RS56035B1 - 5-fenil-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il karboksamidi kao jak inhibitori - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje koje je JAK inhibitor, familiju tirozin kinaze koja obuhvata inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanje transplantacije, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a. Naročito, jedinjenje prema pronalasku se odnosi na JAK1 i JAK2. Predmetni pronalazak takođe pruža metode za proizvodnju jedinjenja prema pronalasku, farmaceutski sastav koji čini jedinjenje prema pronalasku, metode za sprečavanje i/ili lečenje bolesti koje obuhvataju inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanje transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a upotrebom jedinjenja prema pronalasku.

[0002] Janus kinaze (JAK-ovi) su citoplazmične tirozin kinaze koje predaju signale citokina od membrane receptora do STAT faktora transkripcije. Četiri familije JAK-a su opisane, JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2. Nakon povezivanja citokina za svoj receptor, članovi JAK familije automatski- i/ili transfosforilišu jedan drugi, što je praćeno fosforilizacijom STAT-ova koji potom migriraju u nukleus kako bi modifikovali transkripciju. JAK-STAT transkripcija unutarćelijskog signala služi interferonima, najviše interleukinima kao i mnogim citokinskim i endokrinskim faktorima kao što su EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF i PRL (Vainchenker W. i dr. (2008)).

[0003] Kombinacijom genetičkih modela i JAK inhibitora sa malim ćelijama otkriven je terapeutski potencijal nekoliko JAK-ova. JAK3 je potvrđen genetikom miša i čoveka kao imunosupresivna meta (O'Shea J. i dr. (2004)). JAK3 inhibitori uspešno su uvedeni u klinička razvijanja, prvobitno za neprihvatanje pri transplantaciji organa ali kasnije takođe i za imunoinflamatorne indikacije kao što su reumatoidni artritis (RA), psorijaza i Kronova bolest (http://clinicaltrials.gov/).

[0004] TYK2 je potencijalna meta imuno-inflamatornih bolesti, što je potvrđeno studijama nokaut genetike čoveka i miša (Levy D. i Loomis C. (2007)).

[0005] JAK1 je neispitana meta u oblasti imuno-inflamatornih bolesti. JAK1 je u heterodimerizi sa drugim JAK-ovima kako bi predali pro-inflamatorne signale vođene citokinom. Stoga, očekuje se da inhibicija JAK1 i/ili drugih JAK-ova bude od terapeutske koristi za opseg inflamatornih bolesti kao i za druge bolesti uzrokovane JAK-posredovanim transdukcijom signala.

POZADINA PRONALASKA

[0006] Degeneracija hrskavice je oznaka raznih bolesti, među kojima su reumatoidni artritis i osteoartritis najistaknutije. Reumatoidni artritis (RA) je hronična degenerativna bolest zgloba, okarakterisana inflamacijom i uništavanjem strukture zgloba. Kada bolest nije proverena, dovodi do značajnog invaliditeta i bola usred gubitka funkcionalnosti zgloba a čak i do prevremene smrti. Cilj lečenja RA, stoga, nije samo da bi se usporila bolest već da se ostvari razvijanje u cilju sprečavanja uništenja zgloba. Pored ozbiljnosti ishoda bolesti, velika rasprostranjenost RA (~0.8% odraslih širom sveta su pod uticajem) znači visok socioekonomski uticaj. (Za razmatranja na temu RA, upućujemo na Smolen and Steiner (2003); Lee and Weinblatt (2001); Choy and Panayi (2001); O'Dell (2004) and Firestein (2003)).

[0007] Osteoartritis (takođe kao OA ili artritis usled habanja) je najčešći vid artritisa i naznačen je gubitkom zglobne hrskavice, što je često praćeno sa hipertrofijom kosti i bolom. Za opširnija razmatranja o osteoartritisu, upućujemo na Wieland i dr. (2005).

[0008] Osteoartritis je težak za lečenje. Trenutno, ne postoji ni jedan dostupan lek i lečenje je fokusirano na smanjenje bola i sprečavanje obuhvaćenog zgloba da postane deformisan. Poznata lečenja obuhvataju upotrebu ne-stereoidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID-i). Iako su dodaci u ishrani kao što su hondiritin i glukozamin sulfat zagovarani kao bezbedne i efektivne mogućnosti za lečenje osteoartritisa, nedavna klinička ispitivanja otkrila su da ni jedno ni drugo lečenje ne smanjuje bol povezan sa osteoartritisom. (Clegg i dr., 2006).

[0009] Stimulacija anaboličkih procesa, blokiranje kataboličkih procesa ili kombinacija istih može dovesti do stabilizacije hrskavice, i možda čak do otklanjanja oštećenja, stoga sprečavajući dalji razvoj bolesti. Metode lečenja za korigovanje oštećenja zglobne hrskavice koje se javlja pri bolesti osteoartritisa su razvijene ali za sada ni jedna od njih nije bila u stanju da ostvari obnavljanje zglobne hrskavice in situ i in vivo. Kada se sagleda, ne postoji ni jedan lek za modifikaciju oboljenja osteoartritisa.

[0010] Vandeghinste i dr. (WO 2005/124342) otkriva JAK1 kao metu čija inhibicija može imati lekovitost od značaja za nekoliko bolesti uključujući OA. Nokaut genetika JAK1 kod miševa je pokazala da JAK1 igra suštinsku i ne-prekomernu ulogu tkom razvoja: Jak1-/- miš je umro 24 časa nakon rođenja i razvoj limfocita je značajno ometen. Štaviše Jak1 -/- ćelije nisu, ili nisu manje reaktivne na citokine koji koriste receptore citokina klase II, receptore citokina koji koriste gama-c pod-jedinice za signaliziranje i familiju receptora citokina koji koriste gp130 pod-jedinicu za signaliziranje (Rodig i dr., 1998).

[0011] Razne grupe su ukazivale na JAK-STAT signalizaciju u biologiji hondrocita. Li i dr. (2001) pokazuje da Onkostatin M podstiče MPP i TIMP3 ekspresiju gena u primarnim hondrocitima aktiviranjem JAK/STAT i MAPK puteva signaliziranja. Osaki i dr. (2003) pokazuje da interferon-gama posredovana inhibicija kolagena II u hondrocitima obuhvata JAK-STAT signaliziranje. IL1-b podstiče ekspresiju kolageneza i inducibilnu azot monoksid sintazu (NOS2), koja posreduje proizvodnju azot monoksida (NO). Otero i dr., (2005) pokazuje da leptin i IL1-beta sinergistički podstiču NO proizvodnju ili ekspresiju NOS2 mRNA u hondrocitima i da je to blokirano JAK inhibitorom. Legendre i dr. (2003) pokazuje da IL6/IL6Receptor podstiče nishodnu regulaciju specifičnih matričnih gena hrskavice posredovane JAK/STAT signaliziranjem. Stoga, ova razmatranja predlažu ulogu aktivnosti JAK kinaze u homeostazi hrskavice i lekovite mogućnosti inhibitora JAK kinaze.

[0012] Članovi JAK familije su bili obuhvaćeni u dodatnim stanjima koja uključuju mijeloproliferativne poremećaje (O'Sullivan i dr., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506), gde su uočene JAK2 mutacije. Ovo ukazuje da se inhibitori JAKA, konkretno JAK2 mogu koristiti u lečenju mijeloproliferativnih poremećaja. Dodatno JAK familija, konkretno JAK1, JAK2 i JAK3 su bile povezane sa kancerima, konkretno leukemijama npr. akutnom mijeloidnom leukemijom (O'Sullivan i dr., 2007, Mol Immunol.44(10):2497-506; Xiang i dr., 2008, "Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia" Blood First Edition Paper, prepublished online December 26, 2007; DOI 10.1182/blood-2007-05-090308) i akutnom limfoblastičnom leukemijom (Mullighan i dr., 2009) ili čvrstim tumorima npr. lejomisarkom materice (Constantinescu i dr., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131), kancerom prostate (Tam i dr., 2007, British Journal of Cancer, 97, 378 - 383). Ovi rezultati ukazuju da inhibitori JAK-a, konkretno JAK1 i/ili JAK2 mogu takođe imati upotrebu pri lečenju kancera (leukemija i čvrstih tumora poput lejomisarkoma materice, kancera prostate).

[0013] Dodatno, Kastlemanova bolest, multipla mijelom, mesangijalni proliferativni glomerulonefritis, psorijaza i Kaposi sarkom su verovatno usled hipersekrecije citokina IL-6, čiji su biološki efekti posredovani unutarćelijskim JAK-STAT signaliziranjem (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233-S242). Ovaj rezultat pokazuje da inhibitori JAK-a takođe mogu imati upotrebu u lečenju navedenih bolesti.

[0014] WO 2009/047514 obelodanjuje jedinjenja [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridina i [1,2,4]triazolo[1,5-c]pirimidina, koja između ostalog inhibiraju AXL funkcije receptora tirozin kinaze.

[0015] WO 2009/017954 obelodanjuje [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin inhibitore JAK2 kinaze.

[0016] WO 2010/010190 obelodanjuje [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin jedinjenja koja inhibiraju JAK kinaze.

[0017] WO 03/010167 obelodanjuje 8-metoksi-(1,2,4)triazolo(1,5-a)piridin derivate i njihovu upotrebu kao lingade adrenozin receptora.

[0018] Trenutna lečenja nisu zadovoljavajuća i stoga ostaje potreba za otkrivanjem daljih jedinjenja koja mogu biti od koristi u lečenju degenerativnih bolesti zgloba, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis i osteoporoza, konkretno osteoartritis. Predmetni pronalazak stoga daje jedinjenje, metod za njegovu proizvodnju i farmaceutske sastave koji čine jedinjenje prema pronalasku zajedno sa pogodnim farmaceutskim nosiocem. Predmetni pronalazak takođe pruža upotrebu jedinjenja prema pronalasku u pripremi lekova za lečenje degenerativnih bolesti zgloba. Predmetni pronalazak se naročito odnosi na nov JAK inhibitore koji izlažu dramatično poboljšani in vivo potencijal.

REZIME PRONALASKA

[0019] Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću da je jedinjenje prema pronalasku u mogućnosti da ima ulogu kao JAK inhibitor i da je od koristi za lečenje inflamatornih stanja, autoimunih bolesti, proliferativnih bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a. U posebnom aspektu jedinjenje je inhibitor JAK1 i JAK2.

Predmetni pronalazak takođe pruža metode za proizvodnju ovog jedinjenja, farmaceutski sastav koji čini ovo jedinjenje i metode za lečenje inflamatorinih stanja, autoimunih bolesti, proliferativnih bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a upotrebom jedinjenja prema pronalasku.

[0020] Prema tome, u prvom aspektu pronalaska, jedinjenje prema pronalasku ima formulu (I):

[0021] Jedinjenje pronalaska je novi JAK inhibitor koji deluje teko da ispoljava dramatično povećan in vivo potencijal u poređenju sa strukturalno sličnim jedinjenjima. U određenom otelotvorenju jedinjenje prema pronalasku je inhibitor JAK1 i JAK2. Naročito, deluje da ispoljava povećan potencijal u nižim in vivo nivoima ispoljavanja u poređenju sa strukturalno sličnim jedinjenjima. Upotreba jedinjenja sa ovim poboljšanjima se očekuje da se ispolji u potrebama za manjim dozama (i time poboljšanim rasporedom davanja doza).

[0022] U daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža farmaceutski sastav jedinjenja prema pronalasku, i farmaceutskog nosioca, ekscipijenta ili diluenta. Štaviše, jedinjenje prema pronalasku, koje ima upotrebu u farmaceutskim sastavima i metodama lečenja ovde opisanim je farmaceutski prihvatljivo u vidu pripremanja i upotrebe. U ovom aspektu pronalaska, farmaceutski sastav može dodatno sadržati aktivne sastojke pogodne za upotrebu u kombinaciji sa jedinjenjem prema pronalasku.

[0023] U daljem aspektu pronalaska, predmetni pronalazak pruža metod za lečenje sisara osetljivog na ili onog koji boluje od stanja koja su navedena ovde, naročito, od takvih stanja koja se mogu dovesti u vezu sa nenormalnom JAK aktivnošću, npr. inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a, čiji se metod sastoji od upotrebe efektivne količine farmaceutskog sastava ili jedinjenja prema pronalasku kao što je ovde opisano. U posebnom otelotvorenju stanje je povezano sa nenormalnom JAK1 i JAK2 aktivnošću.

[0024] U daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili sprečavanju stanja izabranih od onih ovde navedenih, naročito takva stanja koja se mogu dovesti u vezu sa nenormalnom JAK aktivnošću, npr. inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a.

[0025] U još jednoj metodi aspekta lečenja, predmetni pronalazak pruža metodu za lečenje sisara osetljivog na, ili onog koji boluje od stanja koje je obično povezano za nenormalnu JAK aktivnost kao što je ovde opisano, i sastoji se iz upotrebe efektivne količine za lečenje stanja ili sprečavanje stanja farmaceutskog sastava ili jedinjenja prema pronalasku kao što je ovde opisano. U posebnom aspektu stanje je obično povezano sa nenormalnom JAK1 i JAK2 aktivnošću.

[0026] U daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili sprečavanju stanja koja su obično povezana sa nenormalnom JAK aktivnošću.

[0027] U dodatnim aspektima, ovaj pronalazak pruža metode za sintezu jedinjenja prema pronalasku, sa reprezentativnim sintetičkim protokolima i putevima opisanim kasnije.

[0028] U skladu sa time, glavni cilj ovog pronalaska jeste da pruži novo jedinjenje, koje može da izmeni aktivnost JAK-a i time da spreči ili leči sve bolesti koje se mogu obično vezati za nju. U posebnom aspektu jedinjenje prema pronalasku menja aktivnost JAK1 i JAK2.

[0029] Nadalje, cilj ovog pronalaska je da pruži jedinjenje koje može da leči ili ublaži bolesti ili simptome iste, kao što su inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a, koja se obično mogu dovesti u vezu sa aktivnošću JAK-a, naročito JAK1 i JAK2.

[0030] Dalji cilj ovog pronalaska jeste da pruži farmaceutski sastav koje se može koristiti pri lečenju ili sprečavanju raznih stanja bolesti, uključujući bolesti povezane sa JAK aktivnošću kao što su inflamatorna stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a. U posebnom otelotvorenju bolest je dovedena u vezu sa JAK1 i JAK2 aktivnošću.

[0031] Drugi ciljevi i prednosti će biti očigledni stručnjacima u oblasti razmatranjem posledica detaljnog opisa.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije

[0032] Naredni termini su namenjeni da imaju značenja izneta ispod i da budu od koristi pri razumevanju opisa i namenjenog područja datog pronalaska.

[0033] Pri opisu pronalaska, koji može da obuhvata jedinjenja, farmaceutske sastave od kojih su sačinjena jedinjenja i metode za upotrebu takvih jedinjenja i sastava, naredni termini, ako su prisutni, imaju sledeća značenja ukoliko nije drugačije naznačeno. Takođe, treba razumeti da, kada je ovde opisano, bilo koja od bolesti definisana dalje ispod može se zameniti sa raznim supstituentima i da su odgovarajuće definicije namenjene da obuhvate takve supstituentne bolesti unutar njihovog dometa kao što je dato niže. Ukoliko nije drugačije navedeno, termin 'zamenjen' će biti definisan ispod. Trebalo bi dalje shvatiti da se termini 'grupe' i 'radikali' mogu smatrati nezamenljivim kada se ovde koriste.

[0034] Članovi 'a' i 'an' mogu se ovde koristiti tako da se odnose na jedan ili više (npr. bar jedan) gramatički objekat u članku. U vidu primera "an analogue" (analog) znači jedan analog ili više od jednog analoga.

[0035] Kao što je ovde korišćen, termin 'JAK' odnosi se na familiju Janus kinaza (JAK-ovi) koji su citoplazmatične tirozin kinaze koje predaju signaliziranje citokina sa receptora na membrani do STAT faktora transkripcije. Četiri člana familije JAK su opisani, JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2 i termin JAK se može odnositi na sve članove JAK familije zajedno ili na jedan ili više članova JAK familiji u zavisnosti od konteksta.

[0036] 'Farmaceutski prihvatljivo' znači odobreno ili odobrivo od strane regulatorne agencije savezne ili federalne vlade ili odgovarajuće agencije u drugim zemljama koje nisu Sjedinjene Američke Države, ili da je naznačeno u U.S. Farmakopeji ili drugim generalno priznatim farmakopejama za upotrebu kod životinja, a naročito kod ljudi.

[0037] 'Farmaceutski prihvatljiva so' se odnosi na so jedinjenja prema pronalasku koje je farmaceutski prihvatljivo i koje poseduje željenu farmakološku aktivnost matičnog jedinjenja. Konkretno, takve soli su netoksične i mogu biti neorganski ili organski kiseli dodaci soli i bazni dodaci soli. Konkretno, takve soli obuhvataju: (1) kisele dodatke soli, formirane sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično; ili nastale sa organskim kiselinama kao što su sirćetna kiselina, propionska kiselina, heksanske kiseline, ciklopentanpropionska kiselina, glikolna kiselina, piruvinska kiselina, mlečna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, jabučna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, 3- (4-hidroksi) benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, 1,2-etan-disulfonska kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina, 4-hlorobenzensulfonska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina , 4-toluensulfonska kiselina, kamforsulfonska kiselina, 4-metilbiciklo [2.2.2] okt-2-en-1-karbonska kiselina, glukoheptonska kiselina, 3-fenilpropionska kiselina, trimetilsirćetna kiselina, tercijarna butilsirćetna kiselina, lauril sumporna kiselina, glukonska kiselina, glutaminska kiselina, kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, mukonska kiselina, i slično; ili (2) soli nastale kada se kiseli proton prisutan u osnovnom jedinjenju ili zameni sa jonom metala, npr.

alkalnog metala, jonom zemno-alkalnim jon, ili jonom aluminijuma; ili koordinira sa organskom bazom kao što su etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, N-metilglukamin i slično. Soli dodatno obuhvataju, samo kao primer, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, amonijum, tetraalkilamonijum, i slično; a kada jedinjenje sadrži baznu funkcionalnost, soli ne toksičnih organskih ili neorganskih kiselina, kao što su hidrohlorid, hidrobromid, tartarat, mezilat, acetat, maleat, oksalat i slično. Termin "farmaceutski prihvatljivi katjon" se odnosi na prihvatljiv katjonski suprotni jon kisele funkcionalne grupe. Takvi katjoni su na primer natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, amonijum, tetraalkilamonijum katjona, i slično.

[0038] 'Farmaceutski prihvatljiv prenosilac' odnosi se na difluent, pomoćno sredstvo, ekscipijent ili nosilac sa kojim se jedinjenje prema pronalasku upotrebljava.

[0039] 'Solvat' se odnosi na forme jedinjenja koje su povezane sa rastvaračem, obično putem solvolitičke reakcije. Ova fizička povezanost uključuje vodoničnu vezu. Konvencionalni rastvarači obuhvataju vodu, etanol, sirćetnu kiselinu i slično. Jedinjenje prema pronalasku se može pripremiti na primer u kristalnoj formi i može se rastvarati ili hidratisati. Pogodni rastvarači obuhvataju farmaceutski prihvatljive rastvarače kao što su hidrati i dalje obuhvataju i stehiometrijske rastvarače i ne-stehiometrijske rastvarača. U nekim primerima solvat će biti u stanju da se izoluje, na primer, kada jedan ili više molekula rastvarača je uključen u kristalnu rešetku kristalne supstance. 'Solvat' obuhvata oba, i rastvorenu fazu i solvate koji se mogu izolovati. Reprezentativni solvati obuhvataju hidrate, etanolate i metanolate.

[0040] 'Subjekat' obuhvata ljude. Termin 'čovek', 'pacijent' i 'subjekat' ovde se koriste naizmenično.

[0041] 'Terapeutski efektivna količina' odnosi se na količinu jedinjenja koje je, kada se unese u subjekat za lečenje bolesti, dovoljno da utiče na takvo lečenje bolesti. 'Terapeutski efektivna količina' može varirati u zavisnosti od jedinjenja, ozbiljnosti bolesti, starosti, težine itd., subjekta koji se leči.

[0042] 'Sprečavati' ili 'sprečavanje' odnosi se na smanjenje rizika dobijanja ili razvoja bolesti ili poremećaja (npr., uzrokovanje bar jednog od kliničkih simptoma bolesti da se ne razvije kod subjekta koji može biti izložen agensu koji izaziva bolest ili unapred predisponiran za datu bolest).

[0043] Termin 'profilaksa' je povezan sa 'sprečavanjem', i odnosi se na meru ili proceduru u cilju sprečavanja, pre nego tretiranja ili lečenja bolesti. Neograničavajući primeri profilaktičkih mera mogu obuhvatati upotrebu vakcina; upotrebu herpatina sa niskom molekulskom masom kod bolničkih pacijenata izloženih sa rizikom od tromboze usled, na primer, imobilizacije; i za upotrebu anti-malaričnih agensa kao što su hlorikvin, pre posete geografskoj područja gde je malarija epidemija ili gde je rizik od dobijanja malarije visok.

[0044] 'Lečiti' ili 'lečenje' bilo koje bolesti ili poremećaja odnosi se, u jednom otelotvorenju, na ublažavanje bolesti ili poremećaja (npr., zaustavljanje bolesti ili smanjenje ispoljavanja, obima ili ozbiljnosti bar jednog kliničkog simptoma iste). U drugom otelotvorenju 'lečiti' ili 'lečenje' odnosi se na ublažavanje bar jednog fizičkog parametra, koji ne mora biti primećen od strane subjekta. U još jednom otelotvorenju, 'lečiti' ili 'lečenje' odnosi se na menjanje bolesti ili poremećaja, ili fizički, (npr., stabilizacija primetnih simptoma), fiziološki (npr., stabilizacija fizičkih parametara), ili oba. U daljim otelotvorenjima, 'lečiti' ili 'lečenje' odnosi se na usporavanje razvoja bolesti.

[0045] Kao što je ovde korišćeno termin 'inflamatorno stanje(a)' odnosi se na grupu stanja koja obuhvataju, reumatoidni artritis, osteoartritis, juvenilni idiopatski artritis, psorijazu, alergijske disajne bolesti (npr., astma, rinitis), inflamatorne bolesti utrobe (npr., Kronova bolest, kolitis), stanja vezana za endotoksin-uzrokovane bolesti (npr., komplikacije nakon bajpas operacije ili hronična endotoksin stanja koja doprinose npr., hroničnoj srčanoj insuficijenciji), i bolesti povezane sa hrskavicom, poput one iz zglobova. Naročito se termin odnosi na reumatoidni artritis, osteoartritis, alergijske disajne bolesti (npr., astma) i inflamatorne bolesti utrobe.

[0046] Kao što je ovde korišćeno termin 'autoimuna(e) bolest(i)' odnosi se na grupu bolesti koje obuhvataju bolesti otežanog disanja, uključujući stanja kao što su COPD, astma (npr., unutrašnja astma, spoljašnja astma, astma usled prašine, infantilna astma) naročito hroničnu ili neizlečivu astmu (na primer kasna astma i preosetljivost disajnih puteva), bronhitis, uključujući bronhijalnu astmu, sistemski lupus eritematosus (SLE), multiple sklerozu, tip I bolesti dijabetesa i komplikacije povezane sa njom, atopični ekcem (atopični dermatitis), kontaktni dermatitis i dalji ekcemski dermatitis, inflamatornu bolest utrobe (npr., Kronova bolest i ulcerativni kolitis), arteriosklerozu i amitropičku lateralnu sklerozu. Naročito termin se odnosi na COPD, astmu, sistemski lupus eritematosis, tip I bolest dijabetesa i inflamatornu bolest utrobe.

[0047] Kao što je ovde korišćeno 'proliferativne bolesti' odnose se na stanja kao što su kancer (npr., leimiosarkoma materice ili kancer prostate), mijeloproliferativne poremećaje (npr., policitemija vera, esencijalna trombocitoza i mijelofibroza), leukemija (npr., akutna mijeloidna leukemija i akutna limfoblastična leukemija), multipli mijelom, psorijaza, restenoza, sklerodermitis ili fibroza. Naročito termin se odnosi na kancer, leukemiju, multiple mijelom i psorijazu.

[0048] Kao što je ovde korišćeno termin 'kancer' odnosi se na maligni ili benigni rast ćelija u koži ili u organima tela, na primer ali bez ograničenja, grudi, prostate, pluća, bubrega, pankreasa, stomaka ili utrobe. Kancer teži da infiltrira u susedno tkivo i da se širi (metastazira) to daljih organa, kao na primer kost, jetra, pluća ili mozak. Kao što je ovde korišćeno termin kancer obuhvata oba, tipove metastatičkog tumora ćelija, kao što su ali ne i ograničeno, melanom, limfom, leukemija, fibrosarkom, rabdomijosarkom i mastocitom i tipovi karcinoma tkiva, kao što su ali ne ograiničavajući se na kolorektalni kancer, kancer prostate, kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćelija pluća, kancer grudi, kancer pankreasa, kancer bešike, kancer bubrega, kancer želuca, glioblastom, primarni kancer jetre, kancer jajnika, kancer prostate i lejomiosarkom materice.

[0049] Kao što je ovde korišćeno termin 'leukemija' odnosi se na neoplastične bolesti krvi i organa formiranih od krvi. Takve bolesti mogu uzrokovati disfunkciju koštane srži i imunog sistema, što domaćina čini vrlo podložnim za infekciju i krvarenje. Naročito termin leukemija se odnosi na akutni mijeloidnu leukemiju (AML) i akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL).

[0050] Kao što je ovde korišćeno termin 'neprihvatanje transplantacije' odnosi se na akutna ili hronična neprihvatanja ćelija, tkiva ili čvrstih organa alo- ili ksenografta od npr., Langerhansovih ostrvca, matičnih ćelija, koštane srži, kože, mišića, tkiva rožnjače, srca, pluća, kombinovano od srca i pluća, bubrega, jetre, creva, pankreasa, traheje ili jednjaka ili graft-versus-host bolesti.

[0051] Kao što je ovde korišćeno termin 'bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice' uključuju stanja kao što su osteoartritis, psorijazni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, giht, septički ili infektivni artritis, reaktivni artritis, refleksna simpatetička distrofija, algodistrofija, Tietze sindrom ili kostalni hondritis, fibromijalgija, osteohondritis, neurogeni ili neuropatski artritis, artropatija, endemski oblici artritisa poput osteoartritis deformans endemica, Mseleni bolesti i Handigodu bolesti; degenracije usled fibromijalgije, sistemski lupus eritematozus, skleroderma i ankilozni spondilitis.

[0052] Kao što je ovde korišćeno, termin 'kongentalne malformacije hrskavice' obuhvataju stanja poput naslednih hondrolisiza, hondrodisplazija i pseudohondrodisplazija, naročito, ali bez ograničenja, mikrotija, anotija, metafiza hondrodisplazija, i srodni poremećaji.

[0053] Kao što je ovde korišćeno termin 'bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6' obuhvataju stanja kao što su Kastlemanova bolesti, multil mijelom, psorijaza, Kaposi sarkom i/ili mesangrijalni proliferativni glomerulonefiritis.

[0054] 'Jedinjenje prema datom pronalasku', i ekvivalentni izrazi, su predviđeni da obuhvate jedinjenje prema Formuli kao što je ovde opisano, tako da uključuje farmaceutski prihvatljive soli i solvate, npr., hidrate i solvate farmaceutski prihvatljivih soli gde kontekst tako dozvoljava. Slično, odnoseći se na intermedijere, bez obzira da li su zahtevani ili ne, namenjeno je da obuhvate njihove soli i solvate, gde kontekst tako dozvoljava.

[0055] Drugi derivati jedinjenja prema pronalasku imaju aktivnost u oba, i njihovim kiselinama i u formama derivata kiselina, ali u kiselo-osetljivim formama često nude prednosti rastvorljivosti, tkivne kompatibilnosti ili odloženog otpuštaja u organizmima sisara (videti, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp.7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985).

[0056] Kao što je ovde korišćeno 'izotopska varijanta' odnosi se na jedinjenje koje sadrži neprirodne proporcije izotopa u jednom ili više atoma koji čine takvo jedinjenje. Na primer, 'izotopska varijanta' jedinjenja može da sadrži jedan ili više ne-radioaktivan izotop, kao što je na primer, deuterijum (<2>H or D), ugljenik-13 (<13>C), azot-15 (<15>N), i slično. Podrazumevaće se da, u jedinjenju gde je izvršena takva zamena izotopa, prateći atomi, gde su prisutni, mogu varirati, tako da naprimer, bilo koji vodonik može biti<2>H/D, bilo koji ugljenik može biti<13>C, ili bilo koji azot<15>N, i da prisustvo i smeštanje takvih atoma može biti određeno u skladu sa stručnošću u oblast. Slično, pronalazak može obuhvatati pripremu izotopskih varijanti sa radioizotopima, u slučaju, na primer, kada rezultujuća jedinjenja mogu biti korišćena za lek i/ili studije rasporeda supstratnih tkiva. Radioaktivni izotop tricijum, npr.<3>H, ugljenik-14, npr.<14>C, su naročito od koristi za ovu svrhu u pogledu lakoće njihove inkorporacije i jednostavnog načina detekcije. Dalje, jedinjenja se mogu pripremiti tako da budu zamenjena sa pozitronom koji emituje izotope, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, i koji bi bilo od koristi pri izučavanju Topografije emitovanja pozitrona (PET) za ispitivanje zauzimanja receptora supstrata.

[0057] Sve izotopske varijante jedinjenja ovde date, radioaktivne ili ne, namenjene su da budu obuhvaćene u okviru pronalaska.

[0058] 'Tautomeri' se odnose na jedinjenja koja su zamenljive forme određene strukture jedinjenja, i koje se razlikuju u premeštanju atoma vodonika i elektrona. Stoga, dve strukture mogu biti u ravnoteži kroz pomeranje π elektrona i atoma (obično H). Na primer, enoli i ketoni su tautomeri zato što su oni brzo međusobno preobraćeni tretiranjem sa bazom ili kiselinom. Drugi primer tautomerizma su aci- ili nitro- forme fenilnitrometana, koje su isto tako formirane tretiranjem sa kiselinom ili bazom.

[0059] Tautomerne forme mogu biti od značaja za postizanje optimalne hemijske reaktivnosti i biološke aktivnosti jedinjenja od interesa.

JEDINJENJE

[0060] Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću da je jedinjenje prema pronalasku JAK inhibitor i da je od koristi pri lečenju inflamatornih stanja, autoimune bolesti, proliferativne bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a. Predmetni pronalazak takođe pruža metode za proizvodnju jedinjenja prema pronalasku, farmaceutske sastave koji čine jedinjenje prema pronalasku i metode za lečenje inflamatornih stanja, autoimunih bolesti, proliferativnih bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a upotrebom jedinjenja prema pronalasku. U posebnom otelotvorenju jedinjenje prema pronalasku je inhibitor JAK1 i JAK2.

[0061] U skladu sa time, u prvom aspektu pronalaska jedinjenja prema pronalasku je obelodanjeno sa formulom (I):

[0062] U jednom otelotvorenju jedinjenje prema pronalasku nije izotopska varijanta.

[0063] Jedinjenje prema pronalasku je nov JAK inhibitor. Naročito jedinjenje je potentan inhibitor JAK1 i JAK2, međutim inhibira TYK2 i JAK3 sa manjim potencijalom

[0064] Jedinjenje prema pronalasku ispoljava dramatično poboljšanje in vivo potencijala. Ovo poboljšanje je naročito i iznenađujuće primećeno čak i u poređenju sa strukturalno sličnim jedinjenjima. Upotreba jedinjenja sa ovim poboljšanjima može se ispoljiti u manjim potrebama za dozama (i stoga unapređenim rasporedom davanja doza).

FARMACEUTSKI SASTAVI

[0065] Kada ima svrhu kao farmaceutsko, jedinjenje prema pronalasku se obično upotrebljava u vidu farmaceutskog sastava. Takvi sastavi se mogu pripremiti na poznat način u farmaceutskoj struci i čine bar jedno aktivno jedinjenje. Uopšteno, primenjeno jedinjenje prema pronalasku zapravo će obično biti određeno od strane lekara, u skladu sa okolnostima, uključujući stanje koje se leči, odabranog vida upotrebe, konkretnog jedinjenja koje se upotrebljava, starosti, težine, i reakcije individualnog pacijenta, ozbiljnosti simptoma kod pacijena i slično.

[0066] Farmaceutski sastavi ovog pronalaska se mogu upotrebiti na dosta načina uključujući oralni, rektalni, transdermalni, subkutani, intra-artikularni, intravenozni, intramuskularni i intranazalni. U zavisnosti od namenjenog vida unosa, jedinjenje prema pronalasku je poželjno formulisano kao ili injektibilni ili oralni sastav ili kao melemi, losioni ili kao flasteri za transdermalnu upotrebu.

[0067] Sastavi za oralnu upotrebu mogu biti u obliku pakovanih tečnih rastvora ili suspenzija, ili pakovanih prahova. Češće, štaviše, sastavi su predstavljeni u jediničnim dozama forme kako bi se olakšalo tačnije doziranje. Termin 'jedinična doza forme' odnosi se na fizičke diskretne jedinice pogodne za jedinične doze kod subjekata čoveka i drugih sisara, svaka jedinici sadrži prethodno određenu količinu aktivnog materijala izračunatog da proizvede željeni terapeutski efekat, zajedno sa pogodnim farmaceutskim ekscipijentom, prenosiocem ili nosiocem. Obična jedinica doze forme obuhvata prethodno ispunjene i izmerene ampule ili špriceve sa tečnim sastavima ili pilule, tablete, kapsule ili sličnu u slučaju čvrstih sastava. U takvim sastavima, jedinjenje prema pronalasku je običnu manja komponenta (od oko 0.1 do oko 50% težine ili poželjnije od oko 1 do oko 40% težine) sa ostatkom sačinjenog od raznih prenosioca ili nosioca i procesnih pomagala koja potpomažu formiranje željene forme doze.

[0068] Tečne forme pogodne za oralnu upotrebu mogu obuhvatati pogodne tečne ili prenosioce koji nisu tečni sa puferima, suspendujućim ili disperzionim agensima, bojama, ukusima i slično. Čvrste forme mogu da obuhvataju, na primer, bilo koji od pratećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: veziva kao što su mikrokristalna ceuloza, tragakant guma ili želatin; ekscipijent kao što su skrob ili laktoza, agens za dezintegraciju kao što je alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat; glidant kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aromu kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.

[0069] Sastavi koji se injektiraju su obično zasnovani na injektibilnim sterilnim fiziološkim rastvorima ili fosforom puferisanim fiziološkim rastvorima ili drugim injektibilnim prenosiocima poznatim u struci. Kao i ranije, aktivno jedinjenje u takvom sastavo je obično manja komponenta, često čini oko 0.05 do 10% težine sa ostatkom sačinjenim od injektibilnog prenosioca ili slično.

[0070] Transdermalni sastavi su obično formulisani kao topikalna mast ili krema koja sadrži aktive sastojke, obično u bilo kojoj količini u rasponu od oko 0.01 do oko 20% težine, poželjnije od oko 0.1 do oko 20% težine, poželjnije od oko 0.1 do oko 10% težine i još poželjnije od oko 0.5 do oko 15% težine. Kada su formulisani kao masti, aktivni sastojci će obično biti kombinovani sa ili parafinskom bazom ili bazom u kojoj je mast mešana u vodi. Alternativno, aktivni sastojci mogu biti formulisani u kremi sa, na primer bazom koja je ulje u vodi. Takve transdermalne formulacije su dobro poznate u struci i generalno obuhvataju dodatne sastojke kako bi se poboljšala dermalna penetracija stabilnosti aktivnih sastojaka ili formulacije. Sve takve poznate transdermalne formulacije i sastojci su obuhvaćeni u okviru ovog pronalaska.

[0071] Jedinjenje prema pronalasku se može takođe upotrebiti pomoću transdermalnog uređaja. Shodno tome, transdermalno davanje može biti izvedeno korišćenjem flastera sa rezervoarom ili tipom sa poroznom membranom ili nekom čvrstom sredinom.

[0072] Gore opisane komponente za oralnu upotrebu, injektivnu ili topikalnu upotrebu jedinjenja su samo reprezentativne. Ostali materijali, kao i tehnike obrade i slično navedeni su u Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, koje se navodi ovde u referencama.

[0073] Jedinjenje prema pronalasku se može takođe upotrebiti u oblicima sa kontrolisanim oslobađanjem ili sa sistemima za oslobađanje lekova. Opis reprezentativnih materijala za kontrolisano oslobađanje mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences.

[0074] Sledeći primeri formulacija prikazuju reprezentativne farmaceutske preparate koji se mogu dobiti u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj pronalazak, međutim, nije ograničen na sledeće farmaceutske sastave.

Formulacija 1 - Tablete

[0075] Jedinjenje prema pronalasku može se mešati kao suvi prah sa suvim želatinskim vezivom u približnom težinskom odnosu 1:2. Manja količina magnezijum stearata može se dodati kao lubrikant. Smeša može da se formira u tablete od 240-270 mg (80-90 mg aktivnog amida jedinjenja po tableti) u presi za tablete.

Formulacija 2 - Kapsule

[0076] Jedinjenje prema pronalasku može se mešati kao suvi prah sa skrobom kao razblaživačem u približnom težinskom odnosu 1:1. Smeša se može puniti u kapsule od 250 mg (125 mg aktivnog amida jedinjenja po kapsuli).

Formulacija 3 - Tečnost

[0077] Jedinjenje prema pronalasku (125 mg), može biti pomešano sa saharozom (1.75 g) i ksantan gumom (4 mg) i dobijena smeša može se mešati, propuštati kroz br.10 mreže US sito, a zatim pomešati sa prethodno napravljenim rastvorom mikrokristalne celuloze i natrijum karboksimetil celuloze (11:89, 50 mg) u vodi. Natrijum benzoat (10 mg), aroma, i boja mogu se razblažiti vodom i dodati tokom mešanja. Dovoljna količina vode se može zatim dodati uz mešanje. Dalja potrebna voda se može dodati kako bi se dobila ukupna zapremina od 5 mL.

Formulacija 4 - Tablete

[0078] Jedinjenje prema pronalasku može se mešati kao suvi prah sa suvim želatinskim vezivom u približnom težinskom odnosu 1:2. Manja količina magnezijum stearata može se dodati kao lubrikant. Smeša može da se formira u tablete od 450-900 mg (150-300 mg aktivnog amida jedinjenja) u presi za tablete.

Formulacija 5 - Injekcije

[0079] Jedinjenje prema pronalasku se može rastvoriti ili suspendovati u puferovani sterilni fiziološki rastvor u injektibilnoj vodenoj sredini do koncentracije od približno 5 mg/ml.

Formulacija 6 - Topikalno

[0080] Stearil alkohol (250 g) i beli vazelin (250 g) se mogu istopiti na oko 75 ° C, i zatim smeša jedinjenja prema pronalasku (50 g) metilparaben (0.25 g), propilparaben (0,15 g), natrijum lauril sulfat (10 g), i propilen glikol (120 g) rastvoren u vodi (oko 370 g) se mogu dodati i dobijena smeša se može mešati dok se ne zamrzne.

METODE LEČENJA

[0081] Jedinjenje prema pronalasku se može koristiti kao terapeutski agens za lečenje stanja kod sisara koja su obično povezana ili pripisana nenormalnoj aktivnosti JAK-a. Naročito, stanja povezana sa nenormalnom aktivnošću JAK1 i/ili JAK2. Prema tome, jedinjenje i farmaceutski sastavi prema pronalasku nalaze upotrebu kao lekovi za sprečavanje i/ili lečenje inflamatornih stanja, autoimunih bolesti, proliferativnih bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, urođene malformacije hrskavice i/ili bolesti povezane sa hipersekrecijom IL6-a kod sisara uključujući i ljude.

[0082] U dodatnom aspektu metoda za lečenje, ovaj pronalazak obelodanjuje metode za lečenje sisara podložnim ili onima koji boluju od inflamatornih stanja. Metode se sastoje iz davanja efektivne količine za lečenje stanja ili sprečavanja stanja farmaceutskih sastava ili jedinjenja prema pronalasku ovde opisanih. U posebnom otelotvorenju, inflamatorna stanja se biraju iz reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, alergijskih bolesti disajnih puteva (npr., astma) i inflamatornih bolesti utrobe.

[0083] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi inflamatornih stanja. U posebnom otelotvorenju, inflamatorna stanja se biraju iz reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, alergijskih bolesti disajnih puteva (npr., astma) i inflamatornih bolesti utrobe.

[0084] U dodatnom aspektu metode lečenja, predmetni pronalazak obelodanjuje metode za lečenje sisara podložnih, ili onih koji boluju od autoimunih bolesti. Metode se sastoje od davanja efektivne količine za lečenje stanja ili sprečavanje stanja jednog ili više farmaceutskih sastava jedinjenja prema pronalasku ovde opisanog. U posebnom otelotvorenju, autoimune bolesti se biraju iz COPD, astme, sistemskog lupus eritematoze, tipa I bolesti dijabetesa i inflamatorne bolesti utrobe.

[0085] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi autoimunih bolesti. U posebnom otelotvorenju, autoimune bolesti se biraju iz COPD, astme, sistemskog lupus eritematoze, tipa I bolesti dijabetesa i inflamatorne bolesti utrobe.

[0086] U daljim aspektima metode lečenja, predmetni pronalazak obelodanjuje metode za lečenje sisara podložnih ili onih koji boluju od proliferativnih bolesti, naročito kancera (npr., čvrsti tumori kao što su lejomiosarkom materice ili kancer prostate), leukemije (npr., AML ili ALL) multiple mijeloma i/ili psorijaza.

[0087] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi proliferativnih bolesti, naročito kancera (npr., čvrsti tumori kao što su lejomiosarkom materice ili kancer prostate), leukemije (npr., AML ili ALL) multiple mijeloma i/ili psorijaza.

[0088] U daljim aspektima metode za lečenje, obelodanjene su metode za lečenje sisara podložnih ili onih koj boluju od neprihvatanja transplantata. U posebnom otelotvorenju, pronalazak daje metode za lečenje neprihvatanja transplantata organa.

[0089] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi neprihvatanja transplantata. U posebnom otelotvorenju, pronalazak daje metode za lečenje neprihvatanja transplantata organa.

[0090] U aspektu metode za lečenje, obelodanjen je metod lečenja, sprečavanja ili profilakse kod sisara podložnih ili onih koji boluju od bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice, čiji metod se sastoji iz davanja terapeutski efektivne količine jedinjenja prema pronalasku, ili jednog ili više farmaceutskih sastava ovde opisanih.

[0091] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi bolesti koje obuhvataju oštećenje rasta hrskavice.

[0092] Dato obelodanjivanje takođe pruža metod lečenja urođenih malformacija hrskavice, čiji metod se sastoji iz davanja efektivne količine jednog ili više farmaceutskih sastava ili jedinjenja prema pronalasku kao što je ovde opisano.

[0093] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi urođenih malformacija hrskavice.

[0094] U daljim aspektima metode lečenja, obelodanjene metode lečenja sisara podložnih ili onih koji boluju od bolesti povezanih sa hipersekrecijom IL6, naročito od Kastlemanove bolesti ili mesangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa.

[0095] U još jednom aspektu predmetni pronalazak pruža jedinjenje prema pronalasku za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili profilaksi bolesti povezanih sa hipersekrecijom IL6, naročito od Kastlemanove bolesti ili mesangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa.

[0096] Kao dalji aspekt pronalaska dato je jedinjenje prema pronalasku za upotrebu kao farmaceutsko posebno za lečenje ili sprečavanje prethodno navedenih stanja i bolesti. Takođe ovde je dato da upotreba datih jedinjenja u proizvodnji lekova za lečenje ili sprečavanje jedne od prethodno navedenih stanja i bolesti.

[0097] Poseban režim date metode uključuje primenu na subjektu koji boluje od bolesti koje uključuje zapaljenje, efikasne količine jedinjenja prema pronalasku za period koji je dovoljan da smanji stepen zapaljenja kod subjekta, i poželjno okonča procese odgovorni za pomenuta zapaljenja. Posebno otelotvorenje metode obuhvata davanje efektivne količine jedinjenja prema pronalasku na subjektu pacijenta koji boluje ili je podložan za razvoj reumatoidnog artritisa, tokom perioda vremena dovoljnog da smanji ili spreči, respektivno, inflamaciju u zglobovima pomenutog pacijenta, i poželjno okonča, procese odgovorne za pomenutu upalu.

[0098] Dalji poseban režim date metode sadrži primenu na subjekat koji boluje od stanja bolesti koje se karakteriše degradacijom hrskavice ili zgloba (npr., reumatoidni artritis i / ili osteoartritis) efikasne količine jedinjenja prema pronalasku tokom perioda vremena dovoljnog da smanji i poželjno prekine procese koji se sami produžavaju i koji su odgovorni za pomenutu degradaciju. Posebno otelotvorenje metode obuhvata upotrebu efektivne količine jedinjenja prema pronalasku na subjekat pacijenta koji boluje ili je podložan za razvoj osteoartritisa, za period koji je dovoljan da smanji ili spreči, respektivno, degradaciju hrskavice u zglobovima pomenutog pacijenta, a poželjno okonča, samo-produžavajuće procese za pomenutu degradaciju. U posebnom otelotvorenju navedeno jedinjenje može da ispolji anabolička i/ili antianabolička svojstva hrskavice.

[0099] Doze injekcija su u granicama od oko 0.1 mg/kg/h do bar 10 mg/kg/h, sve za od oko 1 do oko 120 sati a posebno 24 do 96 sati. Prethodno ispunjene kuglice od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg ili više se mogu dodati da bi se postigli adekvatni stabilni nivoi stanja.

Maksimalna ukupna doza se ne očekuje da pređe oko 2 g/danu za pacijenta čoveka od 40 do 80 kg.

[0100] Za sprečavanje i/ili lečenje dugoročnih stanja, kao što su degenerativna stanja, režim lečenja obično se proteže kroz nekoliko meseci ili godina tako da je oralna upotreba poželjnija za udobnost i toleranciju pacijenta. Sa oralnim doziranjem, jedna do pet i posebno dve do četiri a obično tri oralne doze po danu su reprezentativni režimi. Upotrebom ovih redosleda doziranja, svaka doza daje od oko 0.01 do oko 20 mg/kg jedinjenja prema pronalasku, sa posebnim dozama svaka daje od oko 0.1 do oko 10 mg/kg i posebno oko 1 do oko 5 mg/kg.

[0101] Transdermalne doze se obično biraju da bi pružili slične ili niže krvne nivoe nego što su postignuti korišćenjem injekcionih doza.

[0102] Kada se koristi za sprečavanje početka inflamatornih stanja, jedinjenje prema pronalasku će se davati pacijentu sa rizikom razvitka stanja, obično uz savet i kontrolu lekara, u količinama doza kao što je opisano iznad. Pacijenti sa rizikom da razviju određeno stanje obično obuhvataju one koji imaju istoriju sa tim stanjem u familiji, ili oni kojima je genetskim testiranjem otkriveno da su podložni za razvijanje stanja.

[0103] Jedinjenje prema pronalasku se može davati kao samostalni aktivni agens ili se može davati u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima, uključujući druga jedinjenja koja pokazuju iste ili slične terapeutske aktivnosti, i koja su određena kao bezbedna i efikasna za takvu kombinovanu upotrebu. U određenom otelotvorenju, zbirno davanje dva (ili više) agensa omogućava značajno manje doze svakog od korišćenih, time smanjujući viđene nuspojave.

[0104] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku se zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje bolesti koje uključuju inflamaciju; određeni agensi sadrže, ali nisu ograničeni na, imunoregulatorne agense npr., azatioprin, kortikosteroidi (npr., prednisolon ili deksametazon), ciklofosfamid, ciklosporin A, takrolimus, Mikofenolat Mofetil, muromonab-CD3 (OKT3, npr., Orthocolone®), ATG, aspirin, acetaminofen, ibuprofen, naproksen i prioksikam.

[0105] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku se zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje artritisa (npr., reumatoidnog artritis); određeni agensi sadrže ali nisu ograničeni na analgetike, ne-steroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDS), steroide, sintetički DMARDS (na primer ali bez ograničenja metotreksat, leflunomid, sulfasalazin, auranofin, natrijum aurotiomalat, penicilamin, hlorokvin, hidroksihlorokvin, azatiopirin i ciklosporin), i biološki DMARDS (na primer ali bez ograničenja Infliksimab, Etanercept, Adalimumab, Rituksimab i Abatacept).

[0106] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku se zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje proliferativnig poremećaja, određeni agensi sadrže ali nisu ograničeni na: metotrekstat, leukovorin adriamicin, prenisone, bleomicin, ciklofosfamid, 5-fluorouracil, paklitaksel, docetaksel, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, doksorubicin, tamoksifen, toremifen, megestrol acetat, anastrozol, goserelin, anti-HER2 monoklonalno antitelo (npr. Herceptin™), kapecitabin, raloksifen hidrohlorid , inhibitori EGFR (npr., lressa<®>, Tarceva™, Erbitux™), VEGF inhibitori (npr. Avastin™), inhibitori proteazoma (npr. Velcade™), Glivec® i inhibitori hsp90 (npr.17-AAG). Dodatno, jedinjenje prema pronalasku se može upotrebljavati u kombinaciji sa drugim lekovima uključujući ali ne i ograničavajući se na radioterapiju ili operaciju. U određenim otelotvorenjima proliferativni poremećaji se biraju iz kancera, mijeloproliferativnih bolesti ili leukemije.

[0107] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje autoimunih bolesti, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: glukokortikoida, citostatički agensi (npr. analozi purina) agensa za alkilovanje, (npr. azotne iperite (ciklofosfamid), nitrozourea, platinska jedinjenja, i drugi), anti-metabolite (npr. metotreksat, azatioprin i merkaptopurin), citotoksične antibiotike (npr. daktinomicin antracikline, mitomicin C, bleomicin i mitramicin), antitela (npr. anti-CD20, anti-CD25 ili anti-CD3 (OTK3) monoklonalna antitela, Atgam® i Thimoglobuline®), ciklosporin, takrolimus, rapamicin (sirolimus), interferone (npr IFN-b), TNF vezujući proteini (npr. infliksimab (Remicade™), etanercept (Enbrel™), ili adalimumab (HUMIRA ™)), mikofenolat, Fingolimod i Miriocin.

[0108] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje neprihvatanja transplantata, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: inhibitore kalcineurina (npr. ciklosporina ili takrolimus (FK506)), mTOR inhibitori (npr. sirolimus, everolimus), anti-proliferativnih (npr. azatioprin, mikofenolna kiselina), kortikosteroidi (npr. prednizolon, hidrokortizon), antitela (npr. monoklonalno anti-IL-2Ra receptor antitela, basilikimab, daclizumab), policlonal anti-T-ćelija antitela (npr. anti-thimocite globulin (ATG), anti-limfocitni globulin (ALG)).

[0109] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje astme i/ili rinitisa i/ili COPD-a, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: beta2-adrenoceptor (npr. salbutamol, levalbuterol, terbutalin i bitolterol), epinefrin (inhaliranjem ili u tabletama), antiholinergici (npr. ipratropium bromid), glukokortikoidi (oralnim putem ili inhaliranjem) dugo-delujući p2-agonisti (npr. salmeterol, formoterol, bambuterol i oralni albuterol sa zadržanim oslobađanjem), kombinacije za inhaliranje steroida i dugog dejstva bronhodilatatorima (npr. flutikazon/salmeterol, budesonid/formoterol), antagonisti leukotriena i inhibitori sinteze (npr. montelukast, zafirlukast i zileuton), inhibitori medijatora otpuštanja (npr. kromoglikat i ketotifen), biološki regulatori IgE odgovor (npr. omalizumab), antihistaminici (npr ceterizine, cinarizin, feksofenadin) i vazokonstriktora (npr. okimethazoline, kilomethazoline, nafazoline i tramazolinskih).

[0110] Dodatno, jedinjenje prema pronalasku se može upotrebljavati u kombinaciji sa lekovima za astmu /ili COPD, takvi lekovi uključuju upotrebu kiseonika ili helioksa, nebulizovanog salbutamola ili terbutalina (opciono kombinovani sa antiholinergicima (npr. ipratopium), sistemskih steorida (oralno ili intravenozno, npr. prednison, prednisolon, metilprednisolon, deksametaszon ili hidrokortison), intravenoznog salbutamola, netipičnih beta-agonista, injektiranjem ili udisanjem (npr. epinefirin, izotearin, izoproterenol, metaproterenol), antiholinergika (IV ili nebulizovani, npr. glikopirolat, atropin, ipratopijum), metilksantine (teofilin, aminofilin, bamifilin), inhalacione anestetike koji imaju bronhodilatorni efekat (npr. izofluran, halotan, enfluran), keramin i intravenozni magnezijum sulfat.

[0111] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje IBD-a, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: glukokortikoide (npr. prednizon, budesonid) sintetičko modifikovanje bolesti, imunomodulatorni agensi ( npr. metotreksat, leflunomid, sulfasalazin, mesalazin, azatioprin, 6-merkaptopurin i ciklosporin) i biološko modifikovanje bolest, imunomodulatorni agensi (infliksimab, adalimumab, rituksimab i abatacept).

[0112] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje SEL-a, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: antireumatske lekove koji modifikuju bolesti (DMARD) kao što je malarija (npr. plakuenil, hidroksihlorokin), imunosupresante (npr. metotreksat i azatioprin), ciklofosfamid i mikofenolna kiselina; imunosupresivne lekove i analgetike, kao što su nesteroidni anti-inflamatorni lekovi, opijati (npr. dektropropokifen i kokodamol), opioidi (npr. hidrokodon, oksikodon, MS Contin, ili metadona) i fentanila duragesic transdermalni flaster.

[0113] U jednom otelotvorenju, jedinjenje prema pronalasku zbirno se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje i/ili sprečavanje psorijaze, određeni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na: topikalne tretmane kao što rastvori za kupatila, maziva, lekovitim kreme i masti koje sadrže ugljenog katrana, ditranola (antralin), kortikosteroidi poput dezoksimetazon (Topicort ™), fluocinonid, vitamin D3 analozi (na primer, kalcipotriola), Argan oiland retinoidi (etretinat, acitretin, tazarotena), sistemski tretmani kao što je metotreksat, ciklosporin, retinoidi, tioguanin , hidroksiurea, sulfasalazin, mukofenolat mofetil, azatioprin, takrolimus, estri fumarne kiseline ili biologije kao što Amevive ™, Enbrel ™, Humira ™, remikad ™, Raptiva ™ i ustekinumab (a IL-12 i IL-23 blokatorima). Pored toga, jedinjenje iz ovog pronalaska se može davati u kombinaciji sa drugim terapijama, uključujući, ali ne ograničavajući se fototerapija ili Fotohemoterapija (npr psoralen i ultraljubičastom A fototerapija (PUVA)).

[0114] Zbirnim davanjem je uključeno bilo koje sredstvo za isporuku dva ili više terapeutskih agenasa pacijentu kao deo istog režima lečenja, kao što će biti jasno stručnjaku. Dok su dva ili više sredstva mogu da budu davani simultano u jednoj formulaciji ovo nije bitno. Sredstva mogu biti primenjena u različitim formulacijama i u različito vreme.

OPŠTE SINTETIČKE PROCEDURE

Opšte

[0115] Jedinjenje prema pronalasku i komparativni primeri obelodanjeni u WO2010010190 mogu se pripremiti od trenutno dostupnih početnih materijala upotrebom sledećim opštim metodama i procedurama. Podrazumeva se da kada su obični ili poželjni uslovi procesa (npr., temperatura reakcije, vremena, odnos molova reaktanata, rastvarača, pritisaka itd.) data, druga stanja procesa se takođe mogu koristiti osim ukoliko nije drugačije naglašeno.

Optimalni uslovi reakcije može varirati sa određenim reaktantom ili rastvaračem koji se koristi, ali takvi uslovi se mogu odrediti sa strane onoga ko je iskusan u struci rutinskom procedurom optimizacije.

[0116] Dodatno, kao što će biti očigledno stručnjacima, konvencionalne zaštitne grupe mogu biti neophodne da bi se sprečile određene funkcionalne grupe od podleganja nepoželjnim reakcijama. Odabir pogodne zaštitne grupe sa određenu funkcionalnu grupu kao i pogodni uslovi za zaštitu i uklanjanje zaštite su dobro poznati u struci. Na primer, brojne zaštitne grupe, i njihovo uvođenje i uklanjanje su opisani u T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991, i referencama tu naznačenim.

[0117] Sledeće metode su predstavljene sa detaljima u pogledu pripreme jedinjenja prema pronalasku kao što je prethodno definisano i sa komparativnim primerima. Jedinjenje prema pronalasku i komparativni primeri mogu biti pripremljeni od poznatih ili komercijalno dostupnih polaznih materijala i reagenasa onome ko je iskusan u struci organske sinteze.

[0118] Svi reagensi su bili komercijalnog kvaliteta i bili su korišćeni kao što su dobijeni bez daljeg prečišćavanja, ukoliko nije drugačije naznačeno. Komercijalno dostupni bezvodni rastvarači su korišćeni za reakcije sprovedene pod inertnim okruženjem. Rastvarači graduiranog reagensa su korišćeni u svim drugim slučajevima, ukoliko nije drugačije navedeno. Hromatografija na koloni je izvedena na silicijum dioksid gelu 60 (35-70 µm). Hromatografija na tankom sloju je izvedena korišćenjem prethodno obložene silicijum dioksid gelom sa F-254 pločama (debljina 0.25 mm).<1>H NMR spektri su beleženi na Bruker DPKS 400 NMR spektrometru (400 MHz). Hemijska pomeranja (δ) za<1>H NMR spektre su prikazana u delovima na milion (ppm) u odnosu na terametilsilan (δ 0.00) ili odgovarajući maksimum preostalog rastvarača npr., CHCl3(δ 7.27), kao interna referenca. Multipliciteti su dati kao singlet (s), dublet (d), triplet (t), kvartet (k), multiplet (m) i opšti (BR). Konstante spajanja (J) su date u Hz. Elektrosprej MS spektri su dobijeni na Micromass platformi LC/MS spektrometar. Kolona korišćena za sve LCMS analize: Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7µm, 2.1mm ID x 50mm L (Part No.186002350)). Preparativna HPLC: Waters XBridge Prep C185µm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No.186002978). Sve metode koriste MeCN/H2O gradijenate. H2O sadrži ili 0.1% TFA ili 0.1% NH3.

Spisak skraćenica koje se koriste u eksperimentalnom delu:

[0119]

DCM:

Dihlorometan

DiPEA:

N,N-diisopropiletilamin

MeCN

Acetonitril

BOC

tert-Butiloksi-karbonil

DMF

N,N-dimetilformamid

TFA

Trifluorosirćetna kiselina

THF

Tetrahidrofuran

NMR

Nuklearna magnetna rezonanca

DMSO

Dimetilsulfoksid

DPPA

Difenilfosforilazid

LC-MS

Tečna hromatografija – Masena spektrometrija

Ppm

deo na milion

EtOAc

etil acetat

APCI

atmosferski pritisak hemijska jonizacija

Rt

vreme zadržavanja

s

singlet

br s

opšti singlet

m

multiplet

d

dublet

PdCl2dppf

[1,1'-Bis(difenilfosfino)ferocen] dihloropaladijum(II)

TEA

Trietilamin

Sintetičko pripremanje jedinjenja prema pronalasku i komparativni primeri [0120] Jedinjenje prema pronalasku i komparativni primeri se mogu proizvesti prema sledećoj šemi.

Opšte sintetičke metode

[0121]

gde Ar predstavlja fenil-L1-heterocikloalkil, gde je L1 veza, -CH2ili -CO- i heterocikloalkil grupa se opciono zamenjuje.

Opšte

1.1.1 1-(6-Bromo-piridin-2-il)-3-karboetoksi-tiourea (2)

[0122]

[0123] Rastvoru 2-amino-6bromopiridina (1) (253.8 g, 1.467 mol) u DCM-u (2.5 L) koji je hlađen do 5 °C dodat je etoksikarbonil izotiocianat (173.0 mL, 1.467 mol) u vidu kapi tokom 15 min. Reakciona smeša je zatim puštena da se zagreje do sobne temperature (20 °C) i mešana je tokom 16 h. Evaporacija in vacuo daje čvrstu supstancu koja se može prikupiti filtracijom, temeljnim ispiranjem sa benzinom (3x600 mL) i sušenjem na vazduhu da bi se dobilo (2). Tiourea se može koristiti kao takva za sledeći korak bez prečišćavanja.<1>H (400 MHz, CDCl3) δ 12.03 (1H, br s, NH), 8.81 (1H, d, J 7.8 Hz, H-3), 8.15 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, t, J 8.0 Hz, H-4), 7.32 (1H, dd, J 7.7 i 0.6 Hz, H-5), 4.31 (2H, q, J 7.1 Hz, CH2), 1.35 (3H, t, J 7.1 Hz, CH3).

1.1.2 5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-ilamin (3)

[0124]

[0125] Suspenziji hidroksilamin hidohlorida (101.8 g, 1.465 mol) u EtOH/MeOH (1:1, 900 mL) je dodat N,N-diisopropiletilamin (145.3 mL, 0.879 mol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi (20 °C) tokom 1 h.1-(6-Bromo-piridin-2-il)-3-karboetoksi-tiourea (2) (89.0 g, 0.293 mol) je potom dodat i smeša je polako zagrevana uz refluks (Napomena: četka za izbeljivanje je potrebna za gašenje nastalog H2S). Nakon 3 h uz refluks, smeša je ostavljena da se hladi i filtrira se d bi se dobio čvrsti talog. Dalji proizvod je skupljen evaporacijom in vacuo filtrata, dodatkom H2O (250 mL) i filtracijom. Kombinovane čvrste supstance su ispravne sukcesivno sa H2O (250 mL), EtOH/MeOH (1:1, 250 mL) i Et2O (250 mL) i sušene in vacuo kako bi se dobio triazolopiridin derivat (3) kao čvrsta supstanca. Jedinjenje se može koristiti kao takvo za sledeći korak bez prečišćavanja.<1>H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.43-7.34 (2H, m, 2 x aromatic-H), 7.24 (1H, dd, J 6.8 i 1.8 Hz, aromatic-H), 6.30 (2H, br, NH2); m/z 213/215 (1:1, M+H<+>, 100%).

1.1.3 Generalni postupak za mono-acilovanje u cilju dobijanja intermedijera (4):

[0126]

[0127] Rastvoru 2-amino-triazolopiridina (3) (7.10 g, 33.3 mmol) u suvom CH3CN (150 mL) na 5 °C je dodat Et3N (11.6 mL, 83.3 mmol) a zatim ciklopropanekarbonil hlorid (83.3 mmol). Reakciona smeša je potom ostavljena da se zagreje do temperature okoline i mešana je sve dok se početni materijal (3) nije potrošio. Ukoliko je potrebno, još Et3N (4.64 mL, 33.3 mmol) i ciklopropanekarbonil hlorida (33.3 mmol) se dodaje da bi se osigurala kompletna reakcija. Nakon evaporacije rastvarača in vacuo dobijeni ostatak se tretira sa rastvorom 7 N amonijaka u metanu (50 mL) i meša se na temperaturi okoline (tokom 1-16 h) kako bi se dobila hidroliza svih bis-acilovanih proizvoda. Izolacija proizvoda je ostvarena uklanjanjem isparljivih materija što je praćeno titracijom sa Et2O (50 mL). Čvrste supstance se skupljaju filtracijom, ispiraju sa H2O (2x50mL), acetonom (50 mL) i Et2O (50 mL), i suše se in vacuo kako bi se dobilo željeni brom intermedijer (4).

Metoda A

Priprema jedinjenja prema pronalasku pomoću Suzuki spojeva (5):

[0128] Odgovarajuća borna kiselina (2eq.) se dodaje rastvoru brom intermedijeru (4) u 1,4-dioksanu/vodi (5:1). K2CO3(2 eq.) i PdCl2dppf (5%) su dodati rastvoru. Dobijena smeša se zatim zagreva u mikrotalasnoj pećnici na 140 °C tokom 30 min (ova reakcije se takođe može izvesti tradicionalnim zagrevanjem u uljanom kupatilu na 90°C tokom 16h pod N2). Voda je dodata rastvor je ekstrahovan sa etil acetatom. Organski slojevi se suše preko anhidrovanog MgSO4i evaporiraju in vacuo. Konačno jedinjenje se dobija nakon pročišćavanja putem fleš hromatografije ili preparativnog HPLC-a. HPLC: Waters XBridge Prep C185µm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No.186002978). Sve metode koriste MeCN/H2O gradijente. H2O sadrži ili 0.1% TFA ili 0.1% NH3.

Metoda B

[0129]

B1. 4 4-[2-(Ciklopropanekarbonil-amino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-5-il]-benzoil hlorid

[0130]

[0131] 2 kapi DMF-a se dodaju rastvoru 4-[2-(ciklopropanekarbonil-amino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-5-il]-benzoeve kiseline (1 eq) dobijene Metodom A korišćenjem 4-karboksifenilborne kiseline u DCM-u pod okruženjem N2. Potom je oksalil hlorid (2 eq) dodat u vidu kapi ovom dobijenom rastvoru (otpuštanje gasa). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nakon završetka reakcije sa LCMS-om, rastvarač se uklanja. Sirova kiselina hlorida se koristi bez daljeg prečišćavanja u narednom koraku.

B2. Formiranje amida (opšta metoda)

[0133] Odgovarajući amin (1.1 eq) i Et3N (5 eq) se rastvaraju u DCM-u pod okruženjem N2i hlade se na 0°C. Kiselina hlorida (B1, 1 eq) rastvorena u DCM-u se dodaje u vidu kapi ovom rastvoru. Reakcija se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Nakon ovog vremena, reakcija je gotova. Jedinjenje se ekstrahuje sa EtOAc i vodom, ispira se sa fiziološkim rastvorom i suši preko anhidrovanog MgSO4. Organski slojevi se filtriraju i evaporiraju. Konačno jedinjenje je izolovano preparativnim HPLC-om. Preparativni HPLC: Waters XBridge Prep C185µm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No.186002978). Sve metode koriste MeCN/H2O gradijente. H2O sadrži ili 0.1% TFA ili 0.1% NH3.

Metoda C

[0134]

Gde R<3a>ili R<3b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani, mogu formirati heterocikloalkil.

Redukciono alkilovanje (opšta metoda)

[0135] Odgovarajući amin (2 eq.), ciklopropankarboksilna kiselina (na primer ciklopropankarboksilna kiselina [5-(4-formil-fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il]-amid) dobijena je metodom A (1 eq.) i Ti(OPr)4se pomešaju i zajedno mešaju na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Smeša je razblažena u etanolu i Na(CN)BH3(1eq.) je dodat. Dobijeni rastvor se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Smeša je razblažena u vodi i filtrirana je. Filtrat se ispira sa etanolom. Kombinovane faze rastvora se evaporiraju pod vakuumom. Konačno jedinjenje je izolovano preparativnim HPLC-om.

Metoda D

[0136]

gde R<1>i R<2>zajedno sa atomom Azota za koji su vezani, mogu formirati heterocikloalkil. Reakcija alkilacije

[0137]

[0138] 2-(4-Bromomettil-fenil)-4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan (1eq) i Et3N (2 eq) (ili AgCO3) su rastvoreni u DCM/MeOH (4:1 v:v) pod N2i amin (2 eq) je dodat u vidu kapi. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16h. Nakon tog vremena, reakcija je gotova. Rastvarač je evaporirao. Jedinjenje je ekstrahovano sa EtOAc i vodom, isprano sa fiziološkim rastvorom i sušeno preko anhidrovanog MgSO4. Organski slojevi su filtrirani i evaporirani. Konačno jedinjenje je izolovano fleš hromatografijom.

Suzuki spoj

[0139]

[0140] Dobijena borna kiselina (2eq.) je dodata rastvoru ciklopropankarboksilne kiseline (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)-amid (4) u 1,4-dioksanu/vodi (5:1). K2CO3(2 eq.) i PdCl2dppf (5%) su dodati rastvoru. Dobijena smeša je zatim zagrevana u mikrotalasnoj pećnici na 140 °C tokom 30 min (Ova reakcija se takođe može izvesti tradicionalnim grejanjem u uljanom kupatilu na 90°C tokom 16h pod N2). Voda je dodata i rastvor je ekstrahovan sa etil acetatom. Organski sloj je sušen preko anhidrovanog MgSO4 i evaporiran in vacuo. Konačno jedinjenje se dobija nakon prečišćavanja sa fleš hromatografijom ili preparativnim HPLC-om. HPLC: Waters XBridge Prep C185µm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No.186002978). Sve metode koriste MeCN/H2O gradijente. H2O sadrži ili 0.1% TFA ili 0.1% NH3.

Sinteza jedinjenja prema pronalasku i komparativni primeri

Jedinjenje 1(jedinjenje prema pronalasku)

Korak 1:

[0141]

[0142] 2-(4-Bromometill-fenil)-4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan (1eq) i DIPEA (2 eq) su rastvoreni u DCM/MeOH (5:1 v:v) pod N2i tiomorfolin 1,1-dioksid (2 eq) je dodat u vidu delova. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16h. Nakon tog vremena, reakcija je završena. Rastvarač je evaporirao. Jedinjenje je ekstrahovano sa EtOAc i vodom, isprano sa fiziološkim rastvorom i sušeno preko anhidrovanog MgSO4. Organski slojevi su filtrirani i evaporirani. Konačno jedinjenje je izolovano bez daljeg prečišćavanja.

Korak 2: Suzuki spoj

[0143]

[0144] 4-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-benzil]-tiomorfolin-1,1-dioksid (1.1eq.) je dodat rastvoru ciklopropankarboksilne kiseline (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)-amid u 1,4-dioksanu/vodi (4:1). K2CO3 (2 eq.) i PdCl2dppf (0.03 eq.) su dodati rastvoru. Dobijena smeša je zatim zagrevana u uljanom kupatilu na 90°C tokom 16h pod N2. Voda je dodata i rastvor je ekstrahovan sa etil acetatom. Organski slojevi su sušeni preko anhidrovanog MgSO4i evaporirani in vacuo. Konačno jedinjenje je dobijeno nakon prečišćavanja sa fleš hromatografijom.

[0145] Alternativno, nakon završetka reakcije, sakupljač paladijuma kao što je 1,2-bis (difenilfosfino)etan, se dodaje, reakciona smeša je ostavljena da se ohladi, i da se izvrši filtriranje. Filter kolač je razmućen u pogodnom rastvaraču (npr. aceton), čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem, ispere sa više acetona i osuši se. Dobijeni čvrsti ostatak je ponovo suspendovan u vodi, vodeni rastvor HCl je dodat, i posle mešanja na sobnoj temperaturi, dobijeni rastvor se filtrira na celite (Celpure P300). Vodeni NaOH je zatim dodat u filtrat, i dobijena suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi, čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem, ispere sa vodom i osušena usisavanjem. Konačno kolač je ponovo rastvoren u smeši THF/H2O, tretiran sa sakupljačem paladijuma (npr. SMOPEKS 234) na 50 ° C, suspenzija se filtrira, organski rastvarači se uklone isparavanjem, i dobijena gusta smeša je isprana voda i metanol, osušena i prosejana, da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje kao slobodnu bazu.. Alternativni put do Jedinjenja 1(jedinjenje prema pronalasku):

Korak 1:

[0146]

[0147] 4-(hidroksimetil)fenilborna kiselina (1.1eq.) je dodata u rastvor ciklopropankarbonske kiseline (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)-amida u 1,4-dioksanu/vodi (4: 1). K2CO3(2 eq.) i PdCl2dppf (0.03 eq.) su dodati u rastvor. Dobijena smeša je zatim zagrevana u uljanom kupatilu na 90 °C u toku 16h u okruženju N2. Dodata je voda i rastvor je ekstrahovan sa etil acetatom. Organski slojevi se osuše preko anhidrovanog MgSO4i evaporiraju u vakuumu. Dobijena smeša je korišćena bez daljeg prečišćavanja. Korak 2:

[0148]

[0149] Rastvoru ciklopropankarboksilne kiseline [5-(4-hidroksimetil-fenil)-[1,2,4]triazolo [1,5-a] piridin-2-il]-amid (1.0 eq) u hloroformu polako je dodavan fosfor tribromid (1.0 equiv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 sati, ugašena sa ledom i vodom (20 mL) i ekstrahovana sa dihlorometanom. Organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgSO4, filtriran i koncentrovan dok nije postao suv. Dobijena beli ostatak se triturira u dihlormetan/dietil etar 2: 1 kako bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca.

Korak 3:

[0150]

[0151] Ciklopropankarbonska kiselina [5-(4-bromometil-fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il] –amid (1eq) i DIPEA (2 eq) su rastvoreni u DCM/MeOH (5:1 v:v) pod N2i tiomorfolin 1,1-dioksid (1.1 eq) je dodat u kapima. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Nakon tog vremena, reakcija je bila završena. Rastvarač je evaporiran. Jedinjenje je rastvoreno u DCM, isprano sa vodom i osušeno preko anhidrovanog MgSO4. Organski slojevi se filtriraju i evaporiraju. Krajnje jedinjenje je izolovano hromatografijom na koloni primenom EtOAc kako bi se dobilo željeni proizvod.

Komparativni primeri:

Komparativno jedinjenje 2

[0152] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod A i 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-benzil]-morfolin.

Komparativno jedinjenje 3

[0153] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod A i 3-(4-morfolinometil)-fenilboronska kiselina pinakol ester hidrohlorid.

Komparativno jedinjenje 4

[0154] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod A i 2-(4-morfolin)piridin-5-bornu kiselinu pinakol estara.

Komparativno jedinjenje 5

[0155] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod A i 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil]morfolin.

Komparativno jedinjenje 6

[0156] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod C i N-metil-piperazin.

Komparativno jedinjenje 7

[0157] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod C i piperidin.

Komparativno jedinjenje 8

[0158] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod C i piperidin-4-karboksilnu kiselinu amida.

Komparativno jedinjenje 9

[0159] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod C i 1-piperazin-1-il-etanon.

Komparativno jedinjenje 10

[0160] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod B i tiomorfolin 1,1-dioksid.

Komparativno jedinjenje 11

[0161] Ovo jedinjenje je dobijeno koristeći Opšti Metod D i 4,4-difluoropiperidin.

[0162] Jedinjenje prema pronalasku i komparativni primeri koji su bili pripremljeni prema sintetičkim metodama opisanim ovde, nabrojani su ispod u Tabeli 1. NMR spektralni podaci jedinjenja pronalaska i neki komparativni primeri su dati u Tabeli II.

Tabela I

Tabela II: NMR Podaci reprezentativnog jedinjenja pronalaska i komparativna jedinjenja.

Biološki primeri Primer 1: In-vitro testovi 1.1 JAK1 test inhibicije

[0163] Rekombinantni ljudski katalitički domen JAK1 (amino kiseline 850-1154; kataloški broj 08-144) pribavljen je od Carna Biosciences. 10 ng JAK1 je inkubirano sa 12.55 µg polyGT supstrata (Sigma katalog broj P0275) u reakcionom baferu kinaze (15 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 0.01% Tween-20, 10 mM MgCl2, 2 µM neradioaktivni ATP, 0.25 µCi<33>P-gama-ATP (GE Healthcare, kataloški broj AH9968) finalne koncentracije) sa ili bez testa koji sadrži 5µL jedinjenja ili nosioca (DMSO, 1% finalna koncentracija), u ukupnoj zapremini od 25 µL, u polipropilenu ploče sa 96 otvora (Greiner, V-dno). Nakon 45 minuta na 30 °C, reakcije su zaustavljene dodavanjem 25 µL/otvoru od 150 mM fosforne kiseline. Sve zaustavljene reakcije kinaze su premeštene na (75 mM fosforne kiseline) filter ploče sa 96 otvora za prethodno ispiranje (Perkin Elmer kataloški broj 6005177) korišćenjem sakupljača ćelija (Perkin Elmer). Ploče su isprane 6 puta sa 300 µL po otvoru od 75 mM rastvora fosforne kiseline i dna ploča su zatvorene. Dodato je 40 µL/otvoru Microscint-20, zatvoreni su vrhovi ploča i merenje je izvedeno pomoću Topcount (Perkin Elmer). Aktivnost kinaze je izračunata oduzimanjem otkucaja u minuti (cpm) dobijenih u prisustvu inhibitora pozitivne kontrole (10 µM staurosporin) cpm dobijenog u prisustvu nosioca. Mogućnost testiranog jedinjenja da inhibira ovu aktivnost se određuje kao:

[0164] Serije doza razblaživanja su pripremljene za jedinjenja omogućavajući tako testiranje efekata doza-odgovor u testu JAK1 i obračun IC50za svako jedinjenje. Svako jedinjenje je rutisnki testirano u koncentraciji od 20µM praćeno sa 1/3 serijskog razblaživanja, 8 poena (20µM - 6.67µM - 2.22µM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM) u finalnoj koncentraciji od 1% DMSO. Kako je potencijal serije jedinjenja povećan, pripremljeno je još razblaživača i/ili je najviša koncentracija smanjena (npr.5 µM, 1 µM).

[0165] Sledeća jedinjenja bila su testirana za aktivnost protiv JAK1 i IC50vrednosti, kao što je određeno upotrebom testova opisanih ovde, date su ispod u Tabeli IIIA.

Tabela IIIA: JAK1 Vrednosti Jedinjenja

1.2 JAK1 Ki test određivanja

[0166] Za određivanje Ki, različite količine jedinjenja su mešane sa enzimom i enzimska reakcija je praćena sa funkcijom ATP koncentracije. Ki je određen pomoću duplog recipročnog obeležavanja Km protiv jedinjenja koncentracije (Lineweaver-Burk plot).1 ng JAK1 (Invitrogen, PV4774) je upotrebljeno u testu. Supstrat je bio 50nM Ulight-JAK-1 (Tyr1023) Peptid (Perkin Elmer, TRF0121). Reakcija je izvođena u 25mM MOPS pH 6.8, 0.01%, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2Brij-35 sa variranjem koncentracija ATP i jedinjenja.

Fosforilisani supstrat je meren korišćenjem Eu-obeleženog anti-fosfotiroznog antitela PT66 (Perkin Elmer, AD0068). Očitavanje je izvođeno na pokazivaču (Perkin Elmer) sa eksitacijom od 320 nm i emisijom praćenom na 615 nm i 665 nm.

[0167] Na primer, kada je Ilustrativno Jedinjenje 1 testirano u ovom testu, izmerena je Ki vrednost od 39 nM.

1.3 JAK2 test inhibicije

[0168] Rekombinantni ljudski JAK2 katalitički domen (amino kiseline 808-1132; kataloški broj PV4210) je kupljen od Invitrogena.0.025mU JAK2 je inkubirano sa 2.5 µg polyGT supstrata (Sigma kataloški broj P0275) u puferu reakcione kinaze (5 mM MOPS pH 7.5, 9 mM MgAc, 0.3mM EDTA, 0.06% Brij i 0.6 mM DTT, 1 µM neradioaktivni ATP, 0.25 µCi<33>P-gama-ATP (GE Healthcare, kataloški broj AH9968) finalna koncentracija) sa ili bez testa koji sadrži 5µL jedinjenja ili nosioca (DMSO, 1% finalna koncentracija) u ukupnoj zapremini od 25µL u polipropilenskoj posudi sa 96 otvora (Greiner, V-dno). Nakon 90 minuta na 30 °C, reakcija je zaustavljena dodavanjem 25 µL/otvora od150 mM fosforne kiseline. Svaka od zaustavljenih reakcija kinaze je premeštena do filtracionih posuda sa 96 otvora (25 µL/otvoru od 150 mM) za prethodno ispiranje (Perkin Elmer kataloški broj 6005177) upotrebom sakupljača ćelija (Perkin Elmer). Ploče su ispirane 6 puta sa 300 µL po otvoru od 75 mM fosforne kiseline i dno ploča je zatvoreno i očitavanje je izvedeno upotrebom Topcount (Perkin Elmer). Aktivnost kinaze je izračunata oduzimanjem otkucaja po minutu (cpm) dobijenih u prisustvu inhibitora pozitivne kontrole (10 µM staurosporin) od cpm dobijenog u prisustvu nosioca. Sposobnost testiranog jedinjenja da inhibira ovu aktivnost je određena kao:

[0169] Serije doza razblaživanja su pripremljene za jedinjenja omogućavajući testiranje efekata doza-odgovor u JAK2 testovima i računanje IC50za svako jedinjenje. Svako jedinjenje je rutinski testirano u koncentraciji od 20µM praćeno sa 1/3 serijskim razblaživanjem, 8 poena (20µM - 6.67µM - 2.22µM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM -9nM) u finalnoj koncentraciji od 1% DMSO. Kada potencijal serije jedinjenja poraste, pripremljeno je više razblaživača i/ili je najveća koncentracija smanjena (npr.5 µM, 1 µM).

[0170] Sledeća jedinjenja su bila testirana za aktivnost protiv JAK2 i IC50vrednosti, kao što je određeno upotrebom testova opisanih ovde, su date ispod u Tabeli IIIB.

TABELA IIIB: JAK2 IC50 Vrenosti Jedinjenja

1.4 JAK2 test Kd određivanja

[0171] JAK2 (Invitrogen, PV4210) je upotrebljen u finalnoj koncentraciji od 5 nM.

Eksperiment vezivanja je izveden u 50 mM Hepes pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA upotrebom 25nM trasera kinaze 236 (Invitrogen, PV5592) i 2 nM Eu-anti-GST (Invitrogen, PV5594) sa variranjem koncentracija jedinjenja. Detekcija trasera je izvedena prema postupku proizvođača.

[0172] Na primer, kada je Ilustrativno Jedinjenje 1 testirano u testu, izmerena je Kd vrednost od 205 nM.

1.5 JAK3 test inhibicije

[0173] Rekombinantni ljudski JAK3 katalitički domen (aminokiseline 781-1124; kataloški broj PV3855) je kupljen od Invitrogena.0.025mU of JAK3 je inkubiran sa 2.5 µg poliGT substrata (Sigma kataloški broj P0275) u reakcionom puferu kinaze (25 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM EGTA, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM b-glicerolfosfat, 0.01% Triton Ks-100, 1 µM neradioaktivni ATP, 0.25 µCi 33P-gama-ATP (GE Healthcare, kataloški broj AH9968) finalne koncentracije) sa ili bez 5µL sadrže test jedinjenje ili nosilac (DMSO, 1% finalna koncentracija), u ukupnoj zapremini od 25 µL, u polipropilensku posudu sa 96 otvora (Greiner, V-dno). Posle 105 min na 30 °C, reakcija je zaustavljena dodavanjem 25 µL/otvoru 150 mM fosforne kiseline. Čitava okončana reakcija kinaze je prebačena u prethodno ispranu (75 mM fosforne kiseline) posudu sa 96 otvora (Perkin Elmer kataloški broj 6005177) korišćenjem sakupljača ćelija (Perkin Elmer). Posude su isprane 6 puta sa 300 µL rastvora 75 mM fosforne kiseline po otvoru i dno ploče bilo je zapečaćeno.40 µL/otvoru Microscint-20 se doda, vrh posude se zatvori i očitavanje je izvedeno korišćenjem TopCount (Perkin Elmer). Aktivnost kinaze je izračunata oduzimanjem otkucaja u minuti (cpm) dobijenih u prisustvu inhibitora pozitivne kontrole (10 µL staurosporina) iz cpm dobijenog u prisustvu nosioca. Sposobnost testiranog jedinjenja da inhibira ovu aktivnost je određena kao:

[0174] Serije doza razblaživanja su pripremljene za jedinjenja omogućavajući testiranje efekata doza-odgovor u JAK3 testovima i računanje IC50za svako jedinjenje. Svako jedinjenje je rutinski testirano u koncentraciji od 20µM praćeno sa 1/3 serijskim razblaživanjem, 8 poena (20µM - 6.67µM - 2.22µM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM -9nM) u finalnoj koncentraciji od 1% DMSO. Kada potencijal serije jedinjenja poraste, pripremljeno je više razblaživača i/ili je najveća koncentracija smanjena (npr.5 µM, 1 µM).

[0175] Sledeća jedinjenja su bila testirana na aktivnost protiv JAK3 i IC50vrednosti, kao što je određeno upotrebom testova opisanih ovde, date su ispod u Tabeli IIIC.

TABELA IIIC: JAK3 IC50 Vrednosti Jedinjenja

1.6 JAK3 test Ki određivanja

[0176] Za određivanje Ki, različite količine jedinjenja su mešane sa enzimom i enzimska reakcija je praćena sa funkcijom ATP koncentracije. Ki je određen pomoću duplog recipročnog iscrtavanja Km protiv koncentracije jedinjenja (Lineweaver-Burk plot). JAK3 (Carna Biosciences, 09CBS-0625B) je upotrebljen u finalnoj koncentraciji do 10 ng/ml. Supstrat je bio Poly(Glu,Tyr)natrijumova so (4:1), MW 20000 - 50000 (Sigma, P0275). Reakcija je izvedena u 25 mM Tris pH 7.5 , 0.01% Triton X-100 , 0.5mM EGTA, 2.5mM DTT, 0.5mM Na3VO4, 5mM b-glicerolfosfatu, 10mM MgCl2sa variranjem koncentracija ATP i jedinjenja i zaustavljen je dodavanjem 150 mM fosforne kiseline. Merenje inkorporiranog fosfata u polyGT supstratu je odrađeno dodavanjem uzoraka na filtracionu posudu (upotrebom sakupljača, Perkin Elmer) i potom ispiranjem. Inkorporirani<33>P u polyGT je izmeren u Topcount scintilacionom brojaču nakon dodavanja scintilacione tečnosti filtracionim posudama (Perkin Elmer).

[0177] Na primer, kada je Ilustrativno Jedinjenje 1 testirano u testu, izmerena je Ki vrednost od 353 nM.

1.7 TYK2 test inhibicije

[0178] Rekombinantni ljudski TYK2 katalitički domen (amino kiseline 871-1187; kataloški broj 08-147) je kupljen od Carna biosciences. TYK2 od 5 ng je inkubiran sa 12.5 µg polyGT supstrata (Sigma kataloški broj P0275) u puferu reakcione kinaze (25 mM Hepes pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2 mM Na3VO4, 0.1% NP-40, 0.1 µM neradioktivni ATP, 0.125 µCi<33>P-gama-ATP (GE Healthcare, kataloški broj AH9968) finalna koncentracija) sa ili bez testa koji sadrži 5µL jedinjenja ili nosioca (DMSO,1 % finalne koncentracije), u ukupnoj zapremini od 25µL u polipropilenskoj posudi sa 96 otvora (Greiner, V-dno). Nakon 90 minuta na 30 °C, reakcije su zaustavljene dodavanjem 25 µL/otvoru 150 mM fosforne kiseline. Sve zaustavljene reakcije kinaze su premeštene do filtracionih posuda sa 96 otvora (Perkin Elmer kataloški broj 6005177) za prethodno ispiranje (75 mM fosforna kiselina) korišćenjem sakupljača ćelija (Perkin Elmer). Posude su isprane 6 puta sa 300 µL po otvoru sa 75 mM rastvora fosforne kiseline i dna posuda su zatvorena. 40 µL/otvoru Microscint-20 je dodato, vrhovi posuda su zatvoreni i očitavanje je izvedeno pomoću Topcount (Perkin Elmer).

Aktivnost kinaze je izračunata oduzimanjem otkucaja po minutu (cpm) dobijenih u prisustvu pozitivnih kontrolnih inhibitora (10 µM staurosporin) od cpm dobijenog u prisustvu nosioca. Mogućnost jedinjenja u testu da inhibira ovu aktivnost se određuje kao:

[0179] Serije doza razblaživanja su pripremljene za jedinjenja omogućavajući testiranje dozaodgovor efekata u TYK2 testovima i računanje IC50za svako jedinjenje. Svako jedinjenje je rutinski testirano u koncentraciji od 20µM praćeno sa 1/3 serijskim razblaživanjem, 8 tačaka (20µM - 6.67µM - 2.22µM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM) u finalnoj koncentraciji od 1% DMSO. Kada potencijal serije jedinjenja poraste, pripremljeno je više razblaživača i/ili je najveća koncentracija smanjena (npr.5 µM, 1 µM).

[0180] Sledeća jedinjenja su bila testirana na aktivnost protiv TYK2; i IC50vrednosti, kao što je određeno upotrebom testova opisanih ovde, date su ispod u Tabeli IIID.

TABELA IIID: TYK2 IC50 Vrednosti Jedinjenja

1.8 TYK2 test Kd određivanja

[0181] TYK2 (Carna Biosciences, 09CBS-0983D) je upotrebljen u finalnoj koncentraciji od 5 nM. Eksperiment vezivanja je izveden u 50 mM Hepes pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA koristeći 50 nM trasera kinaze 236 (Invitrogen, PV5592) i 2 nM Euanti-GST (Invitrogen, PV5594) sa variranjem koncentracija jedinjenja. Detekcija trasera je izvedena prema procedurama proizvođača.

[0182] Na primer, kada je Ilustrativno Jedinjenje 1 testirano u testu, izmerena je Kd vrednost od 376 nM.

Primer 2. Ćelijski testovi:

2.1 JAK-STAT testovi signalizacije:

[0183] HeLa ćelije su dobijene u Dulbecco's Modified Eagle's medijumu (DMEM) koji sadrži 10% toplote inaktiviranog fetalnog seruma, 100 U/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina. HeLa ćelije su upotrebljene od 70% prirasta za transfekciju. 20,000 ćelija u 87 µL medijuma ćelijske kulture su prelazno transfekovane sa 40 ng pSTAT1(2)-luciferaze izveštaja (Panomics), 8 ng od LacZ izveštaj kao unutrašnji kontrolni izveštaj i 52 ng pBSK-a korišćenjem 0.32 µL Jet-PEI (Polyplus) kao reagensa transfekcije u formatu sa pločom sa 96 otvora. Posle inkubacije preko noći na 37°C, 10% CO2, uklonjen je medijum transfekcije. 75 µL of DMEM 1.5% toplote inaktiviranog fetalnog seruma je dodato.15 µL jedinjenja u 6.7 x koncentraciji je dodato tokom 60 minuta i zatim je 10 µL ljudskog OSM (Peprotech) na 33 ng/mL finalne koncentracije.

[0184] Sva jedinjenja su bila testirana dva puta počevši od 20 µM praćenim sa 1/3 serijskim rastvaračem, 8 doza ukupno (20 µM - 6.6 µM - 2.2 µM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM -9 nM) u finalnoj koncentraciji od 0.2% DMSO.

[0185] Nakom inkubacije preko noći na 37°C, 10% CO2ćelije su lizirane u 100 µL liza baferu/otvoru (PBS, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5% Trehaloze, 0.025% Tergitol NP9, 0.15% BSA).

[0186] 40 µL ćelijskog lizata je upotrebljeno kako bi se očitala aktivnost β-galaktozidaze dodavanjem 180 µL β-Gal rastvora (30µl ONPG 4mg/mL 150 µL bafera β-Galaktozidaze (0.06 M Na2HPO4, 0.04 M NaH2PO4, 1 mM MgCl2)) u toku 20 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µL Na2CO31 M. Apsorbancija je očitana na 405 nm.

[0187] Aktivnost luciferaze je izmerena koristeći 40 µL ćelijskog lizata plus 40 µL Steadylite<®>kao što je opisano od strane proizvođača (Perkin Elmer) na Envision (Perkin Elmer).

[0188] 10 µM pan-JAK inhibitora je upotrebljeno kao pozitivnog kontrolora (100% inhibicije). Kao negativni kontrolor je upotrebljeno 0.5% DMSO (0% inhibicije). Pozitivne i negativne kontrole su upotrebljene kako bi se izračunale z' i 'procenat inhibicije' (PIN) vrednosti.

[0189] PIN vrednosti su ispisane za jedinjenja u doza-odgovor i EC50vrednosti su dobijene.

TABELA IV

Primer 2.2 OSM/IL-1β test signalizacije

[0190] OSM i IL-1β su prikazani da sinergijski dodatno regulišu MMP13 nivoe u ljudskoj hondrosakromskoj ćelijskoj liniji SW1353- Ćelije su posejane u pločama sa 96 otvora sa 15,000 ćelija/otvoru u zapremini od 120 µL DMEM (Invitrogen) koji sadrži 10% (v/v) FBS i 1% penicilin/streptomicin (InVitrogen) inkubiran na 37°C 5% CO2. Ćelije su prethodno inkubirane sa 15 µL jedinjenja u M199 medijumu sa 2% DMSO, 1 sat pre izazivanja sa 15 µL OSM i IL-1β kako bi se dostiglo 25 ng/mL OSM i 1 ng/mL IL-1β, i MMP13 nivoi su izmerene u kondicioniranom medijumu, 48 sati nakon izazivanja. MMP13 aktivnost je izmerena pomoću hvatanja antitela testa aktivnosti. Za ovu svrhu, 384 ploča sa otvorima (NUNC, 460518, MaxiSorb black) su premazane sa 35 µL od 1.5 µg/mL rastvorom antiljudskim MMP13 telima (R&D Systems, MAB511) na 24 časa na 4°C. Nakon ispiranja otvora, 2 puta sa PBS 0.05% Tween, ostatak preostalih veziva je blokiran sa 100 µL 5% bezmasnim suvim mlekom (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) u PBS na 24 sata na 4°C. Sledeće, otvori su isprani dva puta sa PBS 0.05% Tween i 35 µL od 1/10 rastvarača supernatantne kulture koja sadrži MMP13 u 100-struko razblaženom blokirajućem baferu je dodato i inkubirano 4 sata na sobnoj temperaturi. Sledeće, otvori su isprani dva puta sa PBS 0.05% Tween a potom sa MMP13 aktivacijom uz dodavanje 35 µL 1.5 mM 4-Aminofenilživin acetata (APMA) (Sigma, A9563) rastvor i inkubacija na 37 °C tokom jednog časa. Otvori su isprani ponovo sa PBS 0.05% Tween i 35 µL MMP13 supstrat (Biomol, P-126, OmniMMP fluorogenog supstrata) je dodat. Nakon inkubacije tokom 24 časa na 37°C fluorescencija pretvorenih podloga (supstrata) je izmerena u Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 Multilabel Reader (talasna dužina pobude: 320 nm, talasna dužina emisije: 405 nm).

[0191] Na primer, kada je testirano Ilustrativno Jedinjenje 1 u ovom testu, EC50vrednost od 2242.5 (±1098.5) nM je izmerena.

Primer 2.3 PBL Test proliferacije

[0192] Ljudski limfociti periferne krvi (PBL) su stimulisani sa IL-2 i proliferacija je merena korišćenjem BrdU testa inkorporacije. PBL su prvo stimulisani tokom 72 časa sa PHA kako bi izazvali IL-2 receptor, a zatim su ubrzani na 24 časa kako bi se zaustavila ćelijska proliferacija praćena sa IL-2 stimulacijom tokom 72 časa (uključujući 24 časa BrdU obeležavanje). Ćelije su prethodno inkubirane sa jedinjenjima iz testa 1 pre dodavanja IL-2. Ćelije su kultivisane u RPMI 1640 koji sadrži 10% (v/v) FBS.

Primer 2.4 Potpuni test krvi (WBA)

2.4.1 IFNα stimulacioni protokol

[0193] Kako bi se predvideo potencijal jedinjenja iz testa inhibicije JAK1 ili JAK2-zavisnih signalnih puteva in vivo, fiziološki relevantni in vitro model je razvijen korišćenjem ljudske krvi. U testu WBA, krv, uzeta iz ljudskih dobrovoljaca koji su dali pristanak po obaveštenju, tretirana je ex vivo sa jedinjenjem (1 čas) i potom je stimulisana ili na 30 minuta sa interferonom α (IFNα, JAK1 zavisni put), ili na 2 sata sa granulocitnim makrofažomkolonom stimulišućim faktorom (GM-CSF, JAK2 zavisni put).

2.4.1.1 Fosfo - STAT1 test

[0194] Za IFNα stimulaciju, povećanje fosforilacije signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije 1 (pSTAT1) pomoću INFα u ekstraktima belih krvnih zrnaca je izmereno korišćenjem testa pSTAT1 ELISA. Fosforilaciju signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije 1 (STAT1) nakon okidanja interferona alfa (INFα) je događaj posredovan sa JAK1. Fosfo-STAT1 test, koji je korišćen za merenje nivoa fosfo-STAT1 u ćelijskim ekstraktima, je razvijen da proceni sposobnost jedinjenja da inhibira JAK1-zavisne signalne puteve.

[0195] Ljudska krv, dobijena je od ljudi dobrovoljaca koji su dali svoj pristanak, bila je ex vivo tretirana sa jedinjenjem (1h) i potom stimulisana 30 minuta sa IFNα. Povećanje fosforilacije STAT1 od strane IFNα u ekstraktima belih krvnih zrnaca je izmerena korišćenjem fosfo-STAT1 ELISA.

[0196] ACK liza pufera sastoji se iz 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA. pH pufera bio je 7.3.

[0197] Liza 10x ćelija koncentrat pufera (deo PathScan Phospho-STAT1 (Tir701) sendvič ELISA komplet iz Cell Signalling) je razblažen 10 puta u H2O. Inhibitori proteinaze su dodati u pufer pre upotrebe.

[0198] 20 mg IFNα se rastvori u 40 µL H2O kako bi se dobilo 500 µL/mL skladišnog rastvora. Skladišni rastvor se čuva na -20 °C.

[0199] Trostruka serija razblaživanja jedinjenja je pripremljena u DMSO (najvećom koncentracijom: 10 mM). Nakon toga, jedinjenje je dalje razblaženo u medijumu (faktor razblaženja zavisi od željene finalne koncentracije jedinjenja).

2.4.1.1.1 Inkubacija krvi sa jedinjenjem i stimulacije sa IFNα

[0200] Ljudska krv je sakupljena u hepariniziranim epruvetama. Krv je podeljena na alikvote od 392 µL. Nakon toga, 4 µL razblaženja jedinjenja je dodato u svaku alikvotu i uzorci krvi su inkubirani 1 h na 37 °C. IFNα rastvor se razblaži 1000 puta u RPMI medijumu da bi se dobilo 500 ng/mL radnog rastvora.4 µL 500 ng/mL radnog rastvora dodato je uzorcima krvi (krajnja koncentracija IFNα: 5NG/ml). Uzorci su inkubirani na 37 °C tokom 30 min.

2.4.1.1.2 Priprema ekstrakta ćelija

[0201] Na kraju perioda stimulacije, 7.6 mL ACK pufera se doda uzorcima krvi za lizu crvenih krvnih zrnaca. Uzorci su pomešani obrtanjem epruvete pet puta i reakcija se inkubira na ledu tokom 5 minuta. Lize RBC moraju biti prisutne tokom inkubacije. Ćelije su sabijene u kuglice centrifugiranjem na 300 g, 4 °C tokom 7 minuta i supernatant je uklonjen.10 mL 1x PBS se doda u svaku epruvetu i ćelijski pelet se ponovo suspenduje. Uzorci se ponovo centrifugiraju tokom 7 minuta na 300 g, 4 °C. Supernatant je uklonjen i talog ponovo suspendovan u 500 µL 1x PBS. Zatim je suspenzija ćelija je prebačena u čistu 1.5 mL mikrocentrifugugalnu cev. Ćelije su sabijene u kuglice centrifugiranjem na 700 g tokom 5 min na 4 °C. Supernatant je uklonjen i talog je rastvoren u 150 µL pufera za lizu ćelija.

Uzorci su inkubirani na ledu 15 minuta. Nakon toga, uzorci su čuvani na -80 °C do dalje prerade.

2.4.1.1.3 Merenje STAT1 fosforilacije pomoću ELISA

[0202] The Pathscan Phospho-STAT1 (Tir701) sendvič ELISA komplet iz signaliziranja ćelija (Cat.n°: #7234) je korišćen za određivanje nivoa fosfo-STAT1.

[0203] Ekstrakti ćelija su odmrznuti na ledu. Epruvete su centrifugirane tokom 5 minuta na 16,000 g, 4 °C, a očišćeni lizati su sakupljeni. U međuvremenu, trake mikrootvora iz kompleta se uravnoteže do sobne temperature i pufer za pranje je pripremljen razblaživanjem 20 x puferom za ispiranje u H20. Uzorci su razblaženi 2 puta u razblaživača uzorka i 100 µL se doda trakama mikrootvora. Trake su inkubirane preko noći na 4 °C.

[0204] Sledeći dan, ležišta su isprana 3 puta sa puferom za ispiranje.100 µL antitela za detekciju se doda u otvore. Trake su inkubirane na 37 °C tokom 1 h. Zatim su ležišta ponovo isprana 3 puta sa puferom za ispiranje.100 µL HRP-povezanog sekundarnog antitela je dodato u svaki otvor, a uzorci su inkubirani na 37 °C. Posle 30 minuta, pregrade su ponovo isprane 3 puta i 100 µL TMB supstrata je dodato u sve otvore. Kada uzorci postanu plavi, 100 µL STOP rastvora je dodato da se zaustavi reakcija. Apsorpcija se meri na 450 nm.

2.4.1.2 Analiza podataka

[0205] Inhibicija phosphoSTAT1 indukcije pomoću IFNα u ekstraktima ćelija se određuje prema koncentraciji jedinjenja i IC50vrednosti su izvedene korišćenjem Graphpad softvera. Podaci su zadržani ako je R<2>veći od 0,8 i nagib je bio manji od 3.

2.4.1.2 IL-8 ELISA

[0206] Za GM-CSF stimulaciju, povećanje nivoa interleukina-8 (IL-8) u plazmi se meri korišćenjem IL-8 ELISA testa. Granulocitne makrofag-kolonije faktor stimulacije (GM-CSF) - indukovani interleukin 8 (IL-8) izraz je događaj posredovan sa JAK2. IL-8 ELISA, koji se može koristiti za merenje IL-8 nivoa u uzorcima plazme, je razvijen da proceni sposobnost jedinjenja da inhibira JAK2-zavisne signalne puteve.

[0207] Ljudska krv, dobijena iz ljudi volontera koji su dali pristanak je ex vivo tretirana sa jedinjenjem (1H) i zatim stimulisana tokom 2 h uz GM-CSF. Porast IL-8 nivoa u plazmi se meri korišćenjem IL-8 ELISA testa.

[0208] 10 µg GM-CSF je rastvoren u 100 µg H2O dobiti 100 µg/mL skladišnog rastvora. Skladišni rastvor se čuva na -20 °C.

[0209] Trostruka serija razblaživanja testiranog jedinjenja je pripremljena u DMSO (najvećom koncentracijom: 10 mM). Nakon toga, jedinjenje se dalje razblaži u medijumu (faktorom razblaženja koji zavisi od željene finalne koncentracije jedinjenja).

2.4.1.2.1 Inkubacija krvi sa jedinjenjem i stimulacija sa GM-CSF

[0210] Ljudska krv je sakupljena u hepariniziranim epruvetama. Krv je podeljena na alikvote od 245 µg. Nakon toga, 2.5 µg test jedinjenja razblaženja je dodat u svaku alikvotu a uzorci krvi se inkubiraju 1 h na 37 °C. GM-CSF rastvor se je razblažen 100 puta u RPMI medijumu za dobijanje 1 µg/mL radnog rastvora.2.5 µg 1 µg/ml radnog rastvora se dodaje uzorcima krvi (krajnja koncentracija GM-CSF: 10 µg/mL). Uzorci su inkubirani na 37 °C tokom 2 h.

2.4.1.2.2 Priprema uzoraka plazme

[0211] Uzorci se centrifugiraju 15 minuta na 1000 g, 4 °C.100 µg plazme se sakupi i skladišti se na -80 °C do daljeg korišćenja.

2.4.1.2.3 Merenje IL-8 nivoa pomoću ELISA

[0212] Hemiluminiscentna imunoanalizirajuća oprema za ljudski IL-8 od R & D Sistems (Cat.n °: K8000B) se koristi za određivanje IL-8 nivoa.

[0213] Pufer za ispiranje je pripremljen razblaživanjem 10 x pufera za ispiranje u H2O.

Radni glo reagens se dobija dodavanjem 1 dela Glo reagensa 1 do 2 dela Glo reagensa B 15 min do 4 h pre upotrebe.100 µg test razblaživača RD1-86 se doda u svaki otvor. Nakon toga, dodaje 50 µL uzorka (plazma). ELISA posuda je inkubirana tokom 2 h na sobnoj temperaturi, 500 rpm. Sve ležišta su isprana 4 puta sa puferom za ispiranje i 200 µL IL-8 konjugat se doda u svaki otvor. Posle inkubacije od 3 h na sobnoj temperaturi, otvori su isprani 4 puta sa puferom za ispiranje i 100 µL radnog glo reagensa se dodaje u svaki otvor. ELISA posuda je inkubirana tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi (zaštićeno od svetlosti). Osvetljenost se meri (0,5 s/otvor očitano vreme).

2.4.1.3 Rezultati

[0214] Na primer, kada je prati ovaj protokolu pIC50jedinjenja 1 za inhibiranje INFα indukovano povećanje nivoa pSTAT1 je bio 6,23 ± 0,15 (SEM). Ovo pokazuje da Ilustrativno Jedinjenje 1 snažno inhibira JAK1 put u fiziološkom okruženju.

2.4.2 IL-6 stimulacioni protokol

[0215] Pored toga, analiza protočne citometrije je izvedena da se uspostavi JAK1 nad JAK2 selektivnost jedinjenjima ex vivo koristeći ljudsku krv. Zbog toga, krv je uzeta iz ljudi volontera koji su dali pristanak. Krv je nakon toga uravnotežena 30 minuta na 37 °C uz blago ljuljanje, potom alikvotovana u Eppendorf epruvetama. Jedinjenju je dodat u različitim koncentracijama i inkubiran na 37 °C tokom 30 minuta pod blagim ljuljanjem i naknadno stimulisana 20 minuta na 37 °C pod blagim ljuljanjem sa interleukinom 6 (IL-6) za JAK1 zavistan prolaz kada stimulacije ili GM-CSF za JAK2-zavisni put stimulacije. Fosfo-STAT1 i fosfo-STAT5 su zatim procenjivani korišćenjem FACS analize.

2.4.2.1 fosfo-STAT1 eseji

[0216] Za IL-6-stimulisanje povećanjem pretvarača signala i aktivatora transkripcije 1 (pSTAT1) fosforilacije kod belih krvnih zrnaca, ljudskoj krvi, preuzet iz ljudi volontera koji su dali pristanak, je ex vivo tretiran sa jedinjenjem tokom 30 minuta a zatim stimulisana tokom 20 minuta sa IL-6. Povećanje fosforilacije STAT1 sa IL-6 u limfocitima je mereno korišćenjem anti fosfo-STAT1 antitela sa FACS.

[0217] The 5X Lyse/Fix pufer (BD PhosFlov, Kat. N °558049) je razblažen 5-puta sa destilovanom vodom i prethodno zagrejan na 37 °C. Preostali razblaženi Lyse/Fix pufer je odbačen.

[0218] 10 µL rhlL-6 (R & D Sistems, Kat N °206-IL) je rastvoren u 1 ml PBS 0,1% BSA dobijanja 10 µL/mL skladišnog rastvor. Ovaj rastvor je alikvotiran i čuvan na -80 °C.

[0219] Trostruka serija razblaživanja jedinjenja je pripremljena u DMSO (10 mM matični rastvor). Kontrolni uzorci tretirani su primili DMSO umesto jedinjenja. Svi uzorci su inkubirani sa 1% krajnje koncentracije DMSO.

2.4.2.1.1 Inkubacija krvi sa jedinjenjem i stimulacije sa IL-6

[0220] Ljudska krv je sakupljena u hepariniziranim epruvetama. Krv je podeljena po alikvotama 148.5ml. Zatim 1,5 µl testiranog jedinjenja za razblaživanje je dodato svakoj alikvoti krvi i uzorci krvi su inkubirani tokom 30 min na 37 °C pod blagim ljuljanjem. IL-6 rastvor (1.5ml) je dodat uzorcima krvi (konačna koncentracija 10 µL/ml) i uzorci su inkubirani na 37 °C tokom 20 min pod blagim ljuljanjem.

2.4.2.1.2 Priprema belih krvih zrnaca i CD4 označavanje

[0221] Na kraju perioda stimulacije, 3ml 1X prethodno zagrejanog Lyse/Fix pufera odmah se doda uzorcima krvi, kratko se vrti i inkubira tokom 15 minuta na 37 °C u vodenom kupatilu kako bi vršili lizu crvenih krvnih zrnaca i fiksirali leukocite, zatim se zamrznu na -80 °C do daljeg korišćenja.

[0222] Za sledeće korake, epruvete su odmrznute na 37 °C približno 20 minuta i centrifugirane tokom 5 minuta na 400kg na 4 °C. Ćelijski pelet se ispere sa 3ml hladnog 1X PBS, a nakon centrifugiranja ćelijski pelet se ponovo suspenduje u 100 PBS koji sadrži 3% BSA. FITC-konjugovanog anti-CD4 antitela ili kontrola FITC-konjugovanim izotipa antitela su dodati i inkubirani tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, u mraku.

2.4.2.1.3 Permeabilnost ćelija i etiketiranje sa anti fosfo-STAT1 antitelom

[0223] Posle ispiranja ćelije sa 1X PBS, ćelijski pelet se ponovo suspenduje u 100µl ledeno hladnog 1X PBS i 900ml ledeno hladnog 100% metanola se dodaje. Ćelije su zatim inkubirane na 4 °C u trajanju od 30 minuta za permeabilizaciju.

[0224] Permeabilizovane ćelije su zatim isprane sa 1X PBS koje sadrži 3% BSA i konačno se resuspenduju u 80µl od 1X PBX koji sadrži 3% BSA.

[0225] 20 µl PE mišjim anti-STAT1 (pI701) ili PE miša IgG2aκ kontrolnog izotip antitela (BD Biosciences, Kat. N °612564 i 559319, respektivno) su dodati i mešani, zatim inkubirani na 30 min na 4 °C, u mraku.

[0226] Ćelije su zatim isprane jednom sa 1X PBS i analizirane su na tok FACSCanto II sitometrije (BD Biosciences).

2.4.2.1.4 Analiza fluoroscencije FACSCanto II

[0227] 50.000 ukupno izbrojanih događaja i Phospho-STAT1 pozitivnih ćelija je mereno posle zaustavljanja na CD4 ćelija vratima limfocita. Podaci su analizirani korišćenjem softvera FACSDiva i procenat inhibicije IL-6 stimulacije je izračunat na procentu pozitivnih ćelija za fosfo-STAT1 na CD4 ćelije.

2.4.2.2 Fosfo-STAT5 test

[0228] Za GM-CSF-stimulisano povećanje signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije 5 (pSTAT5) fosforilacije kod belih krvnih zrnaca, ljudskoj krvi, preuzet iz ljudi volontera koji su dali pristanak je ex vivo tretiran sa jedinjenjem tokom 30 minuta i naknadno stimulisan tokom 20 minuta sa GM-CSF. Povećanje fosforilacije STAT5 od strane GM-CSF u monocitima se meri korišćenjem anti fosfo-STAT5 antitela sa FACS.

[0229] 5X Lyse/Fix pufer (BD PhosFlov, Kat. N °558049) je razblažen 5-puta sa destilovanom vodom i prethodno zagrejan na 37 °C. Preostali razblaženi Lyse/Fix pufer je odbačen.

[0230] 10 µg rhGM-CSF (AbCis S.A., Kat N °P300-03) je rastvoreno u 100µl PBS 0,1% BSA da dobije 100 µg/mL skladišnog rastvor. Osnovni rastvor se čuva alikvotiran na -80 °C.

[0231] Trostruka serija razblaživanja jedinjenja je pripremljena u DMSO (10 mM skladišni rastvor). Kontrolni uzorci dobijaju DMSO bez testiranog jedinjenja. Svi uzorci se inkubiraju sa 1% krajnje koncentracije DMSO.

2.4.2.2.1 Inkubacija krvi sa jedinjenjem i stimulacije sa GM-CSF

[0232] Ljudska krv je sakupljena u hepariniziranim epruvatama. Krv je podeljena na alikvote 148.5ml. Zatim 1.5 µl razblaženja jedinjenja je dodato u svaku alikvotu a uzorci krvi se inkubiraju 30 minuta na 37 °C pod blagim ljuljanjem. GM-CSF skladišni rastvor (1.5ml) dodaje se uzorcima krvi (krajnja koncentracija 20pg/ml) i uzorci su inkubirani na 37 °C tokom 20 minuta pod blagim ljuljanjem.

2.4.2.2.2 Priprema belih krvnih zrnaca i CD14 označavanje

[0233] Na kraju perioda stimulacije, 3ml of 1X prethodno zagrejanog Lyse/Fix pufera se dodaje neposredno uzorcima krvi, vrti se kratko i inkubiran je tokom 15 minuta na 37 °C u vodenom kupatilu kako bi lizu crvenih krvnih zrnaca i fiksirao leukocite, zatim zamrznuti na -80 °C do daljeg korišćenja.

[0234] Za sledeće korake, cevi su odmrznute na 37 °C približno 20 minuta i centrifugirane tokom 5 min na 400xg na 4 °C. Ćelijski pelet se ispere sa 3ml hladnog 1X PBS, a nakon centrifugiranja, ćelijski pelet se ponovo suspenduje u 100µl PBS koji sadrži 3% BSA. FITC mišjeg anti-CD14 antitela (BD Biosciences, Kat. N °345784) ili kontrolnim FITC miša IgG2bκ izotipa antitela (BD Biosciences, Kat. N °555057) dodaju i inkubiraju 20 minuta na sobnoj temperaturi, u mraku.

2.4.2.2.3 Permeabilizacija ćelija i etiketiranje sa anti fosfo-STAT5 antitelom

[0235] Posle ispiranja ćelije sa 1X PBS, talog ćelija je resuspendovan u 100µl ledeno hladnog 1X PBS i 900ml ledeno hladnog 100% metanola se dodaje. Ćelije su zatim inkubirane na 4 °C u trajanju od 30 minuta za permeabilizaciju.

[0236] Permeabilizovane ćelije su zatim isprane sa 1X PBS koji sadrži 3% BSA i konačno resuspenduju u 80ml od 1X PBKS koji sadrži 3% BSA.

[0237] Dodaje se 20µL PE mišjeg anti-STAT5 (pI694) ili PE mišjeg IgG1κ kontrolnog izotipa antitela (BD Biosciences, Kat. N °612567 i 554680, respektivno) se dodaje i meša zatim su inkubirane tokom 30 minuta na 4 °C, u mraku.

[0238] Ćelije su zatim isprane jednom sa 1X PBS i analizirane na tok FACSCanto II citometra (BD Biosciences).

2.4.2.2.4 Analiza fluorescencije FACSCanto II

[0239] Izbrojano je ukupno 50.000 događaja i Phospho-STAT5 pozitivne ćelije se mere nakon zaustavljanja na CD14+ ćelijama. Podaci su analizirani korišćenjem FACSDiva softvera i odgovaraju procentu inhibicije GM-CSF stimulacije računato na procenat pozitivnih ćelija za fosfor-STAT5 na CD14+ ćelijama.

2.4.2.2 Rezultati

[0240] Kada se prati ovaj protokol, procenat inhibicije (PIN) dobijen prosekom od 3 zdrava dobrovoljca je određen za svaki test jedinjenja. Na primer, Ilustrativno Jedinjenje 1 je testirano i dobijeno je pIC50= 6.08 u inhibiciji fosforilacije STAT1.

Primer 3. In vivo modeli

Primer 3.1 CIA model

3.1.1 Materijali

[0241] Kompletan Freund-ov katalizator (CFA) i nekompletan Freund-ov katalizator (IFA) su nabavljeni od Difco. Bovine kolagena tip II (CII), lipopolisaharidom (LPS) i Enbrel dobijena od Chondrek (Isle d'Abeau, Francuska); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, Francuska), Vhiett (25mg ubrizgavanje špric, Francuska) Acros Organics (Palo Alto, CA), respektivno. Svi drugi korišćeni reagensi su bili klase reagensa i svi rastvarači su bili analitičkog stepena.

3.1.2 Životinje

[0242] Tamni Agouti pacovi (mužjaci, 7-8 nedelja stari) su dobijeni od Harlan Laboratories (Maison-Alfort, Francuska). Pacovi su držani na 12 sati svetlo/mrak ciklusu (0700 - 1900). Temperatura je održavana na 22 °C, a hrana i voda su obezbeđeni ad libitum.

3.1.3 Kolagenom indukovani artritis (CIA)

[0243] Jedan dan pre eksperimenta, CII rastvor (2 mg/ml) je pripremljen sa 0.05 M sirćetnom kiselinom i čuvan na 4 °C. Neposredno pre imunizacije, jednake zapremine katalizatora (IFA) i CII su pomešane sa homogenizerom u prethodno ohlađenoj staklenoj bočici u ledenom kupatilu. Dodatni katalizator i produžena homogenizacija mogu biti potrebni ako nije formira emulzija.0.2 mL emulzije je intradermalno ubrizgana u osnovi repa svakog pacova na 1. dan, drugi pojačivač intradermalno injektiran (rastvor CII na 2 mg/mL u CFA 0.1 mL slanog) se izvedi na 9. dan . Ovaj metod imunizacije je modifikovan u skladu sa objavljenim postupcima (Sims i dr., 2004;. Jou i dr., 2005).

3.1.4 Studija dizajna

[0244] Terapeutski efekti jedinjenja su testirani na pacovima CIA model. Pacovi se nasumice podele na jednake grupe i svaka grupa sadrži 10 pacova. Svi pacovi su imunizovani na dan 1 i pojačani na dan 9. Terapijsko doziranje trajalo je od 16. dana do 30. dana. Negativna kontrolna grupa je tretirana sa nosiocem (MC 0.5%) i pozitivna kontrolna grupa sa Enbrel (10 mg/kg, 3x nedeljno., SC). Jedinjenje od interesa je tipično testirano na 3 doze, npr.3, 10, 30 mg/kg, p.o.

3.1.5 Klinička procena artritisa

[0245] Artritis je postignut prema postupku iz Khachigian 2006, Lin et al 2007 i Nishida i dr.

2004). Oticanje svake od četiri šape je rangirano sa rezultatom artritisa kao što sledi: 0-nikakve simptome; 1-blagi, ali definitivno crvenilo i oticanje jedne vrste zajedničkog kao što je zglob ili kuk, odnosno očigledno crvenilo i oticanje ograničeno na pojedinačne prste, bez obzira na broj pogođenih prstiju; 2 umereno crvenilo i oticanje dva ili više vrsta zglobova; 3-ozbiljno crvenilo i oticanje cele šape uključujući prste; 4-maksimalno upaljeni udovi sa učešćem više zglobova (maksimum kumulativna ocena kliničkog artritisa 16 po životinji) (Nishida i dr., 2004).

[0246] Kako bi dozvolili meta-analizu višestrukih rezultata studija kliničke vrednosti su normalizovane na sledeći način:

[0247] AUC kliničkim rezultatom (AUC skor): Površina ispod krive (AUC) od dana 1 do dana 14 je izračunata za svakog pojedinačnog pacova. AUC svake životinje se podeli sa prosečnom AUC dobijenim za nosioca u studiji iz koje je dobijen i pomnožen sa 100. (tj AUC je izražena kao procenat prosečne AUC nosioca po studiji) podatke o toj životinji.

[0248] Klinički povećanje rezultata od dana 1 do dana 14 (Krajnja tačka rezultata): Klinički rezultat razlike za svaku životinju bila je podeljen sa prosečnom razlikom kliničkog rezultata dobijenog za nosioca u studiji sa kojeg su dobijeni podaci o toj životinji i pomnožen sa 100 (odnosno razlika je izražena kao procenat prosečnog kliničkog rezultata za nosioca po studiji).

3.1. 6 Promena telesne težine (%) posle početka artritisa

[0249] Klinički gubitak telesne težine povezan sa artritisom (Shelton i dr., 2005; Argiles i dr., 1998; Rall, 2004; Walsmith i dr., 2004). Otuda, promena telesne težine posle početka artritisa može da se koristi kao ne-specifični završetak za procenu efekata terapije u modelu pacova. Promena telesne težine (%) posle početka artritisa je izračunata na sledeći način:

3.1.7 Radiologija

[0250] Rendgenski snimci zadnjih šapa svake životinje posebno su napravljeni. Nasumični identifikacioni broj je dodat svakom snimku, i ozbiljnost erozije kosti je poređana uz pomoć dva nezavisna zapisa sa radiološkim sistemom poređenja Larsen kao što sledi: 0- normalno sa netaknutim koštanim obodima i normalnim zglobnim prostorom; 1- mala nepravilnost sa bilo jednom ili dve zglobne kosti koje pokazuju malu eroziju kosti; 2-definitivna rana nepravilnost sa bilo tri do pet spoljašnje zglobne kosti koje pokazuju eroziju kosti; 3-srednja destruktivna nepravilnost sa svim spoljašnjim zglobnim kostima kao i bilo jedna do dve unutrašnje zglobne kosti koje pokazuju definitivnu eroziju kosti; 4-velika destruktivna nepravilnost sa svim zglobnim kostima koje prikazuju definitvnu eroziju kosti i bar jedna unutrašnji zglob potpuno erodiran koji ostavlja neke obode koštanog zgloba delimično netaknutim; 5-upropašćena nepravilnost bez koštanih oboda. Ovaj sistem poređenja je modifikacija od Salvemini i dr., 2001; Bush i dr., 2002; Sims i dr., 2004; Jou i dr., 2005.

3.1.8 Histologija

[0251] Posle radioloških analiza, zadnje šape miševa su fiksirane u 10% fosfatnom-puferu formalina (pH 7,4), dekalcifikovane sa brzim dekalcifikatorom kostiju za finu histologiju (Laboratories Eurobio) i utopljene su u parafin. Da bi se osigurala široku procena artritičnih zglobova, najmanje četiri serijske sekcije (5 µm debljine) su isečene i svaka serija je imala 100 µm između. Isečci su bojeni hematoksilinom i eozinom (H & E). Histološki pregled za sinovijalne upale i oštećenja kostiju i hrskavice su izvršene dvaput naizmenično. U svakoj šapi četiri parametra se ispituju pomoću skale od četiri tačke. Parametri su bili infiltracija ćelija, panusna jačina, erozija hrskavice i erozija kostiju. Bodovanje je izvedeno prema sledećem: 1-normalno, 2-blago, 3-umereno, 4-označena. Ova četiri rezultata se sabiraju i zajedno su predstavljeni kao dodatni rezultat, odnosno "RA ukupni rezultat".

3.1.9 Micro-kompjuterizovana tomografija (mCT) analiza kalkaneusa (petna kost):

[0252] Degradacija kosti primećena je u RA naročito na kortikalnoj kosti i može biti otkrivena mCT analizom (Sims NA i dr., Arthritis Rheum.50 (2004) 2338-2346: Ciljanje osteoklasta sa zolderonskom kiselinom sprečava destrukciju kosti kod kolagenom indukovanih artritisa; Oste L i dr., ECTC Montreal 2007: visoka propusna metoda merenja koštanih arhitektonskih poremećaja u mišijem CIA modelu mikro-CT morphometri). Nakon skeniranja i rekonstrukcije 3D zapremine od kalkaneusa kosti, degradacija kosti meri se kao broj diskretnih objekata prisutnih po slajdu, izolovanih in silico upravno na uzdužnu osu kosti. Što je više kost degradirana, više diskretnih objekti se meri.1000 delova, ravnomerno raspoređenih duž kalkaneusa (razmaknuti za oko 10,8 µm) su analizirani.

3.1.10 PK stabilno stanje

[0253] Na 7. ili 11. dan uzorci krvi su sakupljeni na retro-orbitalnom sinusu sa litijum heparinom kao anti-koagulanta na sledećim vremenskim tačkama: pre doziranja, 1, 3 i 6 časova. Uzorci cele krvi su centrifugirani i uzorci dobijeni plazme su čuvani na -20 °C do početka analize. Koncentracije u plazmi svakog testiranog jedinjenja su određene pomoću postupka LC-MS/MS u kojima je maseni spektrometar je radio u pozitivnom modu elektrospreja. Farmakokinetički parametri su izračunati primenom Vinnonlin® (Pharsight®, Sjedinjene Države) te je pretpostavljeno da predozirani nivoi plazme jesu jednaki nivoima 24-časovne plazme.

[0254] Tabela V rezimira rezultate dobijene za nekoliko parametara PK, za jedinjenja pronalaska i komparativni primer, ilustruje poboljšane PK osobine (npr. Cmak, T1/2) iz jedinjenja pronalaska

.TABELA V

3.1.11 Rezultati

[0255] Tabela VI rezimira rezultate dobijene za ilustrativno jedinjenje 1 i komparativno jedinjenje 2 kod pacova CIA modela, "*" označava da postoji statistički značajno poboljšanje u rezultatu, p 0.05 naspram netretirane kontrole.

TABELA VI

[0256] Ilustrativno Jedinjenje 1 pokazalo je statistički značajna poboljšanja u normalizovanim kliničkim vrednostima rezultata (izračunato kao AUC ili razlika od dana 1 do dana 14) u dozi od 0.1 mg/kg. Pored toga, statistički značajno povećanje oticanja šape očitavanja u Larsen rezultatu viđeni su u dozama od 0,3 mg/kg i 3 mg/kg respektivno.

Nasuprot tome, Komparativno jedinjenje 2 izlaže statistički značajna poboljšanja samo u normalizovanim kliničkim vrednostima (na dan 14.) u dozi od 10 mg/kg. Pored toga, očitavanja statistički značajnog povećanja oticanja šape u Larsen rezultatu su viđena u dozama od 30 mg/kg. Stoga Ilustrativno jedinjenje 1 pokazuje 100-struko poboljšanje u efikasnosti nad Komparativnim jedinjenjem 2, kada se uporede oralne doze. Konkretno, u dozi od 3 mg/kg ilustrativno jedinjenja 1, statistički su viđena značajna poboljšanja u svim merama, međutim, viša doza za komparativno jedinjenje 2 rezultira samo statistički značajnim poboljšanjem u kliničkom učinku. Ovo poboljšanje in vivo potencije ne može se pripisati povećanim izlaganjem jedinjenju jer može biti viđeno da AUC (0-24h) je niža za ilustrativna jedinjenja 1 sa 0.1, 0.3 i 1 mg/kg/dan u poređenju sa komparativnim jedinjenjem 2 na 10 mg/kg/dan.

Primer 3.2 Model septičkog šoka

[0257] Ubrizgavanje lipopolisaharidoma (LPS) indukuje brzo otpuštanje rastvorljivog faktora nekroze tumora (TNF-alfa) u periferiju. Ovaj model je korišćen za analizu potencijalnih blokatora TNF koji se oslobađanja in vivo.

[0258] Šest BALB/cJ ženki miševa (20 g) po grupi su tretirane sa namenjenom dozom jedan po jedan. Trideset minuta kasnije, LPS (15 µg/kg; E. Coli serotip 0111: B4) je ubrizgano ip. Devedeset minuta kasnije, miševi su podvrgnuti eutanaziji i sakupljena je krv. Cirkulacioni TNF alfa nivoi su određeni korišćenjem komercijalno dostupnih ELISA kompleta.

Deksametazon (5 µg/kg) je korišćen kao referentno protivupalno jedinjenja. Odabrana jedinjenja su testirana pri jednoj ili više doza, npr 3 i/ili 10 i/ili 30 mg/kg, po.

[0259] Ilustrativno Jedinjenje 1, i komparativna jedinjenja 2 i 10 su bila aktivna u dozi od 30 mg/kg, PO.

Primer 3.3 MAB model

[0260] Model MAB omogućava brzu procenu modulacije jednog RA-sličnog inflamatornog odgovora na terapiju (Kachigian LM Nature Protocols (2006) 2512-2516:. Kolagena antiteloindukovani artritis). DBA/J miševi su injektirani i.v. koktelom mAbs usmerenih protiv kolagena II. Jedan dan kasnije, jedinjenje tretmana se započinje (vehicle: 10% (v/v) HPβCD). Tri dana kasnije, miševi su primili su i.p. LPS injekcija (50 µg/mišu), rezultira u brzom početku upale. Jedinjenje lečenje se nastavlja dok 10 dana nakon mAb injekcije. Upala je očitana merenjem oticanja šape i snimanje kliničkih rezultata svake šape. Kumulativni rezultat kliničkog artritisa četiri udova je predstavljen da pokaže ozbiljnost zapaljenja. Sistem bodovanja se primenjuje na svakom udu koristeći skalu 0-4, gde je 4 najteža upala.

0 Bez simptoma

[0261]

1 Blago, ali definitivno crvenilo i oticanje jedne vrste članka kao što je zglob ili ručni zglob, ili očigledno crvenilo i otok ograničen na pojedine prste, bez obzira na broj pogođenih prstiju

2 Srednje crvenilo i oticanje dve ili više vrsta zglobova

3 Ozbiljno crvenilo i oticanje cele šape uključujući prste

4 Maksimalno upaljeni ekstremiteti uz učešće više zglobova

Primer 3.4 Onkološki modeli

[0262] In vivo modeli za proveru efikasnosti malih molekula prema JAK2-vođenoj mileoproliferativnoj bolesti su opisali Vernig i dr. Cancer Cell 13, 311, 2008 i Geron i dr. Ćelija kancera 13, 321, 2008.

Primer 3.5 Miš IBD model

[0263] In vitro i in vivo modelima da se potvrdi efikasnost malih molekula prema IBD su opisali Virtz i dr.2007.

Primer 3. 6 Model mišje astme

[0264] In vitro i in vivo modelima da se potvrdi efikasnost malih molekula prema astmi su opisali Nials i dr., 2008; Ip i dr.2006; Pernis i dr., 2002; Kudłacz i dr., 2008.

Primer 4: Farmakokinetički, DMPK i testovi toksičnosti

Primer 4.1 Termodinamička stabilnost

[0265] Rastvor 1 mg/mL testiranog jedinjenja je pripremljen u 0.2M fosfatnom puferu pH 7,4 ili 0,1M citrat puferu pH 3,0 na sobnoj temperaturi u staklenoj bočici.

[0266] Uzorci se rotiraju u pogonskom rotoru STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) pri brzini 3.0 na sobnoj temperaturi 24 časa.

[0267] Posle 24 časa, 800µL uzorka se prenosi na Eppendorf epruvetu i centrifugira 5 minuta na 14000rpm.200 µL supernatanta uzorka se zatim prenosi u MultiscreenR Solubility ploču (Millipore, MSSLBPC50) i supernatant se filtrira (10-12 "Hg) pomoću višestrukog vakuuma u čistu Greiner polipropilensku posudu sa V-dnom i sa 96 otvora (Kat no.651201).

5 µL filtrata je razblaženo sa 95 µL (F20) istog pufera korišćenog da se inkubiraju u posudi koja sadrži standardne krive (Greiner, Kat no.651201).

[0268] Standardna kriva za jedinjenje je dobijena nova u DMSO polazeći od 10mM DMSO skladišnog rastvora koji se razblaži do faktora 2 u DMSO (5000µM) i zatim dalje razblažena u DMSO do 19.5mM. 3ml serije razblaženja počev od 5000µM se zatim prenosi u 97µL acetonitril-pufer smešu (50/50). Konačni raspon koncentracije je iznosio 2,5 do 150 uM.

[0269] Ploča je zapečaćena sa zaptivnim trakama (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) i uzorci su mereni na sobnoj temperaturi na LCMS (ZK 1525 od Vaters) pod optimizovanim uslovima korišćenjem Quanoptimize za određivanje odgovarajuće mase molekula.

[0270] Uzorci su analizirani na LCMS sa protokom od 1 mL/min. Rastvarač A je 15mM amonijak i rastvarač B je acetonitril. Uzorak se uvodi pod pozitivni jonski sprej na KSBridge C18 3.5mM (2.1 k 30mm) kolonu iz Waters-a. Gradijent rastvarača ima ukupno vreme rada od 2 minuta i kreće se od 5% B do 95% B.

[0271] Oblasti vrhova su analizirani uz pomoć softverskog paketa MassLink i vršne oblasti uzoraka se nanose u odnosu na standardne krive za dobijanje rastvorljivosti jedinjenja.

[0272] Vrednosti rastvaranja su prikazane u µM ili µg/mL.

Primer 4.2 Vodena Rastvorljivost

[0273] Polazeći od 10 mM matičnog rastvora u DMSO, serijsko razblaživanje jedinjenja je dobijeno u DMSO. Razblažena serija je preneta u 96 NUNC Maxisorb posudu sa F-dnom (Kat br.442404) i 0.2M fosfatnom puferu pH 7.4 ili 0.1M citrat puferu pH 3,0 na sobnoj temperaturi je dodat.

[0274] Krajnja koncentracija kretala se od 200µM do 2.5mM u 5 jednakih koraka razblaživanja. Konačna koncentracija DMSO ne prelazi 2%.200µM Pirena doda se u uglovima svakog od 96 otvora i služi kao referentna tačka za kalibraciju Z-ose na mikroskopu.

[0275] Test posude su zatvorene i inkubirane 1 čas na 37 °C, uz mešanje na 230rpm. Ploče se zatim skeniraju pod belim svetlom mikroskopa, dajući pojedinačne slike taloga po koncentraciji. Talog je analiziran i pretvoren u broj koji je nacrtan na grafikonu. Prva koncentracija pri kojoj se jedinjenje potpuno ne rastvori je koncentracija izložena u daljem tekstu, međutim prava koncentracija je negde između ove koncentracije i jedan korak razblaživanja više.

[0276] Vrednosti rastvaranja su prikazane u µg/mL

TABELA VII

Primer 4.3 Vezivanje za proteine plazme (Ekuilibrium dijaliza)

[0277] A 10mM skladišnog rastvora jedinjenja u DMSO se razblaži sa faktorom 5 u DMSO. Ovaj rastvor je dalje razblažen u sveže otopljenoj plazmi čoveka, pacova, miša ili psa (BioReclamation INC) sa konačnom koncentracijom 10µM i konačnoj koncentraciji DMSO od 0,5% (5.5mL vo 1094.5mL plazmi u PP-Masterblock sa 96 otvora (Greiner, Kat br.

780285))

[0278] A Pierce Red uređaj sa pločama sa umecima (ThermoScientific, kat.89809) je pripremljen i ispunjen 750mL PBS u tampon komori i 500µL sa šiljcima plazme u komori plazme. Ploča je inkubirana tokom 4 sata na 37 °C uz mešanje na 230rpm. Posle inkubacije, 120mL iz obe komore je prebačeno u 360mL acetonitrila u 96 otvora sa okruglim dnom, PP dubokim otvorima (Nunc, Kat no.278743) i zapečaćeni su sa poklopcem od aluminijumske folije. Uzorci su pomešani i stavljeni na led tokom 30 min. Ova ploča je zatim centrifugirana 30 min na 1200rcf na 4 °C i supernatant se prenese u 96 v dnom PP ploče (Greiner, 651201) za analizu na LCMS.

[0279] Ploča je zapečaćena sa zaptivnim trakama (MA96RD-04S) od www.kinesis.co.uk a uzorci se mere na sobnoj temperaturi na LCMS (ZK 1525 od Vaters) pod optimizovanim uslovima korišćenjem Kuanoptimize za određivanje odgovarajuće mase molekula.

[0280] Uzorci su analizirani na LCMS sa protokom od 1 ml/min. Rastvarač A bio je 15mM amonijaka i rastvarač B je acetonitril. Uzorak je pokrenut pod pozitivnim jonskim sprejom na KSBridge C183.5mM (2.1 k 30mm) kolonu iz Waters. Gradijent rastvarača ima ukupno vreme rada od 2 minuta i kreće se od 5% B do 95% B.

[0281] Oblast vrha jedinjenja u tampon komori i komori plazme se smatraju da su 100% od jedinjenja. Procenat vezan za plazme je izveden iz tih rezultata i bio prijavljen kao procenat vezan za plazmu.

[0282] Rastvorljivost jedinjenja u finalnoj koncentraciji testa u PBS je pregledana pomoću mikroskopa da ukaže da li se taloženje posmatra ili ne.

TABELA VIII

Primer 4.4 Mikrozomalna stabilnost

[0283] 10mM skladišnog rastvora jedinjenja u DMSO je razblaženo 1000 puta u 182 mM fosfatnom puferu pH 7.4 u posudi sa 96 dubokih otvora (Greiner, Kat no.780285) i preinkubirano na 37 °C.

[0284] 40mL dejonizovane vode je dodato u otvore polipropilena Matrix 2D sa barkod oznakom skladišnoj epruveti (Thermo Scientific) i prethodno inkubirano na 37 °C.

[0285] A Glukoza-6-fosfata-dehidrogenaza (G6PDH) radnog matičnog rastvora je dobijeno 182mm fosfatnog pufera pH 7.4 i stavljen na led pre upotrebe. A co-faktor sadrži MgCl2, glukoza-6-fosfat i NADP+ je pripremljen na dejonizovanom vodom i stavljen na led pre upotrebe.

[0286] Konačno radni rastvor koji sadrži mikrosom iz jetre (Ksenotech) jedne vrste od interesa (čovek, miš, pacov, pas), prethodno opisan G6PDH i kofaktora je pripremljen i ova smeša je inkubirana ne duže od 20 minuta na sobnoj temperaturi.

[0287] 30µL smeše u prethodno zagrejanom rastvoru jedinjenja je dodato u 40mL prethodno zagrejane vode u Matrix epruveti i dodato je 30 µL smeša mikrozoma. Finalne koncentracije reakcije su 3µM jedinjenja, 1mg mikrozoma, 0.4U/mL GDPDH, 3.3mm MgCl2, 3.3mm glukoza-6-fosfat i 1.3mm NADP .

[0288] Za merenje procenta preostalog jedinjenja u nultoj vremenskoj tački je dodat MeOH i ACN (1: 1) u otvor pre dodavanja smeše mikrozoma. Posude su zatvorene sa Matrix Sepra sealsTM (Matrik, Kat. No.4464) i protresaju se nekoliko sekundi kako bi se obezbedilo potpuno mešanje svih komponenti.

[0289] Uzorci koji nisu zaustavljeni su inkubirani na 37 °C, 300rpm i posle 1 sata inkubacije, reakcija je zaustavljena sa MeOH ili ACN (1: 1).

[0290] Nakon zaustavljanja reakcije uzorci su pomešani i postavljeni na led tokom 30 minuta da se talože proteini. Posude su zatim centrifugirane 30 minuta na 1200rcf na 4 °C i supernatant se prenese u PP posudu sa 96 v-dnom (Greiner, 651201) za analizu na LCMS.

[0291] Ove posude su zatvorene sa zaptivnim trakama (MA96RD-04S) od www.kinesis.co.uk i uzorci su mereni na sobnoj temperaturi na LCMS (ZK 1525 od Vaters) pod optimizovanim uslovima korišćenjem Quanoptimize za određivanje odgovarajuće mase izvornog molekula.

[0292] Uzorci su analizirani na LCMS sa protokom od 1 mL/min. Rastvarač A je bio 15mM amonijaka i rastvarač B je metanol ili acetonitril, u zavisnosti od toga koji se rastvor za zaustavljanje koristi. Uzorci su izvedeni u pozitivnom jonskom spreju na KSBridge C18 3.5mM (2.1 k 30mm) kolonu iz Waters. Gradijent rastvarača imao je ukupno vreme rada od 2 minuta i kreće se od 5% B do 95% B.

[0293] Oblast vrha od matičnog jedinjenja na vreme 0 smatran je kao 100% preostalog.

Procenat koji ostaje nakon 1 h inkubacije je izračunat od vremena 0 i izračunat je kao procenat ostatka. Rastvorljivost jedinjenja u testu finalne koncentracije u puferu je pregledan mikroskopom i rezultati su prikazani.

[0294] Podaci o stabilnosti mikrozoma su izraženi kao procenat ukupne količine jedinjenja preostalog nakon 60 min.

TABELA IX

Primer 4.5 Caco2 Propustljivost

[0295] Bi-direkcioni Caco-2 testovi su izvedeni kao što je opisano u nastavku. Caco-2 ćelije su dobijene iz European Collection of Cell Cultures (ECACC, Kat 86010202) i koriste se nakon 21 dana ćelijske kulture u Transwell pločama sa 24 otvora (Fisher TKT-545-020B).

[0296] 2k105 ćelije/otvori su zasejane u prevlačući medijum sastoji se od DMEM GlutaMAKSI 1% NEAK 10% FBS (FetalClone II) 1% Pen/Strep. Medijum je promenjen na svaka 2 - 3 dana.

[0297] Test i referentna jedinjenja (propranolol i rodamin 123 ili vinblastin, svi kupljeni od Sigma) su pripremljeni u Hanksov Ravnotežnom Slanom Rastvoru koji sadrži 25 mM HEPES (pH 7,4) i dodat bilo apikalnim (125mL) ili bazolatelarnim (600mL) komorama sklopa Transvell ploče u koncentraciji od 10 µM sa finalnom DMSO koncentracijom od 0,25%.

[0298] 50 µM Lucifer Yellow (Sigma) je dodat baferu donatora u svim otvorima za procenu integriteta slojeva ćelija praćenjem Lucifer Yellow prožimanja. Kao što Lucifer Yellow (LY) ne mogu slobodno prodreti lipofilne barijere, visok stepen LI transporta ukazuje na slab integritet sloja ćelija.

[0299] Posle 1 sata inkubacije na 37 °C uz mešanje na orbitalnom potreskivaču na 150rpm, 70mL alikvoti su uzeti iz obe gornje (A) i bazalne (B) komore i dodati su 100mL1 50:50 acetonitrila: vodeni rastvor koji sadrži analitički interni standard ( 0.5mM karbamazepin) u ploči sa 96 otvora.

[0300] Lucifer Yellow je izmeren sa Spectramax Gemini XS (Ex 426nm i Em 538nm) u čistu ploču sa 96 otvora koja sadrži 150 µL tečnosti iz bazolateralne i gornje strane.

[0301] Koncentracije jedinjenja u uzorcima su merena metodom tečnosti visokih performansi-hromatografije/masene spektroskopije (LC-MS/MS).

[0302] Vrednosti prividne permeabilnosti (Papp) su izračunate iz odnosa:

V = zapremia komore

Tinc= vreme inkubacije.

Površina = 0.33cm<2>

[0303] U Efflux odnosi, kao pokazatelj aktivnog isticanja iz gornje površine ćelije, su izračunati korišćenjem odnosa PappB>A/PappA>B.

[0304] Sledeći testovi kriterijuma prihvatljivoti su upotrebljeni:

Propranolol: Papp(A>B) vrednost ≥ 20(×10<-6>cm/s)

Rodamin 123 ili Vinblastin: Papp(A>B) vrednost < 5 (×10<-6>cm/s) a Efflux odnosom ≥5. Lucifer Yellow permeabilnost: ≤100 nm/s

TABELA X

Primer 4.6 Farmakokinetičke studije kod glodara

4.6.1 Životinje

[0305] Sprague-Dawley pacovi (mužjaci, 5-6 nedelja stari) dobijeni su iz Janviera (Francuska). Pacovi su aklimatizovani najmanje 7 dana pre tretmana i držani na 12 sati svetlo/mrak ciklusu (0700 - 1900). Temperatura se održava na otprilike 22 °C, a hrana i voda su obezbeđeni ad libitum. Dva dana pre primene Ilustrativnog jedinjenja 1 i komparativnog jedinjenja 2, pacovi su podvrgnuti operaciji kako bi se postavio kateter u vratnu venu pod izofluranskom anestezijom. Nakon operacije, pacovi su pojedinačno smešteni. Pacovi su lišeni hrane na najmanje 16 sata pre oralnog doziranja i 6 časova posle. Voda je obezbeđena ad libitum.

4.6.2 Farmakokinetičke studija

[0306] Jedinjenja su formulisana u PEG200/fiziološkom rastvoru (60/40) za intravenozni način i u 0,5% metilcelulozi (Ilustrativno jedinjenje 1 i komparativno jedinjenje 2) i 10% hidroksipropil- β-ciklodekstrin PH3 (Komparativno jedinjenje 11) za oralni način. Test jedinjenja su oralno dozirana kao pojedinačna intubacija jednjaka na 5 mg/kg pod doznom zapreminom od 5 mL/kg i intravenozno dozirana kao kuglice preko kaudalne vene pri 1 mg/kg pod doznom zapreminom od 5 mL/kg. Svaka grupa se sastojala od 3 pacova. Za jedinjenja 1 i 2 uzorci krvi su sakupljeni putem vratne vene sa litijum heparinom kao antikoagulanta u sledećim vremenskim tačkama: 0.05, 0.25, 0.5, 1, 3, 5 i 8 sati (intravenskim putem), i 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 8 i 24 hrs (oralno). Za komparativno jedinjenje 11, uzorci krvi su sakupljeni na retro-orbitalnom sinusu sa litijum heparinom kao anti-koagulanta u sledećim vremenskim tačkama 0.25, 1, 3 i 6 časova (oralno). Uzorci cele krvi su centrifugirani na 5000 rpm tokom 10 minuta, i dobijeni uzorci plazme su čuvani na - 20 °C do početka analize.

4.6.3 Kvantifikacija nivoa jedinjenja u plazmi

[0307] Koncentracije u plazmi svakog testiranog jedinjenja su određene pomoću postupka LC-MS/MS u kojima je maseni spektrometar radio u pozitivnom modu elektrospreja.

4.6.4 Određivanje farmakokinetičkih parametara

[0308] Farmakokinetički parametri su izračunati upotrebom Winnonlin® (Pharsight®, Sjedinjenje Američke države).

TABELA XI

Primer 4.77-dnevna studija toksičnosti pacova

[0309] 7-dnevno oralno istraživanje toksičnosti sa testiranim jedinjenjima se obavlja u Sprague-Dawley muškim pacovima kako i se procenio njihov toksični potencijal i toksikokinetika, u dnevnim dozama od 100, 300 i 500 mg/kg/dan, pomoću sonde, na konstantnoj zapremini doziranja 5 mL/kg/dan.

[0310] Test jedinjenja su formulisana u 30% (v/v) HPβCD u prečišćenoj vodi. Svaka grupa daje 5 glavnih muških pacova kao 3 satelitske životinje za toksikokinetiku. Četvrta grupa se daje 30% (v/v) HPβCD samo u vodi, na istoj frekvenciji, zapremini doze i istim načinom primene i delovala je kao kontrolna grupa.

[0311] Cilj studije je da se odredi najniža doza koja ne izaziva identifikovanje neželjenih dejstava (nema uočljive neželjeni efekte - NOAEL).

Primer 4.8 Stabilnost hepatocita

[0312] Modele za procenu metaboličkog zazora u hepatocitu su opisali McGinniti i dr. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247.

Primer 4.9 Odgovornost za produženje QT intervala

[0313] Potencijal za produženja QT intervala je procenjen u hERG testu Patch-Clamp.

Konvencionalni Patch-Clamp celih ćelija

[0314] Snimci Patch-Clamp celih ćelija su izvedeni korišćenjem EPC10 pojačivača kontrolom impulsa v8.77 softvera (HEKA). Otpor serija je obično manji od 10 MΩ i kompenzuje za više od 60%, snimci ne pokazuju poverljive podatke. Elektrode su proizvedene od GC150TF pipete stakla (Harvard).

[0315] Spoljni rastvor za ispiranje sadrži: 135 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 5 mM glukoze, 10 mM HEPES, pH 7.4.

[0316] Rastvor interne pipete za popunjavanje je sadržao: 100 mM Kglukonata, 20 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5mM Na2ATP, 2mM glutationa, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2.

[0317] Lekovi se ispiraju korišćenjem bioloških MEV-9/EVH-9 brzih sistema ispiranja.

[0318] Svi snimci su izvršeni na HEK293 ćelijama koje stabilno pokazuju hERG kanale. Ćelije su kultivisane na 12 mm okruglim poklopcima (Nemačko staklo, Bellco), postavljene u komoru za snimanje pomoću dve platinaste šipke (Goodfellow). hERG struje su probuđene korišćenjem aktivirajućeg impulsa 40 mV za 1000 ms, zatim pomoću repa strujnih impulsa na -50 mV za 2000 ms, stalni potencijal je -80 mV. Impulsi su primenjeni svakih 20s i svi eksperimenti su izvedeni na sobnoj temperaturi.

Rezultati

[0319] Na primer, kada se podvrgne ovom ogledu, izmeren IC50Ilustrativnog Jedinjenja 1 bio je veći od 150µM.

Generalni Zaključci

[0320] Podaci dati u ovoj patentnoj prijavi pokazuju da Ilustrativno Jedinjenje 1 (jedinjenje ovog pronalaska) pokazuje značajno poboljšan in vivo potencijal u poređenju sa strukturno sličnim jedinjenjima. Ovo poboljšanje je neočekivano i nije moglo da se predvidi od strane stručnjaka u ovoj oblasti, posebno jer mnogi od ovih strukturno sličnih jedinjenja pokazuju veoma sličan in vitro potencijal protiv JAK1 i JAK2.

[0321] To će biti jasno stručnjacima iz oblasti tehnike da su prethodni opisi primerni i pojašnjavajuće prirode sa namerom da ilustruju pronalazak i njegova poželjna otelotvorenja. Kroz rutinsko eksperimentisanje, stručnjak će prepoznati očigledne modifikacije i varijacije koje mogu biti napravljene bez odstupanja od duha ovog pronalaska. Tako, ovaj pronalazak ima za cilj da se definiše ne prema gornjem opisu, nego prema patentnim zahtevima koji slede i njihovim ekvivalentima.

.

REFERENCE

[0322]

Choy EH, Panayi GS. (2001). N Engl J Med.344: 907-16.

Chubinskaya S and Kuettner KE (2003). Regulation of osteogenic proteins by chondrocytes. The international journal of biochemistry & cell biology 35(9)1323-1340.

Clegg DO i dr. (2006) N Engl J Med.2006 354:795-808. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis.

Firestein GS. (2003). Nature.423:356-61.

Lee DM, Weinblatt ME (2001). Lancet.358: 903-11.

Legendre F, Dudhia J, Pujol J-P, Bogdanowicz P. (2003) JAK/STAT but not ERK1/ERK2 pathway mediates interleuking (IL)-6/soluble IL-6R down-regulation of type II collagen, aggrecan core, and link protein transcription in articular chondrocytes. J Biol Chem.278(5)2903-2912.

Li WQ, Dehnade F, Zafarullah M. (2001) Oncostatin M-induced matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 genes expression in chondrocytes requires janus kinase/STAT signaling pathway. (2001) J Immunol 166:3491-3498.

O'Dell JR. (2004) Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 350(25):2591-602. Osaki M, Tan L, Choy BK, Yoshida Y, Cheah KSE, Auron PE, Goldring MB. (2003) The TATA-conatining core promoter of the type II collagen gene (COL2A1) is the target of interferon-gamma-mediated inhibition in human chondrocytes: requirement for STAT1 alpha, JAK1 and JAK2. Biochem J 369:103-115.

Otero M, Lago R, Lago F, Gomez Reino JJ, Gualillo O. (2005) Signalling pathway involved in nitric oxide synthase type II activation in chondrocytes: synergistic effect of leptin with interleukin-1. Arthritis Research & Therapy 7:R581-R591.

Sims NA i dr., (2004) Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis, Arthritis Rheum.50 2338-2346:

Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, King KL, Sheehan KCF, Yin L, Pennica D, Johnson EM, Schreiber RD. (1998) Disruption of the Jak1 gene demonstrates obligatory and nonredundant roles of the jaks in cytokineinduced biologic responses Cell 93: 373-383. Smolen JS, Steiner G. (2003). Nat Rev Drug Discov. 2: 473-88.

Wieland HA, Michaelis M, Kirschbaum BJ, Rudolphi KA. (2005). Nat Rev Drug Discov. 4:331-44. Osteoarthritis - an untreatable disease?

Tam, L., McGlynn, L.M., Traynor, P., Mukherjee, R., Bartlett, J.M.S., Edwards, J. (2007) British Journal of Cancer, 97, 378-383

Constantinescu i dr., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131 Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233-S242 O'Shea J. i dr. Nature Review Drug Discovery 3 (2004) 555-564: A new modality for immunesuppresion: targeting the JAK/STAT pathway Vainchenker W. i dr. Seminars in Cell & Developmental Biology 19 (2008) 385-393: JAKs in pathology: Role of Janus kinases in hematopoietic malignancies and immune deficiencies

Levy D. and Loomis C. New England Journal of Medicine 357 (2007) 1655-1658: STAT3 signaling and the Hyper-IgE-syndrome

Wernig i dr. (2008) Efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in treatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera, Cancer Cell 13(4), 311-320

Geron i dr. (2008) Selective inhibition of JAK2-driven erythroid differentiation of polycythemia vera progenitors Cancer Cell 13 (4), 321-30

Wirtz i dr. (2007) Mouse Models of Inflammatory Bowel Disease, Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 1073-1083:

Nials i dr. (2008) Mouse Models of Allergic Asthma: Acute and Chronic Allergen Challenge, Disease Models & Mechanisms, 213-220.

Ip i dr. (2006) Interleukin (IL)-4 and IL-13 up-regulate monocyte chemoattractant protein-1 expression in human bronchial epithelial cells: involvement of p38 mitogenactivated protein kinase, extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Janus kinase-2 but not c-Jun NH2-terminal kinase 1/2 signalling pathways, Clin. Exp. Immun, 162-172.

Pernis i dr. (2002) JAK-STAT signaling in asthma J. Clin. Invest.1279.

Kudlacz i dr. (2008) The JAK-3 inhibitor CP-690550 is a potent anti-inflammatory agent in a murine model of pulmonary eosinophilia, Eur J Pharmaco 154-161.

Mullighan CG, Zhang J, Harvey RC, Collins-Underwood JR, Schulman BA, Phillips LA, Tasian SK, Loh ML, Su X, Liu W, Devidas M, Atlas SR, Chen I-M, Clifford RJ, Gerhard DS, Carroll WL, Reaman GH, Smith M, Downing JR, Hunger SP Willmane CL; (2009) JAK mutations in high-risk childhood acute lymphoblastic leukemia, PNAS May 22. [Epub ahead of print]

Argiles JM, Lopez-Soriano FJ. (1998)Catabolic proinflammatory cytokines. Curr Opin Clin Nutr Metab Care.1:245-51.

Bush KA, Farmer KM, Walker JS, Kirkham BW. (2002) Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum. 46: 802-5.

Jou IM, Shiau AL, Chen SY, Wang CR, Shieh DB, Tsai CS, Wu CL. (2005) Thrombospondin 1 as an effective gene therapeutic strategy in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 52:339-44.

Nishida K, Komiyama T, Miyazawa S, Shen ZN, Furumatsu T, Doi H, Yoshida A, Yamana J, Yamamura M, Ninomiya Y, Inoue H, Asahara H. (2004) Histone deacetylase inhibitor suppression of autoantibody-mediated arthritis in mice via regulation of p16INK4a and p21(WAF1/Cip1) expression. Arthritis Rheum.10: 3365-76.

Rall LC, Roubenoff R.(2004) Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology; 10:1219-23.

Salvemini D, Mazzon E, Dugo L, Serraino I, De Sarro A, Caputi AP, Cuzzocrea S. (2001) Amelioration of joint disease in a rat model of collagen-induced arthritis by M40403, a superoxide dismutase mimetic. Arthritis Rheum. 44:2909-21.

Shelton DL, Zeller J, Ho WH, Pons J, Rosenthal A. (2005) Nerve growth factor mediates hyperalgesia and cachexia in auto-immune arthritis. Pain.116:8-16.

Sims NA, Green JR, Glatt M, Schlict S, Martin TJ, Gillespie MT, Romas E. (2004) Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collageninduced arthritis. Arthritis Rheum., 50: 2338-46.

Walsmith J, Abad L, Kehayias J, Roubenoff R. (2004) Tumor necrosis factor-alpha production is associated with less body cell mass in women with rheumatoid arthritis. J Rheumatol.; 31:23-9. Khachigian, L. M. Collagen antibody-induced arthritis. (2006) Nature Protocols 1, 2512-6.

Lin HS, Hu CY, Chan HY, Liew YY, Huang HP, Lepescheux L, Bastianelli E, Baron R, Rawadi G, Clément-Lacroix P. (2007) Anti-rheumatic activities of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in vivo in collagen-induced arthritis in rodents. Br J Pharmacol. Apr;150 (7):829-31.

McGinnity i dr. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247.

[0323] Treba razumeti da faktori poput kapaciteta diferencijalnog ćelijskog prodiranja različitih jedinjenja mogu da doprinesu odstupanjima između aktivnosti jedinjenja u in vitro biohemijskim i ćelijskim testovima.

[0324] Barem neka od hemijskih imena jedinjenja pronalaska kao što je dato i izneto u ovoj patentnoj prijavi, mogu nastati na automatizovanoj bazi pomoću komercijalno dostupnog softverskog programa hemijskog imenovanja, i nisu nezavisno potvrđeni. Reprezentativni programi koji obavljaju ovu funkciju uključuju Lekichem alatku imenovanja koju prodaje Open Eye Software, Inc. i alatku Autonom Software prodatu od strane MDL, Inc. U slučaju gde se naznačeni hemijski naziv i slika strukture razlikuju, slika strukture ima prednost.

[0325] Hemijske strukture prikazane ovde su pripremljene primenom ili ChemDraw ® ili ISIS®/DRAW. Svaka otvorena valentnost koja se pojavljuje kod ugljenika, kiseonika ili atoma azota u strukturama ovde ukazuje na prisustvo atoma vodonika. Gde hiralni centar postoji u strukturi, ali nije prikazana specifična stereohemija hiralnog centra, oba enantiomera povezana sa hiralnom strukturom jesu obuhvaćeni strukturom.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema Formuli I:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i farmaceutski efektivnu količinu jedinjenja prema patentnom zahtevu 1.
3. 3. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 2 koji sadrži dodatni terapeutski agens.
4. 4. Upotreba jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 u proizvodnji leka.
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 2, za upotrebu kao lek.
6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u lečenju, prevenciji ili profilaksi inflamatornih stanja, autoimunih bolesti, proliferativnih bolesti, neprihvatanja transplantata, bolesti koje uključuju oštećenje rasta hrskavice, urođene deformacije hrskavice, Castlemanove bolesti, multiple mijelom, psorijaza, Kaposi-jev sarkoma, i/ili mesangijalni proliferativni glomerulonefritis.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je inflamatorno stanje izabrano iz reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, alergijskih bolesti disajnih puteva i inflamatornih bolesti creva.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili 7, gde je inflamatorno stanje reumatoidni artritis.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je inflamatorno stanje inflamatorna bolest creva.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 6, gde je inflamatorno stanje kolitis i/ili Kronova bolest.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je bolest koja uključuje oštećenje rasta hrskavice izabrana iz ankiloznog spondilitisa i psorijatičnog artritisa.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je autoimuna bolest atopijski dermatitis.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je bolest neprihvatanja transplantata graft versus host bolest.
14. 14. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde se jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 daje u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvom.
15. 15. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde je dodatni terapeutski agens agens za lečenje i/ili prevenciju artritisa, inflamatornih bolesti creva, autoimune bolesti ili neprihvatanje transplantata. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5