DE10206616A1 - Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach Markierungsreaktionen - Google Patents
Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach MarkierungsreaktionenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach einer Markierungsreaktion.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach einer Markierungsreaktion Peptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren mit Markierungssubstanzen.
- Zur Quantifizierung oder Identifizierung von Substanzen werden häufigen verwendet. So können beispilesweise Nukleinsäuren mit modifizierten Nukleotiden markiert werden. In anderen Fällen werden markierte Substanzen als Code oder Sensor zur Identifizierung anderer Moleküle oder Prozesse benutzt.
- Um reine markierte Substanzen zu erhalten, werden entsprechend markierte Moleküle als Substrat für Reaktionen eingesetzt. Der Nachteil, der inhärent mit dieser Markierungstechnik verbunden ist, besteht im Lichte der vorliegenden Erfindung darin, dass das markierte Produkt, eine störende "Background-Kontamination" aufweist. Dieses Problem liegt der vorliegenden Erfindung zugrunde.
- Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl von Reinigungsprotokollen bekannt. Diese weisen jedoch alle den Nachteil auf, dass beim Einsatz von markierten Substanzen eine Kontamination dennoch nachweisbar ist.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zustellen, das es ermöglicht, ähnliche Eigenschaften der markierten Reaktanden zu diskriminieren. Mit anderen Worten: es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, Substanzpräparation mit möglichst geringerer Background-Kontamination zur Verfügung zu stellen.
- Bei zahlreichen molekularbiologischen Anwendungen werden Nukleinsäure-Fragmente, Oligonukleotide, Proteine und Peptid beispielsweise mit radioaktiven Verbindungen oder mit Farbstoffen markiert. Die jeweilige Methode für die Markierung wird jedoch beispielsweise von der Länge und der Strängigkeit der Nukleinsäure-Fragmente, von den experimentellen Voraussetzungen und der Nachweisempfindlichkeit bestimmt. Dabei kann die Markierungsreaktion mittels DNA-Polymerasen oder reverser Transkriptasen katalysiert werden.
- Markierte Nukleinsäuren DNA wie auch RNA werden in der molekularbiologischen Klonierung als Reagenz oder als Probe benutzt. Ganz allgemein kann das Markierungsreagenz kovalent and das zu markierende Peptid, Protein oder an die Nukleinsäure gebunden oder mit diesem assoziiert sein.
- Hierbei werden markierte Fragmente von klonierter DNA und/oder Oligonukleotiden von definierter Größe als Reagenz für chemische und enzymatische Sequenzierung, Nuklease S1 Analyse von RNA und in sogenannten Band-shift-Experimenten benutzt. Auf der anderen Seite werden markierte DNA-, RNA- und Oligonukleotid-Proben für Hybridisierungs-Techniken für die Lokalisation und die Bindung von DNAs und RNAs von komplementären Sequenzen benötigt. Diese Techniken schließen Kolonie- und Plaque-Hybridisierung, Southern und Northern Analysen, in sifu Hybridisierungen und Sequenzierung durch Hybridisierungen mit ein.
- In den beschriebenen Fällen ist der Erfolg von einer Einführung der Markierung in DNA oder RNA von Methoden abhängig, wie der Endmarkierung, "Random-priming", Nick- Translation, In vitro Transkription und Variationen der Polymerase Kettenreaktion (PCR) etc.
- Erläuternd sei zunächst beispielhaft auf einige aus dem Stand der Technik bekannte Markierungen von Nukleinsäuren eingegangen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können auch Abwandlungen oder Variationen dieser Methoden wie auch methodisch andere Verfahren eingesetzt werden.
- Mit Hilfe von [γ-32P] ATP erfolgt die radioaktive Markierung einzelsträngiger Hybridisierungsproben oder von DNA zur Sequenzierung nach Maxam-Gilbert. Hierbei wird die y-Phosphatgruppe des ATP durch das Enzym T4-Polynucleotid- Kinase auf die 5'-terminale Hydroxylgruppe des Oligodesoxynucleosidtriphosphats bzw. der DNA katalysiert.
- DNA mit 5' überstehenden Enden kann durch eine Auffüllreaktion des Klenow- Fragmentes der E. coli DNA-Polymerase I an den 3'-Enden oder an einem 3'-Ende radioaktiv markiert werden. Dazu braucht man die [α-32P] Desoxynucleosidtriphosphate, die zu der jeweiligen ersten Base der 5' Einzelstrangenden komplementär sind.
- Bei dieser Methode werden [α-32P] dNTP in DNA durch die 5' ⇐ 3'-Exonuclease sowie die 3' ⇐ 5' Polymerase-Aktivität der DNA-Polymerase I aus E. coli katalysiert. Geringe Mengen von DNase I reichen bei der Anwendung dieser Verfahren aus, um Einzelstrangbrüche (Nicks) als Polymerisationsstartpunkte in die DNA einzuführen.
- Für radioaktiv markierte DNA-Fragmente von 100 bp bis zu mehreren 1000 bp Länge werden nach Denaturierung des zu markierenden DNA-Doppelstranges Hexanucleotide statischer Zusammensetzung als Primer hybridisiert. Nach anschließender Markierung mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I entsteht die Synthese eines neuen Doppelstranges, in Gegenwart eines Desoxynucleotidgemisches sowie des entsprechend markierten Nucleotids.
- Markierte RNA-Sonden hoher spezifischer Aktivität können durch In vitro Transkription klonierter DNA-Fragmente hergestellt werden. Hierfür werden geeignete Klonierungsvektoren (Transkriptionsvektoren), wie z. B. Vektoren der Ribo Gemini Serie pGEM-3 oder pGEM-4 benötigt. Durch diese Vektoren können bei der entsprechenden RNA-Polymerase, durch In-vitro-Transkriptionsreaktionen RNA- Proben gegensätzlicher Orientierung (z. B. "sense" und "antisense") hergestellt werden. Hierzu muss der Vektor stromabwärts der zu amplifizierenden Sequenz linearisiert werden, damit keine RNA-Proben erzeugt werden, die den gesamten Vektor umlaufen ("run-around"-Transkripte). Hierdurch wird nur die gewünschte klonierte Sequenz mit [α-32P]-Nucleotide (ATP oder CTP) markiert.
- Bei Einführung von nichtradioaktiv markierten Substanzen konjugieren chemische Gruppen oder Komponenten, die nicht Bestandteile von Nukleinsäuren sind, mit der Probe über enzymatische oder synthetische Reaktionen. Nach der Hybridisierung mit der Nukleinsäure detektieren geeignete Indikatorsysteme die modifizierten Gruppen der Probe.
- Die ersten nichtradioaktiven Methoden wurden bereits 1980 entwickelt und basieren auf einer Markierung von Nukleinsäure-Probe mit Dinitrophenol, Bromodeoxyuridin und Biotin.
- Die biotinylierten Proben werden nach der Hybridisierung über eine Interaktion mit Streptavidin, das mit einem Reporterenzym konjugiert ist, durch alkalische Phosphatase detektiert.
- Funktionalisierte Nukleotide, wie z. B. biotinylierte, digoxinierte, aminoallylierte oder fluoreszinierte Nucleotide können DNA durch standardisierte enzymatische Techniken, wie Priming random Oligonucleotide, PCR, Nick Translation oder tailing mit terminaler Transferase markieren.
- Nukleinsäuren können mit Biotin und Digoxigenin (DIG) markiert werden, die über eine Nitrophenylazido Gruppe verbunden sind und zu einer photochemischen Reaktion führen. Mit dieser Markierung wird eine Nitrophenylazidogruppe eingeführt, die bei Bestrahlung mit UV Licht reaktive Nitrene abspaltet.
- Die Chemiluminescence ist ein schneller und sensitiver Assay zum Detektieren von DNA. Ein Antikörper gegen die Haptene enthält Strukturen zur spezifischen Erkennung z. B. von Biotin, Fluorescein oder DIG und enthalten z. B. gekoppelt Meerrettich oder alkalische Peroxidase (HRP). Beide gekoppelten Enzyme können bei Reaktionen eingesetzt werden, bei dem Licht emittiert wird oder ein Farbumsatz erfolgt.
- Die Fluoreszenzmarkierung mit Fluorphoren wird vor allem bei Polypeptiden oder kleinen Proteinen, insbesondere bei solchen, die sich weder mit Coomassie Blau noch mit der Silberfärbung nachweisen lassen. Diese Markierung kann alternativ zu Färbetechniken angewandt werden.
- Wie bereits eingangs erwähnt, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die Hintergrund-Kontamination nach erfolgter Markierungsreaktion reduziert wird.
- Es stellt sich daher die Aufgabe ein hohes Hintergrundsignal zu vermeiden, das zu einer geringen Reichweite der Empfindlichkeit und Dynamik der Messungen führt.
- Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, in dem den markierten Substanzen unmittelbar vor oder nach Abschluss der Markierungsreaktion - jedoch vor der Aufreinigung - nicht-markierte Substanzen zu der Reaktionsmischung zugefügt werden.
- Nach dieser Zugabe schließt sich ein an sich aus dem Stand der Technik bekanntes Reinigungsverfahren an. Dabei ist die nicht-markierte Substanz vorzugsweise chemisch, physikalisch oder strukturell mit der zur Markierung eingesetzten Substanz verwandt, bzw. besonders bevorzugt bis auf die eigentliche Markierung identisch.
- Fig. 1 zeigt die Reduktion des Rauschens nach Zugabe von verschiedenen Mengen unmarkierten Reagenzes nach dem Ende der in Beispiel 1 beschriebenen Markierungsreaktion.
- Fig. 2 zeigt das Verhältnis von Signal zu Rauschen (Signal to Noise Ratio) nach der Zugabe von verschiedenen Mengen unmarkierten Reagenzes nach dem Ende der in Beispiel 2 beschriebenen Markierungsreaktion.
- Fig. 3 gibt graphisch die Reduktion der des Rauschen für die Beispiele 1, 2 und 3 wieder.
- Fig. 4 zeigt eine 70-fache Reduzierung des Hintergrundes für das Beispiel 3.
- Weitere Einzelheiten der Erfindung werden in den Beispielen anhand von aufgeführten Beispielen erläutert.
- In diesem Experiment wird die Hintergrund-Kontamination der radioaktiven Nukleotide nach einer Aufreinigung gemessen.
- 10 µCl von 32P-dCTP wird zusammen mit 1 µg polyA + RNA, Standard-Puffer, der in einem pH-Bereich von 7 bis 10 puffert (beispielsweise RT Puffer der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden), 0,1 mM dNTP, 10 U RNase Inhibitor (Promega) und 1 µM oligo-dT15 inkubiert.
- Während dieser Inkubation können keine radioaktiv markierten Nukleotide eingebaut werden, da keine Enzyme zugesetzt werden. Danach wurde das Gemisch für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurde dem Gemisch 10 µl einer Mischung, die nicht markierte Nukleotide von unterschiedlichen Konzentrationen enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen zugegeben. Ein Reaktionsansatz, dem 10 µl Wasser (0 mM dNTP) zugegeben wurde, diente als Kontrollansatz.
- Diese Nukleinsäure-Lösungen, werden über einen Silica Reinigungsschritt (z. B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen, D-40724 Hilden) aufgereinigt. Die RNA bindet während des Reinigungsverfahrens an die Silica Membran. Das so enthaltende Eluat, das keine radioaktiv markierten Nukleotide enthalten sollte, aber aufgereinigte RNA, wird gemessen.
- Hierbei wird eine kontinuierliche Reduktion der Background-Kontamination nach Zugabe von einer 1,7 mM dNTP-, 5 mM dNTP- bis zu einer 10 mM dNTP-Lösung festgestellt.
- In diesem Experiment wird das Signal-Rausch-Verhältnis von eingebauten markierten Substanzen zu nicht-eingebauten markierten Substanzen in Vergleichsreaktionen gemessen.
- 10 µCl von 32P-dCTP werden zusammen mit 1 µg polyA + RNA, Standard-Puffer, der in einem pH-Bereich von 7 bis 10 puffert (beispielsweise RT Puffer der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden), 0,1 mM dNTP, 10 U RNase Inhibitor (Promega) und 1 µM oligo-dT15 inkubiert.
- Ein Teil der Reaktionsansätze enthält Omniscript Reverse Transkriptase (Fa. Qiagen, D-40724 Hilden), während die anderen Reaktionsansätze kein Enzym für den Einbau von radioaktiv markierten Nukleotiden enthielten und damit als Hintergrund-Kontrolle dienten. Diese Gemische werden 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend mit 10 µl einer Mischung, die nicht-markierte Nukleotide von unterschiedlichen Konzentrationen enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen ergänzt. Einem Reaktionsansatz wurden 10 µl Wasser (0 mM dNTP) hinzugegeben. Dieser diente als Kontrollansatz.
- Die Nukleinsäure-Lösungen, werden über einen Silica Reinigungsschritt (z. B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen, D-40724 Hilden) aufgereinigt. Die RNA und radioaktiv markierte cDNA binden während des Reinigungsverfahren an die Silica Membran (QIAGEN). In der Kontroll-Reaktion bindet die RNA an die Silica Membran. Das Eluat, das keine radioaktiv markierten Nukleotide, aber aufgereinigte RNA oder RNA/radioaktiv markierte cDNA enthalten sollte, wird gemessen. Das Signal- Rauschverhältnis im Eluat von eingebauten markierten Substanzen zu nicht- eingebauten markierten Substanzen in Vergleichsreaktionen wurde berechnet.
- Bei Zugabe von nicht-markierten Nukleotiden, nach der Reaktion aber vor der Aufreinigung, erhöhte sich das Signal Rauschverhältnis von 1- auf ein 8-faches.
- In diesem Experiment wird die Hintergrund-Kontamination von markierten Nukleotiden, die Fluorophor-markiert sind, nach der Aufreinigung gemessen.
- 0,1 mM Fluorophor-markierte Nukleotide wurden zusammen mit 0,4 µg DNA und 0,1 mM dNTP in Wasser inkubiert. Fluorophor-markierte Nukleotide konnten nicht eingebaut werden, da keine Enzyme zugesetzt wurden. Diese Gemische werden kurz inkubiert und anschließend mit 10 µl einer Mischung, die nicht-markierte Nukleotide (10 mM) enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen ergänzt. Jeweils einem Reaktionsansatz wurde 10 µl Wasser (0 mM dNTP) zugegeben. Dieser diente als Kontrollansatz.
- Alle Ansätze wurden über einen Silica Reinigungsschritt (z. B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen) aufgereinigt.
- Während des Reinigungsverfahrens bindet die DNA an die Silica Membran. Die optische Dichte des Eluats wurde unter Standard-Bedingungen im Photometer gemessen.
- Gibt man nach der Inkubation, aber vor der Nukleinsäure Aufreinigung dem Ansatz nicht-markierte Nukleotiden zu, erniedrigt sich die Hintergrund-Kontamination um ein bis zu 70-faches.
Claims (5)
1. Verfahren zur Markierung von Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren wobei die
Peptide, Proteine und Nukleinsäuren mit einem Markierungsreagenz umgesetzt
werden und nicht umgesetztes Markierungsreagenz von der markierten
Substanz abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man unmittelbar vor
oder nach dem Ende der Markierungsreaktion Markierungsreagenz
nichtmarkiertes Reagenz zufügt.
2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die
Nukleinsäuren DNA und/oder RNA umfassen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2 dadurch gekennzeichnet, dass
das Markierungsreagenz kovalent an das zu markierende Peptid, Protein oder
die Nukleinsäure gebunden ist oder assoziiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung von
DNA-Polymerase oder Reverser Transkriptase katalysiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das
Konzentrationsverhältnisse des nichtmarkierten Reagenz zum markierten
Reagenz äquimolar bis 1000-fach ist.
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