[go: up one dir, main page]

RS57149B1 - Kloto-beta agonist antitelo za primenu u tretmanu dijabetes melitusa ili otpornosti na insulin - Google Patents

Kloto-beta agonist antitelo za primenu u tretmanu dijabetes melitusa ili otpornosti na insulin

Info

Publication number
RS57149B1
RS57149B1 RS20180480A RSP20180480A RS57149B1 RS 57149 B1 RS57149 B1 RS 57149B1 RS 20180480 A RS20180480 A RS 20180480A RS P20180480 A RSP20180480 A RS P20180480A RS 57149 B1 RS57149 B1 RS 57149B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
klβ
antibodies
binding
cells
Prior art date
Application number
RS20180480A
Other languages
English (en)
Inventor
Luc Desnoyers
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40229367&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57149(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS57149B1 publication Critical patent/RS57149B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A61K31/5685—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone having an oxo group in position 17, e.g. androsterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5032—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on intercellular interactions
    • G01N33/57525—
    • G01N33/5759—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

Opis
POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijave zahteva prioritet SAD prijava patenta br.60/909,699 podneta 2. aprila 2007. i SAD prijava patenta br. 60/916,187 podneta 4. maja 2007.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak se uglavnom odnosi na oblast molekularne biologije. Preciznije, pronalazak se odnosi na upotrebu anti-KLβ agenasa i detektovanje KLβ i/ili FGF19 i/ili FGFR4.
STANJE TEHNIKE
[0003] Kloto beta („KLβ“, „KLB“ ili „beta Kloto“) je 130-kDa tip 1 transmembranski protein sa kratkim (29 aminokiselina) intracelularnim domenom koji nema predviđenu aktivnost kinaze (Ito i dr., Mech. Dev. 98 (2000) 115-119). KLβ ima dva ekstracelularna glikozidazna domena koja nemaju karakterističan ostatak glutaminske kiseline neophodan za enzimsku aktivnost. Klb-deficijentni miševi (Klb-i-miševi) su povećali eksprimiranje CIP7A1 i smanjili veličinu žučne kese, što ukazuje da miševi Klb-I ne mogu više supresovati sintezu žučne kiseline (Inagaki, T. i dr (2005) Cell Metab 2: 217-25). KLβ se pretežno eksprimira u jetri i pankreasu. Id. Poremećaj gena koji kodira KLβ kod miševa dovodi do značajnog povećanja mRNK nivoa holesterola 7alfa-hidroksilaze (CIP7A1), prvog i ograničavajućeg enzima u biosintetičkom putu žučne kiseline. Ito i dr (2005) J Clin Invest 115(8):2202-2208; Arrese i dr (2006) Hepatology 43(1):191-193; Moschetta and Kliewer (2005) J Clin Invest 115(8): 2075-2077.
[0004] Porodica fibroblastnog faktora rasta (FGF) sastoji se od 22 strukturno povezana polipeptida koji se vezuju za 4 receptorske tirozin kinaze (FGFR1-4) i jedan receptor deficijentan kinazom (FGFR5) (Eswarakumar i dr (2005) Cytokine Growth Factor Rev 16, 139-149; Ornitz i dr (2001) Genome Biol 2, REVIEWS3005; Sleeman i dr (2001) Gene 271, 171-182). Interakcija FGF-a sa FGFR1-4 rezultuje homodimerizacijom receptora i autofosforilacijom, upošljavanjem citosolnih adaptera kao što je FRS2 i iniciranjem više signalnih puteva (Powers i dr (2000) Endocr Relat Cancer 7, 165-197; Schlessinger, J. (2004) Science 306, 1506-1507).
[0005] FGF i FGFR igraju važne uloge u razvoju i popravljanju tkiva regulisanjem proliferacije ćelija, migracije, hemotakse, diferencijacije, morfogeneze i angiogeneze (Ornitz i dr (2001) Genome Biol 2, REVIEVS3005; Augustei dr (2003) Cell Tissue Res 314, 157-166; Steiling i dr (2003) Curr Opin Biotechnol 14, 533-537). Nekoliko FGF i FGFR su povezani sa patogenezom raka dojke, prostate, grlića materice, želuca i debelog creva (Jeffers i dr (2002) Expert Opin Ther Targets 6, 469-482; Mattila i dr. (2001) Oncogene 20, 2791-2804; Ruohola i dr. (2001) Cancer Res 61, 4229-4237; Marsh i dr (1999) Oncogene 18, 1053-1060; Shimokawa i dr (2003) Cancer Res 63, 6116-6120; Jang (2001) Cancer Res 61, 3541-3543; Cappellen (1999) Nat Genet 23, 18-20; Gowardhan (2005) Br J Cancer 92, 320-327).
[0006] FGF19 je član najduže od sedam podfamija FGF-a. FGF19 je visoko afinitetni ligand FGFR4 (Xie i dr (1999) Cytokine 11:729-735). FGF19 se obično luči od bilijarnog i crevnog epitela. FGF19 ima ulogu u homeostazama holesterola potiskivanjem eksprimiranja hepatitisa 7-α-hidroksilaze 1 (Cip7α1), brzog ograničavajućeg enzima za holesterol i sintezu žučne kiseline (Gutierrez ct al (2006) Arterioscler Thromb Vasc Biol 26, 301-306; Iu i dr (2000) J Biol Chem 275, 15482-15489; Holt, JA, i dr. (2003) Genes Dev 17 (130):158). Ektopološko eksprimiranje FGF19 u transgenom modelu miša povećava proliferaciju hepatocita, promoviše hepatocelularnu displaziju i dovodi do neoplazije do 10 meseci (Nicholes i dr. (2002). Am J Pathol 160, 2295-2307). Smatra se da mehanizam indukovanog hepatocelularnog karcinoma FGF19 uključuje interakciju FGFR4. Prekomerno eksprimiranje FGF19 u tumorskim tkivima opisano je u zajedničko podnesenom US patentnom prijavom pod serijskim brojem 11/673,411 (podneto 9. februara, 2007). Transgeni miševi koji ekotopski eksprimiraju FGF19, lakši su od divljih miševa iz istog legla, delimično zbog smanjenja belog masnog tkiva. Tomlinson, E i dr. (2002) Endocrinology 143: 1741-1747. Iako FGF19 transgeni miševi imaju povećan unos hrane, oni takođe imaju veću metaboličku brzinu koja je nezavisna od povećanja leptina, IGF-1, hormona rasta ili nivoa tiroidnih hormona. Slično tome, tretman sa FGF-19 povećao je stopu metabolizma i obnavlja dijetetski i leptin deficitarni dijabetes. FGF19 je poboljšao toleranciju glukoze i smanjen serumski insulin, leptin, holesterol i trigliceride. Fu i dr (2004) 145: 2594-2603. Primena rekombinantnog FGF19 kod ob/ob miševa ili prelazak transgenih miševa FGF19 na ob/ob pozadinu rezultovalo je miševima koji su lakši i imaju niži nivo glukoze u serumu i poboljšanu senzitivnost glukoze u poređenju sa ob/ob miševima. Id. FGF-19 je takođe opisan kod, na primer, Harmer i dr (2004) Biochemistry 43: 629-640.
[0007] FGFR4 eksprimiranje je široko rasprostranjeno i prijavljeno je u razvoju skeletnih mišića, jetre, pluća, pankreasa, nadbubrežne žlezde, bubrega i mozga (Kan i dr. (1999) J Biol Chem 274, 15947-15952; Nicholes i dr. (2002). Am J Pathol 160, 2295-2307; Ozawa i dr. (1996) Brain Res Mol Brain Res 41, 279-288; Stark i dr (1991) Development 113, 641-651). Amplifikacija FGFR4 prijavljena je kod adenokarcinoma dojke i jajnika (Jaakkola i sar (1993) Int J Cancer 54, 378-382). FGFR4 mutacija i skraćivanje su u korelaciji sa malignitetom, i u nekim slučajevima prognozom adenokarcinoma prostate i plućna, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, sarkoma mekog tkiva, astrocitoma i adenomima hipofize (Jaakkola i dr (1993) Int J Cancer 54, 378-382; Morimoto (2003) Cancer 98, 2245-2250; Qian (2004) J Clin Endocrinol Metab 89, 1904-1911; Spinola i dr. (2005) J Clin Oncol 23, 7307-7311; Streit i dr (2004) Int J Cancer 111, 213-217; Wang (1994) Mol Cell Biol 14, 181-188; Yamada (2002) Neurol Res 24, 244-248). Prekomerno FGFR4 eksprimiranje u tumorskim tkivima je opisano kod WO2007/13693.
[0008] Jasno je da i dalje postoji potreba za agensima koji imaju kliničke atribute koji su optimalni za razvoj kao terapeutski agensi. Ovde opisani pronalazak zadovoljava ovu potrebu i pruža druge pogodnosti.
SAŽETAK PRONALASKA
[0009] Ovde se demonstrira da je FGF19 potreban KLβ za vezivanje na FGFR4, nizvodna signalizacija FGFR4 i nizvodna modulacija gena. Prema tome, demonstrirano je da KLβ i njegova interakcija sa FGFR mogu biti jedinstveni i pogodni cilj za veće fino podešavanje u dizajniranju profilaktičkih i/ili terapijskih pristupa protiv patoloških stanja povezanih sa abnormalnom ili neželjenom signalizacijom puta FGF/FGFR. Prema tome, predmetna objava pruža postupke, sastave, komplete i predmete proizvodnje za identifikaciju i korišćenje supstanci koje su sposobne za moduliranje FGF/FGFR puteva kroz modulaciju vezivanja KLβ na FGFR i modulaciju vezivanja KLβ na FGF i za modulaciju bioloških/fiziološke aktivnosti povezane sa signalizacijom FGF/FGFR. KLβ predstavlja važan i povoljan terapijski cilj, a predmetna objava daje sastave i postupke zasnovane na vezivanju KLβ. KLβ vezujući agensi, kao što je ovde opisano, pružaju važne terapeutske i dijagnostičke agense za primenu u ciljanim patološkim stanjima povezanim sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću puteva KLβ-FGF-FGFR.
[0010] U jednom aspektu, objava sadrži postupke, sastave, komplete i predmete proizvodnje povezane sa vezivanjem KLβ i detektovanjem KLβ i/ili FGF19 i/ili FGFR4 vezivanja.
[0011] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke i sastave korisne za modulaciju bolesnih stanja povezanih sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ, kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost ili neželjeno eksprimiranje i/ili aktivnost, gde navedeni postupci obuhvataju primenu efikasne doze KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0012] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje tumora, raka ili proliferativnog poremećaja ćelija, koji obuhvata davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim otelotvorenjima tumor, kancer ili proliferativni poremećaj ćelija je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0013] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke ubijanja ćelije (kao što je rak ili tumorska ćelija), gde postupci obuhvataju davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija hepatocelularnog karcinoma ili ćelija raka pankreasa. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija jetre ili pankreasa.
[0014] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za smanjenje, inhibiranje, blokiranje ili sprečavanje rasta tumora ili kancera, gde postupci obuhvataju davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim otelotvorenjima tumor, kancer ili proliferativni poremećaj ćelija je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0015] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje i/ili sprečavanje poremećaja jetre, gde postupci obuhvataju davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim otelotvorenjima poremećaj jetre je ciroza.
[0016] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za tretiranje poremećaja iscrpljivanja koji obuhvata davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelije.
[0017] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje hipoglikemije koji obuhvata davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0018] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje holestaze ili disregulacije metabolizma žučne kiseline koji obuhvata davanje efikasne količine KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0019] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje gojaznosti ili stanja povezanog sa gojaznošću koji obuhvataju davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman. U nekim aspektima stanje povezano sa gojaznošću je dijabetes melitus, kardiovaskularna bolest, insulinska rezistencija, hipertenzija, hiperholesterolemija, tromboembolijska bolest (kao što je moždani udar), ateroskleroza, dislipidemija (na primer, visok nivo ukupnog holesterola ili visokih nivoa triglicerida), osteoartritis, bolest žučne kese, osteoartritis i apneja u spavanju i drugi respiratorni poremećaji.
[0020] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za indukovanje povećanja osetljivosti na insulin koji obuhvataju davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0021] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za smanjenje ukupne telesne mase koji obuhvataju davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0022] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje hiperglikemije koja obuhvata davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0023] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke za smanjenje najmanje jednog od nivoa triglicerida i slobodnih masnih kiselina koji obuhvataju davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0024] Postupci predmetne objave mogu se koristiti da utiču na bilo koje pogodno patološko stanje. Primeri poremećaja su ovde opisani.
[0025] U jednom otelotvorenju, ćelija koja je ciljana u postupku je ćelija raka. Na primer, ćelija raka može biti jedna od grupa koja se sastoji od ćelija hepatocelularnog karcinoma ili ćelije raka pankreasa. U jednom otelotvorenju, ćelija koja je ciljana u postupku pronalaska je hiperproliferativna i/ili hiperplastična ćelija. U jednom otelotvorenju, ćelija koja je ciljana u postupku pronalaska je displastična ćelija. U još jednom otelotvorenju, ćelija koja je ciljana u postupku pronalaska je metastatska ćelija. U jednom otelotvorenju, ciljana ćelija je cirotička ćelija jetre.
[0026] Postupci mogu dodatno da sadrže dodatne korake lečenja. Na primer, u jednom otelotvorenju, postupak dalje sadrži korak u kom je ciljana ćelija i/ili tkivo (npr., ćelija raka) izložena zračenju ili hemoterapeutskom agensu.
[0027] KLβ antagonisti i agonisti su poznati u struci i neki su opisani i prikazani ovde. U nekim otelotvorenjima, KLβ antagonist je molekul koji se vezuje za KLβ i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa jedan ili više aspekata KLβ-pridruženog efekta.
[0028] U nekim otelotvorenjima, KLβ antagonist je antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je poliklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od himernog antitela, zrelog antitela afiniteta, humanizovanog antitela i ljudskog antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo je fragment antitela. U nekim otelotvorenjima antitelo je Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'),2, ili scFv.
[0029] U jednom aspektu, antitelo je himerno antitelo, na primer, antitelo koje sadrži sekvence vezivanja antigena od donjeg ne-ljudska prikrivenog na heterolognu ne-ljudsku, ljudsku ili humanizovanu sekvencu (npr., sekvence okvirnog i/ili konstantnog domena). U jednom aspektu donor koji nije čovek je miš. U jednom otelotvorenju, sekvenca vezivanja antigena je sintetička, npr. dobijena mutagenezom (npr., skrining prikaza faga, itd.). U jednom aspektu, himerno antitelo ima mišje V regije i ljudsku C regiju. U jednom aspektu, područje V regije mišjeg lakog lanca je spojeno sa ljudskim kappa lakim lancem. U jednom otelotvorenju, V regija mišjeg teškog lanca je spojena sa ljudskim IgG1 C regijom.
[0030] Humanizovana antitela korisna u postupcima pronalaska uključuju ona koji imaju aminokiselinske supstitucije u FR i varijante sazrevanja afiniteta sa promenama u graftovanim CDR-ma. Supstituisane aminokiseline u CDR ili FR nisu ograničene na one prisutne u donoru ili primaocu antitela. U drugim otelotvorenjima antitela dalje sadrže promene u aminokiselinskim ostacima u Fc regiji koje dovode do poboljšane efektorske funkcije uključujući poboljšanu CDC i/ili ADCC funkciju i ubijanje B-ćelija. Druga antitela uključuju ona koja imaju specifične promene koje poboljšavaju stabilnost. U drugim otelotvorenjima korisna antitela sadrže promene u aminokiselinskim ostacima u Fc regiji koji dovode do smanjene efektorske funkcije, npr. smanjena CDC i/ili ADCC funkcija i/ili smanjeno ubijanje B ćelija. U nekim otelotvorenjima, antitela se karakterišu smanjenjem vezivanja (kao što je odsustvo vezivanja) za ljudski faktor komplementa C1q i/ili ljudski Fc receptor na ćelijama prirodnim ubicama (NK). U nekim otelotvorenjima, antitela se karakterišu smanjenjem vezivanja (kao što je odsustvo vezivanja) na ljudske FcγRI, FcγRIIA i/ili FcγRIIIA. U nekim otelotvorenjima antitelo ima IgG klasu (npr. IgG1 ili IgG4) i sadrži najmanje jednu mutaciju u E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 i/ili P329 (numerisanje prema EU indeksu). U nekim otelotvorenjima antitela sadrže mutaciju L234A/L235A ili D265A/N297A.
[0031] U jednom aspektu, KLβ antagonist je polipeptid anti-KLβ koji sadrži bilo koju od antigen vezujućih sekvenci koje su ovde navedene, pri čemu se anti-KLβ polipeptidi specifično vezuju za KLβ.
[0032] U jednom aspektu, KLβ antagonist je imunokonjugat (zamenljivo obeležen kao „antitelo-lek konjugat“ ili „ADC“) koji sadrži polipeptid anti-KLβ (kao anti-KLβ antitelo) konjugovan sa agensom, kao što je lek.
[0033] U jednom aspektu, KLβ antagonist je KLβ siRNK. Primeri KLβ siRNK su ovde opisani.
[0034] U nekim otelotvorenjima, KLβ antagonist može modulirati jedan ili više aspekata Klβ-povezanih efekata, uključujući, ali ne ograničavajući se na vezivanje FGFR (npr. FGFR4) (opciono u spoju sa heparinom), vezujući FGF (npr. FGF19) (opciono u konjukciji sa heparinom), vezujući FGFR4 i FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), promovišući indukciju cFos, Junb i/ili June (in vitro ili in vivo) posredstvom FGF19, promovišući signalizaciju FGFR4 i/ili FGF19 nizvodno (uključujući, ali ne ograničavajući se na FGFR fosforilaciju, FRS2 fosforilaciju, ERK1/2 fosforilaciju i aktivaciju putanje Wnt) i/ili promovisanje bilo koje biološki relevantne KLβ i/ili FGFR i/ili FGF biološkog puta i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili rak; i/ili promovisanje poremećaja povezanih sa KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću (kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost KLβ). U nekim otelotvorenjima, antagonist se vezuje (kao što je specifično vezivanje za KLβ). U nekim otelotvorenjima, antagonist se vezuje za FGFR (kao što je FGFR4) vezujuću regiju KLβ. U nekim otelotvorenjima, antagonist se vezuje za FGF (npr., FGF19) vezujuću regiju KLβ. U nekim otelotvorenjima, antagonist smanjuje, inhibira i/ili blokira KLβ aktivnost in vivo i/ili in vitro. U nekim otelotvorenjima, antagonist se nadmeće za vezivanje sa FGFR4 (smanjuje i/ili blokira vezivanje FGFR4 na KLβ). U nekim otelotvorenjima, antagonist se nadmeće za vezivanje sa FGF19 (smanjuje i/ili blokira vezivanje FGF19 na KLβ).
[0035] U drugom aspektu, predmetna objava pruža sastav koji sadrži jedan ili više KLβ antagonist (kao što je anti-KLβ antitelo) i nosač. Ovaj sastav može dalje sadržati drugi lek, pri čemu je KLβ antagonist prvi medikament. Ovaj drugi lek, na primer, za lečenje karcinoma može biti drugi KLβ antagonist (kao što je anti-KLβ antitelo), hemoterapeutski agens, citotoksični agens, anti-angiogeni agens, imunosupresivni agens, prolek, citokin, citokinski antagonist, citotoksična radioterapija, kortikosteroid, anti-emetik, vakcina protiv raka, analgetik, agens protiv vaskularnog ili inhibitora rasta. U drugom otelotvorenju, drugi medikament se daje pacijentu u efikasnoj količini, gde je antitelo prvi lek. Ovaj drugi medikament je više od jednog leka, a poželjno je još jedno antitelo, hemoterapeutski agens, citotoksični agens, anti-angiogeni agens, imunosupresivni agens, prolek, citokin, antagonist citokina, citotoksična radioterapija, kortikosteroid, anti-emetik, vakcina protiv raka, anti-vaskularni agens ili agens za inhibiranje rasta. Specifičniji agensi uključuju, na primer, irinotekan (CAMPTOSAR®), cetuksimab (ERBITUX®), fulvestrant (FASLODEX®), vinorelbin (NAVELBINE®), antagoniste EFG receptora kao što su erotinib (TARCEVA®), VEGF antagonisti kao što je bevacizumab (AVASTIN®), vinkristin (ONCOVIN®), inhibitori mTor (serin/treonin protein kinaza), kao što su rapamicin i CCI-779, i anti-HER1, HER2, ErbB i/ili EGFR antagonisti kao što su trastuzumab (HERCEPTIN®) pertuzumab (OMNITARG™) ili lapatinib i drugi citotoksični agensi uključujući hemoterapeutske agense. U drugom obliku, drugi medikament je antiestrogeni lek, kao što je tamoksifen, fulvestrant ili inhibitor aromataze, antagonist vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) ili ErbB ili Efb receptor, ili Her-1 ili Her-2. U nekim otelotvorenjima drugi medikament je tamokifen, letrozol, eksemestan, anastrozol, irinotekan, cetuksimab, fulvestrant, vinorelbin, erlotinib, bevacizumab, vinkristin, imatinib, sorafenib, lapatinib ili trastuzumab, a poželjno je drugi medikament erlotinib, bevacizumab, ili trastuzumab.
[0036] U jednom aspektu, predmetna objava pruža predmet proizvodnje koji sadrži kontejner; i sastav sadržan u kontejneru, pri čemu sastav sadrži jedan ili više KLA antagonist (kao što je anti-KLβ antitelo). U jednom otelotvorenju, sastav koja sadrži KLβ antagonist dalje sadrži nosač, koji je u nekim otelotvorenjima farmaceutski prihvatljiv. U jednom aspektu, predmet proizvodnje pronalaska dalje sadrži uputstva za davanje sastava (npr., anti-KLβ antitela) pojedincu (kao što su uputstva za bilo koji od postupaka koji su ovde opisani).
[0037] U jednom aspektu, predmetna objava pruža komplet koji sadrži prvi kontejner koji sadrži sastav koji sadrži jedan ili više antagonista anti-KLβ; i drugi kontejner koji sadrži pufer. Ovaj sastav može dalje sadržati drugi lek, pri čemu je KLβ antagonist prvi medikament. Primerni drugi medikamenti su opisani iznad i na drugim mestima ovde. U jednom otelotvorenju, pufer je farmaceutski prihvatljiv. U jednom otelotvorenju, sastav koja sadrži antitelo dalje sadrži nosač, koji je u nekim otelotvorenjima farmaceutski prihvatljiv. U jednom otelotvorenju, komplet dalje sadrži uputstva za davanje sastava (npr. antitela) pojedincu.
[0038] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za detektovanje KLβ, gde postupci uključuju detektovanje KLβ u uzorku (kao što je biološki uzorak). Izraz „detektovanje“ koji se koristi ovde obuhvata kvalitativnu i/ili kvantitativnu detektovanje (nivoi merenja) sa ili bez pozivanja na kontrolu. U jednom otelotvorenju biološki uzorak je od pacijenta koji ima ili se sumnja da ima tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelije, kao što je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, karcinom ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni karcinom U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je iz tumora. U nekim otelotvorenjima biološki uzorak eksprimira FGF (npr., FGF19) i/ili FGFR (npr., FGFR4).
[0039] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za detektovanje poremećaja koji su povezani sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ, gde postupci obuhvataju detektovanje KLβ u biološkom uzorku pojedinca. U nekim otelotvorenjima, KLβ eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima poremećaj je tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelije, kao što je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor.
[0040] U drugom aspektu, predmetna objava daje postupke za detektovanje poremećaja koji su povezani sa FGFR4 i KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću, gde postupci obuhvataju detektovanje FGFR4 i KLβ u biološkom uzorku pojedinca. U nekim otelotvorenjima, KLβ eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima, FGFR4 eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima poremećaj je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, kancer ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor. U nekim otelotvorenjima, FGFR4 eksprimiranje se detektuje u prvom biološkom uzorku, i KLβ eksprimiranje se detektuje u drugom biološkom uzorku.
[0041] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za detektovanje poremećaja koji su povezani sa FGF19 i KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću, gde postupci obuhvataju detektovanje FGF19 i KLβ u biološkom uzorku pojedinca. U nekim otelotvorenjima, KLβ eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje FGF19 je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima ovaj poremećaj je tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelija, kao što je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje FGF19 je detektovana u prvom biološkom uzorku, i KLβ eksprimiranje je otkrivena u drugom biološkom uzorku.
[0042] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za detektovanje poremećaja povezanih sa FGFR4, FGF19 i KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću, gde postupci obuhvataju detektovanje FGFR4, FGF19 i KLβ u biološkom uzorku pojedinca. U nekim otelotvorenjima, KLβ eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima, FGFR4 eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim aspektima, poremećaj je tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelije, kao što je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili iz tumora. U nekim otelotvorenjima FGFR4 eksprimiranje je detektovana u prvom biološkom uzorku, eksprimiranje FGF19 je detektovana u drugom biološkom uzorku, i KLβ eksprimiranje je detektovana u trećem biološkom uzorku.
[0043] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje pojedinca koji ima ili se sumnja da ima kancer, tumor i/ili proliferativni poremećaj ćelije ili poremećaj jetre (kao što je ciroza) davanjem efikasne količine KLβ antagonista ( npr. anti-KLβ antitelo), pri čemu biološki uzorak raka, tumora i/ili poremećaja ćelija ili poremećaja jetre eksprimira (i) KLβ, (ii) KLβ i FGFR4, (iii) KLβ i FGF19, ili (iv) KLβ, FGFR4 i FGF19. U nekim otelotvorenjima, rak tumor i/ili ćelijski proliferativni poremećaj ili poremećaj jetre su hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0044] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje pojedinca koji ima ili se sumnja da ima kancer, tumor i/ili proliferativni poremećaj ćelije ili poremećaj jetre (kao što je ciroza) primenom efikasne količine antagonista FGF19 ( npr. anti-FGF19 antitelo), pri čemu biološki uzorak poremećaja raka, tumora i/ili ćelija ili poremećaja jetre eksprimira (i) KLβ, (ii) KLβ i FGFR4, (iii) KLβ i FGF19, ili (iv) KLβ, FGFR4 i FGF19. U nekim otelotvorenjima, poremećaj raka, glasina i/ili ćelijskog proliferativnog poremećaja ili poremećaja jetre je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak nemalih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0045] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje pojedinca koji ima ili se sumnja da ima kancer, tumor i/ili proliferativni poremećaj ćelije ili poremećaj jetre (kao što je ciroza) primenom efikasne količine antagonista FGFR4 ( npr. anti-FGFR4 antitela), pri čemu biološki uzorak poremećaja raka, tumora i/ili ćelija ili poremećaja jetre eksprimira (i) KLβ, (ii) KLβ i FGFR4, (iii) KLβ i FGF19, ili (iv) KLβ, FGFR4 i FGF19. U nekim otelotvorenjima, poremećaj raka, glasina i/ili ćelijskog proliferativnog poremećaja ili poremećaja jetre je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak nemalih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0046] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za odabir lečenja pojedinca, gde postupci sadrže: (a) određivanje (i) Klβ eksprimiranja, (ii) KLβ i FGF19 eksprimiranja, (iii) KLβ i FGFR4 eksprimiranja ili (iv) KLβ, FGF19 i FGFR4 eksprimiranja, ako ih ima, u biološkom uzorku pojedinca; i (b) posle koraka (a), odabira tretmana za pojedinca, pri čemu se izbor terapije zasniva na eksprimiranju određenom u koraku (a). U nekim otelotvorenjima se određuje povećano KLβ eksprimiranje u biološkom uzorku pojedinca u odnosu na referentnu vrednost ili kontrolni uzorak. U nekim otelotvorenjima, smanjeno KLβ eksprimiranje u biološkom uzorku pojedinca u odnosu na referentnu vrednost ili kontrolni uzorak se određuje kod pojedinca. U nekim otelotvorenjima se određuje KLβ eksprimiranje i izabrana je terapija anti-KLβ antitelom. U nekim otelotvorenjima se određuje KLβ eksprimiranje i bira se tretman sa FGF19 antagonistom (kao što je anti-FGF19 antitelo). U nekim otelotvorenjima se određuje KLβ eksprimiranje i bira se tretman sa FRFR4 antagonistom (kao što je anti-FGFR4 antitelo). FGFR4 antagonisti su poznati u struci. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelije, kao što je hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, rak ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
[0047] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje pojedinca koji ima ili se sumnja da ima kancer, tumor i/ili proliferativni poremećaj ćelije ili poremećaj jetre (kao što je ciroza) davanjem efikasne količine anti-KLβ antitela dalje, u kojoj (i) KLβ eksprimiranje, (ii) KLβ i FGF19 eksprimiranje, (iii) KLβ i FGFR4 eksprimiranje, ili (iv) KLβ, FGF19 i FGFR4 eksprimiranje se određuje u biološkom uzorku pojedinca pre, tokom ili nakon primene anti-KLβ antitelo. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je raka, tumora i/ili proliferativnog poremećaja ćelija. U nekim otelotvorenjima biološki uzorak je serum. U nekim otelotvorenjima, KLβ over-eksprimiranje se određuje pre, tokom i/ili nakon primene anti-KLβ antitela. U nekim otelotvorenjima, FGFR4 eksprimiranje se određuje pre, tokom i/ili nakon primene anti-KLβ antitela. Izraz se može prethodno utvrditi; u toku; posle; pre i tokom; pre i posle; tokom i nakon; ili pre, tokom i nakon primene anti-KLβ antitela.
[0048] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za lečenje pojedinca koji ima ili se sumnja da ima kancer, tumor i/ili proliferativni poremećaj ćelije ili poremećaj jetre (kao što je ciroza) davanjem efikasne količine anti-FGF19 antitela dalje, gde (i) KLβ eksprimiranje, (ii) KLβ i FGF19 eksprimiranje, (iii) KLβ i FGFR4 eksprimiranje, ili (iv) KLβ, FGF19 i FGFR4 eksprimiranje se određuje u biološkom uzorku pojedinca pre, tokom ili nakon primene anti-FGF 19 antitela. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je uzorak raka, tumora i/ili proliferativnog poremećaja ćelija. U nekim otelotvorenjima biološki uzorak je serum. U nekim otelotvorenjima, KLβ prekomerno eksprimiranje se određuje pre, tokom i/ili nakon primene antitela FGF 19. U nekim otelotvorenjima, FGFR4 eksprimiranje se određuje pre, tokom i/ili nakon primene antitela FGF 19. Eksprimiranje se može prethodno utvrditi; u toku; posle; pre i tokom; pre i posle; tokom i nakon; ili pre, tokom i nakon primene anti-FGF 19 antitela. Anti-FGF 19 antitela i postupci lečenja koji sadrže upotrebu anti-FGF 19 antitela su opisani u zajedničko podnesenoj US patentnoj prijavi pod serijskim brojem 11/673,411 (podneto 9. februara, 2007).
[0049] U otelotvorenjima koji uključuju detektovanje, FGFR4 eksprimiranje nizvodne molekularne signalizacije može se detektovati pored ili kao alternativa detektovanju FGFR4 eksprimiranja. U nekim otelotvorenjima detektovanje nizvodnog FGFR4 molekularne signalizacije obuhvata jedno ili više detektovanje fosforilacije MAPK, FRS2 ili ERK1/2 (ili ERK1 i/ili ERK2).
[0050] U nekim otelotvorenjima koja uključuju detektovanje, FGFR4 eksprimiranje obuhvata detektovanje brisanja FGFR4 gena, amplifikaciju gena i/ili mutaciju gena. U nekim otelotvorenjima koji uključuju detektovanje, KLβ eksprimiranje obuhvata detektovanje brisanja KLβ gena, amplifikaciju gena i/ili mutaciju gena. U nekim otelotvorenjima koja uključuju detektovanje, eksprimiranje FGF19 obuhvata detektovanje brisanja FGF19 gena, amplifikaciju gena i/ili mutaciju gena.
[0051] Neka otelotvorenja koja uključuju detektovanje dalje obuhvataju detektovanje aktivacije Wnt puta. U nekim otelotvorenjima, detektovanje aktivacije Wnt puta sadrži jednu ili više fosforilacija tirozina β-katenina, eksprimiranje Wnt ciljanih gena, mutacije β-katenina i vezivanja E-kaderina za βkatenin. detektovanje aktivacije putanje Wnt je poznata u struci, a neki od primera su opisani i prikazani ovde.
[0052] Biološki uzorci su ovde opisani, npr., u definiciji biološkog uzorka. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor.
[0053] U otelotvorenjima koji uključuju detektovanje KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranja može se detektovati KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje polinukleotida i/ili KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19. U nekim otelotvorenjima koja uključuju detektovanje KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranja, detektuje se KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje mRNK. U drugim otelotvorenjima, KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje polipeptida se detektuje korišćenjem anti-KLβ agensa i/ili agensa protiv FGFR4. U nekim otelotvorenjima, KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje polipeptida se detektuje koristeći antitelo. Bilo koje pogodno antitelo može se koristiti za detektovanje i/ili dijagnozu, uključujući monoklonska i/ili poliklonska antitela, ljudsko antitelo, himerno antitelo, antitelo srazmerno afinitetu, humanizovano antitelo i/ili fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo anti-KLβ opisano ovde se koristi za detektovanje. U nekim otelotvorenjima, KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje polipeptida se detektuju primenom imunohistohemije (IHC). U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje polipeptida se boduje sa 2 ili više koristeći IHC.
[0054] U nekim aspektima koji uključuju detektovanje KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranja, može se detektovati prisustvo i/ili odsustvo i/ili nivo KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranja. KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranje se mogu povećati. Podrazumeva se da odsustvo KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 eksprimiranja uključuje beznačajne ili de minimus nivoe. U nekim otelotvorenjima ciljno eksprimiranje u biološkom uzorku testa je veće od onog koje je primećena za kontrolni biološki uzorak (ili kontrolni ili referentni nivo eksprimiranja). U nekim otelotvorenjima ciljano eksprimiranje je najmanje oko 2 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 75 puta, 100 puta, 150 puta više, ili više u biološkom uzorku testa nego u kontrolnom biološkom uzorku. U nekim otelotvorenjima ciljno eksprimiranje polipeptida se određuje u testu imunohistohemije („IHC“) kako bi se postiglo najmanje 2 ili više za intenzitet bojenja. U nekim otelotvorenjima ciljno eksprimiranje polipeptida se određuje u IHC testu kako bi se postiglo najmanje 1 ili više ili najmanje 3 ili više za intenzitet bojenja. U nekim otelotvorenjima ciljno eksprimiranje u biološkom uzorku testa je niže od onog koje je primećeno za kontrolni biološki uzorak (ili kontrolni nivo eksprimiranja).
[0055] U jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke identifikacije inhibitora supstance koja inhibira vezivanje KLβ na FGFR (npr., FGFR4), navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir kandidat supstance sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR, FGF (npr. FGF19 ) i KLβ, i (b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom biološke aktivnosti FGFR u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ, FGF i FGFR kao prvi uzorak ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutim kandidatom, pri čemu smanjenje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom ukazuje na to da je potencirana supstanca sposobna da inhibira vezivanje KLβ na FGFR.
[0056] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke identifikacije inhibitora supstance koja inhibira vezivanje KLβ na FGFR (npr. FGFR4), gde navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir kandidat supstance sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR, FGF i KLβ i (b) upoređivanje količine kompleksa FGFR-KLβ u uzorku sa količinom FGFR-KLβ kompleksa u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ, FGF i FGFR kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutom kandidat supstancom, pri čemu smanjenje količine FGFR-KLβ kompleksa u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom ukazuje na to da je supstanca koja je kandidat sposobna da inhibira vezivanje KLβ na FGFR.
[0057] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke utvrđivanja da li kandidat supstanca inhibira vezivanje KLβ na FGFR (npr., FGFR4), gde navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir supstance koja se kandiduje sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR, FGF i KLβ i ( b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom biološke aktivnosti FGFR u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ, FGF i FGFR kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutom kandidat supstancom, pri čemu smanjenje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom ukazuje na to da je kandidat supstanca sposobna da inhibira vezivanje KLβ na FGFR.
[0058] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke za utvrđivanje da li kandidat supstanca inhibira vezivanje FGF na KLβ, gde navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir kandidat supstance sa prvim uzorkom koji sadrži FGF, FGFR i KLβ, i (b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom biološke aktivnosti FGFR u referentnom uzorku koji sadrži slične količine FGF, FGFR i KLβ kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutom kandidat supstancom, pri čemu smanjenje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom ukazuje na to da je kandidat supstanca sposoban da inhibira KLβ.
[0059] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke utvrđivanja da li kandidat supstanca promoviše biološku aktivnost KLβ, pri čemu navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir kandidata sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR i KLβ, i (b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom biološke aktivnosti FGFR u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ i FGFR kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa navedenom kandidat supstancom, pri čemu povećanje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom pokazuje da je kandidat supstanca sposobna da promeni vezivanje KLβ na FGFR.
[0060] Biološke aktivnosti FGFR su ovde opisane. U nekim otelotvorenjima FGFR, FGF, KLβ su u količini koja je efikasna za FGFR biološku aktivnost.
KRATAK OPIS SLIKA
[0061]
SLIKA 1: KLβ formira kompleks sa FGF19, FGFR4 i heparinom. (A) FGF19 (0,5 μg), heparin (0,5 μg) i različiti fuzioni proteini FGFR-Fc (0,5 μg) su inkubirani u KlβΔTM kondicioniranom medijumu tokom 18 sati na 4°C. Interakcije proteina su određene proteinskim A-agaroznim taloženjem i imunoblot analizama. (B) KLβΔTM ili kontrolisan kondicionirani medijum je inkubiran u prisustvu ili odsustvu FGF19 (0,5 μg), heparina (0,5 μg) ili FGF-Fc fuzionog proteina (0,5 μg) tokom 18 sati na 4°C. Interakcije proteina su određene proteinskim A-agaroznim taloženjem i imunoblot analizama. (C) i (D) Lizati iz HEK293 ćelija transfektovani sa praznim (kontrolni vektor), FGFR4, KLβ -Flag ili kombinacija FGFR4 i KLβ-Flag vektorima eksprimiranja inkubirani su u prisustvu ili odsustvu heparina i FGF19. Interakcije proteina su analizirane pomoću FGFR4 (C) i KLβ-Flag (D) imunoprecipitacije i imunoblotiranja. (E) Interakcija FGFR4-KLβ u lizatima ćelija HEPG2 analizirana je imunoprecipitacijom i imunoblotiranjem.
SLIKA 2: KLβ je potreban za signalizaciju FGF19. Efekat KLβ na signalizaciju FGF19 analiziran je korišćenjem HEK293 ćelija transfektovanih sa praznim (kontrolni vektor) (A), KLβ (B), FGFR4 (C) ili kombinacijom FGFR4 i KLβ vektora eksprimiranja (D). Transfektovane ćelije su inkubirane sa nosačem (PBS) ili FGF19 (0-500 ng/mL) tokom 10 minuta, lizirane, a fosforilacija FRS2 i ERK1/2 analizirana je imunoblotom.
SLIKA 3: KLβ je potreban za FGF19 nizvodno moduliranje eksprimiranja gena. (A) FGF19 potiskuje KLβ eksprimiranje. Ćelijske linije su inkubirane sa FGF19 (100 ng/mL, 0-24 sata) i nivoi eksprimiranja KLβ su analizirani sa RT-PCR. Sve vrednosti su upoređene sa nivoima KLβ eksprimiranja u HEP3B ćelijama u vremenu 0. Za svako stanje je analiziran trostruki skup podataka. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM. (B-D) FGF19 promoviše eksprimiranje c-Fos, JunB i c-Jun. Ćelijske linije su inkubirane sa FGF19 (100 ng/ml, 0-24 sata) i c-Fos (B), JunB (C) i c-Jun (D) eksprimiranjem su analizirane sa RT-PCR. Vrednosti predstavljaju relativno povećanje eksprimiranja određenog gena u odnosu na njegovo eksprimiranje pre izlaganja FGF19. (E) KLβ siRNK transfekcija potiskuje KLβ sintezu. HEP3B ćelije transfektovane sa svakom od četiri različita KLβ siRNK su analizirane za KLβ eksprimiranje imunoblotom. (F) Inhibicija eksprimiranja KLβ pomoću KLβ siRNK transfekcije inhibira signalizaciju FGF19. HEP3B ćelije transfektovane sa svakom od četiri različita KLβ siRNKs su inkubirane sa nosačem (PBS) ili FGF19 (100 ng/mL) tokom 10 minuta i analizirane za FRS2 i ERK1/2 fosforilaciju pomoću imunoblota. (G) Inhibicija eksprimiranja KLβ pomoću KLβ siRNK transfekcije inhibira FGF19-indukovanu c-Fos indukciju. HEP3B ćelije transfektovane sa svakom od četiri različita KLβ siRNKs su inkubirane sa FGF19 (100 ng/mL) tokom 90 minuta, a nivoi eksprimiranja KLβ i c-Fos analizirani su sa RT-PCR. Vrednosti predstavljaju relativno eksprimiranje svakog određenog gena u poređenju sa ćelijama koje su transfektovane sa kontrolnom siRNK. (H) HEK293 ćelije transfektovane bilo praznim (kontrolni vektor), KLβ, FGFR4 ili kombinacijom vektora FGFR4 eksprimiranja i KLβ su inkubirane sa PBS ili FGF19 (100 ng/mL) tokom 90 minuta; Izraz c-Fos analiziran je RT-PCR. Vrednosti predstavljaju povećanje eksprimiranja c-Fos u odnosu na nivoe eksprimiranja pre nego što su ćelije bile izložene FGF19.
SLIKA 4: Distribucija KLβ i FGFR4 određuje aktivnost FGF19 tkiva. KLβ i FGFR4 u ljudskim tkivima. Whisker-box grafički podaci koji pokazuju KLβ (A) i FGFR4 (B) u ljudskim tkivima, kao što je određeno mRNK analizom baze podataka BioExpress. Srednja linija označava sredinu; kvadratići predstavljaju inter-kvartilni raspon između prvog i trećeg kvartila. Udubljenja se protežu od inter-kvartila do pozicija ekstremnih vrednosti. KLβ (C) i FGFR4 (D) eksprimiranje u panelu mišjih tkiva određeni su sa RT-PCR. Vrednost za svaki organ predstavlja srednje eksprimiranje (n = 3 miševi), red veličine u odnosu na nivo eksprimiranja koji se primećuje u tkivima mozga. (E) Specifičnost tkiva FGF19 in vivo određena je analizom c-Fos eksprimiranja u različitim tkivima organa 30 minuta nakon injekcije miševa (n = 3) sa PBS ili FGF19 (1 mg/kg).
1
Vrednosti predstavljaju c-Fos izraz kod miševa injektiranih sa FGF19, u poređenju sa nivoima eksprimiranja kod miševa injektiranih sa PBS. (F) CIP7A1 eksprimiranje u jetri miševa 30 minuta nakon injekcije sa FGF19 (1 mg/kg) ili PBS. Vrednosti predstavljaju eksprimiranje CIP7A1 kod miševa injektiranih FGF19 u poređenju sa izrazom koji se nalazi kod miševa injektiranih PBS. Za svako stanje je analiziran trostruki skup podataka. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
SLIKA 5: KLβ je potreban za FGF19 nizvodno moduliranje eksprimiranja gena u HEPG2 ćelijama. (A) KLβ siRNK transfekcija potiskuje KLβ sintezu. KLβ eksprimiranje u HEPG2 ćelijama transfektovanim sa svakom od četiri različita KLR siRNK analiziran je imunoblotom. (B) transfekcija KLβ siRNK inhibira signalizaciju FGF19. HEPG2 ćelije transfektovane sa svakom od četiri različita KLR siRNKs su inkubirane sa PBS ili FGF19 (100 ng/mL) tokom 10 minuta, lizirane, i analizirane za FRS2 nivoe fosforilacije pomoću imunoblota. (C) KLβ siRNK transfekcija inhibira indukciju c-Fos posredovanu sa FGF19. HEP3B ćelije transfektovane sa svakom od četiri različita KLβ siRNK su inkubirane sa FGF19 (100 ng/mL) tokom 90 minuta, i KLβ i c-Fos eksprimiranje je analizirano sa RT-PCR. Vrednosti predstavljaju izraz svakog gena u poređenju sa njegovim eksprimiranjem u kontrolnim siRNK-transfektovanim ćelijama.
SLIKA 6: Lečenje anti-KLβ antitelom inhibira indukciju c-Fos posredovanu sa FGF19. HEPG2 ćelije su tretirane kontrolnim antitelom ili poliklonskim anti-KLβ antitelima koja su podignuta protiv mišjeg KLβ, ali unakrsno reaguju sa ljudskim KLβ (10 μg/ml). FGF19 stimulisana c-Fos indukcija merena je sa RT-PCR. Tretman sa anti-KLβ antitelom inhibirao je indukciju c-Fos posredovanu sa FGF 19, dok kontrolno antitelo nije imalo značajan uticaj.
SLIKA 7: KLβ mutacija aktivnog mesta inhibira aktivaciju FGF19 putanja. HEK293 ćelije nisu transfektovane ili su transfektovane sa KLβ E416A (aktivno mesto) ili KLβ E693A (neaktivno mesto) mutantom. FGF 19-stimulisana aktivnost ocenjena je pomoću fosforilisane FRS2 i fosforilisane ERK1/2 imunodetekcije. FGF19 tretman (100 ng/ml; 10 min) je povećao fosforilovani FRS2 i fosforilovani ERK1/2 signal kod divljih (vt) KLβ transfektovanih ćelija, dok su ovi signali bili neobjavljene u neprotransficiranim ćelijama. FRS2 i ERK1/2 fosforilacija kod KLβ E693A mutiranih transfektovanih ćelija upoređivane su sa FRS2 i ERK1/2 fosforilacijom u ćelijama koje su transfektovane sa divljim tipom KLβ. Stimulacija FGF19 kod transfektovanih ćelija KLβ E416A značajno je smanjena u poređenju sa divljim tipom KLβ. Ovi nalazi potkrepljuju poboljšanje signalizacije FGF19 od strane KLβ i dodatno sugerišu potrebu za KLβ enzimskom aktivnosti za signalizaciju FGF19.
SLIKA 8: Tretman sa KLβ antitelom inhibira FGF19-zavisnu indukciju c-Fos u jetri miša. FGF19-zavisna c-Fos indukcija merena je u jetri miša tretiranog sa antitelom KLβ (2,2 mg/kg) tokom 0, 3, 9 ili 24 časova. Anti-KLβ tretman antitela za 3, 9 ili 24 sata pre injekcije FGF19 (1 mg/kg) smanjio je indukciju c-Fos posredovanog FGF19 sa specifičnom jetrom za 58%, 68% i 91% respektivno.
SLIKA 9: KLβ eksprimiranje mRNK određeno je u tumorskim tkivima.
SLIKA 10: Eksprimiranje mRNK FGFR4 određeno je u tumorskim tkivima.
SLIKA 11: prikazuje primernu sekvencu KLβ nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 1).
SLIKA 12: prikazuje primernu KL-aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2).
DETALJAN OPIS
[0062] U jednom aspektu, predmetna objava pruža sastave i postupke zasnovane na vezivanju KLβ. KLβ vezujući agensi, kao što je ovde opisano, pružaju važne terapeutske i dijagnostičke agense za primenu u ciljanim patološkim uslovima povezanim sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ-FGF19-FGFR4 puteva. Shodno tome, predmetna objava pruža postupke, sastave, komplete i proizvode proizvodnje vezane za vezivanje KLβ. U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke zasnovane na detektovanju KLβ FGF (kao što je FGF19) i/ili FGFR (kao što je FGFR4). Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
Opšte tehnike
[0063] Tehnike i postupci koji su ovde opisani ili se na njih poziva uglavnom su dobro razumljivi i uobičajeno se upotrebljavaju korišćenjem konvencionalne metodologije od strane stručnjaka u oblasti, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, i dr. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, i ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Definicije
[0064] „Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili se obnavlja iz komponente svoje prirodne sredine. Komponente zagađivači njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske primene za antitelo i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinastične supstance. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95% težine antitela, kako je određeno postupkom Lauri, a najpoželjnije više od 99% težine, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminala ili interne aminokiselinske sekvence pomoću sekvencora rotirajuće posude ili (3) homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovana antitela uključuju antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija, budući da bar jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0065] Molekul „izolovane“ nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminiranog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline je drugačiji nego u obliku ili okruženju u kom se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline stoga se razlikuju od molekula nukleinske kiseline, kakvi postoje u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline sadrži molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo gde je, na primer, molekul nukleinske kiseline na mestu hromozoma različit od onog u prirodnim ćelijama.
[0066] Izraz „numerisanje broja varijabilnih domena kao po Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao po Kabatu“, i njegove varijacije, odnosi se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene laka lanca kompilacije antitela u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili unošenju u FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati jedan pojedinačni aminokiselinski umetak (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 H2 i ubaciti ostatke (npr. ostatke 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca 82. Kabatova numeracija ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ Kabat numerisanom sekvencom.
[0067] Izraz „suštinski sličan“ ili „u suštini isti“, kad se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (obično jedan koji je povezan sa antitelom i drugi povezan sa referentnim/uporedivim antitelom), tako da bi stručnjak u oblasti smatrao da razlika između dve vrednosti ima malo ili je bez biološkog i/ili statističkog značaja u kontekstu bioloških karakteristike merenih navedenim vrednostima (npr. vrednosti Kd). Razlika između pomenute dve vrednosti je poželjno manje od oko 50%, poželjno manje od oko 40%, poželjno manje od oko 30%, poželjno manje od oko 20%, poželjno manje od oko 10% u funkciji vrednosti za referentno/uporedno antitelo.
[0068] „Afinitet vezivanja“ uopšteno govori o snazi zbira ukupnih neovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kad se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ odnosi se na inherentni afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1: 1 između članova vezujućeg para (npr., Antitela i antigena). Afinitet molekula X za svog partnera Y generalno može biti predstavljen konstantom disociacije (Kd). Afinitet se može izmeriti zajedničkim postupcima poznatim u struci, uključujući i one opisane ovde.
Antitela sa niskim afinitetom uglavnom se spajaju antigenom i teže da se disociraju lako, dok antitela sa visokim afinitetom uglavnom vezuju antigen brže i imaju tendenciju da ostanu vezana duže. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja poznati su u struci, od kojih se bilo koji može koristiti za svrhe predmetne objave. Posebna ilustrativna rešenja su opisana u nastavku.
[0069] U jednom otelotvorenju, vrednost „Kd“ ili „Kd vrednost“ se meri pomoću radioobeleženog testa vezivanja antigena (RIA) izvedenog sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena kao što je opisano kod sledećem testu koji meri rastvor koji vezuje afinitet Faba za antigen ekvilibriranjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, uz zatim uzimanje vezanog antigena sa pločicom obloženom anti-Fab antitelom (Chen i dr., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). Kako bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, mikrotitarske ploče (Dyinex) su prekrivene preko noći sa 5 ug/ml antitela za uzimanje anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirane sa 2% (v/v) goveđim serum albuminom u PBS u trajanju od dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U ne-adsorbantnoj ploči (Nunc # 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se pomešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, kod Presta i dr., (1997) Cancer Res.57: 4593-4599). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti duži vremenski period (npr., 65 sati) kako bi osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga smeše se prenose na ploču za hvatanje za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja i ploča se ispira osam puta sa 0,1% Tween-20 u PBS. Kada se tablice osuše, dodaje se 150 ul/komorica scintilanta (MicroScint-20; Packard), i ploče se broje na Topcount gama brojaču (Packard) deset minuta. Koncentracije svakog Faba koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za upotrebu u konkurentnim vezivnim testovima. Prema drugom otelotvorenju, Kd vrednost ili Kd se mere pomoću ispitivanja površinske plazmonske rezonance pomoću BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa imobilizovanim antigen CM5 čipovima na ~10 odzivnim jedinicama (RU). Ukratko, karboksimetilirani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIAcore Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10mM natrijum acetatom, pH 4,8, u 5ug/ml (~0,2uM) pre injektiranja sa brzinom protoka od 5ul/min, kako bi se postiglo otprilike 10 reakcionih jedinica (RU) spojenog proteina. Nakon injekcije antigena, IM ethanolamin se ubrizgava u blokadu neizlečenih grupa. Za merenja kinetike, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) se ubrizgava u PBS sa 0,05% Tween 20 (PBST) na 25°C sa brzinom protoka od približno 25 ul/min. Stope udruživanja (kon) i stope disocijacije (koff) se izračunavaju koristeći jednostavni vezni model Langmuir (BIAcore Evaluation Software verzija 3.2) sa istovremenim prilagođavanjem senzograma asocijacije i disociacije. Konstanta ravnotežne disociacije (Kd) izračunava se kao odnos kon/koff. Pogledati, na primer, Chen, I., i dr. (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Ako on-stopa prelazi 10<6>M<-1>S<-1>pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa iznad, onda se on- stopa može odrediti korišćenjem fluorescentne tehnike gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (uzbivanje = 295 nm, emisija = 340 nm, 16 nm band-pass) na 25°C od 20nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili 8000-serije SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa crvenom kivetom sa mešanjem.
[0070] „On-stopa“ ili „stopa udruživanja“ ili „stopa pridruživanja“ ili „kon“ može se odrediti i sa istom tehnikom površinske plazmonske rezonance opisanom gore korišćenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa imobilizovanim antigen CM5 čipovima na -10 odzivnim jedinicama (RU). Ukratko, karboksimetilirani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIAcore Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10mM natrijum acetatom, pH 4,8, u 5ug/ml (~0,2uM) pre injektiranja sa brzinom protoka od 5ul/min, kako bi se postiglo otprilike 10 odzivnih jedinica (RU) spojenog proteina. Po injekciji antigena, 1M etanolamin se injektuje u blok nereagovanih grupa. Za merenje kinetike dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) se injektira u PBS sa 0,05% Tween 20 (PBST) na 25°C sa brzinom protoka od približno 25 ul/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) se izračunavaju koristeći jednostavni vezni model Langmuir (BIAcore Evaluation Software verzija 3.2) sa istovremenim priključivanjem senzograma asocijacije i disociacije. Konstanta ravnotežne disociacije (Kd) izračunata je kao odnos kon/ koff.
1
Pogledati, na primer, Chen, I., i dr. (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Međutim, ako on-stopa prelazi 10<6>M<-1>S<-1>pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa iznad, onda je brzina poželjno određena korišćenjem fluorescentnog postupke gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (uzbivanje = 295 nm, emitovanje = 340 nm, 16 nm pojas) na 25°C od 20nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili 8000-serije SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.
[0071] Izraz „vektor“, kad se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je povezan. Jedan tip vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu dopuniti dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je fag vektor. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu povezati sa virusnim genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizodni sisarski vektori). Drugi vektori (npr., ne-epizodni sisarski vektori) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i time se repliciraju zajedno sa domaćim genomom. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju eksprimiranje gena na koji se operativno vezuju. Ovakvi vektori ovde se nazivaju „rekombinantni vektori eksprimiranja“ (ili jednostavno, „rekombinantni vektori“). Generalno, vektori eksprimiranja od koristi u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, „plazmid“ i „vektor“ mogu se zamenjivo koristiti, jer je plazmid najčešće korišćen oblik vektora.
[0072] „Polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“, kad se ovde koriste zamenjivo, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji se može inkorporirati u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze ili sintetičkom reakcijom. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analogi. Ako je prisutno, modifikacija nukleotidne strukture može se preneti pre ili posle sklapanja polimera. Sekvence nukleotida mogu biti prekinute ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon sinteze, kao što je konjugacija sa obeležjem. Druge vrste modifikacija uključuju, na primer, „kapice“, supstituciju jednog ili više prirodnih nukleotida sa analognim, internukleotidnim modifikacijama kao što su, na primer, one sa nenaelektrisanim vezama (npr. metil fosfonati, fosfotriesteri, fosfoamidati, karbamati , itd.) i sa naelektrisanim vezama (npr. fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji sadrže privezne delove, kao što su npr. proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, pli-L-lizin itd.), oni sa interkalatorima (npr. akridin, psoralen itd.), oni koji sadrže kelatore (npr. metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali itd.), oni koji sadrže alkilatore, one sa izmenjenim vezama (npr. nukleinske kiseline itd.), kao i nemodifikovane forme polinukleotida. Dalje, bilo koja od hidroksilnih grupa koja je obično prisutna u šećerima može se zameniti, na primer, sa fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićenim standardnim zaštitnim grupama, ili se aktivirati za pripremu dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili može biti konjugovana na čvrstu ili polu-čvrstu podršku. 5' i 3' terminalni OH mogu biti fosforilovani ili supstituisani sa aminima ili grupama organskih ograničavajućih grupa od 1 do 20 atoma ugljenika. Ostali hidroksi mogu takođe biti derivati standardnih zaštitnih grupa. Polinukleotidi takođe mogu da sadrže analogne oblike riboznih ili deoksririboznih šećera koji su opšte poznati u struci, uključujući, na primer, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ili 2'-azidoriboze, analoge karbocikličnog šećera, alfa-anomične šećere, epimerne šećere kao što su arabinoza, ksiloza ili lizos, piranozne šećeri, furanozni šećeri, sedoheptuloze, aciklični analozi i bazni nukleozidni analozi kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza mogu biti zamenjene alternativnim veznim grupama. Ove alternative vezne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, otelotvorenja u kojima se fosfat zamenjuje sa P(O)S („tioat“), P(S)S („dithioat“), „(O)NR2 („amidatc“), P(O)R, P(O)OR', CO ili CH2(„formacetalni“), u kome svaki je R ili R' nezavisno H ili supstituisan ili nesupstituisan alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etar (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Nisu sve veze u polinukleotidu identične. Prethodni opis odnosi se na sve polinukleotide navedene ovde, uključujući RNK i DNK.
[0073] „Oligonukleotid“, kad se ovde koristi, uopšteno govori o kratkim, uglavnom jednolančanim, uglavnom sintetičkim polinukleotidima koji su generalno, ali ne obavezno, manji od oko 200 nukleotida dužine. Izrazi „oligonukleotid“ i „polinukleotid“ se međusobno ne isključuju. Gornji opis za polinukleotide jednako je i potpuno primenljiv na oligonukleotide.
[0074] Izraz „Kloto beta“ (naizmenično obeležen kao „KLβ“ ili „Beta Kloto“ ili βKloto) odnosi se, osim ukoliko nije drugačije specifično ili kontekstualno naznačeno, na bilo koji prirodni ili varijantni (bilo prirodni ili sintetički) KLβ polipeptid. Izraz „prirodna sekvenca“ specifično obuhvata prirodne skraćene ili izlučene oblike (npr. sekvenca vanćelijskog domena), prirodne varijantne oblike (npr. alternativno vezani oblici) i prirodno prisutne alelne varijante. Izraz „divlji tip KLβ“ uopšteno se odnosi na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prirodnog KLβ proteina. Izraz „sekvenca divljeg tipa KLβ“ se uglavnom odnosi na sekvencu aminokiselina koja se nalazi u prirodnom KLβ.
[0075] Izraz „FGF19“ (naizmenično obeležen kao „Fibroblastni faktor rasta 19“), kad se ovde koristi, odnosi se, osim ako nije drugačije specifično ili kontekstualno naznačeno, na bilo koji prirodni ili varijantni (bilo prirodni ili sintetički) KLβ polipeptid. Izraz „prirodna sekvenca“ specifično obuhvata prirodne skraćene ili izlučene oblike (npr. sekvenca vanćelijskog domena), prirodne varijantne oblike (npr. alternativno vezani oblici) i prirodno prisutne alelne varijante. Izraz „divlji tip KLβ“ uopšteno se odnosi na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prirodnog KLβ proteina. Izraz „sekvenca divljeg tipa KLβ“ se uglavnom odnosi na sekvencu aminokiselina koja se nalazi u prirodnom KLβ.
[0076] „FGF19 antagonist“ odnosi se na molekul koji je sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti FGF19 uključujući, na primer, vezivanje KLβ (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGFR4 (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje KLβ i FGFR4 (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje indukcije cFos, Junb i/ili Junc posredovane sa FGF19 (in vitro ili in vivo), promovisanje nizvodne signalizacije FGFR4 i/ili FGF19 (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, ERK1/2 fosforilaciju i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog FGF19 i/ili FGFR4 biološkog puta, i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanog sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću FGF19 (kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost FGF19). FGF19 antagonisti uključuju antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe uključuju inhibitore malih molekula proteina i fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein, čime se sekvestira njegovo vezivanje za svoj cilj, antagonističke varijante proteina, siRNK molekule usmerene na protein, antisens molekule usmerene na protein, RNK aptamere i ribozime protiv proteina. U nekim otelotvorenjima, FGF19 antagonist je molekul koji se vezuje za FGF19 i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost FGF19.
[0077] „KLβ antagonist“ se odnosi na molekul koji je sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti KLβ uključujući, na primer, vezivanje FGFR (npr. FGFR4) (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGF (npr. FGF19) (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGFR4 i FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje indukcije cFos, Junb i/ili Junc posredovane sa FGF19 (in vitro ili in vivo), promovisanje nizvodne signalizacije FGFR4 i/ili FGF19 (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, ERK1/2 fosforilaciju i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog KLβ i/ili FGFR4 biološkog puta, i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanog sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ (kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost KLβ). KLβ antagonisti uključuju antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe uključuju inhibitore malih molekula proteina i fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein, čime se sekvestira njegovo vezivanje za svoj cilj, antagonističke varijante proteina, siRNK molekule usmerene na protein, antisens molekule usmerene na protein, RNK aptamere i ribozime protiv proteina. U nekim otelotvorenjima,, KLβ antagonist je molekul koji se vezuje za KLβ i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost KLβ.
1
[0078] Izraz „FGFR4“ (naizmenično obeležen kao „Receptor 4 fibroblastnog faktora rasta“), kad se ovde koristi, odnosi se, osim ako nije specifično ili kontekstualno naznačeno drugačije, na bilo koji prirodni ili varijantni (bilo prirodni ili sintetički) FGFR4 polipeptid. Izraz „prirodna sekvenca“ specifično obuhvata prirodne skraćene ili izlučene oblike (npr. sekvenca vanćelijskog domena), prirodne varijantne oblike (npr. alternativno vezani oblici) i prirodno prisutne alelne varijante. Izraz „divlji tip FGFR4“ uopšteno se odnosi na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prirodnog FGFR4 proteina. Izraz „sekvenca divljeg tipa FGFR4“ se uglavnom odnosi na sekvencu aminokiselina koja se nalazi u prirodnom FGFR4.
[0079] „FGFR antagonist“ se odnosi na molekul koji je sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti FGF receptora („FGFR“) uključujući, na primer, vezivanje KLβ (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGF (npr. FGF19) (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje KLβ i FGF (npr. FGF19) (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje indukcije cFos, Junb i/ili Junc posredovane sa FGF 19 (in vitro ili in vivo), promovisanje nizvodne signalizacije FGFR i/ili FGF (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, ERK1/2 fosforilaciju i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog FGF i/ili FGFR biološkog puta, i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanog sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću FGFR (kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost FGFR). FGFR antagonisti uključuju antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe uključuju inhibitore malih molekula proteina i fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein, čime se sekvestira njegovo vezivanje za svoj cilj, antagonističke varijante proteina, siRNK molekule usmerene na protein, antisens molekule usmerene na protein, RNK aptamere i ribozime protiv proteina. U nekim otelotvorenjima,, KLβ antagonist je molekul koji se vezuje za FGFR i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost FGFR.
[0080] Izrazi „antitelo“ i „imunoglobulin“ koriste se naizmenično u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela (npr. monoklonska antitela pune dužinu ili netaknuta monoklonska antitela), poliklonska antitela, multivalentna antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela dokle god ona imaju željenu biološku aktivnost) i mogu uključiti i određene fragmente antitela (kao što je detaljnije opisano ovde). Antitelo može biti ljudsko, humanizovano i/ili afinitetno sazrelo.
[0081] Izraz „varijabilno“ se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena znatno razlikuju između antitela i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog pojedinačnog antitela za njegov specifični antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koja se zovu regije za određivanje komplementarnosti (CDR) ili hipervariabilei regije i u varijabilnim domenima lakog lanca i u varijabilnim domenima teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazvani su okviri (FR). Svaki varijabilna domena prirodnih teških i lakih lanaca sadrži po četiri FR regije, koje u velikoj meri usvajaju konfiguraciju βlistova, povezane sa tri CDR, koje formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i sastavni dio strukture β-listova. CDR se u svakom lancu drže zajedno u neposrednoj blizini od strane FR regije i, sa CDR iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (pogledati Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela na antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela.
[0082] Digestijom papaina antitela proizvede dva identična fragmenta vezivanja antigena, pod nazivom „Fab“ fragmenti, svaki sa jednim antigen vezujućim mestom i ostatak fragmenta „Fc“, čije ime odražava njegovu sposobnost kristalizacije. Terapija Pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva antigenkombinujuća mesta i još uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.
[0083] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. U dvolančanim vrstama Fv, ova regija se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog i jednog varijabilnog domena tlakog lanca u čvrstoj, ne-kovalentnoj vezi. U jednolančnanoj Fv vrsti, jedan varijabilni domen teškog i jednog varijabilni domen lakog lanca mogu biti kovalentno povezani
1
sa fleksibilnim peptidnim veznikom tako da se laki i teški lanci mogu povezati u „dimernoj“ strukturi analognoj onoj kod dvolančane Fv vrste. U ovoj konfiguraciji se tri CDR svakog varijabilnog domena interakuju da definišu antigen vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest CDR prenose antigen-specifičnost vezivanja na antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR specifične za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, mada sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.
[0084] Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobne regije antitela. Fab'-SH je ovde obeležje za Fab' u kojoj ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab')2 fragmenti antitela prvobitno su proizvedeni kao parovi Fab fragmenata koji imaju između njih zglobne cisteine. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.
[0085] „Laki lanci“ antitela (imunoglobulina) iz bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno izražena tipa, koja se zovu kappa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.
[0086] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena svojih teških lanaca, imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih se dalje mogu podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju α, δ, ε, γ i μ, respektivno. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
[0087] „Fragmenti antitela“ obuhvataju samo deo netaknutog antitela, pri čemu deo poželjno zadržava najmanje jednu, poželjno većinu ili sve, funkcije koje su obično povezane sa tim delom kada su prisutne u netaknutom antitelu. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. U jednom otelotvorenju, fragment antitela sadrži mesto vezivanja antigena netaknutog antitela i na taj način zadržava sposobnost da vezuje antigen. U još jednom otelotvorenju fragment antitela, na primer, onaj koji obuhvata Fc regiua, zadržava bar jednu od bioloških funkcija koje su obično povezane sa regijom Fc kada su prisutne u netaknutom antitelu, kao što je FcRn vezivanje, modulacija poluživota antitela, ADCC funkcija i vezivanje komplementa. U jednom aspektu, fragment antitela je monovalentno antitelo koje ima poluživot in vivo u suštini sličan netaknutom antitelu. Na primer, takav fragment antitela može se sastojati na antigen vezujuće ruke koja je povezana sa Fc sekvencom sposobnom da prenese stabilnost in vivo u fragment.
[0088] Izraz „hipervariabilna regija“, „HVR“ ili „HV“, kad se ovde koristi, odnosi se na regije varijablnog domena antitela koje su hipervaribilne u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest hipervariabilnih regija; tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U upotrebi je određeni broj razgraničenja hipervarijabilne regije, i ona su ovde obuhvaćena. Kabatove regije za određivanje komplementarnosti (CDR) baziraju se na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste ((Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM hipervarijabilne regije predstavljaju kompromis između Kabat CDR i Čotia strukturnih petlji, i koristi ih Oxford Molccular's AbM program za modeliranje antitela. „Dodirne“ hipervarijabilne regije bazirane su na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura.
[0089] Hipervarijabilne regije mogu obuhvatati „produžene hipervarijabilne regije“ na sledeći način: 24-36 (L1), 46-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL i 26-35 (H1), 49-65 ili 50 do 65 (H2) i 93-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabat i dr., supra za svaku od ovih definicija.
[0090] „Okvir“ ili „FR“ ostaci su ostaci varijabilnog domena različiti od ostataka hipervarijabilne regije, kako je ovde definisano.
[0091] „Humanizovani“ oblici ne-ljudskih (npr., mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od ne-ljudskog imunoglobulina. U većini slučajeva, humanizovana
1
antitela pokreću ljudske imunoglobuline (premno antitelo) u kojima su ostaci hipervarijabilne regije primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilne regije ne-ljudske vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-ljudski primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirne regije (FR) ljudskog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim neljudskim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji nisu pronađeni antitelu primaocu ili u antitelu donoru. Ove modifikacije su učinjene kako bi se dalje poboljšale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili u suštini sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima ne-ljudskog imunoglobulina i sve ili u suštini sve FR su one od ljudske imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati barem deo konstantne regije imunoglobulina (Fc), tipično one ljudskog imunoglobulina. Za dalje detalje, pogledati Jones i dr., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Pogledati i sledeće članke i reference koji su navedeni u njemu: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994).
[0092] „Himerna“ antitela (imunoglobulini) imaju deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (SAD Patent br. 4,816,567; i Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 81: 6851-6855 (1984)). humanizovano antitelo kad se ovde koristi je podskup himernih antitela.
[0093] „Jednolančani Fv“ ili „scFv“ antitela fragmenti sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, scFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni veznik između VH i VL domena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, pogledati Pluckthun, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
[0094] „Antigen“ je unapred određeni antigen na koji se antitelo može selektivno vezati. Cilj može biti polipeptid, ugljeni hidrat, nukleinska kiselina, lipid, hapten ili drugo prirodno ili sintetičko jedinjenje. Poželjno, cilj je polipeptid.
[0095] Izraz „dijatelo“ se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, gde ti fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom laka lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH - VL). Korišćenjem veznika koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. dijatela su detaljnije opisane u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
[0096] „Ljudsko antitelo“ je ono koji poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onoj kod antitela proizvedenog od strane čoveka i/ili je napravljeno pomoću bilo koje od tehnika za stvaranje ljudskih antitela kako je ovde obelodanjeno. Ova definicija ljudskog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-ljudske antigen-vezujuće ostatke.
[0097] „Afinitetno zrelo“ antitelo je ono sa jednom ili više izmena u jednoj ili više CDR-a, što rezultuje poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa roditeljskim antitelom koji ne poseduje te promene. Poželjna afinitetno zrela antitela će imati nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za cilj. Afinitetno zrela antitela proizvedena su postupcima poznatim u struci. Marks i dr. Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta putem zamene VH i VL domena. Nasumična mutageneza CDR i/ili ostaci okvira opisani su kod: Barbas i dr. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier i dr. Gene 169:147-155 (1995); Yelton i dr. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson i dr., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins i dr, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
[0098] „Efektorske funkcije“ antitela odnose se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regiji (Fc regiji sa prirodnom sekvencom ili varijanti Fc regije aminokiselinske sekvence) antitela i varirati sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisno od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost
1
zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; regulaciju nivoa receptora na površini ćelija (npr. B ćelijski receptor); i aktivaciju B ćelija.
[0099] Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela „ili“ ADCC „odnosi se na oblik citotoksičnosti kod koje se izlučen Ig vezuje na Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubica (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen i potom ubijaju ciljanu ćeliju sa citotoksinima. Antitela „naoružavaju“ citotoksične ćelije i apsolutno su neophodna za takvo ubijanje. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Eksprimiranje FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirano u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je opisano kod US Patent No. 5,500,362 ili 5,821,337 ili Presta SAD Patent br. 6,737,056. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije Natural Killer (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti aktivnost ADCC USA od interesa in vivo, na primer, u životinjskom modelu kao što je opisano kod Clines i dr. PNAS (SAD) 95: 652-656 (1998).
[0100] „Ljudske efektorske ćelije“ su leukociti koji eksprimiraju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. Poželjno, ćelije eksprimiraju najmanje FcγRIII i izvršavaju ADCC efektorsku funkciju. Primeri ljudskih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubica (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile; gde su PBMC i NK ćelije poželjne. Efektorska ćelija može biti izolovana iz prirodnog izvora, npr. iz krvi.
[0101] „Fc receptor“ ili „FcR“ opisuje receptor koji se vezuje za Fc regiju antitela. Poželjan FcR je prirodni ljudski FcR. Štaviše, poželjan FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i obuhvata receptore FcγRI, FcγRII i FcγRIII potklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivacioni receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitni receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptornie motivi inhibicije na bazi tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu. (pogledati pregled M. u Daeron, Annu. Rev. Immunol.15: 203-234 (1997)). FcR su opisani od strane Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel i dr., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas i dr., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovatiu budućnosti, obuhvaćeni su izrazom „FcR“ ovde. Izraz takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenošenje materinskih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim i dr., J. Immunol.24:249 (1994)) i reguliše homeostazu imunoglobulina. WO00/42072 (Presta) opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Takođe pogledati, Shields i dr. J. Biol. Chem.9 (2): 6591-6604 (2001).
[0102] Poznati su postupci za merenje vezivanja za FcRn (pogledati, npr., Ghetie 1997, Hinton 2004). Vezivanje na ljudski FcRn in vivo i poluživot ljudskih FcRn polipeptida sa visokim afinitetom za vezivanje može se analizirati, npr. kod transgenih miševa ili transfektovanih ljudskih ćelijskih linija koje eksprimiraju ljudski FcRn ili kod primatima kojima su date Fc varijante polipeptida.
[0103] „Citotoksičnost zavisna od komplemenata“ ili „CDC“ se odnosi na lizu ciljane ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa započinje vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) na antitela (odgovarajuće podklase) koja su vezana za njihov srodni antigen. Kako bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test, npr. kao što je opisano kod Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
[0104] Polipeptidne varijante sa promenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regije i povećanom ili smanjenom sposobnošću vezivanja C1q su opisane u US Patent No. 6,194,551 B1 i WO99/51642. Takođe pogledati, Idusogie i dr. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0105] „Blokirajuće“ antitelo ili „antagonist“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena koji se vezuje. Poželjna blokirajuća antitela ili antitela antagonista suštinski ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena.
1
[0106] „Biološki uzorak“ (zamenljivo nazvan „uzorak“ ili „uzorak tkiva ili ćelije“) obuhvata različite tipove uzoraka dobijenih pojedinca i može se koristiti za dijagnozu ili test praćenja. Definicija obuhvata krvne i druge tečne uzorke biološkog porekla, uzorke čvrstih tkiva kao što su uzorak biopsije ili kulture tkiva ili ćelije koje su izvučene iz nje, i njihovo potomstvo. Definicija obuhvata i uzorke koji su manipulisani na bilo koji način nakon njihove nabavke, kao što su tretman sa reagensima, solubilizacija ili obogaćivanje za određene komponente, kao što su proteini ili polinukleotidi, ili ugradnja u polu čvrstu ili čvrstu matricu za potrebe sekcije. Izraz „biološki uzorak“ obuhvata klinički uzorak, a takođe uključuje i ćelije u kulturi, supernatante ćelija, lizate ćelija, serum, plazmu, biološku tečnost i uzorke tkiva. Izvor biološkog uzorka mogu biti čvrsta tkiva iz svežeg, zamrznutog i/ili očuvanog organa ili uzoraka tkiva ili biopsija ili aspirat; krv ili bilo koji sastojak krvi; telesne tečnosti kao što je cerebralna spinalna tečnost, amniotska tečnost, peritonealna tečnost ili intersticijska tečnost; ćelije iz bilo kog trenutka u gestaciji ili razvoju pacijenta. U nekim otelotvorenjima biološki uzorak se dobija iz primarnog ili metastatskog tumora. Biološki uzorak može sadržati jedinjenja koja se prirodno ne mešaju sa tkivom u prirodi, kao što su konzervansi, antikoagulanti, puferi, fiksativi, hranjivi sastojci, antibiotici i slično.
[0107] Za svrhe ovde, „sekcija“ uzorka tkiva podrazumeva jedan deo ili komad uzorka tkiva, npr. tanak deo tkiva ili ćelija isečenih od uzorka tkiva. Podrazumeva se da se može uzeti više sekcija uzoraka tkiva i podvrgnuti analizi prema predmetnoj objavi. U nekim otelotvorenjima, isti deo uzorka tkiva se analizira i na morfološkom i na molekularnom nivou, ili se analizira u odnosu na protein i nukleinsku kiselinu.
[0108] Reč „obeležje“ kad se ovde koristi odnosi se na jedinjenje ili sastav koji je konjugovan ili spojen direktno ili indirektno sa reagensom kao što je sonda nukleinske kiseline ili antitelo i olakšava objava reagensa na koji je konjugovan ili spojen. Samo obeležje može biti prepoznato (npr., radioizotopska obeležja ili fluorescentna obeležja) ili, u slučaju enzimskog obeležja, mogu katalizovati hemijsku promenu supstratnog jedinjenja ili sastava koja se može detektovati.
[0109] „Lek“ je aktivni lek za lečenje poremećaja u pitanju ili njegovih simptoma ili neželjenih efekta.
[0110] „Poremećaj“ ili „bolest“ je bilo koje stanje koje bi imalo koristi od tretmana supstancom/molekulom ili postupkom. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući i ona patološta stanja koja predisponiraju sisara za taj poremećaj. Neograničavajući primeri poremećaja koji se ovde tretiraju uključuju maligne i benigne tumore; karcinomom, blastomom i sarkomom.
[0111] Izrazi „proliferativni poremećaj ćelija“ i „proliferativni poremećaj“ odnose se na poremećaje koji su povezani sa određenim stepenom abnormalne proliferacije ćelija. U jednom otelotvorenju, proliferativni poremećaj ćelija je kancer.
[0112] „Tumor“, kad se ovde koristi, odnosi se na sav rast i proliferaciju neoplastičnih ćelija, bilo maligan ili benigan, i sve pre-kancerozne i kancerozne ćelije i tkiva. Izrazi „kancer“, „kancerozni“, „proliferativni poremećaj ćelija“, „proliferativni poremećaj“ i „tumor“ se međusobno ne isključuju kao što je ovde navedeno.
[0113] Izrazi „rak“ i „kancerozni“ odnose se na fiziološku bolest sisara koju opisuju fizički poremećaj ćelija ili proliferacije ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leuhemiju. Posebniji primeri takvih karcinoma su rak skvamoznih ćelija, kancer malih ćelija pluća, karcinom hipofize, rak jednjaka, astrocitom, sarkom mekog tkiva, karcinom ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrointestinalni kancer, rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, hepatom, karcinom dojke, kancer debelog creva, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili karcinoma materice, karcinom pluvačnih žlezda, karcinom bbrega, karcinom jetre, rak prostate, kancer vulve, karcinom tiroidne žlezde, hepatični karcinom, kancer mozga, endometrijalni karcinom, karcinom testisa, holangiokarcinom, karcinom žučne kese, kancer želuca, melanom i različite vrste karcinoma glave i vrata. Disregulacija angiogeneze može dovesti do mnogih poremećaja koji se mogu tretirati pomoću sastava i postupaka pronalaska. Ovi poremećaji uključuju i ne-neoplastična i neoplastična stanja. Neoplastični uključuju, ali nisu ograničeni na ona opisana gore. Ne-neoplastični poremećaji obuhvataju ali nisu ograničeni na neželjenu ili aberantnu hipertrofiju, artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijazu, psoriatske plakove, sarkoidozu, aterosklerozu, aterosklerotične plakove, dijabetičke i druge proliferativne retinopatije uključujući prematurnu retinopatiju, retrolentalnu fibroplaziju, neovaskularni
2
glaukom, makularnu degeneraciju uzrokovanu starenjem, dijabetički makularni edem, neovaskularizaciju rožnjače, neovaskularizaciju grafta rožnjače, odbacivanje grafta rožnjače, neovaskularizaciju retine/horoida, neovaskularizaciju ugla (rubeoza), očnu neovaskularnu bolest, vaskularnu restenozu, arteriovenske malformacije (AVM), meningiom, hemangiom, angiofibrom, hiperplaziju tiroidne žlezde (uključujući Gravovu bolest), transplantaciju rožnjače i drugog tkiva, hroničnu upalu, upalu pluća, akutnu povredu pluća/ARDS, sepsu, primarnu plućnu hipertenziju, maligne plućne izlive, cerebralni edem (npr. povezan sa akutnim moždanim udarom/zatvorenom povredom glave/traumaom), sinovijalno zapaljenje, formiranje panusa u RA, nastanak miozitisa, hipertrofičnu formacija kostiju, osteoartritis (OA), refraktorne ascite, bolest policističnih jajnika, endometriozu, bolest trećeg rastojanja fluida (pankreatitis, sindrom kompartmenta, bumovi, bolest creva) fibroide, preuranjenu trudnoća, hroničnu upalu kao što je IBD (Kronova bolest i ulcerativni kolitis), odbacivanje bubrežnog alogena, upalna bolest creva, nefrotični sindrom, neželjeni ili neujednačeni rast tkiva (nekancer), hemofilični zglobovi, hipertrofni ožiljci, inhibicija rasta kose , Osler-Veberov sindroma, pihogenu granulomu retrolentalnih fibroplazija, skleroderm, trahomu, vaskularnu adheziju, snovitis, dermatitis, preeklampsiju, ascite, perikardni izliv (kao što je povezano sa perikarditisom) i pleuralni izliv.
[0114] Izraz poremećaji „trošenja“ (npr. sindrom trošenja, kaheksija, sarkopenija) odnosi se na poremećaj uzrokovan nepoželjnim i/ili nezdravim gubitkom težine ili gubitkom mase tela ćelije. Kod starijih pojedinaca, kao i kod pacijenata sa AIDS-om i pacijentima sa rakom, bolesti trošenja mogu dovesti do neželjenog gubitka telesne težine, uključujući i masne i odeljke bez masti. Bolesti trošenja mogu biti rezultat neadekvatnog unosa hrane i/ili metaboličkih promena u vezi sa bolestima i/ili procesom starenja. Pacijenti sa rakom i pacijenti sa AIDS-om, kao i pacijenti nakon ozbiljnih operacija ili koji imaju hronične infekcije, imunološka oboljenja, hipertiroidizam, Kronovu bolest, psihogene bolesti, hroničnu srčanu insuficijenciju ili druge teške povrede, često pate od bolesti trošenja koja se ponekad naziva i kaheksija, metabolički i, ponekad, poremećaj ishrane. Kaheksija se dodatno karakteriše hipermetabolizmom i hiperkatabolizmom. Iako se kaheksija i bolesti trošenja često koriste naizmenično, u smislu stanja trošenja, postoji najmanje jedno istraživanje koje razlikuje kaheksiju od sindroma trošenja kao gubitka težine bez masti, a posebno mase telesnih ćelija (Mayer, 1999, J. Nutr. 129(1S Suppl.):256S-259S). Sarkopenija, još jedan takav poremećaj koji može uticati na starenje pojedinca, obično se karakteriše gubitkom mišićne mase. Konačna faza bolesti trošenja kao što je gore opisano može se razviti kod pojedinaca koji pate od kaheksije ili sarkopenije.
[0115] Kad se ovde koristi, „tretman“ se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca ili ćelije koja se leči i može se izvesti ili za profilaksu ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju sprečavanje pojave ili ponovne pojavu bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, smanjenje stope progresije bolesti, poboljšanja ili palijacije stanja bolesti i remisije ili poboljšane prognoze. U nekim otelotvorenjima, lukovi antitela se koriste za odlaganje razvoja bolesti ili poremećaja.
[0116] „Agens protiv angiogeneze“ ili „inhibitor angiogeneze“ odnosi se na supstancu male molekulske mase, polinukleotid, polipeptid, izolovani protein, rekombinantni protein, antitelo ili njihove konjugate ili fuzione proteine, koji inhibiraju angiogenezu, vaskulogenezu, ili neželjenu vaskularnu propustljivost, bilo direktno ili indirektno. Na primer, agens protiv angiogeneze je antitelo ili drugi antagonist angiogenski agens kao što je prethodno definisano, npr. antitela ta VEGF, antitela ta VEGF receptore, male molekuli koji blokiraju signalizaciju VEGF receptora (npr. PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (sunitinib malat), AMG706). Agensi protiv angiogeneze takođe uključuju prirodne inhibitore angiogeneze, npr. angiostatin, endostatin itd. Pogledati, na primer, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (npr., Tabela 3 sa listom anti-angiogenih terapija kod malignog melanoma); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini i dr., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (e.g., Table 2 lista antiangiogenih faktora); i, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (npr., Tabela 1 navodi anti-angiogene agense koji se koriste u kliničkim ispitivanjima).
[0117] Pojedinac je kičmenjak, poželjno sisar, poželjnije čovek. Sisari uključuju, ali nisu ograničene na, farmske životinje (kao što su krave), sportske životinje, kućne ljubimce (kao što su mačke, psi i konji), primati, miševi i pacovi.
[0118] „Sisar“ za svrhu terapije odnosi se na bilo koju životinju koja je klasifikovana kao sisar, uključujući ljude, domaće i farmske životinje i životinje u zoo vrtovima, sportske životinje ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave, itd. Poželjno, sisar je čovek.
[0119] „Efektivna količina“ odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
[0120] „Terapeutski efikasna količina“ supstance/molekula pronalaska, agonista ili antagonista može se razlikovati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnost supstance/molekula, agonista ili antagonista da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj su neki otrovni ili štetni efekti supstance/molekula, agonista ili antagonista nadmašeni terapeutski korisnim efektima. „Profilaktički efikasna količina“ odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, ali ne obavezno, jer se profilaktička doza koristi kod pojedinaca pre ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.
[0121] „Stanja koja se odnose na gojaznost“ odnose se na uslove koji su posledica gojaznosti ili koji su pojačani gojaznošću, kao što su, ali ne ograničavajući se na dermatološke poremećaje kao što su infekcije, varikozne vene, akantozne nigrikane i ekcem, nentolerancija na vežbanje, diabetes melitus tipa II, insulinska rezistencija, hipertenzija, hiperholesterolemija, holelitiaza, osteoartritis, ortopedska povreda, tromboembolijska bolest, kancer i koronarna (ili kardiovaskularna) srčana oboljenja, posebno ona kardiovaskularna stanja povezani sa visokim trigliceridima i slobodnim masnim kiselinama kod osobe.
[0122] „Gojaznost“ odnosi se na stanje u kom sisar ima indeks telesne mase (BMI), koji se računa kao težina (kg) po visini<2>(metri), najmanje 25,9. Konvencionalno, pojedinac sa normalnom težinom ima BMI od 19,9 do manje od 25,9. Gubitak ovde može biti zbog bilo kog uzroka, bilo da je genetski ili ekološki. Primeri poremećaja koji mogu dovesti do gojaznosti ili biti uzrok gojaznosti uključuju prejedanje i bulimiju, bolest policističnih bolesti jajnika, kraniopharingioma, Prader-Vili sindrom, Frohličov sindrom, dijabetes tipa II, pacijente sa nedostatkom GH, normalan varijantni niži rast, Turnerov sindrom , i druga patološka stanja koja pokazuju smanjenu metaboličku aktivnost ili smanjenje potrošnje energije za odmor kao procenat ukupne mase bez masti, npr. deca sa akutnom limfoblastnom leukemijom.
[0123] Izraz „citotoksični agens“ koji se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništenje ćelija. Izraz je namenjen uključivanju radioaktivnih izotopa (npr., At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivni izotopi Lu), hemoterapeutski agensi, npr. metotreksat, adriamicin, vinca alkaloidi (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druga interkalirajuća sredstva, enzimi i njegovi fragmenti kao što su nukleolitički enzimi, antibiotici i toksini kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porijekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante, kao i razne antitumorne ili antikancerogene agense koji su objavljeni u nastavku. Ostali citotoksični agensi su opisani u nastavku. Tumoricidni agens izaziva uništavanje tumorskih ćelija.
[0124] „Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje korisno za lečenje kancera. Primeri hemoterapijskih agenasa uključuju agense za alkilaciju kao što su tiotepa i CITOKSAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbo kun, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilenetiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); betalapahol; lapahol; kolhicini; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan (HICAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopektektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; calistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adezelezin, carzelezin i bizelezin); podofilotokin; podofilinska kiselina; tenipozid; kriptoficini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarkodictin; spongistatin; azotne mustarde kao što su hlorambucil, hlornapazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil mustard; nitrozurea kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustink, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su enedinski antibiotici (npr. kaliheamicin, posebno kaliheamicin gamaII i kaliheamicin omegaII (pogledati, npr., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatinski hromofor i srodni hromoproteinski enedienski antiobiotski hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicinis, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin , ADRIAMICIN® doksorubicin (uključujući morfolin-doksorubicin, cijanomorfolin-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), cirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, kvelamicin, rodorubicin, stretonigrin, streptozocin, tuberkidin, ubenimek, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ankitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideokuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolonski propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalini kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljači folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamidni glikozid; aminolevulinična kiselina; eniluracil; amzakrine; bestrabucil; bisantren; edatrakat; defofamin; demekolcin; diazikon; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainine; maitanzinoidi kao što su maitanzin i ansamitocini; mitoguazone; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuone; 2,2',2"-trihlorotrietilamin, trihoteceni (naročito T-2 toksin, vracracin A, roridin A i anguidin), uretan, vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®), dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacitosin; arabinosid („Ara-C“); tiotepa; taksoidi, npr. TAXOL® paclitakel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANETM Formulacija nanočestica paclitakela, američki farmaceutski partneri, Schaumberg, Illinois) i TAXOTERE® doketakel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France), hloranbucil, gemcitabin (GEMZAR®, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, analozi platinei kao što su cisplatin i karboplatin, vinblastin (VELBAN®), platina, etoposid VP-16), ifosfamid, mitokantron, vincristin (ONCOVIN®), oksaliplatin, leucovin, vinorelbinc (NAVELBINE®), novantron, edatreksat, daunomicin, aminopterin, ibandronat, inhibitor topoizomeraze RFS 2000, difluorometilhortritin (DMFO), retinoidi kao retinokiselina, kapecitabin (KSELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenih, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristina i prednizolona, i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja sa oksaliplatinom (ELOXATINTM) u kombinaciji sa 5-FU i leucovovinom.
[0125] U ovu definiciju su uključeni i anti-hormonalni agensi koji deluju da regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu promovisati rast kancera i često su u obliku sistemskog ili tretmana celog tela. Oni mogu biti sami hormoni. Primeri su anti-estrogeni i selektivni modulatori estrogenih receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®) tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LI117018, onapriston i FARESTON® toremifen ; anti-progesteron; regulatori na dole estrogenih receptora (ERD); agensi koji funkcionišu za suzbijanje ili zaustavljanje jajnika, na primer, agonisti oslobađajućih hormona za lučenje hormona (LHRH) kao što su LUPRON® i ELIGARD® leuprolid acetat, goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; drugi anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su npr.4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® ekemestan, formestan, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol. Pored toga, takva definicija hemoterapijskih agenasa uključuje bisfosfonate kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-58095, ZOMETA® zoledronska kiselina/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, SKELID® tiludronat , ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozidni analog citozina); antisens oligonukleotidi, naročito oni koji inhibiraju eksprimiranje gena u signalnim putevima impliciranim u abhantantnoj proliferaciji ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptorski
2
faktor epidermalnog rasta (EGF-R); vakcine kao što su vakcine THERATOPE® i vakcine protiv gena, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAKSID® vakcina; LURTOTECAN® topoizomeraza 1 inhibitor; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditosilat (ErbB-2 i EGFR dual tirozin kinaza mali-molekulski inhibitor takođe poznat kao GV572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog.
[0126] „Agens za inhibiranje rasta“, kad se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili sastav koji inhibira rast ćelije (kao što je ćelija koja eksprimira KLβ) bilo in vitro ili in vivo. Prema tome, agens za inhibiranje rasta može biti jedan koji značajno smanjuje procenat ćelija (kao što je ćelija koja eksprimira KLβ) u S fazi. Primeri agenasa za inhibiranje rast uključuju agense koji blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju G1 zaustavljanje i M-fazno zaustavljanje. Klasični blokatori M faze uključuju vinkas (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ovi agensi koji zaustavljaju G1 takođe prelaze u zaustavljanje S-faze, na primer, agense za alkiliranje DNK, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dodatne informacije mogu se pronaći u Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, pod nazivom "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" od Murakami i dr. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), posebno p.13. Taksoni (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv raka koji se dobijaju od drveta tisa. Docetaksel (TAKSOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), izveden iz evropskog tisa, je polusintetički analog paclitaksela (TAKSOL®), Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel promovišu montažu mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavajući depolimerizaciju, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.
[0127] „Doksorubicin“ je antraciklinski antibiotik. Celokupno hemijsko ime doksorubicina je (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksi-α-L-likso-heksapiranosil)oksi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroksi-8-(hidroksiacetil)-1-metoksi-5,12-naftacendion.
