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TW201940881A - 在癌症診斷中結合前胃泌激素檢測與其他癌症生物標記的技術 - Google Patents

在癌症診斷中結合前胃泌激素檢測與其他癌症生物標記的技術 Download PDF

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TW201940881A
TW201940881A TW108103179A TW108103179A TW201940881A TW 201940881 A TW201940881 A TW 201940881A TW 108103179 A TW108103179 A TW 108103179A TW 108103179 A TW108103179 A TW 108103179A TW 201940881 A TW201940881 A TW 201940881A
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progastrin
cancer
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acid sequence
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Application number
TW108103179A
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亞歷山大 皮瑞爾
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瑞士商Ｅｃｓ前胃泌激素公司
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Publication date
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Abstract

本發明有關體外診斷一特定癌症之方法，其中該方法包含使用會結合前胃泌激素之抗體及對該癌症具專一性之生物標記。

Description

在癌症診斷中結合前胃泌激素檢測與其他癌症生物標記的技術
本揭示係有關於在癌症診斷中結合前胃泌激素檢測與其他癌症生物標記的技術。
發明背景
癌症是一種多面性疾病，其中一群細胞表現出不受控制的生長、侵襲及破壞鄰近組織，及有時會透過淋巴或血液轉移或擴散至體內其它的位置。癌症之此三種惡性特性，將其等與不會侵襲或轉移之良性腫瘤區分開來。
目前有許多的方法用於治療各類型的癌症，包括手術、放射療法、化學療法、標靶療法及免疫療法。成功的癌症治療是針對原發腫瘤及任何的轉移，無論是臨床表現或微觀的。
對病患而言，儘早辨識要治療的癌症類型至關重要。早期診斷出的癌症更有可能成功的治療。若癌症擴散，有效的治療變而更加困難，且通常存活機率要低得多。所以，知道何時要立即採用重且積極的治療方案以便防止侵略性癌症的擴張很重要。
篩選及監測分析對於癌症的診斷及管理很重要。癌症篩選及監測試驗，諸如在醫療環境下收集的血液試驗，可用於大規模的篩選臨床上健康(或"無症狀")的個體、用於受試者中之疾病的診斷、預測試驗或監測。用於此應用之基於血液的遠距樣本，具有方便受試者提供樣本及副作用的風險非常低的優點。因此，改善了試驗族群的順從性。
生物標記廣泛用於腫瘤科，特別是在多種臨床環境中進行患者評估，包括疾病風險之評估、隱匿性原發性癌症之篩選、良性與惡性結果或一種惡性腫瘤與另一種惡性腫瘤的區分、確定已診斷患有癌症之病患的預後及預測以及疾病狀態的監測、用於檢測復發或測定對治療法的反應或進展。
針對特定癌症之生物標記選取，首先涉及辨識相較於供特定醫學應用之對照群組，在該癌症群組中具有可測量及統計上顯著差異之標記。生物標記可包括與疾病的發展或進展並行，且容易從癌組織或從周圍組織擴散進入血流的分泌或脫落分子以及回應腫瘤的循環細胞。已辨識的生物標記或生物標記組，一般是經過臨床驗證或顯示為一種選擇它的原始預期用途之可靠的指標。
最近本申請人已開發出基於檢測前胃泌激素之診斷試驗。使用選定的抗體建立ELISA分析，檢測患有各種類型的癌症及處於各種期別之病患血液中之前胃泌激素。此試驗，商品名CancerRead，對於檢測包括早期階段之各種類型的癌症特別有效(WO 2017/114973)。特別是，CancerRead試驗對早期階段的腫瘤表現出高靈敏度及專一性。
然而，即使血液中前胃泌激素之位準是一個早期癌症篩選之可靠的生物標記，但其無法提供有關癌症來源之資訊。
因此確實需要能夠於活體內辨識癌症，以便可在最早的階段提供適當的治療的試劑。
發明概要
本發明有關於體外診斷一特定癌症之方法，其中該方法包含使用會結合前胃泌激素之抗體及對該癌症具專一性之生物標記。
在第一實施例中，提供一種用於體外評估存在一特定癌症之風險的方法，其中該方法包含檢測一受試者之一生物樣本中之前胃泌激素及此特定癌症之一生物標記之步驟。該樣本中前胃泌激素及該癌症生物標記之存在，指出存在該癌症之風險。
另一實施例有關一種體外診斷一特定癌症之方法，其中該方法包含檢測一受試者之一生物樣本中之前胃泌激素及此特定癌症之一生物標記之步驟。該樣本中前胃泌激素及該癌症生物標記之存在，是具有該癌症之徵兆。
在另一實施例中，測量前胃泌激素之濃度。較佳地，前胃泌激素之濃度高於一閾值(如，3pM、5pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50 pM或100pM)結合檢測到該生物標記，是具有一特定癌症之風險或存在該癌症之徵兆。較佳地，前胃泌激素位準之測量，是通過檢測結合至該受試者之生物樣本中的前胃泌激素之前胃泌激素結合分子(如，抗前胃泌激素抗體)。
在另一實施例中，該癌症生物標記是常用於臨床之生物標記，諸如在National Cancer Institute之網站上所列出的任何一種。較佳地，該癌症生物標記是抑鈣素、a-胎兒蛋白、b絨毛膜促性腺素、前列腺血清抗原(PSA)、血清素、兒茶酚胺、單株免疫球蛋白、癌抗原125　(CA-125)、癌抗原19.9　(CA19.9)、癌抗原15.3 (CA 15.3)、癌胚抗原(CEA)或甲狀腺球蛋白(Tg)。
參考本文所提供之詳細的說明及所附之圖式，將能更完整的理解本發明，該說明及圖式僅例示說明用，不用於限制本發明之預期範疇。
本發明之詳細說明
本發明有關一種診斷受試者之癌症的新方法，其中該方法包含檢測來自受試者之生物樣本中之前胃泌激素及癌症生物標記。較佳地，測定該樣本中前胃泌激素的量，從而允許量化前胃泌激素。
人前胃泌激素原，101個胺基酸之胜肽(胺基酸序列編號：AAB19304.1)，是胃泌激素基因之主要轉譯產物。前胃泌激素是切割前胃泌激素原之前21個胺基酸(訊息肽)所形成。前胃泌激素之80個胺基酸鏈進一步被切割及修飾酵素處理成許多生物活性胃泌激素荷爾蒙形式：胃泌激素34 (G34)及甘胺酸延伸的胃泌激素34 (G34-Gly)，包含前胃泌激素之胺基酸38-71、胃泌激素17 (G17)及甘胺酸延伸的胃泌激素17 (G17-Gly)，包含前胃泌激素之胺基酸55至71。
胃泌激素細胞會自然產生前胃泌激素，其會成熟成胃泌激素。在消化期間，95%的前胃泌激素以胃泌激素之形式從細胞釋出。非常少量的前胃泌激素以前胃泌激素之形式釋出。因此，除了消化期間外，健康人之血液中沒有前胃泌激素。
反過來說，在病理狀況下，前胃泌激素成為一個早期標記。在腫瘤細胞中，前胃泌激素不會成熟成胃泌激素，因此從腫瘤細胞中釋出。前胃泌激素可以自分泌、旁分泌或內分泌方式(Dimaline & Varro,J Physiol 592 (Pt.14): 2951–2958, 2014)促進腫瘤形成(如，胃癌[Burkitt et al.,World J Gastroenterol. 15 (1): 1–16, 2009, WO 2017/114975]、結腸癌[Watson et al.,J Cancer .87 (5): 567-573, 2002]、胰臟癌[Harris et al.,Cancer Res .64 (16): 5624-5631, 2004, WO 2011/083091]、卵巢癌[WO 2017/114972]、前列腺癌[WO 2018/178352]、食道癌[WO 2017/114976]及肺癌[WO 2018/178354])，其亦使得前胃泌激素成為表達此等刺激因子之癌症中優選的抗腫癌標的(見，如WO 2011/045080、WO 2011/083088、WO 2011/116954、WO 2012/013609、WO 2011/083090、WO 2011/083091、WO 2017/114975、WO 2017/114976、WO 2017/114972、WO 2018/178364)。此過程與消化無關。
前胃泌激素是無症狀病患中一個特別可靠的癌症生物標記(WO 2017/114973)。然而，即使檢測到前胃泌激素顯示存在癌症之跡象，但其無法表明該癌症之起源。
在第一態樣中，本發明有關一種用於體外評估存在一特定癌症之風險之方法，其中該方法包含檢測來自一受試者之生物樣本中之前胃泌激素及此特定癌症之生物標記。在該樣本中前胃泌激素及該癌症生物標記之存在，指示存在該癌症之風險。
因此，在第一實施例中，本發明有關一種用於評估一受試者中存在一特定癌症之風險的體外方法，該方法包含下列步驟：
a) 使來自該受試者之一生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，
b) 檢測該樣本中該前胃泌激素結合分子與前胃泌激素之結合，及
c) 檢測該樣本中該特定癌症之至少一種生物標記，
其中假如在該樣本中檢測到該前胃泌激素結合分子與前胃泌激素之結合及存在該生物標記，則在該受試者中有存在該癌症之風險。
在本文中使用之術語“癌症”意指或描述哺乳動物中，典型特徵為未受控制的細胞增生之生理病況。本文中使用之術語“癌症”及“癌性”旨在包含該疾病之所有期別。本文中使用之“癌症”是任一種在有機體內由受損細胞之非期望的生長、侵襲及在某些條件下轉移所產生的惡性腫瘤。長成癌症之細胞是基因受損的且通常喪失其等控制細胞分裂、細胞遷移行為、分化狀態和/或細胞死亡機制之能力。大部分的癌症形成腫瘤，但某些造血癌症如白血病則不會。
因此，本文中使用之“癌症”可包括良性及惡性癌症二者。癌症之例子包括，但不限於，上皮癌、 淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性腫瘤。更具體地，根據本發明之癌症是選自於包含下列之群組：鱗狀細胞癌(如，上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌；口咽癌；鼻咽癌；喉癌；腹膜癌；食道癌；肝細胞癌；胃癌，包括胃腸癌和胃腸道間質癌；胰臟癌；膠質母細胞瘤；腦癌；神經系統癌；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；泌尿道癌；肝腫瘤；乳癌；結腸癌；直腸癌；結直腸癌；子宮內膜或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；前列腺癌；膽囊癌；外陰癌；睾丸癌；甲狀腺癌；卡波西肉瘤；肝癌；肛門癌；陰莖癌；非黑色素瘤皮膚癌；黑色素瘤；皮膚黑色素瘤；表淺散播型黑色素瘤；惡性小痣性黑色素瘤；肢端小痣性黑色素瘤；結節性黑色素瘤；多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤(包括何杰金氏淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤，諸如低惡性度/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞(SL) NHL；中惡性度/濾泡性NHL；中惡性度瀰漫性NHL；高惡性度免疫母細胞NHL；高惡性度淋巴母細胞NHL；高惡性度小型無裂隙細胞NHL；巨大腫瘤疾病NHL；外膜細胞淋巴瘤；愛滋病相關淋巴瘤；及Waldenstrom氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞白血病(CML)；急性骨髓母細胞白血病(AML)；及移植後淋巴增生性疾病(PTLD)；以及與斑痣性錯構瘤病、水腫(諸如與腦腫瘤相關的水腫)、Meigs氏症候群、腦相關的異常血管增生；以及頭與頸癌，包括唇&口腔癌；及相關的轉移。
在一較佳實施例中，該癌症是肺癌、唇&口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、喉癌、前列腺癌、食道癌、膽囊癌、肝癌、肝細胞癌、胃癌，包括胃腸癌及胃腸間質癌、胰臟癌、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、卡波西肉瘤、腎癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、肝腫瘤、肝癌、肛門癌、甲狀腺癌、 非黑色素瘤皮膚癌、皮膚黑色素瘤、腦癌、神經系統癌、睪丸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、卵巢癌或乳癌。
在更佳的實施例中，該癌症是食道癌、肝癌、肝細胞癌、胃癌，包括胃腸癌及胃腸間質癌、胰臟癌、何杰金氏淋巴瘤、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、肝腫瘤、肝癌、肛門癌、非黑色素皮膚癌、皮膚黑色素瘤、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、卵巢癌或乳癌。
前胃泌激素結合分子之結合，可通過熟悉此技藝之人士可得之各種分析法檢測。雖然任何適合進行該分析之方法均包括在本發明內，但特別提到的是FACS、ELISA、RIA、西方墨點法及IHC。
在臨床中大量使用生物標記來辨識特定癌症。據此，可利用對應的臨床核准分析法中之任一種，來檢測該樣本中該生物標記之存在。癌症生物標記將更詳述於下。
在一較佳實施例中，根據本發明之用於體外評估一受試者中存在一特定癌症之風險的方法，包含下列步驟：
a) 使來自該受試者之該生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，
b) 測定該生物樣本中前胃泌激素之濃度，及
c) 檢測該樣本中該特定癌症之至少一種生物標記，
其中假如在該樣本中該前胃泌激素之濃度大於一閾值濃度且檢測到該生物標記之存在，則該受試者存在該癌症之風險。
在一更特定實施例中，該前胃泌激素閾值濃度為至少3pM、5pM、10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM或至少50pM之前胃泌激素濃度。
在另一實施例中，該前胃泌激素閾值濃度由對照樣本之前胃泌激素濃度提供。據此，一旦測得存在該樣本中之前胃泌激素的濃度，即可將結果與對照樣本之結果(其是以與試驗樣本相似的方法獲得，但來自沒有罹患癌症之個體)比較。假如該試驗樣本中前胃泌激素之濃度顯著較高，則可以得到衍生出它的受試者具有所關注之特定癌症之可能性增加之結論。
因此，在一更佳實施例中，本發明之方法之步驟b)包含進一步的步驟：
· 測定一參考樣本中前胃泌激素之一參考濃度，
· 將該生物樣本中該前胃泌激素之濃度與前胃泌激素之該參考濃度比較。
根據此具體實施例，結合使用該受試者之該生物樣本中該前胃泌激素之濃度與該參考濃度之比較與該生物標記之檢測，用於評估該受試者中存在該癌症之風險。
在另一態樣中，本發明有關一種用於診斷一受試者中一特定癌症之體外方法，該方法包含下列步驟：
a) 使來自該受試者之一生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，
b) 檢測該樣本中該前胃泌激素結合分子與前胃泌激素之結合，及
c) 檢測該樣本中該特定癌症之至少一種生物標記，
其中假如在該樣本中檢測到該前胃泌激素結合分子與前胃泌激素之結合及存在該生物標記，則該受試者中存在該特定癌症。
在一較佳實施例中，本發明有關一種用於體外診斷一受試者中一特定癌症之方法，其包含下列步驟：
a) 使來自該受試者之該生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，
b) 測定該生物樣本中前胃泌激素之濃度，
c) 檢測該樣本中該特性癌症之至少一種生物標記，
其中假如在該樣本中檢測到該前胃泌激素之濃度高於一閾值濃度及存在該生物標記，則該受試者中存在該特定癌症。
在根據本發明之方法之一更特定的實施例中，該生物樣本中至少3pM、5pM、10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM或至少50pM的前胃泌激素濃度指示該受試者中存在癌症。
在一更佳實施例中，本發明之方法之步驟b)包含進一步的步驟：
· 測定一參考樣本中前胃泌激素之一參考濃度，及
· 將該生物樣本中該前胃泌激素之濃度與前胃泌激素之該參考濃度比較。
根據此具體實施例，結合使用該受試者之該生物樣本中該前胃泌激素之濃度與該參考濃度之比較與該生物標記之檢測，用於診斷該受試者中之該癌症。
在一特定實施例中，本發明有關一種用於體外診斷一受試者中一特定癌症的方法，其包含測定一生物樣本中前胃泌激素之濃度，及將所獲得之該值與一參考樣本中前胃泌激素之濃度比較。
在一更特定實施例中，在根據本發明之用於診斷一特定癌症之方法中，將該受試者之該生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，其中該前胃泌激素結合分子是一抗體或其抗原結合片段。
“評估一受試者中存在一特定癌症之風險”一詞，意指當與一參考受試者或值比較時，測定一指定受試者罹患該特定癌症之相對機率。根據本發明之方法代表一種結合其它方法或指示物如臨床檢驗、活體組織切片及影像來評估該風險之工具。
