[go: up one dir, main page]

RS58918B1 - Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke - Google Patents

Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke

Info

Publication number
RS58918B1
RS58918B1 RS20190644A RSP20190644A RS58918B1 RS 58918 B1 RS58918 B1 RS 58918B1 RS 20190644 A RS20190644 A RS 20190644A RS P20190644 A RSP20190644 A RS P20190644A RS 58918 B1 RS58918 B1 RS 58918B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
variable region
antibody
chain variable
antigen
Prior art date
Application number
RS20190644A
Other languages
English (en)
Inventor
Gilles Bernard Tremblay
Anna N Moraitis
Mario Filion
Original Assignee
Adc Therapeutics Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adc Therapeutics Sa filed Critical Adc Therapeutics Sa
Publication of RS58918B1 publication Critical patent/RS58918B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE
[0001] Širom sveta, svake godine više od milion žena dobije dijagnozu raka dojke. Rak dojke je veoma heterogena bolest koju čine desetine različitih tipova koji se razlikuju korišćenjem histološkog sistema klasifikacije. Veliki podtip i većina slučajeva su histološki identifikovani kao luminalni A ili luminalni B, koji se može okarakterisati time što ima eksprimiranje receptora estrogena (ER) sa histologijom niskog ili višeg stepena, respektivno (Santana-Davila i Perez, 2010). Za merenje eksprimiranja receptora progesterona (PgR) koriste se imunohistohemijski postupci koji, u kombinaciji sa ER-pozitivnim statusom, dozvoljavaju klasifikaciju tumora kao hormona koji reaguje. Osim toga, prekomerno eksprimiranje ili amplifikacija receptora ljudskog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2) može se pratiti bilo sa imunohistohemijom ili fluorescencijom in situ hibridizacije (FISH). Generalno, eksprimiranje ova tri markera kod tumora dojke povezano je sa boljim kliničkim ishodom, jer postoji nekoliko opcija tretiranja koje su dostupne pacijentima, i koje ciljaju na ove proteine (de Ruijter i dr., 2011), uključujući tamoksifen, Arimidex™ (anastrozol), Aromasin™ (eksemestan), Femara™ (letrozol), Faslodex™ (fulvestrant), Herceptin™ (trastuzumab) ili Tykerb™ (lapatinib).
[0002] Drugi histološki podtip raka dojke sastoji se od bazalnog raka koji je povezan, između ostalog, sa višim histološkim stepenom, povećanjem mitotskog indeksa i visokim eksprimiranjem Ki67 (Santana-Davila i Perez, 2010). Velika većina rakova sličnih bazalnim sastoji se od slučaja trostruko negativnog raka dojke (TNBC), koji čine između 15-20% svih slučajeva raka dojke (Ismail-Khan i Bui, 2010). TNBC je definisan nedostatkom eksprimiranja ER, PgR proteina i odsustvom prekomernog eksprimiranja HER2 proteina. Odnos između bazalnog raka i TNBC nije lako odrediti jer nisu svi TNBC bazalni i nisu svi bazalni rakovi TNBC, ali približno 75% slučajeva u ovim kategorijama dele karakteristike oba. TNBC je povezan sa lošom prognozom koja se sastoji od niskih petogodišnjih stopa preživljavanja i visokog recidiva.
[0003] Pacijenti sa TNBC razvijaju svoju bolest ranije u životu u poređenju sa drugim podtipovima raka dojke i često se dijagnostikuju u fazi pred-menopauze (Carey i dr., 2006). Trostruko negativni rak dojke pokazuje povećanu sklonost ka ponovnom pojavljivanju nakon tretmana i čini se da je agresivniji od drugih podtipova raka dojke (Nofech-Mozes i dr., 2009), slično onima u podtipu rak dojke sličan bazalnom. Shodno tome, ukupno petogodišnje preživljavanje TNBC pacijenata je značajno niže od onih sa dijagnozom drugih podtipova raka dojke. Trenutno ne postoji prihvatljivi specifični molekularni marker za TNBC. Uprkos ovom nedostatku, ovi tumori reaguju na hemoterapiju (Kriege i dr., 2009). Pacijenti su pokazali bolji odgovor na citotoksične agense u adjuvansnom okruženju kao i u neoadjuvansnom okruženju, kada su primenjeni agensi kao što su 5-fluorouracil, doksorubicin i ciklofosfamid (Rouzier i dr.2005). Drugi agensi koji su pokazali određenu efikasnost uključuju jedinjenja na bazi platine kao što su cisplatin i anti-tubulin jedinjenja kao što su taksani (Santana-Davila i Perez, 2010).
[0004] Kao što je gore pomenuto, nema specifičnih ciljeva za TNBC, ali to nije ometalo ispitivanje ciljanih agenasa kao što je inhibicija poli [ADP-riboza] polimeraze 1 (PARP1). PARP1 je enzim koji učestvuje u popravljanju DNK jednolančanih prekida povezivanjem sa oštećenim DNK lancima i posredovanjem u regrutovanju enzima potrebnih za popravak jednolančanih prekida (de Ruijter i dr., 2011). Prema tome, strategija je bila da inhibira aktivnost PARP1 kao načina koji dozvoljava ćelijama raka da akumuliraju više DNK jednolančanih prekida, što naposletku dovodi do genetske nestabilnosti, zaustavljanja mitoze i apoptoze. Obećavajući klinički rezultati postignuti su kod pacijenata koji su pokazali mutacije BRCA1 i/ili BRCA2, važnih medijatora genetičkog održavanja i homologne rekombinacije potrebne za pravilnu ćelijsku podelu. Zaista, pacijenti sa BRCA1 mutacijama, koje su verovatno deficitarne u ovim putevima genetske stabilnosti, pokazali su veći odgovor na inhibitore PARP1 u poređenju sa onima koji su bili divlji za BRCA1 (Fong i dr., 2009). Jasno je da je ciljanje PARP1 kod TNBC pacijenata koji su nosioci BRCA mutacija predstavlja obećavajuću strategiju. Kombinacija statusa ER/PgR/HER2 sa statusom genetskog profila BRCA1/2 gena bi mogli ponuditi najbolju karakterizaciju za odlučivanje o odgovarajućim mogućnostima tretmana za TNBC pacijente.
[0005] Druge strategije su takođe ispitivale upotrebu EGFR inhibitora, bilo kao monoklonskih antitela ili inhibitora malih molekula ili anti-angiogenih jedinjenja za ciljanje VEGF. Nekoliko kliničkih ispitivanja je procenilo efikasnost ovih jedinjenja, ali nijedan od njih nije pokazao značajan odgovor kada su primenjeni sami. Međutim, uočena je blaga efikasnost kod pacijenata koji su tretirani ovim inhibitorima u kombinaciji sa drugim citotoksičnim agensima (Santana-Davila i Perez, 2010).
[0006] Uprkos nedavnom napretku u razumevanju i tretmanu raka dojke, upotreba hemoterapije je uvek povezana sa ozbiljnim neželjenim reakcijama, koje ograničavaju njihovu upotrebu. Shodno tome, potreba za specifičnijim strategijama, kao što je kombinovanje specifičnosti antigena za tkiva sa selektivnošću monoklonskih antitela, treba da omogući značajno smanjenje neželjenih efekata koji su povezani sa ciljanjem. Ne postoje TNBC specifični antigeni koji se trenutno istražuju kao terapeutski ciljevi za monoklonska antitela. Prema tome, TNBC pacijenti imaju malo opcija zbog nemogućnosti ciljanja specifičnog markera proteina koji se eksprimira u ovim tumorima. Postoje hitne potrebe da se identifikuju novi proteini izraženi u TNBC za primenu kao novi dijagnostički markeri i nove ciljane terapije.
[0007] Antigen povezan sa bubrezima 1 (KAAG1), sekvenca proteina koja je ovde identifikovana kao SEQ ID NO.: 2, je prvobitno klonirana iz cDNK biblioteke izvedene iz histokompatibilnoe leukocitne antigen-B7 ćelijske linije raka bubrežnog raka bubrega kao antigenski peptida predstavljen citotoksičnim T limfocitima (Van den Eynde i sar., 1999; Genebank pristupni broj K9UBP8, cDNK sekvenca je predstavljena nukleotidima 738-992 od SEQ ID NO.: 1). Otkriveno je da lokus koji sadrži KAAG1 kodiraju dva gena prepisana u oba pravca na suprotnim stranama. Otkriveno je da sens lanac kodira transkript koji kodira protein nazvan DCDC2. Studije eksprimiranja ovih autora su otkrile da je KAAG1 antisens transkript specifičan za tumor i pokazuje veoma malo eksprimiranja u normalnim tkivima, dok je DCDC2 sens transkript je sveprisutno eksprimiran (Van den Eynde i dr., 1999). Eksprimiranje KAAG1 transkripta u raku, i posebno raku jajnika, raku bubrega, raku pluća, raku debelog creva, raku dojke i melanomu je obelodanjeno u međunarodnoj prijavi br. PCT/CA2007/001134 objavljenoj 27. decembra 2007 pod br. WO 2007/147265. Van den Eynde i dr., su takođe primetili RNK eksprimiranje u bubrežnim rakovima, kolorektalnim rakovima, melanomima, sarkomima, leukemijama, tumorima mozga, tumoru štitne žlezde, rakovima prostate, rakovima jednjaka, tumorima bešike, rakovima pluća i tumorima glave i vrata. Nedavno, snažni genetski dokazi dobijeni putem studija neravnoteže povezivanja su pokazali da je VMP/DCDC2/KAAG1 lokus bio povezan sa disleksijom (Schumacher i dr., 2006; Cope i dr., 2005). Jedan od ovih izveštaja ukazuje na DCDC2 markera kao krivca kod pacijenata sa disleksijom, jer je funkcija ovog proteina u migraciji kortikalnih neurona bila u skladu sa simptomima ovih pacijenata koji često pokazuju abnormalnu migraciju i sazrevanje neurona (Schumacher i dr., 2006).
[0008] Podnosilac prijave je dobio panel antitela i fragmenata koji vezuje antigen koji se vezuju za KAAG1 protein. Za ova antitela ili fragmente koji vezuju antigen se pokazalo da ciljaju tri regiona proteina; aminokiseline 1 do 35, aminokiseline 36 do 60 aminokiseline 61 do 84. Podnosilac prijave je otkrio da su antitela koja ciljaju region između aminokiselina 30 do 84 najpovoljnija za terapeutske svrhe, jer su prepoznali KAAG1 koji se nalazi na površini tumorskih ćelija. Podnosilac prijave je pokazao da neka od ovih antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da posreduju citotoksičnost ćelija zavisnih od antitela i/ili su internalizovani tumorskim ćelijama, što ih čini dobrim kandidatima za isporuku korisnog sadržaja tumorskim ćelijama. Podnosilac zahteva je takođe generisao himerna i humanizovana antitela zasnovana na odabranim kandidatima za antitela i pokazao je da ova antitela mogu inhibirati formiranje i invaziju tumorskih ćelija PCT/CA2009/001586 objavljen 3. juna 2010 pod br. WO2010/060186 i PCT/CA2010/001785 objavljen 12. maja 2011 pod br. WO2011/054112). US 2011/0223107 takođe opisuje monoklonska antitela koja se specifično vezuju za KAAG1. Konačno, podnosilac prijave je otkrio da se ova antitela mogu koristiti za tretman i dijagnostikovanje raka jajnika, raka kože, raka bubrega, kolorektalnog raka, sarkoma, leukemije, tumora mozga, tumora štitne žlezde, raka dojke, raka prostate, tumora jednjaka, tumora bešike, tumora pluća i tumora glave i vrata i metastatskih oblika ovih rakova.
[0009] Podnosilac prijave je sada došao do neočekivanog otkrića da ćelije raka dojke koje nemaju eksprimiranje ER proteina, eksprimiranje PgR proteina i/ili koje pokazuju odsustvo prekomernog eksprimiranja HER2 proteina (tj. trostruko negativne ćelije raka dojke, slične bazalnim), mogu biti efikasno ciljane sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za KAAG1. Anti-KAAG1 antitela se tako mogu koristiti za detektovanje i terapeutski tretman ćelija raka dojke koje su negativne za najmanje jedan od ovih markera.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010]
Slika 1a je poravnanje aminokiselinske sekvence 3A4 varijabilnih domena mišjih i humanizovanih lakih lanaca. Laki lanac ima dve humanizovane varijante (Lh1 a Lh2). CDR su prikazani podebljanim slovima i označeni sa CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Povratne mutacije u ljudskim okvirnim regionima koje su mišje aminokiseline su podvučene u humanizovanim sekvencama.
Slika 1b je poravnanje aminokiselinske sekvence 3A4 varijabilnih domena mišjih i humanizovanih teških lanaca. Teški lanac ima četiri humanizovane varijante (Hh1 do Hh4). CDR su prikazani podebljanim slovima i označeni sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3. Povratne mutacije u ljudskim okvirnim regionima koje su mišje aminokiseline su podvučene u humanizovanim sekvencama.
Slika 2a je poravnanje varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 3A4 (SEQ ID NO.: 4) sa varijantom varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO.:189) korišćenjem ClustalW2 programa (Larkin M.A., i dr., (2007) ClustalW i ClustalX verzija 2. Bioinformatics 200723(21): 2947-2948) gde „*“ (zvezdica) označava položaje koji imaju jedan, potpuno konzervirani ostatak, gde „:“ (dve tačke) označava konzervaciju između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje> 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici i gde „.“ (tačka) označava konzervaciju između grupa slabo sličnih svojstava - bodovanje = < 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici. ;Slika 2b je poravnanje varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 3A4 (SEQ ID NO.: 2) sa varijantom varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO.:194) korišćenjem ClustalW2 programa (Larkin M.A., i dr., (2007) ClustalW i ClustalX verzija 2. Bioinformatics 200723(21): 2947-2948) gde „*“ (zvezdica) označava položaje koji imaju jedan, potpuno konzervirani ostatak, gde „:“ (dve tačke) označava konzervaciju između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje> 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici i gde „.“ (tačka) označava konzervaciju između grupa slabo sličnih svojstava - bodovanje = < 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici.
Slika 3a predstavlja mapu plazmida pKCR5-3A4-HC-varijantu 1. Teški lanci humanizovanih 3A4 varijanti su klonirani na isti način u HindIII mesto od pK-CR5. Prema tome, dobijeni plazmidi su identični sa pKCR5-3A4-HC varijantom 1, izuzev sekvence varijabilnog domena imunoglobulina teškog lanca.
Slika 3b predstavlja mapu plazmida pMPG-CR5-3A4-LC-varijanta 1. Laki lanci humanizovanih varijanti 1 i 2 3A4 antitela su klonirani na isti način na BamHI mesto od pMPG-CR5. Prema tome, dobijeni plazmid je identičan sa pMPG-CR5-3A4-LC-varijantom 1, izuzev sekvence varijabilnog domena imunoglobulina lakog lanca. Slika 4 predstavlja analizu proizvodnje antitela nakon prolazne transfekcije u CHO ćelijama. Supernatant (13 dana posle transfekcije) CHOcTA ćelija transfektovanih sa različitim kombinacijama lakih i teških lanaca humanizovanog 3A4 antitela je analiziran pomoću western blota. Kvantifikacija antitela proizvedenog u supernatantima je određena nakon skeniranja western blot traka u odnosu na razblaženja poznatog standarda (ljudsko prečišćeno IgG antitelo). Marker molekularne težine g (kDa).
Slika 5 je grafički prikaz Superdex G75 gel filtracije rekombinantnog KAAG1 uzorka. KAAG1 je injektiran preko gel filtracije i razdvojen na 0,4 ml/min. Najveći vrh između fragmenata 15 - 19.
Slika 6 je Tabela koja prikazuje konstante brzine i afiniteta za mišje i humanizovane varijante 3A4 antitela. Slika 7a je histogram koji prikazuje stope pridruživanja (Ka) humanizovanih antitela.
Slika 7b je histogram koji prikazuje stope disocijacije (Kd) humanizovanih antitela.
Slika 7c je histogram koji prikazuje konstante afiniteta (KD) humanizovanih antitela.
Slika 8a ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vezuju za KAAG1 u ELISA. Ova slika prikazuje uporedno vezivanje varijanti humanizovanog antitela 3A4 i mišjeg 3A4. Koncentracioni zavisni profili vezivanja humanizovanih teških lanaca (Hh1, Hh2, Hh3 i Hh4), sastavljeni sa varijantom lakog lanca Lh1.
Slika 8b ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vezuju za KAAG1 u ELISA. Ova slika prikazuje uporedno vezivanje varijanti humanizovanog antitela 3A4 i mišjeg 3A4. Koncentracioni zavisni profili vezivanja humanizovanih teških lanaca (Hh1, Hh2, Hh3 i Hh4), sastavljeni sa varijantom Lh2 lakog lanca.
Slika 9 ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vežu za KAAG1 na površini ćelija raka. Ova ilustracija pokazuje uporednu aktivnost vezivanja humanizovanih i mišjih 3A4 antitela na nepermeabilizovane SKOV-3 ćelije raka jajnika.
Slika 10 pokazuje skeniranje tkivnog mikroniza koji sadrži 139 uzoraka biopsije dobijenih od pacijenata sa rakom dojke. Uzorci su blotirani sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom i pokazali su da velika većina tumora dojke izražava veoma visok nivo KAAG1 antigena. Potvrđeni uzorci TNBC označeni su sa zvezdicom.
Slika 11 prikazuje rezultate protočne citometrije izvedene koristeći MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-468, BT-20, BT-549, T47D, MCF-7 i 293-6E ćelijske linije inkubirane sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom (plave trake histograma) u poređenju sa kontrolnim IgG (crvene trake). Ovo je reprezentativni rezultat eksperimenta koji je izveden u triplikatu. Linije TNBC ćelija su označene sa zvezdicom.
Slika 12 predstavlja detektovanje KAAG1 antigena na površini MDA-MB-231 ćelija protočnom citometrijom sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom. Signal fluorescencije opada sa vremenom kada su ćelije inkubirane na 37°C, što sugeriše da je kompleks KAAG1/antitela internalizovan tokom inkubacije kada su ćelije inkubirane sa 3A4. Slika 13 predstavlja detektovanje KAAG1 antigena na površini MDA-MB-436 ćelija protočnom citometrijom sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom. Signal fluorescencije opada sa vremenom kada su ćelije inkubirane na 37°C, što sugeriše da je kompleks KAAG1/antitela internalizovan tokom inkubacije kada su ćelije inkubirane sa 3A4. Slika 14 predstavlja detektovanje KAAG1 antigena na površini BT-20 ćelija protočnom citometrijom sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom. Signal fluorescencije opada sa vremenom kada su ćelije inkubirane na 37°C, što sugeriše da je kompleks KAAG1/antitela internalizovan tokom inkubacije kada su ćelije inkubirane sa 3A4.
Slika 15 predstavlja detektovanje KAAG1 antigena na površini T47D ćelija protočnom citometrijom sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom. Signal fluorescencije opada sa vremenom kada su ćelije inkubirane na 37°C, što sugeriše da je kompleks KAAG1/antitela internalizovan tokom inkubacije kada su ćelije inkubirane sa 3A4.
Slika 16 predstavlja podatke o imunofluorescenciji izvedene na živim MDA-MB-231 ćelijama sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom i anti-LAMP1 antitelom. Imunofluorescentni signal povezan sa anti-KAAG1 antitelom je prikazan na levom panelu, imunofluorescentni signal povezan sa LAMP1 je prikazan u srednjem panelu i spajanje obe slike je prikazano na desnom panelu. Ovi podaci ilustruju ko-lokalizaciju KAAG1 i LAMP1 u blizini perinuklearnog područja.
Slika 17 predstavlja podatke o imunofluorescenciji izvedene na živim MDA-MB-231 ćelijama sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom i anti-LAMP1 antitelom. Imunofluorescentni signal povezan sa anti-KAAG1 antitelom je prikazan na levom panelu, imunofluorescentni signal povezan sa LAMP1 je prikazan u srednjem panelu i spajanje obe slike je prikazano na desnom panelu. Ovi podaci ilustruju lokalizaciju KAAG1 sa LAMP1 marker kasnih endozoma/lizozoma.
SAŽETAK PRONALASKA
[0011] Predmetni pronalazak pruža antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje je sposobno za specifično vezivanje za antigen povezan sa bubregom1 (KAAG1) i konjugovano je sa terapeutskom jedinicom za upotrebu u tretmanu trostruko negativnog raka dojke, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži CDRH1 kao što je prikazano u SEQ ID NO.:49, CDRH2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 50 ili u SEQ ID NO.:212, CDRH3 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 51, i CDRL1 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 52, CDRL2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 53 i CDRL3 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 54.
[0012] Poželjna otelotvorenja pronalaska su navedena u patentnim zahtevima.
[0013] Ovde je obelodanjen postupak tretiranja ili detektovanja raka ili ćelija raka (in vitro ili in vivo) kod pojedinca koji ima potrebu.
[0014] U skladu sa predmetnim pronalaskom, tretman se izvodi sa antitelom sposobnim za vezivanje za KAAG1, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koje je konjugovano sa terapeutskim delom.
[0015] Pojedinac koji ima potrebu može da obuhvati, na primer, pojedinca koji ima ili se sumnja da ima rak. Takav pojedinac može imati rak ili ćelije raka koje potiču od raka dojke.
[0016] Rak ili ćelije raka mogu posebno da potiču od raka dojke koji se karakteriše kao trostruko negativan ili bazalni.
[0017] Prema tome, pojedinci koji mogu imati koristi od postupaka tretmana ili detektovanja koji su ovde opisani, mogu uključivati one koji pate od raka dojke.
[0018] Rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora estrogena.
[0019] Rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora progesterona.
[0020] Rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju smanjenje ili gubitak eksprimiranja Her2.
[0021] Rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju smanjenje ili gubitak prekomernog eksprimiranja Her2.
[0022] Posebno, rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju bilo 1) smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora estrogena i receptora progesterona, 2) smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora estrogena i smanjenje ili gubitak eksprimiranja Her2, 3) smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora progesterona i smanjenje ili gubitak eksprimiranja Her2 ili 4) smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora estrogena, smanjenje ili gubitak eksprimiranja receptora progesterona i smanjenje ili gubitak eksprimiranja Her2.
[0023] Još specifičnije, rak dojke može da sadrži ćelije tumora koje pokazuju ili 1) gubitak eksprimiranja receptora estrogena i receptora progesterona, 2) gubitak eksprimiranja receptora estrogena i gubitak eksprimiranja Her2, 3) gubitak u eksprimiranje receptora progesterona i gubitak eksprimiranja Her2 ili 4) gubitak eksprimiranja receptora estrogena, gubitak eksprimiranja receptora progesterona i gubitak eksprimiranja Her2.
[0024] U skladu sa predmetnim pronalaskom, pojedinac može da nosi ćelije raka dojke koje su karakterisane kao trostruko negativne, ili mogu imati tumor kategorisan kao trostruko negativan rak dojke.
[0025] U skladu sa predmetnim pronalaskom, pojedinac može nositi ćelije raka dojke koje su karakterisane kao bazalne, ili mogu imati tumor kategorisan kao rak dojke sličan bazalnom.
[0026] Drugi pojedinci koji bi imali koristi od tretmana sa anti-KAAG1 uključuju one koji imaju rak koji sadrži ćelije tumora koje pokazuju fenotip epitelne do mezenhimne tranzicije (EMT).
[0027] Najčešće korišćeni molekularni markeri EMT uključuju, na primer, smanjeno eksprimiranje E-kadherina, citokeratina i β-katenina (u membrani) i/ili povećano eksprimiranje Snail, Slug, Twist, ZEB1, ZEB2, N-kadherina, vimentina, aktina glatkih mišića, matrične metaloproteinaze itd. (pogledati na primer, Kalluri i Veinberg, The Journal of Clinical Investigation, 119(6), p1420-1428; 2009; Fassina i dr., Modern Pathology, 25; p86-99; 2012; Lee i dr., JCB; 172; p973-981; 2006). EMT fenotip se takođe može razlikovati po povećanom kapacitetu za migraciju, invaziju otpornošću na anoikis/apoptozu. Ćelije koje su podvrgnute mezenhimu epitelne do mezenhimne tranzicije mogu se stoga detektovati redukcijom epitelnih markera i pojavom mezenhimskih markera ili EMT fenotipova.
[0028] U skladu sa predmetnim pronalaskom, terapeutska upotreba može tako obuhvatiti, na primer, primenu pojedincu koji ima potrebu, antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koje je sposobno za specifično vezivanje za KAAG1. Pojedinac koji ima potrebu je poželjno odabran na osnovu svog tumora bez ER eksprimiranja, PgR eksprimiranja i/ili odsustvom prekomernog eksprimiranja HER2 proteina. Kliničko testiranje ovih markera se obično izvodi uz pomoć histopatoloških postupaka (imunohistohemija, FISH, itd.) i/ili studija genskog eksprimiranja (pogledati na primer Dent i dr, 2007, Bernstein i Lacey, 2011). Prema tome, pojedinac koji ma potrebu može biti pojedinac koji je dobio dijagnozu trostruko negativnog raka dojke ili rak dojke sličan bazalnom. Pojedinac koji ma potrebu može biti pojedinac koji ne reaguje na hormonsku terapiju i/ili terapiju transtuzumabom (ili drugim anti-Her2 antitelima). Alternativno, pojedinac koji ima potrebu može biti pojedinac koji nosi tumorske ćelije koje imaju sposobnost da prolaze epitelnu do mezenhimalnu tranziciju ili koje su stekle mezenhimalni fenotip.
[0029] Ovde je obelodanjen postupak tretiranja trostruko negativnog raka dojke ili rak dojke sličan bazalnom primenom inhibitora aktivnosti ili eksprimiranja KAAG1 pojedincu koji ima potrebu.
[0030] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, KAAG1 inhibitor može tako da sadrži ovde opisano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0031] Takođe, u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, KAAG1 inhibitor može da sadrži nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa SEQ ID NO.: 1 ili njenim fragmentom. Određenije, KAAG1 inhibitor može sadržati nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa nukleotidima 738 do 992 (inkluzivno) od SEQ ID NO.: 1 ili njen fragment. Na primer, inhibitor može da sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida (najmanje 15, najmanje 20) koji su komplementarni sa SEQ ID NO.:1 ili nukleotide 738 do 992 (inkluzivno) od SEQ ID NO.:1. Određeniji tip KAAG1 inhibitora uključuje siRNK koja inhibira eksprimiranje SEQ ID NO.:1.
[0032] Pogodna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju ona koja su sposobna da se vezuju za KAAG1 na površini tumorskih ćelija. Takva antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen poželjno mogu vezati epitop uključen u aminokiseline 30 do 84 od KAAG1 inkluzivno.
[0033] Alternativno, takva antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 36 do 60 (inkluzivno) ili unutar aminokiselina 61 do 84 (inkluzivno) od KAAG1.
[0034] Epitop može biti posebno lociran ili sadržan unutar aminokiselina 50 do 70, 50 do 65, 51 do 65, 52 do 65, 53 do 65, 54 do 65, 54 do 64, 54 do 63, 54 do 62, 54 do 61 54 do 60, 50 do 62; 50 do 61, ili 50 do 60 (inkluzivno ili ekskluzivno).
[0035] U skladu sa otelotvorenjem pronalaska, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 50 do 70 od KAAG1.
[0036] U sledećem otelotvorenju pronalaska, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 50 do 62 od KAAG1.
[0037] U još jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina od 54 do 65 od KAAG1.
[0038] Pogodna antitela za terapeutski tretman uključuju, na primer, ona koja posreduju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela.