[0128] Izraz „polipeptid koji sadrži Fc regiju“ odnosi se na polipeptid, kao što je antitelo ili imunoadezin (pogledati definicije ispod), koji obuhvata Fc regiju. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu za numeraciju) od Fc regije može se ukloniti, na primer, tokom prečišćavanja polipeptida ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Prema tome, sastav koja sadrži polipeptid koji ima Fc regiju u skladu sa ovim pronalaskom može da sadrži polipeptide sa K447, sa svim K447 odstranjenim ili mešavinom polipeptida sa i bez K447 ostatka.
KLβ
[0129] KLβ je transmembranski protein koji sadrži ekstracelularni domen koji sadrži dve regije sa homologijom onih u familiji 1 glikozidaze, transmembranskom domenu i kratkom intracelularnom hidrofilnom repu na karboksi terminusu. Ljudski KLβ protein je 1043 aminokiselinski protein i sadrži sledeće regije: signalni peptid (aminokiseline 1-51); glikozidaza (aminokiseline 77-508); glikozidaza (aminokiseline 517-967); transmembrana (aminokiseline 996-1012); i citoplazmatski domen (aminokiseline 1013-1043). KLβ nukleinske kiseline i sekvence aminokiselina su poznate u struci i o njima se dalje diskutuje ovde. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira KLβ može se dizajnirati koristeći aminokiselinsku sekvencu željene regije KLβ. Alternativno, može se koristiti sekvenca cDNK (ili njegovih fragmenta) od Klβ. Pristupni broj ljudskog KLβ je NM_175737, i pristupni broj mišjeg KLβ je NM_031180. Dodatni primeri KLβ sekvence su, na primer, prikazani na Slikama 17 i 18, i opisani, na primer, u Ito i dr. (2000) Mech Dev.98: 115-119.
KLβ modulatori
[0130] KLβ modulatori su molekuli koji moduliraju aktivnost KLβ, npr. agonisti i antagonisti. Izraz „KLβ agonist“ definisan je u kontekstu biološke uloge KLβ. U određenim otelotvorenjima, agonisti poseduju biološke aktivnosti KLβ, kao što je prethodno definisano. U nekim otelotvorenjima, KLβ agonisti vezuju FGFR4 (opciono u spoju sa heparinom), vezuju FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), vezuju FGFR4 i FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), promovišu indukciju FFF19, Junb i/ili Junc posredovanu sa FGF-19 (in vitro ili in vivo), promovišu nizvodnu signalizaciju FGFR4 i/ili FGF19 (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, aktivaciju ERK1/2 fosforilacije i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog KLβ i/ili FGFR4 biološkog puta.
[0131] Modifikatori KLβ su poznati u struci, a neki su opisani i prikazani ovde. Primerna i neograničavajuća lista KLβ antagonista (kao što je anti-Klβ antitelo) navedena je ovde pod „Definicije“.
[0132] Modulatori korisni u predmetnoj objavi mogu se okarakterisati po svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i biološkim funkcijama različitim analizama poznatim u ovoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, KLβ antagonisti se karakterišu za jedno ili više od: vezivanja za KLβ, redukciju ili blokiranje FGFR4 aktivacije, redukciju ili blokiranja FGFR4 receptora nizvodnom molekularnom signalizacijom, inhibicija KLβ enzimske aktivnosti (kao što je KLβ glikozidazna aktivnost), remećenje ili blokiranje vezivanja za FGF19, smanjenje i/ili blokiranje FGF19 nizvodne molekularne signalizacije i/ili lečenje i/ili prevencija tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili kancera (kao što je hepatocelularni karcinom); i/ili lečenje ili prevencija poremećaja povezanog sa KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću. Postupci za karakterizaciju KLβ antagonista i agonista su poznati u struci, a neki su opisani i prikazani ovde.
FGFR modulatori
[0133] FGFR modulatori su molekuli koji moduliraju aktivnost FGFR, npr. agonisti i antagonisti. „FGFR antagonist“ se odnosi na molekul koji je sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti FGF receptora („FGFR“) uključujući, na primer, vezivanje KLβ (opciono u spoju sa heparinom) FGF (npr. FGF19) (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje KLβ i FGF (npr. FGF19) (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje indukcije cFos, Junb i/ili Junc posredovane sa FGF19 (in vitro ili in vivo), promovisanje nizvodne signalizaciju FGFR i/ili FGF (uključujući ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, aktivaciju ERK1/2 fosforilacije i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog FGF i/ili FGFR biološkog puta i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanih sa FGFR eksprimiranjem i/ili aktivnošću (kao što je povećano eksprimiranje FGFR i/ili aktivnost). FGFR antagonisti uključuju antitela i fragmente koji se vezuju za antigen, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe uključuju inhibitore malih molekula proteina i fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein, čime se vezuje njegovo vezivanje za njegov cilj, antagonističke varijante proteina, siRNK molekula usmerenih na protein, antisens molekula usmerenih na protein, RNK aptameri i ribozimi protiv proteina. U nekim otelotvorenjima, FGFR antagonist (npr., FGFR4 antagonist) je molekul koji se vezuje za FGFR i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost FGFR.
[0134] FGFR modulatori su poznati u struci. Na primer, inhibitori malih molekula FGFR su opisani u Manetti, F. i Botta, M., Curr. Pharm. Des., 9, 567-581 (2003). Primer inhibitora malih molekula FGFR4 je PD173074 (Pfizer, Inc. Groton CT). Primerna i neograničavajuća lista FGFR antagonista (kao što je anti-FGFR antitelo) navedena je ovde pod „Definicije“. Postupci za karakterizaciju FGFR antagonista su poznati u struci, a neki su opisani i prikazani ovde.
FGF19 antagonisti
[0135] „FGF19 antagonist“ odnosi se na molekul koji je sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti FGF19 uključujući, na primer, vezivanje KLβ (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGFR4 (opciono u spoju sa heparin), vezivanje KLβ i FGFR4 (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje indukciju cFos, Junb i/ili Junc posredovane sa FGF19 (in vitro ili in vivo), promovisanje nizvodne signalizaciju FGFR4 i/ili FGF19 (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, aktivaciju ERK1/2 fosforilacije i aktivaciju puta Wnt) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog FGF19 i/ili FGFR4 biološkog puta i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanih sa FGF19 eksprimiranjem i/ili aktivnošću (kao što je povećano eksprimiranje FGF19 i/ili aktivnost). FGF19 antagonisti uključuju antitela i fragmente koji se vezuju za antigen, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe uključuju inhibitore malih molekula proteina i fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein, čime se vezuje njegovo vezivanje za
2
njegov cilj, antagonističke varijante proteina, siRNK molekula usmerenih na protein, antisens molekula usmerenih na protein, RNK aptameri i ribozimi protiv proteina. U nekim otelotvorenjima, FGF19 antagonist je molekul koji se vezuje za FGF19 i neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost FGF19.
[0136] FGF19 antagonisti su poznati u struci. Primerna i neograničavajuća lista FGF19 antagonista (kao što je anti-FGFR antitelo) navedena je ovde pod „Definicije“. Postupci za karakterizaciju FGFR antagonista su poznati u struci, a neki su opisani i prikazani ovde.
Antitela
[0137] Antitela su poželjno monoklonska, iako su poliklonska antitela takođe korisna i prikazana su ovde. Takođe obuhvaćeni u okviru pronalaska su Fab, Fab', Fab'-SH i F(ab')2fragmenti antitela koji su ovde navedeni. Ovi fragmenti antitela mogu se stvoriti tradicionalnim načinima, kao što je enzimska digestija, ili se mogu generisati rekombinantnim tehnikama. Takvi fragmenti antitela mogu biti himerni ili humanizovani. Ovi fragmenti su korisni za dijagnostičke i terapeutske svrhe navedene u nastavku. Anti-KLβ antitela su poznata u struci, npr. antitela objavljena u to i dr (2005) J Clin Invest 115(8): 2202-2208; R&D Systems Catalog No. MAB3738. Anti-FGF19 antitela su objavljena u, na primer, WO2007/13693. Antitelo protiv FGF19 može biti antitelo koje sadrži (a) lak lanac koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu KASQDINSFLA (SEQ ID NO: 53); (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu RANRLVS (SEQ ID NO: 54); i (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 55), i (b) težak lanac koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 56); (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu GVIWPGGGTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 57); i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu VRKEYANLYA (SEQ ID NO: 58).
[0138] Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Tako modifikator „monoklonski“ označava karakter antitela koja nisu mešavina diskretnih antitela.
[0139] Monoklonska antitela se mogu napraviti koristeći postupak hibridoma koju je prvi opisao Kohler i dr., Nature, 256: 495 (1975), ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (SAD Patent br.
4,816,567).
[0140] U postupku hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizuju se kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Antitela za određenu ciljanu grupu uglavnom su uzgajana u životinjama putem multiple potkožne (sc) ili intraperitonealne (ip) injekcije ciljanog imunogena i adjuvansa. Ciljani polipeptid se može pripremiti koristeći postupke dobro poznate u struci, od kojih su neki dalje opisani ovde. Na primer, rekombinantna proizvodnja proteina je opisana u nastavku. U jednom otelotvorenju, životinje su imunizovane sa derivatom antigena koji sadrži ekstracelularni domen (ECD) mete fuzionisan na Fc deo teškog lanca imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, životinje se imunizuju sa ciljanim polipeptid-IgG 1 fuzionim proteinom. Životinje se obično imunizuju protiv imunogenih konjugata ili derivata ciljanog polipeptida sa monofosforil lipidom A (MPL)/trehaloza dikrinomikolatom (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) i rastvor se injektira intradermalno na više mesta. Dve nedelje kasnije životinje su ojačane.7 do 14 dana kasnije životinje se krvare i serum se analizira za anti-antigen titer. Životinje se ojačavaju do titarskih platoa.
[0141] Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti su zatim spojeni sa ćelijama mijeloma korišćenjem odgovarajućeg fuzijskog agensa, kao što je polietilen glikol, kako bi se formirala ćelija hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
[0142] Tako pripremljene ćelije hibridoma se seju i rastu u odgovarajućem medijumu za kulturu, koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljske mijelomske ćelije nemaju enzim hipoksantin-guanfosforibozil-transferaze (HGPRT ili HPRT), medijum za kulturu hibridoma tipično će obuhvatiti hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), gde supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijencije ćelije.
2
[0143] Poželjne ćelije mijeloma su one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu visokokvalitetnu proizvodnju antitela od izabranih ćelija za proizvodnju antitela i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, željene mijelomske ćelijske linije su mijelomske linija miša, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miševa dostupnih od strane Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA i SP-2 ili X63-Ag8- 653 ćelije dostupne od strane American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Ljudski mijelom i mišje-ljudske ćelijske linije heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[0144] Medijum kulture u kom rastu hibridoma ćelije se analizira za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od strane ćelija hibridoma se određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili enzim-povezani imunoadsorbentni test (ELISA).
[0145] Afinitet vezivanja monoklonskih antitela može, na primer, biti određen pomoću Skečardove analize od Munson i dr., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0146] Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti subklonirani procedurama ograničavanja rastvaranja i uzgajani standardnim postupcima (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Pogodni medijumi za kulturu za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao tumori ascita kod životinja.
[0147] Monoklonska antitela koja luče pod-klonovi su odgovarajuće odvojena od medijuma kulture, ascitne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što su, na primer, protein A-Sefaroza, hromatografija hidroksilapatita, elektroforeza gela, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0148] Antitela se mogu napraviti korišćenjem kombinatornih biblioteka za skrining za sintetičke klonove antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. U principu, klonovi sintetičkih antitela se biraju skriningom biblioteka fage koje sadrže fag koji prikazuje različite fragmente varijabilne regije antitela (Fv) spojenog sa proteinom obloge faga. Takve biblioteke faga se paniraju pomoću afinitetne hromatografije protiv željenog antigena. Klonovi koji eksprimiraju fragmente Fv koji se mogu vezati za željeni antigen se adsorbuju na antigen i time se odvajaju od neobavezujućih klonova u biblioteci. Vezujući klonovi se zatim eluiraju iz antigena i mogu se dodatno obogatiti dodatnim ciklusima adsorpcije/elucije antigena. Bilo koje željeno antitelo se može dobiti tako što se dizajnira odgovarajuća procedura za selekciju antigena za odabir za fagni klon od interesa, što je praćeno izgradnjom klona antitela cele dužine koristeći Fv sekvence iz fagnog klona od interesa i odgovarajućih sekvenci konstantne regije (Fc) opisane u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3.
[0149] Antigen-vezujući domen antitela se formira od dve varijabilne (V) regije od oko 110 aminokiselina, po jednog lakog (VL) i teškog (VH) lanca, gde oba predstavljaju tri hipervariabilne petlje ili regije koje određuju komplementarnost (CDR). Varijabilni domeni mogu se funkcionalno prikazivati na fag-u, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti, u kojima su VH i VL kovalentno povezani kroz kratki, fleksibilni peptid ili kao Fab fragmenti, u kojima je svaki fuzionisan sa konstantnim domenom i interakuju ne-kovalentno, kako je opisano kod Winter i dr., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Kad se ovde koristi, scFv koji kodira fagne klonove i Fab koji kodira fagne klonove su kolektivno nazvani „Fv fagni klonovi“ ili „Fv klonovi“.
[0150] Repertoari VH i VL gena mogu se zasebno klonirati pomoću polimerazne lančane reakcije (PCR) i rekombinisati nasumično u fagne biblioteke, koje se zatim mogu pretraživati za kloniranje antigena, kako je opisano kod Winter i dr., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Biblioteke iz imunizovanih izvora pružaju antitela visokog afiniteta za imunogen bez potrebe za izgradnjom hibridoma. Alternativno, naivni repertoar se može klonirati kako bi se obezbedio jedinstveni izvor ljudskih antitela u širokom spektru ne-sopstvenih i takođe sopstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što je opisano kod Griffiths i dr., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu se takođe sintetizovati
2
kloniranjem neraspoređenih V-genih segmenata iz matičnih ćelija i primenom PCR prajmera koji sadrže slučajnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilih CDR3 regija i za postizanje preuređivanja in vitro kao što je opisano kod Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
[0151] Filamentni fag se koristi za prikazivanje fragmenata antitela fuzijom do proteina pIII manjeg sloja. Fragmenti antitela mogu se prikazati kao FV fragmenti sa jednim lancem, u kojima su VH i VL domeni povezani na istom polipeptidnom lancu sa fleksibilnim polipeptidnim distancerom, npr. kao što je opisano kod Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili kao Fab fragmenti, u kojima je jedan lanac spojen sa pIII, a drugi se luči u periplazmu bakterijske ćelije domaćina gde se gradi Fab-obložena struktura proteina koja se prikazuje na površini faga pomeranjem nekog divljeg sloja proteina, npr kao što je opisano kod Hoogenboom i dr., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
[0152] Generalno, nukleinske kiseline koje kodiraju genske fragmente antitela dobijaju se od imunih ćelija prikupljenih od ljudi ili životinja. Ako je poželjna biblioteka pristrasna u korist anti-antigenih klonova, pacijent se imunizuje antigenim polipeptidom kako bi se dobio antitelski odgovor, a ćelije slezine i/ili cirkulišuće B ćelije drugih limfociti periferne krvi (PBL) se prikupljaju za izgradnju biblioteke. U poželjnom otelotvorenju, biblioteka fragmenta gena genetskog antitela koja je pristrasna u korist anti-ljudskih klona dobijena je stvaranjem anti-ljudskog odgovora antitela kod transgenih miševa koji nose funkcionalni ljudski imunoglobulinski genski niz (i nedostaje im funkcionalni sistem proizvodnje endogenih antitela) tako da imunizacija dovodi do B ćelija koje proizvode ljudska antitela protiv antigena. Generisanje ljudskih transgenih miševa za ljudska antitela je opisano kod nastavku.
[0153] Dodatno obogaćivanje za populacije anti-antigen reaktivne ćelija može se dobiti korišćenjem odgovarajuće procedure skrininga kako bi se izolovale B ćelije koje eksprimiraju antigen-specifično membransko vezano antitelo, npr. separacijom ćelija sa hromatografijom afiniteta antigena ili adsorpcijom ćelija na fluorohrom-obeleženi antigeni protein sa sortiranjem tokom-aktiviranih ćelija (FACS).
[0154] Alternativno, korišćenje ćelija slezine i/ili B ćelija ili drugih PBL iz neimunizovanog donora pruža bolju predstavu mogućeg repertoara antitela, a takođe dozvoljava i izgradnju biblioteke antitela pomoću bilo koje vrste životinja (ljudskih ili ne-ljudskih) u kojima antigen nije antigenski. Za biblioteke koje sadrže in vitro konstrukciju gena antitela, matične ćelije se sakupljaju od pacijenta kako bi se obezbedile nukleinske kiseline koje kodiraju neograničene genske segmente antitela. Imunne ćelije od interesa mogu se dobiti od raznih vrsta životinja, kao što su čovek, miš, pacov, lagomorf, luprin, pas, mačka, svinja, govedo, konj i ptica itd.
[0155] Nukleinska kiselina koja kodira varijabilne genske segmente antitela (uključujući VH i VL segmente) se prikuplja iz ćelija od interesa i pojačavaja. U slučaju preuređenih VH i VL biblioteka gena, željena DNK može se dobiti izolovanjem genomske DNK ili mRNK iz limfocita praćeno lančanom reakcijom polimerazne (PCR) sa prajmerima koji se podudaraju sa 5' i 3' krajevima preuređenih VH i VL gena kao je opisano kod Orlandi i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), time stvarajući različite repertoar V gena za eksprimiranje. V geni se mogu pojačati iz cDNK i genomske DNK, sa prajmerima na 5' kraju egzona koji kodiraju zrele V-domene i prednje prajmere zasnovane unutar J-segmenta kao što je opisano kod Orlandi i dr. (1989) and in Ward i dr., Nature, 341: 544-546 (1989). Međutim, za pojačavanje iz cDNK, zadnji prajmeri se takođe mogu zasnivati na lider eksonu kao što je opisano kod Jones i dr., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), i prednji prajmeri unutar konstantne regije kako je opisano kod Sastry i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Kako bi se maksimizovala komplementarnost, degeneracija se može inkorporirati u prajmere kao što je opisano kod Orlandi i dr. (1989) or Sastry i dr. (1989). Poželjno je da se raznolikost biblioteke maksimizira korišćenjem PCR prajmera ciljanih na svaku porodicu V-gena kako bi se pojačali svi raspoloživi VH i VL aranžmani prisutni u uzorku nukleinske ćelije imunih ćelija, npr. kao što je opisano kod postupku Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ili kao što je opisano kod postupku od Orum i dr., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Za kloniranje pojačane DNK u vektore eksprimiranja, retka mesta restrikcije mogu se uvesti u PCR prajmeru kao obeležje na jednom kraju kao što je opisano kod Orlandi i dr. (1989), ili daljim PCR pojačavanjem sa obeleženim prajmerom kao što je opisano kod Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991).
[0156] Repertoari sintetički preuređenih V gena mogu biti izvedeni in vitro iz segmenata V gena. Većina
2
ljudskih segmenta VH-gena je klonirana i sekvencirana (objavljeno kod Tomlinson i dr., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), i mapirana (objavljeno kod Matsuda i dr., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); ti klonirani segmenti (uključujući sve glavne konformacije H1 i H2 petlje) mogu se koristiti za stvaranje različitih repertoara VH gena sa PCR prajmerima koji kodiraju H3 petlje različite sekvence i dužine kao što je opisano kod Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). VH repertoari se takođe mogu napraviti sa svim raznovrsnostima sekvence fokusiranim u dugačku H3 petlju jedne dužine kao što je opisano kod Barbas i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Ljudski VK i VL segmenti su klonirani i sekvencirani (objavljeno kod Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) i mogu se koristiti za proizvodnju sintetičkih repertoara lakih lanaca. Sintetički V genski repertoari, bazirani na opsegu VH i VL savijanja, i dužine L3 i H3, kodiraju antitela sa značajnom strukturalnom raznovrsnošću. Nakon amplifikacije V-gena koji kodiraju DNK, segmenti V gena za germ liniju mogu se preurediti in vitro prema postupcima od Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
[0157] Repertoari fragmenata antitela mogu se konstruisati kombinovanjem VH i VL repertoara gena zajedno na nekoliko načina. Svaki repertoar se može stvoriti u različitim vektorima, a vektori rekombinovani in vitro, npr., kako je opisano kod Hogrefe i dr., Gene, 128: 119-126 (1993) ili in vivo pomoću kombinatorne infekcije, npr. loxP sistema opisanog kod Waterhouse i dr., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). Pristup rekombinacije in vivo koristi dvostepenu prirodu Fab fragmenata kako bi prevazišao ograničenje veličine biblioteke nametnuto efikasnošću transformacije E. coli. Naivni VH i VL repertoari se kloniraju zasebno, jedan u fagemid, a drugi u fagni vektor. Dve biblioteke se zatim kombinuju fagnim infekcijama bakterija koje sadrže fagemid tako da svaka ćelija sadrži drugačiju kombinaciju, a veličina biblioteke ograničena je samo brojem prisutnih ćelija (oko 10<12>klonova). Oba vektora sadrže signale rekombinacije in vivo, tako da se VH i VL geni rekombinuju na jedan replikon i pakuju u fagne virione. Ove ogromne biblioteke pružaju veliki broj različitih antitela dobrog afiniteta (Kd<-1>od oko 10<-8>M).
[0158] Alternativno, repertoari mogu biti klonirani sekvencijalno u isti vektor, npr. kao što je opisano kod Barbas i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ili se zajedno sastavljaju od strane PCR i zatim kloniraju, npr. kao što je opisano kod Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991). PCR sklapanje se takođe može koristiti za pridruživanje VH i VL DNK sa DNK koja kodira fleksibilni peptidni distancer za formiranje repertoara jednolančanog Fv (scFv). U još jednom postupku, „u sklopu ćelija PCR“ se koristi kombinacija VH i VL gena unutar limfocita pomoću PCR, i zatim se kloniraju repertoari povezanih gena kao što je opisano kod Embleton i dr., Nucl. Acids Res., 20, str. 3831-3837 (1992).
[0159] Antitela proizvedena naivnim bibliotekama (bilo prirodnim ili sintetičkim) mogu biti umerenog afiniteta (Kd<-1>od oko 10<6>do 10<7>M<-1>), ali sazrevanje afiniteta može se takođe imitirati in vitro konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka kako je opisano kod Winter i dr. (1994), supra. Na primer, mutacija se može slučajno in vitro uvesti korišćenjem polimeraze podložne greškama (prijavljeno od strane Leung i dr., Technique, 1: 11-15 (1989)) u postpuku Hawkins i dr., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) ili u postpuku Gram i dr., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Pored toga, sazrevanje afiniteta može se izvršiti slučajnim mutiranjem jedne ili više CDR, npr. koristeći PCR sa prajmerima koji nose slučajnu sekvencu koja obuhvata CDR od interesa, u odabranim pojedinačnim klonovima Fv i skriningom za klonove sa višim afinitetom. WO 9607754 (objavljeno 14. marta 1996) opisao je postupak za indukovanje mutageneze u regiji za određivanje komplementarnosti lakog lanca imunoglobulina za stvaranje biblioteke gena lakog lanca. Drugi efikasan pristup je rekombinovanje VH ili VL domena odabranih prikazom faga sa repertoarima varijanti domena u prirodnom obliku dobijenih od neimunizovanih donora i skrininga za veći afinitet u nekoliko krugova premeštanja lanca, kako je opisano kod Marks i dr., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Ova tehnika dozvoljava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa afinitetima u opsegu od 10<-9>M.
[0160] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen može se dizajnirati koristeći aminokiselinsku sekvencu željene regije antigena. Alternativno, može se koristiti sekvenca cDNK (ili njegovih fragmenta). DNK koji kodiraju antigen mogu biti pripremljeni različitim postupcima poznatim u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničene na, hemijsku sintezu prema bilo kojoj od opisanih postupaka kod Engels i dr., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), kao što su triester, fosfit,
2
fosforamidit i H-fosfonat postupci. U jednom otelotvorenju, kodoni koji se preferiraju iz ćelije eksprimiranja domaćina koriste se u dizajniranju DNK. Alternativno, DNK koji kodira antigen može biti izolovan iz genomske ili cDNK biblioteke.
[0161] Posle izgradnje antigena koji kodira molekul DNK, molekul DNK operativno je vezana za sekvencu za kontrolu eksprimiranja u vektoru eksprimiranja, kao što je plazmid, pri čemu kontrolnu sekvencu prepoznaje ćelija domaćin transformisana sa vektorom. Generalno, plazmidni vektori sadrže replikacijske i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćina. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i sekvence koje kodiraju proteine koji su sposobni da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Pogodni vektori za eksprimiranje u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćinima su poznati u struci i neki su dalje opisani ovde. Mogu se koristiti eukariotski organizmi, kao što su kvasci ili ćelije izvedene iz višećelijskih organizama, kao što su sisari.
[0162] Opcionalno, antigen koji kodira DNK operativno je povezan sa sekretornom liderskom sekvencom koja rezultuje lučenjem produkata eksprimiranja od strane ćelije domaćina u medijum za kulturu. Primeri sekretornih liderskih sekvenci uključuju stII, ekotin, lamB, herpes GD, lpp, alkalna fosfataza, invertaza i alfa faktor. Takođe pogodna za upotrebu ovde je 36 aminokiselinska lider sekvenca proteina A (Abrahmsen i dr., EMBO J., 4: 3901 (1985)).
[0163] Ćelije domaćina se transfektovane i poželjno se transformišu sa gore opisanim vektorima eksprimiranja ili vektorima za kloniranje ovog pronalaska i kultivisane su u konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovanom kao što je pogodno za indukovanje promotera, selekciju transformanata ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence.
[0164] Transfekcija se odnosi na uzimanje vektora eksprimiranja od strane ćelije domaćina bez obzira na to da li su sekvence kodiranja stvarno eksprimirane. Brojni postupci transfekcije su poznati uobičajenim stručnjacima, na primer, CaPO4taloženje i elektroporacija. Uspešna transfekcija se generalno prepoznaje kada bilo koja indikacija o delovanju ovog vektora potiče unutar ćelije domaćina. Postupic transfekcije su dobro poznate u struci, a neke su dalje opisane ovde.
[0165] Transformacija znači uvođenje DNK u organizam tako da se DNK može replikovati, bilo kao ekstrahromozomski element ili hromozomski integrant. U zavisnosti od korišćene ćelije domaćina, transformacija se vrši pomoću standardnih tehnika pogodnih za takve ćelije. Postupci za transformaciju su dobro poznati u struci, a neki su dalje opisane ovde.
[0166] Prokariotske ćelije domaćina koji se koriste za proizvodnju antigena mogu se kultivisati kao što je generalno opisano kod Sambrook i dr., Supra.
[0167] Ćelije domaćini sisara koje se koriste za proizvodnju antigena mogu se kultivisati u različitim medijumima, što je dobro poznato u struci i nekeiod njih su ovde opisani.
[0168] Ćelije domaćina navedene u ovom obelodanjivanju obuhvataju ćelije u kulturi in vitro, kao i ćelije koje su u domaćoj životinji.
[0169] Prečišćavanje antigena može se postići korišćenjem postupaka priznatih u struci.
[0170] Očišćeni antigen može biti pričvršćen za odgovarajuću matricu kao što su agarzne prele, akrilamidne perle, staklene perle, celuloza, različiti akrilni kopolimeri, hidroksil metakrilatni gel, poliakrilni i polimetakrilni kopolimeri, najlonski, neutralni i jonski nosače i slično, za upotrebu u afinitetnom hromatografskom odvajanje klonova prikaza faga. Dodavanje proteina u matricu može se postići postupcima opisanim u Methods in Enzymology, vol.44 (1976). Uobičajeno korišćena tehnika vezivanja proteinskih liganda na polisaharidne matrice, npr. agaroza, dekstran ili celuloza, podrazumeva aktivaciju nosača sa cijanogen halidima i kasnije spajanje primarnih alifatskih ili aromatskih amina peptidnih liganda u aktiviranu matricu.
[0171] Alternativno, antigen se može koristiti za premazivanje komorica adsorpcionih ploča, eksrpimiranih na ćelijama domaćinima koje su pričvršćene na adsorpcione ploče ili se koriste u sortiranju ćelija ili konjugovane sa biotinom za uzimanje uzoraka sa streptavidinom ili korišćenjem bilo kog drugog poznatog postupka za ispiranje biblioteke faga.
[0172] Uzorci biblioteke faga stupaju u dodir sa imobilizovanim antigenom pod uslovima pogodnim za vezivanje barem jednog dela čestica faga sa adsorbentom. Normalno, uslovi, uključujući pH, jonsku jačinu, temperaturu i slično, odabrani su da imitiraju fiziološka stanja. Fagi vezani za čvrstu fazu se peru i zatim eluiraju kiselinom, npr. kao što je opisano kod Barbas i dr., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991) ili alkalima, npr. kao što je opisano kod Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597. (1991), ili konkurentim KLβ antigenom, npr. u postupku sličnom postupku nadmetanja antigena od Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991). Fagi se mogu obogatiti 20-1000 puta u jednoj rundi selekcije. Štaviše, obogaćeni fagi se mogu gajiti u bakterijskoj kulturi i podvrgnuti daljim krugovima selekcije.
[0173] Efikasnost selekcije zavisi od mnogih faktora, uključujući kinetiku disocijacije tokom pranja i da li se višestruki fragmenti antitela na jednom fagu istovremeno mogu angažovati sa antigenom. Antitela sa brzom kinetikom disocijacije (i slabim afinitetom vezivanja) mogu se zadržati korišćenjem kratkih pranja, multivalentnog prikaza faga i visoke gustine antigena u čvrstoj fazi. Visoka gustina ne samo da stabilizuje fag preko multivalentnih interakcija, već daje prednost obnavljanju faga koji se disociira. Izbor antitela sa sporijom kinetikom disocijacije (i dobrim afinitetom vezivanja) može se promovisati upotrebom dugih pranja i monovalentnog prikaza faga kao što je opisano kod Bass i dr., Proteins, 8: 309-314 (1990) i u WO 92/09690, i nisku gustinu oblaganja antigena kao što je opisano kod Marks i dr., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
[0174] Moguće je odabrati između antitela faga različitih afiniteta, čak i sa afinitetima koji se blago razlikuju, za antigen. Međutim, slučajna mutacija odabranog antitela (npr. kao što je izvedeno u nekim od tehnika sazrevanja afiniteta opisanih gore) verovatno će dovesti do mnogih mutacija, najčešće vezivanja za antigen, i nekoliko sa većim afinitetom. Sa ograničavajućim antigenom, retki fag visokog afiniteta može biti konkurentan. Za zadržavanje svih mutanata visokog afinitetnih, fagi mogu biti inkubirani sa viškom biotinilovanog antigena, ali sa biotinilovanim antigenom u koncentraciji niže molarnosti od konstantne molarne afinitetne konstante za antigen. Fagi koji se vezuju za visok afinitet mogu zatim biti zarobljeni paramagnetnim perlama obloženim streptavidinom. Takvo „hvatanje ravnoteže“ dozvoljava odabiranje antitela u skladu sa njihovom afinitetom vezivanja, sa osetljivošću koja omogućava izolaciju mutantnih klonova sa čak dvostruko većim afinitetom od velikog viška faga sa manjim afinitetom. Uslovi korišćeni za pranje faga vezanih za čvrstu fazu takođe mogu biti manipulisani kako bi se diskriminisali na osnovu kinetike disociacije. Klonovi protiv antigena takođe mogu biti odabrani.
[0175] DNK koja kodira hibridom monoklonska antitela ili prikaz faga Fv klona se lako izoluju i sekvenciraju korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. pomoću oligonukleotidnih prajmera dizajniranih da specifično pojačavaju teške i lakše lance kodirajuće oblasti od interesa od hibridoma ili šablona DNKA faga). Jednom izolovana, DNK se može staviti u vektore eksprimiranja, koji se tada transfektiraju u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, simian COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se dobila sinteza željenih monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Pregled članaka o rekombinantnom ekspremiranju DNK koja kodira antitela kod bakterija uključuje Skerra i dr., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) i Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).
[0176] DNK koja kodira klonove Fv može se kombinovati sa poznatim sekvencama DNK koje kodiraju konstantne regije teškog lanca i/ili lakog lanca (npr. odgovarajuće DNK sekvence mogu se dobiti od Kabat i dr., supra) kako bi se formirali klonovi koji kodiraju teške i/ili lake lance pune ili delimične dužine. Biće prihvaćeno da se u ovu svrhu mogu koristiti konstantne regije bilo kog izotopa, uključujući IgG, IgM, IgA, IgD i IgE konstantne regije, i da se takve konstantni regije mogu dobiti od bilo koje ljudske ili životinjske vrste. Fv klon, izveden iz DNK varijabilnog domene jedne vrste životinja (kao što je čovek), a zatim je spojen sa konstantnom DNK regijom druge životinjske vrste kako bi se formirale kodirajuće sekvence za „hibridni“, teški lanac i/ili laki lanac pune dužine, uključen je u definiciju „himernih“ i „hibridnih“ antitela kako se ovde koristi. U poželjnom otelotvorenju, Fv klon izveden iz ljudskog varijabilnog DNK je spojen sa DNK ljudske konstantne regije kako bi se formirale kodirajuće sekvence za sve ljudske teške i/ili lake lance, pune ili delimične dužine.
[0177] DNK koja kodira anti-antigen antitela izvedena iz hibridoma takođe može biti modifikovana, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci izvedenih iz klonova hibridoma (npr. kao u postupku od Morrison i dr., Proc. Natl.
1
Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Antitelo ili fragment izvedeni od DNK koja kodira hibridom ili Fv klona mogu se dalje modifikovati kovalentnim spajanje na sekvencu kodiranja imunoglobulina, u celini ili delom kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulinski polipeptid. Na taj način se dobijaju „himerna“ ili „hibridna“ antitela koja imaju specifičnost vezivanja antitela izvedenih od Fv klona ili hibridoma klona.
Fragmenti antitela
[0178] Ovaj pronalazak obuhvata fragmente antitela. U određenim okolnostima postoje prednosti korišćenja fragmenata antitela, a ne celih antitela. Manja veličina fragmenata omogućava brzi klirens i može dovesti do poboljšanog pristupa čvrstim tumorima.
[0179] Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se izvode putem proteolitičke digestije netaknutih antitela (pogledati, na primer, Morimoto i dr., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); i Brennan i dr., Science, 229: 81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti se sada mogu direktno proizvesti rekombinantnim ćelijama domaćina. Fab, Fv i ScFv fragmenti antitela mogu se svi eksprimirati i izlučiti iz E. coli, omogućavajući tako laku proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka faga antitela o kojima se govori gore. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu se direktno dobiti od E. coli i hemijski spojeni tako da formiraju F(ab')2fragmenti (Carter i dr., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti se mogu izolovati direktno iz kulture rekombinantne ćelije domaćina. Fab i F(ab')2fragment sa povišenim poluživotom in vivo koji sadrži ostatke vezivnog epitopa vezujućeg receptora, opisani su u U.S. Pat. No. 5,869,046. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnjaku u oblasti. U drugim otelotvorenjima, izabrano antitelo je jednolančani Fv fragment (scFv). Pogledati WO 93/16185; U.S. Pat. Nos.5,571,894; i 5,587,458. Fv i sFv su jedine vrste sa netaknutim kombinacionim mestima koje su lišene konstantnih regija; tako su pogodni za smanjenje nespecifičnog vezivanja tokom in vivo upotrebe. sFv fuzioni proteini mogu biti konstruisani kako bi se dobila fuzija efektorskog proteina na bilo koji amino ili karboksi terminus sFv. Pogledati Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Fragment antitela takođe može biti „linearno antitelo“, npr., kako je opisano kod U.S. Pat. No. 5,641,870 npr. Takvi fragmenti linearnih antitela mogu biti monospecificni ili bispecifični.
Humanizovana antitela
[0180] Predmetni pronalazak obuhvata humanizovana antitela. Različiti postupci za humanizovanje neljudskih antitela poznati su u struci. Na primer, humanizovano antitelo može imati jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji se unose u njega iz izvora koji nije čovek. Ovi ne-ljudski ostaci aminokiselina se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se obično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti po postupku Winter i saradnika (Jones i dr. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann i dr. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen i dr. (1988) Science 239:1534-1536), zamenjujući sekvence hipervariabilne regije za odgovarajuće sekvence ljudskog antitela. Prema tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (SAD Patent br. 4,816,567) gde je značajno manje od netaknutog ljudskog varijabilnog domena zamenjeno odgovarajućom sekvencom iz ne-ljudske vrste. U praksi, humanizovana antitela su uglavnom ljudska antitela u kojima su neki ostaci hipervarijabilne regije i eventualno neki ostaci FR supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
[0181] Izbor ljudskih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji se koriste za izradu humanizovanih antitela, veoma je važan za smanjenje antigenicnosti. Prema tzv. „best-fit“ postupku, sekvenca varijabilnog domena antitela za glodare se ispituje prema celoj biblioteci poznatih ljudskih sekvenci varijabilnog domena. Ljudska sekvenca koja je najbliža onoj od glodara se onda prihvata kao ljudski okvir za humanizovano antitelo (Sims i dr. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia i dr. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Drugi postupak koristi određeni okvir koji proizilazi iz konsenzusne sekvence svih ljudskih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i dr. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 89:4285; Presta i dr. (1993) J. Immunol., 151:2623.
[0182] Dalje je važno da antitela budu humanizovana zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i druga povoljna biološka svojstva. Kako bi se postigao ovaj cilj, prema jednoj postupku, humanizovana antitela
2
se pripremaju procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli su često dostupni i poznati stručnjacima. Na raspolaganju su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatske imunoglobulinske sekvence, tj. analize ostataka koji utiču na sposobnost kandidatskog imunoglobulina da veže svoj antigen. Na taj način, FR ostaci mogu biti odabrani i kombinovani od primaoca i uvoznih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za metu. Generalno, ostaci hipervariabilne regije su direktno i najznačajnije uključeni u uticaj na vezivanje antigena.
Ljudska antitela
[0183] Ljudska anti-KLβ antitela se mogu konstruisati kombinovanjem Fv klonova varijabilnih domena izabranih iz biblioteka prikazanim faga izvedenih iz ljudi sa poznatim ljudskim sekvencama konstantnog domena, kao što je gore opisano. Alternativno, ljudska monoklonska anti-KLβ antitela mogu biti izvedena hibridomskim postupkom. Ljudski mijelom i mišje-ljudske ćelijske linije heteromijelom za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela opisani su, na primer, kod Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner i dr., J. Immunol., 147: 86 (1991).
[0184] Sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvedu pun repertoar ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna brisanja gena za vezivanje regije teškog lanca (JH) antitela u himernim i germline mutiranim miševima dovode do potpune inhibicije proizvodnje endogenih antitela. Prenos ljudskog germline niza imunoglobulinskih gena u takvim germline mutant miševima bi rezultovao stvaranjem ljudskih antitela nakon izazivanja antigena. Pogledati, na primer, Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immunol., 7: 33 (1993).
[0185] Menjanje gena takođe se može koristiti za izvođenje ljudskih antitela od ne-ljudskih, npr. glodarskih, antitela, gde ljudsko antitelo ima slične afinitete i specifičnosti za početno ne-ljudsko antitelo. Prema ovom postupku, koji se takođe naziva „imprintovanje epitopa“, bilo varijabilna regija teškog ili lakog lanca ne-ljudskog fragmenta antitela dobijena tehnikom fagnog prikaza kao što je gore opisano, zamenjuje se repertoarom ljudskih gena V domena, stvarajući populaciju ne-ljudskog lanca/ljudskog lanca scFv ili Fab himere. Biranje sa antigenom rezultuje izolovanjem lne-ljudskog lanca/ljudskog lanca himernog scFv ili Fab, pri čemu ljudski lanac obnavlja mesto vezivanja antigena uništeno nakon uklanjanja odgovarajućeg ne-ljudskog lanca u klonu primarnog faga, tj. epitop upravlja (otiskuje se na) izborom partnera u partnerskog ljudskom lancu. Kada se proces ponovi kako bi se zamenio preostali ne-ljudski lanac, dobijeno je ljudsko antitelo (pogledati PCT WO 93/06213 objavljen 1. aprila 1993). Za razliku od tradicionalne humanizacije ne-ljudskih antitela pomoću CDR graftinga, ova tehnika pruža potpuno ljudska antitela, koja nemaju FR ili CDR ostatke ne-ljudskog porekla.
Bispecifična antitela
[0186] Bispecifična antitela su monoklonska, poželjno ljudska ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. U jednom otelotvorenju, jedna od specifičnosti vezivanja je za KLβ, a druga za bilo koji drugi antigen. Primerna bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa proteina KLβ. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa za ćelije koje eksprimiraju KLβ. Ova antitela poseduju KL-vezujući krak i krak koji vezuje citotoksični agens (npr. saporin, anti-interferon-α, vinca alkaloid, ricin A lanac, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela mogu se dobiti kao antitela u punoj dužini ili fragmenti antitela (npr. F(ab')2bispecifična antitela).
[0187] Postupci za izradu bispecifičnih antitela poznati su u struci. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela zasnovana je na ko-eksprimiranju dva para teških lanaca i lakih lanaca imunoglobulina, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Zbog nasumičnog asortimana teških i lakih lanaca imunoglobulina, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima tačnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje tačnog molekula, koje se obično vrši pomoću afinitetnih hromatografskih koraka, prilično je teško i prinos proizvoda je nizak. Slične procedure su objavljene u WO 93/08829 objavljenom 13. maja 1993, i kod Traunecker i dr., EMBO J., 10: 3655 (1991).
[0188] Prema drugačijem i poželjnijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim karakteristikama vezivanja (mesta za kombinovanje antitela i antigena) su spojeni sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži bar deo zglobne, CH2 i CH3 regije. Poželjno ima prvu konstantnu regiju teškog lanca (CH1), koja sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutno u barem jednoj od fuzija. DNK koji kodiraju fuzije teških lanaca imunoglobulina i, ako je poželjno, laki lanac imunoglobulina, ubacuju se u odvojene vektore eksprimiranja i ko-transfektuju u odgovarajući organizam domaćina. Ovo pruža veliku fleksibilnost u prilagođavanju uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u otelotvorenjima kada nejednaki odnosi tri lanca polipeptida koji se koriste u konstrukciji pružaju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jednom vektoru eksprimiranja kada eksprimiranje najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultuje visokim prinosima ili kada su odnosi bez posebnog značaja.
[0189] U poželjnom aspektu ovog pristupa, bispecifična antitela su sastavljena od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom specifičnosti vezivanja u jednom kraku i parom lakog lanca i teškog lanca hibridnog imunoglobulina (koji pruža drugu specifičnost vezivanja) u drugom kraku. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, pošto prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula omogućava lakši način odvajanja. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za dalje detalje o stvaranju bispecifičnih antitela, pogledati, na primer, Suresh i dr., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
[0190] Prema drugom pristupu, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati da maksimizuje procenat heterodimera koji se regenerišu iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjni interfejs sadrži bar jedan deo CH3 domena konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više bočnih lanaca male aminokiseline iz interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se sa većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Kompenzujuće „šupljine“ identične ili slične veličine velikog bočnog lanca stvorene su na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih lanaca aminokiselina sa manjim (npr. alanin ili treonin). Ovo pruža mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.
[0191] Bispecifična antitela uključuju unakrsna ili „heterokonjugatna“ antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može se spojiti sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (US Patent No.4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/00373, i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu se napraviti koristeći bilo koje pogodne postupke unakrsnog povezivanja. Pogodni agensi za povezivanje su dobro poznati u struci i opisani su u US Patent No. 4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama unakrsnog povezivanja.
[0192] Tehnike generisanja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu biti pripremljena korišćenjem hemijske veze. Brennan i dr., Science, 229: 81 (1985) opisuju proceduru u kojoj se netaknuta antitela proteolitički odvajaju da generišu F(ab')2fragmente. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu natrijum arzenita agensa za kompleksovanje ditiola, koji stabilizuje vicinalne ditiole i sprečava nastanak intermolekularnih disulfida. Generisani Fab fragmenti pretvaraju se u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim pretvara u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i meša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata kako bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.
[0193] Nedavni napredak omogućio je direktno pribavljanje Fab'-SH fragmenata od E. coli, koja se mogi hemijski spajati i formirati bispecifična antitela. Shalaby i dr., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuju proizvodnju potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2molekula. Svaki Fab' fragment se zasebno izlučio iz E. coli i podvrgnut je usmerenom hemijskom spajanju in vitro kako bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo moglo je da se veže za ćelije koje
4
prekomerno eksprimiraju HER2 receptor i normalne ljudske T ćelija, kao i pokretanje litičke aktivnosti ljudskih citotoksičnih limfocita protiv ciljanih tumora na grudima.
[0194] Takođe su opisane razne tehnike za izradu i izolaciju fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem leucinskih zipera. Kostelny i dr., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucinski ziperi peptidi iz proteina Fos i Jun su povezani sa Fab' delovima dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u zglobnoj regiji kako bi se formirali monomeri i zatim ponovo oksidovani kako bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. „Dijatelo“ tehnologija, opisana od strane Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), pruža alternativni mehanizam za izradu fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) pomoću veznika koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VH i VL domeni jednog fragmenta prisiljeni su da se upare sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta za vezivanje antigena. Prijavljena je još jedna strategija za izradu bispecificnih fragmenata antitela korišćenjem jednolančnih Fv (sFv) dimera. Pogledati Gruber i dr., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
[0195] Antitela sa više od dve valence su razmatrana. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr. J. Immunol.147: 60 (1991).
Multivalentna antitela
[0196] Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolizovano) brže od bivalentnog antitela ćelijom koja eksprimira antigen na kome se antitela vezuju. Antitela iz ovog pronalaska mogu biti multivalentna antitela (koja su različita od IgM klase) sa tri ili više mesta za vezivanje antigena (npr. tetravalentna antitela), koja se lako mogu dobiti rekombinantnim eksprimiranjem nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može da sadrži domen za dimerizaciju i tri ili više mesta za vezivanje antigena. Poželjni domen za dimerizaciju obuhvata (ili se sastoji od) Fc regije ili zglobne regije. U ovom scenariju, antitelo će sadržati Fc regiju i tri ili više antigen vezujućih amino-terminala u Fc regiji. Poželjno multivalentno antitelo ovde sadrži (ili se sastoji od) tri do oko osam, ali poželjno četiri, mesta za vezivanje antigena. Multivalentno antitelo sadrži najmanje jedan polipeptidni lanac (i poželjno dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanci sadrže dva ili više varijabilnih domena. Na primer, polipeptidni lanac može sadržati VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc regije, X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, a n je 0 ili 1. Na primer, polipeptidni lanac može sadržati: VH-CH1-fleksibilan veznik-VH-CH1-Fc regija lanac; ili VH-CH1-VH-CH1-Fc regija lanac. Multivalentno antitelo ovde poželjno dalje sadrži najmanje dva (i poželjno četiri) polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Multivalentno antitelo ovde, na primer, može sadržati od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Polipeptidi varijabilnog domena lakog lanca koji su ovde obuhvaćeni sadrže varijabilni domen lakog lanca i, opciono, dodatno obuhvataju CL domen.
