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TW201420603A - ＧＦＲα３之人類抗體及其使用方法 - Google Patents

ＧＦＲα３之人類抗體及其使用方法 Download PDF

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TW201420603A
TW201420603A TW102129821A TW102129821A TW201420603A TW 201420603 A TW201420603 A TW 201420603A TW 102129821 A TW102129821 A TW 102129821A TW 102129821 A TW102129821 A TW 102129821A TW 201420603 A TW201420603 A TW 201420603A
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pain
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cancer
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Susan D Croll
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
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Regeneron Pharma
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Publication date
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Abstract

本發明提供結合至人類GFRα3的抗體以及使用該抗體的方法。依據本發明的某些具體例，該等抗體為結合至人類GFRα3的完全人類抗體。本發明抗體可用於治療與一或多種GFRα3生物活性相關的疾病或病症，包括治療急性或慢性疼痛病況，或發炎性病況。

Description

GFRα3之人類抗體及其使用方法
本發明是有關於特異結合至人類神經膠細胞株衍生之神經滋養因子(GDNF)家族受體阿伐3(GFRα3)的人類抗體與人類抗體的抗原-結合片段，以及使用彼等抗體的治療方法。
神經膠細胞株衍生的神經滋養因子相關家族是由神經膠細胞株衍生的神經滋養因子(GDNF)、神經秩蛋白(neurturin,NRTN)、阿爾特素(artemin,ARTN)及頗斯菲素(persephin,PSPN)組成。GDNF家族的各個成員結合至與細胞質膜締合之糖化磷脂醯肌醇(GPI)-錨定受體。這個受體家族稱為GDNF-家族受體阿伐(GFRα)。這個受體家族是由四個不同的GFRα受體(GFRα1-4)所組成。GDNF偏好結合至GFRα1，NRTN偏好結合至GFRα2，ARTN偏好結合至GFRα3，而PSPN偏好結合至GFRα4。各個GDNF家族配體透過RET("在轉染期間重排列”)受體酪胺酸激酶傳遞訊號，RET受體酪胺酸激酶最初被發現是一種致癌基因。若配體先結合至其GFRα受體，RET僅會受GDNF家族成員活化(Airaksinen,M.S.,et al. Nature Reviews Neuroscience(2002),3：383-394)。
ARTN及GFRα3在發育期間均被高度地表現，且涉及交感神經系統發育。在成人體內，GFRα3表現大部分僅限於背根神經節(DRG)的感覺神經元(Orozco,O.E.,et al.,European J.Neuroscience,(2001),13：2177-2182)。在成鼠體內，阿爾特素在睪丸、子宮、甲狀腺、前列腺及副睪，以及在嗅球與腸和繫膜內的小動脈中表現(Airaksinen,M.S.,et al.Nature Reviews Neuroscience(2002),3：383-394；Airaksinen,M.S.et al.,Brain,Behavior and Evolution,(2006),68：181-190)。
在一些研究中已顯示GFRα3與阿爾特素在痛覺過敏中所可能扮演的角色。舉例而言，已證實將阿爾特素蛋白注射至囓齒動物的後腳爪會造成溫度痛覺過敏，且當阿爾特素與NGF一起注射時會增強這種痛覺(Malin,S.A.,et al.,J.Neuroscience,(2006),26(33)：8588-8599)。其他的研究顯示，在鼠類發炎模型中阿爾特素mRNA表現被上調(Elitt,C.M.,et al.,J.Neuroscience,(2006),26(33)：8578-8587)。此外，其他的研究顯示，阿爾特素轉殖小鼠的TRPV1與TRPA1表現升高，且對熱及冷的行為敏感化增加(Elitt,C.M.,et al.,J.Neuroscience,(2006),26(33)：8578-8587)。此外，在GFRα3剔除小鼠的研究已顯示在內臟過敏中所扮演的可能角色，此等小鼠在以TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)結腸內治療之後，相對於野生型C57BL/6小鼠顯示內臟過敏減弱(Tanaka,T.,et al.,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.(2011),300：G418-G424)。在歷經胰臟頭切除術的患者中完成的研究亦已顯示阿爾特素及其受體GFRα3在與胰臟炎相關的疼痛中所扮演的可能角色(Ceyhan,G.O., et al.,Gut,(2007),56：534-544)。基於前述，批准進一步研究來確定罹患疼痛/痛覺過敏及/或過敏的患者是否可能受益於使用GFRα3活性抑制劑的治療。
結合GFRα3的抗體描述於US 6,861,509中。此外，US 6,677,135揭示全長GFRα3序列，而GFRα3分子的剪接變體揭示於US 7,026,138；US2007/0232535與US2006/0216289。US 7,138,251揭示與全長GFRα3具有99%同一性的序列且製備此分子的人類化單株抗體描述於此份專利中。
在第一個態樣中，本發明提供結合至人類GFRα3，並且抑制或阻斷其活性(例如阻斷GFRα3結合至神經膠細胞株衍生神經滋養因子阿爾特素)，且可能阻斷RET受體酪胺酸激酶的後續活化及/或阻斷透過RET之訊息傳遞及/或阻斷透過RET以外的中介因子(mediator)訊息傳遞之完全人類單株抗體(mAb)及其抗原-結合片段。抗體或其抗原結合片段可用於治療痛覺過敏、觸痛覺過度敏感(allodynia)及/或對感覺刺激(包括，但不限於壓力、熱及/或冷)的過敏。抗體亦可用來治療疼痛/與廣泛病況及病症相關的過敏，其中需要使用阿爾特素阻斷GFRα3的交互作用。抗體亦可用來抑制腫瘤細胞生長、增殖及/或轉移。
在一個具體例中，本發明提供一種經單離抗體或其抗原-結合片段，其特異結合至人類GFRα3且具有一或多種下列特性：(i)當藉由表面電漿共振測量時表現範圍自約10-8M至 約10-13M的KD，(ii)顯示有阻斷約50-100% GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力，IC50值範圍自約40pM至約15nM；(iii)顯示有阻斷約20%至約100% GFRα3結合至經阿爾特素及RET之混合物塗佈之固體載體的能力；(iv)以範圍自約200pM至約50nM的IC50阻斷或抑制RET的阿爾特素依賴性活化；(v)在骨癌疼痛的活體內模型中抑制或降低一或多種痛覺反應；(vi)在活體內抑制或降低經阿爾特素致敏的溫度痛覺過敏；(vii)在骨關節炎的活體內模型中抑制或降低觸痛覺過度敏感；(viii)不與RET的其他GFR共受體交叉反應；(ix)包含一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；或(x)包含一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段選自由鼠類、嵌合、人類化及人類抗體組成之群。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段不與人類GFRα1或人類GFRα2交叉反應。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含(a)一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；及(b)一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段證實有阻斷約50-95%人類GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力，IC50值範圍自約40pM至約750pM。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段阻斷約75-100%人類GFRα3結合至其配體阿爾特素，IC50值範圍自約400pM至約15nM。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段以範圍自約300pM至約5nM的IC50阻斷或抑制人類RET的阿爾特素-依賴性活化。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段以範圍自約0.7nM至約2.5nM的IC50阻斷或抑制馬來猴RET的阿爾特素-依賴性活化。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含三個重鏈CDR(HCDR1、HCDR2及HCDR3)，含於選自由下 列組成之群的HCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，含於選自由下列組成之群的LCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含選自由下列組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389及397/405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片 段包含選自由下列SEQ ID NO組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對：50/58、146/154、210/218及290/298。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段包含：(a)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR1域：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383及399；(b)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR2域：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385及401；(c)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR3域：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387及403；(d)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR1域：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391及407；(e)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR2域：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393及409；以及 (f)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR3域：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395及411。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段與含有選自由下列所組成之群的重鏈與輕鏈序列對的抗體或抗原-結合片段競爭特異結合至人類GFRα3：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346及354/362、381/389及397/405。
在一個具體例中，經單離單株抗體或其抗原-結合片段結合被包含有選自由下列所組成之群的重鏈與輕鏈序列對的抗體所辨識之人類GFRα3上的同一表位：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346及354/362、381/389及397/405。
本發明抗體可以是全長(例如，IgG1或IgG4抗體)或可含有僅僅抗原-結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可經修飾而影響功能性，例如減少殘基效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。
在一個具體例中，特異地結合至人類GFRα3的經單離抗體或其抗原-結合片段包含一HCVR，其包含三個重鏈CDR (HCDR1、HCDR2及HCDR3)，含於選自由下列組成之群的HCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；及/或一LCVR，其包含三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，含於選自由下列組成之群的LCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。用於鑑別HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDR的方法及技術為技藝中已知的，且可用於鑑別本文揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列中的CDR。可用來鑑別CDR邊界的例示性習知技術包括，例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性術語中，Kabat界定法是以序列變異性為基礎，Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎，而AbM界定法是一種介於Kabat與Chothia法之間的折衷法。參見，例如Kabat，”Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑別抗體內的CDR序列。
在一個具體例中，特異地結合人類GFRα3的經單離抗體或其抗原-結合片段包含：(a)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR3域：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387及403；以及 (b)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR3域：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395及411。
在一個具體例中，如上(a)及(b)中所述，特異地結合人類GFRα3的經單離抗體或其抗原-結合片段進一步包含：(c)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR1域：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383及399；(d)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR2域：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385及401；(e)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR1域：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391及407；以及(f)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR2域：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393及409。
在一個具體例中，本發明提供一種特異地結合至人類GFRα3的完全人類單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或 其片段表現一或多種下列特性：(i)包含具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的HCVR：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；(ii)包含具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的LCVR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405；(iii)包含具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的HCDR3域：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387及403，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；以及具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的LCDR3域：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395及411，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；(iv)包含具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的HCDR1域：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383及399，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的HCDR2域：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385及401，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或 至少99%序列同一性之實質上相似序列；具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的LCDR1域：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391及407，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；具有選自由下列所組成之群之胺基酸序列的LCDR2域：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393及409，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；(v)當藉由表面電漿共振測量時表現自約10-8M至約10-13M的KD；(vi)證明有阻斷約50-100% GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力，IC50值自約40pM至約15nM；(vii)證明有阻斷約20%至約100% GFRα3結合至經阿爾特素及RET之混合物塗佈之固體載體的能力；(viii)以自約200pM至約50nM的IC50阻斷或抑制RET的阿爾特素依賴性活化；(ix)在骨癌疼痛的活體內模型中抑制或降低一或多種痛覺反應；(x)在活體內抑制或降低經阿爾特素致敏的溫度痛覺過敏；(xi)在骨關節炎的活體內模型中抑制或降低觸痛覺過度敏感；(xii)不與RET的其他GFR共受體交叉反應。
在一個具體例中，本發明提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段，其包含具有選自由表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的HCDR3域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；以及具有選自由表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的LCDR3域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列。
在一個具體例中，本發明提供一種抗體或其片段，其進一步包含具有表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的HCDR1域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；具有表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的HCDR2域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；具有表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的LCDR1域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；以及具有表1中所示彼等任一者之胺基酸序列的LCDR2域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列。
在某些具體例中，特異地結合至人類GFRα3之抗體或抗體之抗原-結合部分包含選自由表1中所示HCDR3/LCDR3胺基酸序列任一者的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。依據某些具體例，該抗體或抗體之抗原-結合部分包含選自由下列組成之群之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、387/395及403/411。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：4、6及8之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：12、14及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：20、22及24之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：28、30及32之LCDR1、LCDR2及LCDR3 序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：36、38及40之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：44、46及48之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：52、54及56之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：60、62及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：68、70及72之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：76、78及80之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：84、86及88之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：92、94及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：100、102及104之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：108、110及112之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：116、118及120之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：124、126及128之LCDR1、LCDR2及LCDR3 序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：132、134及136之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：140、142及144之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：148、150及152之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：156、158及160之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：164、166及168之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：172、174及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：180、182及184之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：188、190及192之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：196、198及200之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：204、206及208之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：212、214及216之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：220、222及224之LCDR1、LCDR2及LCDR3 序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：228、230及232之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：236、238及240之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：244、246及248之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：252、254及256之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：260、262及264之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：268、270及272之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：276、278及280之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：284、286及288之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：292、294及296之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：300、302及304之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：308、310及312之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：316、318及320之LCDR1、LCDR2及LCDR3 序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：324、326及328之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：332、334及336之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：340、342及344之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：348、350及352之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：356、358及360之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：364、366及368之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：383、385及387之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：391、393及395之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：399、401及403之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：407、409及411之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
本發明的某些非限制性、例示性抗體及抗原-結合片段包含分別選自表1中所示胺基酸序列任一者的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3域。
在第二個態樣中，本發明提供編碼抗-GFRα3抗體或其片段之核酸分子。帶有本發明核酸之重組型表現載體與引入該等載體的宿主細胞，與藉由在容許生產抗體的條件下培養宿主細胞而生產抗體和回收所生產之抗體的方法亦被本發明所含括。
在一個具體例中，本發明提供一種抗體或其片段，其包含選自由下列所組成之群之核酸序列所編碼的HCVR：SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、380及396，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列。在一個具體例中，該HCVR是由選自由下列所組成之群之核酸序列所編碼：SEQ ID NO：49、145、209及289。
在一個具體例中，該抗體或其片段進一步包含選自由下列所組成之群之核酸序列所編碼的LCVR：SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、388及404，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列。在一個具體例中，該LCVR是由選自由下列所組成之群之核酸序列所編碼：SEQ ID NO：57、153、217及297。
在一個具體例中，本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段，其包含表1中所示抗體任一者之可變區內的核苷酸序列所編碼的HCDR3域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；以及由選自表1中所示彼等任一者之核苷酸序列所編碼的LCDR3域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列。
在一個具體例中，本發明提供一種抗體或其片段，其進一步包含由表1中所示彼等任一者之核苷酸序列所編碼的HCDR1域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；由表1中所示彼等任一者之核苷酸序列所編碼的HCDR2域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；由表1中所示彼等任一者之核苷酸序列所編碼的LCDR1域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列；以及由表1中所示核苷酸序列所編碼的LCDR2域，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似序列。
在第三個態樣中，本發明特徵為一種人類抗-hGFRα3抗體或抗體之抗原-結合片段，其如表2中所示般組合包含由衍生自VH、DH與JH生殖系序列之核苷酸序列段所編碼的HCVR，以及由衍生自VK與JK生殖系序列之核苷酸序列段所編碼的LCVR。
發明含括抗-hGFRα3抗體，其具有經修飾的糖化型態。在一些應用中，移除非所欲糖化位點的修飾可能是有用的，或例如移除岩藻糖部分以增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，可以進行半乳糖化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在第四個態樣中，本發明特徵為一種醫藥組成物，其包含特異地結合hGFRα3的重組型人類抗體或其片段，以及醫藥學上可接受的載劑。在一個具體例中，本發明特徵為一種組成物，其為本發明抗體或抗體之抗原-結合片段，以及第二治療劑的組合。該第二治療劑可以是任一種有利與本發明抗體或其片段組合 的藥劑，例如能夠減低疼痛的藥劑，諸如(但不限於)類鴉片、嗎啡、COX-2抑制劑、阿斯匹林，或其他非類固醇消炎藥、乙醯胺酚、杜洛西汀、局部麻醉劑、NMDA調節劑、大麻素受體促效劑、P2X家族調節劑、VR1拮抗劑，以及物質P拮抗劑。第二治療劑可以是介白素-1(IL-1)抑制劑，例如融合蛋白(US 6,927,044)；或抗癲癇/痙攣藥物，諸如佳巴本汀、普瑞巴林、托比拉邁；或三環抗憂鬱藥，諸如阿米替林；細胞激素抑制劑或拮抗劑(諸如IL-6、IL-6R、IL-18或IL-18R的拮抗劑)，或電壓閘控鈉通道的抑制劑，諸如Nav1.7抑制劑，或Nav1.8抑制劑，或Nav1.9抑制劑；鉀通道或鈣通道的抑制劑；或NGF抑制劑(小分子抑制劑或抗-NGF抗體)，或GFRα3的第二抑制劑或拮抗劑、腫瘤壞死因子(TNF)或TNF受體抑制劑、TWEAK(細胞凋亡的TNF相關WEAK誘導體)的抑制劑、RET抑制劑、GDNF家族配體的抑制劑、GFRα1、GFRα2或GFRα4的抑制劑、酸感應離子通道(例如ASIC1或ASIC3)的抑制劑、或選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)、或血清素正腎上腺素再吸收抑制劑(SNRI)、或前動力蛋白(prekineticin)受體(例如PROK1及PROK2)的抑制劑、或凋亡蛋白酶(caspase)抑制劑、p38抑制劑、IKK1/2抑制劑、CTLA-4lg或皮質類固醇。第二治療劑可以是小分子藥物或蛋白質/多肽抑制劑。第二治療劑可以是合成或天然衍生的。第二治療劑可以是對GFRα3具有特異性的第二抗體、對GFRα3具有特異性的多肽拮抗劑、siRNA或反義分子。亦理解本發明抗體及醫藥上可接受組成物可使用於組合療法中，亦即，該等抗體及醫藥上可接受組成物可在一或多種其他所要治療劑或醫學程序同時、之前或接續投與。要用在組合方案中的療法(治療劑或程序)的特定組合考慮所 要治療劑及/或程序的相容性以及要達到的所欲治療效用。亦要理解所用療法可針對相同病症達到所要效用(例如抗體可與另一用來治療相同病症的藥劑同時投與)，或它們可達到不同效用(例如控制任何不良效果)。如本文所用，一般被投與來治療或預防特定疾病或病況的額外治療劑對於要治療的疾病或病況來說是適當的。
在第五個態樣中，本發明特徵為使用本發明抗-hGFRα3抗體或抗體之抗原-結合部分抑制hGFRα3活性的方法，其中該方法包含投與治療有效量之一或多種本發明抗體，或其抗原結合片段，或醫藥組成物。
在第六個態樣中，本發明特徵為治療GFRα3相關病況或疾病，或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛的方法，該方法包含對有需要的患者投與本發明抗-GFRα3抗體或抗體之抗原-結合部分，或包含抗-GFRα3抗體或其片段的組成物，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或與該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
在一個具體例中，本發明提供經單離抗體或其抗原-結合片段，或包含本發明的至少一抗體或其抗原-結合片段的醫藥組成物，其用以治療GFRα3相關病況或疾病，或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或與該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
在一個具體例中，本發明提供本發明之經單離抗體或其抗原-結合片段，或包含本發明的至少一抗體之醫藥組成物的 用途，其用於製造用來治療GFRα3相關病況或疾病，或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛的醫藥，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
在一個具體例中，GFRα3相關病況或疾病是選自由下列組成之群：急性疼痛、慢性疼痛、神經病性疼痛、發炎性疼痛、功能性疼痛症候群、關節炎、胰臟炎、骨關節炎、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹神經痛、一般性神經痛、神經退化性病症、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調、內臟疼痛、急性痛風、帶狀疱疹後神經痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、嚴重或難治性疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、遺傳性肢端紅痛症、牙痛、鼻炎、癌症疼痛、複雜性局部疼痛症候群(CRPS)、發炎性腸病(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)及膀胱異常。
在一個具體例中，功能性疼痛症候群是選自由下列組成之群：慢性下背痛、大腸急躁症(IBS)、肌纖維痛(FM)、慢性疲勞症候群、腹痛、顳顎關節病症(TMJD)、膀胱疼痛症候群(間質性膀胱炎)、功能性胃腸病症/症候群、功能性胸痛症候群、偏頭痛及緊張型頭痛、慢性骨盆疼痛症候群、前列腺疼痛症候群(慢性前列腺炎)、多種化學品敏感症候群，以及波斯灣症候群。
在一個具體例中，癌症疼痛是與選自由下列組成之群的癌症有關：子宮內膜癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、結腸癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、非小細胞肺癌、腦癌、白血病、淋巴瘤、骨癌及與癌症轉移相關的疼痛。
在一個具體例中，該抗體或抗原-結合片段與第二治療劑組合被投與給患者。
在一個具體例中，該第二治療劑是選自由下列組成之群：類鴉片、COX-2抑制劑、局部麻醉劑、NMDA調節劑、大麻素受體促效劑、P2X家族調節劑、VR1拮抗劑、物質P拮抗劑、第二GFRα3拮抗劑、細胞激素或細胞激素受體拮抗劑、神經生長因子(NGF)抑制劑(小分子抑制劑或抗-NGF抗體)、阿斯匹林、NSAID、類固醇、嗎啡、選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)、血清素正腎上腺素再吸收抑制劑(SNRI)、三環、電壓閘控鈉通道(Nav)的抑制劑、鈣通道抑制劑、鉀通道抑制劑、腫瘤壞死因子(TNF)或TNF受體抑制劑、TWEAK(細胞凋亡的TNF相關WEAK誘導體)的抑制劑、RET抑制劑、GDNF家族配體的抑制劑、酸感應離子通道(ASIC1或ASIC3)的抑制劑、抗痙攣藥物(佳巴本汀或普瑞巴林)、前動力蛋白受體(例如PROK1及PROK2)的抑制劑、凋亡蛋白酶抑制劑、p38抑制劑、IKK1/2抑制劑、CTLA-4lg或皮質類固醇。
在一個具體例中，該第二GFRα3拮抗劑為有機小分子、對GFRα3具有特異性的第二抗體、對GFRα3具有特異性的多肽拮抗劑、siRNA或反義分子。
在一個具體例中，細胞激素或細胞激素受體拮抗劑為介白素-1(IL-1)拮抗劑、IL-6拮抗劑或IL-18拮抗劑。
所要治療的病症為任一種疾病或病況，其藉由移除、抑制或減低hGFRα3活性而被增進、改善、抑制或預防。可藉由本發明治療方法而被治療的特定族群包括選自下列的疾病、病症或病況：急性、慢性、出血性、神經病性或發炎性疼痛、過敏(諸 如內臟、溫度或機械過敏)、慢性胰臟炎、關節炎、偏頭痛、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀皰疹神經痛、一般性神經痛、癲癇或癲癇病況、肌強直、心律不整、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調、發炎性腸病、脾臟發炎、胃疼痛、膀胱三角區炎(trigonitis)、纖維樣變性、腹膜炎、急尿(faecal urgency)、失禁、直腸敏感、內臟疼痛、骨關節炎疼痛、帶狀皰疹後疼痛、糖尿病性神經病變、齒根痛、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、癌症疼痛，或化療引起的疼痛。其他可藉由本發明治療方法治療的病況包括先天性巨大結腸症(Hirschsprung disease)、遺傳性肢端紅痛症(hereditary erythromelalgia)、膀胱異常(bladder disorders)、鼻炎、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、結腸癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、血液(血源性)癌症(諸如白血病或淋巴瘤)、骨癌，或與癌症轉移有關的疼痛，例如與癌症轉移至骨頭有關的疼痛。本發明抗體或其抗原-結合片段亦可用來治療下列病況：非惡性急性、慢性或骨折骨疼痛；類風溼性關節炎、椎管狹窄；神經病性下背痛；肌膜疼痛症候群；胰臟；慢性頭痛；緊張型頭痛；糖尿病性神經病變；HIV-相關神經病變；夏馬杜三氏神經病變；遺傳性感覺神經病變；周邊神經損傷；疼痛性神經瘤；異位性近端與遠端放電(ectopic proximal and distal discharges)；神經根病變；化療引起的神經性疼痛；放射療法引起的神經性疼痛；乳房切除術後疼痛；中樞性疼痛；脊髓損傷疼痛；中風後疼痛；丘腦性疼痛；複雜性局部疼痛症候群(CRPS，亦已知為反射性交感神經萎縮症)；幻痛；難治性疼痛；急性肌肉骨骼疼痛；關節痛；急性痛風疼痛；機械性下背痛；頸疼痛；肌腱炎； 損傷/運動疼痛；腹痛；腎盂腎炎；闌尾炎；膽囊炎；腸閉塞；疝氣；等等；胸痛，包括心痛；骨盆疼痛、腎絞痛、急性產科痛，包括陣痛；剖腹產疼痛；燒傷與創傷疼痛；子宮內膜異位症；帶狀皰疹疼痛；鐮刀細胞貧血；急性胰臟炎；突發性疼痛；口頜面痛，包括鼻竇炎疼痛、牙痛；多發性硬化症疼痛；痲瘋疼痛；貝塞氏病疼痛；痛性肥胖症；靜脈炎疼痛；格巴二氏症候群疼痛；腳痛與趾動；哈格蘭氏症候群；費勃來氏症疼痛；膀胱與泌尿生殖器疾病；以及膀胱機能亢進。在一個具體例中，本發明抗體可用來治療功能性疼痛症候群，其中該功能性疼痛症候群是選自由下列組成之群：慢性下背痛、大腸急躁症(IBS)、肌纖維痛(FM)、慢性疲勞症候群、腹痛、顳顎關節病症(TMJD)、膀胱疼痛症候群(間質性膀胱炎)、功能性胃腸病症/症候群、功能性胸痛症候群、偏頭痛及緊張型頭痛、慢性骨盆疼痛症候群、前列腺疼痛症候群(慢性前列腺炎)、多種化學品敏感症候群，以及波斯灣症候群。
本發明抗體或其抗原-結合片段亦可用來抑制腫瘤細胞生長/增殖，或腫瘤細胞的轉移。在某些具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段可用來治療癌症，或”與癌症有關的疼痛”或”癌症相關疼痛”，其包括，例如(但不限於)子宮內膜癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、結腸癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腦癌、血液學(血源性)癌症(諸如白血病或淋巴瘤)、骨癌，或與癌症轉移有關的疼痛，例如與癌症轉移至骨頭相關的疼痛。”癌症相關疼痛”通常亦更包括與癌性病況相關的疼痛，諸如(例如)腎細胞癌、胰臟癌、頭頸癌、惡性神經膠瘤、骨肉瘤、結腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性 骨髓瘤、滑液肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。本發明抗體亦可用於治療或預防由癌症療法或抗癌醫學治療所致或與其相關的疼痛，例如化療引起的神經性疼痛，諸如由下列所致或與使用下列治療有關的疼痛：太平洋紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇(Taxotere®)；硝基尿、環磷醯胺、阿黴素、表阿黴素、5-氟尿嘧啶、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、雌氮芥，以及鉑基化療化合物，諸如順鉑、卡鉑及異丙鉑。
其他具體例將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
詳細說明
在說明本發明之前，應理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦應理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用，而不是限制性的，因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
除非另有定義，否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可用於實施或測試本發明，現將說明較佳的方法以及材料。所有本文提及的公開資料以其整體併入本文中做為參考資料。
定義
如本文所用，”GFRα3”或”hGFRα3”意指阿爾特素的糖化磷脂醯肌醇(GPI)-錨定蛋白受體，其屬於神經膠細胞株衍生的神經滋養因子(GDNF)家族。其為GDNF家族受體阿伐蛋白的一者，在結合至其配體阿爾特素後，媒介受體酪胺酸激酶RET("在轉染期間重排列”)的活化。至今GFRα家族已被識別出四個成員， GFRα1-4(Lindsay RM et al.,Neuron,(1996),17：571-574；Airaksinen,MS,et al.,Mol.Cell Neurosci.,(1999),13：313-325)。GFRα3在技藝中亦已知為GDNF家族受體阿伐3 GPI-連結受體，或神經膠細胞株衍生的神經滋養因子受體阿伐-3。除非指明為來自非人類物種(例如”小鼠GFRα3”、”大鼠GFRα3”或”猴GFRα3”)，否則用語”GFRα3”，或”hGFRα3”或其片段如本文所用意指人類GFRα3蛋白或其片段。另外，”GFRα3”或”hGFRα3”如本文所用意指由SEQ ID NO：374(Genbank存取編號NP_001496)中所示核酸序列編碼的人類GFRα3，且具有如SEQ ID NO：375(Genbank存取編號NP_001487.2)中所示胺基酸序列，或其生物活性片段。訊號序列橫跨SEQ ID NO：375的胺基酸殘基1-31，成熟蛋白橫跨SEQ ID NO：375的胺基酸殘基32-382，而C端Pro區橫跨SEQ ID NO：375的胺基酸殘基383-400。GPI裂解位點被發現在SEQ ID NO：375的胺基酸殘基374(天門冬醯胺酸)處。在Genbank中能找到人類阿爾特素的胺基酸序列為存取編號Q5T4W7，而帶有myc-myc-六組胺酸標誌的人類阿爾特素胺基酸序列(來自存取編號Q5T4W7的胺基酸A108-G220)如SEQ ID NO：369(其中SEQ ID NO：369的胺基酸殘基114-141為myc-myc六組胺酸標誌)所示。
儘管GFRα3在結構上及功能上與GFRα家族的其他成員相似，但GFRα3是四個家族成員中最不相關的。GFRα1與GFRα2共有約50%同一性(Sanicola,M.et al.,PNAS,USA,(1997),94：6238-43；Klein,RD,et al.,(1997),Nature,387：717-21；Buj-Bello,A.et al.,Nature(1997),387：721-4；Baloh,RH,et al.,Neuron,(1997),18：793-802)，而GFRα3與這些蛋白質分別只有32%與37%同 一性(Masure,S.et al.,Eur.J.Biochem.,(1998),251：622-30；Nomoto,S.et al.,BBRC,(1998),244：849-53)。小鼠GFRα3的胺基酸序列具有以下Genbank存取編號：NP_034410.3。人類GFRα1的胺基酸序列具有以下Genbank存取編號：NP_005255.1，且亦可為SEQ ID NO：376被找到。馬來猴GFRα3的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：377中而馬來猴RET的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：378中。
術語”抗體”，如本文所用，欲意指免疫球蛋白分子，其含有四個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的兩個重(H)鏈以及兩個輕(L)鏈(亦即”完全抗體分子”)，以及其集合體(例如IgM)或其抗原-結合片段。各個重鏈含有一個重鏈可變區(”HCVR”或”VH”)以及一個重鏈恆定區(含有結構域CH1、CH2以及CH3)。各個輕鏈含有一個輕鏈可變區(”LCVR”或”VL”)以及一個輕鏈恆定區(”CL”)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由三個CDR以及四個FR所構成，按下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的某些具體例中，抗-GFRα3抗體(或其抗原結合部分)的FR可能與人類生殖系序列相同，或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDR來限定。
置換一或多個CDR殘基或省略一或多個殘基也是可行的。在科學文獻中已描述就結合而言其中可省去一或多個CDR的抗體。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)依據已公開的結晶結構分析抗體與其抗原之間的接觸區域，並推論只有約五分之一至三分之一的CDR殘基實際接觸到抗原。Padlan也發現許多其中一 或兩個CDR沒有與抗原接觸的胺基酸的抗體(亦參見Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
可依據先前研究從Chothia CDR以外的Kabat CDR區域中，藉由分子建模及/或依據經驗鑑別出不與抗原接觸的CDR殘基(例如CDRH2中的殘基H60-H65通常是不需要的)。若省略CDR或其殘基，通常以在另一個人類抗體序列或此等序列的一致序列中的對應位置的胺基酸予以置換。CDR中供置換用的位置以及要置換的胺基酸也可以依據經驗來選定。按照經驗的置換可以是守恆或非守恆置換。
相較於對應生殖系序列，本文揭示的完全人類抗-hGFRα3抗體可在重鏈及輕鏈可變域之骨架及/或CDR區中含有一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而容易確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列，其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸回復突變成對應生殖系殘基，或對應生殖系殘基的守恆性胺基酸置換(天然或非天然)(此等序列改變在本文中全意指為”生殖系回復-突變”)。從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列，本技藝中具有通常技術者可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系回復-突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中，VH及/或VL域中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成生殖系序列。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成生殖系序列，例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基，或在所有骨架區FR1、FR2、FR3、FR4中的生殖 系回復-突變，或僅有CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。此外，本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系突變的組合，亦即其中某些個別殘基突變回復成生殖系序列，而不同於生殖系序列的某些其他殘基維持原狀。在得到後，含有一或多個生殖系回復突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原-結合片段含括在本發明中。
術語”人類抗體”，如本文所用，欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變)，例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是，術語”人類抗體”，如本文所用，不意欲要包括已被移植至人類FR序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的抗體。本發明之抗-人類GFRα3抗體可命名為”抗-hGFRα3”或”抗-GFRα3”。
術語”特異地結合”或類似者表示與抗原在生理條件下形成相對穩定複合物的抗體或其抗原-結合片段。特異性結合的特徵可以是平衡解離常數為至少約1x10-6M或更低(例如較小的KD表示結合更為緊密)。用於測定兩個分子是否特異地結合的方法為本技藝中已知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。但是，特異地結合hGFRα3的經單離抗體對其他抗原(諸如其他物種的GFRα3分子)表現交叉反應性。此外，如本文所用，結合至hGFRα3及一或多種其他抗原的多特異性抗體或結合hGFRα3的兩個不同區 域的雙特異性抗體也被視為”特異結合”hGFRα3的抗體。
如本文所用，術語”不結合”至指定目標分子(例如特定GFRα3肽)表示抗體當在25℃下於電漿共振分析中測試結合至目標分子時表現出大於500nM的KD，或若在25℃下於酵素連結免疫分析法(ELISA)中測試結合至目標分子時表現出大於50nM的EC50，或於任一類型分析或其相同分析中無法表現任何結合。
術語“高親合力“抗體意指那些當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)或溶液親和力ELISA來測量時，對hGFRα3具有至少10-9M；較佳10-10M；更佳10-11M，又更佳10-12M的結合親合力的mAb。
依據術語“緩慢的解離速率“、“Koff”或“kd“表示抗體當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)測量時，以1 x 10-3s-1或更低，較佳1 x 10-4s-1或更低的速率常數自hGFRα3解離。
術語抗體之“抗原-結合部分“、抗體之“抗原-結合片段“及類似用語，如本文所用，包括任一種天然存在的、以酵素所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白，其特異地結合抗原而形成複合物。術語抗體之”抗原-結合部分”或”抗體片段”，如本文所用，意指一或多個維持能特異地結合至hGFRα3的抗體片段。
本發明的特定具體例、抗體或抗體片段可接合至一治療部分(“免疫接合物“)，諸如類鴉片、COX-2抑制劑、局部麻醉劑、細胞激素拮抗劑(諸如IL-1或IL-6抑制劑)、第二GFRα3抑制劑、NMDA調節劑、大麻素受體促效劑、P2X家族調節劑、VR1拮抗劑、物質P拮抗劑、化療劑或放射性同位素。
“經單離抗體“，如本文所用，欲意指一種實質上不 含具有不同抗原特異性之其他抗體(Ab)的抗體(例如特異地結合hGFRα3的經單離抗體或其片段實質上不含特異地結合hGFRα3以外之抗原的Ab)。
“中和抗體“(或“中和GFRα3活性之抗體“)，如本文所用，欲意指其結合至hGFRα3會抑制GFRα3的至少一種活性的抗體。這個GFRα3生物活性的抑制可以藉由測量GFRα3生物活性的一或多種指標依據技藝中已知活體外或活體內分析的一或多種標準來評估(參見以下實例)。
術語”表面電漿共振”，如本文所用，意指容許藉由偵測生物感測儀基質中的蛋白質濃度變化來分析即時交互作用的光學現象，例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
術語”KD”，如本文所用，欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語”抗原決定位(epitope)”意指一個與已知為抗原決定簇(paratope)之抗體分子的可變區中的特定抗原結合位點交互作用的抗原決定基。單獨一個抗原可能有超過一個抗原決定位。因此，不同抗體可結合至一個抗原的不同區域且可能具有不同的生物效用。術語”抗原決定位”也意指B細胞及/或T細胞所反應的抗原上的一個位點。其亦意指為被抗體所結合之抗原的區域。抗原決定位可定義為結構性或功能性。功能性抗原決定位通常是結構性抗原決定位的一個子類且具有直接貢獻交互作用親和力的殘基。抗原決定位可以是構像性，亦即由非線性胺基酸所構成。在某些具體例中，抗原決定位可包括決定基，其為分子的化學活性 表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基或磺醯基)，且在某些具體例中可具有特定三維結構特性，及/或特定電荷特徵。
當意指核酸或其片段時，”實質同一性”或”實質上相同”表示當藉由任何序列同一性的已知演算法(諸如FASTA、BLAST或Gap，如上所述)來測量時，當在有適當核苷酸插入或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時，在至少約90%、且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基中有核苷酸序列同一性。在某些情況下，與參考核酸分子具有實質同一性的核酸分子可編碼具有與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質上相似胺基酸序列的多肽。
當應用於多肽時，術語”實質相似性”或”實質上相似”表示當兩個肽序列最佳地排列時(諸如按照程式GAP或BESTFIT使用內定空位權重)，共有至少90%序列同一性，甚至更佳至少95%、98%或99%序列同一性。較佳地，不相同的殘基位置因為守恆性胺基酸置換而有所差異。”守恆性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說，守恆性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的官能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因為守恆性置換而彼此有所不同的情況下，相似性百分率或程度可以向上調整而平衡置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，併入本文做為參考資料。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的群組實例包括1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；3)含 醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸與麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸與組胺酸；6)酸性側鏈：天門冬胺酸與麩胺酸；以及7)含硫側鏈：半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換基團為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸，以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者，守恆性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-45中揭示的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的變化。”中度守恆”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
關於多肽的序列相似性，典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例如，GCG軟體含有諸如Gap與BESTFIT的程式，它們可以與內定參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採內定或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最佳重複區域的排列以及百分率序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時，另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN，使用內定參數。參見，例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403 410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389 402，各自併入本文做為參考資料。
在特定具體例中，用於本發明方法中的抗體或抗體片段可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以是對一個目標多肽的不同抗原決定位具有特異性或者可能含有對超過一個目標多肽的抗原決定位具有特異性的抗原-結合域。可以使用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一與第二Ig CH3域因為至少一個胺基酸而彼此不同，以及其中與缺少該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下，至少一個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體對蛋白質A的結合。在一個具體例中，該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有一個會減低或消除蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT；按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括：在IgG1 mAb的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2 mAb的情況下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4 mAb的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式的變化在本發明範圍中是可預想的。
依據片語“治療有效量“表示對其所投與的對象產生需要效用的數量。確切數量將隨著治療目的而定，且由習於技藝者使用已知技術來確定(參見，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
術語“功能性疼痛症候群“意指以慢性症狀為主的症候群，在世界上多達15%的人口受到影響。其特徵在於身體不同部位的慢性疼痛以及不適。沒有普遍獲得同意的結構性、發炎性或生化異常獲得確認能夠充分解釋這些症狀。患者顯示生活品質大為降低，而治療選擇受到限制，且新穎治療方法的發展頗為令人失望。常見病症中的一些(落入此類中)包括慢性下背痛、大腸急躁症(IBS)、肌纖維痛(FM)、慢性疲勞症候群、功能性腹痛症候群、顳顎關節病症(TMJD)、膀胱疼痛症候群(間質性膀胱炎)、功能性胃腸病症/症候群、功能性直腸疼痛症候群、功能性胸痛症候群、偏頭痛及緊張型頭痛、慢性骨盆疼痛症候群、前列腺疼痛症候群(慢性前列腺炎)、多種化學品敏感症候群，以及波斯灣症候群。
一般性說明
神經膠細胞株衍生的神經滋養因子相關家族包括神經膠細胞株衍生的神經滋養因子(GDNF)、神經秩蛋白(NRTN)、頗斯菲素(PSPN)及阿爾特素(ARTN)。GDNF家族蛋白有所差異地參與感覺、腸、交感神經元與副交感神經元及各種非神經組織的發育及維持(Henderson,C.E.,et al.,(1994),Science 266：1062-1064；Kotzbauer,P.T.et al.,(1996),Nature 384：467-470；Springer,J.E.,et al.(1994),Exp.Neurol.127：167-170；Schaar.D.G.,et al.,(1993),Exp.Neurol.124：368-371)。GDNF是一種對多巴胺能、正腎上腺素能及脊椎運動神經元尤其強力的存活因子(Yan,Q.et al.(1995),Nature,373：341-344；Henderson,C.E.,et al.,(1994),Science,266：1062-1064；Buj-Bello,A.et al.,(1995),Neuron,15：821-828)。 其他的GDNF家族生長成員在神經系統以外發揮功能(Trupp,M.et al.,(1995),J.Cell Biol.130：137-148；Kotzbauer,P.T.et al.,(1996),Nature 384：467-470；Springer,J.E.,et al.(1994),Exp.Neurol.127：167-170；Schaar.D.G.,et al.,(1993),Exp.Neurol.124：368-371)。舉例而言，NRTN、ARTN及PSPN也在發育中的腎臟內表現。GDNF於神經系統以外在調節腎臟型態發育以及精子發育中扮演關鍵角色(Airaksinen,M.S.et al.,(2002),Nature Reviews 3：383-392)。
GDNF的各個成員偏好結合至(亦即為下列的配體)與細胞質膜動態締合之糖化磷脂醯肌醇(GPI)-錨定蛋白受體。GDNE-家族受體阿伐家族是由四種不同的受體組成：GFR阿伐1(GFRα1、GDNFR-阿伐)；GFR阿伐2(GFRα2/TrnR2/GDNFR-貝他/NTNR-阿伐/RETL2)；GFR阿伐3(GFRα3)；以及GER阿伐4(GFRα4)。GDNF偏好結合至GFRα1，NRTN偏好結合至GFRα2，ARTN偏好結合至GFRα3，而PSPN偏好結合至GFRα4(Airaksinen,M.S.,et al.Nature Reviews Neuroscience(2002),3：383-394)。
GFRα2在皮質、前腦基底部，及嗅球的特定層被高度表現，但在黑質、小腦及運動核中罕為被表現。GFRα3在胎兒及成鼠神經、交感神經節與感覺神經節、腸、心臟、腦、肺臟與腎臟中被表現。GFRα4在成人的不同腦區以及在一些周邊組織(包括睪丸及心臟)中以低量表現。儘管上文顯示GDNF家族成員結合偏好性為GDNF對GFRα1；神經秩蛋白對GFRα2；阿爾特素對GFRα3；而頗斯菲素對GFRα4，配體受體配對並不是嚴格的(Airaksinen,M.S.,et al.Nature Reviews Neuroscience(2002),3：383-394)。例 如，GDNF以比其結合至GFRα1還低的效率結合至GFRα2與GFRα3。
GDNF家族配體，通常但不排除，透過由配體、其GFR阿伐受體與受體酪胺酸激酶(c-Ret)組成的多組份複合物傳送其訊號。Ret是此等配體訊號傳遞複合物的一個常見要素。Ret是一種原致癌基因，其透過活化磷酸肌醇-3激酶(PI3-K)/PDK/AKT(PKB)以及Ras/Raf/MEK/ERK路徑來強烈活化抗-細胞凋亡訊號。Ret也能夠活化磷酸脂酶C伽馬(PLCγ)，其升高細胞內鈣且促使習知與新穎的蛋白激酶C(PKC)家族的成員活化。GDNF家族配體受體複合物不限於透過Ret傳遞訊號。GDNF：GFRα1可結合至缺乏RET之細胞中的NCAM並活化Fyn與FAK。在一些情況下，GDNF：GFR阿伐複合物直接活化src激酶。
在本發明的某些具體例中，GFRα3的三個富含半胱胺酸的球形域(1、2或3)的一或多者或其片段可用來製備結合GFRα3並抑制其功能，或抑制其結合其配體(諸如阿爾特素)之能力的抗體。在某些具體例中，對GFRα3具有特異性之本發明抗體可結合至GFRα3上的配體-結合域，且諸如可阻斷配體(阿爾特素)-GFRα3複合物結合至RET。人類GFRα3的全長胺基酸序列顯示為SEQ ID NO：375。編碼人類GFRα3的核酸顯示於SEQ ID NO：374中。結構域1橫跨SEQ ID NO：375的殘基44-124；結構域2橫跨SEQ ID NO：375的殘基162-239；結構域3橫跨SEQ ID NO：375的殘基248-340。(參見SEQ ID NO：375或Genbank NP_001487.2)
這些結構域1、2或3或自其衍生而來的片段中的任一者可用來製備特異地結合至GFRα3並抑制其活性，或至少與GFRα3相關的至少一種功能的抗體。在某些具體例中，本發明抗體特異 地結合至GFRα3且可阻止藉由GFRα3媒介的訊號傳遞。在某些具體例中，特異地結合至GFRα3的抗體可阻止GFRα3結合至其配體，諸如阿爾特素(Wang,X.et al.Structure,(2006),14：1083-1092)。在某些具體例中，特異地結合至GFRα3的抗體可阻止RET受體酪胺酸激酶的活化。在某些具體例中，本發明抗體可特異地結合至GFRα3而不會阻止RET受體酪胺酸激酶的活化。在某些具體例中，本發明抗體可特異地結合至GFRα3並阻止透過RET或透過RET以外的中介因子進行訊號傳遞。在某些具體例中，本發明抗體可用於抑制腫瘤細胞生長/增殖，且因此可用來治療某些癌症/惡性腫瘤，或與此等癌症/惡性腫瘤相關的疼痛(參見Tang,J-Z,et al.Mol Cancer Ther(2010),9(6)：1697-1708；Kang,J.et al.Oncogene,(2009),28：2034-2045；Ceyhan,G.O.et al.Annals of Surgery,(2006),244(2)：274-281；Banerjee,A.,et al.Breast Cancer Res(2011),13：R112；Pandey,V.et al.,Endocrinology,(2010),151(3)：909-920；Kang,J.et al.,Oncogene,(2010),29：3228-3240；Li,S.et al.J Biomed Sci(2011),18：24)。在某些具體例中，特異地結合至GFRα3的抗體可使用上述區域的片段，或自本文所述之區域的N端或C端或兩者延伸超過指定區域約10至約50個胺基酸殘基來製備。在某些具體例中，具有上述區域或其片段之任一種組合可用於製備GFRα3特異性抗體。如上所述，為供製備抗-hGFRα3特異性抗體之用，涵蓋hGFRα3之三個結構域的胺基酸殘基長度或數目可能由全長結構域或其片段的N端或C端或兩者延伸約十至五十個胺基酸殘基而變化。
抗體的抗原-結合片段
除非另有特別指明，否則如本文所用術語”抗體”應理解為涵蓋包含兩個免疫球蛋白重鏈以及兩個免疫球蛋白輕鏈的抗體分子(亦即”完全抗體分子”)及其抗原-結合片段。術語抗體的”抗原-結合部分”、抗體的”抗原-結合片段”及類似用語如本文所用包括所有天然存在的、以酵素所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白，其特異地結合抗原而形成複合物。術語抗體的”抗原-結合部分”或”抗體片段”如本文所用意指抗體維持能特異地結合至hGFRα3的一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或經單離CDR。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變及(視情況)恆定域的DNA之重組遺傳工程技術)而衍生自例如完全抗體分子。此DNA為已知及/或容易由例如商業來源、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)取得或可合成。DNA可以被定序並且以化學方式或藉由使用分子生物技術操作，例如將一或多個可變域及/或恆定域排成適當構形，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的最小辨識單元(例如經單離的互補決定區(CDR))。其他經工程化的分子(諸如雙抗體、三抗體、四抗體及微抗體)亦含括在如本文所用用語”抗原-結合片段”中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少一個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成，且通常含有至少一個鄰近一 或多個骨架序列或在一或多個骨架序列框中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原-結合片段中，VH以及VL域可相對另一者以任一種適當排列位處。舉例而言，可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少一個共價連結至少一個恆定域的可變域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定域的非限制例示性構形包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構形)，可變與恆定域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明抗體的抗原-結合片段可包含上列可變與恆定域構形的任一者彼此及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完全抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少兩個不同可變域，其中各個可變域能夠特異地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多特異性抗體形式，包括本文揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用該技 藝中可取得之慣用技術改造成使用於本發明抗體的抗原-結合片段中。
人類抗體的製備
用於在轉殖小鼠中製造人類抗體的方法為技藝中已知的。任何此等已知方法可用於本發明的上下文中以製造特異地結合至人類GFRα3的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他用於生成單株抗體的已知方法，首先分離出帶有人類可變區以及小鼠恆定區之對GFRα3具高度親和力的嵌合抗體。如同在下面實驗節中，鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性，包括親和力、選擇性、抗原決定位等。小鼠恆定區取代成所欲的人類恆定區以生成本發明的完全人類抗體，例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4。儘管選定的恆定區可能會依據特定用途、可變區中的高親和力抗原-結合以及目標特異性特性而改變。
一般而言，本發明抗體具有極高親和力，當藉由結合至固定於固體相上或呈溶液相的抗原測量時，通常具有自約10-13至約10-8M，或約10-12至約10-9M的KD。小鼠恆定區可以取代成所欲人類恆定區以生成本發明的完全人類抗體。儘管選定的恆定區可能會依據特定用途、可變區中的高親和力抗原-結合以及目標特異性特性而改變。
生物等效性
本發明的抗-GFRα3抗體以及抗體片段含括帶有由那些所述抗體變化而來，但仍保有結合人類GFRα3能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相較之下，此等變異抗體以及抗體片段 包含有一或多個胺基酸加入、刪除或置換，但仍展現出基本上與所述抗體等效的生物活性。同樣地，當與所揭示的序列相較之下，本發明之抗-GFRα3抗體編碼DNA序列含括具有一或多個核苷酸加入、刪除或置換，但仍編碼基本上與本發明之抗-GFRα3抗體或抗體片段生物等效的抗-GFRα3抗體或抗體片段的序列。
舉例而言，若兩個抗原-結合蛋白或抗體是藥學等效物或藥學代用品，當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投與時的吸收速率與程度未顯示出明顯差異(不論是單劑量或多劑量)，它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上沒有，它們將會被視為等效物或藥學代用品但不被視為生物等效，因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映，對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的，並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中，若兩個抗原-結合蛋白就其安全性、純度以及效力而言在臨床上並無有意義的差異，它們是生物等效的。
在一個具體例中，若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續療法而沒有這樣改變的情況下相比，在免疫原性上的臨床顯著變化，或減低有效性)時，則兩個抗原-結合蛋白是生物等效的。
在一個具體例中，若兩個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制發揮作用達致此等機制已知的程度，它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內和活體外方法證實。生物等效性測量法包括，例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度；(b)已使用活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測用於人類的活體外測試；(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體(或其目標)之適當急性藥理學效用；以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明之抗-GFRα3抗體的生物等效變體可以藉由例如，製造各種殘基或序列置換，或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言，對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後防止形成不必要或不正確分子內雙硫橋的胺基酸。在其他上下文中，生物等效性抗體可包括抗-GFRα3抗體變體，其含有會修飾抗體之糖化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖化的突變。
包含Fc變體的抗-GFRα3抗體
依據本發明的某些具體例，提供抗-GFRα3抗體，其包含含有一或多個突變的Fc域，該一或多個突變提高或減少抗體結合至FcRn受體，例如與中性pH相比還酸的pH下。舉例而言，本發明包括抗-GFRα3抗體，其在Fc域的CH2或CH3區中含有突變，其中該(等)突變在酸性環境(例如在吞噬小體中，pH範圍為約5.5至約6.0)下增加Fc域對FcRn的親和力。當被投與給動物時，此等突變可使得抗體在血清中的半衰期增加。此等Fc修飾的非限制性實例包括，例如在下列位置處的修飾：250(例如，E或Q)；250與428(例 如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)，及256(例如，S/R/Q/E/D或T)；或在下列位置處的修飾：428及/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如，H/F或Y)；或在位置250及/或428處的修飾；或在位置307或308處的修飾(例如，308F，V308F)，以及434。在一個具體例中，該修飾包含428L(例如，M428L)與434S(例如，N434S)修飾；428L、259I(例如，V259I)，及308F(例如，V308F)修飾；433K(例如，H433K)與434(例如，434Y)修飾；252、254，及256(例如，252Y、254T，及256E)修飾；250Q與428L修飾(例如，T250Q與M428L)；以及307及/或308修飾(例如，308F或308P)。
舉例而言，本發明包括含有一Fc域的抗-GFRα3抗體，其包含一或多對或一或多群選自由下列組成之群的突變：250Q與248L(例如，T250Q與M248L)；252Y、254T與256E(例如，M252Y、S254T與T256E)；428L與434S(例如，M428L與N434S)；以及433K與434F(例如，H433K與N434F)。前述Fc域突變以及本文揭示抗體可變域內其他突變的所有可能組合為本發明範圍內所能預想。
抗體的生物特性
一般而言，本發明抗體可藉由結合至hGFRα3的富含半胱胺酸的三個球形域(1、2或3)的任一或多者而發揮作用。在某些具體例中，本發明抗體可結合至hGFRα3的至少一個富含半胱胺酸結構域上的抗原決定位。在某些具體例中，本發明抗體可結合至GFRα3的結構域1的胺基酸殘基，範圍自SEQ ID NO：375的約殘基44至約殘基124。在某些具體例中，本發明抗體可結合至GFRα3 的結構域2的胺基酸殘基，範圍自SEQ ID NO：375的約殘基162至約殘基239。在某些具體例中，本發明抗體可結合至GFRα3的結構域3的胺基酸殘基，範圍自SEQ ID NO：375的約殘基248至約殘基340。在某些具體例中，本發明抗體可透過結合至作為配體結合域的結構域中任一者藉由阻斷或抑制GFRα3活性，因而阻止配體(諸如阿爾特素)結合至彼位來發揮作用。在某些具體例中，本發明抗體可結合至GFRα3的一結構域上的配體結合位點並阻止阿爾特素-GFRα3複合物後續結合至RET。在一個具體例中，本發明抗體可結合至阿爾特素-GFRα3複合物的一或多個抗原決定位，其可決定配體與GFRα3之間的特異性或在其中發揮作用，諸如在SEQ ID NO：375的殘基167-184的區域內。在某些具體例中，本發明抗體可結合至結構域2的一或多個殘基，該一或多個殘基為阿爾特素與GFRα3之間的特異性以及結合所需，例如SEQ ID NO：375在位置167(met)、176(asp)及/或位置184(glu)處的胺基酸殘基，可阻止配體結合至其受體，並可阻止透過RET受體酪胺酸激酶，或透過RET以外的訊號傳遞中介因子或調節子進行後續訊號傳遞。在某些具體例中，本發明抗體可結合至GFRα3的膜結合形式，或GFRα3的可溶形式。在某些具體例中，本發明抗體可結合GFRα3，但不與GFRα1、GFRα2，或GFRα4交叉反應。在某些具體例中，本發明抗體可為雙特異性抗體。本發明之雙特異性抗體可結合某個結構域的某個富含半胱胺酸區的某一個抗原決定位，且亦可結合hGFRα3的第二結構域中的某個富含半胱胺酸區。在某些具體例中，本發明之雙特異性抗體可結合至相同結構域中的兩個不同區域。在某些具體例中，本發明的雙特異性抗體的一臂可結合至hGFRα3的某 個結構域的某一個富含半胱胺酸的區域，而另一臂可結合至RET，或結合至RET以外的調節子。在某些具體例中，雙特異性抗體可結合GFRα3中的某一個結構域以及GFRα1或GFRα2中的某一個結構域。
更具體而言，本發明之抗-GFRα3抗體可表現出一或多種下列特性：(i)當藉由表面電漿共振測量時表現自約10-8M至約10-13M的KD，(ii)顯示有阻斷約50-100% GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力，IC50值自約40pM至約15nM；(iii)顯示有阻斷約20%至約100% GFRα3結合至經阿爾特素及RET之混合物塗佈之固體載體的能力；(iv)以自約200pM至約50nM的IC50阻斷或抑制RET的阿爾特素依賴性活化；(v)在骨癌疼痛的活體內模型中抑制或降低一或多種痛覺反應；(vi)在活體內抑制或降低經阿爾特素致敏的溫度痛覺過敏；(vii)在骨關節炎的活體內模型中抑制或降低觸痛覺過度敏感；(viii)不與RET的其他GFR共受體交叉反應；(ix)包含一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、 258、274、290、306、322、338、354、381及397；或(x)包含一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
本發明的某些抗-GFRα3抗體在活體外分析中能夠抑制或減弱GFRα3活性。本發明抗體結合至GFRα3並單獨或於RET存在下抑制GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力可使用習於技藝者熟知的任一種標準方法來測量，任一種方法包括結合分析，或測定抗體是否藉由抑制GFRα3結合至其受體阿爾特素而阻斷RET活化的分析(諸如本文所述彼等)。用於測量GFRα3活性的非限制性、例示性活體外分析例示於下面實例4與5中。
本發明包括抗-GFRα3抗體及其抗原結合片段，其結合至GFRα3的一或多個富含半胱胺酸的球形域(如SEQ ID NO：375中所示)或其片段。對GFRα3具有特異性的抗體可不含有其他標誌或部分，或其等可含有N端或C端標誌或部分。在一個具體例中，該標誌或部分為生物素。在結合分析中，標誌的位置(若有的話)於肽結合之後可決定肽相對於表面的位向。舉例而言，若表面塗佈有卵白素，則含有N端生物素的肽將被定向而使得該肽的C端部分遠離表面。
在一個具體例中，本發明提供一種完全人類單株抗體或其抗原-結合片段，其特異地結合hGFRα3並中和hGFRα3活性，其中該抗體或其片段表現一或多種下列特性：(i)包含一HCVR，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO： 2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；(ii)包含一LCVR，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405；(iii)包含表1中所列重鏈或輕鏈CDR1、CDR2與CDR3序列的任一或多者及其組合；(iv)對結合至GFRα3具有特異性及/或阻斷GFRα3活性而不會結合至其他GFR阿伐受體及/或阻斷其他GFR阿伐受體，包括GFRα1、GFRα2與GFRα4；(v)證實對GFRα3的富含半胱胺酸的球形域的一或多者具有特異性結合；(vi)阻斷透過RET受體酪胺酸激酶的活化與訊號傳遞；(vii)抑制或降低阿爾特素致敏的活體內溫度痛覺過敏；(viii)抑制或降低骨關節炎活體內模型的觸痛覺過度敏感；或抑制或降低骨癌疼痛的活體內模型的一或多種痛覺反應。
抗原決定位拼圖以及相關技術
可使用技藝中具有通常技術者所熟知的各種技術來決定一個抗體是否會與多肽或蛋白質中的”一或多個胺基酸交互作用”。例示性技術包括，例如Harlow and Lane的”Antibodies”所述的慣用交叉-阻斷分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)來進行。其他方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)、肽切割分析、結晶研究與NMR分析。此外，可以採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)。另一種可用於鑑別與抗體交互作用之多肽中的胺基酸 的方法為透過質譜偵測氫/氘交換。在通常術語中，氫/氘交換法涉及將感興趣的蛋白質標記氘，然後將抗體結合至經氘標記的蛋白質。接下來，蛋白質/抗體複合物被轉移至水且受到抗體複合物保護之胺基酸內的可交換質子以比非介面部分的胺基酸內的可交換質子還慢的速率歷經氘至氫回復交換。於是，形成蛋白質/抗體介面一部分的胺基酸可保留氘並因此相較於未被納入介面中的胺基酸表現出相對較高的質量。在抗體解離後，目標蛋白質被進行蛋白酶切割與質譜分析，從而揭開經氘標記的殘基，其對應於與抗體交互作用的特定胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
術語”抗原決定位”也意指B細胞及/或T細胞所反應的抗原上的一個位點。B細胞抗原決定位可由因為蛋白質三級摺疊而相鄰的連續胺基酸或不連續胺基酸所形成。由連續胺基酸所形成的抗原決定位通常維持暴露於變性溶液，而由三級摺疊所形成的抗原決定位通常在以變性溶液處理後喪失。抗原決定位於特有空間構形內通常包括至少3個，且一般更包括至少5個或8-10個胺基酸。
修飾-輔助分析(MAP)，亦已知為以抗原結構為基礎的抗體分析(ASAP)是一種將針對相同抗原的大量單株抗體(mAb)依據各個抗體對經化學或酵素修飾之抗原表面的結合概況相似性予以分類的方法(US 2004/0101920，以其整體併入本文做為參考資料)。每一個分類可反映獨特的抗原決定位是與另一類所代表的抗原決定位完全不同或部分重疊。這個技術允許快速過濾出在遺傳 學上相同的抗體，以使得鑑定能夠著重在遺傳學上有所差異的抗體。當應用在融合瘤篩選時，MAP可加快鑑定出生產帶有所要特性之mAb的罕見融合瘤細胞株。MAP可用於將本發明抗體分選成結合不同抗原決定位的抗體群。
在某些具體例中，抗-GFRα3抗體或抗體之抗原-結合片段結合GFRα3富含半胱胺酸結構域1、2或3或其片段的至少一者中的一個抗原決定位，其中結構域1範圍在SEQ ID NO：375的自約殘基號碼44至約殘基號碼124；結構域2範圍在SEQ ID NO：375的自約殘基號碼162至約殘基號碼239；結構域3範圍在SEQ ID NO：375的自約殘基號碼248至約殘基號碼340。
在某些具體例中，抗-GFRα3抗體或抗體之抗原-結合片段結合人類GFRα3之結構域1或其片段中的抗原決定位。
在某些具體例中，抗-GFRα3抗體或抗體之抗原-結合片段結合人類GFRα3之結構域2或其片段中的抗原決定位。
在某些具體例中，抗-GFRα3抗體或抗體之抗原-結合片段結合人類GFRα3之結構域3或其片段中的抗原決定位。
在某些具體例中，該抗體或抗體片段結合某個抗原決定位，其包括在結構域1、2或3內及/或兩個不同結構域內GFRα3的一個以上經列舉抗原決定位(例如，1與2結構域內，或2與3結構域內，或1與3結構域內的抗原決定位)。
在某些具體例中，該抗體為雙特異性抗體，其結合GFRα3的某個結構域中的一個抗原決定位以及GFRα3的不同結構域中的另一個抗原決定位。在一個具體例中，該抗體為雙特異性抗體，其結合GFRα3的結構域1中的一個抗原決定位以及GFRα3的 結構域2中的另一個抗原決定位。在一個具體例中，該抗體為雙特異性抗體，其結合GFRα3的結構域1中的一個抗原決定位以及GFRα3的結構域3中的另一個抗原決定位。在一個具體例中，該抗體為雙特異性抗體，其結合GFRα3的結構域2中的一個抗原決定位以及GFRα3的結構域3中的另一個抗原決定位。
本發明包括與本文所述特定例示性抗體任一者(例如，H4H2207N、H4H2212N、H4H2236N3、H4H2243N2、H4H2210N、H4H2234N、H4H2291S、H4H2292S、H4H2293P、H4H2294S、H4H2295S、H4H2296S、H4H2341S、H4H2342P、H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S、H4H2350P、H4H2352S、H4H2354S、H4H2355S、H4H2357S、H4H2364S、H1M2243N及H1M2236N)結合至相同抗原決定位的抗-GFRα3抗體。同樣地，本發明亦包括與本文所述特定例示性抗體任一者競爭結合至GFRα3或GFRα3片段的抗-GFRα3抗體。
吾人可容易地藉由使用技藝中已知的慣常方法決定一個抗體是否會與參考抗-GFRα3抗體結合至相同的抗原決定位，或與參考抗-GFRα3抗體競爭結合至相同抗原決定位。例如，為決定一測試抗體是否會結合至與本發明參考抗-GFRα3抗體相同的抗原決定位，容許該參考抗體在飽合條件下結合至GFRα3蛋白或肽。接著，評估測試抗體結合至GFRα3分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-GFRα3抗體飽合結合之後結合至GFRα3，則可推論該測試抗體結合至與參考抗-GFRα3抗體不同的抗原決定位。另一方面，若測試抗體無法在參考抗-GFRα3抗體飽合結合後結合至GFRα3分子，則該測試抗體可能結合至與本發明參考抗-GFRα3抗體所結合 之抗原決定位相同的抗原決定位。
為測定一個抗體是否與參考抗-GFRα3抗體競爭結合，以兩個方面來進行上述結合方法學：在第一個方面，容許參考抗體在飽和條件下結合至GFRα3分子，繼而評估測試抗體對GFRα3分子的結合。在第二個方面，容許測試抗體在飽和條件下結合至GFRα3分子，繼而評估參考抗體對GFRα3分子的結合。若在兩個方面中，僅有第一(飽和)抗體能夠結合至GFRα3分子，則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至GFRα3。如技藝中具有通常技術者所了解，與參考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定位，但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰抗原決定位來阻斷參考抗體的結合。
若兩個抗體競爭抑制(阻斷)另一者結合至抗原，則它們結合至相同或重疊抗原決定位。亦即，在一個競爭性結合分析中測量一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一個抗體達至少50%，但較佳75%、90%或甚至99%(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)。或者，若基本上所有在抗原中會減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體被視為具有相同抗原決定位。若會減少或消除抗體結合的一些胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體被視為具有重疊的抗原決定位
接而可進行其他慣常實驗(例如肽突變與結合分析)以確認觀察測試抗體沒有結合實際上是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定位，或若沒有觀察到結合是因為其空間障礙(或另一現象)。這類實驗係使用ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀 或技藝中可供使用的其他任何定量或定性抗體-結合分析來進行。
物種選擇性以及物種交叉反應性
依據本發明的某些具體例，抗-GFRα3抗體結合至人類GFRα3而不會結合至其他物種的GFRα3。或者在某些具體例中，本發明抗-GFRα3抗體結合至人類GFRα3以及一或多個非人類物種的GFRα3。舉例而言，本發明的抗-GFRα3抗體可以結合至人類GFRα3並且視情況可能結合或不結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、馬來猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩GFRα3的一或多者。
免疫接合物
本發明含括接合至一治療部分(”免疫接合物”)(諸如能夠降低疼痛及/或發炎的藥劑、化療藥物或放射性同位素)的人類抗-GFRα3單株抗體。可接合至抗-GFRα3抗體的治療部分類型將考量到待治療的病況以及要達到的所需治療效用。舉例而言，為治療急性或慢性疼痛，諸如NSAID、類鴉片，或COX-2抑制劑或局部麻醉劑、或第二GFRα3抑制劑的藥劑可接合至GFRα3抗體。或者，若所需的治療效用是治療與疼痛病況有關的發炎，將消炎藥劑接合至抗-GFRα3抗體是有利的，消炎藥劑為諸如(但不限於)塞來昔布或細胞激素拮抗劑(諸如IL-1或IL-6抑制劑)。若待治療病況為癌症病況，將化療藥物或放射性同位素接合至GFRα3抗體是有利的。用以形成免疫接合物的適當藥劑的實例為技藝中已知的，參見例如WO 05/103081。
多特異性抗體
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異 性。多特異性抗體可以是對一個目標多肽的不同抗原決定位具有特異性或者可能含有對超過一個目標多肽具有特異性的抗原-結合域。參見例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明的抗-GFRα3抗體可以連結至另一個功能性分子(例如另一個肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子一起表現。舉例而言，抗體或其片段在功能上可以連結(例如，藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或抗體片段，以產生帶有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白的一臂對人類GFRα3或其片段具有特異性，而免疫球蛋白的另一臂對第二治療目標具有特異性或接合至一個治療部分。在本發明的某些具體例中，免疫球蛋白的一臂對hGFRα3或其片段的某結構域上的抗原決定位具有特異性，而免疫球蛋白的另一臂對hGFRα3的第二結構域上的抗原決定位具有特異性。在某些具體例中，免疫球蛋白的一臂對hGFRα3的某結構域上的抗原決定位具有特異性，而另一臂對hGFRα3的相同結構域上的第二抗原決定位具有特異性。
可以使用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一與第二Ig CH3域因為至少一個胺基酸而彼此不同，以及其中與缺少該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下，至少一個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中，該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有一個會減低或消除蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照 EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT；按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括：在IgG1抗體的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗體的情況下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗體的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式的變異在本發明範圍中是可預想的。
治療性投藥以及調配物
本發明提供包含有本發明之抗-GFRα3抗體或其抗原-結合片段的醫藥組成物。投與本發明的治療組成物可與適當載劑、賦形劑以及其他併入配方中以提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起投與。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的調配物：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些配方包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳劑、乳化卡波蠟(具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體劑量可以視待投與個體的年齡與身材、目標疾 病、病況、投藥途徑以及類似因素而改變。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療各種病況與疾病中與GFRα3活性有關的疼痛(其中該病況或疾病造成急性或慢性疼痛、發炎性疼痛、神經性疼痛及類似疾病)時，通常以約0.01至約20mg/kg體重、更佳約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至3mg/kg體重的單劑量靜脈內投與本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物，例如封裝在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見，例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與，例當藉由輸注或團注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收，並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。
醫藥組成物可在囊泡中被遞送，尤其是在脂質體中(參見，例如Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
在某些情況下，醫藥組成物以控制釋放系統的方式被投遞。在一個具體例中，可使用泵。在另一具體例中，可使用聚合材料。在又另一個具體例中，控制釋放系統被置放在組成物目標鄰近處，因此僅需要全身性劑量的一部分。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公知方法製 備。例如，可注射製品可例如，藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質，例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等，其可與適當助溶劑(諸如醇(乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
本發明的醫藥組成物可以使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣空了，空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說，沒有可換式卡匣。更確切地來說，拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物，整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆型以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括，但絕對不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、 HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆型遞送裝置的實例包括，但絕對不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅舉幾個為例。
有利地，上述供口服或非經口使用的醫藥組成物被製備為呈適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括，例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。在1個單位劑量中，所含前述抗體的數量通常每劑型約5至約500mg；尤其是呈注射劑形式，所含前述抗體就其他劑型而言較佳約5至約100mg以及約10至約250mg。
抗體的治療用途
本發明抗體可用於治療、預防及/或改善與GFRα3活性相關的任一種疾病、病症或病況，或用於改善與該疾病、病症或病況有關的至少一種症狀，或用於減輕與此疾病、病症或病況相關的疼痛。可使用本發明抗-GFRα3抗體治療的例示性病況、疾病及/或病症，及/或與此病況、疾病或病症有關之疼痛包括急性、 慢性、神經病性或發炎性疼痛、關節炎、間質性膀胱炎、胰臟炎、偏頭痛、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀皰疹神經痛、一般性神經痛、癲癇或癲癇病況、肌強直、心律不整、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調、大腸急躁症、發炎性腸病、急尿、失禁、直腸敏感、內臟疼痛、骨關節炎疼痛、痛風、帶狀皰疹後神經痛、糖尿病性神經病變、齒根痛、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、癌症疼痛(包括與骨癌或胰臟癌有關的疼痛)。
其他可被本發明治療方法所治療的病況包括遺傳性肢端紅痛症、鼻炎、前列腺癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌，或膀胱異常。本發明抗體或其抗原-結合片段也可用來治療下列病況：非惡性急性、慢性或骨折骨疼痛；類風溼性關節炎、椎管狹窄；神經病性下背痛；肌膜疼痛症候群；肌纖維痛；顳顎關節病症；內臟疼痛，包括腹痛；胰臟；慢性頭痛；緊張型頭痛，包括叢集性頭痛；糖尿病性神經病變；HIV-相關神經病變；夏馬杜三氏神經病變；遺傳性感覺神經病變；周邊神經損傷；疼痛性神經瘤；異位性近端與遠端放電；神經根病變；化療引起的神經性疼痛；放射療法引起的神經性疼痛；乳房切除術後疼痛；中樞性疼痛；脊髓損傷疼痛；中風後疼痛；丘腦性疼痛；複雜性局部疼痛症候群(CRPS)；幻痛；難治性疼痛；肌肉骨骼疼痛；關節痛；急性痛風疼痛；機械性下背痛；頸疼痛；肌腱炎；損傷/運動疼痛；腹痛；腎盂腎炎；闌尾炎；膽囊炎；腸閉塞；疝氣；等等；胸痛，包括心痛；骨盆疼痛、腎絞痛、急性產科痛，包括陣痛；剖腹產疼痛；燒傷與創傷疼痛；子宮內膜異位症；帶狀皰疹疼痛；鐮刀細胞貧 血；急性胰臟炎；突發性疼痛；口頜面痛，包括鼻竇炎疼痛、牙痛；多發性硬化症疼痛；痲瘋疼痛；貝塞氏病疼痛；痛性肥胖症；靜脈炎疼痛；格巴二氏症候群疼痛；腳痛與趾動；哈格蘭氏症候群；費勃來氏症疼痛；膀胱與泌尿生殖器疾病；膀胱機能亢進。
在一個具體例中，本發明抗體可用來治療功能性疼痛症候群，其中該功能性疼痛症候群是選自由下列組成之群：慢性下背痛、大腸急躁症(IBS)、肌纖維痛(FM)、慢性疲勞症候群(CFS)、腹痛、顳顎關節病症(TMJD)、膀胱疼痛症候群(間質性膀胱炎)、功能性胃腸病症/症候群、功能性胸痛症候群、偏頭痛及緊張型頭痛、慢性骨盆疼痛症候群、前列腺疼痛症候群(慢性前列腺炎)、多種化學品敏感症候群，以及波斯灣症候群。
本發明抗體或其抗原-結合片段亦可用來抑制腫瘤細胞生長/增殖，或腫瘤細胞的轉移。因此在某些具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段可用來治療癌症，包括(但不限於)子宮內膜癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、結腸癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、非小細胞肺癌、腦癌、白血病、淋巴瘤、骨癌，或與癌症轉移有關的疼痛，例如與癌症轉移至骨頭相關的疼痛。(參見Tang,J-Z,et al.Mol Cancer Ther(2010),9(6)：1697-1708；Kang,J.et al.Oncogene,(2009),28：2034-2045；Ceyhan,G.O.et al.Annals of Surgery,(2006),244(2)：274-281；Banerjee,A.,et al.Breast Cancer Res(2011),13：R112；Pandey,V.et al.,Endocrinology,(2010),151(3)：909-920；Kang,J.et al.,Oncogene,(2010),29：3228-3240；Li,S.et al.J Biomed Sci(2011),18：24)。
本發明抗體亦可用於治療或預防與癌症相關的疼 痛。”癌症相關疼痛”包括，例如骨癌疼痛，包括已轉移至骨頭的癌症(例如，乳癌、前列腺癌、肺癌、肉瘤、腎癌、多發性硬化症等)的疼痛。”癌症相關疼痛”通常亦更包括與癌性病況相關的疼痛，諸如(例如)腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經膠瘤、骨肉瘤、結腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺炎、滑液肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。本發明抗體亦可用於治療或預防由癌症療法或抗癌醫學治療所致或與其相關的疼痛，例如化療引起的神經性疼痛，諸如由下列所致或與使用下列治療有關的疼痛：太平洋紫杉醇(TaxolTM)、多西他賽(Taxotere®)；亞硝基尿、環磷醯胺、阿黴素、表阿黴素、5-氟尿嘧啶、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、雌氮芥，以及鉑基化療化合物，諸如順鉑、卡鉑及異丙鉑。
組合療法
組合療法可包括本發明抗-hGFRα3抗體，以及例如另一種GFRα3拮抗劑(例如抗-GFRα3抗體或GFRα3的小分子抑制劑)；COX-2抑制劑；局部麻醉劑；NMDA調節劑；大麻素受體促效劑；P2X家族調節劑；VR1拮抗劑；物質P拮抗劑；電壓閘控鈉通道(Nav)的抑制劑，例如Nav1.7拮抗劑，或Nav1.8拮抗劑(例如抗-Nav1.7或抗-Nav1.8抗體或小分子抑制劑)，或Nav1.9拮抗劑(例如抗-Nav1.9抗體或Nav1.9的小分子抑制劑)；鈣通道抑制劑；鉀通道抑制劑；細胞激素抑制劑或細胞激素受體拮抗劑(例如，介白素-1(IL-1)抑制劑(諸如列洛西普(rilonacept)(“IL-1 trap”；Regeneron)或阿那白滯素(anakinra)(KINERET®,Amgen)、小分子IL-1拮抗劑，或抗-IL-1抗體)；IL-18抑制劑(諸如小分子IL-18拮抗劑或抗-IL-18 抗體)；IL-6或IL-6R抑制劑(諸如小分子IL-6拮抗劑、抗-IL-6抗體或抗-IL-6受體抗體)；抗癲癇/抗痙攣藥物(例如佳巴本汀、普瑞巴林)；神經生長因子(NGF)抑制劑(例如，小分子NGF拮抗劑或抗-NGF抗體)；BDNF、TrkA、TrkB或p75的抑制劑；類鴉片；嗎啡；低劑量秋水仙素；阿斯匹林或另一種NSAID；類固醇(例如波尼松、氨甲蝶呤等)；低劑量環孢素A；選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)；血清素正腎上腺素再吸收抑制劑(SNRI)；三環；腫瘤壞死因子(TNF)或TNF受體抑制劑(例如，小分子TNF或TNFR拮抗劑或抗-TNF或TNFR抗體)；TWEAK(細胞凋亡的TNF相關WEAK誘導體)的抑制劑；RET抑制劑；GDNF家族配體的抑制劑；GFRα1、GFRα2或GFRα4的抑制劑；酸感應離子通道(例如ASIC1或ASIC3)；尿酸合成抑制劑(例如異嘌呤醇)；尿酸分泌促進劑(例如丙磺舒、磺吡酮、苯溴香豆酮等)；前動力蛋白受體(PROK1與PROK2)的抑制劑；其他發炎性抑制劑(例如，凋亡蛋白酶-1、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig的抑制劑等)；及/或皮質類固醇。
投藥方案
依據本發明的某些具體例，多劑量之抗-GFRα3抗體可在一段限定時間裡被投與給個體。依據本發明此態樣的方法包含依序將多劑量之抗-GFRα3抗體投與給個體。如本文所用，”依序投與”表示各劑量的抗-GFRα3抗體在不同時間點被投與給個體，例如在由預定間隔(例如數小時、數天、數週或數月)所分開的不同天。本發明包括含有將單起始劑量之抗-GFRα3抗體，接而為一或多個第二劑量的抗-GFRα3抗體，以及視情況一或多個第三劑量的抗-GFRα3抗體依序投與給患者。
術語”起始劑量”、”第二劑量”及”第三劑量”意指投與抗-GFRα3抗體的時間順序。因此，”起始劑量”是在治療方案開始時被投與的劑量(亦意指為”基線劑量”)；”第二劑量”為在起始劑量之後被投與的劑量；而”第三劑量”為在第二劑量之後被投與的劑量。起始劑量、第二劑量與第三劑量可全都含有相同數量之抗-GFRα3抗體，但通常會在投與頻率有所不同。但是，在某些具體例中，起始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含有之抗-GFRα3抗體數量將會在治療期間彼此改變(例如調高或調低，若需要的話)。在某些具體例中，兩個或更多個(例如2、3、4或5)劑量在治療方案開始被投與作為”加載體量”，接著以較不頻繁的方式投與後續劑量(例如”維持劑量”)。
在本發明的一個例示性具體例中，各第二劑量及/或第三劑量在緊接先前劑量之後1至26(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)週被投與。片語”緊接先前劑量”，如本文所用，表示以多次投與的順序，抗-GFRα3抗體劑量在順序上於下一個劑量投與之前沒有任何插入的劑量被投與給患者。
依據本發明此態樣的方法可含有將任一數目的第二劑量及/或第三劑量抗-GFRα3抗體投與給患者。例如，在某些具體例中，僅有單一第二劑量被投與給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量被投與給 患者。同樣地，在某些具體例中，僅有單一第三劑量被投與給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量被投與給患者。
在涉及多個第二劑量的具體例中，各第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率被投與。例如，各第二劑量可在緊接先前劑量之後1至2週被投與給患者。同樣地，在涉及多個第三劑量的具體例中，各第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率被投與。例如，各第三劑量可在緊接先前劑量之後2至4週被投與給患者。或者，第二劑量及/或第三劑量投與給患者的頻率可能隨著治療方案過程而改變。投與頻率也可在治療過程期間由臨床醫師依據個別患者的需要來予以調整。
抗體的治療用途
本發明的抗-GFRα3抗體也可以用來偵測及/或測量樣本中的GFRα3，例如供診斷之用。舉例而言，抗-GFRα3抗體或其片段可以用來診斷特徵在於GFRα3異常表現(例如過度表現、不足表現、缺乏表現等)的病況或疾病。有關GFRα3的例示性診斷分析可包含，例如使得自於一患者的樣本與本發明之抗-GFRα3抗體接觸，其中抗-GFRα3抗體標定有可偵測到的標誌或報導分子。或者，未標定的抗-GFRα3抗體可以組合本身可被偵測到標定之二級抗體一起使用於診斷應用。可偵測到的標誌或報導分子可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅；或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶，或螢光素酶的酵素。可用來偵測或測量樣本中的GFRα3的特定例示性分析包括酵素連結免疫分析法(ELISA)、 放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞選別(FACS)。
依據本發明，可用於GFRα3診斷分析中的樣本包括任何可得自於患者的組織或體液樣本，其在正常或病理狀態下含有可偵測數量的GFRα3蛋白或其片段。一般來說，測量GFRα3在自健康患者(例如未罹患與異常GFRα3濃度或活性有關之疾病或病況的患者)所得到之特定樣本中的濃度以在開始時建立基線，或標準GFRα3濃度。GFRα3的這個基線濃度接而可以與得自於被懷疑帶有與GFRα3相關疾病或病況，或與此疾病或病況相關的疼痛之個體的樣本中所測得的GFRα3濃度來比對。
第1圖. 在接受辣椒素之前2天(接受0.5μg阿爾特素前1天)，以30mg/kg s.c.注射小鼠GFRα3抗體(間接阻斷劑M1M6977N或直接阻斷劑M1M6986N，個別n=8)或同型(陰性)對照抗體(M2M180N，n=8)的動物中，經阿爾特素致敏的辣椒素溫度痛覺過敏的抑制。
第2A與2B圖. 在來自兩個實驗(A & B)之注射纖維肉瘤並以同型(陰性)對照抗體(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療的動物(每組n=8-11)中，藉由馮費瑞毛髮所測得的觸痛覺過度敏感。相較於在相同時間點的同型對照，*p<.05，**p<.01，或***p<.001。
第3A與3B圖. 在來自兩個實驗(A & B)之注射纖維肉瘤並以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療的動物中(每組n=8-11)的同側承重百分率。
第4A與4B圖. 在來自兩個實驗(A & B)之注射纖維肉瘤細胞並以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療的動物(每組n=8-11)中的防護計分。相較於在相同時間點的同型對照，**p<.01。
第5圖. 在注射癌症並以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療的動物(每組n=9-10)中，藉由馮費瑞毛髮所測得的觸痛覺過度敏感。相較於在相同時間點的同型(陰性)對照，*p<.05，**p<.01，或***p<.001。
第6A與6B圖. 在兩個時間點(A=11天& B=18天)注射癌症並以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療(每組n=9-10)的同側承重百分率。依據事後Dunnett氏分析，相較於同型對照抗體，*p<.05。
第7圖. 在注射癌症並以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療的動物中的防護計分(每組n=9-10)。相較於在相同時間點的同型對照，*p<.05，***p<.001。
第8圖. 在以同型(陰性)對照(M2M180N)或M1M6977N或M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體治療之帶有DMM的動物(每組n=10)中，藉由馮費瑞毛髮所測得的觸痛覺過度敏感。相較於在相同時間點的同型對照，**p<.01，***p<.001。
第9圖. 抗-GFRα3抗體結合至生物素hGFRα3-mmH的交叉-競爭分析。
實例
提出下列實例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的正確性，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
實例1. 製造抗人類GFRα3的人類抗體
使用包含具有如SEQ ID NO：370、371、372與373所示胺基酸序列或其片段的GFRα3肽中的任一者的免疫原來產生人類GFRα3的抗體。這些肽被接合至載體(例如KLH)，接著與佐劑一起被投與給VELOCIMMUNE®小鼠以刺激免疫反應，VELOCIMMUNE®小鼠包含編碼人類免疫球蛋白重鏈與κ輕鏈可變區的DNA。藉由GFRα3-特異性免疫分析監控抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，收取脾臟細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞株。篩選並挑選融合瘤細胞株而鑑定出會生產GFRα3-特異性抗體的細胞株。使用此技術，獲得數種抗-GFRα3嵌合抗體(亦即具有人類可變域及小鼠恆定域的抗體)。使用這個方法所製造的抗-GFRα3抗體命名如下：H1M2207N、H1M2212N、H1M2236N、H1M2236N3、H1M2243N、H1M2243N2、H1M2210N及H1M2234N。
如U.S.2007/0280945A1(以其整體併入本文做為參考資料)中所述，亦在不融合至骨髓瘤細胞的情況下直接由抗原- 陽性B細胞分離抗-GFRα3抗體。使用此方法，獲得數種完全人類抗-GFRα3抗體(亦即具有人類可變域與人類恆定域的抗體)；以此方法所製造的例示性抗體命名如下：H4H2207N、H4H2212N、H4H2236N、H4H2243N、H4H2210N、H4H2234N、H4H2291S、H4H2292S、H4H2293P、H4H2294S、H4H2295S、H4H2296S、H4H2341S、H4H2342P、H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S、H4H2350P、H4H2352S、H4H2354S、H4H2355S、H4H2357S及H4H2364S。
依據本實例方法所製造的例示性抗-GFRα3抗體的生物特性詳細描述於下面的實例中。
實例2. 重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列
表1顯示選定抗-GFRα3抗體的重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列對及其對應抗體標識符號。抗體在本文中通常以下列命名法來參照：Fc前綴(例如”H4H”、”H1M”、”H2M”)，接著是數字標識符號(例如表1中所示的”2207”)，然後為”P”、”S”或”N”字尾。因此，依據這個命名法，抗體可參照為例如”H4H2207N”。本文中所用抗體命名的H4H、H1M及H2M前綴表示抗體的特定Fc區。例如，”H2M”抗體具有小鼠IgG2 Fc，而”H4H”抗體具有人類IgG4 Fc。如同技藝中具有通常技術者所理解，H1M或H2M抗體可轉換成H4H抗體，且反之亦然，但在任何情況下，由表1中所示數字標識符號所指之可變域(包括CDR)維持相同。具有相同數字抗體命名，但字尾為N、B、S或P的不同抗體意指具有相同CDR序列的重鏈與輕鏈，但在CDR序列以外的區域(亦即骨架區)有序列差異的抗體。因此，特定抗體的N、B、S與P變體在其重鏈與輕鏈可變區內具有 相同的CDR序列，但在其骨架區內彼此不同。
實例2. 可變基因利用分析
為分析所製造抗體的結構，選殖編碼抗體可變區的核酸並定序。由抗體的核酸序列與預測的胺基酸序列，針對各重鏈可變區(HCVR)與輕鏈可變區(LCVR)鑑定基因利用。表2顯示所選本發明抗體的基因利用。
實例3. GFRα3抗體的結合親和力
抗原結合至抗-GFRα3抗體的結合締合速率常數與解離速率常數(分別為ka與kd)和算出的平衡解離常數與解離半衰期(分別為KD與t1/2)是使用即時表面電漿共振生物感測儀(Biacore T200)分析在25℃與37℃下來進行測定。針對表現有C端myc-myc-六組胺酸標誌(hGFRα3-mmh；SEQ ID：370)、C-端hFc標誌(hGFRα3-hFc；SEQ ID：371)，或C端mFc標誌(hGFRα3-mFc；SEQ ID：372)的人類GFRα3，及表現有C端myc-myc-六組胺酸標誌(MfGFRα3-mmh；SEQ ID：373)的猴GFRa3來測試抗體結合。在藉由直接胺偶合至Biacore CM5感測晶片所產生的山羊抗-小鼠IgG多株抗體(GE Healthcare,# BR-1008-38)或小鼠抗-人類IgG單株抗體(GE Healthcare,#BR-1008-39)表面上捕獲抗-GFRa3抗體。使用HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%介面活性劑P20、pH 7.4)或含有0.05% v/v介面活性劑P20的PBS緩衝液作為運行緩衝液以及樣品緩衝液來進行動力學實驗。藉由注射數個範圍自200至7.4nM(3倍稀釋)的濃度通過經捕獲的抗體表面來評估對人類GFRα3-mmh或猴GFRα3-mmh的結合。藉由注射數個範圍自100至3.7nM(3倍稀釋)的濃度通過經捕獲的抗體表面來評估對人類GFRα3-mFc或人類GFRα3-hFc的結合。監測抗體-抗原締合至多4分鐘，同時監測緩衝液中的解離至多20分鐘。動力學締合(ka)與解離(kd)速率常數是藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理並將數據擬合至1：1結合模型而被確定。由如下的動力學速率常數 計算結合解離平衡常數(KD)與解離半衰期(t1/2)：KD(M)=kd/ka；且t1/2(min)=[ln2/(60*kd)]。
如表3中所示，在25℃下，所有25種抗-GFRα3抗體以範圍自82.0pM至29.7nM的KD值結合至hGFRα3-mmh，所有25種抗-GFRα3抗體以範圍自118pM至47.3nM的KD值結合至hGFRα3-mmh。如表4中所示，在25℃下，所有23種抗-GFRα3抗體以範圍自2.90pM至97.2nM的KD值結合至MfGFRα3-mmh。在37℃下，所有23種抗-GFRα3抗體以範圍自11.7pM至145nM的KD值結合至MfGFRα3-mmh。如表5中所示，在25℃與37℃下，23種抗-GFRα3抗體中的6種測試結合至hGFRα3-hFc，而其他17種測試結合至hGFRα3-mFc。在25℃下，所有6種測試結合至hGFRα3-hFc的抗-GFRα3抗體以範圍自7.50pM至220pM的KD值結合至hGFRα3-hFc。在37℃下，6種測試結合至hGFRα3-hFc的抗-GFRα3抗體以範圍自41.3pM至531pM的KD值結合至hGFRα3-hFc。在25℃下，所有17種測試結合至hGFRα3-mFc的抗-GFRα3抗體以範圍自0.467pM至58.4pM的KD值結合至hGFRα3-mFc。在37℃下，17種測試結合至hGFRα3-mFc的抗-GFRα3抗體以範圍自13.2pM至106pM的KD值結合至hGFRα3-mFc。
*測試結合至hGFRα3-hFc，所有其他抗體測試結合至hGFRα3-mFc
實例4. 藉由抗-GFRα3抗體阻斷人類GFRα3結合至人類阿爾特素
在共受體人類RET存在或不存在下，使用兩種不同的阻斷ELISA形式來測定抗-GFRα3抗體阻斷人類GFRα3結合至人類阿爾特素的能力。
在第一種形式中，於4℃下將帶有C端myc-myc-六組胺酸標誌(h阿爾特素-mmH；SEQ ID：369)的重組型人類阿爾特素蛋白以2ug/ml塗佈在96孔微量滴定盤的PBS緩衝液中過夜，且接著以0.5%(w/v)BSA溶液阻斷。固定量之與C端人類Fc標誌融合的人類GFRα3(hGFRα3-hFc；SEQ ID：371)以120pM預先與不同量的抗體(按連續稀釋0至~10nM)預先混合，繼而在室溫(RT)下培育1小時以容許抗體-hGFRα3-hFc結合達到平衡。之後將經平衡的樣品溶液轉移至經h阿爾特素-mmH塗佈的盤。在1小時結合後，洗滌盤，接著使用HRP-接合的抗-人類IgG Fc特異性抗體(Jackson Immunochemical,#109-035-098)偵測結合的hGFRα3-hFc，並使用TMB HRP受質(BD Biosciences,#51-2606KC與#51-2607KC)使比色訊號顯影。在450nm下於Victor X5盤讀取儀(Perkin Elmer)上紀錄吸光度以測定預平衡hGFRα3-hFc-抗體溶液中能夠結合至經h阿爾特素-mmH塗佈之盤的游離hGFRα3-hFc數量。IC50值，定義為降低固定濃度的hGFRα3-hFc訊號達50%所需的抗體濃度，這是使用GraphPad的Perism軟體由數據來計算。在固定量120pM hGFRα3-hFc下於抗-GFRα3抗體不存在下所測得的吸光度定義為0%阻斷，而不添加hGFRα3-hFc的吸光度定義為100%阻斷。含有最 高抗體濃度的孔中所觀察到的吸光度被用來計算顯示於表中的最大阻斷百分率。結果歸納於表6中。
在第二種ELISA形式中，盤、樣品及數據是以與第一種形式類似的方式來進行處理，除了塗佈h阿爾特素-mmH及帶有C端10個組胺酸標誌的人類RET(hRET-10His；R&D Systems，# 1168-CR/CF)供阻斷ELISA實驗之用。96孔微量滴定盤塗佈1.2ug/ml h阿爾特素-mmh及6.9ug/ml hRET-10His蛋白於PBS中的混合物在4℃下過夜，並接而以0.5%(w/v)BSA溶液阻斷。固定量之帶有C端myc-myc-六組胺酸標誌的生物素化人類GFRα3(生物素-hGFRα3-mmH；SEQ ID：370)以1nM與不同量的抗-GFRα3抗體(按連續稀釋範圍自0至~100nM)預先混合，繼而在RT下培育1小時以容許抗體-生物素-hGFRα3-mmH結合達到平衡。之後將經平衡的樣品轉移至經塗佈的盤。在1小時結合後，洗滌盤，接著使用HRP-接合的卵白素(Pierce,#N200)來偵測結合的生物素-hGFRα3-mmH，以及使用TMB HRP受質使比色訊號顯色。IC50值及最大阻斷是按照各個抗體顯示於表6中。
如表6中所示，在第一種ELISA形式中，23種抗-GFRα3抗體中的9種阻斷51-94%的hGFRα3-hFc結合至經塗佈h阿爾特素-mmH，IC50值範圍自43.8pM至723pM。在第一種ELISA形式中於數個測試的較高抗體濃度下，23種抗-GFRα3抗體中的8種致使hGFRα3-hFc結合訊號增加(在表6中為”增強劑”)。23種在第一種ELISA形式中測試之抗體中的6種不阻斷或增強hGFRα3-hFc對經塗佈h阿爾特素-mmH的結合訊號。如表6中所示，就第二種ELISA形式而言，23種抗-GFRα3抗體中的17種阻斷75-100%的生物素 -hGFRα3-mmH結合至經雙重塗佈之h阿爾特素-mmH與hRET-10His，IC50值範圍自403pM至14.6nM。一樣在第二種ELISA形式中於較低抗體濃度下，23種抗-GFRα3抗體中的5種致使生物素-hGFRα3-mmH結合訊號增加，但在抗體濃度1nM或以下阻斷28-95%的生物素-hGFRα3-mmH結合至h阿爾特素-mmH與hRET-10His(在表6中為”增強劑”)。某一個抗-GFRα3抗體在較高的測試抗體濃度下致使生物素-hGFRα3-mmH結合訊號增加(在表6中為”增強劑”)，但在第二種ELISA形式中於任何濃度下沒有阻斷。
NB=非阻斷劑
實例5. 測量抗-GFRα3抗體在活體外對阻斷GFRα3與RET因為配體阿爾特素而活化的能力
使用以細胞為基礎的分析來測定抗-GFRα3抗體在活體外對阻斷GFRα3與RET因為配體阿爾特素而活化的能力。生成經修飾能穩定表現人類GFRα3(存取編號NP_001487.2的胺基酸1-400)以及人類RET(存取編號NP_065681的胺基酸1-1072)的HEK293細胞並接而以SRE反應性螢光酶報導子(SRE-luc；Sabiosciences，CCS-010L)予以轉導(HEK293/hGFRα3/hRET細胞)。
將兩萬個HEK293/hGFRα3/hRET/SRE-luc細胞種人經聚D-離胺酸塗佈的96孔盤(Greiner,#35-4620)的Optimen(GIBCO,#31985)(含有0.5% FBS)中，且接著在5% CO2於37℃下生長過夜。繼而，在室溫下以連續稀釋的抗-GFRα3抗體(範圍自5pM至300nM)培育細胞1小時。接著將固定量(100pM)之表現有C端myc myc六組胺酸標誌的人類阿爾特素(SEQ ID：369)添加至細胞並又再培育6小時。在添加OneGlo試劑(Promega,#E6051)之後於Victor光度計(Perkin Elmer)上以相對光單位(RLU)測量螢光酶活性。由四參數推理方程式在12-點反應曲線中使用GraphPad Prism數據分析軟體計算EC50以及IC50值。
二十三個抗-GFRα3抗體測試它們抑制阿爾特素-依 賴性活化HEK293/hGFRα3/hRET/SRE-luc細胞的能力。如表7中所示，所有23種測試抗體以範圍自0.2nM至48.3nM的IC50值阻斷螢光酶活性，而23種抗體中的19種在300nM的濃度下阻斷達基線。23種抗體中的四種(H4H2344S、H4H2345S、H4H2346S，以及H4H2354S-1)在任何測試抗體濃度下未阻斷達基線。
實例6. 阿爾特素致敏的辣椒素溫度痛覺過敏的抑制
為在小鼠體內引起阿爾特素致敏的溫度痛覺過敏，在投與蹠內注射0.5微克辣椒素(次最佳劑量)於DMSO(Sigma-Aldrich,#M-2028)中的100mM溶液之前，將每一隻小鼠蹠內注射0.5微克小鼠重組型阿爾特素(R&D Systems,#1085-AR)予以預處理。使用哈貴夫氏檢定評估溫度痛覺過敏，其中光束被導至被注射的腳爪處，直到動物縮回其腳爪。縮回延遲紀錄為痛覺的行為測量方法。依據明顯降低的腳爪縮回延遲，溫度痛覺過敏在辣椒素投與後三天時與阿爾特素致敏一致。關於這些研究，在給予阿爾特素或辣椒素之前測量縮回延遲的基線值，接著在辣椒素處理後三天進行第二次測量。進行這些分析的實驗人員不知道動物的處理組別。
關於所有評估人類抗-GFRα3抗體在阿爾特素致敏的痛覺過敏中的效力的實驗，針對表現人類GFRα3使用成年小鼠同型合子取代小鼠GFRα3("人類化GFRα3”)。在各個分析中使用雄性和雌性小鼠，在處理組中性別為平均的(每個處理組或對照組總計為8隻小鼠)。人類化GFRα3小鼠預先確定帶有經阿爾特素誘導的辣椒素溫度痛覺過敏延遲反應，類似於在野生型小鼠中所觀察到的彼等。
在模型中測試六種抗-GFRα3抗體(H4H2212N、 H4H2243N2、H4H2292S、H4H2294S、H4H2342P，及H4H2352S-1)。所有抗體稀釋於經磷酸鹽緩衝的食鹽水(PBS)中並以25mg/kg於1ml/100g體重的體積在阿爾特素注射至後腳爪中之前24小時被皮下投與。在各個實驗中，一組動物接受同型對照抗體。
各個處理組或對照組的疼痛敏感性被定義為基線縮回延遲的百分率(%BWL)，計算為各動物在辣椒素處理後三天，相比於其沒有辣椒素處理的基線縮回延遲之以時間為基礎的縮回延遲(WL)之變化分率：%BWL=[(WL(辣椒素)-WL(無辣椒素))/WL(無辣椒素)]x 100
使用%BWL，數值越負表示溫度痛覺過敏越大。
就經阿爾特素致敏的辣椒素溫度痛覺過敏模型中於辣椒素注射後三天時所評估的基線縮回延遲百分率(%BWL)，表8顯示組別平均值(以粗體字表示)以及平均值的標準差(以斜體表示)的歸納。
如表8中所示，相比於經同型對照抗體處理的小鼠，經抗-hGFRα3抗體處理的小鼠在%BWL方面表現增加(較不負或正值)。四種抗體，H4H2352S、H4H2243N2、H4H2294S與H4H2342P，在所有進行的實驗中引起對溫度痛覺過敏最大的耐受性。
明顯不同於同型對照，**p<.01；***p<.001
(nd=在此實驗中未測試)
實例7. 抗-GFRα3抗體對GFRα1與GFRα2的交叉反應性的測試
使用Octet Red生物感測儀(Fortebio,Inc.)評估抗-GFRα3抗體結合至GDNF-家族受體的能力。測試抗體結合至表現有C端人類Fc標誌與六組胺酸標誌的人類GFRα1(hGFRα1-hFc-6His,R&D Systems # 714-GR)、表現僅有C端人類Fc標誌的人類GFRα1(hGFRα1-hFc；SEQ ID：376)、表現有C端人類Fc標誌與六組胺酸標誌的人類GFRα2(hGFRα2-hFc-6His,R&D Systems #613-FR)、表現有C端人類Fc標誌的人類GFRα3(hGFRα3-hFc，SEQ ID：371)，或不相干的經人類Fc標誌的蛋白。由10ug/mL溶液將抗原捕獲於抗-人類Fc感測儀尖端歷時5分鐘。接著以100ug/mL溶液的不相干人類Fc抗體阻斷經塗佈的感測儀尖端歷時5分鐘。經阻斷的感測儀尖端繼而被浸入含有667uM各種抗-GFRα3抗體或單獨緩衝液的孔中歷時10分鐘。在25℃下以1000rpm的流速使用HBST+BSA緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v介面活性劑P20、0.1mg/mL BSA，pH 7.4)進行實驗。監控並記錄在實驗各個階段的結合反應(以nm為單位來測量)。
如表9中所示，所有六種測試抗-GFRα3抗體顯示結合至hGFRα3-hFc蛋白超過1.0nm，但未證實有任何結合至其他GDNF-家族受體或經不相干人類Fc標誌的蛋白可測量到。
實例8. 測量抗-GFRα3抗體在HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE-Luc生物分析中阻斷阿爾特素刺激的能力
在活體外使用以細胞為基礎的分析測定抗-GFRα3抗體阻斷馬來猴GFRα3以及馬來猴RET藉由其配體阿爾特素活化的能力。生成經修飾而穩定表現馬來猴GFRα3(MfGFRα3；SEQ ID：377)與馬來猴RET(MfRET；SEQ ID：378)兩者的HEK293細胞並接而以在最小CMV啟動子與血清反應要素重複序列控制下表現螢火蟲螢光酶基因的Cignal Lenti SRE報導子(SA Biosciences,#CLS-010L)轉導以生成HEK293/MfGFRα3/MfRet/SRE-Luc細胞株。
關於生物分析，將20,000個HEK293/MfGFRα3/ MfRET/SRE-luc細胞種至經聚D-離胺酸塗佈的96孔盤(Greiner,#35-4620)的Optimen(GIBCO,#31985)(含有0.5% FBS)上，且接著在5% CO2於37℃下生長過夜。繼而，以連續稀釋的抗-GFRα3抗體(範圍自5pM至300nM)培育細胞1小時。接著將固定量(500pM)之表現有C端myc-myc-六組胺酸標誌的人類阿爾特素(人類阿爾特素-MMH；SEQ ID：369)添加至細胞並又再培育6小時。為了從劑量反應曲線測定人類阿爾特素-MMH的EC50值，在沒有抗體的情況下添加範圍自0.5pM至10nM連續稀釋的人類阿爾特素-MMH至細胞中並在37℃下培育6小時。在添加OneGlo試劑(Promega,#E6051)之後於Victor光度計(Perkin Elmer)上以相對光單位(RLU)測量螢光酶活性。由四參數推理方程式在12-點反應曲線中使用GraphPad Prism數據分析軟體計算EC50以及IC50值。
六個抗-GFRα3抗體測試它們抑制阿爾特素-依賴性活化HEK293/MfGFRα3/MfRET/SRE-luc細胞的能力。如表10中所示，所有六種測試抗體以範圍自0.7nM至2.5nM的IC50值完全阻斷螢光酶活性。人類阿爾特素-MMH以70pM的EC50值刺激HEK293/mfGFRα3/mfRET/SRE-LUC細胞株中的SRE-依賴性螢光酶活性。
實例9. 製造雙-特異性抗-GFRα3抗體
製造各種雙特異性抗體以供實施本發明方法。舉例而言，以雙特異性模式製造GFRα3-特異性抗體(”雙特異體”)，其中結合至GFRα3上特有抗原決定位的可變區被連結在一起以在單獨一個結合分子中賦予雙抗原決定位特異性。經適當設計的雙特異性可透過增加GFRα3特異性與結合性提升整個GFRα3阻斷效力。對三個半胱胺酸重複序列中任一者內個別不同抗原決定位具有特異性的可變區，或可結合至三個半胱胺酸重複序列中任一者的一個抗原決定位內的不同區域者在結構支架上成對排列以容許各可變區同時結合至個別的抗原決定位，或結合至一個抗原決定位內的不同區域。在一個雙特異性的實例中，來自對某一個半胱胺酸重複序列內的抗原決定位具有特異性的連接子的重鏈可變區(VH)與來自對其他兩個半胱胺酸重複序列任一者中的第二抗原決定位具有特異性的一系列連接子的輕鏈可變區(VL)重組在一起，以辨識可與原有VH配對但不會破壞那個VH原有特異性之非同源VL夥伴。以這個方式，單獨VL節段(例如VL1)可與兩個不同的VH域合併(例如VH1與VH2)，以產生含有兩個結合”臂”(VH1-VL1與VH2-VL1)的雙特異體。使用單獨VL節段會降低系統複雜性並從而簡化且增加用以 產生雙特異體的選殖、表現與純化步驟的效率(參見，例如USSN13/022759與US2010/0331527)。
或者，結合至GFRα3與第二目標(諸如(但不限於)例如RET)之抗體，可以雙特異性形式使用本文所述技術，或習於技藝者所熟知的其他技術來製備。結合至暴露於細胞外的不同GFRα3區域的抗體可變區可與結合至(例如)配體阿爾特素、其他GFRα受體或RET上之相關位點的可變區連結一起，以在單獨一個結合分子中賦予雙抗原特異性。舉例而言，對GFRα3之單獨抗原決定位具有特異性的可變區與對例如阿爾特素具有特異性的可變區合併，並成對排列在結構支架上而容許各可變區結合至分別抗原。
在上面針對抗體所述的任一種分析中，測試雙特異性連接子對目標抗原(例如GFRα3及/或阿爾特素、其他GFRα受體或RET)之結合與功能性阻斷。舉例而言，使用測量可溶性蛋白質結合的標準方法來評估與抗原(等)的雙特異性交互作用，諸如Biacore、ELISA、尺寸排除層析、多角度雷射光散射、直接掃描熱量測定以及其他方法。透過使用螢光標定二級抗體辨識細胞上的目標抗原的流式細胞儀測定雙特異性抗體對表現GFRα2之細胞的結合。也可以使用表面電漿共振實驗來進行使用肽的結合實驗，其中肽對抗體的即時結合交互作用是藉由使肽或雙特異體流過分別有雙特異體或肽被捕獲於其上的感測儀表面來進行測定。雙特異體在活體外功能性阻斷GFRα3受體是使用任一種生物分析(諸如本文所述)，或藉由在適當動物模型中於活體內對疼痛的反應測定(諸如本文所述的彼等)來測定。藉由雙特異體在活體外功能性阻斷GFRα3或其配體阿爾特素是使用諸如彼等在WO2010/077854或 US2010/0166768中所述的任一種生物分析，或於適當動物模型中藉由活體內測定對熱刺激的過敏(諸如本文所述的彼等)來測定。
實例10. 單株抗-小鼠GFRα3抗體的表面電漿共振衍生之結合親和力與動力學常數
抗原結合至抗-小鼠GFRα3抗體的結合締合速率常數與解離速率常數(分別為k a與k d)和算出的平衡解離常數與解離半衰期(分別為K D與t1/2)是使用即時表面電漿共振生物感測儀(Biacore 3000)分析在25℃下來進行測定。針對結合至表現有myc-myc-六組胺酸標誌的小鼠GFRα3(mGFRα3-MMH；SEQ ID：379)來測試抗體。在藉由直接胺偶合至Biacore CM5感測晶片所產生的山羊抗-小鼠IgG多株抗體(GE Healthcare,# BR-1008-38)表面上捕獲抗-小鼠GFRα3抗體。使用HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%介面活性劑P20，pH 7.4)作為運行緩衝液以及樣品緩衝液來進行動力學實驗。藉由注射範圍自100nM至6.25nM(2倍稀釋)的數個濃度通過經捕獲的抗體表面來評估對小鼠GFRα3-MMH的結合。監測抗體-抗原締合至多5分鐘，同時監測緩衝液中的解離至多10分鐘。動力學締合(k a)與解離(k d)速率常數是藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理並將數據擬合至1：1結合模型而被決定。由如下的動力學速率常數計算結合解離平衡常數(K D)與解離半衰期(t1/2)：K D(M)=k d/k a；且t1/2(min)=[ln2/(60*kd)]。
如表11中所示，所測試的兩種抗-小鼠GFRα3抗體M1M6986N及M1M6977N在25℃下分別以23.1pM以及107pM的K D值結合至mGFRα3-MMH。
表11：mGFRα3-MMH在25℃下結合至不同抗-小鼠GFRα3抗體的動
實例11. 小鼠GFRα3阻斷ELISA
在共受體小鼠RET存在或不存在下，使用兩種不同的阻斷ELISA形式來測定抗-小鼠GFRα3抗體阻斷小鼠GFRα3結合至小鼠阿爾特素的能力。在第一種形式中，於4℃下將重組型小鼠阿爾特素(R&D cat#1085-AR/CF)蛋白以2ug/ml(166nM)塗佈在96孔微量滴定盤的PBS緩衝液中過夜，且接著以0.5%(w/v)BSA溶液阻斷。固定量(3.5nM)之帶有C端myc-myc-六組胺酸標誌的生物素化小鼠GFRα3(生物素-mGFRα3-MMH；SEQ ID：379)與不同量的抗體(按連續稀釋自100nM至1.6pM)預先混合，繼而在室溫(RT)下培育1小時以容許抗體-生物素-mGFRα3-MMH結合達到平衡。之後將經平衡的樣品溶液轉移至經m阿爾特素塗佈的盤。在1小時結合後，洗滌盤，接著使用卵白素-HRP(Pierce,#N200)偵測結合的生物素-mGFRα3-MMH，以及使用TMB HRP受質(BD Biosciences,#51-2606KC與#51-2607KC)使比色訊號顯影。在450nm下於Victor X5盤讀取儀(Perkin Elmer)上紀錄吸光度以測定預平衡生物素-mGFRα3-MMH-抗體溶液中能夠結合至塗佈m阿爾特素之盤的游離生物素-mGFRα3-MMH數量。IC50值，定義為降低固定濃度的生物素-mGFRα3-MMH訊號達50%所需的抗體濃度，這是使用GraphPad的Perism軟體由數據來計算。在固定量生物素-mGFRα3-MMH下於抗-小鼠GFRα3抗體不存在下所測得的吸光度定義為0%阻斷，而不添加生物素-mGFRα3-MMH的吸光度定義為 100%阻斷。含有最高抗體濃度的孔中所觀察到的吸光度被用來計算顯示於表中的最大阻斷百分率。結果歸納於表12中。
在第二種ELISA形式中，盤、樣品及數據是以與第一種形式類似的方式來進行處理，除了塗佈表現有C端hFc與六組胺酸標誌的小鼠RET(mRET-hFc-6His；R&D cat# 482-RT/CF)以及m阿爾特素(R&D cat# 1085-AR/CF)供阻斷ELISA實驗之用。96孔微量滴定盤塗佈1.2ug/ml(100nM)m阿爾特素及9.5ug/ml(100nM)mRET-hFc-6His蛋白於PBS中的混合物在4℃下過夜，並接而以0.5%(w/v)BSA溶液阻斷。固定量(350pM)之生物素-mGFRα3-MMH與不同量的抗-小鼠GFRα3抗體(按連續稀釋範圍自100nM至1.6pM)預先混合，繼而在RT下培育1小時以容許抗體-生物素-mGFRα3-MMH結合達到平衡。之後將經平衡的樣品轉移至經塗佈的盤。在1小時結合後，洗滌盤，接著使用HRP-接合的卵白素來偵測結合的生物素-mGFRα3-MMH，以及使用TMB HRP受質使比色訊號顯色。IC50值及最大阻斷是按照各個抗體顯示於表12中。
如表12中所示，僅一種測試的抗-小鼠GFRα3抗體M1M6986N證實能以69.1pM的IC50值阻斷生物素-mGFRα3-MMH結合至經塗佈m阿爾特素之盤。其他測試的抗-小鼠GFRα3抗體M1M6977N在這個ELISA形式中未證實任何可測得的阻斷。測試的抗-小鼠GFRα3抗體M1M6986N及M1M6977N證實能分別以47.2pM及366pM的IC50值完全阻斷生物素-mGFRα3-MMH結合至經m阿爾特素與mRET-hFc-6His塗佈的盤。
表12：小鼠GFRα3對小鼠阿爾特素單獨或小鼠阿爾特素與小鼠RET的ELISA阻斷
實例12. 以細胞為基礎的螢光酶生物分析
使用以細胞為基礎的分析來測定抗-小鼠GFRα3抗體在活體外阻斷小鼠GFRα3與小RET因為其配體小鼠阿爾特素而活化的能力。生成經修飾能穩定表現小鼠GFRα3(存取編號AAH66202.1的胺基酸1-397)以及小鼠RET(存取編號NP_033076.2的胺基酸1-1115)的HEK293細胞並接而以SRE反應性螢光酶報導子(SRE-luc；Sabiosciences，CCS-010L)予以轉導(293/mGFRα3/mRET/SRE-luc細胞)。
將兩萬個293/mGFRα3/mRET/SRE-luc細胞種入經聚D-離胺酸塗佈的96孔盤(Greiner,#35-4620)的Optimen(GIBCO,#31985)(含有0.5% FBS)中，且接著在5% CO2於37℃下生長過夜。繼而，在室溫下以連續稀釋的抗-小鼠GFRα3抗體(範圍自3nM至44nM)培育細胞1小時。接著將固定量(100pM)之小鼠阿爾特素(R&D,# 1085-AR/CF)添加至細胞並又再培育6小時。在添加OneGlo試劑(Promega,#E6051)之後於Victor光度計(Perkin Elmer)上以相對光單位(RLU)測量螢光酶活性。由四參數推理方程式在12-點反應曲線中使用GraphPad Prism數據分析軟體計算EC50以及IC50值。
如表13中所示，所測試的抗-小鼠GFRα3抗體 M1M6986N及M1M6977N均證實分別以約44nM及3nM的IC50值抑制293/mGFRα3/mRET/SRE-luc細胞之小鼠阿爾特素-依賴性刺激的能力。
實例13、14及15：抗-小鼠GFRα3抗體在骨癌疼痛與骨關節炎疼痛的動物模型中的效用
本文所述抗體係針對阿爾特素的GPI-連結阿伐受體(GFRα3)具有高度親和力的人類抗體。因為人類GFRα3的此等抗體不與小鼠GFRα3交叉反應，使用這些抗體的活體內分析僅在經遺傳改造以將小鼠GFRα3序列置換為人類GFRα3的小鼠中進行。在這些GFRα3hu/hu小鼠中使用阿爾特素致敏的辣椒素的藥理學抑制的初步活體內實驗揭示四種人類抗體在這個活體內分析中的效用。為了促使產生效用數據，生成小鼠GFRα3抗體作為人類抗體的代用品。使用在中國倉鼠卵巢細胞中表現之重組型小鼠GFRα3胞外域免疫的混合型C57BL6/129Sv品系的小鼠(刪除內生性GFRα3基因的同型合子)。藉由血清免疫分析由經免疫的小鼠確認對GFRα3的特異性免疫反應。從表現高度特異性免疫反應的小鼠收集脾臟，並藉由將經單離的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，接著為標準融 合瘤程序而生成生產抗體的融合瘤細胞。針對在免疫分析形式中結合至GFRα3以及其阻斷GFRα3結合至塗佈在固體表面上的阿爾特素或阿爾特素/Ret的能力在免疫分析中進一步篩選融合瘤上清液。在以細胞為基礎的生物分析中也針對其等阻斷GFRα3/Ret共受體路徑的阿爾特素刺激來篩選上清液。藉由選定融合瘤細胞株的PCR擴增獲得可變區抗體序列，所選融合瘤細胞株的抗體蛋白在以細胞為基礎的分析中表現強力阻斷，且此等序列被用來製造具有小鼠IgG1同型的全長重組型抗-小鼠GFRα3抗體。選定兩種在以細胞為基礎的分析中強力抑制阿爾特素訊號傳遞的抗體用於活體內測試。在活體外結合免疫分析中，抗體M1M6986N阻斷GFRα3結合至被塗佈在固體表面上的阿爾特素或阿爾特素/Ret，並在本文意指為直接阻斷劑。抗體M1M6977N在活體外免疫分析中阻斷GFRα3結合至經塗佈阿爾特素/Ret而非單獨阿爾特素並在本文意指為間接阻斷劑。選定這兩種小鼠抗體M1M6986N及M1M6977N在阿爾特素致敏的辣椒素溫度痛覺過敏模型(實例6中所述)中進行測試，因為這兩種抗體證實與有效人類抗體有類似的結合及阻斷型態。於野生型小鼠中在活體內針對其等阻斷阿爾特素誘導的痛覺過敏敏感篩選這兩種抗體。類似於它們的人類抗體對應物，這兩種抗體在辣椒素注射後三天明顯抑制阿爾特素對辣椒素溫度痛覺過敏的致敏效用(第1圖)。
實例13：骨癌疼痛的纖維肉瘤模型 方法 受試者
約12週大的C57B16背景品系成年雄性小鼠使用於兩 個纖維肉瘤實驗中。就這個實驗而言，測量結果數據的實驗人員在整個數據收集、編集與分析過程中不知道動物治療組別。
骨癌模型
為誘發骨癌疼痛，將小鼠麻醉並股骨內注射1.0x106 MC57G纖維肉瘤細胞。這些細胞是衍生自C57Bl/6小鼠纖維肉瘤腫瘤株。在這個模型中腫瘤通常以侵略的方式生長，使得在腫瘤移植後14天時明顯有骨質破壞。在移植後第7、及10，及14天時拍攝放射線照片來確認腫瘤生長與骨質破壞。依據三分等級來評定骨質破壞，在腫瘤區域中0表示股骨未破壞而3表示股骨完全破壞。
抗體治療
在癌細胞移植前當天以及又在第7天，每隻動物接受投與30mg/kg s.c.抗體注射。將動物假隨機分派至二或三個治療組中的一者：1)在兩個個別實驗中的M2M180N同型(陰性)對照抗體、2)在兩個個別實驗中的M1M6977N抗-小鼠GFRα3抗體，或3)只有在第二個實驗中的M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體。M1M6986N阻斷阿爾特素與GFRα3的交互作用，且從而被視為是阿爾特素作用的”直接”阻斷劑。相反地，M1M6977N透過GFRα3/RET複合物抑制阿爾特素作用，並因此被視為是”間接”抑制劑。
痛覺的測量方法
對骨腫瘤的痛覺反應是針對激起的機械(觸覺)觸痛覺過度敏感使用馮費瑞毛髮測試(von Frey Hair test)、針對在肢體上承重的意願進行動態承重(DWB)測試，以及防護行為來測量。馮費瑞測試結果表示為腳爪縮回所需的壓力克數。承重結果表示為放在同側肢體上的體重百分率。防護行為表示為在兩分鐘期間內 防護肢體所需時間。
結果
骨質破壞
在任何一個實驗中抗體治療對於骨質破壞計分沒有明顯的效用，暗示抗體治療對於骨癌本身的嚴重性不具影響力(數據未示出)。
痛覺行為
在第一個實驗中，於纖維肉瘤注射後使用GFRα3抗體治療在觸痛覺過度敏感方面有統計學上明顯降低(F(1,20)=9.189，p=.007，第2A圖)，且在整個第二個實驗中在統計學上趨向有效(F(2,29)=3.069，p<.062，第2B圖)，其中在第二個研究中個別比較有時能達到顯著性(第2B圖)。
在任何一個實驗中，在以纖維肉瘤細胞移植骨之後14天測得GFRα3抗體對於在同側肢體上的動態承重沒有統計學上顯著效用，儘管第一個實驗揭示使用M1M6977N治療在統計學上趨向有效(t(10)=2.047，p=.068，第3A圖；F(2,28)=1.598，p=.220，第2B圖)。
於兩個纖維肉瘤實驗中，GFRα3抗體在骨癌移植後明顯降低肢體防護(F(1,20)=12.270，p=.002，第4A圖；F(2,29)=3.576，p=.041，第4B圖)。
結論
當藉由評估防護以及觸痛覺過度敏感的馮費瑞測試所測量時，使用抗-小鼠GFRα3抗體治療在這個骨癌疼痛模型中明顯降低痛覺行為。此外，於一個實驗中，M1M6977N抗體於承重差 異方面在統計學上趨向有效。骨質破壞計分在接受抗-小鼠GFRα3抗體的組別中沒有差異，暗示疼痛相關測量方法的差異性無法解釋癌症嚴重性的差異性。因此，吾人的數據暗示，對抗GFRα3的中和抗體能有效對抗骨癌疼痛。因為肉瘤細胞更經常是原發性腫瘤而非在骨頭中轉移，且因為大多數骨癌是由其他位置的原發性腫瘤的轉移衍生而來，也在乳(乳腺)癌引起的骨癌疼痛模型中測試這些抗體。乳房腫瘤與前列腺腫瘤被發現是最常見轉移到骨頭的腫瘤。
實例14：骨癌疼痛的乳癌模型 方法 受試者
約12週大的Balb/c背景品系成年雄性小鼠使用於乳腺癌骨癌實驗中。就這個實驗而言，測量結果數據的實驗人員在整個數據收集、編集與分析過程中不知道動物治療組別。
骨癌模型
為引起骨癌疼痛，將小鼠麻醉並接而股骨內注射10,000 4T-1乳腺癌細胞。這些細胞是衍生自Balb/c乳腺癌腫瘤株。在這個模型中，腫瘤通常以侵略的方式生長，使得腫瘤在移植後18天變得嚴重。在移植後第10、14及19天時拍攝放射線照片來確認腫瘤生長與骨質破壞。依據三分等級來評定骨質破壞，在腫瘤區域中0表示股骨未破壞而3表示股骨完全破壞。
抗體治療
在癌細胞移植前當天以及之後每週兩次，每隻動物接受投與30mg/kg s.c.抗體注射。將動物假隨機分派至三個治療組 中的一者：1)M2M180N同型(陰性)對照抗體、2)M1M6977N抗-小鼠GFRα3抗體，或3)M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體。M1M6986N阻斷阿爾特素與GFRα3的交互作用，且從而被視為是阿爾特素作用的”直接”阻斷劑。相反地，M1M6977N透過GFRα3/RET複合物抑制阿爾特素作用，並因此被視為是”間接”抑制劑。
痛覺的測量方法
對骨腫瘤的痛覺反應是針對激起的機械(觸覺)觸痛覺過度敏感使用馮費瑞毛髮測試、針對在肢體上承重的意願進行動態承重(DWB)測試，以及防護行為來測量。馮費瑞測試結果表示為腳爪縮回所需的壓力克數。承重結果表示為放在同側肢體上的體重百分率。防護行為表示為在兩分鐘期間內防護肢體所需時間。
結果
骨質破壞
在這個模型中抗體治療對於骨質破壞計分沒有明顯的效用，暗示抗體治療對於骨癌本身的嚴重性不具影響力。
痛覺行為
在癌症之後使用GFRα3抗體治療在觸痛覺過度敏感方面有統計學上明顯降低(F(2,25)=8.626，p=.001，第5圖)。
GFRα3抗體對於同側肢體的動態承重沒有統計學上顯著整體效用，在以癌細胞移植骨之後，儘管治療的整體效用達到統計趨勢而M1M6977N在11天(A)而非18天時在事後比較達到顯著效力(11天F(2,25)=2.939，p=.071，第6A圖；18天，F(2,25)=0.149，p=.862，第6B圖)。
在這個模型中於骨癌移植後GFRα3抗體顯著降低肢 體防護(F(2,25)=4.222，p=.026，第7圖)。
結論
當藉由評估防護以及觸痛覺過度敏感的馮費瑞測試測量時，使用抗-小鼠GFRα3抗體治療在這個骨癌疼痛模型中明顯降低痛覺行為。此外，REGN1967抗體於承重差異方面於一個時間點有明顯效力。骨質破壞計分在接受抗-小鼠GFRα3抗體的組別中沒有差異，暗示疼痛相關測量方法的差異性無法解釋癌症嚴重性的差異性。因此，吾人的數據暗示，對抗GFRα3的中和抗體在這個轉移性骨癌疼痛的模型中能有效對抗骨癌疼痛。
實例15. 骨關節炎疼痛的內側半月板不穩定(DMM)模型 方法 受試者
C57B16背景品系成年雄性小鼠自約12週大時使用於DMM實驗中。就這個實驗而言，測量結果數據的實驗人員在整個數據收集、編集與分析過程中不知道動物治療組別。
DMM模型
在DMM模型中，一個膝蓋的內側半月板係不穩定的且允許動物發病歷時16週。在16週期間，動物產生觸痛覺過度敏感且受損膝蓋中的骨體積與骨礦物質含量增加，類似於早期人類骨關節炎。於16週時在開始抗體治療前，在動物體內藉由馮費瑞測試確認觸痛覺過度敏感。
抗體治療
在DMM手術後16週起每隻動物每週接受投與30mg/kg s.c.抗體注射。將動物假隨機分派至三個治療組中的一 者：1)M2M180N同型(陰性)對照抗體、2)M1M6977N抗-小鼠GFRα3抗體，或3)M1M6986N抗-小鼠GFRα3抗體。M1M6986N阻斷阿爾特素與GFRα3的交互作用，且從而被視為是阿爾特素作用的”直接”阻斷劑。相反地，M1M6977N透過GFRα3/RET複合物抑制阿爾特素作用，並因此被視為是”間接”抑制劑。
痛覺的測量方法
對膝蓋病理學的痛覺反應是針對激起的機械(觸覺)觸痛覺過度敏感使用馮費瑞毛髮測試來測量。
結果
痛覺行為
在DMM之後使用GFRα3抗體治療在觸痛覺過度敏感方面有統計學上明顯降低(F(2,27)=21.68，p=.0001，第8圖)。
結論
使用抗-小鼠GFRα3抗體治療對於觸痛覺過度敏感有統計學上顯著效用，使得以兩個GFRα3抗體治療的組別一致顯示自開始每週治療後14天起比同型對照還少的觸痛覺過度敏感。這些數據暗示，GFRα3抗體可有效對抗慢性人類骨關節炎疼痛。
實例16. 抗-GFRα3抗體的交叉-競爭分析
使用Octet RED384生物感測儀(Fortebio Inc.)進行交叉-競爭分析來評估選定抗體與另一者競爭結合至人類GFRα3的能力。在25℃下以1000rpm的流速在Octet HBST緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v介面活性劑P20、0.1mg/mL BSA)進行整個實驗。為評估2個抗體是否能夠與另一者競爭結合至其在表現有C端myc-myc-六組胺酸標誌之生物素 化重組型人類GFRα3(生物素-hGFRα3-mmH；SEQ ID：370)的個別抗原決定位，藉由將尖端浸入10μg/mL的生物素-hGFRα3-mmH溶液中歷時1分鐘，約~1.2nm的生物素-hGFRα3-mmH首先被捕獲在經卵白素塗佈的Octet感測儀尖端。經抗原塗佈的感測儀尖端繼而被置於含有25ug/mL第一抗-GFRα3單株抗體溶液的孔中歷時4分鐘以使得生物素-hGFRα3-mmH表面飽和。感測儀尖端繼而被浸入含有25ug/mL第二抗-GFRα3單株抗體溶液的孔中。於實驗的每個步驟之間在Octet HBST緩衝液中洗滌感測儀尖端。如第9圖中所示，在整個實驗期間監控即時結合反應，且在每個步驟結束時紀錄結合反應。比較mAb-2結合至與第一抗體預先複合的生物素-hGFRα3-mmH的反應並決定不同抗-GFRα3單株抗體的競爭/非競爭行為。
如第9圖中所示，帶有黑色字體的黑灰色盒表示自身競爭的結合反應。呈兩個方向(與結合順序無關)的抗體競爭是以黑色盒與白色字體表示。在抗體之間沒有競爭暗示不同的結合抗原決定位，如帶有黑色字體的白色盒。
九種抗體(H4H2236N3、H4H2342P、H4H2295S、H4H2294S、H4H2291S、H4H2357S、H4H2355S、H4H2296S，及H4H2243N2)雙向地彼此競爭結合至生物素-hGFRα3-mmH。9個中有八個(H4H2236N3、H4H2342P、H4H2295S、H4H2294S、H4H2291S、H4H2357S、H4H2355S，及H4H2296S)不與所測試的任何其他抗-GFRα3抗體競爭，而H4H2243N2也雙向地與所測試的兩個額外抗-GFRα3抗體(H4H2212N及H4H2352S)競爭。H4H2212N及H4H2352S彼此且與H4H2243N2雙向地競爭結合至生物素 -hGFRα3-mmH，但H4H2212N不與所測試的任何其他抗-GFRα3抗體競爭，H4H2352S亦雙向地與所測試的一個額外抗-GFRα3抗體(H4H2292S)競爭。一個所測試的抗-GFRα3抗體，H4H2350P，不與所測試的任何抗-GFRα3抗體競爭結合至生物素-hGFRα3-mmH。
<110> Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
<120> GFRα3之人類抗體及其使用方法
<130> 8300A-WO
<140> 待分派
<141> 隨附申請
<150> 61/692,029
<151> 2012-08-22
<160> 411
<170> 用於WIindows第4.0版的FastSEQ
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<223> 合成
<400> 306
<210> 307
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
<210> 308
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 308
<210> 309
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
<210> 310
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
<210> 311
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
<210> 312
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
<210> 313
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
<210> 314
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
<210> 320
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
<210> 321
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
<210> 322
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
<210> 327
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
<210> 328
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
<210> 329
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
<210> 330
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
<210> 331
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 331
<210> 332
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 332
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 333
<210> 334
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
<210> 337
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
<210> 339
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
<210> 341
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 342
<210> 343
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 344
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 344
<210> 345
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
<210> 346
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
<210> 347
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 349
<210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
<210> 351
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 351
<210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
<210> 353
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 353
<210> 354
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 354
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 355
<210> 356
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 356
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 357
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 358
<210> 359
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 359
<210> 360
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 360
<210> 361
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 361
<210> 362
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 362
<210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 363
<210> 364
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 364
<210> 365
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 365
<210> 366
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 366
<210> 367
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 367
<210> 368
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 368
<210> 369
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 369
<210> 370
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 370
<210> 371
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 371
<210> 372
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 372
<210> 373
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 373
<210> 374
<211> 1200
<212> DNA
<213> 智人
<400> 374
<210> 375
<211> 400
<212> PRT
<213> 智人
<400> 375
<210> 376
<211> 632
<212> PRT
<213> 智人
<400> 376
<210> 377
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 馬來猴GFR阿伐3：小腦cDNA
<400> 377
<210> 378
<211> 1086
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 無訊號序列的馬來猴RET
<400> 378
<210> 379
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠GFR阿伐-MMH Ac.No.AAH66202.1的aa 1-343：N29-N371 aa 344-371：myc-GG連接子-myc-六組胺酸標誌
<400> 379
<210> 380
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 380
<210> 381
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 381
<210> 382
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 382
<210> 383
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 383
<210> 384
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 384
<210> 385
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 385
<210> 386
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 386
<210> 387
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 387
Val
<210> 388
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 388
<210> 389
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 389
<210> 390
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 390
<210> 391
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 391
<210> 392
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 392
<210> 393
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 393
<210> 394
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 394
<210> 395
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 395
<210> 396
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 396
<210> 397
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 397
<210> 398
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 398
<210> 399
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 399
<210> 400
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 400
<210> 401
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 401
<210> 402
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 402
<210> 403
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 403
<210> 404
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 404
<210> 405
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 405
<210> 406
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 406
<210> 407
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 407
<210> 408
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 408
<210> 409
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 409
<210> 410
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 410
<210> 411
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 411

Claims (33)

  1. 一種特異地結合至人類GFRα3的經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其具有一或多種下列特性：(i)當藉由表面電漿共振測量時表現自約10-8M至約10-13M的KD，(ii)顯示有阻斷約50-100% GFRα3結合至其配體阿爾特素(artemin)的能力，IC50值自約40pM至約15nM；(iii)顯示有阻斷約20%至約100% GFRα3結合至經阿爾特素及RET之混合物塗佈之固體載體的能力；(iv)以自約200pM至約50nM的IC50阻斷或抑制RET的阿爾特素-依賴性活化；(v)在骨癌疼痛的活體內模型中抑制或降低一或多種痛覺反應；(vi)在活體內抑制或降低經阿爾特素致敏的溫度痛覺過敏；(vii)在骨關節炎的活體內模型中抑制或降低觸痛覺過度敏感；(viii)不與RET的其他GFR共受體交叉反應；(ix)包含一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；或(x)包含一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之 群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
  2. 如申請專利範圍第1項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體是選自由鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體組成之群。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體不與人類GFRα1或人類GFRα2交叉反應。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體為人類單株抗體，包含(a)一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；及(b)一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體顯示有阻斷約50-95%人類GFRα3結合至其配體阿爾特素的能力，IC50值範圍自約40pM至約750pM。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段阻斷約75-100%人類GFRα3結合至其配體阿爾特素，IC50值範圍自約400pM至約15nM。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離單株抗體或其抗原 -結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段以範圍自約300pM至約5nM的IC50阻斷或抑制人類RET的阿爾特素-依賴性活化。
  8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離單株抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段以範圍自約0.7nM至約2.5nM的IC50阻斷或抑制馬來猴RET的阿爾特素-依賴性活化。
  9. 一種特異地結合至人類GFRα3的經單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體包含三個重鏈CDR(HCDR1、HCDR2及HCDR3)，含於選自由下列組成之群的HCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397；以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，含於選自由下列組成之群的LCVR胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
  10. 如申請專利範圍第9項之經單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含一重鏈可變區(HCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、381及397。
  11. 如申請專利範圍第9或10項之經單離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含一輕鏈可變區(LCVR)，其具有選自由下列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、389及405。
  12. 如申請專利範圍第9-11項中任一項之經單離抗體或抗原-結合片段，其包含選自由下列組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、381/389及397/405。
  13. 如申請專利範圍第12項之經單離抗體或抗原-結合片段，其包含選自由下列組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：50/58、146/154、210/218及290/298。
  14. 如申請專利範圍第9-12項中任一項之經單離抗體或抗原-結合片段，其包含：(a)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR1域：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、383及399；(b)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR2域：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、385及401；(c)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的HCDR3域：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、387及403；(d)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR1域： SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、391及407；(e)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR2域：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、393及409；以及(f)具有選自由下列組成之群的胺基酸序列的LCDR3域：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、395及411。
  15. 一種經單離抗體或其抗原-結合片段，其與包含選自由下列所組成之群的重鏈與輕鏈序列對的抗體或抗原-結合片段競爭特異結合至人類GFRα3：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346及354/362、381/389及397/405。
  16. 一種經單離抗體或其抗原-結合片段，其結合被包含有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的重鏈與輕鏈序列對的抗體所辨識之人類GFRα3上的同一表位：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346及354/362、381/389及397/405。
  17. 一種經單離核酸分子，其編碼如申請專利範圍第9-14項中任一 項的抗體或抗原-結合片段。
  18. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第17項的核酸分子。
  19. 一種製造抗-GFRα3抗體或其抗原-結合片段的方法，其包含將如申請專利範圍第18項之表現載體引入一個經單離宿主細胞中，在允許生產該抗體或其片段的條件下使該細胞生長，以及回收由此所生產之抗體的步驟。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體或其抗原-結合片段以及醫藥學上可接受的載劑或稀釋劑。
  21. 一種治療GFRα3相關病況或疾病、或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛的方法，該方法包含對有需要的患者投與如申請專利範圍第1-16項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或與該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中GFRα3相關病況或疾病是選自由下列組成之群：急性疼痛、慢性疼痛、神經病性疼痛、發炎性疼痛、功能性疼痛症候群、關節炎、胰臟炎、骨關節炎、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹神經痛、一般性神經痛、神經退化性病症、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調(ataxia)、內臟疼痛、痛風、帶狀疱疹後神經痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、嚴重或難治性疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、遺傳性肢端紅痛症、牙痛、鼻炎、癌症疼痛、複雜性局部疼痛症候群(CRPS)、發炎性腸病(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)及膀胱異常。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中功能性疼痛症候群是選自由下列組成之群：慢性下背痛、大腸急躁症(IBS)、肌纖維痛(FM)、慢性疲勞症候群、腹痛、顳顎關節病症(TMJD)、膀胱疼痛症候群(間質性膀胱炎)、功能性胃腸病症/症候群、功能性胸痛症候群、偏頭痛及緊張型頭痛、慢性骨盆疼痛症候群、前列腺疼痛症候群(慢性前列腺炎)、多種化學品敏感症候群，以及波斯灣症候群。
  24. 如申請專利範圍第22項之方法，其中癌症疼痛是與選自由下列組成之群的癌症有關：子宮內膜癌、前列腺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、結腸癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、非小細胞肺癌、腦癌、白血病、淋巴瘤、骨癌及與癌症轉移相關的疼痛。
  25. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該抗體或抗原-結合片段與第二治療劑組合被投與給患者。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該第二治療劑是選自由下列組成之群：類鴉片、COX-2抑制劑、局部麻醉劑、NMDA調節劑、大麻素受體促效劑、P2X家族調節劑、VR1拮抗劑、物質P拮抗劑、第二GFRα3拮抗劑、細胞激素或細胞激素受體拮抗劑、神經生長因子(NGF)抑制劑(小分子抑制劑或抗-NGF抗體)、BDNF、TrkA、TrkB或p75的抑制劑、阿斯匹林、NSAID、類固醇、嗎啡、選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRI)、血清素正腎上腺素再吸收抑制劑(SNRI)、三環、電壓閘控鈉通道(Nav)的抑制劑、鈣通道抑制劑、鉀通道抑制劑、腫瘤壞死因子(TNF)或TNF受體抑制劑、TWEAK(細胞凋亡的TNF相關WEAK誘導體)的抑制劑、RET抑制劑、GDNF家族配體的抑制劑、GFRα1、GFRα2或GFRα4的抑制劑、酸感應離子通道(ASIC1或ASIC3)的抑制劑、抗痙攣藥物(佳巴本汀或普瑞巴林)、前 動力蛋白受體(例如PROK1及PROK2)的抑制劑、凋亡蛋白酶(caspase)抑制劑、p38抑制劑、IKK1/2抑制劑、CTLA-4lg或皮質類固醇。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該第二GFRα3拮抗劑為有機小分子、多肽拮抗劑、對GFRα3具有特異性的第二抗體、對GFRα3具有特異性的siRNA或反義分子。
  28. 如申請專利範圍第26項之方法，其中細胞激素或細胞激素受體拮抗劑為介白素-1(IL-1)拮抗劑、IL-6拮抗劑或IL-18拮抗劑。
  29. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體或其抗原-結合片段，以及如申請專利範圍第26項之第二治療劑與醫藥學上可接受的載劑或稀釋劑。
  30. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之經單離抗體或其抗原-結合片段，或如申請專利範圍第20或29項之醫藥組成物，其用於療GFRα3相關病況或疾病，或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
  31. 如申請專利範圍第30項使用之經單離抗體或其抗原-結合片段，其中GFRα3相關病況或疾病是選自由下列組成之群：急性疼痛、慢性疼痛、神經病性疼痛、發炎性疼痛、功能性疼痛症候群、關節炎、胰臟炎、骨關節炎、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹神經痛、一般性神經痛、神經退化性病症、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調、內臟疼痛、痛風、帶狀疱疹後神經痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、嚴重或難治 性疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、遺傳性肢端紅痛症、牙痛、鼻炎、癌症疼痛、複雜性局部疼痛症候群(CRPS)、發炎性腸病(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)及膀胱異常。
  32. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之經單離抗體或其抗原-結合片段，或如申請專利範圍第20或29項之醫藥組成物的用途，其用於製造用來治療GFRα3相關病況或疾病，或與GFRα3相關病況或疾病有關之疼痛的醫藥，其中該GFRα3相關病況或疾病在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕，或該病況或疾病有關之疼痛在嚴重性或發生頻率方面受到預防、改善或減輕。
  33. 如申請專利範圍第32項之經單離抗體或其抗原-結合片段的用途，其中GFRα3相關病況或疾病是選自由下列組成之群：急性疼痛、慢性疼痛、神經病性疼痛、發炎性疼痛、功能性疼痛症候群、關節炎、胰臟炎、骨關節炎、叢集性頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹神經痛、一般性神經痛、神經退化性病症、運動障礙、神經內分泌病症、共濟失調、內臟疼痛、痛風、帶狀疱疹後神經痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、背痛、頭或頸疼痛、嚴重或難治性疼痛、突發性疼痛、術後疼痛、遺傳性肢端紅痛症、牙痛、鼻炎、癌症疼痛、複雜性局部疼痛症候群(CRPS)、發炎性腸病(例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)及膀胱異常。
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