[0039] Druga još pogodnija antitela za terapeutski tretman uključuju ona koja su konjugovana sa terapeutskim delom.
[0040] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo može biti, na primer, monoklonsko antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, ljudsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Terapeutska upotreba
[0041] Kao što je ovde naznačeno, predmetni pronalazak obuhvata primenu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen pojedincu koji ima rak dojke koji se karakteriše kao „trostruko negativan rak dojke". Rak dojke može biti „rak dojke sličan bazalnom".
[0042] Klasifikacija podtipova raka dojke kao „trostruko negativan rak dojke“ ili „rak dojke sličan bazalnom“ je poznata u struci (pogledati na primer, Foulkes i dr., N. Engl. J. Med., 2010; 363:1938-1948) i obuhvata, na primer, sledeće definicije:
„Rak dojke sličan bazalnom“, može uključivati, na primer, podtip raka dojke koji obuhvata heterogenu grupu tumora karakterisanu odsustvom ili niskim nivoima eksprimiranja estrogenskih receptora, veoma niskom prevalencom eksprimiranja Her2 i eksprimiranjem gena koji se obično nalaze u bazalnim ili mioepitelnim ćelijama ljudske dojke. Takvo eksprimiranje može da se odredi pomoću analize mikronizova.
„Trostruko negativan rak dojke“, može uključivati, na primer, tumor koji karakteriše nedostatak receptora estrogena (ER), receptor progesterona (PR) i Her2 eksprimiranje. Neki istraživači prihvataju tumore kao negativne za eksprimiranje ER ili PR samo ako je manje od 1% ćelija pozitivno za eksprimiranje ER ili PR; drugi smatraju da su tumori negativni za eksprimiranje ER ili PR kada je do 10% ćelija pozitivno eksprimirani. Korišćene su različite definicije negativnosti HER2. Dve najčešće prihvaćene su tumori sa imunohistohemijskim rezultatima od 0/1 ili 2+ koji nemaju amplifikaciju HER2 gena posle in situ hibridizacija. Takvo eksprimiranje može biti posebno određeno imunohistohemijskim bojenjem.
[0043] Ovde je obelodanjen postupak tretiranja koji uključuje primenu KAAG1 inhibitora pojedincu koji ima potrebu. Takav KAAG1 inhibitor uključuje, na primer, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se specifično vezuje za KAAG1.
[0044] Verovatno je da su najsnažnija antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti oni koji imaju visok afinitet za KAAG1. Takođe je verovatno da su najsnažnija antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti oni koji su internalizovani unutar ćelijskog odeljka, kao što je, na primer, lizozom ili endozom.
[0045] Kao takav, predmetni pronalazak naročito obuhvata antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji imaju visok afinitet za KAAG1.
[0046] Pogodna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju one koji su sposobni da se vežu za KAAG1 na površini tumorskih ćelija sa visokim afinitetom. Takva antitela visokog afiniteta ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu prvenstveno vezati epitop uključen u aminokiseline 30 do 84 od KAAG1 inkluzivno.
[0047] Alternativno, takva antitela visokog afiniteta ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 36 do 60 (inkluzivno) ili unutar aminokiselina 61 do 84 (inkluzivno) KAAG1.
[0048] Antitela visokog afiniteta ili fragmenti koji vezuju antigen mogu se vezati, na primer, epitop može biti posebno lociran ili sadržan unutar aminokiselina 50 do 70, 50 do 65, 51 do 65, 52 do 65, 53 do 65, 54 do 65, 54 do 64, 54 do 63, 54 do 62, 54 do 61, 54 do 60, 50 do 62; 50 do 61, ili 50 do 60 (inkluzivno ili ekskluzivno).
[0049] U skladu sa otelotvorenjem pronalaska, antitelo visokog afiniteta ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina od 50 do 70 od KAAG1.
[0050] U sledećem otelotvorenju pronalaska, antitelo visokog afiniteta ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 50 do 62 od KAAG1.
[0051] U još jednom otelotvorenju, antitelo visokog afiniteta ili fragment koji vezuje antigen može vezati epitop koji se nalazi unutar aminokiselina od 54 do 65 od KAAG1.
[0052] Poželjna antitela koja uključuju antitela visokog afiniteta su ona koja se mogu internalizovati u ćelijama ili ćelijskim odeljcima (npr. lizozomi ili endozomi). Sposobnost antitela da se internalizuju može se odrediti postupkom koji je poznat u struci, kao što su na primer i bez ograničenja, imunofluorescentne studije sličnim onima koje se ovde izvode.
[0053] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja imaju CDR identične onima iz 3A4. Kao takva, antitela koja imaju varijabilni region lakog lanca i/ili konsenzus sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO.: 185 do 188 i 191 do 193 i specifične sekvence navedene u SEQ ID NO.:46, 48189, 190, ili 194 do 198 obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom. Među njima, antitela koja imaju varijabilni region lakog lanca i/ili konsenzus sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO.: 188 i 196 ili specifične sekvence navedene u SEQ ID NO.:46, 48, 189, 190 ili 194 do 198 su posebno razmatrane.
[0054] U skladu sa predmetnim pronalaskom antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen su konjugovani sa terapeutskim delom.
[0055] Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu imati ljudski konstantni region. Poželjno, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu imati konstantni region ljudskog IgG1. Alternativno, antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu imati IgG2 konstantni region.
[0056] Antitelo za upotrebu predmetnog pronalaska može takođe uključivati primenu KAAG1 antitela konjugovanog sa terapeutskim delom ili fragmentom koji vezuje antigen konjugovanim sa terapeutskim delom u kombinaciji sa antitumorskim agensom kao što je na primer, mali molekulski lek, antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za cilj koji nije KAAG1, hemoterapeutik ili citotoksični agens. Primer antitumorskog agensa koji se može primenjivati sa KAAG1 antitelom može da uključuje, na primer, doksorubicin, taksane, anti-angiogene agense, soli platine, PARP inhibitore.
[0057] Drugi ovde opisani postupci tretiranja uključuju primenu drugih tipova KAAG1 inhibitora kao što su terapeutici zasnovani na antisensu (siRNK, antisensi, ribozimi, itd.).
Antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju za KAAG1
[0058] Izraz „antitelo ili fragment koji vezuju antigen“ ili slični izrazi kao što su „antitela i fragmenti koji vezuju antigen“ obuhvata, na primer, „varijanta antitela ili fragmenta koji vezuje antigen“ kao što je, na primer, „humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen".
[0059] Izraz „antitelo“ se odnosi na netaknutna antitela, monoklonska ili poliklonska antitela. Izraz „antitelo“ takođe obuhvata multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela. Ljudska antitela su obično napravljena od dva laka lanca i dva teška lanca od kojih svaki sadrži varijabilne regione i konstantne regione. Varijabilni region lakog lanca sadrži 3 CDR, koji su ovde identifikovani kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 okruženi okvirnim regionima. Varijabilni region teškog lanca sadrži 3 CDR, koji su ovde identifikovani kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3, okruženi okvirnim regionima.
[0060] Izraz „fragment koji vezuje antigen“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost vezivanja za antigen (npr., KAAG1, izlučeni oblik KAAG1 ili njegove varijante). Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima netaknutog antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih u okviru termina „fragment koji vezuje antigen“ antitela obuhvataju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) fragment dAb (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; i (vi) izolovano region koje određuje komplementarnost (CDR), npr., VHCDR3. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, koji su kodirane od strane odvojenih gena, one se mogu spojiti, koristeći rekombinantne postupke, pomoću sintetičkog veznika koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan polipeptidni lanac u kom se VLi VHregioni spajaju kako bi se formirali monovalentni molekuli (poznati kao jednolančani Fv (scFv); pogledati npr. Bird i dr. (1988) Science 242:423-426; i Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena izrazom „fragment koji vezuje antigen“ antitela. Dalje, fragmenti koji vezuju antigen uključuju fuzione proteine imunoglobulina domena vezivanja koji sadrže (i) polipeptid domena vezivanja (kao što je varijabilni region teškog lanca, varijabilni region lakog lanca, ili varijabilni region teškog lanca fuzionisan na varijabilni region lakog lanca preko vezivnog peptida) koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina spojen na zglobnom regionu, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca spojen imunoglobulina fuzionisan na CH2 konstantnom regionu. Zglobni region može biti modifikovan zamenom jednog ili više cisteinskih ostataka sa serinskim ostacima kako bi se sprečila dimerizacija. Takvi fuzioni proteini imunoglobulina u domenu vezivanja su dalje obelodanjeni u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate onima stručnjacima u oblasti, i fragmenti se ispituju na korisnost na isti način kao i netaknutna antitela.
[0061] Tipično mesto za vezivanje antigena se sastoji od varijabilnih regiona formiranih uparivanjem imunoglobulina lakog lanca i imunoglobulina teškog lanca. Struktura varijabilnih regiona antitela je veoma konzistentna i pokazuje veoma slične strukture. Ovi varijabilni regioni tipično se sastoje od relativno homolognih okvirnih regiona (FR), razmaknutih sa tri hipervarijabilna regiona nazvana regioni za određivanje komplementarnosti (CDR). Ukupna aktivnost vezivanja fragmenta koji vezuje antigen je često diktirana sekvencom CDR. FR često igraju ulogu u pravilnom pozicioniranju i poravnanju u tri dimenzije CDR za optimalno vezivanje antigena.
[0062] Kako se ovde koristi, izraz „visoki afinitet“ se odnosi na afinitet od 10 nM ili manji. Izraz „visoki afinitet“ posebno uključuje antitela koja imaju afinitet od 5nM ili manje. Izraz „visoki afinitet“ čak još specifičnije uključuje antitela koja imaju afinitet od 1 nM ili manje, ili 0,1 nM ili manje.
[0063] Antitela i/ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu da potiču, na primer, od miša, pacova ili bilo kog drugog sisara ili iz drugih izvora, kao što su tehnologije rekombinantne DNK.
[0064] An-KAAG1 antitela su inicijalno izolovana iz Fab biblioteka zbog svoje specifičnosti prema antigenu od interesa. Primeri postupaka za konvertovanje Fab u potpune imunoglobuline su dati ovde.
[0065] Ovde opisani varijabilni regioni mogu biti fuzionisani sa konstantnim regionima željene vrste, čime se omogućava prepoznavanje antitela pomoću efektorskih ćelija željenih vrsta. Konstantni region može da potiče, na primer, iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipa. Kloniranje ili sintetisanje konstantnog regiona u okviru sa varijabilnim regionom je u okviru znanja stručnjaka i može biti izvedeno, na primer, tehnologijom rekombinantne DNK.
[0066] U određenim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, antitela koja se vezuju za KAAG1 mogu biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipa. Specifičnija otelotvorenja pronalaska se odnose na antitelo IgG1 podtipa ili posebno na ljudski IgG1 podtip. Druga specifična otelotvorenja predmetnog pronalaska se odnose na antitelo IgG2 podtipa ili posebno na ljudski IgG2 podtip.
[0067] Antitelo može biti humanizovano antitelo IgG1 podtipa ili posebno ljudski IgG1 podtip. Alternativno, antitelo može biti humanizovano antitelo IgG2 podtipa ili posebno ljudskog IgG2 podtipa.
[0068] Antitelo može biti, na primer, biološki aktivno u posredovanju ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), citotoksičnosti posredovane komplementima (CMC), ili povezano sa imunim kompleksima. Tipični ADCC uključuje aktiviranje prirodnih ćelija ubica (NK) i oslanja se na prepoznavanje ćelija obloženih antitelima sa Fc receptorima na površini NK ćelija. Fc receptori prepoznaju Fc domen antitela kao što je prisutan na IgG1, koji se vezuju za površinu ciljane ćelije, posebno za ćeliju raka koja eksprimira antigen, kao što je KAAG1. Jednom vezana za Fc receptor IgG, NK ćelija oslobađa citokine i citotoksične granule koje ulaze u ciljanu ćeliju i promovišu ćelijsku smrt aktiviranjem apoptoze.
[0069] Ovde je opisana kolekcija antitela koja se vezuju za KAAG1 ili za varijantu KAAG1. U određenim otelotvorenjima, antitela mogu biti izabrana iz grupe koja se sastoji od poliklonskih antitela, monoklonskih antitela kao što su himerna ili humanizovana antitela, fragmenti antitela kao što su fragmenti koji vezuju antigen, jednolančana antitela, domenska antitela i polipeptidi sa regionom vezivanja antigena.
[0070] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može biti sposoban da indukuje ubijanje (eliminaciju, razaranje, lizu) tumorskih ćelija koje eksprimiraju KAAG1 ili tumorskih ćelija koje eksprimiraju varijantu KAAG1 (npr. na način zavisan od ADCC).
[0071] U daljem aspektu predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može posebno biti okarakterisan svojom sposobnošću smanjenja širenja tumorskih ćelija koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0072] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može se karakterisati svojom sposobnošću da smanji ili ometa formiranje tumora koji eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0073] U primernom otelotvorenju pronalaska, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može sadržati aminokiseline konstantnog regiona, koje mogu poticati, na primer, iz ljudskog antitela.
[0074] U sledećom otelotvorenju pronalaska, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može da sadrži okvirne aminokiseline ljudskog antitela.
[0075] Podnosilac prijave je generisao specifična antitela i fragmente koji vezuju antigen koji mogu biti korisni za ovde opisane svrhe.
[0076] Sledi lista antitela koja su generisana i pokazala se da se specifično vezuju za KAAG1; 3D3, 3A4, 3C4, 3G10, 3A2, 3F6, 3E8, 3E10, 3A9, 3B1, 3G5, 3B2, 3B8, 3G8, 3F7, 3E9, 3G12, 3C3, 3E12, 4A2, 3F10, 3F4, 3B11, 3D1, 3C2, 3E6 i 3H3. Sekvence lakog lanca ili teškog lanca, varijabilnih regiona ili regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) antitela su dostupne u međunarodnoj prijavi br. PCT/CA2009/001586 objavljenoj 3. juna 2010 pod br. WO2010/060186A8, u međunarodnoj prijavi br. PCT/CA2010/001795 objavljenoj 12. maja 2011 pod br. WO2011/054112A1 ili u međunarodnoj prijavi br. PCT/CA2012/000296 objavljeno. 4. oktobra 2012 pod br. WO2012/129668A1.
[0077] U većini slučajeva, sekvenca CDR pružena je odvojeno ili je ovde prikazana podebljanim slovima.
[0078] Među ovim antitelima, 3D3, 3A4, 3G10 i 3C4 su izabrani za in vitro i/ili in vivo biološko testiranje. Izgleda da antitelo 3A4 ima najbolje karakteristike. Na osnovu naših eksperimenata, 3A4 antitelo kada je konjugovano sa terapeutskim delom (npr. citotoksičnim agensom) je efikasnije u ubijanju ćelija raka nego što je ne-konjugovana verzija.
[0079] U primernom obelodanjenju, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata bilo koji pojedinačni CDR ili kombinaciju CDR1, CDR2 i/ili CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca. CDR3 može specifično biti izabran. Kombinacija može da uključuje na primer, CDRL1 i CDRL3; CDRL1 i CDRL2; CDRL2 i CDRL3 i; CDRL1, CDRL2 i CDRL3.
[0080] U drugom primernom obelodanjenju, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata bilo koji pojedinačni CDR ili kombinaciju CDR1, CDR2 i/ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca. CDR3 može specifično biti izabran. Kombinacija može da uključuje na primer, CDRH1 i CDRH3; CDRH1 i CDRH2; CDRH2 i CDRH3 i; CDRH1, CDRH2 i CDRH3.
[0081] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata barem dva CDR od CDRL1, CDRL2 ili CDRL3.
[0082] Takođe u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0083] Dalje u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata:
a. Barem dva CDR od CDRL1, CDRL2 ili CDRL3 i;
b. Barem dva CDR od CDRH1, jedan CDRH2 ili jedan CDRH3.
[0084] Antitelo ili fragment koji vezuje antigen može poželjnije sadržati jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0085] Antitelo ili fragment koji vezuje antigen može takođe poželjnije sadržati jedan CDRH1, jedan CDRH2 i jedan CDRH3.
[0086] Kada je na raspolaganju samo jedan varijabilni region lakog lanca ili varijabilni region teškog lanca, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može biti rekonstituisan skriningom biblioteke komplementarnih varijabilnih regiona koristeći postupke poznate u struci (Portolano i dr. The Journal of Immunology (1993) 150:880-887, Clarkson i dr., Nature (1991) 352:624-628).
[0087] Primeri antitela ili fragmenata koji vezuju antigen su oni koji imaju CDR lakog lanca i/ili teških lanaca 33D3, 3A4, 3C4, 3G10, 3A2, 3F6, 3E8, 3E10, 3A9, 3B1, 3G5, 3B2, 3B8, 3G8, 3F7, 3E9, 3G12, 3C3, 3E12, 4A2, 3F10, 3F4, 3B11, 3D1, 3C2, 3E6 ili 3H3 antitela. Više konkretnih primera obuhvataju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji imaju CDR lakog lanca i/ili teških lanaca 3D3, 3A4, 3C4 ili 3G10 antitela. U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen imaju CDR lakog i teškog lanca 3A4 antitela. Pronalazak tako obuhvata bilo koje monoklonsko, himerno, ljudsko ili humanizovano antitelo koje sadrži CDR 3A4 antitelo.
[0088] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom su oni koji imaju CDR od 3A4 antitela i sadrže, na primer, CDRH1 kao što je prikazano u SEQ ID NO.:49, CDRH2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.:50 ili u SEQ ID NO.: 212, CDRH3 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 51, CDRL1 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 52, CDRL2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 53 i CDRL3 kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 54.
[0089] Predmetni pronalazak stoga obuhvata, antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju sekvence izabrane iz grupe koju čine:
d. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:48 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:46;
aa.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:194,
bb.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:195,
cc.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:196,
dd.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:197,
ee.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:194,
ff. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:195,
gg.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:196,
hh.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:197.
[0090] Ovde su obelodanjena antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju sekvence izabrane iz grupe koju čine:
a.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:16 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:18,
b.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:20 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:22;
c.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:24 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:26;
d.3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:48 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:46;
e. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:103 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:126,
f. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:104 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:127,
g. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:105 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:128,
h. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:106 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:145,
i. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:107 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:129,
j. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:108 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:130,
k. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:109 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:141,
I. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:110 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:131,
m. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:111 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:134,
n. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:112 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:135,
o. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:113 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:136,
p. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:114 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:133,
q. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:115 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:140,
r. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:116 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:137,
s. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:117 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:144,
t. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:118 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:139,
u. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:119 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:132,
v. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:120 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:142,
w. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:121 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:138,
x. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:122 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:146,
y. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:123 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:153,
z. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:124 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:143,
aa. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:194,
bb. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:195,
cc. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:196,
dd. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:189 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:197,
ee. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:194,
ff. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:195,
gg. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:196, ili
hh. 3CDR varijabilnog regiona lakog lanca definisani u SEQ ID NO.:190 i/ili 3CDR varijabilnog regiona teškog lanca definisani u SEQ ID NO.:197.
[0091] Druga primerna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen imaju laki lanac i/ili teške lance od 3D3, 3A4, 3C4, 3G10, 3A2, 3F6, 3E8, 3E10, 3A9, 3B1, 3G5, 3B2, 3B8, 3G8, 3F7, 3E9, 3G12, 3C3, 3E12, 4A2, 3F10, 3F4, 3B11, 3D1, 3C2, 3E6 ili 3H3 antitela. Još određeniji primeri uključuju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji imaju laki lanac i/ili teške lance od 3D3, 3A4, 3C4 ili 3G10 antitela. Još određenije otelotvorenja pronalaska uključuju antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji imaju laki lanac i/ili teške lance od 3A4 antitela (humanizovani i ne-humanizovani).
[0092] Predmetni pronalazak stoga obuhvata, antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju sekvence izabrane iz grupe koju čine:
d. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:48 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:46,
aa. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:189 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:194,
bb. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:189 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:195,
cc. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:194,
dd. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:195,
ee. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:196, ili
ff. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:197.
[0093] Ovde su obelodanjena antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju sekvence izabrane iz grupe koju čine:
a. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:16 (kodiran od strane SEQ ID NO.:15) i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:18 (kodiran od strane SEQ ID NO.:17),
b. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:20 (kodiran od strane SEQ ID NO.:19) i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:22 (kodiran od strane SEQ ID NO.:21);
c. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:24 (kodiran od strane SEQ ID NO.:23) i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:26 (kodiran od strane SEQ ID NO.:25);
d. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:48 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:46,
e. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:103 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:126,
f. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:104 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:127,
g. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:105 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:128,
h. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:106 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:145,
i. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:107 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:129,
j. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:108 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:130,
k. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:109 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:141,
I. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:110 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:131,
m. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:111 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:134,
n. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:112 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:135,
o. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:113 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:140,
p. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:114 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:133,
q. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:115 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:140,
r. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:116 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:137,
s. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:117 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:144,
t. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:118 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:139,
u. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:119 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:132,
v. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:120 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:142,
w. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:121 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:138,
x. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:122 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:146,
y. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:123 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:147;
z. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:124 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:144;
aa. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:189 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:194,
bb. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:189 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:195,
cc. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:194,
dd. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:195,
ee. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:196, ili
ff. varijabilni region lakog lanca definisan u SEQ ID NO.:190 i/ili varijabilni region teškog lanca definisan u SEQ ID NO.:197.
[0094] Okvirni region teških i/ili lakih lanaca koji su ovde opisani može biti izveden iz jednog ili više okvirnog regiona koji su ovde prikazani. Antitelo ili fragmenti koji vezuju antigen mogu tako da sadrže jedan ili više ovde opisanih CDR (npr., izabrani od specifičnih CDR ili konsenzusnih CDR od SEQ ID NO.: 72 do 88 ili CDR varijanti od SEQ ID NO.:89-102) i okvirne regione koji potiču od ovde opisanih. U SEQ ID NO. 103-154, očekivani CDR su prikazani masnim slovima, dok okvirni regioni nisu.
[0095] Tabela 1 se odnosi na kompletne sekvence lakog i teškog lanca nekih anti-KAAG1 antitela koja su izabrana za biološko testiranje.
Tabela 1.
[0096] Studije mapiranja epitopa su otkrile da 3D3 antitelo interakuje sa KAAG1 epitopom obuhvaćenim aminokiselinama 36 - 60, inkluzivno. Antitela 3G10 i 3A4 interakuju sa KAAG1 epitopom obuhvaćenim aminokiselinama 61 - 84, inkluzivno, i 3C4 antitelo interakuje sa KAAG1 epitopom obuhvaćenim aminokiselinama 1 -35. Iako 3G10 i 3A4 vezuju sličan region, 3G10 antitelo se ne vezuje za KAAG1 tako efikasno kao 3A4 antitelo.
[0097] Podrazumeva se da varijabilni region lakog lanca specifične kombinacije koji je dat gore može biti promenjen za bilo koji drugi varijabilni region lakog lanca. Slično tome, varijabilni region teškog lanca specifične kombinacije koja je gore navedena može se promeniti za bilo koji drugi varijabilni region teškog lanca.
[0098] Sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca izabranih antitela koje se vezuju za KAAG1 opisane su u Tabeli 2.
Tabela 2.
[0099] SEQ ID NO. 103-154 odgovaraju varijabilnim regionima lakog lanca i teškog lanca drugih antitela za koje se pokazalo da vezuju KAAG1.
[0100] CDR sekvenca varijabilnih regiona lakog i teškog lanca izabranih antitela koja se vezuju za KAAG1 prikazana je u Tabeli 3.
Tabela 3
Varijanta antitela i fragmenti koji vezuju antigen
[0101] Predmetni pronalazak takođe obuhvata varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen koji su ovde opisani. Varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen su oni koji imaju varijaciju u aminokiselinskoj sekvenci. Na primer, varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključeni u predmetno obelodanjenje su oni koji imaju najmanje jednu varijantu CDR (dve, tri, četiri, pet ili šest varijanti CDR, itd. ili čak dvanaest varijantnih CDR). Varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koje imaju varijantu varijabilnog regiona lakog lanca, varijantu varijabilnog regiona teškog lanca, varijantu lakog lanca i/ili varijantu teškog lanca. Varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključeni u predmetni pronalazak su oni koji imaju, na primer, sličan ili poboljšan afinitet vezivanja u poređenju sa izvornim antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen.
[0102] Kako se ovde koristi, izraz „varijanta“ se odnosi na bilo koju sekvencu koja je ovde opisana i uključuje, na primer, varijantu CDR (bilo CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 i/ili CDRH3), varijantu varijabilnog regiona lakog lanca, varijantu varijabilnog regiona teškog lanca, varijantu lakog lanca, varijantu teškog lanca, varijantu antitela, varijantu fragmenta koji vezuje antigen i varijantu KAAG1.
[0103] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione (CDR), ali se takođe razmatraju modifikacije u okvirnom regionu ili čak u konstantnom regionu. Primerna otelotvorenja varijanti CDR su dati u SEQ ID NO.: 72-102.
[0104] Konzervativne supstitucije mogu biti napravljene zamenom aminokiseline (CDR, varijabilnog lanca, antitela, itd.) jedne od grupa navedenih u nastavku (grupa 1 do 6) za drugu aminokiselinu iste grupe.
[0105] Drugi primerna otelotvorenja konzervativnih supstitucija prikazani su u Tabeli 1A pod naslovom „poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije dovode do neželjenog svojstva, onda se mogu uvesti značajnije promene, nazvane „testiraju supstitucije“ u Tabeli 1A, ili kao što je dalje opisano u daljem tekstu u odnosu na klase aminokiselina, i proizvodi se pregledaju.
[0106] U struci je poznato da varijante mogu biti generisane supstitucionom mutagenezom i zadržati biološku aktivnost polipeptida predmetnog pronalaska. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u uklonjenoj aminokiselinskoj sekvenci i različit ostatak ubačen na njegovo mesto. Na primer, jedno mesto od interesa za supstitucionu mutagenezu može da obuhvati mesto gde su određeni ostaci dobijeni od različitih vrsta identični. Primeri supstitucija identifikovanih kao „konzervativne supstitucije“ prikazani su u Tabeli 1A. Ako takve supstitucije dovode do promene koja nije poželjna, onda se uvodi drugi tip supstitucija, nazvan „primerne supstitucije“ u Tabeli 1A, ili kao što je ovde dalje opisano u odnosu na klase aminokiselina, i proizvodi se pregledaju.
[0107] Značajne modifikacije u funkciji ili imunološkom identitetu postižu se selekcijom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne osnove u području supstitucije, na primer, kao konformacija lista ili spiralna konformacija. (b) naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljanom mestu, ili (c) masu bočnog lanca. Prirodno nastali ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:
(grupa 1) hidrofobna: norleucin, metionin (Met), Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu), Izoleucin (Ile) (grupa 2) neutralna hidrofilna: cistein (Cys), serin (Ser), treonin (Thr)
(grupa 3) kisela: Aspartinska kiselina (Asp), Glutaminska kiselina (Glu)
(grupa 4) baza: Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Histidin (His), Lizin (Lys), Arginin (Arg)
(grupa 5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Glicin (Gly), Prolin (Pro); i
(grupa 6) aromatična: Triptofan (Trp), Tirozin (Tyr), Fenilalanin (Phe)
[0108] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu.
Tabela 1A. Supstitucija aminokiselina
[0109] Varijacije u aminokiselinskoj sekvenci varijante antitela ili fragmenta koji vezuje antigen mogi uključivati dodavanje aminokiselina, brisanje, umetanje, supstituciju itd., jednu ili više modifikacija u okosnici ili bočnom lancu jedne ili više aminokiselina, ili dodavanje grupe ili drugog molekula na jednu ili više aminokiselina (bočni lanci ili okosnica).
