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BRPI1015569B1 - compostos e composições farmacêuticas úteis para o tratamento de doenças degenerativas e inflamatórias, seus métodos e usos - Google Patents

compostos e composições farmacêuticas úteis para o tratamento de doenças degenerativas e inflamatórias, seus métodos e usos Download PDF

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BRPI1015569B1
BRPI1015569B1 BRPI1015569-4A BRPI1015569A BRPI1015569B1 BR PI1015569 B1 BRPI1015569 B1 BR PI1015569B1 BR PI1015569 A BRPI1015569 A BR PI1015569A BR PI1015569 B1 BRPI1015569 B1 BR PI1015569B1
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BR
Brazil
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compound
treatment
disease
diseases
acid
Prior art date
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BRPI1015569-4A
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English (en)
Inventor
Christel Jeanne Marie Menet
Koen Kurt Smits
Original Assignee
Galapagos N.V
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Publication date
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Application filed by Galapagos N.V filed Critical Galapagos N.V
Publication of BRPI1015569A2 publication Critical patent/BRPI1015569A2/pt
Publication of BRPI1015569B1 publication Critical patent/BRPI1015569B1/pt
Publication of BRPI1015569B8 publication Critical patent/BRPI1015569B8/pt

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Abstract

COMPOSTOS ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DEGENERATIVAS E INFLAMATÓRIAS. Um novo composto capaz de inibir JAK é descrito, este composto pode ser preparado como uma composição farmacêutica, e pode ser usa- do para prevenção e tratamento de uma variedade de condições em mamíferos incluindo seres humanos, incluindo a título de exemplo não limitante, conições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeiçãp de transplante, doenças envolvendo comprometimento de renovação de cartilagem, malforamções de cartilagem congênitas, e/ou doenças associadas , com hipersecreção de IL6.

Description

CAMPO DA INVENCÀO
[001] A presente invenção refere-se a um composto que é um inibidor de JAK, uma família de tirosinas quinases que estão envolvidas em condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças prolife- rativas, rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com hipersecreção de IL6. Em particular, os compostos da invenção inibem JAK1 e JAK2. A presente invenção também provê métodos para a produção do composto da invenção, composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, métodos para a prevenção e/ou tratamento de doenças que envolvem processos inflamatórios, doenças autoimunes, doenças pro- liferativas, rejeição de transplantes, doenças que envolvem comprometimento da renovação de cartilagem, malformações congênitas de cartilagem, e/ou doenças associadas com hipersecreção de IL6 através da administração do composto da invenção.
[002] Quinases Janus (JAKs) são tirosinas quinases de tirosina citoplasmáticas que fazem transdução de sinalização de citocinas a partir de receptores de membrana para fatores de transcrição STAT. Quatro membros da família JAK são descritos, JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. Mediante a ligação da citocina ao seu receptor, os membros da família JAK auto- e/ou transfosforilam uns aos outros, seguido pela fosforilação de STATs que, depois, migram para o núcleo a fim de modular a transcrição. A transdução de sinais intracelulares JAK-STAT serve as interferonas, na maioria interleucinas, bem como uma variedade de citocinas e fatores endócrinos, como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF e PRL (Vainchenker W. et al. (2008)).
[003] A combinação de modelos genéticos e a pesquisa de inibidores de JAK de pequenas moléculas,revelou o potencial terapêutico dos diversos JAKs. JAK3 é validado pela genética de camundongos e seres humanos como um alvo de supressão imunológica (O'Shea J. et al. (2004)). Inibidores de JAK3 se encaixaram com sucesso no desenvolvimento clínico, inicialmente para a rejeição de transplante de órgãos, porém mais tarde também em outras indicações imunoinflamató- rias como a artrite reumatoide (AR), psoríase e doença de Crohn (http://clinicaltrials.gov/).
[004] TYK2 é um alvo potencial para as doenças imunoinflamató- rias, sendo validados pela genética humana e estudos de knock-out de camundongos (Levy D. e Loomis C. (2007)).
[005] JAK1 é um novo alvo na área de doenças imunoinflamató- rias. JAK1 heterodimeriza com outras JAKs para transdução de sinalização pró-inflamatória dirigidas para citocinas. Desta maneira, a inibição da JAK1 e/ou outros JAKs é esperada ser um benefício terapêutico para uma variedade de condições inflamatórias, bem como para outras doenças dirigidas pela transdução de sinal mediado por JAK.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[006] A degeneração da cartilagem é a marca registrada de várias doenças, entre as quais artrite reumatoide e osteoartrite são as mais proeminentes. Artrite reumatoide (AR) é uma doença articular degenerativa crônica, caracterizada pela inflamação e destruição das estruturas articulares. Quando a doença está sem controle, ela leva à incapacidade e dor substancial devido à perda de funcionalidade da junta, e até mesmo à morte prematura. O objetivo de uma terapia de AR, desta maneira, não é apenas para retardar a doença, mas para atingir a remissão, a fim de parar a destruição da articulação. Além da gravidade da evolução da doença, a alta prevalência de AR (~ 0,8% dos adultos são afetados em todo o mundo) significa um impacto soci- oeconômico elevado. (Para comentários sobre AR, referência é feita a Smolen e Steiner (2003); Lee e Weinblatt (2001); Choy e Panayi (2001); O'Dell (2004) e Firestein (2003)).
[007] A Osteoartrite (também referida como OA, ou artrite de desgaste-e-rasgo) é a forma mais comum de artrite e é caracterizada pela perda de cartilagem articular, muitas vezes associada à hipertrofia do osso e à dor. Para uma extensiva revisão sobre osteoartrite, consulta é feita a Wieland et al. (2005).
[008] A osteoartrite é difícil de tratar. No momento, não existe cura disponível e o tratamento se concentra em aliviar a dor e impedir a articulação afetada de tornar-se deformada. Tratamentos comuns incluem o uso de fármacos nãoesteroides anti-inflamatórios (AINEs). Embora os suplementos dietéticos, tais como sulfato de condroitina e glucosamina tenham sido defendidos como opções seguras e eficazes para o tratamento da osteoartrite, um ensaio clínico recente revelou que ambos os tratamentos não reduzem a dor associada à osteoartrite. (Clegg et al., 2006).
[009] A estimulação dos processos anabólicos, processos cata- bólicos de bloqueio, ou uma combinação destes dois, pode resultar em estabilização da cartilagem, e talvez até mesmo a reversão dos danos e, portanto, prevenir a progressão da doença. Métodos terapêuticos para a correção das lesões da cartilagem articular, que aparecem durante a doença osteoartrítica, têm sido desenvolvidos, mas até agora nenhum deles foi capaz de mediar a regeneração da cartilagem articular in situ e in vivo. Tomados em conjunto, nenhum fármaco osteoartrí- tico modificador da doença está disponível.
[0010] Vandeghinste et al. (WO 2005/124342) descobriram JAK1 como um alvo cuja inibição poderá ter relevância terapêutica para várias doenças, incluindo OA. O Knockout do gene de JAK1 em camun- dongos demonstrou que JAK1 desempenha papéis essenciais e não redundantes durante o desenvolvimento: JAK1-Z- camundongos morreram dentro de 24 horas após o nascimento e o desenvolvimento de linfócitos foi severamente comprometido. Além do mais, JAK1 -/- células não eram, ou menos, reativas a citocinas que utilizam receptores de citocinas de classe II, receptores de citocinas que usam a subuni- dade de gamma-c para sinalização, e a família de receptores de cito-cinas que usam a subunidade gp130 para sinalização (Rodig et al., 1998).
[0011] Vários grupos estão envolvidos na sinalização de JAK- STAT em biologia de condrócitos. Li et al. (2001) mostraram que On- costatina M induz a expressão do gene MMP e TIMP3 em condrócitos primários pela ativação de vias de sinalização JAK/STAT e MAPK. Osaki et al. (2003) mostraram que a inibição mediada por interferon gama de colágeno II em condrócitos envolve sinalização JAK-STAT. IL1-beta induz o catabolismo da cartilagem através da redução da expressão de componentes da matriz, e por induzir a expressão de cola- genases e sintase induzível de óxido nítrico (NOS2), que media a pro-dução de óxido nítrico (NO). Otero et al., (2005) mostraram que a lep- tina e IL1-beta sinergicamente induziram a produção de NO ou expressão de mRNA NOS2 em condrócitos, e que essa foi bloqueada por um inibidor de JAK. Legendre et al. (2003) mostraram que IL6/Receptor de IL6 induziram a regulagem decrescente de genes específicos da cartilagem matriz de colágeno II, núcleo de agrecano e proteína de ligação em condrócitos articulares bovinos, e que este foi mediada pela sinalização JAK/STAT. Portanto, essas observações sugerem um papel para a atividade da quinase de JAK na homeostase de cartilaem e oportunidades terapêuticas para os inibidores de quinase de JAK.
[0012] Membros da família JAK têm sido envolvidos em condições adicionais, incluindo distúrbios mieloproliferativos (O'Sullivan et al, 2007, Mol Immunol. 44 (10):2497-506), em que as mutações em JAK2 foram identificadas. Isto indica que os inibidores de JAK, em particular JAK2, podem também ser úteis no tratamento de doenças mieloprolife- rativas. Além disso, a família JAK, em particular, JAK1, JAK2 e JAK3, tem sido associada a cânceres, em particular, leucemias, por exemplo, leucemia mieloide aguda (O'Sullivan et al, 2007, Mol Immunol 44 (10):2497-506;.. Xiang et al, 2008, "Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia" Blood First Edition Paper, Pré-publicado on-line em 26 de dezembro de 2007; DOI 10,1182/blood-2007-05-090308) e leucemia linfoblástica aguda (Mul- lighan et al, 2009) ou tumores sólidos, por exemplo, leiomiossarcoma uterino (Constantinescu et al, 2007, Trends in Biochemical Sciences 33 (3): 122-131.), câncer de próstata (Tam et al, 2007, British Journal of Cancer, 97, 378-383.). Estes resultados indicam que os inibidores de JAK, em particular de JAK1 e/ou JAK2, também podem ter utilidade no tratamento de cânceres (leucemias e tumores sólidos, por exemplo, leiomiossarcoma uterino, câncer de próstata).
[0013] Além disso, a doença de Castleman, mieloma múltiplo, glomerulonefrite proliferativa mesangial, psoriase, e sarcoma de Kaposi sâo provavelmente devidos à hipersecreçâo da citocina IL-6, cujos efeitos biológicos são mediados pela sinalização intracelular JAK- STAT (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto e Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3): S233-S242). Este resultado mostra que os inibidores de JAK, também podem encontrar utilidade no tratamento de tais doenças.
[0014] As terapias atuais não são satisfatórias e, desta maneira, permanece uma necessidade de identificar outros compostos, que podem ser de uso no tratamento de doenças degenerativas das articulações, por exemplo, osteoartrite, artrite reumatóide e osteoporose, em particular a osteoartrite. A presente invenção, portanto, provê um composto, métodos para sua fabricação e composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, juntamente com um veículo farmacêutico adequado. A presente invenção também provê o uso do composto da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças degenerativas das articulações. Especificamente, a presente invenção provê um novo inibidor de JAK que exi-be uma potência in vivo drasticamente melhorada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0015] A presente invenção se baseia na descoberta de que o composto da invenção é capaz de agir como um inibidor de JAK e que é útil para o tratamento de condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com hipersecreção de IL6. Em um aspecto específico o composto é um inibidor da JAK1 e JAK2. A presente invenção também provê métodos para a produção deste composto, uma composição farmacêutica compreendendo esse composto e métodos para o tratamento de condições in-flamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, a rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com hipersecreção de IL6 pela administração do composto da invenção.
[0016] Desse modo, em um primeiro aspecto da invenção, um composto da invenção é provido tendo a fórmula (I):
Figure img0001
[0017] O composto da invenção é um novo inibidor de JAK que aparece para exibir uma potência in vivo dramaticamente melhorada em comparação com compostos estruturalmente similares. Em uma modalidade particular, o composto da invenção é um inibidor de JAK1 e JAK2. Em particular, ele aparece para exibir esse aumento de potência em níveis de exposição in vivo inferiores em comparação com compostos estruturalmente similares. O uso de um composto com esses melhoramentos é esperado resultar em um requisito de dosagem mais baixa (e, desta maneira, um planejamento de administração melhorado).
[0018] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, e um veículo farmacêutico, excipiente ou diluente. Além do mais, o composto da invenção, útil nas composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos aqui no presente, é farmaceuticamente aceitável, como preparado e usado. Neste aspecto da invenção, a composição farmacêutica pode adicionalmente compreender princípios ativos adicionais apropriados para uso em combinação com o composto da invenção.
[0019] Em outro aspecto da invenção, esta invenção provê um método de tratar um mamífero suscetível a, ou sofrendo de, uma condição dentre aquelas listadas aqui no presente, e particularmente, tal condição pode estar associada com a atividade de JAK aberrante, por exemplo, condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, a rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e doenças associadas à hipersecreção de IL6, cujo método compreende administrar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, ou compostos da invenção descritos aqui no presente. Em uma modalidade específica a condição está associada com JAK1 aberrante e atividade JAK2.
[0020] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê o composto da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma condição selecionada daquelas listadas aqui no presente, particularmente condições como podem estar associadas com atividade de JAK aberrante, por exemplo, condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplante, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e doenças associadas à hipersecreção de IL6.
[0021] Em ainda outro método de aspecto de tratamento, esta invenção provê um método para o tratamento de um mamífero suscetível a, ou sofrendo de uma condição que é causalmente relacionada à atividade anormal de JAK como descrito aqui no presente, e compreende administrar uma quantidade eficaz para tratar a condição ou prevenir a condição da composição farmacêutica ou o composto da invenção descrito aqui no presente. Em um aspecto específico a condição é causalmente relacionada com atividade anormal de JAK1 e JAK2.
[0022] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê o composto da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma condição que é causalmente relacionada com a atividade JAK anormal.
[0023] Em aspectos adicionais, esta invenção provê métodos para sintetizar o composto da invenção, com protocolos sintéticos representativos e vias descritas mais tarde neste documento.
[0024] Assim, é um objetivo principal desta invenção prover um novo composto, que pode modificar a atividade de JAK e, assim, prevenir ou tratar quaisquer doenças que podem estar causalmente relacionadas a esta. Em um aspecto específico o composto da invenção modula a atividade de JAK1 e JAK2.
[0025] Consequentemente, é um objetivo principal da presente invenção prover um composto novo, que pode tratar ou aliviar doenças ou sintomas das mesmas, como condições inflamatórias, doenças au- toimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplante, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e doenças associadas com hipersecre- ção de IL6, que podem ser causalmente relacionadas à atividade de JAK, em particular, JAK1 e JAK2.
[0026] Um objetivo ainda adicional desta invenção é prover uma composição farmacêutica que pode ser usada no tratamento ou prevenção de uma variedade de estados de doença, incluindo as doenças associadas com atividade JAK, como condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplante, doenças envolvendo comprometimento da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e doenças associadas à hiperse- creção de IL6. Em uma modalidade específica, a doença está associada com a atividade JAK1 e JAK2.
[0027] Outros objetivos e vantagens se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir de uma consideração da próxima descrição detalhada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0028] Os termos a seguir se destinam a ter os significados apresentados com eles abaixo e são úteis para a compreensão da descrição e escopo pretendido da presente invenção.
[0029] Quando descrevendo a invenção, que pode incluir compostos, as composições farmacêuticas contendo tais compostos e métodos de usar tais compostos e composições, os termos a seguir, se presentes, têm os seguintes significados, a menos que indicado de outra maneira. Deve ser entendido que, quando descritas aqui no presente, qualquer uma das porções definidas abaixo pode ser substituída com uma variedade de substituintes, e que as definições respectivas são destinadas a incluir tais porções substituídas dentro do seu escopo, tal como estabelecido abaixo. A menos que estabelecido de outra maneira, o termo 'substituído' é para ser definido, tal como estabelecido abaixo. Deve ficar ainda compreendido que os termos "gru-pos" e "radicais" podem ser considerados intercambiáveis quando usados aqui no presente.
[0030] Os artigos 'a' e 'um' podem ser usados aqui no presente para se referir a um ou a mais de um (isto é, pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, "um análogo" significa um analógo ou mais de um analógo.
[0031] Como usado aqui no presente no presente, o termo "JAK"refere-se à família de quinases Janus (Jaks), que são quinases de ti- rosinas citoplasmáticas que transduzem sinalização de citocina a partir de receptores de membrana para fatores de transcrição STAT. Quatro membros da família JAK são descritos, JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2 e o termo JAK pode se referir a todos os membros da família JAK coletivamente ou um ou mais dos membros da família JAK como o contexto indica.
[0032] "Farmaceuticamente aceitável" significa aprovado ou apro- vável por uma agência reguladora do governo Federal ou um governo estadual ou a agência correspondente em outros países em vez dos Estados Unidos, ou que está relacionado na Farmacopeia dos EUA, ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente, em seres humanos.
[0033] "Sal farmaceuticamente aceitável"refere-se a um sal do composto da invenção que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto de origem. Em particular, tais sais não são tóxicos e podem ser sais de adição de ácidos inorgânicos ou orgânicos e sais de adição de base. Especificamente, tais sais incluem: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sul- fúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e similares; ou formados com ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido propiônico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láti- co, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, 3-(4- hidroxibenzeno) benzoico, ácido cinãmico, ácido mandélico, ácido me- tanossulfônico, ácido etanosulfônico, ácido 1,2-etano-dissulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 4- clorobenzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4- toluenossulfônico, ácido canforsulfônico, ácido 4-metilbiciclo[2,2,2]-oct- 2-eno-1-carboxílico, ácido gluco-heptônico, ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutãmico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucônico e similares, ou (2) sais formados quando um próton ácido presente no composto original ou é substituído por um íon de metal, por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon alcalinoterrosos, ou um íon de alumínio, ou coordena com uma base orgânica, como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N- metilglucamina e similares. Sais incluem ainda, apenas a título de exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetra- alquilamônio, e similares, e quando o composto contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos não tóxicos ácidos orgânicos ou inorgânicos, como o cloridrato, bromidrato, tartarato, mesilato, acetato, maleato, oxalato, e similares. O termo "cátion farmaceuticamente aceitável" refere-se a um contraíon catiônico aceitável de um grupo ácido funcional. Tais cátions são exemplificados por cátions de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetra-alquilamônio, e similares.
[0034] "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um dilu- ente, excipiente, adjuvante ou veículo com o qual o composto da invenção é administrado.
[0035] "Solvato" refere-se a formas do composto que estão associadas com um solvente, geralmente através de uma reação de solvó- lise. Esta associação física inclui ligações de hidrogênio. Os solventes convencionais incluem água, etanol, ácido acético e similares. O composto da invenção pode ser preparado, por exemplo, na forma cristalina e pode ser solvatado ou hidratado. Solvatos adequados incluem solvatos farmaceuticamente aceitáveis, tais como hidratos, e ainda incluem tanto solvatos estequiométricos e solvatos não estequiométri- cos. Em certos casos, o solvato será capaz de isolamento, por exemplo, quando uma ou mais moléculas de solvente são incorporadas na rede cristalina do sólido cristalino. "Solvato" abrange ambas, fase de solução e solvatos isoláveis. Solvatos representativos incluem hidratos, etanolatos e metanolatos.
[0036] "Indivíduo" inclui seres humanos. Os termos "ser humano", "paciente" e "indivíduo" são utilizados intercambiadamente neste documento.
[0037] "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade de um composto que, quando administrado a um indivíduo para tratar uma doença, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo do composto, a doença e sua gravidade, e a idade, peso, etc, do indivíduo a ser tratado.
[0038] "Prevenir" ou "prevenção"refere-se a uma redução do risco de adquirir ou desenvolver uma doença ou distúrbio (isto é, causando pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvolver em um indivíduo que pode estar exposto a um agente causador de doenças, ou com predisposição para a doença antes do início da doença).
[0039] O termo "profilaxia" é relacionado à "prevenção", e se refere a uma medida ou procedimento cujo objetivo é prevenir, ao invés de tratar ou curar uma doença. Exemplos não limitantes de medidas profiláticas podem incluir a administração de vacinas, a administração de heparina de baixo peso molecular para pacientes de hospitais em risco de trombose devido, por exemplo, a imobilização e a administração de um agente antimalária tais como a cloroquina, antes de uma visita a uma região geográfica onde a malária é endêmica, ou o risco de contrair malária é alto.
[0040] "Tratar" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio refere-se, em uma modalidade, a melhorar a doença ou distúrbio (isto é, interromper a doença ou reduzir a manifestação, extensão ou gravidade de, pelo menos, um dos sintomas clínicos da mesma). Em outra modalidade, "tratar" ou "tratamento"refere-se a melhorar pelo menos um parâmetro físico, que pode não ser perceptível pelo indivíduo. Em ainda outra modalidade, "tratar" ou "tratamento"refere-se a modular a doença ou distúrbio, tanto fisicamente (por exemplo, a estabilização de um sintoma visível), fisiologicamente, (por exemplo, a estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Em uma modalidade adicional, "tratar" ou "tratamento"refere-se a retardar a progressão da doença.
[0041] Como usado aqui no presente o termo "condição(ões) in- flamatória(s)" se refere ao grupo de condições, incluindo, artrite reuma- toide, osteoartrite, artrite idiopática juvenil, psoriase, doença alérgica das vias aéreas (por exemplo, asma, rinite), doenças inflamatórias intestinais (doença de Crohn, colite), os estados de doença acionados por endotoxina (por exemplo, complicações após cirurgia de revascu- larização ou estados de endotoxina crônica contribuindo, por exemplo, para insuficiência cardíaca crônica), e doenças relacionadas, envolvendo cartilagem, como as das articulações. Particularmente, o termo se refere à artrite reumatóide, osteoartrite, doença alérgica das vias respiratórias (asma, por exemplo) e doenças inflamatórias intestinais.
[0042] Como usado aqui no presente, o termo "doença(s) autoi- mune(s)" se refere ao grupo de doenças, incluindo doença obstrutiva das vias aéreas, incluindo condições como a DPOC, asma (por exemplo, asma intrínseca, asma extrínseca, asma de poeira, asma infantil), especialmente asma crônica ou inveterada (por exemplo, asma tardia e hiper-responsividade das vias aéreas), bronquite, incluindo asma brônquica, lúpus eritematoso sistêmico (LES), esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo I e as complicações que lhe estão associadas, o eczema atópico (dermatite atópica), dermatite de contato e dermatite eczematosa adicional, doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), aterosclerose e esclerose lateral amiotrófica. Particularmente o termo se refere à DPOC, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus tipo I e doença inflamatória intestinal.
[0043] Como usado aqui no presente, o termo "doença(s) prolifera- tiva(s)" se refere às condições tais como câncer (por exemplo, leiomiossarcoma uterino ou câncer de próstata), doenças mieloproliferativas (por exemplo, policitemia vera, trombocitose essencial e mielofibrose), leucemia (por exemplo, leucemia mieloide aguda e leucemia linfoblás- tica aguda), mieloma múltiplo, psoriase, reestenose, esclerodermite, ou fibrose. Em particular, o termo se refere ao câncer, leucemia, mi- eloma múltiplo e psoríase.
[0044] Como usado aqui no presente, o termo "câncer" se refere a um crescimento maligno ou benigno de células na pele ou nos órgãos do corpo, por exemplo, mas sem limitação mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Um câncer tende a se infiltrar no tecido adjacente e se espalhar (metástase) para órgãos distantes, por exemplo, ossos, fígado, pulmão ou o cérebro. Como usado aqui no presente, o termo câncer inclui ambos os tipos de células de tumor metastático, tais como, mas não limitado a, linfoma, melanoma, leucemia, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e mastocitoma e os tipos de carcinoma de tecidos, tais como mas não limitado a, o câncer colorre- tal, câncer de próstata, câncer de pulmão de pequenas células e câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer primário do fígado, câncer de ovário, câncer de próstata e leiomiossarcoma uterino.
[0045] Como usado aqui no presente, o termo "leucemia" se refere às doenças neoplásicas do sangue e dos órgãos formadores do sangue. Tais doenças podem causar disfução da medula óssea e do sistema imunológico, o que torna o hospedeiro altamente suscetível à infecção e sangramento. Em particular, o termo leucemia se refere à leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoblástica aguda (LLA).
[0046] Como usado aqui no presente, o termo "rejeição de transplante" se refere à rejeição aguda ou crónica das células, tecidos ou de órgãos sólidos ou alo ou xenoenxertos de, por exemplo, ilhotas pancreáticas, células-tronco, medula óssea, pele, músculo, tecido da córnea, tecido neuronal, coração, pulmão, combinação coração- pulmão, rim, fígado, intestino, pâncreas, traqueia, ou esôfago, ou doenças enxerto-versus-hospedeiro.
[0047] Como usado aqui no presente, o termo "doenças envolven- do comprometimento da renovação de cartilagem" inclui condições como osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatoide juvenil, artrite gotosa, artrite séptica ou infecciosa, artrite reativa, distrofia simpático- reflexa, algodistrofia, síndrome de Tietze ou condrite costal, fibromial- gia, osteocondrite, artrite neurogênica ou neuropática, artropatia, formas endêmicas de artrite como osteoartrite deformante endemica, doença de Mseleni e doença de Handigodu; degeneração resultante da fibromialgia, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia e espondilite anquilosante.
[0048] Como usado aqui no presente, o termo "malformação congênita da cartilagem(ns)" inclui condições como condrólise hereditária, condrodisplasias e pseudocondrodisplasias, em particular, mas sem limitação, microtia, anotia, condrodisplasia metafisária, e distúrbios relacionados.
[0049] Como usado aqui no presente, o termo "doença(s) associadas à hipersecreção de IL6" inclui condições como a doença de Castleman, mieloma múltiplo, psoríase, sarcoma de Kaposi e/ou glomeru- lonefrite proliferativa mesangial.
[0050] "Composto da presente invenção", e expressões equivalentes, destinam-se a abranger o composto da Fórmula como acima descrito, que inclui a expressão sais farmaceuticamente aceitáveis, e os solvatos, por exemplo, hidratos, e solvatos dos sais farmaceuticamente aceitáveis, onde o contexto o permitir. Da mesma forma, a referência a intermediários, quer sejam ou não eles mesmos reivindicados, se destina a abranger os seus sais e solvatos, onde o contexto o permitir.
[0051] Outros derivados do composto desta invenção têm atividade em ambas as suas formas de ácido e derivados de ácido, mas na forma de ácido sensível, muitas vezes oferece vantagens de solubilidade, compatibilidade de tecido, ou a liberação retardada no organismo de mamíferos (ver, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp 7-9, 21- 24, Elsevier, Amsterdam, 1985).
[0052] Como usado aqui no presente, o termo "variante isotópica" refere-se a um composto que contém proporções de isótopos não naturais em um ou mais dos átomos que constituem tal composto. Por exemplo, uma "variante isotópica" de um composto pode conter um ou mais isótopos não radioativos, como por exemplo, deutério (2H ou D), carbono-13 (13C), nitrogênio-15 (15N), ou similares. Será entendido que, em um composto quando a substituição isotópica é feita, os átomos seguintes, quando presentes, podem variar, de modo que, por exemplo, qualquer hidrogênio pode ser 2H/D, qualquer carbono pode ser 13C, ou qualquer nitrogênio pode ser 15N, e que a presença e co-locação de tais átomos pode ser determinada dentro da habilidade da técnica. Da mesma forma, a invenção pode incluir a elaboração de variantes isotópicas com radioisotopes, no caso, por exemplo, onde os compostos resultantes podem ser usados para o fármaco e/ou estudos de distribuição de tecido do substrato. Os isótopos radioativos de trítio, ou seja, 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente úteis para este propósito em vista de sua facilidade de incorporação e meios imediatos de detecção. Além disso, compostos podem ser preparados que são substituídos com isótopos emissores de positrons, tais como 11C, 18F, 150 e 13N, e seriam úteis em estudos de Topografia de Emissão de Positrons (TEP) pelo exame de ocupação dos receptores do substrato.
[0053] Todas as variantes isotópicas do composto providas aqui no presente, radioativos ou não, se destinam a ser abrangidas no escopo da invenção.
[0054] "Tautômeros" se referem a compostos que são formas in- tercambiáveis de uma estrutura de composto particular, e que variam no deslocamento de átomos de hidrogênio e elétrons. Assim, duas estruturas podem estar em equilíbrio através de movimento dos elétrons π e um átomo (geralmente H). Por exemplo, enóis e cetonas são tautômeros, porque eles são rapidamente interconvertidos pelo tratamento com ácido ou base. Outro exemplo de tautomeria são as formas aci- e nitro- de fenilnitrometano, que são igualmente formadas por tratamento com ácido ou base.
[0055] Formas tautoméricas podem ser relevantes para a realização da reatividade química e atividade biológica ideal de um composto de interesse.
O COMPOSTO
[0056] A presente invenção se baseia na descoberta de que o composto da invenção é um inibidor de JAK e que é útil para o tratamento de condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação de cartilagem, malformações congênitas de cartilagem, e doenças associadas à hipersecreção de IL6. A presente invenção também provê métodos para a produção do composto da invenção, composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção e métodos para o tratamento de condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, a rejeição de transplantes, doenças envolvendo comprometimento da renovação de cartilagem, malformações congênitas de cartilagem, e doenças associadas à hipersecreção de IL6 pela administração do composto da invenção. Em uma modalidade específica do composto da invenção é um inibidor da JAK1 e JAK2.
[0057] Assim, em um primeiro aspecto da invenção, o composto da invenção é descrito tendo uma fórmula (I):
Figure img0002
[0058] Em uma modalidade o composto da invenção não é uma variante isotópica.
[0059] O composto da invenção é um novo inibidor de JAK. Em particular, o composto é um potente inibidor de JAK1 e JAK2, no entanto, inibe TYK2 e JAK3 com menor potência.
[0060] O composto da invenção apresenta uma potência in vivo dramaticamente melhorada. Estas melhorias são especificamente e, surpreendentemente, vistas mesmo em compostos estruturalmente semelhantes. O uso de um composto com estas melhorias podem resultar em uma menor necessidade de dosagem (e, portanto, um programa de administração melhorado).
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0061] Quando empregado como um produto farmacêutico, o composto desta invenção é geralmente administrado na forma de uma composição farmacêutica. Tais composições podem ser preparadas de uma forma bem conhecida na técnica farmacêutica e incluem pelo menos um composto ativo. Geralmente, o composto desta invenção é administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade do composto realmente administrada normalmente será determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente, e similares.
[0062] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo oral, retal, trans- dérmica, subcutânea, intra-articular, intravenosa, intramuscular, e in- tranasal. Dependendo da via de liberação desejada, o composto desta invenção é preferencialmente formulado como composições injetáveis ou de via oral ou como pomadas, como loções ou como emplastros, tudo para a administração transdérmica.
[0063] As composições para administração oral podem assumir a forma de soluções ou suspensões líquidas a granel ou em pó a granel. Mais comumente, no entanto, as composições são apresentadas em formas de dosagem unitárias para facilitar a dosagem exata. O termo "formas de dose unitária"refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para seres humanos e outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico, veículo ou transportador adequado. Formas de dose unitária típicas incluem ampolas ou seringas pré-cheias, pré-medidos das composições líquidas ou pílulas, comprimidos, cápsulas ou similares, no caso de composições sólidas. Em tais composições, o composto da invenção é geralmente um componente pequeno (de cerca de 0,1 a cerca de 50% em peso ou, de preferência de cerca de 1 a cerca de 40% em peso) com o restante sendo vários veículos ou portadores e auxiliares de processamento úteis para a formação da forma de dosagem desejada.
[0064] Formas líquidas apropriadas para administração oral podem incluir um veículo aquoso ou não aquoso apropriado, com tampões, agentes de suspensão e distribuição, corantes, flavorizantes e similares. Formas sólidas podem incluir, por exemplo, qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza semelhante: um ligante, como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente como o amido ou lactose, um agente de desintegração, como o ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, como estearato de magnésio, um glidante como o dióxido de silício coloidal, um agente adoçante como a sacarose ou sacarina, ou um agente flavorizante, como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou fla- vorizantes de laranja.
[0065] Composições injetáveis são tipicamente baseadas em salina estéril injetável ou salina tamponada de fosfato ou outros veículos injetáveis conhecidos na técnica. Como antes, o composto ativo em tais composições é tipicamente um componente menor, muitas vezes sendo de cerca de 0,05 a 10% em peso com o restante sendo um veículo injetável e similares.
[0066] Composições transdérmicas são geralmente formuladas como uma pomada tópica ou creme que contém o(s) ingrediente(s) ativo(s), geralmente em uma quantidade variando de cerca de 0,01 a cerca de 20% em peso, de preferência de cerca de 0,1 a cerca de 20% em peso, de preferência de cerca de 0,1 a cerca de 10% em peso, e mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 15% em peso. Quando formulada como uma pomada, os ingredientes ativos normalmente são combinados com qualquer base de pomada parafínica ou uma pomada miscível em água. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser formulados em um creme com, por exemplo, uma base de creme de óleo em água. Tais formulações transdérmicas são bem conhecidas na técnica e geralmente incluem ingredientes adicionais para aumentar a penetração cutânea de estabilidade dos ingredientes ativos ou da formulação. Todas essas formulações transdérmicas conhecidas e os ingredientes são incluídos no escopo da presente invenção.
[0067] O composto da invenção também pode ser administrado por um dispositivo transdérmico. Desse modo, a administração trans- dérmica pode ser feita usando um emplastro tanto do tipo reservatório ou de membrana porosa, ou de uma variedade de matriz sólida.
[0068] Os componentes acima descritos para composições administráveis oralmente, injetáveis ou tópicas são meramente representativos. Outros materiais, como também técnicas de processamento e similares são estabelecidas na parte 8 do Pharmaceutical Sciences da Remington, 17 a edição, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, que é incorporado aqui no presente por referência.
[0069] O composto da invenção pode também ser administrado em formas de liberação sustentada, ou de sistemas de liberação de fármacos sustentados. Uma descrição de materiais de liberação sustentada representativos pode ser encontrada em Ciências Farmacêuticas da Remington.
[0070] Os exemplos a seguir ilustram composições farmacêuticas representativas que podem ser preparadas de acordo com esta invenção. A presente invenção, no entanto, não se limita às composições farmacêuticas a seguir.
Formulação 1 - Comprimidos
[0071] O composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante seco de gelatina, em uma relação de peso aproximada de 1:2. Uma quantidade pequena de estearato de magnésio pode ser adicionada como um lubrificante. A mistura pode ser formada em comprimidos de 240-270 mg (80-90 mg do composto amida ativo por comprimido) em uma carteia de comprimidos.
Formulação 2 - Cápsulas
[0072] O composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um diluente de amido em uma relação de peso aproximada de 1:1. A mistura pode ser preenchida em cápsulas de 250 mg (125 mg do composto de amida ativo por cápsula).
Formulação 3 - Líquida
[0073] O composto da invenção (125 mg), pode ser misturado com sacarose (1,75 g) e goma de xantano (4 mg), e a mistura resultante pode ser misturada, passada por uma malha No. 10 de uma peneira dos EUA, e depois misturada com uma solução feita anteriormente de celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio (11:89, 50 mg) em água. Benzoato de sódio (10 mg), sabor e cor pode ser diluído com água e acrescentado, com agitação. Água suficiente pode então ser adicionada com agitação. Água adicional suficiente pode ser então adicionada para produzir um volume total de 5 mL.
Formulação 4 - Comprimidos
[0074] O composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante seco de gelatina em uma relação de peso aproximada de 1:2. Uma pequena quantidade de estearato de magnésio pode ser adicionada como um lubrificante. A mistura pode ser formada em comprimidos de 450-900 mg (150-300 mg do composto ami- da ativo) em uma carteia de comprimidos.
Formulação 5 - Injeção
[0075] O composto da invenção pode ser dissolvido ou suspenso em um meio estéril injetável tamponado aquoso salino a uma concentração de cerca de 5 mg/mL.
Formulação 6 - Tópica
[0076] Álcool estearílico (250 g) e um petrolato branco (250 g) podem ser derretidos em cerca de 75° C e, em seguida, uma mistura do composto da invenção (50 g) metilparabeno (0,25 g), propilparabeno (0,15 g), lauril sulfato de sódio (10 g) e propilenoglicol (120 g) dissolvidos em água (cerca de 370 g) podem ser adicionados e a mistura resultante pode ser agitada até que ela congele.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0077] O composto da invenção pode ser usado como um agente terapêutico para o tratamento de condições em mamíferos que são causalmente relacionadas ou atribuíveis à atividade aberrante de JAK. Em particular, as condições relacionadas à atividade berrante de JAK1 e/ou JAK2. Assim, o composto e as composições farmacêuticas da invenção encontram uso como terapêutica para prevenir e/ou tratar condições inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição de transplante, doenças envolvendo comprometimento da renovação de cartilagem, malformações congênitas de cartilagem, e doenças associadas à hipersecreção de IL6 em mamíferos, incluindo os seres humanos.
[0078] Em método adicional de aspectos de tratamento, esta invenção provê métodos de tratar um mamífero suscetível ou sofrendo com uma condição inflamatória. Os métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz de tratamento de condição ou prevenção de condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a condição inflamatória é selecionada entre artrite reumatóide, osteoar- trite, doença alérgica das vias respiratórias (asma, por exemplo) e doenças inflamatórias intestinais.
[0079] Em outro aspecto, a presente invenção provê o composto da invenção para uso no tratamento, prevenção, ou profilaxia de uma condição inflamatória. Em uma modalidade específica, a condição inflamatória é selecionada a partir de artrite reumatóide, osteoartrite, doença alérgica das vias respiratórias (asma, por exemplo) e doenças inflamatórias intestinais.
[0080] Em método adicional de aspectos de tratamento, esta invenção provê métodos de tratar um mamífero suscetível ou sofrendo de uma doença autoimune. Os métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz para tratamento da condição ou prevenção da condição, de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença autoimune é selecionada de DPOC, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus tipo I e doença inflamatória intestinal.
[0081] Em outro aspecto, a presente invenção provê o composto da invenção para uso na prevenção, tratamento ou profilaxia de uma doença autoimune. Em uma modalidade específica, a doença autoi- mune é selecionada a partir de DPOC, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus tipo I e doença inflamatória intestinal.
[0082] Em método adicional dos aspectos do tratamento, esta invenção provê métodos de tratar um mamífero suscetível a ou sofrendo de uma doença proliferativa, nomeadamente câncer (por exemplo, tumores sólidos, como leiomiossarcoma uterino ou câncer de próstata), leucemia (por exemplo, LMA ou LLA), mieloma múltiplo e/ou psoríase.
[0083] Em outro aspecto, a presente invenção provê o composto da invenção para uso na prevenção, tratamento ou profilaxia de uma doença proliferativa, nomeadamente câncer (por exemplo, tumores sólidos, como leiomiossarcoma uterino ou câncer de próstata), leucemia (por exemplo, LMA ou LLA), mieloma múltiplo e/ou psoríase.
[0084] Em método adicional dos aspectos do tratamento, esta invenção provê métodos de tratar um mamífero suscetível ou afligido com rejeição de transplante. Em uma modalidade específica, a invenção proporciona métodos de tratamento de rejeição de órgãos transplantados.
[0085] Em outro aspecto da presente invenção provê o composto da invenção para uso na prevenção, tratamento ou profilaxia de rejeição de transplante. Em uma modalidade específica, a invenção proporciona métodos de tratamento de rejeição de órgãos transplantados.
[0086] Em um método de aspecto de tratamento, esta invenção provê um método de prevenção, tratamento ou profilaxia em um mamífero suscetível ou portador de doenças envolvendo disfunção da renovação de cartilagem, cujo método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos da invenção, ou uma ou mais das composições farmacêuticas aqui neste documento descritas.
[0087] Em outro aspecto, a presente invenção provê o composto da invenção para uso no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças envolvendo disfunção da renovação de cartilagem.
[0088] A presente invenção também provê um método de tratamento de malformações congênitas de cartilagem, cujo método compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou o composto da invenção aqui descrito.
[0089] Em outro aspecto a presente invenção provê o composto da invenção para uso na prevenção, tratamento ou profilaxia de malformações congênitas de cartilagem.
[0090] Em um método adicional dos aspectos do tratamento, esta invenção provê métodos de tratar um mamífero suscetível ou afligido com doenças associadas à hipersecreção de IL6, em particular, doença de Castleman ou glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[0091] Em outro aspecto, a presente invenção provê o composto da invenção para uso no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças associadas com hipersecreção de IL6, em particular, doença de Castleman ou glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[0092] Como um aspecto adicional da invenção é provido o composto da invenção para uso como um produto farmacêutico especialmente no tratamento ou prevenção das condições e doenças acima mencionadas. Aqui também é fornecido o uso dos compostos presentes na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma das condições e doenças acima mencionadas.
[0093] Um regime especial do presente método compreende a administração a um indivíduo sofrendo de uma doença que envolve inflamação, de uma quantidade efetiva de um composto da invenção por um período de tempo suficiente para reduzir o nível de inflamação no indivíduo, e de preferência interromper os processos responsáveis pela tal inflamação. Uma modalidade especial do método compreende administrar uma quantidade eficaz do composto da invenção a um paciente sofrendo de ou suscetível ao desenvolvimento de artrite reuma- toide, por um período de tempo suficiente para reduzir ou impedir, respectivamente, inflamação nas articulações do referido paciente, e de preferência terminar, os processos responsáveis pela dita inflamação.
