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TWI679019B - 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物 - Google Patents

抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物 Download PDF

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TWI679019B
TWI679019B TW103114922A TW103114922A TWI679019B TW I679019 B TWI679019 B TW I679019B TW 103114922 A TW103114922 A TW 103114922A TW 103114922 A TW103114922 A TW 103114922A TW I679019 B TWI679019 B TW I679019B
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蘇菲 卡瑞翁
Sophie Carayon
歐特曼 柏希夫
Otmane Boussif
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法商賽諾菲公司
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Publication date
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Abstract

本發明係提供安定的醫藥抗體調配物(包括凍乾調配物)，其係包括一抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體和一緩衝系統，其中調配物的pH為約pH 7，且其中該調配物具有低的鹽濃度以便於降低調配物的離子強度。此調配物可視需要進一步包括一非離子界面活性劑、糖及/或非離子安定劑。此等調配物可用於治療各種疾病。

Description

抗IL-4/抗IL-13之雙特異性抗體調配物
本發明係提供安定的醫藥抗體調配物(包括凍乾調配物)，其係包括一抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體和一緩衝系統，其中調配物的pH為約pH 7，且其中該調配物具有低的鹽濃度以便於降低調配物的離子強度。此調配物可視需要進一步包括一非離子界面活性劑、糖及/或非離子安定劑。此等調配物可用於治療各種疾病。
根據IL-4和IL-13的生理功能，其為治療上重要的細胞激素且在許多疾病上(包括氣喘)扮演著重要角色(Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005,Vo.5,161-166)。IL-4已顯示能抑制自體免疫疾病，而IL-4和IL-13二者已顯示促進抗-腫瘤免疫反應之潛在性。因為二種細胞激素係涉及過敏性疾病之發病機制，這些細胞激素的抑制劑應能提供治療利益。
為了開發適合皮下給藥之含有抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體的醫藥調配物，此抗體必須濃縮至約100mg/mL或更高。然而，在此等高濃度下可能引起許多併發難題，包括黏性增加、pH移位、溶液顏色改變及形成可視性和次可視性(sub-visible)粒子。抗體之調配物進一步因其在高濃度下容易聚集之事實而複雜化。當典型的抗體正常係在5℃於4年的時間內形成低於5%高分子量聚集體，而抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係在25℃以每小時介於0.5-1%間的速率及在5℃以每小時0.1%速率形成HMW。實際上，此抗體具有強力的聚集傾向，其無法以目標濃度範圍調配於液體中。最後，抗-IL4/抗-IL13雙特異性抗體具有特別低的等電點，使其因溶解度問題而更難以調配。例如，抗-IL4/抗-IL13雙特異性抗體具有介於5.8至6.2之等電點，而大部分的抗體係具有介於8至10之等電點。
因此，對於可解決這些併發難題之改良和安定的醫藥調配物存有需求。
為了符合此等和其他需求，文中係提供高安定性抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體調配物。令人意外地已發現包括抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體和一緩衝系統之液體和凍乾粉末形式的高安定性抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體調配物，其中調配物的pH為約pH 7，及其中調配物具有低的鹽濃度以便於降低調配物的離子強度。此調配物可視需要進一步包括一非離子界面活性劑、糖及/或非離子安定劑。這些調配物係就習用調配物加以改良，習用調配物其在調配物中抗體的濃度增加時常會導致抗體的分子聚集，及形成可視性和次-可視性粒子。特言之，本發明之調配物就有關可視性粒子、次-可視性粒子、低分子量蛋白及高分子量蛋白上展現良好的安定性。
本發明之一實施例係提供一安定的抗體調配物，其包括：一雙特異性抗-IL-4/抗-IL-13抗體或其抗原結合片段，而該抗體或其抗原結合片段係包括一化學式VL1-連接子-VL2之輕鏈和一化學式VH1-連接子-VH2之重鏈，其中VL1和VH1形成一IL-13抗原結合區而VL2和VH2形成一IL-4抗原結合區；及包括一適合將調配物的pH維持在約pH 7之緩衝系統；且其中該調配物具有低的鹽濃度以便於降低調配物的離子強度。
在特定的實施例中，VL1係包括SEQ ID NO：1之CDR序列；VH1係包括SEQ ID NO：2之CDR序列；VL2係包括SEQ ID NO：3之CDR序列；及VH2係包括SEQ ID NO：4或5之CDR序列。在替代的特定實施例中，VL1係包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；VH1係包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；VL2係包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VH2係包括SEQ ID NO：4或5之胺基酸序列。
在特定的實施例中，輕鏈係包括化學式N-VL1-連接子-VL2-CL，其中CL為一抗體的輕鏈恆定區，及其中重鏈係包括化學式N-VH1-連接子-VH2-CH1-CH2-CH3，其中CH2-CH3係相當於抗體的Fc區。在特定的實施例中，此連接子係包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在特定的實施例中，此抗體或其抗原結合片段進一步係包括一恆定區。在特定的實施例中，此恆定區係由CH1、CH2、CH3和CL組成之群中選出。
在特定的實施例中，此雙特異性抗體或其抗原結合片段為一人源化IgG4雙特異性抗體或其抗原結合片段。
在特定的實施例中，抗體或其抗原結合片段的濃度為約100mg/mL。
在本發明特定的實施例中，此緩衝系統係包括至少二種緩衝劑。在特定的實施例中，此緩衝系統濃度為約10mM。在特定的實施例中，此緩衝系統係包括Tris緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑。在特定的實施例中，此Tris緩衝劑濃度為約3.7mM。在特定的實施例中，此磷酸鹽緩衝劑濃度為約6.3mM。在特定的實施例中，此Tris緩衝劑濃度為約3.7mM及此磷酸鹽緩衝劑濃度為約6.3mM。
在本發明特定的實施例中，此調配物進一步係包括一非離子界面活性劑。在特定的實施例中，非離子界面活性劑濃度為約0.05%至約0.2%(w/v)。在特定的實施例中，此非離子界面活性劑為聚山梨醇酯。在特定的實施例中，此聚山梨醇酯為聚山梨醇酯80。在特定的實施例中，聚山梨醇酯80濃度為約0.05%至約0.2%(w/v)。在特定的實施例中，聚山梨醇酯80濃度為約0.2%(w/v)。
在本發明特定的實施例中，此調配物進一步係包括糖。在特定的實施例中，糖濃度為約5%(w/v)。在特定的實施例中，此糖為一雙糖。在特定的實施例中，此雙糖為蔗糖。在特定的實施例中，蔗糖濃度為約5%(w/v)。
在本發明特定的實施例中，此調配物進一步係包括一非離子安定劑。在特定的實施例中，此非離子安定劑濃度為約1%至約3%(w/v)。在特定的實施例中，此非離子安定劑為胺基酸或糖。在特定的實施例中，此胺基酸為脯胺酸。在特定的實施例中，此糖為甘露醇。在特定的實施例中，脯胺酸濃度為約1%至約3%(w/v)。在特定的實施例中，脯胺酸濃度為約3%(w/v)。在特定的實施例中，甘露醇濃度為約3%(w/v)。
在本發明特定的實施例中，此調配物為一凍乾調配物。
在本發明特定的實施例中，此調配物就有關可視性粒子、次-可視性粒子、低分子量蛋白及高分子量蛋白上展現良好的安定性。
本發明一實施例係提供安定的凍乾抗體調配物，其包括：約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區及包括一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度及約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及約3%(w/v)脯胺酸；其中此調配物的pH為約pH 7。
本發明一實施例係提供安定的凍乾抗體調配物，其包括：約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區及包括一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度及約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及約3%(w/v)甘露醇；其中此調配物的pH為約pH 7。
本發明一實施例係提供一套組，該套組係包括一包含本發明 調配物之容器，以及供投予和使用此調配物之說明書。
本發明一實施例係提供用於治療過敏性疾病、癌症、氣喘、與異常產生IL-4及/或IL-13有關的疾病，或與TH-2媒介的反應升高有關的疾病之方法，其係包括將本發明之調配物投予有此需要的患者。
詳細說明
本發明不限於文中所述之特定的方法、方案、細胞株、載體或試劑，因為在不悖離本發明之精神和範圍下其可改變。再者，文中所用的術語僅為以特定實施例作為例證之目的且不希望限制本發明之範圍。任何類似或相當文中所述之方法和物質皆可用於施行本發明，而文中僅描述示例性方法、裝置和物質。
文中所提及之所有的專利和公開案係以全文引用的方式併入本文中，作為描述和揭示可能與本發明一起使用或於本發明中使用之文中所提出的蛋白、酵素、載體、宿主細胞及方法之目的。然而，其在文中不應解釋為承認本發明無權藉由先前發明而先於此揭示。
定義
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本項技術之一般技術者所正常理解之相同意義。
請注意，除非內容中明確地指出，否則如本說明書和所附的申請專利範圍中所用，單數形式「一」、「此」亦包括複數參照物。
術語「大約」係指特定值或範圍之10%內，及更佳地5%(或1%或更低)之內。
術語「投予」或「給藥」係指注射或另外物理上遞送一存在體外之物質(例如本發明之調配物)至一病患中，例如藉由黏膜、皮內、靜脈內、皮下、肌肉內遞送及/或任何其他文中所述或本項技術中已知的物理性遞送方法。當欲治療一疾病或其癥狀時，物質之投予典型地係在疾病或其癥狀發作之後。當欲預防一疾病或其癥狀時進行，物質之投予典型地係在疾病或其癥狀發作之前進行。
就多肽的情況下，術語「類似物」係指一多肽，其具有與抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽之片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體相似或相同功能，但不一定包括相似或相同的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之胺基酸序列，或具有相同或類似的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之結構。具有相似胺基酸序列之多肽係指一多肽其滿足至少下列之一：(a)與文中所述的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽(例如SEQ ID NO：1-5)、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之胺基酸序列具有至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，及較 佳地至少90%，更佳地至少95%，或最佳地至少99%一致性之多肽；(b)由在嚴格的條件下與編碼至少5個胺基酸殘基，至少10個胺基酸殘基，至少15個胺基酸殘基，至少20個胺基酸殘基，至少25個胺基酸殘基，至少40個胺基酸殘基，至少50個胺基酸殘基，至少60個胺基酸殘基，至少70個胺基酸殘基，至少80個胺基酸殘基，至少90個胺基酸殘基，至少100個胺基酸殘基，至少125個胺基酸殘基或至少150個胺基酸殘基之如文中所述的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其VH或VL區)的核苷酸序列雜交的核苷酸所編碼的多肽(參見，例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Maniatis等人(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；及(c)由與編碼文中所述的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位活抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其VH或VL區)的核苷酸序列具至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，及較佳地至少90%，更佳地至少95%或最佳地至少99%一致性的核苷酸所編碼的多肽。具有與抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體類似結構之多肽係指一多肽，其具有抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體多肽、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性多肽片段、抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性表位或抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之類似的二級、三級或四級結構。多肽之結構可藉由熟習本項技術者已知的方法來測定，包括(但不限於)X-光結晶學、核磁共振和結晶學電子顯微技術。
就測定二個胺基酸序列或二個核苷酸序列之一致性百分比，係將序列以最佳化比較目的對齊(例如，可將缺位導入第一胺基酸序列或核苷酸序列用於與第二胺基酸或和苷酸序列最佳化聯配)。然後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當在第一序列中的一個位置和第二序列中對應位置被相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則此分子 在該位置為一致的。二個序列間之一致性百分比為此等序列所共享的相同位置之數目(亦即，一致性%=相同的重疊位置/位置的總數目X 100%)。在一實施例中，此二種序列具有相同的長度。
測定二個序列間的一致性百分比(例如胺基酸序列或核酸序列)亦可使用數學運算來進行。用於比較二個序列之數學運算的較佳非限定實例為Karlin和Altschul之運算1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264 2268，於Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873 5877修改。此一運算係併入NBLAST和XBLAST程式中，Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403。BLAST核苷酸搜尋可用NBLAST核苷酸程式參數組來進行，例如得分=100，字長=12得到類似所指核酸分子之核苷酸序列。BLAST蛋白搜尋可用XBLAST程式參數組來進行，例如得分=50，字長=3得到類似所指蛋白分子之胺基酸序列。為了得到就比較目的之缺位比對，可如Altschul等人.,1997,Nucleic Acids Res.25：3389 3402中所描述，使用Gapped BLAST。另一種選擇，PSI BLAST可用於進行刪除分子間距離關係之迭代搜尋(Id.)。當利用BLAST時，Gapped BLAST和PSI Blast程式，可使用個別程式的內鍵參數(例如XBLAST和NBLAST)(參見，例如National Center for Biotechnology Information(NCBI)於www.ncbi.nlm.nih.gov上)。另外較佳的，用於序列比較之數學運算的非限定實例為Myers和Miller之運算法，1988,CABIOS 4：11 17。此一運算係併入ALIGN程式中(version 2.0)，其為GCG序列比對套裝軟體之部分。當利用ALIGN程式比較胺基酸序列時，PAM120重量殘基表，可使用12之缺位長度罰值和4之缺位罰值。
二個序列間的一致性百分比可使用類似上述之技術，以有或無允許缺位下來測定。在計算一致性百分比上，典型地僅計算確切的配對數。
「拮抗劑」或「抑制劑」係指能抑制一或多種目標分子之生物活性的分子，例如IL-4及/或IL-13之訊號傳遞。藉由讓被配體活化的細胞失能或將其殺死，及/或藉由干擾受體或配體活化(例如酪胺酸激酶活化)或配體與受體結合後之訊號傳導，拮抗劑可干擾受體與配體之結合且反之亦然。拮抗劑可完全阻斷受體-配體相互作用或實質上可降低此相互作用。在本發明特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為人源化、拮 抗性抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體，較佳地人源化、單株、拮抗性抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體。
術語「抗體」、「免疫球蛋白」或「Ig」在文中可交換使用。術語抗體包括(但不限於)合成抗體、單株抗體、重組產生的抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、內抗體、單鏈Fvs(scFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、駱駝化抗體、Fab片段、F(ab')、二硫化物-連接Fvs(sdFv)、抗-個體基因型(抗-Id)抗體及任何上述之表位結合片段。特言之，抗體係包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫學上活性部分，亦即特異與IL-4或IL-13抗原結合之含有抗原-結合位置之抗原結合區或分子(例如抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之一或多個互補決定區(CDR))。抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體可為任何型式(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或任何亞類(例如IgG2a和IgG2b)之免疫球蛋白分子。在較佳的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為人源化，例如人源化單株抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體。在特定的實施例中，此抗-T抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為IgG抗體，人類IgG4抗體。
術語「抗原」係指能與本發明抗體結合之分子或分子的一部分。一抗原可具有一或一個以上的表位。被本發明抗體所辨識之抗原的實例包括(但不限於)血清蛋白，例如細胞激素，如IL-4、IL5、IL9和IL-13、生物活性多肽、細胞表面分子例如受體、轉運子、離子通道、病毒和細菌蛋白。
術語「抗原結合位置」係指包括特異與部份或所有抗原結合或互補的區域之抗體部分。當抗原較大時，抗體可能僅與抗源的特定部分結合，此部分稱為表位。抗原結合區可藉由一或多個抗體可變區來提供。較佳地，抗原結合區係由抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)結合所構成。
術語「結合劑」係指與IL-4及/或IL-13結合或特異結合之任何分子，例如抗體、siRNA、核酸、適體或小分子有機化合物，或其變體或片段。
術語「雙特異性抗體」或BsAbs係指組合單一分子內二個抗體之抗原結合位置的分子。因此，雙特異性抗體能同時與二個不同的抗原結合。除了診斷目的之應用外，BsAbs藉由將有效的效應子系統重新導向疾病區域或藉由增加中和或刺激抗體活性，為新的治療應用鋪路。雙特異性抗體可為單株的，但較佳地為人類或人源化。製造雙特異性抗體之方法已為本項技術所熟知。
術語「副產物」包括有損或減少治療性/預防性結合劑之比例的不欲的產物，例如在一給予的調配物中之抗體。例如，典型的副產物包括抗體之聚集物、抗體片段例如由去醯胺化或水解之蛋白降解所產生，或其混合物。典型地，聚集物為具有大於單體抗體之分子量的複合物。抗體降解產物可包括，例如抗體片段，例如由去醯胺化或水解所產生的。典型地，降解產物為具有大於單體抗體之分子量的複合物。在IgG抗體的情況下，此等降解產物係低於約150kD。
術語「組成物」和「調配物」希望係涵蓋含有特定成份(例如抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體)，視需要特定量之產品，以及任何直接或間接由特定成份，視需要特定量組合所產生的產品。
術語「恆定區」係指輕鏈和重鏈之羧基端部分，其不會直接涉及抗體與抗原之結合，但具有各種效應子功能，例如與Fc受體相互作用。此術語係指，相對於其他疫球蛋白分子之部分(含有抗原結合位置之可變區)，具有更保守胺基酸序列之免疫球蛋白分子的部分。恆定區係含有重鏈之CH1、CH2和CH3區及輕鏈之CHL區。
術語「病症」係指受益於本發明調配物之治療的任何症狀。此項係包括慢性和急性病症，其包括該等使哺乳動物及特別是人類，易罹患該所指病症之病理症狀。文中所欲治療之病症的非限定實例包括癌症、發炎、自體免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經疾病和代謝疾病。
術語「表位」係指抗原表面上之局部區域，例如IL-4或IL-13多肽或IL-4或IL-13多肽片段，其能與抗體之一或多個抗原結合區結合，且在動物，較佳地哺乳動物，及最佳地人類中具有抗原性或致免疫活性，而能引發免疫反應。具有致免疫活性之表位為在動物中引起抗體反應之一 部份的多肽。具有致免疫活性之表位為與抗體特異結合之一部份多肽，如藉由本項技術中熟知的方法，例如免疫分析所測定。抗原表位不一定需要具有致免疫性。表位通常係由化學活性表面聚合之分子所組成，例如胺基酸或糖側鏈，且具有特定的三維結構特性，以及特定的帶電性特性。形成表位之多肽區可為多肽之鄰近的胺基酸，或此表位可共同來自抗體之二或多個非鄰近的胺基酸區。此表位可為或不可為三-維表面特徵之抗原。在特定的實施例中，IL-4或IL-13表位為三-維表面特徵之IL-4或IL-13多肽。在其他的實施例中，IL-4或IL-13表位為一線性特徵之IL-4或IL-13多肽。抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體可特異與變性形式之IL-4或IL-13的表位、天然形式之IL-4或IL-13表位，或變性和天然形式之IL-4或IL-13二者的表位相結合。
術語「賦形劑」係指通常用於藥物作為稀釋劑、媒劑、防腐劑、結著劑、安定劑等之惰性物質，並包括(但不限於)蛋白(例如，血清白蛋白等)，胺基酸(例如，天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸等)、脂肪酸和磷脂質(例如，烷基磺酸酯、辛酸酯等)、界面活性劑(例如，SDS、聚三梨醇酯、非離子界面活性劑等)、糖類(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻糖等)及多醇類(例如，甘露醇、山梨醇等)。亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，其係以全文引用的方式併入。
在胜肽或多肽之情況，術語「片段」係指包括少於全長胺基酸序列之胜肽或多肽。此一片段可能係由，例如截去胺基端、截去羧基端，及/或刪除胺基酸序列中間的殘基所產生。片段可，例如由替代的RNA剪接或由活體內蛋白酶活性所產生。在特定的實施例中，IL-4或IL-13片段係包括包含與IL-4或IL-13多肽特異結合之IL-4或IL-13多肽或抗體之至少5個鄰近的胺基酸殘基、至少10個鄰近的胺基酸殘基、至少15個鄰近的胺基酸殘基、至少20個鄰近的胺基酸殘基、至少25個鄰近的胺基酸殘基、至少40個鄰近的胺基酸殘基、至少50個鄰近的胺基酸殘基、至少60個鄰近的胺基酸殘、至少70個鄰近的胺基酸殘、至少80個鄰近的胺基酸殘、至少90個鄰近的胺基酸殘、至少100個鄰近的胺基酸殘基及，至少125個鄰近的相鄰胺基酸殘基，至少150個鄰近的相鄰的胺基酸殘基，至少175個 鄰近的相鄰胺基酸殘基，至少200個鄰近的胺基酸殘基，或至少250個鄰近的胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽。
詞語和術語抗體或抗原之「功能性片段、變體、衍生物或類似物」等等，以及其形式，為具有與所指之全長抗體或抗原共通的質性上生物活性之化合物或分子。例如，抗-IL-4抗體之功能性片段或類似物為一可與IL-4分子結合或可防止或實質上降低配體能力者，或與IL-4結合之促效性或拮抗性抗體。
術語「重鏈」當用於有關抗體時係指五種不同的類型，以重鏈恆定區的胺基酸為基準，稱為阿爾法(α)、德爾塔(△)、艾蒲賽龍(ε)、伽瑪(γ)和繆(μ)。這些不同類型的重鏈已為本項技術所熟知並分別產生五種抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四種亞類，亦即IgG1、IgG1、IgG3和IgG4。較佳地，此重鏈為人類重鏈。
術語「絞鏈」或「絞鏈區」係指包括抗體之第一和第二恆定區間的胺基酸之柔韌多肽。
非人類抗體之「人源化」形式為嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其部份(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗體之靶-結合的子序列)，相較於人類抗體，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之序列。一般而言，人源化抗體將包括實質上全部一個，及典型地二個可變區，其中全部或質實上全部CDR區係相當該等非人類免疫球蛋白，及全部或實質上全部FR區為該等人類免疫球蛋白模板序列。人源化抗體亦可包括至少一部份的免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地所選的人類免疫球蛋白模板之恆定區。一般而言，目的係使抗體分子在人類中為輕微致免疫性。因此，在無實質上減少一或多個CDR與IL-4及/或IL-13之特異結合功能下，可將一或多個CDR中的一或多個胺基酸改變成對人類宿主較低致免疫性的胺基酸，為可能的。另一種選擇，FR可為非人類的，但該等大部份致免疫性的胺基酸係以較低致免疫性的胺基酸置換。然而，CDR嫁接，如上所論述，並非唯一得到人源化抗體之方法。例如，只修改CDR區可能不夠，因為對於框架殘基參與決定CDR環之三-維結構和抗體對其配體之整體親和力為常見的。因此，可施用任何方法，以便於將非人類親代抗體分子修改成對人類致免性較低，而與人類抗體全局序列一致性並非一定必要。所以，人源化亦可，例如僅藉 由一些殘基之取代來進行，特別是該等暴露在抗體分子上而非隱藏在分子內，且因此不易影響宿主免疫系統的殘基。參見，例如Studnicka等人，Prot Eng 7(6)805-814,1994；Mol Imm 44：1986-1988,2007；Sims等人，J Immunol 151：2296(1993)；Chothia等人，J Mol Biol 196：901(1987)；Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285(1992)；Presta等人，J Immunol 151：2623(1993),WO 2006/042333和美國專利第5,869,619號。另一種選擇，抗體亦可藉由其他技術加以人源化，包括CDR嫁接(EPO 0 239 400；WO 91/09967；和美國專利第5,530,101和5,585,089號)，鑲飾或表面重修(EPO 0 592 106；EPO 0 519 596；Padlan,1991,Molec Imm 28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Prot Eng 7(6)：805-814；和Roguska等人，1994,PNAS 91：969-973)和鏈改組(美國專利第5,565,332號)。人類抗體可藉由各種本項技術中已知的方法來製造，包括(但不限於)噬菌體表現法，參見美國專利第4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318號；及WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，使用基因轉植動物，例如嚙齒類，使用嵌合細胞等等。
「介白素-4」(IL-4)係關於天然生成或內源性哺乳動物IL-4蛋白及具有與天然生成或內源性對應哺乳動物IL-4蛋白相同胺基酸序列之蛋白{例如，重組蛋白、合成蛋白(亦即使用合成有機化學法所製造)}。因此，如文中所定義，此術語包括成熟的IL-4蛋白、多形態或等位基因變體，及其他IL-4同型和前述之修飾或非修飾型(例如脂質化，糖基化)。天然生成的或內源性IL-4包括野生型蛋白例如成熟的IL-4、多形態或等位基因變體，及其他同型和哺乳動物中天然生成的突變型(例如，人類、非人類靈長類)。此等蛋白，例如可從天然產生的IL-4來源中回收或分離。這些蛋白和具有與天然生成或內源性對等IL-4相同基酸序列的蛋白，係以對應的哺乳動物之名稱來命名。例如，當對應的哺乳動物為人類時，此蛋白係稱為人類IL-4。數種突變的IL-4蛋白已為本項技術所知，例如該等揭示於WO 03/038041中之蛋白。
「介白素-13」(IL-13)係指天然生成或內源性哺乳動物IL-13蛋白及具有與天然生成或內源性對應哺乳動物IL-13蛋白相同胺基酸序列之蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白(亦即使用合成有機化學法所製造))。因 此，如文中所定義，此術語包括成熟的IL-13蛋白、多形態或等位基因變體，及其他IL-13同型(例如藉由替代的剪接或其他細胞處理所製造)和前述之修飾或非修飾型(例如脂質化，糖基化)。天然生成的或內源性IL-13包括野生型蛋白例如成熟的IL-13、多形態或等位基因變體，及其他同型和哺乳動物中天然生成的突變型(例如，人類、非人類靈長類)。例如，如文中所用IL-13係涵蓋人類IL-13變體，其中成熟的人類IL-13之110位置的Arg係被Gin取代(成熟的IL-13之110位置相當於前驅蛋白的130位置)，其係與氣喘有關(異位性和非異味性氣喘)，以及其他IL-13之變體(Heinzmann等人，Hum MoI Genet.9：549-559(2000))。此等蛋白，例如可從天然產生的IL-13來源中回收或分離。這些蛋白和具有與天然生成或內源性對等IL-13相同基酸序列的蛋白，係以對應的哺乳動物之名稱來命名。例如，當對應的哺乳動物為人類時，此蛋白係稱為人類IL-13。數種突變的IL-13蛋白已為本項技術所知，例如該等揭示於WO 03/035847中之蛋白。
「分離的」或「純化的」結合劑，例如抗體為實質上無細胞物質或其他來自細胞或來自結合劑所衍生之組織來源的汙染蛋白，或當由化學合成時，其實質上無化學前驅物或其他化學物質。例如，「實質上無細胞物質」一詞包括抗體之製備物，其中該抗體係由從其分離或重組製造之細胞的細胞組份所分離。因此，實質上無細胞物質之抗體係包括具有低於約30%、20%、10%或5%(重量比)之異源蛋白(文中亦稱為「汙染蛋白」)的抗體製備物。當此抗體係重組產生時，其亦較佳地係實質上無培養基，亦即培養基係低於約20%、10%或5%之蛋白製備物的容量。當此抗體係由化學合成所製造時，其較佳地係實質上無化學前驅物或其他化學物，亦即其與涉及此蛋白合成的化學前驅物或其他化學物分開。因此，此等抗體製備物係具有低於約30%、20%、10%、5%(乾重比)之化學前驅物或相關抗體以外的化合物。在一較佳的實施例中，抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係經分離或純化。
術語「Kabat編號」及類似術語已被本項技術所承認並係指比抗體或其抗原結合蛋白之重鏈和氫鏈可變區的其他胺基酸殘基更可變(亦即高可變)的胺基酸殘基之編號系統(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391及Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。就重鏈可變區，此高變區典型地範圍係從CDR1之31至35的胺基酸位置，CDR2之50至65的胺基酸位置，CDR3之95至102的胺基酸位置。就輕鏈可變區，此高變區典型地範圍係從CDR1之24至34的胺基酸位置，CDR2之50至56的胺基酸位置，CDR3之89至97的胺基酸位置。
術語「輕鏈」當用於有關抗體時係指二種不同的類型，以輕鏈恆定區的胺基酸為基準，稱為(κ)和(λ)。輕鏈胺基酸序列已為本項技術所熟知。在較佳的實施例中，此輕鏈為人類輕鏈。
術語「連接子」係指連接抗體之抗原結合區的分子。此連接子可為任何種類的連接子分子。較佳地，此連接子為一多肽。在重鏈多肽和輕鏈多肽之間和之內的連接子彼此可相同或不同。再者，此連接子可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之長度。如用於輕鏈區，用於重鏈之較佳的胜肽連接子單位為(G4S)2，亦即GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。重鏈和輕鏈之連接子單位的數目可相同(兩邊對稱的順序)或彼此不同(不對稱順序)。胜肽連接子較佳地係具足夠的長度以提供適當的柔韌度使抗原結合基團免於彼此活性的干擾，例如藉由位阻現象，以允許適當的蛋白摺疊，且若需要，讓抗體分子，可能地寬距，與一或多個在相同細胞上的受體相互作用；又其較佳地係夠短而得以讓抗體基團在細胞中仍為穩定的。因此，胜肽連接子之長度、組成及/或構形可由熟習本項技術者容易地選擇，以使多價抗體之所欲的性質最適化。
術語「低鹽」和「低鹽濃度」係指15mM或更低之相對低的鹽濃度，包括0之鹽濃度或無鹽。鹽濃度係以調配物中鹽類和緩衝劑之量來決定。較佳的，此緩衝系統係以低濃度，亦即約15mM或更低之低濃度存在於調配物中，以便於減低調配物之離子強度。另一種選擇，某些較佳的實施例不含有鹽和緩衝劑。亦較佳的，無添加另外的鹽類，例如NaCl至調配物中，以保持調配物盡可能低的離子強度。
術語「管理(manage)」係指患者由治療(例如，預防或治療劑)所衍生的有利效用，其不會使得罹病痊癒。在特定的實施例中，係將一 或多種治療(例如，預防或治療劑，例如本發明調配物)投予一患者，用以「管理」IL-4或IL-13-媒介的疾病(例如癌症、發炎、自體免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經疾病和代謝疾病)，或其一或多種癥狀，而得以阻止此疾病的進展或惡化。
術語「單株抗體」係指得自同源或實質上同源抗體之族群的抗體，且各單株抗體典型地將被認為是此抗原上的單一表位。在較佳的實施例中，「單株抗體」為由單一雜交瘤或其他細胞所產生的抗體。術語「單株」不限於任何特定的製造此抗體之方法。例如，單株抗體可藉由如Kohler等人；Nature,256：495(1975)中所述之雜交瘤方法來製造，或可從噬菌體庫分離。其他製備選殖細胞株和藉此表現的單株抗體之方法已為本項技術所熟知(參見，例如第11章中：Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.；Ausube等人，eds.,John Wiley and Sons,New York)。
術語「醫藥組成物」如本發明中所用係指各種製備物之調配物。含有治療上有效量之抗體的調配物為無菌液體溶液、液體懸浮液或凍乾物及視需要含有安定劑或賦形劑。
術語「醫藥上可接受」係指經聯邦或州政府管理當局核准，或列於美國藥典、歐洲藥典或其他一般所知道之藥典中供用於動物，更特言之用於人類。
術語「醫藥上可接受賦形劑」係指與活性分子例如單株抗體組合，供製備一適合或方便劑型之任何惰性物質。「醫藥上可接受賦形劑」為一在所用的劑量和濃度時對接受者無毒性，且係與包括單株抗體之調配物的其他成份相容。
術語「防止」係指因給予文中所提供的治療或治療組合(例如，預防或治療劑之組合，例如本發明調配物)所導致之完全或部份抑制IL-4或IL-13-媒介的疾病及/或其相關癥狀的發展、再發生、發作或擴散。
術語「預防藥劑」係指可於一患者中完全或部份抑制IL-4或IL-13-媒介的疾病及/或其相關癥狀的發展、再發生、發作或擴散之任何藥劑。在特定的實施例中，術語「預防藥劑」係指本發明調配物。在特定的其他實施例中，術語「預防藥劑」係指本發明調配物以外的藥劑。較佳地，預防藥劑為已知用於或已用於或目前正用於防止IL-4或IL-13-媒介的 疾病及/或其相關癥狀，或阻止IL-4或IL-13-媒介的疾病及/或其相關癥狀之發作、發展、進程及/或嚴重度。在特定的實施例中，此預防藥劑為人源化抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體。
