CN107177002B - 一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体及其用途 - Google Patents
一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能与人β‑Klotho受体特异性结合的抗体及其用途。这些抗体能与成纤维细胞生长因子21的辅助受体β‑Klotho特异性结合并激活人β‑Klotho/FGFR1c复合受体，可以应用于治疗或预防哺乳动物中的II型糖尿病以及相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体及其用途。
背景技术
成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是成纤维细胞生长因子家族(FGF19，FGF21和FGF23)的一名新成员，属于分泌型蛋白质(Itoh et al.,(2004)Trend Genet.20:563-69)。FGFs与存在于细胞表面的生长因子受体(FGFRs)结合，将信号传递到细胞内。FGFRs有4种亚型(FGFRl-4)，属跨膜蛋白，主要由三个部分组成：即胞外区、跨膜区和胞内区，包含多个可变剪切体，如FGFR1c，FGFR2c，FGFR3c和FGFR4。与多数生长因子受体一样，FGFRs都是酪氨酸激酶受体，在与配体结合后发生二聚化，从而激活酪氨酸激酶活性，导致下游信号活化，包括MAPKs、RAF1、AKT1及STATs(Kharitonenkov et at.,(2008)BioDrugs 22:37-44)。FGF21不能与肝素特异性结合，在肝素的参与下，也不能与可溶性FGFRs结合，它需要另外一种跨膜蛋白β-Klotho的参与，才能稳定地结合FGFR1c，从而激活FGF21的信号转导。在对小鼠3T3-L1细胞(表面主要表达FGFRlc，低表达FGFR2c)的研究表明，β-Klotho作为支架蛋白，先与FGFR1c形成复合物，通过变构活化后，促进FGF21与FGFR1c的结合，引起FGFR受体二聚化，激活下游信号通路(Ogawa et al.,(2007)PNAS104:7432-7)。
过表达FGF21的转基因小鼠表现为低胰岛素、低胆固醇及低甘油三酯，胰岛素敏感性提高，阻止高脂食物引起的体重增加(Kharitonenkov et al.,(2005)J Clin Invest115:1627-35)；相反，FGF21基因敲除小鼠表现为体重增加、糖耐量受损。这些数据表明，FGF21通过作用于脂肪组织及胰腺来改善血糖、三酰甘油和胰高血糖素，改善胰岛β细胞的功能，从而预防饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗。FGF21也被证明可作为一种主要的内源性调控因子，在禁食和酮症时起着关键的调控作用。更为重要的是，通过给予FGF21，不会导致低血糖症。因此，作为一种不依赖胰岛素的血糖调节因子，FGF21目前已被看作治疗II型糖尿病的潜在的新型治疗手段。
尽管目前有很多通过基因工程的方法改造天然的FGF21，使之成为新的治疗药物的例子(Adams et al.,(2013)Plos One 8(6):e65763)，但是，改造后的FGF21在有些药学特性还远远不能满足要求，比如药代动力学、稳定性、溶解性等等。而另外一种可行的办法是产生全新的、具有类似FGF21活性的蛋白质，比如抗体。
β-Klotho已被证明是FGF19和FGF21所必需的共受体，它特异性地表达在肝脏、胰腺及脂肪组织中(Ogawa et al.,(2007)PNAS 104:7432-7)。相对于FGFRs广泛表达于各种组织，加上单克隆抗体具有很好的结合特异性，给予抗β-Klotho抗体可以有效地降低药物的毒副作用。本发明提供了一类新的，可以和β-Klotho跨膜蛋白特异性结合的抗体，通过蛋白与蛋白之间的相互作用，模拟FGF21的作用，激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体，引起细胞内Erk的磷酸化，以及制备和应用这类生物大分子的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体，能与成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)的辅助受体β-Klotho特异性结合，可以激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体的功能，本发明抗体可以应用于治疗或预防哺乳动物中的II型糖尿病以及相关疾病。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
a.选自以下序列之一的轻链CDR3序列:
与选自L1-L3的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；
优选的，与选自L1-L3的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；更优选，与选自L1-L3的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34其中之一相差总共不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列。
b.选自以下序列之一的重链CDR3序列：
与选自H1-H3的重链CDR3序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；
优选的，与选自H1-H3的重链CDR3序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；
优选的，与选自H1-H3的重链CDR3序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；
更优选，与选自H1-H3的重链CDR3序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29其中之一相差总共不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列。
c.方案a的轻链CDR3序列和方案b的重链CDR3序列。
作为优选，所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：
a.选自以下之一的轻链CDR1序列：
与选自L1-L3的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；
优选的，与选自L1-L3的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；
更优选，与选自L1-L3的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32其中之一相差不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列。
b.选自以下之一的轻链CDR2序列：
与选自L1-L3的轻链CDR2序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列；
优选的，与选自L1-L3的轻链CDR2序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33其中之一相差不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列。
c.选自以下之一的重链CDR1序列：
与选自H1-H3的重链CDR1序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR1序列；
优选的，与选自H1-H3的重链CDR1序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27其中之一相差不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR1序列。
d.选自以下之一的重链CDR2序列：
与选自H1-H3的重链CDR2序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:28其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR2序列；
优选的，与选自H1-H3的重链CDR2序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:28其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR2序列；更优选，与选自H1-H3的重链CDR2序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:28其中之一相差不超过一个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR2序列。一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体，
所述抗体包含以下方案之一：
方案a：包含轻链CDR1序列、轻链CDR2序列、轻链CDR3序列中的一种或几种的轻链可变结构域，所述轻链CDR1序列选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32其中之一；所述轻链CDR2序列选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33其中之一；所述轻链CDR3序列选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34其中之一；
方案b：包含重链CDR1序列、重链CDR2序列、重链CDR3序列中的一种或几种的重链可变结构域，所述重链CDR1序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27其中之一；所述重链CDR2序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:28其中之一；所述重链CDR3序列选自SEQID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29其中之一；
方案c：方案a的轻链可变结构域和方案b的重链可变结构域的组合。
一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
方案a.选自以下选项之一的轻链可变结构域序列：
i.具有与选自L1-L3的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25、SEQID NO:35其中之一至少80％相同的氨基酸序列；
ii.具有与编码L1-L3的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
方案b.选自以下选项之一的重链可变结构域序列：
i.具有与H1-H3的重链可变结构域序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:30其中之一至少80％相同的氨基酸序列；
ii.具有与编码H1-H3的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26其中之一至少80％相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
方案c.方案a的轻链可变结构域序列和方案b的重链可变结构域序列的组合。
作为优选，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
方案a.选自L1-L3的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:35其中之一的轻链可变结构域序列；
方案b.选自H1-H3的重链可变结构域序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:30其中之一的重链可变结构域序列；
方案c.方案a的轻链可变结构域序列和方案b的重链可变结构域序列的组合。
作为优选，方案c中方案a的轻链可变结构域序列与方案b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一：L1H1、L2H2、L3H3。
作为优选，所述抗体为鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体中的一种。
作为优选，当所述抗体与人β-Klotho受体结合时：
a.以与成纤维细胞生长因子21(FGF21)基本相同的Kd与人β-Klotho受体结合；
b.以与FGF21基本相同的EC50激活人β-Klotho/FGFR1c受体复合物；
c.在人β-Klotho受体上与FGF21没有交叉竞争结合。
作为优选，所述抗体为鼠源抗体或人源化抗体时，当其与人β-Klotho受体结合时：
a.以≤200nM的EC50值增强人β-Klotho信号传导；
b.在II型糖尿病大鼠模型或II型糖尿病小鼠模型中改善II型糖尿病；
c.a和b两者。
一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的本发明的抗体。
作为优选，所述抗体选自鼠源抗体或人源化抗体。
一种分离的核酸，其包含编码本发明的抗体的轻链可变结构域、重链可变结构域或轻链可变结构域和重链可变结构域两者的多聚核苷酸序列。
作为优选，编码本发明的抗体的轻链可变结构域的多聚核苷酸序列选自SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31其中之一；
编码本发明的抗体的重链可变结构域的多聚核苷酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQID NO:17、SEQ ID NO:26其中之一。
一种重组表达载体，其包含本发明的核酸。
一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
一种生产能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体的方法，包括在允许表达所述抗体的条件下培养本发明的宿主细胞。
一种本发明的药用组合物在制备用于治疗II型糖尿病以及相关病症的药物中的用途。
本发明的有益效果是：
(a)本发明的单克隆抗体针对人β-Klotho受体有高亲和力和激活活性，在细胞水平可以明显激活β-Klotho/FGFR1c复合受体信号通路。
(b)本发明的单克隆抗体针对人β-Klotho受体，目前在国内外均无针对相同靶标的抗体专利或药物。
因此，本发明的高亲和力、高特异性的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
附图说明
图1显示了流式细胞术(FACS)检测杂交瘤细胞上清的anti-KLB(A-1，A-3)与人KLB的特异性结合结果。从左至右：灰色峰为阴性对照，虚线表示anti-KLB与CHO-DHFR的结合曲线，实线表示anti-KLB与CHO-DHFR-KLB的结合曲线。
图2显示了流式细胞术(FACS)检测重组表达的anti-KLB(A-1，A-3)与人KLB的特异性结合结果。从左至右：灰色峰为阴性对照，虚线表示anti-KLB与CHO-DHFR的结合曲线，实线表示anti-KLB与CHO-DHFR-KLB的结合曲线。
图3显示了报告基因实验检测重组表达的anti-KLB(A-1，A-2，A-3)与人KLB的浓度梯度激活曲线(EC50＝3.29nM，R2＝0.94)(A-1),(EC50＝5.89nM，R2＝0.95)(A-2)，(EC50＝33.90nM，R2＝0.97)(A-3)。
图4显示了重组表达的anti-KLB(A-1，A-2)在10nM的浓度下，均可引起细胞内Erk的磷酸化升高。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明涉及抗体例如可与人β-Klotho受体(KLB)特异性结合的抗体。这些包括与人KLB结合并激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体的抗体。在一个实施方案中提供了包括激活性抗体的可改善动物模型II型糖尿病的鼠源抗体。
本发明进一步提供可特异性结合至人β-Klotho受体的抗体相关的组合物、试剂盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与β-Klotho受体结合的多肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如编码全部或部分抗β-Klotho受体抗体、抗体片段或抗体衍生物的核酸。本发明进一步提供包含该类核酸的载体和质粒以及包含该类核酸和/或载体和质粒的细胞和细胞系。所提供方法包括，例如，制备、鉴定或分离与人KLB结合的抗体例如抗KLB抗体的方法，测定该抗体是否与KLB结合的方法、以及将与KLB结合的抗体给予动物模型的方法。
定义
使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序列的氨基端在左而它们的羧基端在右，单链核酸序列和双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸80至130，或由该位点的实际残基表示例如Lys80至Lys130。也可通过解释其与参比序列的差异描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。具体轻链和重链可变结构域的多聚核苷酸和多肽可表示为L1(“轻链可变结构域1”)，H1(“重链可变结构域1”)。包含轻链和重链的抗体可通过结合轻链的名称和重链可变结构域的名称表示。例如，“L1H1"表示包含L1轻链可变结构域和H1重链可变结构域的抗体。
除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
抗体
一方面，本发明提供与人β-Klotho受体特异性结合的抗体(例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变异体)。在一个实施方案中该抗体为鼠源抗体或其人源化抗体。
根据本发明的抗体包括与人β-Klotho受体结合并通过β-Klotho受体激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体介导信号传导的抗体。在一个实施方案中，该抗体的EC50值为200nM或更低。另一方面，该抗体与β-Klotho受体特异性结合，激活信号传导并显示出治疗性生物作用，例如改善动物模型的II型糖尿病。在一个实施方案中，该抗体为与β-Klotho受体特异性结合并通过人β-Klotho/FGFR1c复合受体激活信号传导的鼠源抗体。在另一实施方案中，该抗体为与β-Klotho体特异性结合、通过人β-Klotho/FGFR1c复合受体激活信号传导并可以改善II型糖尿病的鼠源抗体。
在一个实施方案中，该抗体包含与下表中A-1至A-3的CDR序列各相差5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。如本文所使用，与表1所示的CDR序列最多不超过例如四个氨基酸添加、瞽换和或缺失的CDR序列指与表1中的序列相比具有4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。
在另一个实施方案中，该抗体包含一个或多个CDR一致序列(consensussequences)。提供了轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2和CDR3的一致序列。
抗体A-1-A-3的轻链CDRs以及示例性抗体A-1-A-3的重链CDRs见表1。A-1至A-3对应于下文的Ll至L3以及下文的H1至H3。也显示了编码CDRs氨基酸序列的多聚核苷酸序列。
另一方面，本发明提供包含选自L1-L3的轻链可变区或选自H1-H3的重链可变区及其片段、衍生物、突变蛋白或变异体的抗体。可用名称“LxHy”表示该类抗体，其中“x”对应于轻链可变区并且“y”对应于重链可变区。例如，L2H1指具有包含如下文表2所示L2氨基酸序列的轻链可变区和包含H1氨基酸序列的重链可变区的抗体。本发明抗体包括例如包含选自组合L1H1、L2H2、L3H3的轻链和重链可变结构域的组合。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体或其人源化抗体。
表1：轻、重链可变区序列
表2提供了编码示例性KLB抗体的可变轻链和可变重链结构域的氨基酸序列的多聚核苷酸(DNA)序列。
表2：轻、重链可变区多聚核苷酸和氨基酸序列
本发明抗体的具体实施方案包含与一个或多个上文所列CDRs和/或FRs(骨架区)的氨基酸序列相同的一个或多个氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链FR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链FR4序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR3厚列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列重链FR4序列。
在另一个实施方案中，至少一个抗体的CDR3序列与来自A-1至A-3的CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，抗体的轻链CDR3序列与上述A-1至A-3的轻链CDR3序列的差异不得超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失并且抗体的重链CDR3序列与上文所述A-1至A-3的重链CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，抗体进一步包含1、2、3、4或5个CDR序列，各序列独自与A-1至A-3的CDR序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸差异。在另一个实施方案中，抗体包含上文所列轻链可变区的CDRs和重链可变区的CDRs。在另一实施方案中，抗体包含上文所述的1、2、3、4、5和/或6个一致CDR序列。在进一步的实施方案中，该抗体包含L1H1、L2H2、L3H3中任何之一的CDRs。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体。
在一个实施方案中，该抗体(例如抗体或抗体片段)包含轻链可变结构域，其包含与选自L1-L3的轻链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸差异的氨基酸序列，其中各该序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与选自L1-L3的轻链可变结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与下文所列L1-L3多聚核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含在中等条件下与编码选自L1-L3的轻链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在另一个实施方棠中，该轻链可变结构域包含在严格条件下与编码选自L1-L3的轻链可变结构域的多聚核苷酸的互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含重链可变结构域的抗体，该可变结构域包含选自H1-H3的重链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个残基存在差异的氨基酸序列，其中各该序列差异独立为一个氨基酸的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含与选自H1-H3的重链可变结构域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含在中等严格条件下与编码选自H1-H3的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，该重链可变结构域包含在严格条件下与编码选自H1-H3的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。
生产鼠单克隆抗体的可选择方法为将杂交瘤细胞注入同系基因小鼠的腹膜腔，例如经处理(例如姥鲛烷初次免疫)促进形成包含单克隆抗体的腹水的小鼠。可通过多种已确立的技术分离和纯化单克隆抗体。该类分离技术包括使用蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法和高子交换色谱法(参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in MolecularBiology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.，1992)。可使用基于抗体的特殊性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)筛选的适当配基通过亲和色谱法纯化单克隆抗体。固定化于固体载体的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链)抗体、抗独特型抗体以及TGF-p结合蛋白或其片段或变异体。
可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)的分子进化分离亲和性增加的抗体，例如对c-erbB-2亲和性增加的抗体，如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263:551所述。因此，该类技术可用于制备人β-Klotho受体的抗体。
例如可在检测是否存在β-Klotho受体的体外或体内测定法中使用针对人β-Klotho受体的抗体。
也可通过任何传统技术制备抗体。例如，可从天然表达这些抗体的细胞将其纯化(例如，可从生产抗体的杂交瘤将其纯化)或使用本领域任何已知的技术在重组表达系统中生产。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in BiologicalAnalyses,Kennet等编辑，Plenum Press(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。这在下文的核酸部分讨论。
可通过任何已知技术制备抗体并筛选期望性质。一些技术涉及分离编码相关抗体(例如，抗β-Klotho受体抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。该核酸可与另一相关核酸融合或经修饰(例如通过诱变或其它传统技术)以添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。
在另一方面本发明提供包含编码本发明多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。
本发明的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的(例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子)，引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的(例如，组织特异调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236：1237，其完整内容以参考形式并于本文)以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的(例如，原核和真核系统二者中的四环霉素反应(tet-responsive)启动子和/或链霉素反应启动子)。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
另一方面，本发明提供可引入本发明表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad,Sci.USA 77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)，和UV20(ATCC#CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC#CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利序列号6210924)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞例如293，293EBNA或MSR 293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，1985)。
可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记(例如抗生素抗性)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞(例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡)。
可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物抗β-Klotho受体抗体多肽，其基本不含污染性内源材料。
适应症
糖尿病尤其是II型糖尿病及其并发症已经成为全世界日益严重的问题。通常，该疾病由胰脏β细胞胰岛素生成受损引起。在II型糖尿病(此疾病最常见的形式)中，人们认为遗传和环境因素联合引起β细胞衰竭，使得在人体中引起胰岛素分泌和活性受损以及胰岛素抵抗。一般认为肥胖症是促使成人甚至儿童中II型糖尿病增加的病症。
人们还认为血脂异常，或者异常HDL(高密度脂蛋白)和LDL(低密度脂蛋白)均与II型糖尿病相关。II型糖尿病的特征为肌肉和其它器官不能响应正常循环浓度的胰岛素。随后胰脏β细胞分泌胰岛素增多，即高胰岛素血症的病症。最终β细胞无法再补偿，导致葡萄糖耐量降低、空腹葡萄糖浓度受损、慢性高血糖和组织损伤。此外，人们认为早发II型糖尿病与血脂异常，或者异常HDL(高密度脂蛋白)和LDL(低密度脂蛋白)有关。代谢综合症患者都表现血脂异常和高血糖症。
本发明提供抗原结合蛋白，尤其是可与人β-Klotho受体体内结合、降低动物模型血糖浓度的人类抗体。抗原结合蛋白还可改善葡萄糖耐量。在一个实施方案中，本发明提供具有体内效价的人源化抗体。对ob/ob小鼠单次注射抗体的作用可在注射后数天内降低血糖，为高血糖、II型糖尿病以及相关病症提供了有效、持久的治疗。单次注射抗体也可改善在下文所述食蟹猴上进行的葡萄糖耐量试验(GTT)中血样的葡萄糖清除率(改善葡萄糖耐量)。本发明的抗原结合蛋白，尤其是人类抗体可用于降低血液或血浆葡萄糖，改善葡萄糖耐量降低，改善空腹葡萄糖水平以及改善血脂异常。这样，本发明的抗原结合蛋白，尤其是人类抗体可用于治疗高血糖症、II型糖尿病、代谢综合症和包括血脂异常的其它相关症状。此外，已显示降低血糖可在某些情况下用于预防和治疗具体的癌症例如结肠癌，如Richardson等，Nature ClinPract Oncol 2:48-53(2005)；Giovannucci等，Gastroenterology 132:2208-2225(2007)；Krone等，Integrative Cancer Ther4:25-31(2005)；Chang等，Diabetologia 46:595-607(2003)；Jee等，Yonsei Med J 46:449-55(2005)所述。
本发明提供可与人β-Klotho受体特异性结合，改善动物模型II型糖尿病的抗体。可以明显改善动物模型的II型糖尿病的症状。
治疗方法
另一方面，治疗受试者的方法，包括给予治疗剂量的本发明提供的抗体。在一个实施方案中，抗体为鼠源抗体或人源化抗体。本文中，术语“受试者”指哺乳动物，包括人类，可与术语“患者”交替使用。鼠源抗体或其人源化抗体可用于治疗和控制患者体内II型糖尿病为特点的病症或症状。术语“治疗”包括减轻或预防至少一种症状或病症的其它方面，或者减轻疾病严重性，等等。本发明的抗体不需要产生完全治愈的效果，或根除疾病的所有症状或表现，即可构成有效治疗剂。如相关领域所公认，作为治疗剂的药物可减少给定疾病状态的严重程度，但不需消除疾病的所有表现即可被认为是有效的治疗剂。相似地，预防给药治疗不需在预防症状出现上完全有效即可构成有效预防剂。只减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重度，或通过提高另一治疗效果，或通过产生另一有效作用)，或者减少受试者中疾病发生或加重的可能性就已经足够。本发明的一个实施方案涉及包含以足以诱导反应具体病症严重性的指示剂高于基线水平的持续改善的量和时间给予患者抗体的方法。
给药剂量和频率可根据以下因素而改变：给药途径、所用具体抗体、所治疾病的性质和严重度、症状为急性还是慢性以及患者的体积和总体症状。可通过本领域熟知的方法确定适当剂量，例如在临床试验中包括剂量放大研究。
本发明抗体可在例如一段时间内按规律间隔给药一次或多次。在具体实施方案中，在至少一个月或更长时间给药一次给予鼠源抗体或人源化抗体，例如一个、两个或三个月或者甚至不确定。对于治疗慢性症状，长期治疗通常最有效。但是，对于治疗急性症状，短期给药例如从一周至六周就已足够。通常，给予人类抗体直至患者表现出所选体征或指示剂高于基线水平的医学相关改善度为止。
本发明方法和组合物的具体实施方案涉及使用例如抗体和一个或多个β-Klotho拮抗剂、两个或更多本发明抗体，或者本发明抗体和一个或更多其它β-Klotho拮抗剂。在进一步的实施方案中，单独或与其它用于治疗使患者痛苦的症状的药剂组合给予抗体。这些药剂的实例包括蛋白质以及非蛋白质药物。当联合给予多种药物时，如本领域所熟知其剂量应相应调整。“联合给药”组合疗法不限于同时给药，也包括在涉及给予患者至少一种其它治疗剂的疗程中至少给予一次抗原和蛋白的治疗方案。
另一方面，本发明提供治疗II型糖尿病及相关病症药用组合物，其包含本发明抗体与药学可接受辅料中的混合物，用于治疗II型糖尿病的相关病症。药剂制备方法如上所述。
具体实施例：
1、免疫用抗原细胞稳定株的构建
接种CHO-DHFR细胞(中科院细胞库)至6孔板中，培养24h后转染含V5-hKLB基因的质粒(市售)于6孔板中的细胞，转染前更换培养液，按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000的转染条件进行转染。48小时后，再换为含有10nM甲氨碟呤(Methotrexate，MTX)的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50％愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，最高至10uM浓度的MTX。构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用KLB蛋白N’-端V5标签抗体(FITC-anti-V5，Invitrogen)鉴定加压后的细胞群体，筛选后的CHO-DHFR-V5-hKLB细胞膜上hKLB有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得2株KLB高表达细胞稳定株。
2、抗体的制备
将在弗氏佐剂中乳化的CHO-DHFR-V5-hKLB全细胞，以2×106细胞/只的剂量皮下注射BALB/c小鼠(6-8周龄)。2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化免疫原，加强免疫小鼠，此后每周加强一次。通过剪尾的方式采血，离心分离血清，进行FACS检测血清效价。直至达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。收集生长状态处于对数生长期的SP2/0细胞，2000rpm，3min离心，沉淀用无血清培养至重悬，再次离心-重悬，计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0：脾脏细胞≥1:1，共“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的沉淀，逐滴加入1mL预温的PEG-1350(30s内滴完)，上下吹吸1分钟，缓慢加入30mL预热的无血清培养基以终止PEG的融合作用，1500rpm，5min离心，弹散细胞沉淀，加入融合培养基，按每孔20000个脾细胞及5000个饲养层细胞铺于96孔板中,每孔100uL。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)筛选，以除去非融合的细胞。10天后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。
3、全细胞ELISA筛选
将CHO-DHFR-V5-hKLB过表达hKLB细胞和不表达hKLB的CHO-DHFR空白细胞分别接种至96孔板，长至90％愈合度。除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100ul 100％甲醇，4℃固定10min。再加入100ul新鲜配制的0.6％H2O2-PBS，室温处理20min，用PBS缓冲液洗涤2遍。经过PBS-1％BSA封闭后，加入杂交瘤细胞上清，4℃孵育90min。多次洗涤后，每孔加入100ul稀释的GxM-HRP-Fc二抗(BD，50倍稀释)，37℃孵育0.5h。洗涤5次后,每孔加入100ul TMB显色底物，37℃反应15min，2M H2SO4终止，读取OD450值。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。选取分泌抗hKLB抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hKLB的细胞株。最后选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。
4、阳性杂交瘤细胞上清流式分析鉴定(FACS)
用含10mM EDTA的PBS消化、收集105个CHO-DHFR-V5-hKLB细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液(PBS，2％FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加200ul抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，加入1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(BD，200ul/孔)，室温避光孵育30min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。如1和图2所示，杂交瘤细胞上清和表达有KLB的CHO-DHFR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰有明显右移。
5、抗体基因的克隆及亚克隆
收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)(SEQ ID NO:36)，轻链逆转录引物为(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:37)和(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:38)。RT-PCR的反应条件为：25℃5min；50℃60min；70℃15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500ul，加入到超滤离心管(AmiconUltra-0.5)中，2000×g离心10min；弃滤液，再加500ul的0.1mM的TE，，2000×g离心10min；弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000×g离心10min，得到纯化后的cDNA；取10ul的纯化后的cDNA作为模板，加入4ul的5×tailing buffer(Promega)，4ul的dATP(1mM)和10U的末端转移酶(Promega)后混匀，37℃孵育5min后65℃5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)(SEQ ID NO:39)和(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQ IDNO:40)，轻链下游引物为(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)(SEQ ID NO:41)。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min 40cycles；72℃7min；PCR产物连接到PMD 18-T载体(Takara)后进行测序。克隆的抗体是:A-1,A-2,A-3。
基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体(市售)相连。
6.抗体的瞬时表达
接种5×105/ml的悬浮HEK293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24小时37℃，5％CO2旋转培养后，密度达到1×106/ml后被用于转染。转染过程中使用polyethylenimine(PEI)作为转染介质，将其与的DNA(DNA用量为每1×106个细胞0.5ug，其中抗体轻链和重链的比重为3:2混合，PEI和DNA的质量混合优选配比为3:1。两者混合物在静置孵育15分钟后被加入到细胞培养中。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37℃，5％CO2旋转培24小时后，向细胞培养液中加入0.5％的胰蛋白胨作为表达需要的氨基酸源，最后在表达完成后(96小时以上)收集细胞上清用于抗体的纯化分离。
7、抗体的纯化分离
收集的细胞上清经过高速(8000rpm，15分钟)离心去除细胞以及细胞碎片后，再用0.45um滤膜过滤澄清，澄清后的上清被用于纯化。纯化过程由层析仪完成。上清首先流过蛋白G亲和层析柱，上清中包含的抗体在此期间与蛋白G亲和层析柱的配基相结合后被滞留于柱内，然后低pH值(小于等于3.0)的洗脱缓冲液灌洗层析柱解离与层析柱结合的抗体，收集到的抗体洗脱液用1M的Tris-HCl迅速中和以保护抗体不变性失活。得到的抗体洗脱液经过16小时的透析后置换成PBS缓冲液。
8、报告基因实验检测抗体体外激活人β-Klotho/FGFR1c受体复合物的功能。
以每孔20000个接种共表达hKLB/FGFR1c-SRE-Luciferase的CHO-DHFR-细胞(在CHO-DHFR-hKLB细胞的基础上，采用实例1中的方法转染FGFR1c和SRE-Luciferase，潮霉素和G418抗生素筛选亚克隆，建立细胞稳定株)至96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，再加入100μl用无血清培养基稀释纯化抗体或FGF21，37℃孵育4小时。刺激结束后，加入100μl Promega的Bright Glo化学发光底物，最后将细胞裂解物转移至白色96孔板，在Molecular Devices的SpectraMaxL酶标仪上读取相对发光强度。结果表明：重组表达的anti-KLB(A-1，A-2，A-3)和FGF21一样，均可激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体的功能(图3)。
9、免疫印迹
以每孔20000个接种共表达hKLB/FGFR1c的CHO-DHFR-细胞(在CHO-DHFR-hKLB细胞的基础上，采用实例1中的方法转染FGFR1c，潮霉素筛选亚克隆，建立细胞稳定株)至96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，无血清中饥饿30分钟。吸去培养液后，再加入100μl用无血清培养基稀释纯化抗体或FGF21，37℃孵育15分钟。刺激结束后，加入细胞裂解液(RIPA，Thermo)裂解细胞，抽取细胞裂解液上清蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，半干法转膜，1％BSA-PBST封闭后的PVDF膜，按照厂家说明书的方法，分别用anti-Erk和anti-p-Erk抗体(Cell signaling technology)进行免疫印迹，曝光后的结果表明：重组表达的anti-KLB(A-1，A-2)在10nM的浓度下，均可引起细胞内Erk的磷酸化条带变粗变浓，即刺激后细胞内Erk磷酸化水平升高(图4)。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (8)
1.一种能与人β-Klotho受体特异性结合的抗体，其特征在于，
所述抗体选自抗体A-l、抗体A-2和抗体A-3中的一种；
所述抗体A-l的轻链CDRl的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示、轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示、轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示、重链CDRl的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示、重链CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示、重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.I0所示；
所述抗体A-2的轻链CDRl的氨基酸序列如SEQ IDNO.22 所示、轻链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.23 所示、轻链CDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO.24 所示、重链CDRl 的氨基酸序列如SEQ ID NO.18 所示、重链CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示、重链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.l9所示；
所述抗体A-3的轻链CDRl的氨基酸序列如SEQ IDNO.32所示、轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.33所示、轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示、重链CDRl的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示、重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示、重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，当所述抗体与人β-Klotho受体结合时：
a．以与成纤维细胞生长因子21（FGF21）基本相同的Kd与人β-Klotho受体结合；
b．以与FGF21基本相同的 EC50激活人β-Klotho/FGFR1c复合受体；
c．不会竞争FGF21 结合人β-Klotho受体。
3.一种包含如权利要求1所述的抗体的药用组合物。
4.一种编码如权利要求1所述的抗体的分离的核酸。
5.一种包含如权利要求4所述的分离的核酸的重组表达载体。
6.一种包含如权利要求5所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.一种生产如权利要求1所述的抗体的方法，其特征在于，包括在允许表达所述抗体的条件下培养如权利要求6所述的宿主细胞。
8.一种包含如权利要求3所述的药用组合物在制备用于治疗II型糖尿病以及相关病症的药物中的用途。
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