mišjim Fc. Izuzev mišjih antitela, svaki ciklus se sastoji od: injekcije ∼5-7 µL 10 µg/mL anti-N3pGlu antitela sa 5 µl/min (hvatanje približno 3,000 RU), injekcije 100 µL peptida sa 50 µl//min (1000 nM - 62.5 nM u dvostrukim serijskim razblaženjima za svaki ciklus), praćeno sa 10 minuta za disocijaciju. Za mišje antitelo, stopa protoka je 50 µL/min, i 20 µL mišjeg antitela sa 50µg/ml je injektirano. U oba

1

slučaja, površina čipa je regenerisana korišćenjem 20 µL 10 mM glicin hidrohlorida, pH 1.5. Afinitet vezivanja (KD) je zatim dobijen iz stopa asocijacije i disocijacije za svaki ciklus korišćenjem 1:1 modela vezivanja u BIAevaluation analysis softveru. Anti-N3pGlu antitela, B 12L i R17L i ishodno mišje antitelo (mE8C) specifično prepoznaju N3pGlu Aβ, sa KD manjom od 1 nM. Anti-N3pGlu antitela, B12L i R17L i ishodno mišje antitelo (mE8C) takođe se vezuju sa pE3-16 sa sličnim afinitetom, ukazujući da je epitop lociran unutar ovog regiona peptida. Analiza vezivanja antitela sa glicin mutantnim peptidima pokazuje da su ostaci kritični za vezivanje bili od 3 do 7: pyroE na poziciji 3, F na poziciji 4, R na poziciji 5, H na poziciji, D na poziciji 7. Detektabilno vezivanje Aβ1-40 nije detektovano za antitela ovog pronalaska.

Primer 3: Afinitet vezivanja za agregirani N3pGlu

[0053] BIACORE® eksperimenti su takođe izvedeni da bi se pratilo vezivanje anti-N3pGlu antitela za agregirani N3pGlu Aβ. U ovom eksperimentu, N3pGlu Aβ peptid je imobilisan na različitim gustinama protočnih ćelija 2 (niska gustina, LD), 3 (srednja gustina, MD), i 4 (visoka gustina, HD) na CM-5 čipu preko hemije kuplovanja amina. Različiti nivoi N3pGlu Aβ peptida su imobilisani da bi se ispitao uticaj površinske gustine na vezivanje anti-N3pGlu antitela. Po imobilizaciji, najveći deo N3pGlu Aβ agregira na površini kao što je pokazano nedostatkom vezivanja kontrolnog Mab koji prepoznaje samo monomerni peptid. Ovaj agregatni oblik peptida imitira karakteristike agregiranih abeta peptida u vlaknastom ili amiloidnom obliku, gde je N-terminalni region peptida izložen i može biti ciljno mesto antitela.

[0054] Vezivanje je procenjeno korišćenjem višestrukih analitičkih ciklusa na 25°C. Svaki ciklus je izveden na stopi protoka od 50 µL/min i sastoji se od sledećih koraka: injekcije 250 µL rastvora N3pGlu antitela (počinjući od 500 nM i korišćenjem dvostrukih serijskih razblaženja za svaki ciklus) praćeno sa 20 minuta za disocijaciju, i regeneraciju korišćenjem ∼30 µL 10 µM glicin hidrohlorida, pH 1.5. Stope asocijacije i disocijacije za svaki ciklus su procenjivane korišćenjem modela heterogenog liganda u BIAevaluation softveru. Kako 1:1 model vezivanja ne odgovara podacima, heterogeno fitovanje daje dva afiniteta vezivanja (nizak i visok afinitet). R17L i B12L antitela i ishodno mišje antitelo mE8c vezuju se za agregirani N3pGlu Aβ sa visokim afinitetom KD,1 <100 pM i nižim afinitetom KD,2 < 10 nM. Maksimalni signal vezivanja (Rmax) izračunat je kao suma Rmax iz vezivanja niskog i visokog afiniteta. Pokazano je da se Rmax povećava kako se povećava gustina peptida na

1

površini, kao što je očekivano kada je više mesta vezivanja dostupno na površini veće gustine. Ove studije vezivanja pokazuju da se antitela ovog pronalaska vezuju za agregirani N3pGlu Aβ.

Primer 4: Studije Ex Vivo angažovanja ciljnog mesta

[0055] Imunohistohemijska analiza je izvedena sa egzogeno dodatim Aβ antitelima da bi se odredilo ex vivo angažovanje ciljnih mesta na presecima mozga iz fiksiranog PDAPP mozga (24-meseca star). Pokazano je da PDAPP transgeni miš razvija veći deo patologije povezane sa Alzheimer-ovom bolešću. Za mišja antitela, biotin obeleživač je korišćen kao obeleživač jer je ovaj eksperiment izveden na tkivu miša, i stoga nije odgovarajuće direktno poređenje između nebiotinilovanih ne-mišjih anti-N3pGlu antitela. Biotinilovano 3D6 N terminalo (1-5) antitelo robusno obeležava značajne količine nataloženog Aβ u PDAPP hipokampusu, dok biotinilovani mE8 obeležava samo podgrupu naslaga. Za razliku od humanog AD mozga, velika većina nataloženog Aβ u PDAPP mozgu je pune dužine. Uočeno je slično obeležavanje plaka za ne- biotinilovana anti-N3pGlu antitela, kao što su B12L i R17L (u poređenju sa mE8). Nije uočeno specifično obeležavanje plaka bilo za mišje ili humane kontrolne IgG. Kako je sastav i verovatno struktura nataloženog Aβ dramatično različita u AD mozgu, nebiotinilovana anti-N3pGlu (3 ug/ml) antitela su istraživana da bi se odredilo da li vezuju nataloženi Aβ na presecima mozga iz sveže zaleđenog AD mozga. Pozitivna kontrola antitela (biotinilovano 3D6) intenzivno obeležava mnoge Aβ plakove u AD mozgu, dok negativna kontrola antitela (mišji i human i IgG) nema uočljivo vezivanje. Nekoliko od nebiotinilovanih anti-N3pGlu antitela kao što su B12L i R17L vezuju se slično sa nataloženim Aβ. Ove histološke studije pokazuju da anti-N3pGlu antitela ovog pronalaska mogu angažovati nataloženi Aβ ciljno mesto ex vivo.

Primer 5: Studije In Vivo angažovanja ciljnog mesta

[0056] Merena je sposobnost anti-N3pGlu antitela da angažuje nataložene ciljne strukture in vivo. Sub-hronična 4-nedeljna studija je izvedena sa biotinilovanim mišjim antitelima 3D6 i mE8c na 40 mg/kg primenjenim intraperitonealno (IP) nedeljno. Mozgovi su sakupljeni po završetku eksperimenta i nivo angažovanja ciljnioh mesta je određen histološkim pregledom mozga. Životinje kojima je ubrizgan biotinilovani 3D6 imaju plake samo duž hipokampalne fisure, dok miševi kojima je ubrizgan biotinilovani mE8c pokazuju robusno obeležavanje

1

plaka u hipokampalnim i kortikalnim regionima. Veoma slični obrasci angažovanja ciljnih mesta uočeni su u akutnijem 3-dnevnom testu (bojenje 3D6 hipokampalne fisure i mE8 obeležavanje i hipokampalnih i kortikalnih regiona). Ovi rezultati snažno sugerišu da 3D6 antitelo, koje vezuje i rastvorljivi i nerastvorljivi Aβ, postaje zasićen sa rastvorljivim Aβ i stoga nije sposoban da angažuje željeni nataloženi target. Potpuno suprotno, mišje anti-N3pGlu antitelo mE8c konzistentno angažuje nameravani target u oba kritična moždana regiona. Visoke i niske doze R17L i B12L anti-N3pGlu antitela procenjivane su u sličnoj 3-dnevnoj in vivo studiji. Antitela su injektirana IP bilo sa 10mg/kg (niska doza) ili 40mg/kg (visoka doza). Po zaključivanju studije, plazma i mozgovi su sakupljeni i određena je PK plazme. Mozgovi su isečeni i izvedena je imunohistohemija na sestrinskim presecima sa antihumanim antitelom (da bi se detektovalo vezano anti-N3pGlu antitelo) i 3D6 (da bi se detektovala ukupna količina nataložene ciljne strukture u preseku). Da bi se bolje kvantifikovao nivo in vivo angažovanja ciljnih mesta, procenat površine vezan sa anti-N3pGlu antitelom je normalizovan prema ukupnom % površine mogućeg ciljnog mesta (ukupni nataloženi Aβ vizuelizovan imunohistohemijom egzogenog 3D6). Dodatno, ukupni procenat angažovanja ciljnih mesta je normalizovan prema vrednosti plazma farmakokinetike (PK) za svakog pojedinačnog miša jer su značajna izlaganja detektovana pri zaključivanju studije. Nađeno je da i R17L i B12L anti-N3pGlu antitela angažuju nataloženi plak sa sličnom distribucijom kao što je ona uočena sa mišjim anti-N3pGlu antitelom (mE8). Ovi rezultati pokazuju da R17L i B 12L anti-N3pGlu antitela kada su primenjena periferno mogu proći krvno-moždanu barijeru i angažovati nameravana ciljna mesta nataloženog Aβ, dok antitelo koje vezuje i rastvorljivi i nerastvorljivi Aβ postaje zasićeno sa rastvorljivim i ne može angažovati nameravana nataložena ciljna mesta.

Primer 6: Terapeutske studije smanjenja plaka

[0057] Terapeutska studija smanjivanja plaka kod PDAPP miševa starih 23 meseca izvedena je sa sledećim antitelima:

Negativno kontrolno antitelo (IgG2a), 3D6, mE8 (IgG1), i mE8c (IgG2a). Ostareli PDAPP miševi injektirani su potkožno sa 12.5 mg/kg svakog antitela nedeljno u trajanju od tri meseca. Grupi miševa je izvedena autopsija na početku studije (nulta vremenska tačka) da bi se odredilo inicijalno opterećenje plakom na 23-meseca starosti. Po zaključenju studije, uzeta je plazma i mozgovi su obrađeni u odnosu na biohemijske i histološke ishode (jedna hemisfera svaki). Hipokampus i kortikalni regioni su homogenizovani u 5M guanidinu i Aβ

1

sadržaj je meren kiselim urea gelovima nakon čega je urađen Western bloting. Analiza hipokampalnih guanidin lizata od 23-meseci starih iz nulte vremenske tačke i negativno kontrolno antitelo (26-meseci starih) kohorti pokazuju beznačajno povećanje u nataloženom Aβ1-42; time potvrđujući da su mozgovi PDAPP miševa na platou plaka. Slično prethodnim studijama kod ostarelih PDAPP miševa, tretman sa 3D6 antitelom za poređenje nema efekat na smanjenje plaka. Tretman bilo sa N3pGlu antitelom, mE8 ili mE8c, rezultuje u značajnom smanjenju plaka u poređenju sa IgG2a antitelom negativom kontrolom (p<0.01 i p<0.001, respektivno)(Tabela 2). mE8 i mE8c smanjuju hipokampalni Aβ1-42sa ∼38% i ∼53%, respektivno. N3pGlu antitelo mE8c sa maksimalnom efektorskom funkcijom ima tendenciju da bude efikasnije od minimalnog efektorskog antitela mE8 (u poređenju sa kontrolom), međutim ova razlika ne dostiže statističku značajnost. Takođe, mE8c antitelo ima značajno ∼30% smanjenje Aβ1-42u hipokampusu u poređenju sa miševima iz nulte veremenske tačke (t-test; p<0.0066), stoga ukazujući na klirens prethodno nataloženih plakova. Analiza koritikalnih guanidin lizata daje veoma slične rezultate uz izuzetak da samo mE8c sa maksimalnom efektorskom funkcijom značajno smanjuje Aβ1-42taloženje. Ovi rezultati pokazuju da hronični tretman sa N3pGlu antitelima iz ovog Primera značajno smanjuje taloženje plaka kod starih PDAPP miševa na način zavisan od efektorske funkcije. Dodatno, ovi rezultati podržavaju hipotezu da je slabo angažovanje targeta za Aβ antitela koja vezuju i rastvorljivi i nerastvorljivi Aβ (suprotno senescenciji) bio uzorčni faktor za njihov nedostatak efikasnosti kada su korišćeni u terapeutskim paradigmama.