[0110] Varijanta antitela ili fragmenta koji vezuje antigen može imati značajnu sličnost sekvenci i/ili identičnost sekvence u svojoj aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa izvornim antitelom ili aminokiselinskom sekvencom fragmenta koji vezuje antigen. Stepen sličnosti između dve sekvence zasniva se na procentu identičnosti (identične aminokiseline) i na konzervativnoj supstituciji.
[0111] Generalno, stepen sličnosti i identičnosti između promenljivih lanaca je ovde određen korišćenjem Blast2 programa za sekvence (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), „Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences“, FEMS Microbiol Lett.174:247-250) korišćenjem podrazumevanih podešavanja, tj. blastp programa, BLOSUM62 matrice ( open gap 11 i extension gap penalty 1; gapx dropoff 50, expect 10.0, word size 3) i aktiviranih filtera.
[0112] Procenat identičnosti će stoga biti indikativan za aminokiseline koje su identične u poređenju sa izvornim peptidom i koje mogu zauzeti isto ili slično mesto. Procenat sličnosti će biti indikativan za aminokiseline koje su identične i one koje su zamenjene sa konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom u poređenju sa izvornim peptidom na istom ili sličnom položaju.
[0113] Varijante predmetnog pronalaska obuhvataju one koje mogu imati najmanje 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnost sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0114] Primerna otelotvorenja varijanti su one koji imaju najmanje 81% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0115] Druga otelotvorenja varijanti su ona koja imaju najmanje 82% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0116] Dalji primeri izvedbi varijanti su one koji imaju najmanje 85% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0117] Druga primerna otelotvorenja varijanti su one koje imaju najmanje 90% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0118] Dodatna primerna otelotvorenja varijanti su one koji imaju najmanje 95% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0119] Još dodatnih primernih otelotvorenja varijanti su one koji imaju najmanje 97% identičnosti sekvence sa ovde opisanom sekvencom i 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0120] U svrhu konciznosti, podnosilaca zahteva ovde pruža Tabelu 1B koja ilustruje primer otelotvorenja pojedinačnih varijanti obuhvaćenih predmetnim pronalaskom i koja sadrži specifičan % identičnosti sekvence i % sličnosti sekvence. Svaki „X“ treba tumačiti kao definisanje date varijante.
[0121] Predmetni pronalazak obuhvata CDR, varijabilne regione lakog lanca, varijabilne regione teškog lanca, lake lance, teške lance, antitela i/ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže najmanje 70% identičnosti ili najmanje 80% identičnosti sa ovde opisanom sekvencom.
[0122] Predmetni pronalazak stoga obuhvata, antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju:
d. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:48 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:46;
[0123] Ovde su obelodanjena antitela i fragment za vezivanje antigena koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 i koji mogu da obuhvataju sekvence izabrane iz grupe koju čine:
a. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:16 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:18,
b. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:20 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:22;
c. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:24 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:26;
d. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:48 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:46;
e. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:103 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:126,
f. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:104 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:127,
g. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:105 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:128,
h. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:106 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:145,
i. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:107 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:128,
j. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:108 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:130,
k. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:109 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:141,
l. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:110 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:131,
m. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:111 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:134,
n. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:112 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:135,
o. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:113 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:136,
p. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:114 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:133,
q. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:115 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:140,
r. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:116 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:137,
s. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:117 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:144,
t. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:118 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:139,
u. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:119 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:132,
v. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:120 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:142,
w. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:121 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:138,
x. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:122 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:146,
y. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:123 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:147, ili;
z. varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:124 i varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:143.
[0124] U skladu sa predmetnim pronalaskom, varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen sadrže CDR koji su identični onima odgovarajućeg varijabilnog regiona lakog lanca i/ili teškog lanca. U drugim primerima varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen mogu sadržati varijantu CDR.
[0125] Stoga, primeri varijanti antitela ili fragmenta za vezivanje antigena su one koje obuhvataju varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80% identična sa SEQ ID NO.:16, 20, 24, 103, 106 ili 121. CDR takve varijante mogu biti identičnim sa onim od odgovarajuće ne-varijante (sekvenca divljeg tipa) antitela ili fragmenta za vezivanje antigena ili može varirati za 1-3 aminokiseline.
[0126] Drugi primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:16 i koji ima na primer od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:16. SEQ ID NO.:16 varijante je data u SEQ ID NO.:168.
[0127] Primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:20 i koji ima na primer od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:20.
[0128] Primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:24 i koji ima na primer od 1 do 21 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:24. SEQ ID NO.:24 varijante je data u SEQ ID NO.:172.
[0129] Primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:103 i koji ima na primer od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:103.
[0130] Primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:106 i koji ima na primer od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:106.
[0131] Primerni varijabilni region lakog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:121 i koji ima na primer od 1 do 21 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:121.
[0132] U nekim slučajevima varijabilni region varijante lakog lanca antitela može da sadrži brisanja ili dodavanja aminokiselina (u kombinaciji ili ne sa aminokiselinskim supstitucijama). Često se mogu tolerisati 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih brisanja ili dodataka.
[0133] Drugi primeri varijante antitela ili fragmenta za vezivanje antigena predmetnog pronalaska su one koje obuhvataju varijabilni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80% identična sa 18, 22, 26, 126, 138 ili 145. CDR takve varijante mogu biti identične sa onim od odgovarajuće ne-varijante (sekvenca divljeg tipa) antitela ili fragmenta za vezivanje antigena ili može varirati za 1-3 aminokiseline.
[0134] Primer varijabilnog regiona teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:18 i koji ima, na primer, od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:18. SEQ ID NO.:18 varijante je data u SEQ ID NO.:169.
[0135] Primerni varijabilni region teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:22 i koji ima, na primer, od 1 do 23 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:22.
[0136] Primerni varijabilni region teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:26 i koji ima, na primer, od 1 do 23 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:26. SEQ ID NO.:26 varijante je data u SEQ ID NO.:173.
[0137] Primerni varijabilni region teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:126 i koji ima, na primer, od 1 do 23 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:126.
[0138] Primerni varijabilni region teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:145 i koji ima, na primer, od 1 do 23 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:145.
[0139] Primerni varijabilni region teškog lanca varijante antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima CDR aminokiselinske sekvence koje su 100% identične sa CDR aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NO.:138 i koji ima, na primer, od 1 do 22 aminokiselinske modifikacije (npr., konzervativne ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije) u svoj okvirnom regionu u poređenju sa okvirnim regionom od SEQ ID NO.:138.
[0140] U nekim slučajevima varijabilna region teškog lanca antitela može da sadrži aminokiselinske brisanja ili dodavanja (u kombinaciji ili ne sa aminokiselinskim supstitucijama). Često se mogu tolerisati 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih brisanja ili dodataka.
Varijanta CDR
[0141] Ovde su takođe obelodanjeni polipeptidi, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u najmanje jednom od ovde opisanih CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0142] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide, antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže promenljive lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u najmanje dva CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0143] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide, antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže promenljive lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u 3 CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0144] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide, antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže promenljive lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje jednom od CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0145] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide, antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže promenljive lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje dva CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0146] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide, antitela ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže promenljive lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u 3 CDR (u poređenju sa izvornim CDR).
[0147] Poređenje aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca ili varijabilnih regiona teškog lanca antitela koje pokazuju najveće karakteristike omogućilo nam je da izvučemo konsenzus sekvence unutar CDR i unutar varijabilnih regiona. Konsenzus za CDR je dat u SEQ ID NO.: 72 do 88.
[0148] Predmetni pronalazak stoga daje primerom, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima;
a. CDRL1 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID i SEQ ID NO.:73;
b. CDRL2 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:74, SEQ ID NO.: 75 i SEQ ID NO.:76, ili; c. CDRL3 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:77, SEQ ID NO.:78 i SEQ ID NO.:79.
[0149] Predmetni pronalazak stoga daje primerom, izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima;
a. CDRH1 sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO.:80;
b. CDRH2 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:81, SEQ ID NO.:82, SEQ ID NO.:83, SEQ ID NO.:84 i SEQ ID NO.:85, ili;
c. CDRH3 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:86, SEQ ID NO.:87 i SEQ ID NO.:88.
[0150] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL1 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1aSSX2aSLLX3aX4aX5aX6aX7aX8aX9aX10aLX11a(SEQ ID NO.:72)
gde X1amože biti bazna aminokiselina;
gde X2amože biti bazna aminokiselina;
gde X3amože biti H, Y ili N;
gde X4amože biti S, T, N ili R;
gde X5amože biti odsutan, S ili N;
gde X6amože biti D, F ili N;
gde X7amože biti G ili Q;
gde X8amože biti K, L ili N;
gde X9amože biti T ili N;
gde X10amože biti aromatična aminokiselina, i;
gde X11amože biti A, N, E ili Y.
[0151] U primernom obelodanjenju X1amože biti K ili R.
[0152] U daljem obelodanjenju X2amože biti Q ili K.
[0153] U još jednom daljem obelodanjenju X3amože biti N ili H.
[0154] U dodatnom obelodanjenju X10amože biti Y ili F.
[0155] Specifičnija obelodanjenja uključuju CDRL1 od SEQ ID gde: X1aje K; X2aje Q; X3aje N; X3aje H; X4aje S; X4aje T; X5aje S; X5aje odsutan; X6aje N; X7aje Q; X7aje G; X8aje K; X9aje N; X9aje T; X10aje Y; ili X11aje A.
[0156] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL1 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
KASQDX1bX2bX3bX4bX5bX6b(SEQ ID NO.:73)
gde X1bmože biti hidrofobna aminokiselina;
gde X2bmože biti G ili H;
gde X3bmože biti T, N ili R;
gde X4bmože biti F, Y ili A;
gde X5bmože biti hidrofobna aminokiselina, i;
gde X6bmože biti N ili A.
[0157] U primernom obelodanjenju X1bmože biti V ili I.
[0158] U drugom primernom obelodanjenju X5bmože biti V ili L.
[0159] Specifičnija obelodanjenja uključuju CDRL1 od SEQ ID NO.:73 gde X1bje I; X2bje H; X3bje T; X3bje N; X4bje Y; X4bje F; X5bje L ili X6bje N.
[0160] Druga primerna obelodanjenja od CDRL1 su data u SEQ ID NO.89 i 90.
[0161] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
FX1cSTX2cX3cS (SEQ ID NO.:74)
gde X1cje A ili G;
gde X2cje R ili T, i;
gde X3cje E, K ili A.
[0162] U primernom obelodanjenju X1cmože biti A i X2cmože biti T.
[0163] U drugom primernom obelodanjenju X1cmože biti A i X2cmože biti R.
[0164] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL2 od SEQ ID NO.:74 gde X1cje A; X2cje R ili X3cje E.
[0165] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1dVSX2dX3dX4dS (SEQ ID NO.:75)
gde X1dmože biti L ili K;
gde X2dmože biti bazna aminokiselina;
gde X3dmože biti L ili R i;
gde X4dmože biti D ili F.
[0166] U primernom obelodanjenju X2dmože biti K ili N.
[0167] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL2 od SEQ ID NO.:75 gde X1dje L; X2dje K; X3dje L ili X4dje D.
[0168] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1eANRLVX2e(SEQ ID NO.:76)
gde X1emože biti bazna aminokiselina, i;
gde X2emože biti D ili A.
[0169] U primernom obelodanjenju X1emože biti R ili H.
[0170] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL2 od SEQ ID NO.:76 gde X1eje R ili X2eje D.
[0171] Druga primerna obelodanjenja od CDRL2 su data u SEQ ID NO.: 91-93.
[0172] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1fQX2fX3fX4fX5fPLT (SEQ ID NO.:77)
gde X1fmože biti Q ili L;
gde X2fmože biti aromatična aminokiselina;
gde X3fmože biti D, F ili Y;
gde X4fmože biti E, A, N ili S, i;
gde X5fmože biti I, F ili T.
[0173] U primernom obelodanjenju pronalaska X2fmože biti Y ili H.
[0174] U drugom primernom obelodanjenju pronalaska X3fmože biti Y ili D.
[0175] U još jednom primernom obelodanjenju pronalaska X5fmože biti I ili T.
[0176] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL3 od SEQ ID NO.:77 gde X1fje Q; X2fje H; X3fje D; X3fje Y; X4fje S; X4fje E; X4fje A; X5fje T, ili X5fje I.
[0177] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
QQHX1gX2gX3gPLT (SEQ ID NO.:78)
gde X1gmože biti aromatična aminokiselina;
gde X2gmože biti N ili S, i;
gde X3gmože biti I ili T.
[0178] U obelodanjenja u primerima X1gmože biti F ili Y
[0179] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL3 od SEQ ID NO.:78 gde X2gje S ili X3gje T.
[0180] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRL3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1hQGX2hHX3hPX4hT (SEQ ID NO.:79)
gde X1hmože biti aromatična aminokiselina;
gde X2hmože biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde X3hmože biti F ili V, i;
gde X4hmože biti R ili L.
[0181] U primernom obelodanjenju X1hmože biti W ili F.
[0182] U drugom primernom obelodanjenju X2hmože biti S ili T.
[0183] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRL3 od SEQ ID NO.:79 gde X1hje W; X2hje T; X3hje F, ili X4hje R.
[0184] Druga primerna obelodanjenja od CDRL3 su data u SEQ ID NO.94 i 95.
[0185] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH1 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
GYX1iFX2iX3iYX4iX5iH (SEQ ID NO.:80)
gde X1imože biti T, I ili K;
gde X2imože biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde X3imože biti kisela aminokiselina;
gde X4imože biti E, N ili D, i;
gde X5imože biti hidrofobna aminokiselina.
[0186] U primernom obelodanjenju X2imože biti T ili S.
[0187] U drugom primernom obelodanjenju X3imože biti D ili E.
[0188] U još jednom primernom obelodanjenju X4imože biti N ili E.
[0189] U daljem primernom obelodanjenju X5imože biti M, I ili v.
[0190] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH1 od SEQ ID NO.:80 gde X2ije T; X3ije D; X4ije E; X5ije I ili X5ije M.
[0191] Druga primerna obelodanjenja od CDRH1 su data u SEQ ID NO.: 96 i 97.
[0192] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1jX2jDPX3jTGX4jTX5j(SEQ ID NO.:81)
gde X1jmože biti V ili G
gde X2jmože biti hidrofobna aminokiselina;
gde X3jmože biti A, G ili E;
gde X4jmože biti R, G, D, A, S, N ili V, i;
gde X5jmože biti hidrofobna aminokiselina.
[0193] U primernom obelodanjenju X2jmože biti I ili L.
[0194] U drugom primernom obelodanjenju X5jmože biti A ili V.
[0195] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH2 od SEQ ID NO.:81 gde X1jje V; X2jje I; X3jje E; X4jje D ili X5jje A.
[0196] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
VX1kDPX2kTGX3kTA (SEQ ID NO.:82)
gde X1kmože biti hidrofobna aminokiselina;
gde X2kmože biti A, E ili G;
gde X3kmože biti R, G, A, S, N V ili D.
[0197] U primernom obelodanjenju X1kmože biti L ili I.
[0198] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH2 od SEQ ID NO.:82 gde X1kje I; X2kje E, ili X3kje D.
[0199] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
YIX1lX2lX3lGX4lX5lX6l(SEQ ID NO.:83)
gde X1lmože biti S ili N;
gde X2lmože biti aromatična aminokiselina
gde X3lmože biti D, E ili N;
gde X4lmože biti D ili H;
gde X5lmože biti Y, S ili N;
gde X6lmože biti D, E ili N.
[0200] U primernom obelodanjenju X3lmože biti D ili N.
[0201] U drugom primernom obelodanjenju X6lmože biti D ili N.
[0202] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH2 od SEQ ID NO.:83 gde X2lje F ili Y, X3lje N, X4lje D ili X6lje N.
[0203] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
X1mINPYNX2mVTE (SEQ ID NO.:84)
gde X1mmože biti N ili Y, i;
gde X2mmože biti E, D ili N.
[0204] U primernom obelodanjenju X2mmože biti D ili N.
[0205] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH2 od SEQ ID NO.:84 gde X1mje N ili X2mje D.
[0206] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH2 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
DINPX1nYGX2nX3nT (SEQ ID NO.:85)
gde X1nmože biti N ili Y,
gde X2nmože biti G ili T i;
gde X3nmože biti I ili T.
[0207] Druga primerna obelodanjenja od CDRH2 su data u SEQ ID NO.98 i 99.
[0208] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
MX1oX2oX3oDY (SEQ ID NO.:86)
gde X1omože biti G ili S;
gde X2omože biti Y ili H, i;
gde X3omože biti A ili S.
[0209] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH3 od SEQ ID NO.:86 gde X1oje G; X2oje Y ili X3oje S.
[0210] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
IX1pYAX2pDY (SEQ ID NO.:87)
gde X1pmože biti G ili S i;
gde X2pmože biti odsutan ili M.
[0211] Druga specifična obelodanjenja uključuju CDRH3 od SEQ ID NO.:87 gde X1pje S ili X2pje M.
[0212] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo može da obuhvata CDRH3 sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od formule:
AX1qX2qGLRX3q(SEQ ID NO.:88)
gde X1qmože biti R ili W;
gde X2qmože biti aromatična aminokiselina i;
gde X3qmože biti bazna aminokiselina.
[0213] U primernom obelodanjenju X2qmože biti W ili F.
[0214] U drugom obelodanjenju X3qmože biti Q ili N.
[0215] Druga specifična obelodanjenja pronalaska uključuju CDRH3 od SEQ ID NO.:88 gde X1qje R; X2qje W ili X3qje N.
[0216] Varijante antitela ili fragmenta koji vezuju antigen obuhvaćene predmetnim pronalaskom uključuju one koje mogu da sadrže umetanje, brisanje ili supstituciju (konzervativna ili ne-konzervativna) aminokiselina. Ove varijante mogu imati najmanje jedan aminokiselinski ostatak u svojoj aminokiselinskoj sekvenci uklonjen i različit ostatak ubačen na njegovo mesto.
Humanizovana antitela
[0217] Primerna otelotvorenja varijanti antitela i fragmenata koji vezuju antigen predmetnog pronalaska su grupa antitela i fragmenata koji vezuju antigen koji se mogu vezati za KAAG1 i ovde su opisani kao humanizovani.
[0218] Humanizovana antitela i fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska uključuju naročito, humanizovana 3D3, 3A4 ili 3C4 antitela i fragmente koji vezuju antigen. Humanizovana 3A4 antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom. Humanizovana 3D3, 3A4 ili 3C4 antitela imaju najmanje jednu aminokiselinsku razliku u okvirnom regionu u poređenju sa monoklonskim 3D3, 3A4 ili 3C4 antitelom.
[0219] Generisana su i testirana humanizovana 3A4 antitela koja imaju CDR identične onima od monoklonskog 3A4 antitela (VL: SEQ ID NO.: 48, VH: SEQ ID NO.: 46). Ova humanizovana antitela sadrže do 11 aminokiselinskih supstitucija (od jednog do jedanaest) u okvirnom regionu varijabilnog lakog lanca i do 23 aminokiselinske supstitucije (od jedne do dvadeset tri) u okvirnom regionu varijabilnog teškog lanca u poređenju sa monoklonskim 3A4 antitelom. Podnosilac prijave je pokazao da se ova humanizovana 3A4 antitela vezuju za KAAG1 jednako efikasno kao i monoklonsko 3A4 antitelo.
[0220] Primerna otelotvorenja varijante antitela ili fragmenata za vezivanje antigena uključuju one koje imaju varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:186:
SEQ ID NO.:186
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer, aminokiselina koja se nalazi na odgovarajućem položaju prirodnog ljudskog antitela ili konsenzusa ljudskog antitela. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0221] Drugo primerno otelotvorenje varijante antitela ili fragmenta za vezivanje antigena uključuje one koje imaju varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:187:
gde Xe1može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xe2može biti A ili P;
gde Xe3može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde Xe4može biti L ili P;
gde Xe5može biti kisela aminokiselina;
gde Xe6može biti Q ili P;
gde Xe7može biti bazna aminokiselina;
gde Xe8može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xe9može biti A ili Q;
gde Xe10može biti bazna aminokiselina; ili
gde Xe11može biti hidrofobna aminokiselina,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48.
[0222] Dodatno primerno otelotvorenje varijante antitela ili fragmenta za vezivanje antigena uključuje one koje imaju varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:188:
gde XE1može biti V ili I
gde XE2može biti A ili P
gde XE3može biti S ili T
gde XE4može biti L ili P
gde XE5može biti D ili E
gde XE6može biti Q ili P
gde XE7može biti K ili Q
gde XE8može biti L ili V
gde XE9može biti A ili Q
gde XE10može biti R ili K ili
gde XE11može biti L ili I,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48.
[0223] U skladu sa otelotvorenjem, varijanta varijabilnog domena lakog lanca može biti sekvenca kako je data u SEQ ID NO.:189 ili 190:
[0224] Primerna otelotvorenja varijante antitela ili fragmenata za vezivanje antigena uključuju one koje imaju varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:191.
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer, aminokiselina koja se nalazi na odgovarajućem položaju prirodnog ljudskog antitela ili konsenzusa ljudskog antitela. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0225] Drugo primerno otelotvorenje varijante antitela ili fragmenta za vezivanje antigena uključuje one koje imaju varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:192:
gde Xf1može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xbf2može biti P ili A;
gde Xf3može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf4može biti V ili K;
gde Xf5može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf6može biti bazna aminokiselina;
gde Xf7može biti S ili A;
gde Xf8može biti H ili P;
gde Xf9može biti bazna aminokiselina;
gde Xf10može biti S ili G;
gde Xf11može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf12može biti bazna aminokiselina;
gde Xf13može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf14može biti I ili T;
gde Xf15može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf16može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xf17može biti K ili T;
gde Xf18može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde Xf19može biti Q ili E;
gde Xf20može biti N ili S;
gde Xf21može biti T ili R;
gde Xf22može biti neutralna hidrofilna aminokiselina; ili
gde Xf23može biti S ili L,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46.
[0226] Dodatno primerno otelotvorenje varijante antitela ili fragmenta za vezivanje antigena uključuje one koje imaju varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:193:
gde XF1može biti I ili V;
gde XF2može biti P ili A;
gde XF3može biti M ili V;
gde XF4može biti V ili K;
gde XF5može biti M ili V;
gde XF6može biti K ili R;
gde XF7može biti S ili A;
gde XF8može biti H ili P;
gde XF9može biti K ili Q;
gde XF10može biti S ili G;
gde XF11može biti I ili M;
gde XF12može biti K ili R;
gde XF13može biti A ili V;
gde XF14može biti I ili T;
gde XF15može biti L ili I;
gde XF16može biti V ili A;
gde XF17može biti K ili T;
gde XF18može biti S ili T;
gde XF19može biti Q ili E;
gde XF20može biti N ili S;
gde XF21može biti T ili R;
gde XF22može biti S ili T; ili
gde XF23je S ili L,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46.
[0227] U skladu sa otelotvorenjem, varijanta varijabilnog domena teškog lanca može biti sekvenca kako je data u bilo kom od SEQ ID NO.194 to 197:
[0228] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:16. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0229] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
gde XA1može biti, na primer, D ili S;
gde XA2može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije L ili I;
gde XA3može biti, na primer, E ili Q;
gde XA4može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije R ili K;
gde XA5može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije A ili V;
gde XA6može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije I ili M;
gde XA7može biti, na primer, P ili S;
gde XA8može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili I;
gde XA9može biti, na primer, S ili I;
gde XA10može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije L ili V;
gde XA11može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili L;
gde XA12može biti, na primer, V ili D;
gde XA13može biti, na primer, aromatična aminokiselina ili određenije Y ili F;
gde XA14može biti, na primer, Q ili A i;
gde XA15može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije I ili L.
[0230] U skladu sa još specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
gde Xa1može biti, na primer, D ili S;
gde Xa2može biti, na primer, L ili I;
gde Xa3može biti, na primer, E ili Q;
gde Xa4može biti, na primer, R ili K;
gde Xa5može biti, na primer, A ili V;
gde Xa6može biti, na primer, I ili M;
gde Xa7može biti, na primer, P ili S;
gde Xa8može biti, na primer, V ili I;
gde Xa9može biti, na primer, S ili I;
gde Xa10može biti, na primer, L ili V;
gde Xa11može biti, na primer, V ili L;
gde Xa12može biti, na primer, V ili D;
gde Xa13može biti, na primer, Y ili F;
gde Xa14može biti, na primer, Q ili A i;
gde Xa15je na primer, I ili L.
[0231] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
EVQLXQSXAEXXXPGASVXXSCKASGYIFTDYEIHWVXQXPXXGLEWXGVIDPE TGNTAFNQKFKGXXTXTADXSXSTAYMELSSLTSEDXAVYYCMGYSDYWGQGTXXTV SS (SEQ ID NO.:177); gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:18. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0232] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
gde XB1može biti, na primer, V ili Q;
gde XB2može biti, na primer, G ili V;
gde XB3može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili L;
gde XB4može biti, na primer, K ili V;
gde XB5može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije K ili R;
gde XB6može biti, na primer, K ili T;
gde XB7može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili L;
gde XB8može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije R ili K;
gde XB9može biti, na primer, A ili T;
gde XB10može biti, na primer, G ili V;
gde XB11može biti, na primer, Q ili H;
gde XB12može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije M ili I;
gde XB13može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije R ili K;
gde XB14može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili A;
gde XB15može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije I ili L;
gde XB16može biti, na primer, T ili I;
gde XB17može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XB18može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XB19može biti, na primer, L ili T i;
gde XB20može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili L.
[0233] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3D3 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
gde Xb1može biti, na primer, V ili Q;
gde Xb2može biti, na primer, G ili V;
gde Xb3može biti, na primer, V ili L;
gde Xb4može biti, na primer, K ili V;
gde Xb5može biti, na primer, K ili R;
gde Xb6može biti, na primer, K ili T;
gde Xb7može biti, na primer, V ili L;
gde Xb8može biti, na primer, R ili K;
gde Xb9može biti, na primer, A ili T;
gde Xb10može biti, na primer, G ili V;
gde Xb11može biti, na primer, Q ili H;
gde Xb12može biti, na primer, M ili I;
gde Xb13može biti, na primer, R ili K;
gde Xb14može biti, na primer, V ili A;
gde Xb15može biti, na primer, I ili L;
gde Xb16može biti, na primer, T ili I;
gde Xb17može biti, na primer, T ili S;
gde Xb18može biti, na primer, T ili S;
gde Xb19može biti, na primer, L ili T;
gde Xb20može biti, na primer, V ili L.
[0234] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
DIVMXQSPSSXXASXGXRVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKXPKTLIFRANRL VDGVPSRFSGSGSGXDYXLTISSLXXEDXXXYSCLQYDEIPLTFGXGTKLEXX (SEQ ID NO.:180); gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:24. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0235] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
gde XC1može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XC2može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije L ili M;
gde XC3može biti, na primer, S ili Y;
gde XC4može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili L;
gde XC5može biti, na primer, kisela aminokiselina ili određenije D ili E;
gde XC6može biti, na primer, A ili S;
gde XC7može biti, na primer, T ili Q;
gde XC8može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XC9može biti, na primer, Q ili E;
gde XC10može biti, na primer, P ili F;
gde XC11može biti, na primer, F ili L;
gde XC12može biti, na primer, A ili G;
gde XC13može biti, na primer, T ili I;
gde XC14može biti, na primer, Q ili A;
gde XC15može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije I ili L, i; gde XC16može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije K ili R.
