[go: up one dir, main page]

RS58311B1 - Humana antitela na gfr 3 i metode za njihovu upotrebu - Google Patents

Humana antitela na gfr 3 i metode za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS58311B1
RS58311B1 RS20190063A RSP20190063A RS58311B1 RS 58311 B1 RS58311 B1 RS 58311B1 RS 20190063 A RS20190063 A RS 20190063A RS P20190063 A RSP20190063 A RS P20190063A RS 58311 B1 RS58311 B1 RS 58311B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
gfrα3
pain
antigen
cancer
Prior art date
Application number
RS20190063A
Other languages
English (en)
Inventor
Susan D Croll
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49036666&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58311(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS58311B1 publication Critical patent/RS58311B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na humana antitela i fragmente koji vezuju antigen humanih antitela koji se specifično vezuju na humani iz glijalne linije ćelije izveden neurotrofični faktor (GDNF) familije receptora alfa 3 (GFRα3), i terapijske upotrebe tih antitela.
IZJAVA O OBLASTI PRONALASKA
[0002] Familija srodna sa neurotrofičnim faktorom izvedenim iz linije glijalne ćelije obuhvata neurotrofični faktor izveden iz linije glijalne ćelije (GDNF), neurturin (NRTN), artemin (ARTN) i persefin (PSPN). Svaki član GDNF familije se vezuje na receptor usidren na glikosilfosfatidilinozitol (GPI) povezan sa membranom plazme. Ova familija receptora se pominje kao alfa receptori od GDNF familije receptora (GFRαs). Ova familija receptora obuhvata četiri različita GFRα receptora, GFRα1-4. GDNF se vezuje preferencijalno na GFRα1, NRTN se vezuje preferencijalno na GFRα2, ARTN se vezuje preferencijalno na GFRα3, i PSPN se vezuje preferencijalno na GFRα4. Svaki od signala liganda iz GDNF familije sve do RET ("preraspoređeni tokom transfekcije") receptora tirozin kinaze, koji je prvo otkriven kao protoonkogen. RET se aktivira putem članova GDNF familije samo ako je taj ligand prvo vezan na njegov GFRα receptor (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394).
[0003] I ARTN i GFRα3 su visoko izraženi tokom razvoja i obuhvaćeni su u razvoj simpatetičkog nervnog sistema. Kod odraslih, GFRα3 ekspresija je uveliko ograničena na senzorne neurone bazalnih korena kičmenog stuba (DRG) (Orozco, O.E., et al., European J. Neuroscience, (2001), 13:2177-2182). Kod odraslog miša, artemin je izraženi u testisu, materici, tiroidnoj žlezdi, prostati, i epididimisu, kao i mirisnom bulbusu (glavici) i arteolama u crevima (tankim) i opornjaku (mezenterijumu) (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394; Airaksinen, M.S. et al., Brain, Behavior and Evolution, (2006), 68:181-190).
[0004] Moguća uloga za GFRα3 i artemin u hiperalgeziji se pokazala u nekoliko studija. Na primer, pokazalo se da je ubrizgavanje proteina artemina u zadnju šapu glodara prouzrokovalo toplotnu hiperalgeziju i ova nocicepcija je pospešena kada je artemin bio ubrizgan zajedno sa NGF (Malin, S.A., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8588-8599). Druge studije su pokazale da je ekspresija iRNK (mRNA) artemina pojačano regulisana na mišjem modelu upale (Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578-8587). Pored toga, i druge studije su pokazale da su artemin transgenski miševi imali pojačanu ekspresiju TRPV1 i TRPA1 i da imaju pospešenu bihejvioralnu osetljivost na toplotu i hladnoću (Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578-8587). Pored toga, moguća uloga za GFRα3 u visceralnoj prekomerna osetljivosti se pokazala i u studijama u GFRα3 laboratorijskh miševa, pri čemu su ovi miševi pokazali ublažavanje visceralne prekomerna osetljivosti posle terapije unutar kolona sa TNBS (2,4,6-trinitrobenzen sulfonska kiselina) u odnosu na divlji tip C57BL/6 miševa (Tanaka, T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418-G424). Moguća uloga za artemin i njegov receptor GFRα3 kod pankreatitisa povezanog sa bolom se takođe pokazala u studiji rađenoj sa pacijentima koji prolaze resekciju pankreasne glave (Ceyhan, G.O., et al., Gut, (2007), 56:534-544). Na osnovu prethodnog, dalje studije su garantovale da bi odrediti da li pacijenti koji imaju tegobe u vidu bola/hiperalgesije i/ili preokmerna osetljivosti mogli osetiti poboljšanje sa inhibitorom aktivnosti GFRα3.
[0005] Antitela koja vezuju GFRα3 su opisana u US 6,861,509. Pored toga, US 6,677,135 opisuje punu dužinu GFRα3 sekvence, pri čemu su varijante splajsovanja molekula GFRα3 opisane u US 7,026,138; US2007/0232535 i US2006/0216289. US 7,138,251 opisuje sekvence koje imaju 99% identičnost na GFRα3 pune dužine i dobijanje humanizovanih monoklonalnih antitela na ovom molekulu je opisano u ovom patentu. WO2006/138721 se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se selektivno vezuje na GFRα3 i inhibira formiranje Neublastin-GFRα3-Ret ternarni kompleks.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] Ovde su opisana potpuno humana monoklonalna antitela (mAbs) i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju na humani GFRα3 i inhibiraju ili blokiraju njegovu aktivnost, na primer, blokiraju vezivanje GFRα3 na neuotrofični faktor izveden iz linije glijalne ćelije, artemin, i moguće blokiranje naknadne aktivacije RET receptora tirozin kinaze i/ili blokiranje signaliziranja sve do RET i/ili blokiranje signaliziranja sve do posrednika koji nije RET. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni za lečenje hiperalgezije, alodinije i/ili prekomerne osetljivosti, na bilo koji senzorni stimulans, uključujući, ali ne i ograničeno na pritisak, toplotu i/ili hladnoću. Antitela je takođe moguće koristiti za lečenje bola/hiperosetljvosti povezane sa širokim opsegom stanja i poremećaja kod kojih je poželjno blokiranje interakcije GFRα3 sa arteminom. Ta antitela mogu takođe da se koriste za lečenje rasta ćelije tumora, proliferaciju i/ili metastazu.
[0007] U prvom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3, pri čemu to antitelo obuhvata tri teška lanca CDR (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i tri laka lanca CDR (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) obuhvaćena u HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 i 397/405.
[0008] Kod jednog izvođenja, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 i 397/405.
[0009] Kod jednog izvođenja, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 50/58, 146/154, 210/218 i 290/298.
[0010] Kod jednog izvođenja, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje na humani GFRα3 ima jednu ili više od sledećih karakteristika:
(i) ispoljava KDu opsegu od oko 10<-8>M do oko 10<-13>M mereno rezonancom površinskog plazmona;
(ii) pokazuje sposobnost da blokira oko 50-100% vezivanja GFRα3 na svoj ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 40 pM do oko 15 nM;
(iii) pokazuje sposobnost da blokira oko 20% do oko 100% vezivanja GFRα3 na čvrstu podlogu obloženu mešavinom artemina i RET;
(iv) blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju RET sa IC50u opsegu od oko 200 pM do oko 50 nM;
(v) inhibira ili smanjuje jedan ili više nociceptivnih odgovora na in vivo modelu bola kancera kosti;
(vi) inhibira ili smanjuje arteminom senzitiziranu toplotnu hiperalgeziju in vivo; ili
(vii) inhibira ili smanjuje alodiniju na in vivo modelu osteoartritisa; ne reaguje unakrsno sa drugim GFR koreceptorima za RET(viii)
[0011] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonalno antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska; pri čemu:
(a) se to antitelo bira iz grupe koja obuhvata himerno antitelo, humanizovano antitelo i humano antitelo, i/ili;
(b) to antitelo ne reaguje između vrsta sa humanim GFRα1 ili humanim GFRα2, i/ili;
(c) antitelo je humano monoklonalno antitelo koje obuhvata (a) promenljivi region teškog lanca (HCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18,
34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338,
354, 381 i 397 i (b) promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405.
[0012] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonalno antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska, pri čemu:
(a) to antitelo pokazuje sposobnost da blokira oko 50-95% vezivanja humanog GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa IC50vrednošću u opsegu od oko 40 pM do oko 750 pM;
(b) to antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira oko 75-100% vezivanja humanog GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 400 pM do oko 15 nM; (c) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju RET sa IC50u opsegu od oko 300 pM do oko 5 nM; ili
(d) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju makaki RET sa IC50u opsegu od oko 0,7 nM do oko 2.5 nM.
[0013] U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovan nukleinski molekul koji kodira antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska.
[0014] U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor ekspresije koji obuhvata molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.
[0015] U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje anti-GFRα3 antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata korake uvođenja vektora ekspresije iz ovog pronalaska u izolovanu ćeliju domaćina, uzgajanje ćelije pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta, i oporavljanje tako proizvedenog antitela.
[0016] U drugom varijantom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
[0017] U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska i drugi terapijski agens izabran iz grupe koja obuhvata opioid, COX-2 inhibitor, lokalni anestetik, NMDA modulator, agonist receptora kanabinoida, P2X familiju modulatora, VR1 antagonist, supstancu P antagonista, drugi GFRα3 antagonist, citokin ili citokin ili antagonist receptora citokina, inhibitor faktora rasta nerva (NGF) inhibitor (inhibitor malog molekula ili anti-NGF antitelo), inhibitor BDNF, TrkA, TrkB ili p75, aspirin, NSAID, steroid, morfin, selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI), inhibitore ponovne apsorpcije norepinefrina u serotoninu (SNRI), triciklik, inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma (Nav), inhibitor kanala kalcijuma, inhibitor kanala kalijuma, faktor nekroze tumora (TNF) ili TNF inhibitor receptora, inhibitor TWEAK (TNF-srodan WEAK induktor apoptoze), RET inhibitor, inhibitor GDNF familije liganda, inhibitor GFRα1, GFRα2 ili GFRα4, inhibitor kanala jona koji registruje kiselinu (ASIC1 ili ASIC3), anti-konvulzant (gabapentin ili pregabalin), inhibitor receptora prekineticina (PROK1 i PROK2), inhibitor kaspaze, inhibitor p38, inhibitor IKK1/2, CTLA-4Ig i kortikosteroid; i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač; opciono pri čemu drugi GFRα3 antagonist je mali organski molekul, antagonist polipeptida, drugo antitelo specifično za GFRα3, siRNK ili antisens molekul specifičan za GFRα3; ili pri čemu citokin ili antagonist receptora citokina je antagonist interleukina-1 (IL-1), antagonist IL-6, ili IL-18 antagonist.
[0018] Kod drugog varijantnog rešenja, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska, za upotrebu za lečenje GFRα3-srodnog stanja ili bolesti, ili bol povezan sa GFRα3-srodno stanje ili bolest, pri čemu GFRα3-srodnim stanjem ili bolešću je sprečeno, poboljšano, ili smanjeno u ozbiljnosti ili učestalosti pojave, ilije pojava bola povezanog sa stanjem ili bolešću je sprečene, poboljšane, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalosti; pri čemu je sa GFRα3-srodno stanje ili bolest izabrano iz grupe koja obuhvata akutni bol, hronični bol, neuropatski bol, inflamatorni bol, sindrom funkcionalnog bola, artritis, pankreatitis, osteoartritis, bol zgloba, klaster glavobolje, trigeminalna neuralgija, herpesna neuralgija, generalne neuralgije, neurodegenerativne poremećaje, poremećaji kretanja, neuroendokrini poremećaji, ataksija, visceralni bol, giht, postherpesna neuralgija, dijabetesna neuropatija, išijas, bol u leđima, bol u glavi ili vratu, težak ili nepopustljiv bol, probadajući bol, postoperativni bol, naslednu eritromelalgiju, stomatološki bol, rinitis, kancerni bol, sindrom složenog regionalnog (CRPS) bola, bolest creva sa upalom (npr. Kronova bolest ili ulcerativni kolitis) i poremećaje bešike.
[0019] U jednom izvođenju, sindrom funkcionalnog bola je izabran iz grupe koja obuhvata hronični bol u donjem delu leđa, sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgiju (FM), sindrom hroničnog umora, bol u predelu abdomena, poremećaj zgloba vilične kosti, (TMJD), sindrom bolne bešike (cistitis creva), funkcionalni gastrointestinalni poremećaji/sindromi, sindrom funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavobolje tenzionog tipa, sindrom hroničnog karličnog bola, sindrom bolne prostate (hronični prostatisi), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata; ili kancerni bol povezan sa kancerom izabranim iz grupe koja obuhvata kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika, kancer bubrega, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mozga, leukemiju, limfom, kancer kosti i bol povezan sa metastazom kancera.
[0020] U jednom izvođenju, antitelo, fragment koji vezuje antigen ili farmaceutska supstanca za upotrebu za lečenje stanja ili bolesti povezane sa GFRα3, ili bol povezan sa stanjem ili bolešću srodnim sa GFRα3, je za isporuku pacijentu u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom; pri čemu je pomenuti terapijski agens opciono izabran iz grupe koja obuhvata opioid, COX-2 inhibitor, lokalni anestetik, NMDA modulator, agonist kanabinoidnog receptora, modulator P2X familije, VR1 antagonist, antagonist P supstance, drugi second GFRα3 antagonist, antagonist citokina ili receptora citokina, inhibitor faktora rasta nerva (NGF) (inhibitor malog molekula ili anti-NGF antitelo), inhibitor BDNF, TrkA, TrkB ili p75, aspirin, NSAID, steroid, morfin, selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI), inhibitor ponovne apsorpcije norepinefrina serotonina (SNRI), triciklik, inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma (Nav), inhibitor kanala kalcijuma, inhibitor kanala kalijuma, inhibitor faktora nekroze tumora (TNF) ili inhibitor receptora fakora nekroze tumora (TNF), inhibitor TWEAK (sa TNF povezanog WEAK induktora apoptoze), RET inhibitor, inhibitor liganda GDNF familije, inhibitor GFRα1, GFRα2 ili GFRα4, inhibitor kanala jona koji registruje kiselinu (ASIC1 ili ASIC3), antikonvulsant (gabapentin ili pregabalin), inhibitor receptora prekineticina (PROK1 i PROK2), inhibitor kaspaze, inhibitor p38, inhibitor IKK1/2, CTLA-4Ig i kortikosteroid; i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača;
opciono pri čemu je drugi GFRα3 antagonist mali organski molekul, antagonist polipeptida, drugo antitelo specifično za GFRα3, siRNK ili antisens molekul specifičan za GFRα3; ili pri čemu citokin ili antagonist receptora citokina jeste interleukin-1 antagonist (IL-1), antagonist IL-6 , ili IL-18 antagonist.
[0021] U jednom izvođenju, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se bira iz grupe koja obuhvata mišje, himerno, humanizovano i humano antitelo.
[0022] U jednom izvođenju, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ne reaguje između vrsta unakrsno sa humanim GFRα1 ili humanim GFRα2.
[0023] Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisano ovde može obuhvatiti (a) promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397 i (b) promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405.
[0024] U jednom izvođenju, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pokazuje sposobnost da blokira oko 50-95% vezivanja humanog GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa IC50vrednošću u opsegu od oko 40 pM do oko 750 pM.
[0025] Kod jednog izvođenja, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira oko 75-100% vezivanja humanog GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 400 pM do oko 15 nM.
[0026] Kod jednog izvođenja, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od aremina zavisnu aktivaciju humanog RET sa IC50u opsegu od oko 300 pM do oko 5 nM.
[0027] Kod jednog izvođenja, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju makaki RET sa IC50u opsegu od oko 0,7 nM do oko 2,5 nM.
[0028] Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisan ovde može obuhvatiti tri regiona za određivanje komplementarnsosti (CDR) teškog lanca CDRs (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) obuhvaćena unutar HCVR sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397; i tri regiona za određivanje komplementarnosti CDR lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) obuhvaćena u LCVR sekvenci amino kiseline izabranoj iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405.
[0029] Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisan ovde može obuhvatiti promenljivi region teškog lanca (HCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397.
[0030] Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisan ovde može obuhvatiti promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405.
[0031] U jednom izvođenju, to izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 i 397/405.
[0032] U jednom izvođenju, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 50/58, 146/154, 210/218 i 290/298.
[0033] Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisan ovde može obuhvatiti:
(a) HCDR1 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276,
292, 308, 324, 340, 356, 383 i 399;
(b) HCDR2 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278,
294, 310, 326, 342, 358, 385 i 401;
(c) HCDR3 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280,
296, 312, 328, 344, 360, 387 i 403;
(d) LCDR1 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284,
300, 316, 332, 348, 364, 391 i 407;
(e) LCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID
BR: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302,
318, 334, 350, 366, 393 i 409; i
(f) LCDR3 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID
BR: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304,
320, 336, 352, 368, 395 i 411.
[0034] Kod jednog izvođenja, to izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se takmiči za specifično vezivanje na humani GFRα3 sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen obuhvata parove sekvence teškog i lakog lanca izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 i 354/362, 381/389 i 397/405.
[0035] Kod jednog izvođenja, izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje isti epitop na humani GFRα3 koji prepoznaje antitelo koje obuhvata parove sekvence teškog i lakog lanca izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 i 354/362, 381/389 i 397/405.
[0036] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu obuhvatii samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab’)2 ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana da bi uticala na funkcionalnost, npr., da se eliminišu rezidualne funkcije efektora (Reddy et al., 2000, J. Immunol.164:1925-1933).
[0037] Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3 opisan ovde može obuhvatiti HCVR koji obuhvata tri teška lanca CDR (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) obuhvaćena unutar HCVR sekvenci amino kiseline izabranih iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397; i/ili LCVR obuhvata tri laka lanca CDR (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) obuhvaćena unutar LCVR sekvenci amino kiseline izabranih iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405. Metode i tehnike za identifikovanje CDR unutar HCVR i LCVR sekvenci amino kiseline su dobro poznate u ovoj oblasti moguće ih je koristiti da bi se identifikovali CDR unutar navedenih HCVR i/ili LCVR sekvenci amino kiseline opisanih ovde. Primeri konvencija koje je moguće koristiti da se odrede granice CDR obuhvataju, npr., Kabat definicija, Chothia definicija, i AbM definicija. U opštem smislu, Kabat definicija se bazira na promenljivosti sekvence, Chothia definicija je bazirana na lokaciji regiona strukturne petlje, i AbM definicija je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javno dostupne baze podataka su takođe na raspolaganju za identifikovanje CDR sekvenci unutar nekog antitela.
[0038] Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3 opisan ovde može obuhvatiti:
(a) HCDR3 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280,
296, 312, 328, 344, 360, 387 i 403; i
(b) LCDR3 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID
BR: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304,
320, 336, 352, 368, 395 i 411.
[0039] Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3, kako je opisano pod (a) i (b) iznad, može još da obuhvati:
(c) HCDR1 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276,
292, 308, 324, 340, 356, 383 i 399;
(d) HCDR2 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK
ID BR: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278,
294, 310, 326, 342, 358, 385 i 401;
(e) LCDR1 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID
BR: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300,
316, 332, 348, 364, 391 i 407; i
(f) LCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID
BR: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302,
318, 334, 350, 366, 393 i 409.
[0040] Ovde je još opisano i potpuno humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3, pri čemu to antitelo ili njegov fragment ispoljava jednu ili više od sledećih karakteristika: (i) obuhvata HCVR sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397; (ii) obuhvata LCVR sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405; (iii) obuhvata HCDR3 domen koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 i 403, ili pretežno njima sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i LCDR3 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 i 411 ili njima pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; (iv) obuhvata HCDR1 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 i 399 ili pretežno njima sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; HCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 i 401 ili njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; LCDR1 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 i 407 ili njima pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i LCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 i 409 ili njima pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; (v) ispoljava KDu opsegu od oko 10<-8>M do oko 10<-13>M mereno rezonancom površinskog plazmona; (vi) pokazuje sposobnost da blokira oko 50-100% vezivanja GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 40 pM do oko 15 nM; (vii) pokazuje sposobnost da blokira oko 20% do oko 100% vezivanja GFRα3 na čvrstu podlogu obloženu mešavinom artemina i RET; (viii) blokira ili suzbija od aretmina zavisnu aktivaciju RET sa IC50u opsegu od oko 200 pM do oko 50 nM; (ix) inhibira ili smanjuje jedan ili više nociceptivnih odgovora u in vivo modelu bola kancera kosti; (x) inhibira ili smanjuje arteminom senzitiziranu toplotnu hiperalgeziju in vivo; (xi) inhibira ili smanjuje alodiniju na in vivo modelu osteoartritisa; (xii) ne reaguje između vrsta unakrsno sa drugim GFR koreceptroima za RET.
[0041] Ovde je opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen antitela koje obuhvata HCDR3 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz bilo koje prikazane u Tabeli 1, ili njene pretežno slične sekvence sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i LCDR3 domen sa sekvencom amino kiseline izabranom iz bilo koje od prikazanih u Tabeli 1, ili njene pretežno slične sekvence sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence.
[0042] Ovde je opisano antitelo ili njegov fragment koje još obuhvata HCDR1 domen sa sekvencom amino kiseline od onih prikaznaih u Tabeli 1, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; HCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline iz bilo koje od onih prikazanih u Tabeli 1, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; LCDR1 domen sa sekvencom amino kiseline od bilo koje iz Tabele 1, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i LCDR2 domen sa sekvencom amino kiseline od bilo koje od onih prikazanih u Tabeli 1, ili njoj pretežno sličnoj sekveci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence.
[0043] Kod izvesnih izvođenja, antitelo ili deo koji vezuje antigen antitela koje se specifično vezuje na humani GFRα3 obuhvata HCDR3/LCDR3 par sekvence amino kiseline izabran iz bilo koje od HCDR3/LCDR3 sekvenci amino kiseline prikazanih u Tabeli 1. Prema izvesnim izvođenjima, antitelo ili deo koji vezuje antigen nekog antitela obuhvata HCDR3/LCDR3 par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 387/395 i 403/411.
[0044] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 4, 6 i 8, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 12, 14 i 16, prema opisanom redosledu.
[0045] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 20, 22 i 24, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 28, 30 i 32, prema opisanom redosledu.
[0046] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 36, 38 i 40, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 44, 46 i 48, prema opisanom redosledu.
[0047] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 52, 54 i 56, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 60, 62 i 64, prema opisanom redosledu.
[0048] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 68, 70 i 72, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 76, 78 i 80, prema opisanom redosledu.
[0049] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 84, 86 i 88, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 92, 94 i 96, prema opisanom redosledu.
[0050] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov frament koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 100, 102 i 104, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 108, 110 i 112, prema opisanom redosledu.
[0051] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 116, 118 i 120, prema opisanom redosledu i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 124, 126 i 128, prema opisanom redosledu.
[0052] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 132, 134 i 136, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 140, 142 i 144, prema opisanom redosledu.
[0053] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 148, 150 i 152, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 156, 158 i 160, prema opisanom redosledu.
[0054] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 164, 166 i 168, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 172, 174 i 176, prema opisanom redosledu.
[0055] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 180, 182 i 184, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 188, 190 i 192, prema opisanom redosledu.
[0056] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 196, 198 i 200, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 204, 206 i 208, prema opisanom redosledu.
[0057] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 212, 214 i 216, prema opisanom redosledu i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 220, 222 i 224, prema opisanom redosledu.
[0058] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 228, 230 i 232, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 236, 238 i 240, prema opisanom redosledu.
[0059] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 244, 246 i 248, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 252, 254 i 256, prema opisanom redosledu.
[0060] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 260, 262 i 264, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 268, 270 i 272, prema opisanom redosledu.
[0061] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 276, 278 i 280, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 284, 286 i 288, prema opisanom redosledu.
[0062] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 292, 294 i 296, prema opisanom redosledu i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 300, 302 i 304, prema opisanom redosledu.
[0063] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 308, 310 i 312, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 316, 318 i 320, prema opisanom redosledu.
[0064] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 324, 326 i 328, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 332, 334 i 336, prema opisanom redosledu.
[0065] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 340, 342 i 344, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 348, 350 i 352, prema opisanom redosledu.
[0066] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 356, 358 i 360, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 364, 366 i 368, prema opisanom redosledu.
[0067] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 383, 385 i 387, prema opisanom redosledu i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 391, 393 i 395, prema opisanom redosledu.
[0068] Kod jednog izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 399, 401 i 403, prema opisanom redosledu LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz SEK ID BR: 407, 409 i 411, prema opisanom redosledu.
[0069] Izvesna neograničavajuća antitela i fragmenti koji vezuju antigen uzeti kao primer opisani ovde obuhvataju HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 domene, prema opisanom redosledu, izabrane iz bilo kojih sekvenici amino kiseline prikazanih u Tabeli 1.
[0070] U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-GFRα3 antitela ili njihove fragmente iz ovog pronalaska. Rekombinantni vektori ekspresije koji nose nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, i ćelije domaćina u koje su takvi vektori uvedeni, su takođe obuhvaćeni ovim pronalaskom, kao što su i postupci za proizvodnju antiela kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela, i oporavljanje proizvedenih antitela.
[0071] U jednom izvođenju, ovaj opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji obuhvata HCVR koji je kodiran pomoću sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 380 i 396 ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna. U jednom izvođenju, taj HCVR je kodiran sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 49, 145, 209 i 289.
