RS56505B1

RS56505B1 - Dkk-1 antitela

Info

Publication number: RS56505B1
Application number: RS20170959A
Authority: RS
Inventors: Marcio Chedid; Ryan James Darling; Rachelle Jeanette Galvin; Barbara Anne Swanson
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2018-02-28
Also published as: PT2930184T; EP2417158B1; CY1124412T1; SI3514173T1; LT3514173T; CY1119399T1; MX2011010707A; RS62214B1; UA103916C2; JP2012523417A; PL2417158T3; LT2930184T; ME03378B; LT2417158T; NZ595011A; PL3514173T3; TR201907261T4; KR20140090273A; KR20140033523A; SI2417158T1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na konstruisana humana antitela protiv DKK-1 i njihovu upotrebu u lečenju bolesti u čijoj je patogenezi posrednik DKK-1.

[0002] Dickkopf-1 (Dkk-1) je član familije dickkopf proteina za koje je dokazano da su negativni regulator kanoničnog Wnt-signalnog puta. Ovaj put igra važnu ulogu u razvoju i stvaranju kostiju. Dkk-1 inhibira Wnt signaliziranje putem interakcije sa Wnt ko-receptorom LRP5 ili LRP6 i KREMEN proteinima. Dkk-1 sprečava članove Wnt puta da stupaju u interakciju sa LRP5 ili LRP6, te tako sprečavaju transdukciju signala posredovanih Wnt-om. Takođe je dokazano da je DKK1 umešan u metastaziranje karcinoma kostiju, uključujući i multipli mijelom, karcinoma dojke, karcinoma bubrega i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

[0003] WO 2007/084344 uči antitela koja se vezuju za protein Dickkopf (DKK-1) koji se koristi za lečenje ćelija sa osteolitičnim procesima, da leče osteolitične procese povezane sa karcinomom.

[0004] Takođe su opisana antitela koja vezuju Dkk-1 (na primer, videti WO2006/015373), međutim i dalje postoji potreba za terapijskim konstruisanim humanim antitelima Dkk-1 koja će inhibirati interakciju Dkk-1 sa LRP5 i 15 LRP6. Osim toga, u pogledu razvoja Dkk-1 u regulaciji stvaranja kostiju, postoji potreba za terapijskim humanim konstruisanim anti-Dkk-1 antitetlima koja se upotrebljavaju u lečenju kostiju. Osim toga, imajući u vidu učešće Dkk-1 u karcinomu, postoji potreba za humanim konstruisanim anti-Dkk-1 antitelima za lečenje karcinoma, uključujući multipli mijelom, karcinom dojke, ne-mikrocelularni karcinom pluća. [0005] Yaccoby Shmeul i saradnici, u časopisu "Blood", Američkog udruženja za hematologiju (eng. American Society of Hematology), US LNKD_D01: 10.1182/BLOOD _2006_09 20 _047712, tom 109, br.5, od 01. marta 2007. godine, strane 2106-2111, XP002485200 opisuje anti-DKK-1 stimulisanu aktivnost osteoblasta, smanjenu osteoklastogenezu i uticaj na stvaranje kosti u mijelomatoznim i nemijelomatoznim kostima.

[0006] Antitela ovog pronalazaka su terapijski korisni Dkk-1 antagonisti koji poseduju veliki broj poželjnih svojstava. Ova humana konstruisana antitela pokazuju visok afinitet (Kd) za humanu DKK-1, Dkk-1 majmuna, DKK-1 pacova, miševa i zečeva. Antitela prisutna u ovom pronalazaku blokiraju inhibiciju alkalne fosfataze, koja je posredovana sa DKK-1, i koja je marker aktivnosti osteoblasta. Osim toga, antitela prisutna u pronalazaku pokazuju porast gustine koštane mase prednjeg i zadnjeg korteksa na in vivo modelu kortikalnog defekta i pokazuju značajnu inhibiciju rasta ne-mikrocelularnog ksenografta pluća in vivo.

[0007] U skladu sa prvim aspektom ovog pronalaska, postoji obezbeđeno humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži laki lanac promenljivog regiona (LCVR) i teški lanac promenljivog regiona (HCVR), gde LCVR sadrži CDRs LCDR1, LCDR2 i LCDR3, a HCVR sadrži CDRs HCDR1. HCDR2, i HCDR3, pri čemu LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 8, LCDR3 je SEQ ID NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 is SEQ ID NO: 2, a HCDR3 je SEQ ID NO: 4 za upotrebu u lečenju karcinoma.

[0008] Po mogućustvu, humana konstruisana DKK-1 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigene, u skladu sa ovim pronalaskom, koriste se za lečenje karcinoma, pri čemu se karcinom bira od multiplog mijeloma, karcinoma dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma.

[0009] Poželjno, humano konstruisano DKK-1 antitelo se upotrebljava u skladu sa ovim pronalazakom i gde se LCVR sastoji od aminokielina čiji je sekvenca SEQ ID NO: 14 i HCVR sadrži aminokiseline čija je sekvenca SEQ ID NO: 12.

[0010] Još poželjnije, humano konstruisano antitelo DKK-1 namenjeno je za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom i isto humano konstruisano antitelo DKK-1 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ 18 i laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20.

[0011] Humano konstruisano antitelo DKK-1 poželjno je da se koristi u skladu sa ovim pronalaskom i sadrži dva laka lanca gde svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 20, i dva teška lanca od kojih svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

[0012] Prema drugom aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži laki lanac promenljivog regiona (LCVR) i teški lanac promenljivog regiona (HCVR), gde LCVR sadrži CDRs LCDR1, LCDR2 i LCDR3, a HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2 i HCDR3, gde je LCDR1 SEQ ID NO: 5, LCDR2 je 8, LCDR3 je SEQ ID NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEK ID NO: 4 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, rastvaračem ili ekscipijentom za upotrebu u lečenju karcinoma.

[0013] Poželjno, farmaceutski sastav je u skladu sa ovim pronalaskom za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je kancer odabran od multiplog mieloma, raka dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

[0014] Farmaceutski sastav za upotrebu prema predmetnom pronalasku može dalje opciono da sadrži druge terapeutske sastojke.

[0015] Postojeći pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima Kd na 37°C od manje od 5.0 X 10<-11>M za humanu DKK-1 (SEQ ID NO: 29), majmunsku DKK-1 (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33) i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32).

[0016] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov vezujući fragment, gde LCDR1 ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 5, LCDR2 ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 47, LCDR3 ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 49, HCDR1 ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 1, HCDR ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 2, i HCDR3 ima sekvencu amino kiselina SEQ ID NO: 44.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutski sastav humanog konstruisanog DKK-1 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuju antigen u skladu sa ovim pronalaskom i farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač, ili ekscipijens.

[0018] Ovaj pronalazak obezbeđuje metod lečenje karcinoma koji se sastoji od davanja humanog konstruisanog antela DKK-1 ili njegovog fragmenta koji vezuju antigen u skladu sa ovim pronalaskom, pri čemu su karcinomi odabrani iz grupe koja obuhvata multipli mijelom, karcinom dojke i ne-mikrocelularni kacrinom pluća.

[0019] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuju antigen koji je ovde opisan, pri čemu antitelo ima Kd manje od 1.5 x 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Poželjnije je da ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd manje od 1.0X10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Dalje, poželjno je da ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd manje od 5.0X10<-12>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Još poželjnije, sadašnji pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd između 0.5 x 10<-12>M i 1.5 x 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Dalje, poželjno, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano antitelo DKK-1 ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd između 1.0 x 10<-12>M i 1.0 x 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29) kao što je opisano u Primeru 2.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen kao što je ovde opisano, gde antitelo ima Kd manji od 5.0 X 11<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd manje od 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dalje poželjno, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd manje od 2.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), i DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33). Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd između 1.0 X 10<-11>M i 5.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dalje poželjno, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd između 1.5 X 10<-11>M i 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), i DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33). Vrednosti Kd utvrđene su putem ravnotežnog vezivanja na 37°C kao što je opisano u Primeru 2.

[0021] Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i HCVR koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 12 i gde humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima Kd manje od 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), 40 DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dalje poželjno, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12 i gde humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima Kd manje od 2.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 i gde humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima Kd manje od 2.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12 i gde humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima Kd između 0.5 X 10<-12>M i 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12 i gde humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde antitelo ima Kd između 1.0 X 10<-12>M i 2.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 majmuna (SEQ ID NO: 30), DKK-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Vrednosti Kd utvrđene su putem ravnoteže vezivanja na 37 °C kao što je opisano u Primeru 2.

[0022] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment, koji sadrži promenljivi region lakog lanca (LCVR) i promenljivi region teškog lanca (HCVR), gde LCVR obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3, a HCVR obuhvata CDRs HCDR1, HCDR2 i HCDR3, pri čemu LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, i HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2.

[0023] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment gde LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45. Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment gde LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44.

[0024] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment gde LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, i SEQ ID NO:10, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:9, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.

[0025] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pri čemu LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 i HCDR3 imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(i) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 6, LCDR3 je SEQ ID

NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ

ID NO: 3,

(ii) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 8, LCDR3 je SEQ ID

NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ

ID NO: 4,

(iii) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 6, LCDR3 je SEQ ID

NO: 9, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ

ID NO: 3,

(iv) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 10, LCDR3 je SEQ ID

NO: 9, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ

ID NO: 3

[0026] Ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen gde se LCVR sastoji od aminokiselnske sekvence SEQ ID NO: 52 i HCVR koji se sastoji od aminokiselnske sekvence SEQ ID NO: 51.

[0027] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment gde LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 15, i SEQ ID NO:16.

[0028] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO: 12.

[0029] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment, gde LCVR i HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) a LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13 i HCVR koji

sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11;

(ii) a LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži promenljivi region lakog lanca aaminokiselinske sekvence SEQ ID NO:12;

(iii) a LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15 i HCVR koji

sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11;

(iv) a LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16 i HCVR koji

sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11.

[0030] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12.

[0031] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo gde humano konstruisano DKK-1 antitelo sadrži laki lanac gde laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, i SEQ ID NO:22.

[0032] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo , gde se humano konstruisano DKK-1 antitelo sastoji od teškog lanca gde teški lanci sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:18.

[0033] Još poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo, gde se humano konstruisano DKK-1 antitelo sastoji od teškog lanca i lakog lanca aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od

(i) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 i lakog

lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19,

(ii) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20,

(iii) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 i lakog lanca koji sadrži promenljivi region lakog lanca aaminokiselinske sekvence SEQ ID NO:21, i

(iv) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.

[0034] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca pri čemu svaki laki lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19, i dva teška lanca pri čemu svaki teški lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17.

[0035] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca pri čemu svaki laki lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, i dva teška lanca pri čemu svaki teški lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17.

[0036] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca, pri čemu svaki laki lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:22, i dva teška lanca, pri čemu svaki teški lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17.

[0037] Ovaj pronalazak poželjno obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca pri čemu svaki laki lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, i dva teška lanca pri čemu svaki teški lanac sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:18.

[0038] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se takmiči sa humanim konstruisanim DKK-1 antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalaskom, za vezivanje sa humanim DKK-1 (SEQ ID NO: 29) kao što je određeno pomoću kompetitivnog testa antitela.

[0039] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegovog deo koji vezuje antigen, u skladu sa ovim pronalaskom i farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili ekscipijens.

[0040] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutska supstanca koji sadrži promenljivi region lakog lanca humanog konstruisanog DKK-1 antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalaskom i farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili ekscipijens, a moguće i druge terapeutski aktivne sastojke.

[0041] Antitelo iz predmetnog pronalaska može se koristiti u metodi za lečenje kostiju koja podrazumeva primenu humanog konstruisanog DKK-1 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalaskom.

[0042] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metod lečenja karcinoma koji se sastoji od primene humanog konstruisanog DKK-1 antitela ili njegov fragmenta koji vezuje antigene u skladu sa ovim pronalaskom, gde je karcinom izabran iz grupe koja se sastoji od multiplog mijeloma, karcinoma dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

[0043] Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalaskom, za primenu u terapiji. Idealno, ovaj pronalazak obezbeđuje humano konstruisano DKK- 1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalsakom, za upotrebu u lečenju karcinoma, gde je karcinom idealno izabran iz grupe koja se sastoji od multiplog mijeloma, karcinoma dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

[0044] Osim toga, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu humanog konstruisanog DKK-1 antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska u proizvodnji leka za lečenje karcinoma, gde je karcinom idealno izabran iz grupe koja se sastoji od multiplog mijeloma, karcinoma dojke i nemikrocelularnog karcinoma pluća .

Definicije

[0045] Antitelo u pinoj dužini kakvo postoji u prirodi, je molekul imunoglobulina koji sadrži 2 teška (H) lanca i 2 laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Završni aminokiselinski fragment svakog lanca obuhvata promenljivi region od oko 100-110 aminokiselina koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena preko regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) koji se u njemu nalazi. Karboksi-terminalni fragment svakog lanca definiše konstantni region koji je prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju.

[0046] CDR-i su raspoređeni unutar regiona koji su bolje očuvani i koji se nazivaju okvirni regioni ("FR"). Svaki promenljivi region lakog lanca(LCVR) i promenljivi region teškog lanca (HCVR) sastoji se od 3 CDR-a i 4 FR-a, raspoređenog od amino terminusa do karboksi terminusa po sledećem rasporedu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Tri CDR-a lakog lanca nazivaju se "LCDR1, LCDR2, i LCDR3", a tri CDR-a teškog lanca nazivaju se "HCDR1, HCDR2, i HCDR3." CDR-i sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Brojanje i pozicioniranje CDR aminokiselinskih rezidua u unutar LCVR i HCVR je u skladu sa dobro poznatom Kabatovom konvencijom numeracije.

[0047] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda, i za njih je karakterističan određeni konstantan region, kao što je poznato iz literature. Teški lanci su klasifikovani kao gamma, mu, alpha, delta, ili epsilon, i defiišu se po izotipovima antitela IgG, IgM, IgA, IgD, odnosno IgE. IgG antitela mogu da budu dalje podeljena na podklase na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Svaki tip teških lanaca karakteriše određeni konstantni region čija je sekvenca poznata iz literature.

[0048] Kao što je ovde upotrebljeno, izraz "monoklonalno antitelo " (Mab) odnosi se na antitelo koje je dobijeno iz jedne kopije ili klona uključujući, na primer, eukariotski, prokariotski ili fagni klon, ali ne i način na koji je ono proizvedeno.

Mab-ovi, u skladu sa ovim pronalaskom, idealno postoje u homogenoj ili substancionalno homogenoj populaciji. Kompletni Mab-ovi sadrže 2 teška lanca i 2 laka lanca. "Fragmenti koji vezuju antigen " takvih monoklonalnih antitela obuhvataju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2fragmente, i Fv fragmente sa jednim lancem. Monoklonalna antitela i njegovi fragmenti koji vezuju antigen u skladu sa ovim pronalaskom mogu se proizvesti, na primer, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, sintetičkim tehnologijama, na primer, CDR-grafting, ili kombinacijom tih tehnologija, ili drugim tehnologijama koje su poznate u literaturi. Na primer, miševi mogu biti vakcinisani humanim DKK-1 ili njegovim fragmentima, a tako nastala antitela mogu se oporaviti i prečistiti, i određivanje da li poseduju vezujuća i funkcionalna svojstva koja su slična ili ista kao ona kod antitela ovde prikazanog jedinjenja, može se izvršiti metodama opisanim u Primerima ispod. Fragmenti koji vezuju antigen mogu takođe biti napravljeni standardnim metodama. Metode za proizvodnju i prečišćavanje antitela i fragmenata koji vezuju antigen takođe su poznati u literaturi i mogu se naći, na primer, u Harlow i Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 i 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0049] Izraz "himeričko antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži domene od različitih vrsta (uglavnom 2 vrste). Antitelo V je himeričko antitelo gde promenljivi domeni lakog lanca i teškog lanca sadrže ostatke iz antitela glodara, pri čemu domen konstantnog regiona lakog lanca sadrži ostatke koji sadrže kappa laki lanac pacova, a domeni konstantnog regiona teškog lanca sadrže ostatke koji sadrže IgG1 antitelo pacova. Antitelo V je himera glodara/pacova i koristi se u studijama da smanji verovatnoću imunog odgovora u dugotrajnim pre-kliničkim modelima.

[0050] Izraz "humano konstruisano antitelo " odnosi se na monoklonalna antitela koja imaju vezujuća i funkcionalna svojstva u skladu sa pronalaskom i koji imaju okvirne regione koji su u suštini humani ili potpuno humani i okružuju CDRs koji su izvedeni iz ne-humanog antitela.

"Fragmenti koji vezuju antigen" ovih humanih konstruisanih obuhvataju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2fragmente i Fv fragmente sa jednim lancem. "Okvirni region" ili "okvirna sekvenca" odnosi se na na bilo koji okvirni region 1 do 4. Humana konstruisana antitela i njihovi delovi koji vezuju antigen koje obuhvata ovaj pronalazak uključuje molekule pri čemu bilo jedan ili više okvirnih regiona 1 do 4 su značajno ili potpuno humani, odnosno, pri čemu je prisutna bilo koja od mogućih kombinacija pojedinačnih suštinski ili potpuno humanih okvirnih regiona 1 do 4. Na primer, ovo obuhvata molekule u kojima su okvirni region 1 i okvirni region 2, okvirni region 1 i okvirni region 3, okvirni region 1, 2, i 3, i td., suštinski ili potpuno humani. Suštinski humani okviri su oni koji imaju najmanje oko 80% identičnih sekvenci poznate humane germinalne liniju okvirne sekvence. Idealno, suštinski humani okviri imaju najmanje oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% sekvenci indentičnih sa poznatim humanim germinalnim okvirnim sekvencama.

[0051] Potpuno humani okviri su oni koji su identični sa poznatim humanim germinalnim okvirnim sekvencama. Humane okvirne germinalne sekvence mogu biti dobijene iz ImMunoGeneTics (IMGT) na njihovoj web stranici http://imgt.cines.fr, ili ili iz „The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc i Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351“. Na primer, okviri germinalnog lakog lanca mogu biti zabrani iz grupe koja se satoji od: Al1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02, i 08, a okvirni regioni germinalnih teških lanaca mogu biti zabrani iz grupe koja se satoji od: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, i VH5-5I.

[0052] Humana konstruisana antitela, osim ovde opisanih, koja pokazuju slična funkcionalna svojstva uskladu sa ovim pronalaskom, mogu se generisati koristeći nekoliko različitih metoda. Specifična antitelo jedinjenja koja su ovde prikazana mogu se koristiti kao modeli ili matična jedinjenja antitela za pripremu dodatnih jedinjenja antitela.

U jednom pristupu, matična jedinjenja antitela CDRs su nakalemljena na okvir koje je po sekvenci veoma identičan sa okvirom matičnih antitela. Identitet sekvence novog okvira biće uglavnom najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identičnih sekvenci odgovarajućih okvira u matičnom jedinjnenju antitela. Ovo kalemljenje može dovesti do smanjenja vezujućeg afiniteta u odnosu na matično antitelo. Ako je to slučaj, okviri se mogu vratiti na mutaciju matičnog okvira na određenim položajima zasnovanim na specifičnim kriterijumima otkrivenim od strane Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Dodatne metode korisne za humanizaciju antitela miša obuhvataju U.S. Patent Nos.

4,816,397; 5,225,539, i 5,693,761; kompjuterske programe ABMOD i ENCAD kao što je opisano u Levitt (1983) J. Mol. Biol.168:595-620; i metod Wintera i saradnika (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; i Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

[0053] Identifikacija ostataka koji se uzimaju u obzir za povratnu mutaciju mogu se izvesti na sledeći način: kada aminokiselina pripadne sledećoj kategoriji, okvirna sekvenca aminokiselina humane germinalne linije koja se koristi ("akceptorski okviri") zamjenjuje se okvirnom aminokiselinom iz okvira matičnog jedinjenja antitela ("donorski okviri"):

(a) amino kiselina u okviru humanog regiona akceptorskog okvira nije uobičajena za humane okvire na tom položaju, dok je odgovarajuća aminokiselina donorskog imunoglobulina tipična za humani okvir na tom položaju;

(b) položaj amino kiseline je u neposrednom susedstvu one koja pripada CDR-u; ili

(c) bilo koji atom postraničnog lanca okvira amino kiseline je unutar oko 5-6 angstrema (centar-ucentar) bilo kog atoma CDR amino kiseline u trodimenzionalnom modelu amino kiseline.