[0236] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region lakog lanca formule:
gde Xc1može biti, na primer, T ili S;
gde Xc2može biti, na primer, L ili M;
gde Xc3može biti, na primer, S ili Y;
gde Xc4može biti, na primer, V ili L;
gde Xc5može biti, na primer, D ili E;
gde Xc6može biti, na primer, A ili S;
gde Xc7može biti, na primer, T ili Q;
gde Xc8može biti, na primer, T ili S;
gde Xc9može biti, na primer, Q ili E;
gde Xc10može biti, na primer, P ili F;
gde Xc11može biti, na primer, F ili L;
gde Xc12može biti, na primer, A ili G;
gde Xc13može biti, na primer, T ili I;
gde Xc14može biti, na primer, Q ili A;
gde Xc15može biti, na primer, I ili L i;
gde Xc16može biti, na primer, K ili R.
[0237] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
EVQLQESGPXLVKPSQXLSLTCTVXGFSITSGYGWHWIRQXPGXXLEWXGYIN YDGHNDYNPSLXRXXIXQDTSKNQFXLXLXSVTXXDTAXYYCASSYDGLFAYWGQG TLVTVSX (SEQ ID NO.:183); gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:26. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
[0238] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
gde XD1može biti, na primer, G ili D;
gde XD2može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XD3može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije S ili T;
gde XD4može biti, na primer, H ili F;
gde XD5može biti, na primer, K ili N;
gde XD6može biti, na primer, G ili K;
gde XD7može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije I ili M;
gde XD8može biti, na primer, hidrofobna aminokiselina ili određenije V ili I;
gde XD9može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije T ili S;
gde XD10može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije S ili T;
gde XD11može biti, na primer, neutralna hidrofilna aminokiselina ili određenije S ili F;
gde XD12može biti, na primer, bazna aminokiselina ili određenije K ili Q;
gde XD13može biti, na primer, S ili N;
gde XD14može biti, na primer, A ili T;
gde XD15može biti, na primer, A ili E;
gde XD16može biti, na primer, V ili T i;
gde XD17može biti bilo koja aminokiselina, A ili odsutan.
[0239] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, humanizovano 3C4 antitelo može da ima varijabilni region teškog lanca formule:
gde Xd1može biti, na primer, G ili D;
gde Xd2može biti, na primer, T ili S;
gde Xd3može biti, na primer, S ili T;
gde Xd4može biti, na primer, H ili F;
gde Xd5može biti, na primer, K ili N;
gde Xd6može biti, na primer, G ili K;
gde Xd7može biti, na primer, I ili M;
gde Xd8može biti, na primer, V ili I;
gde Xd9može biti, na primer, T ili S;
gde Xd10može biti, na primer, S ili T;
gde Xd11može biti, na primer, S ili F;
gde Xd12može biti, na primer, K ili Q;
gde Xd13može biti, na primer, S ili N;
gde Xd14može biti, na primer, A ili T;
gde Xd15može biti, na primer, A ili E;
gde Xd16može biti, na primer, V ili T i;
gde Xd17, A ili odsutan.
[0240] Shodno tome, ovde je obelodanjeno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, sposobno za specifično vezivanje za antigen 1 povezan sa bubregom (KAAG1) koji može imati varijabilni region lakog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.: 16 i/ili varijabilni region teškog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.:18. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može takođe da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa SEQ ID NO.: 16 ili SEQ ID NO.: 18.
[0241] Ovde je takođe opisano antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji može imati varijabilni region lakog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.: 24 i/ili varijabilni region teškog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.: 26. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može takođe da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa SEQ ID NO.: 24 ili SEQ ID NO.: 26.
[0242] Predmetni pronalazak takođe pruža u drugom otelotvorenju, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u skladu sa pronalaskom koji može imati varijabilni region lakog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.: 48 i/ili varijabilni region teškog lanca najmanje 70% identičan sa SEQ ID NO.:46. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može takođe da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa SEQ ID NO.: 48 ili SEQ ID NO.: 46.
[0243] U skladu sa otelotvorenjem pronalaska, aminokiselinska supstitucija je izvan regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji imaju takvu aminokiselinsku sekvencu obuhvata, na primer, humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen.
[0244] Kako se koristi ovde izraz „od jedan do dvadeset pet“ uključuje sve pojedinačne vrednosti i opsege kao što su na primer, 1, 2, 3, i do 25; 1 do 25; 1 do 24, 1 do 23, 1 do 22, 1 do 21, 1 do 20, 1 do 19; 1 do 18; 1 do 17; 1 do 16; 1 do 15 i tako dalje; 2 do 25, 2 do 24, 2 do 23, 2 do 22, 2 do 21, 2 do 20; 2 do 19; 2 do 18; 2 do 17 i tako dalje; 3 do 25, 3 do 24, 3 do 23, 3 do 22, 3 do 21, 3 do 20; 3 do 19; 3 do 18 i tako dalje; 4 do 25, 4 do 24, 4 do 23, 4 do 22, 4 do 21, 4 do 20; 4 do 19; 4 do 18; 4 do 17; 4 do 16 i tako dalje; 5 do 25, 5 do 24, 5 do 23, 5 do 22, 5 do 21, 5 do 20; 5 do 19; 5 do 18; 5 do 17 i tako dalje.
[0245] Kako se koristi ovde izraz „od jedan do dvadeset tri“ uključuje sve pojedinačne vrednosti i opsege kao što su na primer, 1, 2, 3, i do 23; 1 do 23, 1 do 22, 1 do 21, 1 do 20, 1 do 19; 1 do 18; 1 do 17; 1 do 16; 1 do 15 i tako dalje; 2 do 23, 2 do 22, 2 do 21, 2 do 20; 2 do 19; 2 do 18; 2 do 17 i tako dalje; 3 do 23, 3 do 22, 3 do 21, 3 do 20; 3 do 19; 3 do 18 i tako dalje; 4 do 23, 4 do 22, 4 do 21, 4 do 20; 4 do 19; 4 do 18; 4 do 17; 4 do 16 i tako dalje; 5 do 25, 5 do 24, 5 do 23, 5 do 22, 5 do 21, 5 do 20; 5 do 19; 5 do 18; 5 do 17 i tako dalje.
[0246] Kako se koristi ovde izraz „od jedan do dvadeset“ uključuje sve pojedinačne vrednosti i opsege kao što su na primer, 1, 2, 3, i do 20; 1 do 20; 1 do 19; 1 do 18; 1 do 17; 1 do 16; 1 do 15 i tako dalje; 2 do 20; 2 do 19; 2 do 18; 2 do 17 i tako dalje; 3 do 20; 3 do 19; 3 do 18 i tako dalje; 4 do 20; 4 do 19; 4 do 18; 4 do 17; 4 do 16 i tako dalje; 5 do 20; 5 do 19; 5 do 18; 5 do 17 i tako dalje.
[0247] Slično tome, izraz „od jedan do petnaest“ uključuje sve pojedinačne vrednosti i opsege kao što su na primer, 1, 2, 3, i do 15; 1 do 15; 1 do 14; 1 do 13; 1 do 12; 1 do 11; 1 do 10 i tako dalje; 2 do 15; 2 do 14; 2 do 13; 2 do 12 i tako dalje; 3 do 15; 3 do 14; 3 do 13 i tako dalje; 4 do 15; 4 do 14; 4 do 13; 4 do 12; 4 do 11 i tako dalje; 5 do 15; 5 do 14; 5 do 13; 5 do 12 i tako dalje.
[0248] Slično tome, izraz „od jedan do jedanaest“ uključuje sve pojedinačne vrednosti i opsege kao što su na primer, 1, 2, 3, i do 11; 1 do 11; 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, i tako dalje; 2 do 11; 2 do 10; 2 do 9; 2 do 8 i tako dalje; 3 do 11; 3 do 10; 3 do 9 i tako dalje; 4 do 11; 4 do 10; 4 do 9; 4 do 8; 4 do 7 i tako dalje; 5 do 11; 5 do 10; 5 do 9; 5 do 8 i tako dalje.
[0249] U specifičnijem obelodanjenju, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u humanizovanom varijabilnom regionu lakog lanca izvedenom iz SEQ ID NO.: 16 može biti, na primer, od 1 do 15 aminokiselinskih supstitucija.
[0250] U još specifičnijem obelodanjenju, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u humanizovanom varijabilnom regionu teškog lanca izvedenog iz SEQ ID NO.: 18 može biti, na primer, od 1 do 20 aminokiselinskih supstitucija. U nekim slučajevima, kada se razmatra humanizovana verzija SEQ ID NO.: 18, može biti korisno imati najmanje tri aminokiselinske supstitucije.
[0251] U daljem, specifičnijem obelodanjenju, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u varijabilnom regionu humanizovanog lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO.: 24 može biti, na primer, od 1 do 16 aminokiselinskih supstitucija.
[0252] U još jednom još specifičnijem otkriću, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u humanizovanom varijabilnom regionu teškog lanca SEQ ID NO.: 26 može biti, na primer, od 1 do 17 aminokiselinskih supstitucija.
[0253] U sledećem specifičnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u varijabilnom regionu humanizovanog lakog lanca izvedenog iz SEQ ID NO.: 48 može biti, na primer, od 1 do 11 aminokiselinskih supstitucija.
[0254] U jednom još specifičnijem otelotvorenju pronalaska, broj aminokiselinskih supstitucija koje mogu biti smeštene u humanizovanom varijabilnom regionu teškog lanca SEQ ID NO.: 46 može biti, na primer, od 1 do 23 aminokiselinske supstitucije.
[0255] U skladu sa otelotvorenjem pronalaska, jedna do dvadeset aminokiselinskih supstitucija može biti, na primer, u varijabilnom regionu lakog lanca.
[0256] U skladu sa otelotvorenjem pronalaska, jedna do dvadeset aminokiselinskih supstitucija može biti, na primer, u varijabilnom regionu teškog lanca.
[0257] Humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može stoga imati varijabilni region lakog lanca koji ima do dvadeset aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.: 16 ili SEQ ID NO.: 24 i može imati varijabilni region teškog lanca koja ima do dvadeset aminokiselinskih supstitucije u poređenju sa SEQ ID NO.: 18 ili SEQ ID NO.: 26. Humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može stoga imati varijabilni region lakog lanca koji ima do dvadeset pet aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.: 48 i može imati varijabilni region teškog lanca koji ima do dvadeset pet aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.:46.
[0258] Podrazumeva se da kada humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen ima dva varijabilna regiona lakog lanca i dva varijabilna regiona teškog lanca, svaki od varijabilnih regiona lakog lanca može nezavisno imati do dvadeset pet, dvadeset četiri, dvadeset tri, dvadeset dve, dvadeset jednu, dvadeset, devetnaest, osamnaest, sedamnaest, šesnaest, petnaest, četrnaest, trinaest, dvanaest, jedanaest, deset, devet, osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve, jednu aminokiselinsku supstituciju, i svaki od varijabilnih regiona teškog lanca može imati do dvadeset pet, dvadeset četiri, dvadeset tri, dvadeset dve, dvadeset jednu, dvadeset, devetnaest, osamnaest, sedamnaest, šesnaest, petnaest, četrnaest, trinaest, dvanaest, jedanaest, deset, devet, osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve, jednu aminokiselinsku supstituciju.
[0259] Kao što je ovde razmatrano, aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne ili ne-konzervativne. U primernom otelotvorenju, aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne.
[0260] Ovde treba razumeti da humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je ovde opisan može takođe da ima varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca koja pokazuje brisanje u poređenju sa SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18, SEQ ID NO.:189, SEQ ID NO.:190, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196, SEQ ID NO.:197, SEQ ID NO.:24 i/ili SEQ ID NO.:26. Ovde treba razumeti da humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom može takođe da ima varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca koja pokazuje brisanje u poređenju sa SEQ ID NO.:189, SEQ ID NO.:190, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 i/ili SEQ ID NO.: 197. Takva brisanja se može naći, na primer, na aminoili karboksi-kraju varijabilnog regiona lakog lanca i/ili varijabilnog regiona teškog lanca.
[0261] Drugo otelotvorenje humanizovanog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom obuhvata, na primer, antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji ima varijabilni region lakog lanca koji može da sadrži najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:186, SEQ ID NO.:187, SEQ ID NO.:188, SEQ ID NO.:189 ili SEQ ID NO.:190.
[0262] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:186“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, ili najmanje 112 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:186“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:186 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:186, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 108, 5 do 109, 13 do 103, 14 do 111 od SEQ ID NO.:186 i tako dalje.
[0263] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:187“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, ili najmanje 112 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:187“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:187 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:187, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 7 do 109, 12 do 104, 22 do 113, 18 do 112 od SEQ ID NO.:187 i tako dalje.
[0264] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:188“, „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:189“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:190“ imaju slično značenje.
[0265] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:189 ili 190.
[0266] Humanizovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena za primenu u skladu sa pronalaskom uključuje (ili dalje uključuje) na primer, varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, 192, 193, 194, 195, 196 ili 197.
[0267] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:191“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 ili najmanje 116 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:191“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:191 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:191, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 1 do 106, 2 do 112, 11 do 113, 7 do 102 od SEQ ID NO.:191 i tako dalje.
[0268] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:192“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 ili najmanje 116 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:192“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:192 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:192, na primer sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 109, 8 do 113, 1 do 102, 2 do 105 od SEQ ID NO.:192 i tako dalje.
[0269] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.: 193“, „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:194“, „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:195“, „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:196“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:197“ imaju slično značenje.
[0270] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:194, 195, 196 ili 197.
[0271] U skladu sa predmetnim pronalaskom antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata, na primer, a) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:186 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, SEQ ID NO.:192, SEQ ID NO.:193, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197;
b) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:187 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, SEQ ID NO.:192, SEQ ID NO.:193, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197;
c) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata aminokiseline najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:188 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, SEQ ID NO.:192, SEQ ID NO.:193, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197;
d) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, SEQ ID NO.:192, SEQ ID NO.:193, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197 ili
e) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:191, SEQ ID NO.:192, SEQ ID NO.:193, SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197.
[0272] U skladu sa specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:189 ili 190 i varijabilni region teškog lanca može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:194, 195, 196 ili 197.
[0273] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:194.
[0274] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:195.
[0275] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:196.
[0276] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:197.
[0277] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:194.
[0278] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:195.
[0279] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:196.
[0280] U skladu sa još specifičnijim otelotvorenjem pronalaska, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:197.
[0281] Drugi primer humanizovanog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena predmetnog obelodanjenja uključuje na primer, antitelo ili fragment za vezivanje antigena koji ima varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:174, SEQ ID NO.:175, SEQ ID NO.:176 ili SEQ ID NO.:168.
[0282] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:174“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili najmanje 113 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:174“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:174 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:174, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 108, 5 do 109, 13 do 103, 14 do 111 od SEQ ID NO.:174 i tako dalje.
[0283] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:175“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili najmanje 113 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:175“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:175 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:175, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 7 do 109, 12 do 104, 22 do 113, 18 do 112 od SEQ ID NO.:175 i tako dalje.
[0284] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:176“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:168“ imaju slično značenje.
[0285] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:168.
[0286] Humanizovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog obelodanjenja uključuje (ili dalje uključuje) na primer, varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:177, 178, 179 ili 169.
[0287] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:177“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili najmanje 113 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:177“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:177 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:177, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 1 do 106, 2 do 112, 11 do 113, 7 do 102 od SEQ ID NO.:177 i tako dalje.
[0288] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:178“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili najmanje 113 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:178“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:178 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:178, na primer sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 109, 8 do 113, 1 do 102, 2 do 105 od SEQ ID NO.:178 i tako dalje.
[0289] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:179“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:169“ imaju slično značenje.
[0290] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:169.
[0291] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata, na primer,
f) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:174 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:177, SEQ ID NO.:178, SEQ ID NO.:179 ili SEQ ID NO.:169;
g) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:175 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:177, SEQ ID NO.:178, SEQ ID NO.:179 ili SEQ ID NO.:169;
h) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata aminokiseline najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:176 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:177, SEQ ID NO.:178, SEQ ID NO.:179 ili SEQ ID NO.:169 ili;
i) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:168 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:177, SEQ ID NO.:178, SEQ ID NO.:179 ili SEQ ID NO.:169.
[0292] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, varijabilni region lakog lanca može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:168 i varijabilni region teškog lanca može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:169.
[0293] U skladu sa još specifičnijim obelodanjenjem, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:168 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:169.
[0294] Drugi primeri humanizovanog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena predmetnog obelodanjenja su oni koji mogu da obuhvate varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.180, 181, 182 ili 172.
[0295] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:180“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ili najmanje 107, uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:180“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:180 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:180, na primer sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 102, 11 do 106, 1 do 106, 3 do 95, 5 do 95 od SEQ ID NO.:180 i tako dalje.
[0296] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:181“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ili najmanje 107, uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:181“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:181 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:181, na primer sekvenca koja sadrži aminokiseline 9 do 106, 10 do 101, 1 do 98, 3 do 99, 7 do 107 od SEQ ID NO.:181 i tako dalje.
[0297] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:182“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:172“ imaju slično značenje.
[0298] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:172.
[0299] Humanizovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog obelodanjenja uključuje (ili dalje uključuje) na primer, varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:183, 184, 185 ili 173.
[0300] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:183“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 ili najmanje 116 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:183“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:183 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:183, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 6 do 111, 1 do 106, 2 do 104, 5 do 106, 10 do 107 od SEQ ID NO.:183 i tako dalje.
[0301] Kako se koristi ovde izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:185“ takođe uključuje izraze „najmanje 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 ili najmanje 116 uzastopnih aminokiselina“. Izraz „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:185“ obuhvata bilo koju moguću sekvencu od najmanje 90 uzastopnih aminokiselina koje se nalaze u SEQ ID NO.:185 i naročito one sekvence koje uključuju 3 CDR od SEQ ID NO.:185, kao što je, na primer, sekvenca koja sadrži aminokiseline 3 do 107, 1 do 115, 1 do 110, 22 do 116, 20 do 115 od SEQ ID NO.:185 i tako dalje.
[0302] Izrazi „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:184“ ili „najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:173“ imaju slično značenje.
[0303] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima, na primer, varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:173.
[0304] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da obuhvata, na primer,
a) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:180 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:183, SEQ ID NO.:184, SEQ ID NO.:185 ili SEQ ID NO.:173;
b) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:181 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:183, SEQ ID NO.:184, SEQ ID NO.:185 ili SEQ ID NO.:173;
c) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata aminokiseline najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:182 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:183, SEQ ID NO.:184, SEQ ID NO.:185 ili SEQ ID NO.:173 ili;
d) varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:172 i varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata najmanje 90 uzastopnih aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO.:183, SEQ ID NO.:184, SEQ ID NO.:185 ili SEQ ID NO.:173.
[0305] U skladu sa specifičnijim obelodanjenjem, varijabilni region lakog lanca može da ima najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:172 i varijabilni region teškog lanca može da ima najmanje 90 uzastopnih aminokiselina od SEQ ID NO.:173.
[0306] U skladu sa još specifičnijim obelodanjenjem, varijabilni region lakog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:172 i varijabilni region teškog lanca može biti kako je dato u SEQ ID NO.:173.
[0307] Antitelo ili fragment za vezivanje antigena predmetnog pronalaska može da ima varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca u skladu sa pronalaskom kako je opisano iznad i i može dalje da obuhvata aminokiseline konstantnog regiona, kao što su, na primer, aminokiseline konstantnog regiona ljudskog antitela.
[0308] U primernom otelotvorenju, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može da sadrži, na primer, ljudski IgG1 konstantni region.
[0309] U skladu sa drugim primerom otelotvorenja pronalaska, fragment koji vezuje antigen može biti, na primer, scFv, Fab, Fab' ili (Fab')2.
Proizvodnja antitela u ćelijama
[0310] Anti-KAAG1 antitela koja su ovde opisana mogu biti napravljena različitim postupcima koji su poznati stručnjacima, kao što su metodologija hibridoma ili postupci rekombinantne DNK.
[0311] Anti-KAAG1 antitela mogu biti proizvedena konvencionalnom tehnologijom hibridoma, gde je miš imunizovan sa antigenom, izolovanim ćelijama slezine i fuzionisanim sa ćelijama mijeloma bez HGPRT eksprimiranja i hibridnim ćelijama koje su izabrane pomoću medijuma koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timin (HAT).
[0312] Anti-KAAG1 antitela se mogu proizvesti postupcima rekombinantne DNK.
[0313] U cilju eksprimiranja anti-KAAG1 antitela, nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina opisanih ovde ili bilo koji drugi mogu biti umetnute u vektor eksprimiranja, tj. vektor koji sadrži elemente za transkripcionu i translacionu kontrolu umetnute kodirajuće sekvence u određenom domaćinu. Ovi elementi mogu uključivati regulatorne sekvence, kao što su pojačivači, konstitutivni i inducibilni promoteri, i 5' i 3' neprevedeni regioni. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstrukciju takvih vektora eksprimiranja. Ovi postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze, i in vivo genetsku rekombinaciju.
[0314] Različiti sistemi vektora eksprimiranja/ćelije domaćina koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za eksprimiranje polipeptida ili RNK izvedenih iz nukleotidnih sekvenci sposobnih da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških lanaca imunoglobulina. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmidnim ili kosmidnim DNK vektorima eksprimiranja; kvasac transformisan sa vektorima eksprimiranja kvasca; sistemi ćelija insekata inficiranih sa bakulovirusnim vektorima; sistemi biljnih ćelija transformisanih virusnim ili bakterijskim vektorima eksprimiranja; ili sistemi životinjskih ćelija. Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina u sistemima sisara, može se izvršiti stabilno eksprimiranje u ćelijskim linijama. Na primer, nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina koji su ovde opisani, mogu biti transformisani u ćelijske linije korišćenjem vektora eksprimiranja koji mogu da sadrže virusni izvor replikacionih i/ili endogenih elemenata eksprimiranja i selektivni ili vidljivi marker gen na istom ili na posebnom vektoru. Pronalazak ne treba da bude ograničen vektorom ili upotrebljenom ćelijom domaćinom. U određenim primerima, nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina opisanih ovde mogu biti ligirane u odvojeni vektor eksprimiranja i svaki lanac je eksprimiran odvojeno. U drugom primeru, i laki i teški lanci koji mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina koji su ovde opisani, mogu biti vezani u jedan vektor eksprimiranja i eksprimirani istovremeno.
[0315] Alternativno, RNK i/ili polipeptidi mogu biti eksprimirani iz vektora koji sadrži nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina opisanih ovde upotrebom in vitro sistema transkripcije ili uparenog in vitro sistema transkripcije/translacije, respektivno.
[0316] Generalno, ćelije domaćini koje sadrže nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških lanaca imunoglobulina opisanih ovde i/ili koje eksprimiraju polipeptid kodiran nukleotidnim sekvencama sposobnim da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških lanaca imunoglobulina, ili njegov deo, mogu se identifikovati različitim postupcima koji su poznati stručnjacima. Ove procedure uključuju, ali nisu ograničene na DNK/DNK ili DNK/RNK hibridizacije, PCR amplifikaciju i proteinske biološke testove ili imunotest tehnike koje uključuju tehnologije na membrani, rastvoru ili čipu za detektovanje i/ili kvantifikaciju nukleinske kiseline ili amina sekvence kiselina. U struci su poznati imunološki postupci za detektovanje i merenje eksprimiranja polipeptida korišćenjem ili specifičnih poliklonskih ili monoklonskih antitela. Primeri takvih tehnika uključuju testove imunosorbentnog enzima (ELISA), radioimunotestove (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS). Stručnjaci u ovoj oblasti lako mogu prilagoditi ove metodologije predmetnom pronalasku.
[0317] Ćelije domaćini koje sadrže nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških lanaca imunoglobulina mogu se tako kultivisati pod uslovima za transkripciju odgovarajuće RNK (mRNK, siRNK, shRNK itd.) i/ili za eksprimiranje polipeptida iz ćelijske kultura. Polipeptid proizveden od strane ćelije može se izlučiti ili zadržati intracelularno u zavisnosti od sekvence i/ili korišćenog vektora. U primernom obelodanjenju, vektori eksprimiranja koji sadrže nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških lanaca imunoglobulina mogu biti dizajnirani da sadrže signalne sekvence koje usmeravaju izlučivanje polipeptida kroz prokariotsku ili eukariotsku ćelijsku membranu.
[0318] Zbog inherentne degeneracije genetskog koda, druge sekvence DNK koje kodiraju iste, suštinski iste ili funkcionalno ekvivalentne aminokiselinske sekvence mogu biti proizvedene i upotrebljene, na primer, da eksprimiraju polipeptid kodiran nukleotidnim sekvencama sposobnim da kodiraju bilo koji ovde opisanih lakih i teških lanaca imunoglobulina. Nukleotidne sekvence koje su ovde opisane mogu biti konstruisane korišćenjem postupaka koji su opšte poznati u struci kako bi se promenile nukleotidne sekvence za različite svrhe uključujući, ali ne ograničavajući se na, modifikaciju kloniranja, obrade i/ili eksprimiranja genskog proizvoda. Za menjanje nukleotidnih sekvenci mogu se koristiti DNK menjanje nasumičnim fragmentiranjem i PCR ponovno sastavljanje fragmenata gena i sintetskih oligonukleotida. Na primer, oligonukleotidom posredovana mutageneza usmerena na mesto može se koristiti za uvođenje mutacija koje stvaraju nova restrikciona mesta, menjaju obrasce glikozilacije, menjaju prednost kodona, proizvode varijante povezivanja, i tako dalje.
[0319] Pored toga, linija ćelije domaćina može biti izabrana zbog svoje sposobnosti da modulira eksprimiranje ubačenih sekvenci ili da procesuira eksprimirani polipeptid na željeni način. Takve modifikacije polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. U jednom otelotvorenju, mogu biti poželjna anti-KAAG1 antitela koja sadrže određene strukture ili obrasce glikozilacije. Post-translaciona obrada, koja razddvaja „prepro“ oblik polipeptida, može se takođe koristiti za određivanje ciljanja proteina, preklapanja i/ili aktivnosti. Različite ćelije domaćini koje imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za posttranslacione aktivnosti (npr. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 i W138) su komercijalno dostupne od American Type Culture Collection (ATCC) i mogu biti izabrane tako da pruže ispravnu modifikaciji i obradu eksprimiranog polipeptida.
[0320] Stručnjaci u ovoj oblasti lako će shvatiti da se prirodne, modifikovane ili rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina mogu vezati za heterolognu sekvencu što rezultuje translacijom fuzionog polipeptida koji sadrži heterologne polipeptidne grupe u bilo kom od gore pomenutih sistema domaćina. Takve heterologne polipeptidne grupe mogu olakšati prečišćavanje fuzionih polipeptida koristeći komercijalno dostupne afinitetne matrice. Takve grupe uključuju, ali nisu ograničene na, glutation S-transferazu (GST), protein za vezivanje maltoze, tioredoksin, peptid koji vezuje kalmodulin, 6-His (His), FLAG, c-myc, hemaglutinin (HA), i epitopi antitela kao što su kao epitopi monoklonskih antitela.
[0321] Ovde je takođe opisan polinukleotid koji može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein.
Fuzioni protein može da sadrži fuzionog partnera (npr., HA, Fc, itd.) fuzionisan sa polipeptidom (npr., kompletan laki lanac, kompletan teški lanac, varijabilni region, CDR itd.) koji su ovde opisani.
[0322] Stručnjaci u ovoj oblasti će takođe lako prepoznati da se nukleinske kiseline i polipeptidne sekvence mogu sintetizovati, u celosti ili delimično, korišćenjem hemijskih ili enzimskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Na primer, sinteza peptida se može izvesti korišćenjem različitih tehnika u čvrstoj fazi i mašine kao što je ABI 431A Peptidni sintisajzer (PE Biosystems) mogu se koristiti za automatizaciju sinteze. Ako se želi, aminokiselinska sekvenca može biti izmenjena tokom sinteze i/ili kombinovana sa sekvencama iz drugih proteina da se proizvede varijantni protein.
Konjugati antitela
[0323] Ovde opisani antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu biti konjugovani sa detektabilnim delom (tj. za detektovanje ili dijagnostičke svrhe) ili sa terapeutskim delom (za terapeutske svrhe). U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo ili fragment koji vezuje antigen su konjugovani sa terapeutskim delom (u terapeutske svrhe).
[0324] „Detektabilni deo“ je deo koja se može detektovati spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, hemijskim i/ili drugim fizičkim načinim. Detektabilni deo se može vezati ili direktno i/ili indirektno (na primer preko veze, kao što je, bez ograničenja, DOTA ili NHS veza) sa antitelima i njihovim fragmentima koji vezuju antigen prema predmetnom pronalasku koristeći postupke koji su dobro poznate u struci. Može se koristiti širok spektar detektabilnih grupa, gde izbor zavisi od potrebne osetljivosti, lakoće konjugacije, zahteva stabilnosti i raspoložive instrumentacije. Pogodna grupa koja se može detektovati uključuje, ali nije ograničena na, fluorescentnu oznaku, radioaktivnu oznaku (na primer, bez ograničenja,<125>I, In<111>, Tc<99>, I<131>i uključujući izotope koji emituju pozitron za PET skenere itd.), aktivna oznaka nuklearne magnetne rezonance, luminiscentna oznaka, hemiluminiscentna oznaka, hromoforna oznaka, enzimska oznaka (na primer i bez ograničenja peroksidaza rena, alkalne fosfataze, itd.), kvantni tačke i/ili nanočestice. Detektabilna grupa može uzrokovati i/ili proizvesti signal koji se može detektovati, čime se omogućava detektovanje signala iz detektabilne grupe.
[0325] U sledećom otelotvorenju pronalaska, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu biti spojeni (modifikovani) sa terapeutskim delom (npr., lek, citotoksični deo).
[0326] U jednom otelotvorenju, anti-KAAG1 antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu sadržati inhibitor, hemoterapeutik ili citotoksični agens. Na primer, antitelo i fragmenti koji vezuju antigen mogu biti konjugovani sa hemoterapeutskim ili citotoksičnim agensom. Takvi hemoterapeutski ili citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, itrijum-90, skandijum-47, renijum-186, jod-131, jod-125, i mnoge druge poznate od strane stručnjaka (npr. lutecijum (npr. Lu<177>), bizmut (npr. Bi<213>), bakar (npr., Cu<67>)). U drugim slučajevima, hemoterapeutski ili citotoksični agens može da sadrži, bez ograničenja, 5-fluorouracil, adriamicin, irinotekan, jedinjenja na bazi platine kao što su cisplatin i anti-tubulin ili anti-mitotička jedinjenja kao što su, taksani, doksorubicin i ciklofosfamid, pseudomoni endotoksin, ricin i drugi toksini. Pogodni konjugati leka za antitela su izabrani među onima koji imaju IC50u opsegu od 0,001nM do 150nM, 0,001nM do 100nM, 0,001nM do 50nM, 0,001nM do 20nM ili 0,001nM do 10nM (inkluzivno). Citotoksični lek koji se koristi za konjugaciju se tako bira na osnovu ovih kriterijuma.
[0327] Alternativno, kako bi se sprovele terapeutske primene predmetnog pronalaska i kao što je poznato u struci, antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska (konjugovano) može se koristiti u kombinaciji sa drugim molekulom (npr. sekundarno antitelo, itd.) koji je u stanju da se specifično veže za antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska i koji može da sadrži željeni detektabilni, dijagnostički ili terapeutski deo.
Farmaceutski sastavi antitela i njihova upotreba
[0328] Farmaceutski sastavi anti-KAAG1 antitela ili fragmenti koji vezuju antigen (konjugovani ili ne) takođe su ovde opisani. Farmaceutski sastav može da sadrži anti-KAAG1 antitelo ili fragment koji vezuje antigen i može takođe da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0329] Druga obelodanjenja se odnose na sastav koji može da sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je ovde opisan i nosač.
[0330] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koja može da sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je ovde opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0331] Pored aktivnih sastojaka, farmaceutski sastav može da sadrži farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže vodu, PBS, rastvore soli, želatine, ulja, alkohole i druge ekscipijente i pomoćna agense koja olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. U drugim slučajevima, takvi preparati se mogu sterilisati.
[0332] Kako se ovde koristi, „farmaceutski sastav“ označava terapeutski efikasne količine agensa zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, konzervansima, rastvaračima, emulgatorima, adjuvansima i/ili nosačima. „Terapeutski efikasna količina“, kako se ovde koristi, odnosi se na onu količinu koja pruža terapeutski efekat za dato stanje i režim primene. Takvi sastavi su tečnosti ili liofilizirane ili na drugi način osušene formulacije i uključuju razblaživače različitih sadržaja pufera (npr., Tris-HCl., Acetat, fosfat), pH i jonske snage, aditiva kao što su albumin ili želatina za sprečavanje apsorpcije na površine, deterdžente (npr. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, soli žučne kiseline). Agensi za rastvaranje (npr. glicerol, polietilen glicerol), antioksidanti (npr. askorbinska kiselina, natrijum metabisulfit), konzervansi (npr. timerosal, benzil alkohol, parabeni), agensi koje povećavaju volumen ili modifikatori toničnosti (npr. laktoza, manitol), kovalentno pričvršćivanje polimera kao što je polietilen glikol na protein, kompleksiranje sa metalnim jonima, ili inkorporacija materijala u ili na preparate od čestica polimernih jedinjenja kao što su polilaktična kiselina, poliglikolna kiselina, hidrogelovi, itd., ili na lipozome, mikroemulzije, micele, unilamelarne ili multilamelarne vezikule, duhovi eritrocita ili sferoplasti. Takvi sastavi će uticati na fizičko stanje, rastvorljivost, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu uklanjanja in vivo. Sastavi sa kontrolisanim ili odloženim oslobađanjem uključuju formulaciju u lipofilnim depoima (npr. masne kiseline, voskovi, ulja). Takođe su obelodanjeni čestični sastavi obloženi polimerima (npr. poloksameri ili poloksamini). Drugi obelodanjeni sastavi sadrže čestične oblike zaštitnih prevlaka, inhibitore proteaze ili pojačivače propusnosti za različite puteve davanja, uključujući parenteralne,
plućne, nazalne, oralne, vaginalne, rektalne puteve. U jednom primeru, farmaceutski sastav se daje parenteralno, paracanceralno, transmukozno, transdermalno, intramuskularno, intravenozno, intradermalno, subkutano, intraperitonealno, intraventrikularno, intrakranijalno i intratumoralno.
[0333] Dalje, kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ ili „farmaceutski nosač“ su poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, 0,01-0,1 M ili 0,05 M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Dodatno, takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injekcioni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološke rastvore i puferisane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringer-ovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laksiran Ringer-ov ili fiksirana ulja. Intravenozni nosači obuhvataju tečne i hranljive dodatke, elektrolitne dodatke kao što su oni bazirani na Ringer-ovoj dekstrozi, i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu takođe biti prisutni, kao što su, na primer, antimikrobni agensi, antioksidanti, agensi za sabijanje, inertni gasovi i slično.
[0334] Za bilo koje jedinjenje, terapeutski efikasna doza može biti procenjena početno bilo u analizama ćelijske kulture ili u životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi ili svinje. Životinjski model se takođe može koristiti da se odredi opseg koncentracije i put primene. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina davanja kod ljudi. Ove tehnike su dobro poznate prosečnom stručnjaku i terapeutski efikasna doza se odnosi na onu količinu aktivnog sastojka koja ublažava simptome ili stanje. Terapijska efikasnost i toksičnost mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili sa eksperimentalnim životinjama, kao što je izračunavanje i kontrastiranje ED50(doza terapeutski efektivna kod 50% populacije) i LD50(doza smrtonosna kod 50% populacije). Bilo koji od gore opisanih terapeutskih sastava može se primeniti na bilo kog pacijenta kom je potrebna takva terapija, uključujući, ali ne ograničavajući se na sisare kao što su psi, mačke, krave, konji, zečevi, majmuni i ljudi.
[0335] Farmaceutski sastavi koje se koriste u predmetnom pronalasku mogu se primenjivati bilo kojim od brojnih puteva uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intravenozni, intramuskularni, intra-arterijski, intramedularni, intratekalni, intraventrikularni, transdermalni, subkutani, intraperitonealni, intranazalni, enteralni, topički, sublingvalni ili rektalni put.
Postupci upotrebe
[0336] Izraz „tretman“ za svrhe predmetnog obelodanjenja odnosi se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere, gde je cilj sprečavanje ili usporavanje (smanjivanje) ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one koji su skloni da imaju poremećaj ili one kod kojih se ovaj poremećaj treba sprečiti.
[0337] Predmetni pronalazak pruža postupak za tretman pojedinca koji ima ili se sumnja da ima rak dojke sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen koji je sposoban za specifično vezivanje za KAAG1.
[0338] U skladu sa predmetnim pronalaskom, pojedinac može imati rak dojke koji je negativan na eksprimiranje receptora estrogena, eksprimiranje receptora progesterona i/ili eksprimiranje Her2 (ili prekomerno eksprimiranje).
[0339] Takođe, u skladu sa predmetnim pronalaskom, pojedinac može imati rak dojke koji ima nisko eksprimiranje za najmanje jedan od estrogenskih receptora, receptora progesterona i/ili Her2.
[0340] Na primer, tumor može biti negativan na (ili ima nisko) eksprimiranje receptora estrogena, kao i eksprimiranje receptora progesterona.
[0341] U skladu sa predmetnim pronalaskom, pojedinac može imati rak dojke koji je okarakterisan kao trostruko negativan. Rak dojke može biti nalik bazalnom.
[0342] Ovde je takođe opisano korišćenje ovde izolovanog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u tretmanu ili dijagnostikovanju raka dojke koje karakteriše nedostatak eksprimiranja receptora estrogena, eksprimiranje receptora progesterona i/ili Her2 prekomerno eksprimiranje ili nisko eksprimiranje najmanje jednog od ova tri markera.
[0343] U skladu sa predmetnim pronalaskom, terapeutska upotreba može obuhvatiti, na primer, primenu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji je sposoban za specifično vezivanje za KAAG1 u skladu sa pronalaskom, pojedincu koji ima potrebu. Pojedinac koji ima potrebu je poželjno izabran na osnovu nedostatka ER eksprimiranja, PgR eksprimiranja i/ili odsustvom prekomernog eksprimiranja HER2 proteina. Kliničko testiranje ovih markera se obično izvodi uz pomoć histopatoloških postupaka (imunohistohemija, FISH, itd.) i/ili studija eksprimiranja gena (pogledati na primer Dent i dr, 2007, Bernstein i Lacey, 2011). Prema tome, pojedinac koji ima potrebu može biti pojedinac koji je dobio dijagnozu trostruko negativnog raka dojke. Rak može biti rak dojke sličan bazalnom.
[0344] Predmetni pronalazak se tako posebno odnosi na terapeutski tretman pojedinca koji ima trostruko negativan rak dojke sa anti-KAAG1 antitelom. Rak može biti sličan bazalnom.
[0345] Pogodna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen uključuju one koji su sposobni za specifično vezivanje za KAAG1 na površini tumorskih ćelija. Takva antitela poželjno mogu vezati epitop uključen unutar aminokiselina 30 do 84 od KAAG1 inkluzivno (npr., unutar aminokiselina 36 do 60 (inkluzivno) ili unutar aminokiselina 61 do 84 (inkluzivno) od KAAG1).
[0346] Pogodna antitela mogu biti ona koja posreduju citotoksičnost ćelija zavisnu od antitela, i ona koja su konjugovana sa terapeutskim delom.
[0347] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo može biti, na primer, monoklonsko antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0348] Terapeutska upotreba predmetnog pronalaska može da uključuje primenu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u kombinaciji sa inhibitorom, hemoterapeutikom ili citotoksičnim agensom.
[0349] Drugi ovde opisani postupci tretiranja uključuju primenu drugih tipova KAAG1 inhibitora kao što su terapeutici bazirani na antisensu (siRNK, antisensi, ribozimi, itd.).
[0350] Ovde je obelodanjen postupak tretiranja trostruko negativnog raka dojke ili raka dojke sličnog bazalnom primenom inhibitora aktivnosti ili eksprimiranja KAAG1 pojedincu koji ima potrebu.
[0351] Inhibitor može da sadrži nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa SEQ ID NO.: 1 ili njen fragment. Posebno, inhibitor može sadržati nukleotidnu sekvencu komplementarnu nukleotidima 738 do 992 (inkluzivno) SEQ ID NO.: 1 ili njen fragmentu. Na primer, inhibitor može da sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida (najmanje 15, najmanje 20) koji su komplementarni sa SEQ ID NO.:1 ili nukleotidima 738 do 992 (inkluzivno) od SEQ ID NO.:1.
[0352] U određenim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i fragmenti mogu da stupaju u interakciju sa ćelijama raka koje eksprimiraju KAAG1 i indukuju imunološku reakciju posredujući ADCC. U drugim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i fragmenti mogu blokirati interakciju KAAG1 sa njegovim proteinskim partnerima.
[0353] U određenim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se primenjivati istovremeno sa drugim tretmanima datim za isto stanje (inhibitori, hemoterapeutici ili citotoksični agensi). Kao takva, antitela se mogu primenjivati sa inhibitorom PARP1, inhibitorom EGFR, anti-mitoticima (npr., thksani), agensima baziranim na platini (npr., cisplatin), agensima koji oštećuju DNK (npr. doksorubicin) i drugim terapijama protiv raka koje su poznate stručnjacima. U drugim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu se primenjivati sa drugim terapeutskim antitelima. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja ciljaju EGFR, CD-20 i Her2.
[0354] Ovde je obelodanjen postupak za inhibiciju rasta ćelije koja eksprimira KAAG1 koja je negativna na receptor estrogena (ER-), negativna na receptora progesterona (PgR-) i/ili kojoj nedostaje prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2), gde postupak može da obuhvati dovođenje u dodir ćelija sa efikasnom količinom antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji su ovde opisani.
[0355] Ovde je takođe obelodanjen postupak za tretman raka ili inhibiranje rasta ćelija koje eksprimiraju KAAG1 koje su negativne na receptor estrogena (ER-), negativne na receptor progesterona (PgR-) i/ili kojima nedostaje prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2-), kod sisara, gde postupak može da sadrži primenu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, koji su ovde opisani, sisaru u potrebi.
[0356] Predmetni pronalazak pruža postupak tretiranja, dijagnostičkih postupaka i postupka detektovanja korišćenjem antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji je ovde obelodanjen i upotrebu ovih antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u proizvodnji farmaceutskog sastava ili leka za takve svrhe.
[0357] Ovde obelodanjen postupak tretmana obuhvata primenu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, koji su ovde opisani, sisaru u potrebi, i naročito pacijentu koji ima ili je podložan raku koji je karakterisan kao negativan na receptor estrogena (ER-), negativan na receptor progesterona (PgR-) i/ili koji nema prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2-),
[0358] Ovde su takođe obelodanjeni postupci za smanjenje širenja tumora, invazije tumora, stvaranje tumora ili za indukciju lize tumora, koji mogu obuhvatiti primenu izolovanog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen sisaru u potrebi.
[0359] Ovde je obelodanjena upotreba izolovanog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koje je ovde opisan u (u proizvodnji farmaceutskog sastava za) tretmanu raka, smanjenju širenja tumora, invazije tumora, stvaranja tumora ili za indukciju tumorske lize tumorskih ćelija koje eksprimiraju KAAG1 koje su negativne na receptor estrogena (ER-), negativne na receptor progesterona (PgR-) i/ili koje nemaju prekomernu eksprimiranje Her2 (Her2-).
[0360] Antitelo ili fragment koji vezuje antigen može biti naročito pogodan za maligni tumor, uključujući, na primer, maligni tumor koji ima sposobnost metastaziranja i/ili tumorske ćelije karakteristične za rast nezavisan od sidrenja. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je ovde opisan može se takođe koristiti u dijagnostici raka. Dijagnoza raka se može izvršiti in vivo primenom antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koje je ovde obelodanjen sisaru koji ima ili se sumnja da ima rak. Dijagnoza se takođe može izvršiti ex vivo dovođenjem u dodir uzorka dobijenog od sisara sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen i određivanjem prisustva ili odsustva ćelija (ćelija tumora) koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0361] Takođe je obelodanjen postupak za detektovanje raka ili detektovanje ćelija koje eksprimiraju KAAG1 koje su negativne na receptor estrogena (ER-), negativne na receptor progesterona (PgR-) i/ili koje nemaju prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2-), kod sisara, gde postupak može obuhvatiti primenu ovde opisanog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen sisaru u potrebi.
[0362] Takođe je obelodanjen postupak za detektovanje ćelije koja eksprimira KAAG1 ili varijantu KAAG1, gde postupak može da obuhvati dovođenje u dodir ćelije sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen koji je ovde opisan i detektovanje kompleksa formiranog od antitela i ćelije koja eksprimira KAAG1 ili varijantu KAAG1. Primerna otelotvorenja antitela ili fragmenata koji vezuju antigen koji se koriste u postupcima detektovanja su oni koji su sposobni da se vežu za ekstracelularni region od KAAG1.
[0363] Druga primerna otelotvorenja antitela ili fragmenata koji vezuju antigen koji se koriste u postupcima detektovanja su ona koji se vezuju za KAAG1 ili varijantu KAAG1 eksprimirane na površini tumorskih ćelija koje su negativne na receptor estrogena (ER-), negativne na receptor progesterona (PgR-) i/ili koje nemaju prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2-).
[0364] Takođe je obelodanjen postupak za detektovanje KAAG1 (SEQ ID NO.: 2), varijante KAAG1 koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.: 2 ili izlučenog oblika cirkulišućeg oblika KAAG1 ili varijante KAAG1, gde postupak može da obuhvati dovođenje u dodir ćelije koja eksprimira KAAG1 ili varijantu KAAG1 ili uzorka (biopsija, serum, plazma, urin itd.) koji sadrži ili se sumnja da sadrži KAAG1 ili varijantu KAAG1 sa ovde opisanim antitelom ili fragmentima koji vezuju antigen i merenjem vezivanja. Uzorak može poticati od sisara (npr. čoveka) koji može imati rak (npr. rak dojke koji je okarakterisan kao negativan na receptor estrogena (ER-), negativan na receptor progesterona (PgR-) i/ili koji nema prekomerno eksprimiranje Her2 (Her2-), poput rak dojke sličnog bazalnom ili trostruko negativnog raka dojke) ili se sumnja da ima rak. Uzorak može biti uzorak tkiva dobijenog od sisara ili supernatanta ćelijske kulture.
[0365] Uzorak može biti uzorak seruma, uzorak plazme, uzorak krvi ili ascitna tečnost dobijena od sisara. Ovde opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može povoljno detektovati izlučeni ili cirkulišući oblik (cirkulišući u krvi) KAAG1.
[0366] Postupak može da obuhvati kvantifikovanje kompleksa formiranog antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen vezanim za KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0367] Vezivanje antitela za antigen će izazvati povećanje očekivane molekulske težine antigena. Fizička promena se stoga dešava nakon specifičnog vezivanja antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i antigena.
[0368] Takve promene se mogu detektovati korišćenjem, na primer, elektroforeze praćene Western blotom i bojenjem gela ili blota, masene spektrometrije, HPLC zajedno sa računarom ili drugačije. Uređaj koji je sposoban da izračuna promenu u molekularnoj težini je poznat u struci, i uključuje na primer Phosphorimager™.
[0369] Kada antitelo sadrži, na primer, detektabilnu oznaku, antigen-antitelo kompleks može biti detektovan fluorescencijom koju emituje oznaka, zračenjem oznaka, enzimatskom aktivnosti oznaka pružene sa svojim supstratom ili drugačije.
[0370] Detektovanje i/ili merenje vezivanja između antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i antigena može se izvesti različitim postupcima poznatim u struci. Vezivanje između antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i antigena može se pratiti pomoću uređaja koji može detektovati signal koji emituje detektabilna oznaka (zračenje, fluorescencija, promena boje itd.). Takav uređaj daje podatke koji ukazuju na to da se vezivanje desilo i može takođe da pruži indikaciju o količini antitela vezanog za antigen. Uređaj (obično povezan sa kompjuterom) može takođe biti sposoban da izračuna razliku između pozadinskog signala (npr., signal dobijen u odsustvu antigena-antitelo vezivanja), ili pozadinske buke, i signala dobijenog nakon specifičnog antitelo-antigena vezivanja. Takvi uređaji mogu na taj način pružiti korisniku indikacije i zaključke o tome da li je antigen detektovan ili ne.
[0371] Takođe su opisani kompleti koji mogu da sadrže jedan ili više kontejnera koji sadrže jedno ili više ovde opisanih antitela ili fragmenata koji vezuju antigen.
Nukleinske kiseline, vektori i ćelije
[0372] Antitela se obično prave u ćelijama koje omogućavaju eksprimiranje lakog lanca i teškog lanca eksprimiranog iz vektora koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i/ili teški lanac.
[0373] Ovde su obelodanjene nukleinske kiseline koje mogu da kodiraju bilo koji od CDR, varijabilne regione lakog lanca, varijabilne regione teškog lanca, lake lance, teške lance koji su ovde opisani.
[0374] Ovde je obelodanjena nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela koje je sposobno da se specifično veže za KAAG1.
[0375] Primeri nukleinskih kiselina obuhvataju nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od nukleinske kiseline koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence (tj. najmanje 75%, najmanje 80% identičnosti sekvence) sa bilo kojom od SEQ ID NO.:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 45 i 47, njene fragmente (npr., najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20 uzastopnih nukleotida) i njene komplemente.
[0376] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može posebno kodirati varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela koji mogu biti sposobni da indukuju ubijanje (eliminaciju, razaranje, lizu) tumorskih ćelija koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0377] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može posebno kodirati varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela koje može biti sposobno da smanji širenje tumorskih ćelija koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0378] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može posebno kodirati varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela koje može biti sposobno da smanji ili ometa formiranje tumora koji eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0379] Primerne nukleinske kiseline uključuju nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni region lakog lanca i obuhvataju:
a. CDRL1 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:72 i SEQ ID NO.:73;
b. CDRL2 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:74, SEQ ID NO.: 75 i SEQ ID NO.:76, ili; c. CDRL3 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:77, SEQ ID NO.:78 i SEQ ID NO.:79.
[0380] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata barem dva CDR od CDRL1, CDRL2 ili CDRL3.
[0381] Takođe u skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira varijabilni region lakog lanca koji može da obuhvata jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0382] Predmetno obelodanjenje se takođe odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni region teškog lanca i obuhvataju:
a. CDRH1 sekvencu koja sadrži SEQ ID NO.:80;
b. CDRH2 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:81, SEQ ID NO.:82, SEQ ID NO.:83, SEQ ID NO.:84 i SEQ ID NO.:85, ili;
c. CDRH3 sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO.:86, SEQ ID NO.:87 i SEQ ID NO.:88.
[0383] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata barem dva CDR od CDRH1, CDRH2 ili CDRH3.
[0384] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira varijabilni region teškog lanca koji može da obuhvata jedan CDRH1, jedan CDRH2 i jedan CDRH3.
[0385] Takođe obuhvaćene predmetnim obelodanjenjem su nukleinske kiseline koje kodiraju varijante antitela, i koje imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.
[0386] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR i obuhvata najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.
[0387] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR i obuhvata najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u najmanje dva od CDR.
[0388] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR i obuhvata najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u 3 CDR.
[0389] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR obuhvata najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje jednom od CDR.
[0390] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR obuhvata najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje dva od CDR.
[0391] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, nukleinska kiselina može da kodira CDR obuhvata najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u 3 CDR.
[0392] Ovde je obelodanjena nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70%, 75%, 80% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:24, SEQ ID NO.:103, SEQ ID NO.:104, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:106, SEQ ID NO.:107, SEQ ID NO.:108, SEQ ID NO.:109, SEQ ID N0.:110, SEQ ID NO.:111, SEQ ID NO.:112, SEQ ID NO.:113, SEQ ID NO.:114, SEQ ID NO.:115, SEQ ID NO.:116, SEQ ID NO.:117, SEQ ID NO.:118, SEQ ID NO.:119, SEQ ID NO.:120, SEQ ID NO.:121, SEQ ID NO.:122, SEQ ID NO.:123, SEQ ID NO.:124 i SEQ ID NO.:125.
[0393] Ovde je takođe obelodanjena nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70%.75%, 80% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO.:18, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:26, SEQ ID NO.:126, SEQ ID NO.:127, SEQ ID NO.:128, SEQ ID NO.:129, SEQ ID NO.:130, SEQ ID NO.:131, SEQ ID NO.:132, SEQ ID NO.:133, SEQ ID NO.:134, SEQ ID NO.:135, SEQ ID NO.:136, SEQ ID NO.:137, SEQ ID NO.:138, SEQ ID NO.:139, SEQ ID NO.:140, SEQ ID NO.:141, SEQ ID NO.:142, SEQ ID NO.:143, SEQ ID NO.:144, SEQ ID NO.:145, SEQ ID NO.:146 i SEQ ID NO.:147.
[0394] Ovde je takođe obelodanjen vektor koji sadrži ovde opisane nukleinske kiseline.
[0395] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, vektor može biti vektor eksprimiranja.
[0396] U struci je poznat vektor koji sadrži elemente za transkripcionu i translacijsku kontrolu umetnute kodirajuće sekvence u određenom domaćinu. Ovi elementi mogu uključivati regulatorne sekvence, kao što su pojačivači, konstitutivni i inducibilni promoteri, i 5' i 3' ne-prevedeni regioni. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstrukciju takvih vektora eksprimiranja. Ovi postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze, i in vivo genetsku rekombinaciju.
[0397] Ovde je obelodanjena izolovana ćelija koja može da sadrži ovde opisanu nukleinsku kiselinu.
[0398] Izolovana ćelija može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca, bilo na odvojenim vektorima ili na istom vektoru. Izolovana ćelija može takođe da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac i nukleinsku kiselinu koja kodira teški lanac, bilo na odvojenim vektorima ili na istom vektoru.
[0399] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, ćelija može biti sposobna da eksprimira, sastavlja i/ili izlučuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0400] Ovde je takođe opisana ćelija koja može da sadrži i/ili može eksprimirati ovde opisano antitelo.
[0401] U skladu sa predmetnim obelodanjenjem, ćelija može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca.
[0402] Ćelija može biti sposobna da eksprimira, sastavlja i/ili izlučuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0403] Primeri u nastavku su dati kako bi bolje prikazali detalje predmetnog pronalaska.
PRIMERI
Primer 1
[0404] Ovaj primer obelodanjuje postupke koje se koriste za pretvaranje Fab u puna IgG1 himerna monoklonska antitela.
