RS62214B1

RS62214B1 - Dkk-1 antitela

Info

Publication number: RS62214B1
Application number: RS20210998A
Authority: RS
Inventors: Marcio Chedid; Ryan James Darling; Rachelle Jeanette Galvin; Barbara Anne Swanson
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2021-09-30
Also published as: ZA201107256B; DK2930184T3; EP2930184A1; PL2417158T3; KR20110124364A; TR201907261T4; SG175244A1; SI2930184T1; BRPI1014157A2; HUE034625T2; PT2930184T; HRP20211343T1; RS56505B1; LT2930184T; HRP20171400T1; US20100260754A1; RS58612B1; NZ595011A; CA2758252C; PT2417158T

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na humana inženjeringom dobijena antitela protiv DKK-1 i njihovu upotrebu u tretiranju bolesti kod kojih je patogeneza posredovana sa DKK-1.

[0002] Dickkopf-1 (Dkk-1) je član dickkopf familije proteina za koje je pokazano da su negativni regulatori kanonijskog Wnt-signalnog puta. Signalni put ima centralnu ulogu u razvoju i formiranju kostiju. Dkk-1 inhibira Wnt signalizaciju preko njegove interakcije sa Wnt koreceptorom LRP5 ili LRP6 i kremen proteinima. Dkk-1 sprečava čalnove Wnt puta u odnosu na interakciju sa ili LRP5 ili LRP6, čime se sprečava prenošenje Wnt-posredovanog signala. Takođe je pokazano da je DKK1 uključen u metastazirajuće kancere kostiju, uključujući multpni mijelom, karcinom dojke, karcinom bubrega i nesitnoćelijski kancer pluća.

[0003] WO2007/084344 opisuje antitela koja utiču na ili neutrališu protein Dickkopf (Dkk-1) i/ili Dickkopf (Dkk-4) posredovani antagonizam Wnt signalizacije koji su korišćeni za tretiranje Dkk-povezanih abnormalnosti gustine kosti, matabolizma, dijabetesa i kancera.

[0004] Objavljeno je da je antitelo BHQ880 (MOR-4910) opisano u Fulcintini Mariateresa et al: "Anti-DKK1 mAb (BHQ880) as a potential therapeutic agent for multiple myeloma" Blood, vol.

114, no.2, 9 July 2009, pages 371-379, Gaviatopoulou Maria et al, "Dickkopf-1: a suitable target for the management of myeloma bone disease", Expert Opinion on Therapeutic Targets, vol. 13, no. 7, July 2009, pages 839-848 Yaccoby Shmeul et al: "Antibody-based inhibition of DKK1 suppresses tumor-induced bone resorption and multiple myeloma growth in vivo", Blood, American Society of Hematology, vol. 109, no. 5, 1 March 2007, pages 2106-211 i Ettenberg Seth et al: "BHQ880, a novel anti-DKK1 neutralizing antibody, inhibits tumor-induced osteolytic bone disease", Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, vol. 49, 1 April 2008, page 947, anti-DKK1/DKK4 antitelo koje neutrališe i DKK1 i DKK4.

[0005] Antitela koja vezuju Dkk-1 su opisana (na primer, videti WO2006015373), međutim i dalje postoji potreba za terapeutskim humanim inženjeringom dobijenim DKK-1 antitelima koja će inhibirati interakciju Dkk-1 sa LRP5 i LRP6. Dodatno, u pogledu uključivanja Dkk-1 u regulaciju formiranja kostiju, postoji potreba za terapeutskim humanim inženjeringom dobijenim anti-Dkk-1 antitelima za upotrebu u zarastanju kostiju. Dodatno, uzimajući u obzir uključenost Dkk-1 u kancerima, postoji potreba za humanim inženjeringom dobijenim anti-Dkk-1 antitelima za tretiranje kancera, uključujući multipni mijelom, kancere dojke i nesitnoćelijski kancer pluća.

[0006] Antitela prema predmetnom pronalasku su terapeutski korisni DKK-1 antagonisti koi poseduju brojne poželjne osobine. Predmetna humana humana inženjeringom dobijena antitela pokazuju visok afinitet (Kd) za humani DKK-1, DKK-1 makaki majmuna, DKK-1 pacova, DKK-1 miša, i DKK-1 zeca. Antitela prema predmetnom pronalasku blokiraju DKK-1 – posredovanu inhibiciju alkalne fosfataze, markera aktivnosti osteoblasta. Dodatno, antitela prema predmetnom pronalasku pokazuju povećanje u gustini mase kosti i u anteriornim i u posteriornim korteksima u in vivo modelu korteksnog defekta i pokazuju značajnu inhibiciju rasta nesitnoćelijskih ksenografta pluća in vivo.

[0007] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je DKK-1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 36 i HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 37.

[0008] Poželjno, DKK-1 antitelo prema prvom aspektuprema predmetnom pronalasku sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 34 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 35.

[0009] Poželjnije, DKK-1 antitelo prema prvom aspektu predmetnog pronalaska sadrži dva laka lanca naznačeno time da svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 34, i dva teška lanca naznačeno time da svaki teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 35.

[0010] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent.

[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima Kdna 37°C manju od 5.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32).

[0012] Predmetni pronlazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment naznačeno time da LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:47, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:49, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:44.

[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent.

[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje kosti koji sadrži primenu humanog inženjeringom dobijenog DKK-1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za tretiranje kancera koji sadrži primenu humanog inženjeringom dobijenog DKK-1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska, naznačeno time da je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od multipnog mijeloma, kancera dojke i nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 1.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 1.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 5.0 X 10<-12>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdizmeđu 0.5 X 10<-12>M i 1.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdizmeđu 1.0 X 10<-12>M i 1.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29). Kdvrednosti su ustanovljene ravnotežnim vezivanjem na 37°C kao što je opisano u Primeru 2.

[0016] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 5.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdmanju od 2.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), i DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdizmeđu 1.0 X 10<-11>M i 5.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da antitelo ima Kdizmeđu 1.5 X 10<-11>M i 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), i DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33). Kdvrednosti su ustanovljene ravnotežnim vezivanjem na 37°C kao što je opisano u Primeru 2.