“體外診斷”一詞意指用於測定一受試者是否罹患一特定病變。據此，根據本發明之用於體外診斷癌症之方法，可被視為一種診斷過程中之工具。
術語“前胃泌激素”意指哺乳動物前胃泌激素胜肽，特別是人前胃泌激素。在無任何規範下，為避免疑義“人前胃泌激素”一詞意指具序列辨識編號1之人PG。人前胃泌激素特別包含N端及C端結構域，其二者在上述生物活性胃泌激素荷爾蒙中均缺少。較佳地，該N端結構域之序列以序列辨識編號2表示。在另一較佳實施例中，該C端結構域之序列以序列辨識編號3表示。
根據本發明之方法中，該前胃泌激素之濃度的測定可通過任何熟悉生化領域之技術人士已知之方法進行。
較佳地，測定一樣本中前胃泌激素之位準，包括使該樣本與一前胃泌激素結合分子接觸，及測量該前胃泌激素結合分子與前胃泌激素之結合。
當測量蛋白層級之表達位準時，可以特別使用專一性前胃泌激素結合分子如抗體來進行，特別是使用已熟知之技術，像是使用生物素化之細胞膜染色或其它相等的技術，接著使用專一性抗體之免疫沈澱法、西方墨點法、ELISA或ELISPOT、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫組織化學(IHC)、免疫螢光(IF)、抗體微陣列或連結免疫組織化學之組織微陣列。其它合適的技術包括FRET或BRET、單細胞顯微鏡或組織化學方法，其使用單一或多個激發波長且施用任何配合的光學方法，諸如電化學方法(伏安及安培技術)、原子力顯微鏡及射頻方法，如多極共振光譜、共焦及非共焦檢測螢光、發光、化學發光、吸光度、反射率、透射率及雙折射或折射率(如，表面電漿子共振、橢圓偏振法、共振鏡法、光柵耦合器波導法或干涉法)、細胞ELISA、流動式細胞測量法、放射同位素、磁振造影、利用聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析(SDS-PAGE)；HPLC-質譜儀；液相色層分析/質譜儀/質譜儀(LC-MS/MS))。所有此等技術均為業界已知的，於本文中不需要進一步詳細說明。此等不同的技術均可用於測量前胃泌激素位準。
該方法可特別地選自：基於免疫檢測之方法、基於西方墨點法之方法、基於質譜儀之方法、基於色層分析之方法及基於流動式細胞測量法之方法。雖然任何適合進行該分析之方法均包括在本發明內，但諸如FACS、ELISA、RIA、西方墨點法及IHC之方法特別可用於進行本發明之方法。
在一更特定實施例中，根據本發明之用於體外診斷一特定癌症之方法，包含使用一免疫酵素分析法，較佳地基於選自RIA及ELISA之技術，使來自一受試者之一生物樣本與一前胃泌激素結合分子接觸。
本文中使用之“生物樣本”是生物組織或液體之樣本，其含有對所關注的癌症具專一性之如蛋白、多核苷酸或轉錄本之核酸或多肽。此一樣本必須容許測定前胃泌激素之表達位準。前胃泌激素已知為一種分泌型蛋白。因此用於測定前胃泌激素蛋白位準之較佳的生物樣本包括生物液體。在此使用之“生物液體”意指任何包括生物來源之材料之液體。用於本發明之較佳的生物液體包括動物如哺乳動物，較佳地人類受試者之體液。體液可為任何體液，包括但不限於，血液、血漿、血清、淋巴、腦脊液(CSF)、唾液、汗及尿液。較佳地，該較佳的液體生物樣本包括諸如血液樣本、血漿樣本或血清樣本之樣本。更佳地，該生物樣本是血液樣本。確實，此一血液樣本可通過完全無害的血液採集而從病患身上獲得，因此能夠以非侵入之方式評估該受試者發展出腫瘤之風險。
當該癌症是實體癌時，在此使用之“生物樣本”亦包括待試驗之病患的實體癌樣本。此實體癌樣本使得熟悉此技藝之人士可進行任何測量本發明之生物標記位準之類型。在某些情況下，根據本發明之方法可進一步包含從病患身上採取實體癌樣本之一預先步驟。在“實體癌樣本”方面，較佳的是腫瘤組織樣本。即使在癌症病患中，腫瘤位置之組織仍包含非腫瘤健康組織。“癌樣本”因此應限制至從病患身上取得之腫瘤組織。該“癌樣本”可為活體組織切片樣本或從手術切除治療取得之樣本。
生物樣本通常是從真核生物，大部分是哺乳動物，或鳥，爬行動物或魚中獲得。事實上，可接受本文所述之方法處理的“受試者”可為任一種哺乳動物，包括人、狗、貓、牛、山羊、豬(pig、swine)、綿羊及猴子；或鳥；爬行動物；或魚。較佳地，受試者是人；人受試者可被稱作“病患”。在一實施例中，該受試者是無症狀的，即該受試者沒有顯示出癌症之症狀，或已經診斷具有癌症的。當醫事人員進行醫學試驗顯示出存在癌症時，受試者被“診斷具有癌症”。在此使用之“症狀”是疾病如癌症之任一主觀證據。“症狀”是病患覺察到偏離正常之功能或感覺，反應出存在異常狀態或疾病如癌症。假如病患是帶該疾病體，但沒有感覺到症狀，則疾病被視為無症狀。無症狀病況要到病患接受醫學試驗，如測量前胃泌激素位準時，才可能被發現。
本文中之“獲得生物樣本”意指獲得供用於本發明所述方法之生物樣本。最常見的是通過從動物身上移除細胞樣本完成，但亦可通過使用事先單離的細胞(如，從另一人身上、在另一時間和／或為另一目的單離的)或通過活體內進行本發明之方法來完成。具有治療或結果史之檔案組織將特別有用。
此樣本可根據熟悉此技藝之人士己知之方法獲得及製得(若需要的話)。特別是，在本領域中眾所周知的是樣本應取自禁食受試者。
前胃泌激素之濃度的測定，涉及測量已知體積樣本中前胃泌激素之數量。前胃泌激素之濃度可以相對於參考樣本之方式表示，例如依比率或百分比之方式。取決於用於測定該濃度之方法，該濃度亦可表示為訊號之強度或定位。較佳地，樣本中化合物之濃度，以該樣品中相關化合物的總濃度正規化後之濃度表示，例如，樣本中蛋白質之位準或濃度，以蛋白質總濃度正規化後之濃度表示。
較佳地，該受試者罹患一特定癌症之風險，是通過在該生物樣本中測得之前胃泌激素位準與一參考位準的比較測定。
本文中使用之術語“參考位準”意指所考慮的癌症標記，即前胃泌激素，在一參考樣本中之表達位準。在此使用之“參考樣本”意指從已知無疾病之受試者，較佳地二或多個受試者中，或選擇性地從一般大眾獲得之樣本。前胃泌激素之適合的參考表達位準，可通過測量許多適合的受試者中該標記之表達位準決定，且此參考位準可調整以適合特定受試者群組。參考值或參考位準可為絕對值；相對值；具有上或下限之值；範圍值；平均值；與一特定對照或基準值比較之中間值、平均值或值。參考值可以一個別樣本為基礎，諸如從來自待試驗之受試者之樣本，但在較早的時間點獲得之值。該參考值可以大量的樣本為基礎，諸如來自實足年齡匹配組之受試者群組，或以包括或排除待試驗樣本之樣本群體為基礎。
有利地，“參考位準”是從來自具有已知特定癌症狀態之受試者之生物樣本獲得之一預定前胃泌激素位準。在特定實施例中，用於在步驟(b)與試驗樣本比較之參考位準，可從來自健康受試者之生物樣本獲得，或從來自罹患癌症之受試者之生物樣本獲得；應理解，該參考表達譜亦可從一群健康受試者之生物樣本獲得，或從一群具有癌症之受試者之生物樣本獲得。
在本發明之方法之一特定實施例中，該參考樣本是從沒有任何癌症，較佳地任何病理，之受試者採取而得。應理解，根據從病患採取之生物樣本之本質，該參考樣本是與該生物樣本具相同本質之生物樣本。
在本發明中前胃泌激素之位準的測定，是通過測定被前胃泌激素結合分子，較佳地辨識前胃泌激素之抗體，結合之前胃泌激素的數量。
本文中之“前胃泌激素結合分子”意指任何會結合前胃泌激素，但不會結合胃泌激素-17 (G17)、胃泌激素-34 (G34)、甘胺酸延伸的胃泌激素-17 (G17-Gly)或甘胺酸延伸的胃泌激素-34 (G34-Gly)之分子。本發明之前胃泌激素結合分子可為任何前胃泌激素結合分子，諸如抗體分子或受體分子。較佳地，該前胃泌激素結合分子是抗前胃泌激素抗體或其抗原結合片段。
根據一特定實施例，本發明有關一種癌症之體外診斷方法，其包含測定來自一受試者之一生物樣本中前胃泌激素之濃度，其中該受試者顯示出癌症之至少一種臨床症狀。
根據另一特定實施例，本發明有關一種癌症之體外診斷方法，其包含測定來自一受試者之一生物樣本中前胃泌激素之濃度，其中該受試者顯示出癌症和/或轉移之至少一種臨床症狀。
關於“結合”等等，其意指抗體或其抗原結合片段與抗原形成一個在生理條件下相對穩定的複合物。用於測定二個分子是否結合之方法是業界熟知的，且包括例如平衡透析法、表面電漿共振等等。在一特定實施例中，該抗體或其抗原結合片段對前胃泌激素之結合親和力，大於其對非專一性分子如BSA或酪蛋白之結合親和力的至少2倍。在一更特定的實施例中，該抗體或其抗原結合片段僅結合至前胃泌激素。
在一特定實施例中，在根據本發明之用於診斷癌症之方法中，使該受試者之生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸，其中該分子對前胃泌激素之親和力，以上述方法測定時為至少100nM、至少90nM、至少80nM、至少70nM、至少60nM、至少50nM、至少40nM、至少30nM、至少20nM、至少10nM、至少5nM、至少1nM、至少100pM、至少10pM或至少1pM。
在一特定實施例中，本發明有關一種用於診斷癌症之方法，其包含檢測來自一受試者之一生物樣本中前胃泌激素之濃度，其中使該生物樣本與一抗hPG抗體或其抗原結合片段接觸。
本文中使用之術語“抗體”旨在包括多株及單株抗體。抗體(或“免疫球蛋白”)由糖蛋白構成，其包含以雙硫鏈互聯之至少二個重(H)鏈及二個輕(L)鏈。各重鏈包含一重鏈可變區(或結構域) (本文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。該重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含一輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。該VH及VL區可進一步細分為高變異區，稱作“互補決定區” (CDR)或“高變異區”，其主要負責結合抗原之抗原決定位，且其間散佈著較保留的區，稱作骨架區(FR)。辨識抗體之輕及重鏈中之CDR及測定其等之序列之方法，是熟悉此技藝之人士熟知的。為避免疑義，在文中無任何相反的指示之情況下，CDR一詞意指IMGT定義之抗體的重及輕鏈之高變異區，其中IMGT獨特編號提供骨架區及互補決定區之標準定界，CDR1-IMGT：27至38，CDR2。
IMGT獨特編號被界定用於比較任何抗原受體、鏈類型或物種之可變結構域[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。在IMGT獨特編號中，保留胺基酸總是具有相同的位點，例如半胱胺酸23 (第一-CYS)、色胺酸41 (保留-TRP)、疏水性胺基酸89、半胱胺酸104 (第二-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118 (J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特編號提供骨架區(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104及FR4-IMGT：118至128)及互補決定區：CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65及CDR3-IMGT：105至117之定界。因為間隔代表空置的位置，所以CDR-IMGT長度(顯示括號之間且用點隔開，如[8.8.13])變成重要的信息。IMGT獨特編號被用於2D圖形表示，指定為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]及IMGT/3D結構-DB中之3D結構[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]。
各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，從胺基端至羧基端排列順序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合結構域。抗體之恆定區可調解免疫球蛋白對宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(如，作用細胞)及典型補體系統之第一組份(Clq)的結合。抗體可具有不同的同型(即，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。
在一特定實施例中，該前胃泌激素結合抗體或其抗原結合片段是選自於由下列所構成之群組：多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、駱駝化抗體、IgA1抗體、IgA2抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體及IgM抗體。
“多株抗體” 是在一種或多種其他非相同抗體中或存在下產生的抗體。一般而言，多株抗體是在許多其它會產生非相同抗體之B淋巴細胞的存在下，由B淋巴細胞產生。通常，多株抗體是直接從免疫的動物獲得。
術語“單株抗體”意指由幾乎同質的抗體群產生之抗體，其中除了少數可能以最小比例發現之可能的天然突變外，該群包含相同的抗體。單株抗體由單一細胞株如融合瘤生長產生，特徵為具有一種類型及亞型之重鏈及一種類型的輕鏈。
抗體之“抗原結合片段”一詞，意指任何保有結合至該抗體之標的(通常亦稱作抗原；通常是相同的抗原決定位)之能力的胜肽、多肽或蛋白，且包含該抗體之胺基酸序列中至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少60個連續胺基酸殘基、至少70個連續胺基酸殘基、至少80個連續胺基酸殘基、至少90個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基或至少200個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。
在一特定實施例中，該抗原結合片段包含衍生它的抗體的至少一個CDR。又在一較佳實施例中，該抗原結合片段包含衍生它的抗體之2、3、4或5個CDR，更佳為6個CDR。
“抗原結合片段”可非限制性地選自由下列構成之群組：Fv、scFv (sc為單鏈)、Fab、F(ab’)2 、Fab’、scFv-Fc片段或二體；或具無序肽如XTEN (延伸重組多肽)或PAS模體之融合蛋白；或半衰期經化學修飾而延長之任一片段，諸如添加聚(伸烷基)乙二醇，諸如聚乙二醇(“聚乙二醇化”) (稱作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2 -PEG或Fab’-PEG之乙二醇化片段) (“PEG”為聚乙二醇)，或通過併入脂質體，具有至少一個根據本發明之抗體之特徵CDR之片段。較佳地，該“抗原結合片段”可由下列構成或包含下列：衍生其等的抗體之重或輕可變鏈之部分序列，該部分序列對該標的充分保留與它所來自的抗體相同的結合專一性及充分的親和力，較佳地等於它所來自的抗體之親和力的至少1/100，更佳地至少1/10。
在另一特定實施例中，在根據本發明之用於診斷癌症之方法中，使來自一受試者之一生物樣本與會結合至前胃泌激素之一抗體接觸，其中該抗體是由熟悉此技藝之人士已知之免疫方法獲得，其中使用作為免疫原之胜肽，其胺基酸序列包含前胃泌激素之胺基酸序列的全部或部分。更特定地，該免疫原包含選自下列之胜肽：
· 其胺基酸序列包含或由整段前胃泌激素，特別是具序列辨識編號1之整段人前胃泌激素，之胺基酸序列構成之胜肽，
· 其胺基酸序列對應於前胃泌激素，特別是具序列辨識編號1之整段人前胃泌激素，之胺基酸序列之一部分之胜肽，
· 其胺基酸序列對應於前胃泌激素之N端部分的一部分或全部胺基酸序列之胜肽，及特別是包含或由胺基酸序列：SWKPRSQQPDAPLG (序列辨識編號2)構成之胜肽，及
· 其胺基酸序列對應於前胃泌激素之C端部分的一部分或全部胺基酸序列之胜肽，及特別是包含或由胺基酸序列：QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (序列辨識編號3)構成之胜肽，
· 其胺基酸序列對應於前胃泌激素之C端部分的一部分胺基酸序列之胜肽，及特別是包含對應於前胃泌激素之胺基酸71-80之胺基酸序列FGRRSAEDEN (序列辨識編號40)之胜肽。
熟悉此技藝之人士當理解，此免疫作用可依需要用於產生多株或單株抗體。用於獲得此等類型的抗體中之每一種的方法是業界熟知的。熟悉此技藝之人士因此可輕易地選擇及實行用於產生抗任一指定抗原之多株和/或單株抗體之方法。
使用包含對應於人前胃泌激素之胺基酸序列1-14　(N-端)，胺基酸序列“SWKPRSQQPDAPLG”，之免疫原產生的單株抗體之例子包括，但不限於，命名為mAb3、mAb4、mAb16及mAb19和mAb20之單株抗體，如以下表1至表4所述。已有述及其他單株抗體，但尚不清楚這些抗體是否實際上會結合前胃泌激素(WO 2006/032980)。抗原決定位圖譜定位之實驗結果顯示，mAb3、mAb4、mAb16及mAb19和mAb20確實會專一性結合該hPG N端胺基酸序列中的抗原決定位。在本技術領域中已有述及專一性辨識以序列辨識編號2表示之前胃泌激素N端中的抗原決定位之多株抗體(見如WO 2011/083088)。
表1

表2

表3

表4
可使用包含對應於人前胃泌激素之胺基酸序列55-80　(前胃泌激素之C端部分)，胺基酸序列“QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN”，之免疫原產生的單株抗體之例子包括，但不限於，命名為下列之抗體：以下表5及6中之mAb8及mAb13。抗原決定位圖譜定位之實驗結果顯示，mAb13確實專一性結合該hPG C端胺基酸序列中之抗原決定位。另一個可如此產生之單株抗體的例子為WO 2011/083088中所述的，通過融合瘤2H9F4B7產生之抗體Mab14。融合瘤2H9F4B7依布達佩斯條約於2016年12月27日寄存在CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France，編號I-5158。
表5

表6
其它例子包括使用包含序列辨識編號40之胺基酸序列之免疫原產生之抗hPG單株和/或多株抗體。
在一更特定實施例中，在根據本發明之方法中，使該生物樣本與一抗hPG抗體或其抗原結合片段接觸，其中該抗hPG抗體選自N端抗hPG抗體及C端抗hPG抗體。
術語“N端抗hPG抗體”及“C端抗hPG抗體”指分別結合至包含位在hPG N端部分之胺基酸的抗原決定位或包含位在hPG C端部分之胺基酸的抗原決定位之抗體。較佳地，術語“N端抗hPG抗體”意指結合至位在前胃泌激素中，以序列辨識編號2表示之結構域中的抗原決定位之抗體。在另一較佳實施例中，術語“C端抗hPG抗體”意指結合至位在前胃泌激素中，以序列辨識編號3表示之結構域中的抗原決定位之抗體。
術語“抗原決定位”意指抗原上抗體結合的區域。抗原決定位可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定位一般是結構性抗原決定位之亞型，且具有該等直接促成交互反應之親和力之胺基酸序列。抗原決定位亦可為構形的。在某些實施例中，抗原決定位可包括諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基分子之化學活性表面組群的決定因子，及在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵和/或特定電帶特徵。抗體結合抗原決定位之測定，可通過任一熟悉此技藝之人士已知的抗原決定位圖譜定位技術進行。抗原決定位可包含順序位於蛋白之胺基酸序列內之不同的胺基酸。抗原決定位亦可包含不是順序位在蛋白之胺基酸序列內之胺基酸。
在一特定實施例中，該抗體是選自於由下列所構成之群組之單株抗體：
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號4、5及6之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號4、5及6最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號7、8及9之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號7、8及9最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號10、11及12之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號10、11及12最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號13、14及15之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號13、14及15最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號16、17及18之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號16、17及18最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號19、20及21之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號19、20及21最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號22、23及24之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號22、23及24最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號25、26及27之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號25、26及27最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號28、29及30之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號28、29及30最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號31、32及33之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號31、32及33最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及
· 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號34、35及36之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號34、35及36最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號37、38及39之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號37、38及39最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列。
在另一實施例中，該抗體是由在2016年12月27日寄存在CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France，編號I-5158之融合瘤產生的單株抗體。
在本發明之意義上，二個核酸或胺基酸序列間之“百分比一致性”或“%一致性”，意指二個要進行比較之序列間，在最佳比對後獲得相同核苷酸或胺基酸殘基的百分比，此百分比是純統計上的，且該二個序列間之差異沿著其等之長度隨機分佈。二個核酸或胺基酸序列之比較，傳統上是通過比較在最佳比對其等後之序列進行，該比較能夠以片段或使用“比對窗”進行。除了手動比較外，用於比較之序列的最佳比對，亦可通過熟悉此技藝之人士已知之方法進行。
對於表現出與一參考胺基酸序列有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之胺基酸序列，較佳範例包括該等含有該參考序列、某些修飾，主要是至少一個胺基酸之缺失、添加或取代，截短或延長者。在一或多個連續或非連續胺基酸之取代的情況下，其中優選的取代的是取代的胺基酸被“等價”胺基酸取代。在此，“等價胺基酸”一詞意指任何可能取代結構胺基酸之一，但沒有修改對應的抗體及以下所定義之特定例子之生物活性的胺基酸。
等價胺基酸可依其等與其等取代的胺基酸之結構同源性決定，或依可能會產生的各種抗體間之生物活性的比較測試結果決定。
在更特定的實施例中，該抗體是選自於由下列所構成之群組之單株抗體：
· 包含胺基酸序列辨識編號41之重鏈及胺基酸序列辨識編號42之輕鏈之單株抗體；
· 包含胺基酸序列辨識編號43之重鏈及胺基酸序列辨識編號44之輕鏈之單株抗體；
· 包含胺基酸序列辨識編號45之重鏈及胺基酸序列辨識編號46之輕鏈之單株抗體；
· 包含胺基酸序列辨識編號47之重鏈及胺基酸序列辨識編號48之輕鏈之單株抗體；
· 包含胺基酸序列辨識編號49之重鏈及胺基酸序列辨識編號50之輕鏈之單株抗體；及
· 包含胺基酸序列辨識編號51之重鏈及胺基酸序列辨識編號52之輕鏈之單株抗體。
在另一特定實施例中，用於本發明之方法之抗體是人源化抗體。
在此使用之“人源化抗體”一詞意指含有衍生自非人源抗體之CDR區之抗體，該抗體分子之另一部分衍生自一或多種人抗體。此外，可通過熟悉此藝之入士已知之技術，修飾骨架片段殘基(稱FR為骨架)中之一些，以保留結合親和力(Joneset al. , Nature, 321:522-525, 1986)。人源化之目的是降低用於引入人體之異種抗體如鼠抗體的致免疫性，同時維持抗體之完整的抗原結合親和力及專一性。
本發明之人源化抗體或其片段可通過熟悉此技藝之人士已知之技術製備(諸如，於Singeret al. , J. Immun., 150:2844-2857, 1992文獻中所述之技術)。此人源化抗體適合用於涉及體外診斷或活體內之預防和/或治療。其它人源化技術亦為熟悉此技藝之人士所知。事實上，抗體可使用各種技術人源化，包括CDR移植(EP 0 451 261；EP 0 682 040；EP 0 939 127；EP 0 566 647；US 5,530,101；US 6,180,370；US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,639,641；US 6,054,297；US 5,886,152；及US 5,877,293)、鑲飾法(veneering)或表面重塑法(resurfacing) (EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E. A., 1991 , Molecular Immunology 28(4/5): 489-498；Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814；Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91:969-973)及鏈置換(chain shuffling) (美國專利案第5,565,332號)。人抗體可通過各種熟悉此技藝之人士已知的方法製得，包括噬菌體表現方法。亦可見美國專利案第4,444,887號、第4,716,111號、第5,545,806號及第5,814,318號；及國際專利申請公開案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741。
在更特定的實施例中，該抗體是選自於由下列所構成之群組之人源化抗體：
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號4、5及6之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號4、5及6最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號7、8及9之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號7、8及9最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號10、11及12之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號10、11及12最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號13、14及15之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號13、14及15最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號16、17及18之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號16、17及18最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號19、20及21之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號19、20及21最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號22、23及24之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號22、23及24最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號25、26及27之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號25、26及27最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號28、29及30之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號28、29及30最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號31、32及33之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號31、32及33最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及
· 包含一重鏈及一輕鏈之人源化抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號34、35及36之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號34、35及36最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號37、38及39之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，或在分別與胺基酸序列辨識編號37、38及39最佳比對後具有至少80%，較佳地85%、90%、95%及98%一致性之序列，
其中該抗體亦包含衍生自人抗體之輕鏈及重鏈之恆定區。
在另一更特定的實施例中，該抗體是選自於由下列所構成之群組之人源化抗體：
· 包含胺基酸序列辨識編號53之重鏈可變區及胺基酸序列辨識編號54之輕鏈可變區之人源化抗體；
· 包含胺基酸序列辨識編號55之重鏈可變區及胺基酸序列辨識編號56之輕鏈可變區之人源化抗體；
· 包含在胺基酸序列辨識編號57、58及59中選擇之重鏈可變區及在胺基酸序列辨識編號60、61及62中選擇之輕鏈可變區之人源化抗體；
· 包含在胺基酸序列辨識編號63、64及65中選擇之重鏈可變區及在胺基酸序列辨識編號66、67及68中選擇之輕鏈可變區之人源化抗體；
· 包含在胺基酸序列辨識編號69及71中選擇之重鏈可變區及在胺基酸序列辨識編號70及72中選擇之輕鏈可變區之人源化抗體；及
· 包含在胺基酸序列辨識編號75及76中選擇之重鏈可變區及在胺基酸序列辨識編號77及78中選擇之輕鏈可變區之人源化抗體；
其中該抗體亦包含衍生自人抗體之輕鏈及重鏈之恆定區。
在第一實施例中，根據本發明之方法包含使一生物樣本與會結合hPG之抗原決定位之一抗hPG抗體接觸，其中該抗原決定位位在hPG之C端部分內，或位在hPG之N端部分內。
在一更具體的實施例中，根據本發明之方法包含使一生物樣本與會結合hPG之抗原決定位之一抗hPG抗體接觸，其中該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之N端部分的胺基酸序列之胺基酸序列，其選自相應於hPG之胺基酸10至14、hPG之胺基酸9至14、hPG之胺基酸4至10、hPG之胺基酸2至10及hPG之胺基酸2至14之胺基酸序列，其中hPG之胺基酸序列是序列辨識編號1。
在一更具體實施例中，根據本發明之方法包含使一生物樣本與會結合hPG之抗原決定位之一抗hPG抗體接觸，其中該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之C端部分的胺基酸序列之胺基酸序列，其選自相應於hPG之胺基酸71至74、hPG之胺基酸69至73、hPG之胺基酸71至80 (序列辨識編號40)、hPG之胺基酸76至80及hPG之胺基酸67至74之胺基酸序列，其中hPG之胺基酸序列是序列辨識編號1。
在第一實施例中，根據本發明之組成物包含辨識一抗原決定位之抗體，該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之胺基酸序列之胺基酸序列。
在一更具體的實施例中，根據本發明之組成物包含辨識前胃泌激素之一抗原決定位之抗體，其中該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之N端部分的胺基酸序列之胺基酸序列，其中該胺基酸序列可包括hPG之殘基10至14、hPG之殘基9至14、hPG之殘基4至10、hPG之殘基2至10或hPG之殘基2至14，其中hPG之胺基酸序列是序列辨識編號1。
在一更具體的實施例中，根據本發明之組成物包含辨識前胃泌激素之一抗原決定位之抗體，其中該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之C端部分的胺基酸序列之胺基酸序列，其中該胺基酸序列可包括 hPG之殘基71至74、hPG之殘基69至73、hPG之殘基71至80 (序列辨識編號40)、hPG之殘基76至80或hPG之殘基67至74，其中hPG之胺基酸序列是序列辨識編號1。
在根據本發明之用於體外診斷癌症之方法之一特定實施例中，該方法包含使來自一受試者之生物樣本與會結合前胃泌激素之一第一部分之一第一分子及與會結合前胃泌激素之一第二部分之一第二分子接觸之步驟。在一更特定實施例中，其中該前胃泌激素結合分子是一抗體，使來自一受試者之生物樣本與會結合前胃泌激素之一第一抗原決定位之一抗體及與會結合前胃泌激素之一第二抗原決定位之一第二抗體接觸。
在本發明之方法之一特定實施例中，該方法包含使來自一受試者之生物樣本與會結合前胃泌激素之一第一部分之一第一劑及與會結合前胃泌激素之一第二部分之一第二劑接觸之步驟。在一更特定實施例中，其中該前胃泌激素結合分子是一抗體，使來自一受試者之生物樣本與會結合前胃泌激素之一第一抗原決定位之一抗體及會結合前胃泌激素之一第二抗原決定位之一第二抗體接觸。
根據一較佳實施例，該第一抗體結合至一不溶性或部分可溶性載體。該第一抗體對前胃泌激素之結合，結果從該生物樣本中補捉前胃泌激素。較佳地，該第一抗體是會結合hPG之抗原決定位之抗體，其中如上所述該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之C端部分的胺基酸序列之胺基酸序列。更佳地，該第一抗體是單株抗體Mab14，由融合瘤2H9F4B7產生，述於WO 2011/083088中。融合瘤2H9F4B7依布達佩斯條約，於2016年12月27日寄存在CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France，編號I-5158。
根據另一較佳實施例，該第二抗體以一可檢測模體標記，如下所述。第二抗體對前胃泌激素的結合使得能夠檢測存在該生物樣本中之前胃泌激素分子。再者，第二抗體對前胃泌激素之結合使得能夠量化存在該生物樣本中之前胃泌激素分子。較佳地，該第二抗體是會結合hPG之抗原決定位之抗體，其中如上所述該抗原決定位包括相應於前胃泌激素之N端部分的胺基酸序列之胺基酸序列。更佳地，如上所述，該N端抗體是多株抗體。選擇性地，亦可能使用會結合前胃泌激素之N端內之抗原決定位的單株抗體，諸如上文所述之N端單株抗體，即包含分別具胺基酸序列辨識編號16、17及18之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之重鏈及包含具序列辨識編號19、20及21之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之輕鏈之單株抗體。
在一特佳實施例中，該第一抗體結合至一不溶性或部分可溶性載體，及該第二抗體以一可檢測的模體標記。
在一生物樣本中檢測到前胃泌激素，顯示有癌症存在之跡象，但無法提供任何癌症類型之資訊。此問題可通過除了分析前胃泌激素外，再檢測專一性生物標記克服。
在本文中使用之“生物標記”是在血液、其它體液或組織中發現的一種生物分子，其為正常或異常過程或病況或疾病之徵象。生物標記典型地可區分患病的病患與無疾病的人。有種類繁多的生物標記，其可包括蛋白(如，酵素或受體)、核酸(如，微RNA或其它非編碼RNA)、抗體、胜肽、荷爾蒙及代謝物等其它類別。生物標記亦可為諸如基因表達、蛋白質體學及代謝體學標記物之變化的集合。生物標記可在循環(全血、血清或血漿)或排泄物或分泌物(糞便、尿液、痰或乳頭分泌物)中檢測得，因此容易以非侵入式及一系列的方式評估，或可為組織來源的，且需要活體組織切片或特殊影像評估。
本文中所使用之“癌症生物標記”是一種指示一受試者中存在癌症之生物標記。據此，癌症生物標記可區分病症病患與沒有癌症的人。因此癌症生物標記是任一種可區分癌症病患及沒有癌症的受試者之蛋白(如，酵素或受體)、核酸(如，微RNA或其它非編碼RNA)、抗體及胜肽。癌症生物標記可對一種癌症具專一性。目前在臨床上使用之癌症生物標記及其等可用於檢測之癌症的列表，可在National Cancer Institute之網站中找到。其等包括ALK基因重排及過度表達(非小細胞肺癌及退行分化型大細胞淋巴瘤)、a-胎兒蛋白或AFP (肝癌及生殖細胞癌)、b-2-微球蛋白或B2M (多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病及一些淋巴瘤、b-人絨毛膜促性腺素或b-hCG (絨毛膜癌及生殖細胞腫瘤)、BRCA1及BRCA2基因突變(卵巢癌)、BCR-ABL融合基因或費城染色體(慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病及急性骨髓性白血病)、BRAF V600突變(皮膚黑色素瘤及結直腸癌)、C-Kit/CD117 (胃腸基質腫瘤及黏膜黑色素瘤)、CA15-3/CA27.29 (乳癌)、CA19-9 (胰臟癌、膽囊癌、膽道癌及胃癌)、CA-125 (卵巢癌)、抑鈣素(甲狀腺髓樣癌)、癌胚抗原或CEA (結直腸癌及一些其它的癌症)、CD20 (非何杰金氏淋巴瘤)、染色顆粒素A或CgA (神經內分泌腫瘤)、染色體3、7、17及9p21 (膀胱癌)、上皮源之循環腫瘤細胞(CELLSEARCH® )、轉移性乳、前列腺及結直腸癌)、細胞角蛋白片段21-1 (肺癌)、EGFR基因突變分析(非小細胞肺癌)、雌激素受體 (ER)/黃體激素受體(PR) (乳癌)、纖維/纖維原(膀胱癌)、HE4 (卵巢癌)、HER2/neu基因擴增或蛋白過度表達(乳癌、胃癌及食道胃接合部腺癌)、單株免疫球蛋白(多發性骨髓瘤及Waldenström巨球蛋白血症)、兒茶酚胺(嗜鉻細胞瘤及副神經節結瘤)、KRAS基因突變分析(結直腸癌及非小細胞肺癌)、乳酸去氫酶(生殖細胞腫瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤及神經母細胞瘤)、神經元特異烯醇酶或NSE (小細胞肺癌及神經母細胞瘤)、核基質蛋白22 (膀胱癌)、程序性死亡配體1或PD-L1 (非小細胞肺癌)、前列腺專一性抗原或PSA (前列腺癌)、甲狀腺球蛋白或Tg (甲狀腺癌)、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活酶(uPA)及纖維蛋白溶酶原激活酶抑制劑(PAI-1) (乳癌)、5-蛋白標誌(OVA1®，卵巢)、21-基因標誌(Oncotype DX®，乳癌)、70-基因標誌(Mammaprint®，乳癌)。
所有列出的癌症生物標記目前均普遍用於臨床上。因此，熟悉此技藝之人士在此任一種生物標記之分析上，應沒有任何問題。
較佳地，該癌症生物標記是選自於由下列所構成之群組：抑鈣素、a-胎兒蛋白、b絨毛膜促性腺素、前列腺血清抗原(PSA)、血清素、兒茶酚胺、單株免疫球蛋白、CA125、CA19.9、CA 15.3、CEA、Tg。
熟悉此技藝之人士應很容易理解，通過順序檢測癌症生物標記可辨識特定癌症。根據此實施例，本文提供之方法包含檢測個別的生物標記。假如在測試的樣本中沒有檢測到該生物標記的存在，則可檢測另一個生物標記，直到檢測到一種生物標記的存在，然後辨識癌症。
選擇性地，有可能同時檢測超過一種生物標記。此一方式可節省時間且更經濟。較佳地，本方法包含檢測2種，較佳地3種，較佳地4種，較佳地5種，較佳地6種，較佳地7種，較佳地8種，較佳地9種，較佳地10種，較佳地11或較佳地12種生物標記。
本發明亦有關用於監測一病患中一特定癌症之治療如化療、生物療法、免疫療法或抗體療法之效率的方法，其是通過測定從治療該特定癌症之前的病患獲得之一第一樣本(如體液或該特定癌症之活體生物切片)中之前胃泌激素濃度及檢測至少一種生物標記，然後將該第一樣本中之前胃泌激素濃度及該生物標記與治療後從相同病患獲得之一第二樣本中的比較，其中相較於該第一樣本，在該第二樣本中前胃泌激素濃度的減少和/或該生物標記之減少或缺乏，顯示該治療有效。
在一特定實施例中，根據本發明之方法包含比較從一病患獲得之生物樣本中的前胃泌激素之濃度與該樣本中前胃泌激素濃度之一預定值，在一更特定實施例中，該預定值選自：基於無該特定癌症群組之樣本測量值(已知病患沒有罹患該特定癌症時所獲得的前胃泌激素濃度值)的平均值。
在本發明之一特定實施例中，根據本發明之方法包含測定來自已經或正在進行該特定癌症之治療的病患之樣本中，前胃泌激素隨時間改變的位準。
參考以下範例之詳細的說明，本發明之實施例的特徵將變得更清楚。
範例
範例 1 ：前列腺癌之檢測
材料及方法
使用套組RAB0331A-EA (Sigma-Aldrich)，根據製造商的說明書，測量血漿PSA位準。
使用CancerRead套組(ECS Progastrin, CH)測量血漿中前胃泌激素之位準。簡言之，利用ELISA，透過使用二種專一性抗前胃泌激素抗體來量化前胃泌激素位準：一種塗佈在培養皿孔上之補捉型多株抗hPG抗體，及一種用於檢測前胃泌激素及介導訊號的顯示之顯示型單株抗hPG抗體。
結果
測試45位男性病患(18位前列腺癌+12位胰臟癌+15位結直腸癌)之前胃泌激素位準(使用CancerRead套組)及PSA位準(使用Sigma-Aldrich之套組RAB0331A-EA)。全部的癌症病患均為前胃泌激素陽性(濃度超3pM)。14/18 (78%)前列腺癌、3/12 (25%)胰臟癌及1/15 (7%)結直腸癌(CRC)具有PSA位準超過600pg/ml。
結合前胃泌激素及PSA陽性位準能夠辨識18位癌症病患(包括14位前列腺癌病患)，顯示該結合在一群具有未知癌症類型之病患中(當該群組含有40%前列腺癌病患時)，辨識前列腺癌病患之精準度為78%。
範例 2 ：乳癌之檢測
材料及方法
使用套組RAB0375A-EA (Sigma-Aldrich)，依照製造商之說明書，分析病患血漿中之CA15-3位準。
使用CancerRead套組(ECS Progastrin, CH)，測量血漿前胃泌激素位準。
結果
測試48位女性病患(25位乳癌+11位胰臟癌+12位結直腸癌)之前胃泌激素位準(使用CancerRead套組)及CA15-3位準(使用Sigma-Aldrich之套組RAB0375A-EA)。全部的癌症病患均為前胃泌激素陽性(濃度超過3pM)。21/24 (88%)乳癌病患、7/11 (64%)胰臟癌及6/12結直腸癌(CRC)具有CA15-3位準超過13000mU/ml。
結合前胃泌激素及CA15-3陽性位準能夠辨識34位癌症病患(包括21位乳癌病患)，顯示該結合在一群具有未知癌症類型之病患中(當該群組含有52%乳癌病患時)，辨識乳癌病患之精準度為62%。
範例 3 ：胰臟癌之檢測
材料及方法
使用套組RAB0035A-EA (Sigma-Aldrich)，根據製造商的說明書，測量血漿中CA19-9之位準。
使用CancerRead套組(ECS Progastrin, CH)測量血漿中前胃泌激素之位準。
結果
測試93位病人(18位前列腺癌+25位乳癌+23位胰臟癌+27位結直腸癌)之前胃泌激素位準(使用CancerRead套組)及CA19-9位準(使用Sigma-Aldrich之套組RAB0035A-EA)。全部的癌症病患均為前胃泌激素陽性(濃度超過3pM)。12/18 (67%)前列腺癌、9/25 (36%)乳癌、18/23 (43%)胰臟癌症及17/27 (63%)結直腸癌(CRC)具有CA19-9之位準超過2U/ml。
結合前胃泌激素及CA19-9陽性位準能夠辨識56位癌症病患(包括18位胰臟癌病患)，顯示在一群具有未知癌症類型之病患中(當該群組含有19%乳癌病患時)，辨識胰臟癌病患之精準度為32%。
圖1：結合血液中之前胃泌激素及PSA位準來檢測前列腺癌。
圖2：結合血液中之前胃泌激素及CA15-3位準來檢測乳癌。
圖3：結合血液中之前胃泌激素及CA19-9位準來檢測胰臟癌。






























































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Claims (15)

  1. 一種用於體外診斷受試者中之癌症之方法，其包含下列步驟： a) 使來自該受試者之生物樣本與至少一種前胃泌激素結合分子接觸， b) 測定該生物樣本中前胃泌激素之濃度，及 c) 檢測該樣本中該特定癌症之至少一種生物標記， 其中假如該樣本中該前胃泌激素之濃度大於一閾值濃度且檢測到該生物標記之存在，則該受試者存在該癌症之風險。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟b)進一步包含測定前胃泌激素之濃度，及其中該生物樣本中至少3pM、5pM、10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM或至少50pM的前胃泌激素濃度指示該受試者中存在該癌症。
  3. 如請求項1或2之方法，其中步驟b)包含進一步之步驟： · 測定一參考樣本中前胃泌激素之一參考濃度，及 · 將該生物樣本中之該前胃泌激素之濃度與前胃泌激素之該參考濃度比較。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該前胃泌激素結合分子是一抗體或其抗原結合片段。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段是選自N端抗前胃泌激素單株抗體及C端抗前胃泌激素單株抗體。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中結合至前胃泌激素之該抗體是選自於由下列所構成之群組之單株抗體： - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號4、5及6之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號7、8及9之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個， - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號10、11及12之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號13、14及15之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個， - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號16、17及18之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號19、20及21之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個， - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號22、23及24之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號25、26及27之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個， - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號28、29及30之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號31、32及33之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個， - 包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體：該重鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號34、35及36之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及該輕鏈包含分別具胺基酸序列辨識編號37、38及39之 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之至少一個，較佳地至少二個，較佳地三個，及 - 由在2016年12月27日寄存在CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France，編號I-5158之融合瘤產生的單株抗體。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中步驟a)之測定包括： (i)使該樣本與會結合前胃泌激素之一第一部分之一第一前胃泌激素結合分子接觸，及 (ii)使該樣本與會結合前胃泌激素之一第二部分之一第二前胃泌激素結合分子接觸。
  8. 如請求項7之方法，其中該第一前胃泌激素結合分子會結合前胃泌激素之C端內的抗原決定位。
  9. 如請求項7或8之方法，其中該前胃泌激素結合分子是由於2016年12月27日寄存在CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France，編號I-5158之融合瘤產生之單株抗體。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中該第二前胃泌激素結合分子會結合前胃泌激素之N端內的抗原決定位。
  11. 如請求項7至10中任一項之方法，其中該第二前胃泌激素結合分子是會結合前胃泌激素之N端內的抗原決定位之多株抗體，或包含一重鏈及一輕鏈之單株抗體，該重鏈包含下列三種CDR：分別具胺基酸序列辨識編號16、17及18之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，及該輕鏈包含下列三種CDR：分別具胺基酸序列辨識編號19、20及21之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該前胃泌激素之位準是在步驟a)中用ELISA測定。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該癌症生物標記是選自於由下列所構成之群組：抑鈣素、a-胎兒蛋白、b絨毛膜促性腺素、前列腺血清抗原(PSA)、血清素、兒茶酚胺、單株免疫球蛋白、癌抗原-125 (CA-125)、癌抗原19.9 (CA19.9)、癌抗原15.3 (CA 15.3)、癌胚抗原(CEA)、甲狀腺球蛋白(Tg)。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中步驟c)包含檢測2種，較佳地3種，較佳地4種，較佳地5種，較佳地6種，較佳地7種，較佳地8種，較佳地9種，較佳地10種，較佳地11或較佳地12種生物標記。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該生物樣本是選自：血液、血清及血漿。4
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