[0072] U jednom izvođenju, to antitelo ili njegov fragment još obuhvata LCVR kodiran nekom sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 388 i 404 ili pretežno identičnu sekvencu koja joj je barem 90%, barem 95%, barem 98%, ili barem 99% homologna. U jednom izvođenju, taj LCVR je kodiran sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 57, 153, 217 i 297.
[0073] Ovde je takođe opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela koje obuhvata HCDR3 domen kodiran sekvencom nukleotida smeštenom unutar promenljivih regiona iz bilo kog od antitela prikazanih u Tabeli 1, ili pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence; i LCDR3 domen kodiran sekvencom nukleotida izabranom iz bilo kog od prikazanih u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnošću sekvence.
[0074] Ovde je takođe opisano antitelo ili fragment njegov koji još obuhvata HCDR1 domen kodiran bilo kojom od sekvenci nukleotida prikazanih u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnom sekvencom sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; HCDR2 domen kodiran bilo kojoom od sekvenci nukleotida prikazanih u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnom sekvencom sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; LCDR1 domen kodiran bilo kojom od sekvenci nukleotida prikazanih u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnoj sekvenci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i LCDR2 domen kodiran sekvencom nukleotida prikazanom u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnoj sekvenci sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence.
[0075] Ovde je još opisano humano anti-hGFRα3 antitelo ili fragment koji vezuje antigen antitela koje obuhvata HCVR kodiran segmentima sekvence nukleotida izvedenim iz VH, DH i JH sekvenci klicine linije, i LCVR kodiran segmentima sekvence nukleotida izvedenim iz VK i JK sekvenci klicine linije, sa kombinacijama kako je prikazano u Tabeli 2.
[0076] Ovaj pronalazak obuhvata anti-hGFRα3 antitela sa modifikovanim obrascem glikosilacije. U nekim primenama, modifikacija da se uklone neželjena mesta glikosilacije mogu biti korisna, ili npr., uklanjanje dela fukoze da bi se povećala funkcija od antitela zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Kod još nekih drugih primena, modifikaciju galaktosilacije moguće je izvesti da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0077] U jednom drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak karakteriše farmaceutska supstanca koja obuhvata rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment iz ovog pronalaska, koji specifično vezuje hGFRα3 i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom izvođenju, taj pronalazak odlikuje supstanca, koja je kombinacija antitela ili fragmenta koji vezuje antigen iz nekog antitela iz ovog pronalaska, i drugi terapijski agens. Drugi terapijski agens može da bude bilo koji agens koji je pogodno kombinovan sa antitelom ili njegovim fragmentom iz ovog pronalaska, na primer, agens koji može da smanji bol, kao što je, ali bez ograničenja na, opioide, morfin, COX-2 inhibitor, aspirin, ili druge nesteroidne lekove protiv upala, acetaminofen, duloksetin, lokalne anestetike, NMDA modulatore, agoniste kanabinoidnog receptora, modulatore P2X familije, VR1 antagoniste, i antagoniste supstance P. Drugi terapijski agens može da bude interleukin-1 (IL-1) inhibitor, na primer, protein fuzije (US 6,927,044); ili antiepileptik/antikonvulsant lek, kao što je gabapentin, pregabalin, topiramat; ili triciklični antidepresiv, kao što je amitriptilin, inhibitor citokina ili antagonist, kao što je antagonist na IL-6, IL-6R, IL-18 ili IL-18R, ili inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma kao što je Nav1.7 inhibitor, ili Nav1.8 inhibitor, ili Nav1.9 inhibitor; inhibitor kanala kalijuma ili kanala kalcijuma; ili NGF inhibitor (inhibitor malog molekula ili anti-NGF antitelo), ili drugi inhibitor ili antagonist na GFRα3, inhibitor receptora faktora nekroze tumora (TNF) ili inhibitor TNF receptora, nhibitor TWEAK (sa TNF srodan WEAK induktor apoptoze), RET inhibitor, inhibitor GDNF familije ligand, inhibitor GFRα1, GFRα2 ili GFRα4, inhibitor kanala jona koji registruje kiselinu (npr. ASIC1 ili ASIC3), ili selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI), ili inhibitor ponovne apsorpcije norepinefrina serotonina (SNRI), ili inhibitor receptora prekineticina (npr. PROK1 i PROK2), ili inhibitor kaspaze, p38 inhibitor, IKK1/2 inhibitor, CTLA-4Ig, ili kortikosteroid. Drugi terapijski agens može biti lek od malog molekula ili inhibitor proteina/polipeptida. Drugi terapijski agens može biti sintetički ili prirodno izveden. Drugi terapijski agens može biti drugo antitelo specifično za GFRα3, antagonist polipeptida, siRNK ili antisens molekul specifičan za GFRα3. Takođe je jasno da antitela i farmaceutski prihvatljive supstance iz ovog pronalaska mogu biti korišćene u kombinovanim terapijama, to jest, antitela i farmaceutski prihvatljive supstance mogu biti isporučene istovremeno sa, pre, ili posle, jednog ili više drugih željenih lekova ili medicinskih postupaka. Specifična kombinacija terapija (lekova ili postupaka) za upotrebu u kombinovanom režimu će uzeti kompatibilnost željenih lekova i/ili postupaka i željeno terapijsko dejstvo koje treba postići. Takođe će se razumeti da korišćene terapije mogu postići željeno dejstvo za isti poremećaj (na primer, antitelo može biti isporučeno istovremeno sa drugim agensom korišćenim za lečenje istog poremećaja), ili može postići drugačija dejstva (npr., kontrolisati bilo koja neželjena dejstva). Kako se ovde koristi, dodatni terapijski agensi koji se normalno isporučuju za lečenje ili sprečavanje specifične bolesti, ili stanja, su odgovarajući za tu bolest ili stanje, koje se leči.
[0078] Ovde su još opisane metode za suzbijanje aktIvnosti hGFRα3 upotrebom antitela antihGFRα3 ili dela koji vezuje antigen od nekog antitela iz ovog pronalaska, pri čemu te metode obuhvataju isporuku terapijski delotvorne količine jednog ili više antitela iz ovog pronalaska, ili njegovih fragmenata koji vezuju antigen, ili farmaceutske supstance koja obuhvata jedno ili više antitela iz ovog pronalaska ili njegovih fragmenata koji vezuju antigen.
[0079] Metod za lečenje stanja ili bolesti povezanih sa GFRα3, ili bola povezanog sa stanjem ili bolešću povezanim sa GFRα3 je takođe opisan ovde, taj metod obuhvata isporuku anti-GFRα3 antitela ili dela koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska, ili supstance koja obuhvata antitelo anti-GFRα3 ili njegov fragment, pacijentu kom je potrebno, pri čemu sa GFRα3 srodno stanje ili bolest se sprečava, poboljšava, ili mu se smanjuje ozbiljnost ili učestalost pojave, ili bol povezan sa stanjem ili bolešću je sprečen, poboljšan, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalošću pojave.
[0080] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo iz ovog pronalaska ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata barem jedno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje stanja ili bolesti povezane sa GFRα3, ili bola povezanog sa stanjem ili bolešću srodnim sa GFRα3, pri čemu se sprečava to stanje ili bolest srodno sa GFRα3, poboljšava, ili smanjuje ozbiljnost ili učestalost pojave, ili se bol povezan sa stanjem ili bolešću sprečava, poboljšava, ili smanjuje u ozbiljnosti ili učestalosti pojave.
[0081] Upotreba izolovanog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen iz ovog pronalaska, ili farmaceutske supstance koja obuhvata barem jedno antitelo iz ovog pronalaska za proizvodnju leka za lečenje stanja ili bolesti srodne sa GFRα3, ili bola povezanog sa stanjem ili bolešću povezanim sa GFRα3, je opisana ovde, pri čemu je stanje ili bolest srodno sa GFRα3, poboljšano, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalosti pojave, ili je bol povezan sa stanjem ili bolešću sprečen, poboljšan, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalosti pojave.
[0082] U jednom izvođenju, stanje ili bolest povezano sa GFRα3 se bira iz grupe koja obuhvata akutni bol, hronični bol, neuropatski bol, bol usled upala, sindrom funkcionalnog bola, artritis, pankreatitis, osteoartritis, klaster glavobolje, trigeminalnu neuralgiju, herpesnu neuralgiju, opšte neuralgije, neurodegenerativne poremećaje, poremećaje kretanja, poremećaje neuroendokrinog sistema, ataksiju, visceralni bol, giht, postherpesna neuralgija, dijabetesna neuropatija, išijas, bol u leđima, bol u glavi ili vratu, ozbiljni ili neobuzdani bol, probadajući bol, postoperativni bol, nasledna eritromelalgija, stomatološki bol, rinitis, kancerni bol, sindrom složenog regionalnog bola (CRPS), bol upale creva,(npr. Kronova bolest ili ulcerativni kolitis) i poremećaji bešike.
[0083] U jednom izvođenju, sindrom funkcionalnog bola je izabran iz grupe koja obuhvata hronični bol u donjem delu leđa, sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgija (FM), sindorm hroničnog umora, bol u predelu stomaka, poremeća viličnog zgloba (TMJD), sindrom bolne bešike (intersticijalni cistitis), funkcionalni gastrointestinalni poremećaji/sindromi, sindrom funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavovolje tenzionog tipa, sindrom hroničnog bola u karlici, sindrom bolne prostate (hronični prostatitis), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata.
[0084] U jednom izvođenju, kancerni bol se povezuje sa kancerom izabranim iz grupe koja obuhvata kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika, kancer bubrega, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mozga, leukemiju, limfom, kancer kosti i bol povezan sa metastazom kancera.
[0085] U jednom izvođenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen se isporučuje pacijentu u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom.
[0086] U jednom izvođenju, drugi terapijski agens se bira iz grupe koja obuhvata opioid, COX- 2 inhibitor, lokalni anestetik, NMDA modulator, agonist kanabinoidnog receptora, modulator P2X familije, VR1 antagonist, antagonist supstance P, drugi GFRα3 antagonist, antagonist citokina ili receptora citokina, inhibitor faktora rasta nerva (NGF) (inhibitor malog molekula ili anti-NGF antitelo), aspirin, NSAID, steroid, morfin, selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI), ili inhibitor ponovne apsorpcije norepinefrina serotonina (SNRI), triciklik, inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma (Nav), inhibitor kanala kalcijuma, inhibitor kanala kalijuma, inhibitor faktora nekroze tumora (TNF) ili inhibitor receptora TNF, inhibitor TWEAK (sa TNF srodnog WEAK induktora apoptoze), RET inhibitor, inhibitor liganda GDNF familije, inhibitor kanala jona koji registruje kiselinu (ASIC1 ili ASIC3), antikonvulsant (gabapentin ili pregabalin), inhibitor receptora prekineticina (PROK1 i PROK2), inhibitor kaspaze, inhibitor p38, IKK1/2 inhibitor, CTLA-4Ig i kortikosteroid.
[0087] U jednom izvođenju, drugi GFRα3 antagonist je mali organski molekul, drugo antitelo specifično za GFRα3, antagonist polipeptida, siRNK ili antisens molekul specifičan za GFRα3.
[0088] U jednom izvođenju, antagonist citokina ili receptora citokina je interleukin-1 (IL-1) antagonist, IL-6 antagonist, ili IL-18 antagonist.
[0089] Lečeni pormećaj je bilo koja bolest ili stanje, koje je poboljšano, obrađeno, suzbijeno ili sprečeno uklanjanjem, inhibicijom ili smanjenjem hGFRα3 aktivnosti. Specifične populacije koje je moguće lečiti terapijskim metodama opisanim ovde obuhvataju bolest, poremećaj, ili stanje izabrano iz akutnog, hroničnog, ishemijskog, neuropatskog ili upalnog bola, prekomerna osetljivost, kao što je visceralna, toplotna, ili mehanička prekomerna osetjivost, hronični pankreatitis, artritis, migrena, klaster glavobolje, trigeminalna neuralgija, herpesna neuralgija, opšte neuralgije, epilepsija ili epileptička stanja, miotonija (mišićni grč), aritmija, poremećaji pokreta, neuroendokrini poremećaji, ataksija, inflamatorna bolest creva, upala slezine, bol u želucu, trigonitis, fibroidi, peritonitis, analna inkontinencija, inkontinencija, rektalna prekomerna hiperosetljivost, visceralni bol, osteoartritični bol, post-herpesna neuralgija, dijabetesna neuropatija, radikularni bol, išijas, bol u leđima, bol u glavi ili vratu, probadajući bol, posthirurški bol, kancerni bol, ili hemoterapijom indukovan bol. Druga stanja koja je moguće lečiti ovde opisanim terapijskim metodama obuhvataju Hiršsprungovu bolest, naslednu eritromelalgiju, poremećaje bešike, rinitis, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materiice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika, kancer bubrega, hematološki (krvlju nošen) kancer, kao što je leukemija ili limfom, kancer kosti, ili bol povezan sa metastazom kancera, na primer, bol povezan sa metastazom kancera na toj kosti. Antitela iz ovog pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen moguće je takođe koristiti za lečenje sledećih stanja: nemalignog akutnog, hroničnog, ili frakturnog bola kosti, reumatoidni artritis, stenozu kičme; neuropatski bol u donjem delu leđa; sindrom miofascijalnog bola; pankreasni; hronična glavobolja; tenziona glavobolja; dijabetesna neuropatija; sa HIV povezana neuropatija; Šarko-Mari-Tutova (Charcot-Marie-Tooth) neuropatija; nasledne senzorne neuropatije; povredu perifernog nerva; bolnu neuromasu; vanmaterične proksimalne i distalne iscetke; radikulopatija; hemoterapijom indukovan neuropatski bol; radioterapijom indukovan neuropatski bol; radioterapijom indukovan neuropatski bol; postmastektomijski bol; centralni bol; bol usled povrede kičmenog stuba; bol posle moždanog udara; talamusni bol; sindrom složenog regionalnog bola (CRPS, takođe je poznat kao refleksna simpatetička distrofija); fantomski bol; neobuzdani bol; akutni mukoskeletni bol; bol zglobova; akutni giht bol; mehanički bol u donjem delu leđa; bol u vratu; tendonitis; bol povreda/bol pri vežbanju; bol u predelu stomaka; pielonefritis; apendicitis; holecistitis; opstrukcija creva; hermije; itd; bol u grudima, uključujući, kardio bol; bol karlice, bol bubrežnog kolika, akutni opstetrički bol, uključujući, bol usled porođaja; bol usled carskog reza; bol usled opekotine i traume, endometrioza; herpes zoster bol; anemija srpaste ćelije; akutni pankreatitis; probadajući bol; orofacijalni bol uključujući sinusitisni bol, stomatološki bol; bol usled multipla skleroze; bol usled lepre; bol usled Behčetove bolesti; adipozna doloroza; flebitni bol; Gilen-Barov bol (Guillain-Barre); bolne noge, i pomeranje prstiju na stopalima; Haglundov sindrom; bol Fabrijeve bolest, boest bešike i urogenitalnog trakta; i bešika usled hiperaktivnosti. U jednom izvođenju antitela iz ovog pronalaska moguće je koristiti za lečenje sindroma funkcionalnog bola, pri čemu je taj sindrom funkcionalnog bola izabran iz grupe koja obuhvata bolesti kao što je hronični bol u donjem delu leđa, i sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgija (FM), sindorm hroničnog umora, bol u predelu stomaka, poremeća viličnog zgloba (TMJD), sindrom bolne bešike (intersticijalni cistitis), funkcionalni gastrointestinalni poremećaji/sindromi, sindrom funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavovolje tenzionog tipa, sindrom hroničnog bola u karlici, sindrom bolne prostate (hronični prostatis), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata.
[0090] Antitela iz ovog pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen moguće je koristiti i da se suzbije rast/proliferacija ćelije tumora ili metastaza ćelija tumora. Kod izvesnih izvođenja, antiela iz ovog pronalaska ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, moguće je koristiti za lečenje kancera, ili "bola povezanog sa kancerom" ili "bola koji je pridružen kanceru", uključujući, na primer, ali ne i ograničeno na, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika kancer bubrega, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mozga, hematološki (krvlju nošen) kancer, kao što je leukemija ili limfom, kancer kosti, ili bol povezan sa metastazom kancera, na primer, bol povezan sa metastazom kancera na kost. "Bol koji je pridružen kanceru" takođe obuhvata bol uopštenije povezan sa kanceroznim stanjima kao što je, npr., karcinom renalne ćelije, pankreasni karcinom, kancer glave i vrata, maligni gliomi, osteosarkomi, kolorektalni kancer, gastritični kancer, maligni mezoteliom, višestruki mijelom, sinovijalni sarkom, kancer tiroidee, ili melanom. Antitela iz ovog pronalaska su takođe korisna za lečenje ili sprečavanje bola prouzrokovanog ili povezanog sa terapijom kancera ili medicinskim terapijama protiv kancera, npr., hemoterapijom indukovan neuropatski bol kao što je bol prouzrokovan ili povezan sa lečenjem lekom kao što je paklitaksel (Taxol™), docetaksel (Taxotere®); nitrosourea, ciklofosfamid, doksorubicin, epirubicin, 5-fluorouracil, topotekan, irinotekan, karmustin, estramustin, i na platini zasnovana hemoterapijska jedinjenja, kao što je cisplatin, karboplatin, i iproplatin.
[0091] Druga izvođenja će postati očigledna iz prikaza datog detaljnim opisom.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0092]
Slika 1. Inhibicija toplotne hiperalgezije kapsaicina senzitiziranog arteminom na životinjama sa mišjim GFRα3 antitelima (indirektni blokator M1 M6977N ili direktni blokator M1 M6986N, n=8 svaki) ili izotip (negativno) kontrolno antitelo (M2M180N, n=8) na 30 g/kg s.c.2 dana pre nego što dobiju kapsaicin (1 dan pre nego što dobiju 0,5 µg artemina). Slika 2A i 2B. Taktilna alodinija izmerena upotrebom fon Frei anesteziometra za vlakna (von Frey Hairs) kod životinja iz dva eksperimenta (A & B) je ubrizgana sa fibrosarkomom i lečena sa izotipom (negativno) kontrolno antitelo (M2M180N) ili M1M6977N ili M1M6986N antimišja GFRα3 antitela (n=8-11 po grupi). *p<0,05, **p<0,01, ili ***p<0,001 u poređenju sa izotipnom kontrolom u istoj vremenskoj tački.
Slika 3A i 3B. Procenat ipsilateralnog opterećenja težinom na životinjama iz dva eksperimenta (A i B) kojima su ubrizgani fibrosarkomi i lečeni su izotipom (negativnom) kontrolom (M2M180N) ili M1 M6977N ili M1 M6986N antimišjim GFRα3 antitelima (n=8-11 po grupi).
Slika 4A i 4B. Ocene zaštite kod životinja iz dva eksperimenta (A & B) kojima su ubrizgane ćelije firbrosarkoma i lečene su izotip (negativnom) kontrolom (M2M180N) ili M1 M6977N ili M1 M6986N anti-mišjim GFRα3 antitelima (n=8-11 po grupi). **p<,01 u poređenju sa kontrolnim izotipom u istoj vremenskoj tački.
Slika 5. Taktilna alodinija koju je izmerio fon Frei Hairs (von Frey Hairs) anesteziometrom za vlakna na životinjama kojima je ubrizgan harcinom i lečene su izotipom (negativna kontrola (M2M180N) ili M1 M6977N ili M1 M6986N antimišjim GFRα3 antitelima (n=9-10 po grupi). *p<,05, **p<,01, ili ***p<,001 u poređenju sa kontrolnim izotipom (negativni) u istoj vremenskoj tački.
Slika 6A i 6B. Procenat ipsilateralnog opterećenja težinom u dve vremenske tačke (A=11 dana i B=18 dana) ubrizgano sa karcinomomom i lečeno sa kontrolnim izotipom (negativno) (M2M180N) ili M1 M6977N ili M1 M6986N anti-mišja GFRα3 antitela (n=9-10 po grupi).
*p<,05 u poređenju sa kontrolnim antitelom izotipa i to post hok Dunetovom (Dunnett’s) analitom. Slika 7. Ocene zaštite kod životinja kojima je ubrigan karcinom i lečene su kontrolnim izotipom (negativno) (M2M180N) ili M1M6977N ili M1M6986N antimišjim GFRα3 antitelima (n=9-10 po grupi). *p<0,05, ***p<0,001 u poređenju sa kontrolnim izotipom u istoj vremenskoj tački.
Slika 8. Taktilna alodinija koja je izmerena fon Frej Hairs (von Frey Hairs) anesteziometrom za vlakna na životinjama sa DMM lečenim sa kontrolnim izotipom (negativno) (M2M180N) ili M1M6977N ili M1M6986N antimišjim GFRα3 antitelima (n=10 po grupi). **p<,01 ili ***p<,001 u poređenju sa izotipnom kontrolom u istoj vremenskoj tački.
Slika 9. Analiza takmičenja između vrsta anti-GFRα3 antitela za vezivanje na BiotinhGFRα3-mmH.
DETALJAN OPIS
[0093] Pre nego što se opišu ove metode, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na opisane specifične metode, i eksperimentalne uslove, jer takve metode i uslovi mogu da se razlikuju. Takođe treba razumeti da ovde korišćena terminologija jeste u svrhu opisivanja samo specifičnih izvođenja, i nije predviđena da bude ograničavajuća, jer će takav obim ovog pronalaska biti ograničen samo na priložene patentne zahteve.
[0094] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju isto značenje kako to obično razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako bilo koje metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu biti korišćeni u za priktičnu primenu ili testiranje za ovaj pronalazak, sada se opisuju preporučene metode i materijali.
Definicije
[0095] "GFRα3," ili "hGFRα3", kako se ovde koristi, se odnosi na receptor za artemin usidren na glikosilfosfatidilinozitol (GPI) protein, koji pripada familiji linije glijalnih ćelija izvedenih iz neurotrofičnih faktora (GDNF). Jedan od alfa proteina receptora GDNF familije koji, jednom kada se veže na njegov ligand, artemin, posreduje u aktivaciji receptora tirozin kinaze RET ("preraspoređen tokom transfekcije"). Četiri elementa GFRα familije su prepoznata do danas, GFRα-1-4 (Lindsay RM et al., Neuron, (1996), 17:571-574; Airaksinen, MS, et al., Mol. Cell Neurosci., (1999), 13:313-325). GFRα3 je takođe poznat u ovoj oblasti kao receptor GPI povezan na alfa 3 receptor GDNF familije, ili iz linije glijalne ćelije izveden neurotrofični faktor alfa 3 receptora. Izraz "GFRα3," ili "hGFRα3", ili njihovi fragmenti, kako se ovde koristi, se odnosi na humani GFRα3 protein ili njegov fragment, osim ako nije navedeno da je drugačije iz nehumanih vrsta, npr., "mišji GFRα3", "pacovskiGFRα3", ili "majmunski GFRα3". Pored toga, "GFRα3," ili "hGFRα3", kako je ovde korišćeno, se odnosi na humani GFRα3 kodiran sekvencom nukleinske kiseline prikazanom u SEK ID BR: 374 (Genbank pristupni broj NM_001496) i ima sekvencu amino kiseline kako je prikaano u SEK ID BR: 375 (Genbank pristupni broj NP_001487.2), ili njegov biološki aktivan fragment. Signalna sekvenca se proteže da obuhvati ostatke 1-31 SEK ID BR: 375 amino kiseline, zreli protein se proteže da obuhvati ostatke 32-382 amino kiseline iz SEK ID BR: 375, pri čemu se C terminal Pro region proteže da obuhvati ostatke 383-400 amino kiseline od SEK ID BR: 375. Mesto GPI cepanja je ostatak 374 amino kiseline iz SEK ID BR: 375 (asparagin). Sekvenca amino kiseline humanog artemina je nađena u Genbank pod pristupnim brojem Q5T4W7 i sekvenca amino kiseline humanog artemin (iz amino kiselina A108-G220 pod pristupnim borjem Q5T4W7) sa myc-myc-heksahistidin oznakom je prikazana kao SEK ID BR: 369 (sa ostacima 114-141 amino kiseline iz SEK ID BR: 369 koja je myc-myc heksahistidin oznaka).
[0096] Iako je GFRα3 strukturno i funkcionalno sličan drugim članovima GFRα familije, GFRα3 je najdalji srodnik sa ta četiri člana familije. GFRα1 i GFRα2 dele oko 50% identičnosti (Sanicola, M. et al., PNAS, USA, (1997), 94:6238-43; Klein, RD, et al., (1997), Nature, 387:717-21; Buj-Bello, A. et al., Nature (1997), 387:721-4; Baloh, RH, et al., Neuron, (1997), 18:793-802), pri čemu GFRα3 ima samo 32 i 37% identičnost, prema opisanom redosledu, sa ovim proteinima (Masure, S.et al., Eur.J. Biochem., (1998), 251:622-30; Nomoto, S.et al. , BBRC, (1998), 244:849-53). Sekvenca amino kiseline mišjeg GFRα3 ima sledeći Genbank pristuni broj: NP_034410.3. Sekvenca amino kiseline humanog GFRα1 ima sledeći Genbank pristupni broj: NP_005255.1 i nalazi se i kao SEK ID BR: 376. Sekvenca amino kiseline makaki GFRα3 je prikazana u SEK ID BR: 377 i sekvenca amino kiseline makaki RET je prikazana u SEK ID BR: 378.
[0097] Pojam "antitelo", kako se ovde korsisti, je predviđen da se odnosi na molekule imunoglobulina koje čine četiri lanca polipeptida, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama (t.j., "celi molekuli antitela"), kao i njihovi multimeri (npr. IgM) ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen. Svaki teški lanac obuhvata promenljivi region teškog lanca ("HCVR" ili "VH") konstantni region teškog lanca (koji čine domeni CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac je napravljen od promenljivog regiona lakog lanca ("LCVR ili "VL") i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Ti VHi VLregioni mogu da budu dodatno podpodeljeni u regione prekomerne osetljivosti, poznate pod pojmom regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), koji se prepliću (su ispresecani) sa konzervativnijim regionima, poznatim pod pojmom okvirni regioni (FR). Svaki promenljivi teški (VH) i promenljivi laki (VL) se sastoji od tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) i četiri okvirna regiona (FR), raspoređena od amino-terminusa do karboksi terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Kod izvesnih izvođenja iz ovog pronalaska, FRs od anti-GFRα3 antitela (ili njihov fragment koji vezuje antigen) može biti identičan humanoj sekvenci klicine linije, ili može biti prirodno ili veštački modifikovan. Konsenzus sekvencu amino kiseline je moguće definisati na osnovu paralelne analize dva ili više CDR.
[0098] Supstitucija jednog ili više CDR ostataka ili izostavljanje jednog ili više CDR je takođe moguća. Antitela opisana u naučnoj literaturi u kojoj jedan ili dva CDR mogu da budu izostavljeni radi vezivanja. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) su analizirali regione dodira između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih kristalnih struktura, i zaključili da samo oko jedne petine do jedne trećine CDR ostataka zapravo dodiruje antigen. Padlan je takođe našao veliki broj antitela kod kojih jedan ili više od dva CDR nije imao amino kiseline u dodiru sa antigenom (videti takođe, Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320:415-428).
[0099] CDR ostatke kojine sadrže antigen moguće je identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer, često nisu neophodni ostaci H60-H65 u CDRH2), iz regiona Kabat CDR koji leže izvan Chothia CDR, molekularnim modelovanjem i/ili empirijski. Ako se CDR ili njegov ostatak(ci) izostavi, obično se zameni amino kiselinom koja zauzima odgovarajuću poziciju u drugoj humanoj sekvenci antitela ili konsenzusu takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju unutar CDR i amino kiseline za zamenu takođe mogu biti empirijski izabrane. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne supstitucije.
[0100] Potpuno humana anti-hGFRα3 antitela opisana ovde mogu da obuhvate jednu ili više supstitucija amino kiseline, umetaka i/ili brisanja u okvrnim i/ili CDR regionima promenjlivih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama klicine linije. Takve mutacije je lako moguće potvrditi upoređivanjem ovde opisanih sekvenci amino kisleine sa sekvencama klicine linije dostupnim iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovaj pronalazak obuhvata antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz ovde opisanih sekvenci amino kiseline, pri čemu jedna ili više amino kiselina sa jednim ili više okvirnim i/ili CDR regionima koji su reverzno mutirali u odgovarajuće ostatke klicine linije ili u konzervativnu supstituciju amino kiseline (prirodnu ili neprirodnu) odgovarajuće ostat(a)ka klicine linije (takve promene sekvence se ovde pominju kao "reverzne mutacije klicine linije"). Stručnjak u ovoj oblasti tehnike, koji polazi od ovde opisanih sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više pojedinačnih reverznih mutacija klicine linije ili njihove kombinacije. U izvesnim izvođenjima, svi od okvirnih i/ili CDR ostataka unutar VHi/ili VLdomena mutiraju reverzno u sekvencu klicine linije. Kod drugih izvođenja, samo izvesni ostaci mutiraju nazad u sekvencu klicine linije, npr., samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih amino kiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 amino kiselina FR4, ili na reverzne mutacije klicine linije unutar svih okvrnih regiona FR1, FR2, FR3, FR4, ili samo mutirane ostatke pronađene unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. Pored toga, antiela iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti bilo koju kombinaciju dve ili više reverznih mutacija klicine linije unutar okvirnih i/ili CDR regiona, t.j., pri čemu se izvesni pojedinačni ostaci mutiraju reverzno u sekvencu klicine linije pri čemu se izvesni drugi ostaci koji se razlikuju od sekvence klicine linije zadržavaju. Pošto se dobiju, antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više reverznih mutacija klicine linije moguće je lako testirati za jedno ili više željenih svojstava kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pospešena antagonistička ili agonistička biološka svojstva (što može biti slučaj) smanjenu imunogenost, itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni ovim opštim postupkom su obuhvaćeni ovim pronalaskom.
[0101] Pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, je predviđeno da obuhvata antitela koja imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije.
Humana mAb iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti ostatke amino kiseline koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina klicine linije (npr., mutacije uvedene nasumično ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili putem somatske mutacije in vivo), na primer u CDR i specifično CDR3. Međutim, pojam "humano antitelo'', kako se ovde koristi, nije predviđeno da obuhvata mAb u čijim je CDR sekvencama izvedenim iz klicine linije drugih vrsta sisara (npr., miša), kalemljen na humane sekvence okvirnih regiona (FR). Anti-humana GFRα3 antitela iz ovog pronalaska mogu biti naznačena kao "anti-hGFRα3" ili "anti-GFRα3".
[0102] Pojam "specifično se vezuje," ili sličan, znači da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može da bude naznačeno ravnotežom konstante disocijacije od barem oko 1 x 10<-6>M ili manje (npr., manji KDoznačava tesnije vezivanje). Postupci za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su dobro poznati u ovoj oblasti i obuhvataju, na primer dijalizu ravnoteže, površinsku rezonancu plazmona, i slično. Izolovano antitelo koje specifično vezuje hGFRα3 može, međutim, da ispolji unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima kao što su molekuli GFRα3 od drugih vrsta. Međutim, višestruko specifična antitela koja se vezuju na hGFRα3 i jedan ili više dodatnih antigena ili bispecifičnih antitela koji se vezuju na dva različita regiona hGFRα3 se isto tako smatraju antitelima koja "specifično vezuju" hGFRα3, kako se ovde koristi.
[0103] Kako se ovde koristi, pojam "ne vezuje" na specifični ciljni molekul (npr. specifični GFRα3 peptid) znači da to antitelo, kada se testira za vezivanje na ciljni molekul na 25°C u ogledu rezonance plazmona, ispoljava KDveći od 500 nM, ili ako se testira za vezivanje na ciljni molekul na 25°C u sa enzimom povezanim imunosorbent testu (ELISA) ispoljava EC50veći od 50 nM, ili ne uspeva da ispolji bilo koje od vezivanja na bilo koji tip ogleda ili njegovog ekvivalenta.
[0104] Pojam "visoko afinitetno" antitelo se odnosi na ona mAbs koja imaju afinitet vezivanja na hGFRα3 od barem 10<-9>M; poželjno 10<-10>M; još poželjnije 10<-11>M, i još poželjnije 10<-12>M, kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr., BIACORE™ ili ELISA tehnikom za merenje afiniteta rastvora.
[0105] Pod pojmom "usporavanje brzine", "Koff" ili "kd" se misli da se antitelo razdružuje od hGFRα3 sa konstantom brzine od 1 x 10<-3>s-1 ili manjom, poželjno 1 x 10<-4>s<-1>ili manjom, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, npr., BIACORE™.
[0106] Pojmovi "deo koji vezuje antigen" nekog antitela, "fragment koji vezuje antigen" nekog antitela, i slični, kao se ovde koriste, obuhvataju bilo koji prirodno nastao, enzimski dobijen, sintetisan, ili genetski projektovan polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen da bi formirao kompleks. Pojam "deo koji vezuje antigen" ili od nekog antitela "fragment antitela", kako se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržava stabilnost da se specifično veže na hGFRα3.
[0107] Specifična izvođenja, antitela ili fragmenata antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovana na terapijski deo ("imunokonjugat"), kao što je opioid, COX-2 inhibitor, lokalni anestetik, antagonist citokina, kao što je IL-1 ili IL-6 inhibitor, drugi GFRα3 inhibitor, NMDA modulator, agonist kanabinoidnog receptora, modulator P2X familije, VR1 antagonist, antagonist supstance P, hemoterapijski agens, ili radioizotop.
[0108] Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" je predviđeno da se odnosi na antitelo koje je pretežno bez drugih antitela (Ab) koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje hGFRα3, ili njegov fragment, je pretežno bez Abs koji specifično vezuju antigene koji nisu hGFRα3).
[0109] "Neutralizujuće antitelo", kako se ovde koristi (ili "antitelo koje neutralizuje GFRα3 aktivnost"), je predviđeno da se odnosi na antitelo čije vezivanje na hGFRα3 daje kao rezultat inhibiciju od barem jedne biološke aktivnosti od GFRα3. Ovu inhibiciju biološke aktivnosti GFRα3 moguće je proceniti merenjem jednog ili više indikatora GFRα3 biološke aktivnosti jednim ili više od nekoliko standardnih in vitro ili in vivo ogleda poznatih u ovoj oblasti (videti primere dole).
[0110] Pojam "rezonanca površinskog plazmona", kako se ovde koristi, se odnosi na optički fenomen koji omogućava analizu biomolekularnih interakcija u stvarnom vremenu detektovanjem promena u koncentracijama proteina unutar matrice biosenzora, na primer, korišćenjem BIACORE™ sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).
[0111] Pojam "KD", kako se ovde koristi je predviđen da se odnosi na ravnotežu konstante disocijacije iz specifične interakcije antitelo-antigen.
[0112] Pojam "epitop" se odnosi na antigenski determinant koji međusobno reaguje sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela mogu da se vezuju na različita područja na antigen i mogu imati različita biološka dejstva. Pojam ''epitop'' se takođe odnosi na mesto na antigenu na koji B i/ili T ćelija odgovara. Takođe se odnosi na region antigena koji se veže na antitelo. Epitope je moguće definisati kao strukturne ili funkcionalne. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu takođe da budu konformacioni, to jest, sastavljeni od nelinearnih amino kiselina. Kod izvesnih izvođenja, epitopi mogu obuhvatiti determinante - koji su hemijski aktivne površine grupacija molekula kao što su amino kiseline, šećerni bočni lanci, fosforil grupe, ili sulfonil grupe, i kod izvesnih izvođenja, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.
[0113] Pojam "pretežna identičnost" ili "pretežno identično," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada je optimalno usklađen sa odgovarajućim umecima nukleotida ili brisanjima sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost sekvence nukleotida od barem oko 90%, i još preporučljivije barem oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, kako je izmereno nekim dobro poznatim algoritmom identičnosti sekvence, kao što je FASTA, BLAST ili GAP, kako je razmatrano dole u tekstu. Molekul nukleinske kiseline sa pretežnom identičnošću na referentni molekul nukleinske kiseline može, u izvesnim primerima, da kodira polipeptid koji ima istu ili pretežno sličnu sekvencu amino kiseline kao što je polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0114] Kada se primenjuje na polipeptide, pojam "pretežna sličnost" ili "pretežno slično " znači da dve sekvence peptida, kada su optimalno poravnate, kao što je putem programa GAP ili BESTFIT korišćenjem težina zadatih praznina, dele barem 90% identičnost sekvence, i još poželjnije barem 95%, 98% ili 99% identičnost sekvence. Preporučljivo, pozicije ostataka, koje nisu identične, se razlikuju konzervativnim supstitucijama amino kiseline. "Konzervativna supstitucija amino kiseline" je ona kod koje je ostatak amino kiseline supstituisan drugim ostatkom amino kiseline sa bočnim lancem (R grupa) sa veoma sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija amino kiseline neće u znatnoj meri promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. U slučajevima gde se dve ili više sekvence amino ksieline razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može biti podešen nagore da bi se izvršila korekcija zbog konzervativne prirode supstitucije. Načini da se ova podešavanja izvedu su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti (Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol.. Biol.24: 307-331). Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju 1) alifatne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatne hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne lance baze: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne lance baze: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. Preporučene konzervativne supstitucione grupe amino kiseline su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće što su opisali Gonnet et al. (Videti Gonnet et al., Science, (1992), 256:1443 45). "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log matrici merovatnoće.
[0115] Sličnost sekvence za polipeptide se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama koje koriste merenje sličnosti dodeljeno različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije amino kiseline. Na primer, GCG softver koji sadrži programe kao što je GAP i BESTFIT koje je moguće koristiti bez zadatih parametara da bi se utvrdila homologija sekvence ili identičnost sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta ili organizama ili između proteina divljeg tipa njegovog muteina. Videti, npr., GCG verzija 6.1. Sekvencu polipeptida je takođe moguće uporediti korišćenjem FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima; programom u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) omogućava poravnanja i procenat identičnosti sekvence od regiona koji se najbolje preklapaju između upoređenih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Još jedan preporučeni algoritam kada se uporedi sekvenca iz ovog pronalaska sa bazom podataka koja obuhvata veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem zadatih parametara. (Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403410 and (1997) Nucleic Acids Res.25:3389402).
[0116] Kod specifičnih izvođenja, antitelo ili fragment antitela za upotrebu koja je ovde opisana može da bude monospecifičan, bispecifičan, ili višestruko specifičan. Višestruko specifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu obuhvatiti domene koji vezuju antigen specifične za epitope od više od jednog ciljnog polipeptida. Format bispecifičnog antitela uzet kao primer moguće je koristiti u kontekstu ovog pronalaska obuhvata upotrebu prvog domena imunoglobulina (Ig) CH3 i drugog domena Ig CH3, pri čemu se prvi i drugi domen Ig CH3 razlikuju jedan od drugog za barem jednu amino kiselinu, i pri čemu barem jedna razlika u amino kiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela na Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom koje nema tu razliku amino kiseline. U jednom izvođenju, prvi domen Ig CH3 domen Ig CH3 vezuje Protein A i drugi domen Ig CH3 obuhvata mutaciju koja smanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (prema IMGT numeraciji eksona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može još da obuhvati Y96F modifikaciju (putem IMGT; Y436F putem EU). Dalje modifikacije koje je moguće naći unutar drugog CH3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (pomoću IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I putem EU) u slučaju IgG1 mAbs; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I putem EU) u slučaju IgG2 mAb; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (putem IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I putem EU) u slučaju IgG4 mAb. Varijacije na gore opisanom formatu bispecifičnog antitela se obuhvataju obimom ovog pronalaska.
[0117] Pod frazom "terapijski delotvorna količina" se misli na količinu koja proizvodi željeno dejstvo za koje se isporučuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe lečenja, i utvrdiće je stručnjak u ovoj oblasti i moguće ju je utvrditi korišćenjem poznatih tehnika (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[0118] Pojam "sindrom(i) funcionalnog bola", se odnosi na hronične sindrome zasnovane na bazi simptoma koji utiču na do 15% populacije širom sveta. Njih karakteriše hroničan bol i nelagodnost koja se javlja u različitim regionima tela. Za potpuno objašnjenje tih simptoma nisu generalno dovogorene strukturne, inflamatorne, ili biohemijske anomalije. Pacijenti pokazuju značajno smanjen kvalitet života, iako su opcije lečenja ograničene, i razvoj novih terapijskih pristupa ne obećava previše. Neki od uobičajenih poremećaja, koji pripadaju ovoj kategoriji, obuhvataju hronični bol u donjem delu leđa, sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgija (FM), sindrom hroničnog umora, sindrom funkcionalnog bola u abdomenu, poremećaj viličnog zgloba (TMJD), sindrom bolne bešike (intersticijalni cistitis), funkcionalni gastrointestinalni poremećaji/sindromi, sindrom funkctionalnog bola rektuma, sindrom funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavobolje tenzionog tipa, sindrom hroničnog bola u karlici, sindrom bolne prostate (hronični prostatis), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata.
Opšti opis
[0119] Familija srodna sa neurotrofičnim faktorom izvedenim iz linije glijalne ćelije obuhvata neurotrofični faktor izveden iz linije glijalne ćelije (GDNF), neurturin (NRTN), persefin (PSPN) i artemin (ARTN). GDNF familija proteina su diferencijalno obuhvaćene u razvoj i održavanje senzornih, enternih, simpatetičkih i parasimpatetičkih neurona i raznovrsnih neneuronskih tkiva (Henderson, C.E., et al., (1994), Science 266:1062-1064; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467-470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol.127:167-170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368-371). GDNF je specijalno jak faktor opstanka za dopaminergijske, noradrenergijske i motoričke neurone kičme (Yan, Q. et al. (1995), Nature, 373:341-344; Henderson, C.E., et al., (1994), Science, 266:1062-1064; Buj-Bello, A. et al., (1995), Neuron, 15:821-828). Drugi GDNF članovi familije rasta imaju funkcije izvan nervnog sistema (Trupp, M. et al., (1995), J. Cell Biol. 130:137-148; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature 384:467-470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol.127:167-170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol.
124:368-371). Na primer, NRTN, ARTN, i PSPN su takođe izraženi u razvoju bubrega. GDNF takođe ima ključne uloge izvan nervnog sistema za regulaciju morfogeneze bubrega i spermatogeneze (Airaksinen, M.S. et al., (2002), Nature Reviews 3:383-392).
[0120] Svaki član GDNF familije se vezuje preferencijalno na (t.j., je ligand za) receptor proteina usidrenog na glikosilfosfatidilinozitol (GPI) dinamički povezan sa membranom plazme. Alfa familija receptora GDNF familije obuhvata četiri različita receptora: GFR alfa1 (GFRα1,GDNFR-alfa); GFRalfa2 (GFRα2/TrnR2/GDNFR- beta/NTNR-alfa/RETL2); GFRalfa3 (GFRα3); i GFRalfa4 (GFRα4). GDNF se vezuje preferencijalno na GFRα1, NRTN se vezuje preferencijalno na GFRα2, ARTN se vezuje preferencijalno na GFRα3 i PSPN se vezuje preferencijalno na GFRα4 (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394).
[0121] GFRα2 je visoko izražen u korteksu, bazalnom velikom mozgu, i specifičnim slojevima mirisnog bulbusa (glavice), i slabo izražen u crnoj materiji malog mozga, i motoričkim nukleusima. GFRα3 je izražen u fetusu i nervima odraslog miša, simpatetičke i senzorne ganglije, creva, srce, mozak, pluća i bubrega. GFRα4 je izražen na niskim nivoima u različitim područjima mozga kod odraslih kao i u nekim perifernim tkivima uključujući testis i srce. Pri čemu sz preference vezivanja člana GDNF familije prikazane gore kao GDNF na GFRα1; neurturin na GFRα2; artemin na GFRα3; i persefin na GFRα4, uparivanje receptora liganda nije strogo (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394). Na primer, GDNF se vezuje na GFRα2 i GFRα3 sa manjom efikasnošću nego kad se vezuje na GFRα1.
[0122] Ligandi GDNF familije, obično ali ne isključivo, prenose svoje signale kroz višekomponentne komplekse koji su sastavljeni od liganda, i njegovog GFR alfa receptora i receptora tirozin kinaze, c-Ret. Ret je zajednički element ovih ligand-signalnih kompleksa. Ret je proto onkogen koji jako aktivira antiapoptotske signale kroz aktivaciju fosfoinozitol-3 kinaza (PI3K)/PDK/AKT(PKB) i Ras/Raf/MEK/ERK putanje. Ret takođe može da aktivira fosfolipazu C gama (PLCgamma) koja podiže međućelijski kalcijum i olakšava aktivaciju članova standardne i nove familije protein kinaze C (PKC). Kompleksi receptora liganda GDNF familije nisu ograničenai na signaliziranje kroz Ret. GDNF:GFRalfa1 mogu da se vežu na NCAM u ćelijama koje nemaju RET i aktiviraju Fyn i FAK. Pod nekim uslovima GDNF:GFRalfa kompleksi direktno aktiviraju src kinazu.
[0123] U izvesnim izvođenjima iz ovog pronalaska, bilo koji ili više od tri globularna cisteinom bogata domena (1, 2, ili 3) ili GFRα3, ili neki fragment od tih, moguće je koristiti da dobiju antitela koja vezuju GFRα3 i inhibiraju njegovu funkciju, ili inhibiraju njegovu sposobnost da vežu njegov ligand, kao što je artemin. Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska specifično za GFRα3 može da se veže na domen koji vezuje ligand na GFRα3, i kao takvo, može da blokira vezivanje liganda (artemin)-GFRα3 kompleksa na RET. Sekvenca amino kiseline pune dužine humanog GFRα3 je prikazana kao SEK ID BR: 375. Nukleinska kiselina koja kodira humani GFRα3 je prikazana u SEK ID BR: 374. Domen 1 se proteže da obuhvati ostatke 44-124 od SEK ID BR: 375; domen 2 se proteže da obuhvati ostatke 162-239 od SEK ID BR: 375; domen 3 se proteže da obuhvati ostatke 248-340 od SEK ID BR: 375. (Videti bilo SEK ID BR.375 ili Genbank NP_001487.2).
[0124] Bilo koji od ovih domena, 1, 2, ili 3, ili iz njih izvedenih fragmenata, moguće je koristiti da se dobiju antitela koja se vezuju specifično na GFRα3 i inhibiraju njegovu aktivnost, ili barem jednu funkciju povezanu sa GFRα3. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska se vezuju specifično na GFRα3 i mogu da spreče signaliziranje posredovano putem GFRα3. Kod izvesnih antitela, ta antitela koja se specifično vezuju na GFRα3 mogu da spreče vezivanje GFRα3 na njegov ligand, kao što je artemin (Wang, X. et al. Structure, (2006), 14:1083-1092). Kod izvesnih izvođenja, antitela koja se vezuju specifično na GFRα3 mogu da spreče aktivaciju RET receptora tirozin kinaze. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu da se vezuju specifično na GFRα3 a da ne spreče aktivaciju RET receptora tirozin kinaze. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu specifično da se vezuju na GFRα3 i da spreče signaliziranje kroz RET, ili kroz posrednik koji nije RET. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska moguće je koristiti da se suzbije rast/umnožavanje ćelija tumora i kao takva, mogu biti korisna za lečenje izvesnih kancera/maligniteta, ili bola povezanog sa takvim kancerima/malignitetima sa metastazama takvih kancera/maligniteta (Videti Tang, J-Z, et al. Mol Cancer Ther (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinol- ogy, (2010), 151(3):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24). Kod izvesnih izvođenja, antitela koja se vezuju specifično na GFRα3 moguće je pripremiti korišćenjem fragmenata gore navedenih regiona, ili peptida koji se pružaju preko naznačenih regiona za oko 10 do oko 50 ostataka amino kiseline iz bilo kog od njih, ili iz oba, i N ili C terminalnih krajeva ovde opisanih regiona. U izvesnim izvođenjima, bilo koja kombinacija gore pomenutih regiona ili njihovih fragmenata može da se koristi za dobijanje GFRα3 specifičnih antitela. Kako je gore navedeno, dužina, ili broj ostataka amino kiseline koji obuhvata tri domena hGFRα3 mogu da se razlikuju za oko deset do pedeset ostataka amino kiselina iz bilo kog od nijh, ili iz oba, kraja N terminala ili C terminala domena pune dužine, ili njegovog fragmenta, za dobijanje anti-hGFRα3 specifičnih antitela.
Fragmenti antitela koji vezuju antigen
[0125] Osim ako nije specifično drugačije navedeno, pojam "antitelo," kako se ovde koristi, treba razumeti da obuhvata molekule antitela koji obuhvataju dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina (t.j., "cele molekule antitela") kao i njihove fragmente koji vezuju antigen. Pojmovi "deo koji vezuje antigen" nekog antitela, "fragment koji vezuje antigen" nekog antitela, i slični, kao se ovde koriste, obuhvataju bilo prirodno nastao, enzimski dobijen, sintetisan, ili genetski projektovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično veže na antigen da bi se formirao kompleks. Pojam "deo koji vezuje antigen" ili od nekog antitela "fragment antitela", kako se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržava stabilnost da se specifično veže na hGFRα3. Fragment antitela može da obuhvati Fab fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, dAb fragment, fragment koji obuhvata CDR, ili izolovan CDR. Fragmenti koji vezuju antigen Fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu izvedeni, npr., iz molekula celog antitela koji koriste bilo koje pogodne standardne tehnike kao što je proteolitska razgradnja ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju promenljive antitela koja kodira DNK i (opciono) konstantne domene. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr., komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr., biblioteke antitela prikaza faga), ili ih je moguće sintetisati. Tu DNK je moguće sekvencionirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se rasporedi jedan ili više promenljivih i/ili konstantnih domena u pogodnu konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore ostaci cisteina, modifikuju, dodaju ili obrišu amino kiseline, itd.
[0126] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen obuhvataju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) molekule jednolančanog Fv (scFv); (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje obuhvataju ostatke amino kiseline koji oponašaju hiperpromenljivi region antitela (npr., izolovan region određivanja komplementarnosti (CDR)). Drugi projektovani molekuli, kao što su diatela, triatela, tetratela i minitela, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen," kako se ovde koristi.
[0127] Fragment koji vezuje antigen antitela će obično obuhvatiti barem jedan promenljiv domen. Promenljiv domen može biti bilo koje veličine ili sastava amino kiseline i generalno će obuhvatiti barem jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više sekvenci okvirnog domena. Kod fragmenata koji vezuju antigen sa VHdomenom povezanim sa VL domenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni u odnosu jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, promenljivi region može biti dimerni i obuhvatiti VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti monomerni VHili VLdomen.
[0128] Kod izvesnih izvođenja, fragment nekog antitela koji vezuje antigen može obuhvatiti barem jedan promenljivi region kovalentno povezan na barem jedan konstantni domen. Neograničavajuće, za primer uzete konfiguracije promenljivih i konstantnih domena koje je moguće pronaći unutar fragmenta koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska obuhvataju: Neograničavajuće, za primer uzete konfiguracije promenljivih i konstantnih domena koje je moguće pronaći unutar fragmenta koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska obuhvataju: (i) VH-CH1 ; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji promenljivih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od konfiguracija navedenih gore uzetih kao primer, promenljivi i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan na drugi ili mogu biti povezani putem potpunog ili delimičnog zglobnog (hinge) regiona ili vežućeg (linker) regiona. Zglobni region može obuhvatiti barem 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) amino kiselina koje daju kao rezultat fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih promenljivih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom molekulu polipeptida. Pored toga fragment antitela koji vezuje antigen iz ovog pronalaska može obuhvatiti homo dimer ili hetero dimer (ili drugi multimer) iz bilo koje od konfiguracija promenljivog i konstantnog domena koje su navedene gore u nekovalentnoj vezi jedne sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHilI VLdomena (npr., disulfidnim vezama)).
[0129] Kako kod celih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili višestruko specifični (npr., bispecifični). Višestruko specifičan fragment antitela koji vezuje antigen će obično obuhvatiti barem dva različita promenljiva domena, pri čemu je svaki promenljivi domen sposoban da se specifično vezuje na odvojeni antigen ili na drugačiji epitop istog antigena. Format višestruko specifičnog antitela, uključujući ovde opisane formate za primer uzetih bispecifičnih antitela, mogu biti prilagođeni za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen nekog antitela iz ovog pronalaska koji koristi rutinske tehnike dostupne u ovoj oblasti.
Dobijanje humanih antitela
[0130] Metode za generisanje humanih antitela kod transgenskih miševa su poznate u ovoj oblasti. Sve takve poznate metode moguće je koristiti u kontekstu ovog pronalaska da bi se napravila humana antitela koja se specifično vezuju na humani GFRα3.
[0131] Korišćenje VELOCIMMUNE™ tehnologije ili bilo kog drugog poznatog postupka za generisanje monoklonalnih antitela, himerna antitela visokog afiniteta na GFRα3 su prvo izolovana sa humanim promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom. Kao u eksperimentalnom odeljku dole, antitela se karakterišu i biraju zbog poželjnih svojstava, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni se zamene željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo potpuno humano antitelo iz ovog pronalaska, na primer divlji tip ili modifikovani IgG1 ili IgG4. Kako izabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj upotrebi, karakteristike specifičnosti vezivanja antigena visokog afiniteta i ciljne specifičnosti se nalaze u promenljivom regionu.
[0132] Generalno, antitela iz trenutnog pronalaska poseduju veoma visoke afinitete, obično poseduju KDod oko 10<-13>sve do oko 10<-8>M, ili od oko 10<-12>sve do oko 10<-9>M kada su izmerena vezivanjem na antigen bilo imobilizovana na čvrstoj fazi ili u fazi rastvora. Mišji konstantni regioni se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionima da bi se generisala potpuno humana antitela iz ovog pronalaska. Kako izabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj upotrebi, karakteristike specifičnosti vezivanja antigena visokog afiniteta i ciljne specifičnosti se nalaze u promenljivom regionu.
Bioekvivalenti
[0133] Anti-GFRα3 antitela i ovde opisani fragmenti antitela obuhvataju proteine koji imaju sekvence amino kiseline koje se razlikuju od onih od opisanih antitela, ali koje zadržavaju posobnost da vežu humani GFRα3. Takva varijantna antitela i fragmenti antitela obuhvataju jedan ili više dodataka, brisanja, suspstitucija amino kiselina kada se uporede sa roditeljskom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna aktivnosti opisanih antitela. Pored toga, anti-GFRα3 sekvence DNK koje kodiraju antitelo anti-GFRα3 iz ovog opisa obuhvataju sekvence koje obuhvataju jedno ili više dodavanja, brisanja, ili supstitucija nukleotida kada se uporede sa opisanom sekvencom, ali koje kodiraju anti-GFRα3 antitelo ili fragment antitela koji je u suštini bioekvivalentan na anti-GFRα3 antitelo ili fragment antitela iz ovog pronalaska.
[0134] Dva proteina, ili antitela koja vezuju antigen, se smatraju bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i nivo apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se isporuče u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u meri njihove apsorpcije ali ne u brzini njihove apsorpcije i ipak se mogu smatrati bioekvivalentom zbog toga što su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u označavanju, nisu ključne za dobijanje delotvornih koncentracija leka za organizam pri, npr., hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za specifični proučavani proizvod u obliku leka.
[0135] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako ne postoje klinički bitne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći, i jačini.
[0136] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako pacijent može da se prebaci jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda a da se ne očekuje povećanje u riziku od neželjenih dejstava, uključujući klinički značajnu pormenu imunogenosti, ili smanjenu delotvornost, u poređenju sa neprekidnom terapijom bez takvih prebacivanja.
[0137] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako oba deluju putem zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili stanja upotrebe, do mere da su takvi mehanizmi poznati.
[0138] Bioekvivalenti mogu biti prikazani putem in vivo i in vitro metoda. Merenja bioekvivalentnosti obuhvataju, npr., (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, kod kojih je koncentracija antitela ili njegovih metabolita izmerenih u krvi, plazmi, serumu, ili drugom biološkom fluidu kao funkciji vremena; (b) in vitro test koji se dovodi u vezu sa i razumno prognozira humane in vivo podatke o biodostupnosti; (c) in vivo test na ljudima ii drugim sisarima kod kojih se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo antitela (ili njegovog cilja) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili biodostupnost ili bioekvivalentnost antitela.
[0139] Varijante bioekvivalentnosti anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska moguće je konstruisati, na primer pravljenjem različitih supstitucija ostataka i sekvenci ili brisanja teriminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostatke cisteina koji nisu ključni za biološku aktivnost moguće je obrisati ili zameniti sa drugim amino kiselinama da bi se sprečilo formiranje bespotrebnih ili pogrešnih unutarmolekularnih disulfidnih mostova posle renautracije t.j. ponovnog spajanja komplementarnih delova. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu obuhvatiti varijante anti-GFRα3 antitela koje obuhvataju promene amino kiseline, koje modifikuju karakteristike glikosilacije antitela, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikosilaciju.
Anti-GFRα3 antitela koja obuhvataju Fc varijante
[0140] Prema izvesnim izvođenjima iz ovog'' pronalaska, anti-GFRα3 antitela su obezbeđena koja obuhvataju Fc domen koji obuhvata jednu ili više mutacija, koje pospešuju ili smanuju vezivanje antitela na FcRn receptor, npr., pri pH vrednosti za kiselinu u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata anti-GFRα3 antitela koja obuhvataju mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu ta mutacija(e) povećava afinitet Fc domena na FcRn u okruženju koje ima pH vrednost kiseline (npr., u endozomu pri čemu su pH opsezi od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu kao rezultat da daju povećanje poluživota u serumu kada se isporuče životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija obuhvataju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, ta modifikacija obuhvata 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 2591 (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i256 (npr., 252Y, 254T, i256E) modifikaciju; 250Q i428L modifikaciju (npr., T250Q iM428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).
[0141] Na primer, ovaj pronalazak obuhvata anti-GFRα3 antitela koja obuhvataju Fc domen koji obuhvata jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja obuhvata: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije prethodnih mutracija Fc domena, i drugih mutacija unutar ovde opisanih promenljivih domena antitela, se razmatraju obimom ovog pronalaska.
Biološke karakteristike antitela
[0142] Generalno, antitela iz ovog pronalaska mogu da funkcionišu vezivanjem na jedan ili više od tri globularna cisteinom bogata domena (1, 2, ili 3) od hGFRα3. U izvesnim izvođenjima, antitela iz ovog pronalaska mogu da se vežu na epitop smešten na barem jednom od cisteinom bogatih domena hGFRα3. Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na ostatke amino kiseline od domena 1 GFRα3, u opsegu od oko ostatka 44 do oko ostatka 124 od SEK ID BR: 375. Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na ostatke amino kiseline od domena 2 od GFRα3, u opsegu od oko ostatka 162 do oko ostatka 239 od SEK ID BR: 375. Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na ostatke amino kiseline od domena 3 od GFRα3, u opsegu od oko ostatka 248 do oko ostatka 340 od SEK ID BR: 375. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu da funkcionišu blokiranjem ili inhibiranjem GFRα3 aktivnosti vezivanjem na region u bilo kom od abdomena kjoi deluju kao domen koji vezuje ligand, tako sprečavaju vezivanje liganda, kao što je artemin, na to mesto. Kod izvesnih izvođenja, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na mesto vezivanja liganda na jedan od domena GFRα3 i spreči naknadno vezivanje artemin-GFRα3 kompleksa na RET. U jednom izvođenju, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na jedan ili više epitopa u artemin GFRα3 kompleks koji može da odredi ili igra ulogu u specifičnosti između liganda i GFRα3, kao što je region u opsegu od ostataka 167-184 od SEK ID BR: 375. U izvesnim izvođenjima, antitelo iz ovog pronalaska može da se veže na jedan ili više ostataka domena 2 koji su odgovorni za specifičnost između artemina i GFRα3, na primer, ostaci amino kiseline na pozicijama 167 (met), 176 (asp) i/ili poziciji 184 (glu), od SEK ID BR: 375 i u takvom vezivanju, mogu da spreče vezivanje liganda na njegov receptor, i naknadno mogu da spreče signaliziranje kroz RET receptor tirozin kinaze, ili kroz posrednik signaliziranja ili modulator koji nije RET. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu da se vežu na membranu vezanu da formira GFRα3 ili rastvorljivi oblik GFRα3. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu da vežu GFRα3, ali vrste ne reaguju unakrsno sa GFRα1, GFRα2, ili GFRα4. Kod izvesnih izvođenja, antitela iz ovog pronalaska mogu da budu bispecifična antitela. Bispecifična antitela iz ovog pronalaska mogu da vežu jedan epitop u jednom cisteinom bogatom regionu jednog domena i mogu takođe da vežu jedan cisteinom bogat region u drugom domenu hGFRα3. Kod izvesnih izvođenja, bi-specifična antitela iz ovog pronalaska mogu da se vežu na dva različita regiona sa istim domenom. Kod izvesnih izvođenja, jedan krak bispecifičnog antitela iz ovog pronaaska može da se veže na jedan cisteinom bogat region jednog domena hGFRα3 i drugi krak može da se veže na RET, ili na modulator koji nije RET. Kod izvesnih izvođenja, bispecifična antitela mogu da vežu jedan domen u GFRα3 i jedan domen u GFRα1 ili GFRα2.
[0143] Preciznije, anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska mogu da ispolje jednu ili više sledećih karakteristika:
(i) ispoljava KDu opsegu od oko 10<-8>M do oko 10<-13>M mereno rezonancom površinskog plazmona;
(ii) pokazuje sposobnost da blokira oko 50-100% vezivanja GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa IC50vrednošću u opsegu od oko 40 pM do oko 15 nM;
(iii) pokazuje sposobnost da blokira oko 20% do oko 100% vezivanja GFRα3 na čvrstu podlogu obloženu mešavinom artemina i RET;
(iv) blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju RET sa IC50u opsegu od oko 200 pM do oko 50 nM;
(v) inhibira ili smanjuje jedan ili više nociceptivnih odgovora na in vivo modelu bola kancera kosti;
(vi) inhibira ili smanjuje toplotnu hiperalgeziju senzitiziranu arteminom in vivo;
(vii) inhibira ili smanjuje alodiniju na in vivo modelu osteoartritisa; ili
(viii) ne reaguje sa ostalim vrstama unakrsno sa drugim GFR koreceptorima za RET.
[0144] Izvesna anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska mogu da inhibiraju ili ublaže GFRα3 aktivnost u in vitro ogledu. Sposobnost antitela iz ovog pronalaska da se vežu na i suzbiju vezivanje GFRα3 na njegov artemin ligand sami ili u prisustvu RET moguće je izmeriti korišćenjem bilo kog standardnog postupka poznatog stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući oglede vezivanja, ili oglede za utvrđivanje da li antitela blokiraju aktivaciju RET suzbijanjem vezivanja GFRα3 na njegov artemin receptor, kao što su oni koji su ovde opisani. Neograničavajući primeri in vitro ogleda za merenje GFRα3 aktivnosti ilustrovane u Primerima 4 i 5, dole.
[0145] Ovaj pronalazak obuhvata anti-GFRα3 antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji se vezuju na jedan ili više cisteinom bogatih globularnih domena GFRα3, kao što je prikazano u SEK ID BR: 375, ili u njegovom segmentu. Antitela specifična za GFRα3 možda nemaju dodatne oznake ili delove, ili mogu obuhvatiti oznaku ili deo na N terminalu ili C terminalu. U jednom izvođenju, oznaka ili deo je biotin. U ogledu vezivanja, lokacija na oznaci (ako postoji) može odrediti orijentaciju peptida u odnosu na površinu na koju se vezuje peptid. Na primer, ako je površina obložena avidinom, peptid koji obuhvata biotin na N terminalu će biti orijentisan tako da deo na C terminalu peptida bude distalan na površinu.
[0146] Ovde je opisano potpuno humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično vezuje hGFRα3 i neutralizuje hGFRα3 aktivnost, pri čemu to antitelo ili njegov fragment ispoljava jednu ili više od sledećih karakteristika: (i) obuhvata HCVR sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397; (ii) obuhvata LCVR sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405; (iii) obuhvata bilo koju jednu ili više sekvenci CDR1, CDR2, i CDR3 teškog i lakog lanca prikazanih u Tabeli 1 i njihove kombinacije; (iv) je specifičan za vezivanje na i/ili blokiranje GFRα3 aktivnosti bez vezivanja na i/ili blokiranja drugih GFR alfa receptora, uključujući GFRα1, GFRα2 i GFRα4; (v) pokazuje specifičnost vezivanja za jedan ili više cisteinom bogatih globularnih domena GFRα3; (vi) blokira aktivaciju i signaliziranje sve do RET receptora tirozin kinaze; (vii) inhibira ili smanjuje toplotnu hiperalgeziju senzitiziranu arteminom in vivo; (viii) inhibira ili smanjuje alodiniju u in vivo modelu osteoartritisa; ili inhibira ili smanjuje jedan ili više nociceptivnih odgovora na in vivo modelu bola kancera kosti.
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0147] Različite tehnike poznate stručnjacima čije su veštine u ovoj oblasti prosečne moguće je koristiti da se odredi da li antitelo ''reaguje međusobno sa jednom ili više amino kiselina'' unutar nekog polipeptida ili proteina. Tehnike uzete kao primer obuhvataju, na primer, moguće je izvesti rutinski ogled unakrsnog blokiranja kao što je onaj koji su opisali u radu Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Drugi postupci obuhvataju mutacione analize koje pretražuju alanin, blot analizu peptida, (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), kristalografske studije analize cepanja peptida i NMR analizu. Pored toga, moguće je koristiti postupke kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Drugi postupak koji je moguće koristiti da bi se identifikovale amino kiseline unuar polipeptida sa kojima antitelo reaguje međusobno je razmena vodonika/deuterijuma koja je detektovana masenom spektrometrijom. U opštem smislu, razmena vodonika/deuterijuma obuhvata označavanje deuterijumom proteina od interesa, posle čega sledi vezivanje antitela na protein označen deuterijumom. Dalje, kompleks protein/antitelo se prenosi na vodu i izmenjive protone unutar amino kiselina koje su zaštićene kompleksom antitela koji prolazi reverznu izmenu deuterijum-u-vodonik sporijom brzinom nego što je brzina izmenjivih protona sa amino kiselinama koje nisu deo interfejsa. Kao rezultat, amino kiseline koje formiraju deo interfejsa protein/antitelo mogu zadržati deuterijum i samim tim ispoljiti relativno višu masu u poređenju sa amino kiselinama koje nisu obuhvaćene u taj interfejs. Posle disocijacije antitela, ciljni protein se podvrgava cepanju proteaze i analize masenom spektrometrijom, čime se otkriva da ostaci označeni deutrijumom odgovaraju specifičnim amino kiselinama sa kojima antitelo međusobno reaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A.
[0148] Pojam "epitop" se odnosi na mesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T ćelije. Epitopi B ćelije mogu biti formirani i iz dodirnih amino kiselina ili nedodirnih amino kiselina suprotstavljenih tercijarnim prevojem proteina. Epitopi formirani iz dodirnih amino kiselina su obično zadržani na denaturizujućim rastvaračima, pri čemu su epitopi formirani tercijarnim prevojima obično izgubljeni posle lečenja sa denaturizujućim rastvaračima. Epitop obično obuhvata barem 3, a češće, barem 5 ili 8<-10>amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0149] Modifikacijom asistirano profilisanje (MAP), takođe poznato kao na strukturi antigena zasnovano profilisanje antitela (ASAP) je postupak koji kategorizuje veliki broj monoklonalnih anatitela (mAb) usmerenih protiv istog antigena u skladu sa sličnostima profila vezivanja svakog antitela na hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (Videti, npr., US 2004/0101920). Svaka kategorija može da odrazi jedinstveni epitop bilo distinktvino različit od ili delimično preklapajući sa epitopom predstavljenim drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih antitela, kao što je karakterizacija moguće ju je fokusirati na genetski distinktivna antitela. Kada se primeni na pretragu hibridoma, MAP može olakšati identifikaciju retkih klonova hibridoma koji proizvode mAbs koja imaju željene karakteristike. MAP je moguće koristiti da se razvrstaju antitela iz ovog pronalaska u grupe antitela koja se vezuju na različite epitope.
[0150] Kod izvesnih izvođenja, anti-GFRα3 antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela vezuje epitop sa barem jednim od GFRα3 cisteinom bogatih domena 1, 2, ili 3, ili njihovim fragmentom, pri čemu je domen 1 u opsegu od oko ostatka sa brojem 44 do oko ostatka sa brojem 124 od SEK ID BR: 375; domen 2 u opsezima od oko ostatka sa brojem 162 do oko ostatka sa brojem 239 od SEK ID BR: 375; domen 3 u opsezima od oko ostatka sa brojem 248 do oko ostatka sa brojem 340 od SEK ID BR: 375.
[0151] Kod izvesnih izvođenja, anti-GFRα3 antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela vezuje epitop unutar domena 1, ili njegovog fragmenta, humanog GFRα3.
[0152] Kod izvesnih izvođenja, anti-GFRα3 antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela vezuje epitop unutar domena 2, ili njegovog fragmenta, humanog GFRα3.
[0153] Kod izvesnih izvođenja, anti-GFRα3 antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela vezuje epitop unutar domena 3, ili njegovog fragmenta, humanog GFRα3.
[0154] Kod izvesnih izvođenja, antitelo ili fragment antitela vezuje epitop, koji obuhvata više od jednog od brojnih epitopa od GFRα3 unutar domena 1, 2, ili 3, i/ili unutar dva različita domena (na primer, epitope unutar domena 1 i 2, ili unutar domena 2 i 3, ili unutar domena 1 i 3).
[0155] Kod izvesnih izvođenja, antitelo je bispecifično antitelo koje vezuje jedan epitop unutar jednog domena od GFRα3 i drugi epitop unutar drugačijeg domena GFRα3. U jednom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje vezuje jedan epitop u domenu 1 od GFRα3 i drugi epitop u domenu 2 od GFRα3. U jednom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje vezuje jedan epitop u domenu 1 od GFRα3 i drugi epitop u domenu 3 od GFRα3. U jednom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje vezuje jedan epitop u domenu 2 od GFRα3 i drugi epitop unutar domena 3 od GFRα3.
[0156] Ovaj pronalazak obuhvata anti-GFRα3 antitela koja se vezuju na isti epitop kao bilo koja od ovde opisanih specifičnih za primer uzetih antitela (npr., H4H2207N, H4H2212N, H4H2236N3, H4H2243N2, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S, H4H2364S, H1M2243N i H1M2236N). Pored toga, ovaj pronalazak takođe obuhvata anti-GFRα3 antitela koja se takmiče za vezivanje na GFRα3 ili GFRα3 fragment sa bilo kojim od specifičnih ovde opisanih za primer uzetih antitela.
[0157] Stručnjak može lako da utvrdi da li se antitelo vezuje na isti epitop, ili se takmiči za vezivanje sa, referentnim anti-GFRα3 antitelom upotrebom rutinskih metoda poznatih u ovoj oblasti. Na primer, da bi se utvrdilo da li se testirano antitelo vezuje na isti epitop kao referentno anti-GFRα3 antitelo iz ovog pronalaska, referentno antitelo se ostavlja da se veže na GFRα3 protein ili peptid pri uslovima saturacije. Dalje, procenjuje se sposobnost testiranog antitela da se veže na GFRα3 molekul. Ako antitelo koje se tesitra može da se veže na GFRα3 posle vezivanja saturacijom sa referentnim GFRα3 antitelom, može se zaključiti da se to testirano antitelo veže na drugačiji epitop nego što je referentno anti-GFRα3 antitelo. Sa druge strane, ako testirano antitelo nije u mogućnosti da se veže na GFRα3 molekul posle vezivanja saturacijom sa referentnim anti-GFRα3 antitelom, onda testirano antitelo može da se veže na isti epitop kao i epitop na koji se vezalo referentno anti-GFRα3 antitelo iz ovog pronalaska.
[0158] Da bi se utvrdilo da li se neko antitelo takmiči za vezivanje sa referentnim anti-GFRα3 antitelom, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentno antitelo se ostavlja da se veže na GFRα3 molekul pod uslovima zasićenja posle procene vezivanja testiranog antitela na GFRα3 molekul. U drugoj orijentaciji, testirano antitelo se ostavlja da se veže na GFRα3 molekule pri uslovima saturacije posle čega sledi procena vezivanja referentnog antitela na GFRα3 molekul. Ako, kod obe orijentacije, samo prvo (saturaciono) antitelo može da se veže na GFRα3 molekul, onda se zaključuje da se testirano antitelo i referentno antitelo takmiče za vezivanje na GFRα3. Kao što će uvideti prosečan stručnjak u ovoj oblasti, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora neophodno da se veže na identični epitop kao to referentno antitelo, ali može sterno da blokira vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa.
[0159] Dva antitela koja se vežu na isti ili preklapajući epitop ako svako konkurentno suzbija (blokira) vezivanje drugog na antigen. To jest, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog pomoću barem 50% ali preporučljivo 75%, 90% ili čak 99% kako je izmereno ogledom konkurentnog vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). 199050:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako su u suštini sve mutacije amino kiseline u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju epitope koji se preklapaju ako neke mutacije amino kiseline koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.
[0160] Dodatno rutinsko eksperimentisanje (npr., analize mutacije peptida i vezivanja) mogu zatim da budu izvedeni da bi se potvrdilo da li će primećen izostanak vezivanja testiranog antitela zapravo da bude usled vezivanja na isti epitop kao referentno antitelo ili da li sterno blokiranje (ili drugi fenomen) koji je odgovoran za nedostatak primećenog vezivanja. Eksperimente ovog tipa moguće je izvesti korišćenjem ogleda ELISA, RIA, rezonance površinskog plazmona, protočne citometrije ili bilo koje druge kvantitativne ili kvalitativne analize za vezivanje antitela koje je dostupno u ovoj oblasti.
Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta
[0161] Prema izvesnim izvođenjima iz ovog pronalaska, anti-GFRα3 antitela se vezuju na humani GFRα3 ali ne na GFRα3 iz drugih vrsta. Alternativno, anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska, u izvesnim izvođenjima, se vezuju na humani GFRα3 i na GFRα3 od jedne ili više nehumanih vrsta. Na primer, anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska mogu da se vežu na humani GFRα3 i mogu da se vežu ili da se ne vežu, kao što može biti slučaj, na jedan ili više od GFRα3 miša, pacova, gvineja praseta, hrčka, skočimiša, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, makaki, marmoseta, rezusa ili šimpanze.
Imunokonjugati
[0162] Ovde je opisano humano anti-GFRα3 monoklonalno antitelo konjugovano na terapijski deo ("imunokonjugat"), kao što je agens koji može da smanji bol i/ili upalu, hemoterapijski lek, ili radioizotop. Ovaj tip terapijskog dela koji je moguće konjugovati na anti-GFRα3 antitelo će uzeti u obzir stanje koje treba lečiti i željeno terapijsko dejstvo koje treba postići. Na primer, za lečenje akutnog ili hroničnog bola, agens kao što je NSAID, opioid, ili Cox-2 inhibitor, ili agens za lokalnu anesteziju, ili drugi GFRα3 inhibitor je moguće konjugovati na GFRα3 antitelo. Alternativno, ako je željeno terapijsko dejstvo da se leči upala povezana sa bolnim stanjem, može biti pogodnost da se konjuguje agens protiv upale na anti-GFRα3 antitelo, kao što je, ali bez ograničenja na, celekoksib, ili antagonist citokina, kao što je IL-1 ili IL-6 inhibitor. Ako stanje koje treba lečiti jeste kancerozno stanje, može biti korisno da se konjuguje hemoterapijski lek, ili radioizotop na GFRα3 antitelo. Primeri pogodnih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u ovoj oblasti, videti, na primer, WO 05/103081.
Višestruko specifična antitela
[0163] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična, ili višestruko specifična. Višestruko specifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu obuhvatit domene koji vezuju antigen specifične po tome što imaju više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, e.g., Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Ta anti- GFRα3 antitela iz ovog pronalaska mogu biti povezana na ili izražena zajedno sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., još peptid ili protein protein. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) na jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili višestruko specifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata bispecifična antitela pri čemu jedan krak imunoglobulina je specifičan za humani GFRα3 ili njegov fragment, i drugi krak imunoglobulin je specifičan za drugi terapijski cilj ili konjugovan na terapijski deo. Kod izvesnih izvođenja ovog pronalaska, jedan krak imunoglobulina je specifičan za epitop na jednom domenu hGFRα3 ili njegov fragment, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za epitop na drugom domenu hGFRα3. U izvesnim izvođenjima, jedan krak imunoglobulina je specifičan za jedan epitop na jedan domen od hGFRα3 i drugi krak je specifičan za drugi epitop na istom domenu hGFRα3.
[0164] Primer formata bispecifičnog antitela koji je moguće koristiti u kontekstu ovog pronalaska obuhvata upotrebu prvog imunoglobulina (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri čemu prvi i drugi domeni Ig CH3 domena koji se međusobno razlikuju za barem jednu amino kiselinu, i pri čemu barem jedna različita amino kiselina smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela na Protein A kada se uporedi sa bispecifičnim antitelom koje nema tu razliku amino kiseline. U jednom izvođenju, prvi Ig CH3 domen vezuje Protein A i drugi Ig CH3 domen obuhvata mutaciju koja smanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (za IMGT numeraciju eksona; H435R putem EU numeracije). Drugi CH3 može još da obuhvati Y96F modifikaciju (putem IMGT; Y436F putem EU). Dalje modifikacije koje je moguće naći unutar drugog CH3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (putem IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I putem EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I putem EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (putem IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I putem EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije na gore opisanom formatu bispecifičnog antitela se obuhvataju obimom ovog pronalaska.
Terapijska isporuka i formulacije
[0165] Ovaj pronalazak obezbeđuje terapijske supstance koje obuhvataju anti-GFRα3 antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen iz ovog pronalaska. Isporuka terapijskih supstanci u skladu sa ovim pronalaskom biće isporučena sa pogodnim nosačima, ekscipijentima, i drugim agensima koji su inkorporirani u formulacije da bi se obezbedio poboljšan transfer, isporuka, tolerancija, i slično. Više odgovarajućih formulacija moguće je naći u formularu (spisku medicinskih supstanci i lekova) poznatom svim farmacutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, prahove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, mehuriće koji sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je LIPOFEKTIN™), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, carbowax (polietilen glikoli različitih molekularnih težina) emulzije, polučvrsti gelovi, i polučvrste mešavine koje sadrže carbovax. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0166] Ta doza antitela može varirati zavisno od starosti i veličine subjekta kom će biti isporučena, ciljane bolesti, stanja, rute isporuke, i sličnog. Kada se antitela iz ovog pronalaska koriste za lečenje bola povezanog sa GFRα3 aktivnošću u različitim stanjima i bolestima, pri čemu to stanje ili bolest daje kao rezultat akutni ili hronični bol, bol usled upale, neuropatski bol, i slično, kod odraslog pacijenta, prednost je da se intravenozno isporuči antitelo iz ovog pronalaska normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još preporučljivije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. Zavisno od ozbiljnosti stanja, učestalosti i trajanja, terapiju je moguće podesiti.
[0167] Različiti sistemi isporuke su poznati i moguće ih je koristiti da se isporuči farmaceutska supstanca ovog pronalaska, npr., enkapsuacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje su sposobne da izraze mutirane viruse, receptorom posredovanu endocitozu (videti, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Metode uvođenja obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, potkožnu, intranazalnu, epiduralnu, i druge rute. Supstancu je moguće isporučiti bilo kojom prikladnom rutom, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz obloge epitela ili sluzokože (npr., oralna sluzokoža, sluzokoža rektuma i sluzokoža creva, itd.) i moguće ih je isporučiti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Isporuka može biti sistemska ili lokalna.
[0168] Farmaceutsku supstancu je takođe moguće isporučiti u mehuriću, specifično lipozomu (videti, na primer, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[0169] U izvesnim situacijama, farmaceutsku supstancu moguće je isporučiti u sistemu sa kontrolisanim ispuštanjem. U jednom izvođenju, moguće je koristiti pumpu. U drugom izvođenju, moguće je koristiti polimerne materijale. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim otpuštanjem moguće je postaviti blizu cilja te supstance, tako je neophodna samo frakcija sistemske doze.
[0170] Preparati koje je moguće ubrizgati mogu obuhvatiti oblike doze za intravenozne, potkožne, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ove preparate koje je moguće ubrizgati moguće je dobiti opšte poznatim metodama. Na primer, preparate koje je moguće ubrizgati moguće je pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnoj vodenoj podlozi ili u uljnoj podlozi koja se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor koji obuhvata glukozu i druge pomoćne agense, npr., koji je moguće koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim rastvarajućim agensom kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenisanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljna podloga, oni se koriste, npr, susamovo ulje, ulje sojinog zrna, itd., koje je moguće koristiti kombinaciji sa agensom solubilizacije kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Ta injekcija je dakle pripremljena preporučljivo napunjena u odgovarajuću ampulu.
[0171] Farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska moguće je isporučiti potkožno ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u vezi sa potkožnom isporukom, uređaj za isporuku u vidu olovke vrlo lako se primenjuje za isporuku farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Takav uređaj za isporuku u vidu olovke može biti ponovo korišćen ili za jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku u vidu olovke za ponovnu upotrebu generalno koristi zamenjivu patronu koja sadrži farmaceutsku supstancu. Pošto se cela farmaceutska supstanca u patroni isporuči i patrona se isprazni, prazna patrona može lako da se baci i zameni novom patronom koja sadrži tu farmaceutsku supstancu. Uređaj za isporuku u vidu olovke moguće je ponovo koristiti. Kod uređaja za isporuku za jednokratnu upotrebu, ne postoji patrona koju je moguće zameniti. Radije, uređaj za jednokrantu upotrebu u vidu olovke se isporučuje unapred napunjen farmaceutskim lekom koji se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Pošto se iz rezervoara isprazni farmaceutska supstanca, ceo uređaj se odloži u smeće.
[0172] Brojni uređaji u vidu olovke za isporuku leka sa ponovnom upotrebom ili kao autoinjektori imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Primeri obuhvataju, ali se sasvim izvesno ne ograničavaju na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONlC™ olovka (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ olovka, HUMALOG™ olovka, HUMALIN 70/30™ olovka (Eli Lilly i Co., Indianapolis,IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTI- CLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Germany), da se pomene samo nekolicina. Primeri uređaja za isporuku u vidu olovke za jednokratnu isporuku koji imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog opisa obuhvataju, ali se ne ograničavaju na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), the PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL), su samo neki od postojećih.
[0173] Kao pogodnost, farmaceutske supstance za oralnu i parenteralnu upotrebu opisane gore u tekstu se dobijaju u doziranim oblicima u jediničnoj dozi pogodnoj da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi oblici doze u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina gore pomenutog antitela sadržanog je generalno oko 5 do oko 500 mg po obliku doze u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, gore pomenuto antitelo je sadržano u oko 1 do oko 100 mg, u oko 10 do 250 mg druge oblike doze.
Terapijske upotrebe antitela
[0174] Antitela iz ovog pronalaska su korisna za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje neke bolesti, poremećaja, ili stanja povezanog sa GFRα3 aktivnošću, ili za popravljanje barem jednog od simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili stanjem za ublažavanje bola povezanog sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem. Primeri stanja, bolesti i/ili poremećaja, i/ili bola povezanog sa takvim uslovima, bolestima, ili pormećajima, koje je moguće lečiti anti-GFRα3 antitelima iz ovog pronalaska obuhvataju akutni, hronični, neuropatski, ili bol u vidu upale, artritis, interstinalni cistitis, pankreatitis, migrena, klaster glavobolje, trigenimalnu neuralgiju, hepesnu neuralgiju, opšte neuralgije, epilepsiju ili epileptična stanja, miotonija, aritmija, poremećaji kretanja, poremećaji neuroendokrinog sistema, ataksija, sindrom nervoznih creva, sindrom upale creva, analna inkontinencija, inkontinencija, prekomerna osetljivost rektuma, visceralni bol, osteoartritični bol, giht, postherpesna neuralgija, dijabetesna neuropatija, radikularni bol, išijas, bol u leđima, bol glave ili vrata, probadajući bol, postoperativni bol, kancerni bol, uključujući bol povezan sa kancerom kosti ili pankreasnim bolom.
[0175] Druga stanja koja je moguće lečiti ovde opisanim terapijskim metodama obuhvataju naslednu eritromelalgiju, rinitis, kancer prostate, kancer dojke, kancer kosti, kancer grlića materice, ili poremećaje bešike. Antitela iz ovog pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen moguće je takođe koristiti za lečenje sledećih stanja: nemalignog akutnog, hroničnog, ili frakturnog bola kosti, reumatoidni artritis, stenozu kičme; neuropatski bol u donjem delu leđa; sindrom miofascijalnog bola; fibromijalgiju; temporomandibularni bol zglobova; visceralni bol, uključujući bol u predelu stomaka; pankreasni; hronična glavobolja; tenziona glavobolja, uključujući, klaster glavobolje, dijabetesnu neuropatiju; sa HIV povezanu neuropatiju; Šarko-Mari-Tutovu (Charcot-Marie-Tooth) neuropatiju; nasledne senzorne neuropatije; povredu perifernog nerva; bolnu neuromasu; ektopične proksimalne i distalne iscetke; radikulopatiju; hemoterapijom indukovan neuropatski bol; radioterapijom indukovan neuropatski bol; bol posle mastektomije, centralni bol; bol usled povrede kičmenog stuba; bol posle moždanog udara, talamusni bol; sindrom složenog regionalnog bola (CRPS, takođe je poznat kao refleksna simpatetička distrofija); fantomski bol; neobuzdani bol; akutni mukoskeletni bol; bol zglobova; akutni giht bol; mehanički bol u donjem delu leđa; bol u vratu; tendonitis; bol povreda/bol pri vežbanju; bol u predelu stomaka; pijelonefritis; apendicitis; holecistitis; opstrukcija creva; hermije; itd; bol u grudima, uključujući kardijalni bol; bol u karlici, bol bubrežnog kolika, akutni akušerski bol, uključujući bol usled porođaja, bol usled carskog reza; bol usled opekotina i trauma; endometriozu; bol herpes zoster; anemija srpaste ćeije; akutni pankreatitis; probadajući bol; orofacijalni bol uključujući sinusitisni bol, stomatološki bol, bol multipla skleroze; bol usled lepre; bol usled Behčetove bolesti; adipozna doloroza; flebitni bol; Gilen-Barov bol (Guillain-Barre); bolne noge, i pomeranje prstiju na stopalima; Haglundov sindrom; bol Fabrijeve bolesti, bolest bešike i urogenitalnog trakta; hiperaktivne bešike.
[0176] U jednom izvođenju antitela iz ovog pronalaska moguće je koristiti za lečenje sindroma funkcionalnog bola, pri čemu je taj sindrom funkcionalnog bola izabran iz grupe koja obuhvata bolesti kao što je hronični bol u donjem delu leđa, i sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgija (FM), sindorm hroničnog umora, bol u predelu stomaka, poremeća viličnog zgloba (TMJD), sindrom bolne bešike (intersticijalni cistitis), funkcionalni gastrointestinalni poremećaji/sindromi, sindrom funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavovolje tenzionog tipa, sindrom hroničnog bola u karlici, sindrom bolne prostate (hronični prostatis), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata.
[0177] Antitela iz ovog pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen moguće je koristiti i da se suzbije rast/proliferacija ćelije tumora ili metastaza ćelija tumora. Sa tim u skladu, u izesnim izvođenjima, antitela iz ovog pronalaska ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, moguće je koristiti za lečenje kancera, uključujući, ai ne i ograničeno na, kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika, kancer bubrega, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mozga, leukemiju, kancer kosti, ili bol povezan sa metastazom kancera, na primer, metastazaom kancera kosti. (Videti Tang, J-Z, et al. Mol Cancer Ther (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinology, (2010), 151(3):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24).
[0178] Antitela iz ovog pronalaska su takođe korisna za lečenje ili sprečavanje bola povezanog sa kancerom. "Bol povezan sa kancerom" obuhvata, npr., bol usled kancera kosti, uključujući bol od kancera koji je metastazirao na kosti (npr.,, kancer dojke, kancer prostate, kancer pluća, sarkom, kancer bubrega, višestruki mijelom, itd.). "Bol koji je pridružen kanceru" takođe obuhvata bol uopštenije povezan sa kanceroznim stanjima kao što je, npr., karcinom renalne ćelije, pankreasni karcinom, kancer dojke, kancer glave i vrata, kancer prostate, maligni gliomi, osteosarkomi, kolorektalni kancer, gastritični kancer, maligni mezoteliom, višestruki mijelom, kancer jajnika, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sinovijalni sarkom, kancer tiroidee, ili melanom. Antitela iz ovog pronalaska su takođe korisna za lečenje ili sprečavanje bola prouzrokovanog ili povezanog sa terapijom kancera ili medicinskim terapijama protiv kancera, npr., hemoterapijom indukovan neuropatski bol kao što je bol prouzrokovan ili povezan sa lečenjem lekom kao što je paklitaksel (Taxol™), docetaksel (Taxotere®); nitrosourea, ciklofosfamid, doksorubicin, epirubicin, 5-fluorouracil, topotekan, irinotekan, karmustin, estramustin, i na platini zasnovana hemoterapijska jedinjenja, kao što je cisplatin, karboplatin, i iproplatin.
Kombinovane terapije
[0179] Kombinovane terapije mogu obuhvatiti anti-hGFRα3 antitelo iz ovog pronalaska i, na primer, još jedan GFRα3 antagonist (npr., anti-GFRα3 antitelo ili mali molekul inhibitor za GFRα3); COX-2 inhibitor; lokalni anestetik; NMDA modulator; agonist kanabinoidnog receptora; modulator P2X familije; VR1 antagonist; antagonist substance P; inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma (Nav), na primer, Nav1.7 antagonist, ili Nav1.8 antagonist (npr., anti-Nav1.7 ili anti-Nav1.8 antitelo ili inhibitor malog molekula), Nav1.9 antagonist (hnpr., anti-Nav1.9 antitelo ili inhibitor malog molekula Nav1.9); inhibitor kanala kalcijuma; inhibitro kanala kalijuma; inhibitor citokina ili antagonist receptora citokina (npr., interleukin-1 (IL-1) inhibitor (kao što je rilonacept ("IL-1 trap"; Regeneron) ili anakinra (KIN-ERET®, Amgen), antagonist malog molekula IL-1, ili anti-IL-1 antitelo); IL-18 inhibitor (kao što je antagonist malog molekula IL-18 ili anti-IL-18 antitelo); IL-6 ili IL-6R inhibitor (kao što je antagonist malog molekula IL-6, anti- IL-6 antitelo ili antitelo protiv IL-6 receptora); antiepileptik/antikonvulzantni lek (npr., gabapentin, pregabalin); inhibitor faktora rasta nerva (NGF) (npr., antagonist malog molekula NGF ili anti-NGF antitelo); inhibitor BDNF, TrkA, TrkB ili p75; opioid; morfin; kohicin u maloj dozi; aspirin ili drugi NSAID; steroidi (npr., prednizon, metotreksat, itd.); mala doza ciklosporina A; selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI); ili inhibitor ponovne apsorpcije norepinefrina serotonina (SNRI); triciklik; faktor nekroze tumora (TNF) ili inhibitorTNF receptora (npr., mali molekul TNF ili TNFR antagonist ili anti-TNF ili TNFR antitelo); TWEAK inhibitor (sa TNF srodan WEAK induktor apoptoze); RET inhibitor; inhibitor GDNF familije liganda; inhibitor GFRα1, GFRα2 ili GFRα4; inhibitor kanala jona koji registruje kiselinu (npr. ASIC1 ili ASIC3; inhibitori sinteze urinske kiseline (npr., alopurinol); pospešivači izlučivanja urinske kiseline (npr., probenecid, sulfinpirazon, benzbromaron, itd.); inhibitor receptora prekineticina (PROK1 i PROK2); drugi inhibotori upale (npr., inhibitori kaspaze-1, p38, IKK1/2, CTLA-4Ig, itd.);i/ili kortikosteroidi.
Režimi isporuke
[0180] Više doza nekog anti-GFRα3 antitela moguće je isporučiti ispitaniku tokom definisanog vremenskog toka. Ovde opisani postupci obuhvataju sekvencijalno isporučivanje subjektu više doza nekog anti-GFRα3 antitela. Kako se ovde koristi, "isporuka u sledu" znači da svaka doza anti-GFRα3 antitelo je isporučeno ispitaniku u različitim vremenskim trenucima, npr., različitim danima odvojenim unapred određen interval (npr., sati, dani, nedelja ili meseci). Ovaj pronalazak obuhvata postupke koji obuhvataju sekvencijalnu isporuku pacijentu pojedinačne početne doze anti-GFRα3 antitelo, posle čega sledi jedna ili više drugih doza anti-GFRα3 antitelo, i opciono sledi jednom ili više tercijarnih doza anti-GFRα3 antitela.
[0181] Pojmovi "inicijalna doza,""sekundarne doze," i "tercijarne doze," se odnosi na privremenu sekvencu isporuke od anti-GFRα3 antitela. Dakle, "početna doza" je doza koja se isporučuje na početku režima lečenja (takođe se pominje kao "osnovna doza"); "druge doze" su doze koje se isporučuju posle početne doze; i "tercijarne doze" su doze koje se isporučuju posle sekundarnih doza. Početna, sekundarna, i tercijarne doze mogu sve da sadrže istu količinu anti-GFRα3 antitela, ali generalno mogu da se razlikuju jedna od drugog u smislu učestalosti isporuke. Kod izvesnih izvođenja, međutim, količina anti-GFRα3 antitela sadržanog u početnoj, drugoj i/ili tercijarnoj dozi se razlikuje jedna od druge (npr., podešena na veću ili manju kako je prikladno) tokom lečenja. Kod izvesnih izvođenja, dve ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5) doza se isporučuje na početku režima lečenja kao ''udarne doze'' posle čega slede naknadne doze koje se isporučuju na manje čestoj osnovi (npr., ''doze za održavanje'').
[0182] Na primer, svaku sekundarnu i/ili tercijarnu dozu je moguće isporučiti 1 do 26 (npr., 1, 11 / 2, 2, 21 / 2, 3, 31 / 2, 4, 41 / 2, 5, 51 / 2, 6, 61 / 2, 7, 71 / 2, 8, 81 / 2, 9, 91 / 2, 10, 101 / 2, 11, 111 / 2, 12, 121 / 2, 13, 131 / 2, 14, 141 / 2, 15, 151 / 2, 16, 161 / 2, 17, 171 / 2, 18, 181 / 2, 19, 191 / 2, 20, 201 / 2, 21, 211 / 2, 22, 221 / 2, 23, 231 / 2, 24, 241 / 2, 25, 251 / 2, 26, 26 1 / 2, ili više) nedelja posle neposredno prethodne doze. Fraza," neposredno prethodna doza,'' kako se ovde koristi, znači, u nizu više isporuka, dozu anti- GFRα3 antitela, koja se isporučuje pacijentu pre isporuke prve sledeće doze po redosledu bez interventnih doza.
[0183] Ovde opisani postupci mogu obuhvatiti isporuku pacijentu bilo kog broja drugih i/ili tercijarnih doza anti-GFRα3 antitela. Na primer, u izvesnim izvođenjima, samo jedna sekundarna doza se isporučuje pacijentu. Kod drugih izvođenja, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza se isporučuje pacijentu. Slično, u izvesnim izvođenjima, samo jedna tercijarna doza se isporučuje pacijentu. Kod drugih izvođenja, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza se isporučuje pacijentu.
[0184] U izvođenjima koja obuhvataju sekundarne doze, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge sekundarne doze. Na primer, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti pacijentu 1 do 2 nedelje posle neposredno prethodne doze. Slično, u izvođenjima koja obuhvataju tercijarne doze, svaku tercijarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge tercijarne doze. Na primer, svaku tercijarnu dozu moguće je isporuiti pacijentu 2 do 4 nedelje posle neposredno prethodne doze. Alternativno, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze isporučuju pacijentu mogu varirati tokom režima terapije. Učestalost isporuke, zavisno od individualnih potreba pacijenta, može da podesi lekar tokom terapije.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0185] Anti-GFRα3 antitela iz ovog pronalaska je takođe moguće detektovati i/ili izmeriti GFRα3 u uzorku, npr., radi dijagnostičkih potreba. Na primer, anti-GFRα3 antitelo, ili njegov fragment, moguće je koristiti da bi se dijagnostikovalo stanje ili bolest koju karakteriše nepravilna ekspresija (npr., prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) -GFRα3 antitela. Dijagnostički ogledi uzeti kao primer za GFRα3 mogu obuhvatiti, npr., dovođenje uzorka u kontakt, dobijenog od pacijenta, sa anti-GFRα3 antitelom iz ovog pronalaska, pri čemu se to anti-GFRα3 antitelo označava sa prepoznatljivom oznakom ili molekulom reporterom. Alternativno, neoznačeno anti-GFRα3 antitelo moguće je koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektibilno označeno. Detektibilna oznaka ili molekul reporter može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminescentni deo, kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, βgalaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični ogledi uzeti kao primer koje je moguće koristiti da bi se detektovao ili izmerio GFRα3 u uzorku obuhvataju sa enzimom povezan imunosorbent test (ELISA), radioimunotest (RIA), razvrstavanje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).
[0186] Uzorci koje je moguće koristiti u GFRα3 dijagnostičkim ogledima prema ovom pronalasku obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili fluida koji je moguće dobiti od pacijenta, što obuhvata količine GFRα3 proteina koje je moguće detektovati, ili njihove fragmente, pod normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi GFRα3 u specifičnom uzorku dobijeni od zdravog pacijenta (npr., pacijent koji nije oboleo ili nije pogođen stanjem povezanim sa abnormalnim GFRα3 nivoima ili aktivnošću) biće izmereni da bi se na samom početku uspostavila polazna vrednost, ili standardni, nivo GFRα3. Ovaj nivo početne vrednosti GFRα3 je zatim moguće uporediti u odnosu na nivoe GFRα3 izmerene u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje povezano sa GFRα3, ili bol povezan sa takvom bolešću ili stanjem.
PRIMERI
[0187] Nastojalo se da se postigne preciznost u pogledu korišćenih brojeva (npr., količina, temperature, itd.) ali neke eksperimetnalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije navdeno, delovi su delovi prema težini, molekularna težina je prosečna molekularna težina, temperatura se smatra da je u stepenima Celzijusove skale, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Generisanje humanih antitela na humani GFRα3
[0188] Imunogen koji obuhvata jedan od GFRα3 peptida koji imaju sekvence amino kiseline prikazane kao SEK ID BR: 370, 371, 372 i 373, ili njihove fragmente, moguće je koristiti da se generišu antitela na humani GFRα3. Ovi peptidi se konjuguju na nosač, na primer, KLH, zatim se isporučuju sa ađuvansom da bi se stimulisao odgovor imunog sistema, na VELOCIMMUNE® miša koji obuhvata DNK kodiranje humanih promenljivih regiona teškog lanca imunoglobulina i lakog kapa lanca. Odgovor imunog istema antitela se nadgleda pomoću imunoogleda specifičnog za GFRα3. Kada se želi da se postigne dobijanje željenog odgovora imunog sistema, splenociti se pokupe i spoje sa mišjim mijeloma ćelijama da bi se sačuvala njihova održivost i formirale linije hibridoma ćelije. Linije ćelije hibridoma se pregledaju i odabiraju da bi se identifikovale linije ćelije koje proizvode GFRα3 specifična antitela. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko anti-GFRα3 himernih antitela (t.j., antitela koja imaju humane promenljive domene i mišje konstante domene). Anti-GFRα3 antitela generisana korišćenjem ove metode su označena kao H1M2207N, H1M2212N, H1M2236N, H1M2236N3, H1M2243N, H1M2243N2, H1M2210N i H1M2234N.
[0189] Anti-GFRα3 antitela su takođe izolovana direktno iz antigen pozitivnih B ćelija bez fuzije na ćelije mijeloma, kao što je opisano u U.S.2007/0280945A1. Upotrebom ove metode, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-GFRα3 antitela (t.j., antitela koja poseduju humane promenljive domene i humane konstantne domene); primeri antitela generisanih na ovaj način su navedeni kao u nastavku: H4H2207N, H4H2212N, H4H2236N, H4H2243N, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S i H4H2364S.
[0190] Biološka svojstva anti-GFRα3 antitela uzetih za primer generisanih u skladu sa metodama iz ovog Primera su opisani detaljno u primerima iznetim dole u tekstu.
Primer 2. Sekvence amino kiseline promenljivog regiona teškog i lakog lanca
[0191] Tabela 1 iznosi parove sekvenci amino kiseline promenljivog regiona teškog i lakog lanca od izabranih anti-GFRα3 antitela i njihove odgovarajuće identifikatore antitela. Antitela se obično pominju ovde prema sledećoj nomenklaturi: Fc prefiks (npr. "H4H", "H1M, "H2M"), posle kog sledi brojčani identifikator (npr. "2207" kako je prikazano u Tabeli 1), su pokazani putem "P", "S", ili "N" sufiksa. Dakle, prema ovoj nomenklaturi, antitelo može da se pominje kao, npr. "H4H2207N". Ti H4H, H1M, i H2M prefiksi na naznačenim antitelima koje se ovde koriste da se ukaže na specifični Fc region antitela. Na primer, "H2M" antitelo ima mišji IgG2 Fc, pri čemu "H4H" antitelo ima humani IgG4 Fc. Kao što će prosečan stručnjak u ovoj oblasti uvideti, H1M ili H2M antitelo je moguće pretvoriti u H4H antitelo, i vice versa, ali u svakom slučaju, promenljivi domeni (uključujući CDR), koji se označavaju brojčanim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1, će ostati isti. Antitela koja imaju iste brojčane oznake antiela, ali različito slovo u sufiksu kao N, B, S ili P se odnose na antitela sa teškim i lakim lancima sa identičnim CDR sekvencama ali sa varijacjama sekvence u regionima koji spadaju izvan CDR sekvenci (t.j., u okvirnim regionima). Dakle, N, B, S i P varijante specifičnog antitela imaju identične CDR sekvence unutar njihovih promenljivih regiona teškog i lakog lanca ali se međusobno razlikuju unutar svojih okvirnih regiona.
Tabela 1
Primer 2. Analiza upotrebe promenljivog gena
[0192] Da bi se analizirala struktura proizvedenih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju promenljive regione antitela su klonirane i sekvencionirane. Iz sekvence nukleinske kiseline i prognozirane sekvence amino kiseline antitela, upotreba gena je identifikovana za svaki promenljivi region teškog lanca (HCVR) i promenljivi region lakog lanca (LCVR). Tabela 2 iznosi upotrebu gena za odabrana antitela u skladu sa ovim pronalaskom.
Tabela 2
Primer 3. Afiniteti vezivanja GFRα3 antitela
[0193] Konstante brzine povezujućeg i razdružujućeg vezivanja (kai kd, prema opisanom redosledu) i izračunata ravnoteža konstante disocijacije i razdružujući poluživoti (KDi t1/2, prema opisanom redosledu) za vezivanje antigena na anti-GFRα3 antitela su utvrđeni korišćenjem biosenzora rezonance površinskog plazmona u stvarnom vremenu (Biacore T200) ogled na 25°C i 37°C. Antitela su testirana za vezivanje na humani GFRα3 izražen sa bilo C terminalnom mycmyc-heksahistidin oznakom (hGFRα3-mmh; SEK ID: 370, C terminalna hFc oznaka (hGFRα3-hFc; SEK ID:371), ili C terminalna mFc oznAka (hGFRα3-mFc; SEK ID:372), kao i majmunski GFRa3 izražen sa C terminalnom myc-myc-heksahistidin oznakom (MfGFRα3-mmh; SEK ID:373). Anti GFRα3 antitela su registrovana na površini bilo kozjeg anti-mišjeg IgG poliklonalnog antitela (GE Healthcare, # BR-1008-38) ili mišjeg anti-humanog IgG monoklonalnog antitela (GE Healthcare, #BR-1008-39) stvoreno kroz direktno spajanje amina na Biacore CM5 senzor čip. Kinetički eksperimenti su izvedeni korišćenjem HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Surfaktant P20, pri pH 7,4) ili PBS pufer koji obuhvata 0,05% v/v surfaktant P20 kao i radno pufersko sredstvo i pufersko sredstvo uzorka. Vezivanje na humani GFRα3-mmh ili mišji GFRα3-mmh je ocenjeno ubrizgavanjem nekoliko koncentracija u opsegu od 200 do 7,4 nM (3-strukih razblaženja) preko površine na kojoj je registrovano antitelo. Vezivanje na humani GFRα3-mFc ili humani GFRα3-hFc je ocenjeno ubrizgavanjem nekoliko koncentracija u opsegu od 100 do 3,7 nM (3-strukih razblaženja) preko površine na kojoj je registrovano antitelo. Udruživanje antitelo-antigen je nadgledano tokom najviše 4 minuta, pri čemu je razdruživanje u puferskom sredstvu nadgledano tokm najviše 20 minuta. Konstante brzine kinetičkog udruživanja (ka) i razdruživanja (kd)su određene preradom i postavljanjem podataka u model vezivanja 1:1 upotrebom softvera za prilagođavanje krivulje Scrubber 2.0c softver za prilagođavanje krivulje Konstante ravnoteže (KD) razdruživanja vezivanja i poluživoti razdruživanja (t1/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ kai t1/2(min) = [In2/(60*kd)].
[0194] Kako je prikazano u Tabeli 3, na 25°C, sva 25 anti-GFRα3 antitela vezana na hGFRα3-mmh sa KDvrednostima u opsegu od 82,0 pM do 29,7 nM. Na 37°C, sva 25 anti-GFRα3 antitela vezana na hGFRα3-mmh sa KDvrednostima u opsegu od 118pM do 47.3nM. Kao što je prikazano u Tabeli 4, na 25°C, sva 23 anti-GFRα3 antitela vezana na MfGFRα3-mmh sa KDvrednostima u opsegu od 2,90 pM do 97,2 nM. Na 37°C, sva 23 anti-GFRα3 antitela vezana na MfGFRα3-mmh sa KDvrednostima u opsegu od 11,7 pM do 145 nM. Kao što je prikazano u Tabeli 5, na 25°C i 37°C, 6 od 23 anti-GFRα3 antitela su testirana za vezivanje na hGFRα3-hFc, dok su druga antitela testirana za vezivanje na 17 antitela za vezivanje hGFRα3-mFc. Na 25°C, 6 anti- GFRα3 antitela je testirano za vezivanje na hGFRα3-hFc vezano sa KDvrednostima u opsegu od 7,50pM do 220 pM. Na 37°C, 6 anti-GFRα3 antitela za vezivanje na hGFRα3-hFc je vezano sa KDvrednostima u opsegu od 41,3 pM do 531 pM. Na 25°C, 17 anti-GFRα3 antitela je testirano za vezivanje na hGFRα3-mFc vezano sa KDvrednostima u opsegu od 0,467 pM do 58,4 pM. Na 37°C, 17 anti-GFRα3 antitela je testirano za vezivanje na hGFRα3-mFc vezano sa KDvrednostima u opsegu od 13,2 pM do 106 pM.
Tabela 3: Kinetika hGFRα3-mmH vezivanja na različita anti-GFRα3 antitela na 25°C i na
37°C
Tabela 4: Kinetika MfGFRα3-mmH vezivanja na različita anti-GFRα3 antitela na 25°C i na 37°C
Tabela 5: Kinetika hGFRα3-hFc ili hGFRα3-mFc vezivanja na različita anti-GFRα3 antitela na 25°C i na 37°C
(nastavak)
Primer 4. Blokiranje humanog GFRα3 vezivanja na humani ARTEMIN putem anti-GFRα3 antitela
[0195] Sposobnost anti-GFRα3 antitela da blokiraju vezivanje humanog GFRα3 na humani ARTEMIN u prisustvu ili odsustvu koreceptora humanog RET je određena korišćenjem dva različita ELISA formata za blokiranje.
[0196] U prvom formatu, rekombinantni humani ARTEMIN protein sa C terminalnom mycmyc-heksahistidin oznakom (hAR- TEMIN-mmH; SEK ID:369) je obložen na 2 ug/ml u mikrotitarskim pločama sa 96 pregrada u PBS puferu tokom noći na 4°C i zatim je blokiran sa rastvorom od 0,5% (w/v) BSA. Konstantna količina humanog GFRα3 spojenog sa oznakom humanog Fc na C terminalu (hGFRα3-hFc; SEK ID:371) na 120 pM je prethodno mešana sa različitim količinama antitela, u opsegu od 0 do ∼10 nM u serijskim razblaženjima, posle čega je usledila inkubacija od 1 sata na sobnoj temperaturi (RT) da bi se omogućilo da vezivanje antitalo-hGFRα3-hFc dostigne ravnotežu. Uravnoteženi rastvori uzorka su zatim preneti na hARTEMIN-mmH-obloženu ploču. Posle 1 sat od vezivanja, ploča je oprana, zatim je vezani hGFRα3-hFc detektovan upotrebom HRP konjugovanog anti-humanog IgG Fc specifičnog antitela (Jackson Immunochemical, #109-035-098), i razvijeni su kolorimetrijski signali korišćenjem TMB HRP supstrata (BD Biosciences, #51-2606KC i #51-2607KC). Apsorpcija je zabeležena pri 450 nm na čitaču ploče Victor X5 (Perkin Elmer) da bi se odredila količina slobodnog hGFRα3-hFc u prethodno uravnoteženim hGFRα3-hFc- rastvorima antitela što je moglo da se veže na ploču obloženu sa hARTEMIN-mmH. IC50vrednosti, definisane kao koncentracija antitela neophodna da se smanji signal od konstantne koncentracije hGFRα3-hFc za 50%, su izračunate iz podataka korišćenjem Prism softvera sa GraphPad. Apsorpcija izmerena pri konstantnoj količini 120 pM hGFRα3-hFc u odsustvu anti-GFRα3 antitela je definisana kao 0% blokiranje i apsorpcija bez dodatog hGFRα3-hFc je definisana kao 100% blokiranje. Primećena apsorpcija u pregradama koje su sadržale najvišu koncentraciju antitela je korišćena da se izračuna maksimalni procenat blokiranja prikazan u tabeli. Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 6.
[0197] U drugom ELISA formatu, ploče, uzorci i podaci su prerađeni slično kao za prvi format izuzev što su i hARTEMIN-mmH i humani RET sa oznakom histidina 10 na C terminalu (hRET-10His; R&D Systems, # 1168-CR/CF) su obloženi za blokiranje ELISA eksperimenta. Mikrotitarske ploče sa 96 pregrada su obložene mešavinom 1,2 ug/ml hARTEMIN-mmH i 6,9 ug/ml hRET-10His proteina u PBS tokom noći na 4°C i zatim su blokirane sa rastvorom od 0,5% (w/v) BSA. Konstantna količina biotinilisanog humanog GFRα3 sa na C terminalu myc-myc-heksahistidin oznakom (biotin hGFRα3-mmH; SEK ID:370) na 1nM je prethodno pomešana sa različitim količinama anti-GFRα3 antitela, u opsegu od 0 do ∼100 nM u serijskim razblaženjima, posle čega je usledila inkubacija tokom 1 sat na RT da bi se omogućilo da vezivanje antitelo-biotin-hGFRα3-mmH dostigne ravnotežu. Uravnoteženi uzorci su zatim preneti na obloženu ploču. Posle 1 sat od vezivanja, ploča je oprana, zatim je vezani biotin-hGFRα3-mmH detektovan korišćenjem HRP konjugovanog streptavidina (Pierce, #N200), i kalorimetrijski signali su razvijeni korišćenjem TMB HRP supstrata. IC50vrednosti i maksimalno blokiranje svakog antitela su prikazani u Tabeli 6.
[0198] Kao što je prikazano u Tabeli 6, 9 od 23 anti-GFRα3 antitela je blokiralo 51-94% od hGFRα3-hFc vezivanja na obloženi hARTEMIN-mmH sa IC50vrednostima u opsezima od 43.8 pM do 723 pM u prvom ELISA formatu. Osam od 23 anti-GFRα3 antitela je prouzrokovalo da se signal hGFRα3-hFc vezivanja poveća ("pospešivač" u Tabeli 6) pri mnogim od viših testiranih koncentracija antitela u prvom ELISA formatu. Šest od 23 antitela testiranih u prvom ELISA formatu nije blokiralo ili pospešilo hGFRα3-hFc signal vezivanja na obloženi hARTEMIN-mmH. Kao što je prikazano u Tabeli 6, za drugi ELISA format, 17 od 23 anti-GFRα3 antitela je blokiralo 75-100% od biotin-hGFRα3-mmH vezivanja na dvostrukoobložen hARTEMIN-mmH i hRET-10His sa IC50vrednostima u opsegu od 403pM do 14.6nM. Takođe u drugom ELISA formatu, pet od 23 anti-GFRα3 antitela je prouzrokovalo da se signal biotin-hGFRα3-mmH vezivanja poveća na nižim koncentracijama antitela ali je blokiralo 28-95% od biotin-hGFRα3-mmH vezivanja na hARTEMIN-mmH i hRET-10His pri koncentracijama antitela 1nM i iznad ("pospešivač" u Tabeli 6). Jedno anti-GFRα3 antitelo je prouzrokovalo da se signal biotin-hGFRα3-mmH vezivanja poveća ("pospeši" u Tabeli 6) pri višim testiranim koncentracijama antitela, bez ikakvog blokiranja pri bilo kojoj koncentraciji, u drugom ELISA formatu.
Tabela 6: ELISA blokiranje humanog GFRα3 na humani ARTEMIN sam ili humani ARTEMIN i humani RET
Primer 5. Merenje sposobnosti Anti-GFRα3 antitela da blokiraju aktivaciju GFRα3 i RET putem ARTEMIN liganda in vitro
[0199] Sposobnost anti-GFRα3 antitela da blokiraju aktivaciju GFRα3 i RET putem njegovog ARTEMIN liganda in vitro je određena upotrebom ogleda na bazi ćelije. HEK293 ćelije su modifikovane da bi stabilno izrazile i humani GFRα3 (amino kiseline 1-400 sa pristupnim brojem NP_001487.2) i humani RET (amino kiseline 1-1072 sa pristupnim brojem NP_065681) su generisane i zatim su pretvorene sa reporterom luciferaze koji reaguje na SRE (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (HEK293/hGFRα3/hRET ćelije).
[0200] Dvadeset hiljada HEK293/hGFRα3/hRET/SRE-luc ćelija je zasejano u ploče sa 96 pregrada obložene Poly D-Lizinom (Greiner, #35-4620) u Optimem (GIBCO, #31985) koje sadrže 0,5% FBS i zatim su narastale tokom noći u 5% CO2na 37°C. Ćelije su zatim inkubirane tokom 1 sat na sobnoj temperaturi sa serijskim razblaženjima anti-GFRα3 antitela u opsegu od 5 pM do 300 nM. Konstantna doza (100pM) humanog ARTEMIN izraženog sa C terminal myc myc heksahistidin oznakom (SEK ID:369) je zatim dodata u ćelije i inkubirana tokom još 6 sati. Aktivnost luciferaze je izmerena kao jedince relativne svetlosti (RLU) na luminomeraču Victor (Perkin Elmer) posle dodavanja OneGlo reagensa (Promega, #E6051). EC50i IC50vrednosti su izračunate iz logističke jednačine preko krivulje odgovora od 12 tačaka upotrebom GraphPad Prism softvera za analizu podataka.
[0201] Dvadeset tri anti-GFRα3 antitela su testirana za njihovu spososbnost da inhibiraju od ARTEMIN-a zavisnu aktivaciju HEK293/hGFRα3/hRET/SRE-luc ćelija. Kao što je prikazano u Tabeli 7, sva od testiranih 23 antitela su blokirala aktivnost luciferaze sa IC50vrednostima u opsegu od 0,2 nM do 48,3 nM, i 19 od 23 antitela je blokirano na početnoj vrednosti u koncentraciji od 300 nM. Četiri od 23 antitela (H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, i H4H2354S-1) nije blokirano na početnoj vrednosti pri bilo kojoj od testiranih koncentracija antitela.
Tabela 7: Inhibicija od ARTEMIN-a zavisne stimulacije od HEK293/hGFRα3/hRET/SRE-luc ćelije putem anti-GFRα3 antitela
Primer 6. Inhibicija toplotne hiperalgezije kapsaicina senzitiziranog ARTEMIN-om
[0202] Da bi se kod miševa indukovala toplotna hiperalgezija senzitizirana ARTEMIN-om, svaki miš je prethodno tretiran intra-plantarnom injekcijom od 0,5 mikrograma mišjeg rekombinantnog ARTEMIN-a (R&D Systems, #1085-AR) 24 sata pre isporuke intraplantarnim ubrizgavanjem 0,5 mikrograma kapsaicina (podoptimalna doza) iz 100 mM rastvora u DMSO (Sigma- Aldrich, #M-2028). Toplotna hiperalgezija je procenjena korišćenjem Hargreaves’ testa, u kom je zrak svetlosti usmeren na ubrizganu šapu sve dok životinja ne povuče tu šapu. Ta sklonost da se povuče je zabeležena kao bihejvioralna mera nocicepcije. Toplotna hiperalgezija je neprekidno ARTEMIN-senzitizirana 3. dana posle isporuke kapsaicina na osnovu značajno smanjenih sklonosti povlačenja šape. Za ove studije, polazna vrednost za sklonost povlačenja je izmerena pre doziranja sa bilo ARTEMIN-om ili kapsaicinom posle čega je usledilo drugo merenje tri dana posle terapije kapsaicinom. Eksperimentator koji je izvodio ove je nije bio upoznat sa terapijskom grupom životinja.
[0203] Za sve eksperimente procena efikasnosti humanih anti-GFRα3 antitela u ARTEMIN-om senziteziranoj hiperalgeziji, homozigotnih odraslih miševa za ekspresiju humanog GFRα3 umesto mišjeg GFRα3 ("humanizovan GFRα3") su korišćeni. I muški i ženski miševi su korišćeni u svakom ogledu, sa uravnoteženim odnosom polova u terapijskim grupama (ukupno 8 miševa po terapijskoj ili kontrolnoj grupi). Humanizovani GFRα3 miševi su prethodno pregledani u utvrđeno je da imaju sklonost ka odgovorima toplotne hiperalgezije indukovane ARTEMIN-om sličnim onima koji su primećeni kod miševa divljeg tipa.
[0204] Šest anti-GFRα3 antitela (H4H2212N, H4H2243N2, H4H2292S, H4H2294S, H4H2342P, i H4H2352S-1) su testirani u tom modelu. Sva antitela su bila razblažena u fosfat-puferskom fiziološkom rastvoru (PBS) i bili su isporučeni potkožno i to 25 mg/kg u količini od 1 ml/100g telesne težine 24 sata pre ubrizgavanja ARTEMIN-a u zadnju šapu. U svakom eksperimentu, jedna grupa životinja je primila izotip kontrolno antitelo.
[0205] Osetljivost na bol za svaku terapijsku ili kontrolnu grupu je definisana kao procenat sklonosti povlačenja polazne vrednosti (%BWL), izračunato kao frakciona promena za sklonost povlačenja na bazi vremena kod svake životinje (WL) tri dana posle terapije kapsaicinom u poređenju sa sklonosti povlačenja početne vrednosti bez terapije kapsaicinom:
[0206] Upotreba %BWL, većih negativnih vrednosti označava veću toplotnu hiperalgeziju.
[0207] Tabela 8 pokazuje kratak pregled srednjih vrednosti grupe (slovima masnog tipa slova) i standardnu grešku srednjih vrednosti (kurzivnim slovima) za procenat sklonosti povlačenja polazne vrednosti (%BWL) na modelu toplotne hiperalgezije kapsaicina senzitizirane ARTEMIN-om tri dana posle ubrizgavanja.
[0208] Kao što je prikazano u Tabeli 8, miševi su lečeni sa anti-hGFRα3 antitelima i ispojavaju povećanje u %BWL (manje negativne ili pozitivne vrednosti) u poređenju sa miševima tretiranim sa izotip kontrolnim antitelom.. Četiri antitela, H4H2352S, H4H2243N2, H4H2294S, i H4H2342P su pospešila najveći otpor na termalnu hiperalgeziju preko svih izvedenih eksperimenata.
Tabela 8: Podaci su pregledno prikazani za ARTEMIN-senzitizirani model toplotne hiperalgezije na osnovu procene tri dana posle ubrizgavanja kapsaicina.
Primer 7. Testiranje anti-GFRα3 antitela za unakrsnu reaktivnost sa GFRα1 i GFRα2
[0209] Sposobnost anti-GFRα3 antitela da se vežu na GDNF familiju receptora je procenjena korišćenjem Octet Red biosenzora (Fortebio, Inc.). Antitela su testirana za vezivanje na bilo humani GFRα1 sa ekspresijom sa C terminalnom humanom Fc oznakm i heksahistidin oznakom (hGFRα1-hFc-6His, R&D Systems # 714-GR), humani GFRα1 je imao ekspresiju sa samo C terminalnom humanom Fc oznakom (hGFRα1-hFc; SEK ID: 376), humani GFRα2 sa ekspresijom sa C terminalnom humanom Fc oznakom i heksahistidin oznakom (hGFRα2-hFc-6His, R&D Systems #613-FR), humani GFRα3 je ekspresioniran sa C terminalnom humanom Fc oznakom (hGFRα3-hFc, SEK ID:371), ili irrelevantni humani Fc označen protein. Antigeni su registrovani na anti-human Fc vrhovima senzora od 10 ug/mL rastvora 5 minuta. Obložen vrhovi senzora su zatim blokirani sa 100 ug/mL rastvorom irelevantnih humanih Fc antitela tokom 5 minuta. Blokirani vrhovi senzora su zatim uronjeni u pregrade koje su sadžale 667uM svakog anti-GFRα3 antitela ili samog pufera tokom 10 minuta. Eksperiment je izveden na 25°C sa brzinom protoka od 1000 ob/min korišćenjem HBST+BSA puferskog rastvora (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% w/v Surfaktant P20, 0,1 mg/mL BSA, pH 7,4). Odgovor vezivanja (izmeren u jedinicama nm) pri svakom koraku eksperimenta je nadgledan i registrovan.
[0210] Svih šest testiranih anti-GFRα3 antitela je pokazalo vezivanje iznad 1,0 nm na hGFRα3-hFc protein, ali nije pokazalo nikakvo merljivo vezivanje na druge receptore GDNF familije ili na irelevantni humani Fc označen protein, kako je prikazano u Tabeli 9.
Tabela 9. Reaktivnost anti-GFRα3 antitela sa GFRα1, GFRα2 i GFRα3
Primer 8. Merenje sposobnosti anti-GFRa3 antitela da blokiraju
ARTEMIN stimulaciju u HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE-Luc bioogledu
[0211] Sposobnost anti-GFRα3 antitela da blokiraju aktivaciju makaki GFRα3 i makaki RET pomoću njegovog liganda ARTEMIN in vitro je određena korišćenjem ogleda na bazi ćelije. HEK293 ćelije modifikovane da stabilno izraze i makaki GFRα3 (MfGFRα3; SEK ID: 377) i makaki RET (MfRET; SEK ID: 378) su generisane i zatim pretvorene sa Cignal Lenti SRE Reporter (SA Biosciences, #CLS-010L) koji su izrazili gen luciferaze svitaca pod kontrolom minimalnog CMV promotera i tandem ponavljanja elementa odgovora seruma da se generiše HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE-Luc linija ćelije.
[0212] Za taj bioogled, 20,000 HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE-Luc ćelije su zasejane na ploče sa 96 pregrada obložene sa Poly D Lizine (Greiner, #35-4620) u Optimem (GIBCO, #31985) koji je obuhvatio 0,5% FBS i zatim je uzgajan tokom noći na 5% CO2na 37°C. Te ćelije su zatim inkubirane tokom 1 sat serijskim razblaženjima anti-GFRα3 antitela u opsegu od 5 pM do 300 nM. Konstantna doza (500pM) od humanog ARTEMIN izraženog sa C terminalnom myc-myc-heksahistidin oznakom (Human ARTEMIN-MMH; SEK ID: 369) je zatim dodata u ćelije i inkubirana tokom dodatnih 6 sati. Da bi se odredila EC50vrednost humanog ARTEMIN-MMH sa krivulja odgovora na dozu, serijska razblaženja humanog ARTEMIN-MMH u opsegu od 0,5 pM do 10nM su dodata u ćelije bez antitela i inkubirana tokom 6 sati na 37°C. Aktivnost luciferaze je izmerena kao relativna jedinica svetlosti (RLU) na luminometru Viktor (Perkin Elmer) posle dodavanja OneGlo reagensa (Promega, #E6051). EC50i IC50vrednosti su izračunate iz logističke jednačine sa četiri parametra preko krivulje sa odgovorom od 12-tačaka korišćenjem softvera za analizu podataka GraphPad Prism.
[0213] Šest anti-GFRα3 antitela su testirana za njihovu sposobnost da suzbiju od ARTEMIN-a zavisnu aktivaciju HEK293/MfGFRα3/MfRET/SRE-luc ćelija. Kao što je prikazano u Tabeli 10, svih šest antitela je testirano potpuno su blokirali aktivnost luciferaze sa IC50vrednostima u opsegu od 0,7 nM do 2,5 nM. Humani ARTEMIN-MMH je stimulisao aktivnost luciferaze zavisne od SRE u HEK293/mfGFRα3/mfRet/SRE-LUC liniji ćelije sa EC50vrednošću od 70 pM.
Tabela 10: Inhibicija stimulacije zavisne od ARTEMIN-a za HEK293/MfGFRα3/MfRET/
SRE-luc ćelije anti- GFRα3 antitelima
Primer 9. Generisane Bi-specifičnog Anti-GFRα3 antitela
[0214] Različita bispecifična antitela su generisana za upotrebu za praktičnu primenu ovde opisanih postupaka. Na primer, GFRα3-specifična antitela su generisana u bi-specifičnom formatu ( "bi-specifično") u kom su promenljivi regioni koji se vezuju na distinktivne epitope na GFRα3 su povezani zajedno da bi dali dvostruku specifičnost epitopa unutar jednog molekula vezivanja. Prikladno projektovani bispecifični oblici mogu da povećaju ukupnu GFRα3 efikasnost blokiranja kroz povećanje i GFRα3 specifičnosti i avidnosti vezivanja. Promenljivi regioni sa specifičnošću za pojedinačne različite epitope unutar bilo kog od tri cisteinska ponavljanja ili koji mogu da se vežu na različite regione unutar jednog epitopa od bilo kog od tri cisteinska ponavljanja su upareni na strukturnoj skeli koja dozvoljava da se svaki promenljivi region veže istovremeno na odvojene epitope, ili na različite regione unutar jednog epitopa. u jednom primeru za bispecifične, promenljive regione teškog lanca (VH) iz vezivača sa specifičnošću za jedan epitop unutar jednog cisteinskog ponavljanja su rekombinovani sa promenljivim regionima lakog lanca (VL) iz serije vezivača koji imaju specifičnost za drugi epitop unutar bilo kog od druga dva cisteinska ponavljanja da bi se identifikovali nekognitivni VLpartneri koje je moguće upariti sa originalnim VHbez ometanja originalne specifičnosti za VH. Na ovaj način, pojedinačni VLsegment (npr., VL1) je moguće kombinovati sa dva različita VHdomena (npr., VH1 i VH2) da se generriše bispecifični koji obuhvata dva vezujuća "kraka" (VH1- VL1 i VH2- VL1). Upotreba pojedinačnog VLsegmenta smanjuje složenost sistema i time pojednostavljuje i povećava efikasnost za kloniranje, ekspresiju, i procese prečišćavanja korišćene da generiše bispecifični (Videti, na primer, USSN13/022759 i US2010/0331527).
[0215] Alternativno, antitela koja se vezuju i na GFRα3 i drugi cilji, kao što je, ali ne i ograničeno na, na primer, RET moguće je dobiti u bispecifičnom formatu koršćenjem ovde opisanih tehnika, ili drugih tehnika poznatih stručnjaku u ovoj oblasti. Vezivanje promenljivih regiona antitela na distinktivne GFRα3 regione koji su vanćelijski izloženi su povezani zajedno sa promenljivim regionima koji se vezuju na relevantna mesta na, na primer, ligand, artemin, druge GFRα receptore, ili na RET, da bi dali dvostruku specifičnost antigena unutar jednog vezujućeg molekula. Promenljivi regioni sa specifičnošću za individualne epitope GFRα3, se kombinuju sa promenljivim regionom sa specifičnošću za, na primer, artemin i uparuju se na strukturnoj skeli koja omogućava da se svaki promenljivi region veže na odvojene antigene.
[0216] Bispecifični vezivači se testiraju za vezivanje i funkcionalno blokiranje ciljnih antigena, na primer, GFRα3 i/ili artemin, druge GFRα receptore, ili RET, u bilo kom od gore opisanih ogleda za antitela. Na primer, standardni postupci za merenje vezivanja rastvorljivog proteina se koriste da bi se procenila bispecifična interakcija sa njegovim antigenom(ima), kao što je Biacore, ELISA, ekskluziona hromatografija prema veličini, raspršivanje svetlosti višeugaonim laserom, direktna skenirajuća kalorimetrija, i drugim postupcima. Vezivanje bispecifičnih antitela na ćelije koje izražavaju GFRα3 je određeno kroz protočnu citometriju prepoznavanja ciljnog antigena na ćelijama korišćenjem fluorescentno označenog sekundarnog antitela. Eksperimenti vezivanja sa peptidima mogu takođe da budu izbedeni korišćenjem eksperimenata sa rezonancom površinskog plazmona, kod kojih se interakcija vezivanja u realnom vremenu peptida na antitelo meri propuštanjem peptida ili bispecifika preko površine senzora na kojoj se registruje bispecifik ili peptid, prema opisanom redosledu. Funkcionalno in vitro blokiranje GFRα3 receptora bispecifično se određuje korišćenjem bilo kog bioogleda kao što je taj koji je ovde opisan, ili putem in vivo određivanja reakcije prema bolu na odgovarajućim modelima životinje, kao što su oni koji su ovde opisani. Funkcionalno in vitro blokiranje GFRα3 ili njegov ligand, artemin, bispecifik se određuje korišćenjem bilo kog bioogleda kao što su oni koji su opisani u WO2010/077854, ili u US2010/0166768, ili putem in vivo određivanja hipersenzitivnosti na toplotne stimulanse na odgovarajućim modelima životinje, kao što su oni koji su ovde opisani.
Primer 10. Afiniteti vezivanja izvedeni iz rezonance površinskog plazmona i kinetičke konstante monoklonalnih antimišjih GFRα3 antitela
[0217] Konstante brzine udružujućeg i razdružujućeg vezivanja (kai kd, prema opisanom redosledu) i izračunate konstante ravnoteže razdruživanja i poluživoti razdruživanja (KDi t1/2, prema opisanom redosledu) za vezivanje antigena na antimišja GFRα3 antitela su ispitani korišćenjem biosenzora rezonance površinskog plazmona u stvarnom vremenu (Biacore 3000) ogled na 25°C. Antitela su testirana za vezivanje na mišji GFRα3 izraženo sa myc-myc-heksahistidin oznakom (mGFRα3-MMH; SEK ID: 379,). Anti-mišja GFRα3 antitela su registrovana na površini kozjeg anti-mišjeg IgG poliklonalnog antitela (GE Healthcare, # BR- 1008-38) stvoreno kroz direktno spajanje amina na čip senzora Biacore CM5. Kinetički eksperimenti su izvedeni korišćenjem HBS-EP (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0,05% Surfaktant P20, pri vrednosti pH 7,4) kao i radno pufersko sredstvo i uzorak puferskog sredstva. Vezivanje na mišji GFRα3-MMH je procenjeno ubrizgavanjem nekoliko koncentracija u opsezima od 100nM do 6,25 nM (2-strukim razblaženjima) preko registrovane površine antitela. Združivanje antitela i antigena je nadgledano tokom najviše 5 minuta, pri čemu je razdruživanje u puferskom sredstvu nadgledano tokom najviše 10 minuta. Konstante brzine kinetičkog udruživanja (ka) i razdruživanja (kd) su određene preradom i ugradnjom podataka u 1:1 model vezivanja korišćenjem Scrubber 2.0c softvera koji odgovara krivulji. Izračunate su konstante ravnoteže razdruživanja vezivanja (KD) i poluživot razdruživanja (t1/2) iz kinetičkih konstanti brzine kao: KD(M) = kd/ kai t1/2(min) = [In2/(60*kd)].
[0218] Kako je prikazano u Tabeli 11, dva testirana anti-mišja GFRα3 antitela, M1M6986N i M1M6977N, su vezani na mGFRα3-MMH na 25°C sa KDvrednostima od 23.1pM i 107pM, prema opisanom redosledu.
Tabela 11: Kinetika mGFRα3-MMH vezivanja na različita anti-mišja GFRα3 antitela na
25°C
Primer 11. Mišji GFRα3 da blokira ELISA
[0219] Sposobnost anti-mišjih GFRα3 antitela da blokiraju vezivanje mišjeg GFRα3 na mišji ARTEMIN u prisustvu ili odsustvu koreceptora mišjeg RET je određeno korišćenjem dva različita formata blokiranja za ELISA. Kod prvog formata, rekombinantni mišji ARTEMIN (R&D kat# 1085-AR/CF) protein je obložen na 2 ug/mL (166nM) u mikrotitarskim pločama od 96 pregrada u PBS puferu tokom noći na 4°C i zatim je blokiran sa rastvorom od 0,5% (w/v) BSA. Konstantna količina (3.5nM) biotinilisanog mišjeg GFRα3 sa C-terminalnom myc-myc-heksahistidin oznakom (Biotin-mGFRh3-MMH, SEK ID:379) je bila prethodno umešana sa različitim količinama antitela, u opsezima od 100nM do 1.6 pM u serijskim razblaženjima, posle čega je usledila inkubacija u trajanju od 1 sat na sobnoj temperaturi (RT) da bi se dozvolilo da vezivanje antitelo-biotin-mGFRα3-MMH dostigne ravnotežu. Uravnoteženi rastvori uzorka su zatim preneti na ploču obloženu mARTEMIN-om. Posle 1 sat od vezivanja, ploča je oprana, zatim je vezani biotin-mGFRα3-MMH detektovan korišćenjem Streptavidin-HRP (Pierce, #N200) i kolorimetrijski signali su razvijeni korišćenjem TMB HRP supstrata (BD Biosciences, #51-2606KC i #51-2607KC). Apsorpcija je registrovana pri 450 nm na Victor X5 čitaču ploče (Perkin Elmer) da bi se odredila količina slobodnog biotin-mGFRα3-MMH u prethodno uravnoteženim rastvorima biotin-mGFRα3-MMH-antitela koja je mogla da se veže na ploču obloženu mARTEMIN. IC50Vrednosti IC50, definisane kao koncentracija antitela neophodna da se smanji signal od konstantne koncentracije biotin-mGFRα3-MMH za 50%, su izračunate iz podataka korišćenjem softvera Prism softvera iz GraphPad. Apsorpcija je izmerena pri konstantnoj količini od biotin-mGFRα3-MMH u odsustvu anti-mišjeg GFRα3 antitela je definisana kao 0% blokiranja i apsorpcija bez dodatog biotin-mGFRα3-MMH je definisana kao 100% blokiranje. Primećena apsorpcja u preradama koje su sadržale najvišu koncentraciju antitela je korišćena da bi se izračunao maksimalni procenat blokiranja prikazan u tabeli. Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 12.
[0220] U drugom formatu ELISA, ploče, uzorci i podaci su prerađeni slično kao za prvi format izuzev što su i mišji RET izrađen sa oznakama i C-terminalnom hFc, i heksahistidin oznaka (mRET-hFc-6His; R&D cat# 482-RT/CF) i mARTEMIN (R&D kat# 1085-AR/CF) obloženi za blokiranje ELISA eksperimenta. Mikrotitarske ploče sa 96 pregrada su obložene mešavinom 1,2 ug/mL (100nM) mARTEMIN i 9,5 ug/mL (100nM) mRET-hFc-6His proteina u PBS tokom noći na 4°C i zatim su blokirani sa rastvorom od 0,5% (w/v) BSA. Konstantna količina (350 pM) od biotin-mGFRα3-MMH je prethodno pomešana sa različitim količinama anti-mišjih GFRα3 antitela, u opsegu od 100 nM do 1.6pM u serijskim razblaženjima, posle čega je usledila inkubacija od 1 sata na RT da bi se omogućilo da vezivanje antitelo- biotin-mGFRα3-MMH dostigne ravnotežu. Uravnoteženi uzorci su zatim preneti na obloženu ploču. Posle 1 sat od vezivanja, ploča je oprana, zatim je vezan biotinmGFRα3-MMH detektovan korišćenjem HRP konjugovanog streptavidina i kolorimetrijski signali su razvijeni korišćenjem TMB HRP supstrata. IC50vrednosti i maksimalno blokiranje svakog antitela su prikazani u Tabeli 12.
[0221] Kao što je prikazano u Tabeli 12, samo jedno anti-mišje GFRα3 antitelo je testirano, M1M6986N, je pokazalo sposobnost da blokira biotin-mGFRα3-MMH od vezivanja na obloženu mARTEMIN ploču sa IC50vrednošću od 69,1 pM. Drugo anti-mišje GFRα3 antitelo je testirano, M1M6977N, nije pokazalo nikakvu merljivu blokadu u ovom formatu ELISA. Oba testirana anti-mišja GFRα3 antitela, M1M6986N i M1M6977N, su pokazala sposobnost da potpuno blokiraju biotin- mGFRα3-MMH od vezivanja na ploče obložene i sa mARTEMIN i mRET-hFc-6His, sa IC50vrednostima od 47,2 pM i 366pM, prema opisanom redosledu.
Tabela 12: ELISA blokiranje mišjeg GFRα3 na mišji ARTEMIN sam,
ili mišji ARTEMIN i mišji RET
Primer 12. Na ćeliji zasnovan bioogled luciferaze
[0222] Sposobnost anti-mišjih GFRα3 antitela da blokiraju aktivaciju mišjeg GFRα3 i mišjeg RET pomoću njegovog liganda mišjeg ARTEMIN in vitro je određena krišćenjem ogleda na bazi ćelije. HEK293 ćelije su modifikovane da stabilno izražavaju i mišje GFRα3 (amino kiseline 1-397 iz pristupnog broja AAH66202.1) i mišji RET (amino kiseline 1-1115 iz pristupnog broja NP_033076.2) su generisane i zatim su pretvorene sa reporterom luciferaze koji reaguje na SRE (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (293/mGFRα3/mRET/SRE-luc ćelije).
[0223] Dvadeset hiljada 293/mGFRα3/mRET/SRE-luc ćelija je zasejano u Poly D-Lizinom obložene ploče sa 96 pregrada (Greiner, #35-4620) u Optimem (GIBCO, #31985) koji obuhvata 0,5% FBS i zatim su rasle tokom noći u 5% CO2na 37°C. Ćelije su zatim inkubirane tokom 1 sat na sobnoj temperaturi sa serijskim razblaženjima anti-mišjih GFRα3 antitela u opsegu od 3 nM do 44 nM. Konstantna doza (100 pM) mišjeg ARTEMIN (R&D, # 1085-AR/CF) je zatim dodata u ćelije i inkubirana tokom dodatnih 6 sati. Aktivnost luciferaze je izmerena kao relativne jedinice svetlosti (RLU) na Victor luminomeraču (Perkin Elmer) posle dodavanja OneGlo reagensa (Promega, #E6051). EC50i IC50vrednosti su izračunate iz logističke jednačine sa četiri parametra preko krivulje odgovora od 12-tačaka korišćenjem softvera za analizu podataka GraphPad Prism.
[0224] Kao što je prikazano u Tabeli 13, oba anti-mišja GFRα3 antitela su testirana, M1M6986N i M1M6977N pokazala su sposobnost da suzbiju mišju od ARTEMIN-a zavisnu stimulaciju 293/mGFRα3/mRET/SRE-luc ćelija sa IC50vrednostima od približno 44nM i 3nM, prema opisanom redosledu.
Tabela 13: Inhibicija od ARTEMIN-a zavisne stimulacije 293/mGFR�3/mRET/SRE-luc ćelija pomoću antimišjih GFRα3 antitel
Primeri 13, 14 i 15: Dejstvo anti-mišjih GFRα3 antitela na modelima životinja za bol usled kancera kosti i osteoartritisni bol
[0225] Ovde opisana antitela imaju humana antitela visokog afiniteta na sa GPI-povezan alfa receptor za artemin, GFRα3. Kako ova antitela na humanom GFRα3 ne reaguju između vrsta sa mišjim GFRα3, in vivo ogledi sa ovim antitelima mogu samo da budu izvedeni na miševima koji su genetski promenjeni da bi zamenili sekvencu mišjeg GFRα3 sa sekvencom humanog GFRα3. Početni in vivo eksperimenti na ovim GFRα3<hu/hu>miševima korišćenjem farmakološke inhibicije arteminom senzitiziranog kapsaicina je otkrilo efikasnot četiri humana antitela u ovom in vivo ogledu. Da bi se ekspeditovalo generisanje podataka o efikasnosti, mišja GFRα3 antitela su generisana da bi služila kao surogati na humanim antitelima. Miševi izmešanog C57BL6/129Sv soja koji su homozigotni za brisanje endogenog GFRα3 gena su imunizovani sa rekombinantnim mišjim GFRα3 vanćelijskim domenom izraženim u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHOC). Specifični odgovor imunog sistema na GFRα3 je potvrđen imunoogledima seruma iz imunizovanih miševa. Prikupljene su jetre iz miševa koji su ispoljavali visok specifičan odgovor imunog sistema, i ćelije hibridoma koje proizvode antitelo su generisane fuzijom izolovanh splenocita sa ćelijama mišjeg mijeloma posle standardnih postupaka hibridoma. Supernatanti hibridoma su dalje pretraživani u imunoogledima za vezivanje na GFRα3 i za njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje GFRα3 na bilo artemin ili artemin/Ret obložen na čvrstu površinu u formatu imunoogleda. Supernatanti su takođe pregledani za njihovu sposobnost da blokiraju arteminsku stimulaciju putanje GFRα3/Ret koreceptora u ogledima zasnovanim na ćeliji. Sekvence antitela promenljivog regiona su dibijene pomoću PCR pojačavanja izabranih hibridoma izabranih klonova hibridoma čiji su proteini antitela ispojili jako blokiranje u ogledu na bazi ćelije, i ove sekvence su korišćene da se proizvede rekombinantno anti-mišje GFRα3 antitela pune dužine sa mišjim IgG1 izotipom. Dva antitela su izabrana za in vivo testiranje koje je jako suzbilo arteminsko signaliziranje u ogledu zasnovanom na ćeliji. Kod in vitro imunoogleda vezivanja, antitelo M1M6986N je blokiralo vezivanje GFRα3 na artemin ili artemin/Ret obložen na čvrstu površinu i pominje se ovde kao direktan blokator. Antitelo M1M6977N je blokiralo vezivanje GFRα3 na obloženi artemin/Ret ali ne na artemin sam u in vitro imunoogledu i pominje se ovde kao direktan blokator. Ova dva mišja antitela, M1M6986N i M1M6977N, su izabrana za testiranje u modelu toplotne analgezije arteminom senzitiziranog kapsaicina (opisano u Primeru 6), kako su ova dva antitela pokazala slične profile vezivanja i blokiranja na efikasna humana antitela. Ova dva antitela su pregledana za njihovu sposobnost da blokiraju senzitizaciju indukovanu arteminom hiperalgezije in vivo kod miševa divljeg tipa. Slično njihovim humanim odgovarajućim delovima, oba antitela su značajno suzbila arteminom senzitizirano dejstvo na toplotnu hiperalgeziju kapsaicina tri dana posle ubrizgavanja kapsaicina (Slika 1).
Primer 13: Model fibrosarkoma metodologije sa bolom usled kancera kosti
Subjekti
[0226] Odrasli mužjaci miševa na C57BI6 soju pozadine su korišćeni za dva eksperimenta fibrosarkoma u približno 12 nedelja starosti. Eksperimenti su merili podatke ishoda za ovaj eksperiment su bili slepi za terapijsku grupu životinja kroz prikupljanje podataka, kompilaciju, i analizu.
Model kancera kosti
[0227] Da bi se indukovao bol kancera kosti, miševi su anestezirani i zatim je ubrizgano u butnu kost 1,0x10<6>MC57G ćelija fibrosarkoma. Ove ćelije su izvedene iz linije tumora fibrosarkoma miša C57BI/6. Tumori su obično rasli agresivno na ovom modelu, tako da je očigledno uništenje kosti 14 dana posle implantacije tumora. Radiografije su uzete 7, i 10, i 14 dana posle implantacije da bi se verifikovao rast tumora i uništenje kosti. Uništenje kosti je ocenjeno na skali od tri tačke tako da je 0 predstavljalo izostanak uništenja i 3 je predstavljalo potpuno uništenje butne kosti u regionu tumora.
Terapija antitela
[0228] Svaka životinja je primila 30 mg/kg s.c. injekcije antitela isporučene dan pre implantiranja ćelije kancera i ponovo 7. dana. Životinje su pseudo-nasumično raspoređene u jednu od dve ili tri terapijske grupe: 1) M2M180N izotip (negativno) kontrolno antitelo u dva odvojena eksperimenta, 2) M1M6977N anti-mišje GFRα3 anitelo u dva odvojena eksperimenta ili 3) M1M6986N anti-mišje GFRα3 antitelo samo u drugom eksperimentu. M1M6986 blokira inteakciju artemina sa GFRα3, i samim tim se smatra "direktnim" blokatorom aktivnosti artemina. Nasuprot tome, M1M6977N inhibira aktivnost artemina kroz GFRα3/RET kompleks, i samim tim se smatra "indirektnim" inhibitorom.
Mere nocicepcije
[0229] Nociceptivni odgovori na tumor kosti su izmereni korišćenjem von Frey Hair testa za izazvanu mehaničku (taktilnu) alodiniju, test dimačkog opterećenja težinom (DWB) za spremnost da se nosi težina na udu, i zaštitničko ponašanje. Rezultati Von Frey testa su izraženi kao grami pritiska neophodnog za povlačenje šape. Rezultati nošenja težine su izraženi kao procenat telesne težine postavljen na ipsilateralni ud. Zaštitničko ponašanje je izraženo kao vreme provedeno u zaštiti, ili poštedi, uda tokom dvominutnog perioda.
Rezultati
Razgradnja ili unišenje kosti
[0230] Nije bilo značajnog dejstva terapije antitela na ocenu razgradnje kosti u bilo eksperimentu koji nagoveštava da lečenje antitela nije imalo uticaja na ozbiljnost samog kancera kosti (podaci nisu prikazani).
Nociceptivno ponašanje
[0231] Bilo je statistički značajno smanjenje u taktilnoj alodiniji sa terapijom GFRα3 antitela posle ubrizgavanja fibrosarkoma u prvom eksperimentu (F(1,20)=9,189, p=0,007, Slika 2A) i statistička tendencija prema efikasnosti u celini u drugom eksperimentu (F(2,29)=3,069, p<0,062, Slika 2B), sa pojedinačnim poređenjima ponekad dostižu značaj u drugoj studiji (Slika 2B).
[0232] Nije bilo statistički značajnog dejstva GFRα3 antitela na dinamičko opterećenje težinom na ipsilateralni ud izmereno 14 dana posle implantacije kosti sa ćelijama fibrosarkoma u bilo kom eksperimentu, iako je prvi eksperiment otkrio statističku tendenciju prema efikasnosti sa M1M6977N terapijom (t(10)=2,047, p=0,068, Slika 3A; F(2,28)=1,598, p=0,220, Slika 3B).
[0233] GFRα3 antitela su značajno smanjila zaštitu uda posle implantacije kancera kosti u oba eksperimenta sa fibrosarkomom (F(1,20)=12,270, p=0,002, Slika 4A; F(2,29)=3,576, p=0,041, Slika 4B).
Zaključak
[0234] Lečenje sa antimišjim GFRα3 antitelima je značajno smanjilo nociceptivna ponašanja na ovom modelu bola usled kancera kosti kako je izmereno procenom zaštite i von Frey testom za taktilnu alodiniju. Pored toga, statistička tendencija prema efikasnosti M1M6977N antitela za različito opterećenje težinom u jednom eksperimentu. Ocene razgradnje kosti nisu bile različite u grupama koje su primale anti-mišja GFRα3 antitela, nagoveštavaju da razlike u merenjima povezanim sa bolom nisu mogle biti uzete u obzir za razlike u ozbiljnosti kancera. Samim naši podaci nagoveštavaju da bi neutralisanje antitela protiv GFRα3 moglo biti efikasno protiv bola kanera kosti. Zato što su ćelije sarkoma češći primarni tumori nego metastaze u kosti, i zato što se većina kancera kosti izvodi iz metastaza primarnih tumora iz drugih mesta, ova antitela su takođe testirana na modelu bola kancera kosti indukovanog iz karcinoma dojke (mlečne žlede). Tumori dojke i prostate su među najčešćim tumorima na koje se nailazi da metastaziraju na kosti.
Primer 14: Model karcinoma dojke metodologije bola kancera kosti
Subjekti
[0235] Odrasli muški miševi na soju Balb/c pozadine su korišćeni za eksperiment kancera kosti karcinoma dojke u približno 12 nedelja starosti. Eksperimenti su merili podatke ishoda za ovaj eksperiment su bili slepi za terapijsku grupu životinja kroz prikupljanje podataka, kompilaciju, i analizu.
Model kancera kosti
[0236] Da bi se indukovao bol kancera kosti, miševi su anestezirani i zatim im je ubrizgano u butnu kost 10.0004T-1 ćelija karcinoma dojke. Ove ćelije su izvedene iz Balb/c linija tumora karcinoma dojke. Tumori obično rastu agresivno na ovom modelu, tako da su tumori ozbiljni i to već 18 dana posle implantacije. Radiografi su napravljeni 10, 14, i 19 dana posle implantacije da bi se verifikovao rast tumora i razgradnja kosti. Uništenje kosti je ocenjeno na skali od tri tačke tako da je 0 predstavljalo izostanak uništenja i 3 je predstavljalo potpuno uništenje butne kosti u regionu tumora.
Terapija antitelom
[0237] Svaka životinja je primila 30 mg/kg s.c. injekcija antitela isporučenih dan pre implantacije ćelije i dva puta nedeljno posle. Životinje su pseudo-nasumično raspoređene u jednu od tri terapijske grupe: 1) M2M180N izotip (negativno) kontrolno antitelo, 2) M1M6977N anti-mišje GFRα3 antitelo, ili 3) M1M6986N anti-mišje GFRα3 antitelo. M1M6986N blokira interakciju artemina sa GFRα3, i samim tim se smatra "direktnim" blokatorom aktivnosti artemina. Nasuprot tome, M1M6977N inhibira aktivnost artemina kroz GFRα3/RET kompleks, i samim tim se smatra "indirektnim" inhibitorom.
[0238] Nociceptivni odgovori na tumor kosti su izmereni korišćenjem von Frey Hair testa za izazvanu mehaničku (taktilnu) alodiniju, test dinamičkog optrerećenja težinom (DWB) za spremnost da se nosi težina na udu, i zaštitničko ponašanje. Rezultati Von Frey testa su izraženi kao grami pritiska neophodnog za povlačenje šape. Rezultati nošenja težine su izraženi kao procenat telesne težine postavljen na ipsilateralni ud. Zaštitničko ponašanje je izraženo kao vreme provedeno u zaštiti, ili poštedi, uda tokom dvominutnog perioda.
Rezultati
Razgradnja ili unišenje kosti
[0239] Nije bilo značajnog dejstva terapije antitela na ocenu razgradnje kosti kada je reč o ovom modelu, što nagoveštava da lečenje antitela nije imalo uticaja na ozbiljnost samog kancera kosti.
Nociceptivno ponašanje
[0240] Postojalo je statistički značajno smanjenje u taktilnoj alodiniji sa terapijom GFRα3 antitelom posle karcinoma (F(2, 25)=8,626, p=0,001, Slika 5).
[0241] Nije bilo statistički značajnih ukupnih efekata GFRα3 antitela na dinamičko opterećenje težine na ipsilateralni ud, iako je ukupno dejstvo terapije dostiglo statističku tendenciju i M1M6977N dostiglo je značajnu efikasnost na post hoc poređenje 11 dana (A), ali ne 18 dana (B), posle implantacije ćelija karcinoma u kost (11 dana F(2,25)=2.939, p=0,071, Slika 6A; 18 dan F(2,25)=0,149, p=0,862, Slika 6B).
[0242] GFRα3 antitela su značajno smanjila zaštitu uda posle implantacije kancera kosti na ovom modelu (F(2,25)=4,222, p=0,026, Slika 7).
Zaključak
[0243] Terapija sa anti-mišjim GFRα3 antitelima je značajno smanjila nociceptivno ponašanje kod ovog modela bola kancera kosti kako je izmereno procenom zaštitničkog ponašanja i von Frey testom taktilne alodinije. Pored toga, postojao je dokaz o efikasnosti REGN1967 antitela za razliku opterećenja težinom u jednoj vremenskoj tački. Ocene razgradnje kosti nisu bile različite u grupama koje su primale anti-mišja GFRα3 antitela, što je nagoveštavalo da razlike u merenjima povezanim sa bolom nisu mogle biti uzete u obzir zbog razlika u ozbiljnosti kancera. Samim tim, naši podaci nagoveštavaju da bi neutralizujuća antitela protiv GFRα3 mogla biti efikasna protiv bola kancera kosti na ovom modelu bola metastaziranog kancera kosti.
Primer 15. Destabilizacija na modelu medijalnog meniskusa (DMM) metodologije osteoartritisnog bola
Subjekti
[0244] Odrasli mužjaci miševa na C57BI6 soju pozadine su korišćeni za DMM eksperiment počevši od približno 12 nedelja starosti. Eksperimenti merenja podataka ishoda za ovaj eksperiment su bili slepi za terapijsku grupu životinja kroz prikupljanje podataka, kompilaciju, i analizu.
Model destabilizacije medijalnog meniskusa (DMM)
[0245] Na modelu destabilizacije medijalnog meniskusa (DMM), medijalni meniskus kolena je destabilizovan i životinji je dato 16 nedelja da razvije bolest. Tokom perioda od 16 nedelja, životinje razvijaju taktilnu alodiniju i povećavaju zapreminu kosti i sadržaj minerala u kosti u povređenom kolenu što liči na rani stadijum osteoartritisa kod ljudi. Taktilna alodinija je verifikovana kod životinja von Frey testom i to 16 nedelja pre započinjanja terapije antitelom.
Terapija antitela
[0246] Svaka životinja je primila 30 mg/kg s.c. injekcije antitela nedeljno počevši od 16 nedelja posle hirurškog zahvata destabilizacije medijalnog meniskusa (DMM). Životinje su pseudo-nasumično raspoređene u jednu od tri terapijske grupe: 1) M2M180N izotip (negativno) kontrolno antitelo, 2) M1M6977N anti-mišje GFRα3 antitelo, ili 3) M1M6986N anti-mišje GFRα3 antitelo. M1M6986N blokira inteakciju artemina sa GFRα3, i samim tim se smatra "direktnim" blokatorom aktivnosti artemina. Nasuprot tome, M1M6977N inhibira aktivnost artemina kroz GFRα3/RET kompleks, i samim tim se smatra "indirektnim" inhibitorom.
[0247] Nociceptivni odgovori na patologiju kolena su izmereni korišćenjem von Frey Hair testa za izazvanu mehaničku (taktilnu) alodiniju.
Rezultati
Nociceptivno ponašanje
[0248] Bilo je statistički značajno smanjenje taktilne alodinije sa terapijom GFRα3 antitelom posle DMM (F(2, 27)=21,68, p=0,0001, Slika 8).
Zaključak
[0249] Terapija sa mišjim GFRα3 antitelima je imala statistički značajno dejstvo na taktilnu alodiniju tako da su grupe tretirane sa dva GFRα3 antitela je dosledno pokazala manju alodinju nego izotipna kontrola počevši od 14 dana posle započinjanja nedeljne terapije. Ovi podaci nagoveštavaju mogućnost da će GFRα3 antitela biti efikasna protiv hroničnog osteoartritičnog bola kod ljudi.
Primer 16. Analiza takmičenja između različitih vrsta za anti-GFRα3 antitela
[0250] Ogled takmičenja između vrsta je sproveden da bi se procenila sposobnost odabranih antitela da se takmiče jedna sa drugim za vezivanje na humani GFRα3 korišćenjem Octet RED384 biosenzora (Fortebio Inc.). Ceo eksperiment je izveden na 25°C sa brzinom protoka od 1000 ob/min u puferskom sredstvu Octet HBST (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v Surfaktant P20, 0,1 mg/mL BSA). Da bi se procenilo da li su 2 antitela mogla da se takmiče jedno sa drugim za vezivanje na za njih odgovarajuće epitope na biotinilisanom humanom GFRα3 izraženim sa C-terminalnom myc-myc-heksahistidinskom oznakom (biotin-hGFRα3-mmH; SEK ID:370), oko ∼1,2 nm od biotin-hGFRα3-mmH je prvo registrovano na streptavidinom obloženim vrhovima senzora Octet (Fortebio Inc, # 18-5019) potapanjem vrhova na 1 minut u 10 µg/mL rastvora biotin-hGFRα3-mmH. Vrhovi senzora obloženi antigenom su zatim postavljeni u pregrade koje su sadržale 25 µg/mL rastvora prvog anti-GFRα3 monoklonalnog antitela tokom 4 minuta do zasićenja biotin-hGFRα3-mmH površine. Vrhovi senzora su zatim naknadno uronjeni u pregrade koje su sadržale 25 µg/mL rastvora drugog anti-GFRα3 monoklonalnog antitela. Vrhovi senzora su zatim oprani u puferskom sredstvu Octet HBST između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u stvarnom vremenu je nadgledan tokom eksperimenta i odgovor vezivanja na kraju svakog koraka je registrovan kako je prikazano na Slici 9. Odgovor mAb-2 vezivanja na biotin-hGFRα3-mmH prethodno kompeksiran sa prvim antiteom je upoređen i određeno je konkuretno/nekonkurentno ponašanje različitih anti-GFRα3 monoklonalnih antitela.
[0251] Kao što je prikazano na Slici 9, tamne sive kutije sa crnim slovima predstavljaju odgovor vezivanja za samo-takmičenje. Antitela se takmiče u oba smera, nezavisno od redosleda vezivanja predstavljaju se sa crnim kutijama i belim slovima. Nepostojanje takmičenja između antitela koje nagoveštava distinktivan epitop vezivanja je predstavljeno kao bela kutija sa crnim fontom.
[0252] Devet antitela (H4H2236N3, H4H2342P, H4H2295S, H4H2294S, H4H2291S, H4H2357S, H4H2355S, H4H2296S, i H4H2243N2) se takmiče jedan sa drugim u oba smera za vezivanje na biotin-hGFRα3-mmH. Osam (H4H2236N3, H4H2342P, H4H2295S, H4H2294S, H4H2291S, H4H2357S, H4H2355S, i H4H2296S) se ne takmiče ni sa jednim drugim testiranim anti-GFRα3 antitelom, iako se H4H2243N2 takođe takmiči u oba smera sa dva dodatna testirana anti-GFRα3 antitela (H4H2212N i H4H2352S). H4H2212N i H4H2352S se takmiče jedan sa drugim u oba smera i H4H2243N2 za vezivanje na biotin-hGFRα3-mmH, ali kako se H4H2212N ni sa jednim drugim testiranim anti-GFRα3 antitelima, H4H2352S se takođe takmiči u oba smera sa dodatnim testiranim anti-GFRα3 antitelom (H4H2292S). Jedno testirano anti-GFRα3 antitelo, H4H2350P, se ne takiči ni sa jednim od testiranih anti-GFRα3 antitela za vezivanje na biotin-hGFRα3-mmH.

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi
    1<.>Izolovano anatitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se vezuje specifično na humani GFRα3, pri čemu to antitelo obuhvata tri teška lanca CDR (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i tri laka lanca CDR (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) obuhvaćen ur HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR : 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106,
    114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266,
    274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 i 397/405.
  2. 2. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz patentnog zahteva 1, obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10,
    18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186,
    194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346,
    354/362, 381/389 i 397/405.
  3. 3. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz patentnog zahteva 2, obuhvata HCVR/LCVR par sekvence amino kiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 50/58, 146/154, 210/218 i 290/298.
  4. 4<.>Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz jednog od prethodnih patentnih zahteva, ima jednu ili više sledećih karakteristika:
    (i) ispoljava KDu opsegu od oko 10<-8>M do oko 10<-13>M kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona;
    (ii) pokazuje sposobnost da blokira oko 50-100% vezivanja GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 40 pM do oko 15 nM;
    (iii) pokazuje sposobnost da blokira oko 20% do oko 100% vezivanja GFRα3 na čvrstu potporu obloženu mešavinom artemina i RET;
    (iv) blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju RET sa IC50u opsegu od oko 200 pM do oko 50 nM;
    (v) inhibira ili smanjuje jedan ili više nociceptivnih odgovora na in vivo modelu bola u slučaju kancera kostiju;
    (vi) inhibira ili smanjuje na artemin osetljivu toplotnu hiperalgesiju in vivo;
    (vii) inhibira ili smanjuje alodiniju na in vivo modelu osteoartritisa; ili
    (viii) ne reaguje sa ostalim vrstama unakrsno sa drugim GFR koreceptorima za RET.
  5. 5. Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se:
    (a) to antitelo bira iz grupe koja obuhvata himerno antitelo i humano antitelo, i/ili; (b) pri čemu to antitelo ne raguje između vrsta unakrsno sa humanim GFRα1 ili humanim GFRα2, i/ili;
    (c) pri čemu je to antitelo humano monoklonalno antitelo koje obuhvata (a) promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja obuhvata
    SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258,
    274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 i 397 i (b) promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom amino kiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 i 405.
  6. 6<.>Izolovano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
    (a) antitelo pokazuje sposobnost da blokira oko 50-95% vezivanja humanog GFRα3 na svoj ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 40 pM do oko 750 pM;
    (b) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira oko 75-100% vezivanja humanog GFRα3 na njegov ligand, artemin, sa opsegom IC50vrednosti od oko 400 pM do oko 15 nM;
    (c) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju humanog RET sa IC50u opsegu od oko 300 pM do oko 5 nM; ili
    (d) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen blokira ili inhibira od artemina zavisnu aktivaciju makaki RET sa IC<50>u opsegu od oko 0,7 nM do oko 2,5 nM.
  7. 7. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment vezivanja antigena iz bilo kog patentnog zahteva 1-6.
  8. 8. Vektor ekspresije koji obuhvata molekul nukleinske kiseline iz patentog zahteva 7.
  9. 9. Postupak za proizvodnju anti-GFRα3 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen obuhvata korake uvođenja vektora ekspresije iz patentnog zahteva 8 u izolovanu ćeliju domaćina, uzgajanje ćelije pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta, i oporavljanje tako proizvedenog antitela.
  10. 10. Farmaceutska supstanca koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom patentnom zahtevu 1-6 i farmaceutski prihvatljivom nosaču ili razblaživaču.
  11. 11. Farmaceutska supstanca koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i drugi terapijski agens izabran iz grupe koja obuhvata opioid COX-2 inhibitor, lokalni anestetik, NMDA modulator, agonist receptora kanabinoida, modulator P2X familije, VR1 antagonist, antagonist substance P, drugi GFRα3 antagonist, citokin ili antagonist receptora citokina, inhibitor faktora rasta nerva (NGF) (inhibitor malog molekula ili anti-NGF antitela), inhibitor BDNF, TrkA, TrkB ili p75, aspirin, NSAID, steroid, morfin, selektivni inhibitor ponovne apsorpcije serotonina (SSRI), inhibitore ponovne apsorpcije norepinefrina u serotoninu (SNRI), triciklični, inhibitor kanala naponom usmerenog natrijuma (Nav), inhibitor kanala kalcijuma, inhibitor kanala kalijuma, faktora nekroze tumora (TNF) ili inhibitor TNF receptora, inhibitor TWEAK (TNF-srodni WEAK induktor apoptoze), RET inhibitor, inhibitor GDNF familije liganda, inhibitor GFRα1, GFRα2 ili GFRα4, inhibitor kanala jona osetljivog na kiselinu (ASIC1 ili ASIC3), antikonvulsant (gabapentin ili pregabalin), inhibitor receptora prekineticina (PROK1 i PROK2), inhibitor kaspaze, inhibitor p38, inhibitor IKK1/2, CTLA-4Ig i kortikosteroida; i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača;
    opciono pri čemu je drugi GFRα3 antagonist mali organski molekul, antagonist polipeptida, drugo antitelo specifično za GFRα3, siRNK ili antisens molekul specifičan za GFRα3; ili pri čemu je citokin ili antagonist receptora citokina interleukina 1(IL-1) antgaonist, IL-6 antagonist, ili IL-18 antagonist.
  12. 12. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz bilo kog patentnog zahteva 1-6, ili farmaceutska supstanca iz bilo patentnog zahteva 10 ili 11, za upotrebu za lečenje stanja ili bolesti povezane sa GFRα3, ili bola usled stanja ili bolesti povezane sa GFRα3, pri čemu je to stanje il bolest povezano sa GFRα3 sprečeno, poboljšano, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalosti pojave, ili je bol povezan sa stanjem ili bolešću sprečen, poboljšan, ili smanjene ozbiljnosti ili učestalosti pojave;
    pri čemu se to stanje ili bolest povezano sa GFRα3 bira iz grupe koja obuhvata akutni bol, hronični bol, neuropatski bol, inflamatorni bol, sindrom funkcionalnog bola, artritis, pankreatitis, osteoartritis, bol u zglobovima, klaster glavobolje, trigeminalnu neuralgiju, herpesnu neuralgiju, opšte neuralgije, neurodegenerativne poremećaje, poremećaje kretanja, poremećaje neuroendokrinog sistema, ataksiju, visceralni bol, giht, postherpesnu neuralgiju, dijabetesnu neuropatiju, išijas, bol u leđima, bol u glavi ili vratu, ozbiljni ili neobuzdani bol, probadajući bol, postoperativni bol, naslednu eritromelalgiju, bol u zubima, rinitis, kancerni bol, sindrom složenog regionalnog bola (CRPS), upalna bolest creva (npr. Kronova bolest ili ulcerativni kolitis) i poremećaji bešike.
  13. 13. Izolovano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je sindorm funkcionalnog bola izabran iz grupe koja obuhvata hronični bol u leđima, sindrom nervoznih creva (IBS), fibromialgija (FM), sindorm hroničnog umora, bol u predelu stomaka, sindrom hroničnog umora, bol u u predelu abdomena, poremeća viličnog zgloba (TMJD), sindrom bolne bešike (intersticijalni cistitis), funkcionalnih gastrointestinalnih poremećaja/sindroma, sindroma funkcionalnog bola u grudima, migrene i glavovolje tenzionog tipa, sindroma hroničnog bola u karlici, sindroma bolne prostate (hronični prostatis), sindrom višestruke hemijske osetljivosti i sindrom Zalivskog rata; ili pri čemu je kancerni bol povezan sa kancerom izabranim iz grupe koja obuhvata kancer endometrijuma, kancer prostate, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer materice, kancer jajnika, kancer bubrega, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mozga, leukemiju, limfom, kancer kosti i bol povezan sa metastazom kancera.
  14. 14. Antitelo, fragment koji vezuje antigen ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili 13, pri čemu je pomenuto antitelo, fragment koji vezuje antigen ili farmaceutska supstanca za isporuku pacijentu u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom; pri čemu je pomenuti drugi terapijski agens opciono kao što je definisan u patentnom zahtevu 11.
  15. 15. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz patentnog zahteva 1, koje obuhvata HCDR1 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 148; HCDR2 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 150; HCDR3 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 152; LCDR1 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 156; LCDR2 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 158; i LCDR3 sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 160.
RS20190063A 2012-08-22 2013-08-21 Humana antitela na gfr 3 i metode za njihovu upotrebu RS58311B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261692029P 2012-08-22 2012-08-22
EP13753402.0A EP2888280B1 (en) 2012-08-22 2013-08-21 Human antibodies to gfr 3 and methods of use thereof
PCT/US2013/055921 WO2014031712A1 (en) 2012-08-22 2013-08-21 HUMAN ANTIBODIES TO GFRα3 AND METHODS OF USE THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58311B1 true RS58311B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=49036666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190063A RS58311B1 (sr) 2012-08-22 2013-08-21 Humana antitela na gfr 3 i metode za njihovu upotrebu

Country Status (34)

Country Link
US (5) US8968736B2 (sr)
EP (2) EP2888280B1 (sr)
JP (3) JP6392755B2 (sr)
KR (1) KR102158569B1 (sr)
CN (2) CN109096398A (sr)
AR (1) AR092188A1 (sr)
AU (1) AU2013305863B2 (sr)
CA (1) CA2879724C (sr)
CL (1) CL2015000420A1 (sr)
CY (1) CY1121097T1 (sr)
DK (1) DK2888280T3 (sr)
EA (2) EA034683B1 (sr)
ES (1) ES2700160T3 (sr)
HR (1) HRP20190109T1 (sr)
HU (1) HUE042943T2 (sr)
IL (1) IL236738B (sr)
JO (1) JO3462B1 (sr)
LT (1) LT2888280T (sr)
MA (1) MA37945B1 (sr)
MX (1) MX363541B (sr)
MY (2) MY167920A (sr)
NZ (1) NZ704007A (sr)
PH (1) PH12015500114A1 (sr)
PL (1) PL2888280T3 (sr)
PT (1) PT2888280T (sr)
RS (1) RS58311B1 (sr)
SG (2) SG11201500501VA (sr)
SI (1) SI2888280T1 (sr)
SM (1) SMT201900022T1 (sr)
TR (1) TR201816597T4 (sr)
TW (2) TWI613218B (sr)
UY (1) UY34988A (sr)
WO (1) WO2014031712A1 (sr)
ZA (1) ZA201500336B (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
WO2016025884A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glycosyl-phosphatidylinositol (gpi)-linked gdnf family alpha-receptor 4 (gfralpha4)-specific antibody and uses thereof
WO2017139153A1 (en) 2016-02-10 2017-08-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Novel anti-lam and anti-pim6/lam monoclonal antibodies for diagnosis and treatment of mycobacterium tuberculosis infections
US20170281756A1 (en) * 2016-02-25 2017-10-05 University Of Southern California Compositions and methods to selectively block pain induced by cold
CN108697795A (zh) * 2016-02-29 2018-10-23 伊莱利利公司 Gfral受体疗法
SG11201807279QA (en) * 2016-03-31 2018-09-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Binding proteins and methods of use thereof
BR112018073300A2 (pt) 2016-05-13 2019-03-26 Instituto De Medicina Molecular métodos para tratamento de doenças associadas com as células ilc3
US10688181B2 (en) 2016-06-27 2020-06-23 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
CN107827983B (zh) * 2017-11-06 2020-09-25 中国药科大学 一种靶向artn的单链抗体、制备方法及应用
US20220064274A1 (en) * 2018-03-26 2022-03-03 Shanghai Yile Biotechnology Co., Ltd. Use of probdnf regulator in b cell-related diseases
WO2019210144A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 Vanderbilt University Broadly neutralizing antibodies against hepatitis c virus
CN109265551B (zh) * 2018-09-25 2020-09-15 华东师范大学 Cd38抗体、嵌合抗原受体和药物
KR20210134321A (ko) * 2019-02-01 2021-11-09 노바록 바이오테라퓨틱스 리미티드 항-클라우딘 18 항체 및 이의 이용 방법
AU2020270966B2 (en) * 2019-04-10 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies that bind ret and methods of use thereof
US11802159B2 (en) 2019-09-30 2023-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Humanized anti-GDNF family alpha-receptor 4 (GRF-alpha-4) antibodies and chimeric antigen receptors (CARs)
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
BR112023021256A2 (pt) 2021-04-20 2023-12-12 Regeneron Pharma Anticorpos humanos para artemina e métodos de uso dos mesmos
WO2022254255A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Fundacao D. Anna De Sommerchampalimaud E Dr. Neuro-mesenchyme units control ilc2 and obesity via a brain-adipose circuit
US20250154236A1 (en) * 2022-01-31 2025-05-15 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 3) Limited Prevention and treatment of headaches
US20250241951A1 (en) * 2023-01-18 2025-07-31 Texas Tech University System Gfra2 antibodies and their use in cancer treatment

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7138251B1 (en) 1996-04-22 2006-11-21 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a neurotrophic factor receptor
US6677135B1 (en) 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
WO1999049039A2 (en) 1998-03-23 1999-09-30 Genentech, Inc. GFRα3 AND ITS USES
US7026138B1 (en) * 1998-03-23 2006-04-11 Genentech, Inc. Polynucleotides encoding GFRα3
PT1640381E (pt) * 1998-07-14 2014-07-17 Janssen Pharmaceutica Nv Fator de crescimento neurotrófico
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
JP5848861B2 (ja) 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
JP2008546716A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ＧＦＲα３抗体
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
MX2008014804A (es) 2006-06-02 2009-01-27 Regeneron Pharma Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano.
RU2487888C2 (ru) * 2006-06-12 2013-07-20 ЭМЕРДЖЕНТ ПРОДАКТ ДИВЕЛОПМЕНТ СИЭТЛ, ЭлЭлСи Одноцепочечные мультивалентные связывающие белки с эффекторной функцией
CA2687117A1 (en) * 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
JP2010534469A (ja) 2007-07-25 2010-11-11 アストラゼネカ アクチボラグ Ｋｄｒ指向性標的化結合物質およびその使用
US20110135648A1 (en) 2007-08-08 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
CA2766220C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
PL2505654T5 (pl) 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
WO2012077649A1 (ja) * 2010-12-06 2012-06-14 大日本住友製薬株式会社 ヒトモノクローナル抗体
JO3462B1 (ar) * 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها

Also Published As

Publication number Publication date
IL236738B (en) 2022-04-01
JO3462B1 (ar) 2020-07-05
SG10201701376UA (en) 2017-03-30
US20200040087A1 (en) 2020-02-06
JP6392755B2 (ja) 2018-09-19
IL236738A0 (en) 2015-02-26
SI2888280T1 (sl) 2019-03-29
MX363541B (es) 2019-03-27
LT2888280T (lt) 2018-12-10
CY1121097T1 (el) 2019-12-11
EP3450458A1 (en) 2019-03-06
JP6718482B2 (ja) 2020-07-08
US20180340029A1 (en) 2018-11-29
TR201816597T4 (tr) 2018-11-21
ZA201500336B (en) 2019-12-18
AU2013305863A1 (en) 2015-02-05
SMT201900022T1 (it) 2019-02-28
CA2879724C (en) 2023-03-14
EA202090031A2 (ru) 2020-04-30
HUE042943T2 (hu) 2019-07-29
NZ704007A (en) 2018-08-31
TWI631139B (zh) 2018-08-01
US20170096488A1 (en) 2017-04-06
PT2888280T (pt) 2019-01-21
PL2888280T3 (pl) 2019-04-30
EP2888280B1 (en) 2018-10-17
TW201819415A (zh) 2018-06-01
PH12015500114B1 (en) 2015-03-16
JP2018143252A (ja) 2018-09-20
US9522185B2 (en) 2016-12-20
JP2020031662A (ja) 2020-03-05
ES2700160T3 (es) 2019-02-14
CN104768974A (zh) 2015-07-08
US10947312B2 (en) 2021-03-16
MA37945B1 (fr) 2017-05-31
BR112015003110A2 (pt) 2018-08-28
US10077311B2 (en) 2018-09-18
US20140056903A1 (en) 2014-02-27
TW201420603A (zh) 2014-06-01
CA2879724A1 (en) 2014-02-27
KR20150041664A (ko) 2015-04-16
MA37945A1 (fr) 2016-02-29
AR092188A1 (es) 2015-04-08
TWI613218B (zh) 2018-02-01
HK1206037A1 (en) 2015-12-31
CN104768974B (zh) 2018-08-14
SG11201500501VA (en) 2015-02-27
KR102158569B1 (ko) 2020-09-22
AU2013305863B2 (en) 2018-06-07
JP2015532647A (ja) 2015-11-12
EA202090031A3 (ru) 2020-07-31
MX2015002289A (es) 2016-06-07
WO2014031712A1 (en) 2014-02-27
EA201590402A1 (ru) 2015-09-30
MY184241A (en) 2021-03-29
US8968736B2 (en) 2015-03-03
EA034683B1 (ru) 2020-03-05
MY167920A (en) 2018-09-27
UY34988A (es) 2014-03-31
HRP20190109T1 (hr) 2019-03-08
CN109096398A (zh) 2018-12-28
CL2015000420A1 (es) 2015-05-22
EP3450458B1 (en) 2021-07-14
EP2888280A1 (en) 2015-07-01
PH12015500114A1 (en) 2015-03-16
DK2888280T3 (en) 2018-12-10
US20150110801A1 (en) 2015-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10947312B2 (en) Human antibodies to GFRα3 and methods of making thereof
JP6923602B2 (ja) 抗アクチビンａ抗体及びその使用
JP7688175B2 (ja) Ｒｅｔを結合するヒト抗体およびその使用方法
HK1261378B (en) Human antibodies to gfralpha3 and methods of use thereof
HK1261378A1 (en) Human antibodies to gfr 3 and methods of use thereof
HK1206037B (en) Human antibodies to gfr 3 and methods of use thereof
BR112015003110B1 (pt) Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, método para produzir anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, uso do anticorpo isolado ou de seu fragmento de ligação a antígeno, composição farmacêutica, e, uso da composição farmacêutica