[0054] Kada je svaka amino kiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvira i odgovarajuća amino kiselina u donorskom okviru uglavnom neuobičajena za humane okvire na tom položaju, te amino kiseline mogu se zameniti amino kiselinama tipičnim za humani okvir na tom položaju. Ovaj kriterijum povratne mutacije omogućuje obnavljanje aktivnosti matičnog jedinjenja antitela.

[0055] Drugi pristup stvaranju humanih konstruisanih antitela koja pokazuju slične funkcionalne osobine kao jedinjenja antitela koja su ovde opisana, uključuju slučajno mutirajuće aminokiseline unutar graftiranih CDR-ova bez promene okvira, i skrining rezultujućih molekula za afinitet vezivanja i druge funkcionalne osobenosti koje su isto tako dobre ili bolje od onih iz jedinjenja matičnih antitela. Pojedinačne mutacije se takođe mogu uvesti u svaku poziciju aminokiseline unutar svakog CDR-a, praćeno procenom efekata takvih mutacija na afinitet vezivanja i druge funkcionalne osobine. Pojedinačne mutacije koje proizvode poboljšane osobine mogu se kombinovati kako bi se procenili njihovi efekti u kombinaciji s nekim drugim.

[0056] Dalje, moguća je kombinacija oba prethodna pristupa. Nakon CDR graftinga, mogu se povratno mutirati specifični okvirni regioni pored uvođenja promena aminokiselina u CDR. Ova metodologija je opisana u Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

[0057] Primenjujući znanje izovog pronalaska, stručnjak u ovoj oblasti može da koristi uobičajene tehnike, na primer mutagenezu usmerenog-mesta, da se zamene aminokiseline unutar trenutno otkrivenog CDR i okvirne sekvence i na taj način generiše dalje varijabilno područje sekvence amino kiselina izvedenih iz sadašnje sekvence. Sve alternativne prirodno nastale aminokiseline mogu biti uvedene na specifičnoj supstitucionoj lokaciji. Metode koje su ovde otkrivene koriste se za prikazivanje ovih dodatnih varijabilnih regiona aminokiselinskih sekvenci za identifikaciju sekvence koju su naznačene u in vivo funkcijama. Na taj način mogu biti identifikovane dalje sekvence pogodne za pripremu humanih konstruisanih antitela i njihovih delova koji vezuju antigene u skladu sa ovajm pronalaskom. Idealno, zamena amino kiselina unutar okvira ograničena je na jednu, dve, ili tri pozicije okvirnih regiona 4 laka lanca i/ili teška lanca kao što je ovde otkriveno. Idealno, zamena amino kiselina unutar CDR-ova ograničena je na jednu, dve, ili tri pozicije unutar jednog ili više od 3 laka lanca i/ili teška lanca CDR-ova. Moguće su i kombinacije različitih promena unutar ovih okvirnih regiona i CDR-ova koje su opisane iznad. Najidealnije, ove tehnike se koriste da generišu dalje varijabilno područje aminokiselinske sekvence koristeći varijabilne teške i lake lane aminokiselinskih sekvench opisanih u SEQ ID NO: 12 odnosno SEK ID NO: 14.

[0058] Humana konstruisana antitela ili njegovi delovi koji vezuju antigen koji se "takmiče" sa ovde otkrivenim molekulima su oni koji se vezuju za humani DKK-1 (SEQ ID NO:29) na mestima koja su identična, ili se preklapaju sa mestima na koja se vezuju postojeći molekuli. Kompetitivna humana konstruisana antitela ili njihovi delovi koji vezuju antigen mogu se identifikovati, na primer, putem kompetitivnog eseja na antitela. Na primer, uzorak prečišćene ili delimično prečišćene humane DKK-1 (SEQ ID NO:29) vezan je za čvrstu podršku. Ovde otkriveno antitelo i test monoklonalno antitelo ili fragment koji vezuje antigen, obeleženo bilo kao test ili antitelo predmetnog pronalaska, se zatim dodaje. Ako se obeleženo antitelo i neobeleženo antitelo vezuju za odvojena diskretna mesta na DKK-1, obeleženo antitelo će se vezati na isti nivo bez obzira da li postoji sumnjivo konkurentno antitelo ili ne. Međutim, ako su mesta interakcije identična ili se preklapaju, neobeleženo antitelo će se takmičiti, i količina obeleženog antitela vezana za antigen biće smanjena. Ukoliko je neobeleženo antitelo prisutno u višku, obeleženo antitelo se neće vezati. Za potrebe predmetnog pronalaska, konkurentna humana konstruisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen su oni koji smanjuju vezujući potencijal postojećeg antitela na DKK-1 za oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99%. Detalji o procedurama za izvođenje ovakvih kompetitivnih testova su dobro poznati u struci i mogu se naći, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Takvi testovi mogu postati kvantitativni kada se koriste prečišćena antitela. Standardna kriva se uspostavlja titriranjem jednog antitela protiv obeležene verzije istog. Titriran je kapacitet neobeleženog konkurentnog monoklonalnog antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen za inhibiciju vezivanja obeleženog molekula na pločicu. Rezultati su kalibrisani i upoređene su koncentracije potrebne za postizanje željenog stepena inhibicije vezivanja. U primerima metoda analizom takve konkurencije koji su dati ovde, može se odrediti da li monoklonalno antitelo ili njegovi delovi koji vezuju antigen koji se takmiče sa humanim konstruisanim antitelom ili njegovim delovima koji vezuju antigen predmetnog pronalaska, poseduje iste ili slične funkcionalne osobine predmetnog humanog konstruisanog antitela.

[0059] Izraz "inhibirati" znači sposobnost da se suštinski antagonizuje, zabrani, spreči, ograniči, uspori, omete, eliminiše, zaustavi, smanji, ili obrati biološko dejstvo DKK-1.

[0060] Izraz "lečenje" (ili "lečiti" ili "tretman") odnosi se na procese koji obuhvataju usporavanje, ometanje, kontrolu, zaustavljanje, smanjenje ili promenu napredovanja ili ozbiljnosti simptoma, poremećaja, stanja ili oboljenja, ali ne uključuje obavezno potpunu eliminaciju svih simptoma, stanja ili poremećaja vezanih za bolesti koje su povezane sa DKK-1 aktivnošću.

[0061] Izraz "sprečavanje" (ili "sprečiti" ili "prevencija") podrazumeva zabranu, ograničavanje ili inhibiranje incidence ili pojave simptoma, poremećaja, stanja ili bolesti. Akutni događaji i hronična stanja mogu se tretirati i sprečiti. U akutnom slučaju, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se primenjuje na početku pojave simptoma, poremećaja, stanja ili bolesti, i obustavlja se kada se završi akutni događaj. Nasuprot tome, hronični simptom, poremećaj, stanje ili bolest se tretira tokom dužeg vremenskog perioda.

[0062] Izraz "efektivna količina" odnosi se na količinu ili dozu jedinjenja antitela predmetnog pronalaska koji, nakon primene pojedinačne ili višestruke doze kod pacijenta, obezbeđuje željeni tretman ili prevenciju. Terapijski efikasne količine predloženih jedinjenja antitela mogu sadržati količinu u opsegu od oko 0,1 mg / kg do oko 20 mg / kg po jedinačnoj dozi. Terapijski efikasnu količinu za bilo kog pojedinačnog pacijenta može odrediti zdravstveni radnik praćenjem efekta jedinjenja antitelo na biomarkeru.

[0063] Izraz "lečenje kostiju" odnosi se na stimulaciju formiranja kostiju na mestima lezije blokiranjem DKK-1. Primeri indikacija za lečenje kostiju uključuju, između ostalog, lečenje preloma, fiksiranje / retenciju implanta, i fiksacija / retenciju dentalnog implanta.

[0064] Humana konstruisana antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu se koristiti kao lekovi u humanoj medicini, koji se primenjuju različitim putevima. Najidealnije, ova jedinnjenja namenjena su za pernteralnu primenu. Takvi farmaceutski oblici mogu se pripremiti metodama koje su dobro poznate u struci (videti, na primer, Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i sadrže humano konstruisano antitelo kao što je ovde otkriveno, i farmaceutski prihvatljivi nosač, rastvralač, ili ekscipijens.

[0065] Rezultati narednih testova dokazuju da su monoklonalna antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, u skladu sa ovim pronalaskom korisni kao inhibitor DKK-1. Antitela iz predmetnog pronalaska poseduju veliki broj poželjnih svojstva. Na primer, antitelo II iz predmetnog pronalaska poseduje povećanu hemijsku i fizičku stabilnost i rastvorljivost. Ubrzane studije se izvode da bi se procenila hemijska stabilnost antitela inkubiranjem antitela predmetnog pronalaska pod različitim uslovima pufera (pH i NaCl varijacije) i inkubirani na 4 °C, 25 °C, i 40 °C tokom 4 nedelje. Hemijske modifikacije antitela predmetnog pronalaza detektovane su pomoću katjonske hromatografije ("CEKS") kako bi se odvojile različito naelektrisane varijante (npr. deamidacija asparagina u asparaginsku kiselinu) i LC-MS analize za identifikaciju specifičnih mesta raspada. Antitelo II ima najmanju količinu degradacije koju je otkrio CEKS i ovaj rezultat je dodatno potvrdjen pomoću LC-MS podataka koji pokazuju da sva tri asparaginska ostatka u CDR-u imaju najmanje količinu deamidacije u poređenju sa drugim antitelima koji su ovde opisani nakon 4-nedeljne inkubacije na 40 °C u puferu pH 8. Rastvorljivost za antitelo II je povoljnija u odnosu na antitelo I kada se formuliše pri pH 6 150 mM NaCI. Osim toga , antitelo II održava rastvorljivost > 105 mg/ml kada se čuva na 4°C, dok je rastvorljivost antitela I samo 48 mg/ml i precipitiran pod ovim istim uslovima. Kako se ovde koristi, "EC50" odnosi se na koncentraciju agensa koji proizvodi 50% maksimalnog odgovora koji je moguć za taj agens. "Kd" se odnosi na ravnotežu konstante disociacije koja se može izračunati prema formuli: koff/kon= Kd.

Primer 1-Proizvodnja antitela

[0066] Antitela I, II, III, i IV mogu se praviti i prečišćavati na sledeći način. Odgovarajuća ćelija domaćina, na primer HEK 293 EBNA ili CHO, je prolazno ili stabilno transfektovan sistemom ekspresije za sekreciju antitela koristeći optimalno unapred određeni HC: LC vektorski odnos ili jedan vektorski sistem koji kodira i HC, kao što je SEQ ID NO: 23, ili SEQ ID NO: 24, i LC, kao što je SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, ili SEQ ID NO: 28. Očišćeni mediji, u koje je antitelo bilo izlučeno, prečišćava se pomoću bilo koje od mnogih poznatih tehnika. Na primer, medijum se može pogodno primeniti na protein A ili G Sepharose FF kolonu koji je ujednačen sa kompatibilnim puferom, kao što je fiziološki rastvor sa puferom fosfatom (pH 7.4). Kolona je isprana da bi se uklonile nespecifične komponente vezivanja. Vezano antitelo se eluira na primer, pomoću gradijenta pH (kao što je 0,1 M natrijum fosfatni pufer pH 6,8 do 0,1 M natrijum citratni pufer pH 3,0). Detektovane su frakcije antitela, kao što je SDS-PAGE, a onda su udružene. Dalje prečišćavanje je proizvoljno, zavisno od namene. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano primenom uobičajene tehnike. Rastvorljivi agregat i multimeri mogu se efikasno ukloniti zajedničkim tehnikama, uključujući isključivanje po veličini, hidrofobnu interakciju, jonsku razmenu ili hromatografiju hidroksiapatita. Čistoća antitela nakon ovih koraka hromatografije je veća od 99%. Proizvod se može odmah zamrznuti na -70 ° C ili može biti liofiliziran. Aminokiselinska sekvenca za ova antitela su navedena u nastavku.

SEQ ID NOs

[0067]

Primer 2: merenje afiniteta (Kd) za DKK-1 antitela

[0068] Da bi se utvrdila ravnoteža vezivanja, konstantna koncentracija antitela meša se sa raznim koncentracijama His-obeleženog DKK-1 (SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, ili SEQ ID NO:33) (opseg 1 nM - 1 pM) u PBS (pH 7.4) 1 mg/ml albumina goveđeg seruma ("BSA") ili puferovanog samog i inkubiranog tokom nekoliko dana na 37°C. Postavljena su dva skupa vezujućih reakcija, jedan skup sa niskim koncentracijama antitela (3 pM) i drugi skup sa visokim koncentracijama antitela (30 ili 50 pM).

[0069] Nakon uspostavljanja ravnoteže, upotrebljava se KinExA 3000 instrument (Sapidyne Inst. Inc.) da se sondira frakcija “slobodnog“ (nevezanog) antitela. Ukratko, His-obeležena DKK-1 je kovalentno spojena sa NHS-aktiviranim Sepharose 4 Fast Flow perlama (GE Healthcare) koje su pomoću instrumenta spakovane tako da formiraju male kolone. Pre-uravnotežena smeša antitela His-obeležene DKK-1 prenose se preko perli kako bi se ulovilo samo slobodno antitelo. Količina ulovljenog slobodnog antitela proporcionalna je slobodnoj koncentraciji u ravnoteženim uzorcima, i detektuje se ubrizgavanjem fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela. Skupovi podataka iz visokih i niskih koncentracija antitela se uklapaju globalno uz pomoć analize n-krive koja se obavlja pomoću KinExA softvera. Rezultat ovog uklapanja je vrednost Kd kao i 95% interval poverenja.

Tabela 1: Afinitet antitela II na DKK-1 od različitih vrsta

Primer 3: Dejstvo Dkk-1 antitela u C2C12 testu alkalne fosfataze

[0070] Kanonička Wnt signalizacija je važna za aktivnost diferencijacije osteoblasta. Wnt-3a CM (ujednačeni medijum) u kombinaciji sa BMP-4 indukuje pluripotentne C2C12 ćelije miša da se razviju u osteoblaste sa merljivom ishodnom alkalnom fosfatazom ("AP") koja je marker aktivnosti osteoblasta. DKK-1, inhibitor kanonične Wnt signalizacije, inhibira diferencijaciju i proizvodnju AP. Neutraliziranje DKK-1 antitela sprečava DKK-1-posredovanu inhibiciju AP. Antitela koja blokiraju inhibitornu aktivnost DKK-1 sprečavaju gubitak aktivnosti AP.

[0071] C2C12 ćelije uzgajaju se do 60% - 80% sastava u bocama sa kulturom tkiva u medijumu za uzgajanje (Dulbecco's Modified Eagle's Medium ("DMEM") koji sadrži L-glutamin, 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplotom ("FBS"), 1x antibiotik/antimikotik, 1x natrijum piruvat). Ćelije C2C12 se resuspenduju do koncentracije od 30.000 ćelija/ml u medijumu za uzgajanje i 100 µl/ otvoru je dodato u ploču za kulturu tkiva sa 96 otvora i inkubira preko noći na 37 ° C, 95% vlažnosti, 5% CO2. Medijum za rast zamenjuje se sa 50 µl test medijuma (DMEM sadrži L-glutamin, 5% toplotno inaktiviran FBS, 1x antibiotik /antimikotik, 1x natrijum piruvat). Da bi se stimulisala diferencijacija (i samim tim indukovala proizvodnja AP), doda se 100 µl test medijuma plus 1.5k Wnt-3a CM BMP-4 (katalog R & D sistema # 314-BP). Ovo daje konačnu koncentraciju od 1x Wnt-3a CM i 25 ng mL BMP-4. Negativne kontrole sadrže samo L-ćelijsku CM (bez Wnt-3a ili BMP-4). Ćelije se inkubiraju na temperaturi 37°C, 95% vlažnosti, 5% CO2tokom 72 stata. Medijum se uklanja, ćelije se ispiraju pomoću 200 µl fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom ("PBS"), i tPBS se uklanja. Ćelije se zamrzavaju-otapaju 3 puta. Po otvoru se dodaje100 µl jedno-stepenog pNPP substrata (Thermo Scientific katalog #37621), i pločica se inkubira na sobnoj temperaturi. Apsorbanca se očitava na 405 nm. Da bi se odredila koncentracija DKK-1 koja je potrebna za inhibiciju diferencijacije, Dkk-1 molekuli poreklom od različitih vrsta titriraju se tako da identifikuju minimalnu koncentraciju koja je potrebna da se u potpunosti inhibira indukcija AP.

[0072] Minimalna koncentracija DKK-1 od svake vrste, koja potpuno inhibira indukciju AP je sledeća: humana DKK-1=38 nM, majmunski DKK-1=11.4 nM, pacovska DKK-1=5.8 nM, i DKK-1 zeca = 25.0 nM.

[0073] Nakon utvrđivanja koncentracije DKK-1 koja potpuno inhibira indukciju AP, rastuće koncentracije anti-DKK-1 antitela se pre-inkubiraju u test medijumu sa inhibitornom koncentracijom Dkk-1 tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. AP indukcija je određena kao što je gore opisano. Rezultati su prijavljeni kao EC50 (nM standardna greška).

[0074] Antitelo II blokira Dkk-1-posredovanu inhibiciju C2C12 AP. Za DKK-1 različitih vrsta, EC50-ovi (dati kao nM standardna greška) su sledeći: čovek = 9.8 ± 0.41, majmunski = 6.4 ± 0.25, pacov = 2.9 ± 0.25, i zec = 6.0 ± 0.32

Primer 4: in vivo esej kod kortikalnog defekta (CD)

[0075] Šest meseci stare ženke Sprague-Dawley pacova su ovariektomisane i ostavljene da gube koštanu masu tokom dva meseca. U levom i desnom femuru prave se defekti prečnika 2 mm pomoću električne dentalne bušilice zazora 2 mm. Ova rupa se proteže i kroz prednji i kroz zadnji korteks. Lečenje kosti se nadgleda uzdužno procenom gustine koštane mase (BMD) pomoću kvantitativne kompjuterske tomografije ("qCT") 35 dana nakon operacije. Na kraju eksperimenta, životinje su žrtvovane i celokupni femur se podvrgava utvrđenim opterećenjima do pucanja da bi se utvrdila biomehanička jačina čitave dijafize. Antitela se primenjuju subkutano u dozama i razmacima kao što je navedeno.

[0076] Antitelo II dozira se na sledeći način: 5 mg/kg jednom dnevno tokom 2 nedelje, sa početkom jedan dan nakon operacije (Grupa 1), 1 mg/kg (Grupa 2), 5 mg/kg (Grupa 3), ili 15 mg/kg (Grupa 4) i primenjuje se jednom na svake 2 nedelje, počev od 9 dana nakon operacije. BMD se meri pomoću qCT 35-tog dana. Grupa 1 pokazala je statistički značajan porast BMD-a i na prednjem i na zadnjem korteksu. Grupa 4 pokazala je statistički značajan porast BMD-a na oba korteksa, iako su grupe 2 i 3 pokazale nesignifikantan porast BMD-a.

Primer 5: In vivo esej efikasnosti kod karcinoma

[0077] Miševi (ženke C.B-17 miševa, Fox Chase teški kombinovani imunodeficijentni model # CB17SC-M) se aklimatizuju nedelju dana u objektu za životinje pre početka eksperimenta. Nakon aklimatizacije, miševi se randomizuju u grupe od po 10 po tretmanu. Kultivisane humane ćelije A549 ne-mikrocelularnog karcinoma pluća se implantiraju subkutano u zadnji bok miševa i pušta se da tumor dostigne srednju zapreminu ~ 100 mm<3>. Antitelo II (1 mg/kg i 5 mg/kg), kontrolno IgG antitelo (1 mg/kg i 5 mg/kg) ili vehikulum (fiziološki pufer sa citratom dopunjen sa 0,02% Tween 80) se primenjuje putem subkutane injekcije. Životinje primaju 2 tretmana sa razmakom od 7 dana.

[0078] Tumori se mere 2 puta nedeljno pomoću elektronskih kalipera da bi se iscrtala kriva rasta. Životinje su takođe kontrolisane dva puta nedeljno radi procene fluktuacija telesne mase i znakova toksičnosti. Mere zapremine tumora izmerene 29-tog dana prikazane su u tabeli 3.

[0079] Kao što je pokazano u Tabeli 2, terapijske grupe koje dobijaju Antitelo II, pokazale su znake značajne inhibicije razvoja humanih ćelija A549 ksenografta ne-mikrocelularnog karcinoma pluća in vivo.

Tabela 2: efikasnost antitela II u modelu ksenografta humanih ćelija A549 nemikrocelularnog karcinoma pluća

Primer 6: In vivo ksenograftski test angiografske re-normalizacije

[0080] Da bi se shvatio mehanizam antitumorske efikasnosti sprovedena je analiza snimaka visokog sadržaja na A549 tumorima koji su tretirani antitelom II ili IgG kontrolom. Nekoliko markera koji se zasnivaju na fenotipu analizirani su kvantitativno i kvalitativno da bi se procenili biološki procesi angiogeneze koji su bitni za karcinom (CD31 i aktin glatkih mišića, SMA), indukcija hipoksije (nosač glukoze 1, GLUT1), proliferacija ćelija (Ki67), i apoptoza (Terminal UDP Nick-End Labeling, TUNEL).

[0081] Model na ženkama C.B-17 (Fox Chase SCID) # CB17SC-M miševa starih 7 do 8 nedelja aklimatizovanih tokom nedelju dana i hranjenih ad libitum normalnom hranom koja sadrži nizak procenat masti (4.5%), sa čime se nastavilo tokom čitave studije.

[0082] Ćelije A549 poreklom od ATCC uzgajane su i deljene u F-12 Kaighnovom medijumu (InVitrogen #21127) uz dodatak 10% FBS (InVitrogen #0, i 100x razređeni natrijum piruvat, neesencijalne aminno kiseline i pen-strep (Invitrogen #11360, #11140 odnosno #15140). Zatim su odvojeni i pripremljeni u konačnoj koncentraciji od 50x10<6>ćelija/ml u PBS na prolazu 19 sa 95% održivosti.

[0083] 5x10<6>A549 čelija humanog karcinoma pluća ubrizgavaju se subkutano u bok miševa u mešavini 1:1 PBS-a i Matrigela (Becton Dickinson, Bedford, MA). Merenje tumora i telesne mase obavlja se dva puta nedeljno. Pre terapije, miševi su randomizovani na veličinu tumora pomoću randomizacijskog algoritma.

[0084] Počevši od trenutka kada je tumor dostigao 200 mm<3>, randomizovani miševi dele se na 2 grupe od po 10 životinja i lek im se daje subkutano 1. dana i ponovo 8. dana sa 5 mg/kg bilo Antitela II ili IgG4 kontrole. Ova studija obustavljena je 10 dana nakon primene prve doze antitela.

[0085] Antitelo II se priprema u fiziološkom rastvoru puferovanom citratom (CBS) (10 mM citrata pH6, 150 mM NaCl i 0.2% polisorbata). IgG4 kontrola obezbeđena je na 6.0 mg/ml fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS).

[0086] Ekscizija ksenograft tumori iz miša obavljena je posle 17 dana od davanja leka i isti su smešteni u Zinc-Tris fiksator (BD Pharmin-gen). Fiksirani tumori su obrađeni, blokirani u parafinu, i isečeni na režnjeve od po 3 μM na standardnom mikroskopskom slajdu. Slajdovi su zapečeni na 60 °F tokom 1 sat zatim deparafinizovani u ksilenu (4 tretmana, po10 minuta svaki). Slajdovi se rehidriraju kroz seriju potapanja u etanol/vodu i konačnim ispiranjima u Tris-puferovanom fiziološkom rastvoru/Tween (TBST). Slajdovi se zatim blokiraju pomoću blokatora proteina (DAKO) tokom 30 minuta. Za Tumor Health Panel, slajdovi se boje kombinacijom Hoechst 33324 (Invitrogen), pacovskog anti-humaog CD31 (Pharmingen)/anti-pacovski Alexa-488 (Invitrogen), zečiji anti-Ki67 (NeoMarkers)/anti-zečiji Alexa 647 (Invitrogen), i TUNEL-TMR crveno (razblaženo 1:5 u TUNEL puferu za razblaživanje; Roche). Za panel angiogenete, slajdovi su obojeni kombinacijom Hoechst 33324 (Invitrogen), pacovskog antihumanog CD31 (Pharmingen)/anti-pacovskog Alexa-488 (Invitrogen), zešijeg anti-GLUT1 (Chemicon)/anti-zečijeg Alexa 647 (Invitrogen), i mišijeg anti-aktin glatkih mišića/Cy3 (Sigma). Slajdovi su snimljeni pomoću iCys Laser Scanning Cytometer (Com-puCyte) i Marianas Digital Imaging Workstation koje je konfigurisano sa Zeiss Axiovert 200M invertovanovanim fluorescentnim mikroskopom (Inteligentne inovacije za snimanje). Poređenja kvantiativnih podataka terapijskih grupa obavljena su pomoću Dunnet-ove analize u statističkom softveru JMP (SAS).

[0087] Kao što je prikazano na Tabeli 3, A549 ksenografti kontrolnih životinja tretiranih IgG-om su skromno vaskularizovani, imaju umerenu koncentraciju miofibroblasta i mnoge fokalne oblasti hipoksije. Kontrolni tumori tretirani IgG-om imaju proširenu mrežu krvnih sudova koja se satoji kako od neoangiogenih vaskularnih pupoljaka tako i od zrelih krvnih sudova koji su slabo pokriveni pericitima. Kontrolni tumori tretirani IgG-om imaju oblasti u kojima postoji hipoksija (koju označava GLUT1) koja su jasne demarkacione zone udaljene od perfundovanih krvnih sudova kao i polja nekroze, koja su još udaljenija od krvnih sudova. Terapija Antitelom II dovodi do povećanja prokrvljenih oblasti, manjenja oblasti pericita, i smanjenja prekrivenosti krvnih sudova pericitima. Međutim, ova terapija nije dala značajnu razliku u hipoksiji tumora. Kvalitativno, vaskulatura tumora tretiranog Antitelom II izgleda da se sastoji od manjih, slabije umreženih sudova i sa manjom pokrivenošću pericitima u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom IgG-om.

[0088] Kao što je prikazano u Tabeli 3, tumori trtirani IgG-om imaju ravnomerno raspoređene proliferišuće ćelije tumora, ali takođe često pokazuju jednu ili više velikih avaskularnih oblasti nekroze. Tretiranje Antitelom II ne dovodi do promena apoptoze i samo neznetno, nesignifikantno smanjuje ukupnu oblast proliferacije. Međutim, nema suštinskog smanjenja u procentima oblasti visokog intenziteta Ki67 ćelija u tumorima tretiranim Antitelom II, što može da ukazuje na smanjenje broja ćelija koje se nalaze u G2 fazi ćelijskog ciklusa.