[0405] Pored mogućnosti sprovođenja studija interakcije između Fab monoklonskih i KAAG1 proteina, upotreba Fab može biti ograničena u odnosu na obavljanje smislenih in vitro i in vivo studija za validaciju biološke funkcije antigena. Prema tome, bilo je neophodno da se varijabilni regioni lakog i teškog lanca sadržani u Fab prenesu na skele punog antitela, kako bi se proizveli himerni mišji IgG1. Vektori eksprimiranja i za lake i za teške lance imunoglobulina su konstruisani tako da su i) originalne sekvence bakterijskog signalnog peptida uzvodno od Fab vektora eksprimiranja zamenjene su sisarskim signalnim peptidima i ii) konstantni regioni lakog i teškog lanca u mišjim antitelima zamenjeni ljudskim stalnim regionima. Postupci za ostvarivanje ovog transfera koriste standardne tehnike molekularne biologije koje su poznate stručnjacima.
[0406] Vektor eksprimiranja lakog lanca - postojeći plazmid eksprimiranja sisara, nazvan pTTVH8G (Durocher i dr., 2002), dizajniran da se koristi u 293E sistemu prolazne transfekcije, modifikovan je da prihvati mišji varijabilni region lakog lanca. Rezultujući mišje-ljudski himerni laki lanac sadrži mišji varijabilni region praćen ljudskim kappa konstantnim domenom. Sekvenca cDNK koja kodira ljudski kappa konstantni domen je amplifikovana pomoću PCR sa prajmerima OGS1773 i OGS1774 (SEQ ID NO: 55 i 56, respektivno). Sekvenca nukleotida i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za ljudski kappa konstantni region prikazani su u SEQ ID NO: 57 i 58, respektivno. Rezultujući 321 bazni par PCR proizvoda ligiran je u pTTVH8G neposredno nizvodno od sekvence signalnog peptida ljudskog VEGF A (NM_003376). Ovaj korak kloniranja takođe je postavio jedinstvena mesta za restrikcionu endonukleazu koja su omogućila precizno pozicioniranje cDNK koje kodiraju varijabilne regione mišjeg lakog lanca. Sekvenca konačnog plazmida eksprimiranja, nazvana pTTVKl, je prikazana u SEQ ID NO.:59. Na osnovu sekvenci opisanih u Tabeli 2, PCR prajmeri specifični za varijabilne regione lakog lanca antitela 3D3, 3G10, 3C4 i 3A4 (SEQ ID NO: 15, 19, 23 i 47, respektivno) su dizajnirani tako da uključuju, na svom 5'-kraju, sekvencu identičnu sa poslednjih 20 baznih parova VEGF A signalnog peptida. Sekvence ovih prajmera su prikazane u SEQ ID NO: 60, 61, 62 i 213. Isti reverzni prajmer je korišćen za amplifikaciju sva tri varijabilna regiona lakog lanca 3D3, 3G10 i 3C4 pošto su ekstremni 3'-krajevi bili identični. Ovaj prajmer (SEQ ID NO.: 63) uključuje, na svom 3'-kraju, sekvencu identičnu sa prvih 20 baznih parova ljudskog kappa konstantnog domena. Prajmer SEQ ID NO.: 214 je korišćen za amplifikaciju varijabilnog regiona lakog lanca 3A4. I PCR fragmenti i digestirani pTTVK1 su tretirani sa 3'-5' aktivnosti eksonukleaze od T4 DNK polimeraze što je rezultovalo slobodnim krajevima koji su spojeni kalemljenjem. Reakcije kalemljenja su transformisane u kompetentne E. coli i plazmidi eksprimiranja su verifikovani sekvenciranjem kako bi se osiguralo da su varijabilni regioni mišjeg lakog lanca ispravno umetnuti u pTTVK1 vektor eksprimiranja. Stručnjacima u oblasti će lako prepoznati da se postupak koji se koristi za konstrukciju plazmida eksprimiranja lakog lanca odnosi na sva anti-KAAG1 antitela sadržana u originalnoj Fab biblioteci.
[0407] Vektor eksprimiranja teškog lanca - vektor eksprimiranja koji proizvodi imunoglobuline teškog lanca je dizajniran na sličan način kao pTTVK1 opisan gore za proizvodnju imunoglobulina lakog lanca. Plazmid pID11 (Durocher i dr., 2002), koji sadrži sekvencu ljudskog IgGK signalnog peptida kao i CH2 i CH3 regione ljudskog Fc domena IgG1, je modifikovan ligiranjem cDNK sekvence koja kodira ljudski konstantni CH1 region. PCR prajmeri OGS1769 i OGS1770 (SEQ ID NO: 64 i 65), dizajnirani da sadrže jedinstvena restrikciona mesta endonukleaze, korišćeni su za amplifikaciju ljudskog IgG1 CH1 regiona koji sadrži nukleotidnu sekvencu i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO.: 66 i 67. Posle ligacije fragmenta 309 baznih parova ljudskog CH1 odmah iza sekvence IgGK signalnog peptida, modifikovani plazmid (SEQ ID NO.: 68) je označen kao pYD15. Kada se odabrani varijabilni region teškog lanca veže u ovaj vektor, dobijeni plazmid kodira puni IgG1 imunoglobulin teškog lanca sa ljudskim konstantnim regionima. Na osnovu sekvenci opisanih u Tabeli 2, PCR prajmeri specifični za varijabilne regione teškog lanca antitela 3D3, 3G10, 3C4 i 3A4 (SEQ ID NO: 17, 21, 25 i 45, respektivno) su dizajnirani tako da uključuju, na svom 5'-kraju, sekvencu identičnu sa poslednjih 20 baznih parova od IgGK signalnog peptida. Sekvence ovih prajmera su prikazane u SEQ ID NO: 69 (3D3 i 3G10 imaju istu 5'-kraj sekvencu), SEQ ID NO.: 70 ili SEQ ID NO.:215 za 3A4. Isti reverzni prajmer je korišćen za amplifikaciju sva tri varijabilna regiona teškog lanca 3D3, 3C4 i 3G10, pošto su ekstremni 3'-krajevi bili identični. Ovaj prajmer (SEQ ID NO.: 71) uključuje, na svom 3'-kraju, sekvencu identičnu sa prvih 20 baznih parova ljudskog CH1 konstantnog domena. Za varijabilni region 3A4 teškog lanca, korišćen je SEQ ID NO.: 216. I PCR fragmenti i digestirani pYD15 su tretirani sa 3'-5' aktivnosti eksonukleaze T4 DNK polimeraze što je rezultovalo slobodnim krajevima koji su spojeni žarenjem. Reakcije kalemljenja su transformisane u kompetentne E. coli i plazmidi eksprimiranja su verifikovani sekvenciranjem kako bi se osiguralo da su varijabilni regioni mišjeg lakog lanca ispravno umetnuti u pYD15 vektor eksprimiranja. Stručnjacima u oblasti će lako prepoznati da se postupak koji se koristi za konstrukciju plazmida eksprimiranja lakog lanca odnosi na sva anti-KAAG1 antitela sadržana u originalnoj Fab biblioteci.
[0408] Eksprimiranje ljudskih IgG1 u 293E ćelijama – Vektori eksprimiranja pripremljeni iznad koji kodiraju imunoglobuline lakog i teškog lanca su eksprimirani u 293E ćelijama korišćenjem sistema prolazne transfekcije (Durocher i dr., 2002). Mogu se koristiti i drugi postupci prolaznog ili stabilnog eksprimiranja. Odnos lakog i teškog lanca je optimizovan kako bi se postigao najveći prinos antitela u medijumu kulture tkiva i otkriveno je da je 9:1 (L:H). Sposobnost anti-KAAG1 antitela (monoklonskih, himernih ili humanizovanih) da se vezuju za rekombinantni Fc-KAAG1 merena je pomoću ELISA i upoređena sa izvornim mišjim Fab.
[0409] Šema koja se koristi za konverziju drugih Fab u kompletan IgG (uključujući 3A4) i za eksprimiranje antitela je detaljnije opisana u međunarodnoj prijavi br. PCT/CA2012/000296, čiji je celokupan sadržaj ovde uključen kao referenca.
Primer 2
Humanizacija 3A4 mišjeg monoklonskog antitela
[0410] Međunarodni patenti br. PCT/CA2009/001586, PCT/CA2010/001795 i bez. PCT/CA2012/000296Opisana je primerna metodologija korišćena za generisanje varijabilnih regiona humanizovanog lakog i teškog lanca.
[0411] humanizacija varijabilnog regiona lakog lanca 3A4 antitela uključila je 11 mutacija u svoj predloženi humanizovani okvir za 100% humanizovanje okvira. Humanizacija varijabilnog regiona teškog lanca 3A4 antitela uključivala je 23 mutacije u svoj predloženi humanizovani okvir za 100% humanizaciju okvira. Ove 100% humanizovane sekvence varijabilnog regiona su obeležene Lvhl i Hvhl, respektivno (SEQ ID NO.: 189 i 194). Takođe su dizajnirane dodatne humanizovane sekvence u kojima je zadržano nekoliko ostataka iz 3A4 mišjih sekvenci na osnovu pažljivih strukturnih i komparativnih analiza sekvenci koje ukazuju na visoku verovatnoću promene afiniteta vezivanja antigena ako se mutacije uvode na ovim položajima. Ove sekvence varijabilnih regiona su obeležene Lvh2, Hvh2, Hvh3 i Hvh4 (SEQ ID NO: 190, 195, 196 i 197).
[0412] Dve varijante humanizovanog lakog lanca (uključujući konstantni region) su identifikovane ovde kao Lh1 (SEQ ID NO.: 199) i Lh2 (SEQ ID NO.: 200). Četiri varijante humanizovanog teškog lanca (uključujući konstantni region su ovde identifikovane kao Hh1 (SEQ ID NO.:202), Hh2 (SEQ ID NO.: 2020), Hh3 (SEQ ID NO.: 204) i Hh4 (SEQ ID NO Dva humanizovana laka lanca i 4 humanizovana teška lanca mogu biti sastavljena u 8 humanizovanih antitela (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3, Lh1Hh4, Lh2Hh1, Lh2Hh2, Lh2Hh3, i Lh2Hh4).
[0413] U slučaju 3A4 humanizovane sekvence lakog lanca Lvh2 (SEQ ID NO.: 190), okvirni ostaci Val-L2 i Lys-L45 su zadržani iz mišje sekvence pošto ostatak L2 je polu-zakopan, dovode u dodir oba od CDR-L1 i CDR- L3, i imaju sklonost za dovođenje u dodir sa antigenom, dok se ostatak L45 približava teškom lancu. Napominjemo da se oba ova mišja ostatka mogu pojaviti u ljudskim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh2 (SEQ ID NO.: 195), okvirni ostaci Ile-H2 i Lys-L73 su zadržani iz mišje sekvence pošto ostatak H2 je polu-zakopan, dovode u dodir oba od CDR-H1 i CDR- H3, i imaju sklonost za dovođenje u dodir sa antigenom, dok ostatak H73 pripada Vernier zoni koja podržava CDR-H2, i oba ova mišja ostatka mogu se pojaviti u ljudskim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh3 (SEQ ID NO.: 196), Ile-H2 i Lys-L73 povratne mutacije su zadržane i pored ovih, okvirni ostaci Ile-H48, Ala-H67, Leu-H69 i Val-H71 su zadržani iz mišje sekvence pošto su svi ovi dodatni mišji ostaci zakopani ostaci i pripadaju Vernier zoni koja podržava CDR-H2, i takođe se mogu pojaviti mišji ostaci H71 u ljudskim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh4 (SEQ ID NO.: 197), svih 6 povratnih mutacija Hvh3 humanizovane varijante su uključene plus dva dodatna mišja ostatka Lys-H38 i Lys-H66 pošto oni predstavljaju poluzakopane ostatke blizu CDR-H2. Rezultujuće aminokiselinske sekvence mišjih i humanizovanih lanaca navedene su u Tabeli 1. Poravnavanje varijabilnih regiona mišjeg i humanizovanog lakog lanca je prikazano na Slici 1a i poravnanje mišjih i humanizovanih varijabilnih regiona teškog lanca je prikazano na Slici 1b.
[0414] Slika 2a i 2b su poravnanje varijabilnog regiona mišjeg lakog lanca sa varijabilnim regionom 100% humanizovanog lakog lanca i varijabilnim regionom teškog lanca miša sa 100% humanizovanim varijabilnim regionom teškog lanca. Ova slika ilustruje aminokiseline koje su sačuvane i one koje su izabrane za supstituciju.
Primer 3.
Sastavljanje i eksprimiranje humanizovanih varijanti 3A4 antitela
[0415] Svrha ovih istraživanja je da se odrede kinetički parametri anti-klusterin antitela. Posebno, kako bi se odredilo da li humanizacija 3A4 anti-KAAG1 monoklonskog antitela utiče na kinetičke parametre njegovog vezivanja za ljudski KAAG1. U tu svrhu razvijen je postupak kinetičke analize korišćenjem instrumenta ProteOn XPR36 od BioRad. Ljudski KAAG1 je imobilisan na senzorskom čipu. Antitela pune dužine ili Fab fragmenti su injektirani i ostavljeni da interakuju sa imobilisanim KAAG1.
Konstrukcija plazmida koji kodira himerne (mišje) teške i lake lance od 3A4
[0416] Teški i laki lanci himernog antitela su amplifikovani pomoću PCR iz originalnih mišjih lanaca imunoglobulina korišćenjem sledećih parova oligonukleotidnih primera: teški lanac, 5'-oligo kodiran od strane SEQ ID NO.: 206 i 3'-oligo kodiran od strane SEQ ID NO: 207; laki lanac, 5'-oligo kodiran od strane SEQ ID NO.: 208 i 3'-oligo kodiran od strane SEQ ID NO.: 209. Dobijeni PCR proizvodi su digestirani sa Hind III i klonirani u pK-CR5 (SEQ ID NO.: 210) prethodno razgrađeni sa Hind III.
Konstrukcija plazmida koji kodiraju varijante 1, 2, 3 i 4 humanizovanog teškog lanca 3A4
[0417] Fragmenti koji kodiraju region humanizovanog teškog lanca antitela 3A4 (Hh1, Hh2, Hh3 i Hh4) su naručeni od GenScript (Piscataway, USA). DNK fragmenti uključujući kozak i stop kodon sekvence su digestirani sa Hindlll i klonirani u Hindlll mesto plazmida pK-CR5 koji je prethodno defosforilisan sa telećom intestinalnom fosfatazom (NEB) kako bi se sprečila recirkularizacija. Slika 3a prikazuje mapu plazmida pK-CR5-3A4-HC-varijante1. Sve varijante teškog lanca humanizovanog 3A4 su konstruisane na sličan način.
Konstrukcija plazmida koji kodiraju varijante 1 i 2 humanizovanog lakog lanca 3A4
[0418] Fragmenti koji kodiraju za regione ljudskog lakog lanca antitela 3A4 (Lh1 i Lh2) su naručeni od GenScript. Fragmenti DNK uključujući kozak i stop kodon sekvence su digestirani sa BamHI i klonirani u BamHI mesto plazmida pMPG-CR5 (SEQ ID NO.: 211) koji je prethodno defosforilisan sa telećom intestinalnom fosfatazom (NEB) kako bi se sprečila recirkularizacija. Slika 3b prikazuje mapu plazmida pMPG-CR5-3A4-LC-varijante1. Sve varijante lakog lanca humanizovanog 3A4 su konstruisane na sličan način.
Studija prolazne transfekcije
[0419] Plazmidna DNK je izolovana iz malih kultura E. coli pomoću kompleta Mini-Prep (Qiagen Inc, Mississauga, ON) prema preporuci proizvođača. Ukratko, 2 ml LB medijuma koji sadrži 100 µg/ml ampicilina inokulisano je sa jednom kolonijom izabranom posle ligacije i transformacije. Kulture su inkubirane na 37°C preko noći uz snažno mućkanje (250 o/min). Plazmid je zatim izolovan iz 1,5 ml kulture uz korišćenje protokola, pufera i kolona obezbeđenih u kompletu. DNK je eluirana korišćenjem 50 µl sterilne vode. Plazmidna DNK je izolovana iz velike kulture E. coli korišćenjem Plasmid Plus Maxi kompleta (Qiagen Inc, Mississauga, ON) prema preporuci proizvođača. 200 mL LB medijuma koji sadrži 100 µg/mL ampicilina inokulisano je jednom jedinom svežom kolonijom E. coli i inkubirano preko noći na 37°C uz snažno mućkanje (250 o/min). Bakterije (130 mL kulture za teški lanac i 180 mL kulture za laki lanac) su peletirane centrifugiranjem na 6000 x g, tokom 15 min, na 4°C i plazmid je izolovan korišćenjem protokola, pufera i kolone iz kompleta. Čisti plazmidi su resuspendovani u sterilnom 50 mM Tris, pH 8 i kvantifikovani merenjem optičke gustine na 260 nm. Pre transfekcije, prečišćeni plazmid je sterilisan ekstrakcijom sa fenol/hloroformom, i zatim taloženjem etanolom. Plazmid se resuspenduje u sterilnom 50 mM Tris, pH 8 i kvantifikuje optičkom gustinom na 260 nm.
[0420] Pre transfekcije, ćelije (CHO-cTA) su isprane sa PBS i resuspendovane u koncentraciji od 4,0 X 106 ćelija/ml u medijumu za rast (CD-CHO, Invitrogen) bez dekstran sulfata tokom 3 sata u kulturi suspenzije. Za svaku plazmidnu kombinaciju, 45 ml ćelija je transfektovano dodavanjem polako 5 ml CDCHO medijuma dopunjenog sa 10 µg/ml svakog plazmida i 50 µg/ml polietilenimina (PEI Max; Polysciences). Konačna koncentracija je bila 1 µg/ml svakog plazmida i 5 µg/ml PEI. Posle 2 sata, ćelije su prenesene na 30°C. Sledećih dana, u ćelije je dodato 50 µg/mL dekstran sulfata i 3,75 ml svakog dodatka (Efficient Feed A i B Invitrogen) i oni su inkubirani na 30°C tokom 13 dana.2,5 ml hrane za hranjenje A i 2,5 ml hrane za hranjenje B se dodaju na dan 4, 6, 8 i 11. Na dan 13, supernatant se izbistri centrifugiranjem i filtrira kroz 0,22 µM filter.
[0421] CHO ćelije (CHOcTA) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju različite varijante humanizovanog teškog i lakog lanca 3A4 antitela regulisanih sa CR5 promoterom. Izvršena je transfekcija sa različitim kombinacijama lakih i teških lanaca. Kao kontrola, ćelije su takođe transfektovane sa plazmidima koji kodiraju himerno/mišja antitela.
Prečišćavanje antitela
[0422] 15 ml supernatanta iz CHF ćelijskih transfekcija je koncentrovano centrifugiranjem upotrebom Amicon Ultra (Ultacell-50k) kasete na 1500 o/min. Koncentrovano antitelo (550 µl) je prečišćeno korišćenjem Nab spin kompleta Protein A Plus (Thermo Scientific) u skladu sa preporukama proizvođača. Prečišćena antitela su zatim desalinifikovana upotrebom PBS i koncentrovane Amicon Ultra (Ultracel-10K) kasete na 2500 o/min do konačne zapremine od 250 µl. Prečišćeno antitelo je kvantifikovano očitavanjem OD280korišćenjem Nanodrop spektrofotometra i čuvano je zamrznuto na -20°C. Alikvot pročišćenog antitela je resuspendovan u jednaku zapreminu Laemmli 2X i zagrevan na 95°C tokom 5 min i ohlađen na ledu. Standardna kriva je napravljena korišćenjem poznate količine prečišćenog ljudskog IgG1 kappa iz ljudske plazme mijeloma (Athens Research). Uzorci su razdvojeni na poliakrilamidnom Novex 10% Tris-Glicin gelu (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON) i prebačeni na Hibond-N nitroceluloznu membranu (Amersham Bioscience Corp., Baie d'Urfée, QC) tokom 1 sata na 275 mA. Membrana je blokirana tokom 1 sata u 0,15% Tween 20, 5% obranog mleka u PBS i inkubirana tokom 1 sata sa kozjim anti-ljudskim IgG (H L) konjugovanim za Cy5 (Jackson, Cat # 109-176-099). Signal je otkriven i kvantifikovan skeniranjem pomoću Tiphoon Trio+ skenera (GE Healtcare). Kao što je prikazano na Slici 4, sve kombinacije varijanti 3A4 humanizovanog antitela su eksprimirane u CHO ćelijama.
Primer 4.
Kinetička analiza mišjeg i humanizovanog 3A4 antitela
Oprema
[0423] GLM sensorchips, Biorad ProteOn aminski komplet za spajanje (EDC, sNHS i etanolamin), i 10 mM natrijum acetatni puferi su nabavljeni od Bio-Rad Laboratories (Mississauga, ON). HEPES pufer, EDTA i NaCl su nabavljeni od Sigma-Aldrich (Oakville, ON). Deset procenata Tween 20 rastvora je nabavljeno od Teknova (Hollister, CA). Specifično antitelo kozjeg anti-ljudskog IgG Fc fragmenta je nabavljeno od Jackson ImmunoResearch. Kolona za gel filtraciju Superdex 7510/300 GL je nabavljena od GE Healthcare.
Gel filtracija
[0424] KAAG1 protein u koncentraciji od 3,114 mg/ml i zapremina od 220 µl je dat injekcijom u Superdex G75 kolonu. Odvajanje je izvršeno na 0,4 ml/min u HBST tekućem puferu (pogledati dole) bez Tween 20. Zapremina sakupljenih fragmenta je 500 µl. Koncentracija KAAG1 u svakom fragmentu je određena sa OD280korišćenjem koeficijenta ekstenzije od 5500 i MV od 8969. Slika 5 predstavlja profil gel filtracije KAAG1. Mali vrh potencijalnog agregata se eluira na oko 11 ml. Protein koji se eluira sa 13 ml je korišćen kao analit za SPR analizu (fragmenti 15 - 19).
SPR biosenzor testovi
[0425] Sva ispitivanja površinske plazmonske rezonance izvedena su korišćenjem BioRad ProteOn XPR36 instrumenta (Bio-Rad Laboratories Ltd. (Mississauga, ON) sa HBST puferom (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA i 0,05% Tween 20, pH 7,4) na temperaturi od 25°C. Površina za hvatanje anti-mišjeg Fc je generisana korišćenjem GLM senzorskog čipa aktiviranog sa 1:5 razblaženjem standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora datih injekcijom tokom 300 sekundi pri 30 µl/min u analitu (horizontalno). Odmah nakon aktivacije, 13 µg/mL rastvora anti-ljudskog IgG Fc fragmenta specifičnog u 10 mM NaOAc pH 4,5 je dato injekcijom u smeru analita sa brzinom protoka od 25 µl/min do približno 8000 rezonantnih jedinica (RU) Preostale aktivne grupe su ugašene 300-minutnom injekcijom 1M etanolamina na 30 µl/min u smeru analita, i to takođe omogućava da se kreiraju lažno aktivirani interspotovi za prazno referenciranje. KAAG1 se dogodio u dva koraka: indirektno hvatanje 3A4 varijanti iz ćelijskog supernatanta na specifičnu površinu anti-ljudskog IgG Fc fragmenta u pravcu liganda (vertikalno) praćeno KAAG1 injekcijom u pravcu analita. Prvo, jedna puferska injekcija tokom 30 sekundi na 100 µl/min u smeru liganda je korišćena za stabilizaciju osnovne linije. Za svako 3A4 hvatanje, neprečišćene 3A4 varijante u medijumu za kulturu ćelija su razređene do 4% u HBST, ili je korišćeno približno 1,25 µg/mL prečišćenog 3A4 u HBST. Četiri do pet 3A4 varijanti zajedno sa divljim tipom 3A4 su istovremeno injektirane u pojedinačne kanale liganda tokom 240 sekundi pri protoku od 25 µl/min. Ovo je rezultovalo zasićenjem 3A4 hvatanja od približno 400-700 RU na specifičnoj površini anti-ljudskog IgG Fc fragmenta. Prvi kanal liganda ostao je prazan kako bi se koristio kao kontrola praznog uzorka ako je bila potrebna. Ovaj korak hvatanja 3A4 odmah je praćen sa dve injekcije pufera u pravcu analita kako bi se stabilizovala osnovica, i zatim je injektiran gel filtracioni prečišćeni KAAG1. Za tipično ispitivanje, pet KAAG1 koncentracija (8, 2,66, 0,89, 0,29 i 0,098 nM) i kontrola pufera su istovremeno injektirani u pojedinačne kanale analita pri 50 µl/min u toku 120 sekundi sa fazom disocijacije 600s, što je rezultovalo skupom vezivanje senzograma sa referencom pufera za svaku od zarobljenih 3A4 varijanti. Kompleksi specifični za 3A4 Fc fragmente ljudskog IgG su regenerisani 18 sekundi dugačkim pulsom od 0,85% fosforne kiseline tokom 18 sekundi na 100 µl/min kako bi se pripremila specifična površina anti-ljudskog IgG Fc fragmenta za sledeći ciklus injekcija. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referisani upotrebom prazne injekcije pufera i interspotova, i dobijeni senzorski signali su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.0. Kinetičke i afinitetne vrednosti su utvrđene podešavanjem referentnih senzora na 1:1 Langmuir model vezivanja pomoću lokalne Rmaxi konstante afiniteta ( KDM) su izvedene iz dobijenih konstanti brzine (kds<-1>/kaM<-1>s<-1>).
Određivanje konstanti brzine i afiniteta
[0426] Slika 6 sumira konstante brzine asocijacije (ka, 1/Ms) i disocijacije (kd, 1/s), kao i konstante afiniteta (KD, M) za interakciju KAAG1 sa prečišćenim mišjim 3A4, mišjim 3A4 prolazno eksprimiranim kao himernim i prolazno eksprimiranim humanizovanim varijantama. Ove konstante su grafički predstavljene na Slici 7a-c. Konstanta brzine asocijacije je veoma slična za čiste roditeljske, himerne i humanizovane varijante 3A4 (Slika 7a). Konstante brzine disocijacije su slične za prolazno eksprimirane himerne u poređenju sa čistim roditeljskim 3A4, uz sugestiju da postupak transfekcije nije promenio parametre interakcije KAAG1 sa antitelom (Slika 7b). Međutim, čini se da sve humanizovane varijante imaju malo izmenjenu stopu, tj. veću brzinu disocijacije (Slika 7b). Ovo se ogleda u konstantama afiniteta (Slika 7c). Ukratko, postoji linearna korelacija između afiniteta vezivanja (logKD) humanizovane varijante i broja povratnih mutacija napravljenih u roditeljskom antitelu (LcHc) sa smanjenjem afiniteta vezivanja kako se broj mutacija povećava. Međutim, razlika u afinitetu vezivanja je samo 4 puta različita između gore varijante (H1L1, 0,47 nM) koja nema zadržani mišji ostatak i najbolje varijanta koja ima zadržanih 10 mišjih ostataka (H4L2, 0,1 nM). Konačno, otkriveno je da je afinitet vezivanja svih varijanti za KAAG1 sub-nanomolarni i najbolja varijanta (H4L2, 0,1 nM) pokazuje afinitet oko 6 puta slabiji od mišjeg (LcHc, 0,057 nM). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je humanizacija bila uspešna jer su sve varijante pokazale visok afinitet za KAAG1.
Primer 5.
Vezivanje 3A4 humanizovanih varijanti za KAAG1 u ELISA testu
[0427] ELISA postupci su takođe korišćeni za poređenje aktivnosti vezivanja humanizovanih 3A4 varijanti sa mišjim 3A4 antitelom. Rekombinantni ljudski KAAG1 je obložen u ploče sa 96 komorica O/N, ispran i inkubiran tokom 1 sata na RT sa povećanim količinama mišjih ili humanizovanih 3A4 varijanti. Posle još jedne runde koraka ispiranja, antiljudsko antitelo konjugovano sa HRP je dodato u komorice i vezano antitelo 3A4 je mereno kalorimetrijski na Abs450. Kao što je prikazano na Slici 8a, humanizovane varijante (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3 i Lh1Hh4) pokazuju veoma slično vezivanje za KAAG1 u poređenju sa mišjim 3A4 (LcHc), koji ima visok afinitet od 0,016nM. Ovaj rezultat je pokazao da su sve četiri humanizovane varijanta teškog lanca bile uporediva sa izvornim h3A4 teškim lancem kada su sastavljena sa L1 varijantom humanizovanog lakog lanca. Slika 8a prikazuje rezultate kada su varijante teškog lanca sastavljene sa varijantom Lh2 humanizovanog lakog lanca 3A4. U ovom slučaju, postojala je razlika u vezivanju varijanti. Na primer, Lh2hh4 je varijanta sa najbližim profilom u poređenju sa mišjim 3A4. Ovo je bilo u skladu sa SPR podacima, koji su pokazali da varijanta 4 teškog lanca ima najveći afinitet za KAAG1. Uzeti zajedno, ovi rezultati vezivanja pokazuju da su humanizovane varijante sve u interakciji sa ljudskim KAAG1 u ovom testu. Iako je bilo nekih suptilnih razlika, vezivanje u ELISA je bilo u skladu sa rezultatima SPR.
Primer 6.
Vezivanje humanizovanih varijanti 3A4 na površini ćelija raka
[0428] Protočna citometrija je korišćena za procenu kapaciteta humanizovanih 3A4 varijanti za interakciju sa KAAG1 eksprimiranim na površini ćelija raka. U tom cilju, SKOV-3 ćelije raka jajnika, koje smo prethodno pokazale, efikasno su vezane sa 3A4 protočnom citometrijom, inkubirane su sa osam humanizovanih varijanti i izvornim mišjim antitelom. Ukratko, SKOV-3 ćelije su odvojene od ploče sa EDTA i inkubirane na ledu sa 3,0 mg/ml, 0,3 mg/ml ili 0,3 mg/ml antitela za 1 sat. Posle tri koraka ispiranja, ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitelom, anti-ljudskim IgG-konjugovanim sa FITC tokom 1 h na ledu. Fluorescencija ćelijske površine je merena u protočnom citometru i vrednosti ae prikazane na histogramu sa slike 9. Kao što je prikazano, sve varijante mogu da detektuju KAAG1 na površini na nepermeabilizovanim i najjači signali su dobijeni pri najvišoj koncentraciji 3A4 antitela (3 mg)./ml) i smanjena kako je koncentracija antitela smanjena. Među različitim varijantama, one sa većinom mišjih povratnih mutacija (Slika 9, pogledati Lh1Hh4 i Lh2Hh4) su interakovale sa KAAG1 na površini ćelija sa najvećom aktivnošću. U stvari, LhlHh4 i Lh2hh4 su se činili kao blago poboljšano vezivanje ćelijske površine za KAAG1 u poređenju sa mišjim 3A4 antitelom (LcHc).
Primer 7
[0429] Ovaj primer opisuje upotrebu anti-KAAG1 antitela za detektovanje eksprimiranja KAAG1 u TNBC.
[0430] Kao način za određivanje da li je KAAG1 antigen prisutan u uzorcima TNBC, izvršena je imunohistohemija. Dobijeni su mikročipovi tkiva koji su sadržali 139 uzoraka tumora dojke generisanih iz biopsija pacijenta. Uzorci epitela ugrađeni u parafin, postavljeni su na staklene slajdove i fiksirani 15 min na 50°C. Deparafinizacija je sprovedena tretiranjem 2x sa ksilenom praćeno dehidracijom u sledećih 5 min ispiranja u 100%, 80% i 70% etanolu. Slajdovi su isprani 3x u PBS tokom 5 minuta i tretirani su rastvorom za dobijanje antigena (1 mM EDTA, pH 8,0) kako bi se otkrio antigen. Endogene peroksidne reaktivne vrste su uklonjene inkubacijom slajdova sa H2O2u metanolu i blokiranje je izvedeno inkubacijom preparata sa rastvorom za blokiranje bez seruma (Santa Cruz Biotech) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Primarno antitelo (anti-KAAG13A4) je dodavano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. KAAG1-reaktivni antigen detektovan je inkubacijom sa biotin-konjugovanim mišjim anti-kappa praćenim streptavidin-HRP tercijarnim antitelom. Pozitivno bojenje je otkriveno tretiranjem slajdova sa DAB-vodonik peroksidnim supstratom tokom manje od 5 minuta i zatim kontrastno sa hematoksilinom. Nađeno je da se KAAG1 protein eksprimira na veoma visokim nivoima u velikoj većini uzoraka tumora dojke. Reprezentativni niz koji sadrži 139 tumora prikazan je na Slici 10. Konkretno, 15/20 uzoraka biopsije koji su potvrđeni kao TNBC (Slika 10, uzorci identifikovani zvezdicom) su jako obojeni za eksprimiranje KAAG1 sa 3A4 antitelom. Uzete zajedno, ove imunohistohemijske studije ilustruju korisnost detektovanja KAAG1 u raku dojke, posebno TNBC, sa monoklonskim antitelima.
Primer 8
[0431] Ovaj primer opisuje upotrebu anti-KAAG1 antitela za detektovanje eksprimiranja KAAG1 u TNBC ćelijskim linijama.
[0432] Kombinovani rezultati bioinformatičke analize primarne strukture cDNK koja kodira KAAG1, biohemijske studije i imunohistohemijsko detektovanje proteina u epitelnim ćelijama sugeriše da je KAAG1 antigen lociran na površini ćelije. Međutim, bilo je potrebno više direktnih dokaza kako bi se pokazalo da je KAAG1 zaista eksprimiran na površini TNBC ćelija. Kako bi se sprovela ova analiza, ćelijske linije raka dojke su dobijene od komercijalnog prodavca (ATCC, Manassas, VA) i korišćene su u eksperimentima protočne citometrije. RT-PCR ekspresione analize pomoću specifičnih primera KAAG1 mRNK su ranije pokazale da određene ćelijske linije raka dojke eksprimiraju KAAG1 mRNK (pogledati PCT/CA2007/001134). Zbog toga su neke od ovih ćelijskih linija odabrane kako bi se odredilo prisustvo KAAG1 antigena na njihovoj površini. Kako bi se ovo potvrdilo, trostruko negativne MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-468, BT-20 i BT-549 ćelijske linije su testirane na površinsko eksprimiranje KAAG1 korišćenjem 3A4 anti-KAAG1 antitela. Pored toga, u analizu su uključene i ćelijske linije raka dojke, koje nisu trostruko negativne, naime T47D i MCF-7. Konačno, kontrolna ćelijska linija, 293-6E, koja pokazuje nedetektabilan nivo eksprimiranja KAAG1 antigena, uključena je kao negativna kontrola za eksperiment protočne citometrije (FCM). U svrhu FCM analize, ćelije su sakupljene koristeći 5 mM EDTA, prebrojane sa hemocitometrom, i resuspendovane u FCM puferu (0,5% BSA, 0,01% kozjeg seruma u 1x PBS) pri gustini ćelija od 2 x 10<6>ćelija/ml. Himerno 3A4 anti-KAAG1 antitelo ili kontrolni IgG su dodati 100 µl od ćelija u konačnoj koncentraciji od 0,5 µg/ml i inkubirani na ledu tokom 1 sata. Ćelije su isprane u hladnom FCM puferu kako bi se uklonila nevezana antitela, resuspendovane u 100 µl FCM puferu koji sadrži anti-ljudski IgG konjugovan sa FITC sekundarnim antitelom (razblaženo 1:200) i inkubiran na ledu tokom 45 minuta. Nakon sledećeg koraka ispiranja u hladnom FCM puferu, ćelije su resuspendovane u 300 µl FCM pufera i analizirane protočnim citometrom. 10 µg/ml propidijum jodida se dodaje u svaki uzorak kako bi se omogućilo zatvaranje mrtvih ćelija. Rezultati iz tri nezavisna eksperimenta prikazani su na Slici 11, gde srednja indukcija intenziteta fluorescencije (MFI) predstavlja geometrijsku srednju vrednost signala dobijenog kada su ćelije inkubirane sa 3A4 antitelom u odnosu na negativnu kontrolu ljudskog IgG, koja je bila proizvoljno podešena na 1. Inkubacija antitela sa kontrolnim 293-6EHEK-293 ćelijama rezultovala je fluorescentnim signalima koji su bili slični signalu koji je dobijen kada su ćelije inkubirane u odsustvu primarnog antitela. Pored toga, nije bilo značajne razlike između signala dobijenog sa 3A4 u poređenju sa kontrolnim IgG. Štaviše, kada je kontrolni IgG inkubiran sa ćelijskim linijama raka dojke, signali su bili vrlo slični onima dobijenim sa kontrolnim 293-6E ćelijama. Nasuprot tome, detektovani signal fluorescencije je primećen kada je antitelo 3A4 inkubirano sa svim ćelijskim linijama raka dojke. Iako je uočena varijabilna količina fluorescencije, najveća količina KAAG1 je detektovana na površini ćelijskih linija MDA-MB-231 i BT-20, dve TNBC ćelijske linije (pogledati Sliku 11, TNBC ćelijske linije su označene sa zvezdicom). U stvari, svih pet TNBC ćelijskih linija bilo je pozitivno za eksprimiranje KAAG1 pod ovim uslovima. T47 D i MCF-7 ćelije su takođe eksprimirale KAAG1. Uzeta zajedno, ova analiza protočne citometrije pokazuje da TNBC ćelijska linija izražava visok nivo KAAG1 na njihovoj ćelijskoj površini.
Primer 9
Postupci za upotrebu 3A4 anti-KAAG1 antitela kao konjugata antitela
[0433] Kao što je pokazano gore, KAAG1 antigen je detektovan pomoću 3A4 na površini ćelija raka pomoću protočne citometrije. Postoji nekoliko različitih molekularnih događaja koji se mogu pojaviti nakon vezivanja antitela za svoj cilj na površini ćelija. Oni uključuju: i) blokiranje dostupnosti drugog antigena/receptora na površini ćelije ili liganda, ii) formiranje relativno stabilnog kompleksa antitela i antigena kako bi se omogućilo ciljanje ćelija preko ADCC ili CDC, iii) događaji signalizacije mogu se pojaviti kao primeri agonističkog antitela, iv) kompleks može biti internalizovan, ili v) kompleks se može ispustiti sa površine ćelije. Kako bismo odgovorili na ovo pitanje ispitali smo ponašanje 3A4 antitelo-KAAG1 kompleksa na površini ćelija. Ćelijska linija raka jajnika, SKOV3, korišćena je kao pozitivna kontrola u ovom eksperimentu pošto je uspešno upotrebljena u prethodnim eksperimentima internalizacije (pogledati PCT/CA2009/001586). MDA-MB-231 TNBC ćelije su obložene, isprane i inkubirane sa 0,5 µg/ml himernog 3A4 antitela kao što je opisano u Primeru 3. Nakon ispiranja, kompletan medijum je dodat i ćelije su postavljene na 37°C najviše 60 minuta. Ćelije su uklonjene u naznačenim vremenskim tačkama (pogledati Sliku 12), brzo ohlađene, pripremljene za protočnu citometriju sa FITC-konjugovanim anti-ljudskim IgG i rezultati su izraženi kao procenat srednjeg intenziteta fluorescencije koji ostaje na površini ćelije u poređenju sa signalom u vremenu od 0 minuta (pogledati Sliku 12, Signal površine (% ostaje na 0 min). Kao što je prikazano na Slici 12, signal fluorescencije se brzo smanjuje kada se 3A4 inkubira sa ćelijama MDA-MB-231 (Slika 12, crne trake, označene sa MDA-231 na slici) i čini se da je postigao maksimalni gubitak signala za 30 - 45 minuta, gubitak signala bio je uporediv sa onim koji je primećen kada je 3A4 inkubiran sa SKOV3 ćelijama (Slika 12, sive trake). Ovaj rezultat ukazuje da je 3A4/KAAG1 kompleks nestao iz ćelija, što ukazuje da se verovatno dogodila internalizacija kompleksa. Preliminarne studije za objašnjavanje mehanizma odgovornog za ovo smanjenje fluorescencije na površini ćelije otkrile su da deluje da se kompleks internalizovao. Slični rezultati se očekuju kod humanizovanih 3A4 antitela.
[0434] Slični rezultati su uočeni u dve dodatne TNBC ćelijske linije, naime MDA-MB-436 (Slika 13) i BT-20 (Slika 14) koje potvrđuju da je internalizacija kompleksa 3A4/KAAG1 na površini više TNBC ćelijskih linija. Nasuprot tome, uprkos sličnim nivoima MFI vezanja 3A4 na površini MDA-MB-436 i T47D (Slika 11), gubitak signala na površini ćelije nije primećen kada je 3A4 inkubiran sa T47D ćelijskom linijom. Ovaj nalaz sugeriše mogućnost da se internalizacija kompleksa 3A4/KAAG1 može pojaviti u većoj meri u TNBC ćelijama (Slika 15) u poređenju sa ćelijama koje nisu trostruko negativne.
[0435] Ovi rezultati su dalje potvrđeni sprovođenjem imunofluorescencije na živim ćelijama kako bi se ispitalo da li se ova internalizacija može mikroskopski posmatrati. MDA-MB-231 ćelije su zasijane na pokrivačima i kada su ćelije pravilno prilegle, dodata je sveža podloga koja sadrži 3A4 anti-KAAG1 himerno antitelo pri 10 µg/ml i inkubira se tokom 4 sata na 37°C. Ćelije su isprane u PBS i zatim fiksirane u 4% paraformaldehidu (u PBS) tokom 20 minuta. Posle ispiranja, ćelije su permeabilizovane sa 0,1% Triton X-100 u PBS tokom 5 min. Blokiranje je izvedeno sa 1,5% suvog mleka u PBS u toku 1 sata. Lizozomalno-povezani membranski protein 1 (LAMP1, Chang i dr., 2002) je detektovan inkubacijom sa anti-LAMP1 (Santa Cruz, sc-18821, razblažen 1:100) u 1,5% mleka u PBS tokom 2 sata. Posle ispiranja u PBS, sekundarna antitela su dodata zajedno u 1,5% mleka i inkubirana tokom 1 sata. Za anti-KAAG1 himerno antitelo sekundarno antitelo bilo je Rhodamine Red-X konjugovano magareće anti-ljudsko IgG (H+L) razblaženo 1: 300. Za anti-LAMP1 antitelo sekundarno antitelo bilo je DyLight488-konjugovano kozje anti-mišje IgG (H+L) razblaženo 1: 300. Oba sekundarna antitela su bila od Jackson ImmunoResearch. Pokrivači su isprani u PBS i montirani u ProLong Gold antifade reagens sa DAPI. Kao što se vidi na Slici 7, nakon 4 sata inkubacije na 37°C u prisustvu MDA-MB-231 ćelija raka, 3A4 antitelo je bilo moguće detektovati u kompleksima pretežno blizu peri-nuklearnog područja (strelice, pogledati crveno bojenje na levoj ploči na Slici 16), što je tipično za endozomalno-lizozomalne puteve internalizacije. Ovo opažanje je dalje potvrđeno kada je vizuelizovan lizozomalni marker, LAMP1 i otkriveno je da je takođe eksprimirano u ovim oblastima (strelice, pogledati zeleno bojenje u srednjem panelu na Slici 16). Važno je da je spajanje dve slike rezultovalo pojavom žuto-narandžastih struktura koje ukazuju da su 3A4 i anti-LAMP1 antitela prisutna u istim strukturama (strelice, pogledati žuto bojenje na desnom panelu na slici 16). Ko-lokalizacija 3A4, koja se vezuje za KAAG1 na površini ćelija raka, sa LAMP1, marker kasnih endozoma/lizozoma, pokazuje da je kompleks antitela/antigena internalizovan i da prati put koji je pogodan za oslobađanje tereta koji bi bio konjugovan sa 3A4 antitelom. Identični rezultati su uočeni u drugoj TNBC ćelijskoj liniji, BT-20 (pogledati Sliku 17).
[0436] Uzete zajedno, ove studije su pokazale da antitela specifična za KAAG1, kao što je 3A4, mogu da se koriste kao konjugat antitela, naročito, kao antitelo-lek konjugati (ADC). Tako, visok nivo TNBC specifičnosti kod KAAG1 u kombinaciji sa kapacitetom ovog cilja da bude internalizovan u ćelijama podržava razvoj primena kao što su ADC.
Primer 10
[0437] Kako bi se pokazalo da anti-KAAG1 antitela mogu efikasno da ciljaju i ubijaju ćelije kojima nedostaje eksprimiranje ER proteina, eksprimiranje PgR proteina i/ili pokazuju odsustvo prekomernog eksprimiranja HER2 proteina, generisali smo dva konjugata antitela i leka (ADC); 3A4-ADC1 i 3A4-ADC2.
[0438] U tom smislu, koristili smo himerno 3A4 antitelo i konjugovali citotoksični lek preko visoko stabilnog peptidnog veznika koji se selektivno odvaja od lizozomskih enzima nakon internalizacije (3A4-ADC1), ili je konjugovan sa drugim anti-mitotičkim lekom preko nerazdvojivog veznika (3A4-ADC2). Citotoksični lek može postati aktivan kada se internalizuje u ćelijama.
[0439] Sposobnost ADA 3A4 da detektuju KAAG1 na površini TNBC ćelija je određena korišćenjem protočne citometrije korišćenjem ovde opisanih postupaka. Ukratko, nekonjugovani 3A4, 3A4-ADC1, 3A4-ADC2 i kontrolni IgG su inkubirani u prisustvu MDA-231 TNBC ćelija, koje su KAAG1 pozitivne. Rezultati su pokazali da konjugacija 3A4 sa bilo kojim od lekova nije uticala na njeno vezivanje na trostruko negativne ćelije raka dojke kao što je MDA-231 (podaci nisu prikazani).
[0440] Nakon što je potvrđeno da se ADA 3A4 mogu vezati za KAAG1 eksprimiranim na površini TNBC ćelija, procenjena je njihova citotoksičnost prema ovim ćelijama u testovima proliferacije ćelija. MDA-231 ili TOV-112D ćelije su kultivisane kao što je opisano u prethodnim primerima. Ćelije su zasađene pri 3000 ćelija/komorica na ploče sa 96 komorica u 200 µl medijuma po komorici preko noći na 37°C, u 5% CO2. Sledećeg dana, medijum je zamenjen svežim medijumom koji sadrži antitela, u koncentracijama u rasponu od 0,122 nM do 500 nM, i inkubiran na 37°C tokom 72 sata. Svi uslovi su izvedeni u triplikatu komorica. Broj preživelih ćelija je određen izvođenjem testa ćelijske proliferacije, korišćenjem CellTiter 96 Aution One Solution (Promega, Madison, WI), u skladu sa protokolom proizvođača. Nakon prikupljanja sirovih podataka, rezultati su izraženi kao procenat preživljavanja u poređenju sa brojem ćelija u komoricama tretiranim sa PBS, koji je postavljen na 100%. Rezultati su pokazali da nekonjugovani 3A4 nije uticao na proliferaciju MDA-231 ćelija u svim testiranim koncentracijama. Nasuprot tome, testirani 3A4 ADC pokazali su značajnu citotoksičnost.
[0441] Ovi rezultati ukazuju da se konjugati 3A4 antitela mogu koristiti kao alternativni tretman za pacijente koji imaju trostruko negativan rak dojke ili rak dojke sličan bazalnom. Slični rezultati se očekuju za konjugate na osnovu humanizovanih 3A4 antitela.
[0442] Sekvence navedene u opisu
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
SEQ ID NO.:187 (3A4 varijanta varijabilnog regiona lakog lanca konsenzus 2)
gde Xa1može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xa2može biti A ili P;
gde Xa3može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde Xa4može biti L ili P;
gde Xa5može biti kisela aminokiselina;
gde Xa6može biti Q ili P;
gde Xa7može biti bazna aminokiselina;
gde Xa8može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xa9može biti A ili Q;
gde Xa10može biti bazna aminokiselina; ili
gde Xa11može biti hidrofobna aminokiselina,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48.
SEQ ID NO.:188 (3A4 varijanta varijabilnog regiona lakog lanca konsenzus 3)
gde XA1može biti V ili I
gde XA2može biti A ili P
gde XA3može biti S ili T
gde XA4može biti L ili P
gde XA5može biti D ili E
gde XA6može biti Q ili P
gde XA7može biti K ili Q
gde XA8može biti L ili V
gde XA9može biti A ili Q
gde XA10može biti R ili K ili
gde XA11može biti L ili I,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48.
SEQ ID NO.:189 (3A4 varijanta 1 varijabilnog regiona lakog lanca: Lvh1)
SEQ ID NO.:190 (3A4 varijanta 2 varijabilnog regiona lakog lanca: Lvh2)
SEQ ID NO.:191 (3A4 varijanta varijabilnog regiona teškog lanca konsenzus 1)
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46. Aminokiselinska supstitucija može biti, na primer konzervativna.
SEQ ID NO.:192 (3A4 varijanta varijabilnog regiona teškog lanca konsenzus 2)
gde Xb1može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb2može biti P ili A;
gde Xb3može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb4može biti V ili K;
gde Xb5može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb6može biti bazna aminokiselina;
gde Xb7može biti S ili A;
gde Xb8može biti H ili P;
gde Xb9može biti bazna aminokiselina;
gde Xb10može biti S ili G;
gde Xb11može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb12može biti bazna aminokiselina;
gde Xb13može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb14može biti I ili T;
gde Xb15može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb16može biti hidrofobna aminokiselina;
gde Xb17može biti K ili T;
gde Xb18može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
gde Xb19može biti Q ili E;
gde Xb20može biti N ili S;
gde Xb21može biti T ili R;
gde Xb22može biti neutralna hidrofilna aminokiselina; ili
gde Xb23može biti S ili L,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46.
SEQ ID NO.:193 (3A4 varijanta varijabilnog regiona teškog lanca konsenzus 3)
gde XB1može biti I ili V;
gde XB2može biti P ili A;
gde XB3može biti M ili V;
gde XB4može biti V ili K;
gde XB5može biti M ili V;
gde XB6može biti K ili R;
gde XB7može biti S ili A;
gde XB8može biti H ili P;
gde XB9može biti K ili Q;
gde XB10može biti S ili G;
gde XB11može biti I ili M;
gde XB12može biti K ili R;
gde XB13može biti A ili V;
gde XB14može biti I ili T;
gde XB15može biti L ili I;
gde XB16može biti V ili A;
gde XB17može biti K ili T;
gde XB18može biti S ili T;
gde XB19može biti Q ili E;
gde XB20može biti N ili S;
gde XB21može biti T ili R;
gde XB22može biti S ili T; ili
gde XB23može biti S ili L,
gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili nekonzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46.
SEQ ID NO.:194 (3A4 varijanta 1 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh1)
SEQ ID NO.:195 (3A4 varijanta 2 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh2)
SEQ ID NO.:196 (3A4 varijanta 3 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh3)
SEQ ID NO.:197 (3A4 varijanta 4 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh4)
SEQ ID NO: 1983A4 mišji laki (kappa) lanac
SEQ ID NO:1993A4 varijanta 1 humanizovanog lakog (kappa) lanca; Lh1
SEQ ID NO:2003A4 varijanta 2 humanizovanog lakog (kappa) lanca; Lh2
SEQ ID NO:2013A4 mišji težak (Igg1) lanac
SEQ ID NO:2023A4 varijanta 1 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh1
SEQ ID NO:2033A4 varijanta 2 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh2
SEQ ID NO:2043A4 varijanta 3 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh3
SEQ ID NO:2053A4 varijanta 4 humanizovanog teškog (Igg1) lanca: Hh4
SEQ ID NO:206
ATACCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAC SEQ ID NO:207
ATACCCAAGCTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAG SEQ ID NO:208
ATACCCAAGCTTGGGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG SEQ ID NO:209
ATACCCAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG SEQ ID NO:210 pK-CR5
REFERENCE
[0443]
Santana-Davila R. and Perez E.A. (2010) "Treatment options for patients with triple-negative breast cancer" J Hematol Oncol.27:42.
de Ruijter T.C., Veeck J., i dr. (2011) "Characteristics of triple-negative breast cancer." J Cancer Res Clin Oncol.
137:183.
Ismail-Khan R. and Bui M.M. (2010) "A review of Triple-negative breast cancer" Cancer Control 17:173.
Carey L.A., Perou C.M. i dr. (2006) "Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study." JAMA 295:2492.
Krieg M., Seynaeve C. i dr. (2009) "Sensitivity to first-line chemotherapy for metastatic breast cancer in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers." J Clin Oncol 27:3764.
Rouzier R., Perou C.M. i dr. (2005) "Breast cancer molecular subtypes respond differently to preoperative chemotherapy" Clin Cancer Res 11:5678.
Fong P.C., Boss D.S. i dr. (2009) "Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers." N Engl J Med 361:123.
Dent R., Trudeau M i dr. (2007) "Triple-Negative Breast Cancer: Clinical Feature and Patterns of Recurrence" Clin. Cancer Res.13: 4429.
Bernstein L and J.V. Lacey Jr. (2011) "Receptors, Associations, and Risk Factor Differences by Breast Cancer Subtypes: Positive or Negative?" J Natl Cancer Inst 103(6): 451-453 (Advanced publication February 23, 2011). Nofech-Mozes S. i dr., (2009) "Patterns of recurrence in the basal and non-basal subtypes of triple-negative breast cancers" Cancer Res. Treat.118: 131-137.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje je sposobno za specifično vezivanje za antigen 1 povezan sa bubregom (KAAG1) i konjugovan je sa terapeutskom jedinicom za upotrebu u tretmanu trostruko negativnog raka dojke, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži CDRH1 kako je dato u SEQ ID NO.:49, CDRH2 kako je dato u SEQ ID NO.:50 ili u SEQ ID NO.:212, CDRH3 kako je dato u SEQ ID NO.:51, CDRL1 kako je dato u SEQ ID NO.: 52, CDRL2 kako je dato u SEQ ID NO.:53 i CDRL3 kako je dato u SEQ ID NO.: 54.
2. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje za površinu ćelija raka.
3. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuje epitop između aminokiselina 30 do 84 od KAAG1.
4. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, gde su antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, monoklonsko antitelo, himerno antitelo, ljudsko antitelo ili humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
5. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koriste u kombinaciji sa hemoterapeutikom ili citotoksičnim agensom.
6. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:48 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:46.
7. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:186 gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:48 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:191 gde je barem jedna od aminokiselina označenih sa X aminokiselinska supstitucija u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu datom u SEQ ID NO.:46.
8. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5 ili 7, gde je varijabilni region lakog lanca je kako dat u SEQ ID NO.:187 i gde je varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:192.
9. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, 7 ili 8, gde je varijabilni region lakog lanca je kako dat u SEQ ID NO.:188 i gde je varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:193.
10. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5 ili 7 do 9, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži:
a. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.: 189 ili SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:194, SEQ ID NO.:195, SEQ ID NO.:196 ili SEQ ID NO.:197; b. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:194;
c. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:195;
d. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:196;
e. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:189 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:197;
f. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:194;
g. varijabilni region lakog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:190 i varijabilni region teškog lanca kako je dato u SEQ ID NO.:195; ili
h. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.: 199 ili SEQ ID NO.:200 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:202, SEQ ID NO.:203, SEQ ID NO.:204 ili SEQ ID NO.:205.
11. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5 ili 8 do 10, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži;
a. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:199 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:202; b. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:199 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:203; c. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:199 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:204; d. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:199 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:205; e. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:200 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:202; f. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:200 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:203; g. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:200 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:204; ili h. laki lanac kako je dato u SEQ ID NO.:200 i težak lanac kako je dato u SEQ ID NO.:205.
12. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde je terapeutski deo citotoksični agens.
13. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde je terapeutski deo anti-mitotičko jedinjenje.
14. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, ili 8 do 10, gde antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, imaju afinitet od 1nM ili manje ili 0,1nM ili manje za KAAG1.
15. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, 8 do 10, 12 do 14, gde su antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, internalizovani unutar ćelije.
16. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 15, gde se navedeno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koriste sa agensom protiv raka.
RS20190644A 2012-01-09 2013-01-09 Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke RS58918B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261584629P 2012-01-09 2012-01-09
PCT/CA2013/000011 WO2013104050A2 (en) 2012-01-09 2013-01-09 Method for treating breast cancer
EP13735811.5A EP2802351B1 (en) 2012-01-09 2013-01-09 Agents for treating triple negative breast cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58918B1 true RS58918B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=48782004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190644A RS58918B1 (sr) 2012-01-09 2013-01-09 Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke

Country Status (27)

Country Link
US (2) US20170174753A1 (sr)
EP (2) EP3533468A1 (sr)
JP (3) JP6282597B2 (sr)
KR (1) KR102102239B1 (sr)
CN (2) CN111298119A (sr)
AU (1) AU2013209234B2 (sr)
BR (1) BR112014016723A2 (sr)
CA (2) CA2857400A1 (sr)
CY (1) CY1121667T1 (sr)
DK (1) DK2802351T3 (sr)
EA (2) EA034414B1 (sr)
ES (1) ES2731665T3 (sr)
HR (1) HRP20190946T1 (sr)
HU (1) HUE043888T2 (sr)
IL (2) IL232915A0 (sr)
IN (1) IN2014CN04690A (sr)
LT (1) LT2802351T (sr)
MX (2) MX366973B (sr)
NZ (1) NZ625758A (sr)
PL (1) PL2802351T3 (sr)
PT (1) PT2802351T (sr)
RS (1) RS58918B1 (sr)
SI (1) SI2802351T1 (sr)
SM (1) SMT201900350T1 (sr)
TR (1) TR201908872T4 (sr)
WO (1) WO2013104050A2 (sr)
ZA (1) ZA201404798B (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829714A (zh) 2008-11-03 2015-08-12 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 特异性地阻滞肿瘤抗原的生物活性的抗体
RS59080B1 (sr) 2011-03-31 2019-09-30 Adc Therapeutics Sa Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen
LT2802351T (lt) * 2012-01-09 2019-06-25 Adc Therapeutics Sa Agentai, skirti trigubai neigiamo krūties vėžio gydymui
NZ754811A (en) 2017-02-08 2023-06-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201908128D0 (en) 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2022159662A1 (en) * 2021-01-21 2022-07-28 Regenxbio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
CN115873900A (zh) * 2021-12-28 2023-03-31 武汉爱博泰克生物科技有限公司 胞外表达人源Ly6d蛋白的重组表达质粒、重组细胞及构建方法
EP4620979A1 (en) * 2022-11-14 2025-09-24 Cognano, Inc. Antibody and method for producing antibody

Family Cites Families (196)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5075447A (en) 1984-09-17 1991-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Ruthenium complexes useful as carriers for immunologically active materials
DK365785A (da) 1984-09-17 1986-03-18 Hoffmann La Roche Metalcomplexer
US5585279A (en) 1986-01-23 1996-12-17 Davidson; Robert S. Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium
GB8601646D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Davidson R S Binding assay & reagent
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
HUT61296A (en) 1989-12-28 1992-12-28 Upjohn Co Process for producing substituted diaromatic compounds against aids and pharmaceutical compositions comprising same
IL105325A (en) 1992-04-16 1996-11-14 Minnesota Mining & Mfg Immunogen/vaccine adjuvant composition
AU4017695A (en) 1994-10-28 1996-05-23 Procept, Inc. Ruthenium complexes and their use as immunosuppressive agents
US5708022A (en) 1994-10-28 1998-01-13 Procept, Inc. Method for inhibiting immune response
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5831003A (en) 1996-06-28 1998-11-03 Bayer Corporation Peptides which bind to prothrombin and thrombin
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
WO1998058079A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 Krull Ulrich J Nucleic acid biosensor diagnostics
WO1999031513A1 (en) 1997-12-15 1999-06-24 Lakowicz Joseph R Method and composition for characterizing a sample containing a sample lipid and an assay kit
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6472367B1 (en) 1998-05-05 2002-10-29 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion
EP1077989A4 (en) 1998-05-13 2002-01-02 Ludwig Inst Cancer Res ANTIGEN WITH TUMOR ASSOCIATION ENCODED BY THE ANTISENSE STRAND OF A NEW GENE WITH UBIQUISTIC EXPRESSION
PT1078051E (pt) 1998-05-13 2008-03-17 Domantis Ltd Sistema de apresentação em fagos para a selecção de proteínas correctamente organizadas
US7037667B1 (en) 1998-06-01 2006-05-02 Agensys, Inc. Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer
US7521197B2 (en) 1998-06-05 2009-04-21 Alexis Biotech Limited Method for producing cytotoxic T-cells
US20020106678A1 (en) 1998-06-30 2002-08-08 Robishaw Janet D. cDNA clones encoding human G protein gamma subunits
CA2336475A1 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Christopher J. Dinsmore Inhibitors of prenyl-protein transferase
US6288221B1 (en) 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
US6806089B1 (en) 1998-09-08 2004-10-19 University Of Maryland, Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
WO2000014515A1 (en) 1998-09-08 2000-03-16 University Of Maryland At Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
WO2000023448A1 (en) 1998-10-22 2000-04-27 Moheno Phillip B B Novel pterin antineoplastic agents
WO2000025788A1 (en) 1998-10-29 2000-05-11 Merck & Co., Inc. Inhibitors of prenyl-protein transferase
EP1163247A1 (en) 1999-03-19 2001-12-19 Anormed Inc. Pharmaceutical compositions comprising metal complexes
US6872519B1 (en) 1999-04-27 2005-03-29 Mirus Bio Corporation In vitro process for selecting phage resistant to blood inactivation
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
HUP0203954A2 (hu) 1999-09-17 2003-03-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Xa faktor inhibitorok
WO2001046209A1 (en) 1999-12-20 2001-06-28 Fluorrx, Inc. Fluorescent probes
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US7585839B2 (en) 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
US20030215860A1 (en) 2000-02-29 2003-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18636, 2466, 43238, 1983, 52881, 2398, 45449, 50289, 52872 and 26908 molecules and uses therefor
US20030165831A1 (en) 2000-03-21 2003-09-04 John Lee Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
EP1292684A2 (en) 2000-06-16 2003-03-19 Incyte Genomics, Inc. Proteases
AU2002214531A1 (en) 2000-07-03 2002-01-30 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20050053930A1 (en) 2000-07-18 2005-03-10 David Anderson Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
GB0023008D0 (en) 2000-09-20 2000-11-01 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US6783969B1 (en) 2001-03-05 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Cathepsin V-like polypeptides
US7030236B2 (en) 2001-03-09 2006-04-18 Mona Savitri Jhaveri Antisense oligonucleotides tarageting folate receptor alpha, and the use thereof
WO2002071928A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US20030065157A1 (en) 2001-04-04 2003-04-03 Lasek Amy W. Genes expressed in lung cancer
EP2280030A3 (en) 2001-04-10 2011-06-15 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
JP2005527180A (ja) 2001-04-18 2005-09-15 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド 肺がんの診断方法、肺がんの修飾因子の組成及びスクリーニングの方法
WO2002090533A2 (en) 2001-05-07 2002-11-14 National Research Council Of Canada Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
US20040053824A1 (en) 2001-06-29 2004-03-18 Tang Y Tom Extracellular matrix and cell adhesion molecules
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
ES2373644T3 (es) 2001-08-31 2012-02-07 Btg International Limited Uso de derivados de ciclopenta[g]quinazolina para el tratamiento del c�?ncer.
EP2311850A1 (en) 2001-08-31 2011-04-20 BTG International Limited Anti-cancer cyclopenta[g]quinazoline compounds
US7622260B2 (en) 2001-09-05 2009-11-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic and prognostic tests
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
AU2002360403A1 (en) 2001-11-19 2003-06-10 Elan Pharmaceuticals, Inc. (4-phenyl) piperidin-3-yl-phenylcarboxylate derivatives and related compounds as beta-secretase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease
WO2003047526A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Incyte Genomics, Inc. Cell adhesion and extracellular matrix proteins
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
US7803749B2 (en) 2002-01-09 2010-09-28 Xigen Sa Peptide inhibitors of MKK7 kinase binding to insulin binding proteins
ES2291613T3 (es) 2002-01-16 2008-03-01 Biocompatibles Uk Limited Conjugados de polimeros.
AU2003210722B9 (en) 2002-01-28 2008-05-01 Keraplast Technologies, Ltd. Bioactive keratin peptides
US6962910B2 (en) 2002-02-01 2005-11-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Supramolecular complexes as photoactivated DNA cleavage agents
US20050095592A1 (en) 2002-02-13 2005-05-05 Jazaeri Amir A. Identification of ovarian cancer tumor markers and therapeutic targets
DE10206616A1 (de) 2002-02-15 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach Markierungsreaktionen
WO2003075952A1 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
KR100708398B1 (ko) 2002-03-22 2007-04-18 (주) 에이프로젠 인간화 항체 및 이의 제조방법
WO2003087768A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
JP2006508899A (ja) 2002-05-20 2006-03-16 アブジエニツクス・インコーポレイテツド ＥＧＦｒに対する抗体を使用する腎癌の治療方法
JP2006516089A (ja) 2002-10-02 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
EP1422242A1 (en) 2002-11-22 2004-05-26 Emory University Plastic and elastic protein copolymers
KR20050115231A (ko) 2003-02-10 2005-12-07 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 포유동물 세포의 조절
WO2004087874A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2004240765B2 (en) 2003-05-20 2009-03-19 Cellpep Sa Modified antiviral peptides with increased activity and cell membrane affinity
US20070274947A1 (en) 2003-05-21 2007-11-29 Young Aiping H Antisense Oligonucleotides Directed to Ribonucleotide Reductase R1 and Uses Thereof in the Treatment of Cancer
WO2005021710A2 (en) 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US20060078941A1 (en) 2003-06-09 2006-04-13 Santin Alessandro D Gene expression profiling in primary ovarian serous papillary tumors and normal ovarian epithelium
WO2005004795A2 (en) 2003-06-09 2005-01-20 University Of Cincinnati Compositions and methods for targeted drug delivery
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
GB0318096D0 (en) 2003-08-01 2003-09-03 Queen Mary & Westfield College Vaccine
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US20070178458A1 (en) 2003-09-05 2007-08-02 O'brien Philippa Methods of diagnosis and prognosis of ovarian cancer II
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
EP1697389A4 (en) 2003-10-24 2008-12-24 Eisai R&D Man Co Ltd COMPOUNDS AND METHODS FOR TREATING ILLNESS AND SUFFERING TOLL-LIKE RECEPTOR 2 RELATED DISORDERS
US20050153333A1 (en) 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
EP1550458A1 (en) 2003-12-23 2005-07-06 Vectron Therapeutics AG Synergistic liposomal adjuvants
EP1547581A1 (en) 2003-12-23 2005-06-29 Vectron Therapeutics AG Liposomal vaccine for the treatment of human hematological malignancies
CA2551064A1 (en) 2004-01-09 2005-07-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusale M Compounds, pharmaceutical compositions and therapeutic methods of preventing and treating diseases and disorders associated with amyloid fibril formation
US20050202020A1 (en) 2004-01-09 2005-09-15 Jeffrey Ross Diagnosing and treating cancer
AU2005213464A1 (en) 2004-02-06 2005-08-25 Wyeth Diagnosis and therapeutics for cancer
EP2026071B1 (en) 2004-02-19 2013-07-31 Yale University Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
BRPI0507822A (pt) 2004-03-01 2007-07-10 Peptera Pharmaceuticals Ltd método e composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença ou uma condição autoimune ou infecciosa, método e composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença ou uma condição do sangue, método e composição farmacêutica para modular a formação de células do sangue, método e composição farmacêutica para intensificar a mobilização periférico da célula tronco, método e composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença ou uma condição metabólica, método e composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento das condições associadas com doses mieloablativas de quimioradioterapia suportadas pelo transplante autólogo de medula óssea ou de células tronco do sangue periférico (asct) ou pelo transplante alogenéico de medula óssea (bmt), método e composição farmacêutica para aumentar o efeito de um fator estimulante de células do sangue, método e composição farmacêutica para intensificar a colonização de células tronco do sangue doadas em um receptor mieloablatado, método e composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença ou uma condição bacteriana, composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de uma indicação selecionada do grupo que consiste em doença ou condição autoimune, doença viral, infecção viral, doença hematológica, deficiências hematológicas, trombocitopenia, pancitopenia, granulopenia, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, glucosuria, hiperglicemia, diabetes, aids, hiv-1, distúrbios de células t auxiliares, deficiências de células dendrìticas, deficiências de macrofagos, distúrbios de células tronco hematopoiéticas incluindo distúrbios com plaquetas, linfócitos, células do plasma e neutrófilos, condições pré-leucêmicas, condições leucêmicas, distúrbios do sistema imunológico resultantes da terapia de quimioterapia ou de radiação, distúrbios do sistema imunológico humano resultantes do tratamento das doenças de deficiência imunológica e infecções bacterianas, composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de um indicação selecionada do grupo que consiste em doença hematológica, deficiências hematológicas, trombocitopenia, pancitopenia, granulopenia, deficiências de células dendrìticas, deficiências de macrofagos, distúrbios de células tronco hematopoiéticas incluindo distúrbios com plaquetas, linfócitos, células do plasma e neutrófilos, condições pré-leucêmicas, condições leucêmicas, sìndrome mielodisplástiacas, malignidades não mielóides, anemia plástica e insuficiência da medula óssea, peptìdeo purificado, peptìdeo quimérico purificado, peptìdeo quimérico, composição farmacêutica, composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma condição associada com um agente infeccioso de sars, método de processamento a baixa temperatura de hidrolisato proteolìtico de caseìna e hidrolisato de proteìna de caseìna
CA2558767A1 (en) 2004-07-06 2006-01-12 Warwick Effect Polymers Limited Living radical polymerization initiator comprising a functional group capable of reacting with polyeptides or the like, comb polymer obtained therewith, polypeptide conjugates anddrugs obtained therefrom
US7772271B2 (en) 2004-07-14 2010-08-10 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis C
WO2007084413A2 (en) 2004-07-14 2007-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis c
US7553944B2 (en) 2004-07-21 2009-06-30 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
US20080280317A1 (en) 2004-08-27 2008-11-13 Northeastern University Comprehensive Characterization Of Complex Proteins At Trace Levels
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
WO2006027202A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Unite De Recherche En Biotherapie Et Oncologie (Rubio) Generation of multiparent cell hybrids
EP1791544A4 (en) 2004-09-08 2007-09-12 Chelsea Therapeutics Inc CHINAZOLINE DERIVATIVES AS METABOLIC INERT ANTIFOLATE
WO2006044335A2 (en) 2004-10-14 2006-04-27 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Therapy with clostridium perfringens enterotoxin to treat ovarian and uterine cancer
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
AU2005323062A1 (en) 2005-01-04 2006-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Sustained delivery of PDGF using self-assembling peptide nanofibers
WO2006080323A1 (ja) 2005-01-27 2006-08-03 Asahi Kasei Pharma Corporation ヘテロ６員環化合物及びその用途
US7531533B2 (en) 2005-01-27 2009-05-12 Asahi Kasei Pharma Corporation 6-Membered heterocyclic compound and use thereof
NZ613923A (en) 2005-02-14 2015-02-27 Epitopix Llc Antibody compositions that bind polypeptides from staphylococcus aureus
US20090075832A1 (en) 2005-02-24 2009-03-19 Cemines, Inc Compositions and Methods for Classifying Biological Samples
EP1861498A4 (en) 2005-03-17 2009-06-24 Ca Nat Research Council EXPRESSION VECTORS FOR TRANSIENT GENETIC EXPRESSION AND MAMMALIAN CELLS EXPRESSING THE SAME
EP1863800A4 (en) 2005-03-17 2011-05-04 Harvard College SYNTHESIS OF AVRAINVILLAMID, STEPHACIDINE B AND ANALOGUE THEREOF
FR2885525B1 (fr) 2005-05-13 2009-09-18 Urodelia Sa Medicament notamment anti-cancereux, destine a des traitements par immunotherapie, en particulier autologue
NZ565063A (en) 2005-06-13 2011-04-29 Cleveland Biolabs Inc Methods of protecting against apoptosis using lipopeptides
AU2006259415B2 (en) 2005-06-15 2012-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
CA2613517A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Exelixis, Inc. Pyrazole based lxr modulators
WO2007005249A2 (en) 2005-06-29 2007-01-11 Hyperbranch Medical Technology, Inc. Nanoparticles and dendritic-polymer-based hydrogels comprising them
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7820790B2 (en) 2005-07-13 2010-10-26 Amgen Mountain View Inc. IL-6 binding proteins
US20090005268A1 (en) 2005-07-18 2009-01-01 Epigenomics Ag Compositions and Methods for Cancer Diagnostics Comprising Pan-Cancer Markers
GB0516058D0 (en) 2005-08-04 2005-09-14 Oxford Genome Sciences Uk Ltd New protein isoforms and uses thereof
GB0517293D0 (en) 2005-08-24 2005-10-05 Cancer Rec Tech Ltd Vectors and uses thereof
KR101455375B1 (ko) 2005-09-15 2014-10-27 알크-아벨로 에이/에스 알레르겐의 정량 방법
US7576106B2 (en) 2005-10-11 2009-08-18 Chemocentryx, Inc. Piperidine derivatives and methods of use
AU2006303037A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Chromenones and their use as modulators of metabotropic glutamate receptors
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
WO2007059108A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Chemocentryx, Inc. Substituted quinolones and methods of use
EP1954134B1 (en) 2005-11-23 2011-09-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for synthesizing a 2-phenyl-1h-phenantrho[9,10-d]imidazole derivative
KR101049859B1 (ko) 2007-11-28 2011-07-19 대한민국 Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법
MX2008011280A (es) 2006-03-06 2008-09-12 Symphogen As Anticuerpor policlonal recombinante para el tratamiento de infecciones por el virus sincitial respiratorio.
US7781565B2 (en) 2006-03-09 2010-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to profiling a plurality of cells based on peptide binding
AU2007226348A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Warwick Effect Polymers Ltd. Polymers
WO2007110755A1 (en) 2006-03-27 2007-10-04 Medical Therapies Limited Prophylaxis or treatment of cardiovascular inflammation
ATE548380T1 (de) 2006-04-20 2012-03-15 Kringle Pharma Inc Mutante des hgf-precursor-proteins und aktivierte form davon
US20090253156A1 (en) 2006-05-05 2009-10-08 Perkinelmer Las, Inc. Mass spectrometry methods for multiplexed quantification of protein kinases and phosphatases
CA2900402C (en) 2006-05-08 2018-01-16 Adaerata, Limited Partnership Pcsk9 polypeptide, ligand to said polypeptide, kits and methods using said ligands
JP5564249B2 (ja) 2006-06-23 2014-07-30 アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド 癌に関与するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
US20120128661A1 (en) 2006-06-23 2012-05-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotide and polypeptide sequences involved in cancer
US20090297401A1 (en) 2006-06-28 2009-12-03 Rgb Technologies Ab Sensor kit and a system for detecting an analyte in a test environment
US8198046B2 (en) 2006-07-11 2012-06-12 Danisco Us Inc. KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
WO2008011633A2 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
EP2121747A2 (en) 2006-07-27 2009-11-25 Oxford Genome Sciences (UK) Limited New protein isoforms and uses thereof
WO2008016356A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
EP2066806A2 (fr) 2006-09-07 2009-06-10 Laurence Faure Test pharmaco diagnostique ciblant l'oncologie
WO2008033932A2 (en) 2006-09-13 2008-03-20 The Institutes For Pharmaceutical Discovery, Llc Biarylthiazole carboxylic acid derivatives as protein tyrosine phosphatase-ib inhibitors
EP2094715B1 (en) 2006-10-30 2012-08-29 Sanrx Pharmaceuticals, Inc. Dipterinyl calcium pentahydrate (dcp) and therapeutic methods based thereon
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
EP2097534A4 (en) 2006-12-14 2010-05-12 Medarex Inc HUMAN ANTIBODIES BINDING TO CD70 AND USES THEREOF
JP5632582B2 (ja) * 2006-12-14 2014-11-26 中外製薬株式会社 抗Ｃｌａｕｄｉｎ３モノクローナル抗体およびそれを用いる癌の治療および診断
EP2114948B1 (en) 2006-12-28 2014-06-25 AbbVie Inc. Inhibitors of poly(adp-ribose)polymerase
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
CN101631850B (zh) 2007-01-09 2013-12-04 克里夫兰生物实验室公司 增加和转移造血干细胞的方法
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
WO2008124483A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Specigen, Inc. Protein cage immunotherapeutics
WO2009009186A2 (en) 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
JP2010526091A (ja) 2007-04-30 2010-07-29 インテザイン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 癌の処置のための生物学的な標的基の改変
US20080306007A1 (en) 2007-04-30 2008-12-11 Newcastle Innovation Limited Agents for prophylaxis or treatment of neurological related diseases and conditions
US8143372B2 (en) 2007-05-21 2012-03-27 Children's Hospital & Research Center Oakland Synthetic regulators of ferritin protein nanocage pores and methods of use thereof
US20100093554A1 (en) 2007-06-01 2010-04-15 Keting Chu Methods for identifying biomarkers, autoantibody signatures, and stratifying subject groups using peptide arrays
EP2170886A1 (en) 2007-07-02 2010-04-07 Cancer Research Technology Limited 9h-pyrimido[4,5-b]indoles, 9h-pyrido[4',3':4,5]pyrrolo[2,3-d]pyridines, and 9h-1,3,6,9-tetraaza-fluorenes as chk1 kinase function inhibitors
US9018138B2 (en) 2007-08-16 2015-04-28 The Johns Hopkins University Compositions and methods for generating and screening adenoviral libraries
BRPI0817079A2 (pt) 2007-09-07 2016-10-11 Symphogen As processos para fabricação recombinante de anticorpos anti-rsv
US10611818B2 (en) 2007-09-27 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
GB0719644D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
EP2538221A3 (en) 2007-11-05 2013-04-24 Nordic Bioscience A/S Biochemical markers for CVD risk assessment
US20100298368A1 (en) 2007-11-06 2010-11-25 Amira Pharmaceuticals, Inc. Antagonists of pgd2 receptors
EP2071334A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Transmedi SA Compositions and methods of detecting TIABS
WO2009111088A2 (en) 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
AU2009223321A1 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Dnar, Inc. DNA repair proteins associated with triple negative breast cancers and methods of use thereof
WO2009114942A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
WO2009134370A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products relating to gsk3 beta regulation
WO2009151520A2 (en) 2008-05-09 2009-12-17 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible and biodegradable elastomeric polymers
EP2772251B1 (en) 2008-05-26 2021-03-03 Universität Zürich Protamine/RNA nanoparticles for immunostimulation
US20110190227A1 (en) 2008-07-03 2011-08-04 Amira Pharmaceuticals, Inc. Antagonists of Prostaglandin D2 Receptors
US8148088B2 (en) 2008-07-18 2012-04-03 Abgent Regulation of autophagy pathway phosphorylation and uses thereof
CA2730428A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lixte Biotechnology, Inc. Methods for regulating cell mitosis by inhibiting serine/threonine phosphatase
US9126953B2 (en) 2008-08-08 2015-09-08 Synta Pharmaceuticals Corp. Triazole compounds that modulate HSP90 activity
US8680263B2 (en) 2008-09-19 2014-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
EP2344200A2 (en) 2008-09-19 2011-07-20 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CN104829714A (zh) * 2008-11-03 2015-08-12 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 特异性地阻滞肿瘤抗原的生物活性的抗体
WO2011004028A2 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Innate Pharma Tlr3 binding agents
ES2546410T3 (es) * 2009-08-06 2015-09-23 John Wayne Cancer Institute Diagnosis de cáncer de mama, y otros tipos de cáncer, de tipo basal primario y metastásico
WO2011054112A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1
KR101798679B1 (ko) * 2010-03-11 2017-11-16 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. ３중 음성 및 기저형 유방암 치료 시의 ｅｒｂｂ３ 저해제의 용도
US20110233107A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Emily Jainine Lockett Personal Cosmetic Palette
RS59080B1 (sr) 2011-03-31 2019-09-30 Adc Therapeutics Sa Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen
LT2802351T (lt) * 2012-01-09 2019-06-25 Adc Therapeutics Sa Agentai, skirti trigubai neigiamo krūties vėžio gydymui
JP6554959B2 (ja) 2015-07-14 2019-08-07 富士通株式会社 情報処理装置、コンパイル方法、およびコンパイルプログラム

Also Published As

Publication number Publication date
EP2802351A2 (en) 2014-11-19
TR201908872T4 (tr) 2019-07-22
CA2857400A1 (en) 2013-07-18
HRP20190946T1 (hr) 2019-07-26
JP6282597B2 (ja) 2018-02-21
MX2019009121A (es) 2019-09-16
IL254964A0 (en) 2017-12-31
WO2013104050A3 (en) 2015-04-02
US20170174753A1 (en) 2017-06-22
KR102102239B1 (ko) 2020-04-21
EP3533468A1 (en) 2019-09-04
HK1203816A1 (en) 2015-11-06
SMT201900350T1 (it) 2019-07-11
JP6392435B2 (ja) 2018-09-19
CA3115623A1 (en) 2013-07-18
AU2013209234A1 (en) 2014-06-26
ZA201404798B (en) 2020-07-29
MX366973B (es) 2019-08-01
LT2802351T (lt) 2019-06-25
MX2014008410A (es) 2014-12-08
US20190119366A1 (en) 2019-04-25
JP2018203755A (ja) 2018-12-27
EA201491352A1 (ru) 2015-01-30
PT2802351T (pt) 2019-06-27
CN111298119A (zh) 2020-06-19
NZ625758A (en) 2016-05-27
AU2013209234B2 (en) 2017-11-09
JP2018024701A (ja) 2018-02-15
IL232915A0 (en) 2014-07-31
HUE043888T2 (hu) 2019-09-30
JP2015511216A (ja) 2015-04-16
SI2802351T1 (sl) 2019-07-31
EA034414B1 (ru) 2020-02-05
IL254964B (en) 2019-03-31
EP2802351A4 (en) 2016-04-13
CN104955477B (zh) 2020-03-03
BR112014016723A2 (pt) 2018-07-24
WO2013104050A2 (en) 2013-07-18
CN104955477A (zh) 2015-09-30
PL2802351T3 (pl) 2019-11-29
EP2802351B1 (en) 2019-03-27
US11084872B2 (en) 2021-08-10
EA201992513A1 (ru) 2020-05-31
KR20140116093A (ko) 2014-10-01
DK2802351T3 (da) 2019-05-13
IN2014CN04690A (sr) 2015-09-18
CY1121667T1 (el) 2020-07-31
ES2731665T3 (es) 2019-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11084872B2 (en) Method for treating breast cancer
CN106146664B (zh) 针对肾相关抗原1的抗体及其抗原结合片段
HK40013148A (en) Method for treating breast cancer
HK1203816B (en) Agents for treating triple negative breast cancer
HK40011472A (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1238268B (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1238268A1 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1193835B (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1193835A (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof