JP2003334088A - ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ヒト由来の新規Klotho様タンパク質及びその遺
伝子の提供。 【解決手段】 ＶＴＳ（ｖｉｒｔｕａｌ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｂｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）アプローチによって、
ヒト由来の新規なＫｌｏｔｈｏ様タンパク質をコードす
る遺伝子ｃＤＮＡを取得した。これに基づく、ヒト由来
の新規なＫｌｏｔｈｏ様タンパク質、該タンパク質をコ
ードするＫｌｏｔｈｏ様遺伝子、組換えベクター、該組
換えベクターを含む形質転換体及び該Ｋｌｏｔｈｏ様タ
ンパク質の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒト由来Kl
otho様の老化制御タンパク質（Klotho様タンパク質とも
いう）、該タンパク質をコードするKlotho様の老化制御
遺伝子（Klotho様遺伝子ともいう）、該遺伝子を含有す
る組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体
及び該Klotho様タンパク質の製造方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】老化現象は、加齢に伴い進行する個体の
機能的、外見的変化における、個体の劣化を意味し、老
化に伴い種々の生活習慣病の発症頻度が増加することが
知られている。従って、老化を何等かの形で制御できる
薬剤は生活習慣病の治療薬若しくは予防薬、また、機能
的・外見的劣化に対する保護薬若しくは予防薬となるこ
とが期待される。これまで科学的に老化制御効果の証明
されている薬剤は殆ど知られていない。個体の老化に関
する遺伝子レベルの研究は、世界的に開始されたばかり
であり、個体の老化に関する分子遺伝学的情報は皆無に
近い状況であった。しかし、遺伝的早期老化症は、ター
ナー症候群、ウェルナー症候群、ハッチンソン・ギルフ
ォード症候群(プロゲリア)等、いくつか知られている。
特にウェルナー症候群に関しては原因遺伝子の同定がな
されている[Science 272:258(1996)]。以上のことから
老化に関与する遺伝子が存在することは確定的事実とな
っている。老化が、遺伝子によって制御されているとす
れば、その遺伝子の活性をコントロールすることにより
老化を調節することができ、老化と密接に関連して現れ
る種々の疾患の治療又は予防に用いることができると考
えられる。

【０００３】1997年に、鍋島らにより、ヒトの多彩な老
化症状によく似た変異表現型をもつマウスが発見され、
その原因遺伝子Klothoが同定された[Kuro-o M. et al.:
Nature 390:45-51(1997)]。この遺伝子が機能不全とな
ったマウスは、寿命の短縮、各種臓器の石灰化、動脈硬
化、生殖臓器の萎縮など、顕著かつ多彩な早期老化症状
を呈する。このマウスKlotho遺伝子を用いてヒトKlotho
遺伝子もクローン化され、その構造が明らかにされてい
る。また、ヒトKlotho cDNAの解析から、ヒトKlotho遺
伝子からはスプライシングの違いにより２種類のmRNAが
転写され、２種類の蛋白質が翻訳されることが分かって
いる。この２種類のKlothoタンパク質のうち、一方の蛋
白質は、Ｎ末端のシグナル配列領域、細胞外ドメイン領
域及びＣ末端の膜貫通ドメイン領域を有する構造を持つ
１型膜蛋白質であり、細胞外ドメインは細菌あるいは植
物のβ-グルコシダーゼに相同性をもつ２つのドメイン
（KL1、KL2）より構成されているのに対し、もう一方の
蛋白質は、Ｎ末端のシグナル配列領域とKL1ドメイン領
域を有する分泌蛋白質であることが明らかにされた[Mat
sumura H. et al.:Bichem. Biophys. Res. Commun. 24
2:626(1998)]。さらに、マウス及びヒトの遺伝子データ
ベースの検索により、Klotho 遺伝子と類似のヒット配
列が見出され、それを手がかりとしてKlothoタンパク質
と極めて相同性の高いβ- Klothoタンパク質をコードす
る遺伝子が発見された[Ito S. et al:Mechanisms of De
velopment 98:115(2000)]。

【０００４】前記マウスβ--Klothoタンパク質の場合の
ように、ヒトの生体内にも公知のKlothoタンパク質以外
の未知のKlotho様タンパク質が存在し、老化に伴い発症
する様々な疾患に、それらが複合的に関わっていると考
えられる。従って、ヒト生体内に存在するKlothoタンパ
ク質のレパートリーの全容を明らかにすることは、前記
疾患の予防・治療の観点から重要である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト由来の
新規なKlotho様タンパク質、該タンパク質をコードする
Klotho様遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、
該組換えベクターを含む形質転換体及び該Klotho様タン
パク質の製造方法等を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、VTS（virtualtr
anscribed sequence）アプローチによって、ヒト由来の
新規なKlotho様タンパク質をコードする遺伝子cDNAを取
得することに成功し、本発明を完成するに至った。すな
わち、本発明は、以下の(1)〜(15)である。

【０００７】(1) 配列番号２で表わされるアミノ酸配
列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むこ
とを特徴とする老化制御タンパク質又はその塩。 (2) 上記(1)の老化制御タンパク質の部分アミノ酸配列
を含むことを特徴とするペプチド又はその塩。 (3) 上記(1)の老化制御タンパク質又はその部分ペプチ
ドをコードする塩基配列を含むことを特徴とするポリヌ
クレオチド。 (4) 上記(1)の老化制御タンパク質をコードする塩基配
列が、配列番号１で表される塩基配列であることを特徴
とする上記(3)のポリヌクレオチド。 (5) ポリヌクレオチドがDNA又はRNAであることを特徴
とする上記(3)又は上記(4)のポリヌクレオチド。

【０００８】(6) 上記(3)〜(5)のいずれかに記載のポ
リヌクレオチドを含有する組換えベクター。 (7) 上記(6)の組換えベクターで形質転換させた形質転
換体。 (8) 上記(7)の形質転換体を培地に培養し、得られる培
養物から上記(1)のタンパク質又はその塩、あるいは上
記(2)のペプチド又はその塩を採取することを特徴とす
る上記(1)のタンパク質又はその塩あるいは上記(2)のペ
プチド又はその塩の製造方法。 (9) 上記(1)のタンパク質又はその塩あるいは上記(2)
のペプチド又はその塩に対する抗体。 (10) 上記(1)のタンパク質又はその塩あるいは上記(2)
のペプチド又はその塩を有効成分として含有する早期老
化症治療薬又は老化抑制薬。

【０００９】(11) 上記(1)のタンパク質又はその塩あ
るいは上記(2)のペプチド又はその塩を有効成分として
含有する、血管内皮機能劣化による病態の改善又は予防
薬。 (12) 血管内皮機能劣化による病態が、高血圧又は動脈
硬化である上記(11)の血管内皮機能劣化による病態の改
善又は予防薬。 (13) 上記(3)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチ
ドを含有する、早期老化症治療用の遺伝子治療用ベクタ
ー。 (14) 上記(3)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチ
ドを含有する、血管内皮機能劣化による病態の改善又は
予防用の遺伝子治療用ベクター。 (15) 血管内皮機能劣化による病態が、高血圧又は動脈
硬化である上記(14)の血管内皮機能劣化による病態の改
善又は予防用の遺伝子治療用ベクター。 以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の新規なKlotho様タンパク
質は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一又は
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質であ
る。本タンパク質は、以下のようにして得ることがで
き、後述の様々な産業上の利用性を有する。

【００１１】１． 本発明のKlotho様タンパク質をコー
ドする遺伝子のクローニング 本発明のKlotho様タンパク質をコードする遺伝子は、VT
S（virtual transcribed sequence：仮想転写配列）ア
プローチによってクローニングすることができる。ここ
で「VTSアプローチ」とは、ヒトゲノム配列データか
ら、遺伝子予測プログラムによって遺伝子コード領域を
予測及びリスト化し、ESTとして確認されていないVTS
を、多様なRNA源からRT-PCRによって検出し、検出さ
れた断片の塩基配列を決定することによってスプライシ
ングの有無を確認し、実在遺伝子としての評価を与え
ることによって、実際に発現されている新規遺伝子を同
定する手法をいう。以下、本発明のKlotho様タンパク質
をコードする遺伝子のクローニング方法を、図１を用い
て具体的に説明する。

【００１２】まず、GENESCAN等の遺伝子予測プログラム
によってヒトゲノム配列上に遺伝子コード領域を予測
し、それらをリスト化してVTSデータベースを構築す
る。なお、なお、VTSデータベースは既に市販品があり
それを使用することもできる。次いで、仮想転写配列
（VTS）群に対して、データベース中から未だESTとして
発現が確認されておらず、Klotho様タンパク質をコード
すると考えられるVTSを検索する。ここで、検索には公
知のヒト又はマウスKlothoタンパク質中に存在するアミ
ノ酸配列を、query配列（問合わせ配列）として使用す
ることができる。

【００１３】得られたVTSの、ゲノム配列上に予測される
エクソン及びイントロンに基づいて、図１(a)のように
１個以上のイントロンを挟むようエクソン上にプライマ
ー配列を設計・合成する。ここで、プライマーの設計
は、OLIGO（National Biosciences社）等の市販のプラ
イマー設計ソフトを用いて行うことができる。設定した
プライマーを用い、多様なRNA源を用いてRT-PCRを行
う。ここで、RNAの供給源としては、ヒト由来の肝細
胞、乳腺細胞等が挙げられる。前記細胞は、人工中絶又
は自然流産したヒトから調製することもできる。RNAの
調製は、当該技術分野において通常用いられる手法によ
り行うことができる。

【００１４】RT-PCRによって得られるDNA断片〔図１の
(c)：実証エキソン配列〕の塩基配列を決定する。これ
により当該DNA断片が、ゲノム配列から予測されるスプ
ライシング物〔図１の(b)：予測エキソン配列〕と同一
であることを確認する。次いで、確認された配列に基づ
いて設計したプライマーを用いて5’-RACE及び3’-RACE
を実行する〔図１の(d)〕する。これにより本発明のKlo
tho様タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするcDNA
の塩基配列を明らかにすることができる〔図１の
(e)〕。

【００１５】本発明において、ヒトからクローニングさ
れた新規なKlotho様タンパク質及び該タンパク質をコー
ドする遺伝子cDNAを例示すると以下のようになる。すな
わち、配列番号２は、ヒト由来のKlotho様タンパク質の
アミノ酸配列であり、配列番号１は、当該タンパク質を
コードする遺伝子cDNAの塩基配列である。一旦、本発明
の遺伝子cDNAの塩基配列が確定されると、その後は化学
合成によって、あるいはPCRによって本発明のポリヌク
レオチドを得ることができる。例えば、本発明のKlotho
様タンパク質の全長アミノ酸配列（配列番号２）をコー
ドするDNA（配列番号１）は、ヒト肝細胞又は乳腺細胞
由来cDNAを鋳型として、5’-atgaagccaggctgtgcggcagga
t-3’(配列番号３)及び5’-ttagctaacaactctcttgcctttc
-3’(配列番号４)の塩基配列を有するプライマーを用い
ることにより、PCRによって容易に調製することができ
る。但し、本発明においては、プライマーはこれらに限
定されるものではない。

【００１６】２． 本発明のKlotho様タンパク質及びそ
の部分ペプチド 本発明のKlotho様タンパク質は、配列番号２で表わされ
るアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列
を含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のア
ミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号２で表わ
されるアミノ酸配列と約50％以上、好ましくは約70％以
上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90
％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するア
ミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表わされるアミノ
酸配列を含むタンパク質と実質的に同一の活性を有する
タンパク質をいう。「実質的に同一の活性」とは、老化
を制御する活性等のKlothoタンパク質が元来有する生理
学的活性と同一の活性であることをいう。

【００１７】配列番号２で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、
配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以
上（好ましくは、１〜30個程度、より好ましくは１〜10
個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号２で表わされるアミノ酸配
列に１又は２個以上（好ましくは、１〜30個程度、より
好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個）
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、並びに配列番号２
で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好まし
くは、１〜30個程度、より好ましくは１〜10個程度、さ
らに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられ
る。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、Klotho様タ
ンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の
手法によって、改変することによって行うことができ
る。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキッ
ト〔例えば、Mutan^TM−G（TAKARA社）、Mutan^TM−K（TA
KARA社）〕等を使用し、Gupped duplex法やKunkel法等
の公知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩
基置換を行なうことによって達成することができる。

【００１８】また、本発明のKlotho様タンパク質のＣ末
端は、通常カルボキシル基（-COOH）であるが、当該カ
ルボキシル基は、アミド（-CONH₂）やエステル（-COO
R）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル
中のＲとしては、Ｃ_1-6アルキル基（例えば、メチル、
エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル）、Ｃ_3-
8シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロ
ヘキシル）、Ｃ_6-12アリール基（例えば、フェニル、α
-ナフチル）、フェニル-Ｃ_1-2アルキル基（例えば、ベ
ンジル、フェネチル）、α-ナフチル-Ｃ_1-2アルキル基
（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その
他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオ
キシメチルエステルとすることも可能である。本発明の
Klotho様タンパク質がＣ末端以外にもそのポリペプチド
鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキ
シル基がアミド化又はエステル化されているものも、本
発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとし
ては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明の
Klotho様タンパク質のＮ末端は、通常アミノ基（-NH₂）
であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等
のＣ_1-6アシル基等で化学修飾されていてもよい。その
他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基が
ピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側
鎖上の置換基（例えば、-OH、-SH、アミノ基、イミダゾ
ール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官
能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾さ
れているものや糖鎖の結合しているものも本発明のタン
パク質に含まれる。

【００１９】上記いずれかのKlotho様タンパク質中の部
分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともい
う）も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部
分ペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同
一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配
列を含むものである限り、いずれのものであってもよ
い。本発明の部分ペプチドの中でも、Klotho様タンパク
質が天然に存在する場合に細胞膜の外に露出している部
分は、老化現象の制御において特に有用である。そのよ
うな部分ペプチドとしては、配列番号２で表わされるア
ミノ酸配列の膜タンパク質分析プログラム（例えば、TM
HMMプログラム等）による解析において、細胞外領域と
予測される部分が挙げられる。本発明の部分ペプチドを
構成するアミノ酸数は、少なくとも10個以上、好ましく
は30個以上、より好ましくは80個以上である。通常、本
発明の部分ペプチドのＣ末端はカルボキシル基（−COO
H）、Ｎ末端はアミノ基（−NH₂）であるが、これらは前
記Klotho様タンパク質の場合のように、化学修飾されて
いてもよい。

【００２０】本発明のKlotho様タンパク質又はその部分
ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学
的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのよ
うな塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられ
る。

【００２１】本発明のKlotho様タンパク質又はその塩
は、本発明のKlotho様タンパク質を発現しているヒトや
哺乳動物の培養細胞又は組織からの抽出・分離よって、
あるいは後述のように本発明のKlotho様タンパク質をコ
ードするDNAを含む形質転換体を培養することによって
も製造することができる。ヒトや哺乳動物の組織又は細
胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織又は細胞を
ホモジナイズ後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液
を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフ
ィーを組み合わせることにより単離精製することができ
る。

【００２２】また、本発明の部分ペプチド又はその塩
は、公知のペプチド合成法又は前記Klotho様タンパク質
を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリ
プシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断するこ
とによって製造することができる。ペプチド合成法とし
ては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっ
てもよい。すなわち、本発明のKlotho様タンパク質を構
成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを
縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離
することにより目的のペプチドを製造することができ
る。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチ
ドを単離精製することができる。上記の方法で得られる
Klotho様タンパク質又はその部分ペプチドが遊離体であ
る場合は、公知の方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、反対に塩で得られた場合は、公知の方法に
よって遊離体に変換することができる。

【００２３】３． 本発明のKlotho様タンパク質又はそ
の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド 本発明のKlotho様タンパク質又はその部分ペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドは、上記２のKlotho様タンパ
ク質又はその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有
するものであればいかなるものであってもよい。該ポリ
ヌクレオチドとしては、本発明のKlotho様タンパク質を
コードするDNAやRNA（例えば、mRNA）が挙げられ、二本
鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合
は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNAとRNAとのハイブリッ
ドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コ
ード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コ
ード鎖）であってもよい。本発明のKlotho様タンパク質
をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、実験
医学増刊「新PCRとその応用」15(7)、1997記載の方法又
はそれに準じた方法により、本発明のKlotho様タンパク
質のmRNAを定量することができる。本発明のKlotho様タ
ンパク質をコードするDNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNAラ
イブラリー、上記１の細胞由来のcDNA、又は上記１の細
胞若しくは組織由来のcDNAライブラリーから調製したも
の、あるいは合成DNAのいずれでもよい。ライブラリー
に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、上記１の細胞又は組織から調製した全RNA又
はmRNA画分を用いて直接、RT-PCR法（Reverse Transcri
ptasePolymerase Chain Reaction）によって増幅するこ
ともできる。具体的には、本発明のKlotho様タンパク質
をコードするポリヌクレオチドとしては、上記１のよう
に配列番号１で表わされる塩基配列を含有するポリヌク
レオチドが挙げられるが、これらのいずれかのポリヌク
レオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、且つ本発明のKlotho様タンパク質と実質的に同質の
活性（例えば、老化制御活性）を有するKlotho様タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドであればいずれのも
のであってもよい。

【００２４】配列番号１で表わされる塩基配列を含有す
るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズできるDNAとしては、配列番号１で表わされ
る塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より
好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相
同性を有する塩基配列を含有するDNA等が挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とはとは、ナトリ
ウム濃度が約20〜40mM、好ましくは約20〜25mM、温度が
約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件をいう。

【００２５】４． 組換えベクター及び形質転換体の作
製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
Klotho様タンパク質又はその部分ペプチドをコードする
ポリヌクレオチド（例えば、DNA）を連結することによ
り得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するための
ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定
されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げ
られる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラス
ミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、
pUC19、pCBD-C等)、枯草菌由来のプラスミド（例えばpU
B110、pTP5、pC194等)、酵母由来のプラスミド（例えば
YEp13、YEp24、YCp50、YIp30等)などが挙げられ、ファ
ージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、
レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイル
ス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイル
スベクターを用いることもできる。

【００２６】ベクターへの本発明のポリヌクレオチドの
連結は、上記１においてクローニングされたKlotho様タ
ンパク質をコードするDNAをそのまま、又は所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加し、ベクターDN
Aの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入
することにより行うことができる。連結するDNAはその
5'末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'
末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGA又はTAGを
有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止
コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加する
こともできる。連結するDNAは、当該DNA中にコードされ
ている本発明のKlotho様タンパク質が宿主細胞中で発現
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明の組換えベクターには、Klotho様タ
ンパク質コード配列以外にも、プロモーター、選択マー
カー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシング
シグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（S
D配列）などを連結することができる。

【００２７】ここで、本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであれば特に限定されない。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、CM
Vプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、
HSV-TKプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌であ
る場合には、trpプロモーター、lacプロモーター、recA
プロモーター、λＰ _Lプロモーター、lppプロモーター等
が、宿主が枯草菌である場合には、SPO1プロモーター、
SPO2プロモーター、penPプロモーター等が、宿主が酵母
である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモータ
ー、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が挙げられ
る。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、P10プロモーターなどが好ましい。なお、選択
マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイ
シン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げ
られる。

【００２８】(2) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本
発明のKlotho様遺伝子が発現し得るように宿主中に導入
することにより得ることができる。ここで、宿主として
は、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定さ
れるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia col
i）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacil
lus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチ
ダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾ
ビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビ
ウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポン
ベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、サル細胞C
OS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等の動物細
胞、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。

【００２９】大腸菌への組換えベクターの導入方法とし
ては、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et
al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(197
2)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母
への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポ
レーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymo
l.,194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.
et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(19
78)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol.,153：
163(1983)]等が挙げられる。動物細胞への組換えベクタ
ーの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リ
ン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられ
る。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、
例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレ
クトロポレーション法等が挙げられる。

【００３０】５． 本発明のKlotho様タンパク質の製造 本発明のKlotho様タンパク質は、上記４において得られ
る形質転換体を培養し、その培養物から採取することに
より製造することができる。「培養物」とは、培養上
清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しく
は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発
明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いら
れる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の
微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地
としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことが
できる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用
いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル
コール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のア
ンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
る。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、
炭酸カルシウム等が用いられる。

【００３１】培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、LB培地、
M9培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よ
く働かせるために、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラク
トシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加
えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約
30〜40℃で約６〜24時間行ない、必要により通気や撹拌
を加えることもできる。酵母培養するための培地として
は、SD培地、YPD培地があげられる。培地のpHは約５〜
８に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で
約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養す
る際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地
等が挙げられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが
好ましい。培養は通常約27℃で約３〜５日間行ない、必
要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である
形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５
〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地、DMEM培地、RPMI 16
40培地等が用いられる。pHは約６〜８であるのが好まし
い。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必
要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形
質転換体の細胞膜等に本発明のKlotho様タンパク質を生
成させることができる。上記培養物から本発明のKlotho
様タンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法
により行なうことができる。

【００３２】本発明のKlotho様タンパク質を培養菌体あ
るいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方
法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによ
って（必要に応じて、界面活性剤処理を行い）、菌体あ
るいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりKlotho
様タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。培養液中にKlotho様タンパク質が分泌される場合に
は、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細
胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得
られた培養上清又は抽出液中に含まれるKlotho様タンパ
ク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行なうことができる。これらの公知の分離、精製法と
しては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びSDS-PAGE等
の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロ
マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用
する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水
性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点
の差を利用する方法などが用いられる。

【００３３】６． 本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チド 本発明のKlotho様タンパク質をコードする遺伝子の複製
又は発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌク
レオチドを、上記１においてクローニングしたKlotho様
タンパク質をコードするDNAの塩基配列情報に基づい
て、設計・合成することができる。具体的には、本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドとしては、配列番号２
で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含むKlotho様タンパク質又は該タンパク
質の部分ペプチドをコードする塩基配列と相補的である
か、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズすることができるポリヌクレオチドが挙げられる。そ
のようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のKl
otho様遺伝子のmRNAの少なくとも一部に相補的な塩基配
列を有するポリヌクレオチドであり、当該mRNAにハイブ
リダイズすることによって、当該Klotho様遺伝子の発現
を調節又は制御することができる。前記アンチセンスポ
リヌクレオチドは、本発明のKlotho様タンパク質の発現
の調節又は制御以外にも、本発明のKlotho様遺伝子が関
連する疾患の治療又は診断に有用である。

【００３４】前記アンチセンスポリヌクレオチドは、2-
デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボ
ヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌク
レオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドで
あるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌ
クレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市
販のペプチド核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）
又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（ただし、
該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペア
リングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチド
を含有する）等が挙げられる。それらは、二本鎖DNA、
一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、さらにDNAとRNAと
のハイブリッドであり得、さらに非修飾ポリヌクレオチ
ド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の
修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識
のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたも
の、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した
もの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非
荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持
つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持
つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアー
ゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチ
ド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカ
ライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インター
カレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンな
ど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射
活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有す
るもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合
を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であり
得る。

【００３５】本発明のアンチセンスポリヌクレチドは、
リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与
されたり、特定の化合物や修飾基を結合させた形態で与
えられることができうる。具体的には、アンチセンスポ
リヌクレオチドに結合させる物質としては、アンチセン
スポリヌクレオチドがDNAである場合、のリン酸基骨格
の電荷を中和するように働くポリリジン等のポリカチオ
ン体、アンチセンスポリヌクレオチと細胞膜との相互作
用を高め、細胞内へのアンチセンスポリヌクレオチの取
込みを増大させるホスホリッピドやコレステロール等の
粗水性物質、ヌクレアーゼによるアンチセンスポリヌク
レオチドの分解を阻止するポリエチレングリコール、テ
トラエチレングリコール等のグリコール化合物が挙げら
れるが、それに限定されるものではない。

【００３６】なお、本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チドの、Klotho様遺伝子の発現阻害活性は、本発明の形
質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あ
るいは本発明のKlotho様タンパク質の生体内や生体外の
翻訳系を用いて調べることができる。

【００３７】７． 本発明のKlotho様タンパク質に対す
る抗体 本発明の抗体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と
同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むKlotho
様タンパク質又はその塩、あるいは該Klotho様タンパク
質の部分アミノ酸配列を含むペプチド又はその塩に対す
る抗体である。本発明の抗体は、本発明のKlotho様タン
パク質又はその部分ペプチドを認識し得る抗体であれ
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れで
あってもよい。本発明の抗体を用いることにより、血
液、臓器の一部、細胞等のサンプルでの本発明のKlotho
様タンパク質の検出、定量を行うことができる。好適な
手法としてはマイクロタイタープレートを用いるELISA
法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法などが挙げら
れ、さらに病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用
できる。よって、本抗体は本発明のKlotho様タンパク質
発現の低下に伴う早期老化症や老化に関連する種々の疾
患の診断に有用である。本発明の抗体は、本発明のKlot
ho様タンパク質又はその部分ペプチド等を抗原として用
い、当該技術分野で公知の抗体又は抗血清の製造法に従
って製造することができる。

【００３８】(1) モノクローナル抗体の作製 (i) モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のKlotho様タンパク質又はその部分ペプチド等
は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位
にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。
投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイント
アジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し
てもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜10
回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例え
ば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラッ
ト、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウス及びラットが
好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作
製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マ
ウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２
〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれ
る抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製すること
ができる。

【００３９】抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記
の標識したKlotho様タンパク質又はその部分ペプチド等
と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の
活性を測定することにより行なうことができる。融合操
作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方
法[Nature, 256, 495(1975)]に従い実施することができ
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（PEG）やセンダイウィルスなどがあげられるが、
好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例
えば、NS-1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が
好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜20：
１程度であり、PEG（好ましくは、PEG1000〜PEG6000）
が10〜80％程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好まし
くは約30℃〜37℃で約１〜10分間インキュベートするこ
とにより効率よく細胞融合を実施できる。

【００４０】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着さ
せた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培
養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した
抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマ
ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクロ
ーナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又は
プロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上
清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したKlotho様
タンパク質又はその部分ペプチドを加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられ
る。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそ
れに準じる方法に従って行なうことができるが、通常は
HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選
別及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜20％、好ましくは10〜20％の牛胎児血清を含むRPMI
1640培地、１〜10％の牛胎児血清を含むGIT培地（和光
純薬工業（株））又はハイブリドーマ培養用無血清培地
（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができ
る。培養温度は、通常20℃〜40℃、好ましくは約３７℃
である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１
週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行
なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。

【００４１】（ii） モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
（例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲル
ろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なう
ことができる。

【００４２】(2) ポリクローナル抗体の作製 本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいは
それに準じる方法に従って製造することができる。例え
ば、抗原とキャリアータンパク質との複合体をつくり、
上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に
免疫を行ない、該免疫動物から本発明のKlotho様タンパ
ク質又はその部分ペプチドに対する抗体含有物を採取し
て、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。哺
乳動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータ
ンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種
類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアー
に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良く
できれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させても
よいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロ
ブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重
量比でハプテン１に対し、約0.1〜20、好ましくは約１
〜５の割合でカップルさせる方法が用いられる。

【００４３】また、ハプテンとキャリアーのカップリン
グには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタ
ルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステ
ル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エス
テル試薬等が用いられる。縮合生成物は、哺乳動物に対
して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約
２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜10回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。

【００４４】８． 本発明の医療その他への応用 本発明のKlotho様タンパク質の全長又は部分断片を生体
に投与することにより老化の抑制が可能である。従って
老化の進行に密接に関連して生ずる種々の疾患、例えば
動脈硬化、高血圧、骨粗鬆症等の治療薬、予防薬として
有用である。また老化の抑制に基づく寿命の延長の効果
にも有用である。

【００４５】また、本発明のKlotho様遺伝子（老化抑制
遺伝子）をレトロウィルス、アデノウィルス等のウィル
スベクターやその他のベクターに組み込み、遺伝子治療
の方法により治療に用いることもできる。さらに、本発
明のKlotho様遺伝子あるいはオリゴヌクレオチドを用い
て、ノーザンハイブリダイゼーション法又はPCR法によ
り、Klotho様遺伝子の発現量を測定し、老化を診断する
とともに、Klotho様遺伝子あるいはその部分オリゴヌク
レオチドを老化抑制に利用することもできる。また、本
発明のKlotho様遺伝子の先天的な欠損により、老化が促
進され、各種疾患を生じやすくなった個体を、本発明の
Klotho様遺伝子あるいはその部分オリゴヌクレオチドを
用いてサザンブロットハイブリダイゼーションやPCR法
により検出し、検出された個体の核酸配列情報に基づい
て遺伝子診断を行うこともできる。さらにKlotho様遺伝
子あるいはその部分オリゴヌクレオチドは遺伝子研究用
試薬としても極めて有用である。

【００４６】さらに、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウ
マ、ニワトリ等の家畜に、本発明のKlotho様遺伝子又は
Klotho様タンパク質を投与するか、あるいは本発明のKl
otho様遺伝子を遺伝子治療的に適当なウイルス等のベク
ターを用いて個体で発現させることにより、家畜の寿命
を延長し、また老化を抑制することも本発明の好ましい
態様である。これにより長期に渡り状態の良い飼育と、
乳や卵や産子の長期に渡る採取が可能となる。もしくは
受精卵に本発明のKlotho様遺伝子を導入し、体中全ての
細胞の染色体にKlotho様遺伝子を挿入し発現させる、い
わゆるトランスジェニック動物を作製することにより、
同様の効果が期待でき、畜産分野でも育種の面から有用
性が高いと考えられる。また、本発明のKlotho様遺伝子
を含むベクターを用い胚性幹細胞（ＥＳ細胞）において
染色体上の老化抑制遺伝子を公知の相同組換えの手法[C
ell 51(3): 503(1987)等]により不活化又は任意の配列
と置換した変異クローンを作成することができる。

【００４７】このようにして作成した胚性幹細胞クロー
ンを用い、動物の受精卵の胚盤胞への注入キメラ法又は
集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常
細胞からなるキメラ個体を作成することができる。この
キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞
の老化抑制遺伝子に任意の変異を有する個体を得ること
ができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体
の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
このようにして動物個体において、本発明のKlotho様遺
伝子の任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば、
本発明のKlotho様遺伝子の翻訳領域中への塩基置換、欠
失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活
性を変化させることができる。また、その発現制御領域
への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織
特異性等を改変させることも可能である。

【００４８】さらにCre-loxP系との組合せにより、より
積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御すること
も可能である。このような例としては脳のある特定の領
域で発現されるプロモーターを利用して、その領域での
み目的遺伝子を欠失させた例［Cell 87(7): 1317(199
6)］やCreを発現するアデノウィルスを用いて、目的の
時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例[Scien
ce 278:5335 (1997)]が知られている。従って、本発明の
Klotho様遺伝子についてもこのように任意の時期や組織
で発現を制御できる。あるいは、任意の挿入、欠失、置
換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を
作成することが可能である。このような動物は任意の時
期、任意の程度又は任意の部位で、老化と老化に伴って
生ずる種々の疾患の症状を誘導することができる。従っ
て、老化やそれに関連した種々の疾患の治療や予防にお
いて極めて有用な動物モデルとなる。特に、その治療
薬、予防薬等の評価用モデルとして非常に有用である。

【００４９】本発明のKlotho様タンパク質は、本タンパ
ク質に特異的に結合するリガンドを探索し、決定するた
めの試薬として有用である。また、本発明のKlotho様タ
ンパク質と同定されたリガンドとを用いて、本発明のKl
otho様タンパク質とリガンドの特異的結合を阻害する化
合物の探索及び同定に用いることができる。さらには、
本発明のKlotho様タンパク質とそのリガンドとを利用
し、本発明のKlotho様タンパク質とリガンドが結合した
結果誘導される分子を探索、同定することができる。本
発明のKlotho様タンパク質のリガンド、本発明の本発明
のKlotho様タンパク質とそのリガンドとの特異的結合を
阻害する化合物、本発明のKlotho様タンパク質とリガン
ドとが結合した結果誘導される分子は、本発明のKlotho
様タンパク質による老化抑制機能を代替もしくは補助す
ると考えられ、これら分子を含む薬剤は早期老化症治療
薬、老化抑制薬等として有用である。さらに、早期老化
症治療薬、老化抑制薬として有用である本発明の本発明
のKlotho様タンパク質をコードする遺伝子の発現を増加
させる化合物（発現増強化合物）は、本発明のKlotho様
タンパク質同様、早期老化症の治療・予防、老化の抑制
等に有用である。

【００５０】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。 〔実施例１〕 本発明のKlotho様遺伝子のクローニング まず、遺伝子予測プログラムGENE SCANを用いて、公知
のヒトゲノム配列から広範囲に遺伝子候補、すなわち仮
想転写配列（VTS）をリスト化し、VTSデータベースを構
築した。次いで、VTSデータベース中の各VTSの中で、そ
の塩基配列がESTデータベースに登録されていない、す
なわちヒト細胞での発現が確認されていないVTSを検索
した。その結果、公知のいずれのESTのいずれとも配列
が異なる複数のVTSを見出した。次いで、常法に従い、
先に見出した各VTSに関し、実際に細胞中で発現してい
るか否かを調べた。その結果、前記VTSのうちいくつか
が実際にヒト細胞中で発現していることを確認した。発
現が確認されたVTSについて、遺伝子データベースに登
録されている公知の遺伝子とのホモロジー解析を行った
ところ、その中の１つがマウスのβ-Klotho遺伝子と類
似性を有していることを見出し、完全長cDNAクローニン
グを試みた。

【００５１】VTS配列が既に全長をカバーしていると思
われたので、オープンリーディングフレームの外側に以
下のようなプライマーを設定した。 g6vts68545-1f：5’-atcctcagtctcccagttcaa-3’（配列番号５） g6vts68545-1r：5’-ggaactgggatgaatttttaa-3’（配列番号６） このプライマーを用い、肝臓及び乳腺のRNA画分を鋳型
としてPCRを行なった。その結果、予想されたサイズの
増幅断片が得られた。予想サイズのバンドを切り出し
て、pGEM-T Easy Vectorにクローニングした。次いで、
コロニーPCRをして妥当なサイズのバンドが出たものに
つき、塩基配列を決定した。その結果、本遺伝子は、10
44個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしているこ
とが判明した。決定した塩基配列を配列番号１に示し
た。本遺伝子をKlotho様遺伝子と命名した。

【００５２】〔実施例２〕本発明のKlotho様遺伝子及び
タンパク質のコンピュータ解析 Klotho様遺伝子産物、全1044アミノ酸をクエリーとして
nrデータベースに対してBLAST検索を行った。その結
果、本発明のKlotho様タンパク質は、公知のヒトKlotho
タンパク質（配列番号７）とアミノ酸一致度は43％であ
った（図２及び図３に本発明のKlotho様タンパク質と公
知のヒトKlothoタンパク質ClustalWによるペアワイズア
ラインメントを示した）。一方、本発明のKlotho様タン
パク質は、マウスβ-Klothoタンパク質（配列番号８）
とアミノ酸一致度は79％であった（図４及び図５に本発
明のKlotho様タンパク質と公知のマウスβ-Klothoタン
パク質ClustalWによるペアワイズアラインメントを示
す）。

【００５３】次に本配列のモチーフ解析を行った。解析
結果を図６に示した。以下アミノ酸番号で示す。1番目
〜52番目アミノ酸はシグナルペプチド領域〔SignalP[CB
S(Center for Biological Sequence Analysis)]及びSig
cleave[EMBOSS(The EuropeanMolecular Biology Open S
oftware Suite)]のより解析した〕、77番目〜512番目ア
ミノ酸及び517番目〜971番目アミノ酸はそれぞれグリコ
シルヒドロラーゼファミリー1モチーフ領域（Pfamによ
り解析した）、996番目〜1018番目アミノ酸は膜貫通へ
リックス領域〔TMHMM(CBS)により解析した〕、241番
目、416番目、691番目及び887番目のアミノ酸はβ-グル
コシダーゼの活性中心を担う4つのE(Glu)に対応する
が、これらのうち、241番目アミノ酸及び691番目アミノ
酸は、マウスβ-Klothoタンパク質、ヒトKlothoタンパ
ク質及びマウスKlothoタンパク質と同様、Ｎ(Asn)、A(A
la)へおのおの置換されていた。これらのモチーフはす
べて4つのKlotho関連タンパク質で共通している。以上
より、本発明のKlotho様タンパク質はマウスβ-Klotho
タンパク質のヒトホモログと考えられる。

【００５４】〔実施例３〕 本発明のKlotho様遺伝子の
発現部位の確認 実施例１のプライマーを用い、RT-PCRによって発現部位
の確認を行なった。結果を図７に示した。図７から明ら
かなように、肝臓と乳腺で高い発現が見られた。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、新規なヒト由来Klotho様
の老化制御タンパク質、該タンパク質をコードするKlot
ho様の老化制御遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベク
ター、該組換えベクターを含む形質転換体及び該Klotho
様タンパク質の製造方法等が提供される。本発明は、老
化に関連する疾患の予防薬及び／又は治療薬の開発に有
用である。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PharmaDesign, Inc. <120> A Novel Klotho like Protein and Gene thereof. <130> PDP-0019 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3135) <400> 1 atg aag cca ggc tgt gcg gca gga tct cca ggg aat gaa tgg att ttc 48 Met Lys Pro Gly Cys Ala Ala Gly Ser Pro Gly Asn Glu Trp Ile Phe 1 5 10 15 ttc agc act gat gaa ata acc aca cgc tat agg aat aca atg tcc aac 96 Phe Ser Thr Asp Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Arg Asn Thr Met Ser Asn 20 25 30 ggg gga ttg caa aga tct gtc atc ctg tca gca ctt att ctg cta cga 144 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Arg 35 40 45 gct gtt act gga ttc tct gga gat gga aga gct ata tgg tct aaa aat 192 Ala Val Thr Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ile Trp Ser Lys Asn 50 55 60 cct aat ttt act ccg gta aat gaa agt cag ctg ttt ctc tat gac act 240 Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln Leu Phe Leu Tyr Asp Thr 65 70 75 80 ttc cct aaa aac ttt ttc tgg ggt att ggg act gga gca ttg caa gtg 288 Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Ile Gly Thr Gly Ala Leu Gln Val 85 90 95 gaa ggg agt tgg aag aag gat gga aaa gga cct tct ata tgg gat cat 336 Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile Trp Asp His 100 105 110 ttc atc cac aca cac ctt aaa aat gtc agc agc acg aat ggt tcc agt 384 Phe Ile His Thr His Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Asn Gly Ser Ser 115 120 125 gac agt tat att ttt ctg gaa aaa gac tta tca gcc ctg gat ttt ata 432 Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser Ala Leu Asp Phe Ile 130 135 140 gga gtt tct ttt tat caa ttt tca att tcc tgg cca agg ctt ttc ccc 480 Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Leu Phe Pro 145 150 155 160 gat gga ata gta aca gtt gcc aac gca aaa ggt ctg cag tac tac agt 528 Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Tyr Ser 165 170 175 act ctt ctg gac gct cta gtg ctt aga aac att gaa cct ata gtt act 576 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro Ile Val Thr 180 185 190 tta tac cac tgg gat ttg cct ttg gca cta caa gaa aaa tat ggg ggg 624 Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Gly 195 200 205 tgg aaa aat gat acc ata ata gat atc ttc aat gac tat gcc aca tac 672 Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr 210 215 220 tgt ttc cag atg ttt ggg gac cgt gtc aaa tat tgg att aca att cac 720 Cys Phe Gln Met Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile His 225 230 235 240 aac cca tat cta gtg gct tgg cat ggg tat ggg aca ggt atg cat gcc 768 Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr Gly Thr Gly Met His Ala 245 250 255 cct gga gag aag gga aat tta gca gct gtc tac act gtg gga cac aac 816 Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Ala Ala Val Tyr Thr Val Gly His Asn 260 265 270 ttg atc aag gct cac tcg aaa gtt tgg cat aac tac aac aca cat ttc 864 Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asn Thr His Phe 275 280 285 cgc cca cat cag aag ggt tgg tta tcg atc acg ttg gga tct cat tgg 912 Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Ser His Trp 290 295 300 atc gag cca aac cgg tcg gaa aac acg atg gat ata ttc aaa tgt caa 960 Ile Glu Pro Asn Arg Ser Glu Asn Thr Met Asp Ile Phe Lys Cys Gln 305 310 315 320 caa tcc atg gtt tct gtg ctt gga tgg ttt gcc aac cct atc cat ggg 1008 Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile His Gly 325 330 335 gat ggc gac tat cca gag ggg atg aga aag aag ttg ttc tcc gtt cta 1056 Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Arg Lys Lys Leu Phe Ser Val Leu 340 345 350 ccc att ttc tct gaa gca gag aag cat gag atg aga ggc aca gct gat 1104 Pro Ile Phe Ser Glu Ala Glu Lys His Glu Met Arg Gly Thr Ala Asp 355 360 365 ttc ttt gcc ttt tct ttt gga ccc aac aac ttc aag ccc cta aac acc 1152 Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Lys Pro Leu Asn Thr 370 375 380 atg gct aaa atg gga caa aat gtt tca ctt aat tta aga gaa gcg ctg 1200 Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg Glu Ala Leu 385 390 395 400 aac tgg att aaa ctg gaa tac aac aac cct cga atc ttg att gct gag 1248 Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asn Asn Pro Arg Ile Leu Ile Ala Glu 405 410 415 aat ggc tgg ttc aca gac agt cgt gtg aaa aca gaa gac acc acg gcc 1296 Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Arg Val Lys Thr Glu Asp Thr Thr Ala 420 425 430 atc tac atg atg aag aat ttc ctc agc cag gtg ctt caa gca ata agg 1344 Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln Val Leu Gln Ala Ile Arg 435 440 445 tta gat gaa ata cga gtg ttt ggt tat act gcc tgg tct ctc ctg gat 1392 Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Leu Asp 450 455 460 ggc ttt gaa tgg cag gat gct tac acc atc cgc cga gga tta ttt tat 1440 Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr 465 470 475 480 gtg gat ttt aac agt aaa cag aaa gag cgg aaa cct aag tct tca gca 1488 Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys Ser Ser Ala 485 490 495 cac tac tac aaa cag atc ata cga gaa aat ggt ttt tct tta aaa gag 1536 His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn Gly Phe Ser Leu Lys Glu 500 505 510 tcc acg cca gat gtg cag ggc cag ttt ccc tgt gac ttc tcc tgg ggt 1584 Ser Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly 515 520 525 gtc act gaa tct gtt ctt aag ccc gag tct gtg gct tcg tcc cca cag 1632 Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser Val Ala Ser Ser Pro Gln 530 535 540 ttc agc gat cct cat ctg tac gtg tgg aac gcc act ggc aac aga ctg 1680 Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Ala Thr Gly Asn Arg Leu 545 550 555 560 ttg cac cga gtg gaa ggg gtg agg ctg aaa aca cga ccc gct caa tgc 1728 Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro Ala Gln Cys 565 570 575 aca gat ttt gta aac atc aaa aaa caa ctt gag atg ttg gca aga atg 1776 Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu Glu Met Leu Ala Arg Met 580 585 590 aaa gtc acc cac tac cgg ttt gct ctg gat tgg gcc tcg gtc ctt ccc 1824 Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Trp Ala Ser Val Leu Pro 595 600 605 act ggc aac ctg tcc gcg gtg aac cga cag gcc ctg agg tac tac agg 1872 Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg 610 615 620 tgc gtg gtc agt gag ggg ctg aag ctt ggc atc tcc gcg atg gtc acc 1920 Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser Ala Met Val Thr 625 630 635 640 ctg tat tat ccg acc cac gcc cac cta ggc ctc ccc gag cct ctg ttg 1968 Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Leu 645 650 655 cat gcc gac ggg tgg ctg aac cca tcg acg gcc gag gcc ttc cag gcc 2016 His Ala Asp Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr Ala Glu Ala Phe Gln Ala 660 665 670 tac gct ggg ctg tgc ttc cag gag ctg ggg gac ctg gtg aag ctc tgg 2064 Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp 675 680 685 atc acc atc aac gag cct aac cgg cta agt gac atc tac aac cgc tct 2112 Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Ile Tyr Asn Arg Ser 690 695 700 ggc aac gac acc tac ggg gcg gcg cac aac ctg ctg gtg gcc cac gcc 2160 Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn Leu Leu Val Ala His Ala 705 710 715 720 ctg gcc tgg cgc ctc tac gac cgg cag ttc agg ccc tca cag cgc ggg 2208 Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Arg Gln Phe Arg Pro Ser Gln Arg Gly 725 730 735 gcc gtg tcg ctg tcg ctg cac gcg gac tgg gcg gaa ccc gcc aac ccc 2256 Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro 740 745 750 tat gct gac tcg cac tgg agg gcg gcc gag cgc ttc ctg cag ttc gag 2304 Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu 755 760 765 atc gcc tgg ttc gcc gag ccg ctc ttc aag acc ggg gac tac ccc gcg 2352 Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ala 770 775 780 gcc atg agg gaa tac att gcc tcc aag cac cga cgg ggg ctt tcc agc 2400 Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His Arg Arg Gly Leu Ser Ser 785 790 795 800 tcg gcc ctg ccg cgc ctc acc gag gcc gaa agg agg ctg ctc aag ggc 2448 Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu Leu Lys Gly 805 810 815 acg gtc gac ttc tgc gcg ctc aac cac ttc acc act agg ttc gtg atg 2496 Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Met 820 825 830 cac gag cag ctg gcc ggc agc cgc tac gac tcg gac agg gac atc cag 2544 His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ser Asp Arg Asp Ile Gln 835 840 845 ttt ctg cag gac atc acc cgc ctg agc tcc ccc acg cgc ctg gct gtg 2592 Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val 850 855 860 att ccc tgg ggg gtg cgc aag ctg ctg cgg tgg gtc cgg agg aac tac 2640 Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr 865 870 875 880 ggc gac atg gac att tac atc acc gcc agt ggc atc gac gac cag gct 2688 Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser Gly Ile Asp Asp Gln Ala 885 890 895 ctg gag gat gac cgg ctc cgg aag tac tac cta ggg aag tac ctt cag 2736 Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys Tyr Leu Gln 900 905 910 gag gtg ctg aaa gca tac ctg att gat aaa gtc aga atc aaa ggc tat 2784 Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Arg Ile Lys Gly Tyr 915 920 925 tat gca ttc aaa ctg gct gaa gag aaa tct aaa ccc aga ttt gga ttc 2832 Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe 930 935 940 ttc aca tct gat ttt aaa gct aaa tcc tca ata caa ttt tac aac aaa 2880 Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile Gln Phe Tyr Asn Lys 945 950 955 960 gtg atc agc agc agg ggc ttc cct ttt gag aac agt agt tct aga tgc 2928 Val Ile Ser Ser Arg Gly Phe Pro Phe Glu Asn Ser Ser Ser Arg Cys 965 970 975 agt cag acc caa gaa aat aca gag tgc act gtc tgc tta ttc ctt gtg 2976 Ser Gln Thr Gln Glu Asn Thr Glu Cys Thr Val Cys Leu Phe Leu Val 980 985 990 cag aag aaa cca ctg ata ttc ctg ggt tgt tgc ttc ttc tcc acc ctg 3024 Gln Lys Lys Pro Leu Ile Phe Leu Gly Cys Cys Phe Phe Ser Thr Leu 995 1000 1005 gtt cta ctc tta tca att gcc att ttt caa agg cag aag aga aga aag 3072 Val Leu Leu Leu Ser Ile Ala Ile Phe Gln Arg Gln Lys Arg Arg Lys 1010 1015 1020 ttt tgg aaa gca aaa aac tta caa cac ata cca tta aag aaa ggc aag 3120 Phe Trp Lys Ala Lys Asn Leu Gln His Ile Pro Leu Lys Lys Gly Lys 1025 1030 1035 1040 aga gtt gtt agc taa 3135 Arg Val Val Ser 1045 <210> 2 <211> 1044 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Pro Gly Cys Ala Ala Gly Ser Pro Gly Asn Glu Trp Ile Phe 1 5 10 15 Phe Ser Thr Asp Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Arg Asn Thr Met Ser Asn 20 25 30 Gly Gly Leu Gln Arg Ser Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Arg 35 40 45 Ala Val Thr Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ile Trp Ser Lys Asn 50 55 60 Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln Leu Phe Leu Tyr Asp Thr 65 70 75 80 Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Ile Gly Thr Gly Ala Leu Gln Val 85 90 95 Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile Trp Asp His 100 105 110 Phe Ile His Thr His Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Asn Gly Ser Ser 115 120 125 Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser Ala Leu Asp Phe Ile 130 135 140 Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Leu Phe Pro 145 150 155 160 Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Tyr Ser 165 170 175 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro Ile Val Thr 180 185 190 Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Gly 195 200 205 Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr 210 215 220 Cys Phe Gln Met Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile His 225 230 235 240 Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr Gly Thr Gly Met His Ala 245 250 255 Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Ala Ala Val Tyr Thr Val Gly His Asn 260 265 270 Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asn Thr His Phe 275 280 285 Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Ser His Trp 290 295 300 Ile Glu Pro Asn Arg Ser Glu Asn Thr Met Asp Ile Phe Lys Cys Gln 305 310 315 320 Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile His Gly 325 330 335 Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Arg Lys Lys Leu Phe Ser Val Leu 340 345 350 Pro Ile Phe Ser Glu Ala Glu Lys His Glu Met Arg Gly Thr Ala Asp 355 360 365 Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Lys Pro Leu Asn Thr 370 375 380 Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg Glu Ala Leu 385 390 395 400 Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asn Asn Pro Arg Ile Leu Ile Ala Glu 405 410 415 Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Arg Val Lys Thr Glu Asp Thr Thr Ala 420 425 430 Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln Val Leu Gln Ala Ile Arg 435 440 445 Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Leu Asp 450 455 460 Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr 465 470 475 480 Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys Ser Ser Ala 485 490 495 His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn Gly Phe Ser Leu Lys Glu 500 505 510 Ser Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly 515 520 525 Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser Val Ala Ser Ser Pro Gln 530 535 540 Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Ala Thr Gly Asn Arg Leu 545 550 555 560 Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro Ala Gln Cys 565 570 575 Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu Glu Met Leu Ala Arg Met 580 585 590 Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Trp Ala Ser Val Leu Pro 595 600 605 Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg 610 615 620 Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser Ala Met Val Thr 625 630 635 640 Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Leu 645 650 655 His Ala Asp Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr Ala Glu Ala Phe Gln Ala 660 665 670 Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp 675 680 685 Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Ile Tyr Asn Arg Ser 690 695 700 Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn Leu Leu Val Ala His Ala 705 710 715 720 Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Arg Gln Phe Arg Pro Ser Gln Arg Gly 725 730 735 Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro 740 745 750 Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu 755 760 765 Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ala 770 775 780 Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His Arg Arg Gly Leu Ser Ser 785 790 795 800 Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu Leu Lys Gly 805 810 815 Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Met 820 825 830 His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ser Asp Arg Asp Ile Gln 835 840 845 Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val 850 855 860 Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr 865 870 875 880 Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser Gly Ile Asp Asp Gln Ala 885 890 895 Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys Tyr Leu Gln 900 905 910 Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Arg Ile Lys Gly Tyr 915 920 925 Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe 930 935 940 Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile Gln Phe Tyr Asn Lys 945 950 955 960 Val Ile Ser Ser Arg Gly Phe Pro Phe Glu Asn Ser Ser Ser Arg Cys 965 970 975 Ser Gln Thr Gln Glu Asn Thr Glu Cys Thr Val Cys Leu Phe Leu Val 980 985 990 Gln Lys Lys Pro Leu Ile Phe Leu Gly Cys Cys Phe Phe Ser Thr Leu 995 1000 1005 Val Leu Leu Leu Ser Ile Ala Ile Phe Gln Arg Gln Lys Arg Arg Lys 1010 1015 1020 Phe Trp Lys Ala Lys Asn Leu Gln His Ile Pro Leu Lys Lys Gly Lys 1025 1030 1035 1040 Arg Val Val Ser <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 3 atgaagccag gctgtgcggc aggat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 4 ttagctaaca actctcttgc ctttc 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 atcctcagtc tcccagttca a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 ggaactggga tgaattttta a 21 <210> 7 <211> 1012 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro 35 40 45 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly 50 55 60 Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp 65 70 75 80 Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His 85 90 95 Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly 100 105 110 Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro 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Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu 530 535 540 Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val 545 550 555 560 Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val Thr His 580 585 590 Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln 595 600 605 Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser 610 615 620 Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro 625 630 635 640 Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala 645 650 655 Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu 660 665 670 Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn 675 680 685 Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu 690 695 700 Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His 705 710 715 720 Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu 725 730 735 Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val 740 745 750 Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly 755 760 765 Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe 770 775 780 Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr 785 790 795 800 Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser 805 810 815 Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu 820 825 830 Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val 835 840 845 Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly 850 855 860 Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His 865 870 875 880 Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn 885 890 895 Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr 900 905 910 Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr 915 920 925 Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr 930 935 940 Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu 945 950 955 960 Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe 965 970 975 His Thr Arg Lys Ser Leu Leu Ala Phe Ile Ala Phe Leu Phe Phe Ala 980 985 990 Ser Ile Ile Ser Leu Ser Leu Ile Phe Tyr Tyr Ser Lys Lys Gly Arg 995 1000 1005 Arg Ser Tyr Lys 1010 <210> 8 <211> 1043 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Lys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ser Pro Gly Asn Glu Trp Ile Phe 1 5 10 15 Phe Ser Ser Asp Glu Arg Asn Thr Arg Ser Arg Lys Thr Met Ser Asn 20 25 30 Arg Ala Leu Gln Arg Ser Ala Val Leu Ser Ala Phe Val Leu Leu Arg 35 40 45 Ala Val Thr Gly Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ala Ile Trp Asp Lys Lys 50 55 60 Gln Tyr Val Ser Pro Val Asn Pro Ser Gln Leu Phe Leu Tyr Asp Thr 65 70 75 80 Phe Pro Lys Asn Phe Ser Trp Gly Val Gly Thr Gly Ala Phe Gln Val 85 90 95 Glu Gly Ser Trp Lys Thr Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Arg 100 105 110 Tyr Val Tyr Ser His Leu Arg Gly Val Asn Gly Thr Asp Arg Ser Thr 115 120 125 Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Leu Phe Pro 145 150 155 160 Asn Gly Thr Val Ala Ala Val Asn Ala Gln Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg 165 170 175 Ala Leu Leu Asp Ser Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro Ile Val Thr 180 185 190 Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Thr Leu Gln Glu Glu Tyr Gly Gly 195 200 205 Trp Lys Asn Ala Thr Met Ile Asp Leu Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr 210 215 220 Cys Phe Gln Thr Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile His 225 230 235 240 Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Phe Gly Thr Gly Met His Ala 245 250 255 Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Thr Ala Val Tyr Thr Val Gly His Asn 260 265 270 Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asp Lys Asn Phe 275 280 285 Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Ser His Trp 290 295 300 Ile Glu Pro Asn Arg Thr Asp Asn Met Glu Asp Val Ile Asn Cys Gln 305 310 315 320 His Ser Met Ser Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile His Gly 325 330 335 Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Phe Met Lys Thr Gly Ala Met Ile Pro Glu 340 345 350 Phe Ser Glu Ala Glu Lys Glu Glu Val Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe 355 360 365 Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Arg Pro Ser Asn Thr Val Val 370 375 380 Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg Gln Val Leu Asn Trp 385 390 395 400 Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Asp Pro Gln Ile Leu Ile Ser Glu Asn Gly 405 410 415 Trp Phe Thr Asp Ser Tyr Ile Lys Thr Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr 420 425 430 Met Met Lys Asn Phe Leu Asn Gln Val Leu Gln Ala Ile Lys Phe Asp 435 440 445 Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Thr Leu Leu Asp Gly Phe 450 455 460 Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp 465 470 475 480 Phe Asn Ser Glu Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr 485 490 495 Tyr Lys Gln Ile Ile Gln Asp Asn Gly Phe Pro Leu Lys Glu Ser Thr 500 505 510 Pro Asp Met Lys Gly Arg Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr 515 520 525 Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Phe Thr Val Ser Ser Pro Gln Phe Thr 530 535 540 Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Val Thr Gly Asn Arg Leu Leu Tyr 545 550 555 560 Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro Ser Gln Cys Thr Asp 565 570 575 Tyr Val Ser Ile Lys Lys Arg Val Glu Met Leu Ala Lys Met Lys Val 580 585 590 Thr His Tyr Gln Phe Ala Leu Asp Trp Thr Ser Ile Leu Pro Thr Gly 595 600 605 Asn Leu Ser Lys Val Asn Arg Gln Val Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val 610 615 620 Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Val Phe Pro Met Val Thr Leu Tyr 625 630 635 640 His Pro Thr His Ser His Leu Gly Leu Pro Leu Pro Leu Leu Ser Ser 645 650 655 Gly Gly Trp Leu Asn Met Asn Thr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Tyr Ala 660 665 670 Glu Leu Cys Phe Arg Glu Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr 675 680 685 Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Met Tyr Asn Arg Thr Ser Asn 690 695 700 Asp Thr Tyr Arg Ala Ala His Asn Leu Met Ile Ala His Ala Gln Val 705 710 715 720 Trp His Leu Tyr Asp Arg Gln Tyr Arg Pro Val Gln His Gly Ala Val 725 730 735 Ser Leu Ser Leu His Cys Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro Phe Val 740 745 750 Asp Ser His Trp Lys Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala 755 760 765 Trp Phe Ala Asp Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ser Val Met 770 775 780 Lys Glu Tyr Ile Ala Ser Lys Asn Gln Arg Gly Leu Ser Ser Ser Val 785 790 795 800 Leu Pro Arg Phe Thr Ala Lys Glu Ser Arg Leu Val Lys Gly Thr Val 805 810 815 Asp Phe Tyr Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Ile His Lys 820 825 830 Gln Leu Asn Thr Asn Arg Ser Val Ala Asp Arg Asp Val Gln Phe Leu 835 840 845 Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro 850 855 860 Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Ala Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp 865 870 875 880 Arg Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Asn Gly Ile Asp Asp Leu Ala Leu Glu 885 890 895 Asp Asp Gln Ile Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu Lys Tyr Val Gln Glu Ala 900 905 910 Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Lys Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala 915 920 925 Phe Lys Leu Thr Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr 930 935 940 Ser Asp Phe Arg Ala Lys Ser Ser Val Gln Phe Tyr Ser Lys Leu Ile 945 950 955 960 Ser Ser Ser Gly Leu Pro Ala Glu Asn Arg Ser Pro Ala Cys Gly Gln 965 970 975 Pro Ala Glu Asp Thr Asp Cys Thr Ile Cys Ser Phe Leu Val Glu Lys 980 985 990 Lys Pro Leu Ile Phe Phe Gly Cys Cys Phe Ile Ser Thr Leu Ala Val 995 1000 1005 Leu Leu Ser Ile Thr Val Phe His His Gln Lys Arg Arg Lys Phe Gln 1010 1015 1020 Lys Ala Arg Asn Leu Gln Asn Ile Pro Leu Lys Lys Gly His Ser Arg 1025 1030 1035 1040 Val Phe Ser

【００５７】

【配列表フリーテキスト】

配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】VTSアプローチによる遺伝子クローニングの概
要を示した図である。

【図２】ヒトKlothoタンパク質と本発明のKlotho様タン
パク質のアライメントを示した図である。

【図３】ヒトKlothoタンパク質と本発明のKlotho様タン
パク質のアライメントを示した図である。

【図４】マウスβKlothoタンパク質と本発明のKlotho様
タンパク質のアライメントを示した図である。

【図５】マウスβKlothoタンパク質と本発明のKlotho様
タンパク質のアライメントを示した図である。

【図６】４本のKlotho関連タンパク質のモチーフ比較を
示した図である。

【図７】各臓器由来のRNAを鋳型としてRT-PCRにより本
発明のKlotho様遺伝子を増幅した結果を示した写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA11 GA16 HA01 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 CA18 CA53 DC50 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZB22 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA23

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２で表わされるアミノ酸配列と
   同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを
   特徴とする老化制御タンパク質又はその塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載の老化制御タンパク質の部
   分アミノ酸配列を含むことを特徴とするペプチド又はそ
   の塩。
3. 【請求項３】 請求項１記載の老化制御タンパク質又は
   その部分ペプチドをコードする塩基配列を含むことを特
   徴とするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項１記載の老化制御タンパク質をコ
   ードする塩基配列が、配列番号１で表される塩基配列で
   あることを特徴とする請求項３記載のポリヌクレオチ
   ド。
5. 【請求項５】 ポリヌクレオチドがDNA又はRNAであるこ
   とを特徴とする請求項３又は４記載のポリヌクレオチ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれかに記載のポリヌ
   クレオチドを含有する組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターで形質転
   換させた形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培地に培養
   し、得られる培養物から請求項１記載のタンパク質又は
   その塩、あるいは請求項２記載のペプチド又はその塩を
   採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質又
   はその塩あるいは請求項２記載のペプチド又はその塩の
   製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載のタンパク質又はその塩あ
   るいは請求項２記載のペプチド又はその塩に対する抗
   体。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のタンパク質又はその塩
    あるいは請求項２記載のペプチド又はその塩を有効成分
    として含有する早期老化症治療薬又は老化抑制薬。
11. 【請求項１１】 請求項１記載のタンパク質又はその塩
    あるいは請求項２記載のペプチド又はその塩を有効成分
    として含有する、血管内皮機能劣化による病態の改善又
    は予防薬。
12. 【請求項１２】 血管内皮機能劣化による病態が、高血
    圧又は動脈硬化である請求項１１記載の血管内皮機能劣
    化による病態の改善又は予防薬。
13. 【請求項１３】 請求項３〜５のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチドを含有する、早期老化症治療用の遺伝子治
    療用ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項３〜５のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチドを含有する、血管内皮機能劣化による病態
    の改善又は予防用の遺伝子治療用ベクター。
15. 【請求項１５】 血管内皮機能劣化による病態が、高血
    圧又は動脈硬化である請求項１４記載の血管内皮機能劣
    化による病態の改善又は予防用の遺伝子治療用ベクタ
    ー。