Tabela 3: Antitelo II u in vivo ksenograft testu angiografske re-normalizacije

Primer 7: In vivo esej efikasnosti na kostima

[0089] Da bi se procenila sposobnost Antitela V (laki lanac SEQ ID NO:34 i teški lanac SEQ ID NO:35) da ubrza peri-implantno stvaranje kosti i regeneraciju koštanog tkiva korišćeni su četiri meseca stari muđjaci Sprague-Dawley pacova (Harlan Sprague Dawley Inc) mase oko 425 grama. Pacovima je hirurški implantiran titanijumski šraf (2 mm x 4mm) u obe noge medijalno lateralno odmah iznad tibijalno – fibularne veze. Pacovi su zatim, metodom slučajnog izbora, raspoređeni u 2 grupe zavisno od telesne masei dobijali su Antitelo V 10mg/kg ili IgG kontrolu 10mg/kg, u obliku subkutanih injekcija jednom nedeljno, počev od dana kada je obavljena operacija pa tokom 21 dan. Kvantitativna kompjuterizovana tomografija (Aloka LaTheta LTC-100 model CT skener) koristi se za ex vivo snimanje i kvantifikovanje novoformirane kosti sa vokel veličinom od 60-µm. Obim interesovanja (VOI) definiše se kao 28 rezova u razmaku od 0.1mm preko prethodnog mesta implantacije. Razlike između grupa procenjene su pomoću softvera JMP verzija 5.1. (Cary, North Carolina), poređenje u odnosu na IgG-kontrolu pomoću Dunnett-ove metode sa nivoom značajnosti od P<0.05. Kvalitativna procena ex vivo fiksacijom rendgen snimaka pokazuje da su pacovi tretirani Antitelom V imali višenovekosti ili kalusa oko implanta. Kvantitativne CT analze otkrile su statistički značajan porast sadržaja kortikalnog peri-implantnog minerala u kostima (14%), površina nove kosti (16%), debljina korteksa (7%) i sadržaj minerala u koštanoj srži nove peri-implantne kosti (18%), i površina kosti (16%) kod pacova tretiranih Antitelom V u poređenju sa IgG kontrolom. Podaci pokazuju da Antitelo V stimuliše stvaranje nove kosti i ubrzava regeneraciju koštanog tkiva kod pacova kojima je implantiran titanijum.

Tabela 4: mikro-CT analiza stvaranja nove per-implantne kosti

SEQ ID listing

Teški lanac SDR-a

[0090]

SEQ ID NO:1 GFTFSSYTMS

SEQ ID NO:2 TISGGGFGTYYPDSVKG SEQ ID NO:3 PGYHNYYFDI

SEQ ID NO:4 PGYNNYYFDI

Laki lanac CDR-a

[0091]

SEQ ID NO:5 HASDSISNSLH

SEQ ID NO:6 YGRQSIQ

SEQ ID NO:7 QQSESWPLH

SEQ ID NO:8 YARQSIQ

SEQ ID NO:9 QQSASWPLH

SEQ ID NO:10 YARQSEQ

Promenljivi regioni teškog lanca [0092]

Promenljivi regioni teškog lanca

[0093]

Sekvence nukleotida – varijabilni regioni teških lanaca [0096]

Sekvence nukleotida – varijabilni regioni lakih lanaca [0097]

Humano DKK-1

[0098]

DKK-1 miša

[0102]

Antitelo V – kompletan laki lanac

[0103]

Antitelo V – kompletan teški lanac [0104]

Antitelo V – promenljivi region lakog lanca

[0105]

Antitelo V – promenljivi region teškog lanca [0106]

Antitelo V – teški lanac CDR-a

[0107]

SEQ ID NO:38 TISGGGGNTYYPDSVKG SEQ ID NO:39 PGYNNYYFDY

Antitelo V – laki lanac CDR-a

[0108]

SEQ ID NO:40 RASDSISGSLH

SEQ ID NO:41 YASQSIS

SEQ ID NO:42 QQSNSWPLN

Konsenzus teški lanac CDR-a

[0109]

SEQ ID NO:43 TISGGGX1X2TYYPDSVKG X1 je F, G

X2 je G, N

SEQ ID NO:44 PGYX3NYYFDI

X3 je H, N

SEQ ID NO:45 PGYX4NYYFDX5

X4 je H, N

X5 je I, Y

Konsenzus laki lanac CDR-a

[0110]

SEQ ID NO:46 X6ASDSISX7SLH X6 je H, R

X7 je N, G

SEQ ID NO:47 YX8RQSX9Q

X8 je G, A

X9 je I, E

SEQ ID NO:48 YX10X11QSX12X13X10 je G, A

X11 je R, S

X12 je I, E

X13 je Q, S

SEQ ID NO:49 QQSX14SWPLH X14 je E, A

SEQ ID NO:50 QQSX15SWPLX16X15 je E, A, N

X16 je H, N

Konsenzus promenljivi region teškog lanca [0111]

SEQ ID NO:51

X17 je H, N

Konsenzus promenljivi region lakog lanca [0112]

SEQ ID NO:52

X18 je G, A

X19 je I, E

X20 je E, A

SPISAK SEKVENCI [0113]

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, sastoji se od promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) i promenljivog regiona teškog lanca (HCVR), pri čemu se LCVR sastoji od CDR-a LCDR1, LCDR2 i LCDR3, dok se HCVR sastoji od CDR-a HCDR1, HCDR2 i HCDR3, pri čemu LCDR1 je SEQ ID NO:5, LCDR2 je SEQ ID NO:8, LCDR3 je SEQ ID NO:7, HCDR1 je SEQ ID NO:1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2 i HCDR3 je SEQ ID NO: 4, namenjeno za terapiju karcinoma.

2. Humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje je namenjeno za primenu u skladu sa zahtevom 1, pri čemu je karcinom odabran između multiplog mijeloma, karcinoma dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

3. Humano konstruisano DKK-1 antitelo, koje je namenjeno za primenu u skladu sa zahtevom 1 ili zahtevom 2, pri čemu se LCVR sastoji od aminokiselinskih sekvenci ili SEQ ID NO: 14, a HCVR se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 12

4. Humano konstruisano DKK-1 antitelo, koje je namenjeno za primenu u skladu sa tvrdnjama 1 do 3, pri čemu se humano konstruisano DKK-1 antitelo sastoji od teških lanaca koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18 i lakih lanaca koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20.

5. Humano konstruisano DKK-1 antitelo, koje je namenjeno za primenu u skladu sa tvrdnjama 1 do 4, sadrži dva laka lanca pri čemu se svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 i dva teška lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18.

6. Farmaceutska supspstanca koja čini humano konstruisano DKK-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, sastoji se od promenljivog regiona lakih lanaca (LCVR) i promenljivog regiona teških lanaca (HCVR) gde se LCVR sastoji od CDR-a LCDR1, LCDR2 i LCDR3, dok se HCVR sastoji od CDR-a HCDR1, HCDR2 i HCDR3, pri čemu LCDR1 je SEQ ID NO:5, LCDR2 je SEQ ID NO:8, LCDR3 je SEQ ID NO:7, HCDR1 je SEQ ID NO:1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2 i HCDR3 je SEQ ID NO: 4, namenjeno za terapiju karcinoma.

7. Farmaceutska supstanca za primenu u skladu sa zahtevom 6 namenjen je terapiji karcinoma, pri čemu je karcinom odabran između multiplog mijeloma, karcinoma dojke i ne-mikrocelularnog karcinoma pluća.

8. Farmaceutska supstanca za primenu u skladu sa zahtevima 6 i 7 sadrži po izboru, i druge terapijske sastojke.