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TWI669119B - 組合療法 - Google Patents

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TWI669119B
TWI669119B TW106134441A TW106134441A TWI669119B TW I669119 B TWI669119 B TW I669119B TW 106134441 A TW106134441 A TW 106134441A TW 106134441 A TW106134441 A TW 106134441A TW I669119 B TWI669119 B TW I669119B
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TW
Taiwan
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seq
n3pglu
antibody
hcvr
lcvr
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TW106134441A
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English (en)
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TW201827055A (zh
Inventor
達斯汀 詹姆斯 莫高
布萊恩 安德魯 威里斯
Original Assignee
美國禮來大藥廠
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Abstract

本發明提供一種治療認知或神經退化性疾病之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物：

Description

組合療法
本發明係關於BACE抑制劑與抗N3pGlu Aβ抗體之組合，且關於使用其治療某些神經病症(諸如阿茲海默氏症)之方法。 本發明屬於治療阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及其他涉及類澱粉β (Aβ)肽、類澱粉前驅蛋白質(APP)之神經毒性及高度聚集肽段的疾病及病症的領域。阿茲海默氏症為影響全世界數百萬患者之破壞性神經退化性病症。鑒於市場上當前批准之藥劑僅向患者提供短暫症狀性益處，阿茲海默氏症的治療中存在顯著未滿足之需要。
阿茲海默氏症之特徵為腦中Aβ之產生、凝集及沈積。完全或部分抑制β-分泌酶(β位點澱粉樣前驅蛋白裂解酶；BACE)已展示對小鼠模型中之斑塊相關及斑塊依賴性病變具有重大影響。此表明即使Aβ肽含量之少量降低亦可引起斑塊負荷及突觸缺陷之長期顯著降低，因此提供顯著治療益處，尤其在阿茲海默氏症的治療中。 此外，特異性靶向N3pGlu Aβ之抗體已展示降低活體內之斑塊水準(美國專利第8,679,498號)。N3pGlu Aβ，亦稱為N3pE Aβ、N3pE或Aβp3 - 42 ，為僅在斑塊中發現之Aβ肽的截斷形式。儘管N3pGlu Aβ肽為腦中所沈積之Aβ的次要組分，但研究展現N3pGlu Aβ肽具有侵襲性凝集特性且早期積聚於沈積級聯中。 美國專利第8,158,620號揭示具有BACE抑制活性之稠合胺基二氫噻嗪衍生物，且進一步將該等衍生物揭示為適用於由Aβ肽所引起之神經退行性疾病(諸如阿茲海默氏型癡呆症)之治療劑。此外，美國專利第8,338,407號揭示某些稠合胺基二氫噻嗪衍生物，該等衍生物具有BACE抑制作用而適用於治療某些神經退行性疾病，諸如阿茲海默型癡呆症。 需要BACE抑制劑與結合N3pGlu Aβ肽之抗體的組合以提供針對Aβ肽介導之病症(諸如阿茲海默氏症)的治療，其可比之任一單獨藥物更有效。舉例而言，用此類組合治療可使得可使用比單獨使用之各藥物低的劑量的任一或兩種藥物，從而可能使副作用降低，同時維持功效。相信用抗N3pGlu抗體及BACE抑制劑靶向移除Aβ之沈積形式將便於吞噬細胞移除預先存在之斑塊沈積物，而同時藉由抑制Aβ產生來減少或阻止Aβ之進一步沈積。 美國專利第8,278,334號揭露了治療認知或神經退化性疾病之方法，該方法包含投與具有抗澱粉樣蛋白抗體之經取代的環胺BACE -1抑制劑。WO 2016/043997揭露了治療特徵為Aβ之形成及沈積之疾病的方法，該方法包含與抗N3pGlu Aβ單株抗體組合的特定BACE抑制劑。
因此，本發明提供治療認知或神經退化性疾病之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物：， 或其醫藥學上可接受之鹽，該鹽與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明此外提供治療特徵為Aβ之形成及沈積之疾病的方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明進一步提供治療阿茲海默氏症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明此外提供治療輕度阿茲海默氏症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明進一步提供治療輕度認知障礙之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明進一步提供治療前驅性阿茲海默氏症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。此外，本發明提供避免輕度認知障礙進展為阿茲海默氏症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明進一步提供治療大腦澱粉樣蛋白血管病(CAA)之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。 本發明進一步提供治療患者之阿茲海默氏症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體組合，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下各者組成之群： a) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 20，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 23；及 b) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 21，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 24； c) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 36，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 37； d) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 6，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3； e) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 5，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3。 此外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於在阿茲海默氏症之治療中與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。此外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於在輕度阿茲海默氏症之治療中與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。此外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於在前驅性阿茲海默氏症之治療中與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於在防止輕度認知障礙進展為阿茲海默氏症中與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。 本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於在阿茲海默氏症之治療中與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序組合，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下組成之群： a) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 20，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 23；及 b) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 21，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 24； c) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 36，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 37； d) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 6，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3； e) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 5，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3。 本發明進一步提供醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，其與抗N3pGlu Aβ抗體與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物組合，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。 本發明此外提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，該醫藥組合物與抗N3pGlu Aβ抗體之醫藥組合物組合，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下組成之群： a) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 20，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 23；及 b) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 21，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 24； c) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 36，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 37； d) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 6，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3； e) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 5，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2且HCDR3為SEQ ID. NO: 3，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。 此外，本發明提供一種套組，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及抗N3pGlu Aβ抗體，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。本發明進一步提供一種套組，其包含：包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，以及包含抗N3pGlu Aβ抗體與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。如本文所使用，「套組」包括在單一封裝中的各組分之各別容器，其中一個組分為式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且另一組分為抗N3pGlu Aβ抗體，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。「套組」亦可包括各組分之各別容器，其中一個組分為式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且另一組分為抗N3pGlu Aβ抗體，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II，其在具有將各組分作為組合投與之指令的各別封裝中。 本發明進一步提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造藥物之用途，該藥物用於治療阿茲海默氏症、輕度阿茲海默氏症、前驅性阿茲海默氏症或用於防止輕度認知障礙進展為阿茲海默氏症，其中該藥物應與抗N3pGlu Aβ抗體同時、分別或依序投與，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。 式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽尤其適用於本發明之治療方法，但某些基團、取代基及組態為較佳的。以下段落描述此類較佳基團、取代基及組態。應瞭解，此等優選項可適用於治療方法及本發明新化合物。 因此，較佳為其中稠合雙環處於順式組態中之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。舉例而言，一般熟習此項技術者應瞭解，式Ia化合物呈如下文流程A中所示之對於標記為4a及7a的中心的順式相對組態。此外，式Ia之三個對掌性中心的較佳相對組態展示於以下流程A中，其中位5處之二氟乙基取代基相對於位4a處之氫及位7a處之經取代的苯基取代基呈順式組態：流程 A 本發明之其他化合物包括：； 及其醫藥學上可接受之鹽。 儘管本發明涵蓋所有獨立對映異構體及非對映異構體，以及該等化合物之對映異構體的混合物，包括外消旋體，但尤佳為具有如下所列舉的絕對組態之化合物： N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺，及其醫藥學上可接受之鹽。 此外，N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺； N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺甲磺酸鹽； N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸鹽；及 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸鹽半水合物，其係尤其較佳的。 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸鹽；及 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺4-甲基苯磺酸鹽半水合物，其係尤其最佳的。 較佳的抗體為hE8L及B12L、R17L、抗體I以及抗體II，其中hE8L及B12L係尤其較佳的，且hE8L係最佳的。 抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下各者組成之群： a) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 20，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 23；及 b) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 21，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 24； c) LCDR1為SEQ ID. NO: 17，LCDR2為SEQ ID. NO: 18，LCDR3為SEQ ID. NO: 19，HCDR1為SEQ ID. NO: 36，HCDR2為SEQ ID. NO: 22，且HCDR3為SEQ ID. NO: 37； d) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 6，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3； e) LCDR1為SEQ ID. NO: 4，LCDR2為SEQ ID. NO: 5，LCDR3為SEQ ID. NO: 7，HCDR1為SEQ ID. NO: 1，HCDR2為SEQ ID. NO: 2，且HCDR3為SEQ ID. NO: 3。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR及HCVR選自由以下各者組成之群： a) SEQ ID NO: 25之LCVR及SEQ ID NO: 26之HCVR； b) SEQ ID NO: 25之LCVR及SEQ ID NO: 27之HCVR； c) SEQ ID NO: 32之LCVR及SEQ ID NO: 34之HCVR； d) SEQ ID NO: 9之LCVR及SEQ ID NO: 8之HCVR；及 e) SEQ ID NO: 10之LCVR及SEQ ID NO: 8之HCVR。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC及HC選自由以下各者組成之群： a) SEQ ID NO: 28之LC及SEQ ID NO: 29之HC； b) SEQ ID NO: 28之LC及SEQ ID NO: 30之HC； c) SEQ ID NO: 33之LC及SEQ ID NO: 35之HC； d) SEQ ID NO: 12之LC及SEQ ID NO: 11之HC；及 e) SEQ ID NO: 13之LC及SEQ ID NO: 11之HC。 在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含兩個輕鏈(LC)及兩個重鏈(HC)，其中各LC及各HC選自由以下各者組成之群： a) LC of SEQ ID NO: 28 and HC of SEQ ID NO: 29; b) SEQ ID NO: 28之LC及SEQ ID NO: 30之HC； c) SEQ ID NO: 33之LC及SEQ ID NO: 35之HC； d) SEQ ID NO: 12之LC及SEQ ID NO: 11之HC；及 e) SEQ ID NO: 13之LC及SEQ ID NO: 11之HC。 在一些實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含hE8L，其具有分別為SEQ ID NO:33及35之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。 hE8L進一步具有分別為SEQ ID NO: 32及34之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。 hE8L之HCVR進一步包含SEQ ID NO: 36之HCDR1、SEQ ID NO: 22之HCDR2及SEQ ID NO: 37之HCDR3。 hE8L之LCVR進一步分別包含SEQ ID NO. 17之LCDR1、SEQ ID NO. 18之LCDR2及SEQ ID NO: 19之LCDR3。 在一些實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含B12L，其具有分別為SEQ ID NO:28及29之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。 B12L進一步具有分別為SEQ ID NO: 25及26之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。 B12L之HCVR進一步包含SEQ ID NO: 20之HCDR1、SEQ ID NO: 22之HCDR2及SEQ ID NO: 23之HCDR3。 B12L之LCVR進一步分別包含SEQ ID NO. 17之LCDR1、SEQ ID NO: 18之LCDR2及SEQ ID NO: 19之LCDR3。 在一些實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含R17L，其具有分別為SEQ ID NO: 28及30之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。 R17L進一步具有分別為SEQ ID NO: 25及27之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。 R17L之HCVR進一步包含SEQ ID NO: 21之HCDR1、SEQ ID NO: 22之HCDR2及SEQ ID NO: 24之HCDR3。 R17L之LCVR進一步分別包含SEQ ID NO. 17之LCDR1、SEQ ID NO: 18之LCDR2及SEQ ID NO: 19之LCDR3。 在一些實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含抗體I，其具有分別為SEQ ID NO: 12及11之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。抗體I進一步具有分別為SEQ ID NO: 9及8之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。抗體I之HCVR進一步包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2及SEQ ID NO: 3之HCDR3。抗體I之LCVR進一步分別包含SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID NO: 6之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3。 在一些實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體包含抗體II，其具有分別為SEQ ID NO: 13及11之輕鏈(LC)及重鏈(HC)。抗體II進一步具有分別為SEQ ID NO: 10及8之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)。抗體II之HCVR進一步包含SEQ ID NO: 1之HCDR1、SEQ ID NO: 2之HCDR2及SEQ ID NO: 3之HCDR3。抗體II之LCVR進一步分別包含SEQ ID NO: 4之LCDR1、SEQ ID. NO: 5之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3。 一般技術者應瞭解且認識到「抗N3pGlu Aβ抗體」及特異性抗體「hE8L」、「B12L」及「R17L」以及製備及使用該等抗體之方法由一般技術者鑑別且揭示於2014年3月25日發佈之標題為「Anti-N3pGlu Amyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof」之美國專利第8,679,498 B2號(美國專利序列號13/810,895)中。參見例如美國專利第8,679,498 B2號之表1。抗體hE8L、B12L及R17L可用作本發明之抗N3pGlu Aβ抗體。在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體可包含本文所述之抗體「抗體I」。在其他實施例中，抗N3pGlu Aβ抗體可包含本文所述之「抗體II」。 另外，本發明所用之某些抗體的胺基酸序列提供於下表A中： 表A-抗體SEQ ID NO 就「hE8L」、「B12L」、「R17L」、「抗體I」及「抗體II」而言，此類抗體之其他胺基酸序列提供於表B中： 表B-「hE8L」、「B12L」、「R17L」、「抗體I」及「抗體II」之其他SEQ ID NO 本發明之抗體與N3pGlu Aβ結合。N3pGlu Aβ之序列為SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。Aβ之序列為SEQ ID NO: 38。 如本文所使用，「抗體」為包含藉由二硫鍵互連之兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)的免疫球蛋白分子。各LC及HC之胺基端部分包括經由其中所含之互補決定區(CDR)來負責抗原識別的可變區。 CDR與稱為構架區之更保守區穿插。在本發明抗體之LCVR及HCVR區內對於CDR域之胺基酸分配係基於公認Kabat編號規約，諸如以下：Kabat, 等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)；Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版物第91-3242號 (1991))，及North編號規約(North等人, A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))。 如本文所使用，術語「分離」係指未在自然界中發現且不含或實質上不含細胞環境中發現之其他大分子物種的蛋白質、肽或核酸。如本文所使用，「大體上不含」意謂所關注之蛋白質、肽或核酸包含超過80% (以莫耳濃度計)之現存大分子物種，較佳超過90%且更佳超過95%。 表現及分泌抗體之後，澄清培養基以移除細胞且使用許多通常使用之技術中之任一者純化澄清之培養基。純化之抗體可根據用於調配非經腸投與(尤其皮下、鞘內或靜脈內投與)之蛋白質及抗體的熟知方法調配於醫藥組合物中。抗體可與適合醫藥學上可接受之賦形劑一起凍乾，接著隨後在使用之前用水基稀釋劑復原。在任一情況下，抗體之醫藥組合物的存儲形式及注射形式將含有醫藥學上可接受之一或多種賦形劑，其為除抗體以外之成分。一種成分是否為醫藥學上可接受視其對醫藥組合物之安全性及有效性或對安全性、純度及效能之作用而定。若一種成分判定為對安全性或有效性(或對安全性、純度或效能)具有充分不利作用以保證其不用於向人類投與之組合物，則其不為醫藥學上可接受以用於抗體之醫藥組合物。 術語「特徵在於Aβ之沈積的疾病」為在病理學上特徵在於Aβ沈積於腦或腦血管結構中之疾病。此疾病包括諸如阿茲海默氏症、唐氏症候群及大腦澱粉血管病之疾病。阿茲海默氏症之臨床診斷、分級或進展可由主治診斷醫師或健康護理專業人員(作為熟習此項技術者)藉由使用已知技術及藉由觀測結果容易地確定。此一般包括一些形式之腦斑塊成像、精神或認知評估(例如臨床癡呆分級-boxes評分總和(Clinical Dementia Rating-summary of boxes；CDR-SB)、簡短精神狀態檢測25 (Mini-Mental State Exam 25；MMSE)或阿茲海默氏症評估量表-認知(Alzheimer's Disease Assessment Scale-Cognitive；ADAS-Cog))或功能評估(例如阿茲海默氏症協同研究-日常生活活動(Alzheimer's Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living；ADCS-ADL))。如本文中所用之「臨床阿茲海默氏症」為診斷階段之阿茲海默氏症。其包括診斷為前驅性阿茲海默氏症、輕度阿茲海默氏症、中度阿茲海默氏症及重度阿茲海默氏症之病狀。術語「臨床前阿茲海默氏病」為臨床阿茲海默氏病之前的階段，其中生物標記之可量測變化(諸如CSF Aβ42水準或由於類澱粉PET之沈積腦斑塊)指示患有阿茲海默病變之患者的最早病徵，進展成臨床阿茲海默氏症。此通常在諸如記憶缺失及精神混亂之症狀可辨之前。 如本文所用，術語「治療(treating/to treat/treatment)」包括抑制、減緩、阻止、減輕或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重性。 如本文所用，術語「患者」係指人類。 術語「抑制Aβ肽之產生」意謂減少患者之Aβ肽的活體內含量。 如本文所使用，術語「有效量」係指式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之量或劑量，及抗N3pGlu Aβ抗體之量或劑量(該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II)，其在向病患投予單一或多次劑量時提供患者在診斷或治療下所期望的效果。應理解本發明之組合療法藉由以下來進行：以在體內提供有效水準之式I化合物及抗N3pGlu Aβ抗體(該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II)之任何方式，投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及抗N3pGlu Aβ抗體，該抗體選自由以下各者組成之群；hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。 有效量可容易地由熟習此項技術者藉由使用已知技術及藉由在類似情形下獲得的觀測結果來確定。在確定對於患者之有效量時，熟習此項技術者考慮多種因素，包括但不限於：患者之體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；涉及程度或疾病或病症之嚴重性；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之給藥方案；伴隨藥物之使用；及其他相關情況。 在本發明之組合中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽通常在廣泛劑量範圍內有效。舉例而言，式I化合物之每日劑量通常處於約0.1 mg/天至約500 mg/天之範圍內，較佳約0.1 mg/天至約200 mg/天，且最佳約0.1 mg/天至約100 mg/天。在一些實施例中，式I化合物之劑量為約0.1 mg/天至約25 mg/天。此外，在本發明之組合中，抗N3pGlu Aβ抗體(該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II)通常在廣泛劑量範圍內有效。在一些情況下，低於前述範圍之下限之劑量可能已過量，而在其他情況下，可採用仍然更大的劑量而伴隨可接受的不良事件，且因此以上劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。 本發明之BACE抑制劑及抗體較佳調配成醫藥組合物，其藉由使該化合物生物可用之任何路徑投與。投與途徑可以任何方式變化，其受藥物之物理特性及患者及照護者之便利性限制。較佳地，抗N3pGlu Aβ單株抗體組合物用於非經腸投與，諸如靜脈內或皮下投與。此外，BACE抑制劑式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於口服或非經腸投與，包括靜脈內或皮下投與。此類醫藥組合物及其製備方法為此項技術中所熟知的。(參見，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, 編者, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。 如本文所使用，片語「與組合」係指將該BACE抑制劑，諸如式I化合物：， 或其醫藥學上可接受之鹽與抗N3pGlu Aβ抗體同時、或以任何順序或其任何組合依序投與，該抗體選自由以下各者組成之群：hE8L、B12L、R17L、抗體I及抗體II。兩種分子可以同一醫藥組合物之部分的形式投與或在各別醫藥組合物中投與。式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽可在投與抗N3pGlu Aβ抗體之前、與投與抗N3pGlu Aβ抗體同時、或在其之後、或以其某種組合投與。在以重複間隔投與抗N3pGlu Aβ抗體時(例如，在標準治療過程期間)，可在每次投與抗N3pGlu Aβ抗體之前、與每次投與抗N3pGlu Aβ抗體同時、或在每次投與抗N3pGlu Aβ抗體之後、或以其某種組合，或在關於藉由抗N3pGlu Aβ抗體之療法之不同間隔下，或在用抗N3pGlu Aβ抗體治療之療程之前、在用抗N3pGlu Aβ抗體治療之療程期間的任何時間、或抗N3pGlu Aβ抗體治療之療程之後以單次或一系列劑量，投與BACE抑制劑。 本發明之化合物可藉由此項技術中已知之多種程序製備，其中一些在以下製劑及實例中說明。各所述途徑之特定合成步驟可以不同方式組合或與不同程序之步驟結合以製備式I化合物或其鹽。各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、濕磨或結晶。另外，除非另外指明，否則所有取代基如先前所定義。試劑及起始材料為一般熟習此項技術者容易獲得的。 一般熟習此項技術者應理解，術語「甲苯磺酸鹽」、「甲苯磺酸」、「對甲苯磺酸」及「4-甲苯磺酸」係指以下結構之化合物：。 一些縮寫定義如下：「APP」係指澱粉樣前驅蛋白；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CDI」係指1,1'-羰基二咪唑；「cDNA」係指互補去氧核糖核酸；「DAST」係指三氟化二乙基胺基硫；「DCC」係指1,3-二環己基碳化二亞胺；「DIC」係指1,3-二異丙基碳化二亞胺；「DIPEA」係指N,N-二異丙基乙胺；「DMAP」係指4-二甲胺基吡啶；「DMSO」係指二甲亞碸；「EBSS」係指厄爾平衡鹽溶液(Earle's Balances Salt Solution)；「EDCI」係指1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；「ELISA」係指酶聯免疫吸附分析；「F12」係指漢姆氏F12培養基(Ham's F12 medium)；「FBS」係指胎牛血清；「Fc」係指可結晶片段；「FLUOLEAD™」係指4-第三 丁基-2,6-三氟化二甲基苯基硫；「FRET」係指螢光共振能量轉移；「HATU」係指六氟磷酸(二甲胺基)-N,N-二甲基(3H -[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲亞銨；「HBTU」係指六氟磷酸(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲胺基)-N, N-二甲基甲亞銨；「HEK」係指人胚腎；「HF-吡啶」係指氟化氫吡啶或歐拉(Olah)反應劑或聚(氟化吡啶)；「HOBT」係指1-羥基苯并三唑水合物；「IC50 」係指產生對於藥劑可能之最大抑制反應之50%的該藥劑之濃度；「HRP」係指辣根過氧化酶；「IgG1 」係指免疫球蛋白樣域Fc-γ受體；「MBP」係指麥芽糖結合蛋白；「MEM」係指最低必需培養基；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PDAPP」係指血小板衍生之澱粉樣前驅蛋白；「PyBOP」係指(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻)；「PyBrOP」係指六氟磷酸溴(三-吡咯啶基)鏻；「RFU」係指相對螢光單位；「RT-PCR」係指反轉錄聚合酶鏈反應；「SDS-PAGE」係指十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；「THF」係指四氫呋喃；「TMB」係指四甲基聯苯胺；「TMEM」係指跨膜蛋白；「Tris」係指三(羥基甲基)胺基甲烷；「trityl」係指式「(Ph)3 C-」之基團，其中Ph係指苯基；「XRD」係指X射線粉末繞射；「XtalFluor-E®或DAST二氟鋶鹽」係指四氟硼酸(二乙胺基)二氟鋶或四氟硼酸N,N- 二乙基-S,S -二氟亞胺鋶；且「XtalFluor-M®或嗎啉-DAST二氟鋶鹽」係指四氟硼酸二氟(嗎啉基)鋶或四氟硼酸二氟-4-嗎啉基鋶。流程 1 流程 1a 流程 2 流程 3 流程 4 流程5以下製劑及實例進一步說明本發明。 製劑1 (2S)-1-三苯甲氧基丁-3-烯-2-醇流程1，步驟A：在環境溫度下攪拌碘化三甲鋶(193.5 g，948.2 mmol)之THF (1264 mL)溶液75分鐘。將混合物冷卻至-50℃且歷經30分鐘之時間段經由插管添加正丁基鋰(2.5 mol/L之己烷溶液，379 mL，948.2 mmol)。使反應逐漸升溫至-30℃且攪拌60分鐘。分批添加(2S)-2-三苯甲氧基甲基環氧乙烷(100 g，316.1 mmol)，將溫度維持在-10℃以下。添加完成之後，使反應混合物升溫至室溫且攪拌2小時。將反應物倒入飽和氯化銨中，分離各相，且用乙酸乙酯萃取水相。合併有機層且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用甲基第三丁基醚:己烷(10%-15%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(56.22 g，54%)。ES/MS m/z 353 (M+Na)。 替代性製劑1 (2S)-1-三苯甲氧基丁-3-烯-2-醇 流程1a，步驟A起始材料：向(2S)-丁-2-烯-1,2-二醇(如JACS,1999, 121, 8649中所製備) (64.5 g，631 mmol)於二氯甲烷(850 mL)中之溶液中添加三苯甲基氯(287 g，947.1 mmol)、DMAP (7.71 g，63.1 mmol)及三乙胺(140 g，1383.5 mmol)。在24℃下攪拌24小時。添加1 N 檸檬酸水溶液(425 mL)。分離各層且在減壓下將有機萃取物濃縮至乾燥。添加甲醇(900 mL)且歷時1小時冷卻至5℃。藉由過濾收集固體且用5℃之甲醇(50 mL)洗滌。捨棄固體且在減壓下將母液濃縮至乾燥。添加甲苯(800 mL)且濃縮至268 g之質量，以在48重量%之甲苯溶液中獲得標題化合物(129 g，67%)。 製劑2 1-嗎啉基-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮流程1a，步驟A：向0℃與5℃之間的1-三苯甲氧基丁-3-烯-2-醇(832.4 g，2519 mmol)於甲苯(5800 mL)中之溶液中添加四丁基硫酸氫銨(83.2 g，245.0 mmol)及4-(2-氯乙醯基)嗎啉(638.50 g，3902.7 mmol)。將氫氧化鈉(1008.0 g，25202 mmol)添加至水(1041 mL)中。在0℃與5℃之間攪拌19小時。添加水(2500 mL)及甲苯(2500 mL)。分離各層且用水(2 × 3500 mL)洗滌有機萃取物。在減壓下將有機萃取物濃縮至乾燥。將甲苯(2500 mL)添加至殘留物中，且隨後緩慢添加正庚烷(7500 mL)。攪拌16小時。藉由過濾收集所得固體且用正庚烷(1200 mL)洗滌。在真空中乾燥固體，獲得標題化合物(1075.7 g，98%)。 製劑3 1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮流程1a，步驟B：以將反應溫度維持在5℃以下之速率向4-溴-1-氟-2-碘苯(673.2 g，2237.5 mmol)於甲苯(2500 mL)中之溶液中添加1.3 M異丙基氯化鎂氯化鋰錯合物(3079 mL，2000 mmol)之THF溶液。攪拌1小時。以將反應溫度維持在5℃以下之速率向1-嗎啉基-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮(500 g，1093 mmol)於甲苯(5000 mL)中之溶液添加所得格林納(Grignard)溶液(5150 mL)。攪拌3小時，維持溫度在5℃以下。添加額外製備的格林納溶液(429 mL)且攪拌1小時。以將溫度維持在5℃以下之速率添加1 N檸檬酸水溶液(5000 mL)。分離各層且用水(5000 mL)洗滌有機萃取物。在減壓下將溶液濃縮至乾燥。將甲醇(2000 mL)添加至殘留物中且加以濃縮，得到呈殘留物形式之標題化合物(793 g，73.4%效能，83%)。 製劑4 1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮肟流程1a，步驟C：將羥胺鹽酸鹽(98.3 g)添加至1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮(450 g，707 mmol)及乙酸鈉(174 g)之甲醇(3800 mL)溶液中。將溶液加熱至50℃歷時2小時。冷卻至24℃且濃縮。將水(1000 mL)及甲苯(1500 mL)添加至殘留物。分離各層且用甲苯(500 mL)萃取水相。合併有機萃取物且用水(2 × 400 mL)洗滌。在減壓下濃縮溶液，得到呈殘留物形式之標題化合物(567 g，61.4%效能，88%)。 製劑5第三丁基 2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酸酯流程1，步驟B：向四正丁基硫酸銨(13.26 g，22.6 mmol)於甲苯(376 mL)中之溶液中添加(2S)-1-三苯甲氧基丁-3-烯-2-醇(74.67 g，226.0 mmol)。添加氫氧化鈉(50質量%)之水溶液(119 mL)，隨後添加2-溴乙酸第三丁酯(110.20 g，565.0 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物18小時。倒入水中，分離各相，且用乙酸乙酯萃取水相。合併有機層且經硫酸鎂乾燥。將混合物過濾且在減壓下濃縮，得到標題化合物(77.86 g，77%)。ES/MS m/z 467 (M+Na)。 製劑6 (1E)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙醛肟流程1，步驟C：將2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酸第三丁酯(77.66 g，174.7 mmol)之二氯甲烷(582.2 mL)溶液冷卻至-78℃。歷經35分鐘之時間段逐滴添加二異丁基氫化鋁於己烷(1 mol/L，174.7 mL)中之溶液且將溫度維持在-70℃以下。在-78℃下攪拌5小時。將鹽酸之水溶液(2 mol/L，192.1 mL)逐滴添加至反應混合物中，將溫度保持在-60℃以下。使反應逐步升溫至環境溫度且攪拌60分鐘。分離有機萃取物且用飽和碳酸氫鈉洗滌。經硫酸鎂乾燥溶液，加以過濾，且在減壓下濃縮得到殘留物。在二氯甲烷中溶解殘留物。添加醋酸鈉(28.66 g，349.3 mmol)，隨後添加羥胺鹽酸鹽(18.21 g，262.0 mmol)。在環境溫度下攪拌18小時。倒入水中，分離各相，且用二氯甲烷萃取水相。合併有機層且經硫酸鎂乾燥。將混合物過濾且在減壓下濃縮，得到標題化合物(68.38 g，101%)。ES/MS m/z 386 (M-H)。 製劑7 (3aR,4S)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑流程1，步驟D：將(1E)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙醛肟(55.57 g，143.4 mmol)於第三丁基甲基醚(717 mL)之溶液冷卻至5℃。逐滴添加次氯酸鈉(5%之水溶液，591 mL，430.2 mmol)，將溫度保持在10℃以下。在10℃下攪拌30分鐘。使反應升溫至15℃。在15℃下攪拌18小時。用乙酸乙酯稀釋反應混合物且用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離各相，用5%亞硫酸氫鈉溶液及鹽水洗滌有機相。經硫酸鎂乾燥溶液，加以過濾，且在減壓下濃縮得到殘留物。藉由矽膠層析法用50%甲基第三丁基醚/二氯甲烷:己烷(20%-27%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(35.84 g，65%)。ES/MS m/z 408 (M+Na)。 製劑8 (3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑流程1，步驟E：將4-溴-1-氟-2-碘-苯(86.94 g，288.9 mmol)於THF(144.5mL)及甲苯(1445 mL)中之溶液冷卻至-78℃。逐滴添加正丁基鋰(2.5 M之己烷溶液，120 mL，288.9 mmol)，將溫度保持在-70℃以下。在-78℃下攪拌30分鐘。逐滴添加三氟化硼合二乙醚(36.5 mL，288.9 mmol)，將溫度保持在-70℃以下。在-78℃下攪拌溶液30分鐘。歷經30分鐘之時間段將(3aR,4S)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑(55.69 g，144.5 mmol)於THF(482 mL)中之溶液逐滴添加至反應中，將溫度保持在-65℃以下。在-78℃下攪拌90分鐘。迅速添加飽和氯化銨，將溫度保持在-60℃以下。倒入鹽水中，且用乙酸乙酯萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用己烷(100%-30%梯度)/70%乙醚溶離來純化殘留物，得到標題化合物(36.52 g，45%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 560/562 [M+H]。 替代性製劑8 流程1a，步驟D：在氮氣下將1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-[(1S)-1-(三苯甲氧基甲基)烯丙氧基]乙酮肟(458 g，502 mmol)及氫醌(56.3 g，511 mmol)於甲苯(4000 mL)中之溶液加熱至回流歷時27小時。將溶液冷卻至24℃且添加碳酸鈉水溶液(800 mL)。分離各層且用甲苯(300 mL)萃取水相。合併有機萃取物且用水(2 × 500 mL)洗滌。在減壓下濃縮溶液，得到殘留物。添加異丙醇(1500 mL)且加熱至回流。冷卻至24℃且藉由過濾收集固體。在真空中乾燥固體，獲得標題化合物(212 g，75%)。 製劑9 1-[(3aR,4S,6aS)-6a- (5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-1-基]乙酮流程1a，步驟E：在氮氣下向(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑(235.3 g，420 mmol)、DMAP (5.13 g，42.0 mmol)及吡啶(66.45 g，840.1 mmol)於二氯甲烷(720 mL)中之溶液中添加乙醯氯(35.56 g，503.9 mmol)，將內部溫度維持在5℃以下。攪拌1小時且隨後添加水(300 mL)及1 M硫酸(300 mL)。攪拌混合物10分鐘且使各層分離。收集有機萃取物且用飽和碳酸鈉(500 mL)及水(500 mL)洗滌。經硫酸鎂乾燥溶液。過濾且在減壓下濃縮，得到呈灰色固體狀之1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-1-基]乙酮(235 g，93%)。 製劑10 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥基甲基)四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮流程2，步驟A：在20 L夾套反應器中在氮氣下向(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑(1996 g，3384 mmol)、DMAP (56.0 g，458 mmol)、吡啶(500 mL，6180 mmol)於二氯甲烷(10 L)中之溶液中添加乙醯氯(290 mL，4075 mmol)，將內部溫度維持在10℃以下。在添加完成後(1小時)升溫至20℃且攪拌隔夜。若反應不完全，則添加乙醯氯、DMAP、吡啶及二氯甲烷直至觀測到完全反應。將反應混合物冷卻至0℃且緩慢添加水(5 L)，在10℃下攪拌反應混合物30分鐘且使各層分離。收集有機萃取物且用二氯甲烷(1 L)洗滌水溶液。用1 N鹽酸水溶液(2 × 4 L)洗滌經合併之有機萃取物，用二氯甲烷(2 × 1 L)萃取水溶液。用水(4 L)洗滌經合併之有機萃取物且在減壓下移除溶劑，得到大約5 L之總體積。添加90%甲酸(1800 mL)且在環境溫度下靜置3天。升溫至40℃歷時2小時，隨後在減壓下移除溶劑。用甲醇(4 L)稀釋殘留物且緩慢添加飽和碳酸鈉水溶液(3 L)。添加固體碳酸鈉(375 g)以將pH調節至8-9。在45℃下攪拌1小時，隨後冷卻至環境溫度。藉由過濾、用甲醇(4 × 500 mL)洗滌來移除固體，隨後用2 N氫氧化鈉水溶液(100 mL)處理且在環境溫度下靜置1小時。藉由過濾、用甲醇(2 × 100 mL)洗滌來移除固體。在減壓下蒸發溶劑且在乙酸乙酯(5 L)與水(2 L)之間分配殘留物。用乙酸乙酯(2 L)萃取水溶液且用鹽水(2 × 1 L)洗滌經合併之有機萃取物。在減壓下移除溶劑，添加甲基第三丁基醚(2.5 L)且蒸發至乾燥。添加甲基第三丁基醚(4 L)且在65℃下攪拌1小時，冷卻至環境溫度且藉由過濾收集固體，用甲基第三丁基醚(3 × 500 mL)進行洗滌。在真空下乾燥為米色固體。在甲苯(7.5 L)中將此固體加熱至110℃直至完全溶解，歷經1小時冷卻至18℃，且在此溫度下攪拌1小時。升溫至40℃且當沈澱形成時再次冷卻至18℃。攪拌45分鐘，隨後藉由過濾收集固體，用甲苯(2 × 500 mL)進行洗滌。在真空中乾燥固體，獲得標題化合物(443.1 g，36%，藉由LCMS測量之95%純度)。在真空中蒸發濾液，得到殘留物。藉由矽膠急驟層析法用20%至100%乙酸乙酯之異己烷溶液溶離來純化殘留物。在60℃下使含有產物之溶離份之產物在甲基第三丁基醚(2 L)中漿化30分鐘，冷卻至環境溫度，且藉由過濾收集固體，用甲基第三丁基醚(2 × 200 mL)進行洗滌。在真空中乾燥固體，得到呈米色結晶固體狀之標題化合物(304 g，24%，藉由LCMS測量之88%純度)。在真空中蒸發濾液得到殘留物。藉由矽膠急驟層析法用20%至100%乙酸乙酯之異己烷溶液溶離來純化殘留物，得到標題化合物(57.8 g，5%，藉由LCMS測得之88%純度)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 360.0/362.0 [M+H]。 替代性製劑10 流程2，步驟A：將1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-1-基]乙酮(69 g，114.5 mmol)添加至15℃的對甲苯磺酸單水合物(2.2 g，11.45 mmol)、二氯甲烷(280 mL)及甲醇(700 mL)之溶液中。攪拌18小時且隨後在減壓下移除溶劑。用二氯甲烷(350 mL)稀釋殘留物且添加1 M碳酸鈉水溶液(140 mL)及水(140 mL)。分離各層且在減壓下蒸發有機層。向殘留物中添加甲苯(350 mL)且加熱至回流歷時1小時。以10℃/小時之速率冷卻至10-15℃。藉由過濾收集固體且用甲苯(70 mL)洗滌。在真空中乾燥固體，獲得呈灰色固體狀之標題化合物(30 g，65%)。 製劑11 (3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-甲酸流程2，步驟B：在20 L夾套反應器中向1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥甲基)四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮(804.9 g，2177 mmol)、(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基)氧基(40.0 g，251 mmol)於乙腈(4.5 L)中之懸浮液中添加水(2 L)，且冷卻至5℃之內部溫度。歷經30分鐘分批添加(二(乙醯氧)碘基)苯(1693 g，4993.43 mmol)。使用反應器冷卻來控制放熱，且隨後保持在20℃下直至LCMS顯示完全反應。在環境溫度下緩慢添加亞硫酸氫鈉(70 g，672.68 mmol)於水(300 mL)中之懸浮液，將內部溫度維持在25℃以下。攪拌30分鐘且隨後冷卻至5℃。添加水(2 L)，隨後歷經1小時之時間段緩慢添加47重量%氫氧化鈉水溶液(780 mL)，將內部溫度維持在10℃以下。添加乙酸乙酯(2 L)及異己烷(5 L)，劇烈攪拌且分離各層。用水(1 L)萃取兩相有機層且用甲基第三丁基醚(2.5 L)洗滌經合併之水溶液。將萃取物水溶液冷卻至5℃且歷經30分鐘緩慢添加37%鹽酸(1.4 L)，將內部溫度維持在約5℃。添加乙酸乙酯(5 L)，分離各層且用鹽水(3 × 1 L)洗滌有機物。用乙酸乙酯(2.5 L)萃取經合併之萃取物水溶液，用鹽水(1 L)洗滌經合併之有機物，隨後用硫酸鈉乾燥且加以過濾。用庚烷(2.5 L)稀釋有機物且在減壓下蒸發至乾燥。添加甲基第三丁基醚(1.5 L)及庚烷(1.5 L)且蒸發至乾燥。添加庚烷(2.5 L)且蒸發至乾燥兩次。添加庚烷(500 mL)及甲基第三丁基醚(500 mL)且在40℃下攪拌30分鐘，隨後藉由過濾收集沈澱物，用庚烷/甲基第三丁基醚(1:1，1 L)洗滌，隨後用甲基第三丁基醚(3 × 300 mL)洗滌且風乾，得到呈米色結晶固體狀之標題化合物(779 g，91%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 374.0/376.0 [M+H]。 [α]D 20 = -19.0 ° (C=1.004，氯仿)。 替代性製劑11 流程2，步驟B：將水(150 mL)及乙腈(150 mL)添加至1-[(4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-1-基]乙酮(30 g，73.3 mmol)、TEMPO (1.14 g，7.30 mmol)及(二(乙醯氧)碘基)苯(51.9 g，161 mmol)中。冷卻至15℃且攪拌2小時。在環境溫度下緩慢添加硫代硫酸鈉(21 g)及碳酸鉀(22 g)之水溶液(150 mL)。攪拌1小時且隨後添加甲基第三丁基醚(150 mL)。分離各層且用濃縮硫酸將水層之pH調整為2至3。添加乙酸乙酯(150 mL)且分離各層。在減壓下蒸發有機層至乾燥。添加正庚烷(90mL)且加熱至回流歷時1小時。冷卻至15℃且隨後藉由過濾收集沈澱物，用正庚烷(90 mL)進行洗滌。在真空中乾燥，得到呈白色固體狀之標題化合物(27 g，98%)。 製劑12 (3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲醯胺流程2，步驟C：在10 L夾套反應器中，在氮氣下將(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-羧酸(771 g，2019 mmol)於二氯甲烷(7.0 L)中之溶液冷卻至0℃，且歷經40分鐘分批添加CDI (400 g，2421 mmol)。將反應器夾套冷卻至-20℃且攪拌1小時，且隨後歷經約30分鐘分批添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(260.0 g，2612 mmol)。在-20℃下攪拌1小時，在0℃下攪拌2小時，且在10℃下攪拌7小時。添加CDI (175 g，1058 mmol)且在10℃下攪拌隔夜。在10℃下進一步添加CDI (180 g，1088 mmol)且攪拌1小時，隨後在10℃下添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(140 g，1407 mmol)且繼續攪拌。若反應不完全，則可進一步加入CDI，隨後加入N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽直至觀測到完全反應。將反應混合物冷卻至5℃且用1 N鹽酸水溶液(5 L)洗滌，隨後用2 N鹽酸水溶液(5 L)洗滌。用二氯甲烷(1 L)萃取經合併之水溶液，合併有機萃取物且用水(2.5 L)、1 N氫氧化鈉水溶液(2.5 L)及水(2.5 L)洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下蒸發，得到殘留物。添加甲基第三丁基醚(3 L)且在減壓下蒸發。進一步添加甲基第三丁基醚(2 L)且在50℃下攪拌1小時，冷卻至25℃且攪拌30分鐘。藉由過濾收集所得固體，用甲基第三丁基醚(2 × 500 mL)洗滌且在真空中乾燥，得到呈白色固體狀之標題化合物(760 g，88%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 417.0/419.0 [M+H]。 替代性製劑12 流程2，步驟C：在氮氣下將(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-羧酸(27 g，70.7 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(135 mL)中之溶液冷卻至0℃且添加CDI (14.9 g，91.9 mmol)。攪拌1小時且隨後添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(9.0 g，92 mmol)及三乙胺(14.3 g，141mmol)。在15℃下攪拌16小時。將反應混合物冷卻至0℃且添加0.5 M硫酸水溶液(675 mL)。攪拌1小時。藉由過濾收集所得固體。在甲基第三丁基醚(90 mL)中漿化固體1小時。藉由過濾收集固體，用甲基第三丁基醚(30 mL)進行洗滌。在真空中乾燥，得到呈固體狀之標題化合物(23 g，78%)。 製劑13 1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-基]乙酮流程2，步驟D：在20 L夾套反應器中，將(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲醯胺(654.0 g，1536 mmol)於THF (10 L)中之溶液冷卻至-60℃且逐滴添加3.2 M溴化甲基鎂於2-甲基四氫呋喃(660 mL，2110 mmol)中之溶液，同時將內部溫度維持在-40℃以下。在-40℃下攪拌反應混合物30分鐘隨後冷卻至-50℃，且添加1 N鹽酸水溶液(2 L)之THF (2 L)溶液，將內部溫度維持在-38℃以下。將溫度升高至10℃且添加乙酸乙酯(5 L)及水(1 L)，進行攪拌且使內部溫度達至5℃且分離各層。用乙酸乙酯(1 L)萃取水層且合併有機萃取物。用水(2 L)洗滌有機萃取物且用乙酸乙酯(1 L)萃取水層。合併有機萃取物且用鹽水(3 × 2 L)洗滌，隨後經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且在減壓下蒸發得到殘留物。添加環己烷(2.5 L)，在60℃下攪拌1小時，隨後在20℃下攪拌30分鐘，且藉由過濾收集固體，用環己烷(500 mL)進行洗滌。在真空中乾燥固體，獲得呈白色固體狀之標題化合物(565 g，99%)。 ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 372.0/374.0 [M+H]，[α]D 20 = -58.0 ° (C=1.000，氯仿)。 替代性製劑13 流程2，步驟D：將(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-4-甲醯胺(4.0 g，9.59 mmol)於THF(60 mL)中之溶液冷卻至-5℃，且逐滴添加3.0 M溴化甲基鎂之2-甲基四氫呋喃(5.0 mL，15 mmol)溶液，同時將內部溫度維持在-5℃與0℃之間。在-5℃與0℃之間攪拌反應混合物60分鐘，隨後添加飽和氯化銨溶液(20 mL)。添加甲基第三丁基醚(40 mL)，使內部溫度達至5℃且分離各層。在減壓下蒸發有機層得到殘留物。添加正庚烷(50 mL)加以攪拌，且藉由過濾收集固體。在真空中乾燥固體，獲得呈固體狀之標題化合物(3.0 g，77%)。 製劑14 1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(1,1-二氟乙基)四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮流程2，步驟E：在0℃至5℃下將1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-基]乙酮(5.08 g，13.6 mmol)一次性添加至四氟硼酸二氟(N-嗎啉基)鋶 (10.02 g，39.18 mmol)於無水二氯甲烷(100 mL)中之攪拌懸浮液中。攪拌混合物10分鐘且歷經10分鐘逐滴添加三氫氟化三乙胺(4.5 mL，27 mmol)。在冰浴中攪拌反應混合物8小時，隨後升溫至環境溫度且攪拌隔夜。添加飽和碳酸鈉水溶液(100 mL)且攪拌1小時。分離各層且用二氯甲烷(2 × 50 mL)萃取水溶液。合併有機萃取物且用飽和碳酸氫鈉水溶液(100 mL)、2 N鹽酸水溶液(2 × 100 mL)及鹽水(100 mL)進行洗滌。蒸發至乾燥得到淡棕色固體，且在60℃下將其溶解於甲基第三丁基醚(300 mL)中。過濾熱溶液且蒸發濾液，得到棕色固體(5.3 g，81%，藉由LCMS測得之82%純度)，其未經進一步純化即可使用。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 393.8/395.8 [M+H]。 替代性製劑14 流程2，步驟E：在-14℃下向1-[(3aR,4S,6aS)-1-乙醯基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑-4-基]乙酮(565 g，1.51 mol)於無水二氯甲烷(5 L)中之攪拌溶液中分批添加XtalFluor-M® (1.21 kg，4.73 mol)。攪拌混合物10分鐘且歷經20分鐘逐滴添加三氫氟化三乙胺(550 g，3.34 mol)。在-10℃下攪拌反應混合物大約10小時，隨後升溫至環境溫度且攪拌隔夜。緩慢添加50%氫氧化鈉水溶液(750 mL)，將內部溫度維持在10℃以下，隨後添加水(1.5 L)及飽和碳酸氫鈉水溶液(1 L)且攪拌30分鐘。分離各層且用二氯甲烷(1 L)萃取水溶液。合併有機萃取物且用鹽水(3 L)、2 N鹽酸水溶液(5 L)及鹽水(3 L)進行洗滌。蒸發得到殘留物且藉由矽膠層析法用50%-100%二氯甲烷之異己烷溶液，隨後用10%甲基第三丁基醚之二氯甲烷溶液溶離進行純化，得到呈白色粉末狀之標題化合物(467 g，73%，藉由LCMS測得之94%純度)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 393.8/395.8 [M+H]。 製劑15 (3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氫-1H-呋喃并[3,4-c]異噁唑流程2，步驟F：在10 L夾套反應器中向1-[(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟苯基)-4-(1,1-二氟乙基)四氫-1H,3H-呋喃并[3,4-c][1,2]噁唑-1-基]乙酮(570 g，1.45 mol)於1,4-二噁烷(5 L)中之溶液中添加37重量%鹽酸水溶液(1.3 L，16 mol)，且在100℃下攪拌約3小時或直至LCMS顯示完全反應。將反應混合物冷卻至10℃，用水(1 L)稀釋且緩慢添加50重量%的氫氧化鈉水溶液(800 mL)與水(1 L)之混合物，將內部溫度維持在20℃以下。添加乙酸乙酯(2.5 L)且劇烈攪拌，隨後分離各層且用鹽水(2 L)，進一步用鹽水(1 L)及水(1 L)洗滌有機相。經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且在減壓下濃縮至乾燥得到殘留物。添加環己烷(2.5 L)且蒸發至乾燥，隨後重複進行，獲得呈棕色油狀物之標題化合物(527 g，89%，藉由LCMS測得之86%純度)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 351.8/353.8 [M+H]。 製劑16 [(2S,3R,4S)-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氫呋喃-3-基]甲醇流程2，步驟G：在環境溫度下向(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氫-1H-呋喃并[3,4-c]異噁唑(5.06 g，13.4 mmol)於乙酸(100 mL)中之溶液中添加鋅粉(6.0 g，92 mmol)且攪拌隔夜。用乙酸乙酯(200 mL)及水(300 mL)稀釋混合物且劇烈攪拌，同時添加碳酸鈉(97 g，915 mmol)。分離各層且用鹽水(2 × 200 mL)洗滌有機層，經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且濃縮得到殘留物。藉由矽膠層析法用0%至100%甲基第三丁基醚之異己烷溶液溶離來純化殘留物，得到呈蠟狀固體之標題化合物(4.67 g，89%，藉由LCMS測得之90%純度)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 354.0/356.0 [M+H]。 替代性製劑16 流程2，步驟G：在20℃下向(3aR,4S,6aS)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(1,1-二氟乙基)-3,3a,4,6-四氫-1H-呋喃并[3,4-c]異噁唑(304 g，75%純度，647mmol)於乙酸(2 L)及水(2 L)中之溶液中分批添加鋅粉末(200 g，3.06 mol)，隨後升溫至40℃且攪拌隔夜。用水(2 L)稀釋混合物且劇烈攪拌，同時添加碳酸鈉(4 kg，43.4 mol)，隨後進一步用碳酸鈉將pH調整為8至9。添加乙酸乙酯(5 L)及水(2.5 L)，攪拌30分鐘且經由矽藻土過濾，用2:1乙腈/水進行洗滌。分離各層，用乙酸乙酯(2 × 2.5 L)萃取水溶液且用鹽水(2 × 2.5 L)洗滌經合併之有機萃取物，經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且濃縮得到殘留物。藉由SFC，管柱：Chiralpak AD-H (5)，50 × 250 mm；溶離劑：含於CO2 中之12%乙醇(0.2%二乙基甲胺)；流動速率：在UV 220 nm下340 g/min來純化殘留物，得到呈白色固體狀之標題化合物(197.7 g，84%)。[α]D 20 = -6.93° (C=0.678，氯仿)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 354.0/356.0 [M+H]。 製劑17 [(2S,3R,4S)-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(三苯甲氧基甲基)四氫呋喃-3-基]甲醇流程1，步驟F：將(3aR,4S,6aR)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(三苯甲氧基甲基)-3,3a,4,6-四氫呋喃并[3,4-c]異噁唑(31.30 g，55.9 mmol)添加至乙酸(186 mL)中而得到懸浮液。添加鋅(25.6 g，391 mmol)且劇烈攪拌反應混合物18小時。用甲苯稀釋混合物且經由矽藻土過濾。在減壓下濃縮濾液。用乙酸乙酯溶解殘留物，用鹽水及飽和碳酸氫鈉進行洗滌。分離各相，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到標題化合物(31.35 g，99%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 562/564 [M+H]。 製劑18 N-[[(3S,4R,5S)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)-5-(三苯甲氧基甲基)四氫呋喃-3-基]胺甲醯硫基]苯甲醯胺流程1，步驟G：將[(2S,3R,4S)-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(三苯甲氧基甲基)四氫呋喃-3-基]甲醇(31.35 g，55.73 mmol)溶解於二氯甲烷(557 mL)中且冷卻至5℃。添加異硫氰酸苯甲醯酯(9.74 mL，72.45 mmol)。完成添加之後，使反應混合物升溫至室溫且攪拌2小時。倒入飽和碳酸氫鈉中，分離各相，且用二氯甲烷萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾溶液且在減壓下濃縮，得到標題化合物(42.95 g，106%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 747/749 [M+Na]。 製劑19 N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程2，步驟H：在環境溫度下向[(2S,3R,4S)-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氫呋喃-3-基]甲醇(4.67 g，11.9 mmol)於二氯甲烷(20 mL)中之溶液中添加異硫氰酸苯甲醯酯(1.80 mL，13.3 mmol)歷時1小時直至LCMS顯示完成反應。在真空中使反應混合物蒸發得到殘留物。添加環己烷(50 mL)，升溫至60℃且添加甲基第三丁基醚直至沈澱物完全溶解(100 mL)。過濾熱溶液，冷卻至室溫且在減壓下緩慢蒸發直至形成白色沈澱物。在減壓下移除溶劑且將殘留物溶解於無水二氯甲烷(30 mL)中，添加吡啶(2.4 mL，30 mmol)，且將溶液冷卻至-25℃。歷經30分鐘逐滴添加三氟甲磺酸酐(2.2 mL，13 mmol)且歷經1小時使其升溫至0℃。用水(25 mL)、2 N鹽酸水溶液(25 mL)、水(25 mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(25 mL)及水(25 mL)洗滌反應混合物，經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且濃縮至乾燥。藉由矽膠層析法用5%甲基第三丁基醚之二氯甲烷溶液溶離來純化殘留物，得到呈淡黃色泡沫狀之標題化合物(5.0 g，76%，藉由LCMS測量之90%純度)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 499.0/501.0 [M+H]。 替代性製劑19 流程2，步驟H：在30℃下向[(2S,3R,4S)-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)-2-(1,1-二氟乙基)四氫呋喃-3-基]甲醇(197.6 g，546.7 mmol)於二氯甲烷(1.2 L)中之溶液中添加異硫氰酸苯甲醯酯(98 mL，724.9 mmol)歷時1小時。添加CDI (101 g，610.4 mmol)且在環境溫度下攪拌3小時。可進一步加入CDI以確保硫脲中間體完全消耗。加熱至90℃歷時42小時且將溶液冷卻至環境溫度。用乙酸乙酯(2 L)稀釋反應混合物且添加2 N鹽酸水溶液(2 L)，加以攪拌，添加鹽水(1 L)且分離各層。用2 N鹽酸水溶液(0.5 L)、鹽水(2×1 L)及飽和碳酸氫鈉水溶液(1 L)洗滌有機層。經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且濃縮得到殘留物。藉由矽膠層析法用0-100%乙酸乙酯之異己烷溶液溶離來純化殘留物，得到呈淡黃色固體狀之標題化合物(234 g，83%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 499.0/501.0 [M+H]。 製劑20 N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(三苯甲氧基甲基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程1，步驟H：將N-[[(3S,4R,5S)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)-5-(三苯甲氧基甲基)四氫呋喃-3-基]胺甲醯基硫基苯甲醯胺(42.95 g，59.18 mmol)溶解於二氯甲烷(591 mL)中且冷卻至-20℃。添加吡啶(12.0 mL，148.0 mmol)，之後添加三氟甲磺酸酐(10.97 mL，65.10 mmol)。監測添加，將溫度保持在-20℃以下。在-20℃下攪拌反應混合物30分鐘。使反應混合物升溫至室溫。倒入飽和氯化銨中，分離各相，且用二氯甲烷萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾溶液且在減壓下濃縮，得到標題化合物(45.24 g，108%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 707/709 [M+H]。 製劑21 N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基))-5-(羥甲基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程1，步驟I：將N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(三苯甲氧基甲基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(45.24 g，63.93 mmol)溶解於甲酸(160 mL)中且在環境溫度下攪拌1小時。歷經5分鐘之時間段添加水(29 mL)。攪拌50分鐘。在減壓下濃縮混合物得到殘留物。將殘留物溶解於甲醇(639 mL)中，添加三乙胺(26.7 mL，191.8 mmol)，且在環境溫度下攪拌隔夜。倒入鹽水中，分離各相，且用氯仿萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用丙酮:己烷(25%-38%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(16.04 g，54%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 465/467 [M+H]。 製劑22 (4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-5-羧酸流程1，步驟J：將N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(羥甲基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(16.04 g，34.47 mmol)添加至DMSO (172 mL)中。添加2-二氧碘基苯甲酸(35.56 g，120.70 mmol)且在環境溫度下攪拌3小時。用氯仿(300 mL)稀釋反應混合物且倒入飽和氯化銨(400 mL)中。分離有機相且經硫酸鎂乾燥。過濾溶液且在減壓下濃縮得到殘留物。將殘留物溶解於乙酸乙酯(400 mL)中且用飽和氯化銨(2 × 250 mL)洗滌。分離有機相，經硫酸鎂乾燥，加以過濾，且在減壓下濃縮得到殘留物。將殘留物溶解於二氯甲烷:甲醇混合物中且添加乙醚直至固體沈澱。藉由過濾收集固體且在減壓下乾燥，得到標題化合物(5.78 g，35%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 479/481 [M+H]。 製劑23 (4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-N-甲氧基-N-甲基-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-5-甲醯胺流程1，步驟K：將(4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-5-羧酸(5.78 g，12.1 mmol)溶解於二氯甲烷(201 mL)及N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(1.76 g，18.1 mmol)中。添加三乙胺(5.29 mL，36.2 mmol)隨後添加HATU (7.02 g，18.1 mmol)。在環境溫度下攪拌3天。倒入飽和氯化銨中，分離各相，且用乙酸乙酯萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用乙酸乙酯:二氯甲烷(0-50%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(4.15 g，66%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 522/524 [M+H]。 製劑24 N-[(4aS,5S,7aS)-5-乙醯基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程1，步驟L：將甲基溴化鎂(3.0 mol/L於二乙基醚中，4.8 mL，14.5 mmol)逐滴添加至(4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-N-甲氧基-N-甲基-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-5-甲醯胺(1.51 g，2.89 mmol)於THF (57.8 mL)中之-78℃溶液中。在-78℃下攪拌反應5分鐘且使其逐漸升溫至環境溫度。攪拌30分鐘。用甲醇(4 mL)淬滅反應，用飽和氯化銨加以稀釋，且用乙酸乙酯萃取。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用乙酸乙酯:己烷(0-100%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(1.28 g，93%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 477/479 [M+H]。 製劑25 N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程1，步驟M：將一起添加二氯甲烷(34 mL)、三氟化雙(2-甲氧乙基)胺基硫 (1.52 mL，6.88 mmol)及三氟化硼合二乙醚(0.89 mL，6.88 mmol)加到一起。在環境溫度下攪拌2小時。一次性添加N-[(4aS,5S,7aS)-5-乙醯基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.821 g，1.72 mmol)，之後添加三氫氟化三乙胺(1.13 mL，6.88 mmol)。在環境溫度下攪拌18小時。倒入飽和氯化銨中，分離各相，且用乙酸乙酯萃取水相。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用二氯甲烷:己烷(80%-100%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(0.552 g，64%)。ES/MS m/z (79 Br/81 Br) 499/501 [M+H]。 製劑26 N-[(5S,7aS)-5-(1,1-二氟乙基)-7a-{2-氟-5-[(三氟乙醯基)胺基]苯基}-4a,5,7,7a-四氫-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程5，步驟A：將N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4a,5,7,7a-四氫-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(234 g，454.6 mmol)溶解於1,4-二噁烷(2 L)中，且在氮氣流下添加4 Å分子篩(37 g)、2,2,2-三氟乙醯胺(91 g，780.9 mmol)、細粉狀碳酸鉀(114 g，824.9 mmol)，碘化鈉(117 g，780.6 mmol)、碘化銅(I) (17.5 g，91.9 mmol)及外消旋反-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(20 g，140.6 mmol)。用3個真空氮氣交換器吹洗容器且加熱至123℃歷時18小時。冷卻至環境溫度且經由矽藻土過濾溶液，且用乙酸乙酯洗滌。添加飽和氯化銨水溶液(2 L)且劇烈攪拌45分鐘。分離各層且用飽和氯化銨水溶液(3 × 1 L)、鹽水(300 mL)洗滌有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾且蒸發得到殘留物。藉由矽膠層析法用0-100%乙酸乙酯之異己烷溶液溶離來純化殘留物，得到呈淡黃色固體狀之標題化合物(297.9 g，95%，81%純度)。ES/MS m/z 532.0 [M+H]。 製劑27 N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺流程1，步驟N：在乙醇中將N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.372 g，0.74 mmol)與(1R,2R)-N,N'-二甲基-1,2-環己二胺(0.037 mL，0.22 mmol) (30 mL)合併。添加疊氮化鈉(0.194 g，2.98 mmol)，之後添加抗壞血酸鈉(0.66 M溶液，0.50 ml，0.33 mmol)。用氮氣吹洗燒瓶頂部且添加硫酸銅(0.33 M溶液，0.68 ml，0.22 mmol)。將所得混合物加熱至80℃且攪拌5小時。冷卻反應物且添加冷水。用乙酸乙酯萃取混合物。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。將殘留物與鈀(10質量%/碳，0.35 g，0.16 mmol)合併於乙醇(50 ml)及THF(10 ml)中。用氮氣及氫氣吹洗混合物。在環境溫度下於50 psi之氫氣下攪拌1小時。過濾掉催化劑且用乙酸乙酯洗滌。在減壓下濃縮溶液，得到殘留物。藉由矽膠層析法用乙酸乙酯:二氯甲烷(0-20%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(0.2184 g，67%)。ES/MS m/z 436 (M+H)。 替代性製劑27 流程5，步驟B：在室溫下將7 N氨之甲醇溶液(600 Ml，4.2 mol)添加至N-[(5S,7aS)-5-(1,1-二氟乙基)-7a-{2-氟-5-[(三氟乙醯基)胺基]苯基}-4a,5,7,7a-四氫-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(250 g，80%純度，376.3 mmol)於甲醇(200 mL)中之攪拌懸浮液中，且在環境溫度下攪拌18小時。蒸發至乾燥，得到呈棕色膠狀物之標題化合物(190 g，375.2 mmol，86%純度)。ES/MS m/z 436.0 [M+H]。 製劑28 (4aS,5S,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4a,5,7,7a-四氫-4H-呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺流程4，步驟A：將N-[(4aS,5S,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(216.4 g，88%純度，435.9 mmol)溶解於吡啶(400 mL)、乙醇(100 mL)及THF(300 mL)中。添加O-甲基羥胺鹽酸鹽(190 g，2275.0 mmol)且在環境溫度下攪拌18個小時。用2-甲基四氫呋喃(1 L)稀釋且用水(2 × 300 mL)進行洗滌。分離有機層且將35%氫氧化銨水溶液(100 mL)添加至水溶液中。用2-甲基四氫呋喃(300 mL)萃取，隨後用氯化鈉飽和且用2-甲基四氫呋喃(2 × 300 mL)萃取。合併有機萃取物，用鹽水(300 mL)洗滌且蒸發得到殘留物。溶解於甲醇(200 mL)中，添加7 N氨之甲醇溶液(100 mL，700 mmol)且在室溫下攪拌18小時。若殘留任何三氟乙醯胺雜質，則可進一步添加氨。在減壓下移除溶劑且將殘留物溶解於2 N鹽酸水溶液(1.5 L)中。用二氯甲烷(6 × 500 mL)萃取，合併有機層且在減壓下移除溶劑，得到約1 L之總體積。用2 N鹽酸水溶液(300 mL)洗滌且合併全部洗滌水溶液。添加2-甲基四氫呋喃(1 L)且劇烈攪拌，同時用碳酸氫鈉將pH調整為鹼性，直至不會觀測到氣體逸出。分離各層且用2-甲基四氫呋喃(2 × 500 mL)萃取水溶液。用硫酸鎂乾燥經合併之有機萃取物，過濾且蒸發得到棕色固體。藉由矽膠層析法用0-100%二氯甲烷之THF溶液溶離來純化殘留物。用乙酸乙酯/庚烷蒸發含有產物之溶離份之產物，得到呈米色細粉狀之標題化合物(106 g，70%，95%純度)。ES/MS m/z 332.0 [M+H]，[α]D 20 = +42.11° (C= 0.532，氯仿)。 製劑29 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺。流程3，步驟A：將DIPEA (0.032 mL，0.1837 mmol)添加至N-[(4as,5s,7as)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.040 g，0.09185 mmol)、5-氰基吡啶-2-羧酸(0.0203 g，0.1378mmol)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(0.0191 g，0.1378 mmol)之混合物於二氯甲烷(2 ml)與二甲基甲醯胺(0.5mL)中之溶液中。一次性添加EDCI (0.026 g，0.1378 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物18個小時。用乙酸乙酯稀釋溶液，且用水及鹽水進行洗滌。用乙酸乙酯萃取。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮，得到殘留物。藉由矽膠層析法用甲基-第三丁基醚:二氯甲烷(0-10%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(0.0465 g，90%)。ES/MS m/z 566 (M+1)。實例 1 N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺流程3，步驟B：將THF (1.5 mL)及乙醇(1.5 mL)中之N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-苯甲醯胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(0.0465 g，0.0822 mmol)、O-甲基羥胺鹽酸鹽(0.0687 g，0.8220 mmol)及吡啶(0.066 ml，0.8220 mmol)之混合物在50℃下加熱18小時。在減壓下濃縮混合物，得到殘留物。藉由矽膠層析法，用含7 N NH3 之甲醇:二氯甲烷(0-2%梯度)溶離來純化殘留物，得到標題化合物(0.026 g，68%)。ES/MS m/z 462 (M+1)。實例 1a N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸酯半水合物(1:1:0.5)將N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(150 mg，0.33 mmol)及THF(2 mL)添加在一起且在室溫下攪拌至溶解。添加對甲苯磺酸水合物(0.095 g，0.5 mmol)且將溶液加熱至50℃。添加以呈200微升等分試樣添加之水且在總共添加約2 mL之後觀測沈澱觀察沈澱。在50℃下攪拌數小時，得到濃稠懸浮液。為改良混合，再添加額外THF (1 mL)。歷經數小時冷卻至室溫且藉由真空過濾來過濾。用極少量THF洗滌。風乾隔夜，得到標題化合物。替代性製劑 實例 1a N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸酯半水合物(1:1:0.5) 將N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(1.5 g，3.3 mmol)與THF(12 mL)添加在一起且在室溫下攪拌至溶解。加熱至60℃且添加溶解於水(5 mL)中之對甲苯磺酸 水合物(0.75 g，3.90 mmol)。攪拌5分鐘後形成白色沈澱。在60℃下攪拌數小時，得到濃稠懸浮液。歷經數小時冷卻至室溫且藉由真空過濾來過濾。風乾隔夜，得到標題化合物。 X射線粉末繞射(XRD) 在配備有CuKa源(λ=1.54060 Å)及Vantec偵測器且在35 kV及50 mA下操作的Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRD圖。在2θ內的4到40°之間掃描樣品，其中掃描步長為2θ內的0.009°且掃描速率為0.5秒/步，並且散度為0.6 mm，固定抗散射為5.28且偵測器狹縫為9.5 mm。將乾燥粉末裝填於石英樣品固持器中且使用玻璃載片獲得光滑表面。在環境溫度及相對濕度下收集結晶形態繞射圖。結晶學技術中已熟知：對於任何既定結晶形態，由於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之較佳定向，繞射峰之相對強度可能變化。在存在較佳定向之效應之情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如The United States Pharmacopeia #23，National Formulary #18，第1843-1844頁，1995。此外，用於任何既定結晶形式之角峰位置可略微變化，此亦在結晶學領域熟知。舉例而言，峰位置可能由於分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品移位或內標存在或不存在而有位移。在本發明之情況下，2θ之± 0.2之峰位置變化將考慮此等潛在變化而不妨礙明確鑑別指定結晶形式。結晶形式可基於有區別之峰(以°2θ為單位)，通常為更顯著之峰之任何獨特組合來確認。在環境溫度及相對濕度下所收集之結晶形式繞射模式基於8.853及26.774 °2-θ NIST 675處之標準峰值調節。 所製備之結晶N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺 4-甲基苯磺酸鹽半水合物(1:1:0.5)藉由樣本XRD圖表徵，該圖使用如具有如表1中所述之繞射峰(2θ值)的CuKa輻射，且特定言之，該圖具有位於6.8°處之峰以及選自由19.7°、14.9°及10.3°組成之群的峰中之一或多者；該等角伴隨0.2°之繞射角公差。 表1：結晶實例1a之X射線粉末繞射峰 實例 1b N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺甲磺酸鹽將N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(150 mg，0.33 mmol)及THF(2 mL)添加在一起且在室溫下攪拌至溶解。添加甲磺酸(0.095 g，0.5 mmol)且將溶液加熱至50℃。以200微升等分試樣添加水，總計添加至多2 mL以誘導結晶。未觀測到沈澱。在25℃下冷卻並攪拌，且未觀測到沈澱。在氮氣下濃縮至½體積且觀測到沈澱物。將懸浮液加熱至60℃且在約10分鐘之後觀測到澄清溶液。在60℃下加熱1小時。冷卻至室溫，得到白色懸浮液且攪拌混合物數小時。藉由真空過濾分離固體且用極少量水進行洗滌。風乾隔夜，得到呈結晶固體狀之標題化合物。活體外分析程序： 為評定BACE1相對於BACE2之選擇性，在基於FRET及免疫分析測定偵測之酶分析中使用如下所述之針對BACE1及BACE2之特定受質，如下所述來評估測試化合物。測試化合物在DMSO中製備以組成10 mM儲備溶液，用於活體外酶及細胞分析。在進行活體外酶分析及全細胞分析前，用DMSO連續稀釋儲備溶液，獲得十點稀釋曲線，其中在96孔圓底培養盤中最終化合物濃度在10 μM至0.05 nM範圍內。活體外蛋白酶抑制分析： huBACE1:Fc及hu BACE2:Fc之表現。 人類BACE1 (寄存編號：AF190725)及人類BACE2 (寄存編號：AF 204944)藉由RT-PCR自全腦cDNA選殖。將對應於胺基酸序列#1至460之核苷酸序列插入至編碼人類IgG1 (Fc)多肽之cDNA中(Vassar等人,Science ,286 , 735-742 (1999))。在pJB02載體中建構構築BACE1 (1-460)或BACE2 (1-460)與人類Fc之此融合蛋白質，分別稱為huBACE1:Fc及huBACE2:Fc。人類BACE1 (1-460):Fc (huBACE1:Fc)及人類BACE2 (1-460):Fc (huBACE2:Fc)在HEK293細胞中暫時表現。將各構築體之cDNA (250 μg)與Fugene 6混合且添加至1公升HEK293細胞中。轉染後四天，收集改良性培養基進行純化。如下所述藉由如下所述之蛋白A層析法純化huBACE1:Fc及huBACE2:Fc。酶以較小等分試樣形式儲存於-80℃下。(參見Yang, 等人,J.Neurochemistry ,91 (6) 1249-59 (2004))。hu BACE1:Fc及hu BACE2:Fc之純化。 收集經huBACE1:Fc或huBACE2:Fc cDNA短暫轉染之HEK293細胞的改良性培養基。藉由通過0.22 μm無菌過濾器過濾改良性培養基來移除細胞碎片。將5 ml蛋白A-瓊脂糖(柱床體積)添加至4公升改良性培養基中。在4℃下將此混合物輕輕攪拌隔夜。收集蛋白A-瓊脂糖樹脂且將其裝填於低壓層析柱中。用20×柱床體積之PBS以20 ml/h之流動速率洗滌對管柱進行洗滌。用50 mM乙酸(pH 3.6)以20 ml每小時之流動速率溶離結合huBACE1:Fc或huBACE2:Fc蛋白質。緊接著用乙酸銨(pH 6.5，0.5 ml 200 mM)中和1 ml溶離劑部分。最終產品之純度藉由在4-20%Tris-甘胺酸SDS-PAGE中電泳來評定。酶以較小等分試樣形式儲存於-80℃下。BACE1 FRET 分析 如上文所述製備測試化合物之連續稀釋液。在KH2 PO4 緩衝液中將化合物進一步稀釋20×。將10 μL之各稀釋液添加至在含有反應混合物(25 μL之50 mM KH2 PO4 ，pH 4.6，1 mM TRITON® X-100，1 mg/mL BSA，及基於APP之序列的15 μM FRET受質)之對應的低蛋白質結合黑色培養盤之列A至H上的各孔中(參見Yang, 等人,J.Neurochemistry ,91 (6) 1249-59 (2004))。將內含物在培養盤震盪器上充分混合10分鐘。將15 μL之含於KH2 PO4 緩衝液中的200 pM人類BACE1 (1-460):Fc(參見Vasser等人，Science ,286 , 735-741 (1999))添加至含有受質及測試化合物之培養盤中以引發反應。在於盤震盪器上短暫混合後，在激發波長355 nm及發射波長460 nm下記錄時間0時處混合物之RFU。用鋁箔覆蓋反應培養盤且在室溫下保存於黑暗潮濕烘箱中16至24小時。在與時間0時處相同之激發及發射設置的情況下記錄培育結束時之RFU。時間0時與培育結束時之差值表示在化合物處理下BACE1之活性。標繪RFU差值與抑制劑濃度關係且用四參數邏輯方程式擬合曲線，獲得IC50 值。(May,等人 ，Journal of Neuroscience ,31 , 16507-16516 (2011))。 基本上如上所述測試實例1之化合物且展現0.509 nM ± 0.104，n= 4之BACE1 IC50 (平均值±平均值之標準差)。此資料展現實例1化合物在活體外抑制經純化重組BACE1酶活性。BACE2 MBP-C125Swe 分析 在合適範圍內製備測試化合物之10點連續稀釋液。在乙酸銨分析緩衝液(50 mmol乙酸銨，pH 4.6，1 mM Triton X-100，1 mg/mL BSA)中將化合物進一步稀釋6×。將10 µL各稀釋液添加至對應低蛋白結合培養盤之列A至列H上的各孔中，其中該培養盤預添加有針對BACE2活性之10 µL經大腸桿菌衍生之親和純化受質(MBPC125swe，1 µg/mL)。將內含物在培養盤震盪器上充分混合10分鐘。將上述同一反應緩衝液中之10 µL 200皮莫耳人類BACE2 (1-460):Fc添加至含有受質及測試化合物之培養盤中以引發反應。4小時之後，藉由添加終止緩衝液(40 µL)來終止反應。藉由ELISA使用MBP-C26swe標準量測產物之量。將抗MBP抗體固定於高結合性聚苯乙烯培養盤之表面上且使用酪蛋白/PBS阻斷緩衝液阻斷。將樣本或標準物(40 µL)添加至ELISA培養盤中且在4℃下培育隔夜。隨後洗滌培養盤且添加40 μL之裂解特異性偵測抗體(GN405)且使其在室溫下靜置一小時。隨後藉由洗滌移除未結合之GN405且將40 μL之山羊抗兔HRP共軛物(Southern Biotech，4010-05)添加至培養盤中且使其在室溫下靜置1小時。再次洗滌培養盤且添加TMB受質(40 µL)。所釋放產物之對應的量為在任何抑制劑之測試濃度下溶液中BACE2活性之測量。標繪出10點抑制曲線且用四參數邏輯方程式擬合，獲得EC50 值及IC50 值。(參見：Sinha，等人,Nature ,402 , 537-540 (2000))。 實例1之化合物基本上如上文所述來測試且展現BACE2 IC50 為17.6 nM±7.4，n=6 (平均值±平均值之標準差)。BACE1 (FRET IC50 酶分析)與BACE2 (MBP-C125Swe細胞分析)之比為大約35倍，其表明抑制BACE1酶之功能選擇性。上述資料表明實例1之化合物相對於BACE2對BACE1有選擇性。SH-SY5YAPP695Wt 全細胞分析 用於測量對BACE1活性之抑制的常規全細胞分析使用表現人類APP695Wt cDNA之人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y (ATCC寄存編號CRL2266)。細胞常規地使用至多傳代次數6且隨後經丟棄。 將SH-SY5YAPP695Wt細胞以5.0×104 個細胞/孔塗於96孔組織培養盤中的200 μL培養基(50% MEM/EBSS及漢姆氏F12，1×每丙酮酸鈉、非必需胺基酸及含有10% FBS之NaHCO3 )中。第二天，將培養基自孔移除，添加新鮮培養基，隨後在存在/不存在測試化合物的情況下在所需濃度範圍內於37℃下培育24小時。 在培育結束時，分析改良性培養基以藉由特異性夾心ELISA分析Aβ肽1-40及1-42來證實β-分泌酶活性。為量測此等Aβ之特異性同功異型物，使用單株2G3作為Aβ 1-40之捕捉抗體且使用單株21F12作為Aβ1-42之捕捉抗體。Aβ 1-40及Aβ 1-42 ELISA均使用生物素化3D6作為報告抗體(對於抗體之描述參見Johnson-Wood, 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 , 1550-1555 (1997))。化合物處理後改良性培養基中所釋放之Aβ之濃度對應於此類條件下BACE1之活性。繪製10點抑制曲線且用四參數對數等式擬合，以獲得降低Aβ之效果的IC50 值。 基本上如上所述測試實例1之化合物且展現0.157 nM ± 0.048，n=4之SH-SY5YAPP695Wt A-β (1-40) ELISA IC50 及0.177 nM ± 0.050，n=4之SH-SY5YAPP695Wt A-β (1-42) ELISA IC50 (平均值±平均值之標準差)。上述資料表明實例1之化合物在全細胞分析中抑制BACE1。活體內抑制 β- 分泌酶 可使用數種動物模型(包括小鼠、天竺鼠、狗及猴)篩檢化合物處理後活體內對β-分泌酶活性之抑制。本發明中所用動物可為野生型、轉殖基因或基因剔除動物。舉例而言，如Games等人,Nature 373 , 523-527 (1995)中所述製備之PDAPP小鼠模型及其他非轉殖基因或基因剔除動物適用於分析在抑制化合物存在下對Aβ及sAPPβ產生之活體內抑制。通常，經由口服、皮下、靜脈內、飼喂或其它投與途徑向2個月大PDAPP小鼠、基因剔除小鼠或非轉殖基因動物投與化合物，該化合物在媒劑(諸如玉米油、β-環葡聚糖、磷酸鹽緩衝液、PHARMASOLVE®或其他適合之媒劑)中調配。投與化合物後1至24小時，將動物處死，且移除大腦用於分析Aβ 1-x。如本文所用，「Aβ 1-x」係指以殘基1開始且以大於殘基28之C端結束的Aβ物種之總和。此偵測大部分Aβ物種且通常稱為「總Aβ」。總Aβ肽(Aβ 1-x)水準藉由使用單株266作為捕捉抗體及生物素化3D6作為報告抗體之夾心ELISA來量測。(參見May, 等人,Journal of Neuroscience ,31 , 16507-16516 (2011))。 出於短期研究，投與化合物或合適媒劑且在給藥後約3小時處死動物。由所選擇之動物獲得大腦組織且對Aβ 1-x之存在進行分析。長期給藥之後，亦可針對化合物處理後β-類澱粉斑之量分析年長APP轉殖基因動物之大腦組織。 與經媒劑處理之對照物或時間零時對照物相比，經投與抑制化合物之動物(PDAPP或其它APP轉殖基因或非轉殖基因小鼠)之大腦組織中的Aβ可能會顯示降低。舉例而言，對於雌性PDAPP幼鼠，0.1 mg/kg、0.3 mg/kg及1 mg/kg口服劑量之實例1使大腦海馬體中的Aβ 1-x肽含量分別降低32%、40%及55%(所有p值均＜ 0.01)。與給藥後3小時的經媒劑處理之小鼠相比， 實例1之0.1 mg/kg、0.3 mg/kg及1 mg/kg劑量使大腦皮質組織中之Aβ 1-x含量降低38%、50%及67% (所有p值均＜ 0.01)。 鑒於實例1之化合物活體外抗BACE1酶之活性，此等降低Aβ之作用與活體內BACE1抑制一致，且進一步說明實例1之化合物的CNS滲透作用。 此等研究顯示本發明化合物抑制BACE1且因此適用於降低Aβ含量。工程改造之 N3pGlu Aβ 抗體之表現及純化 本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或II)可基本上如下表現及純化。含有編碼SEQ ID NO: 12或13之LC胺基酸序列的DNA序列及編碼SEQ ID NO: 11之HC胺基酸序列的DNA序列的麩醯胺合成酶(GS)表現載體用於藉由電穿孔轉染中國倉鼠卵巢細胞株(CHO)。該表現載體編碼SV早期(猴病毒40E)啟動子及GS之基因。轉染後，利用0-50 µM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)對細胞進行整體選擇(bulk selection)。隨後將所選擇整體細胞或主要孔在無血清懸浮培養基中按比例擴大以用於生產。 將其中已分泌有抗體之澄清的培養基施加至已用相容性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4)平衡之蛋白A親和管柱中。用1 M NaCl洗滌管柱以移除非特異性結合組分。例如藉由檸檬酸鈉在pH (約)3.5下溶離結合之抗N3pGlu Aβ抗體且用1 M Tris緩衝液中和溶離份。諸如藉由SDS-PAGE或分析性尺寸排外偵測抗N3pGlu Aβ抗體溶離份，且隨後合併。在pH 7.4之PBS緩衝液中或pH約6，150 mM NaCl之10 mM NaCitrate緩衝液中濃縮本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)。最終材料可使用常用技術無菌過濾。抗N3pGlu Aβ抗體之純度大於95%。本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)可緊接著在-70℃下冷凍或在4℃下儲存數月。結合親和力及動力學 抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)對pE3-42 Aβ肽或對Aβ 1-40肽之結合親和力及動力學藉由使用BIACORE®3000 (GE Healthcare)之表面電漿子共振來量測。藉由在BIACORE® CMS晶片上經由固定蛋白A捕捉抗N3pGlu Aβ抗體，且使pE3-42 Aβ肽或Aβ 1-40肽流動，以2倍連續稀釋自100 nM開始降至3.125 nM，來量測結合親和力。實驗在25℃下的HBS-EP緩衝液(GE Healthcare BR100669；10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中進行。 對於各循環而言，以10 μL/min流速在10 μg/mL濃度下注射5 μL抗體溶液來捕捉抗體。在50 μL/min下用250 μL注射液使肽結合，且隨後解離10分鐘。藉由以10 μL/mL流速注射pH 1.5下之5 μL甘胺酸緩衝液使晶片表面再生。將資料擬合至1: 1 Langmiur結合模型以導出kon 、koff ，且計算KD 。 隨後程序基本上如上文所述，觀測到以下參數(展示於表2中)。表 2. 結合親和力及動力學 . 未偵測到與Aβ 1-40之明顯結合，指示抗體I及抗體II與Aβ 1-40相比特異性結合至pE3-42 Aβ肽。離體靶向 接合 為了在來自經固定PDAPP大腦之大腦切片上測定離體靶向接合，用外源添加之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)進行免疫組織化學分析。將來自老齡PDAPP小鼠(25個月大)之低溫恆溫器連續冠狀切片與20 µg/mL本發明之例示性N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)一起培育。採用對於人類IgG具有特異性之二級HRP試劑，且用DAB-Plus (DAKO)觀測沈積之斑塊。生物素標記之鼠3D6抗體隨後進行Step-HRP二級，用作陽性對照。陽性對照抗體(經生物素標記之3D6)在PDAPP海馬體中標記大量的沈積Aβ，且抗-N3pGlu Aβ抗體(抗體I或抗體II)標記一子集之沈積物。此等組織學研究表明，本發明之抗N3pGlu Aβ抗體(抗體I及抗體II)離體接合沈積之Aβ靶。 以下實例及分析顯示如何設計研究以驗證(在動物模式)中本發明之抗體與在本文中概述之化合物組合之組合可適用於治療特徵在於Aβ沈積之疾病，諸如阿茲海默氏症、唐氏症候群及CAA。然而應理解以下描述以說明而非限制之方式闡述，且一般熟習此項技術者可作出各種修改。組合研究 BACE 抑制劑饋料初步研究 在飼喂含有BACE抑制劑(諸如N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽)之飲食的PDAPP小鼠中進行先導藥代動力學及藥力學研究，以便界定提供藉由單獨BACE抑制之經標記血漿及大腦Aβ最低程度降低的劑量。以3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg之「quasi-bid」相等劑量用含有含BACE抑制劑之飲食的膳食餵養幼齡PDAPP小鼠14天。將每公克經鑑定之嚙齒動物膳食#8728CM (Harlan labs)0.05、0.15、0.5或1.5 mg BACE抑制劑於Sorvall混合器中混合10分鐘，隨後用Hobart混合器混合15分鐘，隨後粒化。將三十二隻幼齡雌性PDAPP小鼠由親本品系隨機分成由媒劑處理組及三個BACE抑制劑劑量組所組成之4組，一組8隻。使小鼠隨意獲取食物持續14天，隨後處死。用CO2 麻醉小鼠且藉由心臟穿刺將血液收集於塗佈EDTA之微型離心管中且儲存於冰上。隨後，藉由在室溫下在14,000 rpm下離心血液樣品4分鐘收集血漿，轉移至未處理之微型離心管，隨後冷凍於乾冰上且在-80℃下儲存直至分析。藉由斷頭術處死小鼠，將腦快速微切成一半，快速冷凍於乾冰上且儲存在-80℃下直至分析為止(一半用於Aβ分析且另一半用於化合物暴露量測)。為分析實質性Aβ，將腦樣品在5.5 M胍-HCl緩衝液(每一半腦0.5 mL)中用組織破碎機(985-370型)以速度5均質化約1分鐘。在室溫下將均質化腦樣品下垂隔夜。 為進行Aβ ELISA分析，收集萃取物且用酪蛋白緩衝液(1×PBS，其具有0.25%酪蛋白、0.05% Tween 20、0.1%硫柳汞，pH 7.4；以及蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P9340，在0.01 mg / mL下))至少1:10稀釋且在14000 rpm下離心10分鐘。為分析血漿Aβ，用試樣緩衝液(PBS；0.05% Triton X-405；0.04%硫柳汞、0.6% BSA) 1:2稀釋樣品，隨後藉由ELISA分析。藉由夾心ELISA分別使用m266.2 (抗Aβ13-28 )及經生物素標記之3D6 (抗Aβ1-5)作為捕捉及報導抗體測定血漿人類Aβ1-x 。一式兩份分析未知樣品且藉由內插(Soft Max Pro v. 5.0.1，Molecular Dynamics，使用參照曲線之4參數擬合)自8點標準曲線測定pg/mL，隨後調節稀釋度。如上所述藉由夾心ELISA測定實質性Aβ且將值標準化為蛋白含量(藉由布拉福考馬斯普拉斯蛋白法(Bradford Coomassie Plus Protein method)一式兩份地測定)且表示為皮克/毫克蛋白質。 為測定BACE抑制劑之組織及血漿含量，採用以下方法：用甲醇/水(1:1，v/v)連續稀釋BACE抑制劑之0.1 mg / mL儲備溶液以製備工作溶液，隨後用於強化對照血漿及腦勻漿以得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000 ng / mL之分析物濃度。分析前，將腦樣品在3體積甲醇/水(1:4，v/v)中用超音波破碎機均質化。將各研究樣品之等分試樣、適當校準標準物及對照基質樣品轉移至96孔盤，隨後與含有內標之乙腈混合。混合後，將樣品離心以粒化所沈澱之蛋白質。隨後將所得上清液之等分試樣轉移至潔淨96孔盤，用甲醇/水(1:1，v/v)稀釋且藉由LC-MS/MS分析10微升等分試樣。使用藉由校準曲線樣品之多次回歸測定的反應與濃度關係式計算分析物濃度。活體內組合研究 為評估抗N3pGlu Aβ單株抗體(諸如hE8L、抗體I或抗體II)與BACE抑制劑(諸如N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽)之組合斑塊降低療法，首先將一大群PDAPP小鼠老化至16至18個月齡。將經老化PDAPP小鼠基於性別、親本品系及年齡隨機分成五個處理組。每個處理組存在20至30隻經老化PDAPP小鼠。第1組在研究開始之時間零時處死以測定在治療處理之前病變之基線水準(下述屍檢)。隨後如下處理四個剩餘組：第2組，對照動物接受安慰劑飲食且每週注射12.5 mg / kg對照同型IgG2a抗體；第3組，動物每週接受12.5 mg / kg抗N3pGlu-Aβ單株抗體注射；第4組，動物以初步餵養研究中預先規定之劑量(但通常為約3至30毫克/公斤/天)接受BACE抑制劑飲食；第5組，動物接受BACE抑制劑飲食(約3至30毫克/公斤/天)且每週注射12.5 mg / kg抗N3pGlu-Aβ單株抗體。自由抗體於PBS緩衝液中之溶液組成之無菌儲備溶液稀釋抗N3pGlu-Aβ單株抗體且藉由腹膜內注射投與動物。將BACE抑制劑與鬆軟飲食(視所要劑量而定，每公克餵料約0.15至1.5 mg化合物)混合且壓製成餵料丸粒。在研究開始時記錄動物重量，隨後對於第一個月處理每週記錄，隨後對於研究持續時間每月記錄。亦在研究過程期間以規則時間間隔監測食物攝入。動物接受研究處理總共4個月。動物保持其各別飲食直至為屍檢止，此在最終抗體注射後一週進行。在屍檢之時，將動物麻醉且藉由使用EDTA預沖洗1 ml注射器心臟穿刺來獲得血液。於冰上收集血液樣品且藉由標準離心分離血漿。隨後，用冷肝素化生理食鹽水灌注動物，移出腦且切成左半球與右半球。將一個腦半球快速冷凍且保存以供組織學分析。將剩餘腦半球切成由海馬區、皮質、小腦及中腦組成之組織區段，隨後於乾冰上冷凍。將血漿及組織樣品儲存在-80℃下直至分析時。藥物動力學評估 對屍檢時獲得之血漿樣品測定血漿藥物動力學。在抗原結合ELISA分析中測定血漿抗體含量，其中用抗原(Aβp3-42 )塗佈培養盤，隨後與經稀釋血漿樣品或由抗N3pGlu單株抗體於分析緩衝液(PBS+對照鼠類血漿)中之連續稀釋液組成的參考標準物一起培育。洗滌培養盤後，用抗鼠類HRP結合抗體偵測結合之鼠類抗體，繼而用TMB顯色。為測定BACE抑制劑之組織(中腦)及血漿含量，採用以下方法：用甲醇/水(1:1，v/v)連續稀釋BACE抑制劑之0.1 mg / mL儲備溶液以製備工作溶液，隨後用於強化對照血漿及腦勻漿以得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000 ng / mL之分析物濃度。分析前，將腦樣品在3體積甲醇/水(1:4，v/v)中用超音波破碎機均質化。將各研究樣品之等分試樣、適當校準標準物及對照基質樣品轉移至96孔盤，隨後與含有內標之乙腈混合。混合後，將樣品離心以粒化所沈澱之蛋白質。隨後將所得上清液之等分試樣轉移至潔淨96孔盤，用甲醇/水(1:1，v/v)稀釋且藉由LC-MS/MS分析10微升等分試樣。使用藉由校準曲線樣品之多次回歸測定的反應與濃度關係式計算分析物濃度。藥效動力學評估 藉由夾心ELISA測定胍溶解之組織勻漿中的實質Aβ濃度。用珠粒打漿機技術進行組織提取，其中在pH 8.0下在1 ml 5.5 M胍/50 mM Tris/0.5×蛋白酶抑制劑混合物中於含有1 ml矽化玻璃珠之2 ml深孔盤中提取冷凍組織(將密封盤震盪兩個時間間隔，各3分鐘)。藉由夾心ELISA分析所得組織溶解物的Aβ1-40 及Aβ1-42 ：用2% BSA/PBS-T 1:10稀釋珠粒打漿機樣品且經由樣品過濾盤(Millipore)過濾。進一步用0.55 M胍/5 mM Tris於2% BSA/PBST中稀釋樣品、空白、標準物、品質對照樣品，隨後裝載樣品盤。用樣品稀釋劑稀釋參考標準物。將塗佈有15 μg/ml捕捉抗體21F12 (抗Aβ42 )或2G3 (抗Aβ40 )之培養盤與樣品一起培育，且依序用以2% BSA/PBS-T稀釋之經生物素標記之3D6 (抗Aβ1-x )及用2% BSA/PBS-T 1:20 K稀釋之中性抗生物素蛋白-HRP(Pierce)實現偵測，且用TMB (Pierce)顯色。將Aβ含量自標準曲線內插且以每毫克組織濕重Aβ之奈克數計算最終組織濃度。組織學上測定海馬區及皮質中由沈積之Aβ佔據的面積百分比。將連續冠狀面(7至10 µm厚)與10 µg/ml經生物素標記之3D6 (抗Aβ1-x )或陰性對照鼠類IgG (經生物素標記)一起在低溫恆溫器中培育。採用特異於生物素之二次HRP試劑，且用DAB-Plus (DAKO)觀測沈積之Aβ。在海馬區或皮質內之相關規定區域中藉由分析用Image Pro plus軟體(Media Cybernetics)捕獲之影像定量免疫反應性Aβ沈積物。 此等研究可能展示抗N3pGlu-Aβ抗體(諸如hE8L、B12L、R17L、抗體I或抗體II)與BACE抑制劑(諸如N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽)之組合療法可導致相對於單獨的單一療法之改進的Aβ降低。 序列 ＜SEQ ID NO: 1；PRT1；人工＞ HCDR1 - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 2；PRT1；人工＞ HCDR2 - 抗體I及抗體II 抗體I及抗體II HCDR2 (SEQ ID NO: 2)＜SEQ ID NO: 3；PRT1；人工＞ HCDR3 - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 4；PRT1；人工＞ LCDR1 - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 5；PRT1；人工＞ LCDR2 - 抗體II＜SEQ ID NO: 6；PRT1；人工＞ LCDR2 - 抗體I＜SEQ ID NO: 7；PRT1；人工＞ LCDR3 - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 8；PRT1；人工＞ HCVR - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 9；PRT1；人工＞ LCVR - 抗體I＜SEQ ID NO: 10；PRT1；人工＞ LCVR - 抗體II＜SEQ ID NO: 11；PRT1；人工＞ 重鏈 - 抗體I及抗體II＜SEQ ID NO: 12；PRT1；人工＞ 輕鏈 - 抗體I＜SEQ ID NO: 13；PRT1；人工＞ 輕鏈 - 抗體II ＜SEQ ID NO: 14；DNA；人工＞ 用於表現SEQ ID NO: 11之抗體重鏈的例示性DNA ＜SEQ ID NO: 15；DNA；人工＞ 用於表現SEQ ID NO: 12之抗體輕鏈的例示性DNA＜SEQ ID NO: 16；DNA；人工＞ 用於表現SEQ ID NO: 13之抗體輕鏈的例示性DNA ＜SEQ ID NO: 17；PRT1；人工＞ (LCDR1- B12L/R17L/hE8L)＜SEQ ID NO: 18；PRT1；人工＞ (LCDR2 - B12L/R17L/hE8L)＜SEQ ID NO: 19；PRT1；人工＞ (LCDR3 - B12L/R17L/hE8L)＜SEQ ID NO: 20；PRT1；人工＞ (HCDR1 - B12L)＜SEQ ID NO: 21；PRT1；人工＞ (HCDR1 - R17L)＜SEQ ID NO: 22；PRT1；人工＞ (HCDR2 - B12L/R17L/hE8L)＜SEQ ID NO: 23；PRT1；人工＞ (HCDR3 - B12L)＜SEQ ID NO: 24；PRT1；人工＞ (HCDR3 - R17L)＜SEQ ID NO: 25；PRT1；人工＞ (LCVR - B12L/R17L)＜SEQ ID NO: 26；PRT1；人工＞ (HCVR - B12L)＜SEQ ID NO: 27；PRT1；人工＞ (HCVR - R17L)＜SEQ ID NO: 28；PRT1；人工＞ (LC - B12L/R17L)＜SEQ ID NO: 29；PRT1；人工＞ (HC - B12L)＜SEQ ID NO: 30；PRT1；人工＞ (HC - R17L)N3pGlu Aβ (SEQ ID NO: 31)＜SEQ ID NO 32；PRT1；人工＞ (LCVR-hE8L)＜SEQ ID NO 33；PRT1；人工＞ (LC-hE8L)＜SEQ ID NO 34；PRT1；人工＞ (HCVR-hE8L)＜SEQ ID NO 35；PRT1；人工＞ (HC-hE8L)＜SEQ ID NO: 36；PRT1；人工＞ (HCDR1-hE8L)＜SEQ ID NO: 37；PRT1；人工＞ (HCDR3-hE8L)＜SEQ ID NO: 38；PRT1；人工＞ (Aβ 1-42)

Claims (32)

  1. 一種下式化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製造治療阿茲海默氏症的藥物，該藥物係與有效量之抗N3pGlu Aβ抗體併用，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且該HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下組成之群：a)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：20，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：23；b)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：21，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：24；c)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：36，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：37；d)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：6，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3；及e)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：5，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3。
  2. 如請求項1之用途，其中該化合物為N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR及該HCVR係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：26之HCVR；b)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：27之HCVR；c)SEQ ID NO：32之LCVR及SEQ ID NO：34之HCVR；d)SEQ ID NO：9之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR；及e)SEQ ID NO：10之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC及該HC係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含兩個輕鏈(LC)及兩個重鏈(HC)，其中各LC及各HC選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該藥物用於與該抗N3pGlu Aβ抗體同時投與。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該藥物用於在投與該抗N3pGlu Aβ抗體之後投與。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC。
  9. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC。
  10. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC。
  11. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  12. 如請求項1或2之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  13. 一種抗N3pGlu Aβ抗體用於製造藥物之用途，該藥物用於與下式化合物或其醫藥學上可接受之鹽同時、分別或依序投藥以治療阿茲海默氏症：其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3且該HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其選自由以下各者組成之群：a)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：20，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：23；b)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：21，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：24；c)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：36，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：37；d)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：6，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3；及e)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：5，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3。
  14. 如請求項13之用途，其中該化合物為N-[3-[(4aS,5S,7aS)-2-胺基-5-(1,1-二氟乙基)-4,4a,5,7-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺，或其醫藥學上可接受之鹽。
  15. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR及該HCVR係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：26之HCVR；b)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：27之HCVR；c)SEQ ID NO：32之LCVR及SEQ ID NO：34之HCVR；d)SEQ ID NO：9之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR；及e)SEQ ID NO：10之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR。
  16. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC及該HC係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  17. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含兩個輕鏈(LC)及兩個重鏈(HC)，其中各LC及各HC係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  18. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC。
  19. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC。
  20. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC。
  21. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  22. 如請求項13或14之用途，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  23. 一種套組，其包含含有化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物，以及具抗N3pGlu Aβ抗體以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。
  24. 如請求項23之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其係選自由以下各者組成之群：a)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：20，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：23；b)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：21，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：24；c)LCDR1為SEQ ID.NO：17，LCDR2為SEQ ID.NO：18，LCDR3為SEQ ID.NO：19，HCDR1為SEQ ID.NO：36，HCDR2為SEQ ID.NO：22，且HCDR3為SEQ ID.NO：37；d)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：6，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3；及e)LCDR1為SEQ ID.NO：4，LCDR2為SEQ ID.NO：5，LCDR3為SEQ ID.NO：7，HCDR1為SEQ ID.NO：1，HCDR2為SEQ ID.NO：2，且HCDR3為SEQ ID.NO：3。
  25. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR及該HCVR選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：26之HCVR；b)SEQ ID NO：25之LCVR及SEQ ID NO：27之HCVR；c)SEQ ID NO：32之LCVR及SEQ ID NO：34之HCVR；d)SEQ ID NO：9之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR；及e)SEQ ID NO：10之LCVR及SEQ ID NO：8之HCVR。
  26. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC及該HC係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  27. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含兩個輕鏈(LC)及兩個重鏈(HC)，其中各LC及各HC係選自由以下各者組成之群：a)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC；b)SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC；c)SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC；d)SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC；及e)SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  28. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：29之HC。
  29. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：28之LC及SEQ ID NO：30之HC。
  30. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：33之LC及SEQ ID NO：35之HC。
  31. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：12之LC及SEQ ID NO：11之HC。
  32. 如請求項23或24之套組，其中該抗N3pGlu Aβ抗體包含SEQ ID NO：13之LC及SEQ ID NO：11之HC。
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