[0094] Um regime mais específico do presente método compreende a administração a um indivíduo sofrendo de uma condição de doença caracterizada por degradação de cartilagem ou articular (por exemplo, artrite reumatoide e/ou osteoartrite) de uma quantidade eficaz do composto da invenção por um período de tempo suficiente para reduzir e, de preferência finalizar os processos autoperpétuos responsáveis pela dita degradação. Uma modalidade particular do método compreende administração de uma quantidade eficaz do composto da invenção a um paciente sofrendo de ou suscetível ao desenvolvimento da osteoartrite, por um período de tempo suficiente para reduzir ou impedir, respectivamente, a degradação da cartilagem nas articulações do referido paciente, e de preferência terminar, os processos autoper- petuados responsáveis pela dita degradação. Em uma modalidade particular, o dito composto pode apresentar propriedades anabolizan- tes e/ou anticatabólico da cartilagem.
[0095] Níveis de doses de injeção variam de cerca de 0,1 mg/kg/hora, a pelo menos, 10 mg/kg/hora, todos para a partir de cerca de 1 a cerca de 120 horas e, especialmente 24 a 96 horas. Um bolo de pré-carga de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou mais também pode ser administrado para alcançar níveis adequados de estado estacionário. A dose máxima total não deverá ultrapassar cerca de 2 g/dia para um paciente humano de 40-80 Kg.
[0096] Para a prevenção e/ou tratamento de condições de longo prazo, tais como condições degenerativas, o regime de tratamento geralmente se estende por muitos meses ou anos de modo que a administração oral é a preferido para a conveniência e tolerância do paciente. Com dosagem oral, uma a cinco e, especialmente, duas a quatro e, normalmente, três doses por via oral por dia, são regimes representativos. Com estes padrões de dosagem, cada dose provê a partir de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg do composto da invenção, com doses específicas cada provendo de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg e, especialmente, cerca de 1 a cerca de 5 mg/kg.
[0097] Doses transdérmicas são geralmente selecionadas para prover níveis sanguíneos semelhantes ou inferiores aos obtidos utilizando doses de injeção.
[0098] Quando usado para prevenir o aparecimento de uma condição inflamatória, o composto da invenção será administrado a um paciente em risco de desenvolver a condição, normalmente sob o conselho e a supervisão de um médico, nos níveis de dosagem descritos acima. Pacientes em risco de desenvolver uma condição particular em geral incluem aqueles que têm uma história familiar da doença, ou aqueles que foram identificados por testes genéticos ou de triagem a ser particularmente suscetíveis a desenvolver a condição.O composto da invenção podem ser administrado como o único agente ativo ou pode ser administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, incluindo outros compostos que demonstram a mesma ou uma atividade terapêutica semelhante, e que estão determinados como seguros e eficazes para tal administração combinada. Em uma modalidade específica, a coadministração de dois (ou mais) agentes permite doses significativamente mais baixas de cada um ser usada, reduzindo assim os efeitos colaterais observados.
[0099] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que envolve inflamação; determinados agentes inclu- em, mas não estão limitados a, agentes imunorreguladores, por exemplo, azatioprina, corticosteroides (por exemplo, prednisolona ou dexa- metasona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, micofenolato de mofetil, muromonab-CD3 (OKT3, por exemplo, Orthocolone®), ATG, aspirina, paracetamol, ibuprofeno, naproxeno e piroxicam.
[00100] Em uma modalidade, o composto da invenção é co- administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de artrite (por exemplo, artrite reumatóide); determinados agentes incluem mas não estão limitados a analgésicos, fármacos não esteroides anti-inflamatórios (AINEs), esteróides, DMARDS sintéticos (por exemplo, mas sem limitação metotrexato, leflunomida, sulfassala- zina, auranofina, aurotiomalato de sódio, penicilamina, cloroquina, hi- droxicloroquina, azatioprina e ciclosporina), e DMARDS biológicos (por exemplo, mas sem limitação Infliximab, etanercept, adalimumab, Rituximab e Abatacept).
[00101] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios prol iterativos; determinados agentes incluem, mas não estão limitados a: metotrexato, leukovorin, adriamicina, prenisona, ble- omicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila, paclitaxel, docetaxel, vincristi- na, vinblastina, vinorelbina, doxorrubicina, tamoxifeno, tamorifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti- HER2 (por exemplo, Herceptin™), capecitabina, cloridrato de raloxifene, inibidores de EGFR (por exemplo, Iressa®, Tarceva™, Erbitux™), inibidores de VEGF (por exemplo, Avastin™), inibidores dE proteas- soma (por exemplo, Velcade™), Glivec ® e inibidores DE hsp90 (por exemplo, 17-AAG). Além disso, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outras terapias, incluindo mas não limitado a, radioterapia ou cirurgia. Em uma modalidade específica, a doença proliferativa é selecionada a partir de câncer, doença mielopro- liferativa ou leucemia.
[00102] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes, em particular agentes incluem mas não estão limitados a: glicocorticoides, agentes citostáticos (por exemplo, análogos de purina), agentes alquilantes, (por exemplo, mostardas de nitrogênio (ciclofosfamida), nitrosoureias, compostos de platina, e outros), antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, azatioprina e mercaptopu- rina), antibióticos citotóxicos (por exemplo, dactinomicina antraciclinas, mitomicina C, bleomicina e mitramicina), anticorpos (por exemplo, anti- CD20, anti-CD25 ou anti-CD3 (OTK3) anticorpos monoclonais, Atgam ® e Timoglobulina ®), ciclosporina, tacrolimus, rapamicina (sirolimus), interferons (por exemplo, IFN-β), proteínas de ligação TNF (por exemplo, infliximab (Remicade™), etanercept (Enbrel™), ou adalimumab (Humira™)), micofenolato, Fingolimod e Miriocina.
[00103] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção da rejeição de transplante, em particular agentes incluem mas não estão limitados a: inibidores da calcineurina (por exemplo, ciclosporina ou tacrolimus (FK506)), inibidores de mTOR (por exemplo, sirolimus, everolimus), antiproliferatives (por exemplo, azatioprina, ácido micofe- nólico), corticosteroides (por exemplo, prednisolona, hidrocortisona), anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais de receptores anti-IL- 2Ra, basiliximab, daclizumab), amticorpos policlonais anticélulas T (por exemplo, globulina antitimócito (ATG), globulina antilinfócito (ALG)).
[00104] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de asma e/ou rinite e/ou DPOC, determinados agentes incluem mas não estão limitados a: agonistas de beta2-adrenérgicos (por exemplo, salbutamol, levalbuterol, terbutalina e bitolterol), epinefrina (inalado ou comprimidos), anticolinérgicos (por exemplo, brometo de ipratrópio), glicocorticoides (orais ou inalatórios) agonistas β2 de longa duração (por exemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol, e albuterol oral de liberação sustentada), combinações de esteroides inalados e broncodi- latadores de longa duração (por exemplo, fluticasona/salmeterol, bu- desonida/formoterol), antagonistas dos leucotrienos e inibidores da síntese (por exemplo, montelucast, zafirlucast e zileuton), inibidores da liberação de mediadores (por exemplo, cromoglicato e cetotifeno), reguladores biológicos de resposta IgE (por exemplo, omalizumab), anti- histamínicos (por exemplo, ceterizina, cinarizina, fexofenadina) e va- soconstritores (por exemplo, oximetazolina, xilometazolina, nafazolina e tramazolina).
[00105] Além disso, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com terapias de emergência para asma e/ou DPOC, tais terapias incluem administração de oxigênio ou heliox, ne- bulização de salbutamol ou terbutalina (opcionalmente combinado com um anticolinérgico (por exemplo, ipratrópio), esteroides sistêmicos (orais ou intravenosos, por exemplo, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona ou hidrocortisona), salbutamol intravenoso, beta-agonistas não específicos, injetados ou inalados (por exemplo, epinefrina, isoetarina, isoproterenol, metaproterenol), antico-linérgicos (IV ou nebulizados, por exemplo, glicopirrolato, atropina, ipratrópio), metilxantinas (teofilina, aminofilina, bamifilina), anestésicos inalatórios que têm um efeito broncodilatador (por exemplo, isoflurano, halotano, enflurano), cetamina e sulfato de magnésio intravenoso.
[00106] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção da IBD, em particular agentes incluem, mas não estão limitados a: glicocorticoides (por exemplo, prednisona, budesonida) agentes sintéti- cos imunomoduladores, modificadores de doenças (por exemplo, metotrexato, leflunomide, sulfassalazina, mesalazina, azatioprina, 6- mercaptopurina e ciclosporina) e agentes biológicos imunomoduladores, modificadores de doenças (infliximab, adalimumab, rituximab, e abatacept).
[00107] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de LES, em particular agentes incluem mas não estão limitados a: fármacos antirreumáticos modificadores de doenças (DMARDs), tais como antimaláricos (por exemplo, Plaquenil, hidroxicloroquina), imu- nossupressores (por exemplo, metotrexato e azatioprina), ciclofosfamida e ácido micofenólico; fármacos imunossupressores e analgésicos, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteroides, opiáceos (por exemplo, dextropropoxifeno e co-codamol), opioides (por exemplo, hidrocodona, oxicodona, MS Contin, ou metadona) e o emplastro transdérmico duragésico fentanil.
[00108] Em uma modalidade, o composto da invenção é coadminis- trado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de psoriase, em particular agentes incluem mas não estão limitados a: tratamentos tópicos, tais como soluções de banho, hidratantes, cremes e pomadas e unguentos contendo alcatrão de carvão, Dithranol (antra- lina), corticosteroides como desoximetasona (Topicort™), fluocinonide, análogos da vitamina D3 (por exemplo, calcipotriol), retinoides Argan oiland (etretinato, acitretina, tazarotene), tratamentos sistêmicos, como o metotrexato, ciclosporina, os retinoides, tioguanina, hidroxiureia, sulfassalazina, micofenolato mofetil, azatioprina, tacrolimus, ésteres de ácido fumárico ou biológicos, tais como Amevive™, Enbrel,™Humira, Remicade™, Raptiva™ e ustekinumab (um bloqueador de IL-12 e IL- 23). Além disso, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outras terapias, incluindo mas não limitado a fotote- rapia ou fotoquimioterapia (por exemplo, psoraleno e fototerapia ultra-violeta A (PUVA)).
[00109] Pela coadministração está incluído qualquer meio de liberação de dois ou mais agentes terapêuticos para o paciente como parte do mesmo regime de tratamento, como será evidente para a pessoa qualificada. Embora os dois ou mais agentes possam ser administrados simultaneamente em uma única formulação, isso não é essencial. Os agentes podem ser administrados em diferentes formulações e em diferentes momentos.
PROCEDIMENTOS SINTÉTICOS GERAIS Geral
[00110] O composto da invenção e os exemplos comparativos descritos em W02010010190 podem ser preparados a partir de matérias- primas disponíveis usando os seguintes métodos e procedimentos gerais. Será apreciado que onde as condições de processo típicas ou preferenciais (isto é, as temperaturas de reação, tempo, razões molares dos reagentes, solventes, pressões, etc) são dadas, as condições de outro processo também podem ser usadas a menos que indicado de outra forma. Condições ótimas de reação podem variar de acordo com os reagentes em particular ou solvente usado, mas tais condições podem ser determinadas por um técnico no assunto por meio de processos de otimização de rotina.
[00111] Além disso, como será evidente para aqueles versados na técnica, grupos de proteção convencionais podem ser necessários para evitar que certos grupos funcionais de sofrer reações indesejáveis. A escolha de um grupo de proteção adequado para um determinado grupo funcional, bem como condições adequadas de proteção e desproteção são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, numerosos grupos de proteção, e sua introdução e remoção, estão descritas em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protecting Grupos in Organic Synthe- sis, Segunda Edição, Wiley, New York, 1991, e referências citadas nele.
[00112] Os métodos a seguir estão apresentados com detalhes quanto a preparação do composto da invenção como aqui acima definidos e os exemplos comparativos. O composto da invenção e os exemplos comparativos podem ser preparados a partir de matérias- primas e reagentes conhecidos ou disponíveis comercialmente por um habilidoso na técnica de síntese orgânica.
[00113] Todos os reagentes foram de grau comercial e foram usados como recebidos, sem purificação adicional, salvo indicação em contrário. Solventes anídricos comercialmente disponíveis foram usados para reações conduzidas sob atmosfera inerte. Solventes de grau reagente foram usados em todos os outros casos, salvo indicação em contrário. Cromatografia em coluna foi realizada em sílica-gel 60 (35- 70 pm). Cromatografia em camada delgada foi realizada utilizando placas F-254 pré-revestidas de sílica-gel (0,25 mm de espessura).
[00114] Espectros 1H RMN foram gravados em um espectômetro Bruker DPX 400 RMN (400 MHz). Deslocamentos químicos (õ) para espectros 1H RMN foram reportados em partes por milhão (ppm) relativo a tetrametilsilano (õ 0,00) ou o pico de solvente residual apropriado, isto é, CHCI3 (õ 7,27), como referência interna. Multiplicidades são dadas como singleto (s), dubletos (d), tripleto (t), quarteto (q), multiple- to (m) e ampla (br). Constantes de acoplamento (J) são dadas em Hz. Espectros de Eletrospray MS foram obtidos em um espectômetro de plataforma Micromass LC/MS. Coluna Usada para todas as análises LCMS: Águas Acquity UPLC BEH C18 1,7pm, 2,1mm ID x 50mm L (Part No, 186002350)). HPLC preparativa: Águas XBridge Prep C18 5pm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No, 186002978). Todos os métodos usam gradientes MeCN/H2O. H2O contêm ou 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3.Lista de abreviaturas usadas na seção experimental: DCM: Diclorometano DiPEA: N, A/-di-isopropiletilamina MeCN Acetonitrila BOC ferc-Butilóxi-carbonila DMF /V;/V-dimetilformamida TFA Ácido Trifluoroacético THF Tetra-hidrofurano RMN Ressonância Nuclear Magnética DMSO Dimetilsulfóxido DPPA Difenilfosforilazida LC-MS Cromatografia Líquida-Espectometria de Massa Ppm partes-por-milhão EtOAc Acetato de etila APCI Pressão atmosférica de ionização química Rt Tempo de retenção s Singleto brs Singleto amplo m Multipleto d Dubleto PdChdppf [1,T-Bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloropaládio(ll) TEA Trietilamina
Preparação Sintética do Composto da Invenção e Exemplos Comparativos
[00115] O composto da invenção e os exemplos comparativos podem ser produzidos de acordo com o seguinte esquema. Método Sintético Geral Esquema 1
Figure img0003
[00116] em que Ar representa fenil-L1-heterocicloalquila, onde L1 é uma ligação, CH2- ou -CO- e 0 grupo heterocicloalquila é opcionalmente substituído.Geral 1.1.1 1-(6-Bromo-Diridin-2-U)-3-carboetóxi-tioureia (2)
Figure img0004
[00117] Para uma solução de 2-amino-6-bromopiridina (1) (253,8 g, 1,467 mol) em DCM (2,5 L) resfriada a 5o C é adicionado isotiocianato de etoxicarbonila (173,0 ml_, 1,467 mol) gota a gota durante 15 min. A mistura de reação é então deixada para aquecer a temperatura ambiente (20° C) e agitada por 16 horas. Evaporação in vacuodá um sólido que pode ser coletado por filtração, completamente lavado com gasolina (3x600 ml_) e seco com ar para render (2). A tioureia pode ser usada como tal para a próxima etapa sem qualquer purificação. 1H (400 MHz, CDCh) δ 12,03 (1H, br s, NH), 8,81 (1H, d, J 7,8 Hz, H-3), 8,15 (1H, br s, NH), 7,60 (1H, t, J 8,0 Hz, H-4), 7,32 (1H, dd, J 7,7 e 0,6 Hz, H-5), 4,31 (2H, q, J 7,1 Hz, CH2), 1,35 (3H, t, J 7,1 Hz, CH3). 1.1.2 5-Bromo-fl ,2,4ltriazolo[1,5-alpiridin-2-ilamina (3)
Figure img0005
[00118] Para uma suspensão de cloridrato de hidroxilamina (101,8 g, 1.465 mol) em EtOH/MeOH (1:1, 900 mL) é adicionada N,N-di- isopropiletilamina (145,3 mL, 0,879 mol) e a mistura é agitada em temperatura ambiente (20° C) por 1 hora. 1-(6-Bromo-piridin-2-il)-3- carboetóxi-tioureia (2) (89,0 g, 0,293 mol) é então adicionado e a mistura lentamente aquecida a refluxo (Nota: purificador de água sanitária é requerido para extinguir H2S evoluído). Após 3 horas de refluxo, a mistura é deixada para esfriar e filtrada para recolher os sólidos precipitados. Produto posterior é coletado por evaporação in vacuodo filtrado, adição de H2O (250 mL) e filtração. Os sólidos combinados são lavados sucessivamente com H2O (250 mL), EtOH/MeOH (1:1, 250 mL) e Et2O (250 mL), em seguida, secos in vacuopara render 0 derivado triazolopiridina (3) como um sólido. O composto pode ser usado como tal para a próxima etapa sem qualquer purificação. 1H (400 MHz, DMSO-de) δ 7,43-7,34 (2H, m, 2 x H aromático), 7,24 (1H, dd, J 6,8 e 1,8 Hz, H aromático), 6,30 (2H, br, NH2); m/z 213/215 (1:1, M+H+, 100%). 7.7.3 Procedimento geral para monoacilação para render intermediário(4):
Figure img0006
[00119] Para uma solução do 2-amino-triazolopiridina (3) (7,10 g, 33,3 mmols) em CH3CN seco (150 mL) a 5o C é adicionado EtsN (11,6 mL, 83,3 mmols), seguido por cloreto de ciclopropanocarbonila (83,3 mmol). A mistura de reação é então deixada para aquecer à temperatura ambiente e agitada até que todo o material de partida (3) é consumido. Se requerido, EtsN adicional (4,64 mL, 33,3 mmol) e cloreto de ciclopropanocarbonila (33,3 mmol) são adicionados para garantir a reação completa. Após a evaporação do solvente in vacuoo resíduo resultante é tratado com solução a 7 N de amónia de metanol (50 mL) e agitada à temperatura ambiente (por 1-16 horas) para hidrolisar qualquer produto bis-acilado. Isolamento do produto é feito pela remoção de compostos voláteis in vacuoseguido por trituração com Et2θ (50 mL). Os sólidos são recolhidos por filtração, lavados com H2O (2x50 mL), acetona (50 mL) e Et2Ü (50 mL), em seguida, secos in vacuopara dar 0 necessário intermediário de bromo (4).
Método A Preparação de compostos da invenção via acoplamento Suzuki (5):
[00120] Um ácido borônico apropriado (2eq.) é adicionado a uma solução do intermediário de bromo (4) em 1,4-dioxano/água (5:1). K2CO3 (2 eq.) e PdChdppf (5%) são adicionados à solução. A mistura resultante é então aquecida em um micro-ondas a 140°C por 30 min (essa reação também pode ser realizada pelo aquecimento tradicional em banho de óleo a 90°C por 16 horas sob N2). Água é adicionada e a solução é extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas são secas sob MgSÜ4 anídrico e evaporadas in vacuo.O composto final é obtido após purificação por cromatografia rápida ou HPLC preparativa. HPLC: Águas XBridge Prep C18 5pm ODB 19mm ID x 100mm L (No. da peça, 186002978). Todos os métodos estão usando gradientes MeCN/FW. H2O contêm ou 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3. Método B
Figure img0007
B1. 4 cloreto de 4-f2-(Ciclopropanocarbonil-amino)-[1,2,4ltriazolo[1,5- al oiridin-5-ill-benzeno
Figure img0008
[00121] 2 gotas de DMF são adicionadas a uma solução de ácido 4- [2-(ciclopropanocarbonil-amino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-5-il]- benzoico (1 eq.) obtido segundo o método A utilizando o ácido 4- carboxifenilborônico em DCM sob atmosfera de N2. Em seguida, cloreto de oxalila (2 eq.) é adicionado gota a gota para esta solução resultante (liberação de gás). A mistura é agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Após a conclusão da reação por LCMS, 0 solvente é removido. O cloreto de ácido bruto é usado sem purificação adicional na etapa seguinte. B2. Formação de amida (Método Geral)
Figure img0009
[00122] Uma amina apropriada (eq 1,1) e Et3N (eq 5) são dissolvidos em DCM sob atmosfera de N2 e resfriada a 0°C. O cloreto de ácido (B1, eq 1) dissolvido em DCM é adicionado gota a gota para esta solução. A reação é agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Após este tempo, a reação está completa. O composto é extraído com EtOAc e água, lavado com salmoura e seco sobre MgSCU anídrico. Camadas orgânicas são filtradas e evaporadas. O composto final é isolado por HPLC preparativa. HPLC preparativa: Águas XBridge Prep C18 5pm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No, 186002978). Todos os métodos estão usando gradientes MeCN/H2θ. H2O contêm ou 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3. Método C
Figure img0010
[00123] Em que R3a ou R3b juntamente com 0 átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, podem formar uma heterocicloalquila.
Alguilação redutiva (método geral)
[00124] Uma amina apropriada (2 eq.), ácido ciclopropanocarboxí- lico (por exemplo, ácido ciclopropanocarboxílico [5-(4-formil-fenil)- [1,2,4]triazolo [1,5-a]piridina-2-il]-amida), elaborado pelo método A (1 eq.) e Ti(OPR)4 são misturados e agitados à temperatura ambiente por 3 horas. A mistura é diluída em etanol e Na(CN)BH3 (1 eq.) é adicionado. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente por 16 horas. A mistura é diluída em água e filtrada. O filtrado é lavado com etanol. As fases combinadas do solvente são evaporadas sob vácuo. O composto final é isolado por HPLC preparativa. Método D
Figure img0011
[00125] em que R1 e R2 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados, podem formar uma heterocicloalquila. Reação de alguilação
Figure img0012
2-(4-bromometil-fenil)-4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolano (1 Eq) e EtsN (2 eq) (ou AgCOs) são dissolvidos em DCM/MeOH (4:1 v:v), sob N2 e uma amina (2 eq) é adicionada gota a gota. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Após este tempo, a reação está completa. O solvente é eva-porado. O composto é extraído com EtOAc e água, lavado com salmoura e seco sobre MgSCU anídrico. As camadas orgânicas são filtradas e evaporadas. O composto final é isolado por cromatografia rápida. Acoplamento Suzuki
Figure img0013
[00126] O ácido borônico obtido (2 eq.) é adicionado a uma solução de ácido ciclopropanocarboxílico (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin- 2-il)-amida (4) em 1,4-dioxano/água (5:1). K2CO3 (2 eq.) e PdChdppf (5%) são adicionados à solução. A mistura resultante é então aquecida em um micro-ondas a 140°C por 30 min (Esta reação também pode ser realizada pelo aquecimento tradicional em banho de óleo a 90°C por 16 horas sob N2). Água é adicionada e a solução é extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas são secas sobre MgSO4 aní- drico e evaporadas in vacuo.O composto final é obtido após purificação por cromatografia rápida ou HPLC preparativa. HPLC: Águas XBridge Prep C18 5pm ODB 19mm ID x 100mm L (Part No, 186002978). Todos os métodos estão usando gradientes MeCN/FW. H2O contêm ou 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3. Síntese do composto da invenção e exemplos comparativos Composto 1 (0 composto da invenção) Etapa 1:
Figure img0014
[00127] 2-(4-bromometil-fenil)-4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolano (1 Eq) e DIPEA (2 eq) foram dissolvidos em DCM/MeOH (5:1 v:v) sob N2 e 1,1 dióxido de tiomorfolina (2 eq) foi adicionado em porções. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Após este tempo, a reação foi completada. O solvente foi evaporado. O composto foi extraído com EtOAc e água, lavado com salmoura e seco sobre MgSCU anídrico. Camadas orgânicas foram filtradas e evaporadas. O composto final foi isolado, sem purificação adicional. Etapa 2: acoplamento Suzuki
Figure img0015
[00128] 4-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)- benzil]tiomorfolina-1,1-dióxido (1,1 eq.) foi adicionado a um solução de ácido ciclopropanocarboxílico (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2- il)-amida em 1,4-dioxano/ água (4:1). K2CO3 (2 eq.) e PdChdppf (0,03 eq.) foram adicionados à solução. A mistura resultante foi aquecida em banho de óleo a 90°C por 16 horas sob N2. Água foi adicionada e a solução foi extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas foram secas sobre MgSO4 anídrico e evaporadas in vacuo.O composto final foi obtido após purificação por cromatografia rápida.
[00129] Alternativamente, após a conclusão da reação, um purificador de paládio, como 1,2-bis (difenilfosfino)etano, é adicionado, a mistura de reação é deixada para resfriar e uma filtração é realizada. A torta de filtro é ressuspensa em um solvente adequado (acetona, por exemplo), 0 sólido é separado por filtração, lavado com mais acetona e seco. O sólido resultante é ressuspenso em água, HCI aquoso é adicionado, e após agitação à temperatura ambiente, a solução resultante é filtrada em celite (Celpure P300). NaOH aquoso é então adicionado ao filtrado, e a suspensão resultante é agitada à temperatura ambiente, 0 sólido é separado por filtração, lavado com água e seco por sucção. Finalmente, 0 bolo é ressolubilizado em uma mistura de THF/H2O, tratado com um purificador de paládio (por exemplo, SMOPEX 234) a 50°C, a suspensão é filtrada, os solventes orgânicos são removidos por evaporação, 0 chorume resultante é lavado com água e metanol, seco e peneirado, para obter o composto do título como uma base livre. Via Alternativa para o Composto 1 (o composto da invenção): Etapa 1:
Figure img0016
[00130] Ácido 4-(hidroximetil)fenilborônico (1,1 eq.) foi adicionado a uma solução de ácido ciclopropanocarboxílico (5-bromo- [1,2,4]triazolo[1,5-a] piridin-2-il)-amida em 1,4-dioxano/água (4:1). K2CO3 (2 eq.) e PdChdppf (0,03 eq.) foram adicionados à solução. A mistura resultante foi aquecida em banho de óleo a 90°C por 16 horas sob N2. Água foi adicionada e a solução foi extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas foram secas sobre MgSO4 anídrico e evaporadas in vacuo.A mistura resultante foi usada sem purificação adicional. Etapa 2:
Figure img0017
[00131] Para uma solução de ácido ciclopropanocarboxílico [5-(4- hidroximetil-fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridina-2-il]-amida (1,0 eq) em clorofórmio foi lentamente adicionado tribrometo de fósforo (1,0 equiv.). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 20 horas, extinta com gelo e água (20 mL) e extraída com diclorometano. A camada orgânica foi seca sobre MgSCU anídrico, filtrada e concen-trada à secura. O resíduo resultante foi triturado em diclorometano/éter dietílico 2:1 para render o produto esperado como um sólido branco. Etapa 3:
Figure img0018
[00132] Ácido ciclopropanocarboxílico [5-(4-bromometil-fenil)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridina-2-il]-amida (1 Eq) e DIPEA (2 eq) foram dissolvidos em DCM/MeOH (5:1 v:v), sob N2 e 1,1-dióxido de tiomorfo- lina (1,1 eq) foi adicionado gota a gota. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Após este tempo, a reação estava completa. O solvente foi evaporado. O composto foi dissolvido em DCM, lavado com água e seco sobre MgSCU anídrico. Camadas orgânicas foram filtradas e evaporadas. O composto final foi isolado por cromatografia em coluna utilizando EtOAc para render o produto dese-jado.
Exemplos Comparativos: Composto 2
[00133] Este composto foi feito usando 0 Método Geral A e 4-[4- (4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-benzil]-morfolina.
Composto 3
[00134] Este composto foi feito usando 0 Método Geral A e cloridrato de éster de ácido 3-(4-morfolinometil)-fenilborônico pinacol.
Composto 4
[00135] Este composto foi feito usando 0 Método Geral A e éster de ácido 2-(4-morfolino)piridina-5-borônico pinacol.
Composto 5
[00136] Este composto foi feito usando o Método Geral A e 4-[4- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]morfolina.
Composto 6
[00137] Este composto foi feito usando o Método Geral C e N-metil- piperazina.
Composto 7
[00138] Este composto foi feito usando o Método Geral C e piperidina.
Composto 8
[00139] Este composto foi feito usando o Método Geral C e ácido piperidina-4-carboxílico amida.
Composto 9
[00140] Este composto foi feito usando o Método Geral C e 1- piperazin-1 -il-etanona.
Composto 10
[00141] Este composto foi feito usando o Método Geral B e 1,1- dióxido de tiomorfolina.
Composto 11
[00142] Este composto foi feito usando o Método Geral D e 4,4- difluoropiperidina.
[00143] O composto da invenção e os exemplos comparativos, que foram preparados de acordo com os métodos sintéticos descritos aqui no presente, estão listados na Tabela I abaixo. Os dados de RMN espectral do composto da invenção e alguns dos exemplos comparativos são dados na Tabela II. Tabela I
Figure img0019
Tabela I – continuação
Figure img0020
Tabela I – continuação
Figure img0021
Tabela I – continuação
Figure img0022
Tabela II:
[00144] RMN Dados dos Compostos Representativos da Invenção
Figure img0023
Figure img0024
Exemplos Biológicos Exemplo 1: Ensaios In-vitro 1.1 Ensaio de inibição JAK1
[00145] Domínio catalítico de JAK1 de ser humano recombinante (aminoácidos 850-1154; número de catálogo 08-144) foi comprado de Carna Biosciences. 10 ng de JAK1 foram incubados com 12,5 pg de substrato de poliGT (Número de catálogo Sigma P0275) em tampão de reação de quinase (15 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM DTT, 0,01% de Tween-20, 10 mM MgCI2, 2 pM de ATP não reativo, 0,25 pCi 33P- gamma-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentra-ções finais) com ou sem 5 pL contendo compostos ou veículo de teste (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 pL, em uma placa de propileno de 96 poços (Greiner, V-fundo). Depois de 45 min a 30°C, as reações foram interrompidas pela adição de 25 pL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Todas as reações de quinase terminadas foram transferidas para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer número de catálogo 6005177) usando uma ceifadoira de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico a 75mM e o fundo das placas foi lacrado. 40 pL/poço de Mi- croscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi lacrado e a leitura foi realizada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade de quinase foi calculada por contas de subtração contas por minuto (cpm) obtida na presença de um inibidor de controle positivo (10 pM estaurosporina) de cpm obtido na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste para inibir esta atividade foi determinada como:
[00146] Percentagem de inibição = ((cpm determinada por amostra com composto de teste presente - cpm determinada por amostra com inibidor de controle positivo) amostra (cpm determinada na presença de veículo - cpm determinada por amostra com inibidor de controle positivo)) * 100.
[00147] Uma série de diluições de doses foi preparada para os compostos possibilitando o teste de efeitos de resposta de dose no ensaio de JAK1 e o cálculo do IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado em concentração de 20pM seguida por um diluição serial de 1/3, 8 pontos (20pM - 6,67pM - 2,22pM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM) em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou a concentração do topo foi diminuída (por exemplo 5 pM, 1 pM).
[00148] Os compostos a seguir foram testados para sua atividade contra JAK1 e os valores de IC50, como determinado usando os ensaios descritos aqui no presente, são dados abaixo na Tabela 11IA.
TABELA IIIA:
[00149] JAK1 Valores de Compostos
Figure img0025
Figure img0026
1.2 Ensaio de determinação de JAK1 Ki
[00150] Para a determinação de Ki, quantidades diferentes de compostos foram misturadas com a enzima e a reação enzimática foi seguida por uma função de concentração de ATP. O Ki foi determinado por meio de plotagem recíproca dupla de Km vs compostos concentração (Lineweaver-Burk plot). 1 ng de JAK1 (Invitrogen, PV4774) fo usado no ensaio. O substrato foi 50nM Ulight-JAK-1 (Tyr1023) Peptídeo (Perkin Elmer, TRF0121) A reação was realizada em 25mM de MOPS pH 6,8, 0,01%, 2 mM DTT, 5 mM de MgCh Brij-35 com concentrações de ATP variando e compostos. O substrato fosforilado foi medido usando um anticorpo antifosfotirosina Eu-rotulado PT66 (Perkin Elmer, AD0068). A leitura foi realizada na prefiguração (Perkin Elmer) com excitação a 320 nm e emissão seguida a 615 nm e 665 nm.
[00151] Por exemplo, quando o Composto 1 foi testado neste ensaio, um valor de Ki de 39 nM foi medido.
1.3 Ensaio de inibição de JAK2
[00152] O domínio catalítico de JSK2 recombinante de ser humano (aminoácidos 808-1132; número de catálogo PV4210) foi comprado de Invitrogen. 0,025mll de JAK2 foi incubado com 2,5 pg de substrato de poliyGT (número de catálogo Sigma P0275) um tampão de reação de reação de quinase (5 mM MOPS pH 7,5, 9 mM MgAc, 0,3mM EDTA, 0,06% Brij e 0,6 mM DTT, 1 pM de ATP não radioativo, 0,25 pCi 33P- gamma-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentra-ções finais) com ou sem 5 pL contendo compostos de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 pL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, V-bottom). Depois de 90 min a 30°C, as reações foram interrompidas pela adição de 25 pL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Todas as reações de quinase terminadas foram transferidas para placas de filtro de 96 poços pré- lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer número de catálogo 6005177) usando um ceifador de células (Perkin Elmer). Placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de 75 mM de uma solução de ácido fosfórico, e o fundo das placas foi lacrado. 40 pL/poço de Mi- croscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi lacrado e a leitura foi realizada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade de quinase foi calculada por contas de subtração por minuto (cpm) obtida na presença de um inibidor de controle positivo (10 pM estaurosporina) de cpm obtido na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste para inibir esta atividade foi determinada como:
[00153] Percentagem dei inibição = ((cpm determinado por amostra com compostos de teste presentes - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo) amostra (cpm determinado na presença de veículo - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo)) * 100.
[00154] Uma série de diluições da dose foi preparada para os compostos, possibilitando o teste de efeitos de resposta de dose no ensaio de JAK2, e o cálculo do IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado em concentração de 20pM seguido por um 1/3 de diluição em série, 8 pontos (20pM - 6,67pM - 2,22pM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM) em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou 0 topo da concentração foi diminuído (por exemplo 5 pM, 1 pM).
[00155] Os compostos a seguir foram testados por suas atividades contra JAK2 e os valores de IC50, como determinado usando os ensaios descritos aqui no presente, são dados na Tabela 11 IB.
TABELA 11 IB:
[00156] Valores de Compostos JAK2 IC50
Figure img0027
1.4 Determinação de ensaio de JAK2 Kd
[00157] JAK2 (Invitrogen, PV4210) foi usado a uma concentração final de 5 nM. O experimento de ligação foi realizado em 50mM Hepes pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10mM MgCh, 1mM EGTA usando 25nM traça- dor de quinase 236 (Invitrogen, PV5592) e 2 nM de Eu-anti-GST (Invitrogen, PV5594) com concentrações de compostos variadas. A detecção do traçador foi realizada de acordo com 0 procedimento dos fabricantes.
[00158] Por exemplo, quando 0 Composto 1 foi testado neste ensaio, um valor de Kd de 205 nM foi medido.
1.5 Ensaio de inibição de JAK3
[00159] O domínio catalítico de JAK3 recombinante de ser humano (aminoácidos 781-1124; número de catálogo PV3855) foi comprado de Invitrogen. 0,025mU de JAK3 foi incubado com substrato de 2,5 pg polyGT (número de catálogo Sigma P0275) em tampão de reação de quinase (25 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM Na3VO4, 5 mM b- glicerolfosfato, 0,01% de Triton X-100, 1 pM de ATP não radioativo, 0,25 pCi 33P-gamma-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5 pL contendo compostos de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 pL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, V- bottom). Depois de 105 min a 30°C, as reações foram interrompidas adicionando 25 pL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Todas as reações de quinase terminadas foram transferidas para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer número de catálogo 6005177) usando um ceifador de célula (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de 75 mM de solução de ácido fosfórico e o fundo das placas foi lacrado. 40 pL/poço de Microscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi lacrado e a leitura foi realizada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade de quinase foi calculada por contas de subtração por minuto (cpm) obtida na presença de um inibidor de controle positivo (10 pM estaurosporina) de cpm obtido na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste para inibir esta atividade foi determinada como:
[00160] Percentagem de inibição = ((cpm determinado por amostra com o composto de teste presente - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo) amostra (cpm determinado na presença de veículo - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo)) * 100.
[00161] Uma série de diluições de dose foi preparada para os compostos, possibilitando o teste de efeitos de resposta de dose no ensaio de JAK3, e o cálculo do IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado em concentração de 20pM seguida por 1/3 de diluição serial, 8 pontos (20 pM - 6,67 pM - 2,22 pM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou o topo da concentração foi abaixado (por exemplo 5 pM, 1 pM).
[00162] Os compostos a seguir foram testados por sua atividade contra JAK3 e os valores de IC50, como determinado usando os ensaios descritos aqui no presente, são dados abaixo na Tabela IIIC.
TABELA IIIC:
[00163] Valores de Compostos JAK3 ICso
Figure img0028
1.6 Determinação de ensaio de JAK3 Ki
[00164] Para a determinação de Ki, diferentes quantidades de compostos são misturadas com a enzima e a reação enzimática é seguida como uma função da concentração de ATP. O Ki é determinado por meio de plotagem recíproca dupla de Km vs concentração de compostos (Lineweaver-Burk plot). JAK3 (Carna Biosciences, 09CBS-0625B) foi usado em uma concentração final de 10 ng/ml. O substrato foi sal de sódio Poli(Glu,Tyr) (4:1), MW 20 000 - 50 000 (Sigma, P0275) A reação foi realizada em 25mM Tris pH 7,5, 0,01% de Triton X-100, 0,5mM de EGTA, 2,5mM de DTT, 0,5mM de NasVOd, 5mM de b- glicerolfosfato, 10mM de MgCh com variação das concentraçãos de ATP e os compostos e interrompida pela adição de 150 mM de ácido fosfórico. A medição do fosfato incorporado no substrato poliGT foi feita carregando as amostras em uma placa de filtro (usando uma ceifa- dora, Perkin Elmer) e subsequente lavagem. 33P incorporado em poliGT é medido em um contador de cintilação Topcount depois da adição do líquido de cintilação para as placas do filtro (Perkin Elmer).
[00165] Por exemplo, quando o Composto 1 foi testado neste en- saio, um valor de Ki de 353 nM foi medido.
1.7 Ensaio de inibição de TYK2
[00166] Domínio catalítico de TYK recombinante de ser humano (aminoácidos 871-1187; número de catálogo 08-147) foi comprado de Carna biosciences. 5 ng de TYK2 foram incubados com 12,5 pg de substrato de poliGT (número de catálogo Sigma P0275) no tampão de reação de quinase (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM de NaCI, 0,2 mM de NasVCU, 0,1% de NP-40, 0,1 pM de ATP não radioativo, 0,125 pCi 33P-gamma-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5 pL contendo compostos de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 pL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, V-bottom). Depois de 90 min a 30°C, as reações foram interrompidas adicionando 25 pL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Todas as reações de quinase terminadas foram transferidas para as placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer número de catálogo 6005177) usando uma ceifadora de células (Perkin Elmer). Placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico de 75 mM, e o fundo das placas foi lacrado. 40 pL/poço de Microscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi lacrado e a leitura foi realizada usando o To- pcount (Perkin Elmer). Atividade de quinase foi calculada subtraindo contas por minuto (cpm) obtida na presença de um inibidor de controle positivo (10 pM estaurosporina) de cpm obtido na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste para inibir esta atividade foi determinada como:
[00167] Percentagem de inibição = ((cpm determinado por amostra com composto de teste presente - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo) amostra (cpm determinado na presença de veículo - cpm determinado por amostra com inibidor de controle positivo)) * 100.
[00168] Uma série de diluições de dose foi preparada para os compostos, possibilitando o teste de efeitos de respostas de dose no ensaio de TYK2, e o cálculo do IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado em concentração de 20 pM seguida por 1/3 de diluição serial, 8 pontos (20 pM - 6,67 pM - 2,22 pM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência de série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou o topo da concentração foi abaixado (por exemplo, 5 pM, 1 pM).
[00169] Os compostos a seguir foram testados por suas atividades contra TYK2; e os valore de ICso, como determinado usando os ensaios descritos aqui no presente, são dados abaixo na Tabela 111 D.
TABELA IIID:
[00170] Valores de Compostos TYK2 IC50
Figure img0029
1.8 Determinação de ensaio de TYK2 Kd
[00171] TYK2 (Carna Biosciences, 09CBS-0983D) foi usado em uma concentração final de 5 nM. O experimento de ligação foi realizado em 50mM Hepes pH 7,5, 0,01% de Brij-35, WmM de MgCh, 1mM de EGTA usando traçador de qinase de 50nM 236 (Invitrogen, PV5592) e 2 nM de Eu-anti-GST (Invitrogen, PV5594) com concentrações de compostos variadas. Detecção do traçador foi realizada de acordo com o procedimento do fabricante.
[00172] Por exemplo, quando o Composto 1 foi testado neste ensaio, um valor de Kd de 376 nM foi medido.
Exemplo 2. Ensaios celulares: 2.1 Ensaio de sinalização de JAK-STAT:
[00173] Células HeLa foram mantidas em Meio Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) contendo 10% de soro de bezerro fetal inativado por calor, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. As células HeLa foram usadas a 70% de confluência para transfecção. 20.000 células em 87 pL de meio de cultura de células foram transientemente transfectadas com 40 ng pSTAT1(2)-luciferase repórter (Panomics), 8 ng de LacZ repórter com repórter de controle interno e 52 ng de pBSK usando 0,32 pL de Jet-PEI (Polyplus) como reagente de transfecção por poço em formato de placa de 96 poços. Depois de incubação durante a noite a 37°C, 10% de CO2, o meio de transfecção foi removido. 75 pL de DMEM + 1,5% de soro de bezerro fetal inativado por calor foram adicionados. 15 pL de composto a 6,7 x concentração foram adicionados por 60 min e depois 10 pL de OSM de ser humano (Pe- protech) a 33 ng/mL de concentração final.
[00174] Todos os compostos foram testados em duplicata partindo de 20 pM seguido por um 1/3 de diluição serial, 8 doses no total (20 pM - 6,6 pM - 2,2 pM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) em uma concentração final de 0,2% de DMSO.
[00175] Depois de incubação durante a noite a 37°C, 10% de células de CO2 foram lisadas em 100 pL de tampão de lise/poço (PBS, 0,9 mM de CaCI2, 0,5 mM de MgCI2, 5% de Trehalose, 0,025% de Tergitol NP9, 0,15% de BSA).
[00176] 40 pL de lisato de célula foram usados para ler a atividade de β-galactosidase adicionando 180 pL de solução de β-Gal (30pl de ONPG 4mg/mL + 150 pL de tampão de β-Galactosidase (0,06 M de Na2HPO4, 0,04 M de NaH2PO4, 1 mM de MgCI2)) por 20 min. A reação foi interrompida pela adição de 50 pL de Na2CO3 1 M. A absorção foi lida a 405 nm.
[00177] A atividade de Luciferase foi medida usando 40 pL de lisato de célula mais 40 pL de Steadylite® como descrito pelo fabricante (Perkin Elmer), na Previsão (Perkin Elmer).
[00178] 10 pM de um inibidor de pan-JAK foram usados como um controle positivo (100% de inibição). Como controle negativo 0,5% de DMSO (0% de inibição) foi usado. Os controles, positivo e negativo, foram usados para calcular valores de z' e ‘percentual de inibição'(PIN).
[00179] Percentagem de inibição = ((fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada por amostra com composto de teste presente) amostra (fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada por amostra sem disparo)) * 100.
[00180] Valores de PIN foram plotados por composto testado em resposta de dose e valores de EC50 foram derivados. TABELA IV
Figure img0030
Exemplo 2.2Ensaio de sinalização de OSM/IL-1β
[00181] OSM e IL-1 β foram mostrados para sinergisticamente regular a montante os níveis de MMP13, em linha de células de condros- sarcoma de ser humano SW1353. As células foram semeadas em placas de 96 poços em 15.000 células/poços em um volume de 120 pL de DMEM (Invitrogen) contendo 10% (v/v) de FBS e 1% de penicili- na/estreptomicina (InVitrogen) incubadas a 37°C 5% de CO2. As células foram pré-incubadas com 15 pL de compostos em meio M199 com 2% de DMSO 1 hora antes da deflagração com 15 pL de OSM e IL-1 □ para cada 25 ng/mL de OSM, e 1 ng/mL de IL-1 □, e níveis de MMP13 foram medidos em meio condicionado 48 horas depois de deflagar. A atividade de MMP13 foi medida usando um ensaio de atividade de captura de anticorpo. Para este propósito, placas de 384 poços (NUNC, 460518, MaxiSorb negro) foram revestidas com 35 pL de uma solução de 1,5 pg/mL de um anticorpo de MMP13 anti-humano (R&D Systems, MAB511) por 24 horas a 4°C. Depois de lavar os poços 2 vezes com PBS + 0,05% de Tween, os sítios de ligação remanescentes foram bloqueados com 100 pL de 5% de leite seco não gorduroso (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) em PBS por 24 horas a 4°C. Em seguida, os poços foram lavados duas vezes com PBS + 0,05% de Tween, e 35 pL de 1/10 de diluição de sobrenadante de cultura contendo MMP13 em tampão de bloqueio diluído 100 vezes foram adicionados e incubados por 4 horas a temperatura ambiente. Em seguida, os poços foram lavados duas vezes com PBS + 0,05% de Tween seguido por ativação de MMP13 através da adição de 35 pL de uma solução de acetato de 1,5 mM de 4-Aminofenilmercúrico (APMA) (Sigma, A9563) e incubação a 37°C por 1 hora. Os poços foram lavados novamente com PBS + 0.05% Tween e substrato de 35 pL MMP13 (Biomol, P- 126, substrato de OmniMMP fluorogênico) foi adicionado. Depois da incubação por 24 horas a 37°C a fluorescência do substrato convertido foi medida em um Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 Multilabel Reader (excitação do comprimento de onda: 320 nm, emissão de comprimento de odna: 405 nm).
[00182] Percentagem de inibição = ((fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada por amostra com composto de teste presente) amostra (fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada por amostra sem de-flagração)) * 100.
[00183] Por exemplo, quando o Composto 1 foi testado neste ensaio, um valor de ECso de 2242,5 (±1098,5) nM foi medido.
Exemplo 2.3 Ensaio de proliferação de PBL
[00184] Linfócitos de sangue periférico de ser humano (PBL) são estimulados com IL-2 e a proliferação é medida usando um ensaio de incorporação Brdll. Os PBL são primeiro estimulados por 72 horas com PHA para induzir o receptor IL-2, depois eles são fixados por 24 horas para interromper a proliferação das células seguido pela estimulação de IL-2 por outras 72 horas (incluindo 24 horas de rotulação de BrdU). As células são pré-incubadas com compostos de teste 1 hora antes da adição de IL-2. Células são culturadas em RPMI 1640 contendo 10% (v/v) de FBS.
Exemplo 2.4 Ensaio de sangue integral (WBA) 2.4.1 Protocolo de estimulação de IF Na
[00185] Para prever uma potência dos compostos de teste para inibir JAK1 ou vias de sinalização dependente de JAK2 in vivo, um modelo in vitrofisiologicamente relevante foi desenvolvido sangue integral de ser humano. No ensaio de WBA, sangue, colhido de voluntários humanos que deram consentimento informado, foi tratado ex vivo com composto (1 hora) e subsequentemente estimulado por 30 minutos com interferona α (via dependente de IFNα, JAK1) ou por 2 horas com fator estimulante de colônia de granulócito macrófago (via dependente de GM-CSF, JAK2).
2.4.1.1 Ensaio Fosfo - STAT1
[00186] Para estimulação de IFNα, o aumento em fosforilação de Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 1 (pSTATI) por IN- Fa em extratos de células de sangue branco, foi medido usando um ensaio pSTATI ELISA. A fosforilação do Transdutor de Sinal e Ativa- dor de Transcrição de 1 (STAT1) depois de alfa interferona (IFNα) deflagrando um evento mediado por JAK1. O Ensaio de Fosfo-STAT1, que foi usado para medir níveis de Fosfo-STAT1 em extratos celulares, foi desenvolvido para avaliar a capacidade de um composto para inibir vias de sinalização dependentes de JAK1.
[00187] Sangue integral de ser humano colhido de voluntários humanos que deram consentimento informado foi tratado ex vivo com o composto (1 hora) e subsequentemente estimulado por 30 minutos com IFNa. O aumento em fosforilação de STAT1 por INFa em extratos de célula de sangue branco foi medido usando um fosfo-STAT1 ELISA.
[00188] O tampão de lisis de ACK consistiu de 0,15 M NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA. O pH do tampão foi 7,3.
[00189] Um tampão de lise de célula 10x concentrado (parte do PathScan Fosfo-STAT1 (Tyr701) kit de Sandwich ELISA de Sinalização de Célula) foi diluído 10 vezes em H2O. Inibidores de proteinase foram adicionados ao tampão antes do uso.
[00190] 20 pg IFNa são dissolvidos em 40 pL H2O para obter uma solução de estoque de 500 pg/mL. A solução de estoque foi armazenada a -20°C.
[00191] Uma série de diluições de 3 dobras do composto foi preparada em DMSO (concentração mais elevada: 10 mM). Subsequentemente, o composto foi ainda diluído em meio (fator de diluição dependente da concentração de composto final desejada).
Incubação de sangue com composto e estimulação com IFNa
[00192] Sangue de ser humano foi coletado em tubos hepariniza- dos. O sangue foi dividido em alíquotas de 392 pL. Depois, 4 pL de diluição do composto foram adicionados para cada alíquota e as amostras de sangue foram incubadas por 1 hora a 37°C. A solução de estoque IFNa foi diluída 1000 vezes em meio RPMI para obter uma solução de manipulação de 500 ng/mL. 4 pL da solução de manipulação de 500 ng/mL foram adicionados para as amostras de sangue (concentração final IFNa: 5ng/ml). As amostras foram incubadas a 37°C por 30 min.
2.4.1.1.2 Preparação de extratos de célula
[00193] No fim do período de estimulação, tampão de ACK de 7,6 ml_ foi adicionado às amostras de sangue para lise as células de sangue vermelho. As amostras foram misturadas invertendo os tubos cinco vezes e a reação foi incubada em gelo por 5 min. A lise do RBC deverá ser evidente durante esta incubação. As células foram peletiza- das por centrifugação a 300 g, 4°C por 7 min e o sobrenadante foi removido. 10 ml_ 1x PBS foram adicionados a cada tubo e o pelete de células foi ressuspenso. As amostras foram centrifugadas novamente por 7 min a 300 g, 4°C. O subrenadante foi removido e o pelete ressuspenso em 500 pL de 1x PBS. Depois, a suspensão da célula foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml_ limpo. As células foram peletizadas por centrifugação em 700 g por 5 min a 4°C. O sobrenadante foi removido e o pelete foi dissolvido em tampão de lise de células de 150 pL. As amostras foram incubadas em gelo por 15 min. Depois do que, as amostras foram armazenadas a -80°C até processamento adicional.
2.4.1.1.3 Medição de fosfosrilação de STAT1 por ELISA
[00194] O kit Pathscan Fosfo-STAT1 (Tyr701) Sandwich ELISA de Sinalização de Célula (Cat.n°: #7234) foi usado para determinar níveis de Fosfo-STAT1.
[00195] Os extratos celulares foram derretidos no gelo. Os tubos foram centrifugados por 5 min a 16.000 g, 4°C e os lisatos limpos foram ceifados. Enquanto isto, os filamentos da microcavidade do kit foram equilibrados para a temperatura ambiente e o tampão de lavar foi preparado diluindo 20 x o tampão de lavar em H2O. Amostras foram diluídas 2- vezes no diluente de amostra e 100 pL foram adicionados aos filamentos da microcavidade. Os filamentos foram incubados durante a noite a 4°C.
[00196] No dia seguinte, os poços foram lavados 3 vezes com 0 tampão de lavar. 100 pL do anticorpo de detecção foram adicionados aos poços. Os filamentos foram incubados a 37°C por 1 hora. Depois, os poços foram lavados 3 vezes com o tampão de lavar novamente. 100 pL de anticorpo secundário ligado HRP- foram adicionados a cada poço e as amostras foram incubadas a 37°C. Depois de 30 min, os poços foram lavados 3 vezes novamente e 100 pL de substrato de TMB foram adicionados para todos os poços. Quando as amostras ficaram azuis, 100 pL de solução STOP foram adicionados para interromper a reação. A absorção foi medida em 450 nm.
2.4.7.2 Análise dos dados
[00197] Inibição de indução de fosfoSTATI por IFNa em extratos de células foi plotada contra os compostos concentração e os valores de IC50 foram derivados usando 0 software (programa) Graphpad. Os dados serão retidos se R2 for maior do que 0,8 e a inclinação da curva menor do que 3.
2.4.1.2 IL-8 ELISA
[00198] Para a estimulação de GM-CSF, 0 aumento nos níveis de interleucina-8 (IL-8) em plasma é medido usando um ensaio IL-8 ELISA. O fator de estimulação de colônia de granulócito macrófago (GM- CSF) - induzindo a expressão de interleucina 8 (IL-8) n é um evento mediado por JAK2. O IL-8 ELISA, que pode ser usado para medir níveis de IL-8 em amostras de plasma, foi desenvolvido para avaliar a capacidade de um composto para inibir as vias de sinalização dependentes de JAK2.
[00199] O sangue integral de ser humano coletado de voluntários seres humanos, que deram consentimento informado, é tratado ex vivo com 0 composto (1 hora) e subsequentemente estimulado por 2 horas com GM-CSF. O aumento nos níveis de IL-8 no plasma é medido usando um ensaio IL-8 ELISA.
[00200] 10 pg GM-CSF são dissolvidos em 100 pL de H2O para obter uma solução de estoque de 100 pg/mL. A solução de estoque é armazenada a -20°C.
[00201] Uma série de diluições de 3- vezes do composto de teste é preparada em DMSO (concentração mais elevada: 10 mM). Subse-quentemente, o composto é ainda diluído em meio (fator de diluição dependente da concentração final do composto desejada).
2.4.7.2.7 Incubação de sangue com composto e estimulação com GM- CSF
[00202] Sangue de ser humano é coletado em tubos heparinizados. O sangue é dividido em alíquotas de 245 pL. Depois disso, 2,5 pL de diluição de composto de teste são adicionados a cada alíquota e as amostras de sangue são incubadas por 1 hora a 37°C. A solução de estoque de GM-CSF é diluída 100- vezes em meio RPMI para obter um solução de execução de 1 pg/mL. 2,5 pL da solução de execução de 1 pg/mL são adicionados às amostras de sangue (concentração final GM-CSF: 10 ng/mL). As amostras são incubadas a 37°C por 2 horas.
2.4.7.2.2 Preparação de amostras de plasma
[00203] As amostras são centrifugadas por 15 min em 1.000 g, 4°C. 100 pL do plasma são ceifados e armazenados a -80°C até uso posterior.
2.4.1.2.3 Medição dos níveis de IL-8 por ELISA
[00204] O kit de Imunoensaio Quimioluminescente de IL-8 de ser humano de R&D Systems (Cat.n°: Q8000B) é usado para determinar níveis de IL-8.
[00205] O tampão de lavar é preparado diluindo 10 x tampão de lavar em H2O. O reagente de glo de elaboração é preparado adicionando 1 parte de Glo Reagent 1 a 2 partes de Glo Reagent B 15 min a 4 horas antes do uso. 100 pL do diluente de ensaio RD1-86 são adicionados em cada poço. Depois do que, 50 pL de amostra (plasma) são adicionados. A placa ELISA é incubada por 2 horas a temperatura ambiente, 500 rpm. Todos os poços são lavados 4 vezes com tampão de lavar e 200 pL de conjugado IL-8 são adicionados a cada poço. Depois da incubação por 3 horas a temperatura ambiente, os poços são lavados 4 vezes com tampão de lavar e 100 pL de reagente glo de execução são adicionados a cada poço. A placa ELISA é incubada por 5 min a temperatura ambiente (protegida da luz). Luminescência é medida (tempo de leitura 0,5 s/poço).
2.4.1.3 Resultados
[00206] Por exemplo, quando submetido a este protocolo, o pICso do Composto 1 para inibir o aumento induzido de INFa de níveis de pSTATI foi 6,23 ±0,15 (SEM). Isto demonstra que o Composto 1 está fortemente inibindo a via de JAK1 no conjunto fisiológico.
2.4.2 Protocolo de estimulação IL-6
[00207] Além disso, uma análise de citometria de fluxo foi realizada para estabelecer a seletividade de compostos JAK1 sobre JAK2 ex vivo usando sangue integral de ser humano. Desta maneira, o sangue foi tirado de voluntários humanos que deram consentimento informado. O sangue foi depois equilibrado por 30 minutos a 37°C sob oscilação suave, depois preparadas as alíquotas em tubos Eppendorf. Composto foi adicionado em diferentes concentrações e incubado a 37°C por 30 minutos sob oscilação suave e subsequentemente estimulado por 20 minutos a 37°C sob oscilação suave com interleucina 6 (IL-6) por esti-mulação de via dependente de JAK1, ou GM-CSF por estimulação de via dependente de JAK2. Fosfo-STAT1 e fosfo-STAT5 foram depois avaliados usando análise de FACS.
2.4.2.1 Ensaios de Fosfo-STATI
[00208] Por aumento estimulado IL-6 de Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 1 (pSTATI) a fosforilação em célula de sangue branco, sangue integral de ser humano, colhidos de seres humanos voluntários que deram consentimento informado, foi tratada ex vivo com o composto por 30 min e subsequentemente estimulada por 20 minutos com IL-6. O aumento em fosforilação de STAT1 por IL-6 em linfócitos foi medido usando anticorpo anti fosfo-STAT1 por FACS.
[00209] O tampão 5X Lyse/Fix (BD PhosFlow, Cat. N°558049) foi diluído 5 vezes com água distilada e preaquecido a 37°C. O tampão Lyse/Fix diluído remanescente foi descartado.
[00210] 10 pg rhlL-6 (R&D Systems, Cat N°206-IL) foram dissolvi dos em 1ml de PBS 0,1% de BSA para obter uma solução de estoque de 10pg/ml. A solução de estoque foi aliquotada e armazenada a - 80°C.
[00211] Uma série de diluição de 3-dobras do composto foi preparada em DMSO (10 mM de solução de estoque). Amostras tratadas por controle receberam DMSO em vez do composto. Todas as amostras foram incubadas com 1% de concentração final de DMSO.
2.4.2.1.1 Incubação de sangue com composto e estimulação com IL-6
[00212] Sangue de ser humano foi coletado em tubos hepariniza- dos. O sangue foi dividido em alíquotas de 148.5pl. Depois, 1,5 pl de diluição do composto de teste foi adicionado para cada alíquota de sangue e as amostras de sangue foram incubadas por 30 min a 37°C sob oscilação suave. A solução de estoque IL-6 (1,5 pl) foi adicionada às amostras de sangue (concentração final 10ng/ml) e as amostras foram incubadas a 37°C por 20 min sob balanço suave.
2.4.2.1.2 Preparação de célula de sangue branco e marcação de CD4
[00213] No final do período de estimulação, 3ml de 1X de tampão de Lyse/Fix preaquecido foi imediatamente adicionado às amostras de sangue, vortexado brevemente e incubado por 15 min a 37°C em um banho de água a fim de lisar as células de sangue vermelho e fixar leucócitos, depois congelando a -80°C até uso posterior.
[00214] Para as etapas a seguir, tubos foram descongelados a 37°C por aproximadamente 20 minutos e centrifugados por 5 min em 400xg a 4°C. O pelete de célula foi lavado com 3ml de 1X PBS frio, e depois da centrifugação o pelete de célula foi ressuspenso em 10Opl de PBS contendo 3% de BSA. Anticorpo de anti-CD4 FITC-conjugado ou anticorpo de isótopo FITC-conjugado de controle foram adicionados e incubados por 20 min a temperatura ambiente, no escuro.
2.4.2.1.3 Permeabilização e marcação da célula com anticorpo anti Fosfo-STATI
[00215] Depois de lavar células com 1X PBS, o pelete de célula foi ressuspenso em 10Opl de 1X PBS de resfriamento por gelo e 900pl de resfriamento por gelo, 100% de metanol foram adicionados. As células foram depois incubadas a 4°C por 30 min para permeabilização.
[00216] As células permeabilizadas foram depois lavadas com 1X PBS contendo 3% de BSA e finalmente ressuspensas em 80pl de 1X PBX contendo 3% de BSA.
[00217] 20 pL de anticorpo de controle de isótopo de camundongo PE anti-STAT1 (pY701) ou camundongo PE lgG2aK (BD Biosciences, Cat. N°612564 e 559319, respectivamente) foram adicionados e mistu-rados, depois incubados por 30 min a 4°C, no escuro.
[00218] As células são depois lavadas uma vez com 1X PBS e analisadas em um citômetro de fluxo FACSCanto II BD Biosciences).
2.4.2.1.4 Análise de fluorescência em FACSCanto II
[00219] Um total de 50.000 eventos foi contado e as células Fosfo- STATI positivas foram medidas depois de prover as CD4+ de portas (gating on), no portão de linfócitos. Os dados foram analisados usando o programa FACSDiva e a percentagem de inibição de estimulação de IL-6 calculada sobre a percentagem de células positivas para fosfo- STAT1 em CD4+ células.
2.4.2.2 Ensaio de Fosfo-STAT5
[00220] Para aumento de GM-CSF- estimulada de Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 5 (pSTATõ) fosforilação em célula de sangue branco, sangue integral de ser humano, tirados de voluntários de seres humanos que deram consentimento informado, é ex vivo tratados com compostos por 30 min e subsequentemente estimulados por 20 minutos com GM-CSF. O aumento em fosforilação de STAT5 por GM-CSF em monócitos é medido usando um anticorpo anti fosfo- STAT5 por FACS.
[00221] O tampão 5X Lyse/Fix (BD PhosFlow, Cat. N°558049) é diluído 5 vezes com água destilada e pre aquecido a 37°C. O tampão Lyse/Fix diluído restante é descartado.
[00222] 10 pg rhGM-CSF (AbCys S.A., Cat N°P300-03) são dissol vidos em 100 pl de PBS 0,1% de BSA para obter uma solução de estoque de 100 g/ml. A solução de estoque é armazenada aliquotada a - 80°C.
[00223] Uma série de diluição por 3- vezes do composto é preparada em DMSO (10 mM de solução de estoque). As amostras tratadas por controle recebem DMSO sem o composto de teste. Todas as amostras são incubadas com uma concentração final de DMSO a 1%.
2.4.2.2.1 Incubação de sangue com composto e estimulação com GM- CSF
[00224] Sangue de ser humano é coletado em tubos heparinizados. O sangue é dividido em alíquotas de 148,5 pl. Depois, 1,5 pl de diluição do composto é adicionado a cada alíquota e as amostras de sangue são incubadas por 30 min a 37°C sob oscilação suave. A solução de estoque de GM-CSF (1,5pl) é adicionada para as amostras de sangue (concentração final 20 pg/ml) e as amostras são incubadas a 37°C por 20 min sob oscilação suave.
2.42.2.2 Preparação de células de sangue branco de marcação de CD14
[00225] No final do período de estimulação, 3 ml de tampão de Lyse/Fix 1X pré-aquecido são imediatamente adicionados às amostras de sangue, vortexados rapidamente e incubados por 15 min a 37°C em um banho de água a fim de lisar as células de sangue vermelho e fixar leucócitos, depois congelar a -80°C até uso posterior.
[00226] Para as etapas a seguir, tubos são descongelados a 37°C por aproximadamente 20 minutos e centrifugados por 5 min em 400xg a 4°C. O pelete de célula é lavado com 3ml de 1X PBS frio, e depois da centrifugação o pelete de células é ressuspenso em 100pl de PBS contendo 3% de BSA. O anticorpo anti-CD14 de camundongo FITC (BD Biosciences, Cat. N° 345784) ou anticorpo de isótopo lgG2bK de camundongo FITC de controle (BD Biosciences, Cat. N°555057) são adicionados e incubados por 20 min a temperatura ambiente, no escuro.
2.4.2.2.3 Permeabilização e marcação de células com anticorpo fosfo- STAT5
[00227] Depois de lavar células com 1X PBS, o pelete de células é ressuspenso em 100pl de 1X PBS com resfriamento por gelo e 900pl de resfriamento por gelo de 100% de metanol são adicionados. As células são depois incubadas a 4°C por 30 min para permeabilização.
[00228] As células permeabilizadas são depois lavadas com 1X PBS contendo 3% de BSA e finalmente ressuspensas em 80pl de 1X PBX contendo 3% de BSA.
[00229] 20 pL de camundongo PE anti-STAT5 (pY694) ou anticorpo de controle de isótopo IgGlK de camundongo PE (BD Biosciences, Cat. N°612567 e 554680, respectivamente) são adicionados, misturados e depois incubados por 30 min a 4°C, no escuro.
[00230] Células são depois lavadas uma vez com 1X PBS e analisadas em um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences).
2.4.2.2.4 Análise de Fluorescência em FACSCanto II
[00231] Um total de 50.000 eventos é contado e células positivas Fosfo-STAT5 são medidas depois de prender no portão CD 14+ células. Os dados são analisados usando o programa FACSDiva e correspondem à percentagem de inibição de estimulação de GM-CSF calculada sobre a percentagem de células positivas para fosfor-STAT5 em CD14+ células.
2.4.2.2 Resultados
[00232] Quando submetida a este protocolo, a percentagem de inibição (PIN) obtida do meio de 3 voluntários saudáveis como determinado para cada composto de teste. Por exemplo, o Composto 1 foi testado e retornou um pICso = 6,08 na inibição de fosforilação de STAT1.
Exemplo 3. Modelos In vivo Exemplo 3.1 Modelo de CIA 3.1.1 Materiais
[00233] Adjuvante de Freund completo (CFA) e adjuvante de Freund incompleto (IFA) foram comprados de Difco. Colágeno bovino tipo II (CU), lipopolissacarídeo (LPS), e Enbrel foram obtidos de Chon- drex (Isle d'Abeau, França); Sigma (P4252, L'lsle d'Abeau, França), Whyett (seringa injetável de 25 mg, França) Acros Organics (Paio Alto, CA), respectivamente. Todos os outros reagentes usados eram de grau de reagente e todos os solventes eram de grau analítico.
3.1.2 Animais
[00234] Ratos Dark Agouti (machos, 7-8 semanas de idade) foram obtidos de Harlan Laboratories (Maison-Alfort, França). Os ratos foram mantidos em um ciclo de claro/escuro de 12 horas (0700 - 1900). Temperatura foi mantida a 22°C, e alimento e água foram providos ad libitum.
3.1.3 Artrite induzida por colágeno (CIA)
[00235] Um dia antes do experimento, solução de Cll (2 mg/mL) foi preparada com 0,05 M de ácido acético e armazenada a 4°C. Logo antes da imunização, volumes iguais de adjuvantes (IFA) e CH foram misturados por um homogeneizador em uma garrafa de vidro pré- resfriada em um banho de água e gelo. Adjuvante extra e homoge-neização prolongada podem ser requeridos se uma emulsão não é formada. 0,2 mL da emulsão foi injetado intradermicamente na base da cauda de cada rato no dia 1, uma segunda injeção intradérmica de reforço (solução de ClI em 2 mg/mL em 0,1 mL de CFA salino) foi realizada no 9o dia. Este método de imunização foi modificado a partir dos métodos publicados (Sims et al, 2004; Jou et al., 2005).
3.1.4 Projeto de estudo
[00236] Os efeitos terapêuticos dos compostos foram testados no modelo de rato de CIA. Os ratos foram aleatoriamente divididos em grupos iguais e cada grupo continha 10 ratos. Todos os ratos foram imunizados no 1o dia e reforçados no 9o dia. A dosagem terapêutica durou do 16° dia até o 30° dia. O grupo de controle negativo foi tratado com veículo (MC 0,5%) e o grupo de controle positivo com Enbrel (10 mg/kg, 3x por semana, s.c.). Um composto de interesse foi testado tipicamente em 3 doses, por exemplo 3, 10, 30 mg/kg, p.o.
3.1.5 Avaliação clínica de artrite
[00237] Artrite é classificada de acordo com o método de Khachigi- an 2006, Lin et al 2007 e Nishida et al. 2004). O intumescimento de cada uma das quatro vias com classificação artrítica como a seguir: 0- sem sintomas; 1- benigno, mas vermelhidão definida e intumescimento de um tipo de junta, como tornozelo ou punho, ou vermelhidão aparente e intumescimento limitado aos dedos do indivíduo, independente do número de dedos afetados; 2- vermelhidão moderada e intumescimento de dois ou mais tipos de juntas; 3- vermelhidão grave e intumescimento da pata inteira incluindo dedos; 4- membro extremamente inflamado com envolvimento de várias juntas (classificação de artrite clí- nica cumulativa máxima 16 por animal) (Nishida et al., 2004).
[00238] Para permitir a análise da meta de um grande número de estudos os valores do escore clínico foram normalizados como a seguir:
[00239] AUC de escore cíinico (escore AUC): A área sob a curva (AUC) a partir do 1o dia até o 14° dia foi calculada para cada rato individual. O AUC de cada animal foi dividido pelo AUC médio obtido para o veículo no estudo a partir do qual os dados sobre aquele animal foram obtidos e multiplicados por 100 (isto é, o AUC foi expresso como uma percentagem da média do veículo de AUC por estudo).
[00240] Aumento do escore clínico a partir do 1o até o 14° dia (Escore do ponto final): A diferença de escore clínico para cada animal foi dividida pela diferença do escore clínico médio obtido para o veículo no estudo a partir do qual os dados sobre aquele animal foram obtidos e multiplicados por 100 (isto é, a diferença foi expressa como uma percentagem da diferença do escore clínico médio para o veículo por estudo).
3.1.6 Mudança no peso do corpo (%) depois do início da artrite
[00241] Clinicamente, a perda de peso corporal é associada com artrite (Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998; Rali, 2004; Walsmith et al., 2004). Por isso, as mudanças no peso corporal depois do início de artrite podem ser usadas como ponto final não específico para avaliar o efeito de produtos terapêuticos no modelo de rato. A mudança no peso do corpo (%) depois do início da artrite foi calculada como a seguir:
Figure img0031
3.7.7 Radiologia
[00242] Fotos de raio X foram tiradas das patas traseiras de cada animal individual. Um número de identidade cega aleatória foi designado para cada uma das fotos, e a gravidade da erosão do osso foi classificada por dois classificadores independentes com o sistema de escore radiológico de Larsen como a seguir: 0- normal com contornos ósseos intactos e espaço das juntas normal; 1- ligeira anormalidade com qualquer um ou dois dos ossos do metatarso externo mostrando ligeira erosão óssea; 2- anormalidade inicial definida com quaisquer dos três a cinco ossos metatársicos externos mostrando erosão do osso; 3- anormalidade destrutiva média com todos os ossos metatársicos externos como também qualquer um ou dois dos ossos metatársicos internos mostrando erosões definidas; 4- anormalidade destrutiva grave com todos os ossos metatársicos mostrando erosão óssea definida e pelo menos uma das juntas metatársicas internas completamente desgastada, deixando alguns contornos de juntas ósseas parcialmente preservados; 5-anormalidade mutilante sem contornos ósseos. Esse sistema de classificação é uma modificação de Salvemini et al., 2001; Bush etal., 2002; Sims etal., 2004; Jou etal., 2005.
3.1.8 Histologia
[00243] Depois da análise radiológica, as patas traseiras dos ca-mundongos foram fixadas em 10% de formalina tamponada de fosfato (pH 7,4), descalcificadas com rápida descalcificação óssea para histologia fina (Laboratories Eurobio) e embutidas em parafina. Para garantir avaliação prolongada das juntas artríticas, pelo menos quatro sessões seriais (5 pm de espessura) foram cortadas e cada série de seções foram 100 pm entre uma e outra. As seções foram coloridas com hematoxilina e eosina (H&E). Exames histológicos para inflamação sinovial e lesão de osso e cartilagem foram realizados duplo-cego. Em cada pata, quatro parâmetros foram avaliados usando uma escala de quatro pontos. Os parâmetros foram infiltração de célula, gravidade de pannus, desgaste de cartilagem e desgaste de osso. A classificação foi realizada de acordo como a seguir: 1- normal, 2- suave, 3- modera- to, 4- marcante. Essas quatro classificações são somadas juntas e representadas como um escore adicional, a saber, o ‘escore total de RA'.
3.7.9 Análise de tomografia microcomputadorizada (pCT) do calcâneo (osso do calcanhar):
[00244] A degradação óssea observada em RA ocorre especialmente no osso cortical e pode ser revelada por análise de pCT (Sims NA et al.,Arthritis Rheum. 50 (2004) 2338-2346: Alvejando osteoclas- tos com ácido zoledrônico previne a destruição dos ossos em artrite induzida por colágeno; Oste L et al., ECTC Montreal 2007: Um método de alta produtividade para medir distúrbio arquitetural de osso em um murino modelo CIA por micro-CT morfometria). Depois de varredura e reconstrução de volume 3D do osso do calcâneo, o desgaste do osso é medido com número de objetos discretos presentes por slide, isolados em in silico perpendicular ao eixo longitudinal do osso. Quanto mais o osso é desgastado, mais objetos discretos são medidos. 1000 fatias, igualmente distribuídas ao longo do calcâneo (espaçadas por cerca de 10,8 pm), são analisadas.
3.1.10 PK de Estado Fixo
[00245] No 7o ou 11° dia, as amostras de sangue foram coletadas no seio retro-orbital com heparina de lítio como anticoagulante nos pontos de tempo a seguir: pré-dose, 1, 3 e 6 horas. Amostras de sangue integral foram centrifugadas e as amostras de plasma resultantes foram armazenadas em análise pendente a -20°C. As concentrações de plasma de cada composto de teste foram determinadas pelo método LC-MS/MS em que o espectrômetro de massa foi operado em modo de eletrospray positivo. Parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando Winnonlin® (Pharsight®, United States) e foi assumido que os níveis de plasma de pré-dose eram iguais aos níveis de plasma de 24 horas.
[00246] A Tabela V abaixo resume os resultados obtidos por diversos parâmetros de PK, para o composto da invenção e um exemplo comparativo, ilustrando as propriedades melhoradas de PK (por exemplo Cmax, T1/2) do composto da invenção.TABELA V
Figure img0032
3.1.11 Resultados
[00247] A Tabela VI abaixo resume os resultados obtidos para os compostos 1 e 2 no modelo de rato CIA, uma indica que houve um melhoramento estatisticamente significativo no escore, p 0,05 vs. con-trole não tratado.TABELA VI
Figure img0033
$ - "Escore Clínico" refere-se ao escore de AUC normalizado AUC/escore de ponto final normalizado e obtido para o Composto 1, e o escore de AUC/escore de ponto final para o Composto 2.
[00248] O composto 1 exibiu melhoramentos estatisticamente signi- ficativos nos valores de escore clínico normalizado (calculados como AUC ou como a diferença do 1o dia para o 14° dia) em uma dose de 0,1 mg/kg. Adicionalmente, um aumento estatisticamente significativo na leitura do intumescimento da pata e no escore de Larsen foram vistos em doses de 0,3 mg/kg e 3 mg/kg respectivamente. Em contraste, o composto 2 exibiu melhoramentos estatisticamente significativos somente nos valores de escore clínico normalizados (no 14° dia) em uma dose de 10 mg/kg. Adicionalmente, um aumento estatisticamente significativo na leitura do intumescimento da pata no escore de Larsen foram vistos em doses de 30 mg/kg. Desta maneira, o Composto 1 mostra um melhoramento 100 vezes na eficácia sobre o Composto 2, quando doses orais são comparadas. Em particular, em uma dose de 3 mg/kg para Composto 1, melhoramentos estatisticamente significativos foram vistos em todas as medidas, entretanto, uma dose mais alta do Composto 2 resultou em somente um melhoramento estatisticamente significativo no escore clínico. Este melhoramento em potência in vivo não pode ser atribuído à exposição aumentada do composto como ele pode ser visto que o AUC(0-24 horas) é inferior para Compostos 1 a 0,1,0,3 e 1 mg/kg/dia em comparação ao Composto 2 a 10 mg/kg/dia.
Exemplo 3.2 Modelo de choque séptico
[00249] Injeção de lipopolissacarídeo (LPS) induz uma liberação rápida do fator de necrose de tumor solúvel (TNF-alfa) na periferia. Este modelo foi usado para analisar bloqueadores em perspectiva de liberação de TNF in vivo.
[00250] Seis camundongos fêmeas BALB/cJ (20 g) por grupo foram tratados na dosagem pretendida, po. Trinta minutos mais tarde, LPS (15 pg/kg; E. Coli sorotipo 0111 :B4) foi injetado ip. Noventa minutos mais tarde, os camundongos foram eutanazados e o sangue foi coletado. Os níveis de alfa TNF circulando foram determinados usando kits ELISA, comercialmente disponíveis. Dexametasona (5 pg/kg) foi usada como um composto anti-infamatório de referência. Compostos selecionados foram testados em uma ou diversas doses, por exemplo, 3 e/ou 10 e/ou 30 mg/kg, po.
[00251] Compostos 1, 2 e 10 foram ativos em uma dose de 30 mg/kg, po.
Exemplo 3.3 Modelo de MAB
[00252] O modelo de MAB permite uma rápida avaliação da modulação de uma resposta inflamatória como RA por produtos terapêuticos (Kachigian LM. Nature Protocols (2006) 2512-2516: Collagen antibody- induced arthritis). Camundongos DBA/J são injetados intravenosamente com um coquetel de mAbs dirigido contra colágeno II. Um dia mais tarde, o tratamento com o composto é iniciado (veículo: 10% (v/v) HPDCD). Três dias mais tarde, os camundongos receberam uma injeção de LPS i.p. (50 pg/camundongo), resultando em um jejum no início da inflamação. O tratamento com o composto continuou até 10 dias depois da injeção de mAb. A inflamação é lida por medição do intume- cimento da pata e registrando o escore clínico de cada pata. O escore de artrite clínica cumulativo dos quatro membros é apresentado para mostrar a gravidade da inflamação. Um sistema de classificação é aplicado para cada membro usando uma escala de 0—4, com 4 sendo a inflamação mais grave. 0 Sem sintomas 1 Benigna, mas vermelhidão e intumescimento definitivos de um tipo de junta como o tornozelo ou o pulso, ou vermelhidão e intumescimento aparentes limitados aos dedos do indivíduo, in-dependente do número de dedos afetados 2 Vermelhidão e intumescimento moderados de dois ou mais tipos de juntas 3 Vermelhidão e intumescimento graves da pata inteira in- cluindo dedos 4 Membro extremamente inflamado com envolvimento de várias juntas
Exemplo 3.4 Modelos de oncologia
[00253] Modelos in vivo para validar a eficiência de moléculas pequenas para doenças mieloproliferativas em direção a JAK2 são descritas por Wernig et al.Cancer Cell 13, 311, 2008 e Geron et al.Cancer Célula 13, 321,2008.
Exemplo 3.5 Modelo de camundongo IBP
[00254] Modelos in vitroe in vivo para validar a eficiência de moléculas pequenas em direção a IBD são descritos por Wirtz et al. 2007.
Exemplo 3.6 Modelo de asma de camundongo
[00255] Modelos in vitroe in vivo para validar a eficiência de moléculas pequenas em direção a asma são descritos por Nials et al., 2008; lp etal. 2006; Pernis et al., 2002; Kudlacz et al., 2008.
Exemplo 4: Ensaios de Farmacocinética, DMPK e Toxicidade Exemplo 4.1 Solubilidade termodinâmica
[00256] Uma solução de 1 mg/mL do composto de teste é preparada em um tampão de fosfato de 0,2M pH 7,4 ou um tampão de citrato de 0,1 M pH 3,0 a temperatura ambiente em um frasco de vidro.
[00257] As amostras são rodadas em um condutor Rotator STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) em uma velocidade de 3,0 a temperatura ambiente por 24 horas.
[00258] Depois de 24 horas, 800 pL da amostra são transferidos para um tubo eppendorf e centrifugados 5 min a 14000 rpm. 200 pL da sobrenadante da amostra são depois transferidos para uma Placa de Solubilidade MultiscreenR (Millipore, MSSLBPC50) e o sobrenadante é filtrado 33,86 - 40,63 kPa(10-12"Hg) com o auxílio de um vacuum múltiplo em uma placa de 96 poços de fundo V de propileno Greiner claro (Cat no. 651201). 5 pL do filtrado são diluídos em 95 pL (F20) do mesmo tampão usado para incubar na placa contendo a curva padrão (Greiner, Cat no. 651201).
[00259] A curva padrão para o composto é preparada recentemente em DMSO partindo de uma solução de estoque de 10 mM de DMSO diluída no fator 2 em DMSO (5000 pM) e depois ainda diluída em DMSO até 19,5 pM. 3 pl da série de diluições como de 5000 pM são depois transferidos para uma mistura de tampão de 97 pL de acetoni- trila (50/50). A faixa de concentração final foi 2,5 a 150 pM.
[00260] A placa é lacrada com mats de vedação (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) e as amostras são medidas a temperatura ambiente em LCMS (ZQ 1525 de Waters) sob condições otimizadas usando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
[00261] As amostras são analisadas em LCMS com uma taxa de fluxo de 1mL/min. O solvente A é 15mM de amónia e o solvente B é acetonitrila. A amostra é executada sob spray de íon positivo em uma coluna XBridge C18 3,5 pM (2,1 x 30mm), de Waters. O gradiente do solvent© tem um tempo de execução total de 2 minutos e varia de 5% B a 95% B.
[00262] As áreas de pico são analisadas com a ajuda do pacote de programa Masslynx e as áreas de pico das amostras são plotadas contra a curva padrão para obter a solubilidade do composto.
[00263] Valores de solubilidade são reportados em pM ou pg/mL.
Exemplo 4.2 Solubilidade Aquosa
[00264] Partindo de um estoque de 10 mM em DMSO, uma diluição em série do composto foi preparada em DMSO. A série de diluições foi transferida para uma placa de fundo F Maxisorb de 96 NUNC (Cat no. 442404) e tampão de 0,2 M de fosfato pH 7,4 ou um tampão de citrato a 0,1 M pH 3,0 a temperatura ambiente foi adicionado.
[00265] A concentração final variou de 200 pM a 2,5 pM em 5 etapas de diluição iguais. A concentração de DMSO final não excedeu 2%. 200 pM Pyrene foram adicionados para os pontos dos cantos de cada placa de 96 poços e serviu como um ponto de referência para a calibragem do eixo Z- no microscópio.
[00266] As placas de ensaio foram lacradas e incubadas por 1 hora a 37°C enquanto sacudidas a 230 rpm. As placas foram depois esca- neadas sob um microscópio de luz branca, rendendo figuras individuais do precipitado por concentração. O precipitado foi analisado e convertido em um número que foi plotado em um gráfico. A primeira concentração em que o composto aparece completamente dissolvido é a concentração reportada abaixo, entretanto a verdadeira concentração fica em algum lugar entre esta concentração e uma diluição de etapa mais alta.
[00267] Os valores de solubilidade são reportados em pg/mL TABELA VII
Figure img0034
Exemplo 4.3Ligação de Proteína de Plasma (Diálise de Equilí brio)
[00268] Uma solução de estoque a 10 mM do composto em DMSO foi diluída com um fator 5 em DMSO. Esta solução foi ainda diluída em plasma de ser humano, rato, camundongo ou cão recentemente con-gelado (BioReclamation INC) com uma concentração final de 10 pM e concentração final de DMSO de 0,5% (5,5 pL em 1094,5 pL de plasma em um PP-Masterblock de 96 poços (Greiner, Cat no. 780285))
[00269] Uma placa Pierce Red Device com inserções (ThermoScienti- fic, Cat no. 89809) foi preparada e preenchida com 750 pL de PBS em uma câmara de tampão e 500 pL do plasma espetados na câmara de plasma. A placa foi incubada por 4 horas a 37°C enquanto agitando a 230 rpm. Depois da incubação, 120 pL de ambas as câmaras foram transferidos para 360 pL de acetonitrila em um fundo redondo de 96 poços, placas de poços profundas PP (Nunc, Cat no. 278743) e lacradas com uma tampa de folha de alumínio. As amostras foram misturadas e colocadas em gelo por 30 min. Esta placa foi depois centrifugada 30 min em 1200 rcf a 4°C e o sobrenadante foi transferido para uma placa PP de fundo 96 v- (Greiner, 651201) para análise em LCMS.
[00270] A placa é lacrada com mats de vedação (MA96RD-04S) de www.kinesis.co.uke as amostras são medidas a temperatura ambiente em LCMS (ZQ 1525 de Waters) sob condições otimizadas usando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
[00271] As amostras foram analisadas em LCMS com uma taxa de fluxo com de 1ml/min. O solvente A foi 15 mM amónia e solvente B foi acetonitrila. A amostra foi executada sob spray de íon positivo em uma coluna XBridge C18 3,5 pM (2,1 x 30 mm) de Waters. O gradiente do solvente tem um tempo de execução total de 2 minutos e faixas de 5% B a 95% B.
[00272] A área de pico do composto na câmara de tampão e a câmara de plasma são consideradas como sendo 100% composto. A percentagem ligada ao plasma foi derivada desses resultados e foi reportada como percentagem ligada ao plasma.
[00273] A solubilidade do composto na concentração final de teste em PBS foi inspecionada por microscópio para indicar se a precipitação é observada ou não. TABELA VIII
Figure img0035
Exemplo 4.4 Estabilidade microssomal
[00274] Uma solução de estoque a 10 mM do composto em DMSO foi diluída 1000 vezes em um tampão de fosfato de 182 mM pH 7,4 em uma placa de 96 poços profundas (Greiner, Cat no.780285) e pré- incubada a 37°C.
[00275] 40 pL de água desionizada foram adicionados a um poço de um tubo de armazenamento marcado com código de barras Matrix 2D de polipropileno (Thermo Scientific) e pré-incubados a 37°C.
[00276] Uma solução de estoque de execução de Glicose-6-fosfato- desidrogenase (G6PDH) foi preparada em tampão de fosfato de 182 mM pH 7,4 e colocada em gelo antes do uso. Um cofator contendo MgCI2, glucose-6-fosfato e NADP+ foi preparado em água desionizada e colocado em gelo antes do uso.
[00277] Uma solução final de execução, contendo microssomas do fígado (Xenotech) de uma espécie de interesse (ser humano, camundongo, rato, cão), anteriormente descrita G6PDH e cofatores foram preparados e essa mistura foi incubada por não mais do que 20 minutos a temperatura ambiente.
[00278] 30 pL da diluição do composto preaquecida foram adicio nados a 40 pL de água preaquecida em tubos Matrix, e 30 pL da mistura microssomal foram adicionados. As concentrações da reação final foram 3 pM de composto, 1 mg de microssomas, 0,4 U/mL GDPDH, 3,3 mM de MgCI2, 3,3 mM de glicose-6-fosfato e 1,3 mM de NADP+.
[00279] Para medir a percentagem restante do composto em tempo zero, MeOH ou ACN foi adicionado (1:1) para o poço antes de adicionar a mistura microssomal. As placas foram lacradas com Matrix Se- pra sealsTM (Matrix, Cat. No.4464) e agitadas por uns poucos segundos para garantir mistura completa de todos os componentes.
[00280] As amostras que não foram interrompidas são incubadas a 37°C, 300 rpm e, depois de 1 hora de incubação, a reação foi inter- rompida com MeOH ou ACN (1:1).
[00281] Depois de interromper a reação as amostras foram misturadas e colocadas em gelo por 30 min para precipitar as proteínas. As placas foram depois centrifugadas 30 min em 1200 rcf a 4°C e o sobrenadante foi transferido para uma placa PP de fundo v- 96 (Greiner, 651201) para análise em LCMS.
[00282] Essas placas foram lacradas com mats de vedação (MA96RD-04S) de www.kinesis.co.uke as amostras foram medidas a temperatura ambiente em LCMS (ZQ 1525 de Waters) sob condições otimizadas, usando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula de origem.
[00283] As amostras foram analisadas em LCMS com uma taxa de fluxo de ImL/min. O solvente A foi 15 mM de amónia e o solvente B foi metanol ou acetonitrila, dependendo da solução de interrupção usada. As amostras foram executadas sob spray de íon positivo em uma coluna XBridge C18 3,5 pM (2,1 x 30 mm), de Waters. O gradiente do solvente teve um tempo de execução total de 2 minutos e faixas de 5% B a 95% B.
[00284] A área de pico do composto de origem no tempo 0 foi con-siderada como sendo 100% remanescente. A percentagem remanescente depois de 1 hora de incubação foi calculada a partir do tempo 0 e foi calculada como a percentagem restante. A solubilidade do composto no teste de concentração final no tampão é inspecionada por microscópio e os resultados são reportados.
[00285] Os dados sobre estabilidade microssomal são expressos como uma percentagem da quantidade total do composto remanescente depois de 60 min. TABELA IX
Figure img0036
Exemplo 4.5 Permeabilidade Caco2
[00286] Ensaios bidirecionais Caco-2 foram realizados como descrito abaixo. Células Caco-2 foram obtidas de European Collection of Cell Cultures (ECACC, cat 86010202) e usadas depois de uma cultura de células de 21 dias em placas Transwell de 24 poços (Fisher TKT- 545-020B).
[00287] 2x105 células/poço foram semeadas em meio de plaquea- mento consistindo em DMEM + GlutaMAXI + 1% NEAA + 10% FBS (FetalClone II) + 1% Pen/Strep. O meio foi trocado a cada 2-3 dias.
[00288] Compostos de teste e referência (propranolol e rodamina 123 ou vinblastina, todos comprados de Sigma) foram preparados em Solução de Sal B balanceado de Hanks contendo 25 mM HEPES (pH 7,4) e adicionado às câmaras apical (125 pL) ou basolateral (600 pL) do conjunto de placas Transwell a uma concentração de 10 pM com um concentração final de DMSO de 0,25%.
[00289] 50 pM de "Lucifer Yellow" (Sigma) foram adicionados ao tampão do doador em todos os poços para avaliar a integridade das camadas das células monitorando a permeação de Lucifer Yellow permeation. Como Lucifer Yellow (LY) não pode livremente permear as barreiras lipofílicas, um alto grau de transporte de LY indica pobre in-tegridade da camada da célula.
[00290] Depois de uma incubação de 1 hora a 37°C enquanto agitado em uma batedeira orbital a 150 rpm, 70 pL de alíquotas foram tirados das câmaras apical (A) e basal (B) e adicionados a 100 pL 50:50 acetonitrila:solução de água contendo padrão interno analítico (0,.5 pM carbamazepina) em uma placa de 96 poços.
[00291] Amarelo Lucifer foi medido com Spectramax Gemini XS (Ex 426nm e Em 538nm) em uma placa de 96 poços limpos 150 pL de líquido a partir do lado basolateral e apical.
[00292] Concentraçãos de composto nas amostras foram medidas pelo alto desempenho de cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC-MS/MS).
[00293] Valores de permeabilidade aparente (Papp) foram calculados a partir de relacionamento: Papp =[CθmpθStθS]acceptorfinal □ Vac∞ptor/([CθmpθStθS]donor initial □ Vdo- nor)/Tinc □ Vdonor/surface area □ 60 □ 10'6 cm/s V = volume da câmara Tine = tempo de incubação. Área de superfície = 0,33cm2
[00294] As proporções de Efluxo, como uma indicação de efluxo ativo da superfície da célula apical, foram calculadas usando a proporção de Papp B>AZ Papp A>B.
[00295] Os critérios de aceitação de ensaio a seguir foram usados:
[00296] Propranolol: valor de Papp (A>B) > 20(010-6 cm/s)
[00297] Rodamina 123 ou Vinblastina: valor de Papp (A>B) < 5 (□10-6 cm/s) com taxa de Efluxo >5.
[00298] Permeabilidade de Lucifer yellow: <100 nm/s TABELA X
Figure img0037
Exemplo 4.6 Estudo Farmacocinético em roedores 4.6.1 Animais
[00299] Ratos Sprague-Dawley (machos, 5-6 semanas de idade) foram obtidos de Janvier (França). Os ratos foram aclimatizados por pelo menos 7 dias antes do tratamento e foram mantidos em um ciclo de luz/escuridão por 12 horas (0700 - 1900). A temperatura foi mantida em aproximadamente 22°C, alimento e água foram providos ad libitum. Dois dias antes da administração dos compostos 1 e 2, os ratos foram submetidos à cirurgia para colocar um cateter na veia jugular sob anestesia de isoflurano. Depois da cirurgia, os ratos foram alojados individualmente. Os ratos foram privados de alimento por pelo menos 16 horas antes da dosagem oral e 6 horas depois. Água foi provida ad libitum.
4.6.2 Estudo farmacocinético
[00300] Os compostos foram formulados em PEG200/sal fisiológico (60/40) por via intravenosa e em 0,5% de metilcelulose (compostos 1 e 2), e 10% de hidroxilpropil-β-ciclodextrina pH 3 (compostos 11) por via oral. Compostos de teste foram oralmente dosados como uma gava- gem esofageal única a 5 mg/kg sob um volume de dosagem de 5 ml/kg, e intravenosamente dosado como um bolus através da veia da cauda a 1 mg/kg sob um volume de dosagem de 5 mL/kg. Cada grupo consistiu em 3 ratos. Para amostras de sangue os compostos 1 e 2 foram coletados através da veia jugular com heparina de lítio como anticoagulante nos pontos de tempo a seguir: 0,05, 0,25, 0,5, 1, 3, 5 e 8 horas (via intravenosa), e 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 8 e 24 horas (via oral). Para os compostos 11, as amostras de sangue foram coletadas no seio retro-orbital com heparina de lítio como anticoagulante nos pontos de tempo a seguir: 0,25, 1, 3 e 6 horas (via oral). Amostras de sangue integral foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 min e as amostras de plasma resultando foram armazenadas a -20°C de análise pendente.
4.6.3 Quantificação dos níveis de compostos em plasma
[00301] Concentrações de plasma de cada composto de teste foram determinadas por um método de LC-MS/MS em que o espectrômetro de massa foi operado em modo de electrospray positivo.
4.6.4 Determinação de parâmetros farmacocinéticos
[00302] Parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando Winnonlin® (Pharsight®, Estados Unidos). TABELA XI
Figure img0038
Exemplo 4.7 Estudo de toxidade de rato de 7-Dias
[00303] Um estudo de toxidade ora de 7 dias com os compostos de teste é realizado em ratos machos Sprague-Dawley para avaliar seu potencial tóxico e toxicocinético, em doses diárias de 100, 300 e 500 mg/kg/dia, por gavagem, em um volume de dosagem constante de 5 mL/kg/dia.
[00304] Os compostos de teste são formulados em 30% (v/v) HPβCD em água purificada. Cada grupo incluiu 5 principais ratos machos como também 3 animais satélites para toxicocinética. Um quarto grupo recebe 30% (v/v) HPβCD em água somente, na mesma frequência, volume de dosagem e pela mesma via de administração, e atuando como o grupo de controle do veículo.
[00305] O objetivo do estudo é determinar a dose mais baixa que resultou nos eventos adversos sendo identificados (nenhum nível de efeito adeverso observável - NOAEL).
Exemplo 4.8 Estabilidade de hepatócito
[00306] Modelos para avaliar a depuração metabólica em hepatócito são descritos por McGinnity et al.Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247.
Exemplo 4.9 Capacidade para prolongamento de QT
[00307] Potencial para prolongamento de QT foi avaliado no ensaio de fita de emplastro hERG.
Fita de emplastro de célula integral convencional
[00308] Registros de fita de emplastro de célula integral foram realizados usando um amplificador EPC10 controlado pelo programa Pulse v8.77 (HEKA). Resistência em série foram tipicamente menos do que 10 M Ω e compensadas por mais de 60%, os registros não foram subtraídos de vazamento. Os eletrodos foram fabricados por pipeta de vidro GC150TF (Harvard).
[00309] A solução de banho externo continha: 135 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,8 mM CaCh, 5 mM Glicose, 10 mM HEPES, pH 7,4.
[00310] A solução de pipeta de emplastro interno continha: 100 mM Kgluconato, 20 mM KCI, 1 mM CaCh, 1 mM MgCh, 5 mM Na2ATP, 2 mM Glutationa, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2.
[00311] Os fármacos foram borrifados usando um sistema de perfu- são rápida Biologic MEV-9/EVH-9.
[00312] Todos os registros foram realizados em células HEK293 expressando de maneira estável canais de hERG. As células são cul- turadas em tampas redondas de 12 mm (German glass, Bellco) anco-radas em câmara de registro usando duas hastes de platina (Goodfellow). Correntes hERG foram evocadas usando um pulso de ativação para +40 mV por 1000 ms seguido por um pulso de corrente de cauda para -50 mV por 2000 ms, potencial de manutenção foi -80 mV. Pulsos foram aplicados a cada 20 s e todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente.
Resultados
[00313] Por exemplo, quando submetido a este ensaio, o IC50 medido do Composto 1 foi maior do que 150 pM.
Conclusões Gerais
[00314] Os dados providos no presente pedido demonstram que o Composto 1 (os compostos da invenção) exibe potência significativa-mente melhorada in vivo em comparação aos compostos estruturalmente similares. Este melhoramento é inesperado e poderia não ter sido previsto por uma pessoa versada na técnica, particularmente porque muitos destes compostos estruturalmente similares exibem potência in vitromuito similar contra JAK1 e JAK2.
[00315] Será evidente para aqueles versados na técnica que as descrições anteriores são exemplares e não explicativas por natureza, e destinadas a ilustrar a invenção e suas modalidades preferidas. Através de experimentação de rotina, um técnico reconhecerá modificações e variações evidentes que podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Desta maneira, a invenção é destinada a ser definida não pela descrição, mas pelas reivindicações a seguir e seus equivalents. REFERÊNCIAS Choy EH, Panayi GS. (2001). N Engl J Med. 344: 907-16. Chubinskaya S and Kuettner KE (2003). Regulagem de pro-teínas osteogênicas por condrócitos. The international journal of bio- chemistry &célula biology 35(9)1323-1340. Clegg DO et al. (2006) N Engl J Med. 2006 354:795-808. Glucosamina, sulfato de condroitina, e os dois em combinação para osteoartrite dolorosa do joelho. Firestein GS. (2003). Nature. 423:356-61. Lee DM, Weinblatt ME (2001). Lancet. 358: 903-11. Legendre F, Dudhia J, Pujol J-P, Bogdanowicz P. (2003) JAK/STAT but not ERK1/ERK2 pathway mediates interleuking (IL)- 6/soluble IL-6R down-regulation of tipo II collagen, aggrecan core, and link protein transcription in articular chondrocytes. J Biol Chem. 278(5)2903-2912. Li WQ, Dehnade F, Zafarullah M. (2001) Oncostatin M- induced matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloprotein- ase-3 genes expression in chondrocytes requires janus quinase/STAT signaling pathway. (2001) J Immunol 166:3491-3498. O'Dell JR. (2004) Therapeutic strategies for rheumatoid ar-thritis. N Engl J Med. 350(25):2591-602. Osaki M, Tan L, Choy BK, Yoshida Y, Cheah KSE, Auron PE, Goldring MB. (2003) The TATA-conatining core promoter of the tipo II collagen gene (COL2A1) is the target of interferon-gamma- mediated inibição in human chondrocytes: requirement for STAT1 alpha, JAK1 and JAK2. Biochem J 369:103-115. Otero M, Lago R, Lago F, Gomez Reino JJ, Gualillo O. (2005) Signalling pathway involved in nitric oxide synthase tipo II activation in chondrocytes: synergistic effect of leptin with interleukin-1. Arthritis Research & Therapy 7:R581-R591. Sims NA et al., (2004) Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis, Arthritis Rheum. 50 2338-2346: Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, King KL, Sheehan KCF, Yin L, Pennica D, Johnson EM, Schreiber RD. (1998) Disruption of the Jak1 gene demonstrates obligatory and nonredundant roles of the jaks in cytokine-induced biologic responses Célula 93: 373-383. Smolen JS, Steiner G. (2003). Nat Rev Drug Discov. 2: 473- 88. Wieland HA, Michaelis M, Kirschbaum BJ, Rudolphi KA. (2005). Nat Rev Drug Discov. 4:331-44. Osteoarthritis - an untreatabe- la disease? Tam, L, McGlynn, L.M., Traynor, P., Mukherjee, R., Bartlett, J.M.S., Edwards, J. (2007) British Journal of Cancer, 97, 378-383 Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131 Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233-S242 O'Shea J. et al. Nature Review Drug Discovery 3 (2004) 555-564: A new modality for immunesuppresion: targeting the JAK/STAT pathway Vainchenker W. et al. Seminars in Célula & Developmental Biology 19 (2008) 385-393: JAKs in pathology: Role of Janus quinases in hematopoietic malignancies and immune deficiencies Levy D. and Loomis C. New England Journal of Medicine 357 (2007) 1655-1658: STAT3 signaling and the Hyper-lgE-syndrome Wernig et al. (2008) Efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in tratamento of a murine model of JAK2V617F-induced poly-cythemia vera, Cancer Célula 13(4), 311-320 Geron et al. (2008) Selective inibição of JAK2-driven erythroid diferenteiation of polycythemia vera progenitors Cancer Célula 13 (4), 321-30 Wirtz et al. (2007) Mouse Models of Inflammatory Bowel Disease, Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 1073-1083: Nials et al. (2008) Mouse Models of Allergic Asthma: Acute and Chronic Allergen Challenge, Disease Models & Mechanisms, 213- 220. Ip et al. (2006) Interleukin (IL)-4 and IL-13 up-regulate mon-ocyte chemoattractant protein-1 expression in human bronchial epithelial células: involvement of p38 mitogen-activated protein quinase, ex- tracélulaular signal-regulated quinase 1/2 and Janus quinase-2 but not c-Jun NH2-terminal quinase 1/ 2 signalling pathways, Clin. Exp. Im- mun, 162-172. Pernis et al. (2002) JAK-STAT signaling in asthma J. Clin. Invest. 1279. Kudlacz et al. (2008) The JAK-3 inhibitor CP-690550 is a potent anti-inflammatory agent in a murine model of pulmonary eosinophilia, Eur J Pharmaco 154-161. Mullighan CG, Zhang J, Harvey RC, Collins-Underwood JR, Schulman BA, Phillips LA, Tasian SK, Loh ML, Su X, Liu W, Devidas M, Atlas SR, Chen l-M, Clifford RJ, Gerhard DS, Carroll WL, Reaman GH, Smith M, Downing JR, Hunger SP Willmane CL; (2009) JAK mutations in high-risk childhood acute lymphoblastic leukemia, PNAS May 22. [Epub ahead of print] Argiles JM, Lopez-Soriano FJ. (1998)Catabolic proinflam- matory cytokines. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 1:245-51. Bush KA, Farmer KM, Walker JS, Kirkham BW. (2002) Re-duction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by tratamento with interleukin-17 receptor lgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum. 46: 802-5. Jou IM, Shiau AL, Chen SY, Wang CR, Shieh DB, Tsai CS, Wu CL. (2005) Thrombospondin 1 as an effective gene therapeutic strategy in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 52:339-44. Nishida K, Komiyama T, Miyazawa S, Shen ZN, Furumatsu T, Doi H, Yoshida A, Yamana J, Yamamura M, Ninomiya Y, Inoue H, Asahara H. (2004) Histone deacetylase inhibitor suppression of auto-antibody-mediated arthritis in mice via regulation of p16INK4a and p21(WAF1/Cip1) expression. Arthritis Rheum. 10: 3365-76. Rail LC, Roubenoff R.(2004) Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology; 10:1219-23. Salvemini D, Mazzon E, Dugo L, Serraino I, De Sarro A, Caputi AP, Cuzzocrea S. (2001) Amelioration of joint disease in a rat model of collagen-induced arthritis by M40403, a superoxide dismutase mimetic. Arthritis Rheum. 44:2909-21. Shelton DL, Zeller J, Ho WH, Pons J, Rosenthal A. (2005) Nerve growth factor mediates hyperalgesia and cachexia in autoimmune arthritis. Pain. 116:8-16. Sims NA, Green JR, Glatt M, Schlict S, Martin TJ, Gillespie MT, Romas E. (2004) Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum., 50: 2338-46. Walsmith J, Abad L, Kehayias J, Roubenoff R. (2004) Tumor necrosis factor-alpha production is associated with less body célula mass in women with rheumatoid arthritis. J Rheumatol.; 31:23-9. Khachigian, L. M. Collagen antibody-induced arthritis. (2006) Nature Protocols 1,2512-6. Lin HS, Hu CY, Chan HY. Liew YY, Huang HP, Lepescheux L, Bastianelli E, Baron R, Rawadi G. Clément-Lacroix P. (2007) Anti-rheumatic activities of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in vivo in collagen-induced arthritis in rodents. Br J Pharmacol. Apr; 150 (7):829- 31. McGinnity et al. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 77, 1247.
[00316] Todas as publicações, incluindo, mas não limitadas a patentes e pedidos de patente, mencionadas neste relatório descritivo são incorporadas aqui no presente por referência como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência aqui no presente como se totalmente estabelecida.
[00317] A partir da descrição anterior, várias modificações e mudanças nas composições e métodos desta invenção ocorrerão para aqueles versados na técnica. Todas essas tais modificações que entram no escopo das reivindicações anexadas são destinadas para ser incluídas a esse respeito.
[00318] Deve ficar entendido que fatores tais como a capacidade de penetração de célula diferencial dos vários compostos podem contribuir para discrepâncias entre a atividade dos compostos na bioquímica in vitroe ensaios celulares.
[00319] Pelo menos alguns dos nomes de compostos químicos da invenção são dados como estabelecido neste pedido, podem ter sido gerados em uma base automática pelo uso de um programa de software de nomeação química comercialmente disponível, e não foram independentemente verificados. Programas representativos que de-sempenham essa função incluem a ferramenta de nomeação Lexi- chem vendida por Open Eye Software, Inc. e a ferramenta Autonom Software vendida por MDL, Inc. No caso em que o nome químico indicado e a estrutura representada diferem, a estrutura representada vai controlar.
[00320] Estruturas químicas mostradas aqui no presente foram pre-paradas usando ChemDraw® ou ISIS® /DRAW. Qualquer valência aberta aparecendo em um átomo de carbono, oxigênio ou nitrogênio nas estruturas aqui indica a presença de um átomo de hidrogêio. Onde um centro quiral existe em uma estrutura, mas não em estereoquímica específica, é mostrado para o centro quiral, ambos os enantiômeros associados com a estrutura quiral são abrangidos pela estrutura.

Claims (11)

1. Composto, caracterizado pela Fórmula I:
Figure img0039
ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 1.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento para o tratamento de Doença de Crohn, artrite reumatoide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (por exemplo, asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite e doenças inflamatórias intestinais.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias intestinais.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser para uso como medicamento para o tratamento de artrite reumatoide.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para o tratamento de Doença de Crohn, artrite reumatoide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (por exemplo, asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite e doenças inflamatórias intestinais.
7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para uso no tratamento de doença inflamatória intestinal.
8. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para uso no tratamento de artrite reumatóide.
9. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de Doença de Crohn, artrite reumatóide, psoriase, doença alérgica das vias aéreas (por exemplo, asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite e doenças inflamatórias intestinais.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença inflamatória intestinal.
11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ser na fabricação de um medicamento para o tratamento artrite reumatóide.
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Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3041B1 (ar) 2008-07-25 2016-09-05 Galapagos Nv مركبات جديدة مفيدة لمعالجة الأمراض التنكسية والالتهابية
JO3030B1 (ar) 2009-06-26 2016-09-05 Galapagos Nv مركب جديد مفيد لمعالجة الامراض التنكسية والالتهابات
TWI462920B (zh) * 2009-06-26 2014-12-01 葛萊伯格有限公司 用於治療退化性及發炎疾病之新穎化合物
US8871184B2 (en) 2009-10-02 2014-10-28 Foamix Ltd. Topical tetracycline compositions
EP2343294A1 (en) 2009-11-30 2011-07-13 Bayer Schering Pharma AG Substituted triazolopyridines
AR086042A1 (es) * 2011-04-28 2013-11-13 Galapagos Nv Compuesto util para el tratamiento de enfermedades degenerativas e inflamatorias y composicion farmaceutica
EP2770992A4 (en) * 2011-10-26 2015-12-30 Emily A Stein AGENTS, METHODS AND DEVICES FOR AFFECTING NERVOUS FUNCTION
WO2013173506A2 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method of treating muscular degradation
DK2863950T3 (en) * 2012-06-22 2018-09-03 Galapagos Nv AMINOTRIAZOLOPYRIDINE USED IN THE TREATMENT OF INFLAMMATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF
GB201302036D0 (en) * 2013-02-05 2013-03-20 Queen Mary & Westfield College Diagnosis
EP3079694A1 (en) * 2013-12-11 2016-10-19 Cephalon, Inc. Treatment of multiple sclerosis with a 1,2,4-triazolo [1,5a]pyridine derivative
GB201402070D0 (en) 2014-02-07 2014-03-26 Galapagos Nv Pharmaceutical compositions for the treatment of inflammatory disorders
GB201402071D0 (en) * 2014-02-07 2014-03-26 Galapagos Nv Novel salts and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders
TWI679205B (zh) 2014-09-02 2019-12-11 日商日本新藥股份有限公司 吡唑并噻唑化合物及醫藥
MA41252A (fr) 2014-12-23 2017-10-31 Gilead Sciences Inc Formes solides d'un inhibiteur d'ask 1
SG11201708181RA (en) 2015-04-13 2017-11-29 Galapagos Nv Methods for the treatment of inflammatory disorders
AU2016248727B2 (en) 2015-04-13 2021-04-01 Alfasigma S.P.A. Methods for the treatment of cardiovascular disorders
WO2016179207A1 (en) * 2015-05-05 2016-11-10 Concert Pharmaceuticals, Inc. Deuterated filgotinib
CN105061420B (zh) * 2015-06-04 2017-09-05 南京旗昌医药科技有限公司 一种jak抑制剂的晶型及其制备方法和应用
CN104987333B (zh) * 2015-07-14 2017-01-11 苏州富士莱医药股份有限公司 一种Filgotinib的合成方法
WO2017012773A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Ratiopharm Gmbh Solid forms of filgotinib free base
WO2017012770A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Ratiopharm Gmbh Acid addition salts of filgotinib
WO2017012771A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Ratiopharm Gmbh Crystalline filgotinib sulfonic acid addition salts
CN105198880B (zh) * 2015-09-18 2017-07-25 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物a晶型及其制备方法
CN105111206B (zh) * 2015-09-18 2017-07-25 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物e晶型及其制备方法
CN105111207B (zh) * 2015-09-18 2017-07-25 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物d晶型及其制备方法
CN105218539B (zh) * 2015-09-18 2017-07-25 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物b晶型及其制备方法
CN105198877B (zh) * 2015-09-18 2017-09-22 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物g晶型及其制备方法
CN105198878B (zh) * 2015-09-18 2017-07-25 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物f晶型及其制备方法
CN105198879B (zh) * 2015-09-18 2017-09-22 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物c晶型及其制备方法
CN105198876B (zh) * 2015-09-18 2017-09-29 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物h晶型及其制备方法
WO2017106568A1 (en) * 2015-12-17 2017-06-22 Gilead Sciences, Inc. Combination of a jak inhibitor and a bromodomain inhibitor for treating cancer
WO2017106564A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Gilead Sciences, Inc. Combination of a jak inhibitor and a syk inhibitor for treating cancers and inflammatory disorders
US20170174788A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Gilead Sciences, Inc. Combination of a jak inhibitor and an mmp9 binding protein for treating inflammatory disorders
CN108349974B (zh) * 2016-02-02 2021-04-30 深圳市塔吉瑞生物医药有限公司 一种取代的吡啶酰胺类化合物及其应用
TWI712604B (zh) 2016-03-01 2020-12-11 日商日本新藥股份有限公司 具jak抑制作用之化合物之結晶
CN105669669A (zh) * 2016-03-04 2016-06-15 上海宣创生物科技有限公司 一种环丙烷甲酰胺衍生物的a晶型、b晶型、d晶型、g晶型和m晶型及其制备方法
AU2017239301A1 (en) * 2016-03-21 2018-11-08 Crystal Pharmatech Co., Ltd Crystalline forms of hydrochloride of drug for treating or preventing JAK-associated disease and preparation method thereof
US10071079B2 (en) 2016-06-29 2018-09-11 Bristol-Myers Squibb Company [1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridinyl substituted indole compounds
JP6978097B2 (ja) * 2016-07-26 2021-12-08 スーヂョウ ロングバイオテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッドSuzhou Longbiotech Pharmaceuticals Co., Ltd. Ｊａｋ阻害剤としての複素環化合物、該化合物の塩類および治療への使用
EA038972B1 (ru) 2016-07-30 2021-11-16 Бристол-Маерс Сквибб Компани Диметоксифенилзамещенные соединения индола в качестве ингибиторов tlr7, tlr8 или tlr9
CN107759587B (zh) * 2016-08-19 2021-01-26 中国医药研究开发中心有限公司 [1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶类化合物及其制备方法和医药用途
US10398641B2 (en) 2016-09-08 2019-09-03 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Compositions and methods for treating rosacea and acne
MA46188A (fr) 2016-09-09 2019-07-17 Bristol Myers Squibb Co Composés indole substitués par pyridyle
CN107880038B (zh) * 2016-09-30 2021-09-28 中国医药研究开发中心有限公司 [1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶类化合物及其制备方法和医药用途
CA3043396A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Galapagos Nv Compounds and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory diseases
EA039344B1 (ru) * 2017-01-19 2022-01-17 Сучжоу Лонгбайотек Фармасьютикалз Ко., Лтд. Гетероциклическое соединение в качестве ингибитора jak и его соли и терапевтическое применение
GB201702603D0 (en) 2017-02-17 2017-04-05 Galápagos Nv Novel compositions and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders
JOP20180018A1 (ar) 2017-03-14 2019-01-30 Gilead Sciences Inc تركيبات صيدلية تتضمن مثبط jak
ES2909401T3 (es) 2017-08-04 2022-05-06 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de indol sustituidos útiles como inhibidores de TLR7/8/9
ES2921020T3 (es) 2017-08-04 2022-08-16 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de indol sustituidos con [1,2,4]triazolo[4,3-a]piridinilo
US20210253593A1 (en) 2017-11-14 2021-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Substituted indole compounds
MX2020006093A (es) 2017-12-15 2020-08-24 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de indol eter sustituidos.
PE20210129A1 (es) 2017-12-18 2021-01-19 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de 4-azaindol
CN111491930B (zh) 2017-12-19 2023-09-26 百时美施贵宝公司 可用作tlr抑制剂的经取代的吲哚化合物
ES2922174T3 (es) 2017-12-19 2022-09-09 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de indol sustituidos con amida útiles como inhibidores de TLR
BR112020011788A2 (pt) 2017-12-19 2020-11-24 Bristol-Myers Squibb Company compostos 6-azaindóis
US11299501B2 (en) 2017-12-20 2022-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Diazaindole compounds
JP7291707B2 (ja) 2017-12-20 2023-06-15 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アリールおよびヘテロアリール置換されたインドール化合物
KR102714788B1 (ko) 2017-12-20 2024-10-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tlr 억제제로서 유용한 아미노 인돌 화합물
GB201808575D0 (en) 2018-05-24 2018-07-11 Galapagos Nv Methods for the treatment of psoriatic arthrits
US10815227B2 (en) 2018-08-27 2020-10-27 Cadila Healthcare Limited Processes for the preparation of filgotinib
EP3870589B1 (en) 2018-10-24 2023-09-06 Bristol-Myers Squibb Company Substituted indole dimer compounds
KR102839382B1 (ko) 2018-10-24 2025-07-25 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 치환된 인돌 및 인다졸 화합물
CN111154711B (zh) * 2018-11-07 2022-08-05 杭州瑞普晨创科技有限公司 JAK2抑制剂在胰岛β细胞诱导分化中的应用
WO2020177705A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 苏州科睿思制药有限公司 Filgotinib的马来酸盐晶型CSI及其制备方法和用途
US12398141B2 (en) 2019-03-14 2025-08-26 Shanghai Synergy Pharmaceutical Sciences Co., Ltd JAK kinase inhibitor, preparation method for same, and applications thereof in field of medicine
JP2022526713A (ja) 2019-03-21 2022-05-26 オンクセオ がんの処置のための、キナーゼ阻害剤と組み合わせたＤｂａｉｔ分子
MX2021011548A (es) 2019-03-30 2021-10-22 Unichem Lab Ltd Proceso novedoso para la preparacion de filgotinib e intermediarios del mismo.
EP3965888B1 (en) 2019-05-09 2024-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Substituted benzimidazolone compounds
CN110204542B (zh) * 2019-05-23 2022-05-20 四川伊诺达博医药科技有限公司 一种JAK1抑制剂Filgotinib的合成方法
CN110151738A (zh) * 2019-06-03 2019-08-23 上海基科生物化学有限公司 一种Jak2抑制剂联合虎杖苷雾化剂及其制备方法和应用
WO2021067326A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Substituted bicyclic heteroaryl compounds
ES2965164T3 (es) 2019-10-04 2024-04-11 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de carbazol sustituidos
IT201900020240A1 (it) 2019-11-04 2021-05-04 Advitech Advisory And Tech Sa Procedimento per la preparazione di Filgotinib e intermedi di sintesi
JP2023500906A (ja) 2019-11-08 2023-01-11 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） キナーゼ阻害剤に対する獲得抵抗性を有するがんの処置方法
CN110878097B (zh) * 2019-11-29 2021-11-02 杭州科巢生物科技有限公司 菲格替尼的制备方法
CN111072655B (zh) * 2019-12-30 2021-12-10 深圳市坤健创新药物研究院 一种三氮唑并吡啶类化合物及其制备方法和药用组合物与应用
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
CN115066425B (zh) * 2020-02-13 2023-06-23 珠海联邦制药股份有限公司 Jak抑制剂在制备治疗jak激酶相关疾病药物中的应用
ES3037893T3 (en) 2020-02-21 2025-10-07 Zhuhai United Laboratories Co Ltd Crystalline form of jak inhibitor and application thereof
EP4196477A4 (en) * 2020-08-17 2024-10-09 Vyne Therapeutics Inc. TOFACITINIB-CONTAINING ANHYDROUS ELASTOMER-BASED GEL FORMULATIONS
US20230355608A1 (en) * 2020-10-02 2023-11-09 University Of Massachusetts Targeting polycythemia vera (pv)-initiating cells by blocking leukotriene binding to their receptors
CN115368389A (zh) * 2021-05-19 2022-11-22 奥锐特药业(天津)有限公司 一种Filgotinib中间体的制备方法
CN113773322B (zh) * 2021-11-10 2022-02-11 奥锐特药业(天津)有限公司 一种Filgotinib的制备方法
CN114409675B (zh) * 2022-01-07 2023-08-04 重庆医科大学 螺环异恶唑酮色满衍生物在制备用于治疗jak1介导的疾病药物中的用途
CN116496268A (zh) * 2022-01-18 2023-07-28 盛世泰科生物医药技术(苏州)有限公司 一种含环丙酰胺化合物及其应用
WO2023194842A1 (en) 2022-04-05 2023-10-12 Unichem Laboratories Limited Substituted tricyclic compounds and their use in rheumatoid arthritis

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ208996A (en) 1983-07-28 1989-08-29 American Cyanamid Co 5-substituted(1,2,4 triazpyrimidin-2-amine derivatives and pharmaceutical compositions
ES2228451T3 (es) 1999-01-29 2005-04-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Promotores de condrogenesis y derivados de indolin-2-ona.
US20040138285A1 (en) 2001-04-27 2004-07-15 Makoto Okazaki Chondrogenesis promoters
US6514989B1 (en) * 2001-07-20 2003-02-04 Hoffmann-La Roche Inc. Aromatic and heteroaromatic substituted 1,2,4-triazolo pyridine derivatives
EP1601672B1 (en) 2003-02-14 2006-07-26 Pfizer Products Inc. Triazolo-pyridines as anti-inflammatory compounds
US20050222171A1 (en) 2004-01-22 2005-10-06 Guido Bold Organic compounds
WO2005124342A2 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
JP2008509987A (ja) 2004-08-18 2008-04-03 ファルマシア アンド アップジョン カンパニー リミテッド ライアビリティ カンパニー トリアゾロピリジン化合物
JP2008515874A (ja) 2004-10-07 2008-05-15 ワーナー−ランバート カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー 抗菌薬
GB0515026D0 (en) 2005-07-21 2005-08-31 Novartis Ag Organic compounds
JP5336375B2 (ja) 2006-08-30 2013-11-06 セルゾーム リミテッド キナーゼ阻害剤としてのトリアゾール誘導体
CL2008001626A1 (es) 2007-06-05 2009-06-05 Takeda Pharmaceuticals Co Compuestos derivados de heterociclos fusionados, agente farmaceutico que los comprende y su uso en la profilaxis y tratamiento del cancer.
AR067562A1 (es) 2007-07-18 2009-10-14 Novartis Ag Compuestos heterociclicos inhibidores de kinasa
WO2009017954A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Phenomix Corporation Inhibitors of jak2 kinase
KR20100075881A (ko) 2007-08-31 2010-07-05 메르크 세로노 에스. 에이. 트리아졸로피리딘 화합물 및 ａｓｋ 저해제로서 이의 용도
GB0719803D0 (en) * 2007-10-10 2007-11-21 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
US20100035875A1 (en) 2008-06-20 2010-02-11 Bing-Yan Zhu Triazolopyridine jak inhibitor compounds and methods
BRPI0910021A2 (pt) 2008-06-20 2015-09-01 Genentech Inc "composto, composição farmacêutica, método para tratar ou atenuar a gravidade de uma doença ou condição responsiva à inibição da atividade jak2 quinas em um paciente, kit para o tratamento de uma doença ou distúrbio responsivo à inibição da jak quinase"
WO2010010189A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010010188A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases.
WO2010010184A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv [1, 2, 4] triazolo [1, 5-a] pyridines as jak inhibitors
JO3041B1 (ar) 2008-07-25 2016-09-05 Galapagos Nv مركبات جديدة مفيدة لمعالجة الأمراض التنكسية والالتهابية
WO2010010186A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010010187A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010141796A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Cephalon, Inc. PREPARATION AND USES OF 1,2,4-TRIAZOLO [1,5a] PYRIDINE DERIVATIVES
JO3030B1 (ar) 2009-06-26 2016-09-05 Galapagos Nv مركب جديد مفيد لمعالجة الامراض التنكسية والالتهابات
TWI462920B (zh) * 2009-06-26 2014-12-01 葛萊伯格有限公司 用於治療退化性及發炎疾病之新穎化合物
WO2013173506A2 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method of treating muscular degradation
DK2863950T3 (en) 2012-06-22 2018-09-03 Galapagos Nv AMINOTRIAZOLOPYRIDINE USED IN THE TREATMENT OF INFLAMMATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF

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Publication number Publication date
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IL216667A (en) 2015-08-31
ES2626908T3 (es) 2017-07-26

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