[0017] Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12 i naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment ima Kdmanju od 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12 i naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Kdmanju od 2.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12 i naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Kdmanju od 2.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Dodatno poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12 i naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Kdizmeđu 0.5 X 10<-12>M i 3.0 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12 i naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Kdizmeđu 1.0 X 10<-12>M i 2.5 X 10<-11>M za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29), DKK-1 makaki majmuna (SEQ ID NO: 30), Dkk-1 pacova (SEQ ID NO: 31), DKK-1 miša (SEQ ID NO: 33), i DKK-1 zeca (SEQ ID NO: 32). Kdvrednosti su ustanovljene preko ravnotežnog vezivanja na 37°C kao što je opisano u Primeru 2.

[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment, koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCVR sadrže regione koje određuju komplementarnost (CDRs) LCDR1, LCDR2, i LCDR3 i HCVR sadrži CDRs HCDR1, HCDR2 i HCDR3, naznačeno time da LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, i HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2.

[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment naznačeno time da LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:46, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:48, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:50, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:43, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:45. Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment naznačeno time da LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:47, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:49, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:44.

[0020] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov vezujući fragment naznačeno time da LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, i SEQ ID NO:10, LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:9, HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2, i HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.

[0021] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment naznačeno time da LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 i HCDR3 imaju aminokiselinske sekvence izabrane i grupe koja se sastoji od: (i) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 6, LCDR3 je SEQ ID NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ ID NO: 3,

(ii) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 8, LCDR3 je SEQ ID NO: 7, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ ID NO: 4,

(iii) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 6, LCDR3 je SEQ ID NO: 9, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ ID NO: 3,

(iv) LCDR1 je SEQ ID NO: 5, LCDR2 je SEQ ID NO: 10, LCDR3 je SEQ ID NO: 9, HCDR1 je SEQ ID NO: 1, HCDR2 je SEQ ID NO: 2, i HCDR3 je SEQ ID NO: 3

[0022] Predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment naznačeno time da LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 52 i HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 51.

[0023] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment naznačeno time da LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, i SEQ ID NO:16.

[0024] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12.

[0025] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time da LCVR i HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:13 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:11;

(ii) LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12;

(iii) LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:15 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:11;

(iv) LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:16 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:11.

[0026] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:14 i HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:12.

[0027] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo sadrži laki lanac naznačeno time da laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, i SEQ ID NO:22.

[0028] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo, naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo sadrži teški lanac naznačeno time da teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:18.

[0029] Poželjnije, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo, naznačeno time da humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog i lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od

(i) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:19,

(ii) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:18 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20,

(iii) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:21, i

(iv) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 22.

[0030] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca naznačeno time da svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19, i dva teška lanca naznačeno time da svaki težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17.

[0031] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca naznačeno time da svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 21, i koje sadrži dva teška lanca naznačeno time da svaki teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17.

[0032] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca naznačeno time da svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 22, i koje sadrži dva teška lanca naznačeno time da svaki teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:17.

[0033] Predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo koje sadrži dva laka lanca naznačeno time da svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 20, i koje sadrži dva teška lanca naznačeno time da svaki teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:18.

[0034] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koje je u kompeticiji sa inženjeringom dobijenim DKK-1 antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom predmetnog pronalaska za vezivanje za humani DKK-1 (SEQ ID NO: 29) kao što je određeno preko kompetitivnog testa antitela.

[0035] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent.

[0036] Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje farmceutsku kompoziciju koja sadrži humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska zajedo sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem, ili ekscipijentom i izborno drugim terapeutskim sastojcima.

[0037] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje kosti koji sadrži primenu inženjeringom dobijenog DKK-1 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska.

[0038] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje kancera koji sadrži primenu inženjeringom dobijenog DKK-1 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska, naznačeno time da kancer je poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od multipnog mijeloma, kancera dojke i nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0039] Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje inženjeringom dobijena DKK-1 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska za upotrebu u terapiji. Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje humano inženjeringom dobijeno DKK-1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu lečenja kosti ili u tretmanu kancera, naznačeno time da je kancer poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od multipnog mijeloma, kancera dojke i nesitnoćelijskog kancera pluća.

[0040] Dodatno, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu inženjeringom dobijenog DKK-1 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska u proizvodnji leka za terapiju, lečenje kosti ili za tretiranje kancera, naznačeno time da je kancer poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od multipnog mijeloma, kancera dojke i nesitnoćelijskog kancera pluća.

Definicije

[0041] Antitelo pune dužine kao što postoji u prirodi je molekul imunoglobulina koji sadrži 2 teška (H) lanca i 2 laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezma. Amino terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100-110 aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena preko regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) koji se u njima sadrže. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektornu funkciju.

[0042] CDRs su rasuti sa regionima koji su konzervativniji, označenim okvirni regioni ("FR"). Svaki varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR) je sastavljen od 3 CDRs i 4 FRs, raspoređena od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDRs lakog lanca se označavaju kao "LCDR1, LCDR2, i LCDR3" i 3 CDRs teškog lanca se označavaju kao "HCDR1, HCDR2, i HCDR3." CDRs sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Numerisanje i položaji CDR aminokiselinskih ostataka unutar LCVR i HCVR regiona je u skladu sa dobro poznatom konvencijom Kabat numerisanja.

[0043] Laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda, i karakterisani su naročitim konstantnim regionima kao što je poznato u tehnici. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE, respektivno. IgG antitela mogu se dodatno podeliti u potklase, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Svaki tip teškog lanca je karakterisan naročitim konstantnim regionom sa sekvencom dobro poznatom u tehnici.

[0044] Kao što je ovde korišćeno, termin "monoklonsko antitelo" (Mab) odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona uključujući, na primer, bilo koji eukariotski, prokariotski, ili fagni klon, i ne postupak kojim su proizvedeni. Mab predmetnog pronalaska poželjno postoje u homogenoj ili u značajnom stepenu homogenoj populaciji. Kompletna Mab sadrže 2 teška lanca i 2 laka lanca. "Antigen-vezujući fragmenti" takvih monoklonskih antitela uključuju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2 fragmente, i jednolančane Fv fragmente. Monoklonska antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska mogu se proizvesti, na primer, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, sintetičkih tehnologija, npr., CDR-graftingom, ili kombinacijom takvih tehnika, ili drugih tehnologija poznatih u tehnici. Na primer, miševi se mogu imunizovati sa humanim DKK-1 ili njegoim fragmentima, rezultujuća tela se mogu rekuperovati i prečistiti, i odrediti da li poseduju vezujuće i funkcionalne karakteristike slične ili iste kao jedinjenja antitela otkrivena ovde mogu se proceniti postupcima otkrivenim u Primerima koji slede. Antigen-vezujući fragmenti mogu se takođe pripremiti konvencionalnim postupcima. Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela i antigen-vezujućih fragmenata su dobro poznati u tehnici i mogu se naći, na primer, u Harlow i Lane (1988) Antibodies, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 i 15, ISBN 0-87969-314-2.

[0045] Izraz "himerno antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži domene iz različitih vrsta (generalno 2 vrste). Antitelo V je himerno antitelo naznačeno time da varijabilni domeni lakog lanca i teškog lanca sadrže ostatke iz mišjeg antitela, dok domen konstantnog regiona lakog lanca koji sadrži domene kapa lakog lanca i konstantni region teškog lanca pacova sadrži ostatake koji čine IgG1 antitelo pacova. Antitelo V je miš/pacov himera i korišćeno je u studijama da se smanji verovatnoća imunog odgovora u dugotrajnim prekliničkim modelima.

[0046] Izraz "humana humana inženjeringom dobijena antitela" odnosi se na monoklonska antitela koja imaju vezujuće i funkcionalne osobine prema pronalasku, i koja imaju okvirne regione koji su u značajnom stepenu humani ili potpuno humani koji okružuju CDRs izvedene iz ne-humanog antitela. "Antigen-vezujući fragmenti" takvih humanih inženjeringom dobijenih antitela uključuju, na primer, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2 fragmente, i jednolančane Fv fragmente. "Okvirni region" ili "sekvenca okvirnog regiona" odnosi se na bilo koji od okvirnih regiona 1 do 4. Humana inženjeringom dobijena antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti obuhvaćeni predmetnim pronalaskom uključuju molekule naznačeno time da bilo koji ili više okvirnih regiona 1 do 4 je u značajnom stepenu ili potpuno humano, tj., naznačeno time da je prisutna bilo koja od mogućih kombinacija pojedinačnih u značajnom stepenu ili potpuno humanih okvirnih regiona 1 do 4. Na primer, ovo uključuje molekule u kojima su okvirni region 1 i okvirni region 2, okvirni region 1 i okvirni region 3, okvirni region 1,2, i 3, itd., su u značajnom stepenu ili potpuno humani. U značajnom stepenu humani okvirni regioni su oni koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa poznatom sekvencom okvirnog regiona humane klicine linije. Poželjno, u značajnom stepenu humani okvirni regioni imaju najmanje oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% identičnosti sekvence sa poznatom sekvencom okvirnog regiona humane klicine linije.

[0047] Potpuno humani okvirni regioni su oni koji su identični poznatoj sekvenci okvirnog regiona humane klicine linije. Humane sekvence okvirnog regiona klicine linije mogu se dobiti od ImMunoGeneTics (IMGT) preko njihovog internet sajta http://imgt.cines.fr, ili od Immunoglobulin FactsBook od Marie-Paule Lefranc i Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Na primer, okvirni regioni lakog lanca klicine linije mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, O2, i O8, i okvirni regioni teškog lanca klicine linije mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, i VH5-5I.

[0048] Humana inženjeringom dobijena antitela dodatno onima otkrivenim ovde koja pokazuju slične funkcionalne osobine prema predmetnom pronalasku mogu se stvoriti korišćenjem nekoliko različitih postupaka. Specifična jedinjenja antitela otkrivena ovde mogu se koristiti kao šabloni ili roditeljska jedinjenja antitela za pripremu dodatnih jedinjenja antitela. U jednom pristupu, CDRs roditeljskog jedinjenja antitela su graftovani u humane okvirne sekvence koje imaju visoku identičnost sekvence sa roditeljskim jedinjenjem okvirnog regiona antitela. Identičnost sekvence novog okvirnog regiona će generalno biti najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% identična sekvenci odgovarajućeg okvirnog regiona u roditeljskom jedinjenju antitela. Ovaj grafting može rezultovati u smanjenju afiniteta vezivanja u poređenju sa onim roditeljskog antitela. Ukoliko je ovo slučaj, okvirni region može biti povratno mutiran u roditeljski okvirni region na određenim položajima na osnovu specifičnih kriterijuma otkrivenih od strane Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Dodatne reference koje opisuju postupke korisne u humanizovanju mišjeg antitela uključuju SAD Patente br. 4,816,397; 5,225,539, i 5,693,761; kompjuterske programe ABMOD i ENCAD kao što je opisano u Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; i postupak od Winter i saradnika (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; i Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

[0049] Identifikacija ostataka za razmatranje za povratrne mutacije može se izvesti kao što sledi: Kada aminokiselina spada u sledeću kategoriju, aminokiselina okvirnog regiona sekvence humane klicine linije koja je korišćena ("akceptorski okvirni region") je zamenjena amonokiselinom okvirnog regiona iz okvirnog regiona roditeljskog antitela ("donor okvirni region"):

(a) aminokiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvirnog regiona je neuobičajena za humane okvirne regione na toj poziciji, dok je odgovarajuća aminokiselina u donor imunoglobulinu tipična za humane okvirne regione na tom položaju;

(b) položaj amino kiseline je neposredno susedan onome od CDRs; ili

(c) bilo koji atom bočnog lanca aminokiseline okvirnog regiona je umutar oko 5-6 angstrema (centar-do-centra) bilo kog atoma CDR aminokiseline u trodimenzionalnom modelu imunoglobulina.

[0050] Kada je svaka od aminokiselina u humanom okvirnom regionu akceptorskog okvirnog regiona i odgovarajuća aminokiselina u donor okvirnom regionu je generalno neuobičajena za humane okvirne regione na tom položaju, takva aminokiselina se može zameniti aminokiselinom tipičnom za humane okvirne regione na tom položaju. Ovaj kriterijum povratne mutacije omogućava da se vrati aktivnost roditeljskog jedinjenja antitela.