Varijante antitela
[0197] U nekim otelotvorenjima, razmatraju se modifikacije aminokiselinske sekvence antitela koja su ovde opisana. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante anamina aminokiselinskih sekvenci se pripremaju uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u nukleinsku kiselinu antitela ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje iz i/ili umetanje u/i supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, ubacivanja i supstitucije napravljena je da stigne do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske alteracije mogu biti uvedene u aminokiselinskoj sekvenci predmetnog antitela u trenutku kada se pravi sekvenca.
[0198] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regije antitela koji se preferiraju lokacijama za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“, kako je opisano kod Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. oštećeni ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjuju se neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alaninom ili polialaninom) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa antigenom. Lokacije tih aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim se prečišćavaju uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Tako, iako je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije se ne mora prethodno odrediti per se. Na primer, kako bi se analizirale performanse mutacije na datom mestu, ala skeniranje ili slučajna mutageneza se sprovodi na ciljnom kodonu ili regiji i eksprimirani imunoglobulini se ispituju za željenu aktivnost.
[0199] Umetci aminokiselinske sekvence uključuju aminokiseline i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i umetke intrasekvenci ili višestruke aminokiselinske ostatake. Primeri terminalnih umetaka uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo fuzionisano na citotoksični polipeptid. Druge umetne varijante molekula antitela uključuju fuziju na N- ili C-terminus antitela na enzim (npr. Za ADEPT) ili polipeptid koji povećava polu-život antitela u serumu.
[0200] Drugi tip varijante aminokiselina antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Takva promena podrazumeva uklanjanje jednog ili više ugljenih hidrata u antitelu i/ili dodavanje jedne ili više mesta glikozilacije koji nisu prisutni u antitelu.
[0201] Glikozilacija polipeptida je tipično N-vezana ili O-vezana. N-vezano se odnosi na vezivanje ugljovodonočnog dela na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina izuzev prolina, pokriva prepoznatljive sekvence za enzimsko vezivanje ugljenih hidrata u bočni lanac asparagina. Tako prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze u hidroksiaminokiseline, najčešće serin ili treonin, iako se može koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0202] Dodavanje mesta glikozilacije u antitelo se pogodno vrši izmenjivanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezana glikozilaciona mesta). Promena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstitucijom pomoću jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci prvobitnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacijske).
[0203] Kada antitelo obuhvata Fc regiju, ugljovodonik koji je povezan sa njim može se izmeniti. Na primer, antitela sa zrelom ugljovodoničnom strukturom koja nema fukozu vezanu za Fc regiju antitela opisana su u US Pat Appl No US 2003/0157108 (Presta, L.). Takođe pogledati US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Antitela sa bisekcionim N-acetilglukozaminom (GlcNAc) u ugljovodonoku vezanom za Fc regiju antitela navedena su u WO 2003/011878, Jean-Mairet i dr. i US Patent No. 6,602,684, Umana i dr. Antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc regiju antitela objavljena su kod WO 1997/30087, Patel i dr. Takođe pogledati, WO 1998/58964 (Raju, S.) i WO 1999/22764 (Raju, S.) koji se odnose na antitela sa izmenjenim ugljovodonicima vezanim za njihovu Fc regija. Takođe pogledati US 2005/0123546 (Umana i dr.) o molekulima koji vezuju antigene sa modifikovanim glikozilacijom.
[0204] Poželjna varijanta glikozilacije ovde obuhvata Fc regiju, pri čemu ugljovodonična struktura vezana za Fc regiju ima fukozu. Takve varijante su poboljšale ADCC funkciju. Opciono, Fc regija dalje sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u njima koje dalje poboljšavaju ADCC, na primer, zamene na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regije (EU numerisanje ostataka). Primeri publikacija koji se odnose na „defukozilovana“ ili „fukozno-defektna“ antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki i dr. J. Mol. Biol.
336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koji proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije deficirane u fukosilaciji proteina Ripka i dr. Arch. Biochcm. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams i dr., Naročito u Primeru 11), i nukleotidne ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, obarajuće CHO ćelije (Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)).
[0205] Druga vrsta varijanti je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela zamenjen drugim ostatkom. Lokacije od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervariabilne regije, ali takođe su razmatrane i FR izmene. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ukoliko takve susptitucije ne rezultuju promenom biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti i znatnije promene, naznačeno kao „primerne supstitucije“ u Tabeli 1 ili kako je dalje opisano kod daljem tekstu u odnosu na klase aminokiselina i pregledane proizvode.
Table 1
[0206] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima antitela postižu se selekcijom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u području supstitucije, na primer, kao list ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanje ili hidrofobičnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Ostaci koji se prirodno pojavljuju podeljeni su u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnih lanaca:
(1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kiseli: asp, glu;
(4) bazni: his, lys, arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i
(6) aromatični: trp, tyr, phe.
[0207] Nekonzervativne susptitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0208] Jedna vrsta supstitucionih varijanti podrazumeva zamenu jede ili više hipervariabilnih regije ostataka roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili ljudskog antitela). Uopšteno govoreći, rezultujuće varijante odabrane za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kog se generišu. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti podrazumeva sazrevanje afiniteta koristeći prikaz faga. Ukratko, nekoliko lokacija hipervariabilnih regije (npr. 6-7 lokacija) mutiraju da generišu sve moguće zamene aminokiselina na svakoj lokaciji. Tako nastala antitela prikazana su od strane čestica filamentoznih faga kao fuzije do proizvoda gena III od M13 upakovanog unutar svake čestice. Fag-prikazane varijante se zatim prikazuju za svoju biološku aktivnost (npr. vezujući afinitet) kao što je ovde opisano. Kako bi se identifikovale lokacije hipervariabilne regije za modifikaciju, može se izvršiti alanin skenirajuća mutageneza za identifikaciju ostataka hipervariabilne regije koja znatno doprinosi vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno da se analizira kristalna strukturu kompleksa antigen-antitelo kako bi se identifikovale dodirne tačke između antitela i antigena. Takvi dodirni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa tehnikama koje su ovde izložene. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti je podvrgnut skriningu kako je ovde opisano, a antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu biti odabrana za dalji razvoj.
[0209] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence luka antitela pripremljeni su raznim postupcima poznatim u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih aminokiselinskih varijanti) ili pripreme putem mutageneze posredovane oligonukleotidom (ili mutageneze usmerene na mesto), PCR mutageneze i kasetne mutageneze ranije pripremljene varijanta ili ne-varijantna verzije antitela.
[0210] Može biti poželjno uvesti jednu ili više modifikacija aminokiselina u Fc regiju polipeptida imunoglobulina, čime se generiše varijanta Fc regije. Varijanta Fc regije može sadržati ljudsku sekvencu Fc regije (npr., ljudska IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc regija) koja sadrže modifikaciju aminokiselina (npr. supstitucija) na jednom ili više položaja aminokiselina, uključujući i zglobni cistein.
[0211] U skladu sa ovim opisom i znanju struke, pretpostavlja se da u nekim otelotvorenjima antitelo koje se koristi u postupcima iz ovog pronalaska može sadržati jednu ili više izmena u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom antitela, npr. u Fc regiji. Ova antitela bi ipak zadržala u suštini iste karakteristike koje su potrebne za terapijsku primenu u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom antitela. Na primer, smatra se da se u Fc regiji mogu izvršiti određene izmene koje bi mogle dovesti do promene (tj. bilo poboljšanja ili smanjenja) C1q vezivanja i/ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), na primer, kako je opisano kod WO99/51642. Takođe pogledati Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); US Patent No.5,648,260; US Patent No.5,624,821; i WO94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regije. WO00/42072 (Presta) i WO 2004/056312 (Lowman) opisuju varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem na FcR. Takođe pogledati, Shields i dr. J. Biol. Chem.
9(2): 6591-6604 (2001). Antitela sa povišenim poluživotom i poboljšanim vezivanje za Fc receptor neonatalnog porekla (FcRn), koji je odgovoran za prenošenje majčinih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim i dr., J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton i dr.). Ova antitela sadrže Fc regiju sa jednom ili više supstitucija u sebi, što poboljšava vezivanje Fc regije na FcRn. Polipeptidne varijante sa promenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regije i povećanom ili smanjenom sposobnošću vezivanja C1q su opisane u US patent No.6,194,551B1, WO99/51642. Takođe pogledati, Idusogie i dr. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
Derivati antitela
[0212] Antitela iz ovog pronalaska mogu se dalje modifikovati da sadrže dodatne neproteinske čestice koje su poznate u struci i lako dostupne. Poželjno, delovi pogodni za derivatizaciju antitela su polimeri koji su rastvorljivi u vodi. Neograničavajući primeri polimera koji su rastvorljivi u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilceluloze, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, 1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimeri propropilen glikola, kopolimeri prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovani polioli (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilenglikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može se razlikovati, a ako je povezano više polimera, mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja uključujući, ali ne ograničavajući se na određena svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li se derivat antitela koristi u terapiji pod definisanim uslovia itd.
Vektori, ćelije domaćina i rekombinantni postupci
[0213] Za rekombinantnu proizvodnju antitela, nukleinska kiselina koja je kodira je izolovana i umetnuta u replikabilni vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za eksprimiranje. DNK koja kodira antitelo se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., koristeći oligonukleotidne sonde koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Mnogi vektori su dostupni. Izbor vektora delimično zavisi od ćelije domaćina koji se koristi. Generalno, poželjne ćelije domaćina imaju ili prokariotsko ili eukariotsko (uglavnom sisarsko) poreklo. Biće prihvaćeno da se u ovu svrhu mogu koristiti konstantne regije bilo kog izotopa, uključujući IgG, IgM, IgA, IgD i IgE konstantne regije, i da se takve konstantni regije mogu dobiti od bilo koje ljudske ili životinjske vrste.
a. Generisanje antitela pomoću prokariotskih ćelija domaćina:
i. Konstrukcija vektora
[0214] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne komponente antitela mogu se dobiti korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika. Željene polinukleotidne sekvence mogu biti izolovane i sekvencirane od ćelija koje proizvode ćelije, kao što su ćelije hibridoma. Alternativno, polinukleotidi se mogu sintetisati koristeći sintetizator nukleotida ili PCR tehnike. Jednom dobijene, sekvence koje kodiraju polipeptide ubacuju se u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i eksprimiranje heterolognih polinukleotida kod prokariotskih domaćina. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u struci mogu se koristiti u svrhe ovog pronalaska. Odabir odgovarajućeg vektora će zavisiti uglavnom od veličine nukleinskih kiselina koje treba ubaciti u vektor i određene ćelije domaćina koja se transformiše sa vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, u zavisnosti od svoje funkcije (pojačavanje ili eksprimiranje heterolognog polinukleotida, ili oboje) i svoje kompatibilnosti sa određenom ćelijom domaćina u kojoj boravi. Vektorske komponente uglavnom uključuju, ali nisu ograničene na: poreklo replikacije, selekcioni marker gena, promoter, mesto vezivanja ribozoma (RBS), signalnu sekvencu, heterologni umetak nukleinske kiseline i sekvencu završetka transkripcije.
[0215] Uopšte, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koji su izvedeni iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinima koriste se u vezi sa tim domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i obeležavanje sekvenci koje su sposobne da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Na primer, E. coli se tipično transformiše koristeći pBR322, plazmid izveden iz vrste E. coli. pBR322 sadrži gene koje kodiraju ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet) otpornost i time obezbeđuju laki agens za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati ili drugi mikrobiološki plazmidi ili bakteriofag mogu takođe sadržati ili biti modifikovani da sadrže promotere koje mikrobni organizam može koristiti za eksprimiranje endogenih proteina. Primeri pBR322 derivata koji se koriste za eksprimiranje određenih antitela su detaljno opisani kod Carter i dr., SAD Patent br.
5,648,237.
[0216] Pored toga, fagni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koji su kompatibilni sa mikroorganizmom domaćina mogu se koristiti kao transformatorski vektori u vezi sa tim domaćinima. Na primer, bakteriofag kao što je λGEM.TM.-11 može biti korišćen u pravljenju rekombinantnog vektora koji se može koristiti za transformaciju osetljivih ćelija domaćina kao što je E. coli LE392.
[0217] Vektor eksprimiranja može sadržati dva ili više promoter-cistron parova, koji kodiraju svaku od polipeptidnih komponenti. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca koja se nalazi uzvodno (5') do cistrona koji modulira njeno eksprimiranje. Prokariotski promoteri obično spadaju u dve klase, inducibilni i konstitutivni. Inducibilni promoter je promoter koji inicira povećane nivoe transkripcije cistrona pod svojom kontrolom u odgovoru na promene stanja kulture, npr. prisustvo ili odsustvo hranjivih materija ili promena temperature.
[0218] Dobro je poznat veliki broj promotera koje prepoznaju razne potencijalne ćelije domaćini. Odabrani promoter može se operativno povezati sa cistron DNK koja kodira laki ili teški lanac uklanjanjem promotera iz izvorne DNK putem digestije restrikcionog enzima i umetanjem izolovane promoterske sekvence u vektor. I nativna prirodna promoterska sekvenca i mnogi heterologni promoteri mogu se koristiti za usmeravanje amplifikacije i/ili eksprimiranja ciljanih gena. U nekim otelotvorenjima koriste se heterologni promoteri, jer oni uglavnom omogućavaju veću transkripciju i veće prinose izraženog ciljanog gena u poređenju sa prirodnim promoterom ciljanog polipeptida.
[0219] Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariontskim domaćinima uključuju PhoA promoter, βgalaktamazu i sisteme promotera laktoze, promoterski sistem triptofana (trp) i hibridne promotere kao što su tac ili trc promoter. Međutim, pogodni su i drugi promoteri koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fagni promoteri). Njihove nukleotidne sekvence su objavljene, čime se omogućava stručnjaku da ih operativno ligira na cistrone koji kodiraju ciljane lake i teške lance (Siebenlist i dr. (1980) Cell 20: 269) koristeći veznike ili adaptere za snabdevanje bilo kojim potrebnim mestima restrikcije.
[0220] U jednom aspektu, svaki cistron unutar rekombinantnog vektora sadrži komponentu sekrecijskog signala koji usmerava translokaciju eksprimiranih polipeptida preko membrane. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora, ili može biti deo ciljane polipeptidne DNK koja je ubačena u vektor. Signalna sekvenca izabrana za potrebe ovog pronalaska treba da bude ona koja je prepoznata i obrađena (tj. cepana signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine koje ne prepoznaju i procesiraju signalne sekvence prirodne heterolognim polipeptidima, signalna sekvenca se supstituiše sa izabranom prokariotskom signalnom sekvencom, na primer, iz grupe koja se sastoji od alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili toplotno-stabilnih enterotoksin II (STII) lidera, LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. U jednom otelotvorenju, signalne sekvence koje se koriste u oba cistrona sistema za eksprimiranje su STII signalne sekvence ili njihove varijante.
[0221] U sledećem aspektu, proizvodnja imunoglobulina prema pronalasku može se pojaviti u citoplazmi ćelije domaćina, i stoga ne zahteva prisustvo sekvenci signala lučenja unutar svakog cistrona. U tom smislu, laki i teški lanci imunoglobulina su eksprimirani, savijeni i sastavljeni u obliku funkcionalnih imunoglobulina unutar citoplazme. Određeni sojevi domaćina (npr., E. coli trxB-sojevi) obezbeđuju uslove citoplazme koji su povoljni za formiranje disulfidnih veza, čime se omogućava pravilno sklapanje i sklapanje eksprimiranih proteinskih podjedinica. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[0222] Prokariotske ćelije domaćina pogodne za eksprimiranje antitela uključuju arhebakterije i eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Escherichia (npr. E. coli), Bacilli (npr. B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas vrste (npr. P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. U jednom otelotvorenju koriste se gram-negativne ćelije. U jednom otelotvorenju, ćelije E. coli se koriste kao domaćini za pronalazak. Primeri sojeva E. coli uključuju soj W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) i nejgove derivati, uključujući soj 33D3 koji ima genotip W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (U.S. Pat. No. 5,639,635). Takođe su pogodni i drugi sojevi i njihovi derivati, kao što su E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliλ 1776 (ATCC 31,537) i E. coli RV308 (ATCC 31,608). Ovi primeri su ilustrativni a ne ograničavajući. Postupci za konstrukciju derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija sa definisanim genotipovima su poznati u struci i opisani su, na primer, kod Bass i dr., Proteins, 8: 309-314 (1990). Uglavnom je neophodno odabrati odgovarajuće bakterije uzimajući u obzir repliciranje replikona u ćelijama bakterije. Na primer, vrste E. coli, Serratia ili Salmonella mogu se pogodno koristiti kao domaćini kada se za snabdevanje replikona koriste poznati plazmidi kao što su pBR322, pBR325, pACIC177 ili pKN410. Tipično, ćelija domaćina treba da izdvoji minimalne količine proteolitičkih enzima, a dodatni proteazni inhibitori mogu poželjno biti inkorporirani u ćelijsku kulturu.
ii. Proizvodnja antitela
[0223] Ćelije domaćini se transformišu sa gore opisanim ekspresionim vektorima i kultivišu u
4
konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovanom kako bi se indukovali promoteri, selektujući transformante ili pojačavanje gene koji kodiraju željene sekvence.
[0224] Transformacija znači uvođenje DNK u prokariotskog domaćina tako da se DNK može replicirati, bilo kao ekstrahromozomski element ili hromozomski integrant. U zavisnosti od korišćene ćelije domaćina, transformacija se vrši pomoću standardnih tehnika pogodnih za takve ćelije. Obrada kalcijuma koji koristi kalcijum hlorid se generalno koristi za bakterijske ćelije koje sadrže značajne barijere na ćelijskim zidovima. Još jedan postupak za transformaciju koristi polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika koja se koristi je elektroporacija.
[0225] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju polipeptida uzgajaju se u medijumima poznatim u struci i pogodni za kulturu izabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medijuma uključuju luria broth (LB) plus neophodne dodatke hranjivih supstanci. U nekim otelotvorenjima, medijum takođe sadrži agens za selekciju, izabran na osnovu konstrukcije vektora eksprimiranja, da selektivno dozvoljava rast prokariotskih ćelija koje sadrže vektor eksprimiranja. Na primer, ampicilin se dodaje medijumu za rast ćelija koji ekspresiraju geni otporni na ampicilin.
[0226] Svaki neophodni dodatak pored izvora ugljenika, azota i neorganskih fosfata može takođe biti uključen u odgovarajuće koncentracije uvedene same ili kao mešavina sa drugim dodatkom ili agensom kao što je složeni izvor azota. Opcionalno, medijum za kulturu može sadržati jedna ili više redukcionih agenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od glutationa, cisteina, cistamina, tioglikolata, ditiokritritola i ditiotreitola.
[0227] Prokariotske ćelije domaćina su kultivisane na odgovarajućim temperaturama. Za rast E. coli, na primer, poželjna temperatura iznosi od oko 20°C do oko 39°C, poželjnije od oko 25°C do oko 37°C, čak i poželjnije na oko 30°C. pH medijuma može biti bilo koji pH u rasponu od oko 5 do oko 9, zavisno uglavnom od organizma domaćina. Za E. coli, pH je poželjno od oko 6,8 do 7,4, a još poželjnije oko 7,0.
[0228] Ako se inducibilni promoter koristi u vektoru eksprimiranja, eksprimiranje proteina se indukuje pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotera. U jednom aspektu, PhoA promoteri se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. Shodno tome, transformisane ćelije domaćina se kultivišu u fosfatograničavajućem medijumu za indukciju. Poželjno, agens za ograničavanje fosfata je C.R.A.P agens (pogledati, npr., Simmons i dr., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Moguće je koristiti različite druge induktore, prema upotrebljenom vektorskom konstruktu, kako je poznato u struci.
[0229] U jednom otelotvorenju, eksprimirani polipeptidi iz ovog pronalaska se luče i oporavljaju iz periplazma ćelija domaćina. Oporavak proteina obično podrazumeva poremećaj mikroorganizma, generalno sa agensima kao što su osmotski šok, ultrazvuk ili liza. Kada se ćelije poremete, ćelijski ostaci ili cele ćelije mogu biti uklonjeni centrifugiranjem ili filtriranjem. Proteini se mogu dalje prečišćavati, na primer, pomoću afinitetne smole hromatografije. Alternativno, proteini se mogu transportovati u kulturu i izolovati u njima. Ćelije se mogu ukloniti iz kulture i supernatant kulture se filtrira i koncentriše radi dalje prečišćavanja proizvedenih proteina. eksprimirani polipeptidi mogu se dodatno izolovati i identifikovati koristeći najčešće poznati postupci kao što su poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE) i Western blot test.
[0230] U jednom aspektu, proizvodnja antitela se vrši u velikoj količini fermentacionim postupkom. Za proizvodnju rekombinantnih proteina dostupne su različite procedure fermentacije fed-batch fermentacije. Velike fermentacije imaju najmanje 1000 litara kapaciteta, poželjno oko 1,000 do 100,000 litara kapaciteta. Ovi fermentatori koriste agitator pokretače za distribuciju kiseonika i hranljivih sastojaka, posebno glukoze (poželjni izvor ugljenika/energije). Fermentacija male skale se generalno odnosi na fermentaciju u fermentoru koja ne sadrži više od približno 100 litara u volumetrijskom kapacitetu i može se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara.
[0231] U procesu fermentacije indukcija eksprimiranja proteina se obično započinje nakon što su ćelije uzgajane pod odgovarajućim uslovima do željene gustine, npr. OD550 od oko 180-220, a u tom stadijumu ćelije su u ranoj stacionarnoj fazi. Moguće je koristiti različite induktore, prema upotrebljenom vektorskom konstruktu, kako je poznato u struci i opisano gore. Ćelije se mogu uzgajati u kraćim periode pre indukcije. Ćelije se obično indukuju oko 12-50 sati, iako se može koristiti duže ili kraće vreme indukcije.
[0232] Za poboljšanje prinosa proizvodnje i kvaliteta polipeptida, različiti uslovi fermentacije mogu se modifikovati. Na primer, radi poboljšanja pravilnog sklapanja i preklapanja lučenih polipeptida antitela, dodatni vektori koji nadražuju proteine haperona, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis, trans-izomeraza sa haperonom aktivnost) može se koristiti za kotransformaciju prokariotskih ćelija domaćina. Prikazani su proteini haperona da olakšaju pravilno preklapanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćina. Chen i dr. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou i dr., SAD Patent br. 6,083,715; Georgiou i dr., SAD Patent br. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.275:17106-17113; Arie i dr. (2001) Mol. Microbiol.39:199-210.
[0233] Kako bi se minimizirala proteoliza eksprimiranih heterolognih proteina (naročito onih koji su proteolitički osetljivi), za ovaj pronalazak mogu se koristiti određene linije domaćini deficijentni za proteolitičke enzime. Na primer, linije ćelija domaćina mogu se modifikovati kako bi se uticalo na genetsku mutaciju u genu koji kodira poznate bakterijske proteaze kao što su Proteaza III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaza I, Proteaza Mi, Proteaza V, Proteaza VI i njihove kombinacije. Neki E. Coli linije deficijentne za proteazu su dostupne i opisane u, na primer, Joly i dr. (1998), supra; Georgiou i dr., SAD Patent br.5,264,365; Georgiou i dr., SAD Patent br.5,508,192; Hara i dr., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
[0234] U jednom aspektu, linije E. coli deficijentne za proteolitičke enzime i transformisane sa plazmidima, koje prekomerno eksprimiraju jedan ili više proteina haperona, koriste se kao ćelije domaćin u sistemu eksprimiranja.
iii. Pročišćavanje antitela
[0235] Mogu se koristiti standardni postupci prečišćavanja proteina poznati u struci. Sledeće procedure prikazuju primerne postupke prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitetu ili kolone za jonsku razmenu, precipitacija etanola, HPLC sa reverznom fazom, hromatografija na silicijum dioksidu ili na smola za razmenu katjona kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, precipitacija amonijum sulfata, i gel filtracija koristeći, na primer, Sephadex G-75.
[0236] U jednom aspektu, Protein A koji se imobilizuje na čvrstu fazu koristi se za imunoafinitetno prečišćavanje proizvoda antitela pune dužine. Protein A je 41kD ćelijski zidni protein od Staphylococcus aureas koji se vezuje sa visokim afinitetom na Fc regiju antitela. Lindmark ct al (1983) J. Immunol. Mcth.62:1-13. Čvrsta faza na koju je protein A imobilizovan, poželjno je kolona koja sadrži površinu od stakla ili silike, poželjnije kontrolisanu kolonu sa staklenim porama ili kolonu silicinske kiseline. U nekim primenama, kolona je obložena reagensom, kao što je glicerol, u pokušaju da spreči nespecifičnu vezivnost zagađivača.
[0237] Kao prvi korak prečišćavanja, preparat koji se dobija iz ćelijske kulture kao što je prethodno opisano primenjuje se na imobilizovanu čvrstu fazu proteina A kako bi se omogućilo specifično vezivanje antitela od interesa za Protein A. Čvrsta faza se zatim ispira kako bi se uklonili kontaminanti ne-specifično vezani za čvrstu fazu. Konačno, antitelo od interesa se dobija iz čvrste faze eluiranjem. b. Generisanje antitela pomoću eukariotskih ćelija domaćina:
[0238] Vektorske komponente uglavnom uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više markerski gen, element poboljivšača, promoter i sekvencu završetka transkripcije.
(i) Komponenta signalne sekvence
[0239] Vektor za upotrebu u eukariotskoj ćeliji domaćinu može takođe sadržati signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida od interesa. Odabrana heterologna signalna sekvenca je poželjno ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj. cepa se signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. U eksprimiranju ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara, kao i virusni sekretorni lideri, na primer herpes simpleks gD signal.
[0240] DNK za takvu prekursorsku regiju se ligira u čitajući okvir za DNK koja kodira antitelo.
(ii) Poreklo replikacije
[0241] Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore eksprimiranja sisara. Na primer, poreklo SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promoter.
(iii) Komponenta gena za selekciju
[0242] Vektori eksprimiranja i kloniranja mogu sadržati selekcioni gen, takođe nazvan selekcionim markerom. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) pružaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr. ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke, gde je to relevantno, ili (c) snabdevanju kritičnim hranljivim materijama koje nisu dostupne iz kompleksnih medijuma.
[0243] Jedan primer selekcione šeme koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. Ove ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i na taj način preživljava režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0244] Još jedan primer odgovarajućih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija sposobnih za uzimanje nukleinske kiseline antitela, kao što su DHFR, timidinkinaza, metalotionein-I i -II, poželjno geni primata metaliotioneina, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.
[0245] Na primer, ćelije transformisane sa DHFR selekcionim genom se prvo identifikuju kultivacijom svih transformanata u medijumu za kulturu koji sadrži metotreksat (Mtx), konkurentski antagonist DHFR-a. Odgovarajuća ćelija domaćina, kada se koristi divlji tip DHFR, je ćelijska linija kineskog hrčka (CHO) koja je deficitarna u DHFR aktivnosti (npr., ATCC CRL-9096).
[0246] Alternativno, ćelije domaćini (posebno domaćini divljih vrsta koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju antitelo, DHFR protein divljeg tipa i drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) mogu da se izaberu od strane ćelijskog rasta u medijumu koji sadrži selekcioni agens za selektivni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Pogledati SAD Patent br.4,965,199.
(iv) Komponenta promotera
[0247] Vektori eksprimiranja i kloniranja obično sadrže promoter koji je prepoznao organizam domaćina i operativno je vezan za nukleinsku kiselinu polipeptida antitela. Promotivne sekvence su poznate po eukariotima. Praktično svi eukariotski geni imaju AT-bogate regije koje se nalazi približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta na kome se inicira transkripcija. Druga sekvenca koja je pronađena od 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT regija gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodiranja sekvence. Sve ove sekvence su pogodno ubačene u eukariotske vektore eksprimiranja.
[0248] Transkripcija antitela polipeptida iz vektora u ćelijama domaćinima sisara kontrolisana je, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što su virus polioma, virus boginja živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičji virus sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B i Simian Virus 40 (SV40), iz heterolognih promotera sisara, npr. promoter aktina ili promoter imunoglobulina, od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0249] Rani i kasni promoteri virusa SV40 se pogodno dobijaju kao restrikcioni fragment SV40, koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter ljudskog citomegalovirusa se pogodno dobija kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za eksprimiranje DNK kod domaćina sisara koji koriste goveđi papiloma virus kao vektor opisan je u SAD Patent br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u SAD Patent br. 4,601,978. Alternativno, dugoročno ponavljanje Rous Sarcoma Virusa se može koristiti kao promoter.
(v) Komponenta elementa poboljšivača
[0250] Transkripcija DNK koja kodira polipeptid antitela ovog pronalaska pomoću viših eukariota često
4
se povećava ubacivanjem sekvence poboljšivača u vektor. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate od sisarskih gena (globin, elastaza, albumin, α-fektoprotcin i insulin). Međutim, tipično će se koristiti pojačivač iz eukariotskog ćelijskog virusa. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani porekla replikacije i pojačivač adenovirusa. Takođe pogledati Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) o elemenatima poboljšivačima za aktiviranje eukariotskih promotera. Pojačivač može biti spojen u vektor na položaju 5' ili 3' u sekvenci koja kodira polipeptid antitela, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotera.
(vi) Komponenta završetka transkripcije
[0251] Vektori eksprimiranja koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina obično sadrže i sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne od 5' i, povremeno 3', neprevedenih regija eukariotskih ili virusnih DNK ili kDNK. Ovi regije sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovane fragmente u neprevedenom delu mRNK koja kodira antitelo. Jedna korisna komponenta završetka transkripcije je oblast poliadenilacije hormona rasta. Pogledati WO94/11026 i vektor eksprimiranja koji su tamo objavljeni.
(vii) Selekcija i transformacija ćelija domaćina
[0252] Odgovarajuće ćelije domaćini za kloniranje ili eksprimiranje DNK u vektorima ovde obuhvataju više ćelija eukariota koje su ovde opisane, uključujući ćelije domaćine kičmenjaka. Propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih linija ćelija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana od strane SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ljudska embrionalna bubrežna linija (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i dr., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega mladog hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma ljudskog grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); pseće ćelije bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bafalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N.I. Acad. Sci.383: 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i ljudska linija hepatoma (Hep G2).
[0253] Ćelije domaćina se transformišu sa gore navedenim vektorima eksprimiranja ili vektorima kloniranja za proizvodnju antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovana su kao što je pogodno za indukovanje promotera, selekciju transformanata ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence.
(viii) Kultivisanje ćelija domaćina
[0254] Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju antitela mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM), Sigma, RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medijuma opisan kod Ham i dr., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes i dr., Anal. Biochem.102: 255 (1980), U.S. Pat. Nos.4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Patent Re.30,985 mogu se koristiti kao medijum kulture za ćelije domaćine. Svaki od ovih medijuma može se dopuniti ako je potrebno sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), soli (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferi (kao što je HEPES), nukleotidi (kao što su adenozin i timidin), antibiotici (kao što je lek GENTAMICIN™), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Svaki drugi neophodni dodatak takođe može biti uključen u odgovarajuće koncentracije koje bi bile poznate stručnjacima. Uslovi kultivisanja, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za eksprimiranje, i biće očigledni za stručnjaka u oblasti.
(ix) Prečišćavanje antitela
[0255] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo može biti proizvedeno intracelularno ili direktno lučeno u medijum. Ako se antitelo proizvede intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, ili ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se antitelo izluči u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema najčešće se prvo koncentrišu koristeći komercijalno dostupni filter za koncentraciju proteina, na primer Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracionu jedinicu. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka kako bi se inhibirala proteoliza i antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast pogodnih zagađivača.
[0256] Sastav antitela, pripremljen iz ćelija, može se prečišćavati primenom hromatografije hidroksilapatita, elektroforeze gela, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se baziraju na ljudskim γ1, γ2 ili γ4 teškim lancima (Lindmark i dr., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipe miša i za ljudske γ3 (Guss i dr., EMBO J.5: 15671575 (1986)). Matrica na koju je afinitetni ligand vezan najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice poput kontrolisanog stakla sa porama ili poli(stirenedivinil)benzena omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Kad antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za pročišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni za razmenu jona, taloženje etanola, HPLC obrnute faze, hromatografija na silici, hromatografija na heparinskoj SEPHAROSE™. hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartične kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i precipitacija amonijum sulfata su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koji se treba nabaviti.
[0257] Nakon bilo kog prethodnog koraka prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interesa i zagađivače može biti podvrgnuta hromatografiji sa niskim pH hidrofobnim interakcijama pomoću pufera za eluiranje pri pH od oko 2,5-4,5, poželjno izvedeno pri niskim koncentracijama soli (npr. oko 0-0,25M soli).
Imunokonjugati
[0258] Pronalazak takođe pruža imunokonjugate (takođe se nazivaju i „antitelo-lek konjugati“ ili „ADC“), koji obuhvataju bilo koja anti-KLβ antitela koja su ovde opisana konjugovana sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapeutski agens, lek, agens za inhibiranje rasta, toksin (npr. enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovih fragmenata) ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).
[0259] Upotreba konjugata antitela i lekova za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatičkih agenasa, tj. lekova za ubijanje ili inhibiranje tumorskih ćelija u lečenju kancera (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; U.S. patent 4,975,278) dozvoljava ciljanu isporuku ldela eka do tumora i intracelularnu akumulaciju tamo gde sistemska primena ovih nekonjugovanih lekova može rezultovati neprihvatljivim nivoima toksičnosti za normalne ćelije, kao i tumorske ćelije koje se pokušavaju eliminisati (Baldwin i dr., (1986) Lancet pp. (Mar.15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic agenss In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera i dr. (ed.s), pp.475-506). Tako se traži maksimalna efikasnost uz minimalnu toksičnost. Ie poliklonska antitela i monoklonska antitela su prijavljena kao korisni u ovim strategijama (Rowland i dr., (1986) Cancer Immunol. Immunothcr., 21:183-87). Lekovi koji se koriste u ovim postupcima uključuju daunomicin, doksorubicin, metotreksat i vindezin (Rowland i dr., (1986) supra). Toksini koji se koriste u antitelo-toksin konjugatima uključuju bakterijske toksine kao što je toksin difterije, biljne toksini kao što je ricin, toksine malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler i dr (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler i dr (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler i dr (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitanzinoide (EP 1391213; Liu i dr., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), i kalikeamicin (Lode i dr (1998) Cancer Res.
58:2928; Hinman i dr (1993) Cancer Res.53: 3336-3342). Toksini mogu uticati na njihove citotoksične i citostatičke efekte pomoću mehanizama koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili inhibiciju
4
topoizomeraze. Neki citotoksični lekovi imaju tendenciju da budu neaktivni ili manje aktivni kada su konjugovani sa velikim antitelima ili ligandima receptora proteina.
[0260] ZEVALIN® (ibritumomab tiuksetan, Biogen/Idec) je antitelo-radioizotop konjugat koji se sastoji od mišjeg IgG1 kapa monoklonskog antitela usmerenog protiv CD20 antigena na površini normalnih i malignih B limfocita i<111>In or<90>Y radioizotop vezan za tiourea veznik-helator (Wiseman ct al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman i dr (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig i dr (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig ct al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Iako ZEVALIN ima aktivnost protiv B-ćelijskog ne-Hodžkinovog limfoma (NHL), primena rezultuje u teškim i prolongiranim citopenijama kod većine pacijenata. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), antitelo-lek konjugat koji se sastoji od ljudskog CD33 antitela povezanog sa kalikeamicinom, odobren je 2000. godine za lečenje akutne mijeloične leukemije injekcijom (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; US Patent Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertanzin (Immunogen, Inc.), antitelo-lek konjugat koji se sastoji od ljudskog C242 antitela vezanog putem disulfidnog vezivnog SPP za deo maitanzinoidnog leka, DM1, napreduje u Fazu II ispitivanja za lečenje kancera koji eksprimiraju CanAg, kao što je debelo crevo, pankreas, želudac i drugih. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), antitelo-lek konjugat koji se sastoji od specifičnog anti-prostatnog membranskog antigena (PSMA) monoklonskog antitela povezanog sa delom maitanzinoidnog leka DM1, u razvoju je za potencijalni tretman tumora prostate. Auristatinski peptidi, auristatin E (AE) i monometiluraristatin (MMAE), sintetički analozi dolastatina, konjugovani su sa himernim monoklonskim antitelima cBR96 (specifični za Lewis Y na karcinomima) i cAC10 (specifični za CD30 na hematološkim malignitetima) (Doronina i dr (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) su pod terapijskim razvojem.
[0261] Hemoterapeutski agensi korisni u stvaranju imunokonjugata su ovde opisani (npr., iznad). Enzimatski aktivni toksini i njegovi fragmenti koji se mogu koristiti mogu uključivati difterija A lanac, neobavezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina, lanac egzotoksina A (od Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine , dianthin proteine, Phytolaca americana proteine (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordice charantia, curcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restocin, fenomein, enomicin i trikothecen. Pogledati, na primer, WO 93/21232 objavljen 28. oktobra 1993. Na raspolaganju su različiti radionuklidi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re. Konjugati antitela i citotoksičnog agensa izrađuju se pomoću različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol)propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (pazidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što su bis- (p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kako je opisano kod Vitetta i dr., Science, 238: 1098 (1987). Ugljenik-14-obeležena 1-izotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminepentaocetna kiselina (MKS-DTPA) je primerno helatni agens za konjugaciju radionukleotida u antitelo. Pogledati WO94/11026.
[0262] Konjugati antitela i jedan ili više toksina malih molekula, kao što su kalheheamicin, maitanzinoidi, dolastatini, aurostatini, trihothecen i CC1065, kao i derivati ovih toksina koji imaju aktivnost toksina, takođe su ovde razmatrani.
i. Maitanzin i maitanzinoidi
[0263] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo (pune dužine ili fragmente) konjugovano sa jednim ili više molekula maitanzinoida.
[0264] Maitanzinoidi su mitotski inhibitori koji deluju inhibiranjem polimerizacije tubulina. Maitanzin je prvi put izolovan od istočno-afričkog grma Maytenus scrrata (SAD Patent br.3,896,111). Kasnije je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode maitanzinoide, kao što su maitanzinol i C-3 maitanzinol estri (SAD Patent br.4,151,042). Sintetički maitanzinol i njihovi derivati i njihovi analozi su objavljeni, na primer, u U.S. Patent Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598;
4
4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.
[0265] Maitanzinoidni lekovi su atraktivni lekovi u konjugatima antitela, jer su: (i) relativno pristupačni za pripremu fermentacijom ili hemijskom modifikacijom, derivatizacijom fermentacionih proizvoda, (ii) podložnih derivatizaciji sa funkcionalnim grupama pogodnim za konjugaciju kroz nesdifulfidne veznike sa antitelima, (iii) stabilni u plazmi, i (iv) efikasni protiv različitih linija tumorskih ćelija.
[0266] Imunokonjugati koji sadrže maitanzinoide, postupke pravljenja istih i njihova terapeutska upotreba objavljeni su, na primer, u U.S. Patent Nos.5,208,020, 5,416,064 i European Patent EP 0425 235 B1. Liu i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 93: 8618-8623 (1996) su opisali imunokonjugate koji uključuju maitanzinoidom obeležen DMT vezan za monoklonsko antitelo C242 usmereno protiv ljudskog kolorektalnog karcinoma. Utvrđeno je da je konjugat visoko citotoksičan prema kulturama ćelija raka debelog creva i pokazao je antitumorsku aktivnost u in vivo testu rasta tumora. Chari i dr., Cancer Research 52: 127-131 (1992) opisuju imunokonjugate u kojima je maitanzinoid konjugovan preko disulfidnog veznika do mišjeg antitela A7 koje se vezuje za antigen na ćelijskim linijama ćelija kancera debelog creva čoveka ili drugog mišjeg monoklonskog antitelu TA.1 koje vezuje HER-2/neu onkogen. Citotoksičnost konjugata TA.1-maitanzinoida testirana je in vitro na ćelijskoj liniji ljudskog raka dojke SK-BR-3, koja eksprimira 3 x 10<5>HER-2 površinskih antigena po ćeliji. Konjugat leka postigao je stepen citotoksičnosti sličan slobodnom maitanzinoidnom leku, koji bi se mogao povećati povećanjem broja molekula mantansinoida po molekulu antitela. Konjugat A7-maitanzinoida pokazao je nisku sistemsku citotoksičnost kod miševa.
[0267] Antitelo-maitanzinoidni konjugati se pripremaju hemijskim povezivanjem antitela sa molekulom maitanzinoida bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti bilo antitela ili molekula maitanzinoida. Pogledati, na primer, SAD Patent br.5,208,020. Prosečno 3-4 molekula maitanzinoida konjugovana po molekulu antitela pokazala su efikasnost u povećanju citotoksičnosti ciljanih ćelija bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela, iako bi se očekivalo da bi čak i jedan molekul toksina/antitela mogao ojačati citotoksičnost u odnosu na upotrebu golih antitela. Maitanzinoidi su dobro poznati u struci i mogu biti sintetisani poznatim tehnikama ili izolovani iz prirodnih izvora. Odgovarajući mantancinoidi su objavljeni, na primer, u SAD Patent br.5,208,020 i u drugim patentima i nepatentnim publikacijama pomenutim ovde. Poželjni maitanzinoidi su maitanzinol i analozi maitanzinola modifikovani u aromatičnom prstenu ili na drugim položajima molekula maitanzinola, kao što su različiti estri majuzinolina.
[0268] Postoje mnoge vezivne grupe poznate u struci za izradu antitelo maitanzinoid konjugata, uključujući, na primer, on objavljene u SAD Patent br. 5,208,020 ili EP Patent 0425235 B1, Chari i dr., Cancer Research 52: 127-131 (1992), i U.S. Patent Application No.10/960,602, podneto 8. oktobra 2004. antitelo maitanzinoid konjugati koji sadrže veznik komponentu SMCC mogu biti pripremljeni kao što je opisano kod U.S. Patent Application No. 10/960,602, podneto 8. oktobra 2004. Vezivne grupe uključuju disulfidne grupe, tioeterske grupe, labilne kiselinske grupe, fotolabilne grupe, labilne grupe peptidaze ili labilne grupe esteraze, kao što je opisano kod prethodno identifikovanih patenata, disulfidnih i tioeterskih grupa koje su poželjne. Dodatne vezivne grupe su opisane i prikazane ovde.
[0269] Konjugati antitela i maitanzinoida mogu se napraviti pomoću različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat SMCC), iminotiolana (IT), bifunkcionalnih derivata imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivnih estara (kao što je disukcinimidil suberat), aldehida (kao što je glutaraldehid), bis-azidnih jedinjenja (kao što su bis(p-azidobenzoil)heksandiamin), derivata bis-diazonijuma (kao što su bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što su 1,5-difluoro-2,4 -dinitrobenzen). Posebno poželjni agensi za spajanje uključuju N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) (Carlsson i dr., Biochem. J.173:723-737 (1978)) i N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP) kako bi se obezbedila disulfidna veza.
[0270] Veznik se može povezati sa molekulom maitanzinoida na različitim položajima, zavisno od vrste veze. Na primer, estarska veza može se formirati reakcijom sa hidroksilnom grupom koristeći konvencionalne tehnike spajanja. Reakcija može nastati na položaju C-3 koji ima hidroksilnu grupu, položaj C-14 koji je modifikovan sa hidroksimetilom, položaju C-15 koji je modifikovan hidroksil
4
grupom, i položaju C-20 koji ima hidroksilnu grupu. U poželjnom otelotvorenju, veza se formira na položaju C-3 maitanzinola ili analoga maitanzinola.
ii. Auristatini i dolastatini
[0271] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa dolastatinima ili dolostatinskim peptidnim analozima i derivatima, auristatine (US Patent Nos. 5635483; 5780588). Pokazano je da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, GTP hidrolizu i nuklearnu i ćelijsku podelu (Woyke i dr (2001) Antimicrob. agenss and Chemother. 45(12):3580-3584) i imaju antikancer (US 5663149) i antifungalnu aktivnost (Pettit i dr. (1998) Antimicrob. agenss Chemother.
42: 2961-2965). Dolastatin ili auristatin deo leka može biti vezan za antitelo preko N (amino) terminusa ili C (karboksil) terminusa peptidnog dela leka (WO 02/088172).
[0272] Primeri otelotvorenja auristatina uključuju N-terminus vezane monometilaustatin delove leka DE i DF, objavljene u „Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands“, US Ser. No.10/983,340, filed Nov.5, 2004.
[0273] Tipično, delovi zasnovani na peptidima mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se dobiti, na primer, prema postupku sinteze tečne faze (pogledati E. Schroder i K. Lubke, „The Peptides“, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) koji je dobro poznat u polju peptidne hemije. Auristatin/dolastatin delovi leka mogu biti pripremljeni prema postupcima: US 5635483; US 5780588; Pettit i dr (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit i dr (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., i dr. Synthesis, 1996, 719-725; i Pettit i dr (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans.15:859-863.. Takođe pogledati Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778-784; „Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands“, US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004, (koji obijavljuje, na primer, veznike i postupke pripreme jedinjenja monometilvalina kao što su MMAE i MMAF konjugovani za veznike).
iii. Kaliheamicin
[0274] U drugim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula kalikeheamicina. Porodica antibiotika kalijeheamicina je sposobna da proizvede dvostruke prekide DNK u sub-pikomolarnim koncentracijama. Za pripremu konjugata porodice kalicheamicina pogledati U.S. patente 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (svi od strane American Cyanamid Company). Strukturni analozi kalheheamicina koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, γ1<I>, α2<I>, α3<I>, N-acetil-γ1<I>, PSAG i θ<I>1(Hinman i dr., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode i dr., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i pomenuti U.S. patenti za American Cyanamid ). Još jedan anti-tumorski lek za koji antitelo može biti konjugovano je KFA koji je antifolat. I kalicheamicin i KFA imaju intracelularna mesta delovanja i ne prelaze plazma membranu. Prema tome, celularno uzimanje ovih agenasa kroz antitela posredovano internalizacijom značajno povećava njihove citotoksične efekte.
iv. Ostali citotoksični agensi
[0275] Ostali antitumorski agensi koji mogu biti konjugovani sa antitelima uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, porodicu agenasa poznatih kolektivno kao LL-E33288 kompleks opisan kod U.S. patenata 5,053,394, 5,770,710, kao i esperamini (U.S. patent 5,877,296).
[0276] Enzimatski aktivni toksini i njegovi fragmenti koji se mogu koristiti mogu uključivati difterijin A lanac, nezavezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina, egzotoksinv A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), ricinov A lanac, abrinov A lanac, modecinov A lanac, alfa-sarcin, aleurites fordii proteine, dianthin proteine, Phytolaca americana proteine (PAPI, PAPII i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restocin, fenomein, enomicin i trikothecen. Pogledati, na primer, WO 93/21232 objavljen 28. oktobra 1993.
[0277] Ovaj pronalazak dalje obuhvata imunokonjugat formiran između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr., ribonukleazu ili DNK endonukleazu, kao što je dezoksiribonukleaza, DNaza).
[0278] Za selektivno uništenje tumora, antitelo može sadržati visoko radioaktivni atom. Na raspolaganju
4
su različiti radioaktivni izotopi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se konjugat koristi za detektovanje, može sadržati radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer, tc<99m>ili I<123>, ili obeležje spina za nuklearnu magnetnu rezonancu (NMR) (takođe poznatu kao magnetna rezonanca, mri), kao što su jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15 , kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0279] Radio- ili druga obeležja mogu biti inkorporisana u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintezovan ili se može sintetisati hemijskom sintezom aminokiseline korišćenjem odgovarajućih prekursora aminokiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Obeležja kao što je tc<99m>or I<123>, .Re<186>, Re<188>i In<111>mogu biti vezana preko ostatka cisteina u peptidu. Itrijum-90 se može priključiti preko ostatka lizina. Postupak jodOGEN ( Fraker i dr (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 može se koristiti za inkorporisanje joda-123. „Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy“ (Chatal,CRC Press 1989) detaljno opisuju druge postupke.
[0280] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3- (2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4- (N-malcimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat Hcl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kako je opisano kod Vitetta i dr., Science 238: 1098 (1987). Ugljenik-14-obeležen 1-izotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminepentaocetna kiselina (MKS-DTPA) je primerno helatni agens za konjugaciju radionukleotida u antitelo. Pogledati WO94/11026. Veznik može biti „veznik koji može da se cepa“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se koristiti kiselo-labilni veznik, veznik osetljiv na peptidazu, foto-labilni veznik, dimetil veznik ili veznik koji sadrži disulfid (Chari i dr., Cancer Research 52:127-131 (1992); SAD Patent br.5,208,020).
[0281] Jedinjenja izričito razmatraju, ali nisu ograničena na ADC pripremljene sa reagensima unakrsne veze: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon) benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Pogledati stranice 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Priprema antitelo lek konjugata
[0282] U antitelo lek konjugatima (ADC), antitelo (Ab) je konjugovano sa jednim ili više delova leka (D), npr. oko 1 do oko 20 lekova po antitelu, preko veznika (L). ADC Formule I se može pripremiti putem nekoliko pravaca, koristeći reakcije organskih hemija, uslove i reagense poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući: (1) reakciju nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim reagensom veznika, kako bi se formirao Ab-L, preko kovalentne veze, nakon čega sledi reakcija sa delom leka D; i (2) reakciju nukleofilne grupe dela leka sa bivalentnim veznik reagensom, kako bi se se formirao D-L, preko kovalentne veze, praćeno reakcijom sa nukleofilnom grupom antitela. Dodatni postupci za pripremu ADC-a su ovde opisani.
Ab-(L-D)pI
[0283] Veznik može da se sastoji od jedne ili više veznik komponente. Primerne veznik komponente uključuju 6-maleimidokaproil („MC“), maleimidopropanoil („MP“), valin-citrulin („val-cit“), alaninfenilalanin („ala-phe“), p-aminobenziloksikarbonil („PAB“ , N-sukcinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoat („SPP“), N-sukcinimidil 4-(N-malcimidometil)cikloheksan-1 karboksilat („SMCC“) i N-sukcinimidil (4-jodo-acetil) aminobenzoat („SIAB“). Dodatne veznik komponente su poznate u struci i neke su ovde opisane. Pogledati takođe „Monomethilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands“, US Ser. No.10/983,340, podneto 5. novembra 2004.
[0284] U nekim otelotvorenjima, veznik može sadržati ostatke aminokiselina. Primerne komponente
4
aminokiselinskih veznika uključuju dipeptid, tripeptid, tetrapeptid ili pentapeptid. Primeri dipeptida uključuju: valin-citrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe). Primeri tripeptida uključuju: glicin-valin-citrulin (gl-val-cit) i glicin-glicin-glicin (gl-gli-gli). Ostaci aminokiselina koji sadrže aminokiselinsku vezivnu komponentu uključuju one koji se javljaju prirodno, kao i manje aminokiseline i ne-prirodne analoge aminokiselina, kao što je citrulin. Veznik komponente aminokiselina mogu biti projektovane i optimizovane u svojoj selektivnosti za enzimsko cepanje od strane određenih enzima, na primer, proteaze povezane sa tumorom, katepsin B, C i D ili plazmin proteaze.
[0285] Nukleofilne grupe na antitelima uključuju, ali nisu ograničene na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe sa bočnim lancem, npr. lizin, (iii) tiolne grupe bočnog lanca, npr. cistein i (iv) šećerne hidroksilne ili amino grupe gde je antitelo glikozilirano. Amin, tiol i hidroksilne grupe su nukleofilne i mogu reagovati u obliku kovalentnih veza sa elektrofilnim grupama na veznik delovima i veznik reagensima uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiselina; (ii) alkil i benzil halidi kao što su haloakctamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe. Određena antitela imaju međulančane disulfide koji se mogu redukovati, tj. cisteinske mostove. Antitela mogu biti reaktivna za konjugaciju sa veznik reagensom tretiranjem redukcionog agensa kao što je DTT (ditiotreitol). Zbog toga svaki cisteinski most stvara, teoretski, dva reaktivna tiol nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela kroz reakciju lizina sa 2-iminotiolancom (Trautov reagens) što rezultuje konverzijom amina u tiol. Reaktivne tiol grupe mogu se uvesti u antitelo (ili njegov fragment) uvođenjem jednog, dva, tri, četiri ili više ostataka cisteina (npr., pripremanje mutantnih antitela koja sadrže jedan ili više neuronskih cisteinskih ostataka aminokiselina).
[0286] Antitelo lek konjugati mogu takođe biti proizvedeni modifikacijom antitela za uvođenje elektrofilnih delova koji mogu reagovati sa nukleofilnim supstituentima na veznik reagens ili leku. Šećeri glikozilovanih antitela mogu biti oksidovani, npr. sa perzistentnim oksidacionim reagensima, kako bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu reagovati sa amin grupom veznik reagensa ili delovima leka. Dobijene iminske Šif bazne grupe mogu formirati stabilnu vezu ili se mogu redukovati, npr. pomoću borohidridnih reagensa za stvaranje stabilnih aminski veza. U jednom otelotvorenju, reakcija ugljovodoničnog dela glikozilacionog antitela sa glakoznom oksidazom ili natrijum meta-periodatom može da dovede do karbonil (aldehidne i ketonske) grupe u proteinu koji može reagovati sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Bioconjugate Techniques). U još jednom otelotvorenju, proteini koji sadrže ostatke N-terminalnog serina ili treonina mogu da reaguju sa natrijum-meta-perjodatom, što rezultuje stvaranjem aldehida umesto prve aminokiseline (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem.3:138-146; US 5362852). Ovakav aldehid može reagovati sa delom leka ili veznik nukleofilom.
[0287] Isto tako, nukleofilne grupe u sastavu leka obuhvataju, ali nisu ograničene na: amin, tiol, hidroksil, hidrazin, oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazidne grupe sposobne da reaguju kako bi formirale kovalentne veza sa elektrofilnim grupama na veznikdelovima i veznik reagensima uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiselina; (ii) alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe.
[0288] Alternativno, fuzioni protein koji sadrži antitelo i citotoksični agens mogu se napraviti, npr., rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Dužina DNK može sadržati odgovarajuće regije koje kodiraju dva dela konjugata ili su susedne jedna drugoj ili su odvojene regijom koji kodira veznik peptid koji ne uništava željena svojstva konjugata.
[0289] U još jednom otelotvorenju, antitelo može biti konjugovano sa „receptorom“ (kao što je streptavidin) za upotrebu u pred-ciljanju tumora, pri čemu se antitelo receptor konjugat daje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću agensa za čišćenje, a zatim davanjem „liganda“ (npr. avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. radionukleotidom).
Vezujući oligopeptidi
[0290] Vezujući oligopeptidi su oligopeptidi koji se vezuju, poželjno specifično, na KLβ, FGFR ili KLβ-FGFR kompleks kao što je ovde opisano. Vezujući oligopeptidi mogu biti hemijski sintetizovani korišćenjem poznate metodologije sinteze oligopeptida ili mogu biti pripremljeni i prečišćeni korišćenjem rekombinantne tehnologije. Vezujući oligopeptidi su obično najmanje oko 5 aminokiselina dužine, alternativno najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100 aminokiselina dužine ili više, pri čemu su ovde opisani takvi oligopeptidi koji su sposobni da vezuju, poželjno specifično, na polipeptid. Vezujući oligopeptidi se mogu identifikovati bez nepotrebnog eksperimentisanja koristeći poznate tehnike. U tom smislu, primećeno je da su tehnike za skrining biblioteke oligopeptida za oligopeptide koji su sposobni da se specifično vezuju za polipeptidne mete dobro poznate u struci (pogledati, na primer,U.S. Patent Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT Publication Nos. WO 84/03506 and WO84/03564; Geysen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen i dr., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen i dr., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs i dr., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. i dr. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. i dr. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. i dr. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. i dr. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
[0291] U tom pogledu, prikaz bakteriofaga (faga) je jedna dobro poznata tehnika koja omogućava prikazivanje velikih biblioteka oligopeptida kako bi se identifikovali članovi tih biblioteka koji su sposobni da se specifično vezuju za polipeptidnu metu. Prikaz faga je tehnika kojom se varijante polipeptida prikazuju kao fuzioni proteini za protein na površini čestica bakteriofaga (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). Korisnost prikaza faga leži u činjenici da se velike biblioteke selektivno randomizovanih varijanti proteina (ili slučajno klonirane cDNK) mogu brzo i efikasno sortirati za one sekvence koje se vezuju za ciljani molekul sa visokim afinitetom. Prikaz biblioteka peptida (Cwirla, S. E. i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) ili proteina (Lowman, H.B. i dr. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. i dr. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. i dr. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. i dr. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) na fagu korišćen je za skrining miliona polipeptida ili oligopeptida za one sa specifičnim vezivnim svojstvima (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Sortiranje biblioteka faga slučajnih mutanata zahteva strategiju za konstrukciju i širenje velikog broja varijanti, postupak za prečišćavanje afiniteta korišćenjem cilajnog receptora i načina za ocenjivanje rezultata obogaćenja vezivanja. U.S. Patent Nos.
5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, i 5,663,143.
[0292] Iako je većina postupak prikaza faga koristila filamentni fag, takođe su poznati sistemi lambdaidnih prikaza faga (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 sistemi prikaza faga (Ren i dr., Gene, 215: 439 (1998); Zhu i dr., Cancer Research, 58 (15): 3209-3214 (1998); Jiang i dr., Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren i dr., Gene, 195 (2): 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov i dr., Virus Gene, 10: 173 (1995)) i T7 sistemi prikaza faga (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S.5,766,905).
[0293] Sada su razvijena mnoga druga poboljšanja i varijacije osnovnog koncepta faga prikaza. Ova poboljšanja povećavaju sposobnost prikaza sistema za prikazivanje peptidnih biblioteka za vezivanje za odabrane ciljane molekule i za prikaz funkcionalnih proteina sa potencijalom skrininga ovih proteina za željena svojstva. Razvijeni su kombinatorni reakcioni uređaji za reakcije fagnog prikaza (WO 98/14277) i biblioteke faga prikaza su korišćene za analizu i kontrolu bimolekularnih interakcija (WO 98/20169; WO 98/20159) i svojstva ograničenih helikalnih peptida (WO 98/20036). WO 97/35196 opisuje postupak izolacije afinitetnog liganda u kome se biblioteka prikaza faga dovodi u dodir sa jednim rastvorom u kome se ligand vezuje za ciljani molekul i drugi rastvor u kom se afinitetni ligand ne vezuje za ciljani molekul, kako bi se selektivno izolovali vezivni ligandi. WO 97/46251 opisuje postupak biopaninga biblioteke nasumičnih prikaza faga sa pročišćenim antitelom afiniteta, i zatim izoluje fazu vezivanja, nakon čega sledi postupak mikropaninga pomoću mikropločastih komorica za izolaciju vezivanja faga sa visokim afinitetom. Upotreba Staphylococcus aureus proteina A kao afinitetne obeležje takođe je objavljeni (Li i dr. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 opisuje upotrebu biblioteka oduzimanja supstrata kako bi se razlikovale specifičnosti enzima koristeći kombinatornu biblioteku koja može biti biblioteka prikaza faga. Postupak izbora enzima pogodnih za upotrebu u
1
deterdžentima koji koriste prikaz faga je opisan u WO 97/09446. Dodatni postupci selekcije specifičnih vezujućih proteina su opisani u U.S. Patent Nos.5,498,538, 5,432,018, i WO 98/15833.
[0294] Postupci generisanja biblioteka peptida i skeniranje ovih biblioteka takođe su objavljeni u U.S. Patent Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, i 5,723,323.
Vezivanje malih molekula
[0295] Vezujući mali molekule su poželjno organski molekuli, osim oligopeptida ili antitela kao što je ovde definisano, koja se vezuju, poželjno specifično, za KLβ, FGFR ili KLβ/FGFR kompleks kao što je ovde opisano. Vezujući organski mali molekuli mogu biti identifikovani i hemijski sintetizovani korišćenjem poznate metodologije (pogledati, na primer, PCT Publication Nos. WO00/00823 i WO00/39585). Vezujući organski mali molekuli su veličine obično manje od oko 2000 daltonova, alternativno manje od oko 1500, 750, 500, 250 ili 200 daltona, pri čemu se takvi organski mali molekuli koji su sposobni za vezivanje, poželjno specifično, na polipeptid kao što je opisano ovde, mogu identifikovati bez nepotrebnog eksperimentisanja koristeći poznate tehnike. U tom pogledu, primećeno je da su tehnike za skeniranje biblioteka organskih malih molekula za molekule koji su sposobni za vezivanje za polipeptidne mete dobro poznate u struci (pogledati, na primer, PCT Publication Nos. WO00/00823 i WO00/39585). Vezujući organski mali molekuli mogu biti, na primer, aldehidi, ketoni, oksimi, hidrazoni, semikarbazoni, karbazidi, primarni amini, sekundarni amini, tercijalni amini, N-supstituisani hidrazini, hidrazidi, alkoholi, eteri, tioli, tioetri, disulfidi, karboksilne kiseline, estri, amidi, uree, karbamati, karbonati, ketali, tioketali, acetali, tioacetali, aril halidi, aril sulfonati, alkil halidi, alkil sulfonati, aromatična jedinjenja, heterociklična jedinjenja, anilini, alkeni, oksazolini, tiazolidini, tiazolini, enamini, sulfonamidi, epoksidi, aziridini, izocijanati, sulfonilhloridi, diazo jedinjenja, hloridi kiseline ili slično.
Skrining za antitela, oligopeptide i organske male molekule sa željenim svojstvima
[0296] U nekim aspektima, antagonisti vezuju KLβ, i u nekim otelotvorenjima mogu modulirati jedan ili više aspekt efekata povezanih sa KLβ, uključujući, ali ne ograničavajući se, mogu modulirati jedan ili više aspekt efekata povezanih sa KLβ , uključujući, ali ne ograničavajući se na vezivanje FGFR4 (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), vezivanje FGFR4 i FGF19 (opciono u spoju sa heparinom), promovisanje FGF 19-posredničke indukcije cFos, Junb i/ili Junc (in vitro ili in vivo ), promovisanje FGFR4 i/ili FGF19 nizvodne signalizacije (uključujući, ali ne ograničavajući se na FRS2 fosforilaciju, ERK1/2 fosforilaciju i aktivaciju Wnt puta) i/ili promovisanje bilo kog biološki relevantnog biološkog puta KLβ i/ili FGFR4 i/ili promovisanje tumora, proliferativnog poremećaja ćelija ili raka; i/ili promovisanje poremećaja povezanih sa KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću (kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost KLβ).
[0297] Pročišćena antitela mogu se dalje karakterisati serijom analiza uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-terminalno sekvencioniranje, analizu aminokiselina, tečnu hromatografija visokog pritiska (HPLC) sa isključivanjem veličine bez denaturizacije, masena spektrometrija, hromatografiju razmene jona i digestiju papaina.
[0298] U nekim otelotvorenjima pronalaska, antitela koja se ovde proizvode analiziraju se za svoju biološku aktivnost. U nekim otelotvorenjima, antitela iz ovog pronalaska su testirana za njihovu aktivnost vezivanja antigena. Testovi vezivanja antigena koji su poznati u ovoj oblasti i koji se mogu koristiti ovde uključuju, ali nisu ograničeni ni na jedan direktni ili konkurentni test vezivanja koristeći tehnike kao što su Western blot, radioimunoanalize, ELISA (enzimski povezan imunosorbentni test), „sendvič“ imunotestovi, testovi imunoprecipitacije, fluorescentni imunotestovi i imunotestovi proteina A. Ilustrativni test vezivanja antigena dat je u nastavku u odeljku sa Primerima.
[0299] Anti-KLp antitela koja poseduju ovde opisana svojstva mogu se dobiti s kloniranjem anti-KLp hibridoma klonova za željena svojstva bilo kojim pogodnim postupkom.
[0300] Ostali funkcionalni testovi za određivanje kapaciteta vezivanja anti-KLp antitela poznati su u struci, od kojih su neki ovde prikazani.
[0301] Anti-FGFR4 antitela koja poseduju ovde opisana svojstva mogu se dobiti skriningom anti-
2
FGFR4 hibridoma klonova za željena svojstva bilo kojim pogodnim postupkom.
[0302] Ostali funkcionalni testovi za određivanje kapaciteta vezivanja anti-FGFR4 antitela su poznati u struci, od kojih su neki ovde prikazani.
[0303] Za prikazivanje antitela, oligopeptida ili drugih organskih malih molekula koji se vezuju za epitop na polipeptidu za koji je vezano antitelo od interesa, može se izvršiti rutinski unakrsni blok-test, kao što je opisano kod Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Ovaj test se može koristiti za utvrđivanje da li test antitelo, oligopeptid ili drugi organski mali molekul vezu istu lokaciju ili epitop kao poznato antitelo. Alternativno, ili dodatno, mapiranje epitopa se može izvesti postupcima poznatim u struci. Na primer, sekvenca antitela može se mutagenizovati, kao što je skeniranje alaninom, kako bi se identifikovali ostaci dodira. Mutant antitelo se inicijalno testira na vezivanje sa poliklonskim antitelima kako bi se obezbedilo pravilno savijanje. U drugačijem postupku, peptidi koji odgovaraju različitim regijama polipeptida mogu se koristiti u testovima nadmetanja sa test antitelima ili sa test antitelom i antitelom sa karakterisanim ili poznatim epitopom.
[0304] U nekim otelotvorenjima, ovaj pronalazak obuhvata promene antitela koja poseduju neke ali ne i sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za mnoge primene u kojima je poluživot antitela in vivo važan, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC ) su nepotrebne ili štetne. U određenim otelotvorenjima, Fc aktivnosti proizvedenog imunoglobulina se mere kako bi se obezbedilo održavanje samo željenih svojstava. In vitro i/ili in vivo analize citotoksičnosti mogu se provesti kako bi se potvrdilo smanjenje/smanjenje aktivnosti CDC-a i/ili ADCC-a. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se provesti kako bi se osiguralo da antitelo nema FcγR vezu(zbog čega verovatno nema ADCC aktivnost), ali da zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Eksprimiranje FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirano u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Primer in vitro analize za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa je opisan kod US Patent No. 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je onaj opisan kod Clynes i dr. PNAS (SAD) 95: 652-656 (1998). Testiranje vezivanja C1q može takođe biti izvedeno kako bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da vezuje C1q i stoga nema aktivnost CDC. Za procenu aktivacije komplementa, može se izvršiti CDC test, npr. kao što je opisano kod Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota takođe mogu biti izvedene korišćenjem postupaka poznatih u struci.
[0305] U nekim otelotvorenjima korisna su izmenjena antitela koja poseduju povećane efektorske funkcije i/ili povećan poluživot.
Polipeptidi i nukleinske kiseline
[0306] Nukleotidne sekvence imaju različite primene u struci molekularne biologije, kao i upotrebe za terapiju itd. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid takođe će biti korisna za pripremanje polipeptida rekombinantnim tehnikama opisanim ovde, pri čemu se ovi polipeptidi mogu koristiti za na primer, u pripremi antitela kako je ovde opisano.
[0307] Polipeptidni gen sa prirodnom sekvencom ili njegovi delovi mogu se koristiti kao sonde hibridizacije za biblioteku cDNK da izoluju druge cDNK (na primer, oni koji kodiraju varijante polipeptida koje se pojavljuju u prirodi ili polipeptide od drugih vrsta), koji imaju željeni identiteta sekvence sa nativnom polipeptidnom sekvencom koja je ovde prikazana. Opciono, dužine sondi će biti oko 20 do oko 50 baza. Hibridizacijske sonde mogu biti izvedene iz najmanje delimično novih regija nukleotidne sekvence pune dužine, gde se te regije mogu odrediti bez nepotrebnog eksperimentisanja ili iz genomskih sekvenci uključujući promotere, elemente poboljšanja i introne polipeptida nativne sekvence. Kao primer, postupak snimanja će obuhvatiti izolaciju regije kodiranja polipeptidnog gena pomoću poznate DNK sekvence za sintetizaciju odabrane sonde od oko 40 baza. Sonde za hibridizaciju mogu biti obeležene različitim obeležjima, uključujući radionukleotide kao što su<32>P ili<35>S ili enzimska obeležja kao što je alkalna fosfataza povezana sa sondom putem avidin/biotin sistema spajanja.
Obeležene sonde koje imaju sekvencu komplementarnu onoj od polipeptidnog gena prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti za prikazivanje biblioteka ljudske cDNK, genomske DNK ili mRNK, kako bi se utvrdilo na koje članove takvih biblioteka sonda hibridizuje. Tehnike hibridizacije su detaljnije opisane u Primerima u nastavku. Svaka EST sekvenca koja je objavljena u ovoj prijavi može se slično koristiti kao sonde, korišćenjem postupaka koji su ovde objavljeni.
[0308] Ostali korisni fragmenti nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptid uključuju antisens ili sens oligonukleotide koji sadrže jednolančanu sekvencu nukleinske kiseline (bilo RNK ili DNK) koja je sposobna da se vezuje za ciljanu sekvencu polipeptidne mRNK (sens) ili polipeptidne DNK (antisens). Antisens ili sens oligonukleotidi, prema predmetnom pronalasku, sadrže fragment regije kodiranja DNK koja kodira hepsin, pro-HGF ili vezujuće fragmente kao što je ovde opisano. Takav fragment generalno sadrži najmanje oko 14 nukleotida, poželjno od oko 14 do 30 nukleotida. Sposobnost da se dobije antisens ili sens oligonukleotid, zasnovan na cDNK sekvenci koja kodira dati protein, je opisana, na primer, kod Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) i van der Krol i dr. (BioTechniques 6:958, 1988).
[0309] Vezivanje antisens ili sens oligonukleotida za ciljanje sekvence nukleinskih kiselina rezultuje u formiranju dupleksa koji blokiraju transkripciju ili translaciju ciljane sekvence na jednam od nekoliko načina, uključujući poboljšanu degradaciju dupleksa, preuranjen završetak transkripcije ili translacije ili drugim načinima. Ovakvi postupci su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Antisens oligonukleotidi se tako mogu koristiti za blokiranje eksprimiranja proteina, pri čemu protein može igrati ulogu u indukciji kancera kod sisara. Antisens ili sens oligonukleotidi dalje obuhvataju oligonukleotide koji imaju modifikovane magnezijumove šećer-fosfodiestre (ili druge veze sa šećerom, kao što su oni opisani kod WO 91/06629) i gde su takve veze šećera otporne na endogene nukleaze. Takvi oligonukleotidi sa otpornim šećernim vezama su stabilni in vivo (tj. sposobni da se suprotstave enzimskoj degradaciji), ali zadržavaju specifičnost sekvence kako bi se mogla vezati za ciljane nukleotidne sekvence.
[0310] Poželjna intragenska mesta za antisens vezivanje obuhvataju regiju koji sadrži translacijski inicijalni/početni kodon (5'-AUG/5'-ATG) ili terminacijski/zaustavni kodon (5'-UAA, 5'-UAG i 5-UGA/5'- TAA, 5'-TAG i 5'-TGA) otvorenog okvira za čitanje (ORF) gena. Ovi regije se odnose na deo mRNK ili gena koji obuhvata od oko 25 do oko 50 susednih nukleotida u bilo kom pravcu (tj., 5' ili 3') od inicijalnog ili terminacionog kodona za translaciju. Ostale poželjne regije za antisens vezivanje uključuju: introne; ekone; intron-eksonske veze; otvoreni okvir za čitanje (ORF) ili „regiju za kodiranje“, gde je regija između kodona za iniciranje translacije i kodna za terminaciju translacije; 5' kapa od mRNK koja sadrži N7-metilovani gvanozinski ostatak spojen sa 5'-većinom ostataka mRNK putem vezivanja 5,5-trifosfata i uključuje 5' samu strukturu kape, kao i prvih 50 nukleotida susednih od kape; 5' neprevedena regija (5'UTR), deo mRNK u pravcu 5' od inicijalnog kodona za translaciju, i time uključuje i nukleotide između 5' mesta i inicijalnog kodona translacije od mRNK ili odgovarajućih nukleotida na genu; i 3' neprevedena regija (3'UTR), deo mRNK-a u pravcu 3' od terminacionog kodona za translaciju, i na taj način uključuje nukleotide između terminacijskog kodona translacije i 3' kraja mRNK ili odgovarajućih nukleotida na genu.
[0311] Specifični primeri poželjnih antisens jedinjenja korisnih za inhibiranje eksprimiranja polipeptida uključuju oligonukleotide koji sadrže modifikovane kičme ili ne-prirodne međunukleozidne veze. Oligonukleotidi koji imaju modifikovane kičme uključuju one koji zadržavaju atom fosfora u kičmi i oni koji nemaju atom fosfora u kičmi. U svrhu ove specifikacije i kao što se ponekad navodi u struci, modifikovani oligonukleotidi koji nemaju atom fosfora u svojoj interkutnozidnoj kičmi takođe se mogu smatrati oligonukleozidima. Poželjne modifikovane oligonukleotidne kičme uključuju, na primer, fosforotioate, kiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestere, metil i druge alkilfosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate, 5'-alkilencne fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'- aminofosforamidate i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestere, selenofosfate i borano-fosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, njihove 2'-5' vezane analoge, i one koji imaju obrnuti polaritet u kome je jedna ili više internukleotidnih veza 3' do 3', 5' do 5' ili 2' do 2' veza. Poželjni oligonukleotidi koji imaju obrnuti polaritet sadrže vezu 3' do 3' na 3'-većini međukleotidnih veza, tj. jedan obrnuti nukleozidni ostatak koji može biti nebazni (nukleobaza nedostaje ili postoji hidroksilna grupa na njenom mestu). Uključene su i razne soli, mešovite soli i formule slobodne kiseline. Reprezentativni US patenti koji govore o pripremi
4
veza koji sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. Nos.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 i 5,625,050.
[0312] Poželjne modifikovane oligonukleotidne kičme koje ne sadrže atom fosfora u sebi imaju kičme koje su formirane alkilnim alkilima ili cikloalkil internukleozidnim vezama, mešovitim heteroatomom i alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama ili jednim ili više heteroatomskih ili heterocikličnih međucukloidnih veza sa kratkim lancem. To uključuje one koji imaju morfolino veze (delom formirane od šećernog dela nukleozida); siloksanske kičme; sulfid, sulfoksid i sulfon; formacetil i tioformacetil kičme; metilen formacetil i tioformacetil kičme; riboacetil kičme; kičme koje sadrže alken ; sulfamat kičme; metilenimino i metilenhidrazino kičme; sulfonat i sulfonamid kičme; amid kičme; i druge koji imaju mešovite N, O, S i CH2 komponente. Reprezentativni US patenti koji predaju pripremu takvih oligonukleozida obuhvataju, ali ne ograničavajući se. U.S. Pat. Nos.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 i 5,677,439.
[0313] U drugim poželjnim antisens oligonukleotidima, i šećer i internukleozidna veza, tj. kičma, nukleotidnih jedinica zamenjuju se novim grupama. Bazne jedinice se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućim ciljanim jedinjenjem nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, oligonukleotidni mimetik za koji se pokazalo da ima odlična svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNA). U jedinjenjima PNA, kičma lanca oligonukleotida zamenjena je amidom koji sadrži kičmu, posebno nosač aminoetilglicina. Nukleobaze su zadržane i vezane su direktno ili indirektno na aza atome azotne amidnog dela kičme. Reprezentativni US patenti koji podučavaju pripreme PNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. Nos.: 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dalji tekstovi o PNA jedinjenjima mogu naći u Nielsen i dr., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0314] Poželjni antisens oligonukleotidi sadrže fosforotioatne kičme i/ili heteroatomske kičme, i naročito --CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [poznat kao metilen (metilimino) ili MMI kičma], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- i -O-N(CH3)-CH2-CH2- [gde je izvorna fosfodiestarska kičma predstavljena kao -O-P-O-CH2-] opisan u gore navedenom U.S. Pat. No.
5,489,677, i amidna kičma gore navedenog U.S. Pat. No. 5,602,240. Takođe poželjni su antisens oligonukleotidi koji imaju morfolinske strukture kičme gore navedenog U.S. Pat. No.5,034,506.
[0315] Modifikovani oligonukleotidi mogu takođe sadržati jedna ili više supstituisan šećern ostatak. Poželjni oligonukleotidi sadrže jedno od sledećeg na 2' položaju: OH; F; O-alkil, S-alkil ili N-alkil; O-alkenil, S-alkinil ili N-alkenil; O-alkinil, S-alkinil ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, gde alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Posebno poželjni su O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)2, gde su n i m od 1 do oko 10. Ostali poželjni antisens oligonukleotidi sadrže jedno od sledećeg na položaju 2': C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkenil, alkinil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupu za cepanje RNK, reportersku grupu, interkalator, grupu za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava oligonukleotida ili grupu za poboljšanje farmakodinamskih svojstava oligonukleotida i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. Poželjna modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin i dr., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) tj., alkoksialkoksi grupa. Dodatna poželjna modifikacija uključuje 2'-dimetilaminooksietoksi, tj.,O(CH2)2ON(CH3)2grupu, takođe poznatu kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u primerima u nastavku i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznat u struci kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2).
[0316] Dodatna poželjna modifikacija uključuje zaključane nukleinske kiseline (LNA) u kojima je 2'-hidroksilna grupa vezana za 3' ili 4' ugljenikov atom prerađenog šećera, čime se formira biciklična šećerna grupa. Veza je poželjno metilen(-CH2-)ngrupa koja premošćuje 2' atom kiseonika i 4' atom ugljenika gde je n 1 ili 2. LNA i njihova priprema su opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0317] Ostale poželjne modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alil (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alil (2'-O-CH2-CH=CH2) i 2'-fluoro (2'-F). 2'-modifikacija može biti u arabino (gornjem) položaju ili na ribo (donjem) položaju. Poželjna 2'-arabino modifikacija je 2'-F. Slične modifikacije mogu se takođe napraviti na drugim položajima na oligonukleotidu, naročito na 3' položaju šećera na 3' terminalu nukleotida ili u 2'-5' vezanim oligonukleotidima i 5' položaju 5' terminalnog nukleotida. Oligonukleotidi mogu takođe imati šećerne mimetike kao što su ciklobutilne grupe umesto pentofuranozilnog šećera. Reprezentativni US patenti koji govore o pripremi takvih modifikovanih šećernih struktura uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. Nos.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; i 5,700,920.
[0318] Oligonukleotidi mogu takođe uključiti modifikacije ili supstitucije nukleobaze (često se u struci jednostavno nazivaju „baze“). Kad se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju i druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkilne derivate adenina i gvanina, 2-propila i druge alkilne derivate adenina i gvanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina i 2-tiocitozina, 5-halouracila i citozina, 5-propinil (-C=C-CH3ili -CH2-C=CH) uracil i citozin i druge alkinilne derivate pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseuduracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8 -hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i gvanine, 5-halo posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilgvanin i 7-metilladenin, 2-F-adenin, 2-amino-adenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje modifikovane nukleobaze uključuju triciklične pirimidine kao što su fenoksazin citidin (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoksazin-2(3H)-on), fenotiazin citidin (1H-pirimido [5,4-b][1,4-benzotiazin-2(3H)-on), G-spona kao što je supstituisan fenoksazin citidin (npr. 9-(2-aminoetoksi)-H-pirimido[5,4-b] [1,4]benzoksazin-2 (3H)-on), karbazol citidin (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-on), piridoindol citidin (H-pirido [3',2':4,5]pirolo[2,3-d] pirimidin-2-on). Modifikovane nukleobaze mogu takođe uključivati one u kojima se purinska ili pirimidinska baza zamenjuju drugim heterociklima, na primer 7-deaza-adenin, 7-deazagvanozin, 2-aminopiridin i 2-piridon. Dalje nukleobaze obuhvataju one objavljene u U.S. Pat. No.3,687,808, one objavljene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, i one koje objavljene kod Englisch i dr., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Određene od ovih nukleobaza su naročito korisne za povećanje vezivnog afiniteta oligomernih jedinjenja pronalaska. Ovo uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropladenin, 5-propinilluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je da 5-metilcitozin supstitucije povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C (Sanghvi i dr, antisens Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) i predstavljaju poželjne bazne supstitucije, još više u kombinaciji sa modifikacijama 2'-O-metoksietil-šećera. Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi modifikovanih nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na: U.S. Pat. Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 i 5,750,692.
[0319] Druga modifikacija antisens oligonukleotida koji se hemijski povezuje sa oligonukleotidom jedan ili više delova ili konjugata koji povećavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijski uzimanje oligonukleotida. Jedinjenja pronalaska mogu uključiti konjugatne grupe kovalentno vezane za funkcionalne grupe kao što su primarne ili sekundarne hidroksilne grupe. Konjugatne grupe pronalaska uključuju interkalatore, reporterske molekule, poliamine, poliamide, polietilen glikole, polietre, grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva oligomera, i grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva oligomera. Tipične grupe konjugata uključuju holesterole, lipide, katjonske lipide, fosfolipide, katjonske fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakinon, akridin, fluoresceine, rodinine, kumarine i boje. Grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva, u kontekstu ovog pronalaska, uključuju grupe koje poboljšavaju uzimanje oligomera, poboljšavaju otpornost oligomera na degradaciju i/ili ojačavaju sekvencijalno hibridizaciju sa RNK. Grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva, u kontekstu ovog pronalaska, uključuju grupe koje poboljšavaju uzimanje, distribuciju, metabolizam ili izlučivanje oligomera. Konjugovni ostaci uključuju ali nisu ograničeni na lipidne grupe kao što je holesterol deo (Letsinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), holinska kiselina ((Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), tioetar, npr., heksil-S-tritiltiool (Manoharan i dr., Ann. N.I. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), tioholesterol (Oberhauser i dr., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), alifatični lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci(Saison-Behmoaras i dr., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov i dr., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk i dr., Biochimie, 1993, 75, 49-54), fosfolipid, npr., di-hekadecil-rac-glicerol ili trietil-amonijum 1,2-di-0-heksadecil-rac-glicerol-3-H-fosfonat (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea i dr., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), poliamin ili polietilenglikol lanac (Manoharan i dr., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), palmitalni deo (Mishra i dr., Biochim. Biophis. Acta, 1995, 1264, 229-237), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterolni ostatak. Oligonukleotidi prema pronalasku takođe mogu biti konjugovani aktivnim supstancama za lekove, na primer, aspirinom, varfarinom, fenilbutazonom, ibuprofenom, suprofenom, fenbufenom, ketoprofenom, (S)-(+)-pranoprofenom, karprofenom, dansilkarcosinom, 2,3,5-triodobenzoičnom kiselinom, flufenaminskom kiselinom, foliničnom kiselinom, benzotijevadiazidom, hlorothiazidom, diazepinom, indometicinom, barbituratom, cefalosporinom, sulfa lekom, antidijabetikom, antibakterikom ili antibiotikom. Konjugati oligonukleotidnih lekova i njihova priprema su opisani u U.S. patent application Ser. No. 09/334,130 (filed Jun. 15, 1999) i United States patents Nos.: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941.
[0320] Nije neophodno da se svi položaji u datom sastavu ravnomerno modifikuju, a zapravo više od jedne od gore pomenutih modifikacija mogu biti inkorporirane u jedno jedinjenje ili čak u jedan nukleozid unutar oligonukleotida. Predmetni pronalazak takođe uključuje antisens jedinjenja koja su himerna jedinjenja. „Himerna“ antisens jedinjenja ili „himeri“ u kontekstu ovog pronalaska su antisens jedinjenja, posebno oligonukleotidi, koji sadrže dve ili više hemijski različite regije, od kojih je svaka sastavljena od najmanje jedne monomerne jedinice, tj. nukleotida u slučaju oligonukleotidnog jedinjenja. Ovi oligonukleotidi obično sadrže bar jednu regija u kojoj je oligonukleotid modifikovan tako da se oligonukleotidu daje povećana otpornost na degradaciju nukleaze, povećano uzimanje ćelija i/ili povećan afinitet vezivanja za ciljanu nukleinsku kiselinu. Dodatna regija oligonukleotida može poslužiti kao supstrat za enzime sposobne za cepanje RNK:DNK ili RNK:RNK hibrida. Kao primer, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa. Aktivacija RNaze H, dakle, rezultuje cepanjem RNK mete, čime se značajno povećava efikasnost inhibicije oligonukleotida gena. Shodno tome, često se mogu dobiti uporedivi rezultati sa kraćim oligonukleotidima kada se koriste himerni oligonukleotidi, u poređenju sa fosforotioatnim deoksioligonukleotidima koji se hibridizuju u istoj ciljanoj regiji. Himerna antisens jedinjenja iz ovog pronalaska mogu se formirati kao kompozitne strukture dva ili više oligonukleotida, modifikovani oligonukleotidi, oligonukleozidi i/ili oligonukleotidni mimetici kao što je gore opisano. Poželjni himerni antisens oligonukleotidi sadrže najmanje jedan 2' modifikovani šećer (poželjno 2'-O-(CH2)2-O-CH3) na 3' terminalu kako bi se pružila rezistencija nukleaze i regija sa najmanje 4 susedna 2'-H šećera kako bi se prenela aktivnost RNaze sati. Ovakva jedinjenja su takođe poznata u struci kao hibridi ili gapmeri. Poželjni gapmeri imaju regiju od 2' modifikovanih šećera (poželjno 2'-O-(CH2)2-O-CH3) na 3'-terminalu i na 5' terminalu razdvojene sa najmanje jednim regijom koji ima najmanje 4 susedna 2'-H šećere i poželjno uključuje fosforotioatne pozadinske veze. Reprezentativni US patenti koji govore o pripremi takvih hibridnih struktura uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. Nos.5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; i 5,700,922.
[0321] Antisens jedinjenja koja se koriste u skladu sa ovom objavom mogu biti pogodno i rutinski izrađena kroz dobro poznatu tehniku sinteze čvrste faze. Opremu za takvu sintezu prodaje nekoliko proizvođača, uključujući, na primer, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Bilo koji drugi načini za takvu sintezu poznati u struci mogu se dodatno ili alternativno koristiti. Poznato je da koriste slične tehnike za dobijanje oligonukleotida kao što su fosforotioati i alkilovani derivati. Jedinjenja iz ovog pronalaska takođe mogu biti pomešana, inkapsulirana, konjugovana ili na drugi način povezana sa drugim molekulima, molekulskim strukturama ili mešavinama jedinjenja, kao na primer, lipozomi, molekuli na ciljani receptor, oralne, rektalne, topikalne ili druge formulacije, za pomoć pri uzimanju, distribuciji i/ili apsorpciji. Reprezentativni US patenti koji govore o pripremi takvih formulacija koje pomažu u prikupljanju, distribuciji i/ili apsorpciji uključuju, ali nisu ograničene na, U.S. Pat. Nos.
5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; i 5,595,756.
[0322] Drugi primeri sens ili antisensignih oligonukleotida uključuju one oligonukleotide koji su kovalentno povezani sa organskim delovima, kao što su oni opisani u WO 90/10048, i drugi delovi koje povećavaju afinitet oligonukleotida za ciljanu sekvencu nukleinske kiseline, kao što je poli- (L-lizin). Dalje, interaktivni agensi, kao što su elipticin i agensi za alkilovanje ili metalni kompleksi, mogu biti vezani za sens ili antisens oligonukleotide za modifikaciju vezivnih specifičnosti antisens ili smislenog oligonukleotida za ciljanu nukleotidnu sekvencu.
[0323] Antisens ili sens oligonukleotidi mogu biti uvedeni u ćeliju koja sadrži sekvencu ciljane nukleinske kiseline bilo kojim postupkom prenosa gena, uključujući, na primer, CaPO4-posredovanu DNK transfekciju, elektroporaciju ili pomoću vektora prenosa gena kao što je Epstcin-Bar virus. U poželjnoj proceduri, antisens ili sens oligonukleotid ubacuju se u odgovarajući retrovirusni vektor. Ćelija koja sadrži sekvencu ciljane nukleinske kiseline je dovedena u dodir sa rekombinantnim retrovirusnim vektorom in vivo ili ex vivo. Odgovarajući retrovirusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su izvedeni iz mišićnog retrovirusa M-MuLV, N2 (retrovirus izveden iz M-MuLV) ili vektora dvostruke kopije obeleženih kao DCT5A, DCT5B i DCT5C (pogledati WO 90/13641).
[0324] Sense ili antisens oligonukleotidi takođe mogu biti uvedeni u ćeliju koja sadrži ciljanu nukleotidnu sekvencu formiranjem konjugata sa molekulom koji vezuje ligand, kao što je opisano kod WO 91/04753. Odgovarajući molekuli koji vezuju ligand uključuju, ali nisu ograničene na, receptore ćelijske površine, faktore rasta, druge citokine ili druge ligande koji se vezuju za receptore na površini ćelije. Poželjno, konjugacija molekula vezivanja liganda ne ometa u značajnoj meri sposobnost liganda za vezivanje molekula da se vezuje za odgovarajući molekul ili receptor, ili blokira ulazak sens ili antisens oligonukleotida ili svoje konjugovane verzije u ćeliju.
[0325] Alternativno, sens ili antisens oligonukleotid može se uvesti u ćeliju koja sadrži sekvencu ciljane nukleinske kiseline formiranjem oligonukleotid-lipid kompleksa, kao što je opisano kod WO 90/10448. Sens ili antisens oligonukleotid-lipid kompleks je poželjno disociran unutar ćelije endogenom lipazom.
[0326] Antisens ili sens RNK ili DNK molekuli su generalno najmanje oko 5 nukleotida dugački, alternativno najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ili 1000 nukleotida dugački, pri čemu u ovom kontekstu izraz „oko“ označava referentnu dužinu nukleotidne sekvence plus ili minus 10% od navedene referentne dužine.
[0327] Sonde se takođe mogu koristiti u PCR tehnikama da generišu niz sekvenci za identifikaciju blisko povezanih polipeptidnih kodnih sekvenci.
[0328] Nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid mogu se takođe koristiti za konstrukciju hibridizacionih sondi za mapiranje gena koji kodira taj polipeptid i za genetsku analizu pojedinaca sa genetskim poremećajima. Nukleotidne sekvence date ovde mogu biti mapirane na hromozom i specifične regije hromozoma korišćenjem poznatih tehnika, kao što su in situ hibridizacija, analiza povezivanja sa poznatim hromozomskim markerima i hibridizacija skrininga sa bibliotekama.
[0329] Polipeptid se može koristiti u testovima za identifikaciju drugih proteina ili molekula uključenih u vezujuću interakciju sa polipeptidom. Ovakvim postupcima mogu se identifikovati inhibitori interakcije vezivanja receptora/liganda. Proteini uključeni u takve vezujuće interakcije takođe se mogu koristiti za prikazivanje inhibitora peptida ili interakcije vezivanja malih molekula. Ispitivanja se mogu dizajnirati da pronađu vodeća jedinjenja koja imitiraju biološku aktivnost nativnog polipeptida ili receptora za polipeptid. Ovakvi testovi će uključivati procese koji su podložni visokoj detaljnom skriningu hemijskih biblioteka, čineći ih posebno pogodnim za identifikaciju kandidata za mali molekulski lek. Mali molekuli koji se pominju uključuju sintetička organska ili neorganska jedinjenja. Analize se mogu izvoditi u različitim formatima, uključujući analize vezivanja proteina-proteina, biohemijske skrining analize, imunoanalize i ćelijske analize, koje su dobro poznate u struci.
[0330] Nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid ili njegove modifikovane forme mogu se takođe koristiti za stvaranje transgenih životinja ili „oborene“ životinje koje su, zauzvrat, korisne u razvoju i skriningu terapeutski korisnih reagenasa. Transgena životinja (npr. miš ili pacov) je životinja koja ima ćelije koje sadrže transgene, a transgen je prenatalno uveden u životinju ili pretka životinje, na primer, embrionalnoj faze. Transgen je DNK koji je integrisana u genom ćelije iz koje se razvija transgena životinja. U jednom otelotvorenju, cDNK koja kodira polipeptid može se koristiti za kloniranje genomske DNK koja kodira polipeptid u skladu sa utvrđenim tehnikama i genomskom sekvencom korišćenom za stvaranje transgenih životinja koje sadrže ćelije koje eksprimiraju DNK koja kodira polipeptid. Postupci za stvaranje transgenih životinja, naročito životinja kao što su miševi ili pacovi, postali su konvencionalne u struci i opisani su, na primer, u U.S. Patent Nos. 4,736,866 i 4,870,009. Tipično, određene ćelije bi bile usmerene na ugrađivanje transgena polipeptida sa pojačivačima specifičnim za tkivo. Transgene životinje koje uključuju kopiju transgena koja kodira polipeptid uveden u germliniju životinje u embrionalnoj fazi mogu se koristiti za ispitivanje dejstva povećanog eksprimiranja DNK koja kodira polipeptid. Takve životinje mogu se koristiti kao test životinje za reagense koji se smatraju zaštitnim od, na primer, patoloških stanja povezanih sa njegovim prekomernim eksprimiranjem. U skladu sa ovim aspektom pronalaska, životinja se tretira sa reagensom i smanjenom učestalošću patološkog stanja, u poređenju sa životinjama netretiranim sa transgenom, ukazuje na potencijalnu terapeutsku intervenciju za patološko stanje.
[0331] Alternativno, ne-ljudski homolozi polipeptida mogu se koristiti za konstrukciju gena „oborenih“ životinja koje imaju defektan ili izmenjen gen koji kodira polipeptid kao rezultat homologne rekombinacije između endogenog gena koji kodira polipeptid i izmenjenu genomsku DNK koja kodira polipeptid uveden u embrionalnu matičnu ćeliju životinje. Na primer, cDNK koja kodira polipeptid može se koristiti za kloniranje genomske DNK koja kodira polipeptid u skladu sa utvrđenim tehnikama. Deo genomske DNK koji kodira polipeptid može se izbrisati ili zameniti drugim genom, kao što je gen koji kodira marker koji se može odabrati i koji se može koristiti za praćenje integracije. Tipično, nekoliko kilobaza nepromenjene bočne DNK (i na 5' i na 3' krajevima) su uključene u vektor [pogledati npr. Thomas i Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) za opis homolognih vektora rekombinacije]. Vektor je uveden u liniju embrionalnih matičnih ćelija (npr., elektroporacija) i ćelije u kojima je uvedena DNK homologno rekombinovana sa endogenom DNK su odabrane [pogledati npr. Li i dr., Cell, 69: 915 (1992)]. Odabrane ćelije se zatim ubrizgavaju u blastocistu životinje (npr., miš ili pacov) kako bi se formirale agregacione himere [pogledati npr. Bradley, Teratocarcinomas and Embrionic Stem Cells: Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.113-152]. Himerni embrion se zatim može implantirati u odgovarajuću pseudotrudnu žensku hraniteljsku životinju, i embrion dovodi do stvaranja „oborene“ životinje. Potomstvo koje sadrži homologno rekombinovanu DNK u svojim germ ćelijama može se identifikovati standardnim tehnikama i koristiti za uzgajanje životinja u kojima sve ćelije životinje sadrže homologno rekombinovanu DNK. Nekoliko životinja se mogu okarakterisati, na primer, zbog svoje sposobnosti da se odbrane od određenih patoloških stanja i zbog svog razvoja patoloških stanja usled odsustva polipeptida.
[0332] Nukleinska kiselina koja kodira polipeptide takođe se može koristiti u genskoj terapiji. U aplikacijama genske terapije, geni se unose u ćelije kako bi se postigla in vivo sinteza terapeutski efikasnog genskog proizvoda, na primer za zamenu defektnog gena. „Genska terapija“ uključuje i konvencionalnu gensku terapiju u kojoj se trajni efekat postiže jednim lečenjem i primenu genskih terapeutskih agenasa, što podrazumeva jednokratno ili ponovljeno davanje terapeutski efikasne DNK ili mRNK. Antisens RNK i DNK mogu se koristiti kao terapeutski agensi za blokiranje eksprimiranja određenih gena in vivo. Već je pokazano da se kratki antisens oligonukleotidi mogu uvesti u ćelije u kojima deluju kao inhibitori, uprkos svojim niskim intracelularnim koncentracijama uzrokovanim svojim ograničenim unosom od strane ćelijske membrane. (Zamecnik i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Oligonukleotidi mogu biti modifikovani kako bi se poboljšala njihova primena, npr. supstitucijom njihovih negativno naelektrisanih fosfodiesterskih grupa nefunkcionisanim grupama.
[0333] Postoje različite tehnike za uvođenje nukleinskih kiselina u žive ćelije. Tehnike se razlikuju u zavisnosti od toga da li se nukleinska kiselina prenosi u kultivisane ćelije in vitro, ili in vivo u ćelije predviđenog domaćina. Tehnike pogodne za prenos nukleinske kiseline u ćelije sisara in vitro uključuju upotrebu lipozoma, elektroporaciju, mikroinženjering, fuziju ćelija, DEAE-dekstran, postupak precipitacije kalcijum fosfata i sl. Trenutno poželjne in vivo tehnike prenosa gena uključuju transfekciju sa virusnim (tipično retroviralnim) vektorima i transfekciju posredovanu virusno obloženim proteinlipozomom (Dzau i dr., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). U nekim situacijama je poželjno obezbediti izvor nukleinske kiseline sa agensom koji cilja ciljane ćelije, kao što je antitelo specifično za protein ćelijske površine membrane ili ciljanu ćeliju, ligand za receptor na ciljanoj ćeliji itd. Kada se koriste lipozomi, proteini koji se vezuju za protein ćelijske površine membrane povezani sa endocitozom mogu se koristiti za ciljanje i/ili olakšavanje uzimanja, npr. kapsidni proteini ili njihovi fragmenti tropični za određeni tip ćelije, antitela za proteine koji se internacionalizuju u ciklusima, proteini koji ciljaju intracelularnu lokalizaciju i poboljšavaju intracelularni poluživot. Tehnika receptoromposredovane endocitoze je opisana, na primer, od strane Wu i dr., J. Biol. Chem.262, 4429-4432 (1987); and Wagner ct al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Za pregled genskih obeležje i protokola o genskoj terapiji pogledati Anderson i dr., Science 256, 808-813 (1992).
Postupci koje uključuju skrining
[0334] Pronalasci obuhvataju postupke selektivnih jedinjenja za identifikaciju onih koja sprečavaju dejstvo polipeptida (antagonista) ili promovišu efekat polipeptida (agonista). Skrining testovi za kandidate protiv antagonista leka su dizajnirani da identifikuju jedinjenja koja se vezuju ili kompleksuju sa polipeptidima kodiranim genomima koji su ovde identifikovani, ili na drugi način ometaju interakciju kodiranih polipeptida sa drugim ćelijskim proteinima, uključujući npr. inhibiranje eksprimiranja polipeptida od strane ćelije. Ovakvi skrining testovi će uključivati procese koji su podložni visokoj proporciji skrininga hemijskih biblioteka, čineći ih posebno pogodnim za identifikaciju kandidata za mali molekulski lek.
[0335] Analize se mogu izvoditi u različitim formatima, uključujući analize protein-protein vezivanja, analize biohemijskog skrininga, imunoanalize i ćelijske analize, koje su dobro karakterisane u struci.
[0336] Svi testovi za antagoniste su uobičajeni u tome što oni pozivaju na dovođenje u dodir kandidata za lek sa polipeptidom kodiranim nukleinskom kiselinom koja je ovde identifikovana pod uslovima i tokom dovoljnog vremena da omogući interakciji ove dve komponente.
[0337] U analizama vezivanja, interakcija je vezana i formirani kompleks može biti izolovana ili detektovana u reakcionoj smeši. U određenom otelotvorenju, polipeptid ili kandidat za lek se imobilizuje na čvrstu fazu, npr. na pločicu za mikrotitar, pomoću kovalentnih ili nekalentativnih dodataka. Nekoventalno vezivanje se generalno postiže oblaganjem čvrste površine rastvorom polipeptida i sušenjem. Alternativno, imobilizovano antitelo, na primer, monoklonsko antitelo, specifično za imobilizaciju polipeptida, može se koristiti za zakačinjanje na čvrstu površinu. Analiza se vrši dodavanjem neimobilizovane komponente, koja se može obeležiti detektabilnim obeležjem, na imobilizovanu komponentu, npr. obloženu površinu koja sadrži zakačenu komponentu. Kada je reakcija završena, ne-reagujuće komponente se uklanjaju npr. pranjem i detektujuse kompleksi zakačeni na čvrstoj površini. Kada originalno neimobilizovana komponenta nosi detektabilno obeležje, detektovanje obeležja imobilizovanog na površini ukazuje na to da je došlo do kompleksiranja. Tamo gde izvorno neimobilizovana komponenta ne nosi obeležje, kompleksiranje se može detektovati, na primer, korišćenjem obeleženog antitela koje specifično vezuje imobilizovani kompleks.
[0338] Ako kandidat jedinjenje interakuje sa, ali se ne vezuje za polipeptid, njegova interakcija sa tim polipeptidom može se analizirati postupcima poznatim za detektovanje protein-protein interakcija. Takvi testovi uključuju tradicionalne pristupe, kao što su, na primer, unakrsno povezivanje, koimunoprkipitacija i ko-prečišćavanje kroz gradijente ili hromatografske kolone. Pored toga, proteinprotein interakcije mogu se pratiti korišćenjem genetičkog sistema zasnovanog na kvascu koji su opisali Fields i saradnici (Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) as disclosed by Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Mnogi transkripcijski aktivatori, kao što je GAL4 kvasca, sastoje se od dva fizički diskretna modularna domena, jedan koji deluje kao DNK vezujući domen, a drugi funkcioniše kao domen transkripcije. Sistem eksprimiranja kvasca opisan kod prethodnih publikacijama (koji se obično naziva „dvo-hbridni sistem“) koristi ovo svojstvo, i primenjuje dva hibridna proteina, jedan kod kog je antigen spojen sa DNK-vezujućim domenom od GAL4, i drugi, kod kog su kandidati koji aktiviraju proteine spojeni sa domenom aktivacije. Eksprimiranje GAL1-lacZ reporter gena pod kontrolom GAL4-aktiviranog promotera zavisi od rekonstitucije GAL4 aktivnosti preko protein-proteina interakcije. Kolonije koje sadrže interaktivne polipeptide detektuje se pomoću hromogenog supstrata za βgalaktozidazu. Potpun komplet (MATCHMAKER™) za identifikaciju protein-protein interakcija između dva specifična proteina koji koriste dvo-hibridnu tehniku je komercijalno dostupan od strane Clontech. Ovaj sistem se takođe može proširiti tako da mapira proteinske domene uključene u specifične interakcije proteina, kao i da odredi ostatke aminokiselina koji su ključni za ove interakcije.
[0339] Jedinjenja koja ometaju interakciju gena koji kodira polipeptid identifikovan ovde i druge intraili ekstra-celularne komponente može se testirati na sledeći način: obično se pripremi reakciona smeša koja sadrži proizvod gena i intra- ili ekstra-celularne komponente pod uslovima i za vreme koje omogućava interakciju i vezivanje dva proizvoda. Kako bi se testirala sposobnost kandidat jedinjenja da inhibira vezivanje, reakcija se odvija u odsustvu i u prisustvu test jedinjenja. Osim toga, placebo se može dodati u treću reakcionu smešu, da služi kao pozitivna kontrola. Vezivanje (formiranje kompleksa) između test jedinjenja i intra- ili ekstra-celularne komponente prisutne u smeši se prati kao što je gore opisano. Formiranje kompleksa u kontrolnoj reakciji ali ne u reakcionoj smeši koja sadrži test jedinjenje ukazuje na to da test jedinjenje ometa interakciju test jedinjenja i njegovog reakcionog partnera.
[0340] Kako bi se testirao za antagoniste, polipeptid se može dodati u ćeliju zajedno sa jedinjenjem koje će biti skriningovano za određenu aktivnost, i sposobnost jedinjenja da inhibira aktivnost od interesa u prisustvu polipeptida ukazuje na to da je jedinjenje antagonist polipeptida. Alternativno, antagonisti mogu biti detektovani kombinovanjem polipeptida i potencijalnog antagonista sa receptorima vezanim za membranu polipeptidnih receptora ili kodiranim receptorima pod odgovarajućim uslovima za analizu kompetitivne inhibicije. Polipeptid se može obeležiti, kao što je radioaktivno obeležavanje, tako da se broj polipeptidnih molekula vezanih za receptor može koristiti za određivanje efikasnosti potencijalnog antagonista. Gen koji kodira receptor može se identifikovati brojnim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer, ligand paningom i FACS sortiranjem. Coligan i dr., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Poželjno je da se koristi eksprimirajuće kloniranje u kom se poliadenilovana RNK priprema iz ćelije koja odgovara na polipeptid, i biblioteka cDNK stvorena iz ove RNK je podeljena u grupe i koristi se za transfekciju COS ćelija ili drugih ćelija koje ne odgovaraju na polipeptid. Transfektovane ćelije koje se uzgajaju na staklenim pločicama su izložene obeleženom polipeptidu. Polipeptid se može obeležiti različitim sredstvima uključujući jodinaciju ili uključivanje mesta prepoznavanja za protein kinazu specifičnu za mesto. Nakon fiksacije i inkubacije, pločice se podvrgavaju autoradiografskoj analizi. Pozitivne grupe su identifikovane i pod-grupe su pripremljene i ponovo transfektovane koristeći interaktivni proces pod-grupisanja i ponovnog snimanja, konačno prinoseći jedan klon koji kodira predloženi receptor.
[0341] Kao alternativni pristup za identifikaciju receptora, obeleženi polipeptid može biti vezan za fotoafinitet sa ćelijskim membranama ili pripremama ekstrakta koji eksprimiraju molekul receptora. Unakrsno vezani materijal rastvara od strane PAGE i izložen je rendgenskom filmu. Obeleženi kompleks koji sadrži receptor može se ispisati, razdvojiti u fragmente peptida i podvrgnuti mikro sekvencioniranju proteina. Sekvenca aminokiselina dobijena iz mikro sekvenciranja će se koristiti za dizajniranje seta degenerisanih oligonukleotidnih sondi kako bi se prikazala biblioteka cDNK za identifikaciju gena koji kodira željeni receptor.
1
[0342] U drugom testu za antagoniste, ćelije sisara ili membranski preparat koji eksprimira receptor biće inkubiran sa obeleženim polipeptidom u prisustvu kandidat jedinjenja. Potom se može meriti sposobnost jedinjenja da poboljša ili blokira ovu interakciju.
[0343] Bliže specifični primeri potencijalnih antagonista uključuju oligonukleotid koji se vezuje za fuzije imunoglobulina sa polipeptidom, i naročito antitela koja uključuju, ali ne ograničavajući se na poli- i monoklonska antitela i fragmente antitela, jednolančana antitela, anti-idiotipska antitela, i himerne ili humanizovane verzije takvih antitela ili fragmenata, kao i ljudska antitela i fragmente antitela. Alternativno, potencijalni antagonist može biti blisko povezan protein, na primer, mutirani oblik polipeptida koji prepoznaje receptor, ali ne daje nikakav efekat, čime konkurentno inhibira dejstvo polipeptida.
[0344] Drugi potencijalni antagonist je antisens RNK ili DNK konstrukt pripremljen korišćenjem antisens tehnologije, gde, na primer, antisens RNK ili DNK molekul deluje da direktno blokira translaciju mRNK hibridizacijom na ciljanu mRNK i sprečavajući translaciju proteina. Antisens tehnologija može se koristiti za kontrolu eksprimiranja gena putem formiranja trostruke spirale ili antisens DNK ili RNK, oba postupka su zasnovana na vezivanju polinukleotida sa DNK ili RNK. Na primer, 5' kodirajući deo polinukleotidne sekvence, koja ovde kodira zrele polipeptide, može se koristiti za dizajniranje antisens RNK oligonukleotida od oko 10 do 40 baznih parova dužine. DNK oligonukleotid je dizajniran da bude komplementaran regiji gena koja je uključena u transkripciju (trostruka spirala - pogledati Lee i dr., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney i dr., Science, 241: 456 (1988); Dervan i dr., Science, 251:1360 (1991)), čime se sprečava transkripcija i proizvodnja polipeptida. Antisens RNK oligonukleotid hibridizuje sa mRNK in vivo i blokira translaciju molekula mRNK u polipeptid (antisens - Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoksinukleotidi kao antisens inhibitori eksprimiranja gena (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Gore opisani oligonukleotidi takođe se mogu isporučiti ćelijama tako da antisens RNK ili DNK mogu biti eksprimirani in vivo da inhibiraju proizvodnju polipeptida. Kada se koristi antisens DNK, poželjni su oligodeoksiribonukleotidi izvedeni na mestu inicijacije translacije, npr. između oko -10 i 10 položaja ciljane nukleotidne sekvence gena.
[0345] Potencijalni antagonisti uključuju male molekule koji se vezuju za aktivno mesto, mesto vezivanja receptora ili faktor rasta ili drugo relevantno mesto vezivanja polipeptida, čime se blokira normalna biološka aktivnost polipeptida. Primeri malih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, male peptide ili molekule slične peptidima, poželjno rastvorljivi peptidi i sintetička ne-peptidilna organska ili neorganska jedinjenja.
[0346] Ribozimi su enzimski RNK molekuli sposobni da katalizuju specifično cepanje RNK. Ribozimi deluju specifično hibridizacijom sekvenci do komplementarne ciljane RNK, praćene endonukleolitičkim cepanjem. Specifična mesta za cepanje ribozima u potencijalnom RNK cilju mogu se identifikovati poznatim tehnikama. Za dalje detalje pogledati, npr., Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), i PCT publication No. WO 97/33551 (objavljeno 18. septembra 1997).
[0347] Molekuli nukleinske kiseline u obliku trostruke spirale koji se koriste za inhibiciju transkripcije treba da budu jednolančani i sastoje se od deoksinukleotida. Osnovni sastav ovih oligonukleotida je dizajniran tako da promoviše formiranje trostruke spirale pomoću Hoogsteen pravila baznih parova, koji uopšteno zahtevaju znatne prostore purina ili pirimidina na jednom lancu dupleksa. Za dalje detalje pogledati, npr., PCT publication No. WO 97/33551, supra.
[0348] Ovi mali molekuli mogu da se identifikuju pomoću bilo kog ili više testova skrininga koji se ovde razmatraju i/ili sa bilo kojim drugim tehnikama skrininga koje su dobro poznati stručnjacima.
[0349] Izolovana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid može se koristiti za rekombinantnu proizvodnju polipeptida koristeći tehnike dobro poznate u struci i kako je ovde opisano. Zauzvrat, proizvedeni polipeptidi mogu se koristiti za stvaranje antitela koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci i kako je ovde opisano.
[0350] Antitela koje specifično vezuju polipeptid koji je ovde identifikovan, kao i drugi molekuli identifikovani pomoću skrining testova koji su ovde opisani, mogu se administrirati za lečenje različitih poremećaja, uključujući i rak, u obliku farmaceutskih sastava.
[0351] Ako je polipeptid intracelularan i cela antitela se koriste kao inhibitori, poželjna su antitela za
2
internalizaciju. Međutim, lipofekti ili lipozomi takođe mogu da se koriste da bi antitelo ili fragment antitela doveli u ćelije. Kada se koriste fragmenti antitela, najmanji inhibitorni fragment koji se specifično vezuje za vezujući domen antigena je poželjan. Na primer, na bazi sekvenci varijabilne regije antitela, molekuli peptida mogu biti projektovani tako da zadržavaju sposobnost vezivanja antigenske sekvence. Takvi peptidi mogu biti sintetisani hemijski i/ili proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK. Pogledati, npr., Marasco i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).
Farmaceutske formulacije
[0352] Terapeutske formulacije koje sadrže antitelo su pripremljen za čuvanje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, pomoćnim supstancama ili stabilizatorima (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)), u obliku vodenih rastvora, liofilizovanih ili drugih osušenih formulacija. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, histidin i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonski hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni kao metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); polipeptide niske molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajuće agense kao što su EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Znproteina); i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
[0353] Formulacija ovde može takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno onima sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedne na druge. Takvi molekuli su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjene svrhe.
[0354] Aktivni sastojci se takođe mogu uključiti u pripremljene mikrokapsule, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskom mikrokapsulom i poli-(metilmetacilat) mikrokapsulom, respektivno, u koloidnim sistemima za davanje leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makromakulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000).
[0355] Formulacije za koje treba koristiti za in vivo primenu moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0356] Mogu se pripremiti sastavi za trajno oslobađanje. Pogodni primeri sastava sa trajnim oslobađanjem uključuju polu-permeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže imunoglobulin, koje su u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestere, hidroželatine (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. No.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamata, ne-razgradiv etilen-vinil acetat, kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolida acetat) i poli-D-(-)-3-hidroksipatrijske kiseline. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidroželatini otpuštaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda. Kada inkapsulirani imunoglobulini dugo ostanu u organizmu, mogu denaturisati ili agregirati kao rezultat izloženosti vlazi na 37°C, što rezultuje gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama imunogenosti. Racionalne strategije mogu biti osmišljene za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije intermolekularna formacija S-S veze kroz tio-disulfidnu zamenu, stabilizacija se može postići modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, primenom adekvatnih aditiva i razvojem specifičnih sastava polimernih matrica.
[0357] Dalje se razmatra da se agens koristan u pronalasku može uvesti kod pojedinca putem genske terapije. Genska terapija se odnosi na terapiju koja se vrši primenom nukleinske kiseline prema pojedincu. U primenama genske terapije, geni se unose u ćelije kako bi se postigla in vivo sinteza terapeutski efikasnog genskog proizvoda, na primer za zamenu defektnog gena. „Genska terapija“ uključuje i konvencionalnu gensku terapiju, u kojoj se trajni efekat postiže jednim lečenjem, i primenu genih terapeutskih agenasa, što podrazumeva jednokratno ili ponovljeno davanje terapeutski efikasne DNK ili mRNK. Antisens RNK i DNK mogu se koristiti kao terapeutski agensi za blokiranje eksprimiranja određenih gena in vivo. Pogledati, npr., KLβ-SiRNK opisanu u Primerima. Već je pokazano da se kratki antisens oligonukleotidi mogu uvesti u ćelije u kojima deluju kao inhibitori, uprkos svojim niskim intracelularnim koncentracijama uzrokovanim njihovim ograničenim unosom od strane ćelijske membrane. (Zamecnik i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)). Oligonukleotidi mogu biti modifikovani kako bi se poboljšalo njihovo uzimanje, npr. supstitucijom njihovih negativno naelektrisanih fosfodiesterskih grupa sa nenaelektrisanim grupama. Za opšte preglede postupaka genske terapije, pogledati, na primer, Goldspiel i dr. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem.62:191-217 (1993); and May TIBTECH 11:155-215 (1993). Postupci poznati u struci rekombinantne DNK tehnologije koji se mogu koristiti su opisani u Ausubel i dr. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
Primene
[0358] KLβ modulatori se mogu koristiti u, na primer, in vitro, ex vivo i in vivo terapeutskim postupcima.
[0359] Ovaj pronalazak pruža postupke i sastave korisne za moduliranje stanja bolesti povezanih sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ, kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost ili neželjeno eksprimiranje i/ili aktivnost, gde navedeni postupci obuhvataju primenu efektivne doze KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0360] U jednom aspektu, pronalazak pruža postupke za moduliranje stanja bolesti povezanih sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ i FGF19, kao što je povećano eksprimiranje i/ili aktivnost ili neželjeno eksprimiranje i/ili aktivnost, gde navedeni postupci obuhvataju primenu efikasne doze a KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0361] U jednom aspektu, pronalazak pruža postupke za moduliranje stanja bolesti povezanih sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ i FGFR4, kao što su povećano eksprimiranje i/ili aktivnost ili neželjeno eksprimiranje i/ili aktivnost, gde navedeni postupci obuhvataju primenu efektivne doze a KLβ antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) pojedincu kom je potreban takav tretman.
[0362] Uobičajen stručnjak u oblasti može odrediti da li su poremećaji povezani sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću KLβ, FGF19 i/ili FGFR4 koristeći postupke poznate u struci i postupke koji su ovde obelodanjeni.
[0363] Podrazumeva se da se bilo koji pogodan KLβ antagonist (kao što je anti-KLβ antitelo) može koristiti u postupcima lečenja, uključujući monoklonska i/ili poliklonska antitela, ljudsko antitelo, himerno antitelo, afinitetno-zrelo antitelo, humanizovano antitelo, i/ili fragment antitela.
[0364] Štaviše, bar neke od antitela mogu da se vezuju antigenom iz drugih vrsta. Shodno tome, antitela se mogu koristiti za vezivanje specifične aktivnosti antigena, npr. u ćelijskoj kulturi koja sadrži antigen, kod ljudi ili kod drugih pacijenata sisara koji imaju antigen sa kojim antitelo unakrsno reaguje (npr. šimpanze, babun, marmozet, cinomolgus i rezus, svinja ili miš). U jednom aspektu, antitelo može biti korišćeno za inhibiranje aktivnosti antigena dovođenjem u dodirom antitela sa antigenom tako da je aktivnost antigena inhibirana. Poželjno, antigen je molekul ljudskog proteina.
[0365] U jednom otelotvorenju, antitelo može da se koristi u postupku za vezivanje antigena kod pojedinca koji pati od poremećaja povezanog sa povećanom eksprimiranjem i/ili aktivnošću antigena, koji obuhvata davanje pacijentu antitela tako da je antigen u pacijentu vezan. Poželjno, antigen je molekul ljudskog proteina i pacijent je ljudski pacijent. Alternativno, pacijent može biti sisar koji eksprimira antigen sa kojim se antitelo vezuje. Još dalje, pacijent može biti sisar u koh je uveden antigen (npr., primenom antigena ili eksprimiranjem transgena antigena). Antitelo se može davati ljudskom
4
pacijentu u terapeutske svrhe. Štaviše, antitelo se može davati ne-ljudskim sisarima koji eksprimiraju antigen sa kojim imunoglobulin unakrsno reaguje (npr., primat, svinja ili miš) u veterinarske svrhe ili kao životinjski model ljudskog oboljenja. Što se tiče drugog, takvi modeli na životinjama mogu biti korisni za procenu terapijske efikasnosti antitela (npr. testiranje doziranja i vremenskih tokova primene).
[0366] Antitela se mogu koristiti za lečenje, inhibiranje, odlaganje progresije, sprečavanje/odlaganje ponovnog pojavljivanja, poboljšanje ili sprečavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa eksprimiranjem i/ili aktivnošću jednog ili više molekula antigena.
[0367] U određenim otelotvorenjima, pacijentu se daje imunokonjugat koji sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat i/ili antigen na koji je vezan se internalizuju od strane ćelije, što dovodi do povećane terapeutske efikasnosti imunokonjugata u ubijanju ciljane ćelije na koju se vezuje. U jednom otelotvorenju, citotoksični agens cilja ili ometa nukleinsku kiselinu u ciljanoj ćeliji. U jednom otelotvorenju, citotoksični agens cilja ili ometa polimerizaciju mikrotubule. Primeri takvih citotoksičnih agenasa obuhvataju bilo koji od hemoterapeutskih agenasa koji su ovde navedeni (kao što su maitanzinoid, auristatin, dolastatin ili kalheheamicin), radioaktivni izotop ili ribonukleazu ili DNK endonukleazu.
[0368] U bilo kom od opisanih postupaka, pacijentu se zajedno sa KLβ antagonistom može primeniti efikasna količina drugog leka (gde je ovde antitelo prvi lek), koji je drugo aktivni agens koji može da tretira stanje kod pacijenta koji zahteva tretman. Na primer, KLβ antagonist može se primeniti zajedno sa drugim KLβ antagonistom, antitelom, hemoterapeutskim agensima (uključujući koktele hemoterapijskih agenasa), anti-angiogenim agensima, imunosupresivnim agensima, citokinom, citokin antagonistima, i/ili agensima za inhibiranje rasta. Tip takvog drugog leka zavisi od različitih faktora, uključujući vrstu poremećaja, kao što su rak ili autoimunski poremećaj, težinu bolesti, stanje i starost pacijenta, tip i doza prvog korišćenog medikamenta itd.
[0369] Kada KLβ antagonist inhibira rast tumora, na primer, može biti posebno poželjno da se kombinuje sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa koja takođe inhibiraju rast tumora. Na primer, KLβ antagonist može biti kombinovan sa anti-angiogenim agensom, kao što je antitelo protiv VEGF (npr. AVASTIN®) i/ili anti-ErbB antitela (npr. antitelo HERCEPTIN® trastuzumab anti-HER2 ili anti-HER2 antitelo koje se vezuje za domen II od HER2, kao što je antitelo OMNITARG™ pertuzumab anti-HER2) u šemi tretmana, npr. u lečenju bilo koje od opisanih bolesti, uključujući hepatocelularni karcinom i rak pankreasa. Alternativno, ili dodatno, pacijent može primiti kombinovanu terapiju zračenja (npr. zračenje spoljašnjeg snopa ili terapiju sa radioaktivno obeleženim agensom, kao što je antitelo). Takve kombinovane terapije koje su gore navedene uključuju kombinovanu primenu (gde su dva ili više agensa uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojeno primanje, u kom slučaju se davanje antitela može pojaviti pre i/ili nakon davanja dodatne terapije ili terapija. Pored toga, kombinujući KLβ antagonist sa relativno ne-citotoksičnim agensom, kao što je drugi biološki molekul, na primer, očekuje se da antitelo smanji citotoksičnost u odnosu na kombinovanje KLβ antagonista sa hemoterapeutskim agensom drugog agensa koji je visoko toksičan za ćelije.
[0370] Lečenje sa kombinacijom KLβ antagonista sa jednim ili više sekundarnih lekova poželjno dovodi do poboljšanja znakova ili simptoma kancera. Na primer, takva terapija može dovesti do poboljšanja preživljavanja (opšte preživljavanje i/ili preživljavanje bez progresije) u odnosu na pacijenta lečenog samo drugim lekom (npr. samo hemoterapeutskim agensom) i/ili može dovesti do objektivnog odgovora *(delimičan ili potpun, poželjno potpun). Štaviše, lečenje kombinacijom KLβ antagonista i jednog ili više drugih lekova poželjno rezultuje dodatnom, a poželjnije sinergetskom (ili većom od dodatne) terapijskom koristi za pacijenta. Poželjno, u ovom kombinacionom postupku, vreme između najmanje jedne primene drugog medikamenta i najmanje jedne primene KLβ antagonista je oko mesec dana ili manje, poželjnije oko dve nedelje ili manje.
[0371] Za lečenje kancera drugi medikament je poželjno još jedan KLβ antagonist, antitelo, hemoterapeutski agens (uključujući koktele hemoterapijskih agenasa), anti-angiogeni agens, imunosupresivni agens, prolek, citokin, citokinalni antagonist, citotoksična radioterapija, kortikosteroid, anti-emetik, vakcina protiv raka, analgetik, anti-vaskularni agens i/ili inhibitor rasta. Citotoksični agens uključuje agens u interakciji sa DNK, antimetabolitima, inhibitorima topoizomeraze I ili II ili inhibitorima vretena ili stabilizatorima (npr., poželjno vinca alkaloid, poželjnije odabranog od vinblastina, deoksivinblastina, vinkristina, vindezina, vinorelbina, vinepidina, vinfosilina, vinzolidina i vinfunina) ili bilo koji agens koji se koristi u hemoterapiji kao što je 5-FU, taksan, doksorubicin ili deksametazon.
[0372] U drugom otelotvorenju, drugi medikament je antitelo koje se koristi za lečenje karcinoma kao što su ona usmerene protiv ekstracelularnog domena HER2/neu receptora, npr. trastuzumab ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata, pan-HER inhibitor, Src inhibitor, MEK inhibitor ili EGFR inhibitor (npr. anti-EGFR antitelo (kao što je inhibitor aktivnosti tirozin-kinaze od EGFR), koji je poželjno mišje monoklonsko antitelo 225, njegov mišje-ljudski himerni derivat C225, ili humanizovano antitelo izvedeno iz ovog antitela 225 ili izvedeni prirodni agenasi, dianilinoptamididi, pirazolo- ili pirolopiridopirimidini, kinazilini, gefitinib, erlotinib, cetuksimab, ABX-EFG, canertinib, EKB-569 i PKI-166) ili dual-EGFR/HER-2 inhibitor kao lapatanib. Dodatni drugi medikamenti uključuju alemtuzumab (CAMPATH™), FavID (IDKLH), CD20 antitela sa izmenjenom glikozilacijom, kao što su GA-101/GLICART™, oblimersen (GENASENSE™), njihovi talidi i njihovi analozi, kao što su lenalidomid (REVLIMID™), imatinib, sorafenib, ofatumumab (HUMAX-CD20™), anti-CD40 antitelo, npr SGN-40 i anti-CD-80 antitelo, npr. galikimab.
[0373] Agens protiv emetika je poželjno ondansetron hidrohlorid, granisetron hidrohlorid, metroclopramid, domperidon, haloperidol, ciklizin, lorazepam, prohlorperazin, deksametazon, levomepromazin ili tropisetron. Vakcina je poželjno GM-CSF DNK i vakcine na bazi ćelija, vakcina sa dendritičkim ćelijama, vakcine protiv rekombinantnih virusa, vakcine protiv toplotnog šoka (HSP), alogene ili autologne tumorske vakcine. Analgetički agens je poželjno ibuprofen, naproksen, trisalicilat magnezijuma holin ili oksikodon hidrohlorid. Antivaskularni agens je poželjno bevacizumab ili rhuMAb-VEGF. Ostali drugi medikamenti uključuju agense protiv proliferacije kao inhibitore farnesil protein transferaze, anti-VEGF inhibitore, p53 inhibitore ili PDGFR inhibitore. Drugi medikament obuhvata i biološki ciljanu terapiju, kao što je lečenje antitela, kao i terapija koja cilja male molekule, na primer, protiv određenih receptora.
[0374] Mnogi anti-angiogeni agensi su identifikovani i poznati su u struci, uključujući one navedene ovde, npr., navedene u definicijama, i, na primer, Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara i dr., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004); i Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Pogledati takođe US Patent Application US20030055006. U jednom aspektu antitelo anti-KLβ se koristi u kombinaciji sa anti-VEGF neutralizacionim antitelom (ili fragmentom) i/ili drugim VEGF antagonistom ili antagonistom VEGF receptora koji uključuje, ali nije ograničen na, na primer, rastvorljivi VEGF receptor (npr. , VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropiline (npr. NRP1, NRP2)), aptamere koji mogu blokirati VEGF ili VEGFR, neutralizujuća anti-VEGFR antitela, inhibitore težine niske molekulske mase VEGFR tirozin kinaze (RTK) antisens strategije za VEGF, ribozime protiv VEGF ili VEGF receptora, antagonističke varijante VEGF-a; i sve njihove kombinacije. Alternativno, ili dodatno, dva ili više inhibitora angiogeneze mogu opciono da se zajedno daju pacijentu pored VEGF antagonista i drugog agensa. U određenom otelotvorenju, jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, npr., agensi protiv karcinoma, mogu se primenjivati u kombinaciji sa KLβ antagonistom (kao što je anti-KLβ antitelo), VEGF antagonistom i sredstvom protiv angiogeneze.
[0375] Hemoterapeutski agensi koja su korisni ovde opisani su supra, npr., u definiciji „hemoterapeutskog agensa“.
[0376] Primeri drugih medikamenata uključuju agens za alkilovanje, folatni antagonist, pirimidinski antagonist, citotoksični antibiotik, jedinjenje platine ili jedinjenje na osnovu platine, taksan, vinca alkaloid, inhibitor c-Kit, inhibitor topoizomeraze, inhibitor anti-angiogeneze kao što je anti-VEGF inhibitor, inhibitor HER-2, EGFR inhibitor ili dualni inhibitor EGFR/HER-2 kinaze, antiestrogen kao što je fulvestrant i hormonalno terapijski agens, kao što su karboplatin, cisplatin, gemcitabin, kapecitabin, epirubicin, tamoksifen, inhibitor aromataze i prednizon. Najpoželjnije, kancer je kolorektalni kancer, i drugi medikament je EGFR inhibitor kao što je erlotinib, anti-VEGF inhibitor kao što je bevacizumab, ili je cetuksimab, arinotekan, irinotekan ili FOLFOX, ili je kancer rak dojke i drugi medikament je modulator protiv estrogena, kao što je fulvestrant, tamokifen ili inhibitor aromataze kao što je letrozol, egemestan ili anastrozol ili je VEGF inhibitor kao što je bevacizumab ili je hemoterapeutski agens kao što je doksorubicin i/ili taksan kao što je paklitaksel , ili je inhibitor antiHER-2, kao što je trastuzumab ili dvostruki inhibitor EGFR/HER-2 kinaze, kao što je lapatinib ili HER-2 dovnregulator kao što je 17AAG (derivat geldanamicina koji je protein tropskog šoka [Hsp] 90 otrov) (na primer, za karcinoma dojke koji su napredovali na trastuzumabu). U drugim otelotvorenjima, kancer je rak pluća, kao što je rak malih ćelija pluća, i drugi medikament je VEGF inhibitor kao što je bevacizumab ili EGFR inhibitor kao što je npr. erlotinib ili c-Kit inhibitor, kao npr. imatinib. U drugim otelotvorenjima, kancer je rak jetre, kao što je hepatocelularni karcinom, i drugi medikament je EGFR inhibitor kao što je erlotinib, hemoterapeutski agens kao što su doksorubicin ili irinotekan, taksan kao što su paklitaksel, talidomid i/ili interferon. Osim toga, poželjno hemoterapeutski agens za terapiju frontalne linije raka je taksoter, samo u kombinaciji sa drugim drugim lekovima. Najpoželjnije, ako se primenjuje hemoterapija prvo se ona daje, a zatim antitela.
[0377] Takvi drugi medikamenti se mogu davati u roku od 48 sati nakon anptitela, ili u roku od 24 sata, ili u roku od 12 sati, ili u roku od 3-12 sati nakon navedenog agensa, ili se mogu primenjivati tokom unapred odabranog vremenskog perioda, što je poželjno oko 1 do 2 dana. Dalje, doza takvog agensa može biti sub-terapijska.
[0378] KLβ antagonist može se primenjivati istovremeno, sekvencijalno ili alternativno sa drugim medikamentom ili nakon nedostatka odgovora na drugu terapiju. Prema tome, kombinovana primena drugog medikamenta uključuje istovremenu primenu, koristeći odvojene formulacije ili pojedinačnu farmaceutsku formulaciju i uzastopnu primenu u bilo kom redu, pri čemu je poželjno da postoji vremenski period, dok oba (ili svi) medikamenti istovremeno vrše svoje biološke aktivnosti. Svi ovi drugi medikamenti mogu se koristiti u kombinaciji jedni sa drugim ili sami sa prvim medikamentom, tako da izraz „drugi medikament“ koji se ovde koristi ne znači da je to jedini lek osim prvog medikamenta, respektivno. Prema tome, drugi medikament ne mora biti jedan medikament, ali može sadržati više od jednog takvog leka.
[0379] Ovi drugi medikamenti navedeni ovde mogu se koristiti u istim dozama i sa putevima primene kao prvi medikamenti ili oko 1 do 99% doziranja prvih medikamenata. Ukoliko se uopšte koriste takvi drugi medikamenti, poželjno se koriste u nižim količinama nego ukoliko prvi medikament nije bio prisutan, naročito u kasnijim dozama nakon početnog doziranja sa prvim medikamentom, kako bi se eliminisali ili smanjili neželjeni efekti koji su uzrokovani time.
[0380] Pronalazak takođe sadrži postupke i sastave za inhibiranje ili sprečavanje relapsa rasta tumora rasta ili relapsa rasta ćelija raka. Relaps rasta tumora ili relapsa rasta ćelija raka se koristi da opiše stanje kod kojih pacijenti prolaze ili se leče sa jednom ili više trenutno dostupnih terapija (npr. terapije kancera, kao što su hemoterapija, terapija zračenjem, hirurgija, hormonska terapija i/ili biološka terapija/imunoterapija, anti-VEGF terapija antitelima, naročito standardni terapijski režim za određeni kancer) koje nisu klinički adekvatne za lečenje pacijenata ili pacijenti više ne dobijaju nikakav blagotvoran efekat od terapije, tako da ovim pacijentima treba dodatna efikasna terapija. Kad se ovde koristi, izraz se takođe može odnositi na stanje „ne-responzivnog/refraktornog“ pacijenta, npr. koji opisuje pacijente koji reaguju na terapiju ali pate od neželjenih efekata, razvijaju otpor, ne reaguju na terapiju, nemaju zadovoljavajuće reagovanje na terapiju itd. U različitim varijantama, kancer je relapsni rast tumora ili relapsni rasta ćelija raka, gde broj ćelija karcinoma nije značajno smanjen, ili se povećao ili veličina tumora nije značajno smanjena ili se povećava ili ne uspeva dalje smanjenje veličine ili broja ćelija karcinoma. Određivanje da li ćelije raka predstavljaju relaps rasta tumora ili relaps rasta ćelija raka može biti izvršeno bilo in vivo ili in vitro bilo kojim postupkom poznatim u struci za ispitivanje efikasnosti lečenja na ćelijama karcinoma koristeći beleženja prihvaćena u struci za „ relaps“ ili „neresponzivnog/refraktornog pacijenta“ u takvom kontekstu. Tumor otporan na anti-VEGF tretman je primer relapsa rasta tumora.
[0381] Pronalazak daje postupke blokiranja ili smanjenja relapsa rasta tumora ili relapsa rasta ćelija raka kod pojedinca davanjem jednog ili više KL-antagonista (kao što je anti-KLβ antitelo) radi blokiranja ili smanjenja relapsa rasta tumora ili relapsa rasta ćelija raka kod pacijenta. U određenim otelotvorenjima, KLβ antagonist može se davati nakon terapije kancera. U određenim otelotvorenjima, KLβ antagonist se primenjuje istovremeno sa terapijom kancera. Alternativno, ili dodatno, terapija KLβ antagonista se zamenjuje sa drugom terapijom kancera, koja se može izvesti u bilo kom redosledu. Pronalazak takođe obuhvata postupke za primenu jednog ili više inhibitornih antitela kako bi se sprečio nastanak ili ponavljanje kancera kod pacijenata koji su predisponirani za rak. Generalno, pacijent je bio ili se istovremeno podvrgava terapiji kancera. U jednom aspektu, terapija kancera je tretman sa agensom protiv angiogeneze, npr. VEGF antagonistom. Agens protiv angiogeneze obuhvata one poznate u struci, i one koje se nalaze pod ovim definicijama. U jednom otelotvorenju, agens protiv angiogeneza je anti-VEGF neutralizujuće antitelo ili fragment (npr. humanizovani A4,6,1, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), I0317, M4, G6, B20, 2C3 itd. ). Pogledati, na primer, U.S. Patents 6,582,959, 6,884,879, 6,703,020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; US Patent Applications 20030206899, 20030190317, 20030203409, i 20050112126; Popkov i dr., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004); i, WO2005012359. Dodatni agensi se mogu davati u kombinaciji sa VEGF antagonistom i KLβ antagonistom za blokiranje ili smanjenje relapsa rasta tumora ili relapsa rasta ćelija raka.
[0382] KLβ antagonisti (i dodatni terapeutski agens) se primenjuju bilo kojim odgovarajućim načinima, uključujući parenteralnu, potkožnu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu i intranazalnu, i, ako je poželjno za lokalnu terapiju, intralesionalnu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravenoznu, intraarterijalnu, intraperitonealno ili potkožnu primenu. Pored toga, KLβ antagonisti se adekvatno primenjuju puls infuzijom, naročito sa opadanjem doza antitela. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenske ili potkožne injekcije, zavisno od toga da li je primena kratka ili hronična.
[0383] Kombinacija KLβ antagonista će biti formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju poseban poremećaj koji se tretira, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način davanja, raspored primene, i druge faktore poznate lekarima. KLβ antagonist ne mora biti, ali je opciono formulisan sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste kako bi se sprečio ili tretirao poremećaj u pitanju. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine KLβ antagonista prisutnog u formulaciji, tipa poremećaja ili tretmana i drugih faktora koji su gore opisani. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa rutama primene koje su korišćene pre ili oko 1 do 99% dosada primenjenih doza.
[0384] Za sprečavanje ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza KLβ antagonista (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa drugim agensima) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo i diskrecije lekara koji prisustvuje. Antitelo se adekvatno primenjuje pacijentu jednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i jačine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) anti-KLβ antitela je početna kandidat doza za primenu kod pacijenta, na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se održava sve dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Jedna primerna doza antitela bi bila u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako se pacijentu može davati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent prima od oko dva do oko dvadeset, npr. oko šest doza antitela). Može se primenjivati inicijalna više opterećena doza, praćena jednom ili više nižih dozama. Primeran režima doziranja obuhvata davanje inicijalnog režima doze od oko 4 mg/kg, nakon čega sledi nedeljna doza održavanja od oko 2 mg/kg antitela. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
Upotreba koja obuhvata detektovanje KLβ
[0385] U drugom aspektu, predmetna objava daje postupke za detektovanje KLβ, gde postupci obuhvataju detektovanje KLβ u uzorku. Izraz „detektovanje“ koji se koristi ovde obuhvata kvalitativno i/ili kvantitativno detektovanje (nivoi merenja) sa ili bez pozivanja na kontrolu.
[0386] U jednom aspektu, objava daje postupke za detektovanje poremećaja povezanih sa KLβ eksprimiranjem i/ili aktivnošću, gde postupci obuhvataju detektovanje KLβ u biološkom uzorku pojedinca. U nekim otelotvorenjima, KLβ eksprimiranje je povećano eksprimiranje ili abnormalno eksprimiranje. U nekim otelotvorenjima poremećaj je tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelija (kao što je hepatocelularni karcinom i rak pankreasa), poremećaj jetre (kao što je ciroza) ili bilo koji poremećaj koji je ovde opisan. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor.
[0387] Na primer, uzorak se može analizirati za ciljani antigen (npr. KLβ, FGF19 i/ili FGFR4) dobijanjem uzorka iz željenog izvora, mešanjem uzorka sa anti-ciljani antigen antitelom kako bi se omogućilo antitelu da formira antitelo/ciljani antigena kompleks sa bilo kojim prisutnim u smeši, i detektovanje bilo kog antitelo/ciljni antigen kompleksa koji je prisutan u smeši. Biološki uzorak može biti pripremljen za analizu postupcima poznatim u struci koji su pogodni za određeni uzorak. Postupci mešanja uzorka sa antitelima i postupak detektovanja antitelo/ciljani antigen kompleksa izabrani su prema vrsti testa koji se koristi. Takvi testovi uključuju imunohistohemiju, kompetitivne i sendvič testove, i testove steričke inhibicije. Za pripremu uzorka može se koristiti uzorak tkiva ili ćelije od sisara (tipično ljudskog pacijenta). Primeri uzoraka uključuju, ali nisu ograničeni na, ćelije raka, kao što su ćelije kancera debelog creva, dojke, prostate, jajnika, pluća, želuca, pankreasa, limfoma i leukemije. Ciljani antigen može se takođe meriti u serumu. Uzorak se može dobiti različitim procedurama poznatim u ovoj struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na hiruršku eksciziju, aspiraciju ili biopsiju. Tkivo može biti sveže ili smrznuto. U jednom aspektu, uzorak je fiksiran i ugrađen u parafin ili slično. Uzorak tkiva može biti fiksiran (tj. sačuvan) konvencionalnom metodologijom (pogledati npr., „Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,“ 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Uobičajen stručnjak u oblasti će razumeti da je izbor fiksativa određen svrhom za koju je uzorak histološki obojen ili na drugi način analiziran. Uobičajen stručnjak u oblasti takođe će razumeti da dužina fiksiranja zavisi od veličine uzorka tkiva i korišćenog fiksativa. Kao primer, neutralni puferovani formalin, Bouinov ili paraformaldehid, mogu se koristiti za fiksiranje uzorka. Uopšteno gledano, uzorak se prvo fiksira i zatim dehidrira kroz rastuću seriju alkohola, infiltriranih i ugrađenih u parafin ili druge delove za sekciju, tako da se uzorak tkiva može razdvojiti. Alternativno, može se razdvojiti tkivo i fiksirati dobijeni odeljci. Kao primer, uzorak tkiva može biti ugrađen i obrađen u parafinu konvencionalnom metodologijom (pogledati npr. „Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology“, supra). Primeri parafina koji se mogu upotrebiti uključuju, ali nisu ograničeni na, Paraplast, Broloid i Tissuemay. Kada je uzorak tkiva ugrađen, uzorak se može razdvojiti mikrotomom ili slično (pogledati npr. „Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology“, supra). Kao primer za ovu proceduru, sekcije mogu biti u rasponu od oko 3 mikrona do oko 5 mikrona debljine. Kada se razdvoje, sekcije mogu biti povezane za pločice po nekoliko standardnih metodologija. Primeri lepkova za pločice uključuju, ali nisu ograničeni na, silan, želatin, poli-L-lizin i slično. Kao primer, parafinski ugrađeni odeljci mogu biti pričvršćeni za pozitivno naelektrisane pločice i/ili pločice obložene poli-L-lizinom. Ako je parafin korišćen kao materijal za ugradnju, tkiva se generalno deparafinišu i rehidriraju u vodi. Odeljak tkiva može biti deparafinisan po nekoliko standardnih standardnih metodologija. Na primer, mogu se koristiti ksileni i postepeno opadajuća serija alkohola (pogledati npr., „Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology“, supra). Alternativno, mogu se koristiti komercijalno raspoloživi deparafinizujući neorganski agensi kao što je Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).
[0388] Anti-KLβ antitela su korisna u testovima detektovanja KLβ eksprimiranja (kao što su dijagnostički ili prognostički testovi) u specifičnim ćelijama ili tkivima u kojima su antitela obeležena kao što je opisano ispod i/ili imobilisana na nerastvorljivoj matrici. Međutim, podrazumeva se da se bilo koje pogodno anti-KLβ antitelo može koristiti u otelotvorenjima koji uključuju detektovanje i dijagnozu. Neki postupci za izradu anti-KLβ antitela su opisani ovde i postupci za izradu anti-KLβ antitela su dobro poznati u struci, npr. antitela koja su objavljena kod Ito i dr (2005) J Clin Invest 115(8): 2202-2208; R&D Systems Catalog Nos. MAB3738 i AF2619.
[0389] Analitički postupci za ciljani antigen svi koriste jedan ili više od sledećih reagensa: obeleženi analog ciljanog antigena, imobilizovani analog ciljanog antigena, obeleženo anti-ciljani antigen antitelo, imobilizovano anti-ciljani antigen antitelo i sterične konjugate. Obeleženi reagensi su poznati i kao „tragači“.
[0390] Obeležje koje se koristi je bilo koja detektibilna funkcionalnost koja ne ometa vezivanje ciljanog antigena i anti-ciljani antigen antitela. Poznata su brojna obeležja za upotrebu u imunotestu, gde primeri uključujući delove koji se mogu detektovati direktno, kao što su fluorohrom, hemiluminiscentna i radioaktivna obeležja, kao i delovi, kao što su enzimi, koji moraju biti reagovani ili derivatizovani kako bi se detektovali.
[0391] Obeležje koje se koristi je bilo koja detektibilna funkcionalnost koja ne ometa vezivanje ciljanog antigena i anti-ciljanih antigenih antitela. Poznata su brojna obeležja za upotrebu u imunotestu, gde primeri uključujući delove koji se mogu detektovati direktno, kao što su fluorohrom, hemiluminiscentne i radioaktivna obeležja, kao i delovi, kao što su enzimi, koji moraju biti reagovani ili derivatizovani kako bi se detektovali. Primeri takvih obeležje uključuju radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore kao što su helatati retkih zemnih metala ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazinedionei, perokidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze kao što su uricaze i ksantin oksidaze, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što su HRP, laktoperokidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin obeležja, obeležja bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično.
[0392] Uobičajeni postupci su dostupni kako bi se ova obeležja kovalentno vezala za proteine ili polipeptide. Na primer, agense za spajanje kao što su dialdehidi, karbodiimidi, dimaleimidi, bis-imidati, bis-diazotizovani benzidin i slično mogu se koristiti za obeležavanje antitela sa gore opisanim fluorescentnim, hemiluminiscencnim i enzimskim obeležjema. Pogledati, na primer, U.S. Pat. Nos.
3,940,475 (fluorimetrija) i 3,645,090 (enzimi); Hunter i dr., Nature, 144: 945 (1962); David i dr., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain i dr., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); i Nygrcn, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982). Ovde su poželjne obeležja enzimi kao što su peroksidaza rena i alkalna fosfataza. Konjugacija takvog obeležja, uključujući enzime, u antitelo je standardni manipulativni postupak za stručnjaka u oblasti tehnika imunološke analize. Pogledati, na primer, O'Sullivan i dr., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and sati. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp.147-166.
[0393] Imobilizacija reagensa je potrebna za određene postupke ispitivanja. Imobilizacija podrazumeva odvajanje anti-ciljani antigen antitela od bilo kog ciljanog antigena koji ostaje slobodan u rastvoru. Ovo se konvencionalno postiže insolubilizacijom anti-ciljani antigena antitela ili analoga ciljanog antigena pre postupka ispitivanja, kao što je adsorpcija na matrici ili površini koji nisu rastvorljivi u vodi (Bennich i dr.., U.S. 3,720,760), pomoću kovalentnog spajanja (na primer, korišćenjem unakrsnog povezivanja glutaraldehida), ili insolubilizacijom anti-ciljani antigen antitela ili analoga ciljanog antigena nakon toga, na primer, imunoprecipitacijom.
[0394] Eksprimiranje proteina u uzorku može se ispitati primenom imunohistohemije i protokola za bojenje. Pokazalo se da je imunohistohemijsko bojenje delova tkiva pouzdan postupak procene ili otkrivanja prisustva proteina u uzorku. Tehnike imunohistokemije („IHC“) koriste antitelo za sondiranje i vizualizaciju ćelijskih antigena in situ, uglavnom hromogenim ili fluorescentnim postupcima. Za pripremu uzorka može se koristiti uzorak tkiva ili ćelije od sisara (tipično ljudskog pacijenta). Uzorak se može dobiti različitim procedurama poznatim u ovoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na hiruršku eksciziju, aspiraciju ili biopsiju. Tkivo može biti sveže ili smrznuto. U jednom aspektu, uzorak je fiksiran i ugrađen u parafin ili slično. Uzorak tkiva se može fiksirati (tj. očuvati) konvencionalnom metodologijom. Uobičajen stručnjak u oblasti će razumeti da je izbor fiksativa određen svrhom za koju je uzorak histološki fiksiran ili na drugi način analiziran. Uobičajen stručnjak u oblasti takođe će razumeti da dužina fiksiranja zavisi od veličine uzorka tkiva i korišćenog fiksativa.
[0395] IHC se može izvesti u kombinaciji sa dodatnim tehnikama kao što su morfološko bojenje i/ili fluorescentna in-situ hibridizacija. Dostupna su dva opšta postupka IHC-a; direktne i indirektne analize. Prema prvom testu, direktno se određuje vezivanje antitela na ciljani antigen (npr. KLβ). Ovaj direktni test koristi obeleženi reagens, kao što je fluorescentno obeležje ili primarno antitelo obeleženo enzimom, koje se može vizualizovati bez dalje interakcije antitela. U tipičnom indirektnom testu, nekonjugovano primarno antitelo se vezuje za antigen, a zatim se obeleženo sekundarno antitelo vezuje za primarno antitelo. Kada je sekundarno antitelo konjugovano na enzimsko obeležje, dodaje se hromogeni ili fluorogeni supstrat kako bi se obezbedila vizuelizacija antigena. Signalna amplifikacija se javlja jer više sekundarnih antitela može reagovati sa različitim epitopima na primarnom antitelu.
[0396] Primarno i/ili sekundarno antitelo koje se koristi za imunohistohemiju obično će biti obeleženo sa detektabilnim delom. Na raspolaganju su brojna obeležja koje se mogu grupisati u sledeće kategorije:
[0397] Pored postupaka za pripremu uzoraka koji su razmatrani gore, mogu se poželjno dalje tretirati tkiva pre, tokom ili nakon IHC-a. Na primer, mogu se izvesti postupci za pronalaženje epitopa, kao što je grejanje uzorka tkiva u citratnom puferu (pogledati npr. , Leong i dr. Appl. Imunohistochem. 4 (3): 201 (1996)).
[0398] Nakon opcionog koraka blokiranja, tkivni odeljak je izložen primarnom antitelu u dovoljnom vremenskom periodu i pod odgovarajućim uslovima, pri čemu se primarno antitelo vezuje za antigen u uzorku tkiva. Odgovarajući uslovi za postizanje ovoga mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem. Obim vezivanja antitela na uzorak se određuje korišćenjem bilo kog od detektabilnih obeležja koja su gore opisana. Poželjno, obeležje je enzimsko obeležje (npr. HRPO) koja katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata kao što je 3,3'-diaminobenzidinski hromogen. Poželjno je da se enzimsko obeležje konjugoguj za antitelo koje se specifično vezuje za primarno antitelo (npr. primarno antitelo je zečje poliklonsko antitelo, a sekundarno antitelo je kozje anti-zečje antitelo).
[0399] Tako pripremljeni uzorci mogu biti montirani i pokriveni. Procena klizanja se onda određuje, npr. koristeći mikroskop i mogu se koristiti kriterijumi intenziteta bojenja koji se rutinski koriste u struci.
[0400] Drugi postupci ispitivanja, poznate kao konkurentne ili sendvič analize, dobro su uspostavljene i široko se koriste u komercijalnoj dijagnostičkoj industriji.
[0401] Konkurentni testovi se oslanjaju na sposobnost analoga tragaoca ciljanog antigena da se nadmeće sa ciljanim antigenom test uzorka za ograničeni broj antigen vezujućih mesta anti-ciljani antigen antitela. Anti-ciljani antigen antitelo generalno je insolubilizovano pre ili posle nadmetanja, i zatim se tragaoc i ciljani antigen vezani za anti-ciljani antigena antitelo odvajaju od nevezanog tragaoca i ciljanog antigena. Ovo odvajanje se postiže dekantiranjem (gde je vezujući partner prethodno bioizolansiran) ili centrifugiranjem (gde je vezujući partner bio taložen nakon konkurentske reakcije). Količina ciljanog antigena test uzorka je obrnuto proporcionalna količini vezanog tragaoca mereno količinom marker supstance. Krive odgovora na doze sa poznatim količinama ciljanog antigena se pripremaju i upoređuju sa rezultatima testa da se kvantitativno odredi količina ciljanog antigena prisutnog u uzorku testa. Ovi testovi se nazivaju ELISA sistemi kada se enzimi koriste kao detektabilni markeri.
[0402] Druga vrsta konkurentnog testa, nazvana „homogenim“ testom, ne zahteva odvajanje faze. Ovde se priprema i koristi takav konjugat enzima sa ciljanim antigenom tako da, kada se anti-ciljani antigen antitelo vezuje za ciljani antigen, prisustvo anti-ciljani antigen antitela modifikuje aktivnost enzima. U ovom slučaju, ciljani antigen ili njegovi imunološki aktivni fragmenti su konjugovani sa bifunkcionalnim organskim mostom za enzim kao što je peroksidaza. Konjugati su izabrani za upotrebu sa anti-ciljani antigen antitelom tako da vezivanje anti-ciljani antigen antitela inhibira ili potencira enzimsku aktivnost obeležja. Ovaj postupak per se se široko primenjuje pod imenom EMIT.
[0403] Sterički konjugati se koriste u steričkim postupcima prepreka za homogeni test. Ovi konjugati se sintetišu kovalentnim povezivanjem haptena sa niskomolekularnom težinom sa malim fragmentom ciljanog antigena, tako da antitelo za hapten u suštini nije u stanju da se vezuje sa konjugatom istovremeno sa anti-ciljani antigen antitelom. U ovom postupku analize ciljani antigen prisutan u test uzorku će se vezati anti-ciljani antigen antitelo, čime se omogućava anti-haptenu da veže konjugat, što rezultuje promenom karaktera konjugatnog haptena, npr. promenom fluorescencije kada hapten je fluorofor.
[0404] Sendvič analize su posebno korisne za određivanje ciljanih antigena ili anti-ciljani antigen antitela. U sekvencijalnim sendvič analizama se koristi imobilizovano anti-ciljani antigen antitelo za adsorbovanje ciljanog antigena test uzorka, gde se test uzorak uklanja kao sa pranjem, vezani ciljani antigen se koristi za adsorbovanje drugog, obeleženog anti-ciljani antigen antitela i vezani materijal se zatim odvaja od rezidualnog tragaoca. Količina vezanog tragaoca je direktno proporcionalna test uzorku ciljanog antigena. U „istovremenim“ sendvič analizama test uzorak nije odvojen pre dodavanja
1
obeleženog anti-ciljanog antigena. Sekvencijalna sendvič analiza korišćenjem monoklonskog anticiljani antigen antitela kao jednog antitela i poliklonskog anti-ciljani antigen antitela kao drugog je korisna u testiranju uzoraka za ciljani antigen.
[0405] Prethodno navedeni su samo primeri detekcije za ciljani antigen. Drugi postupci koji su sada ili dalje razvijeni koji koriste anti-ciljani antigen antitelo za određivanje ciljanog antigena su uključene u okviru ovde, uključujući ovde opisane biološke procese.
[0406] U jednom aspektu, pronalazak pruža postupke za detektovanje (na primer, prisustvo ili odsustvo ili količinu) polinukleotida (npr. ciljanih polinukleotida) u biološkom uzorku pojedinca, kao što je ljudski pacijent. Mogu se koristiti različiti postupci za detektovanje polinukleotida i uključuju, na primer, RT-PCR, Taqman, postupke amplifikacije, polinukleotidne mikrorakre i slično.
[0407] Postupci za detektovanje polinukleotida (kao što je mRNK) dobro poznaju i uključuju, na primer, testove hibridizacije koristeći komplementarne DNK sonde (kao što su in situ hibridizacija korišćenjem obeleženih ciljanih ribopera), Northern blot i srodne tehnike i razne analize amplifikacije nukleinske kiseline (kao što je RT-PCR koristeći komplementarne primere specifične za cilj i druge postupke za detektovanje tipa amplifikacije, kao što su, na primer, razgranata DNK, SPIA, Ribo-SPIA, SISBA, TMA i slično).
[0408] Biološki uzorci od sisara mogu se pogodno analizirati, na primer, ciljanom mRNK koristeći Northern, dot blot ili PCR analizu. Na primer, RT-PCR analize kao što su kvantitativni PCR testovi su dobro poznati u struci. U ilustrativnom rešenju, postupak za detektovanje ciljane mRNK u biološkom uzorku sadrži proizvodnju cDNK iz uzorka reverznom transkripcijom koristeći najmanje jedan prajmer; pojačavajući tako proizvedenu cDNK korišćenjem ciljanog polinukleotida kao sens i antisens prajmera za pojačavanje ciljanih cDNK u njima; i detektovanje prisustva ili odsustva pojačane ciljane kDNK. Pored toga, takvi postupci mogu uključivati jedan ili više koraka koji omogućavaju određivanju količine (nivoa) ciljane mRNK u biološkom uzorku (npr. istovremenim ispitivanjem nivoa komparativne mRNK sekvence kontrole domaćeg gena kao što je član porodice aktina). Opciono, može se odrediti sekvenca amplifikovane ciljane kDNK.
[0409] Sonde i/ili prajmeri mogu biti obeleženi sa detektabilnim markerom, kao što su, na primer, radioizotop, fluorescentno jedinjenje, bioluminescentno jedinjenje, hemiluminiscentno jedinjenje, kelator metala ili enzim. Takve sonde i prajmeri mogu se koristiti za detektovanje prisustva ciljanih polinukleotida u uzorku i kao agens za detektovanje ćelija koje eksprimiraju antigene. Kao što će razumeti stručnjak u oblasti, može se pripremiti veliki broj različitih prajmera i sondi (npr., zasnovanih na sledećim nizovima) i efikasno se koriste za pojačavanje, kloniranje i/ili određivanje prisustva ili odsustva i/ili iznosa ciljanih mRNK.
[0410] Opcioni postupci iz ovog pronalaska uključuju protokole koji obuhvataju detektovanje polinukleotida, kao što je ciljani polinukleotid, u uzorku tkiva ili ćelije koristeći tehnologije mikronizova. Na primer, koristeći mikronizove nukleinskih kiselina, uzorci mRNK testa i kontrole iz uzoraka testa i kontrolnog tkiva se reverzno transkribuju i obeležavaju radi generisanja cDNK sondi. Sonde se tada hibridizuju u niz nukleinskih kiselina imobilisanih na čvrstoj podlozi. Niz je konfigurisan tako da je poznata sekvenca i položaj svakog člana niza. Na primer, odabir gena koji imaju potencijal da se eksprimiraju u određenim bolestima može biti raspoređen na čvrstu podlogu. Hibridizacija obeležene sonde sa određenim članom niza ukazuje na to da uzorak iz kog je izvedena sonda eksprimira taj gen. Diferencijalna analiza eksprimiranja gena tkiva bolesti može pružiti vredne informacije. Tehnologija mikronizova koristi tehnike hibridizacije nukleinske kiseline i računarske tehnologije za procenu profila eksprimiranja mRNK hiljada gena u okviru jednog eksperimenta, (pogledati, na primer, WO 01/75166 objavljen 11. oktobra 2001; (pogledati, na primer, U.S.5,700,637, U.S. Patent 5,445,934, and U.S. Patent 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. i dr., Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999) za diskusiju o izradi nizova). DNK mikronizovi su minijaturni nizovi koji sadrže fragmente gena koji se sintetišu direktno na ili na osnovu stakla ili drugih supstrata. Hiljade gena su obično predstavljene u jednom nizu. Tipičan eksperiment mikronizova uključuje sledeće korake: 1. pripremanje fluorescencno obeležene mete iz RNK izolovane iz uzorka, 2. hibridizacija obeležene mete do mikroniza, 3. pranje, bojenje i skeniranje niza, 4. analiza skenirane sliku i 5. generisanje profila eksprimiranja gena. Trenutno se koriste dva glavna tipa DNK mikronizova:
2
oligonukleotid (obično 25 do 70 mera) nizovi i nizovi eksprimiranja gena koji sadrže PCR proizvode pripremljene iz cDNK. Pri formiranju niza, oligonukleotidi mogu biti ili montirani i primetni na površinu ili direktno sintetizovani na površinu (in situ).
[0411] Affymetrix GeneChip® sistem je komercijalno dostupan sistem mikronizova koji sadrži nizove proizvedene direktnom sintezom oligonukleotida na staklenoj površini. Sonde/genski nizove: Oligonukleotidi, obično 25 mera, direktno se sintetišu na staklenom vaferu kombinacijom fotolitografije zasnovane na poluprovodnicima i tehnologijama hemijske sinteze čvrste faze. Svaki niz sadrži do 400,000 različitih oligoa i svaki oligo je prisutan u milionima kopija. Pošto su oligonukleotidne sonde sintetizovane na poznatim mestima na nizu, šabloni hibridizacije i intenzitet signala mogu se tumačiti u smislu identiteta gena i nivoa relativnog eksprimiranja pomoću softvera Affymetrix Microarray Suite. Svaki gen je predstavljen na nizu serijom različitih oligonukleotidnih sondi. Svaki par sondi sastoji se od savršenog podudaranja oligonukleotida i nepodudaranja oligonukleotida. Savršeno podudarena sondu ima sekvencu koja je tačno dopunjena određenom genu i na taj način meri eksprimiranje gena. Nepodudarena sonda se razlikuje od sonde savršenog podudaranja po jednoj baznoj supstituciji u centru baznog položaja, uznemiravajući vezivanje transkripta ciljanog gena. Ovo pomaže da se utvrdi pozadina i nespecifična hibridizacija koja doprinosi signalu merenom za savršeno oligo podudaranje. Microarray Suite softver oduzima intenzitete hibridizacije nepodudarenih sondi od onih sondi sa savršenim podudaranjem kako bi se odredila apsolutna ili specifična vrednost intenziteta za svaki skup sondi. Sonde se biraju na osnovu trenutnih informacija iz GenBank i drugih nukleotidnih spremišta. Za sekvence se veruje da prepoznaju jedinstvene regije 3' kraja gena. GeneChip Hybridization Oven („rotisserie“ pećnica) se koristi za hibridizaciju do 64 nizova istovremeno. Stanica za fluidizaciju vrši pranje i bojenje sondi. Kompletno je automatizovana i sadrži četiri modula, gde svaki modul drži jedan niz sondi. Svaki modul se kontroliše nezavisno kroz Microarray Suite softver koristeći unapred programirane protokole fluida. Skener je konfokalni laserski fluorescentni skener koji meri intenzitet fluorescencije koju emituje obeležena cRNK vezana za nizove sondi. Računarska radna stanica sa softverom Microarray Suite kontroliše stanicu za fluidizaciju i skener. Microarray Suite softver može da kontroliše do osam fluidnih stanica koristeći unapred programirane protokole za hibridizaciju, pranje i mrlje za niz sondi. Softver takođe pribavlja i pretvara podatke o intenzitetu hibridizacije u pozivanje prisutnosti/odsutnosti za svaki gen koristeći odgovarajuće algoritme. Konačno, softver detektuje promene u eksprimiranju gena između eksperimenata poređenjem i formatira izlaz u .tkt datoteke, koje se mogu koristiti sa drugim računarskim programima za dalju analizu podataka.
[0412] U nekim otelotvorenjima, detektovano je brisanje gena, mutacije gena ili amplifikacija gena (npr. KLβ i/ili FGFR4 i/ili FGF19 brisanje gena, mutacija gena ili amplifikacija gena). Brisanje gena, mutacija gena ili amplifikacija mogu se meriti bilo kojim od najrazličitijih protokola poznatih u struci, na primer, konvencionalnim Southern blottingom, Northern blottingom kako bi se kvantifikovala transkripcija mRNK (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (DNK analiza), ili in situ hibridizacija (npr., FISH), koristeći odgovarajuću oznaku sonde, citogenetske postupke ili komparativnu genomsku hibridizaciju (CGH) koristeći odgovarajuću oznaku sonde. Pored toga, ovi postupci se mogu koristiti za detektovanje ciljanog gena, mutacije liganda ili amplifikacije gena. Kad se ovde koristi, „detektovanje KLβ eksprimiranja“ obuhvata detektovanje brisanja KLβ gena, genske mutacije ili amplifikacije gena.
[0413] Pored toga, može se ispitati status metilacije ciljanog gena u uzorku tkiva ili ćelije. Aberantna demetilacija i/ili hipermetilacija CpG ostrva u regulatornim regijama gena 5' često se javlja u imortalizovanim i transformisanim ćelijama i može dovesti do izmenjenog eksprimiranja različitih gena. Različiti testovi za ispitivanje statusa metilacije gena su dobro poznati u struci. Na primer, u pristupima Southern hibridizacije mogu se koristiti enzimi osetljivi na metilaciju, koji ne mogu razdvojiti sekvence koje sadrže metilovana CpG mesta za procenu statusa metilacije CpG ostrva. Pored toga, MSP (specifični za metilaciju PCR) može brzo profilisati status metilacije svih CpG mesta prisutnih na CpG ostrvu datog gena. Ovaj postupak podrazumeva inicijalnu modifikaciju DNK natrijum bisulfita (koji će pretvoriti sve nemetilovane citozine u uracil), a potom i amplifikaciju pomoću prajmera specifičnih za metilovane naspram nemetiliovanih DNK. Protokoli koji uključuju interferenciju metilacije mogu se naći i na primer u Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubcl i dr. eds., 1995; De Marzo i dr., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks i dr, Cancer Epidemiol.
Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); and Lethe i dr., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998). Kad se ovde koristi, „detektovanje KLβ eksprimiranja“ obuhvata detektovanje metilacije KLβ gena.
[0414] U nekim otelotvorenjima, korišćenjem postupaka poznatih u struci, uključujući one koji su ovde opisani, može se detektovati eksprimiranje polinukleotida i/ili polipeptida jedne ili više meta. Kao primer, IHC tehnike opisane iznad mogu se koristiti za detektovanje prisustva jednog ili više takvih molekula u uzorku. Kad se ovde koristi, „u konjunkciji“ podrazumeva da obuhvata bilo koje simultano i/ili sekvencijalno detektovanje. Prema tome, pretpostavlja se da u otelotvorenjima u kojima se ispituje biološki uzorak ne samo za prisustvo prve mete, već i za prisustvo Fa druge meta, od istog tkiva ili uzorka mogu biti odvojeni slajdovi, a svaki slajd testiran sa reagensom koji se vezuje za prvu i/ili drugu metu, respektivno. Alternativno, pojedinačni slajd može biti pripremljen iz uzorka tkiva ili ćelije, a antitela usmerena na prvu i drugu metu, respektivno, mogu se koristiti u vezi sa protokolom bojenja sa više boja kako bi se omogućila vizuelizacija i detektovanje prve i druge mete.
[0415] Biološki uzorci su ovde opisani, npr., U definiciji biološkog uzorka. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je serum ili tumor.
Predmeti proizvodnje
[0416] U drugom aspektu ove objave, obezbeđen je predmet proizvodnje koji sadrži materijale koji su korisni za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu poremećaja opisanih gore. Predmet proizvodnje sastoji se od kontejnera i etikete ili umetka za pakovanje na ili povezanog sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, flašice, špriceve itd. Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner drži sastav koji je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugim sastavima koji su efikasni za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnostifikovanje stanja i mogu imati sterilni pristupni port (na primer, kontejner može biti intravenozna vrećica za rastvor ili bočice imaju zatvarač koji može da se probije sa potkožnom iglom za injektiranje). Najmanje jedno aktivni agens u sastavu je antitelo. Etiketa ili umetak za pakovanje ukazuje na to da se sastav koristi za tretiranje izabranog stanja, kao što je rak. Osim toga, predmet proizvodnje može sadržati (a) prvi kontejner sa sastavom koji se nalazi u njemu, pri čemu sastav sadrži KLβ antagonist (kao što je anti-KLβ antitelo); i (b) drugi kontejner sa sastavom sadržanim u sebi. Predmet proizvodnje u ovom otelotvorenju pronalaska može dalje sadržati umetak za pakovanje koji ukazuje na to da se prvi i drugi sastav antitela mogu koristiti za tretiranje određenog stanja, npr. raka. Alternativno, ili dodatno, predmet proizvodnje može dalje sadržati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekciju (BVFI), fiziološki pufer sa fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. On dalje može uključiti i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući i druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
[0417] Slede primeri postupaka i sastava predmetne objave. Razumljivo je da se mogu primeniti različita druga otelotvorenja, imajući u vidu opšti opis koji je gore naveden.
PRIMERI
[0418] Sledeći materijali i postupci su korišćeni u Primerima 1-15.
DNK konstrukti:
[0419] Ljudski Kloto beta konstrukt pune dužine: Ukupna RNK iz ćelijske linije hepatocelularnog karcinoma HepG2 ekstrakovana je pomoću RNeasy kompleta (Quiagen). Ljudski Kloto beta (KLβ) je kloniran pomoću PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR) korišćenjem SuperScript III One-Step RT-PCR kompleta (Invitrogen) i sledećih pragova:
Prednji prajmer 5'-CGGGCGCTAGCATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGG-3' (SEQ ID NO:3)
Reverzni prajmer 5'-
CAGTGGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCTAACAACTCTCTTGCCTT
TCTTTC-3'(SEQ ID NO:4)
[0420] Dobijeni KLβ-PCR proizvod je razblažen pomoću NheI i BamHI i ligiran u pIRESpuro3 (Clontech) kako bi se dobilo ljudski KLβ c-terminal obeležen konstrukt pune dužine (pCMVhKLβ-Flag (SEQ ID NO: 49)).
4
[0421] Ljudski FGFR4 konstrukt pune dužine: Ukupna RNK iz ćelijske linije hepatocelularnog karcinoma HepG2 ekstrakovana je pomoću RNeasy kompleta (Quiagen). Ljudskog FGFR4 cDNK je klonirana pomoću PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR) koristeći SuperScriptIII One-Step RT-PCR komplet (Invitrogen) i sledeće prajmere:
Prednji prajmer 5'-CCGCCGGATATCATGCGGCTGCTGCTGGCCCTGTTGG-3' (SEQ ID NO: 5)
Reverzni prajmer 5'-CCGCCGGAATTCTGTCTGCACCCCAGACCCGAAGGGG-3' (SEQ ID NO: 6)
[0422] Dobijeni FGFR4 PCR proizvod je razblažen pomoću EcoRV i EcoRI i sproveden u pIRESpuro3 (Clontech) kako bi se dobio FGFR4 pune dužine.
[0423] Ljudski FGFR4 konstrukt sa c-terminalnim obeležjem : C terminalno obeležje dodato je u ljudski pIRESpuro3FGFR4 koristeći Stratagene XL QuickChange Site-Direct Mutagenesis komplet i sledeće prajmere:
Prednji primer: 5'-GGT CTG GGG TGC AGA CAG GTA AGC CTA TCC CTA ACC CTC TCC TCG GTC TCG ATT CTA CGT AGG AAT TCG GAT CCG CGG C-3' (SEQ ID NO:7)
Obrnuti primer: 5'-GCC GCG GAT CCG AAT TCC TAC GTA GAA TCG AGA CCG AGG AGA
GGG TTA GGG ATA GGC TTA CCT GTC TGC ACC CCA GAC C-3' (SEQ ID NO:8)
[0424] Ljudski izlučeni KLβ konstrukt sa sa C-terminalnim obeležjem: Ljudski izlučeni KLβ ekstracelularni domen je dobijen pomoću PCR koristeći pCMVHuKLβ-Flag kao šablon i sledeće prajmere:
Prednji prajmer: 5'-GAA TTC CAC CAT GAA GCC AGG CTG TGC GGC AGG ATC TCC AG-3' (SEQ ID NO:9)
Reverzni prajmer: 5'-GGC GCG CCG ACA AGG AAT AAG CAG ACA GTG CAC TCT G-3' (SEQ ID NO:10)
[0425] Nastali izlučeni PCR proizvod je razblažen sa EcoRI i AscI i ligiran u pRK5_c-His (DNA540910) kako bi se dobio pRK5HuKLβΔTM-His (SEQ ID NO: 50).
[0426] Ljudski KLβ E416A i E693A konstrukt: Ljudski KLβ E416A c-terminalno obeleženi konstrukt (pCMVhKLβ- Flag E416A (SEQ ID NO: 51)) dobijen je mutacijom E416 do A416 u pCMVHuKLβ_Flag koristeći XL QuickChange Site-Direct Mutagenesis komplet (Stratagene) i sledeće prajmere:
Prednji prajmer: 5'-CCC TCG AAT CTT GAT TGC TGC GAA TGG CTG GTT CAC AGA CAG-3' (SEQ ID NO:11)
Reverzni prajmer: 5'-CTG TCT GTG AAC CAG CCA TTC GCA GCA ATC AAG ATT CGA GGG-3' (SEQ ID NO: 12)
[0427] Ljudski KLβ E693A c-terminalno obeleženi konstrukt (pCMVhKLβ-Flag E693A (SEQ ID NO: 52)) je dobijen mutacijom E693 do A693 u pCMVHuKLβ_Flag koristeći XL QuickChange Site-Direct Mutagenesis komplet (Stratagene) i sledeće prajmere:
Prednji prajmer: 5'-GCT CTG GAT CAC CAT CAA CGC GCC TAA CCG GCT AAG TGA C-3' (SEQ ID NO:13)
Reverzni prajmer: 5'-GTC ACT TAG CCG GTT AGG CGC GTT GAT GGT GAT CCA GAG C-3' (SEQ ID NO:14)
hKLβΔTM kondicionirani medijum
[0428] HEK 293 ćelije su transfektovane sa praznim ili C-terminalnim his-obeleženim ljudskim Kloto beta ekstracelularnim domenom (hKLβΔTM) koji sadrži vektor eksprimiranja. Nakon transfekcije ćelije su držane u serumu bez PS25 medijuma 72-96 časova. Dobijeni medijum se filtrira, dopunjuje se na 40 mM HEPES pH 7,2, koncentriše 4 puta i procenjuje se za sadržaj hKLβΔTM pomoću Western blot koristeći monoklonsko antitelo koje vezuje hKLβ (R&D Systems, kataloški broj MAB3738)
Koprecipitacija
[0429] Koncentrisani kontrolni ili hKLβΔTM kondicionirani medijum dopunjen je sa Triton-X 100 (Calbiochem) do konačne koncentracije od 0,5% i inkubiran sa ili bez 0,5 μg/ml FGFR-IgG (R&D Systems, kataloški brojevi su sledeći: FGFR1 alpha IIIb, 655-FR-050; FGFR1 alpha III, 658-FR-050; FGFR1 beta IIIb, 765-FR-050; FGFR1 beta IIIc, 661-FR-050; FGFR2 alpha III, 663-FR-050; FGFR2 alpha IIIc, 712-FR-050; FGFR2 beta IIIb, 665-FR-050; FGFR2 beta IIIc, 684-FR-050; FGFR3 IIIb, 1264-FR-050; FGFR3 IIIc, 766-FR-050; FGFR4, 685-FR-050), 0,5 μg/ml heparin (Sigma), 1 μg/ml FGF19 (R&D Systems), 10 μl afinitetni gel EZview Red Protein A(Sigma) na 4°C tokom 18 sati. Matrica afiniteta je centrifugirana i isprana tri puta sa PBS/0,5% Triton-X100 i jednom sa PBS. Pelet je eluirana sa puferom za uzorke SDS-PAGE koji sadrži 5% β-merkapto etanola i analiziran pomoću Western blot koristeći anti-Klotoβ monoklonsko antitelo (R&D Systems kataloški broj MAB3738), antitelo FGF19 (klon 1A6, Genentech Inc.) anti-FGFR4 antitelo (klon 8G11, Genentech Inc.) ili HRP konjugovano anti-ljudsko IgG antitelo (Jackson Immunochemical).
Ćelijska kultura i stabilne ćelijske linije
[0430] HEK 293 (ATCC pristupni broj CRL-1573), HepG2 (ATCC pristupni broj HB-8065) i Hep 3B (ATCC pristupni broj HB-8064) su dobijene od American Type Culture Collection i održavani u F-12: DMEM mešavini (50:50) dopunjenoj sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 2 mM L-glutamina. HEK 293 ćelije stabilno eksprimiraju prazan vektor, receptor 4 ljudskog faktora rasta fibroblasta (hFGFR4) R388-V5, hFGFR4 G388-V5, ljudski Kloto b-FLAG (hKLβ-FLAG), hFGFR4 R388-V5 i hKLβ-FLAG ili hFGFR4 R388- V5 i hKLβ-FLAG su stvoreni i gajene u selektivnom medijumu koji sadrži 500 μg/ml geneticina i 2,5 μg/ml puromicina.
Vremenski tok eksprimiranja gena u ćelijama tretiranim sa FGF19
[0431] Ćelije su položene na 10<6>ćelija/komorica u 6-komoričnoj ploči i uzgajane preko noći u kompletnom medijumu. Ćelije su isprane dva puta sa PBS jednom sa serumom bez medijuma i održavane preko noći u medijumu bez seruma. Sledećeg dana ćelije su tretirane sa 20ng/ml FGF19 tokom 1, 2, 4, 6 ili 24 sati, i na kraju lečenja RNK je ekstrakovana pomoću RNeasy kompleta (Qiagen). Relativni nivo eksprimiranja c-fos, c-jun, junB i KLβ određen je sa Taqman.
Polu-kvantitativni RT-PCR
[0432] Ukupna RNK je ekstrakovana pomoću RNeasy kompleta (Quiagen). Specifični prajmeri i fluorogene sonde su korišćeni za pojačavanje i kvantifikovanje eksprimiranja gena. Signali specifični za gene su normalizovani na RPL19 domaćinskog gena. Setovi podataka u triplikatu su usaglašeni za svako stanje. Svi TaqMan RT-PCR reagensi su kupljeni od Applied Biosystems (Foster City, Kalifornija). Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti /- SEM. Taqman prajmeri i sonde (reporter boja bila je FAM, a tampon boja bila je TAMRA). Prajmer sekvence su bile sledeće:
RPL19 prednji prajmer: AGC GGA TTC TCA TGG AAC A (SEQ ID NO:15) RPL19 reverzni prajmer: CTG GTC AGC CAG GAG CTT (SEQ ID NO:16) RPL19 sonda: TCC ACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG (SEQ ID NO:17) hKLβ prednji prajmer: GCA GTC AGA CCC AAG AAA ATA CAG A (SEQ ID NO:18) hKLβ reverzni prajmer: CCC AGG AAT ATC AGT GGT TTC TTC (SEQ ID NO:19) hKLβ reverse sonda: TGC ACT GTC TGC TTA TTC CTT GT (SEQ ID NO:20) hc-fos prednji prajmer: CGA GCC CTT TGA TGA CTT CCT (SEQ ID NO:21) ) hc-fos reverzni prajmer: GGA GCG GGC TGT CTC AGA (SEQ ID NO:22) hc-fos sonda: CCC AGC ATC ATC CAG GCC CAG (SEQ ID NO:23) hjunb prednji prajmer: AGT CCT TCC ACC TCG ACG TTT (SEQ ID NO:24) hjunb reverzni prajmer: AAT CGA GTC TGT TTC CAG CAG AA (SEQ ID NO:25) hjunb sonda: AGC CCC CCC TTC CAC TTT TT (SEQ ID NO:26) hc-jun prednji prajmer: CGT TAA CAG TGG GTG CCA ACT (SEQ ID NO:27) hc-jun reverzni prajmer: CCC GAC GGT CTC TCT TCA AA (SEQ ID NO:28) hc-jun sonda: ATG CTA ACG CAG CAG TTG CAA ACA (SEQ ID NO:29) mKLβ prednji: TGT GGT GAG CGA AGG ACT GA (SEQ ID NO:30) mKLβ reverzni: GGA GTG GGT TGG GTG GTA CA (SEQ ID NO:31) mKLβ sonda: CTG GGC GTC TTC CCC ATG G (SEQ ID NO:32) mc-fos prednji: CCT GCC CCT TCT CAA CGA (SEQ ID NO:33)
mc-fos reverzni: TCC ACG TTG CTG ATG CTC TT (SEQ ID NO:34) mc-fos sonda: CCA AGC CAT CCT TGG AGC CAG T (SEQ ID NO:35) mFGFR4 prednji: CGC CAG CCT GTC ACT ATA CAA A (SEQ ID NO:36) mFGFR4 reverzni: CCA GAG GAC CTC GAC TCC AA (SEQ ID NO:37) mFGFR4 sonda: CGT TTC CCT TTG GCC CGA CAG TTC T (SEQ ID NO:38)
siRNK transfekcija u HEPG2 i HEP3B ćelijama:
[0433] KLβ i GAPDH siRNK oligoi su dobijeni od Dharmacon.
KLβ siRNK:
Dupleks1: Sens: 5'-GCACACUACUACAAACAGAUU-3' (SEQ ID NO:39)
Anti-sens: 5'-UCUGUUUGUAGUAGUGUGCUU-3' (SEQ ID NO:40) Dupleks2: Sens: 5'-GCACGAAUGGUUCCAGUGAUU-3' (SEQ ID NO:41)
Anti-sens: 5'-UCACUGGAACCAUUCGUGCUU-3' (SEQ ID NO:42) Dupleks3: Sens: 5'-CGAUGGAUAUAUUCAAAUGUU-3' (SEQ ID NO:43)
Anti-sens: 5'-CAUUUGAAUAUAUCCAUCGUU-3' (SEQ ID NO:44) Dupleks4: Sens: 5'-UGAAAUAACCACACGCUAUUU-3' (SEQ ID NO:45)
Anti-sens: 5'-AUAGCGUGUGGUUAUUUCAUU-3' (SEQ ID NO:46) GAPDH siRNK: Sens: 5'-UGGUUUACAUGUUCCAAUA-3' (SEQ ID NO:47)
Antisens: 5'-UAUUGGAACAUGUAAACCA-3'(SEQ ID NO:48)
[0434] Različiti siRNK dupleksi transfektovani su pomoću DharmaFECT kompleta transfekcije (Dharmacon) i prateći protokol koji je preporučio proizvođač. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, ćelije su isprane dva puta sa PBS i jednom sa medijumom bez seruma i održavane u medijumu bez seruma preko noći. Sledećih dana ćelije su tretirane sa 20 ng/ml FGF19 (R&D Systems) tokom 2 sata. RNK uzorci su pripremljeni sa RNeasy kitom (Qiagen). Relativni nivoi c-fos, RPL19 i KLβ eksprimiranja određeni su pomoću Taqman.
In vitro tretman KLβ antitelom
[0435] HEPG2 ćelije su položene na 10<6>ćelija/komorica u 9-komoričnoj ploči i uzgajane preko noći u kompletnom medijumu. Ćelije su isprane 3 puta sa medijumom bez seruma koji sadrže 0,1% BSA i održavane su u istom medijumu preko noći. Sledećeg dana ćelije su tretirane sa 10 μg/ml KLβ specifičnim poliklonskim antitelima (R&D Systems, cat # AF2619) ili kontrolnim antitelom 4 časa. Ćelije su zatim tretirane sa 100 ng/ml FGF19 tokom 2 sata i RNK je ekstrakovana pomoću RNeasy kompleta (Qiagen). Relativni nivo eksprimiranja c-fosa određen je sa Taqman.
Ko-imunoprecipitacija
[0436] HEK 293 ćelije transientno (24-48 sata transfekcija) ili stabilno eksprimiranju prazan vektora, hFGFR4 R388-V5, hKLβ-FLAG ili hFGFR4 R388-V5 i hKLβ-FLAG su lizovani sa RIPA lizinskim puferom (PBS koji sadrži 1% Triton X-100 i 1% NP-40), dopunjen sa koktelom kompletnog inhibitora proteaze bez EDTA (Roche). Ukupne koncentracije proteina određene su BCA proteinskim testom (Pierce). Jednake količine ukupnog proteina za svaki lizat uzorka su imunoprecipitirane sa EZview Red anti-FLAG M2 afinitetnim gelom (Sigma) ili anti-V5 agaroznim gelom (Sigma) na 4°C preko noći. Imunoprecipitovani proteini su isprani tri puta sa TBST i zatim inkubirani bez ili sa 1 mg/ml FGF-19 (R&D Systems) u F-12: DMEM smeši (50:50) dopunjenoj sa 0,5% FBS i 0,5% Triton X-100 na 4°C u trajanju od 3 sata. Perle su zatim oprane jednom pomoću Krebs-Ringer-HEPES (KRH) pufera koji sadrži 1% Triton X-100 i tri puta sa KRH puferom. Imunoprecipitovani proteini eluiraju se dodavanjem 1X NuPAGE LDS uzorka pufera (Invitrogen) i ključanjem 5 minuta. Elutirani proteini u puferu za uzorke su pribavljeni i dodat je 1X NuPAGE redukcioni agens (Invitrogen), a zatim je ključano 10 minuta. Uzorci proteina su elektroforezirani na 4-12% NuPAGE Bis-Tris gelu, nakon čega su prebačeni do nitrocelulozne membrane i podvrgnuti kasnijim imunoblot analizama koristeći anti-hKLβ antitelo (1 mg/ml, R&D Systems, kataloški broj MAB3738), anti-hFGFR4 antitelo (1 mg/ml, klon 8G1, Genentech) ili FGF-19 antitelo(1 mg/ml, klon 1A6, Genentech). Signal je detektovan pomoću ECL Plus substrata (GE Healthcare).
FGF aktivacija putanje
[0437] HEK 293 ćelije transientno (24 sata transfekcije) ili stabilno eksprimiranje praznog vektora, hFGFR4 R388-V5, hFGFR4 G388-V5, hKLβ-FLAG, hFGFR4 R388-V5 i hKLβ-FLAG ili hFGFR4 G388-V5 i hKLβ-FLAG su tretirani sa 0, 1, 10 ili 100 ng/ml FGF-19 (R&D Systems), 20 ng/ml FGF-1 (FGF kiseli, R&D Systems) ili 20 ng/ml epidermalnog faktora rasta (Roche) . Ćelije su lizirane pomoću RIPA lizinskog pufera (Upstate), dopunjenog koktelom inhibitora proteaze inhibitora (Roche) i inhibitora fosfataze 1 i 2 (Sigma). Ukupne koncentracije proteina određene su BCA proteinom testom (Pierce). Za analizu fosforilacije FRS2 i ERK1/2, jednake količine ukupnog proteina su elektroforezirane na 10% NuPAGE Bis-Tris gela (Invitrogen), nakon čega je preneo transfer na nitrocelulozne membrane i kasnije imunoblot analize koristeći anti-fosfo-FRS2 antitelo (1: 1,000, Cell Signaling Technologi) ili anti-ERK1/2 antitela (1: 1,000, Cell Signaling Technologi). za detektovanje ukupnih FRS2 i ERK1/2, membrane su uklonjene i resondirane sa anti-FRS2 antitelom (1 mg/ml, Upstate Biotechnologi) ili anti-ERK1/2 antitelom (1: 1,000, Cell Signaling Technologi). Signal je detektovan pomoću ECL Plus supstrata (GE Healthcare).
In vivo eksperimenti
[0438] Sve životinjske protokole odobrila je Institutional Animal Care and Use Committee. Pet do šest nedelja stare ženke FVB miševa dobijeni su od Charles River Laboratories. Miševima su obezbeđeni standardna hrana i voda ad libitum do 12 sati pre lečenja kad je uklonjena hrana. Miševi su injektirani intravenozno sa nosačem (PBS) ili sa 1 mg/kg FGF19. Kada je naznačeno, miševi su injektirani intravenozno sa 2,2 mg/kg KLβ antitela (R&D Systems, cat # AF2619) 3, 9 ili 24 časa pre intravenozne FGF19 inokulacije. Posle 30 min, miševi iz svih grupa su žrtvovani i uzorci tkiva su sakupljeni, zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -70°C. Ukupna RNK iz uzorka smrznutog tkiva pripremljena je pomoću RNAeasy kompleta (Qiagen). Grupe od 3-5 životinja su analizirane za svako stanje. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM i analizirani su studentovim t-testom.
In silico analiza eksprimiranja
[0439] Za analizu eksprimiranja KLβ i FGFR4, putanje su zasnovane na normalizovanim podacima o eksprimiranju gena koji su izvučeni iz baze podataka BioExpress™ (Gene Logic, Inc., Gaithersburg, MD, USA). KLβ eksprimiranje koje je ovde prijavljeno odgovara signalu datom sondoma broj 244276_at i 204579_at, respektivno, u ljudskim tkivima analiziranim na Affymetrix GeneChips. Podebljana srednja linija označava sredinu; kućica (bela, normalno; siva, tumor) predstavlja interkvartilni opseg između prvog i trećeg kvartila. Raspodela vrednosti za određene uzorke obeležena je slomljenim linijama. Sakupljanje ljudskog uzorka opisano je od strane izvora BioExpress™ baze podataka (Shen-Ong GL i dr. Cancer Res 2003; 63: 3296-301. Odgovarajuće hibridizacije su izvedene na Affymetrix HG-U133P oligonukleotidnim čipovima (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Californija, USA). Ukratko, ovi čipovi se zasnivaju na 25-mer oligonukleotidima i omogućavaju detektovanje više od 33,000 dobro potkrijepljenih ljudskih gena, sa sinkronima od 11 oligonukleotida korišćenih po transkriptu.
Primer 1: KLβ ekstracelularni domen i FGF19 vezujuće specifičnosti su ograničene na FGFR4.
[0440] FGF19, heparin i FGFRs-Fc fuzioni proteini su inkubirani u kondicioniranom medijumu koji sadrži KLβΔTM. Interakcije proteina su zatim analizirane pomoću ko-precišitacije. KLβ i FGF19 su povezani samo sa FGFR4 i oboreni su samo sa FGFR4-Fc (Slika 1A). Ovi podaci pokazuju da su vezivne specifičnosti KLβ ekstracelularnog domena i FGF19 ograničene na FGFR4 i da ekstracelularni domen KLβ, FGF19 i FGFR4 verovatno formira tripartitni kompleks.
Primer 2: Vezivanje KLβ na FGFR4 promoviše FGF19 i heparin.
[0441] Kako bi se procenio doprinos svake komponente kompleksnoj formaciji, korišćen je test koprecipitacije. Kontrolni ili KLβΔTM koji sadrži kondicionirani medijum je inkubiran u prisustvu ili odsustvu FGFR4-Fc, FGF19 i heparina. U odsustvu heparina i FGF19, interakcija nije otkrivena između KLβ i FGFR4-Fc (Slika 1B). Heparin je bio slab promoter, dok je FGF19 bio snažan promoter interakcije KLβ-FGFR4. Maksimalni nivo stabilizacije interakcije KLβ-FGFR4-Fc nastao je u prisustvu heparina i FGF19. Nasuprot tome, FGF19 vezivanje za FGFR4-Fc zahteva prisustvo heparina ili KLβ. Maksimalni nivo FGF19 vezivanja za FGFR4 se desio kada su i heparin i KLβ uključeni u reakciju. Ovi podaci pokazuju da je KLβ dovoljan da podrži vezivanje FGF19 na FGFR4. Takođe pokazuje da KLβ promoviše prethodno dokazanu interakciju FGF19 sa FGFR4 zavisnu od heparina (Xie i dr (1999) Cytokine 11 :729-35). Prema tome, svaka pojedinačna komponenta doprinosi stabilnosti FGF 19-FGFR4-Klβ-heparin kompleksa.
[0442] U poređenju sa članova porodice parakrinskih FGF, FGF19 ima afinitet vezivanja za nizak heparin koji mu dozvoljava da deluje na endokrini način bez vezivanja za pericelularni proteoglikan ćelija koje se luče (Choi, M i dr (2006) Nat Med 12: 1253-5; Harmer, NJ i dr (2004) Biochem 43:629-40; Inagaki, Y i dr (2005) Cell Metab 2:217-25; Lundasen, T i dr (2006) J Intern Med 260:530-6). Topologija mesta za vezivanje heparina FGF19 sprečava FGF19 da formira vodonične veze sa heparinom kada je FGF19 vezan za njegov receptor Goetz, R i dr (2007) Mol Cell Biol.27: 3417-28). Zbog toga KLβ može delovati kao FGFR4 ko-receptor koji stabilizuje slabu interakciju FGF19-FGFR4-heparina.
Primer 3: Interakcija transfektovanih FGFR4 i KLβ na površini ćelije.
[0443] Kako bi se testiralo da li KLβ i FGFR4 takođe učestvuju u formiranju kompleksa sa FGF19 i heparinom na površini ćelije, procenili smo sposobnost FGFR4 i KLβ da imunoprecipitiraju FGF19 od lizata transientno ili stabilno transfektovanih ćelija u prisustvu ili odsustvu heparina. Detektabilni FGF19 nije ko-precipitovan iz lizata ćelija transfektovanih samo sa kontrolnim ili FGFR4-vektorom eksprimiranja (Slika 1C i 1D). FGFR4 i KLβ su spustili FGF19 iz KLβ-transfektovanog ćelijskog lizata samo u prisustvu heparina koji ukazuje na to da KLβ transfekcija promoviše vezivanje FGF19 na heparin prema endogenom HEK293 FGFR4.
[0444] Ovi nalazi sugerišu da FGFR4 i KLβ postoje kao preformirani kompleks i da njihova interakcija nije poboljšana od strane FGF19.
Primer 4: Interakcija endogenog FGFR4 i KLβ na površini ćelija.
[0445] Transmembranski domeni KLβ i FGFR4 mogu direktno međusobno da komuniciraju ili unapređuju interakciju proteina tako što ih vezuju za površinu ćelija. Kako bi se testirala hipoteza da KLβ i FGFR4 formiraju konstitutivni kompleks na površini ćelije, procenili smo da li KLβ koimunoprecipituje sa FGFR4 iz HEPG2 ćelijskih lizata u odsustvu FGF ili heparina. Inkubacija HEPG2 ćelijskih lizata sa antitelom protiv FGFR4 imunoprecipitiranog FGFR4 i KLβ, dok nije bilo proteina imunoprecipovala je sa kontrolnim antitelom (Slika 1E), što pokazuje da endogeni transmembranski KLβ i FGFR4 formiraju konstitutivni kompleks koji ne zavisi od heparina i liganda. Klβ-FGFR4 ćelijski površinski kompleks može da promeni dimerizaciju receptora indukovanu heparinom i ligandom koji je prethodno opisan za parakrinske FGF (PPlonikov, A (1999) Cell 98:641-50; Schlessinger, J i dr (2000) Mol Cell 6:743-50). Ovi podaci ukazuju da endogeni KLβ i FGFR4 interakuju na površini ćelije. Podnosioci zahteva imaju u vidu da je Slika 4 prethodne prethodne prijave podnosioca zahteva, US Serial No. 60/909,699, podneto 2. arpila 2007, (koja odgovara Sici 1E ove prijave) pokazuje oznaku molekulske težine od 150kDa, dok Slika 1E pokazuje oznaku molekulske težine od 130kDa. Zamena nalaza na Slici 4 prijave '699 je bila nenamerna očigledna greška, jer je poznato da je KLβ 130-kDa protein (pogledati, na primer, Ito i dr., Mech. Dev.98 (2000) 115-119).
Primer 5: FGF19 vezivanje za FGFR4 i KLβ na površini ćelije.
[0446] Kako bi se testiralo da li KLβ i FGFR4 takođe učestvuju u formiranju kompleksa sa FGF19 i heparinom na površini ćelije, procenili smo sposobnost FGFR4 i KLβ da imunoprecipitira FGF 19 iz lizata transientno ili stabilno transfektovanih ćelija u prisustvu ili odsustvu heparina. Detektabilni FGF19 nije ko-precipitovan iz lizata ćelija transfektovanih samo sa kontrolnim ili FGFR4-vektorom eksprimiranja (Slika 1C i 1D). FGFR4 i KLβ su spustili FGF19 iz KLβ-transfektovanog ćelijskog lizata samo u prisustvu heparina koji ukazuju na to da KLβ transfekcija promoviše vezivanje FGF19 na heparin prema endogenom HEK293 FGFR4.
[0447] U lizatima od KLβ- i FGFR4-ko-transfektovanih ćelija, KLβ i FGFR4 su lako spustili FGF19. Ova interakcija se dalje stabilizovala u prisustvu heparina (Slika 1C i 1D). Ovi podaci pokazuju da je KLβ potreban za vezivanje FGF 19 na površinu ćelija FGFR4 i da heparin promoviše ovu interakciju. Osim toga, FGFR4 i KLβ su lako interakovali na način koji nije povezan sa heparinom i ligandom u kotransfektovanim ćelijama. Ovaj rezultat je u suprotnosti sa formiranjem kompleksa zavisnim od heparina i liganda koji se posmatra sa sekretima himernih FGFR4 i KLβ proteina. Ovo odstupanje ukazuje na ulogu transmembranskih domena KLβ i FGFR4 u formiranju kompleksa.
[0448] Ovi nalazi sugerišu da se FGF19 vezuje za KLβ i FGFR4 na površini ćelije i da heparin povećava ovu interakciju.
Primer 6: FGF19 potiskuje Kloto beta eksprimiranje
[0449] Procenjen je efekat FGF19 na KLβ eksprimiranje u različitim ćelijskim linijama. Detektovali smo visoko KLβ eksprimiranje u linijama ćelija jetre (HepG2 i Hep3B), ali samo tragove kod linija bubrega (HEK293) ili debelog creva (SV620 i Colo205, Slika 3A). Nakon izlaganja FGF19, KLβ eksprimiranje u HepG2 i Hep3B je postepeno potisnuto, na 50-60% nivoa neizloženih ćelija nakon 6 sati, i ostalo je na ovom nivou najmanje 24 sata. Izlaganje FGF19 nije uticalo na nivoe eksprimiranja KLβ u drugim ćelijskim linijama. Snaženje eksprimiranja KLβ pomoću FGF19 može biti regulatorni negativni mehanizam povratne sprege u ćelijama jetre.
Primer 7: FGF19 je potreban za FGF19 nizvodno moduliranje gena eksprimiranja
[0450] Pošto mnoštvo fizioloških i patoloških stimulusa indukuje gene porodice Fos i Jun u širokom spektru tipova ćelija koje smo testirali da li FGF19 moduliše c-Fos, JunB i c-Jun eksprimiranje u različitim ćelijskim linijama (Ashida, R i dr (2005) Inflammapharmacology 13: 113-25; Hess, J i dr (2004) Biochemistry 43:629-40; Shaulian, E i dr (2002) Nat Cell Biol 4:E131-6). FGF19 uvećava c-Fos i JunB eksprimiranje, kao i eksprimiranje c-Jun u manjoj meri, u ćelijama koje eksprimiraju KLβ (HepG2 i HEP3B, Slika 3 B-D). Indukcija c-Fos, JunB i c-Jun eksprimiranja se desila u roku od 30 minuta nakon izlaganja FGF19, i u većini slučajeva se eksprimiranje vratilo na bazalne nivoe posle 6 sati. JunB eksprimiranje je ostalo povišena najmanje 24 sata u HEP3B ćelijama (Slika 3C).
[0451] Ovi podaci pokazuju da FGF19 indukuje c-Fos, Junb i c-Jun eksprimiranje samo u ćelijama koje eksprimiraju KLβ.
Primer 8: KLβ obaranje inhibira indukciju c-fos zavisnu od FGF19.
[0452] Kako bi testirali da li KLβ promoviše FGF19 signalizaciju i c-Fos indukciju u HEP3B i HEPG2 ćelijama, inhibirali smo KLβ eksprimiranje pomoću specifičnih siRNKs. KLβ siRNK transfekcija značajno redukuju eksprimiranje KLβ mRNK i eksprimiranje proteina u HEP3B (Slika 3G i E) i HEPG2 ćelijama (Slika 5A). Individualna transfekcija četiri različita KLβ siRNK značajno je umanjila fosforilaciju FRS2 i ERK1/2 sa FGF19 (Slika 3F, 5B). Pored toga, transfekcija HEP3B ćelija sa KLβ siRNK transfekcijom inhibirala je indukciju c-Fos posredovanu sa FGF19 za 62%-80%, u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Slika 3). Slično tome, transfekcija HEPG2 ćelija sa KLβ siRNK je smanjila nivoe FGF19-zavisne FRS2 i ERK1/2 fosforilacije, kao i c-Fos indukciju u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Slika 5C). Ovi rezultati ukazuju da je KLβ eksprimiranje potrebno za aktivaciju FGF19 zavisnog puta i c-Fos indukciju. Ovi rezultati ukazuju da je KLβ eksprimiranje potrebno za FGF 19-zavisnu indukciju c-Fos.
[0453] Kako bi dalje procenili učešće KLβ u indukciji c-Fos posredstvom FGF 19, transfekovali smo HEK293 ćelije sa praznim, KLβ-, FGFR4- ili kombinacijom vektora eksprimiranja KLβ- i FGFR4, i izložili ćelije do FGF19. Samo ćelije transfektovane sa oba vektore eksprimiranja KLβ i FGFR4 indukovale su c-Fos kao odgovor na FGF19 (Slika 3H). Ovi podaci pokazuju da je KLβ potreban za aktivaciju putanje FGF19 i modulaciju regulacije gena.
Primer 9: Lečenje antitela anti-KLβ inhibira FGF19-zavisnu indukciju c-Fos.
[0454] Za dodatno vrednovanje doprinosa KLβ na FGF19-zavisnu indukciju c-Fos, HEPG2 ćelije tretirane su antitelom anti-KLβ (podignutom protiv mišjeg KLβ, ali unakrsno reaktivno sa ljudskim KLβ) ili kontrolnim antitelom pre lečenja ćelija sa FGF19. Tretman anti- KLβ antitelom smanjuje indukciju c-Fos zavisnu od FGF19 za 80%, dok kontrolno antitelo nije pokazalo nikakav značajan efekat (Slika 6).
[0455] Ovi rezultati pokazuju da ciljanje KLβ sa specifičnim antitelima inhibira aktivnost FGF19. Primer 10: KLβ je potreban za signalizaciju FGF19.
[0456] Kako bi se testiralo da li KLβ doprinosi aktiviranju signalnog puta FGF19, procenili smo efekte FGF19 na FGFR supstrat 2 (FRS2) i ekstracelulranim siglanom regulisanu kinaza-1 i -2 (ERK1/2) fosforilaciju u KLβ-i/ili FGFR4-transfektovanim HEK 293 ćelije, kao i kontrolama. FGF19 nije promovisao FRS2 ili ERK1/2 fosforilaciju u ćelijama transfektovanim praznim vektorom eksprimiranja (Slika 2). HEK 293 ćelije transfektovane sa KLβ ili FGFR4 pokazale su samo slabo, zavisno od doze povećanje fosforilacije ERK1/2, ali nema detektabilne FRS2 fosforilacije nakon izlaganja FGF19. Kotransfekcija FGFR4 sa KLβ promovisala je FGF19 signalizaciju u HEK 293 ćelijama, što ukazuje na robusno, zavisno od doze povećanje fosforilacije FRS2 i ERK1/2. Jedno moguće objašnjenje za ovaj efekat je da lokalne, visoke koncentracije FGF19 i FGFR4 omogućavaju slabu signalizaciju u odsustvu KLβ. Međutim, jer FGF19 ima endokrinsku funkciju i njegova prosečna cirkulacijska koncentracija je 193 ± 36 pg/mL (opseg od 49-590 pg/mL), ovo je malo verovatno (Lundasen, T i dr (J Intern Med, 260: 530-6). Zbog toga je verovatno da će KLβ robusna indukcija signalizacije FGF19 doći u fiziološkim koncentracijama FGF19.
Primer 11: Aktivacija KLβ aktivnog mesta inhibira aktivaciju puta FGF19.
[0457] Potreba za KLβ za FGF19-stimulisanom aktivnosti procenjena je detekcijom nizvodne signalizacije (tj. fosfo-FRS2 i -ERK1/2) u HEK 293 ćelijama transfektovane sa divljim (wt) KLβ ili KLβ mutantima. Divlje KLβ-transfektovane ćelije pokazale su detektabilne fosfo-FRS2 i fosfo-ERK1/2 nakon tretmana sa 100 ng/ml FGF19 (Slika 7). Kada se leči sa istom dozom FGF19, mutacija KLβ E416A (koja sadrži glutamat do alaninske mutacije u jednom od predloženih aktivnih mesta; Ito i dr. (2000) Meh. Dev. 98 (1-2): 115-119 za opis ovog ostatka) nije pokazao detektabilnu fosforilaciju ni FRS2 ni ERK1/2. Tako, mutacija na E416 potencijalnom aktivnom mestu KLβ eliminisala je FGFR4 nizvodnu signalizaciju, što ukazuje na to da je KLβ enzimska aktivnost potrebna za signalizaciju FGFR4.
[0458] FGF19 tretira ćelije transfektovane sa mutacijom KLβ E693A ((koje sadrži glutamat do alaninske mutacije na jednom od predloženih aktivnih mesta, pogledati Ito i dr., za opis ovog ostatka) pokazalo je slične nivoe fosfo-FRS2 ili fosfo-ERK1/2 fosforilacije kao FGF19-tretirane ćelije koje su izložene divljem KLβ (Slika 7.) Tako, mutacija na E693 pretpostavljenom aktivnom KLβ a nije uticala na aktivnost KLβ. Zato je samo E416 potaknuto pretpostavljeno mesto od KLβ potrebno za FGF19 zavisnu stimulacija fosforilacije FRS2 i ERK1/2. Detektovano je KLβ eksprimiranje proteina kako bi se pokazalo da ćelije koje su transfektovane sa vektorima koji eksprimiraju divlji ili mutant KLβ eksprimiraju ekvivalentne količine proteina.
[0459] Ovi nalazi potkrepljuju zaključak da se FGF19 signalizacija kroz FGFR4 povećava prisustvom KLβ i dalje sugeriše da je KLβ enzimska aktivnost potrebna za signalizaciju FGFR4.
Primer 12: Distribucija KLβ eksprimiranja u mišjim tkivima in vivo.
[0460] Kako bi se testirala hipoteza da FGF19 deluje samo na tkiva koja eksprimiraju i FGFR4 i KLβ, prvo smo ispitali KLβ i FGFR4 distribuciju u različitim organima miša koristeći polu-kvantitativan RT-PCR. Relativni nivoi mRNK predstavljaju relativni uzorak u odnosu na mozak (organ sa najnižim ispitanim eksprimiranjem). KLβ je pretežno eksprimiran u jetri (Slika 4C). Niži nivoi eksprimiranja KLβ su takođe pronađeni u masnim kiselinama i debelom crevu. Ispitani dodatni organi pokazali su
1
nivoe marginalnog eksprimiranja KLβ. FGFR4 je bio visoko eksprimiran u jetri, plućima, nadbubrežnoj žlezdu, bubrezima i debelom crevu (Slika 4D). Niži nivoi FGFR4 eksprimiranja su takođe primećeni u crevima, jajnicima, mišićima i pankreasu. Ukupna distribucija KLβ i FGFR4 u mišjim tkivima bila je slična onima u ljudskim tkivima. Međutim, suprotno nalazima u ljudskim tkivima, u mišićnom pankreasu nije se moglo detektovati konzistentno eksprimiranje KLβ ili FGFR4. Pored toga, nizak nivo KLβ eksprimiranja je detektovan u debelm crevu miša, dok u odgovarajućem ljudskom tkivu nije pronađeno nikakvo eksprimiranje. Ove razlike mogu se pripisati raspodeli tkiva specifičnih za vrstu i/ili tkivo. Ovi podaci ukazuju na to da je jetra jedini organ miša u kom su KLβ i FGFR4 visoko koeksprimirani.
Primer 13: FGF19 deluje specifično na jetru miša.
[0461] Za određivanje FGF19 specifičnog mesta aktivnosti, upoređivali smo nivoe c-Fos eksprimiranja u organima miševa injektiranim sa FGF19 sa onima miševima injektiranim sa PBS (kontrole). Izabrali smo da pratimo c-Fos odgovor na FGF19, jer je c-Fos eksprimiranje prisutno i njegova indukcija je osetljiva na stimulaciju FGF19. Eksprimiranje C-Fos je bilo 1300 puta veće u jetri miševa injektiranih sa FGF19 u poređenju sa jetrom miševa injektiranih sa PBS (Slika 4E). Indukcija c-Fos zavisna od FGF19 bila je najmanje 150 puta niža u svim drugim testiranim organima. Aktivnost FGF19 u jetri potvrđena je 98% inhibicijom eksprimiranja CIP7A1 (Slika 4F). Ovi podaci pokazuju da FGF19 deluje specifično u jetri, jedinom organu miša koji eksprimira visoke nivoe KLβ i FGFR4.
[0462] Zajedno, podaci prikazani u Primerima 12 i 13 pokazuju da FGF19 zahteva KLβ za vezivanje za FGFR4, intracelularnu signalizaciju i modulaciju nizvodnog gena. Najvažnije, potreba za KLβ ograničava endokrinu aktivnost FGF19 na tkiva koja eksprimiraju i FGFR4 i KLβ. Jet specifično delovanje FGF19 podržava ovaj molekularni mehanizam. Ovi podaci pokazuju da je jetra glavno mesto delovanja FGF19 kod miševa.
Primer 14: Lečenje sa anti-KLβ antitelom in vivo inhibira FGF19-zavisnu indukciju c-Fos u jetri miša.
[0463] Kako bi se procenila KLβ potreba za aktivnost FGF19 in vivo, FGF19-zavisna c-Fos indukcija je određena u jetri miša tretiranog antitelom KLβ tokom različitih dužina vremena. Tretman miševa sa 2,5 mg/kg KLβ antitela 3, 9 ili 24 sati pre injekcije FGF19 smanjio je indukciju c-Fos posredovanu sa FGF19 za 58%, 68% i 91%, što je posledica FGF19 (Slika 8).
[0464] Ovi podaci pokazuju da je KLβ potreban za FGF19 signalizaciju kroz FGFR4 in vivo. Osim toga, podaci dodatno pokazuju da se KL-specifična antitela mogu koristiti za inhibiranje aktivnosti FGF19 in vivo.
Primer 15: Analiza eksprimiranja KLβ i FGFR4 u normalnim i tkivima kancera.
[0465] KLβ eksprimiranje i FGFR4 su evaluirani u različitim ljudskim tkivima analizom BioExpress baze podataka (Gene Logic, Inc., Gaithersburg, MD, USA). U opadajućem redosledu intenziteta signala, KLβ je eksprimiran u masnom tkivu, jetri, pankreasu i tkivu dojki (Slika 4A). U opadajućem redosledu intenziteta signala, FGFR4 je eksprimiran u jetri, plućima, žučnom tkivu, tankom crevu, pankreasu, debelom crevu, limfoidi, jajniku i tkivu dojke (Slika 4B). Ovi podaci pokazuju da je KLβ eksprimiranje ograničeno samo na nekoliko tkiva, dok je FGFR4 eksprimiranje široko rasprostranjeno. Visok nivo koeksprimiranja KLβ i FGFR4 je primećen samo u jetri i pankreasu. Zbog toga što je eksrpimiranje KLβ i FGFR4 potrebno za aktivnost FGF19, ovaj zaključak ukazuje na to da su jetra i pankreas glavni organi u kojima su oni aktivni. Marginalni nivoi eksprimiranja KLβ i FGFR4 takođe su primećeni u tkivima dojke. KLβ je bio visoko eksprimiran u masnim tkivima, ali odsustvo FGFR4 sprečava funkciju FGF19 u ovom tkivu. Moguće je da KLβ promoviše aktivnost drugih članova endokrinih članova FGF-a sa različitim FGFR vezivnim specifičnostima u masnim tkivima. Značajno, FGF21 reguliše uzimanje glukoze delovanjem specifično na masno tkivo endokrinim mehanizmom (Kharitonenkov, A, i dr (2005) J Clin Invest 115:1627-35). Zbog niskog afiniteta vezanog za heparin, FGF21 može zahtevati da KLβ signalizuje FGFR1 i FGFR2 (Goetz, R i dr (2007) Mol Cell Biol 27:3417-28; Kharitonenkov, supra).
[0466] Eksprimiranje KLβ i FGFR4 takođe su procenjeni u različitim tkivima raka. KLβ eksprimiranje se generalno smanjuje u drugim tkivima raka u poređenju sa relevantnim normalnim tkivom (Slika 9). U opadajućem redosledu intenziteta signala, FGFR4 se eksprimira u sledećim tkivima karcinoma: jetra,
2
debelo crevo, želudac, jednjak, bubrezi, testisi, tanko crevo, pankreas, jajnik i dojka (Slika 10). Ovi podaci pokazuju da je FGFR4 eksprimiranje široko rasprostranjeno i da se njegovo normalan eksprimiranje menja u karcinomu.
Primer 16: Diskusija
[0467] U ovoj studiji mi smo obezbedili dokaze da je FGF 19 potreban KLβ za vezivanje za FGFR4, intracelularnu signalizaciju i modulaciju nizvodnog gena. Međutim, razlog za takvu potrebu je i dalje nejasan. U poređenju sa članovima porodice parakrinskih FGF, FGF19 ima afinitet vezivanja za nizak heparin koji mu omogućava da deluje na endokrin način, a da se ne vezuje za pericelularni proteoglikan ćelija koji se luče (3, 6, 8, 15). Topologija lokacije za vezivanje heparina FGF19 sprečava FGF19 da formira vodonične veze sa heparinom kada je FGF 19 vezan za njegov receptor (5). Zbog toga KLβ može delovati kao FGFR4 ko-receptor koji stabilizuje slabu FGF 19-FGFR4-heparin interakciju.
[0468] Pored toga, pokazali smo da FGFR4 i KLβ spremno interakuju na površini ćelija na način koji ne zavisi od heparina i liganda. Ovaj rezultat je u suprotnosti sa formiranjem kompleksa zavisnog od heparina i liganda koji se posmatra sa sekretima himernih FGFR4 i KLβ proteina. Ovo neslaganje može ukazati na ulogu transmembranskih domena KLβ i FGFR4 u formiranju kompleksa. Transmembranski domeni KLβ i FGFR4 mogu direktno da međusobno komuniciraju ili unapređuju interakciju proteina tako što ih vezuju za površinu ćelija. KLβ-FGFR4 kompleks površina ćelije može da promeni dimerizaciju receptora indukovanu heparinom i ligandom koji je prethodno opisan za parakrinske FGF (18, 20).
[0469] Pronašli smo visoko eksprimiranje KLβ u masnom tkivu. Međutim, odsustvo FGFR4 eksprimiranja sprečava aktivnost FGF 19 u ovom tkivu. Stoga je moguće da KLβ promoviše aktivnost drugih članova porodice endokrinih članova FGF sa različitim FGFR vezivnim specifičnostima u masnim tkivima. Pre svega, za KLβ se nedavno pokazalo da je potreban za FGF21 adipozno specifičnu aktivnost (17). Zbog niskog afiniteta vezanog za heparin, FGF21 može zahtevati KLβ da signalizuje kroz FGFR1 i FGFR2 (6, 12).
[0470] Zajedno, ovi podaci pokazuju da FGF19 zahteva KLβ za vezivanje za FGFR4, intracelularnu signalizaciju i modulaciju nizvodnog gena. Najvažnije, potreba za KLβ ograničava endokrinu aktivnost FGF19 na tkiva koja eksprimiraju i FGFR4 i KLβ. Jetreno-specifično delovanje FGF19 podržava ovaj molekularni mehanizam.
Delimična lista referenci
[0471]
1. Ashida, R., i dr.2005. Inflammopharmacology 13:113-25.
2. Chiang, J. Y.2004. J Hepatol 40:539-51.
3. Choi, M., A.i dr.2006. Nat Med 12:1253-5.
4. Fu, L., i dr.2004. Endocrinology 145:2594-603.
5. Goetz, R., A. i dr.2007. Mol Cell Biol 27:3417-28.
6. Harmer, N. J., i dr.2004. Biochemistry 43:629-40.
7. Hess, J., P. Angel, i M. Schorpp-Kistner.2004. J Cell Sci 117:5965-73.
8. Inagaki, T., M. i dr.2005. Cell Metab 2:217-25.
9. Ito, S., T. i dr.2005. J Clin Invest 115:2202-8.
10. Ito, S. i dr.2000. Mech Dev 98:115-9.
11. Jelinek, D. F.i dr.1990. J Biol Chem 265:8190-7.
12. Kharitonenkov, A. i dr.2005. J Clin Invest 115:1627-35.
13. Kurosu, H. i dr.2006. J Biol Chem 281:6120-3.
14. Li, Y. C. i dr.1990. J Biol Chem 265:12012-9.
15. Lundasen, T.i dr.2006. J Intern Med 260:530-6.
16. Nicholcs, K. i dr 2002. Am J Pathol 160:2295-307.
17. Ogawa, Y. ct al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.104, 7432-7437
18. Plotnikov, A. N. i dr 1999. Cell 98:641-50.
19. Russell, D. W.2003. The enzymes, regulation, and genetics of bile acid synthesis. Annu Rev Biochem 72:137-74.
20. Schlessinger, J. i dr 2000. Mol Cell 6:743-50.
21. Shaulian, E., and M. Karin.2002. Nat Cell Biol 4:E131-6.
22. Tomlinson, E. i dr.2002. Endocrinology 143:1741-7.
23. Trauner, M., and J. L. Boyer.2004. Curr Opin Gastroenterol 20:220-30.
24. Urakawa, I. i dr.2006. Nature 444:770-4.
25. Winer, J. i dr.1999. Anal Biochem 270:41-9.
26. Xie, M. H. i dr.1999. Cytokine 11:729-35.
[0472] Naredne numerisane klauzule predstavljaju aspekte i deo su opisa
1. Postupak za moduliranje poremećaja povezanog sa eksprimiranjem ili aktivnošću KLβ, postupak obuhvata davanja efikasne količine KLβ modulatora pojedincu kom je potreban takav tretman. 2. Postupak za tretiranje poremećaja povezanog sa eksprimiranjem ili aktivnošću KLβ, postupak koji obuhvata davanje efikasne količine KLβ antagonista pojedincu kom je potreban takav tretman.
3. Postupak od 2, gde je poremećaj tumor, kancer ili proliferativni poremećaj ćelije.
4. Postupak od 3, gde je tumor, kancer ili proliferativni poremećaj ćelija hepatocelularni karcinom, kancer pankreasa, kancer ne-malih ćelija pluća, rak dojke ili kolorektalni kancer.
5. Postupak od 2, gde je poremećaj jetre.
6. Postupak od 5, gde je poremećaj jetre ciroza.
7. Postupak od 2, gde je poremećaj hipoglikemija, holestaza ili disregulacija metabolizma žučne kiseline.
8. Postupak od 2, gde se poremećaj trošenja.
9. Postupak od 8, gde pojedinac dalje ima tumor, kancer i/ili proliferativni poremećaj ćelija.
10. Postupak bilo kog od 1-9, koji dalje obuhvata davanje pacijentu efektivne količine drugog medikamenta, gde je KLβ antagonist prvi medikament.
11. Postupak od 10, gde je drugi medikament antitelo, hemoterapeutski agens, citotoksični agens, anti-angiogeni agens, imunosupresivni agens, prolek, citokin, citokinski antagonist, citotoksična radioterapija, kortikosteroid, emetik, vakcina protiv raka, analgetik ili agens za inhibiranje rasta.
12. Postupak od 11, gde je drugi medikament tamoksifen, letrozol, eksemestan, anastrozol, irinotekan, cetuksimab, fulvestrant, vinorelbin, erlotinib, bevacizumab, vinkristin, imatinib, sorafenib, lapatinib ili trastuzumab.
13. Postupak od 10, gde se drugi medikament primenjuje pre ili posle primene KLβ antagonista.
14. Postupak od 10, gde se drugi medikament primenjuje istovremeno sa KLβ antagonistom. 15. Postupak bilo kog od 2-14, gde je KLβ antagonist antitelo
16. Postupak od 15, gde je antitelo monoklonsko antitelo.
17. Antitelo od 15, gde je antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od himernog antitela, humanizovanog antitela, afinitetno zrelog antitela, ljudskog antitela i bispecifičnog antitela.
4
18. Antitelo od 15, gde je antitelo fragment antitela.
19. Antitelo od 15, gde je antitelo imunokonjugat.
20. Postupak bilo kog od 2-19, gde dalje biološki uzorak pojedinca eksprimira (i) KLβ, (ii) KLβ i FGF, (iii) KLβ i FGFR, ili (iv) KLβ, FGF i FGFR.
21. Postupak od 20, gde biološki uzorak eksprimira KLβ.
22. Postupak od 20, gde biološki uzorak eksprimira KLβ i FGFR4.
23. Postupak od 20, gde biološki uzorak eksprimira KLβ, FGF19 i FGFR4.
24. Postupak od 1, gde je KLβ modulator KLβ agonista.
25. Postupak od 24, gde je poremećaj gojaznost ili stanje vezano za gojaznost.
26. Postupak od 25, gde je stanje vezano za gojaznost dijabetes melitus, kardiovaskularnu bolest, insulinsku rezistenciju, hipertenziju, hiperholesterolemiju, tromboembolijsku bolest, aterosklerozu, dislipidemiju, osteoartritis, bolest žučne kese, osteoartritis i apneu tokom spavanja i dr uge respiratorne poremećaje.
27. Postupak od 25, gde je poremećaj hiperglikemija.
28. Postupak indukcije povećanja osetljivosti na insulin, gde postupak obuhvata davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu koji zahteva takav tretman.
29. Postupak za smanjenje ukupne telesne mase, gde postupak obuhvata davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
30. Postupak za smanjenje najmanje jednog od triglicerida i slobodnih masnih kiselina, gde postupak obuhvata davanje efikasne doze agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman.
31. Postupak za detektovanje KLβ, gde postupci obuhvataju detektovanje KLβ u uzorku.
32. Postupak od 31, gde je uzorak biološki uzorak raka, tumora ili proliferativnog poremećaja ćelija.
33. Postupak od 32, gde biološki uzorak eksprimira FGF ili FGFR.
34. Postupak identifikacije inhibitora supstance koja inhibira vezivanje KLG na FGFR, gde navedeni postupak sadrži: (a) dovođenje u dodir kandiduje supstance sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR, FGF i KLβ, i (b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom biološke aktivnosti FGFR u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ, FGF i FGFR kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutom kandidat supstancom, gde smanjenje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom pokazuje da je kandidat supstanca sposobna da inhibira vezivanje KLβ na FGFR.
35. Postupak utvrđivanja da li kandidat supstanca promoviše biološku aktivnost KLβ, gde navedeni postupak obuhvata: (a) dovođenje u dodir kandidat supstance sa prvim uzorkom koji sadrži FGFR i KLβ, i (b) upoređivanje količine biološke aktivnosti FGFR u uzorku sa količinom FGFR biološke aktivnosti u referentnom uzorku koji sadrži slične količine KLβ i FGFR kao prvi uzorak, ali koji nije bio doveden u dodir sa pomenutom kandidat supstancom, gde povećanje količine biološke aktivnosti FGFR u prvom uzorku u poređenju sa referentnim uzorkom ukazuje na to da je kandidat supstanca je sposobna da promoviše KLβ vezivanje za FGFR.
Spisak sekvenci
[0473]
1
2
4
1
11
12
�
14
�
1
1
1
�
11
11
11
11
11
11
11
12
��
��
12
��
12
12

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. KLβ agonist za upotrebu u postupku lečenja stanja vezanog za gojaznost, pri čemu je stanje vezano za gojaznost dijabetes melitus ili insulinska rezistencija, gde postupak obuhvata davanje agonista KLβ pojedincu kom je potreban takav tretman, pri čemu je KLβ agonist anti-KLβ antitelo.
2. KLβ agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u postupku lečenja dijabetes melitusa.
3. KLβ agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je anti-KLβ antitelo monoklonsko antitelo.
4. KLβ agonist za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je anti-KLβ antitelo himerno antitelo, humanizovano antitelo, afinitetno zrelo antitelo ili ljudsko antitelo.
5. KLβ agonist za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je anti-KLβ antitelo bispecifično antitelo.
6. KLβ agonist za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je anti-KLβ antitelo fragment antitela.
7. Upotreba KLβ agonista u pripremi medikamenta za upotrebu u postupku lečenja stanja vezanog za gojaznost, pri čemu je stanje povezano sa gojaznošću dijabetes melitus ili insulinska rezistencija, gde postupak obuhvata davanje KLβ agonista pojedincu kom je potreban takav tretman, pri čemu je KLβ agonist anti-KLβ antitelo.
8. Upotreba prema patentnom zahtevu 7, gde je medikament za upotrebu u postupku lečenja dijabetes melitusa.
9. Upotreba prema patentnom zahtevu 7 ili 8, gde je anti-KLβ antitelo monoklonsko antitelo.
10. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 9, pri čemu je anti-KLβ antitelo himerno antitelo, humanizovano antitelo, afinitetno zrelo antitelo ili ljudsko antitelo.
11. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 10, pri čemu je KLβ agonist bispecifično antitelo.
12. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 11, pri čemu je anti-KLβ antitelo fragment antitela.
RS20180480A 2007-04-02 2008-04-01 Kloto-beta agonist antitelo za primenu u tretmanu dijabetes melitusa ili otpornosti na insulin RS57149B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90969907P 2007-04-02 2007-04-02
US91618707P 2007-05-04 2007-05-04
EP12179244.4A EP2550972B1 (en) 2007-04-02 2008-04-01 A Klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57149B1 true RS57149B1 (sr) 2018-07-31

Family

ID=40229367

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180480A RS57149B1 (sr) 2007-04-02 2008-04-01 Kloto-beta agonist antitelo za primenu u tretmanu dijabetes melitusa ili otpornosti na insulin

Country Status (21)

Country Link
US (7) US20100158914A1 (sr)
EP (3) EP2139508B1 (sr)
AR (1) AR065911A1 (sr)
AU (1) AU2008275559B2 (sr)
CA (1) CA2682096A1 (sr)
CL (2) CL2008000947A1 (sr)
DK (1) DK2550972T3 (sr)
ES (2) ES2665996T3 (sr)
HR (1) HRP20180667T1 (sr)
HU (1) HUE038279T2 (sr)
LT (1) LT2550972T (sr)
NO (1) NO2550972T3 (sr)
NZ (2) NZ597947A (sr)
PE (1) PE20090227A1 (sr)
PL (1) PL2550972T3 (sr)
PT (1) PT2550972T (sr)
RS (1) RS57149B1 (sr)
SI (1) SI2550972T1 (sr)
TW (3) TW201446265A (sr)
WO (1) WO2009009173A2 (sr)
ZA (1) ZA200906495B (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100292303A1 (en) * 2007-07-20 2010-11-18 Birrer Michael J Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EA032727B1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Мутантный резистентный к протеолизу полипептид fgf21 и его применение
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
EP4353247A3 (en) * 2009-05-05 2024-07-17 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
JP2012530493A (ja) * 2009-06-17 2012-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド キメラポリペプチドおよびその使用
CA2782814A1 (en) * 2009-12-02 2011-06-09 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human fgfr1c, human .beta.-klotho and both human fgfr1c and human .beta.-klotho
UA109888C2 (uk) * 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
US9517264B2 (en) 2010-04-15 2016-12-13 Amgen Inc. Human FGF receptor and β-Klotho binding proteins
AU2011239386B2 (en) 2010-04-16 2015-03-19 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using FGF
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
WO2012154263A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Amgen Inc. Method of identifying compounds that specifically modulate the interaction of fgfr1 and beta-klotho
PE20141727A1 (es) 2011-07-01 2014-11-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones, usos y metodos para tratamiento de trastornos y enfermedades metabolicas
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) * 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
CA2892152A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9925242B2 (en) 2012-12-27 2018-03-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides for treatment of nonalcoholic steatohepatitis
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
KR102120264B1 (ko) 2013-02-11 2020-06-09 루미리즈 홀딩 비.브이. 발광 디바이스 및 발광 디바이스를 제조하기 위한 방법
US9550820B2 (en) 2013-02-22 2017-01-24 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23/fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
CA2928135A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
CA2927252C (en) 2013-10-25 2021-09-28 Novartis Ag Ring-fused bicyclic pyridyl derivatives as fgfr4 inhibitors
MX377380B (es) 2013-10-28 2025-03-10 Ngm Biopharmaceuticals Inc Modelos de cáncer y métodos asociados.
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
AU2015209131B2 (en) 2014-01-24 2020-06-25 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
WO2015183890A2 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2016054483A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Novartis Ag Use of ring-fused bicyclic pyridyl derivatives as fgfr4 inhibitors
UA123763C2 (uk) 2014-10-23 2021-06-02 Енджіем Байофармасьютикалз, Інк. Фармацевтична композиція для контролю або лікування захворювання або порушення, пов’язаного з fgf19
US10434144B2 (en) 2014-11-07 2019-10-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
RU2017134379A (ru) 2015-03-25 2019-04-03 Новартис Аг Формилированные n-гетероциклические производные в качестве ингибиторов fgfr4
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
WO2017075260A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (fgf) 1 analogs
CA3003616C (en) 2015-11-09 2020-07-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
CN107177002B (zh) * 2016-03-09 2021-02-09 郑州鸿运华宁生物医药有限公司 一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体及其用途
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
WO2018055503A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Novartis Ag Combination comprising a pd-1 antagonist and an fgfr4 inhibitor
MX387222B (es) 2016-11-02 2025-03-18 Novartis Ag Combinaciones de inhibidores de fgfr4 y secuestrantes de ácido biliar.
US20200330555A1 (en) * 2017-04-21 2020-10-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal motility-related disorders using variants and fusions of fgf19/fgf21 polypeptides
WO2019010314A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Yale University COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING ENDOCRINE FGF-RELATED DISEASES
CN109722480B (zh) * 2018-05-17 2022-04-26 上海交通大学 一种非小细胞肺癌检测试剂盒及其应用
CN109718385B (zh) * 2018-05-30 2022-05-10 上海交通大学 Klotho-beta的功能与应用
US20190254476A1 (en) 2019-02-25 2019-08-22 Sharkninja Operating Llc Cooking device and components thereof
USD982375S1 (en) 2019-06-06 2023-04-04 Sharkninja Operating Llc Food preparation device
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
JP2024534531A (ja) * 2021-09-23 2024-09-20 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 抗ｋｌｂ抗体及び使用
JP2025517398A (ja) 2022-05-19 2025-06-05 タイラ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド Ｐｐａｒアゴニスト及びｆｇｆｒ４阻害剤による治療
EP4509142A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Ona Therapeutics S.L. Fgfr4 as target in cancer treatment

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020042367A1 (en) 1997-11-25 2002-04-11 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
JP2001072607A (ja) * 1999-09-03 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規血管内皮機能改善法
EP1210426A2 (en) 1999-09-10 2002-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polymorphisms in a klotho gene
JP2003334088A (ja) * 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
JP2006158339A (ja) * 2004-12-09 2006-06-22 Kyoto Univ βＫｌｏｔｈｏ遺伝子、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子、及びそれらの利用
NZ569957A (en) * 2006-02-10 2012-03-30 Genentech Inc Anti-FGF19 antibodies and methods using same

Also Published As

Publication number Publication date
EP2139508B1 (en) 2013-05-08
CL2008000947A1 (es) 2008-10-10
ES2665996T3 (es) 2018-04-30
AR065911A1 (es) 2009-07-08
WO2009009173A2 (en) 2009-01-15
US20180208677A1 (en) 2018-07-26
CA2682096A1 (en) 2009-01-15
US20220089780A1 (en) 2022-03-24
PE20090227A1 (es) 2009-04-03
US20140363435A1 (en) 2014-12-11
ES2422605T3 (es) 2013-09-12
TW200906438A (en) 2009-02-16
AU2008275559B2 (en) 2014-04-10
PL2550972T3 (pl) 2018-08-31
EP3372237A1 (en) 2018-09-12
DK2550972T3 (en) 2018-04-23
WO2009009173A3 (en) 2009-10-29
NZ597947A (en) 2013-08-30
HRP20180667T1 (hr) 2018-06-01
EP2550972B1 (en) 2018-02-21
TW201412331A (zh) 2014-04-01
PT2550972T (pt) 2018-05-02
AU2008275559A1 (en) 2009-01-15
US20150368358A1 (en) 2015-12-24
EP2139508A2 (en) 2010-01-06
CL2017002807A1 (es) 2018-05-11
US20100158914A1 (en) 2010-06-24
HUE038279T2 (hu) 2018-10-29
LT2550972T (lt) 2018-05-10
EP2550972A1 (en) 2013-01-30
TWI577387B (zh) 2017-04-11
SI2550972T1 (en) 2018-05-31
NZ580180A (en) 2012-03-30
TW201446265A (zh) 2014-12-16
ZA200906495B (en) 2010-11-24
US20210284753A1 (en) 2021-09-16
NO2550972T3 (sr) 2018-07-21
TWI524898B (zh) 2016-03-11
US20150132309A1 (en) 2015-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220089780A1 (en) Klotho beta
JP5209505B2 (ja) 抗ｆｇｆ１９抗体およびその使用方法
JP5852010B2 (ja) 抗Ｂｖ８抗体およびその使用
JP2012525853A (ja) ヒト化抗ｅｇｆｌ７抗体とその使用方法
BRPI0706840A2 (pt) anticorpos anti- ephb4 isolado polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo anti ephb4, método para produção de um imunoconjugado anti ephb4, método para a detecção de ephb4, método para diagnosticar um distúrbio composição, método para inibir a angiogênese, método para tratar um cáncer, tumor e/ou distúrbio da proliferação celular e uso de um anticorpo
AU2014203654B2 (en) Klotho-beta for use in treating cancer, liver disorders, gallstones, wasting syndrome and obesity-related diseases
HK1260779A1 (en) A klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
HK1178787A (en) A klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
HK1178787B (en) A klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
HK1120273B (en) Anti-fgf19 antibodies and methods using same