Tabela 2 – Smanjenje hipokampalnih i korteksnih plaka (ng Aβ1-42/mg vlažne težine)

2

Primer 7: Analiza mikrokrvarenja kod ostarelih PDAPP miševa

[0058] Izvedena je histološka studija da bi se istražilo da li bi mehanizam dejstva N3pGlu antitela koji dovodi do manjeg smanjivanja plaka kod ostarelih PDAPP miševa rezultovao u pogoršanju CAA-povezanim mikrokrvarenjem. Prethodne studije su pokazale da će tretman ostarelih APP transgenih miševa sa određenim anti- Aβ aminoterminalnim i karboksiterminalnim antitelima dovesti do povećanja u CAA-povezanim mikrokrvarenjima (Pfeifer et al. 2002; Wilcock et al. 2004; Racke et al. 2005). Iako mehanizam koji je u osnovi ovog potencijalno štetniog događaja nije jasan, date su dve međusobno neisključujuće hipoteze: redistribucija Aβ u cerebralnim krvnim sudovima (Wilcock et al. 2004) ili direktno vezivanje antitela za postojeće CAA (Racke et al. 2005). Biohemijske i histološke analize pokazuju da je Aβp3-xkonstituent CAA i kod AD pacijenata i kod PDAPP miševa. Detaljna histološka analiza mikrokrvarenja kod ostarelih PDAPP miševa (23 do 26 meseci starosti) koji su terapeutski tretirani sa N3pGlu i kontrolnim antitelima izvedena je u toku tri meseca sa nedeljnim potkožnim injekcijama od 12.5 mg/kg. Pozitivna kontrola za analizu mikrokrvarenja su životinje hronično tretirane sa 3D6 koje su prethodno pokazale da ovo anti-Aβ amino-terminalno antitelo značajno pogoršava mikrokrvarenja (Racke et al. 2005). Po zaključenju studije, jedna hemisfera mozga svake životinje je fiksirana ubacivanjem u 4% formaldehid i ukalupljena u parafin. Frontalni preseci koji obuhvataju 2mm tkiva isečeni su na 50 pločica (četiri 10 mm preseka po pločici). Jedanaest pločica iz jednakih intervala duž 2mm tkiva obojeno je sa Perls Blue da bi se vizuelizovao hemosiderin (akumulacija gvožđa u ćeliji usled mikrokrvarenja). Dva preseka po pločici su ručno brojana u skaldu sa procedurom za slepi eksperiment. Hronični tretman ostarelih PDAPP miševa sa 3D6 (pozitivna kontrola) dramatično povećava mikrokrvarenja (p<0.001). Važno je da je pokazano da tretman ili sa mE8 (IgG1) ili sa mE8c (IgG2a) ne pogoršava mikrokrvarenja, iako ova N3pGlu antitela značajno smanjuju nataloženi Aβ kod ovih životinja. Ovi rezultati pokazuju da N3pGlu antitela iz ovog Primera ne pogoršavaju CAA-povezano mikrokrvarenje kod ostarelih PDAPP miševa.

2

2

2

2

2

2

1

2

4

�

�

4

4

4

4

�

1

�

4

1

2

4

1

2

4

1

�

4

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Anti-N3pGlu Aβ antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCDRI je KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 je AVSKLX4S (SEQ ID NO:52), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) i HCDRI je GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), naznačeno time da XI je S ili T; X2 je Q ili R, X3 je G ili S, X4 je D ili G, X5 je D ili T, X6 je R ili D, i X7 je I, T, E, ili V, za upotrebu u prevenciji Alzheimer-ove bolesti.

2. Anti-N3pGlu Aβ antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCDRI je KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 je AVSKLX4S (SEQ ID NO:52), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) i HCDRI je GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), naznačeno time da XI je S ili T; X2 je Q ili R, X3 je G ili S, X4 je D ili G, X5 je D ili T, X6 je R ili D, i X7 je I, T, E, ili V, za upotrebu u prevenciji stanja izabranog od kliničke ili prekliničke Alzheimer-ove bolesti, prodromalne Alzheimer-ove bolesti, i kliničke ili pre-kliničke CAA.

3. Anti-N3pGlu Aβ antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde pomenuti LCVR sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3 polipeptide i HCVR sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 polipeptide koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od:

a) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGITVY (SEQ ID NO: 9);

b) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10);

c) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGETVY (SEQ ID NO: 41);

d) LCDR1 je KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2 je AVSKLGS (SEQ ID NO: 35), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTRYYIN (SEQ ID NO: 7), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGTTVY (SEQ ID NO: 10); ili

e) LCDR1 je KSTRSLLYSRSKTYLN (SEQ ID NO: 45), LCDR2 je AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 je VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5), HCDR1 je GYTFTDYYIN (SEQ ID NO: 40), HCDR2 je WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8), i HCDR3 je EGVTVY (SEQ ID NO: 46).

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5