RS57966B1 - Monoklonska antitela na progastrin i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

1. OBLAST PRONALASKA

[0001] Ova prijava se, između ostalog, odnosi na monoklonska antitela na progastrin, sastave i metode za pravljenje takvih antitela i na metode upotrebe takvih antitela, na primer, u dijagnozi i/ili lečenju kolorektalnog kancera.

2. POZADINA PRONALASKA

[0002] Kolorektalni kancer (CRC) je glavni problem u javnom zdravstvu, koji pogađa više od 1,000,000 ljudi svake godine i koji je odgovoran za više od 500,000 smrti svake godine. CRC je drugi vodeći uzrok smrti od kancera. Samo u Sjedinjenim Državama, za 2009., referisano je približno 147,000 novih slučajeva i preko 49,900 smrti zbog CRC. Postoje tri oblika CRC: sporadični CRC; nasledan nepolipozni kancer kolona (HNPCC), izazvan embrionskim mutacijama u genima za popravku pogrešno sparenih baza u DNK i familijarna adenomatozna polipoza (FAP), zbog embrionskih mutacija na APC genu. Sporadičan CRC je odgovoran za skoro 85% slučajeva, dok je HNPCC odgovoran za oko 5% i FAP je odgovoran za oko 1% (Heyer et al., 1999, Oncogene 18:5325-5333).

[0003] Klinički postupak CRC tipično uključuje hiruršku resekciju tumora, često praćenu hemoterapijom. Danas, oko 50% pacijenata sa CRC umire u okviru od pet godina od dijagnoze. Nedostatak pouzdanih skrining testova i neefektivnost trenutno dostupnih terapija su glavni uzroci visoke stope smrtnosti. Postoji hitna potreba za novim kliničkim pristupima za dijagnostikovanje CRC, kao i za efektivnim tretmanima kolorektalnih kancerskih tumora koji imaju minimalne štetne efekte na inače zdravo tkivo.

3. KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo na progastrin, kao što je definisano u zahtevima.

[0005] Predmetna prijava obezbeđuje sastave i metode korisne za dijagnostikovanje i/ili lečenje kolorektalnog kancera (CRC) u životinjama, uključujući ljude. Predmetni pronalazak i opis su zasnovani, delimično, na prijaviočevom otkriću monoklonskih antitela koja specifično vezuju progastrin (PG), na primer, humani progastrin (hPG), polipeptid koji proizvode tumorske ćelije CRC, i koja ispoljavaju antiproliferativne osobine u in vitro modelima CRC.

[0006] Progastrin proizvode ćelije kolorektalnog tumora i smatra se da on stimuliše proliferaciju ovih ćelija tako što trigeruje put transdukcije signala koji blokira normalne procese diferencijacije ćelija, uključujući one procese koji dovode do ćelijske smrti. Iscrpljivanje genskog transkripta za gastrin koji kodira progastrin indukuje diferencijaciju ćelija i programiranu ćelijsku smrt u tumorskim ćelijama u in vitro i in vivo CRC modelima, smanjujući proliferaciju tumorskih ćelija. Mada bez namere da se bude vezan za bilo koju teoriju o mehanizmu, kroz vezivanje PG, smatra se da antitela na hPG blokiraju ili inhibiraju njegovu sposobnost da interaguju sa partnerima u signalizaciji. Ovo, sa svoje strane, inhibira put transdukcije signala u ćelijama kolorektalnog tumora koji bi inače doveo do proliferacije.

[0007] U skladu sa tim, u jednom aspektu, predmetna prijava obezbeđuje monoklonska antitela koja specifično vezuju PG, na primer hPG, ali ne druge proizvode gena za gastrin.

Pozivajući se na SL. 1, gen za gastrin se prevodi u polipeptid od 101 aminokiseline, nazvan pre-progastrin, koji sadrži signalnu sekvencu (podvučeno) koja se razlaže, dajući progastrin, polipeptid od 80 aminokiselina. Progastrin se, sa svoje strane, cepa da generiše proizvod od 34 aminokiseline, koji odgovara ostacima 38 do 71 progastrina, koji se zatim produžava na svom karboksi kraju glicinskim ostatkom, generišući G34 produžen glicinom ("G34-Gly"). Nuzproizvod ovog cepanja je peptid od 5 aminokiselina, nazvan C-terminalni bočni peptid, ili CTFP, koji uključuje ostatke 75 do 80 progastrina. G34-Gly se zatim dalje cepa da generiše polipeptid od 17 ostataka, koji po sekvenci odgovara ostacima 55 do 71 progastrina i označava se sa G17-Gly. Uklanjanje glicina sa C-terminusa iz G34-Gly i G17-Gly, praćeno C-terminalnom amidacijom, daje G34 i G17, respektivno, gde su oba amidovana na C-kraju. Prema tome, dok je prvih 37 ostataka progastrina jedinstveno za njega (tj. nije prisutno u njegovim proizvodima obrade, kao što je G34, G34-Gly, G17, G17-Gly, ili CFTP), ostaci 38 do 80 su takođe prisutni u post-translacionim proizvodima gena za gastrin.

[0008] Prijavioci su otkrili da, dok se monoklonska antitela na PG mogu podići pomoću metoda poznatih stručnjacima, važan je izbor antigena. Neće svi antigeni izvedeni iz hPG da stimulišu proizvodnju monoklonskih antitela koja specifično vezuju hPG u fiziološkim uslovima. Kao što je opisano dole, razni antigeni korišćeni da podignu poliklonska antitela na hPG, kao što je rekombinantni humani progastrin cele dužine (videti, npr., Singh WO 08/076454) i peptidi koji odgovaraju poslednjih deset aminokiselina na C-kraju hPG (videti, npr., Hollande WO 07/135542) nisu uspeli da generišu monoklonska antitela na hPG. Prijavljeno je da su monoklonska antitela na progastrin dobijena korišćenjem peptida u C-terminusu proteina (WO 2006/032980), ali ova antitela u stvari ne vezuju progastrin. Prijavioci su, međutim, otkrili antigenske N- i C-terminalnane sekvence unutar hPG sekvence koja se može koristiti za generisanje monoklonskih antitela koja specifično vezuju hPG. Prilično iznenađujuće, prijavioci su otkrili da nije neophodno da se antigenske sekvence ograniče na nizove PG sekvence koji su jedinstveni za njega da bi se dobila monoklonska antitela koja specifično vezuju PG, a ne druge proizvode izvedene iz gena za gastrin. Peptidni antigeni koji imaju zajedničke sekvence sa drugim proizvodima gena za gastrin, na primer, G17, G34 i CTFP, su dali monoklonska antitela koja ne samo što vezuju hPG, nego ga vezuju specifično.

[0009] Prijavioci su generisali monoklonska antitela pomoću antigena izvedenih iz različitih regiona hPG molekula. Monoklonska antitela na PG, koja se mogu dobiti pomoću peptidnog antigena koji ima sekvencu koja odgovara N-terminalnanom regionu hPG, i/ili koja se vezuje za N-terminalni region hPG, se ovde označavaju sa "N-terminalna monoklonska antitela na hPG". Specifičan primer antigenskog regiona koji se može koristiti za konstruisanje imunogena korisnog za dobijanje N-terminalnih monoklonskih antitela na PG odgovara ostacima 1 do 14 hPG: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:25). Primeri imunogena, uključujući ovaj antigen koristan za dobijanje N-terminalnih monoklonskih antitela na PG, su opisani u Tabeli 1A i pod naslovom Primeri.

[0010] Monoklonska antitela na PG, koja se mogu dobiti pomoću peptidnog antigena koji ima sekvencu koja odgovara C-terminalnanom regionu hPG, i/ili koja vezuje C-terminalni region hPG, se ovde označavaju sa "C-terminalna monoklonska antitela na hPG." Specifičan primer antigenskog regiona koji se može koristiti za konstruisanje imunogena korisnog za dobijanje C-terminalnih monoklonskih antitela na PG odgovara ostacima 55 do 80 hPG: QGPWLEEEEEAYGWMDFG RRSAEDEN (SEQ ID NO:27). Primeri imunogena, uključujući ovaj antigen koristan za dobijanje C-terminalnih monoklonskih antitela na PG su opisani u Tabeli 1B i pod naslovom Primeri.

[0011] Za neke upotrebe, poželjno je imati monoklonska antitela na hPG sa visokim afinitetom prema hPG. Za određene upotrebe, kao što su terapijske upotrebe, poželjan je afinitet od bar oko 100 nM, mada antitela koja imaju veće afinitete, na primer, afinitete od bar oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ili čak veće, mogu biti poželjna. Razni specifični primeri monoklonskih antitela na PG, opisanih ovde, ispoljavaju afinitete koji se kreću od 10<-6>do 10<-12>M (videti Tabelu 6). Monoklonsko antitelo na PG, koje ima afinitet naročito podešen za određenu željenu primenu, može se lako odabrati od njih, ili se generisati ili dizajnirati korišćenjem različitih imunogena, sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR), sekvenci varijabilnih teških VHi varijabilnih lakih VLlanaca i metoda opisanih ovde. Afinitet bilo kog konkretnog monoklonskog antitela na PG se može odrediti korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci ili opisanih ovde, kao što je, na primer, ELISA, izotermalna titraciona kalorimetrija (ITC), BIAcore ili test fluorescentne polarizacije.

[0012] hPG je relativno mali polipeptid, dužine samo 80 aminokiselina. Očekivalo bi se da bi svako monoklonsko antitelo koje specifično vezuje hPG sa relativno visokim afinitetom (npr., bar oko 10 nM), interferiralo sa sposobnošću PG da interaguje sa njegovim signalnim partnerima, i, kao rezultat, inhibira proliferaciju CRC ćelija. Međutim, prijavioci su otkrili da nisu sva monoklonska antitela na PG neutrališuća (tj., ne sva monoklonska antitela koja vezuju PG interferiraju sa ili inhibiraju njegovu biološku aktivnost signalizacije). Zaista, kao što će biti diskutovano detaljnije pod naslovom Primeri, prijavioci su otkrili da neka monoklonska antitela na PG, uprkos ispoljavanju visoke specifičnosti i visokog afiniteta prema PG, ne neutrališu PG. Na primer, anti-hPG MAb14 vezuje hPG sa KDod oko 6 pM, ali ne inhibira rast CRC ćelija in vitro, kao što je dato detaljnije pod naslovom Primeri, niže. Iako su neneutrališuća monoklonska antitela koja specifično vezuju hPG korisna u dijagnostičke svrhe, ona monoklonska antitela na hPG koja neutrališu PG su naročito pogodna za terapijske primene u lečenju CRC.

[0013] Kao što se ovde koristi, "neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG" je monoklonsko antitelo na hPG koje dovodi do statistički značajnog smanjenja broja živih CRC ćelija u testiranom uzorku tretiranom monoklonskim antitelom na hPG u poređenju sa kontrolnim uzorkom tretiranim nespecifičnim monoklonskim antitelom. Specifičan test za procenu sposobnosti bilo kog konkretnog monoklonskog antitela na hPG da neutrališe hPG je opisan pod naslovom Detaljan opis, niže. Ona monoklonska antitela na hPG koja ispoljavaju bar oko 50% smanjenja broja živih ćelija u ovom testu se smatraju naročito korisnim u lečenju CRC, mada se očekuje da monoklonska antitela na hPG koja ispoljavaju niže nivoe aktivnosti neutralisanja, na primer, statistički značajno smanjenje od 40%, 30%, 20%, 15%, ili čak 10% broja živih ćelija u ovom testu pruže terapijske prednosti.

[0014] U skladu s tim, u nekim rešenjima, monoklonska antitela na PG su neutrališuća monoklonska antitela na PG. Otkriveno je da sposobnost monoklonskog antitela na PG da neutrališe PG nije zavisna od epitopa. Kao što je pokazano pod naslovom Primeri, i N-terminalna i C-terminalna antitela na PG imaju neutrališuću aktivnost. Prema tome, u nekim rešenjima neutrališuća monoklonska antitela na PG su N-terminalna neutrališuća antitela, u nekim drugim rešenjima, monoklonska antitela na PG su C-terminalna neutrališuća antitela.

[0015] Mapiranje epitopa otkriva da N-terminalna monoklonska antitela na PG ne vezuju sva isti epitop, čak i kad se podignu na isti imunogen. Isto važi i za C-terminalna monoklonska antitela na hPG. Epitopi vezani za N-terminalna i C-terminalna monoklonska antitela na hPG iz primera, kao što je identifikovano skeniranjem alanina i SPOT tehnikom, su obezbeđeni pod naslovom Primeri, u Tabelama 8 i 9.

[0016] U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG vezuju epitop koji uključuje aminokiselinu sekvencu koja odgovara N-terminalnom delu hPG. U nekim specifičnim rešenjima, N-terminalna monoklonska antitela na hPG vezuju epitop koji uključuje ostatke 10 do 14 u hPG (SEQ ID NO:28), ostatke 9 do 14 u hPG (SEQ ID NO:29), ostatke 4 do 10 u hPG (SEQ ID NO:30), ostatke 2 do 10 u hPG (SEQ ID NO:31), ili ostatke 2 do 14 u hPG (SEQ ID NO:32).

[0017] U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG vezuju epitop koji uključuje aminokiselinu sekvencu koja odgovara delu C-terminalnog regiona hPG. U nekim specifičnim rešenjima, C-terminalna monoklonska antitela na hPG vezuju epitop koji uključuje ostatke 71 do 74 u hPG (SEQ ID NO:33), ostatke 69 do 73 u hPG (SEQ ID NO:34), ostatke 76 do 80 u hPG (SEQ ID NO:35), ili ostatke 67 do 74 u hPG (SEQ ID NO:36).

[0018] Očekuje se da bi odgovarajući CDR i/ili VHi VLlanci monoklonskih antitela na hPG koja vezuju približno iste epitope mogli da se zamene da daju nova monoklonska antitela na hPG. Na primer, kao što je naznačeno u Tabeli 9, primeri monoklonskih antitela na hPG MAb 5 i MAb 6 vezuju isti epitop. Monoklonsko antitelo na hPG se može dizajnirati da uključi, u svom VLlancu, različite kombinacije VLCDR-ova ova dva antitela, i/ili u svom VHlancu, različite kombinacije VHCDR-ova ova dva antitela. Kao specifičan primer, da bi se moguće ilustrovale različite kombinacije, takvo antitelo bi moglo da uključi u svom VLlancu, CDR 1 i 2 MAb 5 (VLCDR1.5 i VLCDR2.5, respektivno) i CDR 3 MAb 6 (VLCDR3.6), i u svom VHlancu, CDR 1 MAb 6 (VHCDR1.6) i CDR 2 i 3 MAb 5 (VHCDR2.5 i VHCDR3.5, respektivno).

[0019] Nekoliko monoklonskih antitela na hPG, koja imaju visoku specifičnost i afinitet za hPG i koja ispoljavaju dobru antitumorsku aktivnost u in vitro testovima, je identifikovano i u nekim slučajevima su određene sekvence njihovih CDR, sekvence njihovih VHi VLlanaca, i/ili sekvence predloženih VHi VLlanaca za humanizovane verzije. Takođe je deponovano nekoliko hibridoma. Sva ova monoklonska antitela na hPG iz primera, kao i druga specifična rešenja monoklonskih antitela na hPG korisna u različitim kompletima i metodima opisanim ovde, na primer, monoklonska antitela koja su u kompeticiji za vezivanje PG sa referentnim antitelom, su opisana detaljnije pod naslovom Detaljan opis.

[0020] Monoklonska antitela na hPG iz prijave uključuju antitela koja su u kompeticiji sa referentnim monoklonskim antitelom na hPG za vezivanje hPG. Referentno monoklonsko antitelo na hPG može da bude bilo koje od monoklonskih antitela na hPG opisanih ovde. Neograničavajući primeri uključuju: antitela koja sadrže tri VLCDR i tri VHCDR kao što su opisani ovde; antitela koja sadrže VHlanac i VLlanac koji imaju aminokiselinske sekvence kao što su date ovde; antitela koja sadrže humanizovane polipeptide teškog i lakog lanca kao što su dati ovde; antitela koja je proizveo bilo koji od hibridoma opisanih ovde; antitela koja se vezuju za epitop unutar hPG, kao što su opisana ovde.

[0021] Monoklonska antitela na PG opisana ovde mogu biti u vidu antitela cele dužine, antitela sa više lanaca ili sa jednim lancem, fragmenti takvih antitela koja selektivno vezuju PG (uključujući, ali bez ograničenja, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, i scFv), surotela (uključujući surogate konstrukta lakog lanca), antitela sa jednim domenom, humanizovana antitela, kamilovana antitela i slično. Ona mogu da budu i od, ili izvedena iz, bilo kog izotipa, uključujući, na primer, IgA (npr., IgA1 ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4), ili IgM. U nekim rešenjima, antitelo na PG je IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4).

[0022] Monoklonska antitela na PG mogu biti humanog ili ne-humanog porekla. Primeri antitela na PG ne-humanog porekla uključuju, ali bez ograničenja, ona sisarskog porekla (npr., majmuni, glodari, koze i zečevi). Monoklonska antitela na PG za terapijsku upotrebu kod ljudi su poželjno humanizovana.

[0023] U jednom drugom aspektu, predmetna prijava obezbeđuje nukleinske kiseline sposobne da se koriste za proizvodnju monoklonskih antitela na PG. Obezbeđeni su nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobulinske polipeptide lakog lanca i teškog lanca za monoklonska antitela na hPG opisana ovde i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Pored toga, ovde su obezbeđene prokariotske i eukariotske ćelije domaćini transformisane takvim vektorima, kao i eukariotske, npr., sisarske, ćelije domaćini, konstruisane da eksprimiraju polipeptide lakog i teškog lanca monoklonskih antitela na hPG. Takođe su obezbeđene ćelije domaćini sposobne da eksprimiraju i lak i težak lanac i da sekretuju monoklonska antitela opisana ovde u medijum u kom su gajene ćelije domaćini. U nekim rešenjima, ćelija domaćin je hibridom. Metodi proizvodnje monoklonskih antitela na hPG gajenjem ćelija domaćina su takođe obezbeđene.

[0024] Neutrališuća monoklonska antitela na PG, kao što su monoklonska antitela na hPG, vezuju PG i blokiraju signaliziranje zavisno od PG, što dovodi do inhibicije odgovora indukovanih PG-om u CRC tumorskim ćelijama. U skladu s tim, takođe su obezbeđeni metodi inhibiranja odgovora indukovanih PG-om CRC ćelija, koji uključuju represiju diferencijacije ćelija, represiju ćelijske smrti i/ili stimulaciju proliferacije ćelija. Generalno, metod obuhvata kontaktiranje CRC ćelije sa, ili izlaganje populacije ćelija, neutrališućem monoklonskom antitelu na PG u količini efektivnoj da inhibira jedan ili više odgovora indukovanih PG-om CRC ćelija. Metod može da sprovodi in vitro ili in vivo, uvođenjem neutrališućeg monoklonskog antitela na hPG u okolinu koja sadrži CRC ćelije, što može da bude ćelijska kultura ili tumor.

[0025] Neutrališuća monoklonska antitela na PG opisana ovde inhibiraju proliferaciju CRC tumorskih ćelija zavisnu od PG, što ih čini korisnim terapijskim agensima za lečenje kolorektalnog kancera. U skladu s tim, obezbeđeni su i farmaceutski sastavi koji sadrže neutrališuće monoklonsko antitelo na PG i metode za upotrebu neutrališućih monoklonskih antitela na PG i/ili farmaceutski sastavi za lečenje CRC. Farmaceutski sastavi mogu biti formulisani za bilo koji pogodan način administracije, uključujući, npr., parenteralno, subkutano ili intravensko injektiranje i tipično uključuju neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG i jedan ili više prihvatljivih nosača, ekscipijenata i/ili razblaživača, pogodnih za željeni način administracije i mogu da uključe i druge komponente po želji, kao što će biti opisano dalje, pod naslovom Detaljan opis. Za terapijske upotrebe, sastavi se mogu pakovati u oblik jedinične doze zbog lakoće upotrebe.

[0026] Metodi lečenja generalno obuhvataju administriranje subjektu kome je lečenje potrebno, na primer, subjektu kome je dijagnostikovan CRC, količine neutrališućeg monoklonskog antitela na PG i/ili njegovog farmaceutskog sastava efektivnog da obezbedi terapijsku korist. Terapijska korist, opisana niže u više detalja, uključuje svako poboljšanje CRC, na primer, usporavanje ili zaustavljanje napredovanja CRC, smanjenje jačine CRC, inhibiranje rasta CRC tumora ili proliferacij CRC ćelija, smanjenje veličine CRC tumora i/ili smanjenje serumskih nivoa PG u CRC pacijentima. Subjekt može da bude čovek ili životinja, uključujući domaće životinje (npr., mačka, pas. krava, svinja, konj) ili životinje koje nisu domaće. Poželjno je da monoklonsko antitelo na PG bude specifično za PG vrste koja se leči. Na primer, antitelo na hPG se administrira humanom pacijentu, antitelo na pseći PG se is administrira psećem pacijentu i slično. Subjekti kojima je terapija monoklonskim antitelom na hPG korisna mogu biti: pacijenti u bilo kom stadijumu napretka bolesti (npr., CRC stadijum 0, I, II, III ili IV), pacijenti koji su primili terapiju za CRC (npr., hemoterapiju, terapiju zračenjem, hiruršku resekciju) ili pacijenti koji primaju neki drugu terapiju za CRC.

[0027] Lečenje monoklonskim antitelom na PG, kao što je opisano ovde, može biti kombinovano sa, ili adjunktivno sa, nekom drugom terapijom. Neograničavajući primeri drugih terapija za CRC uključuju hemoterapijski tretman, terapiju zračenjem, hiruršku resekciju i terapiju antitelom, kao što je opisano ovde. U jednom specifičnom primeru, monoklonska antitela na hPG se daju u kombinaciji sa hemoterapijskim agensima. U jednom drugom specifičnom primeru, monoklonska antitela na hPG se daju adjunktivno sa hirurškom resekcijom. Monoklonska antitela na PG se mogu koristiti i u kombinaciji jedno sa drugim.

[0028] Osobe sa CRC tumorom često imaju povišene nivoe cirkulišućeg PG (npr., u serumu ili plazmi). U skladu s tim, monoklonska antitela na hPG mogu da se koriste za detekciju nivoa PG u svrhu dijagnostikovanja CRC. Pored toga, u pacijentima kojima je već dijagnostikovan CRC, monoklonska antitela na hPG se mogu koristiti da se izaberu subjekti podobni za primanje anti-PG terapije, ili praćenje efikasnosti lečenja. Kao što je ovde opisano, metod za dijagnostikovanje kolorektalnog kancera u subjektu obuhvata određivanje da li je količina progastrina u uzorku iz subjekta, na primer, uzorku krvi ili uzorku seruma, merena pomoću monoklonskog antitela na hPG prema predmetnoj prijavi, iznad nivoa praga. U jednom specifičnom rešenju, nivo praga je 50 pM. U nekim rešenjima se koriste dva antitela na PG, jedno koje prepoznaje C-terminalni region PG, a drugo koje prepoznaje N-terminalni region PG. U ovom rešenju, jedno ili oba N-terminalna ili C-terminalna antitela su monoklonska antitela na PG, kao što je opisano ovde. Poželjno je da se koriste N-terminalna i C-terminalna monoklonska antitela na PG. Antitela mogu, ali ne moraju biti, neutrališuća.

[0029] U svrhu praćenja efikasnosti lečenja, monoklonska antitela na PG se mogu koristiti za određivanje da li se nivo progastrina smanjuje tokom vremena u uzorcima iz subjekta koje je lečen ili se leči od CRC, poređenjem količine PG u uzorcima uzetim u različita vremena. Specifična rešenja antitela na PG, opisana u prethodnom paragrafu, se mogu koristiti i u ovom testu.

[0030] Obezbeđeni su i kompleti pogodni za sprovođenje različith dijagnostičkih, metoda praćenja i drugih metoda opisanih ovde. Takvi kompleti tipično sadrže monoklonsko antitelo na PG, kao što je opisano ovde i, opciono, dodatna antitela na PG i/ili reagense pogodne za izvođenje specifičnog testa. U nekim rešenjima, jedno ili više antitela na PG, uključena u komplet, su obeležena vidljivim obeleživačem, kao što je fluorofora. U jednom specifičnom rešenju, komplet uključuje antitelo na PG koje specifično vezuje N-terminalni region PG, antitelo na PG koje specifično vezuje C-terminalni region PG i opciono, reagense pogodne za izvođenje dijagnostičkog testa, gde je N-terminalno specifično antitelo N-terminalno antitelo, N-terminalno monoklonsko antitelo na PG, kao što je opisano ovde, i/ili je C-terminalno specifično antitelo C-terminalno monoklonsko antitelo na PG, kao što je opisano ovde.

4. KRATAK OPIS SLIKA

[0031]

SL. 1 prikazuje aminokiselinske sekvence pre-progastrina, progastrina i proizvoda obrade progastrina uključujući G34, G34-Gly, G17, G17-Gly i C-terminalni bočni peptid, CTFP.

SL. 2 prikazuje polipeptid i odgovarajući polinukleotid, sekvence VHi VLlanaca za primere mišjih monoklonskih antitela na hPG: anti-hPG MAb 3 (SEQ ID NOS 16, 12, 17 i 13, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL 2A, 2B), anti-hPG MAb 4 (SEQ ID NOS 18, 14, 19 i 15, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL. 2C, 2D), anti-hPG MAb 8 (SEQ ID NOS 67, 59, 71 i 63, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL. 2E, 2F), anti-hPG Mab 13 (SEQ ID NOS 68, 60, 72 i 64, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL.2G, 2H), anti-hPG MAb 16 (SEQ ID NOS 69, 61, 73 i 65, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL. 2I, 2J), i anti-hPG MAb 19 (SEQ ID NOS 70, 62, 74 i 66, respektivno, po redu pojavljivanja) (SL.

2K, 2L), gde su tri CDR iz svakog lanca podvučena.

SL. 3A-C prikazuju grafike koji ilustruju relativne afinitete vezivanja (merene kao apsorbance na 492 nm) pri rastućim koncentracijama antitela (µg/mL) primera mišjih monoklonskih antitela na hPG, MAb 1-4 (SL.3A); MAb 5-14 i 20-23 (SL.3B) i MAb 3 i 15-19 (SL.3C).

SL. 4 prikazuje grafik koji ilustruje odnos apsorbance (optičke gustine) na 280 nm i 330 nm za četiri različita primera mišjih monoklonskih antitela na hPG u poređenju sa kontrolnim uzorkom goveđeg serumskog albumina (u arbitrarnim jedinicama).

SL. 5A-C prikazuju grafike koji ilustruju vezivanje 23 različita primera mišjih monoklonskih antitela na hPG za 25 ili 50 ng hPG u poređenju sa: samim puferom (negativna kontrola), 250 ng KLH (negativna kontrola) i peptidima izvedenim iz gena za gastrin (50 i 250 ng CTFP, G17 ili G17-Gly (označen na slici kao "G-Gly"), kao što je naznačeno. SL. 5A pokazuje vezivanje anti-hPG MAb 1-4, SL. 5B pokazuje vezivanje anti-hPG MAb 5-14 i 21-23 i SL.5C pokazuje vezivanje anti-hPG MAb 3 i 15-20.

SL. 6 prikazuje grafik koji ilustruje vezivanje poliklonskog N-terminalnog antitela na hPG pri rastućim koncentracijama anti-hPG MAb3.

SL. 7 prikazuje grafike koji ilustruju proliferaciju reprezentativnih CRC ćelijskih linija tretiranih monoklonskim antitelima na hPG kao što sledi: SW480, HCT-116, LS174T, kao što je naznačeno, tretiranih monoklonskim antitelima na hPG iz primera, MAb 3 i MAb 4 (SL. 7A, 7B, 7C, respektivno, pokazujući promenu broja živih ćelija na kraju tretmana u odnosu na početak tretmana antitelom (T0)), ili poliklonskim antitelom na hPG (SL. 7D, 7E, 7F, respektivno, pokazujući promenu broja živih ćelija na kraju tretmana u odnosu na početak tretmana antitelom (T0)); proliferacija CRC ćelijskih linija SW620 tretiranih pomoću anti-hPG MAb 5 do MAb 23 (SL. 7G, pokazujući žive ćelije tretirane pomoću anti-hPG kao procenat od broja kontrolnih ćelija tretiranih antitelom na kraju tretmana u odnosu na početak tretmana (T0)); proliferacija LS174T ćelija tretiranih pomoću anti-hPG MAb 8, 13, 14, 16, i 19 (SL. 7H, pokazujući žive ćelije tretirane pomoću anti-hPG kao procenat od broja kontrolnih ćelija tretiranih antitelom na kraju tretmana u odnosu na početak tretmana (T0)); i proliferacija HCT-116 ćelijas treated with monoklonska antitela na hPG MAb 8, 13, 14, 16, 19 (SL. 7I, pokazujući žive ćelije tretirane pomoću anti-hPG kao procenat od broja kontrolnih ćelija tretiranih antitelom na kraju tretmana u odnosu na početak tretmana (T0)).

SL. 8 prikazuje grafik koji ilustruje broj živih LS174T ćelija 48 sati posle 4 tretmana kontrolnim monoklonskim antitelom, anti-hPG MAb 8 (5µg/mL), anti-hPG MAb 8 prethodno inkubiranim sa hPG, kontrolnim antitelom prethodno inkubiranim sa hPG ili samim hPG.

SL. 9 prikazuje grafike koji ilustruju broj tumora po mišu (SL. 9A) i prosečnu dužinu i visinu tumora (SL. 9B) u miševima tretiranim hPG antitelima na hPG u poređenju sa kontrolnim poliklonskim antitelom.

5. DETALJAN OPIS REŠENJA

5.1. Detaljan opis

[0032] Progastrin (PG) je prvo identifikovan kao prekursor gastrina, peptidni hormon u crevima koji stimuliše sekreciju gastrične kiseline. Gastrin postoji u više različitih molekulskih oblika (G17, G34, G17 produžen glicinom, G34 0produžen glicinom), izvedenih iz progastrina. Videti SL. 1. Gen za gastrin kodira proizvod od 101 aminokiseline, preprogastrin. Prvo cepanje uklanja signalni peptid dug 21 aminokiselinu (podvučeno na SL.

1) i dovodi do PG, peptid koji ima 80 aminokiselina. Podrazumevana, poznata polipeptidna sekvenca humanog PG (hPG) je obezbeđena u SEQ ID NO:20. Kao što je ilustrovano na SL.

1, aminokiselinski ostaci hPG su numerisani od 1 do 80, sa najčešćim amino ostatkom na poziciji 1. Sekvence u okviru prvih 40 aminokiselina progastrina su označene kao "N-terminalne", dok su sekvence koje upadaju u ostatak 41 do 80 su označene kao "C-terminalne".

[0033] Nedavne studije su pokazale da su nivoi progastrina povišeni kod pacijenata sa CRC. U normalnim fiziološkim uslovima, progastrin je odgovoran za manje od 10% ukupnog sekretovanog peptida kod ljudi. U kolorektalnom kanceru, nivoi progastrina su značajno povišeni u tkivima i plazme i tumora, moguće kao rezultat povećane ekspresije gena za gastrin zajedno sa nepotpunom obradom proizvoda gena. Jedna studija je pokzala značajno više nivoe progastrina u serumu u pacijentima sa CRC u poređenju sa kontrolnim pacijentima, ali takva razlika nije postojala za obrađenije oblike gastrina (Siddheshwar et al., 2001, Gut 48:47-52). U testiranim uzorcima CRC tumora, 80-100% uzoraka je pokazalo showed povišene nivoe PG. Videti, npr., Ciccotosto et al., 1995, Gastroenterology 109:1142-1153; Baldwin et al., 1998, Gut 42:581-584; Van Solinge, 1993, Gastroenterology 104:1099-1107. Uloga PG u CRC je dalje potkrepljena eksperimentima koji pokazuju da su miševi, koji eksprimiraju rekombinantni humani PG, tretirani karcinogenom azoksimetanom, imali značajno veće brojeve aberantnih skrivenih fokusa, adenoma i adenokarcinoma u kolonu nego prirodni miševi ili miševi koji eksprimiraju amidovane gastrine (Singh et al. 2000, Gastroenterology 119:162-171).

[0034] Nedavno su Hollande et al. demonstrirali da progastrin stimuliše put beta-katenin/Tcf4 reprimiranjem ICAT, negativnog regulatora beta-katenin/Tcf4 signalizacije i da blokiranje progastrina dovodi do de novo ekspresije ICAT. Videti WO 2007/135542. Bez namere o vezivanju za bilo koju teoriju o mehanizmu, veruje se da blokiranje progastrinske signalizacije dovodi do represije proliferacije indukovane beta-katenin/ Tcf4-om kao rezultat povećane ekspresije ICAT. U odsustvu kontinuiranog signaliziranja zavisnog od PG, proliferacija ćelija je inhibirana, a trigerovana je diferencijacija ćelija i/ili ćelijska smrt (uključujući apoptozu).

[0035] Uprkos hitnoj potrebi za novim pristupima lečenju i dijagnozi CRC, dokazima da PG stimuliše proliferaciju ćelija CRC tumora i uprkos povećanom fokusu na terapije monoklonskim antitelom u lečenju kancera, do danas, ne postoje izveštaji koji demonstriraju da je ikakvo monoklonsko antitelo sposobno da blokira proliferaciju tumorskih ćelija zavisnu od PG, ili čak vezivanje PG. Takva antitela, predstavljena ovde prvi put, su se pokazala kao teška za razvoj. Kao prvi izazov, prijavioci su našli da rekombinantni humani progastrin, koji se može koristiti za generisanje poliklonskog antitela na hPG, nije uspeo da indukuje monoklonski imunogeni odgovor u testiranim miševima. Prema tome, bilo je neophodno dizajnirati imunogene korišćenjem samo peptidnih fragmenata PG za generisanje antitela specifičnih za progastrin, a ne za druge proizvode gena za gastrin. Čak i kad su klonovi hibridoma dali antitela koja su vezala antigenski peptid, nađeno je da vezivanje za peptid nije bilo prediktivno za sposobnost vezivanja PG, specifično ili uopšte. Kao što je pokazano detaljnije u Primerima niže, mnogi hibridomi su dali antitela koja vezuju antigenski peptid iz PG korišćen za imunogen, ali nisu vezali PG. Predmetna prijava obezbeđuje monoklonska antitela na hPG koja vezuju ne samo peptidni antigen na koji su podignuta, već i specifično vezuju hPG. Prilično iznenađujuće, monoklonska antitela, vrlo specifična za hPG u odnosu na proizvode njegove obrade (npr., G34, G34-Gly, G17, G17-Gly, CTFP), su dobijena sa antigenima koji u nekim slučajevima nisu jedinstveni za hPG, nego su uključivali aminokiselinske sekvence regiona zajedničkih za jedan ili više proizvoda obrade progastrina. Štaviše, takođe je neočekivano otkriveno da uprkos relativno maloj veličini hPG (80 aminokiselina), ne sva monoklonska antitela na hPG, čak ni ona koja ispoljavaju visok stepen afiniteta i specifičnosti za hPG, neutrališu njegovu biološku aktivnost.

Monoklonska antitela na hPG

[0036] Prijavioci su otkrili peptidne antigene korisne za podizanje monoklonskih antitela na hPG. Peptidi korisni za podizanje antitela na hPG iz predmetne prijave sadrže sekvence specifične za progastrin koje nisu nađene u obrađenijim oblicima polipeptida, kao što su gastrini produženi glicinom ili amidovani gastrini ili CTFP, ali takođe mogu da sadrže sekvence koje nisu nađene u obrađenim oblicima hPG. U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG su podignuta na peptidni antigen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara N-terminalnom regionu hPG i označena su kao N-terminalna monoklonska antitela na hPG. Specifičan primer antigenskog regiona koji se može koristiti za konstruisanje imunogena korisnog za dobijanje N-terminalnog monoklonskog antitela na PG odgovara ostacima 1 do 14 iz hPG (SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO: 25)) kuplovanim sa linker sekvencom. U nekim drugim rešenjima, monoklonska antitela na hPG su podignuta na peptidni antigen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara C-terminalnom regionu hPG i označena su kao C-terminalna monoklonska antitela na hPG. Specifičan primer antigenskog regiona koji se može koristiti za konstruisanje imunogena korisnog za dobijanje C-terminalnog monoklonska antitela na PG odgovara ostacima 55 do 80 hPG (SEQ ID NO:27) kuplovanim sa linker sekvencom. Videti Tabelu 1.

[0037] Monoklonska antitela na PG iz predmetne prijave vezuju PG i korisna su za detektovanje i izolovanje PG iz kompleksnih smesa. Pored toga, monoklonska antitela na PG iz prijave su jednistveno prilagođena za terapijske i/ili dijagnostičke primene za kolorektalni kancer. U različitim rešenjima, monoklonska antitela na hPG (1) specifično vezuju PG u odnosu na ostale proizvode gena za gastrin, (2) imaju visok afinitet za hPG, (3) inhibiraju proliferaciju ćelija kolorektalnog kancera in vitro i in vivo, (4) smanjuju veličinu i broj tumora in vivo, (5) detektuju PG u kompleksnim smesama koje sadrže i druge peptide dobijene iz gena za gastrin.

[0038] Gen za gastrin se eksprimira i ekstenzivno obrađuje, da bi dao nekoliko proteinskih proizvoda koji imaju uloge u normalnoj homeostazi. Progastrin, s druge strane, tipično nije detektabilan u cirkulaciji zdravih subjekata. Monoklonska antitela iz predmetne prijave su namenjena da ciljaju progastrin, a ne i druge peptide dobijene iz gena za gastrin. U skladu s tim, monoklonska antitela na hPG specifično vezuju progastrin, iz ljudi i drugih životinja, ali ne i druge proizvode gena za gastrin, kao što su, ali bez ograničenja, gastrini produženi glicinom ili amidovani gastrini, ili C-terminalni bočni peptid (CTFP).

[0039] Specifičnost monoklonskih antitela na hPG se može odrediti pomoću ELISA na sledeći način. Ploče sa 96 udubljenja se inkubiraju preko noći na 4°C, sa odgovarajućim koncentracijama testiranog polipeptida (npr., 25 i 50 ng rekombinantnog humanog PG, 50 i 250 ng CTFP ili nekog drugog proizvoda gena za gastrin) u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (PBS), posle čega se udubljenja peru tri puta rastvorom za pranje (PBS i 0,1% Tween-20), a zatim inkubiraju 2 sata na 22°C sa 100 µL rastvora za blokiranje (PBS, 0,1% Tween-20, 0,1% goveđi serumski albumin ili hidrolizat kazeina) po udubljenju. Posle blokiranja, udubljenja se peru tri puta i dodaje se antitelo za testiranje (testirano antitelo).100 µL testiranog antitela (0,3 do 1 ng/mL) u PBS i 0,1% Tween-20 se doda u svako udubljenje. Ploče se zatim inkubiraju 2 sata na 22°C, posle čega se rastvor testiranog antitela odbacuje i zamenjuje, posle koraka pranja (3X 100 µL rastvora za pranje, kao što je gore pomenuto), rastvorom za blokiranje koji sadrži sekundarno antitelo, kozje anti-mišje IgG (Fc) antitelo kuplovano sa peroksidazom rena. Posle 1-časovne inkubacije sa sekundarnim antitelom, 100 µL rastvora supstrata (npr. Fast OPD, ili O-fenilendiamin dihidrohlorid, dostupan od Sigma-Aldrich Co., pripremljen prema uputstvima proizvođača) se doda u svako udubljenje i inkubira u mraku 20 minuta na 22°C. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 50 µL 4N sumporne kiseline i količina katalizovanog supstrata se određuje merenjem optičke gustine (O.D.) na 492 nm. Konverzija supstrata je proporcionalna količini primarnog (testiranog) antitela vezanog za antigen. Eksperimenti se rade u duplikatu i merenja OD se crtaju kao funkcija koncentracije antigena. Testirana antitela se ocenjuju kao specifična za PG ako je mereni O.D. između 0,2 i 1,5 za hPG i ako nema statistički značajnog signala iznad pozadinskog sa CTFP ili sa bilo kojim drugim peptidom dobijenim od gena za gastrin, gde je pozadina prosečan signal iz kontrolnog udubljenja koje sadrži samo PBS.

[0040] Nađeno je da je nekoliko monoklonskih antitela na hPG iz predmetne prijave visoko specifično. U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG ispoljavaju 100 puta veću specifičnost za progastrin nego za ostale produkte gena za gastrin. U takvim rešenjima, 100 puta više antigena (npr., produžen glicinom ili amidovani gastrin) je potrebno da dovede do istog vezivanja kao ono koje se vidi kad je antigen progastrin.

[0041] Drugi metodi za određivanje vezivanja uključuju, ali bez ograničenja, imunofluorescentni metod, enzimski imunosorpcioni test (ELISA), imunološki test sa radioaktivnim obeleživačem (RIA), sendvič ELISA (Monoclonal Antibody Experiment Manual (izdanje: Kodansha Scientific, 1987), Second Series Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, izdanje: Tokyo Kagaku Dojin (1986)).

[0042] Monoklonska antitela na hPG sa visokim afinitetom za PG su poželjna i za terapijsku i za dijagnostičku upotrebu. Za određene upotrebe, kao što su terapijske upotrebe, poželjan je afinitet od bar oko 100 nM, mada antitela koja imaju veće afinitete, na primer, afinitete od bar oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, 10 pM, 1 pM, ili čak i veće, mogu biti poželjni. U nekim rešenjima, monoklonska antitela specifično vezuju hPG sa afinitetom koji se kreće od oko 1 pM do oko 100 nM, ili afinitetom koji se kreće između bilo kojih od gornjih vrednosti.

[0043] Afinitet monoklonskih antitela na hPG za hPG se može određivati pomoću tehnika dobro poznatih u struci ili opisanih ovde, kao što su, na primer, ne na ograničavajući način, ELISA, izotermalna titraciona kalorimetrija (ITC), BIAcore, Proteon, ili test fluorescentne polarizacije.

[0044] Korišćenjem antigena iz N- ili C-terminalnih regiona hPG, mogu se generisati antitela koja prepoznaju različite epitope hPG. Epitop koji prepoznaje monoklonsko antitelo će zavisiti od konkretnog antigena koji je upotrebljen da podigne antitelo i može se mapirati pomoću tehnika poznatih iskusnom stručnjaku, kao što su skeniranje alanina i SPOT analiza (videti pod naslovom Primeri, niže). Na primer, mapiranje epitopa otkriva da anti-hPG MAb 2 i MAb 4 vezuju isti epitop; anti-hPG MAb 1 i MAb 3 vezuju približno isti epitop; MAb 17, MAb 18, MAb 19, i MAb 20 vezuju približno isti epitop; MAb 15 i MAb 16 vezuju približno isti epitop; anti-hPG MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb 9, i MAb 12 vezuju isti epitop i vezuju približno isti epitop kao anti-hPG MAb 10; i anti-hPG MAb 11 i MAb 14 vezuju približno isti epitop.

[0045] Da li ili ne monoklonsko antitelo na hPG prepoznaje konkretan epitop se može odrediti pomoću testa kompeticije, kao što je opisano ovde, u kom je poznat epitop vezan za referentno antitelo. U nekim rešenjima, monoklonsko antitelo na hPG je u kompeticiji sa referentnim antitelom koje vezuje epitop koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara N-terminalnom regionu hPG. U nekim specifičnim rešenjima, monoklonska antitela na hPG su u kompeticiji sa referentnim antitelom koje vezuje epitop koji uključuje ostatke 10 do 14 hPG (SEQ ID NO:28), ostatke 9 do 14 hPG (SEQ ID NO:29), ostatke 4 do 10 hPG (SEQ ID NO:30), ostatke 2 do 10 hPG (SEQ ID NO:31), ili ostatke 2 do 14 hPG (SEQ ID NO:32). U nekim rešenjima, monoklonsko antitelo na hPG je u kompeticiji sa referentnim antitelom koje vezuje epitop koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara C-terminalnom regionu hPG. U nekim specifičnim rešenjima, monoklonska antitela na hPG su u kompeticiji sa referentnim antitelom koje vezuje epitop koji uključuje ostatke 71 do 74 hPG (SEQ ID NO:33), ostatke 69 do 73 hPG (SEQ ID NO:34), ostatke 76 do 80 hPG (SEQ ID NO:35), ili ostatke 67 do 74 hPG (SEQ ID NO:36).

[0046] Monoklonska antitela na PG mogu biti neutrališuća. Bez namere o vezivanju za bilo koju teoriju o mehanizmu, misli se da, kroz vezivanje za PG, neutrališuća monoklonska antitela na hPG blokiraju ili inhibiraju njegovu sposobnost da interaguje sa svojim signalnim partnerima. Ovo, sa svoje strane, inhibira put prenosa signala u ćelijama kolorektalnog tumora koji bi inače doveo do proliferacije, smanjene diferencijacije ćelija i ćelijske smrti. U nekim rešenjima, neutrališuća monoklonska antitela na PG vezuju N-terminalni region hPG. U nekim specifičnim rešenjima, neutrališuća monoklonska antitela na PG su u kompeticiji za vezivanje PG sa anti-hPG MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb 16, MAb 17, MAb 18, MAb 19 ili MAb 20. U nekim drugim rešenjima, neutrališuća monoklonska antitela na PG vezuju C-terminalni region hPG. U nekim specifičnim rešenjima, neutrališuća monoklonska antitela na PG su u kompeticiji za vezivanje PG sa anti-hPG MAb 5, MAb 6, MAb 7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb21, MAb 22 ili MAb23.

[0047] Specifičan test za određivanje da li je monoklonsko antitelo na PG neutrališuće može da se izvede na sledeći način. CRC LS174T ćelije se zaseju na ploču sa 6 udubljenja, kao što je opisano u Primeru 7 niže, sa približno 50000 ćelija po udubljenju. Ćelije se zatim tretiraju u intervalima od 12 sati na 48 sati testiranim monoklonskim antitelom na PG ili kontrolnim monoklonskim antitelom kao što je naznačeno u Primeru 7, u koncentracijama antitela od oko 5 µg/mL. Testirano antitelo se u testu definiše kao neutrališuće, ako broj CRC kancerskih ćelija tretiranih testiranim antitelom pokazuje statistički značajno smanjenje od bar 10% od broja preživelih ćelija u poređenju sa brojem ćelija tretiranih kontrolnim nespecifičnim antitelom, uz upotrebu dvostranog Mann-Whitney testa (gde se razlike smatraju značajnim kad je p<0,05). Ukupni brojevi ćelija su korigovani za broj ćelija na početku perioda tretmana, što je označeno sa T0.

[0048] Kao što se ovde koristi, antitelo (Ab) se odnosi na molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za, ili je imunološki reaktivan na, konkretan antigen i uključuje poliklonske, monoklonske, genetički inženjerisane i na drugi način modifikovane oblike antitela, uključujući, ali bez ograničenja, himerna antitela, humanizovana antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen, uključujući npr., Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG, i scFv fragmente. U različitim rešenjima, monoklonska antitela na hPG sadrže ceo ili deo konstantnog regiona antitela. U nekim rešenjima, konstantan region je izotip odabran od: IgA (npr., IgA1 ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i IgM.

[0049] Termin "monoklonsko antitelo", kao što se ovde koristi, nije ograničen na antitela proizvedena putem hibridomske tehnologije. Monoklonsko antitelo je izvedeno iz jednog jedinog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski, ili klon faga, na bilo koji način koji je dostupan ili poznat u struci. Monoklonska antitela korisna u predmetnoj prijavi se mogu dobiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u struci, uključujući upotrebu hibridomskih, rekombinantnih i tehnologija ispoljavanja na fazima, ili njihove kombinacije. U mnogim upotrebama predmetne prijave, uključujući in vivo upotrebu monoklonskih antitela na hPG u ljudima i in vitro testove detekcije, himerna, primatizovana, humanizovana ili humana antitela se mogu pogodno koristiti.

[0050] Termin "scFv" se odnosi na jednolančano Fv antitelo u kom su varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca iz tradicionalnog antitela spojeni da formiraju jedan lanac.

[0051] Reference na "VH" se odnose na varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca antitela, uključujući težak lanac Fv, scFv ili Fab. Reference na "VL" se odnose na region imunoglobulinskog lakog lanca, uključujući lak lanac Fv, scFv, dsFv i Fab. Antitela (Ab) i imunoglobulini (Ig) su glikoproteini koji imaju iste strukturne karakteristike. Dok antitela ispoljavaju specifičnost vezivanja za specifičnu metu, imunoglobulini uključuju i antitela i druge molekule slične antitelu kojima nedostaje specifičnost u odnosu na metu. Nativna antitela i imunoglobulini su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki težak lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) i iza njega niz konstantnih domena. Svaki lak lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantan domen ina svom drugom kraju.

[0052] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR). CDR-ovi su poznati i kao hipervarijabilni regioni u varijabilnim domenima i lakog lanca i teškog lanca. Konzervisaniji delovi varijabilnih domena se zovu okvirni (FR). Kao što je poznato u struci, aminokiselinska pozicija/granica koja razgraničava hipervarijabilni region antitela može da varira, u zavisnosti od konteksta i različitih definicija poznatih u struci. Na neke pozicije unutar varijabilnog domena može se gledati kao na hibridne hipervarijabilne pozicije u smislu da te pozicije mogu da smatraju da su unutar hipervarijabilnog regiona u jednom skupu kriterijuma, dok se smatraju da su van hipervarijabilnog regiona u različitom skupu kriterijuma. Jedna ili više ovih pozicija se može naći i u produženim hipervarijabilnim regionima. Ova prijava obezbeđuje antitela koja sadrže modifikacije u tim hibridnim hipervarijabilnim pozicijama. Svaki od varijabilnih domena nativnog teškog i lakog lanca sadrži četiri FR regiona, u velikoj meri uzimajući konfiguraciju β ravni, spojenih pomoću tri CDR, koji formiraju petlje koje spajaju i, u nekim slučajevima, čine deo strukture β ravni. CDR-ovi u svakom lancu se drže zajedno u bliskom susedstvu pomoću FR regiona i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju ciljnog mesta vezivanja antitela (Videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md.1987).

[0053] Identifikovano je nekoliko monoklonskih antitela na hPG koja imaju visoku specifičnost i afinitet za hPG i dobro antitumorsko dejstvo i njihovi CDR i varijabilni teški i laki lanci su sekvencirani. Mišji varijabilni domeni teškog i lakog lanca su ovde označeni kao mVHi mVL, iza čega sledi broj koji odgovara monoklonskom antitelu, na primer, mVH.3 i mVL.3 za anti-hPG MAb3. Monoklonska antitela na hPG imaju tri varijabilna CDR lakog lanca i tri varijabilna CDR teškog lanca, označena kao VHCDR1, 2 ili 3 i VLCDR1, 2 ili 3, respektivno, iza čega sledi broj datog monoklonskog antitela na hPG. Na primer, VLCDR1 MAb 3 je označen kao VLCDR1.3, a VHCDR1 MAb 3 je označen kao VHCDR1.3. Slično, varijabilni domeni teškog i lakog lanca su ovde označeni kao hVHi hVL, iza čega sledi broj koji odgovara monoklonskom antitelu.

[0054] U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG podignuta na N-terminalni deo hPG imaju tri varijabilna CDR lakog lanca i tri varijabilna CDR teškog lanca, gde je VLCDR1 odabran od QSIVHSNGNTY ("VLCDR 1.3"; SEQ ID NO:4), QSLVHSSGVTY ("VLCDR 1.4"; SEQ ID NO:10), QSLLDSDGKTY ("VLCDR 1.16"; SEQ ID NO:50), i SQHRTYT ("VLCDR 1.19"; SEQ ID NO:51); VLCDR2 je odabran od KVS ("VLCDR 2.3" i ("VLCDR 2.4"; SEQ ID NO:5), LVS ("VLCDR 2.16"; SEQ ID NO:53), i VKKDGSH ("VLCDR 2.19"; SEQ ID NO:54); VLCDR3 je odabran od FQGSHVPFT ("VLCDR 3.3"; SEQ ID NO:6), SQSTHVPPT ("VLCDR 3.4"; SEQ ID NO:11), WQGTHSPYT ("VLCDR 3.16"; SEQ ID NO:57) i GVGDAIKGQSVFV ("VLCDR 3.19"; SEQ ID NO:58); VHCDR1 je odabran od GYIFTSYW ("VHCDR 1.3"; SEQ ID NO:1), GYTFSSSW ("VHCDR 1.4"; SEQ ID NO:7), GYTFTSYY ("VHCDR 1.16"; SEQ ID NO:39), i GYSITSDYA ("VHCDR 1.19"; SEQ ID NO:40); VHCDR2 je odabran od FYPGNSDS ("VHCDR 2.3"; SEQ ID NO:2), FLPGSGST ("VHCDR 2.4"; SEQ ID NO:8), INPSNGGT ("VHCDR 2.16"; SEQ ID NO:43) i ISFSGYT ("VHCDR 2.19"; SEQ ID NO:44) i VHCDR3 je odabran od TRRDSPQY ("VHCDR 3.3"; SEQ ID NO:3), ATDGNYDWFAY ("VHCDR 3.4" SEQ ID NO:9), TRGGYYPFDY ("VHCDR 3.16"; SEQ ID NO:47) i AREVNYGDSYHFDY ("VHCDR 3.19"; SEQ ID NO:48). Videti Tabelu 1A.

[0055] U nekim rešenjima, monoklonska antitela na hPG podignuta na C-terminalni deo hPG imaju tri varijabilna CDR lakog lanca i tri varijabilna CDR teškog lanca, gde je VLCDR1 odabran od KSLRHTKGITF ("VLCDR 1.8"; SEQ ID NO:49) i QSLLDSDGKTY ("VLCDR 1.13"; SEQ ID NO:50); VLCDR2 je odabran od QMS ("VLCDR 2.8"; SEQ ID NO:52) i LVS ("VLCDR 2.13"; SEQ ID NO:53); VLCDR3 je odabran od AQNLELPLT ("VLCDR 3.8"; SEQ ID NO:55) i WQGTHFPQT ("VLCDR 3.13"; SEQ ID NO:56); VHCDR1 je odabran od GFTFTTYA ("VHCDR 1.8"; SEQ ID NO:37) i GFIFSSYG ("VHCDR 1.13"; SEQ ID NO:38); VHCDR2 je odabran od ISSGGTYT ("VHCDR 2.8"; SEQ ID NO:41) i INTFGDRT ("VHCDR 2.13"; SEQ ID NO:42); i VHCDR3 je odabran od ATQGNYSLDF ("VHCDR 3.8"; SEQ ID NO:45) i ARGTGTY ("VHCDR 3.13"; SEQ ID NO:46). Videti Tabelu 1B.

[0056] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.3, VHCDR2.3 i VHCDR3.3. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.3 (SEQ ID NO:12). Videti SL.2A.

[0057] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.3, VLCDR2.3 i VLCDR3.3. U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.3 (SEQ ID NO:13). Videti SL.2B.

[0058] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.4, VHCDR2.4 i VHCDR3.4. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima sekvencu koja odgovara mVH.4 (SEQ ID NO:14). Videti SL.2C.

[0059] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.4, VLCDR2.4 i VLCDR3.4 U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.4 (SEQ ID NO:15). Videti SL.2D.

[0060] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.8, VHCDR2.8 i VHCDR3.8. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima sekvencu koja odgovara mVH.8 (SEQ ID NO:59). Videti SL.2E.

[0061] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.8, VLCDR2.8 i VLCDR3.8. U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.8 (SEQ ID NO:63). Videti SL.2F.

[0062] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.13, VHCDR2.13 i VHCDR3.13. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima sekvencu koja odgovara mVH.13 (SEQ ID NO:60). Videti SL.2G.

[0063] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.13, VLCDR2.13 i VLCDR3.13. U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.13 (SEQ ID NO:64). Videti SL.

2H.

[0064] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.16, VHCDR2.16 i VHCDR3.16. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima sekvencu koja odgovara mVH.16 (SEQ ID NO:61). Videti SL.2I.

[0065] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.16, VLCDR2.16 i VLCDR3.16. U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.16 (SEQ ID NO:65). Videti SL.

2J.

[0066] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.19, VHCDR2.19 i VHCDR3.19. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima sekvencu koja odgovara mVH.19 (SEQ ID NO:62). Videti SL.2K.

[0067] U nekim rešenjima, CDR-ovi VLlanca monoklonskog antitela na hPG su VLCDR1.19, VLCDR2.19 i VLCDR3.19. U jednom specifičnom rešenju, VLlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.19 (SEQ ID NO:66). Videti SL.

2L.

[0068] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.3, VHCDR2.3 i VHCDR3.3, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.3, VLCDR2.3 i VLCDR3.3. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na PG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.3 (SEQ ID NO: 12), a VLlanac ima sekvencu koja odgovara mVL.3 (SEQ ID NO:13).

[0069] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.4, VHCDR2.4 i VHCDR3.4, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.4, VLCDR2.4 i VLCDR3.4. U jednom specifičnom rešenju, VHlanac monoklonskog antitela na hPG ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.4 (SEQ ID NO:14), a VLlanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.4 (SEQ ID NO:15).

[0070] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.8, VHCDR2.8 i VHCDR3.8, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.8, VLCDR2.8 i VLCDR3.8. U jednom specifičnom rešenju, monoklonsko antitelo na hPG je anti-hPG MAb 8 opisano ovde i sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.8 (SEQ ID NO:59) i aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.8 (SEQ ID NO:63).

[0071] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.3, VHCDR2.13 i VHCDR3.13, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.13, VLCDR2.13 i VLCDR3.13. U jednom specifičnom rešenju, monoklonsko antitelo na hPG je anti-hPG MAb 13 opisano ovde i sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.13 (SEQ ID NO:60) i aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.13 (SEQ ID NO:64).

[0072] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.16, VHCDR2.16 i VHCDR3.16, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.16, VLCDR2.16 i VLCDR3.16. U jednom specifičnom rešenju, monoklonsko antitelo na hPG je anti-hPG MAb 16 opisano ovde i sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.16 (SEQ ID NO:61) i aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.16 (SEQ ID NO:65).

[0073] U nekim rešenjima, CDR-ovi VHlanca monoklonskog antitela na hPG su VHCDR1.19, VHCDR2.19 i VHCDR3.19, a CDR-ovi VLlanca su VLCDR1.19, VLCDR2.19 i VLCDR3.19. U jednom specifičnom rešenju, monoklonsko antitelo na hPG je anti-hPG MAb 19 opisano ovde i sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVH.19 (SEQ ID NO:62) i aminokiselinsku sekvencu koja odgovara mVL.19 (SEQ ID NO:66).

[0074] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave uključuju i intaktne molekule i fragmente antitela (kao što su, na primer, Fab i F(ab')2fragmenti) koji su sposobni da specifično se vežu za hPG. Fab i F(ab')2fragmentima nedostaje Fc fragment intaktnog antitela, oni brže nestaju iz cirkulacije životinje ili biljke i mogu da imaju manje nespecifično vezivanje za tkivo nego intaktno antitelo (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med.24:316). Fragmenti antitela su, prema tome, još korisni u terapijskim primenama između ostalih primena.

[0075] Termin "fragment antitela" se odnosi na deo antitela pune dužine, generalno za vezivanje mete ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente. "Fv" fragment je minimalan fragment antitela koje sadrži potpuno prepoznavanje mete i mesto vezivanja. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnih domena jednog teškog i jednog lakog lanca u tesnom, nekovalentnom udruživanju (VH-VLdimer). U ovoj konfiguraciji tri CDR svakog varijabilnog domena interaguju da definišu mesto vezivanja za metu na površini VH-VLdimera. Često, šest CDR-ova daju antitelu specifičnost vezivanja za metu. Međutim, u nekim primerima, čak i jedan jedini varijabilni domen (ili pola Fv koja sadrži samo tri CDR specifična za metu) može da ima sposobnost da prepozna i veže metu, iako sa nižim afinitetom nego celo mesto vezivanja. "Jednolančani Fv" ili "scFv" fragment antitela sadrži VHi VLdomene antitela, gde su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje mete. "Jednodomenska antitela" se sastoje od jednog VHili VLdomena koji ispoljava dovoljan afinitet prema hPG. U jednom specifičnom rešenju, jednodomensko antitelo je kamilizovano antitelo (Videti, npr., Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

[0076] Fab fragment sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodatku od nekoliko ostataka na karboksil kraju CHldomena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. F(ab') fragmenti se proizvode cepanjem disulfidne veze na zglobnim cisteinima produkta F(ab')2pepsinske digestije. Dodatna hemijska kuplovanja fragmenata antitela su poznata stručnjacima uobičajenog nivoa.

[0077] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave mogu biti himerna antitela. Termin "himerno" antitelo, kao što se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje ima variabilne sekvence izvedene iz ne-humanih imunoglobulina, kao što je pacovsko ili mišje antitelo, i konstantne regione humanih imunoglobulina, tipično izabrane iz matrice humanih imunoglobulina. Metodi za proizvodnju himernog antitela su poznati u struci. Videti, npr., Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos.5,807,715; 4,816,567 i 4,816397.

[0078] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave mogu biti humanizovana. "Humanizovani" oblici ne-humanih (npr., mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge podsekvence antitela za vezivanje mete) koji sadrže minimalne sekvence izvedene iz nehumanih imunoglobulina. U opštem slučaju, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od bar jednog, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz konsenzus sekvence humanog imunoglobulina, i mogu se označavati kao "preneseni CDR-om". Humanizovano antitelo može da sadrži i bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onaj iz humane imunoglobulinske konsenzus sekvence. Metodi humanizacije antitela, uključujući metode dizajniranja humanizovanih antitela, su poznati u struci. Videti, npr., Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol.27:55-77; Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res.37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent Nos: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762 i 6,180,370 do Queen et al.; EP239400; PCT publikacija WO 91/09967; U.S. Patent No.

5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Imunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; i U.S. Patent No.5,565,332.

[0079] Sekvence za humanizovana monoklonska antitela na hPG su dizajnirane iz mišjih monoklonskih antitela na hPG iz predmetne prijave, kao što je opisano u Primerima, niže. Specifična rešenja humanizovanih antitela uključuju antitela koja sadrže: (1) bilo koja tri VL CDR i bilo koja tri VH CDR opisana ovde; (2) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:21 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:22; (3) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:23 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:24; (4) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:75, 77 i 79 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:76 i 78; (5) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:80 i 82 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:81 i 83; (6) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:84, 86 i 88 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:85, 87 i 89; (7) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:90, 92 i 94 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:91, 93, i 95.

[0080] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave se mogu primatizovati. Termin "primatizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži majmunske varijabilne regione i humane konstantne regione. Metodi za proizvodnju primatizovanih antitela su poznati u struci. Videti, npr., U.S. Patent Nos.5,658,570; 5,681,722 i 5,693,780.

[0081] Unutar monoklonskih antitela na hPG su antitela koja su u kompeticiji sa referentnim antiteloa, kao što je, na primer, poliklonsko antitelo na hPG, ili bilo koje od monoklonskih antitela na hPG opisanih ovde. Antitela koja su u kompeticiji sa monoklonskim antitelima na hPG iz ove prijave su korisna za niz dijagnostičkih i terapijskih primena. Specifična rešenja pogodnih referentnih monoklonskih antitela na hPG uključuju antitela opisana ovde, na primer, ali bez ograničenja: antitela koja sadrže bilo koja tri VL CDR i bilo koja tri VH CDR opisana ovde; antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:12 (mVH.3), a VL lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:13 (mVL.3) i antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:14 (mVH.4), a VL lanac ima sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:15 (mVL.4), antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:59 (mVH.8), a VL lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:63 (mVL.8); antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:60 (mVH.13), a VL lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:64 (mVL.13); antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:61 (mVH.16), a VL lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:65 (mVL.16); antitela u kojima VH lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:62 (mVH.19), a VL lanac ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:66 (mVL.19) ili bilo koja kombinacija VH i VL lanaca opisana ovde.

[0082] Pogodna referentna antitela uključuju i antitela koja proizvodi hibridom odabran iz grupe koja se sastoji od 43B9G11, WE5H2G7, 6B5B11C10, 20D2C3G2, 1B4A11D11, 1B6A11F2, 1B11E4B11, 1C10D3B9, 1D8F5B3, 1E1C7B4, 2B4C8C8, 2B11E6G4, 2C6C3C7, 2H9F4B7, 1E9A4A4, 1E9D9B6, 1C8D10F5, 1A7C3F11, 1B3B4F11, 1C11F5E8, 1F11F5E10, 1F11F5G9, i 1A11F2C9; antitela koja vezuju epitop koji uključuje ostatke 10 do 14 hPG (SEQ ID NO:28), ostatke 9 do 14 hPG (SEQ ID NO:29), ostatke 4 do 10 hPG (SEQ ID NO:30), ostatke 2 do 10 hPG (SEQ ID NO:31), ili ostatke 2 do 14 hPG (SEQ ID NO:32) i antitela koja vezuju epitop koji uključuje ostatke 71 do 74 hPG (SEQ ID NO:33), ostatke 69 do 73 hPG (SEQ ID NO:34), ostatke 76 do 80 hPG (SEQ ID NO:35), ili ostatke 67 do 74 hPG (SEQ ID NO:36).

[0083] Sposobnost da bude u kompeticiji sa monoklonskim antitelom iz predmetne prijave za vezivanje za PG, na primer hPG, se može testirati pomoću kompeticionog testa na sledeći način. Ploče sa 96 udubljenja su obložene antitelom hvatačem (poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje N- ili C-terminalni region progastrina koji se razlikuje od epitopa prepoznatog od strane referentnog monoklonskog antitela), u koncentraciji koja se bira iz opsega 1-10 µg/ml, preko noći, na 4°C (0,1 do 1µg/udubljenje). Posle blokiranja pomoću 0,1% Tween-20/0,1% BSA u PBS (pufer za blokiranje) 2h na 22°C, rekombinantni humani progastrin je dodat u koncentraciji od 10pM do 1nM (10 do 1000 pg/udubljenje) i inkubirane su 2h na 22°C. Posle toga, biotinilovano referentno monoklonsko antitelo na hPG ili smesa koja sadrži referentno monoklonsko antitelo je dodata zajedno sa rastućim koncentracijama neobeleženog testiranog antitela i inkubirano je 1 sat na 22°C. Posle pranja je izvedena detekcija inkubiranjem 1h na 22°C sa fluorogenim supstratom za peroksidazu rena, a zatim kvantifikacija relativnih svetlosnih jedinica (RLU) u luminometru. Testovi su izvođeni u duplikatu. Antitela u kompeticiji sa referentnim monoklonskim antitelom na hPG iz predmetne prijave inhibiraju vezivanje referentnog antitela na hPG. Antitelo koje se vezuje za isti epitop kao kontrolna antitela će biti u stanju da efektivno uđe u kompeticiju za vezivanje i time će značajno smanjiti (na primer, za bar 50%) vezivanje referentnog antitela, kao što je pokazano smanjenjem vezanog obeleživača. Reaktivnost (obeleženog) referentnog antitela u odsustvu potpuno irelevantnog antitela bi bila kontrolna gornja vrednost. Kontrolna donja vrednost bi bila dobijena inkubiranjem neobeleženog testiranog antitela sa ćelijama koje eksprimiraju progastrin, a zatim inkubiranjem smese ćelije/antitela sa obeleženenim kontrolnim antitelima potpuno istog tipa, kad bi se pojavila kompeticija i smanjilo vezivanje obeleženih antitela. U testu, značajno smanjenje reaktivnosti obeleženog antitela u prisustvu testiranog antitela je indikativno za testirano antitelo koje prepoznaje suštinski isti epitop.

[0084] Inhibicija vezivanja može da izrazi kao konstanta inhibicije, ili Ki, koja se izračunava po sledećoj formuli:

Ki = IC50/ (1 [koncentracija referentnog Ab] / Kd)

gde je IC50 testiranog antitela koncentracija testiranog antitela koja dovodi do 50% smanjenja u vezivanju referentnog antitela, a Kd je konstanta disocijacije referentnog antitela, mera njegovog afiniteta za progastrin. Antitela koja su u kompeticiji sa monoklonskim antitelima na hPG opisanim ovde mogu da imaju Ki od 10 pM do 10 nM u uslovima testa opisanim ovde.

[0085] U različitim rešenjima, neobeleženo monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave smanjuje vezivanje obeleženog referentnog antitela za bar 40%, za bar 50%, za bar 60%, za bar 70%, za bar 80%, za bar 90%, za 100%, ili za procenat koji se kreće između bilo koje dve vrednosti date gore (npr., monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave smanjuje vezivanje obeleženog referentnog antitela za 50% do 70%) kad se monoklonsko antitelo na hPG koristi u koncentraciji od 0,01 µg/ml, 0,08 µg/ml, 0,4 µg/ml, 2 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml ili u koncentracija koji se kreće između bilo koje dve vrednosti date gore (npr., u koncentraciji koja se kreće od 2 µg/ml do 10 µg/ml).

[0086] U vođenju studije kompeticije između referentnog antitela i bilo kog od testiranih antitela (bez obzira na vrstu ili izotip), može se prvo obeležiti referentno detektabilnim obeleživačem, kao što je, biotin ili enzimski (ili čak radioaktivan) obeleživač da bi se omogućila identifikacija. U tom slučaju, obeleženo referentno antitelo (u fiksiranim ili rastućim koncentracijama) se inkubira sa poznatom količinom progastrina. Neobeleženo testirano antitelo se zatim doda u prethodno vezan kompleks progastrina i obeleženog antitela. Meri se intenzitet vezanog obeleživača. Ako je testirano antitelo u kompeticiji sa obeleženim antitelom za vezivanje za preklapajući epitop, intenzitet će se smanjiti u odnosu na vezivanje kontrolnog obeleženog antitela u odsustvu testiranog antitela.

[0087] Testovi za kompeticiju su poznati i mogu se prilagoditi da daju uporedljive rezultate sa testom opisanim gore. Test može biti bilo koji iz opsega imunoloških testova zasnovan na kompeticiji antitela, a referentna antitela bi bila detektovana posredstvom njihovog obeleživača, npr., korišćenjem streptavidina u slučaju biotinilovanih antitela ili korišćenjem hromogenog supstrata u vezi sa enzimskim obeleživačem (kao što je 3,3'5,5'-tetrametilbenzidinski (TMB) supstrat sa enzimom peroksidazom) ili prosto detektovanjem radioaktivnog obeleživača ili fluorescentnog obeleživača.

[0088] Ovde su uključena i monoklonska antitela na hPG koja su izvedena, kovalentno modifikovana, ili konjugovana sa drugim molekulima, za upotrebu u dijagnostičkim i terapijskim primenama. Na primer, ali bez ograničenja, izvedena antitela uključuju antitela koja su modifikovana, npr., glikozilacijom, acetilacijom, pegovanjem, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom pomoću zaštitnih/blokirajućih grupa, proteoliticčkim cepanjem, vezivanjem za ćelijske ligande ili neki drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može da se izvede pomoću poznatih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja, specifična hemijska cepanja, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Pored toga, derivat može da sadrži jednu ili više ne-klasičnih aminokiselina.

[0089] U jednom drugom primeru, antitela iz predmetne prijave se mogu zakačiti za poli(etilenglikol) (PEG) grupe. U jednom specifičnom rešenju, antitelo je fragment antitela i PEG grupe su spojene preko bilo kog dostupnog aminokiselinskog bočnog lanca ili terminalne aminokiselinske funkcionalne grupe locirane u ovom fragmentu antitela, na primer, bilo koja slobodna amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupa. Takve aminokiseline mogu prirodno da se pojave u fragmentu antitela ili se mogu inženjerisati u fragment metodima rekombinantne DNK. Videti, na primer, U.S. Patent No. 5,219,996. Mnoga mesta mogu da se iskoriste za vezivanje dva ili više PEG molekula. PEG grupe se mogu kovalentno vezati preko tiol grupe bar jednog cisteinskog ostatka lociranog u fragmentu antitela. Kad se tiol grupa koristi kao tačka veze, mogu se koristiti adekvatno aktivirane efektorske grupe, na primer, tiol-selektivni derivati, kao što su maleimidi i derivati cisteina.

[0090] U jednom specifičnom primeru, konjugat monoklonskog antitela na hPG je modifikovan Fab' fragment koji je PEGovan, tj., ima kovalentno vezan PEG (poli(etilenglikol)), npr., u skladu sa metodom opisanim u EP0948544. Videti i Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997) i Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998) i Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. PEG se može vezati za cistein u zglobnom regionu. U jednom primeru, Fab' fragment modifikovan PEG-om ima maleimid grupu kovalentno vezanu za jednu tiol grupu u modifikovanom zglobnom regionu. Lizinski ostatak se može kovalentno vezati za maleimidnu grupu, a za svaku od amino grupa na lizinskom ostatku se može vezati metoksipoli(etilenglikol) polimer koji ima molekulsku težinu od približno 20,000 Da. Ukupna molekulska težina PEGa vezanog za Fab' fragment, prema tome, može da bude približno 40,000 Da.

[0091] Monoklonska antitela na hPG uključuju obeležena antitela, korisna u dijagnostičkim primenama. Antitela se mogu koristiti dijagnostički, na primer, za detekciju ekspresije mete od interesa u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu; ili za praćenje razvoja ili napredovanja imunološkog odgovora kao dela procedure kliničkog testiranja da bi se, npr., odredila efikasnost datog režima lečenja. Detekcija se može olakšati kuplovanjem antitela sa detektabilnom supstancom ili "obeleživačem". Obeleživač se može konjugovati direktno ili indirektno sa monoklonskim antitelom na hPG iz ove prijave. Sam obeleživač može biti detektabilan (npr., radioizotopski obeleživači, izotopski obeleživači, ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskog obeleživača, može da katalizuje hemijsku promenu supstratnog jedinjenja ili sastava koji je detektabilan. Primeri detektabilnih supstanci uključuju razne enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitrone pomoću raznih pozitronska emisionih tomografija i neradioaktivne paramagnetne jone metala. Detektabilne supstance se mogu kuplovati ili konjugovati bilo direktno sa antitelom (ili njegovim fragmentom), bilo indirektno, preko intermedijera (kao što je, na primer, linker poznat u struci) korišćenjem tehnika poznatih u struci. Primeri enzmskih obeleživača uključuju luciferaze (npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza; U.S. Patent No.

4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što su peroksidaza rena (HRPO), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, acetilholinesteraza, glikoamilaza, lizozim, saharidne oksidaze (npr., glukozna oksidaza, galaktozna oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterociklične oksidaze (kao što su urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidaza, mikroperoksidaza i slično. Primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid, dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, ili fikoeritrin i slično; primeri luminescentnih materijala uključuju luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin; primeri pogodnih izotopnih materijala uključuju<13>C,<15>N i deuterijum i primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju<125>I,<131>I,<111>In ili<99>Tc.

[0092] Monoklonska antitela na hPG poreklom iz svih vrsta su uključena u predmetnu prijavu. Neograničavajući primeri prirodnih antitela uključuju antitela izvedena iz ljudi, majmuna, kokoški, koza, zečeva i glodara (npr., pacovi, miševi i hrčci) (Videti, npr., Lonberg et al., WO93/12227; U.S. Pat. No. 5,545,806; i Kucherlapati, et al., WO91/10741; U.S. Pat. No. 6,150,584). Prirodna antitela su antitela koja proizvodi životinja domaćin pošto je bila imunizovana antigenom, kao što je polipeptid.

Nukleinske kiseline i sistemi za ekspresiju

[0093] Predmetna prijava obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji sadrže gene koji kodiraju imunoglobulinski lak i težak lanac za monoklonska antitela na hPG, vektore koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije domaćine sposobne da proizvedu monoklonska antitela na hPG iz ove prijave.

[0094] Monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave se može dobiti rekombinantnom ekspresijom gena za imunoglobulinski lak i težak lanac u ćeliji domaćinu. Da bi rekombinantno eksprimirala antitelo, ćelija domaćin se transfektuje jednim ili više vektora za rekombinantnu ekspresiju koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinski lak i težak lanac antitela tako da se lak i težak lanac eksprimiraju u ćeliji domaćinu i, opciono, sekretuju u medijum u kom su ćelije domaćini gajene, iz kog medijuma se antitela mogu sakupiti. Standardne metodologije rekombinantne DNK se koriste za dobijanje gena za težak i lak lanac antitela, inkorporisanje ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore i uvođenje vektora u ćelije domaćine, kao što su one opisane u Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) i u U.S. Patent No.4,816,397.

[0095] Da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju takva monoklonska antitela na hPG, prvo se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca. Ove DNK se mogu dobiti amplifikovanjem i modifikovanjem embrionske DNK ili cDNK koja kodira varijabilne sekvence lakog i teškog lanca, na primer, primenom polimerazne lančane reakcije (PCR). Embrionske sekvence DNK za humane gene za varijabilni region teškog i lakog lanca su poznate u struci (Videti, npr., Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; baza podataka humanih embrionskih sekvenci "VBASE"; videti i Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija br. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; i Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol.

24:827-836).

[0096] Jednom kad su dobijeni fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLsegmente vezane za monoklonsko antitelo na hPG, ovi fragmenti DNK mogu dalje biti manipulisani standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, da se geni varijabilnog regiona konvertuju u gene za ceo lanac antitela, u gene za Fab fragment ili u gene za scFv. U ovim manipulacijama, DNK koji kodira VL- ili VH- fragment je operativno vezan za jedan frugi fragment DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilan linker. Termin "operativno vezan", kao što se koristi u ovom kontekstu, je namenjen da znači da su dva fragmenta DNK spojena tako da aminokiselinske sekvence koje kodiraju ova dva fragmenta DNK ostaju u okviru.

[0097] Izolovana DNK koja kodira VHregion se može konvertovati u gen za celu dužinu teškog lanca operativnim vezivanjem DNK koja kodira VHza drugi molekul DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, CH3i, opciono, CH4). Geni za sekvence konstantnog regiona humanog teškog lanca su poznati u struci (Videti, npr., Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija br.91-3242), a fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione se mogu dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali u određenim rešenjima je konstantni region IgG1ili IgG4. Za gen za težak lanac Fab fragmenta, DNK koja kodira VHse može operativno vezati za drugi molekul DNK koji kodira samo konstantni region teškog lanca CH1.

[0098] Izolovana DNK koja kodira VLregion se može konvertovati u gen za celu dužinu lakog lanca (kao i za gen za lak lanac Fab) operativnim vezivanjem za drugi molekul DNK koji kodira konstantne regione lakog lanca, CL. Geni za sekvence konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznati u struci (Videti, npr., Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija br. 91-3242)), a fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione se mogu dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti konstantni region kapa ili lambda, ali u određenim rešenjima je konstantni region kapa. Da bi se kreirao gen za scFv, fragmenti DNK koji kodiraju VH- i VL- su operativno vezani za jedan frugi fragment koji kodira fleksibilan linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4∼Ser)3(SEQ ID NO: 99), tako da se sekvence VHi VLmogu eksprimirati kao susedan jednolančani protein, sa VLi VHregionima spojenim preko fleksibilnog linkera (Videti, npr., Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).

[0099] Da bi se eksprimirala monoklonska antitela na hPG iz ove prijave, DNK koje kodiraju deo ili celu dužinu lakog i teškog lanca, dobijene kao što je opisano gore, su ubačene u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani za transkripcione i translacione kontrolne sekvence. U ovom kontekstu, termin "operativno vezan" treba da znači da je gen za antitelo ligiran u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojoj namenjenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su odabrane tako da budu kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćinom. Gen za lak lanac antitela i gen za težak lanac antitela su ubačeni u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su ubačena u isti ekspresioni vektor.

[0100] Geni antitela su insertovani u ekspresioni vektor standardnim metodima (npr., ligacija komplementarnih mesta restrikcije za gen i vektor za fragment antitela, ili ligacija ravnog kraja ako mesta restrikcije nisu prisutna). Pre insercije sekvenci lakog ili teškog lanca vezanih za monoklonsko antitelo na hPG, ekspresioni vektor može već da nosi sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup pretvaranju VHi VLsekvenci vezanih za monoklonsko antitelo na hPG u gene za celu dužinu antitela je da se one ubace u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i lakog lanca, respektivno, tako da segment VHbude operativno vezan za CH segment(e) unutar vektora, a segment VLbude operativno vezan za CL segment unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji facilitira sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitela se može klonirati u vektor tako da signalni peptid bude vezan u okviru čitanja za amino kraj lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid koji nije iz imunoglobulinskog proteina).

[0101] Kao dodatak genima za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz ove prijave nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lance antitela u ćeliji domaćinu. Termin "regulatorne sekvence" treba da uključuje promotore, enhansere i ostale kontrolne elemente ekspresije (npr., signale za poliadenilaciju) koji kontrolišu transkripciju i translaciju gena za lance antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Stručnjaci će znati da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju sisarskih ćelija domaćina uključuju virusne elemente koji prave visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili enhanseri izvedeni iz citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promotor/enhanser), Simian Virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promotor/enhanser), adenovirus (npr., adenovirusni glavni kasni promotor (AdMLP)) i poliom. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, videti, npr., U.S. Patent No. 5,168,062, Stinski, U.S. Patent No. 4,510,245, Bell et al. i U.S. Patent No. 4,968,615, Schaffner et al.

[0102] Pored gena za lance antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori iz ove prijave mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr., starta replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilni marker gen facilitira izbor ćelija domaćina u koje je vektor uveden (Videti, npr., U.S. Patents Nos. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axel et al.). Na primer, tipično selektabilni marker gen daje otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Pogodni selektabilni marker geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u DHFR<->ćelijama domaćinima sa izborom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za izbor G418). Za ekspresiju lakog i teškog lanca, ekspresioni vektor(i) koji kodira težak i lak lanac je transfektovan u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina "transfekcija" treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, lipofekcija, calcijum-fosfatna precipitacija, DEAE-dekstranska transfekcija i slično.

[0103] Moguće je eksprimirati antitela iz ove prijave ili u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćinima. U određenim rešenjima, ekspresija antitela se izvodi u eukariotskim ćelijama, npr., sisarskim ćelijama domaćinima, optimalne sekrecije pravilno savijenog i imunološki aktivnog antitela. Primeri sisarskih ćelija domaćina za ekspresiju rekombinantnih antitela iz ove prijave uključuju jajnike kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman i Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), NSO mijelomske ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije. Kad se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene za antitelo uvedu u sisarske ćelije domaćine, proizvode se antitela gajenjem ćelija domaćina u vremenskom periodu dovoljnom za ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili sekreciju antitela u medijum za kulture u kom su gajene ćelije domaćini. Antitela se mogu sakupiti iz medijuma za kulture korišćenjem standardnih metoda za prečišćavanje proteina. Ćelije domaćini se mogu koristiti i za proizvodnju delova intaktnih antitela, kao što su Fab fragmenti ili molekuli scFv. Podrazumeva se da su varijacije gornje procedure u okviru predmetne prijave. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćin transfektuje pomoću DNK koja kodira ili lak lanac ili težak lanac (ali ne oba) monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave.

[0104] Tehnologija rekombinantne DNK se može koristiti i za uklanjanje dela ili cele DNK koja kodira jedan od ili oba, lak i težak lanac, koji nije neophodan za vezivanje za hPG. Molekuli eksprimirani iz takvih skraćenih molekula DNK su takođe obuhvaćeni antitelima iz ove prijave.

[0105] Za rekombinantnu ekspresiju monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave, ćelija domaćin se može ko-transfektovati pomoću dva ekspresiona vektora iz ove prijave, gde prvi vektor kodira polipeptid izveden iz teškog lanca, a drugi vektor kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Ova dva vektora mogu da sadrže identične selektabilne markere, ili svaki od njih može da sadrži drugi selektabilni marker. Alternativno, može se koristiti jedan jedini vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca.

[0106] Jednom kad je dobijena nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više delova monoklonskog antitela na hPG, dalje promene ili mutacije se mogu uvesti u kodirajuću sekvencu, na primer, da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom za Fc receptor, ili antitela različitih podklasa.

[0107] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave se mogu praviti i hemijskom sintezom (npr., metodima opisanim u Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Varijantna antitela se takođe mogu praviti korišćenjem platforme bez ćelija (Videti, npr., Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals).

[0108] Jednom kad je monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave napravljeno rekombinantnom ekspresijom, ono se može prečistiti bilo kojim metodom poznatim u struci za prečišćavanje imunoglobulinskih molekula, na primer, hromatografijom (npr., jonska izmena, afinitet i hromatografija na molekulskim sitima), centrifugiranjem, preko različite rastvorljivosti ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dalje, monoklonska antitela na hPG iz predmetne prijave ili njihovi fragmenti se mogu fuzionisati sa heterolognim polipeptidnim sekvencama kao što je opisano ovde ili na drugi način poznato u struci, da bi se olakšalo prečišćavanje.

[0109] Jednom kad je izolovano, monoklonsko antitelo na hPG može, po želji, dalje da se prečišćava, npr., tečnom hromatografijom visoke performanse (Videti, npr., Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980), ili gel filtracionom hromatografijom on a Superdex™ 75 column (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden).

[0110] Predmetna prijava obezbeđuje ćelije domaćine sposobne da proizvode monoklonska antitela na hPG. Ćelije domaćini mogu biti ćelije konstruisane pomoću tehnika rekombinantne DNK da eksprimiraju gene koji kodiraju težak i lak lanac ili hibridomi izvedeni iz pogodnog organizma i izabrani zbog sposobnosti da proizvode željena antitela.

[0111] Ćelije domaćini sposobne da proizvode monoklonska antitela na PG mogu biti hibridomi. Metodi za pravljenje hibridoma su poznati u struci (videti, npr., Kohler i Milstein, 1975, Nature 256:495) i niže je dat primer. Generalno, životinja domaćin, kao što je miš, je imunizovana imunogenom, kao što je peptid od interesa, da bi se podigao razvoj limfocita, na primer, ćelije slezine, koje proizvode antitela sposobna za specifično vezivanje imunogena. Alternativno, izolovani limfociti, uključujući ćelije slezine, ćelije linfnog čvora, ili limfociti periferne krvi, se mogu immunizovati in vitro. Limfociti se zatm fuzionišu sa imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je mijelomska ćelijska linija, korišćenjem pogodnog agensa za fuzionisanje (npr., polietilen glikol), za formiranje hibridomske ćelijske linije. Pogodne imortalizovane ćelijske linije mogu biti sisarskog porekla, kao što su mišje, goveđe ili humane. Hibridomske ćelije se zatim gaje u bilo kom pogodnom medijumu koji sadrži jednu ili više supstanci koja inhibira rast ili preživljavanje nefuzionisanih, imortalizovanih ćelija. Na primer, kad se koriste roditeljske ćelije kojima nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), fuzije mogu rasti u medijumu koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timidin ("HAT" medijum), koji inhibira rast roditeljskih, nefuzionisanih ćelija.

[0112] U nekim rešenjima, N-terminalna monoklonska antitela na hPG imaju CDR-ove varijabilnog lakog lanca (VL) koji odgovaraju VLmonoklonskog antitela koje se može dobiti iz hibridoma 43B9G11 (koji proizvodi anti-hPG MAb 1), WE5H2G7 (koji proizvodi antihPG MAb 2), 6B5B11C10 (koji proizvodi anti-hPG MAb 3), 20D2C3G2 (koji proizvodi antihPG MAb 4), 1E9A4A4 (koji proizvodi anti-hPG MAb 15), 1E9D9B6 (koji proizvodi antihPG MAb 16), 1C8D10F5 (koji proizvodi anti-hPG MAb 17), 1A7C3F11 (koji proizvodi anti-hPG MAb 18), 1B3B4F11 (koji proizvodi anti-hPG MAb 19) i 1C11F5E8 (koji proizvodi anti-hPG MAb 20).

[0113] U nekim rešenjima, N-terminalna monoklonska antitela na hPG imaju CDR-ove VLi VHkoji odgovaraju CDR-ovima VLi VHmonoklonskih antitela koja se mogu dobiti iz gornjih hibridoma.

[0114] U nekim rešenjima, C-terminalna monoklonska antitela na hPG imaju CDR-ove VLkoji odgovaraju VLmonoklonskog antitela koje se može dobiti iz hibridoma 1B4A11 D11 (koji proizvodi anti-hPG MAb 5), 1B6A11F2 (koji proizvodi anti-hPG MAb 6), 1B11E4B11 (koji proizvodi anti-hPG MAb 7), 1C10D3B9 (koji proizvodi anti-hPG MAb 8), 1D8F5B3 (koji proizvodi anti-hPG MAb 9), 1E1C7B4 (koji proizvodi anti-hPG MAb 10), 2B4C8C8 (koji proizvodi anti-hPG MAb 11), 2B11E6G4 (koji proizvodi anti-hPG MAb 12), 2C6C3C7 (koji proizvodi anti-hPG MAb 13), 2H9F4B7 (koji proizvodi anti-hPG MAb 14), 1F11F5E10 (koji proizvodi anti-hPG MAb 21), 1F11F5G9 (koji proizvodi anti-hPG MAb 22) i 1A11F2C9 (koji proizvodi anti-hPG MAb 23).

[0115] U nekim rešenjima, C-terminalna monoklonska antitela na hPG imaju CDR-ove VLi VHkoji odgovaraju CDR-ovima VLi VHmonoklonskih antitela koja se mogu dobiti iz gornjih hibridoma.

[0116] U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:13. U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:15. U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:59 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:63. U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:60 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:64. U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:61 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:65. U jednom rešenju, obezbeđena je ćelija domaćin sposobna da proizvede antitelo na hPG koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:62 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:66.

[0117] U nekim rešenjima, ćelija domaćin iz ove prijave sadrži nukleinsku kiselinu izabranu od: nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO:12, 14, 59, 60, 61 i 62 i nukleinsku kiselinu izabranu od: nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO:13, 15, 63, 64, 65 i 66. U nekim rešenjima, varijabilni region teškog lanca kodira sekvenca nukleinske kiseline izabrana od: SEQ ID NO:16, 18, 67, 68, 69 i 70. U nekim rešenjima, varijabilni region lakog lanca kodira sekvenca nukleinske kiseline izabrana od: SEQ ID NOs:17, 19, 71, 72, 73 i 74.

[0118] U nekim rešenjima, obezbeđene su polinukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilni region teškog lanca humanizovanog monoklonskog antitela na hPG. Specifična rešenja uključuju polinukleotide koji kodiraju polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:21, 23, 75, 77, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 i 94. U nekim rešenjima, obezbeđene su polinukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilni region lakog lanca humanizovanog monoklonskog antitela na hPG. Specifičnai rešenja uključuju polinukleotide koji kodiraju polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:22, 24, 76, 78, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 i 95.

Biološka dejstva monoklonskih antitela na hPG

[0119] PG je impliciran u preživljavanju i/ili proliferaciji tumorskih ćelija CRC. Mada bez namere da se bude vezan za bilo koju teoriju o mehanizmu, smatra se da, kroz vezivanje PG, neutrališuća monoklonska antitela na PG blokiraju ili inhibiraju sposobnost PG da interaguju sa svojim signalnim partnerom(-ima). Ovo, sa svoje strane, blokira ili inhibira ćelijske odgovore na progastrin, kao što su ćelijska proliferacija, smanjena diferencijacija ćelija i/ili smanjena ćelijska smrt i/ili rast tumora. Kao posledica ovih aktivnosti, neutrališuća monoklonska antitela na hPG iz ove prijave se mogu koristiti u mnoštvu in vitro, in vivo i ex vivo konteksta da vežu PG i blokiraju signalizaciju zavisnu od PG.

[0120] U skladu s tim, prijava obezbeđuje metode inhibiranja odgovora zavisnih od PG u CRC ćelijama. Generalno, metodi obuhvataju dovođenje u kontakt CRC ćelija sa neutrališućim monoklonskim antitelom na PG, ili izlaganje ćelijske populacije njemu, u količini efektivnoj da inhibira jedan ili više odgovora CRC ćelija indukovanih PG-om, npr. proliferaciju i/ili preživljavanje CRC ćelija. Proliferacija ili njena inhibicija, in vitro i in vivo se može odrediti u skladu sa testovima za merenje povećanja broja ćelija, broja tumora ili veličine tumora tokom vremena. Testovi za inhibiciju proliferacije ćelija i tumora su dobro poznati u struci.

[0121] Blokiranje signalizacije zavisne od PG može da inhibira preživljavanje CRC ćelija povećavanjem ćelijske smrti. Inhibicija preživljavanja CRC ćelija in vitro ili in vivo se može odrediti merenjem smanjenja broja živih ćelija kancera tokom vremena (npr., 24 ili 48 sati). Testovi za ćelijsku smrt su dobro poznati u struci. Pored toga, ovde je obezbeđen primer testa za preživljavanje ćelija.

[0122] Studije dalje sugerišu da inhibiranje signalizacije zavisne od PG u ćelijama CRC tumora može da inhibira preživljavanje CRC ćelija uključivanjem programirane ćelijske smrti ili apoptoze. Indukcija apoptoze se može odrediti na bilo koji način poznat u struci, uključujući, ali bez ograničenja, merenje promena u ekspresiji gena koji imaju pro- ili antiapoptotsku aktivnost. Na primer, povećanje ekspresije tokom vremena (npr., 48 sati) proapoptotskog gena, kao što je, na primer, Bax, je indikativno za apoptozu. Slično, smanjenje ekspresije tokom vremena (npr., 72 ili 96 sati) antiapoptotskog gena, kao što je, na primer, ali bez ograničenja, Bcl-2, je indikativno za povećanje apoptoze. Tehnike za merenje promena u ekspresiji gena, kao što su kvantitativna PCR u realnom vremenu, su dobro poznate u struci. Videti, npr., Hollande et al., WO 2007/135542.

[0123] Inhibicija signalizacije zavisne od progastrina stimuliše i diferencijaciju ćelija. U skladu s tim, metodi inhibiranja proliferacije i/ili preživljavanja CRC ćelija obuhvataju davanje količine neutrališućeg monoklonskog antitela na PG efektivne da indukuje diferencijaciju CRC ćelija in vitro ili in vivo. Diferencijacija CRC ćelija se može odrediti merenje povećanja tokom vremena (npr., 24 ili 48 sati) ekspresije genetskih markera za ćelijsku diferencijaciju, kao što je, na primer, ali bez ograničenja, Muc-2 ili drugi markeri za različite intestinalne ćelije (npr., kupaste (goblet) ćelije). Promene u ekspresiji gena se mogu na bilo koji način poznat u struci. Videti, npr., Hollande et al., WO 2007/135542. Ostali geni čija ekspresija ili represija zavisi od PG, kao što je ICAT, se takođe mogu testirati primenom standardnih metoda. Videti id.

Farmaceutski sastavi

[0124] Monoklonska antitela na PG se mogu formulisati u sastave. Opciono, sastavi mogu da sadrže jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa, kao što su drugi terapijski agensi opisani niže i obezbeđeni su ovde. Sastavi će obično biti isporučeni kao deo sterilnog, farmaceutskog sastava koji će normalno uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj sastav može biti u bilo kakvoj pogodnoj formi (u zavisnosti od željenog metoda administracije pacijentu).

[0125] Monoklonska antitela na hPG iz ove prijave se mogu davati pacijentu na mnogo načina kao što su oralno, transdermalno, subkutano, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, intraokularno, topički, intratekalno i intracerebroventrikularno. Najpogodniji način administracije u nekom datom slučaju će zavisiti od konkretnog antitela, subjekta i prirode i jačine bolesti i fizičkog stanja subjekta. Antitelo se može formulisati kao vodeni rastvor i davati subkutanom injekcijom.

[0126] Farmaceutski sastavi se mogu pogodno prezentovati u formi jediničnih doza koje sadrže prethodno određenu količinu monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave po dozi. Takva jedinica može da sadrži, na primer, ali bez ograničenja, 5 mg do 5 g, na primer, 10 mg do 1 g, ili 20 do 50 mg. Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu u prijavi mogu da uzmu mnošzvo oblika u zavisnosti od, npr., stanja koje se tretira ili načina administracije.

[0127] Farmaceutski sastavi iz ove prijave se mogu pripremati za skladištenje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori, mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima tipično korišćenim u struci (svi ovde pod nazivom "nosači"), tj., agensi za puferisanje, stabilizujući agensi, konzervansi, izotonifikatori, nejonski deterdženti, antioksidanti i drugi različiti aditivi. Videti Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Takvi aditivi moraju biti netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama.

[0128] Agensi za puferisanje pomažu za održavanje pH u opsegu koji aproksimira fiziološke uslove. Oni mogu biti prisutni u koncentraciji koja se kreće od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodni agensi za puferisanje za upotrebu sa predmetnom prijavom uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli, kao što su citratni puferi (npr., smesa mononatrijum citrata i dinatrijum citrata, smesa limunske kiseline i trinatrijum citrata, smesa limunske kiseline i mononatrijum citrata, itd.), sukcinatni puferi (npr., smesa ćilibarne kiseline i mononatrijum sukcinata, smesa ćilibarne kiseline i natrijum hidroksida, smesa ćilibarne kiseline i dinatrijum sukcinata, itd.), tartaratni puferi (npr., smesa vinske kiseline i natrijum tartarata, smesa vinske kiseline i kalijum tartarata, smesa vinske kiseline i natrijum hidroksida, itd.), fumaratni puferi (npr., smesa fumarne kiseline i mononatrijum fumarata, smesa fumarne kiseline i dinatrijum fumarata, smesa mononatrijum fumarata i dinatrijum fumarata, itd.), glukonatni puferi (npr., smesa glukonske kiseline i natrijum glukonata, smesa glukonske kiseline i natrijum hidroksida, smesa glukonske kiseline i kalijum glukonata, itd.), oksalatni pufer (npr., smesa oksalne kiseline i natrijum oksalata, smesa oksalne kiseline i natrijum hidroksida, smesa oksalne kiseline i kalijum oksalata, itd.), laktatni puferi (npr., smesa mlečne kiseline i natrijum laktata, smesa mlečne kiseline i natrijum hidroksida, smesa mlečne kiseline i kalijum laktata, itd.) i acetatni puferi (npr., smesa sirćetne kiseline i natrijum acetata, smesa sirćetne kiseline i natrijum hidroksida, itd.). Dodatno se mogu koristiti fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli kao što je Tris.

[0129] Konzervansi se mogu dodavati da uspore mikrobijalan rast i mogu se dodavati u količinama u opsegu od 0,2%-1% (w/v). Pogodni konzervansi za upotrebu sa predmetnom prijavom uključuju fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halide (npr., hlorid, bromid i jodid), heksametonijum hlorid i alkil parabene kao što je metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol i 3-pentanol. Izotonifikatori, ponekad znani i kao "stabilizatori" se mogu dodavati da osiguraju izotoničnost tečnih sastava iz predmetne prijave i uključuju polihidrične šećerne alkohole, na primer, trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenata koji mogu da imaju različite funkcije od punjača do aditiva koji pomaže rastvaranju terapijskog agensa ili pomaže sprečavanju denaturacije ili prianjanja za zid suda. Tipični stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (nabrojani gore); aminokiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što su laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol i slični, uključujući ciklitole kao što su inozitol; polietilen glikol; aminokiselinski polimeri; reduktivna sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, lipoinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; polipeptidi male molekulske težine (npr., peptidi od 10 ili manje ostataka); proteini kao što su humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što su polivinilpirolidon monosaharidi, kao što su ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što su laktoza, maltoza, saharoza i trisaacharidi kao što su rafinoza; i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u opsegu od 0,1 do 10000 težinskih delova po delu težine aktivnog proteina.

[0130] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (poznati i kao "sredstva za kvašenje") se mogu dodati da pomognu rastvaranju terapijskog agensa, kao i da štite terapijski protein od agregiranja izazvanog mešanjem, što takođe dozvoljava da se formulacija izlaže stresu površinskog smicanja a da se ne izazove denaturacija proteina. Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80, itd.), polioksamere (184, 188, itd.), pluronske poliole, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN®-20, TWEEN®-80, itd.). Nejonski surfaktanti mogu biti prisutni u opsegu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, na primer, oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.

[0131] Različiti dodatni ekscipijenti uključuju punjenja (npr., skrob), sredstva za heliranje (npr., EDTA), antioksidanse (npr., askorbinska kiselina, metionin, vitamin E) i ko-rastvarače.

[0132] Monoklonska antitela na PG se mogu davati pojedinačno, kao smese jednog ili više monoklonskih antitela na PG, u smesi ili kombinaciji sa drugim agensima korisnim u tretmanu CRC, ili adjunktivno sa nekom drugom terapijom za CRC. Primeri pogodnih kombinacija i adjunktivnih terapija su takođe obezbeđene niže.

[0133] Predmetna prijava obuhvata i farmaceutske komplete koji sadrže neutrališuća monoklonska antitela na hPG (uključujući konjugate antitela) iz ove prijave. Farmaceutski komplet je paket koji sadrži neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG (npr., bilo u liofilizovanoj formi, bilo kao vodeni rastvor) i jedan ili više od sledećih:

• Drugi terapijski agens, na primer, kao što je opisano niže;

• spravu za administraciju monoklonskog antitela na hPG, na primer penkalo, iglu i/ili špric; i

• vodu ili pufer farmaceutskog stepena čistoće za suspendovanje antitela ako je ono u liofilizovanom vidu.

[0134] Svaka jedinična doza monoklonskog antitela na hPG se može pakovati odvojeno, a komplet može da sadrži jednu ili više jediničnih doza (npr., dve jedinične doze, tri jedinične doze, četiri jedinične doze, pet jediničnih doza, osam jediničnih doza, deset jediničnih doza, ili više). U jednom specifičnom rešenju, svaka od jedne ili više jediničnih doza je smeštena u špric ili penkalo.

Efektivna doziranja

[0135] Neutrališuća monoklonska antitela na PG, ili njihovi sastavi, će generalno da se koriste u količini efektivnoj da postigne planirani rezultat, na primer, količini efektivnoj da tretira CRC u subjektu kome je to potrebno. Farmaceutski sastavi koji sadrže neutrališuća monoklonska antitela na PG se mogu davati pacijentima (npr., humanim subjektima) u terapijski efektivnim dozama. Kao što se ovde koristi, "terapijski efektivno" doziranje je količina koja donosi terapijsku korist. U kontekstu terapije CRC, terapijska korist znači bilo kakvo poboljšanje CRC, uključujući bilo šta od, ili njihovu kombinaciju, zaustavljanja ili usporavanja napredovanja CRC (npr., sa jednog stadijuma kolorektalnog kancera do sledećeg), zaustavljanja ili odlaganja pogoršanja ili deterioracije simptoma ili znakova CRC, smanjenja jačine CRC, indukovanja remisije CRC, inhibiranja proliferacije ćelija CRC tumora, veličine CRC tumora, ili broja CRC tumora, ili sniženja nivoa serumskog PG.

[0136] Količina neutrališućeg monoklonskog antitela na PG koja se daje će zavisiti od mnoštva faktora, uključujući prirodu i stadijum CRC koji se tretira, formu, način i mesto administracije, terapijski režim (npr., da li se koristi drugi terapijski agens), starost i stanje konkretnog subjekta koji se leči, osetljivost pacijenta koji se leči na monoklonska antitela na PG. Stručnjak može lako odrediti odgovarajuće doze. Konačno, lekar će odrediti odgovarajuće doze koje treba primeniti. Ova doza može da se ponovi onoliko često koliko to odgovara. Ako se razviju bočni efekti, količina i/ili frekvenca doze se može promeniti ili smanjiti, u skladu sa normalnom kliničkom praksom. Pravilno doziranje i režim lečenja se mogu ustanoviti praćenjem napredovanja terapije pomoću konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima.

[0137] Efektivne doze se inicijalno mogu proceniti iz in vitro testova. Na primer, početna doza za upotrebu u životinjama se može formulisati tako da se postignu cirkulišuće koncentracije u krvi ili serumu monoklonskog antitela na PG koje su na ili iznad afiniteta vezivanja antitela za progastrin, kao što je mereno in vitro. Izračunavanje doza da se postignu takve cirkulišuće koncentracije u krvi ili serumu, uzimajući u obzir biodostupnost konkretnog antitela je sasvim u okviru sposobnosti iskusnog stručnjaka. Za uputstva, čitalac se upućuje na Fingl & Woodbury, "General Principles" u Goodman i Gilman-ovoj The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 1. poglavlje, poslednje izdanje, Pagamonon Press i na reference citirane tamo.

[0138] Početne doze se mogu proceniti iz in vivo podataka, kao što su životinjski modeli. Životinjski modeli, korisni za testiranje efikasnosti jedinjenja za lečenje CRC su dobro poznati u struci. Pored toga, životinjski modeli CRC su opisani u Primerima niže. Stručnjaci sa uobičajenim iskustvom mogu rutinski da prilagode takvu informaciju za određivanje doza pogodnih za administraciju ljudima.

[0139] Efektivna doza neutrališućeg monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave može da se kreće od oko 0,001 do oko 75 mg/kg po jednoj (npr., bolus) administraciji, višestrukim administracijama ili kontinuiranim administracijama, ili da se postigne serumska koncentracija od 0,01-5000 µg/ml po jednoj (npr., bolus) administraciji, višestrukim administracijama ili kontinuiranim administracijama, ili bilo koji efektivni opseg ili vrednost u njemu u zavisnosti od stanja koje se leči, puta administracije i starosti, težine i stanja subjekta. U jednom određenom rešenju, svaka doza može da se kreće od oko 0,5 µg do oko 50 µg po kilogramu telesne težine, na primer, od oko 3 µg do oko 30 µg po kilogramu telesne težine.

[0140] Količina, frekvenca i trajanje administracije će zavisiti od niza faktora, kao što su pacijentova starost, težina i stanje bolesti. Terapijski režim administracije može trajati od 2 nedelje do neodređenog, 2 nedelje do 6 meseci, od 3 meseca do 5 godina, od 6 meseci do 1 ili 2 godine, od 8 meseci do 18 meseci, ili slično. Opciono, terapijski režim obezbeđuje ponovljenu administraciju, npr., jedanput dnevno, dvaput dnevno, svaka dva dana, tri dana, pet dana, jednu nedelju, dve nedelje, ili jedan mesec. Ponovljena administracija može biti u istoj dozi ili u različitoj dozi. Administracija se može ponoviti jedanput, dvaput, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, sedam puta, osam puta, devet puta, deset puta, ili više. Terapijski efektivna količina monoklonskog antitela na hPG se može administrirati kao jedna doza ili tokom trajanja terapijskog režima, npr., tokom jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, jedan mesec, tri meseca, šest meseci, jednu godinu ili duže.

Terapijski metodi

[0141] Sposobnost neutrališućih monoklonskih antitela na hPG iz predmetne prijave da blokiraju odgovore zavisne od PG, uključujući proliferaciju ćelija, čini ih korisnim za lečenje kolorektalnog kancera. U skladu s tim, u jednom drugom aspektu, predmetna prijava obezbeđuje metode lečenja CRC u pacijentu kome je to potrebno. Generalno, metodi obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efektivne količine neutrališućeg monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave.

[0142] "Subjekt" ili "pacijent", kome se monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave administrira, je poželjno sisar kao što je ne-primat (npr., krava, svinja, konj, mačka, pas, pacov, itd.) ili primat (npr., majmun ili čovek). Subjekt ili pacijent može biti čovek, kao što je odrastao pacijent ili pedijatrijski pacijent.

[0143] Pacijenti pogodni za terapiju monoklonskim antitelom na hPG su pacijenti kojima je dijagnostikovan CRC. CRC može biti bilo kog tipa i u bilo kom kliničkom stadijumu ili sa bilo kojim manifestacijama. Pogodni subjekti uključuju pacijente sa CRC tumorima (operabilnim ili neoperabilnim), pacijenti čiji su tumori odstranjeni hirurški ili isečeni, pacijenti sa CRC tumorom koji sadrži ćelije koje nose mutaciju u onkogen, kao što je, na primer, RAS ili APC, pacijenti koji su primili ili primaju neku drugu terapiju za CRC u kombinaciji sa ili adjunktivno terapiji monoklonskim antitelom na hPG. Ostale terapije za CRC uključuju, ali nisu ograničene na, hemoterapijski tretman, terapiju zračenjem, hiruršku resekciju i tretman jednim ili više drugih terapijskih antitela, kao što je detaljno dato niže.

[0144] Terapija antitelom na hPG se može kombinovati sa, ili biti adjunktivna, jednom ili više drugih tretmana. Ostali tretmani uključuju, bez ograničenja, hemoterapijski tretman, terapiju zračenjem, hiruršku resekciju i terapiju antitelom, kao što je opisano ovde.

[0145] Terapija monoklonskim antitelom na hPG može biti adjunktivna drugom tretmanu, uključujući hiruršku resekciju.

[0146] Kombinacija terapija, kao što je ovde obezbeđeno, uključuje administraciju bar dva agensa pacijentu, od kojih je prvi neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave, a drugi je neki drugi terapijski agens. Neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG i neki drugi terapijski agens se mogu administrirati simultano, sukcesivno ili odvojeno.

[0147] Kao što se ovde koristi, kaže se da se neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG i drugi terapijski agens administriraju sukcesivno ako se administriraju pacijentu istog dana, na primer, tokom istog dolaska pacijenta. Sukcesivna administracija se može javiti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 sati razdvojeno. Nasuprot tome, kaže se da se monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave i drugi terapijski agens administriraju odvojeno ako se administriraju pacijentu različitih dana, na primer, monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave i drugi terapijski agens se mogu administrirati u 1-dnevnim, 2- dnevnim ili 3- dnevnim, one-nedeljnim, 2-nedeljnim ili mesečnim intervalima. U metodima iz predmetne prijave, administracija monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave može da prethodi ili da sledi administraciju drugog terapijskog agensa.

[0148] Kao neograničavajući primer, neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG i drugi terapijski agens se mogu administrirati istovremeno tokom jednog perioda, iza kog sledi drugi period u kome administracija monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave i drugog terapijskog agensa alterniraju.

[0149] Kombinovane terapije iz predmetne prijave mogu da dovedu do većeg od dodatnog ili do sinergijskog efekta, obezbeđujući terapijske koristi koje nema ni neutrališuće monoklonsko antitelo na hPG, ni drugi terapijski agens dat u količini koja je sama terapijski efektivna. Prema tome, takvi agensi se mogu administrirati u manjim količinama, smanjujući mogućnost i/ili jačinu štetnih efekata.

[0150] Drugi terapijski agens može biti hemoterapijski agens. Hemoterapijski agensi uključuju, ali bez ograničenja, radioaktivne molekule, toksine, poznate i kao citotoksini ili citotoksični agensi, koji uključuju sve agense koji su štetni za vijabilnost ćelija, agenasa i lipozoma ili druge vezikule koje sadrže hemoterapijska jedinjenja. Primeri pogodnih hemoterapijskih agenasa uključuju, ali bez ograničenja, 1-dehidrotestosteron, 5-fluorouracil dekarbazin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, aktinomicin D, adriamicin, aldesleukin, sredstva za alkilovanje, alopurinol natrijum, altretamin, amifostin, anastrozol, antramicin (AMC)), antimitotičke agense, cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatina), diamino dihloro platinu, antracikline, antibiotike, antimetabolite, asparaginazu, živ BCG (intravezikulski), betametazon natrijum fosfat i betametazon acetat, bikalutamid, bleomicin sulfat, busulfan, kalcijum leukouorin, kalichemicin, kapecitabin, karboplatinu, lomustin (CCNU), karmustin (BSNU), hlorambucil, cisplatinu, kladribin, kolhicin, konjugovane estrogene, ciklofosfamid, citarabin, citohalazin B, citoksan, dakarbazin, daktinomicin, daktinomicin (bivši aktinomicin), daunirubicin HCL, daunorubicin citrat, denileukin diftitoks, deksrazoksan, dibromomanitol, dihidroksi antracin dion, docetaksel, dolasetron mezilat, doksorubicin HCL, dronabinol, E. coli L-asparaginazu, emetin, epoetin-a, Erwinia L-asparaginazu, esterifikovane estrogene, estradiol, estramustin fosfat natrijum, etidijum bromid, etinil estradiol, etidronat, etopozid citrororum faktor, etopozid fosfat, filgrastim, floksuridin, flukonazol, fludarabin fosfat, fluorouracil, flutamid, folinsku kiselinu, gemcitabin HCL, glukokortikoide, goserelin acetat, gramicidin D, granisetron HCL, hidroksiureu, idarubicin HCL, ifosfamid, interferon α-2b, irinotekan HCL, letrozol, leukovorin kalcijum, leuprolid acetat, levamisol HCL, lidokain, lomustin, majtanzinoid, mehloretamin HCL, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, melfalan HCL, merkaptipurin, mesnu, metotreksat, metiltestosteron, mitramicin, mitomicin C, mitotan, mitoksantron, nilutamid, oktreotid acetat, ondansetron HCL, oksaliplatinu, paklitaksel, pamidronat dinatrijum, pentostatin, pilokarpin HCL, plimicin, polifeprosan 20 sa implantom karmustina, porfimer natrijum, prokain, prokarbazin HCL, propranolol, rituksimab, sargramostim, streptozotocin, tamoksifen, taksol, tegafur, tenipozid, tenopozid, testolakton, tetrakain, tioepa hlorambucil, tioguanin, tiotepa, topotekan HCL, toremifen citrat, trastuzumab, tretinoin, valrubicin, vinblastin sulfat, vinkristin sulfat i vinorelbin tartrat.

[0151] Neutrališuća monoklonska antitela na hPG opisana ovde se mogu administrirati pacijentu kome je potrebno lečenje kolorektalnog kancera koji prima kombinaciju hemoterapijskih agenasa. Primeri kombinacija hemoterapijskih agenasa uključuju 5-fluorouracil (5FU) u kombinaciji sa leukovorin (folinska kiselina ili LV); kapecitabin, u kombinaciji sa uracilom (UFT) i leukovorinom; tegafur u kombinaciji sa uracilom (UFT) i leukovorinom; oksaliplatina u kombinaciji sa 5FU, ili u kombinaciji sa kapecitabinom; irinotekan u kombinaciji sa kapecitabinom, mitomicin C u kombinaciji sa 5FU, irinotekanom ili kapecitabinom. Moguća je i upotreba drugih kombinacija hemoterapijskih agenasa opisanih ovde.

[0152] Kao što je poznato u relevantnoj struci, režimi hemoterapije za kolorektalni kancer upotrebom kombinacija različitih hemoterapijskih agenasa je standardizovana u kliničkim probama. Takvi režimi su često poznati pod akronimima i uključuju 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI, FOLFOXIRI. Videti, npr., Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100:1704-19 i Field, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:3806-15.

[0153] Neutrališuća monoklonska antitela na hPG se mogu kombinovati i sa drugim terapijskim antitelima. U skladu s tim, terapija monoklonskim antitelom na hPG se mogu kombinovati sa, ili administrirati adjunktivno sa različitim monoklonskim antitelom kao što je, na primer, ali bez ograničenja, monoklonsko antitelo na EGFR (EGF receptor) ili monoklonsko antitelo na VEGF. Specifični primeri antitela na EGFR uključuju cetuksimab i panitumumab. Specifičan primer antitela na na VEGF je bevacizumab.

Detekcija progastrina pomoću antitela na hPG

[0154] Monoklonska antitela na PG, bilo neutrališuća, bilo ne-neutrališuća, su korisna i za primene koje zavise od detekcije PG, kao što su dijagnostikovanje CRC ili praćenje efekata tretmana na subjektov CRC. U skladu s tim, u jednom aspektu, predmetna prijava obezbeđuje metod dijagnostikovanja kolorektalnog kancera u pacijentu, koji obuhvata određivanje količine progastrina u uzorku iz pacijenta, primenom monoklonskog antitela na hPG u skladu sa predmetnom prijavom. Generalno, metodi dijagnostikovanja kolorektalnog kancera u pacijentu obuhvataju merenje progastrina u uzorku dobijenom iz pacijenta primenom monoklonskog antitela na hPG iz ove prijave, gde je vrednost od 20 pM do 400 pM progastrina u uzorku indikativno za kolorektalni kancer. Progastrin se može meriti u uzorcima, npr., krvi, seruma, plazme, tkiva i/ili ćelija. Detekcija hPG se može vršiti korišćenjem testova poznatih u struci i/ili opisanih ovde, kao što su, ELISA, sendvič ELISA, imunoblot (Western blot), imunoprecipitacija, BIACORE tehnologija i slično.

[0155] Kao što je ovde pomenuto, progastrin je samo jedan od broja različitih polipeptida dobijenih iz post-translacione obrade gena za gastrin. Dijagnoza, praćenje i drugi metodi opisani ovde specifično detektuju hPG u odnosu na ostale proizvode gena za gastrin, uključujući proizvode degradacije. U skladu s tim, u nekim specifičnim rešenjima, hPG se detektuje pomoću ELISA, kao što je opisano ovde, gde se koriste dva antitela na hPG, koja ciljaju N- i C-terminus hPG, respektivno. U nekim rešenjima, jedno od dva antitela korišćena za detekciju je monoklonsko antitelo na hPG, kao što je opisano ovde. Nivoi hPG koji se kreću od 20 pM do 400 pM su indikativni za kolorektalni kancer.

[0156] Uopšteno, procedura za određivanje nivoa hPG pomoću monoklonskih antitela na hPG je sledeća. Pripremi se površina, kao što su udubljenja u ploči sa 96 udubljenja, na koju se veže poznata količina prvog antitela na hPG, "hvatača". Antitelo "hvatač" može biti, na primer, antitelo na hPG koje se vezuje za C- ili N-terminus hPG. Posle blokiranja, testirani uzorak se nanese na površinu, posle čega sledi inkubacioni period. Površina se zatim opere da se ukloni nevezan antigen i doda se rastvor koji sadrži drugo, "detekciono" antitelo na hPG. Detekciono antitelo može biti bilo koje od monoklonskih antitela na hPG opisanih ovde, uz uslov da se detekciono antitelo vezuje za različit epitop u odnosu na antitelo hvatač. Na primer, ako se antitelo hvatač vezuje za C-terminalni region peptida hPG, onda bi pogodno detekciono antitelo bilo ono koje vezuje N-terminalni region peptida hPG. Nivoi progastrina se zatim mogu detektovati bilo direktno (ako je, na primer, detekciono antitelo konjugovano sa detektabilnim obeleživačem), bilo indirektno (preko obeleženog sekundarnog antitela koje vezuje detekciono antitelo na hPG).

[0157] U jednom specifičnom rešenju, nivoi hPG se mere na sledeći način iz testiranog uzorka. Mikrotitarske ploče sa 96 udubljenja su prevučene zečjim C-terminalnim poliklonskim antitelom na hPG u koncentraciji između 0,5 i 10 µg/mL i inkubirane preko noći. Ploče su zatim oprane tri puta u PBS-Tween (0,05%) i blokirane 2% (w/v) nemasnim suvim mlekom u PBS-Tween-u (0,05%). Odvojeno su pripremljeni, u odgovarajućem razblaživaču (npr., PBS-Tween 0,05%), testirani uzorci, kontrolni uzorci (prazni ili plazma ili serumski uzorci negativni na PG) i referentni standard (liofilizovan hPG razblažen u plazmi ili serumu, negativnim na PG) sa hPG u koncentraciji između oko 5 pM (0,5 x 10<-11>M) i oko 0,1 nM (1x10<-10>M),. Uzorci su inkubirani na obloženim pločama između 2 i 4 sata na 37°C, ili alternativno, između 12 i 16 sati na 21 °C. Posle inkubacije, ploče su oprane tri puta PBS-Tween-om (0,05%) i inkubirane sa N-terminalnim monoklonskim antitelom na hPG u koncentraciji između 0,001 i 0,1 µg/mL, kao što je opisano ovde, kuplovanim sa peroksidazom rena (HRP)(Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091), 30 minuta na 21 °C. Ploče su zatim oprane tri puta PBS-Tween-om (0,05%) i dodat je HRP supstrat na 15 minuta na 21 °C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL 0,5M sumporne kiseline i izmerena je optička gustina na 405 nm. Nivoi hPG testiranog uzorka su određeni poređenjem sa standardnom krivom, konstruisanom iz merenja izvedenih iz referentnog standarda za hPG.

[0158] Tipično, pacijenti su dijagnostikovani na bazi invazivnih procedura, kao što je histološka procena tkiva dobijenog biopsijom, kao i drugih invazivnih procedura, kao što je kolonoskopija. CRC je podeljen u 5 stadijuma, koji su: stadijum 0 (kancer je ograničen na najdublji deo zida kolona ili rektuma), stadijum 1 (kancer u unutrašnjem zidu kolona ili rektuma), stadijum 2 (kancer se proširio kroz zid kolona, ali nije nađen u susednim limfnim čvorovima), stadijum 3 (kancer je nađen u limfnim čvorovima i tkivu koje okružuje kolon ili rektum) i stadijum 4 (kancer se proširio na druge delove tela). Iz histološke perspektive, kolorektalni tumori se javljaju sa širokim spektrom neoplazmi, koji se kreću od benignih izraslina do invazivnih kancera i prvenstveno su tumori izvedeni iz epitela (tj., adenomi ili adenokarcinomi). Lezije se mogu klasifikovati u tri grupe: ne-neoplastični polipi, neoplastični polipi (adenomatozni polipi, adenomi) i kanceri. Adenomatozni polipi su benigni tumori koji mogu da podlegnu malignoj transformaciji i klasifikovani su u tri histološka tipa, sa rastućim malignim potencijalom: tubularni, tubulovilozni i vilozni. Adenokarcinomi su takođe kategorisani prema svojoj histologiji u mucinozne (koloidne) adenokarcinome, signet ring adenokarcinome; skirozne tumore i neuroendokrine.

[0159] Nasuprot sadašnjim sredstvima za dijagnostikovanje CRC, predmetna prijava obezbeđuje metode za dijagnostikovanje subjekata sa CRC u odsustvu histološke analize ili određivanja stadijuma bolesti, na osnovu merenja nivoa hPG koji se može odrediti iz uzorka krvi. Štaviše, metodi iz predmetne prijave su korisni u biranju pacijenata sa CRC podobnih za terapiju monoklonskim antitelom na hPG, bez obzira na to kako je pacijent dijagnostikovan.

[0160] Serumski nivoi PG su takođe korisni u proceni efikasnosti tretmana CRC. U skladu s tim, predmetna prijava obezbeđuje metod za praćenje efektivnosti terapije kolorektalnog kancera, koji obuhvata određivanje nivoa PG u pacijentu koji je lečen od CRC. Metodi za praćenje efektivnosti terapije kolorektalnog kancera obuhvataju ponavljano određivanje nivoa hPG pomoću monoklonskog antitela na PG iz predmetne prijave u pacijentu sa kolorektalnim kancerom, koji prolazi tretman za kolorektalni kancer, gde je smanjenje pacijentovih nivoa cirkulišućeg hPG tokom intervala tretmana indikativno za efikasnost tretmana. Na primer, može se izvesti prvo merenje pacijentovog nivoa cirkulišućeg hPG, a zatim i drugo za vreme ili pošto pacijent primi tretman za kolorektalni kancer. Ova dva merenja se onda porede i smanjenje nivoa hPG je indikativno za terapijsku korist.

[0161] U jednom aspektu, prijava obezbeđuje dijagnostičke komplete koji sadrže monoklonska antitela na hPG (uključujući i konjugate antitela). Dijagnostički komplet je paket koji sadrži bar jedno monoklonsko antitelo na hPG iz ove prijave (npr., ili u liofilizovanom vidu ili kao vodeni rastvor) i jedan ili više reagenasa korisnih za vršenje dijagnostičkog testa (npr., razblaživače, obeleženo antitelo koje se vezuje za monoklonsko antitelo na hPG, odgovarajući supstrat za obeležen antitelo, hPG u formi odgovarajućoj za upotrebu kao pozitivna kontrola i referentni standard, negativna kontrola). U nekim specifičnim rešenjima, komplet sadrži dva antitela na hPG, gde je bar jedno od antitela monoklonsko antitelo na hPG. Opciono, drugo antitelo je poliklonsko antitelo na hPG. U nekim rešenjima, komplet iz predmetne prijave sadrži N-terminalno monoklonsko antitelo na hPG, kao što je opisano ovde.

[0162] Antitela na hPG mogu biti obeležena, kao što je opisano gore. Alternativno, komplet može da uključi obeleženo antitelo koje vezuje monoklonsko antitelo na hPG i konjugovano je sa enzimom. Kad je monoklonsko antitelo na hPG ili neko drugo antitelo konjugovano sa enzimom za detekciju, komplet može da uključi supstrate i kofaktore potrebne enzimu (npr., prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilnu hromoforu ili fluoroforu). Dodatno, mogu biti uključeni i drugi aditivi, kao što su stabilizatori puferi (npr., blokirajući pufer ili pufer za lizu) i slično. Monoklonska antitela na hPG uključena u dijagnostički komplet mogu biti imobilisana na čvrstoj površini, ili, alternativno, čvrsta površina (npr., pločica) na kojoj se antitelo može imobilisati je uključena u komplet. Relativne količine različitih reagenasa mogu široko varirati da obezbede koncentracije u rastvoru reagenasa koje suštinski optimizuju osetljivost testa. Antitela i drugi reagensi mogu biti obezbeđeni (pojedinačno ili kombinovano) kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji će po rastvaranju obezbediti rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

[0163] Kompleti mogu da uključe materijale sa uputstvima koji sadrže uputstva (npr., protokole) za praktikovanje dijagnostičkih metoda. Dok materijali sa uputstvima tipično sadrže pisane ili štampane materijale, oni nisu ograničeni na to. Medijum sposoban da čuva takva uputstva i da ih komunicira krajnjem korisniku je predviđen ovde. Takvi medijumi uključuju, ali bez ograničenja, elektronske medijume za čuvanje (npr., magnetne diskove, trake, kertridže, čipove), optičke medijume (npr., CD ROM) i slično. Takvi medijumi mogu da uključe adrese internet sajtova koji obezbeđuju takve materijale sa uputstvima.

6. PRIMERI

[0164] Sledeći primeri su ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

Primer 1: Generisanje monoklonskih antitela na progastrin

Imunogeni za humani progastrin

[0165] Generisano je nekoliko imunogena da bi se razvili hibridomi koji proizode monoklonska antitela na humani progastrin. Antigeni koji su ranije korišćeni za generisanje poliklonskog antitela, kao što je humani progastrin pune dužine i imunogeni zasnovani na ostacima 70 do 80 hPG, nisu uspeli da dovedu do monoklonskog imunog odgovora ili da podignu monoklonska antitela specifična za PG. Kao što je opisano sa više detalja niže, antigeni od 14 aminokiselina i duži, koji uključuju sekvence jedinstvene za hPG bilo na N-terminusu bilo na C-terminusu proteina, su bili sposobni da indukuju adekvatan imuni odgovor u životinjama i bili su korišćeni da generišu hibridome koji proizode preko 20 različitih monoklonskih antitela na hPG. Iznenađujuće, nekoliko imunogena koji uključuju ostatke 55 do 80 hPG, od kojih su neki nađeni i u drugim peptidima izvedenim iz gena za gastrin, je uspešno korišćeno za generisanje monoklonskih antitela koja su specifična za hPG. U sledećoj tabeli su sumirani testirani imunogeni.

[0166] Imunogeni nabrojani u Tabeli 2 su napravljeni prema tehnikama poznatim u struci, korišćenjem hemijske sinteze peptidne sekvence i linkera, a zatim unakrsnim vezivanjem za nosač - goveđi serumski albumin (BSA), hemocijanin iz prilepka (KLH) ili Diptheria Toksin (DT), upotrebom odgovarajućih agenasa za unakrsno vezivanje (npr., MBS (mmaleimidobenzoil-N-hidrosukcinimid estar), glutaraldehid ili sulfo-SMCC (Sulfosukcinimidil 4-[N-maleimidometil]ciklolheksan-1-karboksilat). (Coligan JE et al., Current protocols in Immunology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons; 1996, p 9.0.1-9.0.15; Harlow DL. Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1998, p72-87). Korišćeni linkeri su jedan ili dva ostatka aminoheksanonske kiseline (Ahx) kuplovana sa cisteinskim ostatkom.

[0167] U svakom od tri eksperimenta, Balb/c miševima su 4 do 5 puta ubrizgani N-terminalni imunogeni, a 2 do 4 puta C-terminalni imunogeni. Svaka injekcija je unela 10 µg imunogena sa ribi, alum ili Freund-ovim adjuvantom.

Ćelijske fuzije i skrining hibridoma

[0168] Serum iz svakog miša je testiran pomoću ELISA na imunogen i splenociti su sakupljeni iz miševa sa najjačim imunim odgovorom. Splenociti su fuzionisani sa Sp2 ćelijama mijeloma pomoću polietilen glikola i zasejani na ploču sa 96 udubljenja, u gustini od 15000 do 35000 ćelija po udubljenju. Fuzionisane ćelije su odabrane pomoću medijuma koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum).

[0169] Supernatanti hibridoma su pretraženi pomoću ELISA za sposobnost da vežu imunogen i progastrin pune dužine. Urađene su tri runde skrininga da bi se osiguralo da samo hibridomi koji stabilno proizode antitela koja prepoznaju hPG pune dužine i imunogen budu izabrani.

[0170] Skrining hibridoma i monoklonskih antitela da bi se odredilo vezivanje za različite peptide PG je izveden pomoću ELISA tehnike kao što je opisano niže. Ovaj protokol je korišćen za pretraživanje PG vezivanja fuzionisanih splenocita, subklonova iz prve i druge runde, kao i za proveru specifičnosti antitela za PG, u poređenju sa drugim peptidima izvedenim iz gena za gastrin.

[0171] Ukratko, ploča sa 96 udubljenja je inkubirana preko noći na 4°C sa odgovarajućom koncentracijom(-ama) testiranog peptida u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (PBS), posle čega su udubljenja oprana tri puta rastvorom za pranje (PBS i 0,1% Tween-20) i inkubirana 2 sata na 22°C sa 100 µL rastvora za blokiranje (PBS, 0,1% Tween-20, 0,1% goveđi serumski albumin ili hidrolizat kazeina) po udubljenju. Posle blokiranja, udubljenja su oprana tri puta i dodato je primarno antitelo - antitelo koje se testira. Za inicijalni skrining fuzionisanih splenocita, dodato je 50 µL supernatanta koji se testira iz svake kulture u svako udubljenje u ploči. U testovima izvođenim na monoklonskim antitelima, 100 µL testiranog antitela u PBS i 0,1% Tween-20 je dodato u svako udubljenje. Ploče su onda inkubirane 2 sata na 22°C, posle čega je rastvor primarnog antitela odbačen i zamenjen, posle koraka pranja (3X 100 µL rastvora za pranje, kao što je gore naznačeno), rastvorom za blokiranje koji sadrži sekundarno antitelo, koje se vezuje za primarno antitelo i kuplovano je sa enzimom. Sekundarno antitelo je bilo kozje anti-mišje IgG (Fc) antitelo kuplovano sa peroksidazom rena. Posle 1-časovne inkubacije sa sekundarnim antitelom, 100 µL rastvora supstrata (npr. Fast OPD, ili O-fenflendiamin dihidrohlorid, dostupan od Sigma-Aldrich Co., pripremljen po uputstvima proizvođača) je dodato u svako udubljenje i inkubirano je u mraku 20 minuta na 22°C. Reakcija je onda zaustavljena dodavanjem 50 µL 4N sumporne kiseline i količina katalizovanog supstrata je određena merenjem optičke gustine (O.D.) na 492 nm. Konverzija supstrata je proporcionalna količini primarnog (testiranog) antitela vezanog za antigen. Eksperimenti su rađeni u duplikatu i merenja OD su crtana u funkciji koncentracije antigena ili antitela, u zavisnosti od cilja eksperimenta. Uzorci su ocenjeni kao pozitivni za antitela na PG ako je mereni O.D. bio između 0,2 i 1,5. Ista konzola za O.D. je korišćena za identifikaciju antitela koja su vezala imunogeni peptid korišćen za inokulisanje testiranih životinja.

[0172] Primeri materijala i reagenasa korišćenih u testu su:

[0173] Primeri peptida korišćenih u skriningu hibridoma i monoklonskih antitela su:

Rekombinantni humani progastrin je proizveden kao što je opisano u McQueen et al, 2002, J. Protein Chem. 21: 465-471) sa manjim modifikacijama. Ukratko, bakterijske ćelije BL21 DE3 Star (InVitrogen) su transformisane vektorom koji sadrži sekvencu humanog progastrina pune dužine u PGEX-GST-TEV okosnici (GE Healthcare). Bakterije su rasle 3 sata na 37°C u LB medijumu koji sadrži 0,5 mM IPTG. Bakterijski peleti su razbijeni pomoću French Press, i rastvorljive, kao i nerastvorljive frakcije su odvojene centrifugiranjem. Posle toga, hPG obeležen GST-om je izolovan korišćenjem glutation-afinitetne kolone i PG je odvojen od GST proteazom virusa Tobacco Itdh Virus Nla (TEV). Konačno, PG je dijalizovan prema konačnom puferu (10mM Hepes, 0,5 % BSA, pH 7,4).

[0174] Hibridomi su prvo klonirani, a zatim subklonirani i amplifikovani. Pozitivni hibridomi su izabrani na osnovu sledećih kriterijuma: (1) specifičnost za PG i imunogen, (2) relativan afinitet antitela, (3) rast hibridomskih ćelija, (4) sekrecija antitela i (5) monoklonost hibridoma. Testovi i kriterijumi selekcije su bili sledeći.

[0175] Za specifičnost, supernatanti testiranih hibridoma su testirani ELISA-om, kao što je opisano gore (50 µL supernatanta u razblaženju 1 u 2 u medijumu za testiranje PBS). Hibridomi su ocenjeni kao pozitivni ako je vrednost O.D. bila između 0,2 i 1,5 u testu sa hPG ili imunogenom korišćenim za inokulaciju testiranih miševa. Kao sledeći kriterijum za specifičnost, klonovi su izabrani na osnovu nedostatka vezivanja za druge peptide izvedene iz gena za gastrin. Izostanak vezivanja je meren kao izostanak statistički značajne razlike između signala iz testiranih udubljenja i prosečnog signala iz kontrolnih udubljenja koja sadrže samo PBS.

[0176] Za karakterizaciju afiniteta, serijska razblaženja antitela su testirana pomoću ELISA za vezivanje za hPG, kao što je opisano gore. Standardna razblaženja korišćena u testovima N-terminalnih antitela su bila 0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 ng/ml. Standardna razblaženja korišćena u testovima C-terminalnih antitela su bila 0, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 ng/ml.

[0177] Rast hibridomskih ćelija kroz više rundi serijskog gajenja je procenjen pomoću mikroskopskih posmatranja dva dan posle zasejavanja. Očekivalo se da ćelije proliferuju i napune udubljenje za 48 sati posle zasejavanja. Izvedeno je serijsko razblaženje (tipično, prvo razblaženje od 1:5, a zatim bar još 2 razblaženja od 1:10), a zatim mikroskopsko posmatranje na 48 sati da se potvrdi adekvatan rast. Ćelije iz hibridoma koje su ispunile ovaj kriterijum su razblažene ponovo zasejane, da bi se posmatrale pod mikroskopom 48h kasnije. Takve runde "razblaženje-zasejavanje-posmatranje" su ponovljene 3 puta pre nego što je hibridom ocenjen da ispunjava kriterijume "rasta".

[0178] Sekrecija antitela je testirana izvođenjem ELISA uz korišćenje hPG kao što je opisano gore, u serijskim razblaženjima (1/2, 1/20, 1/200, 1/500, 1/1000, 1/2000) supernatanata bez ćelija.

[0179] Monoklonost je određivana zasejavanjem klona ili hibridoma na ploči sa 96 udubljenja u gustini od 0,6 ćelija/udubljenje i inkubiranjem dve nedelje. Na dve nedelje, supernatanti su testirani na vezivanje hPG pomoću ELISA-e i klonska priroda populacije je određivana na osnovu imanja konzistentnih OD vrednosti u bar 90% udubljenja koja sadrže žive ćelije.

Monoklonska antitela na progastrin pune dužine

[0180] Svaki od tri miša je inokulisan rekombinantnim humanim progastrinom (opisanim gore). Imunogen nije uspeo da podigne ikakav detektabilan imuni odgovor u miševima: nikakvo vezivanje za PG nije moglo da se detektuje pomoću ELISA-e kao što je opisano gore. Fuzije nisu rađene.

N-terminalna monoklonska antitela na progastrin

[0181] Kao što je pomenuto gore, generisana su N-terminalna monoklonska antitela na antigen koji sadrži ostatke 1 do 14 hPG vezane ili za goveđi serumski albumin (BSA) ili za hemocijanin iz prilepka (KLH) preko Ahx-Cys linkera na C-kraju antigena od 14 ostataka (SWKPRSQQPDAPLG-Ahx-Cys (SEQ ID NO:26)).

[0182] U prvom eksperimentu, tri miša su inokulisana N-terminalnim peptidom vezanim za BSA. Od tri fuzije, izvedene sa splenocitima iz dva od tri miša, jedna fuzija nije dala klonove koji pokazuju vezivanje za PG ili imunogen. Od dve ostale fuzije zasejane na ploči sa 96 udubljenja, jedna je generisala 4 vezivanja PG i hibridome specifične za PG, iz koje je dobijen jedan jedini stabilan subklon koji proizvodi IgG. Druga fuzija je takođe dala jedan jedini stabilan hibridomski subklon koji proizvodi IgG, vezuje PG i specifičan je za PG. Sveukupno, iz tri miša, 17 hibridoma iz prve runde, ili 0,74% pretraženih hibridoma), je bilo pozitivno na vezivanje PG i imunogena, od kojih je subklonirano 9 pozitivnih ćelijskih linija, od kojih su dve bile pozitivne ćelijske linije koje proizvode IgG. Prema tome, prvi eksperiment je generisao dva klona posle par rundi subkloniranja, koja su zadržala jak pozitivan signal prema imunogenu i hPG (pozitivni na "vezivanje PG"), a nisu vezala druge peptide izvedene iz gena za gastrin (pozitivni na "specifični za PG"): hibridomi 43B9G11 i WE5H2G7, koji proizvode anti-hPG MAb1 i anti-hPG MAb 2 respektivno.

[0183] U drugom eksperimentu, miševi su inokulisani N-terminalnim peptidom vezanim za KLH. Dve fuzije izvedene sa ćelijama Sp2 mijeloma. Od ovih, samo jedna fuzija je generisala klonove pozitivne na PG i imunogen, koji su bili i specifični za PG. Od toga, zasejano je 1920 hibridoma. Mnogi hibridomi su bili pozitivni na imunizirajuće peptide, ali ne na progastrin, ili nisu bili specifični za PG. Konkretno, 297 hibridoma je pokazalo jak pozitivan signal za imunizirajući peptid (oko 15,5% od 1920), od čega je 124 bilo pozitivno i na vezivanje progastrina (6,5%). Bilo je 36 hibridoma, ili 1,8%, koji su bili pozitivni na progastrin, ali ne na korišćen imunogen. Samo 12 hibridoma od zasejanih 1920 je dalo antitela koja specifično vezuju progastrin, ali ne i druge proizvode gena za gastrin (0,6% od svih hibridoma, 3,6% od klonova koji su bili pozitivni na peptid i/ili progastrin u prvom skriningu). Od 12 izabranih klonova, samo 2 su bila dovoljno stabilna da budu ustanovljena kao stalni klonovi i zamrznuta za dugoročno čuvanje. Prema tome, u ovom drugom eksperimentu, od skoro 2000 hibridoma koji su zasejani, regenerisana su samo 2 klona, 6B5B11C10 (koji proizvode anti-hPG MAb 3) i 20D2C3G2 (koji proizvode anti-hPG MAb4), koji proizvode anti-hPG MAb3 i MAb4, respektivno, koji eksprimiraju monoklonska antitela sposobna za vezivanje hPG i imunizirajućeg peptida i koji imaju specifičnost za progastrin u odnosu na druge proizvode gena za gastrin i visok afinitet prema hPG. Oba primera antitela su IgG1 izotipa.

[0184] U trećem eksperimentu, miševi su inokulisani istim imunogenom kao u drugom eksperimentu. Fuzije sa ćelijama Sp2 mijeloma su izvedene sa splenocitima iz dva miša sa najjačim imunim odgovorom. Hibridomi su zasejani iz fuzija (3840 hibridoma iz jedne fuzije po mišu) i supernatanti su testirani na vezivanje za PG i imunogen, kao i na specifičnost za PG. Iz svake fuzije, po 6 hibridoma je pokazalo specifičnost za PG, od kojih su izabrana 3 subklona koji su ispunili uslove za dalji izbor za rast, monoklonost, sekreciju antitela, relativan afinitet. Prema tome, sve u svemu, 2,9% od hibridoma testiranih posle zasejavanja (220/7680) je pozitivno na PG i imunogen, od čega su 0,15% bili pozitivni klonovi (12/7680), konačni subklonovi koji su dobijeni su činili 0,15% od originalnih zasejanih hibridoma (6/7680). Ovaj eksperiment je generisao hibridome 1E9A4A4 (koji proizvode anti-hPG MAb 15), 1E9D9B6 (koji proizvode anti-hPG MAb 16), 1C8D10F5 (koji proizvode anti-hPG MAb 17), 1A7C3F11 (koji proizvode anti-hPG MAb 18), 1B3B4F11 (koji proizvode anti-hPG MAb 19) i 1C11F5E8 (koji proizvode anti-hPG MAb 20).

[0185] Sledeća tabela pokazuje broj klonova zasejanih u svakom eksperimentu, korišćen imunogen i broj i procenat hibridoma koji proizvode monoklonska antitela koja prepoznaju i imunogen i progastrin pune dužine.

C-terminalna monoklonska antitela na progastrin

[0186] Generisana su C-terminalna monoklonska antitela na antigen koji sadrži ostatke 55 do 80 hPG vezane ili za KLH, ili za DT preko Cys-Ahx-Ahx linkera na N-kraju antigena od 26 ostataka (Cys-Ahx-Ahx-QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO:96)). Pokušaji da se naprave hibridomi pomoću manjeg antigena koji sadrži samo ostatke 70 do 80 hPG, Cys-Ahx-Ahx-FGRRSAEDEN (SEQ ID NO:97), konjugovane ili sa BSA ili sa KLH, nisu uspeli da generišu nikakve klonove.

[0187] Izvedena su tri eksperimenta. U prva dva eksperimenta, u kojima je korišćen kraći peptid, regenerisano je nula subklonova. Tačnije, u prvom eksperimentu u 4 miša je ubrizgan C-terminalni peptid koji odgovara SEQ ID NO:97, vezan za BSA. Nijedna od fuzija nije generisala nikakve hibridome koji proizvode IgG. U drugom eksperimentu, u 3 miša je injektiran peptid koji odgovara SEQ ID NO:97, vezan za KLH na svom N-kraju, a u 3 miša peptid koji odgovara SEQ ID NO:97, vezan za KLH na svom C-kraju. Za prvi imunogen, fuzije su urađene i hibridomi su sakupljeni, ali nisu izolovani subklonovi pozitivni na vezivanje za PG i na specifičnost za PG. Za drugi imunogen, nijedan od miševa nije razvio nikakav imuni odgovor i fuzije nisu rađene.

[0188] U trećem eksperimentu, korišćen je peptid od 26 aminokiselina, uključujući C-terminalne sekvence koje nisu jedinstvene za hPG. Imunogen, koji je uključivao peptid koji odgovara SEQ ID NO:96, vezan ili za KLH ili za DT, je ubrizgan u miševe. Fuzije sa ćelijama mijeloma Sp2 su izvedene sa splenocitima iz dva miša koji su imali najjači odgovor.

3840 hibridoma je zasejano iz jedne fuzije po mišu. Sveukupno, od 7680 pregledanih hibridoma, od kojih je 382 (5%) bilo pozitivno na PG i specifično za PG, sakupljeno je 13 (0,17%) stabilnih, pozitivnih subklonova: 1B4A11D11 (koji proizvode anti-hPG MAb 5), 1B6A11F2 (koji proizvode anti-hPG MAb 6), 1B11E4B11 (koji proizvode anti-hPG MAb 7), 1C10D3B9 (koji proizvode anti-hPG MAb 8), D8F5B3 (koji proizvode anti-hPG MAb 9), 1E1C7B4 (koji proizvode anti-hPG MAb 10), 2B4C8C8 (koji proizvode anti-hPG MAb 11), 2B11E6G4 (koji proizvode anti-hPG MAb 12), 2C6C3C7 (koji proizvode anti-hPG MAb 13), 2H9F4B7 (koji proizvode anti-hPG MAb 14), 1F11F5E10 (koji proizvode anti-hPG MAb 21), 1F11F5G9 (koji proizvode anti-hPG MAb 22) i 1A11F2C9 (koji proizvode anti-hPG MAb 23).

[0189] Sledeća tabela pokazuje broj klonova zasejanih u svakom eksperimentu, korišćen imunogen, broj pretraženih hibridoma i broj i procenat hibridoma koji proizvode monoklonska antitela koja proizvode PG i vezuju imunogen, koja su specifična za PG i ispunjavaju kriterijume za izbor (rast, monoklonst, relativni afinitet, itd.) posle tri runde subkloniranja.

[0190] Monoklonska antitela i stabilni hibridomi u kojima su ona proizvedena su dati detaljno u sledećoj tabeli:

g

[0191] Hibridomske ćelijske linije 1B4A11D11 (MAb 5, registracioni br. CNCM I-4371), 1B6A11F2 (MAb 6, registracioni br. CNCM I-4372), 1B11E4B11 (MAb 7, registracioni br. CNCM I-4373), 2B4C8C8 (MAb 11, registracioni br. CNCM I-4374), 2B11E6G4 (MAb 12, registracioni br. CNCM I-4375) i 1E9A4A4 (MAb 15, registracioni br. i CNCM I-4376) su deponivane u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom i primljene 6. oktobra, 2010, od strane Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, Paris, France.

Kloniranje i sekvenciranje monoklonskih antitela na hPG

[0192] Monoklonska antitela proizvedena od strane hibridoma mogu se klonirati i sekvencirati korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima. Monoklonska antitela iz hibridoma, nabrojana u gore prikazanoj Tabeli 5, su sekvencirana kao što je opisano u daljem tekstu.

[0193] Sekvence koje kodiraju monoklonska antitela proizvedena od strane hibridoma 6B5B11C10 i 20D2C3G2 su klonirane i sekvencirane primenom standardnih tehnika. Ukratko, ukupna RNK je izolovana iz zamrznutih ćelijskih peleta pomoću reagensa RNKBee, AMSBio kataloški br. CS-104B, korišćenog prema uputstvima proizvođača. cDNK za V regione je dobijena iz iRNK primenom lančane reakcije polimerizacije pomoću reverzne transkriptaze (RT-PCR), iza koje je sledila 5' brza amplifikacija cDNK krajeva (RACE). Sinteza cDNK je vršena uz korišćenje prajmera specifičnih za konstantni region, posle čega je proizvod u vidu prvog lanca prečišćen i terminalna dezoksinukleotid transferaza je korišćena za dodavanje homopolimernih repova na 3' krajeve cDNK. cDNK sekvence "sa repom" su zatim amplifikovane pomoću PCR uz primenu parova prajmera, po jedan prajmer za svaki homopolimerni rep, kako za VH, tako i za VLregion. Proizvodi PCR u vidu varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su zatim klonirani u "TA" vektor za kloniranje (p-GEM-T Easy, Promega kat. br. A 1360) i sekvencirani primenom standardnih procedura. Videti SL. 2A-B (MAb 3), SL.2C-D (MAb 4).

[0194] Sekvence koje kodiraju monoklonska antitela koja proizvode hibridomi 1C10D3B9, 2C6C3C7, 1B3B4F1 i 1E9D9B61 su određene na sledeći način. Ukupna RNK je izolovana iz zamrznutih ćelijskih peleta pomoću kompleta RNAqueous®-4PCR (Ambion kat. br. AM1914), korišćenog prema uputstvima proizvođača. mRNK teškog lanca V regiona je umnožena uz upotrebu skupa od šest pulova izrođenih prajmera (HA do HF), a mRNK lakog lanca V regiona je umnožena uz upotrebu skupa od osam pulova izrođenih prajmera, sedam za κ klaster (KA do KG) i jedan za λ klaster (LA). Sinteza cDNK je vršena uz korišćenje prajmera specifičnih za konstantni region, posle čega je sledio PCR uz upotrebu pulova izrođenih prajmera za 5' mišje signalne sekvence i prajmere za 3' konstantne regione za svaki od IgGVH, IgκVL i IgλVL. (Jones et al., 1991, Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions, Bio/Technology 9:88-89). Proizvodi PCR u vidu varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su zatim klonirani u "TA" vektor za kloniranje (p-GEM-T Easy, Promega kat. br. A 1360) i sekvencirani primenom standardnih procedura. Videti SL.2E-F (MAb 8), 2G-H (MAb 13), 21-J (Mab 16) i 2K-L (Mab 19).

Primer 2: Afinitet vezivanja antitela na hPG A. Relativan afinitet

[0195] Relativni afinitet primera monoklonskih antitela je meren pomoću ELISA metoda opisanog gore, u kom su udubljenja obložena peptidnim rastvorom koji sadrži 50ng progastrina, a zatim inkubirana u prisustvu rastućih koncentracija svakog monoklonskog antitela na sledeći način:

, , g

[0196] SL 3A prikazuje relativne afinitete četiri monoklonska antitela na hPG, MAbs 1-4 testiranih u koncentracijama od 1 ng/mL do 1 µg/mL. SL 3B prikazuje relativni afinitet N-terminalnih monoklonskih antitela na hPG MAbs 3 i 15-20, testiranih u koncentracijama antitela od 0,1-100 ng/mL. SL 3C prikazuje relativni afinitet C-terminalnih monoklonskih antitela na hPG MAbs 5-14 i 21-23, testiranih u koncentracijama antitela od 0,03-30 ng/mL.

B. Merenja konstante afiniteta

[0197] Da bi se dobila apsolutnija kvantifikacija afiniteta monoklonskih antitela, konstante afiniteta su merene primenom Proteon Technique (BioRad), prema Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383:52-60. Ukratko, anti-mišje IgG antitelo (50 µg/ml) je prvo naneseno na senzorski čip, osiguravajući se da signal detektovan čipom posle injekcije antitela upada u interval između 10000 i 11500 RU (jedinice odgovora). Mišje monoklonsko antitelo koje se testira je zatim ubrizgano (tipične koncentracije: 30 µg/ml). Dovoljno vezivanje antitela koje se testira je određeno na osnovu daljeg signala od bar 500 RU na senzorskom čipu. Tok interakcije između monoklonskog antitela na progastrin i progastrina je zatim mereno injektiranjem različitih koncentracija progastrina, na primer, 200, 100, 50, 25 i 12,5 nM i detektovan je nivo asocijacije. Tipično, dostupno je nekoliko kanala za testiranje više antitela paralelno u jednom eksperimentu, omogućavajući vezivanje testiranog antitela pri različitim koncentracijama PG paralelno. Tipično, jedan kanal je rezervisan za mišje monoklonsko antitelo koje nije specifično za PG, kao kontrolno za nespecifično vezivanje i u još jedan kanal se ubrizgava sam pufer za razblaživanje kao osnovna linija za pozadinski signal. Generalno, vezivanje nije detektabilno u kanalima u koje je ubrizgano nespecifično mišje antitelo. Antitela koja ispoljavaju visok nivo asocijacije u ovoj postavci, što može da dovede do zasićenja monoklonskog antitela zarobljenog progastrinom, mogu da se testiraju na niže koncentracije progastrina (50, 25, 12,5, 6,25 i 3,125 nM), omogućavajući finije merenje.

[0198] Konstante afiniteta (KD) su izračunate kao odnos između konstanti disocijacije (kd) i konstanti asocijacije (ka). Eksperimentalne vrednosti su validirane analizom statistički značajne sličnosti između eksperimentalnih krivih na osnovu merenja vezivanja i teorijskih profila. Matematički model korišćen u eksperimentima pomoću Proteona za određivanje da li se eksperimentalne krive slažu sa teorijskim modelom je bio Langmuir-ov model, zasnovan na 1:1 interakciji između molekula progastrina i monoklonskih antitela na progastrin.

, ( , )

Primer 3: Agregiranje antitela na hPG

[0199] Agregiranje antitela može da smanji terapijsku efikasnost smanjivanjem količine antitela dostupnog za vezivanje ciljanog proteina. Antitela sa vrlo niskim nivoima agregiranja su poželjna za terapijsku primenu. Svaka partija antitela će varirati u poređenje su ostalim partijama istog monoklonskog antitela. Generalno je poželjno da se koriste partije sa niskim agregiranjem. Da bi se kvantifikovalo agregiranje antitela, rastvori antitela su stavljeni u spektrofluorimetar (Photon Technology International) i zračeni na 280nm. Difuzija je merena na 280nm, dok je emisija usled aromatičnih aminokiselina (najviše triptofana) merena na 330nm. Nivo agregiranja je zatim kvantifikovan izračunavanjem odnosa između OD vrednosti merenih na 280nm i na 330nm, kao što je opisano u Nominé et al., 2003, Biochemistry 42: 4909-4917. Viši odnos 280/330nm ukazuje na veću količinu agregiranja. Korišćena koncentracija antitela je bila 15 µg/ml, 5 do 15 puta veća od one korišćene za in vitro tretmane.

[0200] Rezultati su prikazani u Tabeli 7 niže i na SL.4.

Tabela 7

Primer 4: Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela na hPG

[0201] PG je samo jedan od peptidnih proizvoda gena za gastrin. Drugi proizvodi gena za gastrin imaju uloge u normalnoj homeostazi, ali je uloga PG u CRC ta koja ga čini korisnom metom za terapijske i dijagnostičke svrhe. Monoklonska antitela opisana ovde su specifična za progastrin pune dužine u odnosu na sve ostale peptide dobijene ekspresijom i obradom gena za gastrin, kao što su gastrin produžen glicinom (G17-gly), amidovan gastrin (Gastrin17) i C-terminalni bočni peptid (CTFP). Ovi peptidi su prisutni u cirkulaciji. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela na hPG je određivana testiranjem antitela na humani progastrin i ostalih peptida izvedenih iz gena za gastrin, pomoću ELISA testa opisanog gore u Primeru 1.

[0202] Konkretno, udubljenja obložena rastvorom koji sadrži jedan od sledećih peptida u naznačenim količinama: progastrin, hemocijanin iz prilepka (KLH), amidovan gastrin-17 (G17), gastrin produžen glicinom 17 (Gly) ili C-terminalni bočni peptid (CTFP):

[0203] U prvom eksperimentu, korišćeno je 3 ng/ml (0,3 ng) anti-hPG MAb 3 i po 1 µg/ml (0,1 µg) od svakog anti-hPG MAb 1, 2 i 4. Videti SL 5A. U drugom eksperimentu, specifičnost vezivanja anti-hPG MAb 5 za 14 i 21-23 je testirana pri 0,3 ng/mL, videti SL 5B, i specifičnost vezivanja anti-hPG MAb 3, 15-20 je testirana pri 1 ng/mL, videti SL 5C.

[0204] Antitela su pokazala slabu reakciju na velike količine KLH koji je kuplovan sa antigenskim peptidom korišćenim u nekim imunogenima za imunizovanje miševa u Primeru 1 gore. Nije bilo detektabilnog efekta BSA na vezivanje ijednog antitela za PG, uključujući ona podignuta na imunogene koji uključuju BSA kao nosač.

[0205] Sva antitela su ispoljila visoku specifičnost za vezivanje hPG pune dužine (testirano pri 50, a zatim 25 ng) u poređenju sa drugim peptidima izvedenim iz gena za gastrin, kao što su amidovan gastrin-17, gastrin produžen glicinom 17 i C-terminalni bočni peptid, peptid od 5 aminokiselina koji je dobijen cepanjem progastrina tokom normalne obrade polipeptida u formiranju gastrina. Primeri antitela nisu pokazali nikakvo detektabilno vezivanje (signal iznad pozadine od "samog PBS") za bilo koji od peptida izvedenih iz gena za gastrin osim za hPG.

Primer 5: Test kompeticije

[0206] Sposobnost monoklonskog antitela na hPG da bude u kompeticiji sa poliklonskim antitelom na hPG za vezivanje progastrina je određivana pomoću ELISA sa anti-hPG antitelom "hvatačem" i "detekcijom" antitela na hPG. Anti-hPG MAb 3 je testiran na sledeći način: ploča sa 96 udubljenja je prethodno obložena C-terminalnim poliklonskim antitelima na progastrin koja su podignuta na peptid koji se sastojao od ostataka 71 do 80 hPG. Ploče su zatim inkubirane sa 100pM progastrina, posle čega je dodato 10µg/ml biotinilovano N-terminalno poliklonsko antitelo na hPG, podignuto na peptid koji se sastojao od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:25 i rastuće koncentracije anti-hPG MAb 3 monoklonskog antitela. Vezivanje biotinilovanog N-terminalnog poliklonskog antitela na hPG je detektovano inkubiranjem ploča sa streptavidin-HRP, a zatim OPD, prema standardnim protokolima. Vezivanje je mereno kvantifikovanjem luminiscencije.

[0207] Rezultati pokazuju da rastuće koncentracije (µg/ml) Anti-hPG MAb 3 smanjuju sposobnost poliklonskog antitela na hPG da veže progastrin, pokazujući da je monoklonsko antitelo u kompeticiji sa poliklonskim antitelom. Videti, SL.6.

Primer 6: Mapiranje epitopa

[0208] Specifični epitopi koje su vezala monoklonska antitela iz primera su mapirani primenom SPOT tehnike i alaninskog skeniranja, kao što je opisano u Laune, D., et al., 2002, J. Immunol. Methods 267:53-70 i Laune, D., 1997, J. Biol. Chem. 272:30937-30944, respektivno. U SPOT tehnici, peptidne sekvence od 15 aminokiselina koje čine pretpostavljeni epitop su generisane i nanete na nitroceluloznu membranu, koja je zatim probana testiranim antitelom da se odredi minimalna sekvenca epitopa koju prepoznaje antitelo. Alaninsko skeniranje se koristi da se odrede ostaci unutar epitopa koji su kritični za vezivanje antitela: svaki ostatak u okviru pretpostavljenog epitopa je mutiran jedan po jedan u alanin i peptidi koji sadrže alanin su zatim probani testiranim antitelom.

[0209] Familije epitopa su identifikovane za antitela iz primera iz predmetne prijave. Za N-terminalna monoklonska antitela na hPG MAbs 1-4 i 15-20, epitopi sadrže bar sledeće sekvence: DAPLG (SEQ ID NO:28), PDAPLG (SEQ ID NO:29), PRSQQPD (SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD (SEQ ID NO:31) ili WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:32), kao što je prikazano u Tabeli 8 ispod.

[0210] Za C-terminalna monoklonska antitela na hPG, MAbs 5-7, 9-12, 14 i 21-23, epitopi sadrže bar sledeće sekvence: FGRR (SEQ ID NO:33), MDFGR (SEQ ID NO:34), AEDEN (SEQ ID NO:35), i GWMDFGRR (SEQ ID NO:36), kao što je prikazano u Tabeli 9 ispod.

Primer 7: Neutrališuća aktivnost antitela na hPG na ćelijske linije kancera

(A) Neutrališuća aktivnost monoklonskih antitela na hPG

[0211] Monoklonska antitela na hPG smanjuju preživljavanje ćelija u reprezentativnim ćelijskim linijama kolorektalnog kancera. Pogodne ćelijske linije kolorektalnog kancera su poznate u struci. Na primer, HCT116, LS174T, SW480 i SW620 su ćelijske linije koje se obično koriste za proučavanje kancera kolona, koje proizvode i sekretuju progastrin. Monoklonska antitela na PG su testirana na sposobnost da inhibiraju proliferaciju u ovim različitim ćelijskim linijama. Preživljavanje ćelija iz svake od HCT116, LST174T, SW480 i SW620 je testirano različitim monoklonskim antitelima na hPG.

[0212] Za svaki eksperiment, 50000 ćelija je zasejano u ploče sa 6 udubljenja u medijumu koji sadrži fetalni teleći serum i inkubirano 8 sati. Ćelije su ostavljene bez seruma preko noći, i počev od 24 sata posle zasejavanja (vreme "T0"), ćelije su tretirane 48 sati, u duplikatima, na svakih 12h, u odsustvu fetalnog telećeg seruma, sa 1 µg/ml monoklonskog kontrolnog antitela (mišji antihumani IgG1, Calbiochem, Ref #411451)(CT mAb), ili sa 1 µg/ml anti-hPG MAb 1-4, kao što je naznačeno. Daljom kvantifikacijom monoklonskih antitela, određeno je da su antitela korišćena u približno 3 do 5 µg/ml. Broj ćelija u T0 je prebrojan u kontrolnom udubljenju, za svaki eksperiment. Za HCT116 ćelije, eksperimenti su vođeni u prisustvu 0,5% fetalnog telećeg seruma. 48h posle početka tretmana, broj preživelih ćelija u svakom udubljenju je prebrojavan tri puta u eksperimentu naslepo. Smanjenje proliferacije ili preživljavanja CRC ćelija je određen računanjem preživelih ćelija tretiranih anti-hPG MAB-om, kao procenat kontrolnih ćelija tretiranih MAb-om. Brojevi ćelija na početku tretmana (T0) su oduzeti od brojeva testiranih i kontrolnih ćelija, merenih na 48 sati. Konkretno, broj živih ćelija i u kontrolnim udubljenjima i u udubljenjima tretiranim anti-hPG MAb-om je brojan na 48 sati, a zatim je računata razlika između svakog broja ćelija i broja ćelija određenih u T0. Dobijeni broj ćelija tretiranih anti-hPG MAB-om je izražen kao procenat broja kontrolnih ćelija tretiranih MAb-om.

[0213] SL. 7A-C prikazuju efekat anti-hPG MAb 3 i anti-hPG MAb 4 na preživljavanje SW480 ćelija, LS174T ćelija i HCT116 ćelija iz reprezentativnih eksperimenata. Rezultati su srednje vrednosti /- S.E. iz 4 udubljenja, iz dva nezavisna eksperimenta. Tretman monoklonskim antitelima na hPG je značajno smanjio broj ćelija u poređenju sa tretmanom kontrolnim antitelom. Statistička značajnost je određivana pomoću studentovog T testa: * = p<0,05, ** = p<0,01 i *** = p<0,001. U svakoj ćelijskoj liniji, antitela na hPG su smanjila preživljavanje ćelija. U jednoj ćelijskoj liniji, LST174T, brojevi ćelija na kraju 48 sati tretmana antitelima na hPG su bili niži nego brojevi ćelija na početku eksperimenta, sugerišući da su antitela prouzrokovala umiranje ćelija, pored inhibiranja ćelijske proliferacije.

[0214] Tabela 10 prikazuje procenat preživelih ćelija SW480 kolorektalnog kancera tretiranih svakim od četiri monoklonskih antitela na hPG u poređenju sa kontrolnim monoklonskim antitelom (mišji anti-humani IgG1, Calbiochem, Ref #411451)(CT mAb).

U poređenju sa kontrolnim, tretman monoklonskim antitelima na hPG je smanjio preživljavanje kancerskih ćelija za 83,2% (Anti-hPG MAb 3), 51,3% (Anti-hPG MAb 4), 19,8% (Anti-hPG MAb 2) i 15,6% (Anti-hPG MAb 1).

[0215] Tabele ispod prikazuju procenat preživelih LS174T i HCT-116 ćelija tretiranih antihPG MAb-om 3 i 4 u poređenju sa kontrolnim monoklonskim antitelom. Podaci su prikazani grafički u odgovarajućim panelima na SL 7.

[0216] U in vitro uslovima testa, potpuna inhibicija ćelijskog rasta nije očekivana. U ćelijskoj kulturi, progastrin se kontinuirano sekretuje od strane kancerskih ćelija i akumulira se u ćelijskom medijumu za kulture. Očekuje se da nivoi progastrina porastu tokom vremena više nego što bi se to desilo u cirkulaciji u telu, povećavajući odnos ciljanog proteina prema antitelu i razblažujući neutrališući efekat antitela. Prema tome, neutrališući efekat viđen sa antitelima in vitro je očekivan da bude veći in vivo, gde se progastrin sekretovan od strane tumorskih ćelija odnosi u krvotok, smanjujući svoju akumulaciju in situ.

[0217] Inhibicija proliferacije ćelija pomoću anti-hPG MAb 5 do 23 je određivana u jednoj ili više CRC ćelijskih linijs SW620, HCT116 i LS47T. Testovi su izvođeni u pločama sa 6 udubljenja, kao što je opisano gore, uz upotrebu 5 µg/ml kontrolnog ili testiranog(anti-hPG) monoklonskog antitela. 50000 ćelija je zasejano po udubljenju za HCT116 i LS174T, a 100000 za SW620 ćelija. Tabele niže daju procenat preživelih tretiranih ćelija u odnosu na kontrolni tretman iz reprezentativnih eksperimenata. Prosečni rezultati su dati na grafiku na SL. 7G-I za ćelijske linije SW620, LS174T i HCT-116, respektivno.

Eksperiment 2

LS 174T

(T0 = 86389)

Kontrolni Mab 241 711 /- 11

620

MAb 14 246 444 /-19563102 % ns

MAb 19 204 433 /- 8946 84,5 % 0,0005

Eksperiment 3

LS 174T

(T0 = 79667)

Kontrolni MAb 135 800 /- 18

338

Tabela 14

Broj ćelija - T0 % kontrole P (tretiran vs kontrolni) Mann Whitney, dvostrano

MAb 8 57 333 /- 12657 42 % < 0,001

Tabela 15

Broj ćelija - T0 % kontrole P (tretiran vs kontrolni) Mann Whitney, dvostrano Eksperiment 1

HCT-116

(T0 = 49286)

Kontrolni MAb 78 214 /- 6230

MAb 13 28 805 /- 3477 36 % < 0,0001

MAb 16 56 484 /- 8333 72 % < 0,0001

MAb 19 68 945 /- 8795 88 % 0,0302

Eksperiment 2

Broj ćelija - T0 % kontrole P (tretiran vs kontrolni) Mann Whitney, dvostrano

HCT-116 (T0 = 60

944)

Kontrolni MAb 122 456 / - 1697

MAb 8 75 867 /- 15627 62 % < 0,0001

MAb 16 87011 /- 5091 71 % < 0,0001

(B) Neutrališuća aktivnost poliklonskih antitela na hPG

[0218] Testovi su izvođeni kao što je opisano gore, uz sledeće modifikacije. Korišćeno je N-terminalno poliklonsko antitelo na hPG, kao što je opisano u Primeru 5. Kao kontrola, korišćeno je 3 µg/ml poliklonsko (poliklonski zečji anti-humani IgG, Affinity BioReagents, Ref #SA1 -600)(CT pAB). Za anti-PG tretmane, korišćeno je 3 µg/ml poliklonsko antitelo na hPG za sve ćelijske linije. SW480 i LS174T su tretirane kontrolnim ili N-terminalnim poliklonskim antitelima na hPG 24 do 48h u DMEM bez FCS, dok su HCT116 bile tretirane poliklonskim antitelima na hPG 48h u DMEM sa 0,5% FCS. Preživele ćelije su zatim tripsinizovane i prebrojane, u poređenju sa ćelijama tretiranim ekvivalentnom koncentracijom kontrole (anti humani IgG) poliklonskog antitela.

[0219] Rezultati reprezentativnih eksperimenata su prikazani u donjim tabelama i na SL.7D-F. Tretman poliklonskim antitelima na hPG je značajno smanjio broj ćelija u odnosu na tretman kontrolnim antitelom. Statistička značajnost je određivana pomoću studentovog T testa: * = p<0,05, ** = p<0,01 i *** = p<0,001. Brojevi ćelija su izraženi u odnosu na broj ćelija u kulturi na početku eksperimenta (T0). Za svaki eksperiment, ćelije u svakom od 4 udubljenja su brojane tri puta. Kao sa monoklonskim antitelima na hPG, proliferacija ćelija kolorektalnog kancera je inhibirana poliklonskim antitelima na hPG, demonstrirajući da antitumorski efekti koji su viđeni sa poliklonskim antitelima na progastrin razumno prediktivni za aktivnost monoklonskog antitela u blokiranju efekta progastrina na kancerske ćelije.

Primer 8: Neutrališući efekat monoklonskih antitela na hPG je eliminisan kad se antitela prethodno inkubiraju sa prečišćenim hPG

[0220] Da bi se demonstriralo da je neutrališući efekat monoklonskih antitela na hPG posredovan vezivanjem za hPG, LS174T ćelije su gajene u prisustvu antitela iz primera - antihPG MAb 8 – koje je prethodno bilo inkubirano sa i bez hPG. Kao pozitivne i negativne kontrole, ćelije su gajene samo sa hPG, samo sa kontrolnim antitelom i sa kontrolnim antitelom prethodno inkubiranim sa hPG.

[0221] Konkretno, 33,3 nM (5µg/mL) anti-hPG MAb 8 je prethodno inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi sa rekombinantnim hPG, 20 puta u molarnom višku, ili 667 nM (6,67 µg/mL). Korišćen je rekombinantni humani progastrin, dobijen kao što je opisano u Primeru 1.

Paralelno, 33,3 nM (5µg/mL) mišji anti-humani IgG1 (General BioScience, br. reference AB23420) je slično prethodno inkubiran sa i bez hPG.

[0222] 5000 LS174T ćelije su zasejane u svako udubljenje u ploči sa 96 udubljenja u medijumu koji sadrži 10% fetalni teleći serum i inkubirane 8 sati, posle čega su ćelije prebačene u medijum bez seruma i gajene još 12 sati. Posle rasta u medijumu bez seruma 12 sati, ćelije su tretirane jednim od sledećih na svakih dvanaest sati: kontrolnim antitelom, kontrolnim antitelom prethodno inkubiranim sa hPG, samim anti-hPG MAb 8, anti-hPG MAb 8 prethodno inkubiranim sa hPG i samim hPG. 48 sati posle prvog tretmana, preostale vijabilne ćelije su kvantifikovane inkubiranjem ploče sa Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution i snimana je apsorbanca na 490 nM. Apsorbanca merena u ćelijama tretiranim kontrolnim monoklonskim antitelom ("kontrolni MAb") je nameštena na 100%, a svi ostali eksperimentalni uslovi su mereni u odnosu na apsorbancu ćelija tretiranih kontrolnim MAb. Rezultati su prikazani u sledećoj Tabeli i na SL.8.

[0223] Dodatak hPG ili inkubacija antitela sa njim, povećava broj živih ćelija u kulturi. Nasuprot tome, tretman ćelija sa samim anti-hPG MAb 8 uzrokuje značajno smanjenje broja vijabilnih ćelija. Prema tome, sposobnost monoklonskih antitela na hPG da neutrališu aktivnost PG je poništena dodavanjem hPG, za koji se smatra da vezuje i saturira antitelo. Ovaj rezultat potvrđuje specifičnost neutrališuće aktivnosti monoklonskih antitela na hPG.

Primer 9: In vivo antitumorsko dejstvo antitela na hPG

[0224] Razvijeni su brojni eksperimentalni in vivo modeli za proučavanje kolorektalnog kancera. Razvijene su studije sa ksenograftom miša, u kojima se tumorsko tkivo ili ćelije iz humanih kancerskih ćelijskih linija transplantira u imunodeficijentne (takozvane "gole") miševe. Pocard M., et al., In vivo (1996) 10(5): 463-469. Razvijeno je i nekoliko modela sa transgenim mišem. Mišji modeli uključuju heterozigotne mutacije na genu adenomatous polyposis coli (APC), kao što su Apc<Min>, Apc1638N, Apc716, ili Apc∆14. Supresorski gen APC tumora kodira citosolni protein, APC, koji, kad je intaktan, vezuje i "zapleni" β-katenin u citosolu unutar multiproteinskog kompleksa ciljajući β-katenin u proteazomu za degradaciju, čime sprečava β-katenin da aktivira transkripcioni faktor Tcf-4 u nukleusu, Heyer et al., Oncogene 18:5325-5333 (1999). APC∆14 miševi nose heterozigotnu deleciju egzona 14 unutar adenomateous polyposis coli (APC) gena. Slično onome što se javlja kod više od 70% pacijenata sa sporadičnim kolorektalnim kancerom, somatski gubitak heterozigotnosti (LOH) na drugom Apc alelu se javlja u intestinalnim ćelijama, što dovodi do konstitutivne aktivacije β-katenin/Tcf-4 transkripcionog kompleksa i do spontanog razvoja intestinalnih tumora u ovim životinjama. Molekulsko poreklo ovih adenoma i karcinoma, kao i tumorske morfologije (uključujući vaskularizaciju, inflamatorni odgovor i prisustvo imunih ćelija) sa mnogo većom sličnošću sa humanim tumorima nego mišji modeli ksenografta, čine APC∆14 visoko relevantnim modelom za studije terapija za humani kolorektalni kancer. Colnot et al., 2004, Lab. Invest. 84:1619-1630. Drugi modeli sa transgenim mišem su zasnovani na mutacijama na genima kao što su MSH2, MSH6, CDX2, K-RAS, kao i linije koje kombinuju mutacije na APC sa mutacijama u drugim onkogenima. Heyer et al., 1999, Oncogene 18:5325-5333, Janssen KP et al., 2002, Gastroenterology 123: 492-504. Ovi modeli se široko koriste za proučavanje kolorektalnog kancera i testiranje hipoteze u vezi sa lečenjem kolorektalnog kancera.

[0225] Transgeni miševi koji nose heterozigotnu deleciju egzona 14 na adenomatous polyposis coli genu (APC∆14) služe kao model za kolorektalni kancer, razvijajući tumore slične onima nađenim u humanim kancerima kolona. U prvom eksperimentu, APC∆14 miševi su tretirani preparatom koji sadrži jednake količine poliklonskog antitela na hPG, podignutog na (1) peptid koji odgovara SEQ ID NO:25 i (2) C-terminalni peptid kao što je opisan u Hollande et al., WO 07/135542.3,5 meseca stari miševi su tretirani 5 nedelja bilo kontrolnim poliklonskim antitelom, bilo poliklonskim antitelom na hPG (dva miša po tretmanu). Antitela su davana intraperitonealnom injekcijom dvaput nedeljno u dozi od 10 mg/kg (zapremina injekcije 150 µl). Na kraju tretmana, miševi su žrtvovani i creva su oprana PBS-om, disecirana za digitalni imidžing i fiksirana u 4% paraformaldehidu za imunohistohemijsku analizu. Broj tumora i snimci kolorektalnog tkiva su beleženi.

[0226] Morfološka procena intestinalnog tkivaje pokazala da antitela na hPG nisu uticala na obnavljanje zdravog mišjeg intestinalnog epitela. Tumori su prebrojani u tretiranoj i kontrolnoj grupi. Ukupan broj tumora za miševe tretirane kontrolnim antitelima je bio 27, u poređenju sa 4 u miševima tretiranim antitelima na hPG. Prema tome, antitela na hPG smanjuju broj tumora više od 6,5 puta u poređenju sa kontrolnim antitelima, a ne pogađaju obnavljanje zdravog epitela u mišjim crevima.

[0227] U drugom eksperimentu, ispitan je efekat antitela na hPG u APC∆14 miševima i normalnim (kontrolnim) miševima (C57BL6J). Četiri meseca stari miševi su tretirani dvaput nedeljno 6 nedelja, bilo kontrolnim poliklonskim antitelom - zečjim anti-humanim IgG antiserumom (Jackson ImmunoResearch (br. reference 309-005-0089), bilo anti-hPG poliklonskim antitelom, intraperitonealnom injekcijom dvaput nedeljno, u dozi od 9 mg/kg (zapremina injekcije 150 µl). Posle šest nedelja tretmana, dva sata pre žrtvovanja, miševima je injektiran bromo-dezoksi-uridin (BrdU)(2 mg po mišu, intraperitonealna injekcija). 6 APC∆14 miševa je tretirano poliklonskim antitelom na hPG, a 4 kontrolnim poliklonskim antitelima. Kontrolno i antitela na hPG su administrirana svakom od 6 normalnih (C57BL6J) miševa. Nisu detektovane nikakve intestinalne abnormalnosti ni u jednom od miševa iz obe grupe, dalje demonstrirajući bezbednost i odsustvo averzivnih efekata antitela na hPG na normalno intestinalno tkivo.

[0228] Broj i veličina tumora (visina i dužina) su ispitani u tretiranoj u odnosu na kontrolnu grupu APC∆14 miševa. Veličina tumora je određena merenjem slika napravljenih u crevima svake životinje, dobijenih na sledeći način. Creva su isprana kao što je opisano gore, disecirana longitudinalno, stavljena u paraffin i obrađena za imunohistohemiju primenom tehnike "švajcarska kifla". Merenja dužine i visine tumora su izvedena primenom softvera Image J.

[0229] Rezultati su prikazani u Tabeli 18 i na SL. 8A i B. Rezultati za veličinu tumora pokazuju statistički značajnu razliku između kontrolno tretirane i anti-hPG tretirane grupe. Statistička značajnost je određena pomoću Mann Whitney testa: * = p<0,05, ** = p<0,01 i *** = p<0,001. Miševi tretirani kontrolnim antitelom su imali ukupno 125 tumora, sa 31,25 tumora po mišu u proseku. Anti-hPG tretirani miševi su imali 46 tumora ili u proseku 7,6 tumora po mišu. Ova razlika je statistički značajna (Mann-Whitney test, P= 0,0095) i polazuje da antitela na hPG značajno smanjuje broj tumora kolorektalnog kancera in vivo.

( )

[0230] Antitela na hPG značajno smanjuju broj tumora kolorektalnog kancera in vivo, što je izmereno smanjenjem i broja i veličine tumora u mišjem modelu kolorektalnog kancera, bez ikakvih vidljivih štetnih uticaja na normalan kolorektalni epitel. Prema tome, tretman tumora kolorektalnog kancera antitelima na hPG obezbeđuje terapijsku dobrobit in vivo.

Primer 10: Dizajn humanizovan antitela na hPG

[0231] Humanizovana antitela su dizajnirana "in silico" iz mišjih monoklonskih antitela na hPG, MAb 3, 4, 8, 13, 16, i 19. Dizajn humanizovanog antitela je urađen metodologijom opisanom u Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111. Za svako od mišjih monoklonskih antitela, odgovarajuće humanizovane VHi VLpeptidne sekvence su određene identifikovanjem CDR-ova i okvirnih regiona u mišjim sekvencama korišćenjem baze podataka IMGT-ONTOLOGY (Duroux et al., 2008, Biochimie, 90:570-583; Giudicelli i Lefranc, 1999, Bioinformatics, 15: 1047-1054) i baze podataka i alata IMGT® (Ehrenmann et al., 2010, Nucl.Acids. Res., 38: D301-307; Brochet et al., 2008, Nucl.Acids. Res., 36: W503-508), zatim identifikovanjem aminokiselinske sekvence najbližih humanih sekvenci okvirnog regiona u IMGT/GENE-DB (Giudicelli et al., 2005, Nucl.Acids. Res., 33: D256-261) i prenošenjem mišjih CDR sekvenci u humane okvirne regione. Konkretnije, nukleotidne i aminokiselinske sekvence mišjih VHi VLdomena su analizirane pomoću IMGT/V-QUEST i IMGT/ DomenGapAlign da bi se razgraničili mišji CDR i okvirni regioni, definisale dužine CDR i identifikovale aminokiseline-sidra. Aminokiseline-sidra su ostaci na pozicijama 26, 39, 55, 66, 104 i 118 IMGT "Biserne ogrlice" koja podržava CDR1-IMGT, CDR2-IMGT, CDR3-IMGT (Kaas i Lefranc, 2007, Current Bioinformatics, 2: 21-30; Kaas et al., Brief. Funct. Genomic Proteomic, 2007, 6: 253-264). Najbliži humani V (varijabilni) i J (spojni) geni za mišje sekvence su identifikovani i najpogodniji geni su izabrani. Pojedinačne aminokiseline u mišjem okvirnom regionu su zadržane ako se smatra da one možda doprinose specifičnosti antitela poređenjem sa poznatim 3D strukturama (Kaas et al., 2004, Nucl. Acids. Res. 32: 208-210) pomoću IMGT "Biserne ogrlice" na dva sloja.

[0232] Određeno je da CDR 1, 2 i 3 VHu Mab 3 budu po 8 aminokiselina dugi. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VHu Mab 3, IGHV1-5*01, se razlikovao za 10 ostataka, od kojih su 3 mapirana na CDR-ove i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG (I29 u CDR1, F56 i S65 u CDR2). Pored toga, V39, G55 i R66 su smatrani potencijalno važni za očuvanje specifičnosti i ostavljeni su u dizajnu. Najbliži humani embrionski gen je IGHV1-3*01 (63,3% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 27 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, treonin-123 i leucin-124 su promenjeni u leucin-123 i valin-124, da bi se složili sa humanim IGHJ1*01 genom. Sve u svemu, humanizovani VHu Mab 3 je 87,8% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV1 -46*03 i 88 od 91 aminokiseline u četiri okvirna regiona je identično.

[0233] Određeno je da CDR-ovi VLu Mab 3 budu 11, 3 i 9 aminokiselina dugi za CDR 1, 2 i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VLu Mab 3, IGKV1-117*01, se razlikovao za jedan jedini ostatak mapiran na okvirni region. Najbliži humani embrionski gen je IGKV2-30*02 (81% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 14 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. Ostaci E40 i F68 su zadržani u projektovanoj humanizovanoj sekvenci. U okvirnom regionu 4, leucin-124 je promenjen u valin-124, tako da se složi sa humanim IGKJ4*01 genom. Sve u svemu, humanizovana sekvenca Vκ za Mab 3 je 93% identična sa IGKV2D-29*02 i 87 od 89 aminokiselina u četiri okvirna regiona je identično.

[0234] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

[0235] Određeno je da CDR-ovi VHza MAb 4 budu 8, 8 i 11 aminokiselina dugi za CDR 1, 2 i 3, respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VHu MAb 4, IGHV1-9*01, se razlikovao za 11 ostataka, od kojih su 4 mapirana na CDR-ove i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG (S35, S36 i S37 u CDR1, F56 u CDR2). Pored toga, D66 je smatran potencijalno važnim za očuvanje specifičnosti i ostavljen je u dizajnu. Najbliži humani embrionski gen je bio IGHV1-46*03 (64,9% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 27 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, alanin-128 je promenjen u serin-128, tako da se složi sa humanim IGHJ5*01 genom. Sve u svemu, humanizovani VHza MAb 4 je 91,8% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV1-46*03 i 90 od 91 aminokiselina u četiri okvirna regiona je identično.

[0236] Određeno je da CDR-ovi VLza MAb 4 budu 11, 3 i 9 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VLu MAb 4, IGKV1-110*01, se razlikovao za 3 ostatka, od kojih je 2 mapirano na CDR1 (serin-34 i valin-36) i ostavljeno u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski gen je bio IGKV2D-29*02 (81% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 11 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, serin-120 je promenjen u glutamin-120, tako da se složi sa humanim IGKJ2*01 genom. Sve u svemu, humanizovana sekvenca VKza MAb 4 je 92% identična sa IGKV2D-29*02 i 100% identična u četiri okvirna regiona.

[0237] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

[0238] Određeno je da CDR-ovi VHza MAb 8 budu 8, 8 i 10 aminokiselina dugi za CDR 1, 2 i 3, respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VHu MAb8, IGHV5-9-3*01, se razlikovao na 5 ostataka, od kojih su 4 mapirana na CDR-ove i i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski geni su bili IGHV3-21*01 i *02 (80,4% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 12 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, serin-123 i leucin-124 su promenjeni u treonin-123 i valin-124, respektivno, tako da se slože sa humanim IGHJ6*01 genom. Sve u svemu, humanizovani VHza MAb 8 je 92,8% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV3-21*01 i *02 i 100% identičan u četiri okvirna regiona. Postoji potencijalno mesto N-glikozilacije u mišjem CDR3 VHza MAb8.

[0239] Određeno je da CDR-ovi VLza MAb 8 budu 11, 3 i 9 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VLu MAb 8, IGKV2-109*01, se razlikovao za 6 ostataka, od kojih su 4 mapirana na CDR1 i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski geni su bili IGKV2-28*01 i IGKV2D-28*01 (75% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 12 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, alanin-120, leucin-124 i leucin-126 su promenjeni u glicin-120, valin-124, i izoleucin-126, respektivno, tako da se slože sa humanim IGKJ4*01 genom. Sve u svemu, humanizovana sekvenca Vκ u MAb 8 je 87% identična sa IGKV2-28*01 i IGKV2D-28*01 i 100% identična u četiri okvirna regiona.

[0240] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

[0241] Određeno je da CDR-ovi VHza MAb 13 budu 8, 8 i 7 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VHu MAb 13, IGHV5-6-3*01, se razlikovao za 10 ostataka, od kojih je 5 mapirano na CDR-ove i ostavljeno u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski geni su IGHV3-7*01 i *02 (78,6% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 13 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, treonin-123 i leucin-124 su promenjeni u leucin-123 i valin-124, respektivno, tako da se slože sa humanim IGHJ4*01 genom. Sve u svemu, humanizovani VHza MAb 13 je 91,8% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV3-7*01 i *02 i 100% identičan u četiri okvirna regiona.

[0242] Određeno je da CDR-ovi VLza MAb 13 budu 11, 3 i 9 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg VLu MAb 13, IGKV1-135*01, se razlikovao za jedan jedini ostatak lociran u okvirnom regionu. Najbliži humani embrionski geni su IGKV2-30*01 i *02 (81% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 13 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, leucin-124 je promenjen u valin-124, tako da se složi sa humanim IGKJ4*01 genom. Sve u svemu, humanizovana Vκ sekvenca za MAb 13 je 94% identična sa IGKV2-30*01 i *02 i 100% identična u četiri okvirna regiona.

[0243] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

[0244] Određeno je da CDR-ovi VHza MAb 16 budu 8, 8 i 10 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu mišjeg MAb 16, VH, IGHV1-53*01, se razlikovao na 7 ostataka, od kojih su 2 mapirana na CDR-ove i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski geni were IGHV1-46*01 i *03 (71.4% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 25 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, leucin-124 je promenjen u valin-124, tako da se složi sa humanim IGHJ6*01 genom. Sve u svemu, humanizovan VHza MAb 16 je 96,9% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV1-46*01 i *03 i 100% identičan u četiri okvirna regiona.

[0245] Određeno je da CDR-ovi VLza MAb 1611, 3 i 9 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu VLmišjeg MAb 16, IGKV1-135*01, se razlikovao na 4 ostatka locirana u okvirnom regionu. Najbliži humani embrionski geni su bili IGKV2-30*01 i *02 (79% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign), koji su se razlikovali za jednu aminokiselinu u CDR1. Razlike od 15 sekvenci u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, glicin-120 je promenjen u glutamin-120, tako da se složi sa humanim IGKJ2*01 genom. Sve u svemu, humanizovana sekvenca Vκ za MAb 16 je 94% identična sa IGKV2-30*01 i *02 i 100% identična u četiri okvirna regiona.

[0246] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

[0247] Određeno je da CDR-ovi VHza MAb 19 budu 9, 7 i 14 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu VHmišjeg MAb 19, IGHV3-2*01, se razlikovao za 5 ostataka, od kojih su 2 mapirana na CDR-ove i ostavljena u dizajnu humanizovanih monoklonskih antitela na hPG. Najbliži humani embrionski gen je bio IGHV4-30-4*01 (72.4% identičan na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Međutim, pošto je ovaj gen polimorfan, izabrani su IGHV4-31*02 i *03 (71.4% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 21 sekvence u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, izoleucin-123 je promenjen u leucin-123, tako da se složi sa humanim IGHJ4*01 genom. Sve u svemu, humanizovani VHza MAb 19 je 91,9% identičan sa varijabilnim regionom za IGHV4-31*02 i *03 i 100% identičan u četiri okvirna regiona.

[0248] Određeno je da CDR-ovi VLza MAb 19 budu 7, 7 i 13 aminokiselina dugi za CDR 1, 2, i 3 respektivno. Najbliži embrionski mišji gen za sekvencu VLmišjeg MAb 19, IGLV3*01, se razlikovao za 8 ostataka, od kojih je 5 locirano na CDR. Najbliži humani embrionski geni su bili IGLV4-69*01 i *02 (69,9% identični na nivou aminokiselina, na osnovu IGMT/DomenGapAlign). Razlike od 23 sekvence u okvirnim regionima 1 do 3 su nađene između mišjih i humanih embrionskih gena. U okvirnom regionu 4, valin-124 je promenjen u leucin-124, tako da se složi sa humanim IGLJ3*01 genom. Alternativno, IGJK4*01 gen može da se koristi za okvirni region 4. Sve u svemu, humanizovana sekvenca Vκ za MAb 19 je 92,4% identična sa IGLV4-69*01 i *02 i 100% identična u četiri okvirna regiona.

[0249] Projektovane sekvence VHi Vκ su date u sledećoj tabeli.

Claims (20)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Monoklonsko antitelo na hPG, koje specifično vezuje C-terminalni region humanog progastrina (hPG), koje sadrži sledeće CDR-ove VHi VL:

CDR1 VHsekvence SEQ ID NO: 37, VHCDR2 sekvence SEQ ID NO:41, VHCDR3 sekvence SEQ ID NO:45, VLCDR1 sekvence SEQ ID NO:49, VLCDR2 sekvence SEQ ID NO:52 i VLCDR3 sekvence SEQ ID NO:55.

2. Monoklonsko antitelo na hPG iz zahteva 1, koje daje statistički značajno smanjenje broja živih ćelija kolorektalnog kancera posle in vitro tretmana testiranog uzorka u odnosu na kontrolni uzorak tretiran nespecifičnim monoklonskim antitelom.

3. Monoklonsko antitelo iz zahteva 2, gde su navedene ćelije kolorektalnog kancera LS174T ćelije.

4. Monoklonsko antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 3, gde je navedeno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od himernog, primatizovanog i humanizovanog antitela.

5. Monoklonsko antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 4, koje sadrži VHi VLlance koji imaju sekvence predstavljene sekvencama SEQ ID NO: 59 i SEQ ID NO: 63, respektivno.

6. Monoklonsko antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 4, koje je humanizovano.

7. Monoklonsko antitelo iz zahteva 6 koje sadrži VHi VLlance koji imaju sekvence izabrane iz jedne od sledećih grupa VHi VLsekvenci:

(i) VHsekvence SEQ ID NO:75 i VLsekvence SEQ ID NO:76;

(ii) VHsekvence SEQ ID NO:77 i VLsekvence SEQ ID NO:78 i

(iii) VHsekvence SEQ ID NO:79 i VLsekvence SEQ ID NO:76.

8. Monoklonsko antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 7, koje ima afinitet u opsegu od oko 1 pM do oko 7 nM.

9. Monoklonsko antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8, gde je navedeno antitelo konjugovano sa hemijskom grupom.

10. Sastav koji sadrži monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i ekscipijent, nosač i/ili razblaživač.

11. Sastav iz zahteva 10 koji je formulisan za farmaceutsku upotrebu.

12. Prvi polinukleotid koji kodira varijabilni lak lanac (VL) i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni težak lanac (VH), ili jedan polinukleotid koji kodira i varijabilan lak i varijabilan težak lanac (VLi VH), za eksprimiranje monoklonskog antitela na hPG, prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

13. Ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira varijabilan lak lanac (VL) i drugi polinukleotid koji kodira varijabilan težak lanac (VH), ili jedan polinukleotid koji kodira i varijabilan lak i varijabilan težak lanac (VLi VH), za eksprimiranje monoklonskog antitela na hPG, prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

14. Ćelija domaćin transformisana prvim polinukleotidom koji kodira varijabilan lak lanac (VL) i drugim polinukleotidom koji kodira varijabilan težak lanac (VH) ili jednim polinukleotidom koji kodira i varijabilan lak i varijabilan težak lanac (VLi VH), za eksprimiranje monoklonskog antitela na hPG, prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

15. Hibridom sposoban da sekretuje monoklonsko antitelo na hPG, prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

16. Monoklonsko antitelo na hPG prema bilo kom od zahteva 1 do 9, za upotrebu u lečenju kolorektalnog kancera.

17. Antitelo za upotrebu iz zahteva 16, gde lečenje kolorektalnog kancera uključuje administriranje navedenog antitela u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom.

18. Antitelo za upotrebu iz zahteva 17, gde se navedeno antitelo i navedeni drugi terapijski agens administriraju simultano, sukcesivno ili odvojeno.

19. Antitelo za upotrebu iz bilo kog od zahteva 17 ili 18, gde je navedeni drugi terapijski agens hemoterapijski agens ili terapijsko antitelo.

20. Antitelo za upotrebu iz zahteva 19, gde je navedeno drugo terapijsko antitelo monoklonsko antitelo na EGFR ili monoklonsko antitelo na VEGF.