「重組抗體」一詞包括藉由重組方法所製備、表現、創造或分離之人類抗體，例如使用重組表現載體轉染至宿主細胞所表現的抗體，或由重組的、組合的人類抗體庫所分離的抗體，由人類免疫球蛋白基因之基因轉殖及/或轉染色體的動物(例如小鼠或牛)所分離的抗體(參見，例如，Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或藉由任何涉及人類免疫球蛋白基因與其他DNA序列剪接之其他方法所製備、表現、創造或分離之抗體。此等重組的人類抗體可具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區(參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。在特定的實施例中，然而，此等重組的人類抗體係於活體外進行突變(或當使用人類Ig序列之動物基因轉殖時，為活體內體細胞突變)且因此當係由人類生殖系VH和VL序列所衍生或與其相關時，重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列可能為非天然存在於活體內人類生殖系儲庫之序列。
術語「糖類」係指一種分子其為多元醇之衍生物。糖類通常係稱為碳水化合物且可含有不同量的糖單元，例如單糖、雙糖和多糖。
術語「特異結合」係指與抗原或其片段特異結合且不會與其他的抗原特異結合。例如，特異與抗原結合之抗體可以較低的親和力與其他多肽結合，如以例如，放射免疫分析(RIA)、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或其他本項技術中已知的分析所測定。特異與抗原結合之抗體或其變體或片段可與相關的抗原交叉反應。較佳地，特異與抗原結合之抗體或其變體或片段不會與其他抗原交叉反應。特異與IL-4及/或IL-13抗原結合之抗體或其變體或片段可藉由，例如免疫分析、BIAcore或其他熟習本項技術者已知的技術來鑑別。典型地，特異或選擇性反應將為至少二倍背景訊號或雜音，且更典型地為大於10倍背景。參見，例如，Paul,ed.,1989,Fundamental Immunology Second Edition,Raven Press,New York於第332-336頁就有關抗體特異性之論述。
「安定」或「安定化」調配物為其中結合劑，例如抗體，於儲存時在其中必須保留其物理安定性、特性、完整性及/或化學安定性、特性、完整性，及/或生物活性。各種用於測量蛋白安定性之分析技術在本項技術中為可取得的並例如審閱Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。安定性可在選擇的溫度及其他儲存條件下歷經一段選擇的時間來測量。安定性可藉由至少一種由下列組成之群中選出的方法來測定：目測檢查、SDS-PAGE、IEF、HPSEC、RFFIT及κ/λ ELISA。例如，若在目測檢查顏色及/或澄清度，或以UV光分散、SDS-PAGE或以(高壓)粒徑篩析層析(HPSEC)測量時，其顯示無聚集、沉澱及/或變性之現象，則抗體在醫藥調配物中係「保留其物理安定性」。較佳地，當使用本發明調配物時，如由HPSEC或任何用於測量聚集形成之適合的方法所測量，係有5%或更低，典型地4%或更低，較佳地3%或更低，更佳地2%或更低，及特別式1%或更低的抗體形成聚集物。例如，在特定調配物中於特定的儲存條件下經過一段特定的預定時間後，若抗體單體具有約90%，較佳地約95%，特別是約98%之純度，則抗體在一特定的調配物中係視為安定的。化學安定性可藉由偵測和定量化學上改變的蛋白形式來評估。化學改變可能涉及大小修改(例如剪裁)，其可使用，例如(HP)SEC、SDS-PAGE及/或介質輔助雷射脫附離子化/飛行時間質譜(MALDI/TOF MS)來評估。其他類型的化學改變包括電荷改變(例如，因去醯胺化所產生)，其例如可藉由離子交換層析來評估。若在一給予的時間抗體之生物活性，例如如抗原分析或病毒中和分析中所測定，為至少約90%(在分析的誤差內)之醫藥調配物在製備時所展現的生物活性，則抗體在一給予的時間於醫藥調配物中係「保留其生物活性」。
術語「患者(subject)」和「病患(patient)」係交換使用。如中所述，一患者較佳地為一哺乳動物，例如非靈長類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類(例如，猴子和人類)，最佳地為人類。在一實施例中，此患者為患有IL-4及/或IL-13-媒介疾病之哺乳動物，較佳地人類。在另外的實施例中，此患者為處於發生IL-4及/或IL-13-媒介疾病風險之哺乳動物，較佳地人類。
「實質上一致」一詞有關抗體鏈多肽序列可解釋為與參照抗體序列具有至少70%、80%、90%、95%或更高序列一致性之抗體鏈。有關核酸序列之術語可解釋為與參照核酸序列具有至少85%、90%、95%或97%或更高序列一致性之核苷酸序列。
「替代的」變體為該等在天然的序列中具有至少一胺基酸殘基移除或被不同的胺基酸置換，插入其相同的位置。取代可為單一的，其中在分子中僅有一個胺基酸被取代，或可為多重的，其中在相同分子中之二或多個胺基酸係經取代。多數個取代可在連續的位置。又，一個胺基酸可經多數個殘基取代，在該情況下此一變體係包括取代和插入二者。「插入的」變體為該等一或多個胺基酸係緊鄰一胺基酸插入至天然序列中的特定位置。緊鄰一胺基酸係指以胺基酸之α-羧基或α-胺基功能基相連接。「刪除的」變體為該等在天然胺基酸序列中移除一或多個胺基酸。一般，刪除的變體將在分子的特定區域具有一或多個胺基酸刪除。
術語「治療上有效量」係指治療(例如本發明調配物)之量其係足以降低及/或改善一特定疾病之嚴重性及/或時間及/或其相關癥狀。此術語亦涵蓋用於降低或改善特定疾病之進展或進程，降低或改善特定疾病之發生、進展和發作，及/或改善或增進另外的治療(例如本發明調配以外的治療)之預防性或治療性效用所需的量。在某些實施例中，本發明抗體之治療上有效量係提供介於約5至20ng/ml，較佳地介於約10至20ng/ml之局部濃度。在某些實施例中，「治療上有效量」如文中所用係指用於達到特定結果(例如抑制IL-4及/或IL-13細胞激素)之本發明抗體的量。
術語「治療劑」係指可用於治療、管理或改善IL-4及/或IL-13-媒介疾病及/或其相關癥狀之任何藥劑。在特定的實施例中，術語「治療劑」係指本發明調配物。在特定的其他實施例中，術語「治療劑」係指本發明調配物以外的藥劑。較佳地，治療劑為一已知可用於，或已用於或目前正用於治療管理或改善IL-4及/或IL-13-媒介疾病或一或多種其相關癥狀之藥劑。
術語「治療(therapy)」係指任何可用預防、管理、治療及/或改善IL-4及/或IL-13-媒介疾病(例如癌症、發炎、自體免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經疾病和代謝疾病)之方案、方法及/或藥劑。在 特定的實施例中，術語「治療」係指可用預防、管理、治療及/或改善熟習本項技術者(例如醫療人員)已知的IL-4及/或IL-13-媒介疾病之生物性治療、支持性治療及/或其他治療。
術語「治療(treat)」係指由給予一或多種治療(包括，但不限於給予一或多種預防性或治療性藥劑，例如本發明調配物)所產生之減低或改善IL-4及/或IL-13-媒介疾病(例如癌症、發炎、自體免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經疾病和代謝疾病)的進程、嚴重性及/或期間。
術語「可變區」係指輕鏈和重鏈之一部份，典型地在重鏈中約胺基端120至130個胺基酸及在輕鏈中約100至110個胺基酸，其在抗體中的序列大不相同且係用於結合及各特定抗體對其特定抗原之特異性。序列的可變性係集中在該等稱為互補決定區(CDR)之區域，而可變區中更高度保守區域係稱為架構區(FR)。輕鏈和重鏈的CDR主要係負責抗體與抗原之相互作用。胺基酸位置的編號係根據EU索引，如Kabat等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department of Health and Human Services,Washington D.C.)5th ed.("Kabat et al.")。在較佳的實施例中，此可變區為一人類可變區。
B.調配物和調配物組份
如前面所述，本發明調配物係包括一抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體和一緩衝系統，其中此調配物之pH為約pH 7，及其中此調配物具有低的鹽濃度以便於降低調配物之離子強度。調配物可視需要進一步包括一非離子界面活性劑、糖及/或一非離子安定劑。已發現本發明調配物係提供優於先前抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體調配物之顯著改良，其中先前的調配物其在調配物中抗體濃度增加時常導致抗體之分子聚集，及形成可視性和次可視性粒子。特言之，本發明之調配物就有關可視性粒子、次-可視性粒子、低分子量蛋白及高分子量蛋白上展現良好的安定性。
i.抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體及其變體和片段
在特定的實施例中，本發明調配物係包括一抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體。此雙特異性抗體係與IL-4及/或IL-13或其變體或片段結合 或特異結合。此IL-4及/或IL-13分子可來自任何物種。較佳地，此IL-4及/或IL-13分子係來自人類。IL-4和IL-13之胺基酸序列和蛋白結構已為本項技術所熟知。
在特定的示例性實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為人源化抗體、全人類抗體或其變體或其抗原結合片段。較佳的抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係防止IL-4和IL-13與其受體結合，及抑制IL-4和IL-13生物活性。
在一特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-13相結合之輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：1胺基酸序列(加底線係表示胺基酸作改變，粗體字係表示CDR)。
抗-IL13 hB-B-13 VH3(SEQ ID NO：1)：
Figure TWI679019B_D0001
在一特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-13相結合之重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：2胺基酸序列(加底線係表示胺基酸作改變，粗體字係表示CDR)。
抗-IL13 hB-B-13 VH2(SEQ ID NO：2)：
Figure TWI679019B_D0002
在一特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-4相結合之輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：3胺基酸序列(加底線係表示胺基酸作改變，粗體字係表示CDR)。
抗-IL4 h8D4-8 VL1(SEQ ID NO：3)：
Figure TWI679019B_D0003
在一特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-4相結合之重鏈可變區(VH)，其係包括SEQ ID NO：4胺基酸序列(加底線係表示胺基酸作改變，粗體字係表示CDR)。
抗-IL4 h8D4-8 VH1(SEQ ID NO：4)：
Figure TWI679019B_D0004
在另外特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-4相結合之重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：5胺基酸序列(加底線係表示胺基酸作改變，粗體字係表示CDR)。
抗-IL4 h8D4-8 VH2(SEQ ID NO：5)：
Figure TWI679019B_D0005
在某些特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-13相結合之重鏈可變區，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：2胺基酸序列；及一與IL-13相結合之輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：1胺基酸序列。
在其他特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-4相結合之重鏈可變區，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：4胺基酸序列；及一與IL-4相結合之輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：3胺基酸序列。
又在其他特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-4相結合之重鏈可變區，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：5胺基酸序列；及一與IL-4相結合之輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：3胺基酸序列。
在更特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括一與IL-13和IL-4相結合之重鏈可變區，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：2和4，或2和5胺基酸序列；及一與IL-13和IL-4 相結合之輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：1和3胺基酸序列。
在最特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係包括一與IL-13和IL-4結合之重鏈可變區，該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：2和4胺基酸序列；及一與IL-13和IL-4相結合之輕鏈可變區，該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：1和3胺基酸序列(前導抗體(Lead Antibody))。此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之實施例的示意圖係如圖1中所示，而示例性重鏈和輕鏈可變區係如圖2所示。前導抗體之分子量如質譜所測定為198kDa。前導抗體之等電點，如等電點聚焦所測，範圍係介於5.8至6.2。
在替代最特定的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係包括化學式VL1-連接子-VL2之輕鏈和化學式VH1-連接子-VH2之重鏈，其中VL1和VH1係形成IL-4抗原結合區而VL2和VH2係形成IL-13抗原結合區。在某些實施例中，VL1包括SEQ ID NO：1之CDR序列；VH1包括SEQ ID NO：2之CDRV序列；VL2包括SEQ ID NO：3之CDR序列；及VH2包括SEQ ID NO：4或5之CDR序列。在替代的實施例中，VL2包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；VH2包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；VL1包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VH1包括SEQ ID NO：4或5之胺基酸序列。
在某些實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段係在抗體之抗原結合區之間包括一連接子。此連接子可為任何種類的連接子分子。較佳地，此連接子為一多肽。在重鏈多肽和輕鏈多肽之間和之內的連接子彼此可相同或不同。再者，此連接子可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之長度。如用於輕鏈區，用於重鏈之較佳的胜肽連接子單元為(G4S)2，亦即GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。最佳地，SEQ ID NO：2和4係藉由一第一胜肽連接子連結一起，其中該第一和第二胜肽連接子各自包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。重鏈和輕鏈之連接子單元的數目可相同(兩邊對稱的順序)或彼此不同(不對稱順序)。胜肽連接子較佳地係具足夠的長度以提供適當的柔韌度來使抗原結合基團免於彼此活性的干擾，例如藉由位阻現象，以允許適當的蛋白摺疊，且若需要，讓抗體分子，可能地寬距，與一 或多個在相同細胞上的受體相互作用；又其較佳地係夠短而得以讓抗體基團在細胞中仍為穩定的。因此，胜肽連接子之長度、組成及/或構形可由熟習本項技術者容易地選擇，以使多價抗體之所欲的性質最適化。
在本發明一較佳的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段為一人源化抗體。人源化抗體同型之實例包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。較佳地，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為一IgG抗體。有四種形式的IgG。較佳地，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為一IgG4抗體。在本發明一更佳的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體為人源化IgG4抗體。
在某些實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段進一步係包括一恆定區，例如CH1、CH2、CH3和CL。
本發明調配物之特定的實施例亦包括抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其抗原結合片段之變體。抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之變體基於其高度相似性可具有類似的生理化學性質，且因此亦包括在本發明範圍內。變體係定義為帶有與抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體至少95%，較佳地至少97%，例如至少98%或99%之同源胺基酸序列，且能競爭與IL-4及/或IL-13多肽、IL-4及/或IL-13多肽片段或IL-4及/或IL-13表位結合之抗體。較佳地，此等變體將改善、中和或另外抑制IL-4及/或IL-13生物活性。測定與目標結合之競爭可藉由熟習本項技術者已知的例行方法來進行。較佳地，此等變體為人類或人源化抗體，及較佳地為IgG4分子。在較佳的實施例中，變體在胺基酸序列上係至少90%、95%、96%、97%、98%或99%與結合IL-13和IL-4包含SEQ ID NO：2、4和5之胺基酸序列的重鏈可變區；及結合IL-13和IL-4包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區一致。術語「變體」係指包括一胺基酸序列之抗體，其中此胺基酸序列，相較於抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之胺基酸序列，係具有一或多個胺基酸改變。此變體可具有保守性序列修飾，包括胺基酸取代、修飾、添加和刪除。
修飾之實例包括(但不限於)糖基化、乙醯基化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、以已知的保護/阻斷基團衍生化、蛋白分解性裂解以及連結細胞配體或其他蛋白。胺基酸修飾可藉由本項技術中已知的標準技術來 進行，例如定點突變、分子選殖、寡核苷酸定向突變以及編碼抗體之核酸中隨機PCR-媒介的突變。保守性胺基酸取代包括其中胺基酸殘基係經具有類似結構或化學性質之胺基酸殘基所置換。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在本項技術中已有定義。這些家族包括帶有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如，天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性側鏈(例如，天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)，非極性側鏈(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫銨酸)，β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。熟習技術者應明瞭，亦可使用上述所用以外的胺基酸殘基家族種類。再者，一變體可能具有非保守性胺基酸取代，例如，以具有不同結構或化學性質之胺基酸殘基取代一胺基酸。類似的小變異亦可包括胺基酸刪除或插入或二者。測定哪一個胺基酸殘基可能被取代、修飾、插入或刪除而不會消除免疫活性之指南，可使用本項技術中熟知的電腦程式來尋找。電腦運算法例如，其中包括，Gap或Bestfit，其已為熟習本項技術者所知，可用於最佳化對齊胺基酸序列進行比較並定義類似或相同的胺基酸殘基。相較於抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體，變體可具有相同或不同，更高或更低的結合親和力，但仍能特異與IL-4及/或IL-13結合，且可具有與抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體相同、更高或更低的生物活性。
本發明之實施例亦包括抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之抗原結合片段。術語「抗原結合區」、「抗原結合片段」及類似術語係指包括與抗原相互作用及授予結合劑其對抗原的特異性和親和力之胺基酸殘基的抗體部份(例如，互補決定區(CDR))。抗原結合區可衍生自任何動物物種，例如嚙齒類(例如，兔、大鼠或倉鼠)和人類。較佳地，此抗原結合區應為人類來源。抗原結合片段之非限定實例包括：Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)分子、dAb片段及由模擬抗體之高可變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位。
在本發明較佳的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其變體或其抗原結合片段)將能改善、中和或其他抑制活體內IL-4及/或IL-13生物活性。
在本發明較佳的實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其變體或其抗原結合片段)為改善、中和或其他抑制活體內IL-4及/或IL-13生物活性之結抗劑抗體。
鑑別、分離、製備和定性與IL-13和IL-4結合之抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體或其變體或片段，包括包含一重鏈可變區和一輕鏈可變區之抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體，其中該重鏈可變區係包括SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列，而該輕鏈可變區係包括SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列，已詳述描述於PCT公開案WO 2009/052081中，其係以引用的方式併入本文中。
較佳地，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其變體或其抗原結合片段)係以從約5mg/mL至約200mg/mL，例如約50mg/mL至約150mg/mL，約75mg/mL至約125mg/mL和約100mg/mL之量存在調配物中。另一種選擇，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體(或其變體或其抗原結合片段)係以從約5mg/mL至約65mg/mL，約66mg/mL至約130mg/mL，約131mg/mL至約200mg/mL之量存在調配物中。例如，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體可以從約5mg/mL，約10mg/mL，約15mg/mL，約20mg/mL，約25mg/mL，約30mg/mL，約35mg/mL，約40mg/mL，約45mg/mL，約50mg/mL，約55mg/mL，約60mg/mL，約65mg/mL，約70mg/mL，約75mg/mL，約80mg/mL，約85mg/mL，約90mg/mL，約95mg/mL，約100mg/mL，約105mg/mL，約110mg/mL，約115mg/mL，約120mg/mL，約125mg/mL，約130mg/mL，約135mg/mL，約140mg/mL，約145mg/mL，約150mg/mL，約155mg/mL，約160mg/mL，約165mg/mL，約170mg/mL，約175mg/mL，約180mg/mL，約185mg/mL，約190mg/mL，約195mg/mL或約200mg/mL之量存在調配物中。。
在特定的示例實施例中，此抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係以約100mg/mL之量存在調配物中。在另外的示例實施例中，人源化IgG4抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體，其包括包含SEQ ID NO：2和4，或2和5之胺基酸序列之與IL-13和IL-4結合的重鏈可變區；包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列之與IL-13和IL-4結合的輕鏈可變區，係以約100mg/mL之量存在調配物中。
ii.緩衝劑、緩衝系統、離子強度和pH
緩衝劑係幫助將調配物之pH維持在大約生理條件的範圍內。緩衝劑較佳地係以範圍從約1mM至約50mM之濃度存在調配物中。適合用於本發明之緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽類，例如檸檬酸鹽緩衝劑(例如，檸檬酸二氫鈉-檸檬酸二鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸二氫鈉混合物等)，琥珀酸鹽緩衝劑(例如，琥珀酸-琥珀酸二氫鈉混合物，琥珀酸-氫氧化鈉混合物，琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)，酒石酸鹽緩衝劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物，酒石酸-酒石酸鉀混合物，酒石酸-氫氧化鈉混合物等)，延胡索酸鹽緩衝劑(例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物，延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物，延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物等)，葡萄糖酸鹽緩衝劑(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物，葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)，草酸鹽緩衝劑(例如，草酸-草酸鈉混合物，草酸-氫氧化鈉混合物，草酸-草酸鉀混合物等)，乳酸鹽緩衝劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物，乳酸-氫氧化鈉混合物，乳酸-乳酸鉀混合物)及乙酸鹽緩衝劑(例如，乙酸-乙酸鈉混合物，乙酸-氫氧化鈉混合物等)。磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑、三甲胺鹽例如Tris、HEPES和其他此等已知的緩衝劑亦適合並可使用。較佳地，緩衝劑之組合物，亦即於本發明調配物中使用二或多種緩衝劑。二或多種緩衝劑之組合物在文中係指一緩衝系統。
本發明調配物係包括一緩衝系統。緩衝系統係維持生理上適合的pH。此外，緩衝系統參予達到調配物之等張性和化學安定性。由於開發雙特異性抗體之適合的抗體調配物困難，較佳的係使用組合的緩衝系統以利用二或多種緩衝劑之優勢。藉由組合二或多種緩衝劑，能開發出更安定的抗體調配物。
較佳地，此緩衝系統係以從約1mM至約50mM，例如約5mM至約25mM，約5mM至約15mM或約10mM之濃度存在調配物中。另一種選擇，此緩衝系統係以從約1mM至約15mM，約16至約30mM，約31至約45mM或約46mM至約50mM之濃度存在調配物中。例如，此緩衝系統可以從約1mM，約2mM，約3mM，約4mM，約5mM，約6mM， 約7mM，約8mM，約9mM，約10mM，約11mM，約12mM，約13mM，約14mM，約15mM，約16mM，約17mM，約18mM，約19mM，約20mM，約21mM，約22mM，約23mM，約24mM，約25mM，約26mM，約27mM，約28mM，約29mM，約30mM，約31mM，約32mM，約33mM，約34mM，約35mM，約36mM，約37mM，約38mM，約39mM，約40mM，約41mM，約42mM，約43mM，約44mM，約45mM，約46mM，約47mM，約48mM，約49mM及約50mM之濃度存在調配物中。更佳地，此緩衝系統係以從約5mM至約15mM之濃度存在調配物中，及甚佳地從約8mM至約12mM。在一最佳的實施例中，此緩衝系統係以約10mM之濃度存在。
較佳地，此緩衝系統係包括一Tris緩衝劑和一磷酸鹽緩衝劑。較佳地，此Tris緩衝劑係以從約1至約5mM之濃度存在調配物中。例如，此Tris緩衝劑可以從約1mM，約2mM，約3mM，約4mM或約5mM之濃度存在調配物中。更佳地，此Tris緩衝劑係以從約2mM至約4mM之濃度存在調配物中，及甚佳地從約3mM至約4mM。在一最佳的實施例中，此Tris緩衝系統係以約3.7mM之濃度存在。
較佳地，磷酸鹽緩衝液係以從約1至約10mM之濃度存在調配物中。例如，磷酸鹽緩衝劑係以約1mM，約2mM，約3mM，約4mM，約5mM，約6mM，約7mM，約8mM，約9mM或約10mM之濃度存在調配物中。更佳地，磷酸鹽緩衝劑係以從約3mM至約8mM之濃度存在調配物中，及甚佳地從約5mM至約7mM。在一最佳的實施例中，此緩衝系統係以約6.3mM之濃度存在。
在本發明一最佳的實施例中，此緩衝系統係包括濃度約3.7mM之Tris緩衝劑和濃度約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑。此緩衝系統中Tris緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑之組合為非比尋常的且不為本項技術所知。
亦較佳的，此緩衝系統係以低濃度，亦即約15mM或更低存在調配物中，以便於降低調配物中的離子強度。此項係基於當調配物的離子強度增加，抗體之聚集的動能增加之事實。為了改善調配物的安定性，降低抗體的聚集或抗體聚集的速度為必需的。
在特定的實施例中，本發明調配物具有約pH 7之pH。較佳地，調配物的pH範圍係從約5.0至約8.0。例如，調配物的pH可為約5.0，約5.1，約5.2，約5.3，約5.4，約5.5，約5.6，約5.7，約5.8，約5.9，約6.0，約6.1，約6.2，約6.3，約6.4，約6.5，約6.6，約6.7，約6.8，約6.9，約7.0，約7.1，約7.2，約7.3，約7.4，約7.5，約7.6，約7.7，約7.8，約7.9及約8.0。更佳地，調配物的pH範圍可從約6.5至約7.5。在一最佳的施例中，pH為約7.0。當調配物的pH為約pH 7時，此調配物展現有關可視性粒子、次-可視性粒子、低分子量蛋白及高分子量蛋白之良好的安定性。調配物的pH可藉由任何熟習本項技術者已知的方法來測量。一測量pH之較佳的方法係使用帶有微電極之pH測量計。調配物的pH可使用任何本項技術中已知的方法來調整。用於改變調配物pH之較佳的化學物質為鹽酸(HCl)和氫氧化鈉(NaOH)。
在特定的實施例中，本發明調配物具有抗體等電點(pI)以上的pH。等電點為特定分子或表面載體無淨電荷時之pH。雙特異性抗體之pI可藉由任何熟習本項技術者已知的方法來測定。較佳地，雙特異性抗體之PI係以變性等電聚焦來測量。抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體之PI，其中該抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈和一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈，為5.8-6.2。
iii.非離子界面活性劑
本發明調配物可視需要進一步包括一非離子界面活性劑。界面活性劑為安定生物分子之化學化合物及/或調配物中之一般的醫藥賦形劑。界面活性劑一般係保護分子和賦形劑免於空氣/溶液介面引發的應力及溶液/表面引發的應力，其另外可能造成分子聚集。界面活性劑亦防止可視性和次可視性粒子形成。
較佳地，此非離子界面活性劑係以從約0.01%至約1%(w/v)，例如約0.01%至約0.5%，約0.01%至約0.3%或約0.01%至約0.2%之濃度存在調配物中。另一種選擇，此非離子界面活性劑係以從約0.01%至約0.05%(w/v)，約0.06%至約0.10%(w/v)，約0.11%至約0.15%(w/v)，約0.16%至約0.20%(w/v)，約0.20%至約0.30%(w/v)，約0.30%至約0.40%(w/v)，約 0.40%至約0.50%(w/v)，約0.50%至約0.60%(w/v)，約0.60%至約0.70%(w/v)，約0.70%至約0.80%(w/v)，約0.80%至約0.90%(w/v)或約0.90%至約1.0%(w/v)之濃度存在調配物中。例如，此非離子界面活性劑可以約0.01%(w/v)，約0.02%(w/v)，約0.03%(w/v)，約0.04%(w/v)，約0.05%(w/v)，約0.06%(w/v)，約0.07%(w/v)，約0.08%(w/v)，約0.09%(w/v)，約0.1%(w/v)，約0.2%(w/v)，約0.3%(w/v)，約0.4%(w/v)，約0.5%(w/v)，約0.6%(w/v)，約0.7%(w/v)，約0.8%(w/v)，約0.9%(w/v)和約1%(w/v)之量存在調配物中。在特定的實施例中，此非離子界面活性劑係以從約0.05%至約0.2%(w/v)存在調配物中。
界面活性劑之實例包括(但不限於)聚山梨醇酯、甘油、二羧酸、草酸、琥珀酸、延胡索酸、酞酸及其組合物。熟習本項技術者已了解可使用其他非離子界面活性劑，只要其為醫藥上可接受的，亦即適合投予患者。此非離子界面活性劑較佳地為聚山梨醇酯。聚山梨醇酯之實例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80。最佳地，此非離子界面活性劑為聚山梨醇酯80。
在示例的實施例中，聚山梨醇酯80係以從約0.01%至約1%(w/v)之量存在調配物中。例如，聚山梨醇酯80可以從約0.01%(w/v)，約0.02%(w/v)，約0.03%(w/v)，約0.04%(w/v)，約0.05%(w/v)，約0.06%(w/v)，約0.07%(w/v)，約0.08%(w/v)，約0.09%(w/v)，約0.1%(w/v)，約0.2%(w/v)，約0.3%(w/v)，約0.4%(w/v)，約0.5%(w/v)，約0.6%(w/v)，約0.7%(w/v)，約0.8%(w/v)，約0.9%(w/v)及約1%(w/v)之量存在調配物中。在特定的實施例中，聚山梨醇酯80係以從約0.03%至約0.2%(w/v)存在調配物中。例如，聚山梨醇酯80可以從約0.01%至約1%(w/v)，約0.02%至約0.5%(w/v)及約0.03%至約0.2%(w/v)之量存在調配物中。在本發明一最佳的實施例中，聚山梨醇酯80係以0.2%(w/v)之量存在調配物中。
iv.糖
本發明調配物可視需要進一步包括糖。典型地，糖可用作高分子量蛋白之安定劑或作為低溫保護劑或作為凍乾保護劑。
較佳地，糖係以從約1%至約10%(w/v)，例如約2%至約8%(w/v)，約3%至約7%(w/v)，約4%至約6%(w/v)或約5%(w/v)之濃度存在調配物中。另一種選擇，糖係以從約1%至約3%(w/v)，約3%至約6%(w/v)或約6%至約10%(w/v)之濃度存在調配物中。例如，糖可以約1%(w/v)，約2%(w/v)，約3%(w/v)，約4%(w/v)，約5%(w/v)，約6%(w/v)，約7%(w/v)，約8%(w/v)，約9%(w/v)或約10%(w/v)之量存在調配物中。在特定的實施例中，糖係以從約3%至約7%(w/v)，及更佳地約5%存在調配物中。
糖之實例包括(但不限於)單糖、雙糖和多糖。糖類的實例包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、右旋糖、木糖醇、果糖和甘露醇。熟習本項技術者已了解可使用其他糖類，只要其為醫藥上可接受，亦即適合投予患者。較佳地，此糖為雙糖。更佳地，此糖為蔗糖。
在特定的實施例中，蔗糖係以從約1%至10%(w/v)之量存在調配物中。例如，蔗糖可以約1%(w/v)，約2%(w/v)，約3%(w/v)，約4%(w/v)，約5%(w/v)，約6%(w/v)，約7%(w/v)，約8%(w/v)，約9%(w/v)或約10%(w/v)之量存在調配物中。較佳地，蔗糖係以約3%至約7%(w/v)或約4%至約6%(w/v)之量存在。最佳地，蔗糖係以約5%(w/v)之量存在調配物中。
v.非離子安定劑
本發明調配物可視需要進一步包括一非離子安定劑。安定劑係指廣泛類別之賦形劑，其功能範圍可從膨脹劑至使治療劑安定或幫助防止變性或黏附於容器壁之添加劑。安定劑亦使高分子量蛋白形成降至最小。
較佳地，此非離子安定劑係以從約1%至約10%(w/v)，例如約2%至約8%(w/v)，約2%至約5%(w/v)，約2%至約4%(w/v)或約3%(w/v)之濃度存在調配物中。另一種選擇，此非離子安定劑係以從約1%至約2%(w/v)，約2%至約4%(w/v)，約4%至約6%(w/v)，約6%至約8%(w/v)或約8%至約10%(w/v)之濃度存在調配物中。例如，此非離子安定劑可以從約1%(w/v)，約2%(w/v)，約3%(w/v)，約4%(w/v)，約5%(w/v)，約6%(w/v)，約7%(w/v)，約8%(w/v)，約9%(w/v)或約10%(w/v)之量存在 調配物中。在特定的實施例中，此非離子安定劑係以從約1%至約5%(w/v)，更佳地從約1%至約3%(w/v)，及最佳地約3%(w/v)存在調配物中。
安定劑之實例包括(但不限於)多元醇；胺基酸，例如脯胺酸、精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖類或糖醇，例如乳糖、海藻糖、木蘇糖、阿拉伯糖醇、赤藻糖醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、甘油及其類似物，包括環醇，例如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、硫乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(亦即<10個殘基)；蛋白，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯酮、糖類、單糖類，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙糖類，例如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖類例如棉子糖；多糖類例如葡聚糖等等。熟習本項技術者已了解可使用其他非離子安定劑，只要其為醫藥上可接受，亦即適合投予患者。較佳地，此非離子安定劑為胺基酸。更佳地，此非離子安定劑為脯胺酸或甘胺酸。最佳地，此非離子安定劑為脯胺酸。另一種選擇，此非離子安定劑為甘露醇。
在特定的實施例中，脯胺酸係以從約1%至10%(w/v)之量存在調配物中。例如，脯胺酸可以從約1%(w/v)，約2%(w/v)，約3%(w/v)，約4%(w/v)，約5%(w/v)，約6%(w/v)，約7%(w/v)，約8%(w/v)，約9%(w/v)或約10%(w/v)之量存在調配物中。較佳地，脯胺酸可以約1%至約5%(w/v)或約1%至約3%(w/v)之量存在。最佳地，脯胺酸係以約3%(w/v)之量存在調配物中。
在特定替代的實施例中，甘露醇係以從約1%至10%(w/v)之量存在調配物中。例如，甘露醇可以約1%(w/v)，約2%(w/v)，約3%(w/v)，約4%(w/v)，約5%(w/v)，約6%(w/v)，約7%(w/v)，約8%(w/v)，約9%(w/v)或約10%(w/v)之量存在調配物中。較佳地，甘露醇可以約1%至約5%(w/v)或約1%至約3%(w/v)之量存在。最佳地，甘露醇係以約3%(w/v)之量存在調配物中。
vi.其他賦形劑
再者，本發明調配物可視需要進一步包括其他的賦形劑，包括(但不限於)注射用水、稀釋劑、增溶劑、安撫劑、另外的緩衝劑、無機或有機鹽類、抗氧化劑、防腐劑、膨脹劑、螯合劑、張度劑及其類似物。較佳地，然而，本發明調配物除了上述之外，並無包括其他賦形劑。其他的醫藥上可接受載劑、賦形劑或安定劑，例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中所述，可包括在調配物中，其限制條件為不能對本發明之特性有不利的影響。在一特別的實施例中，此調配物實質上無防腐劑，雖然，在替代的實施例中，添加防腐劑可能為需要的。例如，低溫保護劑或凍乾保護劑可包括在凍乾調配物中。
vii.液體或凍乾調配物
本發明調配物可為液體調配物或凍乾調配物。較佳地，此調配物為液體調配物。更佳地，此液體調配物係供注射用。另一種選擇，此調配物可為凍乾粉末。較佳地，此凍乾粉末係就在投予之前與溶劑組合。
viii.示例的調配物
在本發明一示例的實施例中，本發明係提供一適合皮下給藥之液體抗體調配物，此調配物包括：約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度和約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及約3%(w/v)脯胺酸；其中此調配物之pH為約pH 7。
在本發明之另外的示例實施例中，本發明係提供一適合皮下給藥之液體抗體調配物，此調配物包括： 約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度和約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及約3%(w/v)甘露醇；其中此調配物之pH為約pH 7。
在本發明之替代的示例實施例中，本發明係提供一適合皮下給藥之安定的凍乾抗體調配物，此調配物包括：約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度和約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及約3%(w/v)脯胺酸；其中此調配物之pH為約pH 7。
在本發明之另外替代的示例實施例中，本發明係提供一適合皮下給藥之安定的凍乾抗體調配物，此調配物包括：約100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；約10mM的緩衝系統，其中此緩衝系統係包括約3.7mM之Tris緩衝劑濃度和約6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；約0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；約5%(w/v)蔗糖；及 約3%(w/v)甘露醇；其中此調配物之pH為約pH 7。
ix.安定性
本發明調配物在2-8℃係持續安定至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36個月或更久。在示例的實施例中，其在2-8℃係持續安定至少約6個月或更久。在其他示例的實施例中，其在2-8℃係持續安定至少約9個月。在另外示例的實施例中，其在2-8℃係持續安定至少約1年或更久，更佳地約2年，及甚佳地約3年。
C.給藥模式
在本發明特定的實施例中，此調配物係適合非經腸、靜脈內、肌肉內、皮下給藥或其組合。本發明調配物適合藉由各種技術來遞送。在本發明較佳的實施例中，此調配物係以皮下給藥。例如，其較佳的，含有100mg/mL之抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體的調配物係以皮下給藥。因此，此調配物較佳地為無菌的。製造無菌調配物之方法已為本項技術所熟知並包括，例如，經由無菌過濾膜過濾或調配物成份(抗體除外)之高壓蒸氣滅菌於約120℃進行約30分鐘。
D.劑量和劑型
本發明調配物之有效劑量係依照許多不同的因素而變，包括給藥方法、目標位置、患者的生理狀態、患者是否為人類或動物、給予的其他藥物，及治療是否為預防性或治療性。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括基因轉殖哺乳動物。治療劑量可能需要定出效價以使安全性和效力最佳化。較佳地，劑量範圍係從100-200mg/瓶。
本發明調配物可以多重時機給藥。單一劑量間的間隔可為每天、每週、每二週、每月或每年。間隔亦可為非規律性的。在幾個月內，調整劑量以達到特定的血漿結合劑(例如抗體)濃度。劑量和頻率將依照抗 -IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體在患者中的半衰期而變。一般而言，人類抗體顯現最長的半衰期，接著人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗。
在另外的實施例中，本發明係提供包括一治療上有效量之本發明調配物的醫藥單位劑型，經由將此劑型投予患者用於治療患者中一或多種疾病。在一較佳的實施例中，此患者為人類。此人類可為成人或可為嬰兒。術語「醫藥單位劑型」係指適用於所欲治療之患者作為單一的劑量之物理上離散單位，各單位含有一經計算產生所欲治療/預防效用之預定量的活性化合物結合所需的檸檬酸鹽緩衝劑和pH。
單位劑型可為包括此調配物之容器。適合的容器包括(但不限於)密封的安瓶、小瓶、瓶、注射器和試管。此等容器可由各種材料來製成，例如玻璃或塑膠，且可具有無菌的出入口(例如，此容器可為一小瓶，其具有一可被皮下注射針穿透的塞子)。在一較佳的實施例中，此容器為一小瓶。一般，此容器應保持調配物之無菌及安定性。
在特定的實施例中，此調配物係包裝在7、10、1或20mL小瓶中，其係由透明、無色第I型玻璃所製作，並以塞子關閉(塗覆氟聚合物-溴丁基)以凸緣(聚乙烯)之彈壓蓋密封。
在特定的實施例中，此調配物係二次包裝於一容器中，例如使小瓶避開光線之紙板盒。
用於活體內給藥之調配物必須為無菌的。此項可藉由，例如經由無菌過濾膜過濾來進行。例如，本發明之液體調配物可使用0.2μm或0.22μm過濾器藉由過濾來殺菌。
E.治療方法
文中進一步係提供治療IL-4及/或IL-13-媒介的疾病或病症之方法，該方法包括將本發明調配物投予一病患。在特定的實施例中，該IL-4及/或IL-13-媒介的疾病為癌症、發炎、自體免疫疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神經疾病和代謝疾病。
本發明之調配物可用於治療、抑制或預防疾病，例如過敏疾病、Th2-媒介的疾病、IL-13-媒介的疾病、IL-4-媒介的疾病及/或IL-4/IL-13-媒介的疾病。此等疾病之實例包括何傑金氏症、氣喘、過敏性氣喘、異位 性皮膚炎、異位性過敏、潰瘍性結腸炎、硬皮症、過敏性鼻炎、COPD3特發性肺纖維化、慢性移植排斥、博來黴素引發的肺纖維化、放射線引發的肺纖維化、肺肉芽腫、進行性全身性硬化症、血吸蟲病、肝纖維化、腎癌、勃奇氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、何傑金氏症、非何傑金氏症、塞扎里症候群(Sezary syndrome)、氣喘、敗血性關節炎、皰疹樣皮膚炎、慢性自體性蕁蔴疹、潰瘍性結腸炎、硬皮症、肥厚性疤痕、惠普爾病(Whipple's Disease)、良性攝護腺肥大、其中涉及IL-4受體參與之肺病症、其中涉及IL-4受體-媒介的上皮障礙破壞之症狀、其中涉及IL-4受體之消化系統病症、對藥物之過敏性反應、川崎氏症、鐮刀型紅血球疾病、過敏性肉芽腫(Churg-Strauss syndrome)、葛瑞夫茲病(Grave's disease)、妊娠毒血症、修格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、自體免疫淋巴細胞增生症候群、自體免疫溶血性貧血、巴瑞特氏食道症(Barrett's esophagus)、自體免疫葡萄膜炎、結核病、囊狀纖維化、過敏性支氣管肺黴菌病、慢性阻塞性肺疾病、博來黴素引發的肺病變和纖維化、肺泡蛋白質沉積症、成人呼吸窘迫症候群、類肉瘤病、高IgE症候群、特發性嗜酸性粒細胞增多症、自身免疫性皰病、尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、重症肌無力、慢性疲勞症候群、腎病。
術語「過敏性疾病」係指一種病理症狀，其中病患係對一正常無致免疫性之物質高度敏感或增大對其之免疫反應。過敏疾病一般其特徵為肥大細胞被IgE活化，導致一發炎反應(例如，局部反應、全身性反應)，其可能導致良性如打噴嚏至威脅生命之過敏性休克和死亡。過敏性疾病之實例包括(但不限於)過敏性鼻炎(例如花粉熱)、氣喘(例如，過敏性氣喘)、過敏性皮膚炎(例如濕疹)、接觸性皮膚炎、食物過敏和蕁麻疹。
術語「Th2-媒介的疾病」係指其中病變係(全部或部份)由免疫反應(Th2-型免疫反應)所產生之疾病，其中該免疫反應係由特徵為產生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13之CD4+ Th2 T淋巴細胞所調節。Th2-型免疫反應係與特定細胞激素(例如，IL-4,IL-13)和特定種類的抗體(例如IgE)之產生有關，且與體液免疫相關。Th2-媒介的疾病其特徵為出現升高量的Th2細胞激素(例如，IL-4,IL-13)及/或特定種類的抗體(例如IgE)並包括，例如過敏性疾病(例如，過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、氣喘(例如，異位性氣喘)、過敏性氣管疾病(AAD)、過敏性休克、結膜炎)，與升高量之IL-4及/或IL-13有 關的自體免疫病症(例如，類風濕性關節炎、宿主-抗-移植物疾病、腎疾病(例如，腎炎症候群、狼瘡腎炎))，及與升高量之IL-4及/或IL-13有關的感染(例如，病毒、寄生蟲、真菌(例如，白色念珠菌(C.albicans))感染)。特定癌症係與升高量之IL-4及/或IL-13有關或與IL-4-引發及/或IL-13-引發的癌細胞增生有關(例如，B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、頭和頸癌、乳癌和卵巢癌)。這些癌症可使用本發明調配物來治療、抑制或預防。
術語「癌症」係指或描述哺乳動物，特別是人類的生理狀況，其典型地特徵為細胞生長失調。癌症的實例包括(但不限於)惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。
術語「自體免疫疾病」係指由個體自身組織所產生或針對個體自身組織之非惡性疾病或病症。自體免疫疾病或病症之實例包括(但不限於)發炎反應，例如發炎性皮膚疾病，包括乾癬和皮膚炎；過敏性症狀例如濕疹和氣喘；其他涉及T細胞浸潤和慢性發炎反應之症狀；動脈硬化；糖尿病(例如，第I型糖尿病或胰島素依賴糖尿病)；多發性硬化症和中樞神經系統(CNS)發炎性病症。
在特定的實施例中，本發明調配物係與一或多種治療(例如，非本發明調配物之治療，其目前正投予供預防、治療、管理及/或改善IL-4及/或IL-13-媒介的疾病)組合投予。使用的術語「組合」並非限制其中治療投予患者之順序。第一治療可在投予第二治療之前(例如，1分鐘，45分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時，2小時，4小時，6小時，12小時，24小時，48小時，72小時，96小時，1週，2週，3週，4週，5週，6週，8週，或12週)，同時或之後(例如，1分鐘，45分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時，2小時，4小時，6小時，12小時，24小時，48小時，72小時，96小時，1週，2週，3週，4週，5週，6週，8週或12週)，投予一曾經患有、已患有或易罹患IL-4及/或IL-13-媒介疾病之患者。任何另外的治療可以任何順序與其他另外的治療一起投予。可與本發明抗體組合投予之治療的非限定實例包括列於美國藥典(U.S.Pharmacopoeia)及/或醫師參考手冊(Physician's Desk Reference)中之核准的抗-發炎劑。
F.套組
本發明之特定的實施例係包括一包含本發明調配物之套組。此套組可進一步包括一或多個容器，該容器係包括醫藥上可接受賦形劑，及包括其他商業和使用者立場所希望的物質，其包括過濾器、針和注射器。與套組結合的可為包括在治療、預防或診斷產品之商業包裝中的習用說明書，其包含有關，例如適應症、使用、劑量、製造商、給藥、禁忌症及/或關於使用此治療、預防或診斷產品之警告的資訊。
圖1為顯示包括二條輕鏈和二條重鏈之示例雙特異性抗-IL-4/抗-IL-13抗體分子的示意圖。此二條輕鏈係包括N-VLhB-B13-連接子-VLh8D4-8-CL-C基團，及此二條重鏈係包括N-VHhB-B13-連接子-VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C基團。此連接子序列係包括(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。
圖2係說明示例抗體的胺基酸序列，亦即B-B13抗-IL-13抗體之人源化可變區(SEQ ID NOS：1和2)和8D4-8抗-IL-4抗體之人源化可變區(SEQ ID NOS：3、4和5)。加底線係表示胺基酸已作改變。粗體係表示CDR序列。
圖3為一組顯示震盪應力後分析#P5(pH-緩衝劑篩選)之粒子污染的照片。
圖4係顯示數種應力之後對#P6分析(pH-緩衝劑篩選)之次-可視性粒子>1.5μm汙染的圖形。
圖5係顯示數種應力之後分析#P6(pH-緩衝劑篩選)之次-可視性粒子>10μm汙染的圖形。
圖6係顯示熱應力之後分析#P6(pH-緩衝劑篩選)之HMW圖形。
圖7係顯示在45℃ 2週後分析#P5(pH-緩衝劑篩選)之SEC層析圖。
圖8為在45℃ 2週後分析#P5(pH-緩衝劑篩選)之SDS-PAGE凝膠照片。
圖9為在45℃ 2週後分析#P5和6(pH-緩衝劑篩選)之IEF凝膠照片。
圖10為顯示應力程序後於分析#P13上(鹽效應)之HMW量的圖式。
圖11係顯示機械應力後分析#P12(界面活性劑)之雙目成像照片。
圖12為顯示在5℃儲存6週時分析#P12(界面活性劑)之HMW監測圖式。
圖13為顯示在5℃儲存6週時分析#P12(添加劑)之HMW監測圖式。
圖14為顯示在5℃儲存4週時分析#P20-FDS(添加劑)之HMW監測圖式。
圖15為顯示在5℃儲存2週時分析#P12(添加劑)之HMW監測圖式。
圖16為比較前導調配物中1%脯胺酸與3%脯胺酸，單體含量倒數之時間函數的圖式。
圖17為調配物#P16-1之冷凍乾燥程序期間追隨溫度之圖式。
圖18係顯示#P18-1餅在15mL模製玻璃小瓶中之照片。
圖19為顯示凍乾程序後分析#P14(添加物)之HMW量的圖式。
圖20為顯示凍乾後分析#P20(添加物)之HMW量的圖式。
圖21為顯示一冷凍/解凍週期後於非調配DS(分析#9)上HMW量之圖式(a)和照片(b)。
圖22為顯示重建後分析#P14(添加物)之HMW量的圖式。
圖23為顯示重建後分析#P20(添加物)之HMW量的圖式。
圖24為顯示餅儲存和重建後分析#P17(添加物)之HMW量的圖式。
圖25為顯示餅儲存和重建後分析#P20(添加物)之HMW量的圖式。
圖26為顯示第一次篩選(分析#H04-150至172-pH-緩衝劑篩選)之DSC結果的圖式。
圖27係顯示組胺酸和琥珀酸調配物之視覺外觀的照片(分析#P-H04-144和148，#H04-150 A1至A6)。
圖28為顯示於5℃(分析#H04-150 B1)和RT時(分析#H04-163 A1、B1、B2和H04-172 A1、A2)以SEC對緩衝劑篩選之HMW演變。
圖29為磷酸/Tris緩衝劑(分析#H04-187)上pH篩選之DSC結果的圖式。
圖30為以SEC於磷酸/Tris緩衝劑(分析#H04-187)上對pH篩選之HMW演變的圖式。
圖31為顯示緩衝劑濃度篩選(分析#H04-185)之DSC結果的圖式。
圖32為於RT以SEC隨緩衝劑濃度之HMW演變的圖式(分析#H04-185)。
圖33為顯示於RT以SEC對NaCl之HMW演變的圖式(分析#H04-185)。
圖34為顯示於RT以SEC對甘胺酸與蔗糖之HMW演變的圖表(分析#H04-185)。
實例
提供下列實例，用以幫助說明本發明。並不希望此等實例在任何方面限制本發明之範圍。一般而言，除非另有指出，否則本發明之施行係應用醫藥調配物之習用技術、化學、分子生物、重組DNA技術、免疫學例如抗體技術和多肽製備之標準技術，如，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),volume 51,Ed.：Paul S.,Humana Press(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),Eds.：McCafferty J.等人，Humana Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Eds.Ausubel等人，John Wiley & Sons(1992)中所描述。
用於實例2-6之縮寫為：
BD：生物技術開發
BsAb：雙特異性抗體
DLS：動態光散射
DoE：實驗設計
DP：藥物產品
DS：藥物基質
DSC：示差掃描熱分析儀
FCM：流式細胞顯微技術
FDS：調配的藥物基質
FT-IR：傅立葉轉換(Fourier Transformed)-紅外線
HAP：羥磷灰石層析
HDPE：高密度聚乙烯
HMW：高分子量
HPLC：高效液相層析
IEF：等電聚焦
IgG：免疫球蛋白G
IL：介白素
kDa：千道爾頓
LMW：低分子量
Nd：未測定
PEG：聚乙二醇
PES：聚醚碸
PS80：聚山梨醇酯80
PVDF：聚偏氟乙烯
rpm：每分鐘轉數
SC：皮下
SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳
SEC：粒徑篩析層析
SLS：靜態光散射
Sq：適量
TGA：熱重分析
UF/DF：超濾/滲濾
USP：美國藥典
UV-Vis：紫外線-可見
w/v：重量/體積
WFI：注射用水
XRPD：X-光粉末繞射
在下列實例中係使用人源化IgG4抗-IL-4/抗-IL-13雙特異性抗體，其包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列、與IL-13和IL-4 結合之重鏈可變區，及一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列、與IL-13和IL-4結合之輕鏈可變區(前導抗體)，用以測定最佳調配物條件。
下列調配物研究(實例2-6)之目的係了解前導抗體在溶液和在冷凍-乾燥狀態之行為(亦即，鑑定主要的降解路徑)和測定適合的緩衝劑-pH系統及為約100mg/mL之前導抗體提供良好安定性之添加劑，供進一步的調配物開發。
下列係顯示用於實例2-6中之藥物基質：前導抗體後HAP純化步驟(下游處理之最後步驟)：
批件#RSN0169(研究#P5至P6)
調配物緩衝劑：磷酸鈉緩衝液75mM,pH 6.7
濃度：10.4mg/mL；
批件#RSN0169-SZW 320、326和327(研究#P7至P13)
調配物緩衝劑：磷酸鈉緩衝液59mM,pH 6.9
濃度：4.5mg/mL；
批件#RSN0169-SZW 330(研究#P14)
調配物緩衝劑：磷酸鈉緩衝液55mM,NaCl 20mM,pH 6.8
濃度：4.4mg/mL；及
批件# RSN0152(研究#P15至P21)
調配物緩衝劑：磷酸鈉緩衝液55mM,NaCl 20mM,pH 6.8
濃度：3.9mg/mL。
就各調配物之方析，係於水中UF/DF終了或最終緩衝時，調整前導抗體濃度及然後進一步以適量的濃縮緩衝劑和添加劑溶液稀釋至所欲的最終調配物(詳情請參見表1)。
將各調配物於層流下無菌過濾(Millex® GV,Millipore,0.22μm,PVDF)並在適當的各安定性時間點將溶離份分散於1型玻璃小瓶中，但是冷凍/解凍研究係使聚乙烯管。
就實例2-6中的調配物測定機械應力和熱應力條件。
為了評估震盪應力對調配物分析#P5-7之影響，係將小瓶於室溫使用Test 74401以350rpm震盪2至15h，及然後分析。
為了評估灌注應力對調配物分析#P12、13、16-18和20之影響，當可取得小量樣本時係以HPLC注射器(Unimetrics Corporation 100μL)，及當可取得較大量的樣本，係以Terumo 26G x ½-0.45x12mm注射器評估灌注性能之潛在影響(亦即，針內的剪應力)。
為了評估熱應力對調配物分析#P5-7和13之影響，係將小瓶存放在45℃歷時1和2週，及然後分析。以DSC測定升高溫度之熱應力。亦將分析#P5-7和13存放於5℃歷時2週，及然後分析。
為了評估熱應力對調配物分析#P12、15和21之影響，係將小瓶存放在5℃歷時3至6週，並每週分析。將凍乾之前的溶液，稱為調配藥基質(FDS)，就分析#P16-18和20係存放於5℃歷時4至5週並每週分析。就分析#P14、16-18和20凍乾後之重建的溶液，係存放於5℃歷時24h及然後分析。
實例1-PH最適化
在此調配物開發之第1步驟係測定前導抗體調配物之最佳pH。為了測定最佳pH，係使用低濃度的前導抗體(1mg/ml，對照100mg/ml)， 因為此低濃度的前導抗體係足以測定此最佳pH。表2係顯示此研究中所試驗的調配物。
在此研究中，調配物不穩定，因為其導致前導抗體之構形上不安定性。特言之，前導抗體傾向未摺疊。又，調配物9產生了去醯胺化。因此，經測定前導抗體調配物之最佳pH應在約pH 7.0之狹隘的範圍內。
其他調配物參數，例如緩衝劑、界面活性劑和安定劑之後續研究，係包括較高濃度的前導抗體。當使用較高濃度的前導抗體時，這些後續的研究確認了上述有關前導抗體調配物之最佳pH的結論。
實例2-緩衝系統/離子強度(鹽) 緩衝劑
調配物開發程序之下個步驟係測定前導抗體調配物之最佳緩衝劑。以數個不同的分析試驗數種不同的緩衝劑，例如組胺酸、磷酸鹽、Tris及其組合物。
因處理和調配物調合，過濾的調配物分析和對照組無可視性和次可視性粒子粒子，及由於起始的DS含有5.5%的HMW，SEC分析顯示純度
Figure TWI679019B_D0015
92.0%。
由DSC得到的開始和變性溫度顯示下列緩衝劑-pH系統有較佳的熱安定性：
‧磷酸鹽pH 6.5和7.0：#P5-5、P5-6、6-2、P6-3
‧Tris pH 7.0和7.5：#P6-5、P6-6例如，相較於pH 4.5之48℃，及組胺酸緩衝劑之59℃，其開始的溫度為約61℃。
由SLS所得到的膠體安定性顯示下列緩衝劑-pH系統有較佳的安定性：
‧磷酸鹽pH 7.5：#P6-4
‧Tris pH 7.0和7.5：#P6-5、P6-6例如，相較於組胺酸緩衝劑之0.4 10-4mL.mol/g2和磷酸鹽pH 7.0緩衝劑之1.5 10-4mL.mol/g2，其第二均功係數係接近3.0 10-4mL.mol/g2。
在震盪應力1小時30分鐘後，觀察到不同程度的粒子汙染(參見圖3)。
有關可視性粒子，就分析#P5，顯示良好安定性之候選緩衝劑-pH系統係如下：
‧磷酸鹽pH 6.5,7.0和7.5：#P5-5,P5-6和P5-7
‧Tris pH 8.0和8.5：#P5-8和P5-9
就這二個緩衝系統以介於6.5至7.5之pH進行分析#6。顯現最佳安定性之候選物係如下：
‧磷酸鹽pH 7.0和7.5：#P6-3和P6-4
‧Tris pH 7.0和7.5：#P6-5和P6-6
鹼性pH對於降低粒子形成似乎為較佳。
震盪應力和熱應力(於45℃ 2週)為用於區別有關次-可視性粒子之緩衝-pH系統的相關方法。
提供良好安定性之候選緩衝劑-pH系統有：
分析#5：調配物#P5-6至P5-9，亦即pH
Figure TWI679019B_D0016
7.0
分析#6(參見圖4和圖5)：
-磷酸鹽7.5：# P6-4
-Tris 7.5：# P6-6
接著：
-磷酸鹽pH 7.0：#P6-3
-Tris pH 7.0：#P6-5
注意，對所有的應力條件，組胺酸緩衝劑(#P6-1)顯示，重大的不穩定效應。
HIAC測量確認此目測檢驗：鹼性pH對於降低粒子形成為較佳的。再者，在相同的pH，磷酸鹽-為基底的調配物比Tris緩衝系統提供略少的次-可視性粒子。
有關分析#5和6，對於HMW和LMW二者，熱應力顯示有趣的結果。注意，調配物#P5-1(pH 4.5)在45℃ 1週後完全降解；及調配物#P5-2在45℃ 2週後亦同樣完全降解。將這二個樣本從下列分析中移出。
有關HMW，在45℃ 2週後之結果，就調配物#P5-6至P5-9(pH
Figure TWI679019B_D0017
7.0)為相類似，而#P5-5至P5-3為較佳，因pH從6.5降至5.5。就分析#6，確認此趨勢及提供良好安定性之候選緩衝劑-pH系統有(參見圖6)：磷酸鹽pH 6.5：#P6-2
Tris pH 7.0：#P6-5
組胺酸pH 6.5：#P6-1
因此，pH 6.5對降低HMW形成比pH 7.0提供較佳的安定性，其本身比pH 7.5更好。再者，在相同的pH(7.0和7.5)，Tris-為基底的調配物比磷酸鹽緩衝-系統提供略低的HMW。
有關LMW，調配物#P5-3至P5-5(pH
Figure TWI679019B_D0018
6.5)在45℃ 2週後顯現良好的安定性。就調配物#P5-6至P5-9(7.0
Figure TWI679019B_D0019
pH
Figure TWI679019B_D0020
8.5)，形成實質的LMW及在SDS-PAGE凝膠上產生額外色帶。調配物#P5-9(Tris pH 8.5)之LMW降解更明顯(參見圖7)及#P5-7(磷酸鹽pH 7.5)之SDS-PAGE凝膠上的額外色帶為顯見的(參見圖8)。注意，就磷酸鹽和Tris緩衝系統之降解產物似乎不相同。
分析#6確認了這些結論並顯示，對於相同的pH，磷酸鹽-為基底的調配物比-Tris緩衝系統提供略高的LMW。
有關HMW和LMW，酸性pH似乎比鹼性pH展現較佳的安定性，其中Tris略優於磷酸鹽緩衝系統。
由IEF證明，熱應力在45℃歷時4週對前導抗體之力值化學降解為一重大意義(亦即酸模式改變)，並因此選擇提供前導抗體良好安定性之緩衝-pH系統(參見圖9)。最低安定性調配物為Tris pH 8.5(#P5-9)和磷酸鹽pH 7.5(#P6-4)，為同型模式，二者出現2種額外的酸形式及主要的形式變成次要的。顯現良好安定性之候選的緩衝-pH系統為Tris pH 7.0(#P6-5)。
總之，以最初的狀態分析和分析#P5和6(1mg/mL溶液)之應力程序結果為基礎，pH已設定在7.0。此選擇為有關可視性和次可式性粒子(鹼性pH)之良好安定性及有關HMW和LMW(酸pH)之安定性間的折衷。有關緩衝系統，磷酸鹽和Tris二者對於所選的pH顯現優勢：就可視性和次可式性粒子而言為磷酸鹽，就HMW和LMW而言為Tris。
注意，對於第一添加劑評估，係使用緩衝系統磷酸鹽10mM或Tris 10mM：‧在100mg/mL前導抗體溶液上確認上述結果，‧及於二個緩衝系統上分開試驗冷凍-乾燥過程。
確認上述結果且二個緩衝系統(#P14-3和P14-8)在冷凍乾燥過程期間顯現良好的結果(參見圖19)。
於pH 7.0，磷酸鹽比Tris具有較強的緩衝能力；然而，與Tris不同，其鹼在冷凍步驟期間具有沉澱的傾向。結合Tris和磷酸鹽二者之優點，選擇這二種緩衝系統的混合物：磷酸鹽6.3mM和Tris 3.7mM。即便使用Tris緩衝劑或磷酸鹽緩衝劑已為本項技術所知(各自分開使用)，但結合Tris緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑於一緩衝系統中為非比尋常且不為本項技術所知。
導電率(pH和緩衝劑選擇)
在凍乾之前，溶液具有約300μS/cm之導電率，其在重建後就DP得到850μS/cm之理論的導電率。
吾等首次嘗試常用於mAb之緩衝劑：組胺酸，以其在pH 6.2和6.6之緩衝區及10mM之濃度。在pH 6.2，在室溫遭遇到前導抗體沉澱之不溶解的問題(參見圖29)。在pH 6.6，溶液在室溫略為乳白色，第二均功係數為低的0.410-4mL.mol/g2。與大部份的mAb不同，組胺酸並非前導抗體之良好的緩衝劑。
然後，吾等嘗試另一種常用的緩衝劑：磷酸鹽，以其在pH 6.5、7.0和6.5之緩衝區及10mM之濃度。就pH 6.5和7.0，第二均功係數係低於1.510-4mL.mol/g2，其係代表膠體安定性低。就pH 7.5，第二均功係數接近3.010-4mL.mol/g2，其係代表良好的膠體安定性，然而熱應力(在45℃ 2週)顯示純度降低(HMW和LMW增加)比pH 6.5和7.0更明顯。磷酸鹽為一良好的緩衝劑，然而在酸性pH時膠體穩定性低，而在鹼性pH時前導抗體對熱應力具敏感性。
為了擴大緩衝劑篩選，係將Tris以其在pH 7.0和7.5之緩衝區及10mM之濃度作測試。二個pH皆顯現良好的膠體穩定性，其中第二均功係數接近03.010-4mL.mol/g2。熱應力(在45℃ 2週)顯示純度降低(HMW和LMW增加)pH 7.5比pH 7.0更明顯。Tris在pH 7.0時比相同pH的磷酸鹽，就HMW而言提供更佳的安定性及就LMW而言略佳的安定性。Tris pH 7.0為比Tris pH 7.5和磷酸鹽pH 7.0更優良的緩衝系統。雖然，為 了得到Tris於此pH(pka=8.1)時良好的緩衝能力，所需之量應比用於商業化產品中的最大量更多。
為了將用於前導抗體之緩衝劑最適化，係選擇磷酸鹽6.5mM/Tris 3.7mM之組合物，以便在pH 7.0由於磷酸鹽(pka=7.2)而得到良好的緩衝能力，及由於Tris而得到良好安定性之前導抗體。
如上所述，即便使用Tris緩衝劑或磷酸鹽緩衝劑已為本項技術所知(各自分開使用)，但結合Tris緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑於一緩衝系統中為非比尋常且不為本項技術所知。
離子強度/鹽濃度
以二種濃度70mM之選擇的候選緩衝劑-pH對100mg/mL前導抗體溶液測試氯化鈉(NaCl)。
由DSC所得到的開始和變性溫度以及由SLS所得到的膠體安定性並未顯示NaCl對溶液的安定性有任何實質效應。
在調配物分析#P13之機械應力及相同的調配物於5℃儲存2週後，候選物#P13-1和P13-3，亦即無NaCl，對HMW形成顯示較佳的安定性(參見圖10)。相同c/c於圖33中。
鹽濃度增加使得離子強度增加，其造成前導抗體之聚集動能增加。因此，決定此調配物不應含有鹽或滲透劑。此外，決定最佳的調配物應包括低濃度的緩衝劑以便具有低的離子強度。
實例3-界面活性劑
在調配物開發程序的下一步係決定用於前導抗體調配物之最佳賦形劑。賦形劑必須足以安定此前導抗體，且與凍乾作用相容。試驗數種不同的界面活性劑，例如各種濃度的聚山梨醇酯和泊洛沙姆(poloxamers)。
就在0.22μm過濾後，調配物分析和對照組無可視性和次-可視性粒子。由於前導抗體之濃度從4.5mg/mL至100mg/mL(起始DS含有3.0% HMW)，SEC分析顯示純度
Figure TWI679019B_D0023
92.0%。
機械應力為區別候選調配物間之相關方法。由於可取得的起始物之量有限，標準目測觀察並不可能，且因此係使用於放大鏡下毛細管中之觀察。有關可視性/次可視性粒子，就分析#12顯現良好安定性之候選物係如下(參見圖11)：
PS80 0.1%：#P12-6
PS20 0.1%：#P12-8
在所測試的界面活性劑中，相較於無界面活性劑之調配物，對於HMW形成皆無任何影響，但#P12-8(PS200.1%)除外，其在5℃儲存6週期間具有些微負面效應(參見圖12)。
總之，界面活性劑間並無強烈的不同。選擇下列界面活性劑：PS80，用以防止可視性/次可視性粒子粒子形成。
接著，於前導抗體調配物中測試各種濃度的PS80(參見表23)。將0.05-0.2%之PS80濃度就震盪應力以350rpm(室溫)測試15小時。然後以流式細胞顯微技術分析樣本，且結果係如表9中所示。表9係顯示介於0.05至0.2%之PS80濃度，就所有的濃度對於震盪應力具有同等的安定效應。因此，0.05至0.2%之PS80濃度可用於調配物中。
實例4-蔗糖
如上所述，在調配物開發程序的下一步係決定用於前導抗體調配物之最佳賦形劑。此賦形劑必須足以安定此前導抗體，且與凍乾作用相容。試驗數種不同的糖，例如各種濃度的蔗糖、海藻糖和甘露醇。
總之，基於上述研究，選擇蔗糖作為賦形劑，因為其使前導抗體安定。此外，眾所周知的，蔗糖為一種凍乾物保護劑，所以其將可改善凍乾的調配物。事實上，無蔗糖的凍乾作用造成HMW增加(參見圖19)。另外，發現5%蔗糖對調配物為最佳的。
實例5-安定劑
如上所述，在調配物開發程序的下一步係決定用於前導抗體調配物之最佳賦形劑。賦形劑必須足以安定此前導抗體，且與凍乾作用相容。試驗數種不同的安定劑，例如各種濃度的甘露醇、天門冬胺酸、脯胺酸、甘胺酸、精胺酸和白胺酸。就此可參見下列和上文表10-14。
這些篩選的目的為就有關HMW形成，發現進一步安定前導抗體之添加劑(分析#12、15、20-FDS和21)。由於前導抗體對聚集作用的高敏感性，發現期望的長期儲存溫度(亦即5℃)係與監測添加劑之效應有關。
進行一實驗設計(DoE)-篩選模型，一階、D-最適矩陣，用以篩選不同的糖、多醇、胺基酸和溶劑對HMW形成之效應(分析#15)。此DoE之結果係彙整於表19中。
發現對HMW具有效應之添加劑係分開於分析#12和20-FDS中測試：‧發現胺基酸甘胺酸(#P12-1和P20-4-FDS)和脯胺酸(#P20-3-FDS)對於最小化HMW形成，具有最佳效應(參見圖13和圖14)，‧甘露醇(#P20-1-FDS)為其次(參見圖14)，‧接著蔗糖(#P12-3)和海藻糖(#P12-4)，其效用低很多(參見圖13)，‧最後，在4%濃度時，並未確認天門冬胺酸8%之正面效應(#P20-2-FDS)(參見圖14)。
在分析#21期間測試了數個其他的添加劑：‧發現離胺酸(#P21-5)對HMW形成具有輕微的正面效應(參見圖15)，‧發現甘露醇(#P21-1)在此分析中為最佳的。
已發現，添加脯胺酸至調配物中有二種效應：其藉由降低液體調配物中之聚集速率，控制HMW形成，及其係作為一膨脹劑使餅塊在凍乾調配物中更細緻。亦發現，添加甘露醇至凍乾調配物使此餅塊變得細緻。
接著於前導抗體調配物中測試各種濃度的脯胺酸(參見表23)。測試1%和3%濃度。以UPLC分析樣本，及結果係如表20和21，及圖16中所示。表20和21係顯示調配物中可使用濃度1或3%之脯胺酸。這些數據亦確定脯胺酸對HMW動能之正面效應。再者，帶有3%脯胺酸之凍乾餅塊略微細緻(較少回縮)，其確認了脯胺酸作為安定物之角色(結果未顯示)。
總之，雖然藉由添加賦形劑，亦即甘露醇和胺基酸，例如甘胺酸和脯胺酸，明顯地降低HMW形成，但在100mg/mL之前導抗體濃度時有利的效應並不夠強到足以達到滿意的保存期限。因此，開發一凍乾調配物以及凍乾程序。
實例6-凍乾調配物
就冷凍/乾燥程序，係將5至5.5mL所欲的FDS原型(範圍20-38mg/mL之前導抗體濃度)分散於15mL小瓶(參見實例表13和表14)。
於分散在15mL小瓶接近5至5.5mL最終調配物之20至38mg/mL預濃縮的溶液上，進行冷凍/乾燥程序。
使用來自Usifroid之三種不同類型的凍乾系統：PL45(分析#14)、SMH-300(分析#17)和SMH-90(分析#16,18,20)。凍乾循環之詳情請參見表22。凍乾步驟間的溫度變化斜率為1℃/min。
然後將得到的乾燥物質藉由添加適量的WFI重建至100mg/mL之目標濃度(1.0至1.6mL)。
就凍乾分析#P16-20，係將1mL FDS溶液於-20℃冷凍，於室溫解凍一次及然後分析。
亦測試中間物DS(HAP步驟終了-BD)之冷凍和解凍(分析#9)。就此分析，係將置於50mL HDPE Nalgene瓶之20mL的DS於-20℃和-70℃冷凍，於室溫解凍一次及然後分析。
進行下列分析法：
‧目測檢查外觀(澄清度和顏色)
‧光線遮蔽(HIAC)用於定量次-可視性粒子
‧SEC用於蛋白純度
‧SDS-PAGE用於蛋白純度
‧IEF用於電荷異質性
‧FCM用於定量次-可視性粒子
‧DLS用於聚集作用
‧DSC用於變性溫度
‧SLS用於膠體安定性
‧FT-IR光譜用於二級結構
‧螢光光譜用於三級結構
‧卡爾費雪(Karl ficher)用於殘餘水百分比測定(用於凍乾物)
‧XRPD用於餅塊之晶體/非晶基質測量(用於凍乾物)
選擇調配物和凍乾程序之主要準則為：監測下列參數：
‧凍乾程序期間之前導抗體的安定性
‧重建溶液的安定性
‧FDS(凍乾前之溶液)的安定性
‧餅塊的細緻度
‧重建時間
‧餅塊的安定性
選擇冷凍乾燥週期以避免餅塊崩解(參見表22)：
‧冷凍溫度係設定在完全固化溫度以下，亦即略低於玻璃轉換溫度(Tg’)，其係藉由DSC對各候選FDS(凍乾前之溶液)進行測量(參見圖17)。
‧初次乾燥溫度係經設定使樣本的溫度保持在崩解溫度以下(其係接近Tg’)(參見圖17)。
於各凍乾分析期間所得到的餅塊全部皆為細緻的(參見圖18)且重建時間係在五分鐘內。即使這些參數對於開發期間之監測很重要，但其與區別調配物並不相關。
在冷凍步驟期間，係選擇1℃/min之冷卻速率用以避免顯著的前導抗體濃度和pH改變。選擇第二次乾燥溫度用於得到餅塊中殘餘水量，以卡爾費雪測量係低於1%(參見表22)。
前導抗體之安定性係以SEC和SDS-PAGE測量純度，及以DLS和FCM測量粒子形成來評估。區別調配物之相關準則為重建之前和之後的HMW量和重建後次-可視性粒子的計數。
就評估凍乾程序之影響，係以各調配物之凍乾前和重建後HMW之量代表，以及此量的增加-相對於凍乾前之量的百分比(參見圖19和圖20)。各圖中虛線係指增加10%。提供良好安定性之候選物為：
‧磷酸鹽與蔗糖10%：#P14-2
‧磷酸鹽和Tris與蔗糖5%+甘露醇3%：#P14-3和P14-8
‧磷酸鹽與甘露醇3%+甘胺酸1%：#P14-6
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+甘露醇3%：#P20-1
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+天門冬胺酸3%：#P20-2
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+脯胺酸3%：#P20-3
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+甘胺酸3%：#P20-4
請注意，在無任何賦形劑下(#P14-1)，此前導抗體對於凍乾程序強烈不穩定，因為在凍乾之前和之後觀察到HMW增加約130%。此結果預期係如在20℃和-70℃時於DS上所作的冷凍/解凍循環(分析#9)，顯示前導抗體強烈的不穩定性(參見圖21)-冷凍為凍乾程序的第一步驟。
有關次-可視性粒子，以FCM進行重建溶液間的比較顯示下列候選物具較佳的安定性：
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+脯胺酸3%：#P20-3
‧Tris/磷酸鹽
Figure TWI679019B_D0045
蔗糖5%+甘胺酸3%：#P20-4
注意：分析#14未測定。
就餅塊重建後安定前導抗體，係使用之前發現可降低聚集作用之賦形劑(參見有關液體調配物之賦形劑篩選的部份)。重建後前導抗體之安定性係以SEC針對純度，及以DLS和FCM針對粒子形成作評估。區別調配物之相關準則為：
‧重建後24h之HMW量(儲存於5℃)
‧機械應力後粒子之數目
重建後24h有關HMW形成(儲存於5℃)，提供最佳安定性之候選物為(參見圖22和圖23)：
‧磷酸鹽與甘露醇3%+甘胺酸1%：#P14-6
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+脯胺酸3%：#P20-3
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+甘胺酸3%：#P20-4
接著：
‧磷酸鹽與蔗糖10%：#P14-2
‧磷酸鹽和Tris與蔗糖5%+甘露醇3%：#P14-3、P14-7和P14-8
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+甘露醇3%：#P20-1
就評估凍乾物之安定性，係於製造後立刻(分析#16-20)進行重建和一至二個月之後(分析#18-20)進行重建。將候選的凍乾物儲存於5℃(分析#16-20)和20℃(分析#17)。餅塊的安定性係以SEC針對純度，及以FCM針對粒子形成，及以XRPD針對餅塊結構來評估。
有關HMW和可視性/次-可視性粒子形成，發現所有的調配物當儲存於5℃時皆為穩定的(參見圖24和圖25)。分析#17和20在5℃一個月後所觀察到的HMW量稍微增加於下列分析中未再重現(未顯示)。再者，當儲存於20℃時觀察到HMW量稍微增加(參見圖24)。
FDS安定性，其為確定DP品質之重要參數，係列入分析#16-18和20考量中。在此程序階段時前導抗體的安定性係以SEC針對純度，及以DLS和FCM針對粒子形成作評估。發現儲存於5℃對於監測添加劑對前導抗體安定性之效應有重大意義。在FDS上進行一冷凍/解凍循環對於區別調配物亦為重要的。
有關儲存於5℃時前導抗體之安定性，結果係描述於有關添加劑之部份(參見圖14)。最佳的安定性係得自：
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.75%+脯胺酸1.05%：#P20-3-FDS
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.75%+甘胺酸1.05%：#P20-4-FDS
接著：
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.75%+甘露醇1.05%：#P20-1-FDS
有關一個冷凍/解凍循環後，前導抗體之安定性，以FCM進行粒子計數顯示下列候選調配物為安定的：
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.67%+甘露醇1%：#P17-2-FDS
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.75%+甘露醇1.05%：#P20-1-FDS
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖1.75%+脯胺酸1.05%：#P20-3-FDS
總之，考慮下列標準：程序處理期間前導抗體之安定性，餅塊之樣態和安定性以及重建時間，重建溶液和FDS的安定性，有2種候選調配物明顯勝出：
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+甘露醇3%
‧Tris/磷酸鹽與蔗糖5%+脯胺酸3%
實例2-6之結論
在預調配操作期間，由選擇緩衝系統(Tris/磷酸鹽)之pH範圍(
Figure TWI679019B_D0046
7.0)及特別是添加界面活性劑：濃度0.2%之聚山梨醇酯80，管理可視性/次-可視性粒子的形成。
然而，HMW之形成仍為液體調配物之問題。雖然HMW形成因選擇適當的pH(7.0)和某些賦形劑(亦即蔗糖、甘露醇和胺基酸，例如甘胺酸和脯胺酸)而顯著地降低，但在100mg/mL時有利的效應並不足以防止HMW形成而達到預期的液體調配物之滿意的保存效期。
因此開發一凍乾調配物連同一凍乾程序。為了防止凍乾過程期間的聚集作用，係選擇一低溫保護劑：濃度5%之蔗糖。選擇用於安定液體調配物之賦形劑係於凍乾過程中測試以便更能安定凍乾前之液體(濃度：35mg/mL)和重建的溶液(濃度：100mg/mL)。有一些賦形劑係與凍乾程序相容並於其中選擇二種：濃度3%之甘露醇和脯胺酸。選擇的主要標準為：餅塊的細緻度和安定性以及FDS(凍乾前之溶液)和重建溶液的安定性。
二種長期安定性之調配物差別為一種賦形劑(參見表23)：
原型1：脯胺酸
原型2：甘露醇
另外的調配物研究(實例7-8)
用於實例7-8之縮寫：
DP：藥物產品
DS：藥物基質
FD：調配的藥物基質
FIM：第一次人體中
GRAS：一般認定為安全的
HDPE：高密度聚乙烯
HMW：高分子量
IEF：等電聚焦
IL：介白素
LMW：低分子量
PC：聚碳酸酯
PES：聚醚碸
PP：聚丙烯
PVDF：聚偏氟乙烯
RT：室溫
SC：皮下
Td1：第一變性溫度
TOR：離開冷藏時間
概述
這些研究的目的(實例7-8)為針對液態前導抗體對HMW形成之高傾向，改善FDS安定性。
此研究計畫係以由預-調配物研究(實例2-6)中得到的先前知識為基準來定義並集中在35mg/mL之FDS於室溫時HMW形成之動能。
所使用的所有緩衝劑和賦形劑為已有販售的抗體產品或供非經腸使用的其他產品，特言之其全部為GRAS(一般認定為安全的)。pH範圍係介於6.2至7.4。
總計50種不同的調配物並排與表23所述的調配物比較。主要的結果為：
‧pH值約6.2降低前導抗體溶解度：以琥珀酸鹽和組胺酸分別觀察到凝膠形成和沉澱
‧此外，組胺酸應避免在pH 6.6，因為溶液略為乳白色及熱安定性稍低
‧在介於6.6至7.4之pH範圍，對HMW形成動力學無明確的pH效應
‧增加離子強度對HMW形成動力學有不穩定效應
‧磷酸鹽和檸檬酸鹽為最佳的試驗緩衝劑，前提為其係在低濃度例如1.75mM時
‧在所有試驗的賦形劑中，最佳的安定效應係由甘胺酸10和72mM及蔗糖2.4%所得到。然而，此安定效應並未使HMW形成顯著減緩。
總之，實例7-8之結果並不能鑑別出可顯著改善表23所述的調配物有關HMW形成之新賦形劑組合。建議為保留下列調配物(參見表24)：磷酸鹽6.5mM/Tris 3.7mM,pH 7.0,PS80 0.2%(w/v)，蔗糖5%(w/v)，脯胺酸3%(w/v)。
前言
前導抗體為以細胞激素IL-4和IL-13為標靶之基因工程人源化雙特異性抗體(BsAb)。其分子量，以質譜所測量，為198kDa，及其Ip，以IEF所測量範圍係介於5.8至6.2之間。
主要的製造DS過程變化為執行IIb階段，及4在I/IIa階段和IIb階段DS和DP品質之間規畫一可比較性研究。作為DS製造變化的部份，決定進行一項以降低液態中HMW形成為目標之調配物研究。因此，調配物之可能的改良應包括在可比較性研究中。
請注意，在同時，IIb階段之DP製造程序係針對擴大規模、FDS解凍和DP劑量/小瓶變成100mg/7mL小瓶，而非150mg/15mL小瓶，進行最適化。此研究係與調配物開發平行進行。
目前此研究(實例7-8)之目標產品特性係規定下列藥物產品之特徵：
‧給藥路徑：SC注射
‧DP形式；凍乾的
‧濃度：100mg/mL之重建溶液
‧保存效期：24個月
‧儲存溫度：2℃-8℃
‧劑量強度：100mg/小瓶
‧主容器：7mL 1型管狀透明玻璃小瓶
藥物基質應在於1L聚碳酸酯瓶中調配成35mg/mL，之後存放於-20℃。在冷凍-乾燥之前不添加賦形劑或進行稀釋。
預-調配物和調配物之FIM研究，得到下列結論：
‧避免酸性pH<6.0(低的熱安定性和膠體安定性)和鹼性pH>7.5(LMW形成和於熱應力下電荷同型變化)。
‧使用濃度0.2%之聚山梨醇酯80與緩衝系統磷酸鹽/Tris,pH 7.0組合，顯著降低可視性/次-可視性粒子
‧HMW形成動能隨前導抗體濃度增加，且100mg/mL之試驗的調配物不足以防止HMW形成達到預期的液體調配物之滿意的保存效期。
‧液態中HMW形成驅使開發朝向凍乾的DP，其係由35mg/mL FDS以略低於1/3起始體積重建(凍乾前)，達到100mg/mL。選擇一低溫保護劑和凍乾保護劑：濃度5%之蔗糖。
‧選用於I和IIa階段之調配物係如下：磷酸鹽6.5mM/Tris 3.7mM,pH 7.0,PS80 0.2%(w/v)，蔗糖5%(w/v)，脯胺酸3%(w/v).
‧此調配物可針對HMW形成藉由與經鑑定具有些微正面效應之賦形劑，亦即：蔗糖、甘露醇和胺基酸，例如甘胺酸和脯胺酸組合，進行最適化。
已鑑別出液態中HMW形成為主要的降解途徑。動能係隨溶液的溫度(於DP中在5℃比在RT時慢10倍)和隨前導抗體濃度增加：
35mg/mL之FDS於RT：△HMW=+1.6%(在7h內)及+4.1%(在24h內)
100mg/mL之DP於RT：△HMW=+0.6%(在1h內)及+3.5%(在5h內)
目的
此研究(實例7-8)之目的係就HMW形成而言，增加前導抗體於液態中之安定性。為了設定此研究之定量指標，係提出下列數值：‧就使用穩定性為DP重建後於RT下5h：△HmW<+1% in 5h,‧為了使DP製造容易，就FDS為TOR 12h：△HMW<+1% in 12h.
這些指標值係考慮100mg/mL之重建DP的使用條件和當35mg/mL之FDS離開冷藏狀況時之處理製造條件。這些數值應依照目標產品的品質性質(Quality Target Product Profile)作調整。
研究設計
此研究(實例7-8)所提出的方法係用於在35mg/mL之前導抗體濃度時於廣泛範圍的調配物上篩選組合的賦形劑。
調配物的篩選係集中在能潛在地影響HMW形成之安定賦形劑。此研究係決定下列各項：
‧在此篩選中PS80和蔗糖係保持在調配物第I階段濃度，因為已證明在這些濃度時對HMW形成無負面效應並已觀察到對製造過程及/或重建有強烈的正面影響
‧pH範圍緊縮在6.2至7.4之間，因為之前的研究已顯示保持在約pH 7的pH之優勢
‧篩選此pH範圍內的5種可注射緩衝劑(單獨或與數種賦形劑組合)：其他的緩衝系統及/或添加劑(主要地胺基酸、蔗糖(除了已包含在第I階段調配物中之外)和鹽類)。
藥物基質
用於此研究(實例7-8)之DS係描述於表25中。
藥物基質
用於此研究之DP(實例7-8)係以第I/IIa階段的調配物所調配(磷酸鹽6.5mM/Tris 3.7mM,pH 7.0,PS80 0.2%，蔗糖5%，脯胺酸3%)(參見表26)。
配方
實例7-8中各分析之配方係列於表27中。
製造程序
在實例7-8中之調配物係以由濃度42mg/mL之UF/DF於蔗糖2.1%中得來的前導抗體之濃縮溶液所製造。將此前導抗體溶液以濃的賦形劑之儲存溶液稀釋。
UF/DF製程
在UF/DF過程中(實例7-8)，先將35mg/mL之最初的蛋白溶液濃縮至40mg/mL，然後交換緩衝劑。滲濾後，將蛋白溶液濃縮至高於42mg/mL，其為目標最終濃度(參見表28)。
各UF/DF所用的物質和處理條件係如表28所述。在UF/DF結束時，將前導抗體濃度以蔗糖2.1%調整至42mg/mL。
調配物調整
將UF/DF溶液後之前導抗體(實例7-8)以適量的濃儲存液稀釋至所欲的最終濃度。用於此研究之參照物和製造的濃縮溶液之組成係彙整於表29中。
將各調配物於層流下無菌過濾(Millex® GV)並將濾液酌情(1至2mL)分散於2mL I型玻璃小瓶並以塞子塞住用於各安定性時間點分析。
應力條件 熱應力
根據調配物分析，實例7-8中所進行的熱應力條件係列於表30中。
分析方法說明
實例7-8中進行下列分析方法：
‧目測檢查外觀(澄清度和顏色)
- 以自然光線觀察置於7mL小瓶中的溶液
‧HPLC-SEC測量蛋白純度
- 2管柱PROSEC 300S-250 x 4.6mm於35℃
- 移動相：磷酸鹽0.1M/NaCl 0.2M pH 7.0
- 偵測：280nm
- 注射：10μL(濃度5mg/mL)
- 流速：0.2mL/min
- 總操作時間：40min
進行下列分析方法：
‧UPLC-SEC測量蛋白純度
- 管柱：1 Acquity BEH200 SEC(150 x 4.6mm dp=1.7μm)於40℃
- 移動相：Na2HPO4 50mM/NaClO4 300mM at pH 7.0
- 偵測：UV at 280nm
- 注射：1μL(5mg/mL之溶液)標準3014ET
- 注射：2μL(2.0mg/mL之溶液)
- 流速：0.3mL/min
- 總操作時間：8min
監測下列分析方法：
‧DSC測量變性溫度：
- 使用示差掃描熱分析儀(DSC)預估不酮調配物中的抗體熱安定性
- 以VP-毛細管DSC從25℃至100℃於1℃/min之加熱速率下進行熱量測量。
- 容量曲線給予有關變性溫度Td(℃)(最大峰值)之資料。
評估標準
‧SEC：當差異等於或低於0.5%之HMW時，結果係視為相當的。
‧DSC：當Td1差異等於或低於0.4℃時，結果係視為相當的。
UPLC與HPLC法
於開發用於第I階段之HPLC上進行第一次篩選(分析#H04-150至172)。當分析一連串大量的樣本時，已觀察到有關影響HMW量測量之基線漂移。
對於第二次篩選(分析#H04-185至190)，為了得到精確的HMW量演變，係使用無觀察到基線漂移之UPLC法。即使在200個以上的樣本注射至相同管柱後，亦觀察到標準之相同的層析圖形。
SEC測量之參照
為了比較不同系列有關HMW隨時間之演變，係使用第I階段調配物作為參照：
‧對於第一次篩選(分析#H04-150至172)，就各3個系列得到第I階段FDS，藉由以WFI重建35mg/mL之DP凍乾物#H04-016。
‧對於第二次篩選(分析#H04-185 to 190)，除了前面的第I階段FDS(H04-016)外，就各3個系列，使用新鮮製造之另外的第I階段FDS連同試驗調配物。再者，使用第3個第I階段FDS參照(#LT-10006-DS)：非冷凍乾燥，但僅解凍。
出乎意料地，HMW動力學在各種參照物間似乎不相同。將二種另外的DP凍乾物連同DP凍乾物#H04-016進行試驗作比較。在RT下40h後DP凍乾物內的差異變得明顯。然而，解凍的參照物，#LT-10006-DS在RT下從16h明顯地於所有的DP凍乾物不同。此DP凍乾物比解凍的參照#LT-10006-DS物顯現較快的HMW動力學，且因此不能用於比較此研究中所製造的調配物(此研究之調配物係由解凍的FDS製造(參見有關製造程序之章節)至此調配物第I/IIa階段。
使用相同批件和新鮮製備的冷凍-乾燥DP，在解凍的FDS和DP凍乾物間並未觀察到HMW動力學上明顯的差異。因此，在此研究中新鮮製造的調配物上所觀察到的HMW動力學應同樣在冷凍-乾燥後之相同的調配物上觀察到。
由這些分析得出的結論不能推廣到所有的DP凍乾物及所有的解凍FDS。不同批件間之HMW比較可依照各種參數而定且將需要特定和個別的研究。
結果與討論
所有實例7-8中所製造的調配物含有至少1.75%(w/v)的蔗糖和接近0.07%(w/v)的PS80。這些濃度為公稱值且係以用於前導抗體起始溶液之稀釋因子為基礎。有關PS80濃度，係假設UF/DF期間PS80吸收可忽略不計。這些賦形劑濃度係與此第I階段調配物相同。
實例7-緩衝劑篩選
在此實例中係篩選6.2至7.4之pH，且在此範圍內所有可注射的緩衝劑皆有測試：琥珀酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽和Tris。
A)緩衝劑種類和pH
在此第一次篩選中(分析#H04-150至172)，係測試濃度10mM之上述緩衝劑，與數種賦形劑組合其將進一步詳述於實例8-添加劑篩選。注意，緩衝劑濃度係固定在10mM且其對HMW形成的影響可參見有關緩衝劑濃度部份(實例7)。
DSC
DSC結果顯示，所有的調配物與參照為相當的(Td1=65.5℃)， 但組胺酸調配物除外，其熱安定性稍低(Td1=64.7℃至65.1℃)(參見圖26)。
開始時之目測檢查
所有的調配物皆為澄清的且與參照物相當，但pH 6.2之調配物及pH 6.6之組胺酸調配物除外。
在pH 6.2，在二種試驗緩衝劑中觀察到溶解度下降：
‧於RT下組胺酸調配物沉澱(參見圖27)
‧於RT下琥珀酸鹽調配物略為乳白色且在5℃可觀察到凝膠形成(參見圖27)，當溶液回到RT及緩和振盪時其可回復。琥珀酸鹽可能具有螯合性質。
pH 6.6之組胺酸調配物在RT下比參照物略顯乳白色。
SEC之HMW演變
因為本處所呈現的結果係來自3個不同系列，所以HMW演變不能直接比較，僅能與參照物比較。
‧組胺酸pH 6.6在RT與參照物相當，但在5℃時略佳(就單獨組胺酸為+2.4%而參照物於144h為+3.2%)。
‧檸檬酸鹽pH 6.6在RT比參照物略佳(於24h內，單獨檸檬酸鹽為+4.6%而參照物為+5.2%)而在5℃時與參照物相當。
‧磷酸鹽pH 6.6在RT比參照物略佳(於48h內，單獨磷酸鹽為+8.2%而參照物為+9.0%)而在5℃時與參照物相當。
‧磷酸鹽pH 7在RT和5℃時與參照物相當。
‧Tris pH 7在RT比參照物略差(於48h內，Tris單獨為+7.8%而參照物為+7.0%)而在5℃時與參照物相當。
‧Tris pH 7.4在RT和5℃時與參照物相當。
參見圖28.
有關HMW形成，在pH 6.6時，磷酸鹽和檸檬酸鹽為相當的，而在pH 7.0時，磷酸鹽比Tris略微安定。上述10mM緩衝劑不能直接與第I/IIa階段調配物相比較，因為用於此篩選之參照物係從另外的批件所製造的凍乾物(參見上文有關SEC測量之參照物部份)。
結論
有關濃度10mM之緩衝系統篩選，可結論出：
‧pH值約6.2(接近pI)降低前導抗體溶解度：
‧pH 6.2之琥珀酸鹽觀察到凝膠形成
‧pH 6.2之組胺酸觀察到沉澱
‧此外，組胺酸應避免在pH 6.6，因為溶液為乳白色及熱安定性稍低
‧在6.6至7.4之範圍內，下列試驗緩衝劑對HMW形成無明確的pH效應傾向：組胺酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽和Tris
‧雖然在10mM時檸檬酸鹽和磷酸鹽似乎為最佳的緩衝劑，但緩衝劑對於HMW形成效應非常弱
B)第I/IIa階段調配物之pH微調
為了測定相同的操作上pH對HMW形成的影響，係於第I階段調配物上於範圍6.7至7.2內篩選pH(分析#H04-187)。
DSC
DSC結果顯示，所有的調配物係與參照物相當(pH 7.0)(參見圖29)。
SEC之HMW演變
當pH從6.7增加至7.2時，HMW形成有輕微降低的傾向(參見圖30)，然而，此現象僅在RT下24h後才變得明顯(pH 6.7為+4.1%而pH 7.2為+3.4%)。
結論
以緩衝劑磷酸鹽2.2mM/Tris 1.3mM(調配物第I階段)，在RT下24h後於範圍6.7至7.2內有些微pH效應。然而，此效應為微弱的，因為就前16h並不明顯。由此確認了在此pH範圍內，pH對HMW形成之微弱效應。
C)緩衝劑濃度
檸檬酸鹽和磷酸鹽係以比10mM更小的濃度作測試：0、1.75和5.25mM，以便於調查緩衝劑濃度對HMW形成的影響(分析#H04-185)。pH係設定在試驗範圍的中間點：pH=6.8。所有的調配物含有72mM之甘胺酸用以調整滲透壓，及如在關於結果和討論部份之開始中所言，1.75%蔗糖和約0.07% PS80。
DSC
DSC結果顯示，所有的調配物係與參照物相當(調配物第I階段)(參見圖31)。注意，不含緩衝劑的甘胺酸(185A2)比其他試驗的調配物安定性略低(Td1約1℃差異)。
SEC之HMW演變
對於二種試驗的緩衝劑，當緩衝劑濃度降低時，HMW形成有降低的傾向，以無緩衝劑和1.75mM之緩衝劑得到最佳結果(例如，在RT 下48h內，檸檬酸鹽10mM為+7.8%及無緩衝劑為+7.0%)(參見圖32)。1.75mM之檸檬酸鹽和無緩衝劑者係與參照物相當(例如，在RT下48h內，檸檬酸鹽為+7.1%及無緩衝劑為+7.0%，而參照物為+6.8%)。
結論
緩衝劑濃度降低對HMW形成動力學具有些微的安定效應。此效應可能與離子強度有關。無緩衝劑和1.75mM檸檬酸鹽緩衝劑就HMW形成而言為最佳的候選物，緊接著為1.75mM磷酸鹽。這些帶有72mM甘胺酸的試驗緩衝劑與第I/IIa階段調配物相當。
實例8-添加劑篩選
添加劑甘胺酸、脯胺酸、組胺酸和Tris之篩選係結合緩衝劑篩選來進行(第一次篩選：分析#H04-150至172)以便於測定賦形劑間潛在的協同性。添加劑氯化鈉、苯甲酸鈉、甘胺酸和蔗糖之篩選(第二次篩選：分析#H04-185至190)係於磷酸鹽或檸檬酸鹽上(來自第一次篩選之最佳緩衝劑選擇(實例7))進行。
調配物含有1.75%蔗糖和約0.07% PS80。
A)氯化鈉和苯甲酸鈉
測試氯化鈉和苯甲酸鈉用以分別評估離子強度和親水性相互作用對HMW形成之效應。這些添加劑係於磷酸鹽1.75mM pH 6.8濃度未超過此第I階段調配物滲透壓上進行試驗(FDS中165mOsm/kg)。
DSC
DSC結果顯示，NaCl調配物係與參照物相當(NaCl之Td1=65.7℃，及參照物為65.6℃)，而苯甲酸鈉調配物熱安定性略低(Td1=65.0℃)。
SEC之HMW演變
對於二種試驗的添加劑，相較於對照物，對HMW形成有明確的負面效應(例如在RT下24h內，38.5mM之NaCl為+5.2%，37.8mM之苯甲酸鈉為+5.2%而參照物為+3.2%)。對於二種賦形劑此演變相類似，在本處僅顯示NaCl結果(參見圖33)。
結論
如所示，對於緩衝劑濃度，帶有NaCl或苯甲酸鈉之離子強度增加對HMW形成動力學有明確的負面效應。再者，親水性相互作用對HMW形成之效應，由於添加了苯甲酸鈉而未觀察到。
B)甘胺酸、脯胺酸甘胺酸、組胺酸和Tris
這些添加劑(甘胺酸、脯胺酸、組胺酸和Tris)係以10mM之濃度進行測試(第一次篩選：分析#H04-150至172).
DSC
DSC結果顯示，所有含上述添加劑之調配物係與無緩衝劑調配物(單獨)相當。
SEC之HMW演變
雖然在RT下48h和5℃係下6天後可看到傾向，但調配物間的差異很小：
‧組胺酸緩衝劑：
-At RT：
Figure TWI679019B_D0060
(no添加劑s)=甘胺酸>脯胺酸>Tris
-At 5℃：
Figure TWI679019B_D0061
>甘胺酸=脯胺酸>Tris
‧檸檬酸鹽緩衝劑：
-At RT：甘胺酸>脯胺酸=組胺酸=Tris=(Tris+甘胺酸)>
Figure TWI679019B_D0062
-At 5℃：甘胺酸>脯胺酸=組胺酸=Tris=(Tris+甘胺酸)=
Figure TWI679019B_D0063
‧磷酸鹽緩衝劑：
-At RT：甘胺酸=脯胺酸=
Figure TWI679019B_D0064
>組胺酸=Tris
-At 5℃：甘胺酸>脯胺酸=
Figure TWI679019B_D0065
=組胺酸=Tris
‧Tris緩衝劑：
-At RT：甘胺酸>
Figure TWI679019B_D0066
=組胺酸
-At 5℃：甘胺酸=
Figure TWI679019B_D0067
=組胺酸
結論
有關HMW形成，這些添加劑的效應微微弱的，雖然可到有傾向：
‧10mM之甘胺酸具有些微正面效應
‧10mM之組胺酸和脯胺酸似乎無效應
‧10mM之Tris不具有安定效應及可能有些微的不安定效應
C)蔗糖和甘胺酸
在第二次篩選中(分析#H04-185)，另外量的2.4%蔗糖(除了包含在所有調配物中之已添加的1.75%蔗糖之外，其得到總計4.15%(w/v)的蔗糖)和濃度72mM之甘胺酸係於最佳選擇的緩衝劑(參見關於緩衝劑篩選部份)進行測試。將這些濃度最大化以不超過此調配物第I階段滲透壓(FDS中165mOsm/kg)。
DSC
DSC結果顯示，所有的蔗糖2.4%和甘胺酸72mM調配物係與參照物相當(例如就蔗糖之情況，1.75mM磷酸鹽之Td1=65.7℃而參照物為65.6℃)。
SEC之HMW演變
當相較於僅含有蔗糖的調配物對於檸檬酸鹽1.75mM和無緩衝劑，確認甘胺酸有些微正面影響(參見圖34)。然而，此正面影響僅在RT下48h後為明顯的。
結論
有關HMW形成，對於所指的時序表(RT下<24h)，於最佳候選緩衝劑上測試的蔗糖和甘胺酸調配物係與第I階段調配物相當。
實例7-8之結論
對於此研究，製造大約50種調配物並以目前的第I/IIa階段調配物並列作比較。範圍從6.2至7.4之pH篩選，涉及所有在此pH範圍內可注射的緩衝劑，單獨或與數種賦形劑(皆為GRAS)組合，用以評估賦形劑間潛在的協同性。
此處為主要的結論：‧pH值約6.2降低了前導抗體溶解度：以琥珀酸鹽和組胺酸分別觀察到凝膠形成和沉澱；‧此外，組胺酸應避免在pH 6.6，因為溶液為乳白色及熱安定性稍低；‧在介於6.6至7.4之pH範圍，對HMW形成動力學無明確的pH效應；‧增加離子強度對HMW形成動力學有不穩定效應；‧磷酸鹽和檸檬酸鹽為最佳的試驗緩衝劑，前提為其係在低濃度例如1.75mM時；‧在所有試驗的賦形劑中，最佳的安定效應係由10和72mM甘胺酸及2.4%蔗糖所得到。然而，此安定效應並未使HMW形成顯著減緩；及‧脯胺酸，其在10mM時無效應，可用作為等張劑(91mM脯胺酸之效應(在FDS第I階段調配物中之脯胺酸濃度)並未就有關HMW形成作評估(例如，評估有或無脯胺酸之FDS第I階段調配物)。
總之，實例7-8之結果並未鑑定出可就HMW形成顯著改善目前調配物之新的賦形劑組合。亦即，實例7-8之結果確認了實例1-6之結果。建議保留目前第I/IIa階段的調配物用於第IIb階段研究。因此目前的調配物係如下(參見表31)：磷酸鹽6.5mM/Tris 3.7mM,pH 7.0,PS80 0.2%(w/v)，蔗糖5%(w/v)，脯胺酸3%(w/v)。
目前調配物之用量調整(在無添加新的賦形劑下，微調賦形劑濃度)可針對第III階段/商業調配物來進行。
<110> 賽諾菲公司
<120> 抗IL4/抗IL-13之雙特異性抗體調配物
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<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-IL13 hB-B13 VL3
<400> 1
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-IL13 hB-B13 VH2
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<223> h8D4-8 VH2 CDR1
<400> 19
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h8D4-8 VH2 CDR2
<400> 20
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h8D4-8 VH2 CDR3
<400> 21

Claims (29)

  1. 一種安定的抗體調配物，係包括：一雙特異性抗-IL-4/抗-IL-13抗體或其抗原結合片段，其包括式輕鏈可變區1(VL1)-連接子-輕鏈可變區2(VL2)之輕鏈和式重鏈可變區1(VH1)-連接子-重鏈可變區2(VH2)之重鏈，其中VL1和VH1係形成IL-13抗原結合區，而VL2和VH2係形成IL-4抗原結合區，其中抗體或其抗原結合片段之濃度為從約50mg/mL至約150mg/mL；及一適合將調配物的pH維持在pH 7之緩衝系統，其中該緩衝系統包含Tris緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑；且其中該調配物具有15mM或更低的鹽濃度，以便於降低調配物之離子強度，且其中該調配物包含甘露醇。
  2. 如請求項1之調配物，其中VL1係包括SEQ ID NO：1之CDR序列；VH1係包括SEQ ID NO：2之CDR序列；VL2係包括SEQ ID NO：3之CDR序列；及VH2係包括SEQ ID NO：4或5之CDR序列。
  3. 如請求項1之調配物，其中VL1係包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；VH1係包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；VL2係包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VH2係包括SEQ ID NO：4或5之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之調配物，其中該輕鏈係包括式N-VL1-連接子-VL2-CL，其中CL為抗體之輕鏈恆定區，且其中重鏈係包括式N-VH1-連接子-VH2-CH1-CH2-CH3，其中CH2-CH3係相當抗體之Fc區。
  5. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該連接子係包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  6. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原結合片段進一步係包括一恆定區。
  7. 如請求項6之調配物，其中該恆定區係由CH1、CH2、CH3和CL組成之群中選出。
  8. 如請求項1之調配物，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段為一人源化IgG4雙特異性抗體或其抗原結合片段。
  9. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原結合片段之濃度為100mg/mL。
  10. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該緩衝系統係包括至少二種緩衝劑。
  11. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該緩衝系統濃度為10mM。
  12. 如請求項1之調配物，其中該Tris緩衝劑濃度為3.7mM。
  13. 如請求項1之調配物，其中該磷酸鹽緩衝劑濃度為6.3mM。
  14. 如請求項1之調配物，其中該Tris緩衝劑濃度為3.7mM，而該磷酸鹽緩衝劑濃度為6.3mM。
  15. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該調配物進一步係包括一非離子界面活性劑。
  16. 如請求項15之調配物，其中該非離子界面活性劑濃度為0.05%至0.2%(w/v)。
  17. 如請求項15之調配物，其中該非離子界面活性劑為聚山梨醇酯。
  18. 如請求項17之調配物，其中該聚山梨醇酯為聚山梨醇酯80。
  19. 如請求項18之調配物，其中該聚山梨醇酯80濃度為0.05%至0.2%(w/v)。
  20. 如請求項19之調配物，其中該聚山梨醇酯80濃度為0.2%(w/v)。
  21. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該調配物進一步係包括糖。
  22. 如請求項21之調配物，其中該糖濃度為5%(w/v)。
  23. 如請求項21之調配物，其中該糖為雙糖。
  24. 如請求項23之調配物，其中該雙糖為蔗糖。
  25. 如請求項24之調配物，其中該蔗糖濃度為5%(w/v)。
  26. 如請求項1之調配物，其中該甘露醇濃度為1%至3%(w/v)。
  27. 如請求項1之調配物，其中該甘露醇濃度為3%(w/v)。
  28. 如請求項1-4中任一項之調配物，其中該調配物為一凍乾調配物。
  29. 一種安定的凍乾抗體調配物，係包括：100mg/mL的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：2和4之胺基酸序列的重鏈可變區及一包含SEQ ID NO：1和3之胺基酸序列的輕鏈可變區；10mM的緩衝系統，其中該緩衝系統係包括3.7mM之Tris緩衝劑濃度和6.3mM之磷酸鹽緩衝劑濃度；0.2%(w/v)聚山梨醇酯80；5%(w/v)蔗糖；及3%(w/v)甘露醇；其中該調配物的pH為pH 7。
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