[0051] Sledeći pristup generisanju humanih humanih inženjeringom dobijenih antitela koja pokazuju slične funkcionalne osobine jedinjenjima antitela otkrivenim ovde uključuju randomizovano mutiranje aminokiselina untar graftovanih CDRs bez promena okvirnog regiona, i skrining rezultujućih molekula u odnosu na afinitet vezivanja i druge funkcionalne osobine koje su dobre kao ili bolje od onih kod roditeljskih jedinjenja antitela. Pojedinačne mutacije se takođe mogu introdukovati na svakom aminokiselinskom položaju unutar svakog CDR, nakon čega sledi procena efekata takvih mutacija na afinitet vezivanja i druge funkcionalne osobine. Pojedinačne mutacije koje proizvode poboljšane osobine mogu se kombinovati da bi se procenili njihovi efekti u međusobnoj kombinaciji.

[0052] Dodatno, moguća je kombinacija oba prethodna pristupa. Nakon CDR graftovanja, mogu se povratno mutirati specifični okvirni regioni dodatno introdukciji aminokiselinskih promena u CDRs. Ova metodologija je opisana u Wu et al. (1999) J. Mol. Biol.294:151-162.

[0053] Primenjivanjem saznanja predmetnog pronalaska, stručnjak može koristiti uobičajene tehnike, npr., na mesto usmerenu mutagenezu, da bi supstituisao aminokiseline unutar predmetnog otkrivenog CDR i okvirnih sekvenci i time stvorio dodatne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona izvedene iz predmetnih sekvenci. Sve alternativne aminokiseline koje se javljaju u prirodi mogu se introdukovati na specifično supstituciono mesto. Postupci otkriveni ovde se zatim mogu korisiti za skrining tih dodatnih aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona da bi se identifikovale sekvence koje koje imaju naznačene in vivo funkcije. Na ovaj način, mogu se identifikovati dodatne sekvence pogodne za pripremanje humanih humanih inženjeringom dobijenih antitela i njihovih antigen-vezujućih delova u skladu sa predmetnim pronalaskom. Poželjno, supstitucija aminokiselina unutar okvirnih regiona je ograničena na jedan, dva, ili tri položaja unutar bilo kog ili više od 4 okvirna regiona lakog lanca i/ili teškog lanca otkrivenih ovde. Poželjno, aminokiselinska supstitucija unutar CDRs je ograničena na jedan, dva, ili tri položaja unutar bilo kog ili više od CDRs 3 laka lanca i/ili teška lanca. Kombinacije različitih promena unutar ovih okvirnih regiona i CDRs opisani prethodno su takođe mogući. Najpoželjnije, ove tehnike su korišćene za generisanje dodatnih aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona korišćenjem aminokiselinskih sekvenci varijabilnog teškog i lakog lanca opisane u SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:14 respektivno.

[0054] Humana inženjeringom dobijena antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su u "kompeticiji" sa molekulima otkrivenim ovde su oni koji vezuju humani DKK-1 (SEQ ID NO:29) na mestu (mestima) koja su identična, ili se preklapaju sa, mestom (mestima) na kojima se vezuje predmetni molekul. Kompetitivna humana inženjeringom dobijena antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti se mogu identifikovati, na primer, preko kompetitivnog testa antitela. Na primer, uzorak prečišćenog ili delimično prečišćenog humanog DKK-1 (SEQ ID NO:29) je vezan za čvrstu podlogu. Antitelo otkriveno ovde i test monoklonsko antitelo ili antigen vezujući fragment, sa obeleženim ili test ili antitelom predmetnog pronalaska, su zatim dodati. Ukoliko se obeleženo antitelo i neobeleženo antitelo vezuju za zasebna i odvojena mesta na DKK-1, obeleženo antitelo će se vezati sa istim nivoom bez obzira da li je ili nije prisutno suspektno kompetitivno antitelo. Međutim, ukoliko su mesta interakcije identična ili preklapajuća, neobeleženo antitelo će biti u kompeticiji, i količina obeleženog antitela vezanog za antigen će biti smanjena. Ukoliko je neobeleženo antitelo prisutno u višku, obeleženo antitelo se neće vezati. Za svrhe predmetnog pronalaska, kompetitivno humano humano inženjeringom dobijeno antitelo ili njegovi antigen-vezujući fragmenti su oni koji smanjuju vezivanjepredmetnih antitela za DKK-1 za oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99%. Detalji procedura za izvođenje takvih komeptitivnih testova dobro su poznati u tehnici i mogu se naći, na primer, u Harlow i Lane (1988) Antitela, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pages 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Takvi testovi mogu biti kvatitativni korišćenjem prečišćenih antitela. Standardna kriva je ustanovljena titracijom jednog antitela nasuprot njegove obeležene verzije. Kapacitet neobeleženog kompetitivnog moonklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta za inhibiciju vezivanja obeleženog molekula za ploču je titrovana. Rezultati su plotovani, i upoređene su koncentracije neophodne da se postigne željeni stepen inhibicije vezivanja. Da li monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koi su u kompeticiji sa humanim inženjeringom dobijenim antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima predmetnog pronalaska u takvim kompetitivnim testovima poseduju iste ili slične funkcionalne osobine predmetnih humanih humanih inženjeringom dobijenih antitela može se odrediti preko postupaka otkrivenih ovde u Primerima.

[0055] Termin "inhibira" označava sposobnost da se u značajnom stepenu antagonizuje, zabrani, spreči, zadrži, uspori, poremeti, eliminiše, stopira, smanji, ili izvrši reverzija bioloških efekata DKK-1.

[0056] Termin "tretiranje" (ili "tretirati" ili "tretman") odnosi se na proces koji uključuje usporavanje, ometanje, zastoj, kontrolu, stopiranje, smanjenje, ili reverziju napredovanja ili težine simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti, ali ne uključuje obavezno potpunu eliminaciju svih simptoma povezanih sa bolešću, stanjima, ili poremećajima povezanim sa DKK-1 aktivnošću.

[0057] termin "prevencija" (ili "sprečiti" ili "sprečavanje") označava zabranu, zadržavanje, ili inhibiciju incidence ili pojavljivanja simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti. Akutni događaji i hronična stanja mogu se tretirati i sprečiti. U akutnom događaju, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment je primenjen na početku simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti, i prekinut je kada se završi akutni događaj. Nasuprot tome, hronični simptom, poremećaj, stanje, ili bolest je tretirana tokom dužeg vremenskog okvira.

[0058] Termin "efikasna količina" odnosi se na količinu ili dozu jedinjenja antitela predmetnog pronalaska koje, nakon jedne ili više doza primene na pacijenta, obezbeđuje željeni tretman ili prevenciju. Terapeutski efikasne količine predmetnih jedinjenja antitela mogu sadržati količinu u opsegu od oko 0.1 mg/kg do oko 20 mg/kg po jednoj dozi. Terapeutski efikasna količina za bilo kog pojedinačnog pacijenta može se odrediti od strane zdravstvenog radnika praćenjem efekta jedinjenja antitela na biomarker.

[0059] Termin "lečenje kosti" odnosi se na stimulaciju formiranja kosti na mestima povrede blokiranjem DKK-1. Primeri indikacija za lečenje kosti uključuju, ali nisu ograničeni na, lečenje frakture, fiksiranje/retenciju implanta, i fiksaciju/retenciju dentalnog implanta.

[0060] Humana inženjeringom dobijena antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao medikamenti u humanoj medicini, primenjeni različitim putevima. Najpoželjnije, takve kompozicije su za parenteralnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije se mogu pripremiti postupcima dobro poznatim u tehnici (Videti, npr., Remington: Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i sadrže humano inženjeringom dobijeno antitelo kao što je ovde otkriveno, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijent.

[0061] Rezultati sledećih testova pokazuju da su monoklonska antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, predmetnog pronalaska korisni kao DKK-1 inhibitor. Antitela predmetnog pronalaska poseduju brojne poželjne osobine. Na primer, Antitelo II predmetnog pronalaska ima povećanu hemijsku i fizičku stabilnost, i rastvorljivost. Ubrzane studije su izvedene da bi se procenila hemijska stabilnost antitela inkubiranjem antitela predmetnog pronalaska pod različitim uslovima pufera (pH i NaCl varijacija) i inkubiranjem na 4°C, 25°C, i 40°C 4 nedelje. Hemijske modifikacije antitela predmetnog pronalaska su detektovane katjon-izmenjivačkom ("CEX") hromatografijom da bi se razdvojile naelektrisane varijante (npr., deamidacija asparagina u asparaginsku kiselinu) i LC-MS analiza da bi se identifikovala specifična mesta degradacije. Antitelo II ima najmanju količinu degradacije detektovanu sa CEX i ovaj rezultat je dodatno potvrđen sa LC-MS podacima koij su pokazali da su sva tri asparaginska ostataka u CDRs imali najmanju količinu deamidacije u poređenju sa drugim antitelima opisanim ovde nakon 4-nedelje inkubacije na 40°C u pH 8 puferu. Rastvorljivost Antitela II je povoljnija u poređenju sa Antitelom I kada je formulisano na pH 6+150 mM NaCl. Dodatno, Antitelo II je održalo rastvorljivost od >105 mg/mL kada je uskladišteno na 4°C, dok je rastvorljivost za Antitelo I samo 48 mg/mL i taložilo se pod ovim istim uslovima. Kao što je ovde korišćeno, "EC50" odnosi se na koncentraciju sredstva koje proizvodi 50% maksimalnom mogućeg odgovora za to sredstvo. "Kd" se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije koja se može izračunati preko formule: koff/kon= Kd.

Primer 1-Proizvodnja antitela

[0062] Antitela I, II, III, i IV mogu se stvoriti i prečistiti kao što sledi. Odgovarajuće ćelije domaćini, kao što su HEK 293 EBNA ili CHO, su ili prolazno ili stabilno transfektovane sa ekspresionim sistemom za sekreciju antitela korišćenjem optimalnog predeterminisanog HC:LC odnosa vektora ili jedan sistem vektora koij kodira oba HC, kao što su SEQ ID NO: 23, ili SEQ ID NO: 24, i LC, kao što su SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, ili SEQ ID NO: 28. Izbostreni medijum, u koje je izlučeno antitelo, prečišćen je korišćenjem bilo kojim od uobičajeno korišćenih postupaka. Na primer, medijum se može pogodno primeniti na Protein ili G sefaroza FF kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (pH 7.4). Kolona je isprana da bi se uklonile nespecifične vezujuće komponente. Vezano antitelo je eluirano, na primer, sa pH gradijentom (kao što je 0.1 M natrijum fosfat pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citrat pufer pH 3.0). Frakcije antitela su detektovane, kao što je sa SDS-PAGE, i zatim su pulovane. Dodatno prečišćavanje je izborno, u zavisnosti od nameravane upotrebe. Antitelo se može koncentrovati i/ili sterilno filtrirati korišćenjem uobičajenih postupaka. Rastvorljivi agregat i multimeri mogu se efikasno ukloniti uobičajenim postupcima, uključujući ekskluzionu, sa hidrofobnom interakcijom, jonoizmenjivačku, ili hidroksiapatitnu hromatografiju. Čistoća antitela nakon ovih koraka hromatografije je veća od 99%. Proizvod može biti odmah zamrznut na -70°C ili se može liofilizovati. Aminokiselinske sekvence za ova antitela su obezbeđene u nastavku

SEQ ID NOs

Primer 2: Merenje afiniteta (Kd) za DKK-1 antitela

[0063] Da bi se ustanovilo ravnotežno vezivanje, konstantna koncentracija antitela je pomešana sa različitim koncentracijama His-tagovanog DKK-1 (SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, ili SEQ ID NO:33) (1 nM - 1 pM opseg) u PBS (pH 7.4) 1 mg/mL goveđeg serum albumina ("BSA") ili samog pufera i inkubirana nekoliko dana na 37°C. Postavljena su dva seta reakcija vezivanja, jedan set na niskoj koncentraciji antitela (3 pM) i jedan set na visokoj koncentraciji antitela (30 ili 50 pM).

[0064] Nakon ustanovljavanja ravnoteže, KinExA 3000 instrument (Sapidyne Inst. Inc.) je korišćen za testiranje u odnosu na frakciju ’slobodnog’ (nevezanog) antitela. Ukratko, Histagovani DKK-1 je kovalentno kuplovan sa NHS-aktiviranim Sepharose 4 Fast Flow perlama (GE Healthcare) koje su pakovane instrumentom da bi se stvorila mala kolona. Pre-ekvilibrisane smeše antitelo His-tagovani DKK-1 su propušteni preko perli da bi se zarobilo samo slobodno antitelo. Količina zarobljenog slobodnog antitela je proporcionalna slobodnoj koncentraciji u ravnotežnim uzorcima, i detektovana je injekcijom fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela. Setovi podataka iz niskih i visokih koncentracija antitela su fitovani globalno korišćenjem analize n-krive u KinExA programu. Ovo fitovanje daje Kdvrednost kao i 95% interval poverenja.

Tabela 1: Afinitet antitela II prema DKK-1 iz različitih vrsta

Primer 3: Efekat Dkk-1 antitela u C2C12 testu alkalne fosfataze

[0065] Kanonijska Wnt signalizacija je važna za diferencijaciju i aktivnost osteoblasta. Wnt-3a CM (kondicionirani medijum) kombinovan sa BMP-4 indukuje pluripotentne mišje C2C12 ćelije da se diferenciraju u osteoblaste sa merljivom krajnjom tačkom alkalne fosfataze ("AP"), markerom aktivnosti osteoblasta. DKK-1, inhibitor kanonijske Wnt signalizacije, inhibira diferencijaciju i proizvodnju AP. Neutralizujuća DKK-1 antitela sprečavaju DKK-1-posredovanu inhibiciju AP. Antitela koja blokiraju DKK-1 inhibirajuću aktivnost sprečavaju gubitak AP aktivnosti.

[0066] C2C12 ćelije su uzgajane do 60% - 80% konfluence u bocama za kulturu tkiva u medijumu za rast (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ("DMEM") koji sadrži L-glutamin, 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma ("FBS"), 1x antibiotik/antimikotik, 1x natrijum piruvat). C2C12 ćelije su resuspendovane do koncentracije od 30,000 ćelija/mL u medijumu za rast 100 µL/bunarčiću je dodato u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića i inkubirano preko noći na 37°C, 95% vlažnosti, 5% CO2. Medijum za rast je zamenjen sa 50 mL test medijuma (DMEM koji sadrži L-glutamin, 5% toplotno inaktiviranog FBS, 1x antibiotik/antimikotik, 1x natrijum piruvat). Da bi se stimulisala diferencijacija (i stog aindukovala proizvodnjaj AP), dodato je 100 mL test medijuma plus 1.5x Wnt-3a CM BMP-4 (R & D Systems kataloški #314-BP). Ovo daje finalnu koncentraciju od 1x Wnt-3a CM i 25 ng/mL BMP-4. Negativne kontrole sadrže samo L-ćelija CM (bez Wnt-3a ili BMP-4). Ćelije su inkubirane na 37°C, 95% vlažnosti, 5% CO272 časa. Medijum je uklonjen, ćelije su isprane sa 200 mL fosfatno puferovanog slanog rastvora ("PBS"), i PBS je uklonjen. Ćelije su zamrzavaneodmrzavane 3 puta. Dodato je 100 µL One-step pNPP supstrata (Thermo Scientific kataloški #37621) po bunarčiću, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi. Apsorbanca je očitana na 405 nm. Da bi se odredila koncentracija DKK-1 potrebna za inhibiranje diferencijacije, Dkk-1 molekuli iz različitih vrsta su titrovani da bi se identifikovala minimalna koncentracija potrebna da se potpuno inhibira AP indukcija.

[0067] Minimalna koncentracija DKK-1 iz svake vrste koja potpuno inhibira AP indukciju je kao što sledi: humani DKK-1=38 nM, makaki DKK-1=11.4 nM, pacov DKK-1=5.8 nM, i zec DKK-1= 25.0 nM.

[0068] Po određivanju koncentracije DKK-1 koja potpuno inhibira AP indukciju, povećane koncentracije anti-DKK-1 antitela su pre-inkubirane u test medijumu sa inhibitornom koncentracijom Dkk-1 30 minuta na sobnoj temperaturi. AP indukcija je određena kao što je prethodno opisano. Rezultati su dati kao EC50(nM ± standardna greška).

[0069] Antitelo II blokira Dkk-1-posredovanu inhibiciju C2C12 AP. Za DKK-1 različitih vrsta, EC50(date kao nM ± standardna greška) su kao što sledi: čovek = 9.8 ± 0.41, makaki = 6.4 0.25, pacov = 2.9 ± 0.25, i zec = 6.0 ± 0.32.

Primer 4: In vivo test kortikalnog defekta (CD)

[0070] Šest meseci stare ženke Sprague-Dawley pacova su ovariektomizovane i ostavljen da izgube kost dva meseca. Defekti prečnika od 2 mm su introdukovani u levi i desni femur sa električnom bušilicom sa 2 mm dentalnim svrdlom. Ova rupa se pruža duž i anteriornog i posteriornog korteksa. Zarastanje kosti je praćeno longitudinalno procenom gustine mase kosti ("BMD") upotrebom kvatitativne kompjuterizovane tomografije ("qCT") 35 dana nakon operacije. Na dan eksperimenta, životinje su žrtvovane i celi femuri su podvrgnuti određivanju maskimalnog opterećenja da bi se procenila biomehanička snaga cele dijafize. Antitela su primenjena subkutano sa dozma i intervalima kao što je naznačeno.

[0071] Antitelo II je dozirano kao što sledi: 5 mg/kg jednom svake dve nedelje počinjući jedan dan nakon operacije (Grupa 1), 1 mg/kg (Grupa 2), 5 mg/kg (Grupa 3), ili 15 mg/kg (Grupa 4) je primenjeno jednom svake dve nedelje počinjući devet dana nakon operacije. BMD je procenjena sa qCT na dan 35. Grupa 1 pokazala je statistički značajno povećanje BMD i u anteriornom i u posteriornom korteksu. Group 4 je pokazala statistički značajno povećanje BMD na oba korteksa, iako su Grupe 2 i 3 pokazale povećanje bez značaja u BMD.

Primer 5: Test in vivo efikasnosti na kancer

[0072] Miševi (ženke C.B-17 miševa, Fox Chase model teške kombinovane imunodeficijencije # CB17SC-M) su aklimatizovane jednu nedelju u prostorijama za životinje pre početka eksperimenta. Nakon aklimatizacije, miševi su randomizovani u grupe od po 10 po tretmanu. Kultivisane humane A549 ćelije nesitnoćelijskog karcinoma pluća su implantirane subkutano u zadnji deo boka miševa i omogućeno je da tumor dostigne srednju zapreminu tumora ∼ 100 mm<3>. Antitelo II (1 mg/kg i 5 mg/kg), kontrolno IgG antitelo (1 mg/kg i 5 mg/kg), ili vehikulum (citratno puferovani fiziološki rastvor sa dodatkom 0.02% Tween 80) je primenjen preko subkutane injekcije. Životinje primaju 2 tretmana razdvojena sa 7 dana.

[0073] Tumori su mereni 2 puta nedeljno elektronskim nonijusima da bi se plotovale krive rasta. Životinje su takođe praćene dva puta nedeljno u odnosu na fluktuacije telesne težine i znakove toksičnosti. Merenja zapremine tumora prikazane u Tabeli 3 su uzete na dan 29.

[0074] Kao što je pokazano u Tabeli 2, grupe tretmana koje su primile Antitelo II, pokazale su značajnu inhibiciju rasta humanih A549 nesitnoćelijskih ksenografta pluća in vivo.

Tabela 2: Efikasnost antitela II u modelu ksenografta A549 humanog nestinoćelijskog karcinoma pluća

Primer 6: In vivo ksenograft test angiogene re-normalizacije

[0075] Da bi se shvatio mehanizam anti-tumorske efikasnosti, izvedena je analiza vizuelizacije visokog sadržaja na A549 tumorima tretiranim sa Antitelom II ili IgG kontrolom. Nekoliko fenotipski zasnovanih markera je analizirano i kavntitativno i kvalitativno da bi se procenili biološki procesi angiogeneze relevantni za kancer (CD31 i aktin glatkog mišića, SMA), indukcija hipoksije (transporter glukoze 1, GLUT1), proliferacija ćelija (Ki67), i apoptoza (Terminal UDP Nick-End Labeling, TUNEL).

[0076] Ženke C.B-17 (Fox Chase SCID) model # CB17SC-M miševi starosti 7 do 8 nedelja su aklimatizovani jednu nedelju i dozvoljeno im je da se hrane ad libitum na normalnoj isharni sa niskim sadržajem masti (4.5%), koja je nastavljena tokom studije.

[0077] A549 ćelije ATCC porekla su uzgajane i podeljene u F-12 Kaighn medijumu (InVitrogen #21127) sa dodatkom 10% FBS (InVitrogen #0, i 100x razblaženja natrijum piruvata, neesencijalnih aminokiselina i pen-strep (Invitrogen #11360, #11140 i #15140 respektivno).

Odvojene su i pripremljene na finalnoj koncentraciji od 50x10<6>ćelija/ml u PBS na pasažu 19 sa 95% vijabilnosti.

[0078] 5x10<6>A549 humanih ćelija karcinoma pluća je injektirano potkožno u bok miševa u 1:1 smeši PBS i Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). Merenja tumora i telesne težine izvedena su dva puta nedeljno. Pre tretmana, miševi su randomizovani na osnovu veličine tumora korišćenjem algoritma za randomizaciju.

[0079] Sa početkom kada su tumori dostigli 200 mm<3>, randomizovani miševi su podeljeni u 2 grupe od 10 životinja i dozirani potkožno na dan 1 i ponovo na dan 8 sa 5 mg/kg ili Antitela II ili IgG4 kontrolom. Studija je završena 10 dana nakon primene prve doze antitela.

[0080] Antitelo II je pripremljeno u citratno puferovanom fiziološkom rastvoru (CBS) (10 mM citrat pH6, 150 mM NaCl i 0.2% polisorbat). IgG4 kontrola je obezbeđena na 6.0 mg/ml u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS).

[0081] Ksenografti tumora su isečeni iz miševa nakon 17 dana doziranja i stavljeni u cink-Tris fiksativ (BD Pharmingen). Fiksirani tumori su obrađeni, stavljeni u parafinske blokove, i isečeni kao 3 mM preseci na standardnim mikroskopskim pločicama. Pločice su pečene na 60°F 1 čas i zatim deparafinisane u ksilenu (4 tretmana, 10 minutes svaki). Pločice su rehidrirane preko serija etanol/voda imerzija sa finalnim ispiranjima u Tris-puferovanom fiziološkom rastvoru/Tween (TBST). Pločice su zatim blokirane sa Protein Block (DAKO) 30 minuta. Za za panel tumora, pločice su obojene sa kombinacijom Hoechst 33324 (Invitrogen), pacovskim anti-humanim CD31 (Pharmingen)/anti-pacovskim Alexa-488 (Invitrogen), zečjim anti-Ki67 (NeoMarkers)/anti-zečjim Alexa 647 (Invitrogen), i TUNEL-TMR red (razblaženo 1:5 u TUNEL puferu za razblaživanje; Roche). Za panel angiogeneze, pločice su bojene sa kombinacijom Hoechst 33324 (Invitrogen), pacovskim anti-humanim CD31 (Pharmingen)/anti-pacovskim Alexa-488 (Invitrogen), zečjim anti-GLUT1 (Chemicon)/anti-zečjim Alexa 647 (Invitrogen), i mišjim anti-aktin glatkog mišića/Cy3 (Sigma). Pločice su vizuelizovane korišćenjem iCys Laser Scanning Cytometer (CompuCyte) i Marianas Digital Imaging Workstation konfigurisanim sa Zeiss Axiovert 200M invertovanim mikroskopom za fluorescenciju (Intelligent Imaging Innovations). Poređenja kvantitativnih podataka grupa tretmana izvedena su korišćenjem Dunnet analize u JMP statističkom programu (SAS).

[0082] Kao što je prikazano na Tabeli 3, A549 ksenografti iz kontrolnih IgG-tretiranih životinja su skromno vaskularizovani, imaju umerene nivoe miofinroblasta i mnoge fokuse oblasti hipoksije. Kontrolni IgG-tretirani tumori imaju proširenu mrežu sudova koji se sastoje i od neoangiogenih vaskularnih izdanaka i zrelih sudova koji su slabo pokriveni pericitama. Kontrolni IgG-tretirani tumori imaju hipoksične oblasti (obeležene sa GLUT1) koje su jasno ograničene zone nešto udaljene od perfuzionih sudova i nekrotične oblasti koji su još dalje od sudova. Tretman sa Antitelom II rezultuje u smanjenoj oblasti sudova, smanjenoj oblasti pericita, i smanjenoj pokrivenosti sudova pericitama. Međutim, ovaj tretman nije rezultovao u značajnoj razlici u hipoksiji tumora. Kvalitativno, tumorska vaskulatura tretirana Antitelom II izgleda da se sastoji od manjih, slabije umreženih sudova i sa manjom pokrivenošću pericitama u poređenju sa kontrolnom IgG-tretiranom grupom.

[0083] Kao što je prikazano na Tabeli 3, IgG-tretirani tumori imaju proliferišuće tumorske ćelije širom ravnomerno raspoređene, ali takođe često pokazuju jednu ili više velikih oblasti nekoze koje su avaskularne. Tretman sa Antitelom II rezultuje u nepromenjenoj apoptozi i samo blagom, beznačajnom smanjenju u ukupnoj oblasti proliferacije. Međutim, postoji snažno smanjenje u procentu oblasti visokog intenziteta Ki67 ćelija kod Antitelo II-tretiranih tumora, što može ukazivati na smanjenu količinu ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa.

Tabela 3: Antitelo II u in vivo ksenograft testu angiogene re-normalizacije

Primer 7: In vivo test efikasnosti kod kosti

[0084] Da bi se procenila sposobnost Antitela V (laki lanac SEQ ID NO:34 i teški lanac SEQ ID NO:35) za ubrzavanje formiranja peri-implanta kosti i regeneracije tkiva kosti, korišćeni su četiri meseca stari mužjaci Sprague-Dawley pacova (Harlan Sprague Dawley Inc) težine oko 425 grama. Pacovima je hirurški impantiran titanijumski šraf (2 mm x 4mm) u obe noge medijalno lateralne strane neposredno iznad tibio – fibularnog spoja. Pacovi su zatim po principu slučajnosti podeljeni u 2 grupe prema telesnoj težini i primili su ili Antitelo V 10 mg/kg ili IgG kontrolu 10 mg/kg potkožnom injekcijom jednom nedeljno sa početkom istog dana operacije u trajanju od 21 dan. Kvantitativna kompjuterizovana tomografija (Aloka LaTheta LTC-100 model CT skener) je korišćena za ex vivo skeniranje i kvantifikaciju novoformirane kosti sa 60-mm veličinom voksela. Zapremina od interesa (VOI) je definisana kao 28 isečaka na 0.1mm intervalu na mestu prethodnog implanta. Razlike između grupa su procenjene sa JMP verzija 5.1.

programom (Cary, North Carolina), poređenje nasuprot IgG-kontroli korišćenjem Dunnett postupka sa nivoom značajnosti od P<0.05. Kbvalitativna procena ex vivo faksitron rentgenskih snimaka ukazuje da pacovi tretirani sa Antitelom V imaju više nove kosti ili kalusa oko implanta. Kvantitativna CT analiza otkrila je statistički značajno povećanje mineralnog sadržaja kosti kortikalnog peri-implanta (14%), nove oblasti kosti (16%), kortikalne debljine (7%) mineralnog sadržaja nove kosti sunđerastog tkiva kostne srži peri-implanta (18%), i oblasti kosti (16%) kod pacova tretiranih sa Antitelom V treated u poređenju sa IgG kontrolom. Podaci pokazuju da Antitelo V stimuliše formiranje nove kosti i ubrzava regeneraciju kosti kod pacova sa titanijumskim implantom.

Listing SEQ ID

CDR regioni teškog lanca

[0085]

CDR regioni lakog lanca

[0086]

Varijabilni regioni teškog lanca [0087]

SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO:12

Varijabilni regioni lakog lanca [0088]

SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:15

SEQ ID NO:16

Kompletni teški lanci [0089]

SEQ ID NO:17

SEQ ID NO:18

Kompletni laki lanci [0090]

SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:20

SEQ ID NO:21

Nukleotidne sekvence – Varijabilni regioni teškog lanca [0091]

SEQ ID NO:23

SEQ ID NO:24

Nukleotidne sekvence – varijabilni regioni lakog lanca [0092]

SEQ ID NO:25

SEQ ID NO:26

SEQ ID NO:27

SEQ ID NO:28

Humani DKK-1

[0093] SEQ ID NO:29

DKK-1 makaki majmuna [0094] SEQ ID NO:30

DKK-1 pacova

[0095] SEQ ID NO:31

DKK-1 zeca

[0096] SEQ ID NO:32

DKK-1 miša

[0097] SEQ ID NO:33

Antitelo V – kompletan laki lanac [0098] SEQ ID NO:34

Antitelo V – kompletan težak lanac [0099] SEQ ID NO:35

Antitelo V – varijabilni region lakog lanca [0100] SEQ ID NO:36

Antitelo V – varijabilni region teškog lanca [0101] SEQ ID NO:37

Antitelo V – CDR regioni teškog lanca

[0102]

Antitelo V – CDR regioni lakog lanca

[0103]

Koncenzus CDR regioni teškog lanca

[0104]

X4 je H, N X5 je I, Y Koncenzus CDR regioni lakog lanca

[0105]

Koncenzus varijabilni region teškog lanca [0106] SEQ ID NO:51

X17 je H, N

Koncenzus varijabilni regioni lakog lanca [0107] SEQ ID NO:52

X18 je G, A

X19 je I, E

X20 je E, A

[0108] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Claims

Patentni zahtevi

1. DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i varijabilni region teškog lanca (HCVR), pri čemu LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 36 i HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 37.

2. DKK-1 antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da DKK-1 antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 34 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 35.

3. DKK-1 antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koje sadrži dva laka lanca pri čemu svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 34, i dva teška lanca pri čemu svaki težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 35.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži DKK-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5