[go: up one dir, main page]

RS55014B1 - Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona - Google Patents

Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona

Info

Publication number
RS55014B1
RS55014B1 RS20160678A RSP20160678A RS55014B1 RS 55014 B1 RS55014 B1 RS 55014B1 RS 20160678 A RS20160678 A RS 20160678A RS P20160678 A RSP20160678 A RS P20160678A RS 55014 B1 RS55014 B1 RS 55014B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid residues
heavy chain
immunoglobulin
Prior art date
Application number
RS20160678A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas Baurin
Christian Beil
Carsten Corvey
Christian Lange
Danxi Li
Vincent Mikol
Anke Steinmetz
Ercole Rao
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46927552&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55014(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of RS55014B1 publication Critical patent/RS55014B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA
[0001 ]Ovaj pronalazak se odnosi na belančevine slične antitelima koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri Čemu svaki par polipeptida. koji formiraju veznu belančevinu koja sliči antitelu, poseduje dvojne varijabilne domene koji imaju ukrštenu orijentaciju. Takođe su opisani i postupci za proizvodnju takvih veznih belančevina sličnih antitelima.
POZADINA PRONALASKA
[0002JPrirodna IgG antitela su bivalentna i monospecifična. Bispecifična antitela koja imaju vezne specifičnosti za dva različita antigena mogu da se proizvedu uz pomoć rekombinantnih tehnologija, a uobičajeno imaju široku kliničku primenu. Dobro je poznato da kompletni molekuli IgG antitela imaju Y-tbrmu pri čemu sadrže četiri polipeptidna lanca: dva teška lanca i dva laka lanca. Svaki laki lanac se sastoji od dva domena, N-terminalni domen koji je poznat kao varijabilni ili Vj, domen (ili region) i C-terminalni domen koji je poznat kao konstantni (ili Ci.) domen (konstantni kapa (Ck) ili konstantni lambda( CX)domen). Svaki teški lanac se sastoji od četiri ili pet domena, u zavisnosti o klasi antitela. N-terminalni domen je poznat kao varijabilni (ili Vn) domen (ili region), kojeg sledi prvi konstantni (ili Cm) domen, region drške, a tada i drugi i treći konstantni (ili C112i Cm) domen. U sklopljenom antitelu. Vi. i Vn domeni se spajaju kako bi formirali mesto za vezanje antigena. Takođe, Ct. i Cm domeni se spajaju zajedno kako bi omogućavali da teški lanac bude spojen na jedan laki lanac. Dva heterodimera teški-laki lanac se spajaju preko interakcije Cm i Cm domena i preko interakcije između regiona sa drškama oba teška lanca.
[0003]Poznato je da proteolitičko cepanje (digestija) nekog antitela može da dovede do nastanka fragmenata antitela (Fab i Fab2). Takvi fragmenti celog antitela mogu da poseduju sposobnost vezanja antigena. Fragmenti antitela takođe mogu da se proizvedu rekombinantno. Mogu da se dobiju Fv fragmenti koji se sastoje samo od varijabilnih domena teških i lakih lanaca koji su međusobno spojeni. Ovi Fv fragmenti su monovalentni šta se tiče vezanja antigena. Manji fragmenti poput pojedinačnih varijabilnih domena (domen-antitela ili dAB; Wardet al.,1989.Nature341(6242): 544-46). i pojedinačni regioni koji određuju komplementarnost ili CDR (Williamset al..1989.Proc. Nali. Acad. Sci. USA86(14): 5537-41) takođe zadržavaju vezne karakteristike parentnog antitela, mada većina prirodnih antitela generalno zahteva oba lanca. Vh i Vi., kako bi zadržala svoj vezni potencijal.
|00041Konstrukti sa pojedinačnim lancem varijabilnog fragmenta (scFv) sadrže Vh i Vi domene koji se nalaze u jednom polipeptidnom lancu u kojem su pomenuti domeni odvojeni uz pomoć fleksibilnog linkera dovoljne dužine (više od 12 amino-kiselinskih ostataka), koji omogućava intramolekulamu interakciju, dozvoljavajući spontano sklapanje oba domena u vezno mesto za neki funkcionalni epitop (Birdet al, 1988. Science242(4877): 423-26). Ove male belančevine (MW -25,000 Da) generalno zadržavaju specifičnost i afinitet za svoje antigene u pojedinačnom polipeptidu i mogu da obezbede prikladan vezni blok za veće. antigen-specifične molekule.
[0005JPrednost korišćenja fragmenata antitela umesto celih antitela u dijagnozi i terapiji se skriva u njihovoj smanjenoj veličini. Oni su manje imunogeni u odnosu na cela antitela i mogu da se lakše probiju kroz tkiva. Nedostatak povezan sa primenom takvih fragmenata je taj šta pomenuti sadrže samo jedno vezno mesto za antigen šta smanjuje aviditet. Osim toga, zbog njihove smanjene veličine, pomenuti brzo nestaju iz seruma, pa prema tome imaju kratak polu-život.
[0006|Od interesa je da se proizvedu bispecifična antitela (BsAbs) koja spajaju vezna mesta za antigen iz dva antitela u jedna molekul, zbog čega će biti sposobna da vežu dva različita antigena istovremeno. Osim primene u dijagnostici, takvi molekuli otvaraju put novim terapeutskim aplikacijama,na primer.uz pomoć usmeravana potentnih efektorskih sistema u željene delove (gde tumorske ćelije često razvijaju mehanizme kako bi suprimirali normalne imuno-odgovore koje potiču monoklonska antitela, poput antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) ili komplement -zavisne citotoksičnosti (CDC)). ili uz pomoć povećavanja neutralizujućih ili stimulacionih delovanja antitela. Ovaj potencijal je bio rano prepoznat što je omogućilo brojne pristupe za dobijanje takvih bispecifičnih antitela. Početni pokušaji da se spoje vezne specifičnosti dva cela antitela protiv različitih ciljanih antigena za
terapeutske ciljeve su koristili hemijski fuzionisane hetero-konjugovane molekule (Staerzet al,1985,Nature314(6012): 628-31).
[0007]Bispccifična antitela su originalno načinjena uz pomoć fuzionisanja dva hibridoma, od kojih je svaki spodoban za proizvede različiti imunoglobulin (Milsteinet al..1983.Nature305(5934):537-40), ali je složenost vrsta (do deset različitih vrsta) proizvedenih u čelijskoj kulturi otežavala i poskupljivala prečišćavanje (Georgeet al..1997.THE ANTIBODIES4:99-141 (Capraet al..ur.. Harvvood Academic Publishers)). Uz pomoć ovog formata. lgG2a iz miša i IgG2b iz pacova su proizvedeni zajedno u istoj ćeliji( na primer.kao četvorostruku fuziju dva hibridoma, ili u projektovanim CHO ćelijama). Zbog toga šta su laki lanci svakog antitela bili preferirano spojeni sa teškim lancima svojih srodnih vrsta, sklopile su se tri glave vrste antitela: oba parentalna antitela, i heterodimer oba pomenuta antitela koji je sadržavao jedan par teški/laki lanac iz svakog antitela koji su bili spojeni preko njihovih Fc delova. Željeni heterodimer može da se prečisti iz ove smeše zbog toga šta su njegove vezne karakteristike prema Belančevini A različite od onih iz parentalnih antitela: IgG2b iz pacova se ne veže za Belančevinu A, dok se mišji IgG2a veže. Kao posledica, heterodumer miš-pacov se veže za Belančevinu A. ali se oslobađa kod većeg pH u odnosu na IgG2a homodimer. koje čini selektivno prečišćavanje bispecifičnog heterodimera mogućim (Lindhoferet al.,1995, ./.Immunol.155(1): 219-25). Nastao bispecifičan heterodimer je potpuno ne-humani, pa prema tome je veoma imunogen, koje može da dovede do pojave štetnih nus-pojava{ na primer."HAMA" ili "HARA" reakcije), i/ili neutralizuje terapeutski efekat. Tako je preostala potreba za projektovanim bispecifičnim antitelima sa superiornim karakteristikama koja mogu da se lako proizvedu uz veliki prinos iz kulture ćelija sisara.
[0008JUnatoč obećavajućih rezultata, koji su dobiveni primenom hetero-konjugata ili bispecifičnih antitela proizvedenih iz ćelijskih fuzija kao šta je malopre opisano, nekoliko faktora ih čini nepraktičnima za masovnu terapeutsku primenu. Ti faktori uključuju: brz nestanak hetero-konjugatain vivo,potrebu za primenom intenzivnih laboratorijskih tehnika za proizvodnju oba tipa molekula, potrebu za opsežnim prečišćavanjem (odvajanjem) hetero-konjugata od homo-konjugata ili mono-specifičnih antitela, i generalno niski prinosi.
[0009]Genetičko inženjerstvo se ubrzano koristi za dizajn, mođifikovanje. i proizvodnju antitela ili derivata antitela sa željenim setom veznih karakteristika i efektorskih funkcija. Brojni rekombinantni postupci su razvijeni za efikasnu proizvodnju BsAbs u formi fragmenata antitela (Čarteret al, 1995. J. Hematother.4(5): 463-70: Pluckthunet al.1997.lmmunotechnology3(2): 83-105; Todorovskaet al.2001../.Immunol. Methods248(1-2): 47-66) i IgG formata cele dužine (Čarter, 2001../Immunol Methods248(1-2): 7-15).
|0010]Spajanje dva različita scFvs daje BsAb formate sa minimalnom molekularnom masom, koji su poznati kao sc-BsAbs ili Ta-scFvs (Macket al..1995.Proc. Nali. Acad. Sci. USA92(15): 7021-25: Mallenderet al, 1994../. Biol. Chem.269(1): 199-206). BsAbs je konstruiran uz pomoć genetičkog fuzionisanja dva scFvs do dimerizacijske tlinkcionalnosti poput leucinskog rajsferšlusa (Kostelnvet al.. 1992../. Immunol.148(5): 1547-53; deKruif et al..1996,./.Biol. Chem.271(13): 7630-34).
|0011|Diatela su mali bivalentni i bispecifični fragmenti antitela. Ovi fragmenti obuhvataju Vhkoji je spojen na V|. iz istog polipeptidnog lanca uz pomoć linkera koji je dovoljno kratak (kraći od 12 amino-kiselinskih ostataka) da dozvoljava sparivanje između dva domena na istom lancu. Ovi domeni su prisiljeni da se sparuju inter-moiekularno sa komplementarnim domenima iz drugog lanca stvarajući dva mesta za vezanje antigena. Ovi dimerni fragmenti antitela, ili "diatela". su bivalentni i bispecifični (Holligeret al.1993.Proc. Nali. Acad. Sci. USA90(14): 6444-48). Diatela su slična u veličini sa Fab fragmentom. Polipeptidni lanci Vh i Vi. domena spojenih sa linkerom između 3. i 12. amino-kiselinskog ostatka predominantno daju dimere (diatela), dok spajanje sa linkerom između 0. i 2. amino-kiselinskog ostatka predominantno daje trimere (triatela) i tetramere (tetratela). Osim dužine linkera. tačan obrazac oligomerizacije se čini da zavisi o sastavu kao i o orijentaciji varijabilnih domena (Hudsonet al.1999../.Immunol Methods231(1-2): 177-89). Predvidljivost finalne strukture molekula diatela je veoma slaba.
[0012}Mada konstrukti na bazi sc-BsAb i diatela pokazuju interesantan klinički potencijal, bilo je pokazano da su takvi ne-kovalentno spojeni molekuli dovoljno stabilni u fiziološkim uslovima. Ukupna stabilnost scFv fragmenta zavisi o urođenoj stabilnosti Vi i Vh domena kao i o stabilnosti domenskog interfejsa. Nedovoljna stabilnost Vn-Vi interfejsa iz scFv fragmenata je često sugerisana kao glavni razlog nepovratnog inaktivisanja scFv. jer prolazno otvaranje interfejsa, koje bi bilo omogućeno uz pomoć peptidnog linkera. izlaže hidrofobne delove koji favorizuju agregaciju pa prema tome dovode do nestabilnosti i slabog proizvodnog prinosa ( Wornet al.2001../.Mol. Biol.305(5): 989-1010).
[0013]Alternativni postupak za proizvodnju bispecitlčnih bivalentnih belančevina iz Vn i Vi domena koji vežu antigen je opisan u U.S. patentu br. 5.989.830. Takve dualne Fv konfiguracije sa dvostrukim glavama se dobijaju uz pomoć ekspirmiranja bicistronskog vektora, koji kodira dva polipeptidna lanca. U dualnoj-Fv konfiguraciji, varijabilni domeni iz dva različita antitela se eksprimiraju u tandemskoj orijentaciji na dva različita lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac sadrži dva Vn u serijama odvojenim sa peptidnim linkerom (Vm-linker-VH:). a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih Vi. domena spojenih u serijama uz pomoć peptidnog linkera (Vi i-linker-Vi.2). Kod konfiguracije ukrštene dvostruke glave, varijabilni domeni iz dva različita antitela se eksprimiraju u tandemskoj orijentaciji na dva različita polipeptidna lanca (jedan teški lanac ijedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac sadrži dva Vn u serijama odvojenima sa peptidnim linkerom (Vni-linker-Viu). a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih Vi. domena spojenih u serijama uz pomoć peptidnog linkera u suprotnoj orijentaciji (Vi,2-linker-Vu). Molekularno modeliranje ovih konstrukata sugeriše da veličina linkera treba da bude dovoljno duga da prekrije 30-40 A (15-20 amino-kiselinskih ostataka).
[0014]Povećavanje valencije nekog antitela je važno jer pojačava funkcionalni afinitet pomenutog antitela usled efekta aviditeta. Kompleksi sa polivalentnim belančevinama (PPC) sa povećanom valencijom su opisani u U.S. patentnoj prijavi br. US 2005/0003403 Al. PPC obuhvata dva polipeptidna lanca koja su generalno aranžirana lateralno (jedan u odnosu na drugog). Svaki polipeptidni lanac tipično sadrži tri do četiri "v-regiona". koji obuhvataju amino-kiselinske sekvence koje su sposobne da formiraju vezno mesto za antigen kada se spoje sa odgovarajućim v-regionom iz suprotnog polipeptidnog lanca. Na svakom polipeptidnom lancu može da se koristi do šest "v-regiona". V-regioni iz svakog polipeptidnog lanca su međusobno spojeni linearno i mogu da budu spojeni preko isprekidanih veznih regiona. Kada su aranžirani u formi PPC, v-regioni sa svakog polipeptidnog lanca formiraju pojedinačna vezna mesta za antigen. Kompleks može da sadrži jednu ili više veznih specifičnosti.
[0015]Jedna strategija je bila predložena od strane Čarteret al.(Ridgwayet al,1996,Protein Eng.9(7): 617-21: Čarter, 2011, ./.Immunol Methods248(1-2): 7-15} u svrhu proizvodnje Fc heterodimera primenom mutacija "čvor-u-rupi" u Ci 13 domenu iz Fc. Ove mutacije omogućavaju promenu rezidualne komplementarnosti pakovanja između interfejsa iz Ci 13 domena sa strukturno konzerviranim hidrofobnim središnjim regionom tako da je nastanak heterodimera favorizovan u odnosu na homodimere, koje omogućava dobru ekspresiju heterodimera u kulturi ćelija sisara. Mada ova strategija omogućava veći prinos heterodimera. pojava homodimera nije potpuno suprimirana (Merchantet al. 1998, Nat. Biotechnoi.16(7): 677-81.
[0016]Gunasekaranet al.su istraživali mogućnost zadržavanja integriteta hidrofobnog središnjeg regiona uz poticanje nastanka Fc heterodimera uz pomoć promene komplementarnosti naboja u interfejsu iz Ci 13 domena (Gunasekaranet al.,2010. ,/.Biol. Chem.285(25): 19637-46). Koristeći se sa elektrostatičkim upravljačkim mehanizmom, ovi konstrukti pokazuju efikasnu promociju nastanka Fc heterodimera uz minimalnu kontaminaciju sa homodimerima preko mutacije dva para periferno lociranih nabijenih ostataka. Suprotno od dizajna ..čvor-u-rupi". homodimeri su podjednako suprimirani zbog prirode mehanizma elektrostatičkog odbijanja, ali ne može ih se izbeči potpuno.
[0017|Davišet al.opisuju pristup projektovanog antitela sa ciljem konvertovanja Fc homodimera u heterodimere uz pomoć internog isprepletanja segmenata (3-plohe iz Cm domena iz humanog IgG i IgA. ali bez uvođenja inter-lančanih disulfiđnih veza (Davišet al..2010,Protein Eng. Des. Sel.23(4): 195-202). Ekspresija SEEDtelo (Sb) fuzionisanih belančevina u ćelijama sisara daje Sb heterodimere u visokom prinosu koji mogu lako da se prečiste kako bi se eliminisali retki nus-produkti.
[0018]U.S. patentna prijava br. US 2010/331527 Al opisuje bispecifično antitelo na bazi heterodimerizacije Cm domena uz pomoć uvođenja mutacija H95R i Y96F u Cm domenu u jednom teškom lancu. Ove amino-kiselinske supstitucije potiču iz Cm domena iz IgG3 pod-tipa i mogu da heterodimerizuju sa osovinom IgGl. Uobičajeni laki lanac, koji ima tendenciju da se sparuje sa svakim teškim lancem, je osnovni uslov za sve formate na bazi heterodimerizacije preko Cm domena. Prema tome. nastaje ukupno tri tipa antitela: 50% imaju čistu IgGl osovinu, jedna-trećina ima čistu H95R i Y96F imitiranu osovinu, a jedna-trećina ima dva različita teška lanca (bispecifično). Željeni heterodimer može da se prečisti iz ove smeše zbog toga šta su njegove vezne karakteristike prema Belančevini A različite od onih koje imaju parentalna antitela: IgG3-izvedeni Cm domeni se ne vežu na Belančevinu A. dok IgGl se vežu. Kao posledica. heterodimer se veže na Belančevinu A, ali može da se eluira na višem pH u odnosu na Čisti IgGl homodimer. koje selektivno prečišćavanje bispecifičnog heterodimera čini mogućim. [0019|U.S. patentni br. 7,612.181 opisuje Dvostruki-Vairjabilni-Domen IgG (DVD-IgG) koje je bispecifično antitelo na bazi Dvostrukog-Fv formata koji je opisan u U.S. patentu br. 5.989.830. Sličan bispecifičan format je takođe opisan u U.S. patentnoj prijavi br. US 2010/0226923 Al. Dodavanje konstantnih domena odgovarajućim lancima iz Dvostrukog-Fv (Cni-Fc na teški lanac, a kapa ili lambda konstantni domen na laki lanac) daje funkcionalna bispecifična antitela bez potrebe dodatnih modifikovanja(//',očitog dodavanja konstantnih domena kako bi se pojačala stabilnost). Neka od antitela koja su eksprimirana u DVD-Ig/TBTI formatu pokazuju pozicioni efekt na drugoj (ili unutrašnji-most) poziciji za vezanje antigena (Fv2). U zavisnosti o sekvenci i prirodi antigena kojeg prepoznaje Fv2 pozicija, ovaj domen pokazuje smanjeni afinitet prema svojim antigenom(//"..gubitakon- ratekonstante u odnosu na parentalno antitelo). Jedno moguće objašnjenje za ovaj nalaz je to da se linker između Vu i Vt.2 proteže u CDR region iz Fv2, koje čini Fv2 da nekako bude nedostupan za veće antigene.
[0020]Druga konfiguracija nekog fragmenta za bispecifično antitelo, koja je opisana u U.S. patentu br. 5.989,830, je ukrštena dvoglava (CODH). koja poseduje sledeće orijentacije varijabilnih domena eksprimiranih na dva lanca:
Vu-linker-Vi.2, za laki lanac, i
Viii-linker-Viu, za teški lanac.
Patent '830 opisuje da bispecifičan ukršteni dvoglavi fragment za antitelo (konstrukt GOSA.E) zadržava višu veznu aktivnost u odnosu na Dvostruki-Fv( vidistranicu 20. linije 20-50 iz patenta '830), i dodatno opisuje daje ovaj format manje pod uticajem linkera koji se koriste između varijabilnih domena( vidistranice 20-21 iz patenta '830). Dokumenti EP 2 050 764 i WO 2010/014659 opisuju formate bispecifičnog antitela.
SAŽETAK PRONALASKA
[0021]Okvir ovoga pronalaska je definisan sa pridodanim zahtevima.
[0022]Ovaj pronalazak obezbeđuje vezne belančevine slične antitelima koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom : a dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
V1..2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vi u je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
Vi 12 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca; Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca; Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca; Fc je imunoglobulinski region ručke, a O12, Ci 13 su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; Li, L2, Li, i L4su amino-kiselinski linkeri kao šta je definisano u pridodanim zahtevima; i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki ianac-teškilanac. |0023| Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje veznu belančevinu sličnu antitelu koja obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom: a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
V1.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
V112je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog tanca;
Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca;
Li. L.2, L3. i L4su amino-kiselinski linkeri kao šta je definisano u pridodanim
zahtevima;
i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0024| Takođe je opisan postupak za proizvodnju vezne belančevina slične antitelu koja obuhvata četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu
pomenuti postupak obuhvata identifikovanje varijabilnog domena iz prvog antitela koji veže prvi ciljani antigen i varijabilnog domena iz drugog antitela koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu oba sadrže Vi i Vn; pripisivanje lakom lancu ili teškom lancu funkciju lanca za kalup; pripisivanje Vi. iz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela funkciju Vi.i: pripisivanje funkcija Vi 2. Vm. i Vh2u skladu sa formulama fl] i [II] ispod:
određivanje maksimalnih i minimalnih dužina Li, L2, L;u i L4; generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II; izbor polipeptidnih struktura sa formulama I i II koji vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
V1.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
Vn2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Ci. jc konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca:
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca; Fc je imunoglobulinski region ručke, a C112, Cm su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a Li, L2.Li,i L4su amino-kiselinski linkeri; i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac. [0025J Takođe je opisan postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu, koja sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuti postupak obuhvata identifikovanje varijabilnog domena iz prvog antitela koji veže prvi ciljani antigen i varijabilnog domena iz drugog antitela koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu svaki sadrži Vi. i Vn; pripisivanje lakom lancu ili teškom lancu funkciju lanca za kalup; pripisivanje Vi. iz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela funkciju Vu; pripisivanje funkcija V1.2, Vm. i Vm u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:
određivanje maksimalnih i minimalnih dužina za Li, Li. L3. i L4: generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II; izbiranje polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vj,2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
Vh2 je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca;
Ci, je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca; a
Li. L2, L3. i L4su amino-kiselinski linkeri;
i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teškilanac.
[0026JSpecifične izvedbe ovoga pronalaska će postati vidljive iz sledećeg detaljnijeg opisa određenih izvedaba i iz zahteva.
KRATAK OPIS SLIKA
[0027J
Slika 1.Shematski prikaz domena Fvl i Fv2 koji vežu antigen kod konfiguracije dvostrukog V regiona i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera Li. i L11 u TBTI formatu.
Slika2. Shematski dijagram (2D) domena Fvl (anti-IL4) i Fv2 (anti-IL13). koji vežu antigen u ukrštenoj dvostrukoj varijabilnoj (CODV) konfiguraciji, i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera.
Slika3. Shematski prikaz Fv anti-lL4 i Fab anti-IL 13 koji pokazuje jedan mogući prostorni aranžman dobiven uz pomoć pristajanjabeJančevina- behinčevinuFv iz anti-IL4 i Fv iz anti-IL13.
Slika 4.Procena tetravalentne i bispecifične vezne sposobnosti CODV belančevine u ogledu BIACORE uz pomoć uzastopnog ili simultanog injektiranja dva antigena u čipa koji je prekriven sa DVD-Ig belančevinom. Maksimalni primećeni signal uz pomoć uzastopnog injektiranja može da se dobije uz pomoć ko-injekcije oba antigena, pokazujući zasićenje svih veznih mesta.
Slika5. Shematski dijagram (2D) domena koji vežu antigen u CODV konfiguraciji i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera Li. (Li i 1:) i Ln ( L\ i L-i). U panelu A. laki lanac je raspoređen u "linearnom ili kalup" ravnanju, dok je teški lanac raspoređen u "unakrsnoj" konfiguraciji. U panelu B, teški lanac je raspoređen u "linearnom ili kalup" ravnanju, a laki lanac je raspoređen u "unakrsnoj" konfiguraciji.Slika 6.Shematski prikaz CODV-Ig dizajna na bazi toga da li se laki lanac ili teški lanac koristi kao "kalup".
Slika 7. Uporedba TBTI/DVD-lg ili CODV-Ig molekula koje nose anti-IL4 i anti-IL13 sekvence.
Slika 8.Uporedba CODV-Fab i B-Fab formata u citotoksičnom ogledu sa NALM-6 ćelijama.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0028]Ovaj pronalazak obezbeđuje vezne belančevine slične antitelu, kao šta je definisano u pridodanim zahtevima. koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri Čemu svaki par polipeptida koji formira veznu belančevinu sličnu antitelu poseduje dvostruke varijabilne domene u unakrsnoj orijentaciji. Takođe su opisani i postupci za proizvodnju takvih veznih belančevina sličnih antigenu.
[0029]Kompjutersko modeliranje predviđa da će unakrsni dvoglavi (CODFI) dizajn iz U.S. patenta br. 5.989.830 dati kompleks u kojem su oba vezna mesta okrenuta u suprotnim smerovima. ali bez ograničenja koje sugeriše Dvostruka-Fv konfiguracija iz U.S. patenta br. 7.612.181. Specifično, kompjutersko modeliranje pokazuje da dužina amino-kiselinskih linkera između varijabilnih domena nije kritična za GODI I dizajn, ali je važna za omogućavanje punog pristupa prema oba vezna mesta za antigen u Dvostrukom-Fv dizajnu. Kao i kod DVD-Ig/TBTI formata, konstrukti vezne belančevine slične antitelu su pripremljeni tako da su konstantni domeni spojeni sa CODH konfiguracijom kako bi formirali vezne belančevine slične antitelu koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu svaki par polipeptida koji formira veznu belančevinu sličnu antitelu poseduje dvostruke varijabilne domene u unakrsnoj orijentaciji(//.,CODH-Ig). CODH-Ig molekuli se očekuje da poseduju značajno poboljšanu stabilnost u odnosu na CODH molekule (jer DVD-Ig/TBTI poseduju poboljšanu stabilnost u odnosu na Dvostruke-Fv molekule).
[0030]Sa ciljem da se testira malopre pomenuta hipoteza. CODH-Ig molekul je pripremljen uz pomoć anti-IL4 i anti-IL13 sekvenca iz antitela opisanih u U.S. patentnoj prijavi br. US 2010/0226923 Al. CODH-Ig molekul se razlikovao od CODH molekula iz dokumenta US 2010/0226923 u veličini amino-kiselinskih linkera koji odvajaju varijabilne domene na odgovarajućim polipeptidnim lancima. CODH-Ig molekuli su eksprimirani u ćelijama nakon prolazne transfekcije. a tada su prečišćeni uz pomoć hromatografije na Belančevini A. Mada su njihovi profili, na osnovu hromatografske veličine (SEC). pokazivali nivoe agregacije od 5-10%, niti jedan od CODH-Ig molekula nije bio funkcionalan, pa tako niti jedan CODH-Ig molekul nije bio sposoban da se veže na svoje ciljne antigene. Nedostatak vezne aktivnosti možda je bio posledica izmenjene dimerizacije Fv-regiona teških i lakih lanaca zbog neprikladnih dužina linkera koje je kompromitovalo pravilno formiranje paratopa. Kao rezultat je razvijen protokol sa ciljem da se identifikuju prikladni amino-kiselinski linkeri za inserciju između dva varijabilni domena i između drugog varijabilnog domena i konstantnog domena na teškom i lakom polipeptidnom lancu iz vezne belančevine slične antitelu. Ovaj protokol se bazira na pristajanjubelančevina- belančevinai uzima u obzir eksperimentalne modele FvIL4 i FvIL13 regiona, kao i uključivanje Fcl domena u model, i konstrukciju prikladnih linkera između FvIL4 i FvIL13 regiona i između Fv i konstantnog Fcl regiona.
[00311Standardna metodologija rekombinantne DNA je korišćena kako bi se konstruirali polinukleotidi koji kodiraju polipeptide koji formiraju vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska, ugradili pomenuti polinukleotidi u rekombinantne ekspresione vektore, i pomenuti vektori uveli u ćelije domaćine. Vidina primerSambrooket al..2001.MOLECULAR CLONING: A LABORATORV MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 3. izd.). Encimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se provedu u skladu sa instrukcijama proizvođača, kao šta je uobičajeno poznato stanju tehnike, ili na način kako je ovde opisano. Osim ako su navedene specifične definicije, korišćena nomenklatura, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hernija, hernija za organsku sintezu, i medicinska i farmaceutska hernija, koji su ovde opisani, su dobro poznati stručnjacima iz ove tehničke oblasti. Slično, konvencionalne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, dostavu, i za tretman pacijenata.
1.Opšte definicije
[0032]Korišćeni u skladu sa ovim opisom, sledeći termini, osim ako je drugačije navedeno, treba da se razumeju kao da imaju sledeća značenja. Osima ako kontekst zahteva drugačije, termini u jednini uključuju i množinu, a termini u množini uključuju i jedninu.
[0033]Termin "polinukleotid", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedno-lančane ili dvo-lančane polimere nukleinske kiseline od najmanje 10 nukleotida u dužini. U nekim izvedbama, nukleotidi koji čine polinukleotid mogu da budu ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovana forma bilo kojeg tipa nukleotida. Takve modifikacije uključuju modifikacije poput bromuridina. modifikacije riboze poput arabinozida i 2'.3'-dideoksiriboze, i modifikacije internukleotidnih veza (spajanja) poput fosforotioata. fosforoditioata. fosforoselenoata, fosforodiselenoata, fosforoanilotioata. fosforan i ladata i fosforoamidata. Termin "polinukleotid" specifično uključuje jedno-lančane i dvo-lančane forme DNA.
|0034|"Izolovani polinukleotid" je polinukleotid genomskog porekla. cDNA, ili sintetski ili neka njihova kombinacija, koji je izolovani polinukleotid upravo zbog svojeg porekla: (1) nije spojen sa, potpuno ili delomično, polinukleotidom u kojem se pomenuti izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, (2) je spojen na polinukleotid na koji nije spojen u prirodi, ili (3) se ne pojavljuje u prirodi kao deo neke veće sekvence.
|0035|"Izolovani polipeptid" je takav polipeptid koji: (1) je očišćen od barem nekih drugih polipeptida koji ga uobičajeno pridružuju u prirodi, (2) je značajno očišćen od drugih polipeptida iz istog izvora,na primer.iste vrste. (3) se eksprimira u ćeliji iz druge vrste. (4) je očišćen od najmanje oko 50% polinukleotida. lipida. ugljohidrata, ili drugih materijala koji ga pridružuju u prirodi, (5) nije povezan (kovalentnom ili ne-kovalentnom interakcijom) sa delovima nekog polipeptida koji pomenutog "izolovanog polipeptida" pridružuje u prirodi, (6) je operativno povezan (kovalentnom ili ne-kovalentnom interakcijom) sa nekim polipeptidom koji ga pridružuje u prirodi, ili (7) se ne pojavljuje u prirodi. Takav izolovani polipeptid može da bude kodiran sa genomskom DNA. cDNA, mRNA ili drugom RNA. ili može da bude sintetskog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija. Preferirano, izolovani polipeptid je značajno očišćen od polipeptida ili drugih kontaminanata koji ga pridružuju u njegovoj prirodnoj sredini, a koji bi uticali na njegovu primenu (terapeutsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili neku drugu).
[0036]Termin "humano antitelo". kao šta se ovde koristi, uključuje antitela koja sadrže varijabilni i konstantni region koji se značajno podudara sa humanim imunoglobulinskim sekvencama iz germinativne linije. U nekim izvedbama, humana antitela se proizvode u ne-humanim sisarima, uključujući, ali bez ograničenja, glodare, poput miševa i pacova. i dvojezupce, poput zečeva. U drugim izvedbama, humana antitela se proizvode u hibridom ćelijama. U drugim izvedbama, humana antitela se proizvode rekombinantno.
|0037[Prirodna antitela tipično su tetramer. Svaki takav tetramer se tipično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par sadrži jedan "laki" lanac pune dužine (tipično sa molekularnom masom od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac pune dužine (tipično sa molekularnom masom od oko 50-70 kDa). Termini "teški lanac" i "laki lanac", kao šta se ovde koriste, se odnose na bilo koji imunoglobulinski polipeptid koji sadrži dovoljno specifičan varijabilni domen koji bi bio sposoban da prepozna ciljani antigen. Amino-terminalni deo svakog lakog i teškog lanca tipično uključuje varijabilni domen od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina koje su tipično odgovorne ua prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantni domen koji je odgovoran za efektorsku funkciju. Tako, kod prirodnih antitela, teški lanac imunoglobulinskog polipeptida pune dužine uključuje varijabilni domen (Vn) i tri konstantna domena (Cm. C112. i Cio), pri čemu se Vh domen nalazi na amino-terminusu pomenutog polipeptida. a Cm domen na karboksil-terminusu. dok laki lanac imunoglobulinskog polipeptida pune dužine uključuje varijabilni domen (Vl) i konstantni domen (Cl), pri čemu se Vi. domen nalazi na amino-terminusu pomenutog polipeptida, a Ci. domen na karboksil-terminusu.
[0038|Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci, a humani teški lanci su tipično klasifikovani kao mu, delta. gama. alfa. ili epsilon, pri čemu pomenuti definišu izotipove antitela kao IgM. IgD, IgG. IgA. i IgE. IgG obuhvata nekoliko podklasa. uključujući, ali bez ograničenja, IgGl, IgG2. IgG3. i SgG4. IgM obuhvata podklase koje uključuju, ali bez ograničenja, IgMl i IgM2. IgA je slično podeljen u podklase koje uključuju, ali bez ograničenja. IgAl i IgA2. U lakim i teškim lancima pune duljine, varijabilni i konstantni domeni tipično su spojeni uz pomoć "J" regiona od oko 12 ili više amino-kiselina, pro čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više amino-kiselina. Vidi,na primer,FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W.. ur., Raven Press. 2. izd., 1989). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično formira mesto za vezanje
antigena. Varijabilni domeni prirodnih antitela tipično imaju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) spojenih preko tri hipervarijabilna regiona. takođe poznati kao regioni koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR iz oba lanca svakog para tipično su poravnani uz pomoć okvirnih regiona. koje omogućava vezanje na neki specifični epitop. Od amino-terminusa do karboksil-terminusa. varijabilni domeni iz lakog i teškog lanca tipično obuhvataju domene FR1. CDR1. FR2. CDR2. FR3. CDR3. i FR4.
[0039]Termin "nativni Fc", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul koji obuhvata sekvencu fragmenta koji ne veže antigen koji je produkt digestije nekog antitela ili je proizveden na neki drugi način, bez razlike da li je u monomernoj ili multimernoj formi, i može da sadrži region ručke. Originalni imunoglobulin nativnog Fc preferirano ima humano poreklo i može da bude bilo koji imunoglobulin, mada su IgG 1 i IgG2 preferirani. Nativni Fc molekuli su načinjeni od monomernih polipeptida koji mogu da se po vežu u dimeme ili multimerne forme preko kovalentne (//.. disulfidni mostovi) i ne-kovalentne veze. Broj intennolekularnih disulfidnih veza između monomernih pođjedinica nativnih Fc molekula se kreće u rasponu od 1 do 4 u zavisnosti o klasi( na primer,IgG. IgA, i IgE) ili podklasi( na primer,IgGl, IgG2, IgG3. IgAl. i IgGA2). Jedan primer za nativni Fc je disulfidno-povezan dimer koji je produkt cepanja IgG sa papainom. Termin "nativni Fc". kao Šta se ovde koristi, je generički naziv za monomernu. dimernu, i multimernu formu.
[0040| Termin "Fc varijanta", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki moiekul ili sekvencu koja je modifikovani nativni Fc, koji još uvek poseduje vezno mesto za .va/v(/#t'-receptor, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primeri za Fc varijante i njihovu interakciju sasalvage-receptorom su poznati stanju tehnike. Tako. termin "Fc varijanta" može da obuhvata molekul ili sekvencu koja je humanizovani ne-humani nativni Fc. Nadalje, nativni Fc obuhvata regione koji mogu da se odstrane zbog toga šta obezbeduju strukturalne karakteristike ili biološku aktivnost koji nisu potrebni veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska. Tako, termin "Fc varijanta" obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedan ili više nativnih Fc mesta ili ostataka, ili u kojoj su jedno ili više Fc mesta ili ostataka modifikovani, pri čemu pomenuta obuhvata ili je uključena u: (1) nastanku disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćina, (3) N-terminalnu heterogenost nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćina. (4) glikozilaciju. (5) interakciju sa kompiementom. (6) vezanju na Fc receptor koji nije .vrz/vat^-receptor. ili (7) antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC).
[00411Termin "Fc domen". kao šta se ovde koristi, obuhvata nativne Fc i Fc varijante i sekvence kao šta je definisano iznad. Kao i sa Fc varijantama i nativni Fc molekuli, termin "Fc domen" uključuje molekule u monomernoj ili multimernoj formi, bez razlike da li su dizajnirani iz celog antitela ili proizvedeni na drugi način.
[0042) Termin "vezna belančevina slična antitelu", kao šta se ovde koristi, se odnosi na ne-prirodni (li rekombinantni) molekul koji specifično veže najmanje jedan ciljani antigen, a koji obuhvata četiri polipeptidna lanca koji formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuta dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:
i dva polipeptidna lanca koji imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
V|.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
Vn2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Cl je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca; Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca; Fc je imunoglobulinski region drške, a Cm. Cm su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; Li. L.2, Lj, i L-i su amino-kiselinski linkeri; i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac - teški lanac. Termin "vezna belančevina slična antitelu". kao šta se ovde koristi, takođe se odnosi na ne-prirodni (ili rekombinantni) molekul koji specifično veže najmanje jedan ciljani antigen, i koji obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom: a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
V|.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca: Vhi je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
Vii2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;
Ci je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca:
Li. I,?. L.>, i L-i su amino-kiselinski linkeri:
i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac. "Rekombinantni" molekul je takav molekul koji je bio konstruiran, eksprimiran. kreiran, ili izolovan uz pomoć rekombinantne tehnologije.
[0043| Jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje vezne belančevine slične antitelu. kao šta je definisano u pridodanim zahtevima, koje imaju biološku i imunološku specifičnost za između jednog i četiri ciljana antigena. Druga izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju vezne belančevine slične antitelu. Druga izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje ekspresione vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu. Još jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje ćelije domaćine koje eksprimiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu (//.. koje sadrže molekule nukleinske kiseline ili vektore koji kodiraju polipeptidne lance koji formiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu).
[0044) Termin "razmenljivost", kao šta se ovde koristi, se odnosi na međusobnu razmenljivost varijabilnih domena u CODV formatu uz zadržavanje sklapanja i krajnjeg veznog afiniteta. "Puna razmenljivost" se odnosi na sposobnost da se zameni redosled Vm i Vn2domena, pa prema tome i redosled Vi.ii V1.2domena u CODV-Ig(7/..da se ostvari obrnuti redosled) ili CODV-Fab uz zadržavanje pune funkcionalnosti veznih belančevina sličnih antitelu kao šta može da se potvrdi uz pomoć zadržavanja veznog afiniteta. Nadalje, treba da se primeti da oznake Vhi Vi u određenim CODV-Ig ili CODV-Fab se odnose samo na lokaciju pojedinog domena u pojedinom proteinskom lancu u finalnom formatu. Na primer, Vm i Vm mogu da se izvedu iz Vi 1 i V12domena iz parentnog antitela i da se premeste na Vm i Vm pozicije vezne belančevine slične antitelu. Na isti načine. Vi 1 i V1.2mogu da se izvedu iz Vm i Vm domena iz parentnog antitela i da se premeste na Vm i Vm pozicije u veznoj belančevini sličnoj antitelu. Tako. oznake Vn i Vi. se odnose na sadašnju
lokaciju, a ne na originalnu lokaciju u parentnom antitelu. Vn i Vi, domeni su, prema tome, "razmenljivi".
[0045)"Izolovana" vezna belančevina slična antitelu je takva belančevina koja je bila identifikovana i odvojena i/ili obnovljena iz neke komponente iz njene prirodne sredine. Kontaminirajuće komponente iz njene prirodne sredine su materijali koji će interferirati sa dijagnostičkom ili terapeutskom primenom vezne belančevine slične antitelu, a mogu da uključuju encime. hormone, i druge proteinske i ne-proteinske rastvorene materije. U preferiranim izvedbama, pomenuta vezna belančevina slična antitelu će biti prečišćena: (1) do čistoće koja je veća od 95 težinskih procenata antitela utvrđeno uz pomoć Lowry-evog postupka, a najbolje veća od 99 težinskih procenata. (2) do stepena čistoće koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne amino-kiselinske sekvence primenomspinning cupsekvenatora, ili (3) do homogenosti koja se dobija uz pomoć SDS-PAGE u reducirajućim i ne-reducirajućim uslovima uz pomoć bojanja sa Coomassie-plavim ili. preferirano, srebrom. Izolovane vezne belančevine slične antitelu uključuju veznu belančevinu sličnu antiteluin situunutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta iz prirodne sredine pomenute vezne belančevine slične antitelu neće biti prisutna.
[00461 Termini "bitno Čist" ili "bitno prečišćen", kao šta se ovde koriste, se odnose na jedinjenje ili vrste čija prisutnost dominira(//..na molarnoj bazi je više zastupljena u odnosu na bilo koju drugu pojedinačnu vrstu u kompoziciji). U nekim izvedbama, bitno prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj je pomenuta vrsta zastupljena najmanje oko 50% (na molarnoj bazi) u odnosu na sve ostale prisutne makromolekularne vrste. U drugim izvedbama, bitno čista kompozicija sadrži vrstu koja je više od 80%, 85%. 90%, 95%. ili 99% zastupljenija u odnosu na ostale makromolarne vrste prisutne u kompoziciji. U još drugim izvedbama, pomenuta vrsta je prečišćena do esencijalne homogenosti (kontaminirajuće vrste ne mogu da se detektuju u kompoziciji uz pomoć konvencionalnih postupaka za detekciju) pri čemu se pomenuta kompozicija sastoji uglavnom od pojedinačnih makromolekularnih vrsta.
[0047]Termin "antigen" ili "ciljni antigen", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul ili deo nekog molekula koji može da bude vezan od strane neke vezne belančevine slične antitelu, a dodatno može da se koristi u nekoj životinji sa ciljem da se proizvedu antitela koja su sposobna da se vežu na neki epitop iz pomenutog antigena. Ciljani antigen može da poseduje jedan ili više epitopa. U odnosu na svaki ciljani antigen koji može da bude prepoznat od strane neke vezne belančevine slične antitelu. pomenuta vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se takmiči sa nekim intaktnim antitelom koje prepoznaje pomenuti ciljani antigen. "Bivalentna" vezna belančevina slična antitelu. koja nije "multispeeifična" ili "multifunkcionalna" vezna belančevina slična antitelu. se pođrazumeva da obuhvata mesta za vezanje antigena koja imaju identičnu antigenu specifičnost.
[0048| Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično je veštačko hibridno antitelo koje sadrži dva različita para teški lanac/laki lanac i dva različita vezna mesta ili epitopa. Bispecifično antitelo može da se proizvede uz pomoć brojnih postupaka uključujući, ali bez ograničenja, fuziju hibridoma ili spajanje F(ab') fragmenata.
[0049] F(ab) fragment tipično uključuje jedan laki lanac i Vn i Cm domene iz jednog teškog lanca, pri čemu Vn-Cm deo iz teškog lanca iz Ffab) fragmenta ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim polipeptidom teškog lanca. Kao šta se ovde koristi. F(ab) fragment takođe može da uključuje jedan laki lanac koji sadrži dva varijabilna domena koji su odvojeni sa amino-kiselinskim linkerom i jedan teški lanac koji sadrži dva varijabilna domena koji su odvojeni sa amino-kiselinskim linkerom i Cm domenom.
[0050| F(ab') fragment tipično uključuje jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži veći deo konstantnog regiona (između Cm i Ci 12 domena), na takav način da može da se formira inter-lančana disulfidna veza između oba teška lanca kako bi nastao F(ab')2molekul.
(00511 Fraze "biološko svojstvo", "biološka karakteristika", i termin "aktivnost" u odnosu na veznu belančevinu sličnu antitelu iz ovoga pronalaska se koriste kao sinonimi i uključuju, ali bez ograničenja, afinitet i specifičnost prema epitopu. sposobnost da se antagonizuje aktivnost ciljanog antigena (ili ciljanog polipeptida),in rivostabilnost vezne belančevine slične antitelu, i imunogene karakteristike pomenute vezne belančevine slične antitelu. Druga biološka svojstva i karakteristike, koje mogu da se identifikuju. a koje opisuju pomenutu veznu belančevinu sličnu antitelu uključuju, na primer. unakrsnu-reaktivnost.(//".,uopšteno sa ne-humanim homolozima ciljanog antigena, ili sa drugim ciljanim antigenima ili tkivima), i sposobnost da se sačuvaju visoki nivoi ekspresije belančevina u ćelijama sisara. Malopre pomenuta svojstva i karakteristike mogu da se primete ili izmere uz pomoć tehnika koje su poznate stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja. ELISA, kompetitivna ELISA, analiza
površinske rezonance plazmona.in vitroi\ n vivoogieđi neutraiizovanja. i imunohistohemiju tkivnih preseka iz različitih izvora uključujući čoveka. primate, ili bilo koji drugi izvor prema potrebi.
[0052|Termin "imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki polipeptidni fragment koji sadrži najmanje CDR iz imunoglobulinskih teških ili lakih lanaca iz koji je izveden pomenuti polipeptidni fragment. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment je sposoban da veže ciljani antigen.
[0053]"Neutralizovanje" vezne belančevine slične antitelu. kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul koji je sposoban da blokira ili značajno smanji efektorsku funkciju ciljanog antigena na kojeg se veže. Kao šta se ovde koristi, "značajno smanjuje" označava najmanje oko 60%. preferirano najmanje oko 70%. još bolje najmanje oko 75%. još bolje najmanje oko 80%, još bolje najmanje oko 85%, a najbolje oko 90% smanjivanje efektorske funkcije ciljanog antigena.
[0054]Termin "epitop" uključuje bilo koji determinant, preferirano polipeptidni determinant. sposoban da specifično veže imunoglobulin ili receptor iz T-ćelije. U nekim izvedbama, epitop-determinanti uključuju hemijski aktivno površinsko grupiranje molekula poput amino-kiselina, lanaca bočnih šećera, fosforilne grupe, ili sulfonilne grupe, i, u nekim izvedbama, mogu da imaju specifične tri-dimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naboja. Epitop je region nekog antigena koji je vezan od strane nekog antitela ili vezne belančevine slične antitelu. U nekim izvedbama, vezna belančevina slična antitelu se specifično veže na neki antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši belančevina i/ili makromolekula. U preferiranim izvedbama, neka vezna belančevina slična antitelu se specifično veže na neki antigen kada ravnotežna konstanta disocijacije iznosi < 10"K M, bolje kada ravnotežna konstantna disocijacije iznosi < 10"<9>M. a najbolje kada konstantna disocijacije iznosi < 10 10M.
[0055]Pomenuta konstantna disocijacije (Ko) neke vezne belančevine slične antitelu može da se odredi, na primer, uz pomoć površinske rezonance plazmona. Uopšteno, analiza površinske rezonancije plazmona prati (tneri) vezne interakcije između liganda (ciljani antigen na biosenzorskoj matrici) i analita (vezna belančevina slična antitelu u rastvoru) u realnom vremenu uz pomoć površinske rezonancije plazmona (SPR) primenom sistemaBlAcore(Pharmacia Biosenson Piscatavvav, NJ). Površinska analiza plazmona takođe može da se provede uz pomoć imobiliziranja analita (vezna belančevina slična antitelu na biosenzorskoj matrici) i prezentacije (izlaganja) Uganda (ciljani antigen). Termin "Ko", kao šta se ovde koristi, se odnosi na disocijacijsku konstantnu interakcije između određene vezne belančevine slične antitelu i ciljnog antigena.
J0056j Termin "specifično veže", kao šta se ovde koristi, se odnosi na sposobnost neke belančevine slične antitelu ili nekog fragmenta koji veže antigen da veže antigen koji sadrži epitop sa Kd od najmanje oko 1 x 10"h M, 1 x IO"<7>M, 1 x IO"<8>M. I x IO'<9>VI, 1 x 10"'" M, 1 x 10"" M, 1 x IO"<12>M, ili više, i/ili da veže epitop sa afinitetom koji je najmanje dva-puta veći od njegovog afiniteta za neki ne-specifični antigen.
(0057| Termin "linker", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više amino-kiselinskih ostataka ugrađenih između imunoglobulinskih domena kako bi omogućili dovoljnu mobilnost domena lakih i teških lanaca sa ciljem da se unakrsno zamotaju oko imunoglobulina sa dvojnim varijabilnim regionom. Linker je ugrađen na prelazu između varijabilnih domena ili između varijabilnog i konstantnog domena, na nivou sekvence. Prelaz između domena može da se identifikuje zbog toga šta je približna veličina imunoglobulinskih domena dobro poznata. Precizna lokacija prelaza domena može da se odredi uz pomoć lociranja peptidnih isečaka koji ne formiraju sekundarne strukturne elemente poput beta-ploha ili alfa-heliksa kao šta je pokazano uz pomoć eksperimentalnih podataka ili kao šta može da se predvidi uz pomoć tehnika modeliranja ili predviđanja sekundarnih struktura. Ovde opisani linkeri se označavaju kao Li. koji je lociran na lakom lancu između N-tenninalnih Vu i V1.2domena; L2, koji se takođe nalazi na lakom lancu je lociran između V1.2 i C-terminalnih Ci. domena. Linkeri iz teškog lanca su poznati kao Li. koji je lociran između N-terminalnih Vm i Vm domena; i L4, koji je lociran između Vm i Cm-Fc domena. Linkeri Li, L2, L.i, i L4su nezavisni, ali u nekim slučajevima mogu da imaju istu sekvencu i/ili dužinu.
|0058J Termin "vektor", kao šta se ovde koristi, se odnosi na bilo koji molekul{ na primer.nukleinska kiselina, plazmid, ili virus) koji se koristi da se prenese kodirana informacija u ćeliju domaćin. Termin "vektor" uključuje neki molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu na koju je spojen. Jedan tip vektora je "plazmid". koji se odnosi na cirkularni dvo-lančani DNA molekul u kojeg su ugrađeni dodatni DNA segmenti. Drugi tip vektora je neki viralni vektor, pri čemu dodatni DNA segmenti mogu da
budu ugrađeni u viralni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni( na primer,bakterijski vektori koji imaju bakterijski početak replikacije i episomalni vektori za ćelije sisara). Drugi vektori( na primer,ne-episomalni vektori za ćelije sisara) mogu da se ugrade u genom ćelije domaćina nakon ulaska u nju. pa se prema tome repliciraju zajedno sa genomoin domaćina. Osim toga, određeni vektori su sposobni da diriguju ekspresiju gena na koje su operativno spojeni. Takvi vektori se ovde nazivaju "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Uopšteno, ekspresioni vektori koji se primenjuju u tehnikama rekombinantne DNA su često u formi plazmida. Termini "plazmid" i "vektor" ovde mogu da se koriste kao sinonimi, jer je plazmid najčešća korišćena forma vektora. Međutim, ovaj pronalazak ima za cilj da obuhvati i druge forme ekspresionih vektora, poput viralnih vektora( na primer.retorvirusi koji se ne repliciraju, adenovirusi, i adeno-slični virusi), koji služe predviđenoj nameni podjednako dobro.
[0059] Termin "operativno spojen" ovde se koristi sa ciljem da se opiše aranžman susednih (bočnih) sekvenca pri čemu su pomenute bočne sekvence konfigurisane ili sklopljene tako da mogu da obavijaju svoje uobičajene funkcije. Tako. bočna sekvenca koja je operativno spojena na kodirajući! sekvencu može da bude sposobna da potakne replikaciju. transkripciju, i/ili translaciju kodirajuće sekvence. Na primer. neka kodirajuća sekvenca je operativno spojena na neki promotor kada je pomenuti promotor sposoban da potakne transkripciju pomenute kodirajuće sekvence. Bočna sekvenca ne mora đa bude susedna kođirajućoj sekvenci sve dok ispravno funkcionira. Tako, na primer, interventne ne-translatirane sekvence koje se transkribiraju mogu da budu prisutne između sekvence promotora i kodirajuće sekvence, pri Čemu se sekvenca promotora još uvek smatra "operativno spojenom" na pomenutu kodirajuću sekvencu.
[0060] Fraza "rekombinantna ćelija domaćin" (ili "ćelija domaćin"), kao šta se ovde koristi, se odnosi na neku ćeliju u koju je uveden neki rekombinantni ekspresioni vektor. Predviđeno je đa rekombinantna ćelija domaćin ili ćelija domaćin obuhvata ne samo određenu ćeliju subjekt, već takođe i potomke takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu pojaviti u budućim generacijama usled mutacija ili okolišnih uticaja, takvi potomci ne moraju, u stvari, da budu identični sa parentnom ćelijom, ali su takve ćelije još uvek obuhvaćene okvirima termina "ćelija domaćin", na način kao šta se ovde koristi. Brojni ekspresioni sistemi u ćeliji domaćinu mogu da se koriste sa ciljem da se eksprimiraju vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska, uključujući bakterijske, kvašćeve, bakuloviralne, i sisteme za ekspresiju u ćelijama sisara (kao i ekspresioni sistemi za izlaganje faga). Jedan primer za prikladan bakterijski ekspresioni vektor je pUC19. Sa ciljem da se neka vezna belančevina slična antitelu eksprimira rekombinantne. ćelija domaćin se transformira ili transfektira sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose DNA fragmente koji kodiraju polipeptidne lance pomenute vezne belančevine slične antitelu na način da se pomenuti polipeptidni lanci eksprimiraju u ćeliji domaćina, a, preferirano, da se izlučuju u medijumu u kojem se ćelije domaćini uzgajaju, iz kojeg medijuma pomenuta vezna belančevina slična antitelu može da se obnovi.
[0061 ]Termin "transformacija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na promenu ćelijskih genetičkih karakteristika, a ćelija je transformirana kada je moditlkovana tako da sadrži novu DNA. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetički modi Okovana tako da je promenjeno njeno prirodno stanje. Nakon transformacije, transformirajuća DNA može da rekombinira sa genomom ćelije tako da se fizički ugradi u hromosom pomenute ćelije, ili može da se privremeno održava u formi episomalnog elementa bez da se replicira, iii može da se replicira nezavisno kao plazmid. Ćelija se smatra stabilno transformiranom kada se DNA replicira zajedno sa deobom ćelije. Termin "transfekcija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na unos strane ili egozogene DNA u neku ćeliju, pri čemu je ćelija "transfektovana" kada se egzogena DNA uvede u ćeliju. Stanju tehnike su poznate brojne tehnike transfekcije. Takve tehnike mogu da se koriste da se uvede jedan ili više egzogenih DNA molekula u neku prikladnu ćeliju domaćin.
[0062]Termin "pojavljuje se prirodno" kada se koristi i primenjuje na neki predmet se odnosi na činjenicu da se pomenuti predmet može naći u prirodi i da nije manipulisan od strane čoveka. Na primer. neki polinukleotid ili polipeptid koji je prisutan u nekom organizmu (uključujući i viruse), koji može da se izoluje iz nekog prirodnog izvora i koji nije bio ciljano modifikovan od strane čoveka je prirodan. Slično, "ne-prirodno". kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki predmet koji ne može da se pronađe u prirodi ili koji je strukturno modifikovan ili sintetizovan od strane čoveka.
|00631^ao šta se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih kiselina i njihove skraćenice se primenjuju na uobičajeni način. Stereoizomeri( na primer.D-amino-kiseline) dvadeset konvencionalnih amino-kiselina; neprirodnih amino-kiselina poput u-, a-disupstituisanih
amino-kiselina, N-alkil amino-kiselina, mlečna kiselina, i druge ne-konvencionalne amino-kiseline mogu takođe da budu prikladne komponente za polipeptidne lance veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska. Primeri za ne-konvencionalne amino-kiseline uključuju: 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, e-N.N.N-trimetillizin. e-N-acetillizin, O-fosfoserin. N-acetilserin, N-formilmetionin. 3-metilhistidin. 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin, i druge slične amino-kiseline i imino-kiseline{ na primer.4-hidroksiprolin). Šta se tiče polipeptidne notacije koja se ovde koristi, levi smer je ainino-tenninalni smer. a desni smer je karboksil-terminalni smer, u skladu sa standardima i konvencijama.
[0064]Prirodni ostaci mogu da se podele u klase na bazi karakteristika običnog bočnog lanca:
(1) hidrofobno: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr. Pro:
(2) polarno hidrofilno: Arg, Asn, Asp, Gln. Glu. His. Lys, Ser, Thr ; (3) alifatsko: Ala, Gly, Ile, Leu, Val. Pro;
(4) alifatsko hidrofobno: Ala, Ile, Leu, Val, Pro:
(5) neutralno hidrofilno: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (6) kiselo: Asp. Glu; (7) bazno: His, Lys, Arg; (8) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(9) aromatsko: His, Tip, Tvr, Phe; i
(10) aromatsko hidrofobno: Phe, Trp. Tyr.
]0065]Konzervativne amino-kiselinske supstitucije mogu da uključuju izmenu nekog člana iz jedne klase sa drugim članom iz iste klase. Konzervativne amino-kiselinske supstitucije mogu da obuhvataju ne-prirodne amino-kiselinske ostatke, koji se tipično ugrađuju uz pomoć hemijske sinteze peptida pre no sintezom u biološkom sistemu. Pomenuto uključuje peptidomimetike i druge reverzne ili invertne forme amino-kiselinskih ostataka. Ne-konzervativne supstitucije mogu da uključuju izmenu jednog člana iz jedne klase sa članom iz neke druge klase.
[0066]Stručnjak je sposoban da odredi prikladne varijante polipeptidnih lanaca veznih belančevina sličnih antitelu iz. ovoga pronalaska primenom dobro poznatih tehnika. Na primer. stručnjak može da iđentifikuje prikladne delove u polipeptidnom lancu koji mogu da se promene bez da se uništi aktivnost uz pomoć ciljanja regiona za koje se veruje da nisu važni za aktivnost. Alternativno, stručnjak može da identilikuje ostatke i delove molekula koji su konzervisani između sličnih polipeptida. Osim toga, čak i delovi koji su važni za biološku aktivnost ili za strukturu mogu da se podvrgnu konzervativnim amino-kiselinskim supstitucijama bez da se uništi biološka aktivnost ili bez štetnih efekata koji bi uticali na polipeptidnu strukturu.
[0067] Termin "pacijent", kao šta se ovde koristi, uključuje humane i životinjske subjekte.
[0068]"Poremećaj" je bilo koje stanje koje bi imalo korist od tretmana sa veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska. "Poremećaj" i "stanje" se ovde koriste kao sinonimi i uključuju hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja prema kojima pacijent ima sklonosti.
[0069] Termini "tretman" ili "tretiranje", kao šta se ovde koriste, se odnose na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Pacijenti koji trebaju takav tretman uključuju one koji boluju od pomenutog poremećaja kao i one koji imaju sklonost da razviju pomenuti poremećaj ili one kod kojih se pomenuti poremećaj treba sprečiti.
[0070] Termini "farmaceutska kompozicija" ili "terapeutska kompozicija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje ili kompoziciju koja je sposobna da uzrokuje željeni terapeutski efekt kada se pravilno administrira nekom pacijentu.
[0071J Termin "farmaceutski prihvatljivi nosilac" ili "fiziološki prihvatljivi nosilac", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više materijala za formulaciju koji su prikladni za postizanje ili pojačavanje dostave veznih belančevina sličnih antitelu.
|0072] Termini "efektivna količina" i "terapeutski efektivna količina" kada se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jednu ili više veznih belančevina sličnih antitelu podrazumeva količinu ili dozu koja je dovoljna da se proizvede željeni terapeutski rezultat. Još specifičnije, terapeutski efektivna količina je ona količina vezne belančevine slične antitelu koja je dovoljna da inhibira. tokom određenog vremenskog perioda, jedan ili više kliničkih definisanih patoloških procesa povezanih sa stanjem koje se tretira. Efektivna količina može da varira u zavisnosti o specifičnoj veznoj belančevini sličnoj antitelu koja se koristi, a takođe zavisi o brojnim faktorima i stanjima povezanim sa pacijentom koji prima
tretman i sa snagom samog poremećaja. Na primer, ako se pomenuta vezna belančevina slična antitelu treba administriratiin vivo,faktori poput starosti, težine, i zdravlja pacijenta kao i kriva odgovora na dozu i podaci o toksičnosti, dobiveni uz pomoć pred-kliničkih istraživanja na životinjama, spadaju u faktore koji su važni za razmatranje. Određivanje efektivne količine ili terapeutski efektivne količine određene farmaceutske kompozicije spada u uobičajenu ekspertizu stručnjaka.
[0073|Jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata neki farmaceutski prihvatljivi nosilac i terapeutski efektivnu količinu neke vezne belančevine slične antitelu, kao šta je definisano u pridodanim zahtevima.
2.Vezne belančevine slične antitelu
[0074]U jednoj izvedbi ovoga pronalaska, pomenute vezne belančevine slične antitelu obuhvataju četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri mesta za vezanje antigena, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom: a dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:
gde:
Vi.i je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vu je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vi u je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
Vn2 je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Ci u je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca;
Fc je imunoglobulinski region drške, a G12 i Cio su konstantni domeni imunoglobulinskog teškog lanca: Li, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri kao šta je definisano u pridodanim
zahtevima;
i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0075]U drugoj izvedbi ovoga pronalaska, pomenute vezne belančevine slične antitelu obuhvataju dva polipeptidna lanca koja formiraju da mesta za vezanje antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom: a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja jc predstavljena sa formulom:
gde:
Vu je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vi ? je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
Vn2 je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Ci, je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca;
Li, L-2. L3, i L4su amino-kiselinski linkeri kao šta je definisano u pridodanim
zahtevima;
i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0076] Pomenute belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska mogu da se pripreme primenom domena ili sekvenca koji su dobiveni ili izvedeni iz bilo kojeg humanog ili ne-humanog antitela, uključujući, na primer, humana, mišja, ili humanizovana antitela.
[0077] Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, dužina L3je najmanje dva puta veća od dužine Li. U drugim veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska, dužina L4je najmanje dva puta veća od dužine L?. Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, dužina Li je najmanje dva puta veća od dužne L3. Kod drugih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, dužina L2je najmanje dva puta veća od dužine L4.
[0078] Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska. Li sadrži 3 do 12 amino-kiselinskih ostataka. L2sadrži 3 do 14 amino-kiselinskih ostataka. L3sadrži 1 do 8 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 1 do 3 amino-kiselinska ostatka. U drugim veznim belančevinama sličnim antitelu. Li sadrži 5 do 10 amino-kiselinskih ostataka. L2sadrži 5 do 8 amino-kiselinskih ostataka, L;, sadrži 1 do 5 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 1 do 2 amino-kiselinska ostatka. Kod preferirane vezne belančevine slične antitelu. Li sadrži 7 amino-kiselinskih ostataka. L2sadrži 5 amino-kiselinskih ostataka. L3sadrži 1 amino-kiselinski ostatak, a L4sadrži 2 amino-kiselinska ostatka.
(0079] Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska. Li sadrži 1 do 3 amino-kiselinska ostatka, L2sadrži 1 do 4 amino-kiselinska ostatka, L;, sadrži 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka. Kod drugih veznih belančevina sličnih antitelu. Li sadrži 1 do 2 amino-kiselinska ostatka, L2sadrži 1 do 2 amino-kiselinska ostatka. L3sadrži 4 do 12 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 2 do 12 amino-kiselinskih ostataka. Kod preferirane vezne belančevine slične antitelu. Lisadrži 1 amino-kiselinski ostatak, L2sadrži 2 amino-kiselinska ostatka. L3sadrži 7 amino-kiselinskih ostataka, a Lt sadrži 5 amino-kiselinskih ostataka.
[0080| Ovde su takođe opisane vezne belančevine slične antitelu u kojima Li. L3, ili L4mogu da budu jednaki nuli. Međutim, kod veznih belančevina sličnih antitelu kod kojih su Li, L?. ili L4jednaki nuli, odgovarajući prelazni linker između varijabilnog regiona i konstantnog regiona ili između dvostrukih varijabilnih domena na drugom lancu ne mogu da budu nula. U nekim izvedbama. Li je jednak nuli, a L3sadrži 2 ili više amino-kiselinskih ostataka. L? je jednak nuli. a Ltsadrži 1 ili više amino-kiselinskih ostataka, ili L4je jednak nuli 0, a L2sadrži 3 ili više amino-kiselinskih ostataka.
|0081 JKod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, najmanje jedan od linkera, koji je izabran iz grupe koja obuhvata Li. L2. L3. i L4, sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak.
|0082j Primeri za prikladne linkere uključuju pojedinačni glicinski (Gly) ostatak: diglicinski peptid (GIy-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri glicinska ostatka (Gly-Gly-Gly-Gly; SEO ID BR: 25); peptid sa pet glicinskih ostataka (Giy-Gly-Gly-Gly-Gly: SEQ ID BR: 26); peptid sa šest glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 27): peptid sa sedam glicinskih ostataka (Gly-GIy-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly: SEO ID BR: 28); peptid sa osam glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly: SEO ID BR: 29). Druge kombinacije amino-kiselinskih ostataka mogu da se koriste kao peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID BR: 30) i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEO ID BR: 31). Drugi prikladni linkeri uključuju pojedinačni Ser. i Val ostatak: dipeptid Arg-Thr. Gln-Pro. Ser-Ser, Thr-Lys, i Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID BR: 52). Thr-Val-Ala-Ala-Pro
(SEO ID BR: 53), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID BR: 54), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEO ID BR: 55); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEO ID BR: 48). Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID BR: 49). Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEO ID BR: 50). i His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID BR: 51). Navedeni primeri ne ograničavaju okrive ovoga pronalaska na bilo koji način, a linkeri koji sadrže nasumično odabranih amino-kiselina izabranih iz grupe koja sadrži valin, leucin. izoleucin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat. glutamat, asparagin. glutamin, glicin. i prolin su se pokazali prikladnima za vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska( vidiPrimer 12).
|00831Identitet i sekvenca amino-kiselinskih ostataka u linkeru mogu da zavise o tipu sekundarnog strukturnog elementa koji je neophodan za izgradnju linkera. Na primer, glicin, serin, i alanin su najbolji za linkere koji poseduju maksimalnu fleksibilnost. Neke kombinacije glicina. prolina, treonina, i serina su korisne ako je potreban rigidniji i izdužcniji linker. Bilo koji amino-kiselinski ostatak može da se smatra linkerom u kombinaciji sa drugim amino-kiselinskim ostacima sa ciljem da se konstruišu veći peptidni linkeri koji neophodno zavise o željenim karakteristikama.
100841U nekim veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska. Vu obuhvata amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 1; Vi 2 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu SEO ID BR: 3; Vm obuhvata amino-kiselinu sekvencu SEQ ID BR: 2: a Vm obuhvata amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 4.
|0085|U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se specifično veže na jedan ili više ciljanih antigena. U preferiranim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se specifično veže na najmanje jedan ciljani antigen izabran iz grupe koja obuhvata B7.1. B7.2. BAFF. BlyS. C3, C5. CCL11 (cotaksin), CCL15 (MlP-ld), CCL 17 (TARC), CCL 19 (MIP-3b). CCL2 (MCP-1), CCL20 (MlP-3a). CCL21 (MIP-2). SLC. CCL24 (MPIF-2/eolaksin-2). CCL25 (TECK). CCL26 (eotaksin-3). CCL3 (MlP-la). CCL4 (MlP-lb). CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3). CCL8 (mcp-2). CD3, CD19, CD20, CD24, CD40. CD40L. CD80. CD86, CDH1 (E-kaderin), hitinazu, CSF1 (M-CSF). CSF2 (GM-CSF). CSF3 (GCSF). CTLA4. CX3CLI (SCYD1). CXCL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A. FCER2, HER2, IGF1R, IL-1. IL-12, 11.13. IL435, IL37, IL18. ILI A. IL1B. IL1F10, ILlp. IL2. IL4, IL6, IL7. IL8. IL9, 1L12/23. IL22, IL23. IL25, IL27, IL35. ITGB4 (b4 integrin). LEP (leptin). MHC iz klase II. TLR2. TLR4.
TLR5, TNF« TNF-a, TNFSF4 (0X40 ligand). TNFSF5 (CD40 ligand).Toll- likereceptore. TREMI. TSLP, TWEAK. XCR1 (GPR5/CCXCR1). DNGR-1(CLEC91). i HMGB1. U drugim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da inhibira delovanje jednog ili više ciljanih antigena.
[0086]U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je bispecifična i sposobna da veže dva različita ciljana antigena ili epitopa. U jednoj preferiranoj izvedbi ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je bispecifična pri čemu je svaki par laki lanac-teški lanac sposoban da veže dva različita ciljana antigena ili epitopa. U još jednoj preferiranoj izvedbi, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da veže dva različita ciljna antigena koja su izabrana iz grupe koja obuhvata IL4 i IL13. IGF1R i HER2. IGF1R i EGFR. EGFR i HER2, BK i ILI 3, PDL-1 i CTLA-4. CTLA4 i MHC iz klase II. IL-12 i 1L-18. IL-la i IL-lp\ TNFa i ILI2/23. TNFa i IL-12p40. TNFa i IL-I0, TNFa i IL-23. i ILI 7 i IL23. U još jednoj preferiranoj izvedbi, pomenuta vezna belančevina slična antitelu je sposobna da veže ciljane antigene IL4 i ILI3.
[0087]U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu specifično veže IL4 saon- ralekonstantom od 2.97 E+07 ioff- raiekonstantom od 3.30 E-04 i specifično veže ILI3 saon- ralekonstantom od 1.39 E+06 ioff- raiekonstantom od 1.63 E-04. U drugim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu specifično veže IL4 saon-ralekonstantom od 3.16 E+07 ioff- raiekonstantom od 2.89 E-04 i specifično veže ILI3 saon- ralekonstantom od 1.20 E+06 ioff- raiekonstantom od 1.12 E-04.
[0088]Takođe je opisan postupak u kojem vezna belančevina slična antitelu. koja obuhvata četiri polipeptidna lanaca koja formiraju četiri mesta za vezanje antigena, se priprema uz pomoć identifikovanja varijabilnog domena iz prvog antitela. koji veže prvi ciljani antigen, i varijabilnog domena iz drugog antitela, koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu svaki sadrži V|„ i Vn: pripisivanja lakom lancu ili teškom lancu oznaku lanac kalup: pripisivanja Vi iz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela oznaku Vi.i; označavanja V1.2, Vm. i Viu u skladu sa formulama [I] i [II] ispod: određivanja maksimalnih i minimalnih dužina za Li, L2, L3, i L4; generisanja polipeptidnih struktura sa formulama I i II; izbora polipeptidnih struktura sa formulama 1 i II koje vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada su spojeni tako da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
V1.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
V112 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;
Cl je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Ci 11 je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca;
Fc je imunoglobulinski region drške, a C112, Ci« su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a
Li, L2, Lj, i L4su amino-kiselinski linkeri:
i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni para laki lanac-teški lanac.
[0089] Takođe je opisan postupak u kojem se vezna belančevina slična antitelu. koja obuhvata Četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, priprema uz pomoć identifikovanja varijabilnog domena iz prvog antitela, koji veže prvi ciljani antigen, i varijabilnog domena iz drugog antitela, koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu oba sadrže Vi., i Vm; pripisivanja lakom lancu ili teškom lancu oznaku lanac kalup; pripisivanja Vi. iz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela oznaku Vu; označavanja V1.2, Vm. i Vira u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:
određivanja maksimalnih i minimalnih dužina za Li. L2. L3, i L4; generisanja polipeptidnih struktura sa formulama I i II; izbora polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje se vežu na prvi ciljani antigen i na drugi ciljani antigen kada su spojeni tako da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;
gde:
Vi.j je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vu je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
Vh2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca:
Ci 11 je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca: a
Li, L2.Li,i\ asu amino-kiselinski linkeri;
i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teskilanac.
[0090]U drugim izvedbama se priprema vezna belančevina slična antitelu u kojoj su varijabilni domen iz prvog antitela i varijabilni domen iz drugog antitela isti.
[0091]Takođe je opisan postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu koji obuhvata eksprimiranje (u ćeliji) jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture predstavljene sa formulama [I] i [II] ispod:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vi_2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca:
V| 12 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca:
Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca;
Fc je imunoglobulinski region drške, a Cm, Ciusu konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a
Lt, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri:
i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
[0092]Takođe je opisan postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu koji obuhvata eksprimiranje (u ćeliji) jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture koje su predstavljene sa formulama [II i [III ispod:
gde:
Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca:
Vi.i je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;
Vhi je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;
V112 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;
G. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca:
Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca; a
Lu L?, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri:
i gde polipeptid sa formulom I i polipeptid sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac - teški lanac.
3.Primene veznih belančevina sličnih antitelu
[0093]Vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska mogu da se primene u bilo kojem poznatom ogledu, poput ogleda kompetetivnog vezanja, direktnih i indirektnih sendvič-ogleda, i ogleda imunoprecipitacije sa ciljem detektovanja i kvantifikovanja jednog ili više ciljanih antigena. Vezne belančevine slične antitelu će se vezati na jedan ili više ciljanih antigena sa afinitetom koji je prikladan za primenjeni ogled.
[0094JZa dijagnostičke primene, u nekim izvedbama, vezne belančevine slične antitelu mogu da se označe uz pomoć ostatka koji može da se detektuje. Pomenuti ostatak koji može da se detektuje može da bude bilo koji ostatak koji može da proizvede, direktno ili indirektno, signal koji može da se detektuje. Na primer, ostatak koji može da se detektuje može da bude neki radioizotop, poput<3>H,<l4>C.<12>P, 35S, l25I. "Tc.<m>In. ili<fl7>Ga; neko fluorescentno ili hemiluminescentno jedinjenje, poput fluorescein izotiocijanata. rodamina. ili luciferina: ili neki encim, poput alkalne fosfataze. p-galaktozidaze. ili peroksidaze iz hrena.
[0095]Vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska su takođe korisne zain vivosnimanja. Vezna belančevina slična antitelu koja je označena sa nekim ostatkom koji može da se detektuje može da se administrira nekoj životinji, preferirano u krvotok, a tada se analizira prisustvo i lokacija označenog antitela. Vezna belančevina slična antitelu može da bude označena sa bilo kojim ostatkom koji može da se detektuje u nekoj životinji uz pomoć nuklearne magnetne rezonance, radiologije, ili uz pomoć drugih načina đetektovanja koji su poznati stanju tehnike.
J0096] Takođe je opisan komplet hemikalija koji sadrži veznu belančevinu sličnu antitelu i druge reagense korisne za detektovanje nivoa ciljnog antigena u biološkim primercima. Takvi reagensi uključuju oznaku koja može da se detektuje, serum za blokiranje, primerke za pozitivnu i negativnu kontrolu, i reagense za detektovanje.
4.Terapeutske kompozicije sa veznom belančevinom sličnom antitelu i njihovo
administriramo
[0097]Terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže vezne belančevine slične antitelu, kao šta je definisano u pridodanim zahtevima, spadaju u okvire ovoga pronalaska. Takve terapeutske ili farmaceutske kompozicije mogu da sadrže terapeutski efektivnu količinu neke vezne belančevine slične antitelu. lekoviti konjugat vezne belančevine slične antitelu u smeši sa nekom farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim agensom za fonnulisanje koji je izabran tako da bude prikladan sa modusom za administriranje.
[0098]Prihvatljivi materijali za formulisanje su netoksični za recipijente u dozama i koncentracijama u kojima se primenjuju.
|0099]Pomenuta farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale za formulisanje koji služe modifikovanju, održavanju, ili konzervisanju, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti. bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, stope raspadanja ili oslobađanja, apsorpcije, ili penetracije same kompozicije. Prikladni materijali za formulisanje uključuju, ali bez ograničenja, amino-kiseline (poput glicina. glutamina. asparagina. arginina. ili lizina). sredstva protiv mikroorganizama, antioksidanse (poput askorbinske kiseline, natrij um sulfita. ili natrijum hidrogen-sulfita), pufere (poput borata. bikarbonata. Tris-HCI, raznih citrata. fosfata, ili drugih organskih kiselina), agense za bubrenje (poput rnanitola ili glicina). agense za heliranje (poput etilendiamin tetraoctene kiseline (II.) I A)), agense za kompleksovanje (poput kofeina, polivinilpirolidona, beta-ciklodekstrina, ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrina). filere, monosaharide. disaharide. i druge ugljohidrate (poput glikoze. manoze, ili dekstrina). belančevine (poput albumina iz seruma, želatina, ili raznih imunoglobulina), agense za boju, ukus i za razblaživanje. agense za emulziju, hidrofilne polimere (poput polivinilpirolidona), polipeptide niske molekularne mase, kontra-jone koji
formiraju soli (poput natrijuma). konzervanse (poput benzalkonijum hlorida. benzojeve kiseline, salicilne kiseline, timerosala. fenetil alkohola, metilparabena. propilparabena. hlorheksidina, sorbinske kiseline, ili hidrogen peroksida), rastvarače (poput glicerina, propilen glikola, ili polietilen glikola), šećerne alkohole (poput manitola ili sorbitola), agense za suspendovanje, surfaktante ili agense za vlaženje (poput pluronika; PEG; sorbitan estera: polisorbata kao polisorbat 20 ili polisorbat 80: trilona: trometamina; lecitina; holesterola ili tiloksapala), agense koji pojačavaju stabilnost (poput saharoze ili sorbitola), agense koji pojačavaju tonicitet (poput alkalo-metalnih hahda - preferirano natrijum ili kalij um hlorid - ili manitol sorbitola), prenosnike za dostavu, razblaživaće. ekscipijente i/ili farmaceutske dodatke (vidi,na primer,REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18. izd., A.R. Gennaro, ur., Mack Publishing Companv 1990). i novija izdanja pomenutog naslova).
[0100] Optimalnu farmaceutsku kompoziciju određuje stručnjak u zavisnosti o, na primer. predviđene rute za administriranje, formata za dostavu, i željene doze. Takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, stopu otpuštanjain vivo.i stopu čišćenjain vivopomenute vezne belančevine slične antitelu.
[0101 ]Primarni prenosnik ili nosilac u nekoj farmaceutskoj kompoziciji može da bude tečan ili ne-tečan po prirodi. Na primer. neki prikladni prenosnik ili nosilac za injekciju može da bude voda, fiziološki salini rastvor, ili veštačka cerebrospinalna tečnost. moguće obogaćena sa drugim materijalima koji su uobičajeni kod kompozicija namenjenih za parenteralno administriranje. Prirodno puferovana slanica ili slanica pomešana sa albuminom iz seruma su dodatni primeri za prenosnike. Drugi primeri za farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris-pufer (pH od oko 7.0-8.5). ili acetatni pufer (pH od oko 4.0-5.5), koji dodatno može da uključuje sorbitol ili neku prikladnu zamenu. Kompozicije sa veznom belančevinom sličnom antitelu mogu da se pripreme za skladištenje na način da se pomeša izabrana kompozicija, koja ima željenu stepen čistoće, sa opcionim agensima za formulisanje u formi liofilizovanog kolača ili nekog vodenog rastvora. Nadalje, pomenuta vezna belančevina slična antitelu može da se formuliše kao liofilizat primenom odgovarajućih ekscipijenata poput saharoze.
[0102] Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da budu namenjene za parenteralnu dostavu. Alternativno, pomenute kompozicije mogu da budu namenjene za inhalaciju ili za dostavu preko digestivnog trakta, na primer oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je poznata stručnjacima. [01031 Komponente pomenute formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto administrirani a. Na primer, puferi se koriste sa ciljem da se u kompoziciji održava fiziološki pH ili blago niži pH, tipično u pH rasponu od oko 5 do oko 8.
[0104JKada se govori o parenteralnom administriranju. pomenute terapeutske kompozicije mogu da budu u formi vodenog rastvora koji ne sadrži pirogen. koji je parenteralno prihvatljiv, i koji sadrži željenu veznu belančevinu sličnu antitelu u nekom farmaceutski prihvatljivom prenosniku. Posebno prikladan prenosnik za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je formulisana vezna belančevina slična antitelu u formi sterilnog, izotoničnog rastvora, koji je propisno konzervisan. Jedan drugi preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa nekim agensom, poput mikro-sfera za injektiranje. čestica za bio-eroziju, polimemih jedinjenja (poput poli-mlečne kiseline ili poliglikolne kiseline), kuglica, ili liposoma, koje obezbeđuje kontrolisano ili zadržano oslobađanje produkta koji može da se dostavi preko depo-injekcije. Hijaluronska kiselina takođe može da se koristi, a to može da obezbedi efekt održivog trajanja tokom cirkulisanja. Drugi prikladni načini uvođenja željenog molekula uključuju dostavu leka preko naprave za implantiranje.
|0105jU jednoj izvedbi, farmaceutska kompozicija može da se formuliše kao preparat za inhalaciju. Na primer, vezna belančevina slična antitelu može da se formuliše kao suvi prah za inhalaciju. Rastvori za inhalaciju vezne belančevine slične antitelu takode mogu da se formulišu uz pomoć propelanta za dostavu aerosola. U još jednoj izvedbi, pomenuti rastvori mogu da budu nebulizovani.
[0106]Takođe je predviđeno da se određene formulacije administriraju oralno. Vezne belančevine slične antitelu koje se administriraju na ovaj način mogu đa se formulišu sa ili bez onih nosioca koji se uobičajeno koriste kod pripreme čvrstih doznih forma poput tableta i kapsula. Na primer. kapsula može da se dizajnira tako da oslobađa aktivni deo formulacije u tačno određenoj tačci gastrointestinalnog trakta gde je bio-dostupnost maksimalna, a pre-sistemska degradacija minimalna. Dodatni agensi mogu da se dodaju sa ciljem da se ubrza apsorpcija vezne belančevine slične antitelu. Razređivači. agensi za ukus, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja. lubrikanti. agensi za suspendovanja. agensi za raspadanje tablete, i veznici takođe mogu da se primene.
[0107]Druga farmaceutska kompozicija može da sadrži efektivnu količinu veznih belančevina sličnih antitelu u smeši ne-toksičnih ekscipijenata koji su prikladni za proizvodnju tableta. Uz pomoć rastvaranja tabieta u sterilnoj vodi. ili u drugom prikladnom prenosniku, mogu da se pripreme rastvori u formi pojedinačnih doza. Prikladni ekscipijenti uključuju, ali bez ograničenja, inertne razblaživaće, poput kalcijum karbonata, natrij um karbonata ili bikarbonata, laktoze. ili kalcijum fosfata; ili vezne agense, poput škroba, želatina, ili akcije; ili lubrikante poput magnezijum stearata, stearinske kiseline, ili talka.
[0108] Dodatne farmaceutske kompozicije će biti evidentne stručnjacima, uključujući formulacije koje sadrže vezne belančevine slične antitelu koje su formulisane u preparatima za zadržanu- ili kontrolisanu-dostavu. Stručnjacima su poznate brojne tehnike za formulisanje preparata za zadržanu- ili kontrolisanu-dostavu. poput liposomalnih nosioca, mikročestica za bio-eroziju ili poroznih kuglica i depo-injekcija. Dodatni primeri za preparate za zadržano otpuštanje uključuju polu-propustljive polimerne matrice u formi oblikovanih artikala,na primer.filmova, ili mikrokapsula. Matrice za zadržano otpuštanje mogu da uključuju poliestere, hidrogelove, polilaktide. kopolimer L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat. poli(2-hidroksietilmetakrilat). etilen vinil acetat, ili poii-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Kompozicije za zadržano otpuštanje takođe mogu da uključuju liposome, koji mogu da se pripreme na više načina koji su poznat stanju tehnike.
[0109| Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste zain vivoadministriranje, pri čemu tipično moraju da budu sterilne. To može da se postigne uz pomoć filtriranja kroz sterilnih membrana za filtriranje. Kada je pomenuta kompozicija liofilizovana, sterilizacija može da se primeni pre, ili nakon, liofilizovanja i obnavljanja. Kompozicija za parenteralno administriranje može da se skladišti u liofilizovanoj formi ili u formi rastvora. Osim toga, parenteralne kompozicije se uobičajeno smeštaju u kontejner koji ima sterilni otvor za, na primer, intravenoznu vrećicu ili posudu koja sadrži zatvarač koji može da se probije uz pomoć igle za hipodermičku injekciju.
[0110) Jednom kada se farmaceutska kompozicija formuliše, može da se skladišti u sterilnim posudama u formi rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste materije, ili kao dehidriram ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da se skladište u formi preparata ..gotov-za-upotrebu" ili u formi preparata( na primer.liofilizovan) koji zahteva obnovu neposredno pre administriranja.
[0111]Takođe su opisani kompleti hemikalija za proizvodnju pojedinačnih doznih jedinica. Pomenuti kompleti hemikalija mogu da obuhvataju prvi kontejner koji sadrži osušenu belančevinu i drugi kontejner koji sadrži vodenu formulaciju. Takođe su opisani kompleti hemikalija koji sadrže pojedinačne i višestruke špriceve koji su od pre ispunjeni sa formulacijom( na primer.tečni špricevi i liošpricevi).
[0112] Efektivna količina farmaceutske kompozicije sa veznim belančevinama sličnim antitelu. koja se primenjuje terapeutski. zavisi, na primer. o terapeutskom kontekstu i ciljevima. Stručnjak razume da će odgovarajući nivoi za tretman zavisiti, delomično, o molekulu koji se dostavlja, o indikaciji za koju se primenjuje vezna belančevina slična antitelu, ruti za administriranje, i veličini (telesnoj težini, teiesnoj površini, ili veličini organa) i stanju (starosti i opšteg zdravstvenog stanja) pacijenta. Prema tome, kliničar može da titrira dozu i da modifikuje rutu za administriranje kako bi postigao optimalni terapeutski efekt. Tipična doza može da se kreće u rasponu od oko 0.1 ug/kg do oko 100 mg/kg ili više. u zavisnosti o ovde pomenutim faktorima. U drugim izvedbama, pomenuta doza može da se kreće u rasponu od 0.1 ug/kg do oko 100 mg/kg: ili 1 ug/kg do oko 100 mg/kg: ili 5 ug/kg, 10 ug/kg, 15 ug/kg. 20 ug/kg. 25 ug/kg, 30 ug/kg, 35 ug-kg. 40 ug/kg. 45 ug/kg. 50 ug/kg.
55 ug/kg, 60 ug/kg, 65 ug/kg, 70 ug/kg. 75 ug/kg. do oko 100 mg/kg.
|0113| Frekvencija doziranja zavisi o farmakokinetičkim parametrima vezne belančevine slične antitelu iz formulacije koja se primenjuje. Tipično, kliničar administrira kompoziciju do postizanja doze koja postiže željeni efekt. Pomenuta kompozicija, premalome. može đa se administrira kao pojedinačna doza. kao dve ili više doza (koje mogu, ali ne moraju, da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuiranu infuzija preko implantirane naprave ili katetera. Dodatno podešavanje odgovarajuće doze je rutinsko znanje i veština stručnjaka. Odgovarajuće doze mogu da se utvrde uz pomoć primene odgovarajućih podataka koji proizlaze iz odgovora na dozu.
[0114] Ruta za administriranje pomenute farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima,na primer,oralno: preko injekcije kroz intravenozne, intraperitonealne. intracerebralne (intraparenhimalne). intracerebroventrikularne. intramuskularne, intraokularne. intraarlerijalne, intraportalne, ili intralezionalne rute; uz pomoć sistema za zadržano otpuštanje; ili uz pomoć naprava za implantiranje. Ako je poželjno, pomenute kompozicije mogu da se administriraju uz pomoć bolus-injekcije ili kontinuirano preko infuzije, ili uz pomoć implantirane naprave.
[0115JPomenuta kompozicija može da se administrira lokalno preko implantiranja membrane, sunđera, ili nekog drugog odgovarajućeg materijala u kojem je poželjni molekul bio apsorbiran ili enkapsuliran. Kada se koristi impiantirana naprava, pomenuta može da se implantira u neko odgovarajuće tkivo ili organ, a dostava željenog molekula može da se ostvari uz pomoć difuzije, bolusa koji se oslobađa tokom vremena, ili uz pomoć kontinuiranog administriranja.
5.Primeri
10116]Primeri koji slede samo ilustruju specifične izvedbe ovoga pronalaska, i njegove brojne primene. Primeri služe samo kao ilustracija i ne treba da ih se shvati kao da ograničavaju okvire ovoga pronalaska na bilo koji način.
Primer 1. Dizajn i projektovanje bispecifičnih veznih belančevina sličnih antitelu sa
ukrštenim dvojnim varijabilnim regionom
[0117)Ukršteni dvojni varijabilni region u Fv formatu je opisan u U.S. patentu br. 5.989,830, a navodi se kao ukrštena dvoglava (CODH) konfiguracija. Molekularno modeliranje predviđa da ukršteni dvoglavi (CODH) dizajn dovodi do kompleksa u kojem su oba vezna mesta usmerena u suprotnim smerovima, bez ograničenja koja su sugerisana za Dvostruku-Fv konfiguraciju. CODH Fv format je ispitan sa ciljem da se utvrdi da li može da se konvertuje u kompletne molekule slične antitelu uz pomoć dodavanja Ci. domena lakom lancu i Fc regiona teškom lancu. Slična konverzija je uspešna za odgovarajuće dvojne varijabilne domene (DVD-Ig) i TBTI kao šta je opisano u U.S. patentu br. 7.612.181 i Internacionalnoj prijavi br. WO 2009/052081. Raspored varijabilnih regiona u CODH formatu je prikazan u strukturama ispod koje ukazuju na orijentaciju peptidnih lanaca u smet uamino- prema- karboksihr.
(a) laki lanac: NH2-Vu-Linker-Vi,2-COOH
(b) teški lanac: NH2-Vii2-Linker-Viit-COOH.
[0118]Pomenutiamino- prema- karbotsihtterminalni aranžman varijabilnih regiona u (a) i (b) iznad može da se razlikuje od aranžmana u Dvostrukoj-Fv konfiguraciji koja je prikazana pod (c) i (d) ispod:
(c) laki lanac: NH2-Vi.Linker-V, 2-COOH
(d) teški lanac: Nlb-Vm-Linker-Vm-COOH.
[0119]Glavna razlika, koja treba da se primeti. je različiti raspored odgovarajućih varijabilnih regiona iz lakog lanca i teškog lanca (Vm/V| i i Vni/Vu), jedan prema drugomu, u konfiguracijama sa dva dvostruka varijabilna regiona. Odgovarajući Vu i Vm domeni se nalaze na N-terminusu lakog i teškog lanca u konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom. Suprotno, u ukrštenoj konfiguraciji, jedna polovina jednog para varijabilnog regiona antitela je prostorno odvojena sa proteinskim lancem u ukrštenoj konfiguraciji. Kod ukrštene konfiguracije, Vu domen se nalazi na N-terminusu proteinskog lakog lanca, ali domen Vm za sparivanje se nalazi na C-terminusu teškog lanca iz ukrštene konfiguracije. Prostorni odnos između Vui Vm, koji se nalazi u konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom, je aranžman koji je prisutan u prirodnim antitelima.
[0120]Jedan potencijalan nedostatak dvostruke-Fv konfiguracije je taj da linker Li., koji odvaja dva varijabilna regiona, strci u mesto za vezanje antigena iz Fv2 domena( vidiSliku 1). Ova protruzija može da interferira sa mestom za vezanje antigena i da dovede do narušene pristupačnosti Antigena 2 prema Fv2. Ovakva narušena pristupačnost ili interferencija može da spreči vezanje antigena. Osim toga. ova interferencija može da bude izraženija kada je veličina Antigena 2 veća. Uistinu, već je pokazano u U.S. patentu br. 7.612.181 da vezni afinitet i sposobnost neutralizovanja DVD-Ig molekula zavisi o tome koja je antigena specifičnost predstavljena na N-terminusu ili C-terminusu.VidiU.S. patent br. 7,612,181, Primer 2.
[01211Prema tome, kako bi se kreirale stabilnije vezne belančevine slične antitelu. koje neće gubiti afinitet prema antigenu u odnosu na parentalno antitelo, projektovani su i konstruirani ukršteni molekuli sa dvostrukim varijabilnim regionom koji sadrže Ci. domen u lakom lancu i Fc region u teškom lancu. Polipeptidi koji formiraju pomenute belančevine slične antitelu imaju strukture koje su prikazane ispod, a u kojima je prikazanaamino- prema- karboksiluterminalna orijentacija polipeptidnih lanaca:
(e) laki lanac: NH2-Vu-Linker-Vu-Ci.-COOH
(0 teški lanac: NH2-Vn2-Linker-Vni-Cin-Fc-COOH.
[0122]Sa ciljem da se proceni da li će ovako dizajnirana bispecifična belančevina slična antitelu vezati dva različita antigena, korišćena su dva prethodno generisana i humanizovana varijabilna regiona iz antitela koja su bila specifična za IL4 (parentalno humanizovano anti-IL4 antitelo) i za IL13 (parentalno humanizovano anti-ILl 3 antitelo) kako bi se konstruirali bispecifični molekuli slični antitelu koji su prikazani u Tabeli 1. Sekvenciranje mišjeg antitela i proces njegovog humanizovanja su opisani u Internacionalnoj prijavi br. WO 2009/052081 (TBTI). Ukratko, amino-kiselinske sekvence varijabilnih teških i lakih lanaca iz mišjeg anti-ILl3 kiona B-B13 i mišjeg anti-IL4 klona 8D4-8 su određene uz pomoć sekvenciranja amino-kiselinske sekvence. Mišje sekvence su bile humanizovane. a tada ponovo prevedene u nukleotidne sekvence kao šta je opisano u Primeru 5 iz Internacionalne prijave br. WO 2009/052081. Sekvence Vn i Vi. iz parentalnog humanizovanog anti-IL4 antitela, i Vn i Vi sekvence iz parentalnog humanizovanog anti-ILl3 antitela su kombinovane i aranžirane kao Šta je prikazano u Tabeli 1. Skraćene oznake u prvom stupcu iz Tabele 1 su kreirane radi pojednostavljenja rasprave o ovim veznim belančevinama sličnim antitelu. Pomenute vezne belančevine slične antitelu se razlikuju u veličini linkera koji je ugrađen između dva varijabilna regiona kao šta je prikazano u Tabeli 1. DNA molekuli koji kodiraju polipeptide prikazane u Tabeli 1 su generisani iz translatovanih parentalnih anti-IL4 i anti-ILl3 antitela. Cm, Ci., i Fc domeni su dobiveni iz IGHG1 (GenBank pristupni br. 569F4) i IGKC (GenBank pristupni br. Q502W4).
(0123]Kombinacije belančevina prikazane u Tabeli 2 su eksprimirane uz pomoć prolazne transfekcije i prečišćene uz pomoć hromatografije na Belančevini A. U svakom slučaju, hromatograftja koja razdvaja na osnovu veličine je pokazala manje od 12% agregacije. a najčešće manje od 7% agregacije: ali niti jedan od ukrštenih dvoglavih imunoglobulina nije mogao da veže IL4 ili ILI 3. Međutim, funkcionalno vezanje slično vezanju antitela nije moglo da se detektuje. a razlozi za ovakav nedostatak aktivnosti nisu bili otkriveni. Prethodno je bilo predviđeno da će ovakav aranžman pokazati superiornu stabilnost u odnosu na antitela sa dvostrukim varijabilnim regionom koja su opisana u U.S. patentu br. 7.612,181 i u Internacionalnoj publikaciji br. WO 2009/052081.
Primer 2. Dizajniranje CODV-Ig belančevina uz pomoć molekularnog modeliranja
[0124|Sa ciljem da se dobiju potpuno funkcionalne belančevine slične antitelu primenom ukrštene dvoglave konfiguracije, koje mogu da prime Fc i Ci.i domene, razvijen je protokol za molekularno modeliranje koji je korišćen za ugradnju i procenu različitih linkera između konstantnih i varijabilnih domena i između dvostrukih varijabilnih domena na teškom i lakom lancu. Pitanje je bilo da li će dodavanje pojedinačnih linkera u svakom interfejsu između konstantnog i varijabilnog domen i između dva interfejsa varijabilni/varijabilni domen na teškom i lakom lancu omogućiti pravilno sklapanje belančevine tako da se dobiju funkcionalni molekuli slični antitelu u ukrštenoj konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom( vidiSliku 2). Drugim recima, ukupno su procenjena četiri nezavisna i jedinstvena linkera( vidiSliku 2). Ovakav protokol molekularnog modeliranja se bazira na pristajanjebelančevirta- belančevinaiz modela homologija i eksperimentalnih modela za Fviu i Fvn 13 regione. u kombinaciji sa odgovarajućim linkerima između Fviu i Fvn.13 regiona i između Fv i konstantnih ili Fc regiona.
[0125]Nezavisni linkeri su dobili jedinstvene oznake kako sledi: Lise odnosi na linker između N-terminalnog Vl i C-terminalnog Vi. u lakom lancu; Li se odnosi na linker između C-terminalnog Vi i G u lakom lancu: L3se odnosi na linker između N-terminalnog Vhi C-terminalnog Vn u teškom lancu; L4se odnosi na linker između C-terminalnog Vn i Cm (i Fc) u teškom lancu. Treba da se primeti da se oznake Vn i Vi. odnose na lokaciju domena u određenom proteinskom lancu u finalnom formatu. Na primer. Vm i Vi 12 mogu da se izvedu iz Vu i V1.2domena iz parentnog antitela i da se smeste na Vm i V112pozicije u CODV-Ig. Slično. Vu i V1.2mogu da se izvedu iz Vm i Vn? domena iz parentnog antitela i da se smeste na Vm i V112pozicije u CODV-Ig. Tako, oznake Vn i Vi. se odnose na sadašnju lokaciju, a ne na originalnu lokaciju u parentnom antitelu.
[0126]Detaljnije, model homologije Fviu je konstruisan na PDB unosima 1YLD (laki lanac) i 1IQW (teški lanac). Fvn.4dimer je prekomponovan na jednojin- hou. sekristalnoj strukturi kompleksa IL13/anti-IL 13 Fabii.13 pa je optimizovan. Sa ciljem da se napravi procena volumena kojeg zahvata IL4 kada je vezan na Fviu. kristalna struktura IL4 (IRCB.pdb) je pridodana modelu homologije Fvn 4. Sledeće, generisana su dvadeset i dva pretpostavljena modela pomenutog kompleksa koje je zahtevalo dodatna razmatranja. |0127| Paralelno, model pristajanja homologije za Fviu je pridodan Fvtuj koji je ekstrahiran izin- housekristalne strukture kompleksa IL13/Fabiuj!. Pronađeno je jedno superiorno rešenje koje je dozvolilo konstrukciju relativno kratkih linkera koji ne stvaraju steričku interferenciju kod vezanja antigena i postavljanja konstantnih domena koje se događa kod imunoglobulina sa dvostrukim varijabilnim regionom( vidiSliku 3). U ovom aranžmanu Fviu(Vi i) je postavljen na N-terminusu lakog lanca, a nakon njega se nalaze Fviu 3 (V12) i Fc (G.i) na C-terminusu lakog lanca. U teškom lancu, Fvn. 13 (Vn?) je postavljen N-terminalno, a nakon njega sledi Fviu (Vm) i konstantni regioni (Chi-Ch2-Cib)-
[0128J Kao sta je prikazano u Tabeli 3, modeli lakog lanca sugerišu da linker Li između Vu i Vi,2domena i linker L2između V1.2 i Ćudomena treba da bude dugačak između jednog i tri i nula i dva glicinska ostatka. Modeli teškog lanca sugerišu da linker L.i između Vi 12 i Vm domena i linker L4između Vm i Cm domena treba da bude dugačak između dva i šest i četiri i sedam glicinska ostatka( vidiTabelu 3 i Sliku 2). U ovom primeru, glicin se koristi kao prototipična amino-kiselina za linkere. ali takođe i drugi amino-kiselinski ostaci mogu da posluže kao linkeri. Strukturna stabilnost predloženih modela je verifikovana uz pomoć optimizacije linkerskih konformacija, minimizovanja, i izračuna molekularnih dinamika. Sistematsko kombinovanje konstrukata od između četiri laka lanca i šest teških lanaca je dalo 24 moguće anti-IL4 i anti-ILl3 bispecifične vezne belančevine slične antitelu koje sadrže ukrštene dvostruke varijabilne regione( vidiTabelu 4).
[0129]U Tabeli 4, prefiks "anti" nije uključen, ali namenjen je đa pokazuje da se ILI 3 odnosi na anti-ILl3. a IL4 na anti-IL4.
Primer 3. Generisanje CODV-Ig ekspresionih plazmida
[0130)Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilne teške i lake lance između onih šest teških lanaca i Četiri laka lanca, opisanih u Tabeli 4. su generisani uz pomoć sinteze gena na aparatuGeneari(Regensburg, Nemačka). Varijabilni domeni iz lakog lanca su fuzionisani na konstantni domen iz lakog lanca (IGKC. GenBank pristupni br. Q502W4) uz pomoć digestije sa restrikcionim endonukleazamaApaLI i5.s7WI, a naknadno ligirani u mestaApaL l/ BsiWI u episomalnom ekspresionom vektoru pFF. koji je analogon pTT vektoru koji
je opisan od autora Durocheret al.. (2002, Nucl. Acids Res.30(2): E9), koje dovodi do kreiranja plazmida za ekspresiju lakih lanaca u ćelijama sisara.
(01311Varijabilni domeni uz teškog lanca su fuzionisani na "Ted" varijantu humanog konstantnog domena iz teškog lanca (IGHG1. GenBank pristupni br. 569F4), ili alternativno, na Cm domen sa priveskom od 6x His iz humanog konstantnog IGHG1 sa ciljem da se kreira bispecifični Fab. Sledeće. Vndomen je pocepan sa restrikcionim endonukleazamaApaL1 iApaI, a tada je fuzionisan na IGHG1 ili na Cm domen sa His-priveskom uz pomoć ligiranja uApaL \/ ApaI mesta iz episomalnog ekspresionog vektora pFF pri čemu nastaju plazmidi za ekspresiju teških lanaca u ćeliji sisara (IgGl ili Fab).
Primer 4. Eksprimiranje CODV-lg
|0132]Ekspresioni plazmidi koji kodiraju teški i laki lanac iz odgovarajućih konstrukata su propagirani u ćelijamaE. col i(DH5a). Plazmidi koji su korišćeni za transfekciju su pripremljeni izE. coliprimenom kompleta hemikalijaOiagen EndoFree Plasmid Mega Kit.
[0133]HEK 293-FS ćelije koje rastu u međijumu Freestvle (Invitrogen) su transfektovane sa navedenim LC i HC plazmidima koji kodiraju teške lance i lake lance prikazane u Tabeli 4 primenom 293fektina (Invitrogen) (reagens za transfektovanje) sledeći instrukcije proizvođača. Nakon 7 dana, ćelije su odstranjene uz pomoć centri tugovanja, a supernatant je propušten kroz filter (0.22 pm) sa ciljem da se odstrane čestice.
(0134)Konstrukti CODV-IgGl su prečišćeni uz pomoć afinitetne hromatografije na koloni od Belančevine A (koloneHiTrap Protein A HP.GE Life Sciences). Nakon elucije iz kolone uz pomoć acetatnog pufera (100 mM; pH 3.5) i NaCl (100 mM), konstrukti CODV-IgGl su odsoljeni uz pomoć kolonaHiPrep 26/ 10.fonnulisani u PBS u koncentraciji od 1 mg/mL i filtrirani kroz membranu (0.22 um).
[0135]Bispecifični CODV Fab konstrukti su prečišćeni uz pomoć I MAC na kolonamaHiTrap 1K4AC HP(GE Life Sciences). Nakon elucije iz kolone uz pomoć linearnog gradijenta (pufer za eluciju: 20 mM natrijum fosfat, 0.5 M NaCl, 50-500 mM imidazol, pH 7.4), frakcije koje sadrže belančevinu su sakupljene i odsoljene uz pomoć kolonaHiPrep 26' 10.formulisane u PBS u koncentraciji od 1 mg/mL i filtrirane kroz membranu (0.22 um). [0136)Koncentracija belančevine je određena uz pomoć merenja apsorbancije koci 280 nm. Svaka serija je analizirana uz pomoć SDS-PAGE u uslovima redukcije ili bez redukcije kako bi se odredila Čistoća i molekularna masa svake podjedinice i monomera.
[0137]PločicaF96- MaxiSorp- lmmunoje obložena sa kozjim anti-humanim IgG (Fc specifičnim) [NatuTec A80-104A]. Antitelo je razređeno do 10 ug/ml u karbonatnom puteru za oblaganje (50 mM natrijum karbonat, pH 9.6) i dodano u rupice (po 50 uL u svaku). Pločica je zatvorena sa trakom za prianjanje, pa je ostavljena na 4° C preko noći. Pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje (PBS, pH 7.4 i 0.1% Tween20). U svaku rupicu je dodano po 150 uL rastvora za blokiranje (1% BSA/PBS) sa ciljem da se prekrije pločica. Nakon 1 h na sobnoj temperaturi, pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 uL primerka ili standarda (u rasponu od 1500 ng/mi do 120 ng/ml). a pločica je ostavljena da stoji tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 u.L konjugata kozji anti-humani IgG-FC-HRP [NatuTec A80-104P-60j koji je bio razređen 1:10.000 uz pomoć rastvora za inkubaciju (0.1 % BSA. PBS. pl l 7.4, i 0.05% Tween20). Nakon 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 uL ABTS supstrata (tableta ABTS od 10 mg (Pierce 34026) u 0.1 M Na2HP04, 0.05 M rastvora limunske kiseline, pfl 5.0). U svaku rupicu je dodano po 10 uL 30% H2O2/IO ml supstrata, a smeša je ostavljena da razvije boju. Nakon pojave boje (približno 10 do 15 min) je dodano 50 uL 1% SDS rastvora sa ciljem da se zaustavi reakcija. Pločica je očitana kod A405.
Primer 5. Karakterizovanje varijanata CODV-Ig
|0138|Sa ciljem da se odredi da li se teški i laki lanci iz CODV-Ig belančevine slične antitelu sparuju i ispravno sklapaju, nivo agregacije je izmeren uz pomoć analitičke hromatografije osetljive na veličinu (SEC). Analitička SEC je provedena na sklopljenim parovima uz pomoć aparataAKTA expforer 10(GE Healthcare) koji je bio opremljen sa kolonomTSKgel G3000SWXL(7.8 mm x 30 cm) i kolonomTSKgel Sli' XI gitare!(Tosoh Bioscience). Analiza je provedena stopom od 1 ml/min primenom 250 mM NaCl. 100 mM Na-fosfata. pH 6.7. pri čemu je detektovanje provedeno kod 280 nm. 30 uL primerka sa belančevinom (0.5-1 mg/ml) je naneseno na kolonu. Za procenu molekularne veličine, kolona je kalibrirana uz pomoć standardne smeše za gel-filtraciju (MWGF-1000. SIGMA Aldrich). Procena podataka je provedena uz pomoć programaUNfCORN v5. 1I.
[0139]Tabela 5 prikazuje rezultate prve grupe od 24 različitih CODV-Ig molekula koji su dobiveni uz pomoć kombinovanja anti-IL4 i anti-ILl3 varijabilnih regiona iz Tabele 4. Oznake iz Tabele 4 predstavljaju susedne strukture prikazane u Tabeli 4. Za parove lakog lanca sa teškim lancima koji su formirali belančevinu. nivoi agregacije su izmereni primenom SEC. Rezultati su prikazani u Tabeli 5 pri čemu LC4 (Li = 1; L2- 2) je najuspešniji u sparivanju sa svih šest teških lanaca. LC4 odgovara strukturi IL4 Vi-(Gly)-IL13 Vi.-(Gly2)-C1.1sa linkerom Li koji je jednak 1. pri Čemu jedan amino-kiselinski ostatak odvaja dva Vi domena dvostrukog varijabilnog regiona iz lakog lanca. Osim toga. LC4 ima L2koji je jednak 2. koji sadrže Gly-Gly dipeptidni linker između centralnog Vi. i C-terminalnog Cm.
(0140)Tamo gde su se pojavili CODV-Ig molekuli je proveden eksperiment pojedinaćne-koncentracije BIACORE kod interminedijarnih koncentracija ILI3 i IL4 sa ciljem da se potvrdi vezanje ciljanih antigena. CODV-Ig molekuli slični antitelu koji odgovaraju kombinacijama LC4:HC4 i LC4:HC6, opisanima u Tabeli 4. su izabrani za provođenje pune konetičke analize primenom površinske rezonance plazmona.
[0141]Kao šta je prikazano u Tabeli 5. najveći deo CODV-lg molekula ne može da se proizvede uopšte ili nastaje samo u formi agregata (do 90%). Kombinacije teški lanac/laki lanac koje daju prihvatljive nivoe agregacije (5-10%) nakon jednog hromatografskog koraka su one u kojima je kombinovan laki lanac IL4 Vi-(Gly)-IL13 Vi-(Gl<y>2)-<C>u. Laki lanac je najbiraniji lanac bez ove CODV-Ig varijante i služi kao platforma koja prihvata različite teške lance sa različitim kompozicijama linkera.
1.Kinetička analiza
[0142]Dva para teških i lakih lanaca su izabrana za punu kinetičku analizu. Rekombinantni humani IL13 i IL4 su nabavljeni od Chemicon (USA). Kinetičko karakterizovanje prečišćenih antitela je provedeno uz pomoć površinske rezonance plazmona na aparatuBlACORE 3000(GE Healthcare). Primenjen je ogled zarobljavanja koji koristi specifično antitelo (na primer. humano-Fc specifično MAB 1302. Chemicon) za zarobljavanje i orijentaciju ispitivanog antitela. Zarobljeno antitelo je imobilizirano preko primarnih aminskih grupa (11000 RU) na čipu za istraživanje CM5 (GE Life Sciences) uz pomoć standardnih procedura. Analizirano antitelo je zarobljeno kod stope protoka od 10 u L/min sa podešenom RU vrednosti koje obezbeđuje maksimalno vezanje analita od 30 RU. Kinetike vezanja su izmerene u odnosu na rekombinantni humani IL4 i ILI3 preko raspona koncentracije između 0 i 25 nM u HBS EP (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl. 3 mM EDTA. i 0.005% surfaktant P20 ) kod stope protoka od 30 u l/min. Površine čipa su regenerisane sa 10 mM glicinom (pH 2.5). Kinetički parametri su analizirani i izračunati uz pomoć programskog paketaBIAevahialion v4. 1u odnosu na protok ćelija bez zarobljenog antitela (referenca).
[0143]Tabela 6 ispod prikazuje uporedbu kinetika parentalnih BB13 (anti-Il .13) i 8D4 (anti-IL4) antitela (eksprimirani kao IgG) pri čemu se odgovarajući domeni nalaze u CODV-Ig formatu (Tabela 4, oznake LC4:HC4 i LC4:HC6). Kao šta je prikazano u Tabeli 6. konstrukti CODV-Ig ne pokazuju karakteristike smanjenog vezanja odgovarajućih antigena, kada se uporede sa parentalnim anti-ILl3 i anti-lL4 antitelima. Gubitakon- ratekonstante, koji je primećen u DVD-Ig/TBTI formatu primenom istih Fv sekvenca. ne nastupa sa CODV-Ig konfiguracijom. Vezna mesta koja su okrenuta u suprotnim smerovima se očekuje da omoguće vezanje većih antigena ili premošćivanje različitih ćelija uz pomoć bispecifične konfiguracije slične antitelu, koja je takođe prikladna za opsežniju selekciju parentalnog antitela. Dodatna prednost CODV-Ig je ta da linkerski ostaci ne strče u mesta koja vežu antigen čime bi smanjivali pristupačnost antigena. 2.Ko- injekcija IL4 i IL13 sa ciljem demonstracije aditivnog vezanja antigena uz pomoć
CODV- lg
[0144]Sa ciljem da se istraži aditivno vezanje oba antigen je primenjen uz pomoć automatskog ko-ubrizgavanja pri čemu je prvo injektiran jedan antigen, a odmah nakon toga je injektiran i drugi nakon lag-perioda (IL4. a tada ILI3 i obrnuto). Nastao vezni nivo može da se uporedi sa onim koji je postignut uz pomoć smeše oba antigena (1:1) u istoj koncentraciji. Sa ciljem da se dokaže aditivno vezanje oba antigena. IL4 i ILI3, od strane CODV-Ig molekula, proveden je BIACORE eksperiment uz pomoć CODV-Ig kombinacije [HC4:LC4] pri Čemu su ko-injektirana oba antigena u tri odvojena analitička ciklusa( vidiSliku 4). Ko-injektiranje je provedeno sa 3.125 nM IL4/25 nM IL13 (i obrnuto) i sa smešom 3.125 nM ILA i 25 nM IL13 (1:1). Ko-injekcija HBS-EP pufera je provedena kao referenca. U vremenskoj tačci od 800 s je postignut identičan vezni nivo od 63 RU nakon injektiranja smeše antigena ili ko-injektiranja antigena, bez razlike na ko-injektiranu sekvencu. Kada je CODV-Ig belančevina bila zasićena sa prvim antigenom (IL4). injektriran je drugi antigen (ILI 3) nakon čega je primećen drugi vezni signal. Ova opservacija je reprodukovana i kada je redosled injektiranih antigena bio promenjen. To pokazuje da je vezanje oba antigena uz pomoć CODV-lg aditivno i nije inhibirano. Prema tome, CODV-Ig konstrukt je sposoban da veže oba antigena istovremeno(//..pokazuje bispecifičnost) pri Čemu su zasićena sva vezna mesta((/.,pokazuje tetravalenciju).
Primer 6. Tolerancija linkerskih dužina kod CODV-lg
[0145]Tolerancija različitih dužina linkera je procenjena uz pomoć konstruisanja CODV-Ig molekula koji sadrže različite kombinacije linkera Lti L?na lakom lancu i Lii L4 na teškom lancu (linkeri su bili različitih dužina). CODV-Ig konstrukti su generisani tako da na teškom lancu imaju linkere Ls i L4čija dužina varira između l i 8 ostataka za L3i 0 ili 1 ostatak za L4. Teški lanac je sadržavao anti-IL4 kao N-terminalni vezni domen i anti-ILl 3 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg se nalazio Citi-Fc. Dužine linkera Li i L2iz lakog lanca su varirale od 3 do 12 ostataka za Lii od 3 do 14 ostataka za Li- Laki lanac je sadržavao anti-ILl 3 kao N-terminalni vezni domen i anti-IL4 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg se nalazio Cu.
1.Karakterizovanje varijanataCODV- Ig
[0146]Određivanje nivoa agregacije je provedeno uz pomoć analitičke hromatografije osetljive na veličinu (SEC). Analitička SEC je provedena uz pomoć aparataAKTA explorer 10(GE Healthcare) koji je bio opremljen sa kolonomTSKgel G3000SWXL(7.8 mm x 30 cm) i kolonomTSKgel SWXL guard(Tosoh Bioscience). Analiza je provedena kod stope od 1 ml/min primenom 250 mM NaCl. 100 mM Na-fosfata. pH 6.7. pri čemu je detektovanje provedeno na 280 nm. U kolonu je dodano 30 uL primerka sa belančevinom (0.5-1 mg/ml ). Za procenu molekularne mase, kolona je kalibrirana uz pomoć sta standardne smeše za gel-filtraciju (MWGF-1000, SIGMA Aldrich). Procena podataka je provedena uz pomoć programaUNICORN v5. 11.
[0147]Rekombinantni humani ILI3 i IL4 su nabavljeni od Chemicon (SAD). Rekombinantni humani TNF-u je nabavljen od Sigma Aldrich (H8916-10u.g). rekombinantni humani IL-lp (201-LB/CF), rekombinantni humani IL-23 (1290-IL/CF). rekombinantni humani EGFR (344 ER), i rekombinantni humani HER2 (1129-ER-50) su nabavljeni od R&D Svstems.
[0148]Analiza kinetike vezanja uz pomoć pristupa Biacore je provedena kako sledi. Tehnologija površinske rezonance plazmona na aparatuBiacore 3000(GE Healthcare) je korišćena za detaljno kinetičko karakterizovanje prečišćenog antitela. KoriŠćen je ogled zarobljavanja sa specifičnim antitelom( na primer.humano-Fc specifično MAB 1302. Chemicon) za zarobljavanje i orijentaciju ispitivanog antitela. Za određivanje veznih kinetika IL4 i ILI3. odgovarajući CODV Fab kao u Primeru 10 i Tabeli 12 su zarobljeni uz pomoć kompleta hemikalija za zarobljavanje sa anti-humanim Fab (GE Healthcare). Zarobljeno antitelo je imobilizirano preko primarnih aminskih grupa (11000 RU) na istraživačkom čipu CM5 (GE Life Sciences) uz pomoć standardnih procedura. Analizirano antitelo je zarobljeno kod stope protoka od 10 u.L/min sa podešenom RU vrednosti koja obezbeđuje maksimalno vezanje analita od 30 RU. Vezne kinetike su izmerene u odnosu na rekombinantni humani IL4 i ILI3 preko raspona koncentracije od između 0 i 25 nM u HBS EP (10 mM HEPES pH 7.4. 150 mM NaCl. 3 mM EDTA. 0.005% surfaktant P20) kod stope protoka od 30 uL/min. Površine čipa su regenerisane uz pomoć 10 mM glicina (pH 2.5). Kinetički parametri su analizirani i izračunati uz pomoć programskog paketaBIAevaluution v4 1primenom protoka ćelija bez zarobljenog antitela (referenca).
[0149]Vezni afiniteti CODV-Ig, CODV-Fab, i TBTI za EGFR i HER2 su izmereni uz pomoć sistemaProteon XPR36 protein interaction arrav(Biorad). Antigeni su imobilizirani uz pomoć reaktivnog kuplovanja amina na čipovimaGLC sensor(Biorad). Serije razblaživanja varijanata bispecifičnog antitela u puferu PBSET (Biorad) su analizirane paralelno u modusuone- shotkinetike uz pomoć dvostruke reference. Podaci su analizirani uz pomoć programaProteon Manager Sofhvare v3.()(Biorad) primenom modela Langmuir 1:1 sa prenosom mase ili modela bivalentnog analita.
[0150]Tabela 7 prikazuje rezultate za prinos, agregaciju (izmerene uz pomoć hromatografije osetljive na veličinu), vezni afinitet za CODV-Ig koji je sadržavao linkere različitih veličina. Rezultati su pokazali da se CODV-Ig molekuli, kod kojih je Li iznosio nula. ne mogu proizvesti, ili kada je belančevina bila proizvedena, postojao je visoki nivo agregacije( vidiSerije br. 101, 102. 106-111. i 132-137 u Tabeli 7). Prema tome. suprotno od predviđanja molekularnog modeliranja iz Primera 2, gde se Lj jednak nuli nalazio u prihvatljivom rasponu, ovi rezultati pokazuju da Vi.2-Ce. tranzicija (ili L2) zahteva linker od najmanje jednog ostatka( vidiTabelu 7).
|0151|Osim toga. malopre opisane dužine CODV-Ig linkera su osetljivije na povećanje od 1 amino-kiselinskog ostatka nego na povećanje od 2 amino-kiselinska ostatka. Na primer, dok se Serije br. 103 i 104 razlikuju za 1 amino-kiselinski ostatak u L?, Serija br. 103 pokazuje 6-puta povećanu agregaciju, a Serija br. 104 pokazuje manji stepen agregacije i dvostruko povećani prinos. Suprotno. Serije br. 104 i 105. koje se razlikuju za dva ostatka u L2. pokazuju slične profile u odnosu na prinos, agregaciju, i vezanje.
Primer 7. Teški lanac kao lanac kalup za CODV-Ig
[0152]U primerima 1 do 5. optimalne veličine kratkog linkera na lakom lancu sugerišu da je pomenuti laki lanac služio kao kalup ostajući u linearnom rasporedu i da su potrebni veći linkeri na teškom lancu kako bi se pomenuti teški lanac ispravno sklapao u ukrštenu konfiguraciju kako bi se podesio prema lakom lancu koji je kalup( vidiSliku 5. Panel A). Sledeće je bilo procenjeno da li su kratki linkeri. koji su specifično postavljeni na teškom lancu sa ciljem da održavaju lineran raspored u njemu, omogućili pomenutom teškom lancu da postane lanac "kalup" i da li će se takav obrazac ponoviti, a veći linkeri biti potrebni kako bi se lanac koji nije kalup ispravno sklopio i prilagodio novom teškom lancu koji služi kao kalup( vidiSliku 5, Panel B).
|0153jSlika 6 pokazuje pomenute principe kod dizajna CODV-Ig na bazi toga da kao lanac
..kalup"služi laki lanac ili teški lanac. Sa ciljem da se evaluira generička priroda ovog koncepta, CODV-Ig konstrukti su generisani tako da poseduju linkere L?i U na teškom lancu čija dužina varira između 1 i 8 ostataka za L3i 0 ili 1 ostatak za L4. Teški lanac je sadržavao anti-IL4 kao N-terminalni vezni domen i anti-ILl3 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg slede Cm-Fc. Linkeri na lakom lancu. Li i L?. imaju dužine koje variraju između
3 i 12 ostataka za Li i od 3 do 14 ostataka za Lj. Laki lanac je sadržavao anti-ILl 3 kao N-tenninalni vezni domen i anti-IL4 kao C-terminalni vezni domen, nakon kojeg sledi Cu.(0154]Tabela 8 prikazuje rezultate za prinos, agregaciju (izmerenu uz pomoć hromatogralije koja je osetljiva na veličinu), i vezni afinitet za CODV-Ig koji sadrži linkere različitih dužina pri čemu se teški lanac održava u linearnom aranžmanu kao lanac kalup, a lakom lancu je omogućeno da se sklopi u ukrštenu konfiguraciju. Rezultati su otkrili da CODV-Ig molekuli kod kojih L-4 je nula generalno ne mogu da se proizvedu. ili kada je belančevina proizvedena, primećen je visoki nivo agregacije {slično molekulima kod kojih L?je jednak nuli){ vidiSerije br. 207-209, 211-212. 219-224. 231-236, 243-252, i 263-266 u Tabeli 8). Jedna iznimka je Serija br. 210, u kojoj Li je 7. L-2 je 5. L3je 2, a L4je nula. Ovakav raspored omogućava proizvodnju dovoljne količine belančevine i ima prihvatljivi nivo agregacije i vezanja, koje sugeriše da može da se pronađe kombinacija linkerskih veličina koja može da kompenzira za dužinu nula linkera L4u nekim situacijama.
[0155]Rezultati iz Tabela 7 i 8 jasno pokazuju da su linkeri potrebni između varijabilnih i konstantnih domena kako bi se omogućilo ispravno sklapanje. Samo je u retkim aranžmanima linker dužine nula tolerisan( vidiSerije br. 103-105, u kojima Li (LC) je nula. i Seriju br. 210. u kojoj L4 je nula). Međutim, u svakom slučaju, odgovarajući prelazili linker između varijabilnog regiona i konstantnog regiona na drugom lancu može da bude nula.
[0156]Ovi rezultati pokazuju da kombinacije Li=7, L2=5. L3=l, iLa=2su dobra početna tačka za optimizovanje novog CODV-lg u kojem teški lanac služi kao kalup. Rasponi u Tabeli 9 su se pokazali kao razumni rasponi za uspešno projektovanje novog CODV-Ig iz dva parentna antitela.
Primer 8. Univerzalna primena CODV-Ig formata
[0157]Sa ciljem da se proceni prikladnost CODV-Ig formata za projektovanje nove vezne belančevine slične antitelu, varijabilni regioni iz brojnih postojećih humanih i humanizovanih antitela koja imaju specifičnost za receptor faktora rasta 1 koji je sličan insulinu (IGF1 R( 1)), drugo antitelo protiv receptora faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGF1R(2)). humanog receptora 2 za epidermalni faktor rasta (HHR2), receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR), alfa faktora nekroze tumora (TNF a), interleukina 12 i 23 (IL-12/23) i interleukina lbeta (IL-113) su ugrađeni u CODV-Ig format( vidiTabelu 10). [0158)Varijabilni regioni iz humanog ili humanizovanog antitela se koriste da se testira univerzalna primena CODV-Ig formata u dizajniraju bispecifičnih veznih belančevina sličnih antitelu. Osim toga, ispitana je i mogućnost pozicionih efekata u odnosu na položaj određenih varijabilnih regiona na N-terminusu ili C-terminusu na teškom lancu ili na lakom lancu. Na bazi dizajna CODV-Ig molekula koji imaju imkersku kompoziciju Li=7. L.2=5. L3=l. i 1.4=2, različite sekvence antitela su uvedene u CODV-Ig format.
[0159JAktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv IL1 p i TNFa su određene uz pomoć komercijalno dostupnihHEK- Blue TNFoj/ Lifj reporterćelija (InvivoGen). Sa ciljem da se odredi aktivnost antitela protiv TNFa i ILip, citokini su pre-inkubirani tokom 1 h sa antitelom u različitim koncentracijama pa su dodani u 50000 ćelija sojaHEK Bhte
TNFa/ILIfi.Indukcija SEAP posredovana sa citokinom je izmerena nakon 24 h u supematantu kulture primenom ogledaQUANTI- Blue(InvivoGen).
[0160] Kao staje prikazano u Tabeli 11, svi konstrukti su pokazali dobar do izvršan prinos belančevina i prihvatljive nivoe agregacije( vidi,posebno Serije br. 301 i 302 u Tabeli 11). Izmereni afinitet za svaki varijabilni domen se nalazio unutar objavljenih ili očekivanih vrednosti. U slučajevima kada je afinitet procenjen, pozicioni efekti nisu primećeni. Sve zajedno, kao šta je prikazano u sledećim tabelama, pozicioni efekti nisu bili primećeni za bilo koji varijabilni domen koji je korišćen na bilo kojem lancu antitela.
Primer9. Retencija afiniteta parentalnog antitela u CODV-Ig formatu
[0161| Identične sekvence za anti-IL4 i anti-IL13 su ugrađene u TBTI/DVD-Ig ili CODV-Ig formate za direktnu uporedbu pomenutih konfiguracija, pozicija linkera, i afiniteta nastalih molekula. Kao šta je prikazano na Slici 7, parentalni afinitet svakog antitela se održava u CODV formatu. Kao šta je prikazano u gornjem panelu Slike 7. kada su varijabilni regioni smešteni u TBTI/DVD-Ig format, pad afiniteta IL4 antitela koje zauzima unutarnju Fv2 poziciju se manifestuje kao smanjivanjeon- ratekonstante vezanja antitela na antigen. Suprotno, gubitak afiniteta za CODV-Ig format nije nastupio ako se uporedi sa parentalnim antitelom( vidiSliku 7, donji panel).
Primer 10. Adaptabilnost CODV-Ig na Fab format
[0162] Sledeće je procenjena sposobnost CODV-Ig formata da obezbedi fragmente poput Fab fragmenata. Različiti varijabilni regioni iz teških lanaca su fuzionisani jedan sa drugim preko linkera Li i C-terminalno produženi preko linkera L.4. Ovaj Vu kompleks je tada fuzionisan na Cm domen iz IGHG1 (GenBank pristupni br. Q569F4) koji na C-terminalu ima pet amino-kiselinskih sekvenca DKTHT (SEO ID BR: 60). od regiona ručke na kojeg se nastavlja šest histidinskih ostataka. Dva različita varijabilna regiona iz lakih lanaca su fuzionisana jedan sa drugim u unakrsnu konfiguraciju sa odgovarajućim teškim lancem preko linkera Li i C-lerminalno produženi preko linkera L2. nakon čega su fuzionisani na konstantni region iz kapa lanca (IGKC. GenBank pristupni br. Q502W4).
[0163] Fab fragmenti su eksprimirani preko prolazne transfekcije kao šta je ranije opisano. Sedam dana nakon transfekcije. ćelije su odstranjene uz pomoć centrifugovanja. nakon čega je dodano 10% vol/vol IM Tris-HCl (pH 8.0), a supernatant je propušten kroz filter (0.22 um) sa ciljem da se odstrane Čestice. Fab belančevine su zarobljene uz pomoć kolonaHisTrap High Performance(GE Healthcare), a elucija je provedena uz pomoć gradijenta imidazola. Frakcije koje sadrže belančevinu su sakupljene i odsoljene uz pomoć kolonaPD-10iliSephadex.Rastvori sa belančevinom su koncentrovani i sterilizirani uz pomoć filtracije (0.22 pm), koncentracija je podešena na 1 mg/ml, a smeše su čuvane na 4° C do upotrebe.
|0164[ Neposredne koristi proizlaze zbog toga šta molekuli slični Fab-u u CODV orijentaciji pokazuju tendenciju da agregiraju i zadržavaju afinitete parentalnih antitela( vidiTabelu 12). Konstrukti veznih belančevina iz Serija br. 401-421 su direktno upoređivali belančevine
slične antitelu u kojima su varijabilni regioni bili aranžirani kao kod CODV-Ig molekula gde teški lanac sliži kao kalup (401, 402, 406. i 407). fragmente CODV slične Fab-u (402. 408. 413, 418. i 421), molekule sa četiri domena slične antitelu u TBTI/DVD-Ig formatu (404. 409, 414, i 419). i CODV-Ig bez linkera (405, 410, 415. i 420). Kao staje prikazano u Tabeli 12, rezultati ove uporedbe pokazuju da je verovatnije da će nastupiti gubitak afiniteta u odnosu na parentna antitela kada je varijabilni region ugrađen kao TBTI ili DVD-Ig format. Suprotno, formati CODV-Ig i CODV-Ig sličan Fab-u su bili sposobni da održavaju parentalne afinitete. Rezultati dodatno potvrđuju da CODV-Ig molekuli zahtevaju linkere između varijabilnih regiona i između varijabilnih regiona i konstantnih domena( vidiTabelu 12).
Primer 11. Supstitucija varijabilnih domena unutar CODV-Ig i CODV-Fab
[0165]Sa ciljem da se karakterizuje CODV format kroz pristup koji koristi T-ćelije, bispecifične vezne belančevine CODV slične Fab-u (CODV-Fab), koje imaju TCR vezno mesto (CD3epsilon) i CD 19 vezno mesto, su generisani i upoređeni sa bispecifičnim Fab koji je dobiven iz TBTI/DVD-lg formata (B-Fab). Sa ciljem da se istraži važnost orijentacije veznih mesta (TCR x CD 19 naspram CD 19 x TCR). obe orijentacije su procenjene za svaku veznu belančevinu.
[0166]Vezne belančevine su karakterizovane u citotoksičnom ogledu primenom NALM-6 ćelija (koje eksprimiraju CD 19), koje su korišćene kao ciljne ćelije, i primarnih humanih T-ćelija, koje su korišćene kao efektorske ćelije. CD3 pozitivne ćelije su izolovane iz sveže pripremljenih humanih PBMC. Efektorske i ciljne ćelije su pomešane u omeru 10:1 pa su inkubirane tokom 20 h sa bispecifičnim veznim belančevinama sa navedenim koncentracijama( vidiSliku 8). Apoptotične ciljane ćelije su određene uz pomoć ogleda na bazi FACS bojanja sa 7-aminoaktinomicinom.
[0167]B-Fab format u konfiguraciji CD3-CD19 (1060) se pokazao aktivnim u indukovanju citotoksičnosti prema NALM-6 ćelijama, koja je posredovana sa T-ćelijama. sa konstantom EC50od 3.7 ng/ml. Slična visoka aktivnost je primećena za CD19-CD3 CODV-Fab (1109) sa konstantom ECso od 3.2 ng/ml( vidiSliku 8).
[0168]Razmena konfiguracije u B-Fab molekulu (Fab iz TBTI/DVD-Ig formata) sa CD19-CD3 orijentacijom dovodi do značajnog gubitka aktivnosti( vidiSliku 8). Razmenjeni B-Fab molekul ne pokazuje aktivnost kod koncentracija koje su bile maksimalne za obe orijentacije CODV-Ig Fab i drugu orijentaciju B-Fab. Za brojne CODV-Ig Fab i jednu orijentaciju B-Fab je primećen maksimalni odgovor (u rasponu od između 1 i 100 ng/ml). Za CD19-CD3 orijentaciju B-Fab, čak i kod maksimalne koncentracije (30 ug/ml). optimalni citotoksični odgovor nije postignut. Suprotno, promena orijentacije domena u CODV-Fab prema CD3-CD19 (1108) obezbeđuje molekul sa značajnom aktivnosti u ovom ogledu( vidiSliku 8). Mada razmena domena u CODV-Fab takođe smanjuje indukciju citotoksičnosti posredovane sa T-ćelijama (povećanje ECso za faktor od 100). ovaj efekt je manje izražen od onog koji je primećen kod B-Fab formata, a molekul je bio sposoban da indukuje maksimalnu citotoksičnost. Podaci su bili reprezentativni i dobiveni iz tri nezavisna eksperimenta.
Primer 12. Uticaj identiteta amino-kiselinske sekvence na CODV-Iglinkere
[0169]Optimizovani konstrukt koji odgovara Seriji br. 204( vidiPrimer 7 i Tabelu 8) je izabran sa ciljem da se ispita uticaj linkerskog sastava na linkere Li do L-i. Dužine linkera su podešene na 7. 5, 1. i 2 ostatka za Li, L?. Li. i L4( vidiTabelu 13). Testirane sekvence su izvedene iz prirodnih linkera na prelazu između Vn i Cm domena iz prirodnog antitela ili između Fv i Ci. domena iz kapa ili lambda lakih lanaca. Sekvence kandidati su ASTKGPS (SEO ID BR: 48). koja je izvedena iz prelaza između Vn i Cm domena. RTVAAPS (SEQ ID BR: 49) i GOPKAAP (SEQ ID BR: 50). koje su izvedene iz prelaza između Fv i G domena iz kapa i lambda lakih lanaca. Nadalje, jedan konstrukt je generisan sa arbitrarnim sastavom linkera sa ciljem da se pokaže da bilo koja sekvenca može potencijalno da se koristi u linkerima Li do L4. Ovaj linkerski sastav je dobiven nasumičnim rasporedom amino-kiselina valin. leucin. izoleucin, serin, treonin, lizin. arginin, histidin, aspartat, glutamat. asparagin, glutamin, glicin. i prolin na 15 pozicija u četiri pomenuta linkera. Aromatske amino-kiseline fenilalanin, tirozin, i triptofan, kao i amino-kiseline metionin i cistein su namemo izostavljene sa ciljem da se izbegne potencijalni porast agregacije.
[0170]Tri-dimenzionalni model konstrukta za Seriju br. 204 je generisan sa ciljem da se obezbedi prikladnost ili da se rafinira izbor linkerskog sastava. Tako. serin je izabran za linker L3 jer su u tri-dimenzionalnom modelu primećeni pozitivno i negativno nabijeni ostaci u susedstvu. Ostaci u linkeru L4su izabrani tako da budu kompatibilni sa rastvaračem kojem su izloženi kao šta sugeriše sam model. Slično, problemi nisu anticipirani ili predviđeni za linkerske sastave za Li i Li. Konstruisani su tri-dimenzionalni modeli za izabrane predloge za linkersku kompoziciju.
[0171]Kao šta je prikazano u Tabeli 12. linkerski sastav može da ima dramatični uticaj na prinos. Sekvence koje su izvedene iz lambda lanca na Li (uporedbom Serija br. 505-507 sa Serijama br. 501-503) su generatori produktivnijih belančevina (porast od 8-puta). Uistinu, linkeri na bazi nasumičnog generisanja takođe stvaraju dobre prinose, kao sta je pokazano u Tabeli 13. Serija br. 508. Prema tome. linkerski sastav treba da bude jedan od parametara koji treba da se uzmu u obzir kod optimizovanja CODV-Ig.
|0172|Aktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv citokina IL4 i ILI 3 su određene sa komercijalno dostupnim reporter ćelijamaHEK- Blue IL- 4/ IL- 13(InvivoGen).HEK- Blue IL-4/ IL- 13ćelije su dizajnirane sa ciljem da se prati aktiviranje STAT6 puta uz pomoć IL-4 ili ILI3. Stimulacija ćelija sa bilo kojim citokinom dovodi do proizvodnje embrionske alkalne fosfataze (reporter gen, SEAP), čija prisutnost može da se izmeri u supernatantu kulture uz pomoć testaOUANTI- Blue.Sa ciljem da se testira delovanje antitela protiv IL4 ili ILI3. citokini su pre-inkubirani tokom 1 h sa antitelom u različitim koncentracijama pa su dodani u 50000 ćelijaHEK- Blue IL- 4/ IL- I3.Indukcija SEAP posredovana citokinom je izmerena nakon i 24-časovne inkubacije u supernatantu ćelijske kulture uz pomoć testaOUANTI- Blue(InvivoGen).
Primer 13. Uvođenje cisteina u CODV-Ig linkere
[0173]Objavljeni podaci sugerišu da se stabilnost antitela i veznih belančevina izvedenih iz antitela može povećati uz pomoć uvođenja ne-prirodnih disulfidnih mostova( vidiWozniak-Knoppet al,2012, "Stabilisation of the Fc Fragment of Human IgGl by Engineered Intradomain Disulfide Bonds."PLoS ONE7(1): e30083). Sa ciljem da se ispita da li ekvivalentni Fc fragment, koji je izveden iz humanog IgGl antitela i projektovan u CODV-Ig molekul, može da se stabilizuje uz pomoć uvođenja inter- i intra-lančanih disulfidnih mostova ekvivalentne Fc pozicije CODV-Ig konstrukta iz Serije br. 204 (iz Primera 7) su mutirane u cisteinske ostatke, a mutirane belančevine su proizvedene, prečišćene, i karakterizovane( vidiTabelu 14).
[0174]Kao šta je prikazano u Tabeli 14, svaki mutirani CODV-Ig molekul, koji sadrži dodatne cisteinske ostatke, je imao iste temperature topljenja kao i temperature topljenja CODV-Ig konstrukta iz Serije br. 204.
[01751Osim toga, dva simultana cisteina su bila uvedena u Kabat poziciju 100 u lakom lancu i 44 u teškom lancu u svakom varijabilnom domenu kao šta je opisano od sirane autora Brinkmannet al,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 7538-42. Ove pozicije su strukturno konzervisane unutar nabora antitela, pa zbog toga tolerišu cisteinske supstitucije bez da utiču na integritet pojedinačnih domena.
[01761Kao šta je prikazano u Tabeli 15. CODV i CODV-lg konstrukti u kojima su cisteinski ostaci uvedeni u Kabat poziciju 100 u lakom lancu i 44 u teškom lancu u svakom varijabilnom domenu imaju veće temperature topljenja u odnosu na CODV i CODV-Ig konstrukte u kojima cisteinski ostaci nisu uvedeni u pomenute pozicije( vidi. na primer.Serije br. 704 i 706 i Serije br. 713 i 714).
1.Merenja termostabilnosti varijanata CODV i TBTI
[0177]Tačke topljenja (Tm) varijanata CODV i TBTI su određene uz pomoć diferencijalne skening fluorimetrije (DSF). Primerci su razblaženi u D-PBS puferu (Invitrogen) do konačne koncentracije od 0.2 ug/ul pa su dodani u 2 ul 40x koncentrovanog rastvora SYPRO-naranđžaste boje (Invitrogen) u D-PBS u belimsemi- skirtpločicama sa 96-rupica. Sva merenja su provedena u duplikatu uz pomoć instrumentaMyiQ2 real time PCR(Biorad). Tm vrednosti su ekstrahirane iz negativnog prvog derivata kriva topljenja primenom programa
iQ5v2. 1.
|0178]Sledeće je ispitan efekt uvođenja cisteinskih ostataka direktno u linkere ili u varijabilni region. U ovom primeru. Serija br. 204 (iz Primera 7 i Tabele 8) je korišćena kao model za CODV-Ig veznu belančevinu, a cistein je zamenjen sa glicinom u Li. U. ili u varijabilnom regionu na bazi tri-dimenzionalnog modela. Kao šta je prikazano u Tabeli 16 ispod, rezultati pokazuju da uvođenje cisteinskih parova utiče na prinos i agregaciju. Predviđene mutacije su bile modelirane sa ciljem da se konstatuje da li se đisulfidne veze ispravno formiraju, pri čemu je korektna geometrija je održavana u linkerima i njihovoj sredini u modelima. Bez razlike na to. Serija br. 808 je dala dobar prinos, niski nivo agregacije, koje sugeriše da ispravan cisteinski most može da se formira.
[0179] Svaka izvedba koja je vode opisana može da se kombinuje sa bilo kojom drugom izvedbom ili izvedbama osim ako je navedeno drugačije. Posebno, bilo koja karakteristika ili izvedba za koju je navedeno daje preferirana ili da donosi prednost može da se kombinuje sa bilo kojom drugom karakteristikom ili karakteristikama ili izvedbom ili izvedbama za koje je navedeno da su preferirane ili da donose prednost, osim ako je navedeno drugačije.

Claims (16)

1. Vezna belančevina slična antitelu.naznačena time.što sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom: a dva polipeptidna lanca imaju strukturu kojaje predstavljena sa formulom: gde: Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca: V|.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca; Vhi je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca; Vh2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca; Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca; Chi je konstantni domen iz imunoglobulinskog Ci u teškog lanca: Fc je imunoglobulinski region drške, a Ci 12 i Cio su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca: a Li. L2. L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; pri čemu: Li je dugačak 3 do 12 amino-kiselinskih ostataka: Lije dugačak 3 do 14 amino-kiselinskih ostataka; L3 je dugačak 1 do 8 amino-kiselinskih ostataka; a L4 je dugačak 1 do 3 amino-kiselinska ostatka; i gde polipeptidi sa formulom l i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
2. Vezna belančevina slična antitelu.naznačena time.što obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen, pri Čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu kojaje predstavljena sa formulom: a drugi polipeptidni lanac ima strukturu kojaje predstavljena sa formulom: gde: Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca; Vu je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca; Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca: Vm je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca; Ci, je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca; Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca: a Li. L2, Li. i L4su amino-kiselinski linkeri; pri čemu: Li je dugačak 3 do 12 amino-kiselinskih ostataka; L2 je dugačak 3 do 14 amino-kiselinskih ostataka: Laje dugačak 1 do 8 amino-kiselinskih ostataka; a Laje dugačak 1 do 3 amino-kiselinska ostatka; i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
3. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 1 ili 2, naznačena time. što: Li je dugačak 5 do 10 amino-kiselinskih ostataka; L2 je dugačak 5 do 8 amino-kiselinskih ostataka: L3 je dugačak 1 do 5 amino-kiselinskih ostataka; a Laje dugačak 1 do 2 amino-kiselinska ostatka.
4. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 1 ili 2. naznačena time, što: Li je dugačak 7 amino-kiselinskih ostataka; L2je dugačak 5 amino-kiselinskih ostataka; L3je dugačak 1 amino-kiselinski ostatak; a L4 je dugačak 2 amino-kiselinska ostatka.
5. Vezna belančevina slična antitelu, naznačena time, što sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu kojaje predstavljena sa formulom: a dva polipeptidna lanca imaju strukturu kojaje predstavljena sa formulom: gde: Vu je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca: Vi.2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca; Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca; Vn2 je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca; Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca: Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca: Fc je imunoglobulinski region drške, a Ci 12 i Cm su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca: a Li, L2. L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; pri čemu: Li je dugačak 1 do 3 amino-kiselinska ostatka: L2je dugačak 1 do 4 amino-kiselinska ostatka; L3 je dugačak 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka: a Laje dugačak 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka; i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
6. Vezna belančevina slična antitelu.naznačena time.što sadrži dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu kojaje predstavljena sa formulom: a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom: gde: Vi 1 je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca; Vl2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca; Vm je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca: Vh2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca: Ci. je konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca; Cm je konstantni domen iz imunoglobulinskog Cm teškog lanca: a Li, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; pri čemu: Li je dugačak 1 do 3 amino-kiselinska ostatka; 1,2 je dugačak 1 do 4 amino-kiselinska ostatka; L3 je dugačak 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka; a Laje dugačak 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka; i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.
7. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 5 ili 6. naznačena time. što: Li je dugačak 1 do 2 amino-kiselinska ostatka; L2 je dugačak 1 do 2 amino-kiselinska ostatka; L3 je dugačak 4 do 12 amino-kiselinskih ostataka; a Laje dugačak 2 do 12 amino-kiselinskih ostataka.
8. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 5 ili 6. naznačena time. što: Li je dugačak 1 amino-kiselinski ostatak; Lije dugačak 2 amino-kiselinska ostatka; L3 je dugačak 7 amino-kiselinskih ostataka; a Laje dugačak 5 amino-kiselinskih ostataka.
9. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 1. 2. 5, ili 6, naznačena time. što je pomenuta sposobna da specifično veže jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu. preferirano, pomenuti jedan ili više ciljanih antigena su izabrani iz grupe koja obuhvata B7.1. B7.2, BAFF. BlyS, C3. C5. CCL11 (eotaksin). CCL 15 (MlP-ld). CCL 17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MlP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/eotaksin-2). CCL25 (TECK). CCL26 (eotaksin-3). CCL3 (MlP-la), CCL4 (MlP-lb), CCL5 (RANTES). CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20. CD24. CD40, CD40L. CD80, CD86, CDH1 (E-kaderin). hitinazu. CSF1 (M-CSF). CSF2 (GM-CSF). CSF3 (GCSF). CTLA4. CX3CL1 (SCYD1). CXCL12 (SDFl). CXCL13, EGFR, FCER1A. FCER2. HER2, IGF1R. IL-1. IL-12. IL13, IL15, IL17, ILIS, ILIA, IL1B. IL1F10. ILip, IL2. IL4, IL6. IL7. IL8. IL9. IL12/23, IL22, IL23, IL25. IL27. IL35. ITGB4 (b 4 integrin). LEP (leptin), MHC klase II, TLR2. TLR4, TLR5, TNF, TNFa, TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (CD40 ligand),Toll- likereceptore, TREMI, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1). DNGR-KCLEC91), i HMGB1.
10. Vezna belančevina slična antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1. 2, 5. ili 6. naznačena time, što pomenuta belančevina je bispecifična i sposobna da veže dva različita ciljana antigena, pri čemu, preferirano, pomenuta dva različita ciljana antigena su izabrana iz grupe koja obuhvata IL4 i IL13, IGF1R i HER2. IGF1R i EGFR, EGFR i HER2, BK i ILI3. PDL-1 i CTLA-4. CTLA4 i MHC klase II, IL-12 i IL-18. IL-Ia i IL-1J1 TNFa i IL12/23. TNFa i IL-12p40. TNFa i ILlp. TNFa i 1L-23. i IL17 i IL23.
11.Vezna belančevina slična antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1, 2. 5. ili 6.naznačena time,što pomenuta belančevina je sposobna da inhibira deiovanje jednog ili više ciljanih antigena.
12. Vezna belančevina slična antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1. 2, 5, ili 6, naznačena time, što najmanje jedan od linkera izabranih iz grupe koja se sastoji od Li, L2. L3. i L4sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak.
13. Izolovani molekul nukleinske kiseline, naznačentime,što sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira veznu belančevinu sličnu antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1, 2, 5, ili 6.
14. Ekspresioni vektor,naznačen time,što sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 13.
15. Izolovana ćelija domaćina,naznačena time,što sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 13 ili ekspresioni vektor iz zahteva 14. pri čemu, preferirano, pomenuta ćelija domaćin je ćelija sisara ili ćelija insekta.
16. Farmaceutski kompozicija,naznačena time,što sadrži neki farmaceutski prihvatljivi nosilac i terapeutski efektivnu količinu vezne belančevine slične antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1, 2, 5, ili 6.
RS20160678A 2011-03-28 2012-03-28 Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona RS55014B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161468276P 2011-03-28 2011-03-28
FR1160311 2011-11-14
EP12716818.5A EP2691416B1 (en) 2011-03-28 2012-03-28 Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
PCT/US2012/030948 WO2012135345A1 (en) 2011-03-28 2012-03-28 Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55014B1 true RS55014B1 (sr) 2016-11-30

Family

ID=46927552

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160678A RS55014B1 (sr) 2011-03-28 2012-03-28 Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona
RS20210133A RS61399B1 (sr) 2011-03-28 2012-03-28 Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210133A RS61399B1 (sr) 2011-03-28 2012-03-28 Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona

Country Status (32)

Country Link
US (7) US20120251541A1 (sr)
EP (4) EP3112380A1 (sr)
JP (6) JP6023172B2 (sr)
KR (3) KR20230166147A (sr)
CN (3) CN110256568A (sr)
AR (4) AR085726A1 (sr)
AU (1) AU2012236603B2 (sr)
BR (3) BR122022004041B1 (sr)
CA (1) CA2831603C (sr)
CL (1) CL2018001827A1 (sr)
CO (1) CO6781527A2 (sr)
CY (1) CY1118807T1 (sr)
DK (2) DK2691416T3 (sr)
ES (1) ES2588306T3 (sr)
HR (1) HRP20161030T1 (sr)
HU (1) HUE028230T2 (sr)
IL (4) IL299392B2 (sr)
LT (1) LT2691416T (sr)
MA (1) MA35051B1 (sr)
MX (1) MX338907B (sr)
MY (1) MY164906A (sr)
PH (1) PH12013502024A1 (sr)
PL (2) PL2691416T3 (sr)
PT (1) PT2691416T (sr)
RS (2) RS55014B1 (sr)
RU (1) RU2695880C2 (sr)
SG (1) SG193916A1 (sr)
SI (2) SI2691416T1 (sr)
TW (6) TWI743461B (sr)
UY (1) UY33983A (sr)
WO (1) WO2012135345A1 (sr)
ZA (1) ZA201307017B (sr)

Families Citing this family (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
TWI700093B (zh) 2011-03-16 2020-08-01 法商賽諾菲公司 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途
TWI743461B (zh) * 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
AU2012245260B2 (en) 2011-04-22 2016-09-08 Aptevo Research And Development Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
SG11201404850SA (en) 2012-02-13 2014-09-26 Agency Science Tech & Res IL-1β NEUTRALIZING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
FI3366705T3 (fi) 2012-09-12 2023-07-28 Genzyme Corp Muuttuneen glykosylaation ja vähentyneen efektoritoiminnan omaavia fc:n sisältäviä polypeptidejä
WO2014106015A2 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Abbvie, Inc. Multivalent binding protein compositions
US9458244B2 (en) 2012-12-28 2016-10-04 Abbvie Inc. Single chain multivalent binding protein compositions and methods
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
JP2016515093A (ja) * 2013-02-05 2016-05-26 サノフイ 抗体−薬物コンジュゲート療法とともに使用するための免疫イメージング剤
SG10201809779RA (en) 2013-03-11 2018-12-28 Genzyme Corp Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
MX357011B (es) * 2013-03-15 2018-06-22 Amgen Inc Anticuerpos biespecificos heterodimericos.
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI679019B (zh) 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
CN103509117B (zh) * 2013-05-06 2016-03-09 江苏匡亚生物医药科技有限公司 抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途
KR102216088B1 (ko) 2013-07-25 2021-02-15 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법
CN104418947A (zh) * 2013-09-11 2015-03-18 香港大学 抗her2和抗-igf-ir的双特异性抗体及其用途
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US10435453B2 (en) * 2014-02-07 2019-10-08 Mcmaster University Trifunctional T cell-antigen coupler and methods and uses thereof
CN106471010A (zh) 2014-03-19 2017-03-01 建新公司 靶向模块的位点特异性糖工程化
LT3122781T (lt) 2014-03-28 2020-03-25 Xencor, Inc. Bispecifiniai antikūnai, kurie jungiasi prie cd38 ir cd3
CN104974258B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 重组抗hgf/dll4双特异性抗体、其制备方法和应用
US10647777B2 (en) 2014-05-28 2020-05-12 Genzyme Corporation Methods of controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions
TWI745962B (zh) * 2014-06-27 2021-11-11 法商賽諾菲公司 測定投予至人類個體之包括雙-v-區類抗體蛋白或其片段的劑量是否在人類個體中與il-4或il-13特異性結合之方法
PE20170286A1 (es) 2014-07-01 2017-03-30 Pfizer Diacuerpos heterodimericos biespecificos y sus usos
RS58957B1 (sr) * 2014-07-18 2019-08-30 Sanofi Sa Postupak za predviđanje ishoda tretmana sa afliberceptom kod pacijenta za kog se sumnja da boluje od raka
US10669337B2 (en) 2014-07-25 2020-06-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Bispecific anti-CD3 antibodies, bispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
MX388301B (es) * 2014-09-03 2025-03-19 Boehringer Ingelheim Int Il-23a y tnf-alfa orientados y compuesto y sus usos.
EP3799887A1 (en) 2014-10-09 2021-04-07 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
IL252467B (en) 2014-11-26 2022-06-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
TN2017000223A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
WO2016094834A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
JP6621478B2 (ja) * 2014-12-19 2019-12-18 アルカーメス，インコーポレイテッド 一本鎖Ｆｃ融合タンパク質
SMT202400477T1 (it) 2014-12-22 2025-01-14 Systimmune Inc Anticorpi tetravalenti bispecifici e loro procedimenti di fabbricazione e d'uso
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US12428483B2 (en) 2014-12-22 2025-09-30 Systimmune, Inc. Bispecific tetravalent antibodies and methods of making and using thereof
CN114230667A (zh) * 2015-01-23 2022-03-25 赛诺菲 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
TWI733661B (zh) * 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
SG11201707383PA (en) 2015-03-13 2017-10-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
JP7133925B2 (ja) 2015-03-23 2022-09-09 アレクシオン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス濾過
AR104368A1 (es) 2015-04-03 2017-07-19 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-cd20- / anti-baff
DK3302527T3 (da) 2015-06-03 2020-03-30 Medical College Wisconsin Inc Manipuleret CCL20-låst-dimerpolypeptid
US11571462B2 (en) 2015-06-03 2023-02-07 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
JP6839101B2 (ja) * 2015-06-15 2021-03-03 ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ヘテロ二量体多重特異性抗体フォーマット
TWI861413B (zh) 2015-07-23 2024-11-11 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向il-23a與b細胞活化因子(baff)之化合物及其用途
JP2018528218A (ja) 2015-09-11 2018-09-27 アンドリアン、ブルース 組換えグリコシル化エクリズマブおよびエクリズマブ変異体
UA126278C2 (uk) 2015-09-21 2022-09-14 Аптево Рісьорч Енд Девелопмент Ллс Поліпептиди, які зв'язують cd3
EP3359566A1 (en) 2015-10-07 2018-08-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating age-related macular degeneration in a patient
WO2017059900A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen receptors and uses thereof
EP3156417A1 (en) * 2015-10-13 2017-04-19 Affimed GmbH Multivalent fv antibodies
EP3365366B1 (en) 2015-10-25 2021-07-14 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of hiv infection
CN105294863B (zh) * 2015-11-13 2019-01-22 叶才果 双功能抗体及其用途
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
GB201604458D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
JP7195929B2 (ja) * 2016-04-13 2022-12-26 サノフイ 三重特異性および／または三価結合タンパク質
MY192090A (en) 2016-04-13 2022-07-26 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3463461A4 (en) 2016-05-27 2020-05-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis
MA45255A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Xencor Inc Anticorps inhibiteurs de points de contrôle bispécifiques
AU2017291321B2 (en) 2016-06-22 2020-06-18 Alkermes, Inc. Compositions and methods for modulating IL-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
HRP20240474T1 (hr) 2016-08-26 2024-07-05 Sanofi Multispecifična protutijela koja olakšavaju selektivno uparivanje lakog lanca
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP7142630B2 (ja) 2016-10-14 2022-09-27 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαヘテロ二量体ＦＣ－融合タンパク質
US11965884B2 (en) 2016-10-19 2024-04-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of quantitating unbound C5 in a sample
US11828683B2 (en) 2016-10-19 2023-11-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of quantitating unbound C5a in a sample
JP7304288B2 (ja) * 2017-02-17 2023-07-06 サノフイ ジストログリカンおよびラミニン２に対する特異性を有する多特異性結合性分子
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
EP4659808A2 (en) 2017-02-17 2025-12-10 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
WO2018193063A2 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Institute For Research In Biomedicine Novel malaria vaccines and antibodies binding to plasmodium sporozoites
CA3059769A1 (en) * 2017-04-28 2018-11-01 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
WO2018209055A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 David Weiner Optimized nucleic acid antibody constructs
US11168144B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
AR112341A1 (es) 2017-08-02 2019-10-16 Lilly Co Eli ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS ANTI-TNF- / ANTI-IL-23 DE IgG
CA3078800A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Sanofi Anti-cd38 antibodies and methods of use
CA3078637A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University T cell-antigen coupler with y182t mutation and methods and uses thereof
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
JP7765181B2 (ja) 2017-12-19 2025-11-06 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ－２ ｆｃ融合タンパク質
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
WO2019140320A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Genzyme Corporation Methods for the quantitation of polypeptides
EP3743441A1 (en) 2018-01-26 2020-12-02 Genzyme Corporation Fc variants with enhanced binding to fcrn and prolonged half-life
EP3768705A1 (en) * 2018-03-22 2021-01-27 Universität Stuttgart Multivalent binding molecules
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
CN112867734A (zh) 2018-04-18 2021-05-28 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
AU2019355971B2 (en) 2018-10-03 2025-05-08 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
SG11202103478RA (en) 2018-10-09 2021-05-28 Sanofi Sa Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
US20220002393A1 (en) 2018-11-20 2022-01-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis in pediatric patients
GB2583560A (en) 2018-12-11 2020-11-04 Admirx Inc Fusion protein constructs for complement associated disease
JP2022515424A (ja) * 2018-12-24 2022-02-18 サノフイ 突然変異ｆａｂドメインを有する多重特異性結合タンパク質
EP3674316A1 (en) 2018-12-24 2020-07-01 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
CA3124770A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Sanofi Pseudofab-based multispecific binding proteins
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
MA55529A (fr) 2019-04-03 2022-02-09 Genzyme Corp Polypeptides de liaison anti-alpha bêta tcr à fragmentation réduite
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
MX2021012386A (es) * 2019-04-09 2022-01-18 Sanofi Sa Proteínas de union triespecíficas, métodos y usos de las mismas.
EP3980464A1 (en) * 2019-06-07 2022-04-13 Amgen Inc. Bispecific binding constructs with selectively cleavable linkers
US20210024620A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Genzyme Corporation Methods of Treating Antibody-Mediated Disorders with FcRn Antagonists
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
US20220259305A1 (en) 2019-08-05 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis with eculizumab
MX2022001799A (es) * 2019-08-15 2022-03-11 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para fragmentos variables de cadena unica mejorados.
IL292480A (en) 2019-10-25 2022-06-01 Sanofi Sa Methods for the analysis of chain mispairs in multispecific binding proteins
CN114761412B (zh) 2019-11-25 2024-10-11 阿尔克姆斯有限公司 取代的大环化合物和相关治疗方法
JP2023525423A (ja) 2020-01-15 2023-06-16 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
MX2022010538A (es) 2020-02-28 2022-09-21 Genzyme Corp Polipeptidos de union modificados para conjugacion optimizada con farmacos.
CA3173162A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Eli Lilly And Company Multispecific binding proteins and methods of developing the same
JP2023519699A (ja) * 2020-03-30 2023-05-12 サノフイ スプリットｃｈ２ドメイン
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
KR20230166150A (ko) 2020-08-19 2023-12-06 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
IL301330A (en) 2020-09-18 2023-05-01 Ichnos Sciences S A CD47-CD38 bispecific antibodies
US12441786B2 (en) 2020-11-18 2025-10-14 Novartis Ag Bispecific antibodies for use in treatment of NLRC4-GOF inflammasomapathy
US11760747B2 (en) 2020-12-21 2023-09-19 Alkermes, Inc. Substituted piperidino compounds and related methods of treatment
WO2022155340A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Visterra, Inc. Humanized complement 5a receptor 1 antibodies and methods of use thereof
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
US20240190993A1 (en) 2021-04-14 2024-06-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to improve the anti-tumoral activity of macrophages
WO2022219080A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to improve nk cells cytotoxicity
MX2023012902A (es) 2021-05-05 2023-11-08 Immatics Biotechnologies Gmbh Proteinas de union a antigenos que se unen especificamente a prame.
IL308733A (en) 2021-05-27 2024-01-01 Sanofi Sa Fc variant with increased affinity for Fc receptors and improved thermal stability
AU2022283819A1 (en) 2021-06-01 2024-01-04 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
TW202330598A (zh) * 2021-06-30 2023-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 特異性結合ｂａｆｆ和ｉｌ－１２／２３的抗原結合分子及用途
JP2024537827A (ja) * 2021-09-29 2024-10-16 モードエックス セラピューティクス インコーポレイテッド 抗原結合ポリペプチド、抗原結合ポリペプチド複合体、及びｈｉｖにおけるそれらの使用方法
MX2024003807A (es) * 2021-09-29 2024-06-11 Modex Therapeutics Inc Polipeptidos de union a antigeno, complejos de polipeptidos de union a antigeno y metodos de uso de los mismos.
CN118317979A (zh) * 2021-09-29 2024-07-09 摩德斯医疗股份有限公司 抗原结合多肽、抗原结合多肽复合物及其使用方法
KR20240102981A (ko) 2021-11-02 2024-07-03 비스테라, 인크. Fc감마r 및 c1q에 대한 결합이 제거된 fc 변이체
EP4198052A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and antigen binding proteins for use in immunotherapy against fibrolamellar hepatocellular carcinoma (fl-hcc) and other cancers
US20240117030A1 (en) * 2022-03-03 2024-04-11 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
US20240228650A9 (en) 2022-05-06 2024-07-11 Ichnos Sciences SA CD3/BCMA/CD38 Trispecific Antibodies
WO2023222665A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Sanofi Method, system and apparatus for predicting pk values of antibodies
EP4532023A1 (en) 2022-05-27 2025-04-09 Sanofi Natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and bcma variants with fc-engineering
US20240018201A1 (en) 2022-06-08 2024-01-18 Sanofi Methods for purification of multi-specific antibodies
AR130869A1 (es) 2022-10-25 2025-01-29 Ablynx Nv Polipéptidos de variantes de fc diseñados por glicoingeniería con función efectora aumentada
WO2024121311A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 Ichnos Sciences SA Cd47/cd38 bispecific antibodies and methods of use to treat leukemia
WO2024126833A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Ichnos Sciences SA Cd47-il1rap bispecific antibodies
KR20250152101A (ko) 2023-03-13 2025-10-22 하이델베르크 파마 리서치 게엠베하 암 치료에의 사용을 위한 피하 투여 항체-약물 접합체
WO2025027003A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Sanofi Methods and uses for anti-cd38 t cell engagers in treatment of peripheral t-cell lymphomas
JP2025036273A (ja) * 2023-08-30 2025-03-14 ファイザー・インク 多重特異性抗体およびその使用
WO2025088546A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Ablynx N.V. Fc domain variants with enhanced fc receptor binding
WO2025233420A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Use of anti-cancer molecules
WO2026022712A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Sanofi Cereblon ligase modulator and bcma nk cell engager combination therapy

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DK0672142T3 (da) * 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
UA40577C2 (uk) * 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
BR9606706A (pt) * 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6258562B1 (en) 1996-02-09 2001-07-10 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
ES2225961T3 (es) 1996-04-04 2005-03-16 Unilever N.V. Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica.
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
DK2857516T3 (en) * 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
CN1268394C (zh) * 2001-01-17 2006-08-09 特鲁比昂药品公司 结合域－免疫球蛋白融合蛋白
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2004232928A1 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
WO2008157379A2 (en) * 2007-06-21 2008-12-24 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) * 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
ES2628395T3 (es) * 2007-08-15 2017-08-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anticuerpo regulado por proteasa
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
KR20110104032A (ko) * 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
CA2766220C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
TWI700093B (zh) * 2011-03-16 2020-08-01 法商賽諾菲公司 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途
TWI743461B (zh) * 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
US20140213772A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
CN114230667A (zh) * 2015-01-23 2022-03-25 赛诺菲 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
JP7195929B2 (ja) * 2016-04-13 2022-12-26 サノフイ 三重特異性および／または三価結合タンパク質
CA3078800A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Sanofi Anti-cd38 antibodies and methods of use
SG11202103478RA (en) * 2018-10-09 2021-05-28 Sanofi Sa Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
US11613576B2 (en) * 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20120251541A1 (en) 2012-10-04
TWI743461B (zh) 2021-10-21
AR124512A2 (es) 2023-04-05
US20180155450A1 (en) 2018-06-07
TW201808994A (zh) 2018-03-16
EP3199547B1 (en) 2020-11-18
HRP20161030T1 (hr) 2016-10-21
KR101974901B1 (ko) 2019-05-08
BR112013024758B1 (pt) 2022-06-14
TW202317615A (zh) 2023-05-01
DK3199547T3 (da) 2021-02-08
IL228512A0 (en) 2013-12-31
JP2017038607A (ja) 2017-02-23
CA2831603C (en) 2020-07-21
IL299392B1 (en) 2025-06-01
IL228512B (en) 2018-10-31
US20140011238A1 (en) 2014-01-09
SI2691416T1 (sl) 2016-10-28
PH12013502024A1 (en) 2013-12-16
CN110256569B (zh) 2025-01-07
EP2691416B1 (en) 2016-05-18
JP2023100752A (ja) 2023-07-19
US9221917B2 (en) 2015-12-29
JP2018087211A (ja) 2018-06-07
SG193916A1 (en) 2013-11-29
JP7003101B2 (ja) 2022-02-04
AR124511A2 (es) 2023-04-05
CL2018001827A1 (es) 2018-08-31
TW201302786A (zh) 2013-01-16
JP6023172B2 (ja) 2016-11-09
IL299392A (en) 2023-02-01
TWI803876B (zh) 2023-06-01
EP3199547A1 (en) 2017-08-02
IL299392B2 (en) 2025-10-01
BR122022004041B1 (pt) 2022-12-06
PL3199547T3 (pl) 2021-06-14
IL261674A (en) 2018-10-31
AU2012236603B2 (en) 2015-06-18
BR112013024758A2 (pt) 2018-07-10
MX2013011176A (es) 2013-11-01
AU2012236603A1 (en) 2013-04-18
HUE028230T2 (en) 2016-12-28
DK2691416T3 (en) 2016-09-05
US20210189011A1 (en) 2021-06-24
TW201722988A (zh) 2017-07-01
TW201940510A (zh) 2019-10-16
NZ616174A (en) 2015-10-30
WO2012135345A1 (en) 2012-10-04
LT2691416T (lt) 2016-09-12
MY164906A (en) 2018-02-15
IL261673B (en) 2020-06-30
RU2013147821A (ru) 2015-05-20
EP2691416A1 (en) 2014-02-05
AR124513A2 (es) 2023-04-05
TWI622597B (zh) 2018-05-01
JP7273135B2 (ja) 2023-05-12
ZA201307017B (en) 2014-05-28
TWI588156B (zh) 2017-06-21
JP7603739B2 (ja) 2024-12-20
CN103562221A (zh) 2014-02-05
US20130345404A1 (en) 2013-12-26
IL261673A (en) 2018-10-31
TWI838039B (zh) 2024-04-01
JP2022046668A (ja) 2022-03-23
SI3199547T1 (sl) 2021-03-31
MA35051B1 (fr) 2014-04-03
KR102607708B1 (ko) 2023-11-30
EP3805262A1 (en) 2021-04-14
CY1118807T1 (el) 2018-01-10
CN110256568A (zh) 2019-09-20
ES2588306T3 (es) 2016-11-02
KR20140019420A (ko) 2014-02-14
JP6877371B2 (ja) 2021-05-26
UY33983A (es) 2012-10-31
PL2691416T3 (pl) 2016-11-30
MX338907B (es) 2016-05-05
JP2014511684A (ja) 2014-05-19
CN110256569A (zh) 2019-09-20
JP2020058363A (ja) 2020-04-16
CN103562221B (zh) 2019-06-14
EP3112380A1 (en) 2017-01-04
TWI671315B (zh) 2019-09-11
JP6490038B2 (ja) 2019-03-27
PT2691416T (pt) 2016-08-26
CA2831603A1 (en) 2012-10-04
CO6781527A2 (es) 2013-10-31
KR20210042183A (ko) 2021-04-16
US20140056895A1 (en) 2014-02-27
IL261674B (en) 2020-06-30
AR085726A1 (es) 2013-10-23
US9181349B2 (en) 2015-11-10
BR122020011291B1 (pt) 2022-06-14
TW202212358A (zh) 2022-04-01
US20160200811A1 (en) 2016-07-14
KR20230166147A (ko) 2023-12-06
RU2695880C2 (ru) 2019-07-29
RS61399B1 (sr) 2021-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7603739B2 (ja) 交差結合領域の配向性を有する二重可変領域抗体様結合タンパク質
KR102240802B1 (ko) 교차 결합 영역 배향을 갖는 이원 가변 영역 항체-유사 결합 단백질
HK40050601A (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
RU2823693C2 (ru) Антитело-подобные связывающие белки с двойными вариабельными областями, имеющие ориентацию связывающих областей крест-накрест
HK1247929A1 (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
HK1247929B (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
HK1194744B (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
NZ616174B2 (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation