[go: up one dir, main page]

RS55716B1 - Terapeutski i dijagnostički cilj - Google Patents

Terapeutski i dijagnostički cilj

Info

Publication number
RS55716B1
RS55716B1 RS20170147A RSP20170147A RS55716B1 RS 55716 B1 RS55716 B1 RS 55716B1 RS 20170147 A RS20170147 A RS 20170147A RS P20170147 A RSP20170147 A RS P20170147A RS 55716 B1 RS55716 B1 RS 55716B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
bst1
antibody
cancer
antibodies
protein
Prior art date
Application number
RS20170147A
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Rohlff
Alasdair Stamps
Original Assignee
Oxford Biotherapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxford Biotherapeutics Ltd filed Critical Oxford Biotherapeutics Ltd
Publication of RS55716B1 publication Critical patent/RS55716B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01M—PROCESSES OR MEANS, e.g. BATTERIES, FOR THE DIRECT CONVERSION OF CHEMICAL ENERGY INTO ELECTRICAL ENERGY
    • H01M10/00—Secondary cells; Manufacture thereof
    • H01M10/05—Accumulators with non-aqueous electrolyte
    • H01M10/058—Construction or manufacture
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01M—PROCESSES OR MEANS, e.g. BATTERIES, FOR THE DIRECT CONVERSION OF CHEMICAL ENERGY INTO ELECTRICAL ENERGY
    • H01M50/00—Constructional details or processes of manufacture of the non-active parts of electrochemical cells other than fuel cells, e.g. hybrid cells
    • H01M50/10—Primary casings; Jackets or wrappings
    • H01M50/147—Lids or covers
    • H01M50/148—Lids or covers characterised by their shape
    • H01M50/15—Lids or covers characterised by their shape for prismatic or rectangular cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/10—Energy storage using batteries

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Description

Opis pronalaska
UVOD
[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na identifikaciju membranskog proteina povezanog sa akutnom mijeloidnom leukemijom (AML), hroničnom limfocitnom leukemijom B-ćelija, kancerom dojke, kolorektalnim kancerom, kancerom bubrega, kancerom glave i vrata, kancerom pluća i kancerom pankreasa koji se može primeniti kao terapeutski cilj za lečenje kancera ili kao marker za takve kancere. Taj protein naročito predstavlja biološki cilj protiv koga se mogu napraviti afinitetni reagensi, uključujući terapeutska antitela, ili drugi farmaceutski agensi. Pronalazak se takođe odnosi na primenu takvih afinitetnih reagenasa za lečenje ili dijagnozu kancera, kao što su akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija B-ćelija, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća ili kancer pankreasa. Otkrivanje se takođe odnosi na depleciju ekspresije proteina imunih ćelija npr. primenom monoklonskih antitela za lečenje zapaljenskih bolesti.
STANJE TEHNIKE
[0002]Najveći izazovi u lečenju akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije B-ćelija, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća i kancera pankreasa su ti da se poboljšaju stope rane detekcije, da se pronađu novi neinvazivni markeri koji se mogu primeniti za praćenje progresije bolesti i identifikaciju relapsa, kao i da se pronađu poboljšane i manje toksične terapije, a naročito za uznapredovalu bolest, gde je 5-godišnje preživljavanje još uvek slabo. Postoji velika potreba da se identifikuju ciljevi koji su specifičniji za ćelije kancera, npr. one koje se izražavaju na površini tumorskih ćelija, tako da se one mogu napasti obećavajućim novim pristupima, kao što su imunoterapeutici i ciljani toksini.
[0003]U US2009/232822 su opisani metodi za dijagnostikovanje i detekciju bolesti povezanih sa plućima. Njime su realizovani jedan ili više proteina ili fragmenata, molekula peptida ili nukleinskih kiselina koji se diferencijalno izražavaju u plućnim bolestima (LCAT) i antitela koja se vezuju za LCATs. Njime su takođe realizovani metodi za lečenje bolesti povezane sa plućima.
[0004]U US6414113 su opisani peptidi koji mogu da se vezuju za BST-1 i peptidi koji mogu da se vezuju za BST-1 i inhibiraju aktivnost ADP-ribozil ciklaze i aktivnost cADP-riboza hidrolaze. Ovi peptidi su korisni za lečenje reumatoidnog artritisa i multiplog mijeloma.
[0005]Ortolan, E., et al, (2010), J Natl Cancer Inst, tom102, str. 1160-1177, opisuje ulogu CD157 u kontroli ćelijske migracije i peritonealne invazije kod raka jajnika, što može biti korisno kao prognostičko oruđe i terapeutski cilj.
[0006]Pronalazak je pokazao da se BST1 može izraziti na monocitima i granulocitima, od kojih su i jedni i drugi povezani sa bolestima kao što su astma, giht, kron, lupus i dijabetes, i aktivirani u njima. Monociti su takođe uključeni u razvoj ateroskleroznih plakova. Do sada za BST1 nije bilo navedeno da potiče iz ćelijskih membrana kod akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije B-ćelija, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća ili kancera pankreasa i on predstavlja protein sa novom terapeutskom i dijagnostičkom vrednosti.
SUŠTINA PRONALASKA
[0007]Predmetnim pronalaskom je otkrivena detekcija ADP-ribozil ciklaze 2, koja se u nastavku naziva BST1, u ekstraktima membrana tkiva različitih bolesti, npr. akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije B-ćelija, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća i kancera pankreasa, koje se u nastavku nazivaju 'bolesti prema pronalasku', ali ne i u ekstraktima membrana normalnih tkiva.
[0008]Diferencijalna ekspresija BST1 kod različitih kancera dozvoljava da taj protein bude ciljan kao osnova za terapije za takve kancere bazirane na afinitetnom reagensu, npr. antitelu. Shodno tome, BST1, koji je povezan sa kancerom, se može primeniti za generisanje afinitetnih reagenasa, uključujući antitela, koja se specifično vezuju za BST1 i na koja, kao osnova za lečenje, mogu ciljati takvi afinitetni reagensi. Afinitetni reagensi, uključujući antitela, koja ciljaju protein na ćelijskoj površini ćelija kancera se mogu primeniti u lečenju kancera pomoću mnoštva mehanizama, uključujući (i) lizu posredovanu komplementom ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), (ii) lizu lekovima ili toksinom, odnosno toksinima konjugovanim sa takvim antitelima ili (iii) inhibiciju fiziološke funkcije takvog proteina, koji može podsticati rast ćelija kancera, npr. pomoću signalnih puteva. Važan aspekt takvog lečenja baziranog na antitelima je taj što je normalni profil ekspresije ciljnog proteina, u smislu raspodele u tkivu i nivoa ekspresije, takav da bilo kakvo ciljanje na ciljni protein pomoću antitela ne dovodi do neželjenih efekata zbog vezivanja za normalna tkiva.
[0009]Humana varijanta BST1 cele dužine je prikazana sa SEQ ID NO: 1.
[0010]Predmetni pronalazak pokazuje vezu BST1 sa različitim kancerima i generisanje antitela specifičnih za BST1. Takva antitela se koriste za verifikaciju profila ekspresije BST1 pomoću imunohistohemije i analize protočnom citometrijom, što zahvaljujući specifičnom vezivanju otkriva prisustvo BST1 na površini ćelija različitih kancerskih tkiva i odsustvo BST1 u normalnim tkivima. Pored toga, pokazano je da takva antitela ispunjavaju zahteve za citolitičke anti-kancerske agense zahvaljujući vezivanju njihovih ćelijskih površina za kancerske ćelijske linije, internalizaciji posle vezivanja za kancerske ćelijske linije, vezivanju živih ćelijaex- vivoza maligne ćelije i, krucijalno, njihovoj sposobnosti da ubijaju ćelije kancera putem internalizacije toksina.
[0011]Pronalaskom je realizovan afinitetni reagens koji se vezuje za BST1 za primenu u lečenju ili profilaksi kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru.
[0012]Kancer je prvenstveno jedna od bolesti prema pronalasku.
[0013]Pronalaskom je takođe realizovan afinitetni reagens koji je definisan u patentnim zahtevima, a koji se vezuje za BST1 za primenu u lečenju ili profilaksi kancera koji je gore opisan.
[0014]Pronalaskom je takođe realizovana primena afinitetnog reagensa koji je definisan u patentnim zahtevima, a koji se vezuje za BST1 u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu kancera koji je gore opisan.
[0015]Afinitetni reagensi za primenu u pronalasku se prvenstveno specifično vezuju za BST1.
[0016]Afinitetni reagens je antitelo, npr. celo antitelo, ili njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela. Poželjni afinitetni reagensi obuhvataju antitela, na primer, monoklonska antitela.
[0017]Afinitetni reagens može biti himerično antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, jednolančano antitelo, defukozilovano antitelo ili bispecifično antitelo.
[0018]Funkcionalni fragmenti antitela obuhvataju unitelo, domensko antitelo ili nanotelo.
[0019]Mimetici antitela obuhvataju afitelo, DARPin, antikalin, avimer, versatelo ili duokalin.
[0020]Afinitetni reagensi za primenu u pronalasku mogu sadržati ili biti konjugovani sa terapeutskom grupom, kao što je citotoksična grupa ili radioaktivni izotop. Afinitetni reagens može biti konjugat antitelo-lek ili imunokonjugat.
[0021]U primeni prema pronalasku afinitetni reagens može pobuditi ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) ili može pobuditi citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Afinitetni reagens može indukovati apoptozu tumorskih ćelija, ubiti ili smanjiti broj matičnih ćelija kancera i/ili ubiti ili smanjiti broj cirkulišućih tumorskih ćelija. Afinitetni reagensi mogu modulisati fiziološku funkciju BST1, inhibirati vezivanje liganda i/ili inhibirati puteve transdukcije signala.
[0022]Ovde je takođe opisan metod za lečenje ili profilaksu kancera, pri čemu je BST1 izražen u pomenutom kanceru, koji sadrži administraciju subjektu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine hibridizujućeg agensa koji može da se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira BST1.
[0023]Takođe je opisan hibridizujući agens koji može da se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira BST1 za primenu u lečenju ili profilaksi gore opisanog kancera.
[0024]Takođe je opisana primena hibridizujućeg agensa koji može da se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira BST1 u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu gore opisanog kancera.
[0025]Hibridizujući agensi se prvenstveno specifično vezuju za nukleinsku kiselinu koja kodira BST1.
[0026]Podesni hibridizujući agensi za primenu obuhvataju inhibitornu RNK, kratku interferentnu RNK (siRNK), kratku ukosničnu RNK (shRNK), mikroRNK (miRNK), i anti-sensnu nukleinsku kiselinu ili komplementarnu DNK (cDNK), oligonukleotide i ribozime.
[0027]Pronalaskom je takođe realizovan postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, ili praćenja efekta leka ili terapije za kancer, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, kod subjekta koji obuhvata detekciju prisustva ili nivoa BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili koji sadrži detekciju promene njegovog nivoa kod pomenutog subjekta.
[0028]Takav postupak može sadržati detekciju prisustva BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, u kome (a) prisustvo povišenog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata kod subjekta se upoređuje sa nivoom kod zdravog subjekta, ili (b) prisustvo detektabilnog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata kod subjekta se upoređuje sa odgovarajućim nedetektabilnim nivoom kod zdravog subjekta indikator prisustva kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, kod pomenutog subjekta.
[0029]Pronalaskom je takođe realizovan postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, ili praćenja efekta leka ili terapije za kancer, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva ili nivoa antitela sposobnih za imunospecifično vezivanje za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata.
[0030]U dijagnostičkim postupcima prema pronalasku prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili prisustvo ili nivo antitela sposobnih za imunospecifično vezivanje za BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, se detektuje analizom biološkog uzorka dobijenog od subjekta.
[0031]Prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, se može detektovati primenom afinitetnog reagensa koji se vezuje za BST1. Afinitetni reagens može biti bilo koji gore navedeni podesni afinitetni reagens. Afinitetni reagens može sadržati ili biti konjugovan sa detektabilnim markerom.
[0032]U bilo kom gore navedenom aspektu pronalaska subjekt može biti čovek.
[0033]Takođe je opisan postupak za identifikaciju agensa za lečenje ili profilaksu kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, pri čemu postupak sadrži (a) dovođenje BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, u kontakt sa agensom kandidatom; i (b) određivanje da li se taj agens vezuje za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata. Postupak može dalje takođe sadržati korak testiranja sposobnosti agensa koji se vezuje za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata, da inhibira kancer, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru.
[0034]Agensi koji se identifikuju primenom postupka su prvenstveno za lečenje ili profilaksu bolesti prema pronalasku.
[0035]Agensi koji se identifikuju primenom takvih postupaka mogu biti mali molekuli i mogu modulisati aktivnost BST1, smanjiti vezivanje liganda za BST1.
[0036]U različitim primerima izvođenja pronalaska koji su ovde opisani specifični tipovi kancera koji se mogu pomenuti su bolesti prema pronalasku.
[0037]U jednom primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je akutna mijeloidna leukemija (AML).
[0038]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kancer dojke.
[0039]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kolorektalni kancer.
[0040]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kancer bubrega.
[0041]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kancer glave i vrata.
[0042]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kancer pluća, npr. kancer ne-malih ćelija pluća i/ili kancer malih ćelija pluća.
[0043]U sledećem primeru izvođenja kancer koji treba da bude detektovan, sprečen ili lečen je kancer pankreasa.
[0044]Drugi aspekti predmetnog pronalaska su navedeni u nastavku i u priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0045]Fig. 1a, 1b, 1c, 1d i 1e prikazuju aminokiselinsku sekvencu proteina prema pronalasku. Tandem peptidi koji su detektovani eksperimentalno pomoću LCMS su podvučeni. Fig. 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu proteina prema pronalasku. Tandem peptidi koji su detektovani eksperimentalno pomoću iTRAO kod kancera ne-malih ćelija pluća su podvučeni. Fig. 3a i 3b prikazuju rezultate analize RNK profilisanja za BST1. Fig. 3c prikazuje rezultate komparativnog RT-PCR profilisanja na skupu normalnih tkiva koja ispoljavaju ekspresiju BST1 zajedno sa CD33. Fig. 4a prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom za BST1 kod AML pacijenata. Fig. 4b prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom za BST1 i CD33 na podskupu humanih leukocita. Fig. 4c prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom za BST1 na A549 i H226 ćelijama. Fig. 5a do 5b prikazuju internalizacije anti-BST1 monoklonskih antitela pomoću A549 i H226 ćelija, uz korišćenje MabZAP testa.
Fig. 6a i 6b
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0046]Predmetnim pronalaskom su realizovani postupci i kompozicije za primenu u skriningu, dijagnostici i terapiji bolesti prema pronalasku, stratifikaciji pacijenata, za praćenje efektivnosti lečenja bolesti prema pronalasku, a takođe su opisane i metode za razvoj leka za lečenje bolesti prema pronalasku.
[0047]Pronalazak koji je detaljno opisan u nastavku obuhvata administraciju terapeutskih kompozicija subjektu, npr. sisarskom subjektu, radi lečenja ili prevencije kancera npr. bolesti prema pronalasku. Pronalaskom su takođe realizovani postupci i kompozicije za klinički skrining i dijagnozu kancera npr. bolesti prema pronalasku kod sisarskog subjekta radi identifikacije pacijenata za koje je najverovatnije da će reagovati na specifično terapeutsko lečenje, za praćenje rezultata terapije kancera npr. bolesti prema pronalasku, za skrining lekova i za razvoj lekova.
[0048]Prema jednom aspektu pronalaskom je realizovan agens koji se može specifično vezivati za BST1, ili njegov fragment, ili agens koji može detektovati aktivnost BST1 za primenu u lečenju, skriningu, detekciji i/ili dijagnostikovanju bolesti, kao što je kancer, a naročito bolesti prema pronalasku.
[0049]Takođe je opisan afinitetni reagens koji može da se specifično vezuje za BST1 ili njegov fragment, na primer, afinitetni reagens koji sadrži ili je konjugovan sa detektabilnim markerom ili sadrži ili je konjugovan sa terapeutskom grupom, kao što je citotoksična grupa. Afinitetni reagens može biti, na primer, antitelo.
[0050]Afinitetni reagensi za primenu u pronalasku se mogu vezivati za epitop od BST1 koji sadrži jedan ili više delova SEQ ID NO: 13.
[0051]Takođe je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu afinitetnog reagensa koji može da se specifično vezuje za BST1 ili njegov fragment.
[0052]Takođe je opisana primena BST1 polipeptida, ili jednog ili više njegovih fragmenata ili derivata, za lečenje ili profilaksu npr. bolesti prema pronalasku.
[0053]Takođe je opisana primena BST1 polipeptida, jednog ili više njegovih fragmenata ili derivata za proizvodnju leka za lečenje ili profilaksu npr. bolesti prema pronalasku.
[0054]Takođe je opisan postupak lečenja koji sadrži davanje terapeutski efektivne količine BST1 polipeptida, jednog ili više njegovih fragmenata ili derivata, ili jednog ili više njegovih fragmenata ili derivata, za lečenje ili profilaksu npr. bolesti prema pronalasku.
[0055]Takođe je opisan metod za lečenje ili profilaksu npr. bolesti prema pronalasku kod subjekta, ili vakcinaciju subjekta npr. protiv bolesti prema pronalasku, koji sadrži korak davanja subjektu efektivne količine BST1 polipeptida i/ili jednog ili više njegovih antigenih ili imunogenih fragmenata, na primer, kao vakcine.
[0056]Sisarski subjekt može biti nehumani sisar, ali je generalno humani, kao što je odrasli čovek, tj. humani subjekt star najmanje 21 (na primer, najmanje 35, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, ili najmanje 80) godina.
[0057]Takođe je opisana kompozicija koja može da pobudi imunu reakciju kod subjekta, koja kompozicija sadrži BST1 polipeptid i/ili jedan ili više njegovih antigenih ili imunogenic fragmenata, i jedan ili više podesnih adjuvanasa (podesni adjuvansi su razmotreni u nastavku).
[0058]Kompozicija koja može da pobudi imunu reakciju može biti, na primer, pripremljena kao vakcina koja sadrži BST1 polipeptid ili njegove derivate, i/ili jedan ili više njegovih antigenih ili imunogenih fragmenata.
[0059]Radi jasnoće otkrivanja, ali ne kao ograničavajuće, pronalazak će biti opisan na osnovu analize mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva. Međutim, kao što će shvatiti stručnjak iz odgovarajuće oblasti, testovi i tehnike koji su opisani u nastavku se mogu primeniti i na druge tipove uzoraka pacijenata, uključujući telesne tečnosti (npr. krv, urin ili pljuvačku), uzorak tkiva pacijenta koji ima rizik da ima bolesti prema pronalasku (npr. biopsiju, kao što je mijeloidna biopsija, biopsija dojke, kolorektalna, bubrežna, plućna ili pankreasna biopsija) ili njegov homogenat. Postupci i kompozicije prema predmetnom pronalasku su posebno podesni za skrining i dijagnozu kod živog subjekta, ali se takođe mogu primeniti i za postmortem dijagnozu kod subjekta, na primer, za identifikaciju članova porodice koji su pod rizikom od razvijanja iste bolesti.
[0060]Ovde je opisan postupak za dobijanje anti-BST1 antitela, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake: pripreme ćelije domaćina tako da sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema pronalasku; kultivisanje ćelije domaćina u kulturi za ćelije domaćine; obezbeđivanje uslova kulturi za ćelije domaćine u kojima će se izraziti jedan ili više molekula nukleinske kiseline; i sakupljanje antitela iz ćelije domaćina ili iz kulture za ćelije domaćine.
[0061]Druga otkrivanja su usmerena na postupak pravljenja antitela prema pronalasku, koji sadrži korake: imunizaciju transgenske životinje koja sadrži humane imunoglobulinske gene sa BST1 peptidom; sakupljanje B-ćelija od pomenute transgenske životinje; pravljenje hibridoma od pomenutih B-ćelija; selekciju hibridoma koji izražavaju antitela koja se vezuju za BST1; i sakupljanje pomenutih antitela koja se vezuju za BST1 iz pomenutih selekcionisanih hibridoma.
[0062]U drugim primerima, postupak pravljenja anti-BST1 antitela, sadrži korake: (a) imunizaciju transgenske životinje koja sadrži humane imunoglobulinske gene sa BST1 peptidom; (b) sakupljanje mRNK iz B ćelija pomenute transgenske životinje; (c) pretvaranje pomenute mRNK u cDNK; (d) izražavanje pomenute cDNK u fagima tako da su anti-BST1 antitela koja su kodirana pomenutom cDNK prisutna na površini pomenutih faga; (e) selekciju faga koji prezentuju anti-BST1 antitela; (f) sakupljanje molekula nukleinske kiseline iz pomenutih selekcionisanih faga koji kodiraju pomenute anti-BST1 imunoglobuline; (g) izražavanje pomenutih sakupljenih molekula nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu; i (h) sakupljanje antitela koja se vezuju za BST1 iz pomenute ćelije domaćina.
[0063]Takođe je opisana primena BST1 polipeptida, jednog ili više njegovih imunogenih fragmenata ili derivata za lečenje ili profilaksu npr. bolesti prema pronalasku.
[0064]Dalje su opisani metodi lečenja npr. bolesti prema pronalasku, koji sadrže davanje pacijentu terapeutski efektivne količine jedinjenja koje moduliše (npr. povećava ili smanjuje) ili komplementira izražavanje ili biološku aktivnost (ili oba) proteina prema pronalasku kod pacijenata koji imaju npr. bolesti prema pronalasku, da bi se (a) sprečila pojava ili razvoj npr. bolesti prema pronalasku; (b) sprečila progresija npr. bolesti prema pronalasku; ili (c) ublažili simptomi npr. bolesti prema pronalasku.
[0065]Prema sledećem aspektu pronalaska realizovali smo postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga bolesti prema pronalasku ili praćenja efekta npr. anti-kancerskog leka ili terapije usmerenih protiv bolesti prema pronalasku kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva ili nivoa BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata ili prisustva ili nivoa aktivnosti BST1 ili koji sadrži detekciju promene njegovog nivoa kod pomenutog subjekta.
[0066]Prema sledećem aspektu pronalaska realizovali smo postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga npr. bolesti prema pronalasku kod subjekta kandidata koji sadrži detekciju prisustva BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata ili prisustva aktivnosti BST1 kod pomenutog subjekta kandidata, u kome (a) prisustvo povišenog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata ili prisustvo povišenog nivoa BST1 aktivnosti kod subjekta kandidata u poređenju sa nivoom kod zdravog subjekta ili (b) prisustvo detektabilnog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata ili prisustvo detektabilnog nivoa BST1 aktivnosti kod subjekta kandidata u poređenju sa odgovarajućim nedetektabilnim nivoom kod zdravog subjekta ukazuje na prisustvo npr. bolesti prema pronalasku kod pomenutog subjekta.
[0067]Ovde je takođe opisan postupak praćenja progresije npr. bolesti prema pronalasku kod subjekta ili praćenja efekta npr. anti-kancerskog leka ili terapije usmerenih protiv bolesti prema pronalasku koji sadrži detekciju prisustva BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili prisustva nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili prisustva aktivnosti BST1 kod pomenutog subjekta kandidata u prvom vremenskom trenutku i kasnijem vremenskom trenutku, prisustva povišenog ili sniženog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata ili povišenog ili sniženog nivoa nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili prisustva povišenog ili sniženog nivoa BST1 aktivnosti kod subjekta u kasnijem vremenskom trenutku u poređenju sa nivoom kod subjekta u pomenutom prvom vremenskom trenutku, što ukazuje na progresiju ili regresiju npr. bolesti prema pronalasku ili ukazuje na efekat ili izostanak efekta npr. anti-kancerskog leka ili terapije usmerenih protiv bolesti prema pronalasku kod pomenutog subjekta.
[0068]Prema sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga za bolesti prema pronalasku ili praćenje efekta anti-kancerskog leka ili terapije usmerenih protiv bolesti prema pronalasku kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva ili nivoa antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop, ili koji sadrži detekciju promene njegovog nivoa kod pomenutog subjekta.
[0069]Prema sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga za bolesti prema pronalasku kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop kod pomenutog subjekta, u kome (a) prisustvo povišenog nivoa antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1 ili pomenuti jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop kod pomenutog subjekta u poređenju sa nivoom kod zdravog subjekta ili (b) prisustvo detektabilnog nivoa antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1 ili pomenuti jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop kod pomenutog subjekta u poređenju sa odgovarajućim nedetektabilnim nivoom kod zdravog subjekta ukazuje na prisustvo pomenutog kancera kod pomenutog subjekta.
[0070]Jedan poseban postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga kancera, npr. bolesti prema pronalasku sadrži: dovođenje u kontakt sa biološkim uzorkom koji treba da bude testiran na BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop; i detekciju prisustva antitela kod subjekta koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop.
[0071]Dalje je ovde opisan postupak praćenja progresije kancera, npr. bolesti prema pronalasku ili praćenja efekta anti-kancerskog leka ili terapije usmerenih protiv bolesti prema pronalasku kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop kod pomenutog subjekta u prvom vremenskom trenutku i u kasnijem vremenskom trenutku, prisustva povišenog ili sniženog nivoa antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop kod pomenutog subjekta u kasnijem vremenskom trenutku u poređenju sa nivoom kod pomenutog subjekta u pomenutom prvom vremenskom trenutku, uključujući progresiju ili regresiju pomenutog kancera, ili efekta ili izostanka efekta pomenutog anti-kancerskog leka ili terapije kod pomenutog subjekta.
[0072]Prisustvo antitela koja mogu da se imunospecifično vezuju za BST1, ili jedan ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop se obično detektuje analizom biološkog uzorka dobijenog od pomenutog subjekta (primeri bioloških uzoraka su navedeni gore, npr. uzorak je uzorak mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva, ili još uzorak krvi ili pljuvačke). Postupak obično sadrži korak uzimanja pomenutog biološkog uzorka za analizu od pomenutog subjekta.
[0073]Antitela koja se mogu detektovati obuhvataju IgA, IgM i IgG antitela.
[0074]U bilo kom od gornjih postupaka, nivo koji se može detektovati kod subjekta kandidata koji ima kancer, npr. bolesti prema pronalasku je 2 ili više puta veći nego nivo kod zdravog subjekta.
[0075]U jednom aspektu pronalaska se koriste jednodimenzionalna elektroforeza ili drugi podesni metodi za analizu uzoraka mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva subjekta, a prvenstveno živog subjekta, da bi se izmerilo izražavanje proteina prema pronalasku za skrining ili dijagnozu npr. bolesti prema pronalasku, da bi se pratila efektivnost terapije bolesti prema pronalasku, ili za razvoj lekova.
[0076]Kada se ovde koristi, izraz "protein prema pronalasku" ili "BST1" se odnosi na protein ilustrovan na Fig. 1 koji je eksperimentalno detektovan tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom kancera uzoraka tkiva i Fig. 2 koji je eksperimentalno detektovan izotopskim obeležavanjem radi apsolutne & relativne kvantitacije. Derivati proteina sa ovom sekvencom mogu biti korisni za iste svrhe koje su ovde opisane.
[0077]Ovaj protein je bio identifikovan u ekstraktima membranskog proteina u uzorcima kancerskog tkiva pacijenata sa kancerom, pomoću metoda i aparata iz poželjnih tehnologija koji su opisani u Primerima 1 i 2 (npr. tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom i izotopskim obeležavanjem radi apsolutne & relativne kvantitacije tripsinskom digestijom ekstrakata membranskog proteina). Peptidne sekvence su bile upoređene sa SWISS-PROT i trEMBL bazama podataka (koje drže the Svviss Institute of Bioinformatics (SIB) i the European Bioinformatics Institute (EBI), koje se nalaze na raspolaganju na www.expasy.com), i bio je identifikovan sledeći unos: O10588, ADP-ribozil ciklaza 2. Nukleotidna sekvenca koja kodira ovaj protein se nalazi pod pristupnim brojem NM 004334.2.
[0078]ADP-ribozil ciklaza 2 (takođe poznata kao antigen stromalnih ćelija koštane srži 1 (engl. Bone marrow stromal antigen 1, skr. BST1 ili CD157) je lipidno vezani, bi-funkcionalni ektoenzim koji katalizuje ciklizaciju i hidrolizu ribonukleotida. On generiše nukleotidne druge mesendžere ciklične ADP-riboze i ADP-riboze koji mogu da aktiviraju oslobađanje kalcijuma i fosforilaciju proteina (FEBS Lett. 1994, 356(2-3):244-8). On može da podrži rast pre-B ćelija na parakrini način, eventualno putem generisanja NAD+ metabolita (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91:5325-5329; J Biol Chem. 2005, 280:5343-5349).
[0079]Imunohistohemijski eksperimenti (vidi Primer 3) su pokazali jako bojenje kod kancera ne-malih ćelija pluća.
[0080]Takođe su bili izvedeni eksperimenti sa RNK profilisanjem i protočnom citometrijom i oni su pokazali da se BST1 izražava u visokim nivoima u cirkulišućim ćelijama kancera kod pacijenata sa akutnom mijeloidnom leukemijom (AML). U ovim nivoima bi antitelo sa ADCC povećanim genetskim inženjeringom moglo biti terapeutski efektivno.
[0081]MabZAP testom je pokazano da se BST1 internalizuje (vidi Primer 9), što ukazuje da bi konjugat antitelo-lek (ADC), mogao biti terapeutski efektivan.
[0082]Ovde opisani protein je koristan, kao i njegovi fragmenti, a naročito njegovi fragmenti koji sadrže epitop npr. njegovi antigeni ili imunogeni fragmenti i derivati. Fragmenti koji sadrže epitop uključujući i antigene ili imunogene fragmente će obično imati dužinu od 12 aminokiselina ili više, npr. 20 aminokiselina ili više, npr. 50 ili 100 aminokiselina ili više. Fragmenti mogu imati 95% ili više od dužine celog proteina, npr. 90% ili više, npr. 75% ili 50% ili 25% ili 10% ili više od dužine celog proteina.
[0083]Alternativno tome, protein/polipeptid koji se ovde upotrebljava ili na koji se ovde poziva može biti ograničen na one koji su specifično navedeni/opisani u predmetnom opisu ili grupu koja je 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili slična sa njim.
[0084]Fragmenti koji sadrže epitop uključujući antigene ili imunogene fragmente će moći da pobude odgovarajuću imunu reakciju kod pacijenta. DNK koja kodira ovde opisani protein je takođe korisna, kao i njeni fragmenti npr. fragmenti DNK koji kodiraju ovde opisani protein, kao što su njeni imunogeni fragmenti. Fragmenti nukleinske kiseline (npr. DNK) koji kodiraju ovde opisani protein mogu imati 95% ili više dužine celog kodirajućeg regiona npr. 90% ili više npr. 75% ili 50% ili 25% ili 10% ili više dužine celog kodirajućeg regiona. Fragmenti nukleinske kiseline (npr. DNK) mogu imati dužinu od 36 nukleotida ili više npr. dužinu od 60 nukleotida ili više npr. 150 ili 300 nukleotida ili više.
[0085]Derivati ovde opisanog proteina obuhvataju varijante na sekvenci u kojoj je napravljena jedna ili više (npr. 1-20, kao što je 15 aminokiselina, ili do 20%, kao što je do 10% ili 5% ili 1% od broja aminokiselina bazirano na celoukupnoj dužini proteina) delecija, insercija ili supstitucija. Supstitucije obično mogu biti konzervativne supstitucije. Derivati će obično imati u suštini istu biološki funkciju kao protein od koga potiču. Derivati će obično biti uporedivo antigeni ili imunogeni sa proteinom od koga potiču. Derivati će obično imati aktivnost vezivanja za ligand, ili sposobnost formiranja kompleksa sa aktivnim receptorom, ili prvenstveno oba, proteina od koga potiču.
[0086]Derivati proteina takođe obuhvataju hemijski tretirani protein, kao što su karboksimetilovani, karboksiamidovani, acetilovani proteini, koji su tretirani, na primer, tokom prečišćavanja.
[0087]Za BST1, detektovani nivo dobijen posle analize tkiva od subjekata koji npr. imaju bolesti prema pronalasku u odnosu na detektovani nivo dobijen posle analize tkiva subjekata koji nemaju npr. bolesti prema pronalasku zavisi od specifičnog analitičkog protokola i tehnike detekcije koja se upotrebljava. Shodno tome, predmetni pronalazak razmatra to da svaka laboratorija uspostavi referentni opseg za subjekte koji nemaju npr. bolesti prema pronalasku u skladu sa analitičkim protokolom i tehnikom detekcije koji su u upotrebi, kao što je uobičajeno u oblasti dijagnostike. Prvenstveno, najmanje jedan kontrolni pozitivni uzorak tkiva od subjekta za koga je poznato da ima npr. bolesti prema pronalasku ili najmanje jedan kontrolni negativni uzorak tkiva od subjekta za koga je poznato da nema npr. bolesti prema pronalasku (i još poželjnije i pozitivni, i negativni kontrolni uzorci) su uključeni u svaku šaržu analiziranih testiranih uzoraka.
[0088]BST1 se može upotrebiti za detekciju, dijagnozu, ili praćenje npr. bolesti prema pronalasku ili za razvoj lekova. U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, tkivo subjekta (npr. subjekta za koga se sumnja da ima bolesti prema pronalasku) se analizira tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom radi detekcije BST1. Povećana količina BST1 u tkivu subjekta u odnosu na tkivo subjekta ili subjekata koji nemaju bolesti prema pronalasku (npr. kontrolni uzorak) ili prethodno određeni referentni opseg ukazuje na prisustvo bolesti prema pronalasku.
[0089]U sledećem primeru izvođenja prema pronalasku, tkivo subjekta (npr. subjekta za koga se sumnja da ima bolesti prema pronalasku) se analizira izotopskim obeležavanjem radi apsolutne & relativne kvantitacije za detekciju BST1. Povećana količina BST1 u tkivu subjekta u odnosu na tkivo subjekta ili subjekata koji nemaju bolesti prema pronalasku (npr. kontrolni uzorak) ili prethodno određeni referentni opseg ukazuje na prisustvo bolesti prema pronalasku.
[0090]Što se tiče fragmenata, fragmenti koji sadrže epitop, imunogene fragmente ili antigene fragmente BST1: za odgovarajuće kancerske primene, u jednom aspektu pronalaska isti sadrže sekvence koje su identifikovane kao tripsinske sekvence u Primerima 1 i 2.
[0091]Kada se ovde koristi, BST1 je "izolovan" kada je prisutan u preparatu tako da u suštini ne sadrži kontaminirajuće proteine, tj. preparat u kome su manje od 10% (na primer, manje od 5%, kao što je manje od 1%) ukupne količine prisutnih proteina kontaminirajući protein, odnosno proteini. Kontaminirajući protein je protein koji ima znatno drugačiju aminokiselinsku sekvencu od one u izolovanom BST1, što je određeno masenom spektralnom analizom. Kada se ovde koristi, "znatno drugačija" sekvenca je ona koja dozvoljava da se kontaminirajući protein razlikuje od BST1 pomoću masene spektralne analize, koja je izvršena u skladu sa referentnim protokolom koji je ovde opisan u Primerima 1 i 2.
[0092]Ovde je takođe opisana farmaceutska kompozicija za lečenje npr. bolesti prema pronalasku koja sadrži terapeutski efektivnu količinu BST1 polipeptida (a naročito onih koji su gore definisani) ili njegov imunogeni fragment i adjuvans.
[0093]BST1 se može testirati bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, uključujući, ali bez ograničavanja na poželjne tehnologije koje su ovde opisane, testove kinaze, enzimske testove, testove vezivanja i druge funkcionalne testove, imunotestove, i vestern bloting.
[0094]Alternativno tome, BST1 se može detektovati u imunotestu. U jednom primeru izvođenja, imunotest se vrši dovođenjem u kontakt uzorka subjekta koji treba da bude testiran sa anti-BST1 antitelom (ili drugim afinitetnim reagensom) pod uslovima pod kojima može doći do takvog vezivanja (npr. imunospecifičnog vezivanja) ako je BST1 prisutan, i detekcijom ili merenjem količine bilo kakvog vezivanja (npr. imunospecifičnog vezivanja) sa agensom. Agensi za vezivanje BST1 se mogu proizvesti metodama i tehnikama koje su ovde opisane. U posebnom primeru izvođenja, BST1 se analizira korišćenjem imunohistohemije.
[0095]BST1 može biti detektovan detekcijom njegovog fragmenta npr. njegovog fragmenta koji sadrži epitop (npr. imunogeni ili antigeni). Fragmenti mogu imati dužinu od najmanje 10, a češće od najmanje 20 aminokiselina npr. najmanje od 50 ili 100 aminokiselina npr. najmanje od 150 ili 200 aminokiselina; npr. najmanje od 300 ili 500 aminokiselina; npr. najmanje od 700 ili 900 aminokiselina.
[0096]U jednom primeru izvođenja, vezivanje afinitetnog reagensa (npr. antitela) u sekcijama tkiva se može koristiti za detekciju nenormalne BST1 lokalizacije ili nenormalnog nivoa BST1. U specifičnom primeru izvođenja, antitelo (ili drugi afinitetni reagens) za BST1 se može koristiti za testiranje tkiva pacijenta (npr. mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva) u pogledu nivoa BST1, gde je nenormalni nivo BST1 indikator bolesti prema pronalasku. Kada se ovde koristi, "nenormalni nivo" označava nivo koji je povećan u poređenju sa nivom kod subjekta koji nema bolesti prema pronalasku ili referentnim nivoom.
[0097]Može se upotrebiti bilo koji podesni imunotest, uključujući, ali bez ograničenja, kompetitivne i nekompetitivne sisteme za testiranje korišćenjem tehnika kao što su vestern blotovi, radioimunotestovi, ELISA (enzimski imunosorbentni test), "sendvič" imunotestovi, testovi sa imunotaloženjem, precipitinske reakcije, precipitinske reakcije sa difuzijom gela, imunodifuzioni testovi, testovi sa aglutinacijom, testovi fiksacije komplementa, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunotestovi i imunotestovi sa proteinom A.
[0098]Na primer, BST1 se može detektovati u uzorku fluida (npr. krvi, urina, ili pljuvačke) pomoću sendvič testa u dva koraka. U prvom koraku, reagens za hvatanje (npr. anti-BST1 antitelo ili drugi afinitetni reagens) se koristi za hvatanje BST1. Reagens za hvatanje se može opciono imobilizovati na čvrstoj fazi. U drugom koraku, direktno ili indirektno obeleženi reagens za detekciju se koristi za detektovanje uhvaćenog BST1. U jednom primeru izvođenja, reagens za detekciju je lektin. Za ovu svrhu se može koristiti bilo koji lektin koji se pre vezuje za BST1 nego za druge izoforme koje imaju isti protein u jezgru kao i BST1 ili za druge proteine koji dele istu antigenu determinantu koju prepoznaje antitelo. U poželjnom primeru izvođenja, izabrani lektin se vezuje za BST1 sa najmanje 2-struko većim afinitetom, a poželjnije najmanje 5-struko većim afinitetom, te još poželjnije sa najmanje 10-struko većim afinitetom, nego za pomenute druge izoforme koje imaju isti protein u jezgru kao BST1 ili za pomenute druge proteine koji dele antigenu determinantu koju prepoznaje afinitetni reagens. Na osnovu predmetnog opisa, lektin koji je podesan za detekciju BST1 se može lako identifikovati metodama koje su dobro poznate iz odgovarajuće oblasti, na primer, posle testiranja jednog ili više lektina navedenih u Tabeli I na stranama 158-159 autora Šumar et al., Lectins as Indicators of Disease-Associated Glvcoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (uredn.), 1993, Lectins and Glycobiology, na str. 158-174. U varijantnom primeru izvođenja, reagens za detekciju je antitelo (ili drugi afinitetni reagens), npr. antitelo koje specifično (npr. imunospecifično) detektuje druge post-translacione modifikacije, kao što je antitelo koje se imunospecifično vezuje za fosforilovane aminokiseline. Primeri takvih antitela obuhvataju ona koja se vezuju za fosfotirozin (BD Transduction Laboratories, kataloški br.: P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), ona koja se vezuju za fosfoserin (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, kataloški br. 61-8100) i ona koja se vezuju za fosfotreonin (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, kataloški br. 71-8200, 13-9200).
[0099]Ako je poželjno, gen koji kodira BST1, srodni gen, ili sekvence ili podsekvence srodnih nukleinskih kiselina, uključujući komplementarne sekvence, se takođe mogu koristiti u testovima hibridizacije. Nukleotid koji kodira BST1, ili njegove podsekvence koje sadrže najmanje 8 nukleotida, a prvenstveno najmanje 12 nukleotida, i najpoželjnije najmanje 15 nukleotida se mogu koristiti kao proba za hibridizaciju. Testovi hibridizacije se mogu koristiti za detekciju, dijagnozu, ili praćenje stanja, poremećaja ili stadijuma bolesti, povezanih sa nenormalnom ekspresijom gena koji kodira BST1, ili za diferencijalnu dijagnozu subjekata sa znacima ili simptomima koji sugerišu npr. bolesti prema pronalasku. Takav test hibridizacije naročito može biti izveden postupkom koji sadrži dovođenje u kontakt subjektovog uzorka koji sadrži nukleinsku kiselinu sa probom za nukleinsku kiselinu koja može da se hibridizuje sa DNK ili RNK koja kodira BST1, pod takvim uslovima da može da dođe do hibridizacije, i detekciju ili merenje eventualne rezultujuće hibridizacije.
[0100]Tako se može detektovati nukleinska kiselina koja kodira BST1 (npr. DNK ili, podesnije, RNK), na primer, korišćenjem hibridizujućeg agensa koji može da se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira BST1.
[0101]Jedan primer takvog postupka sadrži: dovođenje u kontakt jedne ili više oligonukleotidnih proba koje sadrže 10 ili više uzastopnih nukleotida koji su komplementarni sa nukleotidnom sekvencom koja kodira BST1, sa RNK dobijenom iz biološkog uzorka subjekta ili sa cDNK kopiranom sa RNK, pri čemu se pomenuto dovođenje u kontakt vrši pod uslovima koji omogućavaju hibridizaciju probe sa nukleotidnom sekvencom, ako je prisutna; detekciju hibridizacije, ako je prisutna, između probe i nukleotidne sekvence; i upoređivanje hibridizacije, ako je prisutna, detektovane u koraku (b) sa hibridizacijom detektovanom u kontrolnom uzorku, ili sa prethodno određenim referentnim opsegom.
[0102]Takođe su opisani dijagnostički kitovi, koji sadrže anti-BST1 antitelo (ili drugi afinitetni reagens). Pored toga, takav kit može opciono sadržati jedno ili više od sledećih: (1) instrukcije za korišćenje anti-BST1 afinitetnog reagensa za dijagnozu, terapeutsko praćenje ili bilo koju kombinaciju ovih primena; (2) obeleženi partner za vezivanje za afinitetni reagens; (3) čvrstu fazu (kao što je traka za reagens) pomoću koje je imobilizovan anti-BST1 afinitetni reagens; i (4) etiketu ili insert koji ukazuju na odobrenje od strane regulatornog tela za dijagnostičku, prognostičku ili terapeutsku primenu ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ako nije predviđen obeleženi partner za vezivanje za afinitetni reagens, onda sam anti-BST1 afinitetni reagens može biti obeležen detektabilnim markerom, npr. hemiluminescentnom, enzimskom, fluorescentnom, ili radioaktivnom grupom.
[0103]Pronalaskom je takođe realizovan kit koji sadrži probu za nukleinsku kiselinu koja može da se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom, a posebno RNK, koja kodira BST1. U jednom primeru, kit sadrži jedan ili više kontejnera par prajmera (npr. svaki u opsegu veličina od 6-30 nukleotida, poželjnije od 10-30 nukleotida i još poželjnije od 10-20 nukleotida) koji pod odgovarajućim reakcionim uslovima mogu da prajmiraju amplifikaciju dela nukleinske kiseline koja kodira BST1, kao što su reakcija lanca polimeraze (vidi npr. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reakcija lanca ligaze (vidi EP 320,308) primenaf Qp replikaze, reakcija ciklične probe, ili druge metode koje su poznate iz odgovarajuće oblasti.
[0104]Kit opciono može dalje sadržati unapred određenu količinu BST1 ili nukleinsku kiselinu koja kodira BST1, npr. za primenu kao standarda ili kontrole.
[0105]Biološki uzorak koji se upotrebljava može biti iz bilo kog izvora, kao što je uzorak seruma ili uzorak tkiva npr. mijeloidno tkivo, tkivo dojke, kolorektalno, bubrežno, plućno ili pankreasno tkivo. Na primer, kada se traži dokaz metastatičke bolesti prema pronalasku, onda bi se on mogao tražiti na glavnim mestima na kojima bolesti prema pronalasku metastaziraju, npr. jetri, plućima i kostima za kancer dojke; jetri, peritonealnoj duplji, karlici, retroperitoneumu i plućima za kolorektalni kancer; kostima, plućima i jetri za kancer bubrega; mozgu, jetri, kostima i nadbubrežnim žlezdama za kancer pluća i jetri za kancer pankreasa.
[0106]Alternativno tome, prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili prisustvo nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili prisustvo aktivnosti BST1 mogu biti detektovani analizom in situ.
[0107]U izvesnim primerima izvođenja, ovde opisani metodi dijagnoze se mogu bar delimično, ili u celini, izvoditiin vitro.
[0108]Podesno je da se prisustvo BST1, ili jednog ili više fragmenata ili prisustvo aktivnosti BST1 detektuje kvantitativno.
[0109]Na primer, kvantitativna detekcija može sadržati: dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa afinitetnim reagensom koji je specifičan za BST1, pri čemu je pomenuti afinitetni reagens opciono konjugovan sa detektabilnim markerom; i detekciju da li je došlo do vezivanja između afinitetnog reagensa i najmanje jedne vrste u uzorku, pri čemu se pomenuta detekcija vrši bilo direktno ili indirektno.
[0110]Alternativno tome, prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili prisustvo aktivnosti BST1 se može detektovati kvantitativno, uključujući primenu tehnologije snimanja.
[0111]U sledećem primeru izvođenja, postupak prema pronalasku sadrži primenu imunohistohemije npr. na sekcijama mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva da bi se odredilo prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, ili prisustvo nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili prisustvo aktivnosti BST1, a da bi se time lokalizovale ćelije npr. bolesti prema pronalasku.
[0112]U jednom primeru izvođenja se detektuje prisustvo BST1 ili jednog ili više njegovih fragmenata koji sadrže epitop, na primer, korišćenjem afinitetnog reagensa koji može da se specifično vezuje za BST1 ili jedan ili više njegovih fragmenata, kao što je antitelo.
[0113]U sledećem primeru izvođenja se detektuje aktivnost BST1. Izgleda da ADP-ribozil ciklaza 2 i njen homolog, CD38, deluju kao receptori, koji generišu druge mesendžerske metabolite koji indukuju intracelularno oslobađanje Ca2+ preko rijanodinskog receptora (Biochem Biophvs Res Commun. 1996, 228(3):838-45). Ona takođe može delovati preko CD11b integrina da bi se ostvarilo oslobađanje Ca2+ pomoću puta PI-3 kinaze (J Biol Regul Homeost Agents. 2007;21(1-2):5-11).
Primena u kliničkim studijama
[0114]Dijagnostički postupci i kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu pomoći u praćenju kliničke studije, npr. za evaluaciju lekova za terapiju bolesti prema pronalasku. U jednom primeru, molekuli kandidati se testiraju u pogledu svojih sposobnosti da ponovo vrate nivoe BST1 kod subjekta koji imaju npr. bolesti prema pronalasku do nivoa koje imaju subjekti koji nemaju bolesti prema pronalasku ili, kod lečenog subjekta, da se očuvaju nivoi BST1 na ili blizu vrednosti za ne-akutnu mijeloidnu leukemiju, ne-kancer dojke, ne-kolorektalni kancer, ne-kancer bubrega, ne-kancer pluća ili ne-kancer pankreasa.
[0115]U sledećem primeru, postupci i kompozicije prema predmetnom pronalasku se primenjuju za skrining kandidata za kliničku studiju radi identifikacije pojedinaca koji imaju npr. bolesti prema pronalasku; takvi pojedinci onda mogu biti isključeni iz studije ili mogu biti dodeljeni posebnoj grupi za lečenje ili analizu.
Proizvodnja proteina prema pronalasku i odgovarajuće nukleinske kiseline
[0116]Ovde je opisan postupak lečenja ili prevencije npr. bolesti prema pronalasku, koji sadrži davanje subjektu kome je potrebno takvo lečenje ili prevencija terapeutski efektivne količine nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili jednog ili više njenih fragmenata ili derivata, na primer, u obliku vakcine.
[0117]Takođe je otkriven postupak lečenja ili prevencije npr. bolesti prema pronalasku koji sadrži davanje subjektu kome je potrebno takvo lečenje ili prevencija terapeutski efektivne količine nukleinske kiseline koja inhibira funkciju ili ekspresiju BST1.
[0118]Opisani postupci (i/ili drugi ovde opisani aspekti DNK) mogu obuhvatati, na primer, da je nukleinska kiselina u njima BST1 anti-sensna nukleinska kiselina ili ribozim.
[0119]Shodno tome, pronalaskom je realizovana primena nukleinske kiseline koja kodira BST1 ili jedan ili više njenih fragmenata ili derivata, za proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju npr. bolesti prema pronalasku.
[0120]Takođe je realizovana primena nukleinske kiseline koja inhibira funkciju ili ekspresiju BST1, za proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju npr. bolesti prema pronalasku.
[0121]DNK koja se upotrebljava u opisanim postupcima se može dobiti izolacijom kao cDNK fragment iz cDNK biblioteka uz korišćenje komercijalnih mRNKs kao polaznih materijala i određivanje i identifikaciju njihovih nukleotidnih sekvenci. Preciznije, to znači da se klonovi izoluju na slučajan način iz cDNK biblioteka, koje se pripremaju u skladu sa postupkom Ohara et al. (DNA Research tom 4, 53-59 (1997)). Kao sledeće, pomoću hibridizacije, duplicirani klonivi (oni koji se pojavljuju više puta) se uklanjaju, a onda se vršein vitrotranskripcija i translacija. Određuju se nukleotidne sekvence oba terminusa klonova, za koje su potvrđeni proizvodi od 50 kDa ili više.
[0122]Pored toga se pretražuju baze podataka poznatih gena u pogledu homologije uz korišćenje dobijenih terminalnih nukleotidnih sekvenci kao upita.
[0123]Pored gornjeg postupka skrininga, 5' i 3' terminalne sekvence cDNK su srodne sa humanom genomskom sekvencom. Onda se potvrđuje nepoznati gen dugog lanca u regionu između sekvenci, i analizira se cDNK cele dužine. Na ovaj način se može sistematski klonirati nepoznati gen koji se ne može dobiti uobičajenim postupkom kloniranja koji zavisi od poznatih gena.
[0124]Pored toga, svi regioni gena humanog porekla koji sadrže DNK prema predmetnom pronalasku se takođe mogu pripremiti uz korišćenje PCR postupka, kao što je RACE, pri čemu se poklanja dovoljna pažnja da bi se sprečile veštačke greške usled uzimanja kratkih fragmenata ili dobijenih sekvenci. Kao što je gore opisano, mogu se dobiti klonovi koji imaju DNK prema predmetnom pronalasku.
[0125]U sledećem postupku za kloniranje DNK prema pronalasku se proizvodi veštački DNK prajmer koji ima odgovarajuću nukleotidnu sekvencu dela polipeptida prema pronalasku, što je praćeno amplifikacijom pomoću PCR postupka uz korišćenje odgovarajuće biblioteke. Alternativno tome, selekcija se može izvršiti hibridizacijom DNK prema pronalasku sa DNK koja je bila inkorporirana u odgovarajući vektor i obeležena sa DNK fragmentom ili veštačke DNK koja kodira neke ili sve regione polipeptida prema pronalasku. Hibridizacija se može izvršiti, na primer, postupkom koji je opisan u Current Protocols in Molecular Biologv (uredili Frederick M. Ausubel et al., 1987). DNK prema pronalasku može biti bilo koja DNK, sve dok sadrži nukleotidne sekvence koja kodiraju polipeptide prema pronalasku kao što je opisano gore. Takva DNK može biti cDNK koja je identifikovana i izolovana iz cDNK biblioteka ili sličnog poreklom od mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva. Takav DNK takođe može biti veštački DNK ili slično. Vektori za primenu u konstrukciji biblioteka mogu biti bilo koji od bakteriofaga, plazmida, kozmida, fargemida, ili slično. Pored toga, korišćenjem celokupne RNK frakcije ili mRNK frakcije pripremljene od gornjih ćelija i/ili tkiva, amplifikacija se može izvesti direktnom reverznom transkripcijom kuplovanom sa reakcijom lanca polimeraze (u nastavku se navodi skraćeno kao "RTPCR metod").
[0126]DNK koja kodira gornji polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je u suštini identična sa aminokiselinskom sekvencom BST1 ili DNK koja kodira gornji polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je dobijena od aminokiselinske sekvence BST1 delecijom, supstitucijom, ili adicijom jedne ili više aminokiselina koja sadrži deo aminokiselinske sekvence se može lako proizvesti odgovarajućom kombinacijom, na primer, metodom mesno usmerene mutageneze, metodom homologe rekombinacije gena, metodom elongacije prajmerima, i PCR postupkom koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Pored toga, u ovom trenutku, mogući postupak za dobijanje polipeptida koji ima u suštini ekvivalentnu biološku aktivnost je supstitucija homologih aminokiselina (npr. polarnih i nepolarnih aminokiselina, hidrofobnih i hidrofilnih aminokiselina, pozitivno naelektrisanih i negativno naelektrisanih aminokiselina, i aromatičnih aminokiselina) među aminokiselinama od kojih je polipeptid sačinjen. Pored toga, da bi se održala u suštini ekvivalentna biološka aktivnost, aminokiseline u okviru funkcionalnih domena sadržanih u polipeptidu prema predmetnom pronalasku su prvenstveno sačuvane, odn. konzervirane.
[0127]Pored toga, primeri DNK prema pronalasku obuhvataju DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu BST1 i DNK koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima sa DNK i kodira polipeptid (protein) koji ima biološku aktivnost (funkciju) ekvivalentnu funkciji polipeptida koji se sastoji od aminokiselinske sekvence BST1. Pod takvim uslovima, primer takve DNK koja može da se hibridizuje sa DNK koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu BST1 je DNK koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima stepen opšte prosečne homologije sa ćelom nukleotidnom sekvencom DNK, kao što je približno 80% ili više, a prvenstveno približno 90% ili više, i još poželjnije približno 95% ili više. Hibridizacija se može izvesti postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti, kao što je postupak opisan u Current Protocols in Molecular Biologv (uredili Frederick M. Ausubel et al., 1987) ili postupak u skladu sa time. Ovde su "stringentni uslovi", na primer, uslovi od približno "1<*>SSC, 0.1% SDS, i 37°C, još stringentniji uslovi od približno "0.5<*>SSC, 0.1% SDS, i 42°C, ili čak još stringentniji uslovi od približno "0.2<*>SSC, 0.1% SDS, i 65°C. Sa stringentnijim uslovima hibridizacije se može očekivati izolacija DNK koja ima visoku homologiju sa sekvencom probe. Gornje kombinacije SSC, SDS, i temperaturski uslovi su dati za svrhe ilustracije. Stringentnost sličnu gore navedenoj mogu realizovati stručnjaci iz odgovarajuće oblasti uz korišćenje odgovarajuće kombinacije gornjih faktora ili drugih faktora (na primer, koncentracije probe, dužine probe, i vremena reakcije za hibridizaciju) radi određivanja stringentnosti hibridizacije.
[0128]Klonirana DNK prema pronalasku se može upotrebiti direktno ili se može upotrebiti, ako je poželjno, posle digestije sa restrikcionim enzimom ili dodavanja linkera, u zavisnosti od namene. DNK može imati ATG kao kodon za inicijaciju translacije na 5' terminalnoj strani i može imati TAA, TGA, ili TAG kao kodon za inicijaciju na 3' terminalnoj strani. Ovi kodoni za inicijaciju translacije i završetak translacije se takođe mogu dodati uz korišćenje odgovarajućeg veštačkog DNK adaptera.
[0129]U postupcima/primenama prema pronalasku, BST1 može biti obezbeđen, na primer, u izolovanom obliku, kao tamo gde je BST1 polipeptid bio prečišćen bar do izvesne mere. BST1 polipeptid se može obezbediti u suštini u čistom obliku, to jest da kažemo čist, do znatne mere, od drugih proteina. BST1 polipeptid se takođe može proizvesti uz korišćenje rekombinantnih metoda, proizvesti sintetički ili proizvesti kombinacijom ovih metoda. BST1 se može lako pripremiti bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, a koji obuhvata proizvodnju vektora ekspresije koji sadrži odgovarajuću DNK prema pronalasku ili gen koji sadrži DNK prema pronalasku, kultivaciju transformanta transformisanog uz korišćenje vektora ekspresije, generisanje i akumulaciju odgovarajućeg polipeptida prema predmetnom pronalasku ili rekombinantnog proteina koji sadrži polipeptid, a zatim sakupljanjem rezultante.
[0130]Rekombinantni BST1 polipeptid se može pripremiti procesima koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti od ćelija domaćina podvrgnutih genetičkom inženjeringu koje sadrže sisteme ekspresije. Shodno tome, pronalazak se takođe odnosi na sisteme ekspresije koji sadrže BST1 polipeptid ili nukleinsku kiselinu, na ćelije domaćine koje su podvrgnute genetskom inženjeringu sa takvim sistemima ekspresije i na proizvodnju BST1 polipeptida rekombinantnim tehnikama. Za rekombinantnu proizvodnju BST1 polipeptida, ćelije domaćini mogu biti podvrgnute genetskom inženjeringu da bi se inkorporirali sistemi ekspresija ili njihovi delovi za nukleinske kiseline. Takva inkorporacija se može izvršiti uz korišćenje dobro poznatih metoda koje su poznate iz odgovarajuće oblasti, kao što su kalcijum fosfatna transfekcija, DEAD-dekstranom posredovana transfekcija, transvekcija, mikroinjekcija, katjonska lipidno posredovana transfekcija, elektroporacija, transdukcija, uvođenje struganjem (eng. scrape loading), balističko uvođenje ili infekcija (vidi npr. Daviš et al., Basic Methods in Molecular Biologv, 1986 i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. izd., Cold Spring Harbour laboratorv Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).
[0131]Kao ćelije domaćini se mogu koristiti, na primer, bakterije rodaEscherichia, Streptococci, Staphylococci, Streptomyces,bakterije rodaBacillus,kvasci,Aspergillus ćelije,insektne ćelije, insekti, i životinjske ćelije. Specifični primeri bakterija rodaEscherichia,koje se ovde koriste, obuhvatajuEscherichia coliK12 i DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., tom 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, tom 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biologv, tom 120, 517 (1978)), i HB101 (Journal of Molecular Biologv, tom 41, 459 (1969)). Kao bakterije roda Bacillus se koriste, na primer, Bacillus subtilis MM 14 (Gene, tom 24, 255 (1983)) i 207-21 (Journal of Biochemistrv, tom 95, 87
(1984)). Kao kvasci se koriste, na primer,Saccaromyces cerevisiaeAH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, i 20B- 12,Schizosaccaromyces pombeNCYC1913 i NCYC2036, iPichia pastoris.Kao insektne ćelije se koriste, na primer, Drosophila S2 i Spodoptera Sf9 ćelije. Kao životinjske ćelije se koriste, na primer, COS-7 i Vero majmunske ćelije, CHO ćelije kineskog hrčka (u nastavku se koristi skraćenica CHO ćelije), dhfr-genski-deficijentne CHO ćelije, mišije L ćelije, mišije AtT-20 ćelije, mišije mijeloma ćelije, pacovske GH3 ćelije, humane FL ćelije, COS, HeLa, C127,3T3, HEK 293, BHK i Bowes melanoma ćelije.
[0132]Translacioni sistemi bez ćelija se takođe mogu upotrebiti za proizvodnju rekombinantnih polipeptida (npr. zečiji reticulocitni lizat, lizat pšeničnih klica, SP6/T7 in vitro T&T i RTS 100E. ColiHY transkripcioni i translacioni kitovi firme Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK i TNT Ouick kuplovani transkripcioni/translacioni sistem firme Promega UK, Southampton, UK).
[0133]Vektor ekspresije se može proizvesti nekim postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti. Na primer, vektor se može proizvesti (1) isecanjem DNK fragmenta koji sadrži DNK prema predmetnom pronalasku ili gena koji sadrži DNK prema predmetnom pronalasku i (2) ligatiranjem DNK fragmenta nizvodno od promotera u odgovarajućem vektoru ekspresije. Može se upotrebiti veliki broj sistema ekspresije, kao što su, ali bez ograničenja, hromozomski, epizomski i od virusa dobijeni sistemi, npr. plazmidi dobijeni od Escherichia coli (npr. pBR322, pBR325, pUC18, i pUC118), plazmidi dobijeni od Bacillus subtilis (npr. pUB110, pTP5, i pC194), od bakteriofaga, od transpozona, od kvaščevih epizoma (npr. pSH19 i pSH15), od insercionih elemenata, od kvaščevih hromozomskih elemenata, od virusa kao što su bakulovirusi, papova virusa, kao što je SV40, vacinija virusa, adenovirusa, virusa kokošijih boginja, virusa pseudobesnila i retrovirusa, kao i vektori dobijeni od njihovih kombinacija, kao što su oni koji su dobijeni od genetskih elemenata plazmida i bakteriofaga (kao što je [lambda] fag), kao što su kozmidi i fagemidi. Sistemi ekspresije mogu sadržati kontrolne regione koji regulišu, a i izazivaju ekspresiju. Promoteri koji se upotrebljavaju u ovom otkrivanju mogu biti bilo koji promoteri sve dok su podesni kao domaćini koji će se koristiti za ekspresiju gena. Na primer, kada je domaćinEscherichia coli,onda su poželjni trp promoter, lac promoter, recA promoter, pL promoter, Ipp promoter, i slično. Kada je domaćinBacillus subtilis,onda su poželjni SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, i slično. Kada je domaćin kvasac, onda su poželjni PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, i slično. Kada se koristi životinjska ćelija kao domaćin, primeri promotera za primenu u ovom slučaju obuhvataju SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, i HSV-TK promoter. Generalno, može se koristiti bilo koji sistem ili vektor koji može da održava, propagira ili izražava nukleinsku kiselinu za proizvodnju polipeptida u domaćinu.
[0134]Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline se može insertovati u sistem ekspresije bilo kojom od dobro poznatih i rutinskih tehnika, kao što su one koje su izložene u Sambrooket al.,supra. Odgovarajući signali za izlučivanje mogu biti inkorporirani u BST1 polipeptid da bi se omogućilo izlučivanje transliranog proteina u lumen endoplazmatičnog retikuluma, periplazmidni prostor ili ekstracelularno okruženje. Ovi signali mogu biti endogeni sa BST1 polipeptidom ili oni mogu biti heterologi signali. Transformacija ćelija domaćina se može izvršiti metodama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. Na primer, može se vršiti poziv na sledeće dokumente: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., tom 69, 2110 (1972); Gene, tom 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, tom 168, 111
(1979); Methods in Enzymology, tom 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), tom 75, 1929
(1978); Cell Technology, poseban tom 8, New Cell Technology, Experimental Protocol. 263-267 (1995)
(koji je izdao Shujunsha); i Virology, tom 52, 456 (1973). Ovako dobijeni transformant koji je transformisan sa vektorom ekspresije koji sadrži DNK prema pronalasku ili genom koji sadrži DNK prema pronalasku se može kultivisati metodom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti. Na primer, kada su domaćini bakterije rodaEscherichia,onda se bakterije generalno kultivišu približno na 15°C do 43°C tokom približno 3 do 24 sata. Ako je potrebno, takođe mogu biti dodati aeracija ili agitacija. Kada su domaćini bakterije rodaBacillus,onda se bakterije generalno kultivišu približno na 30°C do 40°C tokom približno 6 do 24 sata. Ako je potrebno, takođe mogu biti dodati aeracija ili agitacija. Kada se kultivišu transformanti ili domaćini su kvasci, onda se kultivacija generalno vrši približno na 20°C do 35°C tokom približno 24 do 72 sata uz korišćenje medijuma sa pH podešenim približno na 5 do 8. Ako je potrebno, takođe mogu biti dodati aeracija ili agitacija. Kada se kultivišu transformanti čiji domaćini su životinjske ćelije, onda se kultivacija generalno vrši približno na 30°C do 40°C tokom približno 15 do 60 sati uz korišćenje medijuma sa pH podešenim približno na 6 do 8. Ako je potrebno, takođe mogu biti dodati aeracija ili agitacija.
[0135]Ako BST1 polipeptid treba da bude izražen za primenu u skrining testovima baziranim na ćelijama, onda je poželjno da polipeptid bude proizveden na ćelijskoj površini. U ovom slučaju, ćelije se mogu sakupiti pre upotrebe u skrining testu. Ako se BST1 polipeptid izlučuje u medijum, onda se medijum može rekuperisati da bi se izolovao pomenuti polipeptid. Ako se proizvodi intracelularno, onda se ćelije moraju prvo lizirati pre nego što se BST1 polipeptid rekuperiše.
[0136]BST1 polipeptid se može rekuperisati i prečistiti iz kultura rekombinantnih ćelija ili drugih bioloških izvora dobro poznatim metodama uključujući, amonijum sulfatnim ili etanolskim taloženjem, kiselom ekstrakcijom, anjonsko ili katjonsko izmenjivačkom hromatografijom, fosfoceluloznom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, hidrofobnom interaktivnom hromatografijom, hidroksilapatitnom hromatografijom, hromatografijom na molekulskim sitima, metodima centrifugiranja, metodima elektroforeze i lektinskom hromatografijom. U jednom primeru se koristi kombinacija ovih metoda. U drugom primeru se koristi tečna hromatografija visokih performansi. U sledećem primeru se može koristiti antitelo koje se specifično vezuje za BST1 polipeptid za depleciju uzorka koji sadrži BST1 polipeptid pomenutog polipeptida ili za prečišćavanje pomenutog polipeptida.
[0137]Da bi se izdvojio i prečistio polipeptid ili protein prema pronalasku od produkata kulture, na primer, post kulture, mikrobna tela ili ćelije se sakupljaju bilo kojim poznatim metodom, a onda se suspenduju u odgovarajućem puferu, pa se mikrobna tela ili ćelije cepaju, na primer, ultrazvučnim talasima, lizozimima, i/ili zamrzavanjem-topljenjem, a rezultanta se onda podvrgava centrifugiranju ili filtriranju, i zatim se može dobiti sirovi ekstrakt proteina. Pufer takođe može sadržati agens za denaturaciju proteina, kao što su urea ili gvanidin hidrohlorid, ili surfaktant, kao što je Triton X-100(TM). Kada se protein izlučuje u rastvor za kultivaciju, onda se mikrobna tela ili ćelije i supernatant razdvajaju bilo kojim poznatim postupkom posle završetka kultivacije, pa se onda sakuplja supernatant. Protein sadržan u ovako dobijenom supernatantu ili ekstraktu kulture se može prečistiti podesnom kombinacijom bilo kojih poznatih metoda za izdvajanje i prečišćavanje. Ovako dobijeni polipeptid (protein) prema pronalasku se može prevesti u so bilo kojim poznatim postupkom ili postupkom u skladu sa time. Obrnuto, kada se polipeptid (protein) prema pronalasku dobije u obliku soli, onda se on može prevesti u slobodni protein ili peptid ili drugu so bilo kojim poznatim postupkom ili postupkom u skladu sa time. Pored toga, enzim za odgovarajuću modifikaciju proteina, kao što je tripsin ili himotripsin, može da deluje na rekombinantno proizvedeni protein pre ili posle prečišćavanja, tako da se može dodati modifikacija na slučajan način ili se polipeptid može delimično ukloniti. Prisustvo polipeptida (proteina) prema pronalasku ili njegove soli se može meriti različitim testovima vezivanja, enzimskim imunotestovima uz korišćenje specifičnih antitela, i slično.
[0138]Tehnike koje su dobro poznate iz odgovarajuće oblasti se mogu koristiti za ponovno uspostavljanje prirodnih ili aktivnih konformacija BST1 polipeptida kada je polipeptid denaturisan tokom izolacije i ili prečišćavanja. U kontekstu pronalaska, BST1 polipeptid se može dobiti od biološkog uzorka iz bilo kog izvora, kao što su, ali bez ograničavanja, uzorak krvi ili uzorak tkiva, npr. mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva.
[0139]BST1 polipeptid može biti u obliku "zrelog proteina" ili može biti deo većeg proteina, kao što je fuzioni protein. Često je poželjno da se uključi dodatna aminokiselinska sekvenca koja sadrži izlučujuću ili lider sekvencu, pre-, pro- ili prepro- proteinsku sekvencu, ili sekvencu koja pomaže u prečišćavanju, kao što je afinitetni tag, odn. marker, kao što su, na primer, ali bez ograničenja, višestruki histidinski ostaci, FLAG tag, HA tag ili myc tag.
[0140]BST1 može biti, na primer, fuzionisan sa heterologim fuzionim partnerom, kao što je površinski protein, koji je poznat kao protein D iz Haemophilus Influenze B, nestrukturni protein iz virusa influence, kao što je NS1, S antigen od Hepatitisa B ili protein koji je poznat kao LYTA, kao što je njegov C terminus.
[0141]Takođe se može upotrebiti dodatna sekvenca koja može obezbediti stabilnost tokom rekombinantne proizvodnje. Ako je potrebno, takve sekvence se mogu opciono ukloniti inkorporiranjem odvojive sekvence kao dodatne sekvence ili njenog dela. Shodno tome, BST1 polipeptid može biti fuzionisan sa drugim grupama, uključujući druge polipeptide ili proteine (na primer, glutation S-transferazu i protein A). Takav fuzioni protein se može odvojiti uz korišćenje odgovarajuće proteaze, a onda se može izdvojiti u svakom proteinu. Takve dodatne sekvence i afinitetni tagovi su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti. Pored gore navedenog, vektoru ekspresije mogu biti dodata svojstva koja su poznata iz odgovarajuće oblasti, kao što su pojačavač, signal za splajsovanje, poliA adicioni signal, selektivni marker, i SV40 poreklo replikacije, ako je poželjno.
Proizvodnja afinitetnih reagenasa za BST1
[0142]Prema onima iz odgovarajuće oblasti, postoje tri glavna tipa imunoafinitetnih reagenasa - monoklonska antitela, antitela za ispoljavanje na fagima i mali molekuli dobijeni od antitela, kao što su afitela, domenska antitela (dAbs), nanotela, unitela, DARPini, antikalini, duokalini, avimeri ili versatela. Generalno se u primenama prema predmetnom pronalasku, gde je navedena primena antitela, mogu koristiti drugi afinitetni reagensi (npr. afitela, domenska antitela, nanotela, unitela, DARPini, antikalini, duokalini, avimeri ili versatela). Takve supstance mogu da se imunospecifično vezuju za BST1. Ako je podesno, izraz "afinitetni agens" treba shvatiti tako da obuhvati imunoafinitetne reagense i druge supstance koje mogu da se specifično vezuju za BST1, uključujući, ali bez ograničavanja na ligande, lektine, streptavidine, mimetike antitela i sintetičke vezujuće agense.
[0143]Proizvodnja antitela za BST1
[0144]Prema pronalasku se BST1, BST1 analog, BST1-srodni protein ili fragment ili derivat bilo kog od napred navedenih može upotrebiti kao imunogen za generisanje antitela koja se imunospecifično vezuju za takav imunogen. Takvi imunogeni mogu biti izolovani bilo kojim podesnim sredstvom uključujući i gore opisane metode. Izraz "antitelo", kada se ovde koristi, se odnosi na peptid ili polipeptid dobijen od, modeliran prema ili u suštini kodiran imunoglobulinskim genom ili imunoglobulinskim genima, ili njihovim fragmentima, koji može da se specifično vezuje za antigen ili epitop. Vidi npr. Fundamental Immunologv, 3. izdanje, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); VVilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophvs. Methods 25:85-97. Izraz antitelo obuhvata delove koji vezuju antigen tj. "mesta za vezivanje antigena" (npr. fragmente, podsekvence, regione koji određuju komplementarnost (CDRs)) koji zadržavaju sposobnost da vezuju antigen, uključujući (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena samo jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Jednolančana antitela su takođe obuhvaćena novođenjem izraza "antitelo". Antitela prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničena na poliklonska, monoklonska, bispecifična, humanizovana ili himerična antitela, jednolančana antitela, Fab fragmente i F(ab')2fragmente, fragmente proizvedene pomoću biblioteke za ekspresiju Fab, anti-idiotipska (anti-ld) antitela, i fragmente koji vezuju epitop bilo kog od gore navedenih. Imunoglobulinski molekuli prema pronalasku mogu pripadati bilo kojoj klasi( npr.IgG, IgE, IgM, IgD i IgA, kao što je IgG) ili podklasi imunoglobulinskih molekula.
[0145]Izraz "specifično se vezuje" (ili "imunospecifično se vezuje") ne treba da ukaže da se antitelo vezuje isključivo za njegov određeni cilj. Umesto toga, antitelo "se specifično vezuje" ako je njegov afinitet za njegov određeni cilj obično oko 5-struko veći kada se uporedi sa njegovim afinitetom za neciljni molekul. Poželjno je da ne bude značajne unakrsne reakcije ili unakrsnog vezivanja za nepoželjne supstance, a naročito prirodne proteine ili tkiva zdrave osobe ili životinje. Prvenstveno će afinitet antitela biti najmanje oko 5 puta, a prvenstveno 10 puta, još poželjnije 25 puta, čak još poželjnije 50 puta, i najpoželjnije 100 puta ili više, veći za ciljni molekul od njegovog afiniteta za neciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, specifično vezivanje između antitela ili drugog vezujućeg agensa i antigena označava afinitet vezivanja od najmanje 10<6>M"1. Antitela se mogu, na primer, vezivati sa afinitetima od najmanje oko107M"<1>, a prvenstveno između oko 10<8>M"<1>do oko 10<9>M"<1>, oko 10<9>M"<1>do oko 10<10>M"<1>, ili oko 1010M"1 do oko 1011M~1.
[0146]Afinitet se izračunava kao Kd=koff/kon(koffje konstanta brzine disocijacije, konje konstanta brzine asocijacije i Kdje kontanta ravnoteže. Afinitet se može odrediti pri ravnoteži merenjem udela vezanog (r) obeleženog liganda u različitim koncentracijama (c). Podaci su grafički prikazani korišćenjem Scatchard-ove jednačine: r/c = K(n-r):
gde su
r = molovi vezanog liganda/molu receptora pri ravnoteži;
c = koncentracija slobodnog liganda pri ravnoteži;
K = konstanta asocijacije pri ravnoteži; i
n = broj mesta za vezivanje liganda po receptorskom molekulu
[0147]Grafičkom analizom se r/c unosi na Y-osi, a r na X-osi, čime se dobija Scatchard-ov dijagram. Afinitet je negativni nagib linije. koffse može odrediti upoređivanjem obeleženog vezanog liganda sa neobeleženim viškom liganda (vidi npr. US pat br. 6,316,409). Afinitet ciljajućeg agensa za njegov ciljni molekul je, na primer, najmanje oko 1 x 106 mola/litru, kao što je najmanje oko 1 x 10<7>mola/litru, kao što je najmanje oko 1 x 10~<8>mola/litru, a naročito najmanje oko 1 x 10~<9>mola/litru, i posebno najmanje oko 1 x 10~<10>mola/litru. Merenje afiniteta antitela Scatchard-ovom analizom je dobro poznato iz odgovarajuće oblasti.Vidi npr.van Erp et al., J. Immunotest 12: 425-43, 1991; Nelson i Grisvvold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988.
[0148]U jednom primeru izvođenja su javno dostupna antitela koja prepoznaju genske proizvode gena koji kodiraju BST1. U sledećem primeru izvođenja, metode koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se koriste za proizvodnju antitela koja prepoznaju BST1, BST1 analog, BST1-srodni polipeptid, ili fragment ili derivat bilo kog od prethodno navedenih. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da su na raspolaganju mnoge procedure za proizvodnju antitela, na primer, kao što je opisano u Antibodies, A Laboratorv Manual, Ed Harlovv i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratorv
(1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će takođe shvatiti da se vezujući fragmenti ili Fab fragmenti koji podražavaju antitela takođe mogu pripremiti različitim procedurama na osnovu genetskih informacija (Antibodv Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C, ed.), 1995, Oxford Universitv Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)).
[0149]U jednom primeru izvođenja prema pronalasku se proizvode antitela za specifični domen BST1. U specifičnom primeru izvođenja se koriste hidrofilni fragmenti BST1 kao imunogeni za proizvodnju antitela.
[0150]U proizvodnji antitela, skrining za željeno antitelo se može ostvariti tehnikama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti, kao što je npr. ELISA (enzimski imunosorbentni test). Na primer, da bi se izabrala antitela koja specifično prepoznaju domen BST1, mogu se testirati generisani hibridomi radi nalaženja produkta koji se vezuje za BST1 fragment koji sadrži takav domen. Za selekciju antitela koje se specifično vezuje za prvi BST1 homolog, ali se ne vezuje specifično (ili se vezuje manje izraženo) za drugi BST1 homolog, može se izabrati na osnovu pozitivnog vezivanja za prvi BST1 homolog i nedostatka vezivanja (ili smanjenog vezivanja) za drugi BST1 homolog. Slično tome, za selekciju antitela koje se specifično vezuje za BST1, ali se specifično ne vezuje (ili se vezuje manje izraženo) za drugačiju izoformu istog proteina (kao što je drugačija glikoforma koja ima isto jezgro peptida kao BST1), može se izvršiti selekcija na osnovu pozitivnog vezivanja za BST1 i nedostatka vezivanja (ili smanjenog vezivanja) za drugačiju izoformu (npdrugačiju glikoformu). Shodno tome, predmetnim pronalaskom je realizovano antitelo (kao što je monoklonsko antitelo) koje se vezuje sa većim afinitetom (na primer, najmanje 2-struko, kao što je najmanje 5-struko, a posebno najmanje 10-struko većim afinitetom) za BST1 nego za drugačiju izoformu ili izoforme (npr. glukoforme) BST1.
[0151]Poliklonska antitela koja se mogu upotrebiti u postupcima prema pronalasku su heterogene populacije molekula antitela dobijenih iz seruma imunizovanih životinja. Takođe se može upotrebiti nefrakcionisani imuni serum. Različite procedure koje su poznate iz odgovarajuće oblasti se mogu upotrebiti za proizvodnju poliklonskih antitela za BST1, fragmenta za BST1, BST1-srodnog polipeptida, ili fragmenta BST1-srodnog polipeptida. Na primer, jedan način da se prečiste polipeptidi od interesa ili da se sintetišu polipeptidi od interesa je korišćenje, npr. metoda sinteze peptida u čvrstoj fazi koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti. Vidi npr. Guide to Protein Purification, Murrav P. Deutcher, ed., Meth. Enzvmol. tom 182 (1990); Solid Phase Peptide Svnthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzvmol. tom 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Buli. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujivvara et al., Chem. Pharm. Buli. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996. Izabrani polipeptidi se onda mogu upotrebiti pomoću injekcije za imunizaciju različitih životinja domaćina, uključujući, ali bez ograničavanja zečeve, miševe, pacove, itd. da bi se generisala poliklonska ili monoklonska antitela. Ako se BST1 prečišćava gel elektroforezom, onda se BST1 može upotrebiti za imunizaciju sa ili bez prethodne ekstrakcije iz poliakrilamidnog gela. Različiti adjuvansi (tj. imunostimulansi) se mogu upotrebiti za pojačanje imunološke reakcije, u zavisnosti od vrste domaćina, uključujući, ali bez ograničavanja na kompletni ili nekompletni Frojndov adjuvans, mineralni gel, kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivnu supstancu, kao što su lizolecitin, pluronski poliol, polianjon, peptid, uljana emulzija, hemocijanin iz prilepkaMegathura crenulata,dinitrofenol, i adjuvans, kao što je BCG (bacil Calmette-Guerin) ili corynebacterium parvum. Iz odgovarajuće oblasti su takođe dobro poznati dodatni adjuvansi.
[0152]Za pripremu monoklonskih antitela (mAbs) usmerenih prema BST1, fragmentu BST1, BST1-srodnom polipeptidu, ili fragmentu BST1-srodnog polipeptida se može koristiti bilo koja tehnika koja omogućava proizvodnju molekula antitela pomoću kontinualnih ćelijskih linija u kulturi. Na primer, hibridoma tehnika, koju su originalno razvili Kohler i Milstein (1975, Nature 256:495-497), kao i trioma tehnika, tehnika hibridoma humanih B-ćelija (Kozbor et al., 1983, lmmunology Today 4:72), i EBV-hibridoma tehnika za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96). Takva antitela mogu biti iz bilo koje klase imunoglobulina uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i bilo koju njihovu potklasu. Hibridomi koji proizvode mAbs prema pronalasku se mogu kultivisatiin vitroiliin vivo.U jednom dodatnom primeru izvođenja pronalaska, monoklonska antitela se mogu proizvesti u negerminativnim životinjama korišćenjem poznate tehnologije.
[0153]Monoklonska antitela obuhvataju, ali nisu ograničena na humana monoklonska antitela i himerična monoklonska antitela (npr. humano-mišije himere). Himerično antitelo je molekul čiji različiti delovi su dobijeni od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju konstantni region humanog imunoglobulina i varijabilni region dobijen od mišijeg mAb. (vidi npr. Cabilly et al., US patent br. 4,816,567; i Boss et al., US patent br. 4,816397). Humanizovana antitela su molekuli antitela od nehumanih vrsta koji imaju jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) od nehumane vrste i okvirni region humanog imunoglobulinskog molekula, (vidi npr. Queen, US patent br. 5,585,089).
[0154]Himerična i humanizovana monoklonska antitela se mogu proizvesti tehnologijama rekombinantne DNK poznatim iz odgovarajuće oblasti, na primer, korišćenjem metoda koje su opisane u PCT objavi br. WO 87/02671; evropskoj prijavi patenta 184,187; evropskoj prijavi patenta 171,496; evropskoj prijavi patenta 173,494; PCT objavi br. WO 86/01533; US patentu br. 4,816,567; evropskoj prijavi patenta 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; i Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; US patentu 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoevan et al. (1988) Science 239:1534; i Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
[0155]Potpuno humana antitela su posebno poželjna za terapeutsko lečenje humanih subjekata. Takva antitela se mogu proizvesti uz korišćenje transgenskih miševa koji nisu sposobni za izražavanje endogenih imunoglobulinskih gena teškog i lakog lanca, ali koji mogu da izražavaju humane gene teškog i lakog lanca. Transgenski miševi se imunizuju na normalan način sa izabranim antigenom, npr. celim ili delom BST1. Monoklonska antitela usmerena protiv antigena se mogu dobiti korišćenjem uobičajene tehnologije hibridoma. Humani imunoglobulinski transgeni koje nose transgenski miševi se pregrupišu tokom diferencijacije B ćelija, i sledstveno tome su izloženi promeni klase i somatskim mutacijama. Shodno tome, korišćenjem takve tehnike je moguće da se proizvedu terapeutski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregled ove tehnologije za proizvodnju humanih antitela, vidi Lonberg i Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Za detaljno razmatranje ove tehnologije za proizvodnju humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokole za proizvodnju takvih antitela,vidi npr.US patent 5,625,126; US patent 5,633,425; US patent 5,569,825; US patent 5,661,016; i US patent 5,545,806. Pored toga, kompanije kao što su Abgenix, Inc. (Freemont, CA) i Genpharm (San Jose, CA) se mogu angažovati da bi obezbedile humana antitela usmerena protiv izabranog antigena uz korišćenje tehnologije koja je slična gore opisanoj.
[0156]Potpuno humana antitela koja prepoznaju izabrani epitop se mogu generisati korišćenjem tehnike koja se naziva "vođena selekcija". U ovom pristupu, izabrano nehumano monoklonsko antitelo, npr. mišije antitelo, se upotrebljava za vođenje selekcije potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop. (Jespers et al. (1994) BioTechnologv 12:899-903).
[0157]Antitela prema predmetnom pronalasku se takođe mogu generisati primenom tehnologije ispoljavanja na fagima da bi se proizvele i proverile biblioteke polipeptida u pogledu vezivanja za izabrani cilj. Vidi npr. Cvvirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott i Smith, Science 249, 386-88, 1990; i Ladner et al., US patent br. 5,571,698. Osnovni koncept metoda ispoljavanja na fagima je uspostavljanje fizičke asocijacije između DNK koja kodira polipeptid koji treba da bude proveren i polipeptida. Ova fizička asocijacija je ostvarena pomoću čestice faga, koji ispoljava polipeptid kao deo kapsida koji okružuje genom faga koji kodira polipeptid. Uspostavljanje fizičke asocijacije između polipeptida i njihovog genetskog materijala omogućava istovremeni masovni skrining veoma velikog broja faga koji nose različite polipeptide. Fagi na kojima se ispoljavaju polipeptid sa afinitetom za cilj se vezuju za cilj i ovi fagi se obogaćuju afinitetnim skriningom za cilj. Identitet polipeptida koji se ispoljavaju na ovim fagima se može odrediti na osnovu njihovih odgovarajućih genoma. Uz korišćenje ovih metoda se polipeptid za koji je utvrđeno da ima afinitet vezivanja za željeni cilj može sintetizovati u većim razmerama uobičajenim sredstvima. Vidi npr. US patent br. 6,057,098. Takav fag se naročito može primeniti za ispoljavanje domena za vezivanje antigena izraženih iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. humane ili mišije). Izraženi domen za vezivanje antigena na fagima koji se vezuje za antigen od interesa se može selekcionisati ili identifikovati sa antigenom, npr. uz korišćenje obeleženog antigena ili vezanog antigena ili uhvaćenog na čvrstoj površini ili perli. Fagi koji se upotrebljavaju u ovim metodima su obično vlaknasti fagi koji sadrže fd i M13 domene za vezivanje izražene iz faga sa domenima Fab, Fv ili disulfidno stabilizovanog Fv antitela rekombinantno fuzionisanih sa genom faga III ili genom VIII proteina. Metode ispoljavanja na fagima koje se mogu upotrebiti za pravljenje antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju one koje su opisane u Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunologv 57:191-280 (1994); PCT objavama WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i US patentima br. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.
[0158]Kao što je opisano u gornjim referencama, posle selekcije faga, regioni koji kodiraju antitelo iz faga se mogu izolovati i upotrebiti za generisanje celih antitela, uključujući humana antitela, ili bilo kog drugog željenog fragmenta za vezivanje antigena, i mogu biti izražena u bilo kom željenom domaćinu, uključujući sisarske ćelije, insektne ćelije, biljne ćelije, kvasce, i bakterije, npr. kao što je dole detaljnije opisano. Takođe se mogu primeniti, na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2fragmenata uz korišćenje metoda koji su poznati iz odgovarajuće oblasti, kao što su oni koji su opisani u PCT objavi WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); i Savvai et al., AJRI 34:26-34 (1995); i Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
[0159]Primeri tehnika koje se mogu primeniti za proizvodnju jednolančanih Fvs i antitela obuhvataju one koje su opisane u US patentima 4,946,778 i 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra et al., Science 240:1038-1040
(1988).
[0160]Pronalaskom je dalje realizovana primena bispecifičnih antitela, koja se mogu napraviti metodama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela cele dužine je bazirana na koekspresiji dva para imunoglobulinskih teških lanaca-lakih lanaca, pri čemu dva lanca imaju različite specifičnosti (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Zbog slučajnog izbora imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalno smešu 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima korektnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje korektnog molekula, koje se obično vrši koracima afinitetne hromatografije, je dosta opsežno, a prinosi proizvoda su niski. Slične procedure su opisane u WO 93/08829, objavljenom 13. maja 1993, i u Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
[0161]Prema drugačijem i poželjnijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta kombinovanja antitela-antigena) se fuzionišu sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija se vrši prvenstveno sa konstantnim domenom imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži bar deo zgloba, CH2, i CH3 regione. Poželjno je imati prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, a koje je prisutno u najmanje jednoj od fuzija. DNKs koje kodiraju fuzije imunoglobulinskih teških lanaca, i ako je poželjno, imunoglobulinski laki lanac, se umeću u odvojene vektore ekspresije, i kotransfektuju se u podesni organizam domaćin. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost podešavanja uzajamnih udela tri polipeptidna fragmenta u primerima izvođenja kada se u konstrukciji koriste nejednaki udeli tri polipeptidna lanca da bi se dobili optimalni prinosi. Međutim, moguće je umetnuti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan vektor ekspresije kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim proporcijama rezultuje visokim prinosima ili kada proporcije nisu od posebnog značaja.
[0162]U poželjnom primeru izvođenja ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od hibridnog imunoglobulinskog teškog lanca sa prvom specifičnosti vezivanja u jednom kraku, i hibridnog imunoglobulinskog para teški lanac-laki lanac (što obezbeđuje drugačiju specifičnost vezivanja) u drugom kraku. Otkriveno je da asimetrična struktura olakšava razdvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od nepoželjnih kombinacija imunoglobulinskog lanca kombinacija, pošto prisustvo imunoglobulinskog lakog lanca u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula obezbeđuje lako izdvajanje. Ovaj pristup je opisan u WO 94/04690 koji objavljen 3. marta 1994. Za druge detalje za generisanje bispecifičnih antitela vidi, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
[0163]Pronalazak se odnosi na funkcionalno aktivne fragmente, derivate ili analoge anti-BST1 imunoglobulinskih molekula. Funkcionalno aktivan znači da je fragment, derivat ili analog sposoban da pobudi anti-anti-idiotipska antitela{ tj.tercijarna antitela) koja prepoznaju isti antigen koji je prepoznalo antitelo od koga potiču fragment, derivat ili analog. Naročito se u poželjnom primeru izvođenja antigenost idiotipa imunoglobulinskog molekula može pojačati delecijom okvira i CDR sekvenci koje su C-terminalne do CDR sekvence koja specifično prepoznaje antigen. Da bi se odredilo koje CDR sekvence vezuju antigen, mogu se upotrebiti sintetički peptidi koji sadrže CDR sekvence u testovima vezivanja sa antigenom pomoću bilo kog postupka za testiranje vezivanja koji je poznat iz odgovarajuće oblasti.
[0164]Predmetni pronalazak se odnosi na fragmente antitela kao što su, ali bez ograničavanja na, F(ab')2fragmenti i Fab fragmenti. Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope se mogu generisati bilo kojim poznatim tehnikama. F(ab')2fragmenti se sastoje od varijabilnog regiona, konstantnog regiona lakog lanca i CH1 domena teškog lanca i generišu se pepsinskom digestijom molekula antitela. Fab fragmenti se generišu redukcijom disulfidnih mostova F(ab')2fragmenata. Pronalazak se takođe odnosi na dimere teškog lanca i lakog lanca antitela prema pronalasku, ili bilo koji njihov minimalni fragment, kao što su Fvs ili jednolančana antitela (SCAs) (npr. kao što je opisano u US patentu 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; i Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), ili bilo koji drugi molekul sa istom specifičnosti kao antitelo prema pronalasku. Jednolančana antitela se formiraju vezivanjem fragmenata teškog i lakog lanca Fv regiona preko aminokiselinskog mosta, što rezultuje jednolančanim polipeptidom. Mogu se primeniti tehnike za sastavljanje funkcionalnih Fv fragmenata uE. coli(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
[0165]U drugim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na fuzione proteine imunoglobulina prema pronalasku (ili njihove funkcionalno aktivne fragmente), na primer, u kojima je imunoglobulin fuzionisan preko kovalentne veze (npr. peptidne veze), bilo na N-terminusu ili C-terminusu sa aminokiselinskom sekvencom drugog proteina (ili njegovog dela, a prvenstveno dela proteina od najmanje 10, 20 ili 50 aminokiselina) koji nije imunoglobulin. Prvenstveno je imunoglobulin, ili njegov fragment kovalentno vezan za drugi protein na N-terminusu konstantnog domena. Kao što je gore navedeno, takvi fuzioni proteini mogu olakšati prečišćavanja, povećati poluživotin vivo,i povećati davanje antigena kroz epitelnu barijeru imunom sistemu.
[0166]Imunoglobulini prema pronalasku obuhvataju analoge i derivate koji su modifikovani, tj. kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula, sve dok takvo kovalentno vezivanje ne remeti imunospecifično vezivanje. Na primer, ali bez ograničavanja, derivati i analozi imunoglobulina obuhvataju one koji su bili dalje modifikovani, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatih zaštitnih/ blokirajućih grupa, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem za ćelijski ligand ili drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija se može izvršiti bilo kojim poznatim tehnikama, uključujući, ali bez ograničavanja na specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, itd. Pored toga, analog ili derivat mogu sadržati jednu ili više neklasičnih aminokiselina.
[0167]Prethodno navedena antitela se mogu koristiti u metodama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti, a odnose se na lokalizaciju i aktivnost BST1, npr. radi snimanja ovog proteina, merenja njegovih nivoa u podesnim fiziološkim uzorcima, u dijagnostičkim metodima, itd.
[0168]Proizvodnja afitela za BST1
[0169]Molekuli afitela predstavljaju novu klasu afinitetnih proteina baziranih na 58-aminokiselinskom ostatku proteinskog domena, dobijenom od jednog od domena stafilokoknog proteina A za vezivanje IgG. Ovaj domen, koji je sačinjen od svežnja od tri zavojnice, se koristi kao skelet za konstrukciju kombinatornih fagemidnih biblioteka, iz kojih se mogu izabrati varijante afitela koje ciljaju željene molekule uz korišćenje tehnologije ispoljavanja na fagima (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nvgren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nvgren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55.). Jednostavna, robusna struktura molekula afitela u kombinaciji sa njihovom malom molekulskom težinom (6 kDa), ih čini podesnim za široki spektar primena, na primer, kao reagensa za detekciju (Ronmark J, Hansson M, Nguven T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) i za inhibiranje receptorskih interakcija (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nvgren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Dalji detalji u vezi afitela i metodi njihove proizvodnje se mogu naći kao referenca u US patentu br. 5831012.
[0170]Obeležena afitela takođe mogu biti korisna u primenama za snimanje radi određivanja količine izoformi.
Proizvodnja domenskih antitela za BST1
[0171]Ovde navođenje antitela obuhvata i navođenje domenskih antitela. Domenska antitela (dAbs) su najmanje funkcionalno vezujuće jedinice antitela, koje odgovaraju varijabilnim regionima teških (VH) ili lakih (VL) lanaca humanih antitela. Jednolančana antitela imaju molekulsku težinu približno od 13 kDa. Domensko antitelo je razvijeno pomoću niza velikih i visoko funkcionalnih biblioteka potpuno humanih VH i VL dAbs (više od deset milijardi različitih sekvenci u svakoj biblioteci), i koristi ove biblioteke za selekciju dAbs koja su specifična za terapeutske ciljeve. Nasuprot mnogim uobičajenim antitelima, domenska antitela se dobro izražavaju u bakterijskim, kvaščevim, i sisarskim ćelijskim sistemima. Drugi detalji domenskih antitela i metoda njihove proizvodnje se mogu dobiti konsultovanjem US patenata 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; US redni br. 2004/0110941; evropsku prijavu patenta br. 1433846 i evropskih patenata 0368684 & 0616640; VVO05/035572, VVO04/101790, VVO04/081026, VVO04/058821, VVO04/003019 i VVO03/002609.
Proizvodnja nanotela za BST1
[0172]Nanotela su terapeutski proteini koji potiču od antitela, a sadrže jedinstvena strukturna i funkcionalna svojstva prirodnog antitela sačinjenog od teškog lanca. Ovakvo antitelo sačinjeno od teškog lanca sadrži samo jedan varijabilni domen (VHH) i dva konstantna domena (CH2 i CH3). Važno je da je klonirani i izolovani VHH domen savršeno stabilni polipeptid koji zadržava kapacitet vezivanja celog antigena originalnog teškog lanca antitela. Nanotela imaju visoku homologiju sa VHdomenima humanih antitela i mogu se dalje humanizovati bez gubitka aktivnosti. Važno je to što nanotela imaju nizak imunogeni potencijal, što je bilo potvrđeno u studijama na primatima sa jedinjenjima uvedenim nanotelima.
[0173]Nanotela kombinuju prednosti uobičajenih antitela sa važnim karakteristikama lekova sa malim molekulima. Slično kao uobičajena antitela, nanotela ispoljavaju visoku ciljnu specifičnost, visoki afinitet za svoj cilj i nisku inherentnu toksičnost. Međutim, kao i lekovi sa malim molekulima, oni mogu inhibirati enzime i lako pristupiti receptorskim pukotinama. Pored toga, nanotela su ekstremno stabilna, mogu se davati i drugim načinima primene osim injekcijom (vidi npr. WO 04/041867) i lako se proizvode. Druge prednosti nanotela obuhvataju prepoznavanje neuobičajenih ili skrivenih epitopa zahvaljujući svojoj maloj veličini, vezivanje u šupljinama ili aktivnim mestima proteinskih ciljeva sa visokim afinitetom i selektivnosti zbog njihove jedinstvene 3-dimenzionalne fleksibilnosti formata leka, prilagodljivog poluživota i lakoće i brzine otkrivanja leka.
[0174]Nanotela su kodirana pojedinačnim genima i efikasno se proizvode u skoro svim prokariotskim i eukariotskim domaćinima npr.E. coli(vidi npr. US 6,765,087), plesnima (na primer,Aspergillus ili Trichoderma)i kvascima (na primer,Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula ili Pichia)(vidi npr. US 6,838,254). Proces proizvodnje je skalabilan, a proizvedene su količine od više kilograma nanotela. Pošto nanotela ispoljavaju superiornu stabilnost u poređenju sa uobičajenim antitelima, ona se mogu formulisati kao rastvor koji je spreman za upotrebu, koji ima dugi rok trajanja.
[0175]Postupak nanokloniranja (vidi npr. WO 06/079372) je zaštićeni postupak za generisanje nanotela protiv željenog cilja, baziran na visoko produktivnoj selekciji B-ćelija.
Proizvodnja unitela za BST1
[0176]Unitela su sledeća tehnologija za fragmente antitela; međutim, ona je bazirana na odstranjivanju regiona zgloba lgG4 antitela. Delecija regiona zgloba rezultuje molekulom koji u suštini ima polovinu veličine tradicionalnih lgG4 antitela i ima univalentni vezujući region umesto bivalentnog vezujućeg regiona lgG4 antitela. Takođe je dobro poznato da su lgG4 antitela inertna i da zato ne sadejstvuju sa imunim sistemom, što može biti podesno za lečenje bolesti gde nije poželjna imuna reakcija, a ova prednost prelazi na unitela. Na primer, unitela mogu funkcionisati tako da inhibiraju ili utišavaju, ali ne ubijaju ćelije za koje su vezana. Pored toga, vezivanje unitela za ćelije kancera ih ne stimuliše da vrše proliferaciju. Pored toga, pošto unitela imaju oko polovine veličine tradicionalnih lgG4 antitela, onda ona mogu ispoljiti bolju raspodelu preko većih čvrstih tumora uz potencijalno poželjnu efikasnost. Unitela se izbacuju iz tela sličnom brzinom kao cela lgG4 antitela i mogu se vezivati sa sličnim afinitetom za njihove antigene kao cela antitela. Drugi detalji u vezi unitela se mogu dobiti razmatranjem patenta VVO2007/059782.
Proizvodnja DARPina za BST1
[0177]DARPini (engl. Designed Ankvrin Repeat Proteins) su jedan primer mimetika antitela DRP (engl. Designed Repeat Protein) tehnologije koja je razvijena da bi se iskoristile sposobnosti vezivanja polipeptida koji nisu antitela. Ponavljajući proteini, kao što su ankirinom ili leucinom-bogati ponavljajući proteini, su sveprisutni vezujući molekuli, koji se, za razliku od antitela, pojavljuju intra i ekstracelularno. Njihovu jedinstvenu modularnu arhitekturu karakterišu ponavljajuće strukturne jedinice (ponavljanja), koje se zajedno slažu da bi formirale izdužene ponavljajuće domene koji ispoljavaju varijabilne i modularne površine za vezivanje cilja. Na bazi ove modularnosti se mogu generisati kombinatorne biblioteke polipeptida sa visoko diversifikovanim specifičnostima vezivanja. Ova strategija obuhvata konsenzusni dizajn auto-kompatibilnih ponavljanja koja ispoljavaju varijabilne površinske ostatke i njihovo slučajno slaganje u ponavljajuće domene.
[0178]DARPini se mogu proizvesti u bakterijskim sistemima ekspresije sa veoma visokim prinosima i oni pripadaju najstabilnijim poznatim proteinima. Selekcionisani su visoko specifični, visoko afinitetni DARPini za široki spektar ciljnih proteina, uključujući humane receptore, citokine, kinaze, humane proteaze, viruse i membranske proteine. Mogu se dobiti DARPini koji imaju afinitete u opsegu od jednocifrenog nanomolskog do pikomolskog opsega.
[0179]DARPini se upotrebljavaju za široki spekat primena, uključujući ELISU, sendvič ELISU, analizu protočnom citometrijom (FACS), imunohistohemiju (IHC), primene sa čipovima, afinitetno prečišćavanje ili Vestern bloting. DARPini su se takođe pokazali kao visoko aktivni u intracelularnom odeljku, na primer, kao intracelularni markerski proteini koji su fuzionisani sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP). DARPini su bili dalje upotrebljeni za inhibiranje ulaska virusa sa IC50 u pM opsegu. DARPini nisu samo idealni za blokiranje interakcija protein-protein, već takođe inhibiraju i enzime. Proteaze, kinaze i transporteri su bili uspešno inhibirani, a najčešće u alosternom inhibitornom modu. Veoma brzo i specifično obogaćivanje na tumoru i veoma podesni odnosi tumora prema krvi čine DARPine veoma podesnim za in vivo dijagnostiku ili terapeutske pristupe.
[0180]Dodatne informacije u vezi DARPina i drugih DRP tehnologija se mogu naći u US objavljenoj prijavi patenta br. 2004/0132028, i međunarodnoj objavljenoj prijavi patenta br. VVO02/20565.
Proizvodnja antikalina za BST1
[0181]Antikalini su dodatna tehnologija mimetika antitela, međutim, u ovom slučaju specifičnost vezivanja potiče od lipokalina, familije proteina male molekulske tečine koji su prirodno i obilno izraženi u ljudskim tkivima i telesnim tečnostima. Lipokalini su se razvili da bi izvršavali niz funkcija in vivo povezanih sa fiziološkim transportom i skladištenjem hemijski osetljivih ili nerastvorljivih jedinjenja. Lipokalini imaju robusnu inherentnu strukturu koja sadrži visoko konzervirano B-bure koje nosi četiri petlje na jednom terminusu proteina. Ove petlje obrazuju ulaz u džep za vezivanje, a konformacione razlike u ovom delu molekula su odgovorne za varijacije u specifičnosti vezivanja između pojedinih lipokalina.
[0182]Dok je celokupna struktura hipervarijabilnih petlji nošena konzerviranim okvirom B-listova reminiscentna za imunoglobuline, lipokalini se znatno razlikuju od antitela u pogledu veličine, pošto su sastavljeni od samo jednog polipeptidnog lanca sa 160-180 aminokiselina koje su neznatno veće od samo jednog imunoglobulinskog domena.
[0183]Lipokalini se kloniraju, pa se njihove petlje podvrgavaju genetskom inženjeringu da bi se stvorili antikalini. Generisane su biblioteke strukturno različitih antikalina, a ispoljavanje na antikalinima omogućava selekciju i skrining funkcije vezivanja, koje su praćene ekspresijom i proizvodnjom rastvorljivog proteina za dalju analizu u prokariotskim ili eukariotskim sistemima. Studije su uspešno demonstrirale da se mogu razviti antikalini koji su posebno praktični za bilo koji humani ciljni protein; oni se mogu izolovati i mogu se dobiti afiniteti vezivanja u nanomolskom ili višem opsegu.
[0184]Antikalini takođe mogu biti formatirani kao dualni ciljajući proteini, takozvani duokalini. Duokalin koji se vezuje za dva odvojena terapeutska cilja u jednom proteinu se lako proizvodi uz korišćenje standardnih procesa proizvodnje, pri čemu zadržava ciljnu specifičnost i afinitet bez obzira na strukturnu orijentaciju njegova dva vezujuća domena.
[0185]Modulacija više ciljeva pomoću samo jednog molekula je posebno poželjna kod bolesti za koje je poznato da obuhvataju više od jednog uzročnog faktora. Pored toga, bi- ili multivalentni formati vezivanja, kao što su duokalini imaju značajan potencijal u ciljanju molekula na ćelijskoj površini kod bolesti, posredovanju agonističkih efekata na puteve transdukcije signala ili indukciju povećanih internalizacionih efekata putem vezivanja i grupisanja receptora na ćelijskoj površini. Pored toga, visoka inherentna stabilnost duokalina je uporediva sa monomernim antikalinima, što obezbeđuje fleksibilno formulisanje i potencijal davanja duokalina.
[0186]Dodatne informacije u vezi antikalina se mogu naći u US patentu br. 7,250,297 i međunarodnoj objavljenoj prijavi patenta br. WO 99/16873.
Proizvodnja avimera za BST1
[0187]Avimeri su se razvili iz velike familije humanih ekstracelularnih receptorskih domena in vitro mešanjem egzona i ispoljavanjem na fagima, generisanjem multidomenskih proteina sa vezujućim i inhibitornim svojstvima. Pokazano je da vezivanje više nezavisnih vezujućih domena stvara privlačnost i rezultuje poboljšanim afinitetom i specifičnošću u poređenju sa uobičajenim vezujućim proteinima sa samo jednim epitopom. Druge potencijalne prednosti obuhvataju jednostavnu i efikasnu proizvodnju molekula specifičnih za više ciljeva u Escherichia coli, poboljšanom termostabilnošću i otpornošću na proteaze. Dobijeni su avimeri sa subnanomolskim afinitetima za različite ciljeve.
[0188]Dodatne informacije u vezi avimera se mogu naći u US objavljenim prijavama patenta br. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.
Proizvodnja versatela za BST1
[0189]Versatela su mali proteini od 3-5 kDa sa >15% cisteina, koji obrazuju skelet sa visokom gustinom disulfida, koji zamenjuje hidrofobno jezgro koje imaju uobičajeni proteini. Zamena velikog broja hidrofobnih aminokiselina, koje sadrže hidrofobno jezgro, sa malim brojem disulfida rezultuje proteinom koji je manji, hidrofilniji (manja agregacija i nespecifično vezivanje), otpornijim na proteaze i toplotu, i ima manju gustinu T-ćelijskih epitopa, jer su ostaci koji najviše doprinose MHC prezentaciji hidrofobni. Dobro je poznato da sva ova četiri svojstva utiču na imunogenost, i da se očekuje da zajedno izazovu veliko smanjenje imunogenosti.
[0190]Inspiracija za versatela je došla od prirodnih injektabilnih biofarmaceutika koje proizvode pijavice, zmije, pauci, škorpije, puževi, i morske sase, za koje je poznato da ispoljavaju neočekivano nisku imunogenost. Polazeći od izabranih familija prirodnih proteina, konstrukcijom i skriningom po veličini, hidrofobnosti, proteolitičkoj preradi antigena, i gustini epitopa minimizirana su na nivou daleko ispod prošeka za prirodne injektabilne proteine.
[0191]Kada je data struktura versatela, onda ovi mimetici antitela omogućavaju raznovrsne formate koji obuhvataju multi-valenciju, multi-specifičnost, diverzitet mehanizama poluživota, module za ciljanje tkiva i odsustvo Fc regiona antitela. Pored toga, versatela se proizvode u E. coli sa visokim prinosima, a zbog svoje hidrofilnosti i male veličine, versatela su veoma rastvorljiva i mogu se formulisati u visokim koncentracijama. Versatela su termički izuzetno stabilna (ona se mogu iskuvavati) i omogućavaju duži rok upotrebe.
[0192]Dodatne informacije u vezi versatela se mogu naći u US objavljenoj prijavi patenta br. 2007/0191272.
Ekspresija afinitetnih reagenasa
Ekspresija antitela
[0193]Antitela prema pronalasku se mogu proizvesti bilo kojim postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti za sintezu antitela, a naročito, hemijskom sintezom ili rekombinantnom ekspresijom, i prvenstveno se proizvode tehnikama rekombinantne ekspresije.
[0194]Rekombinantna ekspresija antitela, ili njihovih fragmenata, derivata ili analoga, zahteva konstrukciju nukleinske kiseline koja kodira antitelo. Ako je poznata nukleotidna sekvenca antitela, onda se nukleinska kiselina koja kodira antitelo može sastaviti od hemijski sintetizovanih oligonukleotida (npr. kao što je opisano u Kutmeieref al.,1994,BioTechniques17:242), što, ukratko, obuhvata sintezu oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo koji se preklapaju, anelaciju i ligaciju tih oligonukleotida, a zatim amplifikaciju ligatiranih oligonukleotida pomoću PCR.
[0195]Alternativno tome, nukleinska kiselina koja kodira antitelo se može dobiti kloniranjem antitela. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira posebno antitelo nije na raspolaganju, ali je poznata sekvenca molekula antitela, onda se nukleinska kiselina koja kodira antitelo može dobiti iz podesnog izvora (npr. cDNK biblioteke antitela, ili cDNK biblioteke generisane od bilo kog tkiva ili ćelije koji izražavaju antitelo) pomoću PCR amplifikacije uz korišćenje sintetičkih prajmera koji se mogu hibridizovati sa 3' i 5' krajevima sekvence ili kloniranjem uz korišćenje oligonukleotidne probe specifične za posebnu sekvencu gena.
[0196]Ako molekul antitela koje specifično prepoznaje poseban antigen nije na raspolaganju (ili izvor za cDNK biblioteku za kloniranje nukleinske kiseline koja kodira takvo antitelo), onda se antitela koja su specifična za posebni antigen mogu generisati bilo kojim postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti, na primer, imunizacijom životinja, kao što je zec, da bi se generisala poliklonska antitela ili, na primer, generisanjem monoklonskih antitela. Alternativno tome, klon koji kodira bar Fab deo antitela se može dobiti skriningom biblioteka za ekspresiju Fab (npr. kao što je opisano u Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) za klonove Fab fragmenata koji se vezuju specifično za antigen ili skriningom biblioteka antitela (vidi npr. Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
[0197]Kada se jednom dobije nukleinska kiselina koja kodira bar varijabilni domen molekula antitela, onda se ona može uvesti u vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (vidi npr. PCT objavu WO 86/05807; PCT objavu WO 89/01036; i US
[0198]Patent br. 5,122,464). Vektori koji sadrže kompletni laki ili teški lanac za koekspresiju sa nukleinskom kiselinom da bi se omogućila ekspresija kompletnog molekula antitela su takođe na raspolaganju. Onda se nukleinska kiselina koja kodira antitelo može upotrebiti za uvođenje nukleotidne supstitucije, odnosno supstitucija ili delecije, odnosno delecija neophodnih da se supstituiše (ili obriše) jedan ili više varijabilnih regiona cisteinskih ostataka koji učestvuju u intralančanoj disulfidnoj vezi sa aminokiselinskim ostatkom koji ne sadrži sulfidil grupu. Takve modifikacije se mogu napraviti bilo kojim postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti za uvođenje specifičnih mutacija ili delecija u nukleotidnu sekvencu, na primer, ali bez ograničavanja na, hemijsku mutagenezu, in vitro mesno usmerenu mutagenezu (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), PCT bazirane metode, itd.
[0199]Pored toga se mogu koristiti tehnike razvijene za proizvodnju "himeričnih antitela" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) splajsovanjem gena iz molekula mišijeg antitela odgovarajuće antigenske specifičnosti zajedno sa genima iz molekula humanog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti. Kao što je opisanosupra,himerično antitelo je molekul u kome su različiti delovi dobijeni od različitih životinjskih vrsta, kao što su oni koji imaju varijabilni region dobijen od mišijeg mAb i konstantni region humanog antitela, npr. humanizovana antitela.
[0200]Kada se jednom dobije nukleinska kiselina koja kodira molekul antitela prema pronalasku, onda se vektor za proizvodnju molekula antitela može proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK uz korišćenje tehnika koje su dobro poznate iz odgovarajuće oblasti. Shodno tome, ovde su opisani metodi za dobijanje proteina prema pronalasku izražavanjem nukleinske kiseline koja sadrži sekvence molekula antitela. Metodi koji su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu primeniti za konstruisanje vektora ekspresije koji sadrže kodirajuće sekvence molekul antitela i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ovi metodi obuhvataju, na primer,in vitrotehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze, iin vivogensku rekombinaciju. Vidi, na primer, tehnike koje su opisane u Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, NY) i Ausubel et al. (uredn., 1998, Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, NY).
[0201]Vektor ekspresije se prenosi u ćeliju domaćina uobičajenim tehnikama, pa se transfektovane ćelije onda kultivišu uobičajenim tehnikama za proizvodnju antitela prema pronalasku.
[0202]Ćelije domaćini koje se koriste za izražavanje rekombinantnog antitela prema pronalasku mogu biti bakterijske ćelije, kao što jeEscherichia coli,ili, prvenstveno, eukariotske ćelije, a naročito za ekspresiju celog rekombinantnog molekula antitela. Naročito su sisarske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), u vezi sa vektorom kao što je veliki srednji rani genski promoterski element iz humanog citomegalovirusa, efektivan sistem za ekspresiju antitela (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
[0203]Za izražavanje molekula antitela prema pronalasku se mogu koristiti različiti sistemi domaćin-vektor ekspresije. Takvi sistemi ekspresije domaćina predstavljaju nosače koje kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i zatim prečistiti, ali takođe predstavljaju i ćelije koje, kada se transformišu ili transfektuju sa podesnim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, mogu izraziti molekul antitela prema pronalaskuin situ.Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme, kao što su bakterije (npr.E. coli, B. subtilis)transformisane sa rekombinantnim bakteriofagom DNK, plazmidnim DNK ili kozmidnim DNK vektorima ekspresije koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; kvasce (npr.Saccharomyces, Pichia)transformisane sa rekombinantnim kvaščevim vektorima ekspresije koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; sisteme sa insektnim ćelijama inficiranim sa rekombinantnim virusnim vektorima ekspresije (npr. bakulovirus) koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; sisteme sa biljnim ćelijama inficiranim sa rekombinantnim virusnim vektorima ekspresije (npr. mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisane sa rekombinantnim plazmidnim vektorima ekspresije (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence za kodiranje antitela; ili sistemi sa sisarskim ćelijama (npr. COS, CHO, BHK, 293, 3T3 ćelije) koje sadrže rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotere koji potiču iz genoma sisarskih ćelija (npr. metalotionski promoter) ili iz sisarskih virusa (npr. adenovirusni kasni promoter; vaccinia virus 7.5K promoter).
[0204]U bakterijskim sistemima može biti izabrano više vektora ekspresije u zavisnosti od nameravane primene molekula antitela koje se izražava. Na primer, kada treba da bude proizvedena velika količina takvog proteina, radi generisanja farmaceutskih kompozicija koje sadrže molekul antitela, mogu biti poželjni vektori koji upravljaju ekspresijom visokih nivoa fuziono-proteinskih produkata koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni naE. coli vektorekspresije pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), u kome sekvenca koja kodira antitelo može biti individualno ligatirana u vektor u okviru salacZkodirajućim regionom, tako da se proizvede fuzioni protein; pIN vektore (Inouve & Inouve, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); i slično. pGEX vektori se takođe mogu upotrebiti za izražavanje stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST). Generalno su takvi fuzioni proteini rastvorljivi i mogu se lako prečistiti od liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matricu glutation-agarozne perle, praćenim eluiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su konstruisani tako da sadrže trombin ili mesta cepanja faktora Xa proteaze, tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi od GST grupe.
[0205]U insektnom sistemu,Autographa californicanuklearni polihedrinski virus (AcNPV) se koristi kao vektor za izražavanje stranih gena. Virus se kultiviše uSpodoptera frugiperdaćelijama. Sekvenca koja kodira antitelo se može klonirati individualno u neesencijalnim regionima (na primer, polihedrinski gen) virusa i staviti pod kontrolu AcNPV promotera (na primer, polihedrinskog promotera). U sisarskim ćelijama domaćinima se može upotrebiti više sistema ekspresija baziranih na virusima (npr. adenovirusni sistem ekspresije).
[0206]Kao što je gore razmotreno, može biti izabran soj ćelije domaćina koji moduliše ekspresiju umetnutih sekvenci, ili modifikuje i prerađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i prerada (npr. cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važni za funkciju proteina.
[0207]Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih antitela, sa visokim prinosom, je poželjna stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno izražavaju antitelo od interesa se mogu proizvesti transfekcijom ćelija sa vektorom ekspresije koji sadrži nukleotidnu sekvencu antitela i nukleotidnu sekvencu koja je selektabilna (npr. sa neomicinom ili higromicinom), i selekcijom ekspresije selektabilnog markera. Ćelijske linije koje su tako podvrgnute genetskom inženjeringu mogu biti posebno korisne za skrining i evaluaciju jedinjenja koja sadejstvuju direktno ili indirektno sa molekulom antitela.
[0208]Nivoi ekspresije molekula antitela se mogu povećati amplifikacijom vektora (za pregled, vidi Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, tom 3. (Academic Press, New York, 1987). Kada se marker u vektorskom sistemu za izražavanje antitela može amplifikovati, onda će povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelija domaćina povećati broj kopija markerskog gena. Pošto je amplifikovani region povezan sa genom antitela, onda će i proizvodnja takođe biti povećana (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
[0209]Ćelija domaćin može biti kotransfektovana sa dva vektora ekspresije prema pronalasku, i to prvim vektorom koji kodira teški lanac poreklom od polipeptida i drugim vektorom koji kodira laki lanac poreklom od polipeptida. Ova dva vektora mogu sadržati identične selektabilne markere koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno tome, može se upotrebiti samo jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac bi trebalo da bude postavljen pre teškog lanca da bi se izbegao višak toksičnog slobodnog teškog lanca (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Kodirajuće sekvence za teški i laki lanac mogu sadržati cDNK ili genomsku DNK.
[0210]Kada se molekul antitela prema pronalasku jednom rekombinantno izrazi, onda on može biti prečišćen bilo kojim postupkom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti za prečišćavanje molekula antitela, na primer, hromatografijom (npr. jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, kao što je sa proteinom A ili specifičnim antigenom, i ekskluzionom kolonskom hromatografijom), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivosti, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina.
[0211]Alternativno tome, bilo koji fuzioni protein se može lako prečistiti korišćenjem antitela koje je specifično za fuzioni protein koji se izražava. Na primer, sistem koji su opisali Janknecht et al. omogućava lako prečišćavanje nedenaturisanih fuzionih proteina izraženih u humanim ćelijskim linijama (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). U ovom sistemu, gen od interesa se subklonira u vacinija rekombinantni plazmid, tako da je otvoreni okvir za čitanje gena translaciono fuzionisan sa amino-terminalnim tagom koji se sastoji od šest histidinskih ostataka. Tag služi kao matrica vezujućeg domena za fuzioni protein. Ekstrakti iz ćelija inficiranih sa rekombinantnim vacinija virusom se stavljaju na Ni2<+>nitrilosirćetna kiselina-agaroza kolone, a sa histidinom-obeleženi proteini se selektivno eluiraju sa puferima koji sadrže imidazol.
[0212]Antitela koja se generišu ovim metodama onda mogu biti selekcionisana prvo skriningom u pogledu afiniteta i specifičnosti sa prečišćenim polipeptidom od interesa i, ako je potrebno, upoređivanjem rezultata za afinitet i specifičnost antitela sa polipeptidima za koje je poželjno da budu isključeni iz vezivanja. Procedura skrininga može uključivati imobilizaciju prečišćenih polipeptida u posebnim bunarčićima mikrotitarskih ploča. Rastvor koji sadrži potencijalno antitelo ili grupe antitela se onda stavlja u odgovarajuće mikrotitarske bunarčiće i inkubira se tokom oko 30 min do 2 h. Mikrotitarski bunarčići se onda ispiraju i označavaju sekundarnim antitelom (na primer, anti-mišijim antitelom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom ako su dobijena antitela misija antitela) koje se dodaje bunarčićima i oni se inkubiraju tokom 30 min, a zatim se ispiraju. Supstrat se dodaje bunarčićima, a reakcija bojenja će se pojaviti tamo gde je prisutan imobilizovani polipeptid, odnosno polipeptidi.
[0213]Tako identifikovana antitela se onda mogu dalje analizirati u pogledu afiniteta i specifičnosti u izabranom dizajniranom testu. U razvoju imunotestova za ciljni protein, prečišćeni ciljni protein deluje kao standard pomoću koga se procenjuje senzitivnost i specifičnost imunotesta korišćenjem antitela koja su bila izabrana. Pošto se afinitet vezivanja različitih antitela može razlikovati, pa može doći do međusobne prostorne interferencije izvesnih parova antitela (npr. u sendvič testovima), itd., zato performanse testa sa antitelom mogu biti važnija mera od apsolutnog afiniteta i specifičnosti antitela.
[0214]Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se mogu usvojiti mnogi pristupi u proizvodnji antitela ili vezujućih fragmenata i skriningu i selekciji u pogledu afiniteta i specifičnosti različitih polipeptida, ali ovi pristupi ne menjaju obim pronalaska.
[0215]Za terapeutske primene je podesno da antitela (a naročito monoklonska antitela) budu humana ili humanizovana životinjska (npr. mišija) antitela. Životinjska antitela se mogu stvoriti u životinjama uz korišćenje humanog proteina (npr. BST1) kao imunogena. Humanizacija obično sadrži graftovanje CDRs identifikovanih u humanim okvirnim regionima. Normalno je da je potrebna izvesna prateća retromutacija da bi se optimizovala konformacija lanaca. Takvi procesi su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.
Ekspresija afitela
[0216]Konstrukcija afitela je već bila opisana (Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nvgren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655.), uključujući konstrukciju biblioteka za ispoljavanje afitela na fagima (Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlen, M. & Nvgren, P.A, A combinatorial librarv of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608. Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. & Nvgren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 772-777).
[0217]Biosenzorske analize za ispitivanje optimalnih varijanti afitela uz korišćenje biosenzorskih studija vezivanja su takođe već bile opisane (Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nvgren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655.).
Modifikacije afinitetnih reagenasa
[0218]U poželjnom primeru izvođenja, anti-BST1 afinitetni reagensi, kao što su antitela ili njihovi fragmenti, su konjugovana sa dijagnostičkom grupom (kao što je detektabilni marker) ili terapeutskom grupom. Antitela se mogu upotrebiti za dijagnozu ili za određivanje efikasnosti datog režima lečenja. Detekcija se može olakšati kuplovanjem antitela sa detektabilnom supstancom (markerom). Primeri detektabilnih supstanci obuhvataju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne nuklide, pozitronske emisione metale (za primenu u pozitronskoj emisionoj tomografiji), i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Vidi generalno US patent br. 4,741,900 za metalne jone koji se mogu konjugovati sa antitelima za primenu kao dijagnostici prema predmetnom pronalasku.
[0219]Podesni enzimi obuhvataju ren peroksidazu, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; podesne prostetičke grupe obuhvataju streptavidin, avidin i biotin; podesni fluorescentni materijali obuhvataju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i fikcoeritrin; podesni luminescentni materijali obuhvataju luminol; podesni bioluminescentni materijali obuhvataju luciferazu, luciferin, i aekvorin; i podesni radioaktivni nuklidi obuhvataju 125l,1311,111 In i<99>Tc. Takođe se može upotrebiti68Ga.
[0220]Kao što je gore navedeno, afinitetni reagensi, kao što su antitela za primenu u pronalasku, moći će da se konjuguju sa terapeutskom grupom, kao što je citotoksin, lekom (npr. imunosupresantom) ili radiotoksinom. Takvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugati". Imunokonjugati koji sadrže jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens obuhvata bilo koji agens koji je štetan za (npr. ubija) ćelije. Primeri obuhvataju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe obuhvataju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin).
[0221]Drugi poželjni primeri terapeutskih citotoksina koji se mogu konjugovati sa antitelom prema pronalasku obuhvataju duokarmicine, kaliheamicine, majtanzine i auristatine, i njihove derivate. Jedan primer konjugata kaliheamicin-antitelo je komercijalno raspoloživ (Mvlotarg®; American Home Products).
[0222]Citotoksini se mogu konjugovati sa antitelima prema pronalasku uz korišćenje tehnologije linkera koja je raspoloživa iz odgovarajuće oblasti. Primeri tipova linkera koji se koriste za konjugaciju citotoksina sa antitelom obuhvataju, ali nisu ograničeni na linkere koji sadrže hidrazone, tioetre, estre, disulfide i peptide. Linker može biti izabran tako da bude, na primer, podložan cepanju pri niskom pH u okviru lipozomskog odeljka ili podložan cepanju pomoću proteaza, kao što su proteaze koje se prvenstveno izražavaju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr. katepsini B, C, D).
[0223]Primeri citotoksina su opisani, na primer, u US patentima br. 6,989,452, 7,087,600, i 7,129,261, i u PCT prijavi VVO2006/110476, i u US prijavi patenta br. 60/891,028. Za dalju diskusiju u vezi tipova citotoksina, linkera i metoda za konjugaciju terapeutskih agenasa sa antitelima, vidi takođe Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, C.J.
(2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
[0224]Afinitetni reagensi se takođe mogu konjugovati sa radioaktivnim izotopom da bi se generisali citotoksični radiofarmaceutici, koji se takođe nazivaju radioimunokonjugatima. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku primenu obuhvataju, ali nisu ograničeni na jodl 31, indijuml 11, itrijum90 i Iutecijum177. Postupci za pripremanje radioimunokonjugata su poznati iz odgovarajuće oblasti. Primeri radioimunokonjugata koji su komercijalno raspoloživi, uključuju Zevalin® (I DEC Pharmaceuticals) i Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), a slični metodi se mogu koristiti za pripremanje radioimunokonjugata uz korišćenje antitela prema pronalasku.
[0225]Konjugati se mogu primeniti za modifikaciju date biološke reakcije, a grupu lekova ne treba smatrati ograničenom na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, grupa lekova može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu obuhvatati, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, ili difterija toksin; protein, kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-y; ili, modifikatori biološke reakcije, kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonija granulocitnih makrofaga ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonija granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta. Senter P.D. (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244; Kovtun et al.
(2010) Cancer Res. 70(6):2528-2537.
[0226]Tehnike za konjugaciju takvih terapeutskih grupa sa antitelima su dobro poznate, vidi npr. Arnon et al., " Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapv," u Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, Reisfeld et al. (uredn.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Deliverv," u Controlled Drug Deliverv (2. izd.), Robinson et al. (uredn.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibodv Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapv: A Review," u Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (uredn.), str. 475-506 (1985); "Analvsis, Results, and Future Prospective Of The Terapeutic Use Of Radiolabeled Antibodv In Cancer Therapv," u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapv, Baldvvin et al. (uredn.), str. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
[0227]Alternativno tome, antitelo se može konjugovati sa drugim antitelom da bi se formirao heterokonjugat antitela kao što je opisano u US patentu br. 4,676,980.
[0228]Antitelo sa ili bez terapeutske grupe koja je konjugovana sa njim se može primeniti kao terapeutik koji se daje sam ili u kombinaciji sa citotoksičnim faktorom, odnosno faktorima i/ili citokinom, odnosno citokinima.
[0229]Pronalazak se odnosi na potpuno humana, ili humanizovana antitela koja indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Potpuno humano antitelo je ono u kome su sekvence proteina kodirane prirodnim humanim imunoglobulinskim sekvencama, bilo iz izolovanih humanih B-limfocita koji proizvode antitelo, ili iz transgenskih mišijih B-limfocita miševa u kojima su misiji imunoglobulinski kodirajući hromozomski regioni zamenjeni sa ortologim humanim sekvencama. Transgenska antitela zadnje pomenutog tipa obuhvataju, ali nisu ograničena na HuMab (Medarex, Ine, CA) i XenoMouse (Abgenix Inc., CA). Humanizovano antitelo je ono u kome je konstantni region nehumanog molekula antitela odgovarajuće antigenske specifičnosti zamenjen sa konstantnim regionom humanog antitela, a prvenstveno IgG podtipa, sa odgovarajućim efektorskim funkcijama (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). Odgovarajuće efektorske funkcije obuhvataju ADCC, koji je prirodni proces kojim se potpuno humana antitela ili humanizovana antitela, kada se vežu za ciljeve na površini ćelija kancera, menjaju u svojstva ubijanja ćelija od strane limfocita koja su deo normalnog imunog sistema. Ovi aktivni limfociti, koji se nazivaju ćelije prirodne ubice (NK), koriste citotoksični proces za uništavanje živih ćelija za koje su vezana antitela. ADCC aktivnost se može detektovati i kvantifikovati merenjem oslobađanja europijuma (Eu<3+>) iz živih ćelija obeleženih sa Eu<3+>u prisustvu antitela specifičnog za antigen i mononuklearnih ćelija periferne krvi ekstrahovanih iz imunokompetentnog, živog humanog subjekta. ADCC proces je detaljno opisan u Janeway Jr. CA. et al., Immunobiologv, 5. izd., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., lmmunology, Infection, and lmmunity, 2004, str.246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:str.2153-68 i Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21 :str. 3940-3947. Podesne metode za detekciju i kvantifikaciju ADCC se mogu naći u Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86:str.225-9; Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21 ;92:str.117-23 i Patel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184:str.29-38.
[0230]ADCC obično obuhvata aktivaciju NK ćelija i zavisan je od prepoznavanja ćelija obloženih sa antitelom od strane Fc receptora na površini NK ćelije. Fc receptori prepoznaju Fc (kristalni) deo antitela, kao što je IgG, koji je specifično vezan za površinu ciljne ćelije. Fc receptor koji pokreće aktivaciju NK ćelije se naziva CD16 ili FcyRIHa. Kada se FcyRllla receptor jednom veže za IgG Fc, onda NK ćelija oslobađa citokine, kao što je IFN-y, i citotoksične granule koje sadrže perforin i granzime koji ulaze u ciljnu ćeliju i dovode do smrti ćelije pokretanjem apoptoze.
[0231]Uvođenje ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) pomoću antitela se može pojačati modifikacijama koje menjaju interakcije između konstantnog regiona (Fc) antitela i različitih receptora koji su prisutni na površini ćelija imunog sistema. Takve modifikacije obuhvataju redukciju ili odsustvo alfa 1,6-vezanih fukoznih grupa u kompleksu oligosaharidnih lanaca koji se normalno dodaju Fc antitelima tokom prirodne ili rekombinantne sinteze u sisarskim ćelijama. U poželjnom primeru izvođenja, ne-fukozilovani anti-BST1 afinitetni reagensi, kao što su antitela ili njihovi fragmenti se proizvode za svrhe pojačanja njihove sposobnosti da indukuju ADCC reakciju.
[0232]Tehnike za smanjenje ili odsecanje alfa 1,6-vezanih fukoznih grupa u oligosaharidnim lancima Fc su dobro poznate. U jednom primeru se rekombinantno antitelo sintetizuje u ćelijskoj liniji čija sposobnost da dodaje fukozu u alfa 1,6 vezu najviše prema unutrašnjosti smeštenog N-acetilglukozamina N-vezanog biantenarnog kompleksa-tipa Fc oligosaharida je oštećena. Takve ćelijske linije obuhvataju, ali nisu ograničene na pacovski hibridom YB2/0, koji izražava smanjeni nivo alfa 1,6-fukoziltransferaza gena, FUT8. Prvenstveno se antitelo sintetizuje u ćelijskoj liniji koja nije u stanju da dodaje alfa 1,6-vezane fukozil grupe kompleksu oligosaharidnih lanaca, zbog delecija obe kopije FUT8 gena. Takve ćelijske linije obuhvataju, ali nisu ograničene na, FUT8-/- CHO/DG44 ćelijske linije. Tehnike za sintezu delimično fukozilovanih, ili nefukozilovanih antitela, kao i afinitetni reagensi su opisani u Shinkavva et al., J. Biol. Chem. 278:3466-34735 (2003); Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology i Bioengineering 87: 614-22 (2004) i u VVO00/61739 A1, VVO02/31140 A1 i VVO03/085107 A1. U drugom primeru, fukozilacija rekombinantnog antitela je smanjena ili sprečena sintezom u ćelijskoj liniji koja je podvrgnuta genetskom inženjeringu da bi prekomerno izražavala glikoprotein-modifikujuću glikozil transferazu sa nivoom koji maksimizira proizvodnju kompleksa N-vezanih oligosaharida koji nose bisektujući N-acetilglukozamin. Na primer, antitelo se sintetizuje u ćelijskoj liniji jajnih ćelija kineskog hrčka koja izražava enzim N-acetil glukozamin transferazu III (GnT III). Ćelijske linije koje su stabilno transfektovane sa podesnim glikoprotein-modifikujućim glikozil transferazama, i metode za sintezu antitela uz korišćenje ovih ćelija su opisane u VV099/54342.
[0233]Ne-fukozilovano antitelo ili afinitetni reagens se može koristiti kao terapeutik koji se daje sam ili u kombinaciji sa citotoksičnim faktorom, odnosno faktorima i/ili citokinom, odnosno citokinima.
[0234]U sledećoj modifikaciji, aminokiselinske sekvence Fc antitela se menjaju tako da pojačavaju ADCC aktivaciju, bez uticaja na afinitet liganda. Primeri takvih modifikacija su opisani u Lazar et al., Proceedings of the National Academv of Sciences 2006, 103: str.4005-4010; VVO03/074679 i VVO2007/039818. U ovim primerima, supstitucija aminokiselina u Fc antitelima, kao što je aspartat sa serinom na poziciji 239, i izoleucin sa glutamatom na poziciji 332, menja afinitet vezivanja antitela za Fc receptore, što dovodi do povećanja ADCC aktivacije.
[0235]Antitelo kao reagens sa pojačanom ADCC aktivacijom zbog aminokiselinskih supstitucija se može koristiti kao terapeutik koji se daje sam ili u kombinaciji sa citotoksičnim faktorom, odnosno faktorima i/ili citokinom, odnosno citokinima.
[0236]Pronalazak se takođe odnosi na bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za prvi ciljni epitop (tj. BST1) i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istom ciljnom proteinu za koji se vezuje prva specifičnost vezivanja; ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na različitom ciljnom proteinu za koji se vezuje prvi protein, za koji se vezuje prva specifičnost vezivanja. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istoj ćeliji kao prvi ciljni epitop (tj. BST1); ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na cilju koji se ne ispoljava na ćeliji koja ispoljava prvi ciljni epitop. Kada se ovde koristi, izraz 'specifičnost vezivanja' se odnosi na grupu koja sadrži najmanje jedan varijabilni domen antitela.
[0237]Ovi bispecifični molekuli ciljaju BST1 koji izražavaju ćelije CD3 ili CD5 koje izražavaju efektorske ćelije (npr. CD3 ili CD5 izražavaju citotoksične T ćelije) i pokreću sa CD3 ili CD5 -posredovanu aktivnost efektorskih ćelija, kao što je klonska ekspanzija T ćelija i T ćelijska citotoksičnost. Bispecifična antitela prema pronalasku mogu imati ukupno dva ili tri varijabilna domena antitela, pri čemu prvi deo bispecifičnog antitela može da pokrene aktivnost humane imune efektorske ćelije specifičnim vezivanjem za efektorski antigen lociran na humanoj imunoj efektorskoj ćeliji, u kojoj je efektorski antigen humani CD3 ili CD5 antigen, pri čemu se pomenuti prvi deo sastoji od jednog varijabilnog domena antitela, a drugi deo bispecifičnog antitela može da se specifično vezuje za ciljni antigen koji je različit od efektorskog antigena npr. BST1, pri čemu je pomenuti ciljni antigen lociran na ciljnoj ćeliji koja je različita od pomenute humane imune efektorske ćelije, i pomenutog drugog dela koji sadrži jedan ili dva varijabilna domena antitela.
Dijagnoza kancera uključujući bolesti prema pronalasku
[0238]U skladu sa predmetnim pronalaskom, uzorci za testiranje npr. mijeloidnog tkiva, tkiva dojke, kolorektalnog, bubrežnog, plućnog ili pankreasnog tkiva, seruma, plazme ili urina dobijeni od subjekta za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima bolesti prema pronalasku se mogu upotrebiti za dijagnozu ili praćenje. U jednom primeru izvođenja, pramena količine BST1 u uzorku za testiranje u odnosu na kontrolni uzorak (od subjekta ili subjekata koji nemaju bolesti prema pronalasku) ili prethodno određeni referentni opseg ukazuje na prisustvo bolesti prema pronalasku. U sledećem primeru izvođenja, relativna količina BST1 u uzorku za testiranje upoređenom sa kontrolnim uzorkom ili prethodno određenim referentnim opsegom ukazuje na podtip bolesti prema pronalasku (npr. zapaljenski kancer dojke, familijarni ili sporadični kolorektalni kancer, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija pluća, karcinom malih ćelija ili endokrine tumore pankreasa). U jednom drugom primeru izvođenja, relativna količina BST1 u uzorku za testiranje u odnosu na kontrolni uzorak ili prethodno određeni referentni opseg ukazuje na stadijum ili ozbiljnost bolesti prema pronalasku (npr. verovatnoću metastaziranja). U bilo kom od gore pomenutih metoda, detekcija BST1 se može opciono kombinovati sa detekcijom jednog ili više dodatnih biomarkera za bolesti prema pronalasku. Bilo koji podesan postupak iz odgovarajuće oblasti se može primeniti za merenje nivoa BST1, uključujući, ali bez ograničavanja na poželjne tehnologije koje su ovde opisane, testove kinaze, imunotestove za detekciju i/ili vizualizaciju BST1 (npr. Vestern blot, imunotaloženje praćeno sa natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gel elektroforezom, imunocitohemijom, itd.). U sledećem primeru izvođenja, promena količine mRNK koja kodira BST1 u uzorku za testiranje u odnosu na kontrolni uzorak ili prethodno određeni referentni opseg ukazuje na prisustvo bolesti prema pronalasku. Bilo koji podesni test hibridizacije se može koristiti za detektovanje BST1 ekspresije detekcijom i/ili vizualizacijom mRNK koja kodira BST1 (npr. Nordern testovi, dot blotovi,in situhibridizacija, itd.).
[0239]U sledećem primeru izvođenja prema pronalasku, obeležena antitela (ili drugi afinitetni reagensi), njihovi derivati i analozi, koji se specifično vezuju za BST1 se mogu primeniti za dijagnostičke svrhe za detekciju, dijagnozu ili praćenje bolesti prema pronalasku. Prvenstveno se bolesti prema pronalasku detektuju kod životinje, a poželjnije kod sisara i najpoželjnije kod čoveka.
Skrining testovi
[0240]Pronalaskom su realizovani metodi za identifikaciju agenasa (npr. jedinjenja kandidata ili testiranih jedinjenja) koji se vezuju za BST1 ili imaju stimulatorni ili inhibitorni efekat na ekspresiju ili aktivnost BST1. Pronalaskom su takođe realizovani metodi za identifikaciju agenasa, jedinjenja kandidata ili testiranih jedinjenja koja se vezuju za BST1-srodni polipeptid ili BST1 fuzioni protein ili imaju stimulatorni ili inhibitorni efekat na ekspresiju ili aktivnost BST1-srodnog polipeptida ili BST1 fuzionog proteina. Primeri agenasa, jedinjenja kandidata ili testiranih jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na nukleinske kiseline (npr. DNK i RNK), ugljene hidrate, lipide, proteine, peptide, peptidomimetike, male molekule i druge lekove. Agensi se mogu dobiti uz korišćenje bilo kog od brojnih pristupa u metodima kombinatornih biblioteka koji su poznati iz odgovarajuće oblasti, uključujući: biološke biblioteke; prostorno adresabilne paralelno čvrsto-fazne ili rastvorno-fazne biblioteke; metode sintetičkih biblioteka koje zahtevaju dekonvoluciju; metod biblioteka "jedna-perla jedno-jedinjenje"; i metode sintetičkih biblioteka sa primenom selekcije afinitetnom hromatografijom. Pristup sa biološkim bibliotekama je ograničen na peptidne biblioteke, dok se druga četiri pristupa mogu primeniti na peptidne, nepeptidne oligomerne biblioteke jedinjenja ili biblioteke jedinjenja sa malim molekulima (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; US patent br. 5,738,996; i US patent br. 5,807,683).
[0241]Primeri metoda za sintezu molekulskih biblioteka se mogu naći u odgovarajućoj oblasti, na primer, u: DeVVitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; i Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.
[0242]Biblioteke jedinjenja mogu biti prezentovane, npr. prezentovane u rastvoru (npr. Houghten, 1992, BioTechniques 13:412-421), ili na perlama (Lam, 1991, Nature 354:82-84), čipovima (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bakterijama (US patent br. 5,223,409), sporama (patenti br. 5,571,698; 5,403,484; i 5,223,409), plazmidima (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) ili fagima (Scott i Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cvvirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; i Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310).
[0243]U jednom primeru, agensi koji sadejstvuju sa (tj. vezuju se za) BST1, BST1 fragmentom (npr. funkcionalno aktivnim fragmentom), BST1 -srodnim polipeptidom, fragmentom BST1 -srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionom proteinom se identifikuju u sistemu za testiranje baziranom na ćelijama. U skladu sa ovim primerom, ćelije koje izražavaju BST1, fragment BST1, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein se dovode u kontakt sa jedinjenjem kandidatom ili kontrolnim jedinjenjem i određuje se sposobnost jedinjenja kandidata da sadejstvuje sa BST1. Ako je poželjno, ovaj test se može primeniti za skrining mnoštva (npr. biblioteke) jedinjenja kandidata. Ćelija može biti, na primer, prokariotskog porekla (npr.E. coli)ili eukariotskog porekla (npr. kvaščeva ili sisarska). Dalje, ćelije mogu izražavati BST1, fragment BST1, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein endogeno ili mogu biti podvrgnute genetskom inženjeringu da bi izražavale BST1, fragment BST1, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein. U izvesnim slučajevima, BST1, fragment BST1, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein ili jedinjenje kandidat su obeleženi, na primer, sa radioaktivnim markerom (kao što su<32>P,<35>S,i<125>l) ili fluorescentnim markerom (kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid ili fluoreskamin) da bi se omogućila detekcija interakcije između BST1 i jedinjenja kandidata. Sposobnost jedinjenja kandidata da sadejstvuje direktno ili indirektno sa BST1, fragmentom BST1, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionim proteinom se može odrediti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Na primer, interakcija između jedinjenja kandidata i BST1, BST1-srodnog polipeptida, fragmenta BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionog proteina se može odrediti protočnom citometrijom, scintilacionim testom, imunotaloženjem ili vestern blot analizom.
[0244]U sledećem primeru, agensi koji sadejstvuju (tj. vezuju se za) BST1, BST1 fragment (npr. funkcionalno aktivni fragment), BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein se identifikuju u sistemu za testiranje bez ćelija. U skladu sa ovim primerom, prirodni ili rekombinantni BST1 ili njegov fragment, ili prirodni ili rekombinantni BST1-srodni polipeptid ili njegov fragment, ili BST1 -fuzioni protein ili njegov fragment, se dovodi u kontakt sa jedinjenjem kandidatom ili kontrolnim jedinjenjem i određuje se sposobnost jedinjenja kandidata da sadejstvuje sa BST1 ili BST1-srodnim polipeptidom, ili BST1 fuzionim proteinom. Ako je poželjno, ovaj test se može upotrebiti za proveru mnoštva (npr. biblioteke) jedinjenja kandidata. Prvenstveno se BST1, BST1 fragment, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1-fuzioni protein prvo imobilizuje, na primer, dovođenjem u kontakt BST1, BST1 fragmenta, BST1-srodnog polipeptida, fragmenta BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionog proteina sa imobilizovanim antitelom (ili drugim afinitetnim reagensom) koji ga specifično prepoznaje i vezuje, ili dovođenjem u kontakt prečišćenog preparata BST1, BST1 fragmenta, BST1-srodnog polipeptida, fragmenta BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionog proteina sa površinom namenjenom za vezivanje proteina. BST1, BST1 fragment, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein mogu biti delimično ili potpuno prečišćeni (npr. delimično ili potpuno od drugih polipeptida) ili mogu biti deo ćelijskog lizata. Dalje, BST1, BST1 fragment, BST1-srodni polipeptid, ili fragment BST1-srodnog polipeptida može biti fuzioni protein koji sadrži BST1 ili njegov biološki aktivni deo, ili BST1-srodni polipeptid i domen, kao što je glutationin-S-transferaza. Alternativno tome, BST1, BST1 fragment, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida ili BST1 fuzioni protein može biti biotinilovan uz korišćenje tehnika koje su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti (npr. kit za biotinilaciju, Pierce Chemicals; Rockford, IL). Sposobnost jedinjenja kandidata da sadejstvuje sa BST1, BST1 fragmentom, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionim proteinom se može odrediti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.
[0245]U sledećem primeru, sistem za testiranje baziran na ćelijama se koristi za identifikaciju agenasa koji se vezuju za ili modulišu aktivnost proteina, kao što je enzim, ili njegov biološki aktivni deo, koji je odgovoran za proizvodnju ili degradaciju BST1 ili je odgovoran za post-translacionu modifikaciju BST1. U primarnom skiningu, se mnoštvo (npr. biblioteka) jedinjenja dovodi u kontakt sa ćelijama koje prirodno ili rekombinantno izražavaju: (i) BST1, izoformu BST1, BST1 homolog, BST1-srodni polipeptid, BST1 fuzioni protein, ili biološki aktivni fragment bilo kog od gore navedenih; i (ii) protein koji je odgovoran za preradu BST1, BST1 izoforme, BST1 homologa, BST1-srodnog polipeptida, BST1 fuzionog proteina, ili fragmenta da bi se identifikovala jedinjenja koja modulišu proizvodnju, degradaciju, ili post-translacionu modifikaciju BST1, BST1 izoforme, BST1 homologa, BST1-srodnog polipeptida, BST1 fuzionog proteina ili fragmenta. Ako je poželjno, jedinjenja koja su identifikovana u primarnom skriningu se onda mogu testirati u sekundarnom skriningu protiv ćelija koje prirodno ili rekombinantno izražavaju BST1. Sposobnost jedinjenja kandidata da moduliše proizvodnju, degradaciju ili post-translacionu modifikaciju BST1, izoforme, homologa, BST1 -srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionog proteina se može odrediti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, uključujući bez ograničenja, protočnu citometriju, scintilacioni test, imunotaloženje i vestern blot analizu.
[0246]U sledećem primeru, agensi koji kompetitivno sadejstvuju sa (tj. vezuju se za) BST1, BST1 fragment, BST1 -srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein se identifikuju u kompetitivnom testu vezivanja. U skladu sa ovim primerom, ćelije koje izražavaju BST1, BST1 fragment, BST1-srodni polipeptid, fragment BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzioni protein se dovode u kontakt sa jedinjenjem kandidatom i jedinjenjem za koje je poznato da sadejstvuje sa BST1, BST1 fragmentom, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida ili BST1 fuzionim proteinom; onda se određuje sposobnost jedinjenja kandidata da prvenstveno sadejstvuje sa BST1, BST1 fragmentom, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionim proteinom. Alternativno tome, agensi koji prvenstveno sadejstvuju sa (tj. vezuju se za) BST1, BST1 fragment, BST1 -srodni polipeptid ili fragment BST1-srodnog polipeptida se identifikuju u sistemu za testiranje bez ćelija dovođenjem u kontakt BST1, BST1 fragmentom, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionim proteinom sa jedinjenjem kandidatom i jedinjenjem za koje je poznato da sadejstvuje sa BST1, BST1-srodnim polipeptidom ili BST1 fuzionim proteinom. Kao što je gore navedeno, sposobnost jedinjenja kandidata da sadejstvuje sa BST1, BST1 fragmentom, BST1-srodnim polipeptidom, fragmentom BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionim proteinom može biti određena metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Ovi testovi, bez obzira da li su bazirani na ćelijama ili ne, se mogu primeniti za skrining mnoštva (npr. biblioteke) jedinjenja kandidata.
[0247]U sledećem primeru, agensi koji modulišu (tj. povećavaju ili smanjuju) ekspresiju ili aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida se identifikuju dovođenjem u kontakt ćelija (npr. ćelija prokariotskog porekla ili eukariotskog porekla) koje izražavaju BST1 ili BST1-srodni polipeptid sa jedinjenjem kandidatom ili kontrolnim jedinjenjem (npr. fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS)) i određivanjem ekspresije BST1, BST1-srodnog polipeptida, ili BST1 fuzionog proteina, mRNK koja kodira BST1, ili mRNK koja kodira BST1-srodni polipeptid. Nivo ekspresije BST1, BST1-srodnog polipeptida, mRNK koja kodira BST1, ili mRNK koja kodira BST1-srodni polipeptid u prisustvu jedinjenja kandidata se upoređuje sa nivoom ekspresije BST1, BST1-srodnog polipeptida, mRNK koja kodira BST1, ili mRNK koja kodira BST1 -srodni polipeptid u odsustvu jedinjenja kandidata (npr. u prisustvu kontrolnog jedinjenja). Onda se jedinjenje kandidat može identifikovati kao modulator ekspresije BST1, ili BST1-srodnog polipeptida na osnovu ovog poređenja. Na primer, kada je ekspresija BST1 ili mRNK znatno veća u prisustvu jedinjenja kandidata nego u njegovom odsustvu, onda se jedinjenje kandidat identifikuje kao stimulator ekspresije BST1 ili mRNK. Alternativno tome, kada je ekspresija BST1 ili mRNK znatno manja u prisustvu jedinjenja kandidata nego u njegovom odsustvu, onda se jedinjenje kandidat identifikuje kao inhibitor ekspresije BST1 ili mRNK. Nivo ekspresije BST1 ili mRNK koja ga kodira se može odrediti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Na primer, mRNK ekspresija se može odrediti pomoću Nordern blot analize ili RT-PCR, a nivoi proteina se mogu odrediti pomoću vestern blot analize.
[0248]U sledećem primeru, agensi koji modulišu aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida se identifikuju dovođenjem u kontakt preparata koji sadrži BST1 ili BST1-srodni polipeptid ili ćelije (npr. prokariotske ili eukariotske ćelije) koje izražavaju BST1 ili BST1-srodni polipeptid sa testiranim jedinjenjem ili kontrolnim jedinjenjem i određivanjem sposobnosti testiranog jedinjenja da moduliše (npr. da stimuliše ili inhibira) aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida. Aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida se može odrediti detekcijom indukcije puta ćelijske transdukcije signala BST1 ili BST1-srodnog polipeptida (npr. intracelularnog Ca2<+>, diacilglicerola, IP3, itd.), detekcijom katalitičke ili enzimske aktivnosti cilja na podesnom supstratu, detekcijom indukcije reporter gena (npr. regulatornog elementa koji reaguje na BST1 ili BST1-srodni polipeptid i koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira detektabilni marker, npr. luciferazom), ili detekcijom ćelijske reakcije, na primer, ćelijske diferencijacije, ili ćelijske proliferacije. Na osnovu aktuelnog opisa za merenje ovih aktivnosti se mogu primeniti tehnike koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti (vidi npr. US patent br. 5,401,639). Jedinjenje kandidat se onda može identifikovati kao modulator aktivnosti BST1 ili BST1-srodnog polipeptida upoređivanjem efekata jedinjenja kandidata sa kontrolnim jedinjenjem. Podesna kontrolna jedinjenja obuhvataju fosfatni puferovani slani rastvor (PBS) i normalni slani rastvor (NS).
[0249]U sledećem primeru, agensi koji modulišu (tj. povećavaju ili smanjuju) ekspresiju, aktivnost ili i ekspresiju, i aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida se identifikuju u životinjskom modelu. Primeri podesnih životinja obuhvataju, ali nisu ograničeni na miševe, pacove, zečeve, majmune, zamorčiće, pse i mačke. Prvenstveno životinja koja se koristi predstavlja model bolesti prema pronalasku (npr. ksenografti ćelijskih linija kancera dojke, kao što su MCF-7 (Ozzello L, Sordat M., Eur J Cancer. 1980;16:553-559) i MCF10AT (Miller et al., J Natl Cancer Inst. 1993;85:1725-1732) kod golih ili SCID miševa; ksenografti ćelijskih linija humanog kolorektalnog kancera, kao što je MDA-MB-345 kod SCID miševa lišenih estrogena, Eccles et al. 1994 Cell Biophvsics 24/25, 279; ksenografti ćelijskih linija kancera bubrega, kao što su CAKI-1 (Matthevvs PN, Grant AG, Hermon-Tavlor J. Br J Cancer. 1984 February; 49(2): 193-198), 786-0 (G. J. STREVVLER et al Endocrinology tom 119, br. 1 303-310) i ACHN (Zeng J, Mei W, Huang H, Li X, Kong P.; J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2002;22(4):331-3) kod golih miševa; ksenografti ćelijskih linija kancera ne-malih ćelija pluća, kao što su A549 i H460 i ksenografti ćelijskih linija kancera malih ćelija pluća, kao što je NCI-H345 ili ksenografti ćelijskih linija kancera pankreasa, kao što je MIA PaCa-2 kod golih miševa, Marincola et al., J Surg Res 1989 Dec;47(6):520-9). Oni se mogu koristiti za testiranje jedinjenja koja modulišu nivoe BST1, pošto je patologija koja se ispoljava u ovim modelima slična npr. onoj kod bolesti prema pronalasku. U skladu sa ovim primerom, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daje (npr. oralno, rektalno ili parenteralno, kao što je intraperitonealno ili intravenski) podesnoj životinji i određuje se efekat na ekspresiju, aktivnost ili i ekspresiju, i aktivnost BST1 ili BST1-srodnog polipeptida. Promene u ekspresiji BST1 ili BST1-srodnog polipeptida se mogu odrediti gore navedenim metodama.
[0250]U jednom drugom primeru, BST1 ili BST1-srodni polipeptid se koristi kao "protein mamac" u dvo-hibridnom testu ili tro-hibridnom testu za identifikaciju drugih proteina koji se vezuju ili sadejstvuju sa BST1 ili BST1-srodnim polipeptidom (vidi npr. US patent br. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924; Ivvabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; i PCT objavu br. WO 94/10300). Kao što će shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, verovatno je da će takvi vezujući proteini biti uključeni u prenošenje signala pomoću BST1, na primer, kao uzvodni ili nizvodni elementi puta signalizacije u koji je uključen BST1.
[0251]Ovim pronalaskom su dalje realizovani novi agensi koji su identifikovani sa gore opisanim skrining testovima i njihove primene za lečenje koje su ovde opisane. Pored toga, pronalazak se takođe odnosi na primenu agensa koji sadejstvuje sa, ili moduliše aktivnost BST1 u proizvodnji leka za lečenje bolesti prema pronalasku.
Terapeutska primena BST1
[0252]Pronalazak se odnosi i na lečenje ili prevenciju različitih bolesti i poremećaja administracijom antitela, njegovog funkcionalnog fragmenta ili mimetika antitela koji se vezuje za BST1. Druga otkrivena terapeutska jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničena na: BST1, BST1 analoge, BST1-srodne polipeptide i njihove derivate (uključujući fragmente); ili druge afinitetne reagense za napred navedene; nukleinske kiseline koje kodiraju BST1, BST1 analoge, BST1-srodne polipeptide i njihove fragmente; antisensne nukleinske kiseline za gen koji kodira BST1 ili BST1 -srodni polipeptid; i modulator (npr. agoniste i antagoniste) gena koji kodira BST1 ili BST1-srodni polipeptid. Važna karakteristika prema pronalasku je identifikacija gena koji kodiraju jonsku varijantu BST1 koja je uključena u kancere, kao što su bolesti prema pronalasku. Bolesti prema pronalasku se mogu, na primer, lečiti (npr. da bi se ublažili simptomi ili odložila pojava ili progresija) ili sprečiti administracijom terapeutskog jedinjenja koje smanjuje funkciju ili ekspresiju BST1 u serumu ili tkivu subjekata koji imaju bolesti prema pronalasku.
[0253]U jednom primeru izvođenja, jedno ili više antitela (ili drugih afinitetnih reagenasa), od kojih se svako specifično vezuje za BST1, se daju sama ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih jedinjenja ili lečenja.
[0254]Biološki proizvod kao što je antitelo (ili drugi afinitetni reagens) je alogen za subjekta kome se daje. U jednom primeru izvođenja, antitelo (ili drugi afinitetni reagens) za humani BST1 ili humani BST1 -srodni polipeptid, se daje humanom subjektu za terapiju (npr. da bi se ublažili simptomi ili odložila pojava ili progresija) ili profilaksu.
[0255]Bez vezivanja za neku teoriju, smatra se da se terapeutska aktivnost antitela (ili drugih afinitetnih reagenasa) koja se specifično vezuju za BST1 može ostvariti zahvaljujući fenomenu ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (vidi npr. Janeway Jr. CA. et al., lmmunobiology, 5. izd., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., lmmunology, Infection, and lmmunity, 2004, str.246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532: str.2153-68 i Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncologv, 2003, 21: str. 3940-3947).
[0256]Lečenje i prevencija bolesti prema pronalasku
[0257]Bolesti prema pronalasku, na primer, se leče ili sprečavaju administracijom subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima bolesti prema pronalasku ili da je pod rizikom da razvije bolesti prema pronalasku jedinjenja koje moduliše (tj. povećava ili smanjuje) nivo ili aktivnost (tj. funkciju) BST1 koja je diferencijalno prisutna u serumu ili tkivu subjekata koji imaju bolesti prema pronalasku u poređenju sa serumom ili tkivom subjekata koji nemaju bolesti prema pronalasku. U jednom primeru, bolesti prema pronalasku se leče ili sprečavaju davanjem subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima bolesti prema pronalasku ili da je pod rizikom da razvije bolesti prema pronalasku jedinjenja koje podiže (tj. povećava) nivo ili aktivnost (tj. funkciju) BST1 koje su smanjene u serumu ili tkivu subjekata koji imaju bolesti prema pronalasku. Primeri takvog jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, BST1 antisensne oligonukleotide, ribozime, antitela (ili druge afinitetne reagense) usmerene protiv BST1, i jedinjenja koja inhibiraju enzimsku aktivnost BST1. Druga korisna jedinjenja npr. BST1 antagonisti i mali molekuli antagonisti BST1, se mogu identifikovati korišćenjemin vitrotestova.
[0258]Kancer npr. bolesti prema pronalasku se takođe leči ili sprečava administracijom subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima takav kancer, ili da je pod rizikom da razvije takav kancer, jedinjenja koje smanjuje nivo ili aktivnost (tj. funkciju) BST1 koja je povećana u serumu ili tkivu subjekata koji imaju takav kancer. Primeri takvog jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na: BST1, BST1 fragmente i BST1-srodne polipeptide; nukleinske kiseline koje kodiraju BST1, BST1 fragment i BST1-srodni polipeptid (npr. za primenu u genskoj terapiji); i, za one BST1 ili BST1-srodne polipeptide sa enzimskom aktivnosti, jedinjenja ili molekula za koje je poznato da modulišu tu enzimsku aktivnost. Druga jedinjenja koja se mogu primeniti, npr. BST1 agonisti, se mogu identifikovati korišćenjemin vitrotestova.
[0259]U sledećem primeru, terapija ili profilaksa se prilagođavaju potrebama individualnog subjekta. Shodno tome, u specifičnim primerima, jedinjenja koja povećavaju nivo ili funkciju BST1 se terapeutski ili profilaktički daju subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima kancer npr. bolesti prema pronalasku, kod koga su nivoi ili funkcije BST1 odsutni ili smanjeni u odnosu na kontrolni ili normalni referentni opseg. U narednim primerima, jedinjenja koja povećavaju nivo ili funkciju BST1 se terapeutski ili profilaktički daju subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima kancer npr. bolesti prema pronalasku, kod koga su nivoi ili funkcije BST1 povećani u odnosu na kontrolni ili referentni opseg. U narednim primerima, jedinjenja koja smanjuju nivo ili funkciju BST1 se daju terapeutski ili profilaktički subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima kancer npr. bolesti prema pronalasku, kod koga su nivoi ili funkcije BST1 smanjeni u odnosu na kontrolni ili referentni opseg. U narednim primerima, jedinjenja koja smanjuju nivo ili funkciju BST1 se daju terapeutski ili profilaktički subjektu za koga se sumnja da ima ili za koga je poznato da ima kancer npr. bolesti prema pronalasku, kod koga su nivoi ili funkcije BST1 smanjeni u odnosu na kontrolni ili referentni opseg. Promena BST1 funkcije ili nivoa zbog administracija takvih jedinjenja se može lako detektovati, npr. uzimanjem uzorka (npr. krvi ili urina) i testiranjemin vitronivoa ili aktivnosti BST1, ili nivoa mRNKs koje kodiraju BST1, ili bilo koje kombinacije napred navedenih. Takvi testovi se mogu izvesti pre i posle administracije ovde opisanog jedinjenja.
[0260]Jedinjenja prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničena na bilo koje jedinjenje, npr. mali organski molekul, protein, peptid, antitelo (ili drugi afinitetni reagens), nukleinsku kiselinu, itd. koja ponovo vraća BST1 profil prema normalnom. Jedinjenja prema pronalasku se mogu davati u kombinaciji sa bilo kojim drugim hemoterapeutskim lekovima.
Terapija vakcinama
[0261]Ovde je takođe opisana imunogena kompozicija, a prvenstveno kompozicija vakcine, koja sadrži BST1 ili njegov fragment koji sadrži epitop, ili nukleinsku kiselinu koja kodira BST1 ili njen fragment, opciono zajedno sa imunostimulansom.
[0262]Ovde je takođe realizovan postupak za povećanje imune reakcije koji sadrži davanje subjektu takvih kompozicija i postupak lečenja ili prevencije kancera npr. bolesti prema pronalasku, koji sadrži davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine takvih kompozicija i takve kompozicije za primenu u prevenciji ili lečenju bolesti prema pronalasku.
[0263]Shodno tome, BST1 može biti koristan kao antigeni materijal, i može se primeniti u proizvodnji vakcina za lečenje ili profilaksu kancera, npr. bolesti prema pronalasku. Takav materijal može biti "antigeni" i/ili "imunogeni". Generalno se smatra da "antigeni" znači da protein može da se upotrebi za stvaranje/podizanje antitela (ili drugih afinitetnih reagenasa) ili da je zaista sposoban da indukuje reakciju antitela kod subjekta ili eksperimentalne životinje. "Imunogeni" znači da protein može da pobudi imunu reakciju kao što je zaštitna imuna reakcija kod subjekta ili eksperimentalne životinje. Shodno tome, u zadnje pomenutom slučaju, protein ne samo da može generisati reakciju antitela, već takođe i imune reakcije koje nisu bazirane na antitelima. "Imunogeni" takođe obuhvata to da protein može pobuditi reakcije nalik imunim u in-vitro uslovima npr. testu proliferacije T-ćelija. Generisanje odgovarajuće imune reakcije može zahtevati prisustvo jednog ili više adjuvanasa i/ili odgovarajuću prezentaciju antigena.
[0264]Stručnjak će shvatiti da će homolozi ili derivati BST1 takođe naći primenu kao antigeni/imunogeni materijal. Shodno tome, na primer, proteini koji sadrže jednu ili više adicija, delecija, supstitucija ili slično su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
[0265]Pored toga, može biti moguće da se jedna aminokiselina zameni sa drugom sličnog "tipa", na primer, zamenom jedne hidrofobne aminokiseline sa drugom. Za upoređivanje sekvenci aminokiselina se može primeniti program kao što je CLUSTAL program. Ovaj program upoređuje sekvence aminokiselina i nalazi optimalno poravnanje insertovanjem praznina u bilo koju od sekvenci tamo gde je podesno. Moguće je izračunati identičnost ili sličnost aminokiselina (identitet plus konzervacija tipa aminokiseline) radi optimalnog poravnanja. Program kao što je BLASTx će poravnati najduži niz sličnih sekvenci i dodeliti vrenost radi fitovanja. Shodno tome, moguće je dobiti poređenje tamo gde se pronađe nekoliko regiona sličnosti, od kojih svaki ima različit skor. Oba tipa analize su razmotrena u aktuelnom otkrivanju.
[0266]U slučaju homologa i derivata, stepen identičnosti sa proteinom kao što je ovde opisano je manje važan od toga da homolog ili derivat treba da zadrži svoju antigenost i/ili imunogenost. Međutim, podesno je da budu realizovani homolozi ili derivati koji imaju najmanje 60% sličnosti (kao što je razmotreno gore) sa ovde opisanim proteinima ili polipeptidima, na primer, kao što su homolozi ili derivati koji imaju najmanje 70% sličnosti, kao što je najmanje 80% sličnosti. Naročito su realizovani , homolozi ili derivati koji imaju najmanje 90% ili čak 95% sličnosti. Podesno je da homolozi ili derivati imaju najmanje 60% identičnosti sekvence sa ovde opisanim proteinima ili polipeptidima. Naročito homolozi ili derivati imaju najmanje 70% identičnosti, još poželjnije najmanje 80% identičnosti. Najpoželjnije je da homolozi ili derivati imaju najmanje 90% ili čak 95% identičnosti.
[0267]U jednom alternativnom pristupu, homolozi ili derivati bi mogli biti fuzioni proteins, koji sadrže grupe koje čine prečišćavanje lakšim, na primer, efektivnim obeležavanjem željenog proteina ili polipeptida. Može biti neophodno da se ukloni taj "tag" (marker) ili može biti slučaj da sam fuzioni protein zadrži dovoljnu antigenost da bi bio koristan.
[0268]Dobro je poznato da je moguće izvršiti skrining antigenog proteina ili polipeptida da bi se identifikovan epitopski regioni, tj. oni regioni koji su odgovorni za antigenost ili imunogenost proteina ili polipeptida. Mogu se primeniti metode koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti za testiranje fragmenata i/ili homologa i/ili derivata u pogledu njihove antigenosti. Shodno tome, fragmenti prema pronalasku bi trebali da sadrže jedan ili više takvih epitopskih regiona ili da budu dovoljno slični takvim regionima da bi zadržali svoja antigena/imunogena svojstva. Shodno tome, za fragmente prema pronalasku je stepen identičnosti možda irelevantan, pošto oni mogu biti 100% identični sa posebnim delom proteina ili polipeptida, homologa ili derivata koji su ovde opisani. Još jednom, ključna stvar je da fragment zadrži antigena/imunogena svojstva proteina od koga potiče.
[0269]Ono što je važno za homologe, derivate i fragmente je da oni poseduju bar stepen antigenosti/imunogenosti proteina ili polipeptida od koga potiču. Shodno tome, u jednom dodatnom aspektu pronalaska su realizovani antigeni/ili imunogeni fragmenti BST1, ili njihovi homolozi ili derivati.
[0270]BST1, ili njegovi antigeni fragmenti se mogu realizovati sami, kao prečišćeni ili izolovani preparat. Oni mogu predstavljati deo smeše sa jednim ili više drugih proteina prema pronalasku, ili njihovih antigenih fragmenata. U sledećem otkrivanju je realizovana antigena kompozicija koja sadrži BST1 i/ili jedan ili više njegovih antigenih fragmenata. Takva kompozicija se može upotrebiti za detekciju i/ili dijagnozu kancera, npr. bolesti prema pronalasku.
[0271]Kompozicije vakcina prema pronalasku mogu biti kompozicije profilaktičke ili terapeutske vakcine.
[0272]Kompozicije vakcina prema pronalasku mogu sadržati jedan ili više adjuvanasa (imunostimulanasa). Primeri koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti obuhvataju neorganske gelove, kao što je aluminijum hidroksid, i emulzije voda-u-ulju, kao što je nekompletni Frojndov adjuvans. Drugi korisni adjuvansi su dobro poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.
[0273]Podesni adjuvansi za primenu u kompozicijama vakcina za lečenje kancera obuhvataju: 3De-0-acilovani monofosforil lipid A (koji je poznat kao 3D-MPL ili jednostavno MPL, vidi VV092/116556), saponin, na primer, QS21 ili QS7, i TLR4 agoniste, kao što su oni koji sadrže CpG molekul, na primer, kao što je opisano u VVO95/26204. Upotrebljeni adjuvansi mogu biti kombinacija komponenata, na primer, MPL i QS21 ili MPL, QS21 i koje sadrže CpG grupu. Adjuvansi mogu biti formulisani kao emulzije ulje-u-vodi ili lipozomske formulacije. Takvi preparati mogu sadržati druge nosače.
[0274]U sledećem primeru, preparati oligonukleotida koji sadrže 10 ili više uzastopnih nukleotida komplementarnih nukleotidnoj sekvenci koja kodira BST1 ili BST1 peptidne fragmente se primenjuju kao vakcine za lečenje kancera, npr. bolesti prema pronalasku. Takvi preparati mogu sadržati adjuvanse ili druge nosače.
[0275]Inhibicija BST1 za lečenje bolesti prema pronalasku
[0276]U jednom primeru, kancer, npr. bolesti prema pronalasku se leče ili sprečavaju administracijom jedinjenja koje antagonizuje (inhibira) nivo i/ili funkciju BST1 koji su povišeni u serumu ili tkivu subjekata koji imaju takav kancer u poređenju sa serumom ili tkivom subjekata koji nemaju takav kancer.
[0277]Jedinjenja koja su korisna za ove svrhe obuhvataju, ali nisu ograničena na anti-BST1 antitela (ili druge afinitetne reagense, i fragmente i derivate koji sadrže njihov region vezivanja), BST1 antisensne ili ribozimske nukleinske kiseline, i nukleinske kiseline koja kodiraju disfunkcionalni BST1, koje se mogu upotrebiti za "knockout", tj. onesposobljavanje endogene BST1 funkcije homologom rekombinacijom (vidi npr. Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Druga jedinjenja koja inhibiraju BST1 funkciju se mogu identifikovati primenom bilo kog od poznatihin vitrotestova, npr. testova sposobnosti testiranog jedinjenja da inhibira vezivanje BST1 za drugi protein ili partner za vezivanje, ili da inhibira poznatu BST1 funkciju.
[0278]Takva inhibicija se može testirati, na primer,in vitro iliu ćelijskoj kulturi, ali se takođe mogu upotrebiti i genetski testovi. Podesne tehnologije se takođe mogu upotrebiti za detekciju nivoa BST1 pre i posle administracije jedinjenja. Podesniin vitro ili in vivotestovi se koriste za određivanje efekta specifičnog jedinjenja i da li je njegova administracija indikovana za lečenje pogođenog tkiva, kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0279]U specifičnom primeru, jedinjenje koje inhibira BST1 funkciju (aktivnost) se daje terapeutski ili profilaktički subjektu kod koga je detektovan povećani nivo u serumu ili tkivu ili funkcionalna aktivnost BST1 (npr. veća od normalnog nivoa ili poželjnog nivoa) u poređenju sa serumom ili tkivom subjekata npr. sa bolesti prema pronalasku koji ne dobija lečenje prema pronalasku ili za dovođenje do nivoa ili aktivnosti koji su utvrđeni kod subjekata koji nemaju takav kancer, ili u unapred određeni referentni opseg. Za merenje povećanja BST1 nivoa ili funkcije se mogu upotrebiti standardne metode iz odgovarajuće oblasti, kao što je gore opisano. Podesne BST1 inhibitorske kompozicije mogu sadržati, na primer, male molekule, tj. molekule od 1000 daltona ili manje. Takvi mali molekuli se mogu identifikovati ovde opisanim metodama skrininga.
Testovi za terapeutska ili profilaktička jedinjenja
[0280]Predmetni pronalazak se takođe odnosi na testove za primenu u otkrivanju lekova da bi se identifikovala ili verifikovala efikasnost jedinjenja za lečenje ili prevenciju kancera koji izražavaju ekstracelularni domen BST1, npr. bolesti prema pronalasku.
[0281]Shodno tome, opisan je postupak za skrining jedinjenja koja modulišu aktivnost BST1, pri čemu postupak sadrži: (a) dovođenje u kontakt BST1 ili njegovog biološki aktivnog dela sa jedinjenjem kandidatom; i (b) određivanje da li je time modulisana aktivnost BST1. Takav proces može sadržati (a) dovođenje u kontakt BST1 ili njegovog biološki aktivnog dela sa jedinjenjem kandidatom u uzorku; i (b) upoređivanje aktivnosti BST1 ili njegovog biološki aktivnog dela u pomenutom uzorku posle kontakta sa pomenutim jedinjenjem kandidatom sa aktivnosti BST1 ili njegovog biološki aktivnog dela u pomenutom uzorku pre dovođenja u kontakt sa pomenutim jedinjenjem kandidatom, ili sa referentnim nivoom aktivnosti.
[0282]Postupak skrininga može biti postupak skrininga jedinjenja koja inhibiraju aktivnost BST1.
[0283]BST1 ili njegov biološki aktivni deo, na primer, mogu biti izraženi na ćeliji ili pomoću ćelije. BST1 ili njegov biološki aktivni deo mogu biti izolovani, na primer, iz ćelija koje ih izražavaju. BST1 ili njegov biološki aktivni deo mogu biti imobilizovani, na primer, na čvrstoj fazi.
[0284]Takođe je opisan postupak skrininga jedinjenja koja modulišu ekspresiju BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1, pri čemu taj postupak sadrži: (a) dovođenje u kontakt ćelija koje izražavaju BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1 sa jedinjenjem kandidatom; i (b) određivanje da li se ekspresija BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1 time moduliše. Takav proces može sadržati (a) dovođenje u kontakt ćelija koje izražavaju BST1 ili nukleinsku kiselinu koja kodira BST1 sa jedinjenjem kandidatom u uzorku; i (b) upoređivanje ekspresije BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1 sa ćelijama u pomenutom uzorku posle kontakta sa pomenutim jedinjenjem kandidatom sa ekspresijom BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1 u ćelijama u pomenutom uzorku pre dovođenja u kontakt sa pomenutim jedinjenjem kandidatom, ili sa referentnim nivoom ekspresije.
[0285]Postupak može biti postupak za skrining jedinjenja koja inhibiraju ekspresiju BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1.
[0286]Ovde su takođe opisani: jedinjenje koje se može dobiti gore navedenim metodom za skrining, jedinjenje koje moduliše aktivnost ili ekspresiju BST1 ili nukleinska kiselina koja kodira BST1, na primer, jedinjenje koje inhibira aktivnost ili ekspresiju BST1 ili nukleinske kiseline koja kodira BST1.
[0287]Takvo jedinjenje je opisano za primenu u lečenju ili prevenciji kancera, npr. bolesti prema pronalasku. Takođe je opisan postupak lečenja ili prevencije kancera, npr. bolesti prema pronalasku koji sadrži davanje subjektu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine takvog jedinjenja.
[0288]Testirana jedinjenja se mogu testirati u pogledu svog svojstva da ponovo vrate BST1 nivoe kod subjekta koji ima npr. bolesti prema pronalasku prema nivoima koje imaju subjekti koji nemaju takve kancere ili dovode do sličnih promena u modelima sa eksperimentalnim životinjama sa takvim kancerima. Jedinjenja koja mogu da ponovo vrate BST1 nivoe kod subjekta koji ima npr. bolesti prema pronalasku prema nivoima koje imaju subjekti koji nemaju takve kancere ili dovode do sličnih promena u modelima sa eksperimentalnim životinjama sa takvim kancerima mogu se primeniti kao vodeća jedinjenja za dalji razvoj lekova, ili se mogu primeniti terapeutski. BST1 ekspresija se može testirati pomoću poželjnih tehnologija, imunotestova, gel elektroforeze praćene vizualizacijom, detekcije BST1 aktivnosti, ili bilo kog drugog postupka koji je ovde opisan ili koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Takvi testovi se mogu upotrebiti za skrining lekova kandidata, u kliničkom praćenju ili u razvoju lekova, gde količina BST1 može služiti kao surogat marker za kliničku bolest.
[0289]U različitim specifičnim primerima se mogu izvestiin vitrotestovi sa ćelijama koje predstavljaju tipove ćelija koje su uključene u poremećaj kod subjekta da bi se odredilo da li jedinjenje ima željeni efekat na takve tipove ćelija.
[0290]Jedinjenja za primenu u terapiji se mogu testirati u podesnim sistemima sa životinjskim modelima pre testiranja na ljudima, uključujući, ali bez ograničavanja na pacove, miševe, piliće, krave, majmune, zečeve, itd. Za testiranjein vivo,pre administracije ljudima se može upotrebiti bilo koji sistem sa životinjskim modelom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti. Primeri životinjskih modela bolesti prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na ksenografte ćelijskih linija kancera dojke, kao što su MCF-7 (Ozzello L, Sordat M., Eur J Cancer. 1980;16:553-559) i MCF10AT (Miller et al., J Natl Cancer Inst. 1993;85:1725-1732) kod golih ili SCID miševa; ksenografte humanih ćelijskih linija kolorektalnog kancera, kao što je MDA-MB-345 kod SCID miševa lišenih estrogena, Eccles et al. 1994 Cell Biophvsics 24/25, 279; ksenografte ćelijskih linija kancera bubrega, kao što su CAKI-1 (Matthevvs PN, Grant AG, Hermon-Tavlor J. Br J Cancer. 1984 februar; 49(2): 193-198), 786-0 (G. J. STREVVLER et al Endocrinologv tom 119, br. 1 303-310) i ACHN (Zeng J, Mei W, Huang H, Li X, Kong P.; J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2002;22(4):331-3) kod golih miševa; ksenografte ćelijskih linija kancera ne-malih ćelija pluća, kao što su A549 i H460 i ksenografte ćelijskih linija kancera malih ćelija pluća, kao što je NCI-H345 ili ksenografte ćelijskih linija kancera pankreasa, kao što je MIA PaCa-2 kod golih miševa, Marincola et al., J Surg Res 1989 dec;47(6):520-9. Oni se mogu koristiti za testirana jedinjenja koja modulišu BST1 nivoe, pošto je patologija koja se ispoljava u ovim modelima slična onoj npr. kod bolesti prema pronalasku. Stručnjaku iz odgovarajuće oblasti je takođe očigledno da se na osnovu aktuelnog otkrivanja mogu proizvesti transgenske životinje sa "knock-out" mutacijama jednog ili više gena koji kodiraju BST1. "Knock-out" mutacija gena je mutacija koja izaziva da mutirani gen ne bude izražen, ili da bude izražen u nenormalnom obliku ili na niskom nivou, tako da aktivnost povezana sa genskim proizvodom bude skoro ili potpuno odsutna. Prvenstveno je transgenska životinja sisar; još poželjnije, transgenska životinja je miš.
[0291]U jednom primeru, testirana jedinjenja koja modulišu ekspresiju BST1 su identifikovana kod nehumanih životinja (npr. miševa, pacova, majmuna, zečeva i zamorčića), a prvenstveno nehumanih životinjskih modela za bolesti prema pronalasku izražavaju BST1. U skladu sa ovim primerom, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daju životinjama, i onda se određuje efekat testiranog jedinjenja na ekspresiju BST1. Testirano jedinjenje koje menja ekspresiju BST1 se može identifikovati upoređivanjem nivoa BST1 (ili mRNK koja kodira isti) kod životinje ili grupe životinja tretiranih sa testiranim jedinjenjem sa nivoom BST1 ili mRNK kod životinje ili grupe životinja tretiranih sa kontrolnim jedinjenjem. Tehnike koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu primeniti za određivanje mRNK i nivoa proteina, kao što je, na primer,in situhibridizacija. Životinje mogu ili ne moraju biti usmrćene da bi se odredili efekti testiranog jedinjenja.
[0292]U sledećem primeru, testirana jedinjenja koja modulišu aktivnost BST1 ili njegovog biološki aktivnog dela se identifikuju kod nehumanih životinja (npr. miševa, pacova, majmuna, zečeva i zamorčića), a prvenstveno nehumanih životinjskih modela za bolesti prema pronalasku za izražavanje BST1. U skladu sa ovim primerom, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daje životinjama, i onda se određuje efekat testiranog jedinjenja na aktivnost BST1. Testirano jedinjenje koje menja aktivnost BST1 se može identifikovati testiranjem životinja tretiranih sa kontrolnim jedinjenjem i životinja tretiranih sa testiranim jedinjenjem. Aktivnost BST1 se može odrediti detekcijom indukcije ćelijskog drugog mesendžera BST1 (npr. intracelularnog Ca2<+>, diacilglicerola, IP3, itd.), detekcijom katalitičke ili enzimske aktivnosti BST1 ili njegovog partnera za vezivanje, detekcijom indukcije reporter gena (npr. regulatornog elementa koji reaguje na BST1 operativno povezanog sa nukleinskom kiselinom koja kodira detektabilni marker, kao što je luciferaza ili zeleni fluorescentni protein), ili detekcijom ćelijske reakcije (npr. ćelijske diferencijacije ili ćelijske proliferacije). Tehnike koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu upotrebiti za detekciju promena aktivnosti BST1 (vidi npr. US patent br. 5,401,639).
[0293]U jednom drugom primeru, testirana jedinjenja koja modulišu nivo ili ekspresiju BST1 se identifikuju kod humanih subjekata koji imaju npr. bolesti prema pronalasku, a prvenstveno kod onih koji imaju npr. ozbiljne bolesti prema pronalasku. U skladu sa ovim primerom, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daju humanom subjektu, i onda se određuje efekat testiranog jedinjenja na BST1 ekspresiju analizom ekspresije BST1 ili mRNK koja kodira isti u biološkom uzorku (npr. serumu, plazmi, ili urinu). Testirano jedinjenje koje menja ekspresiju BST1 se može identifikovati poređenjem nivoa BST1 ili mRNK koja kodira isti kod subjekta ili grupe subjekata tretiranih kontrolnim jedinjenjem sa onima kod subjekta ili grupe subjekata tretiranih testiranim jedinjenjem. Alternativno tome, promene ekspresije BST1 se mogu identifikovati poređenjem nivoa BST1 ili mRNK koja kodira isti kod subjekta ili grupe subjekata pre i posle administracije testiranog jedinjenja. Tehnike koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu upotrebiti za dobijanje biološkog uzorka i analizu mRNK ili ekspresije proteina. Na primer, ovde opisane poželjne tehnologije se mogu upotrebiti za određivanje promena u nivou BST1.
[0294]U sledećem primeru, testirana jedinjenja koja modulišu aktivnost BST1 se identifikuju kod humanih subjekata koji imaju npr. bolesti prema pronalasku (a prvenstveno onih npr. sa ozbiljnom bolesti prema pronalasku). U ovom primeru, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daje humanom subjektu, i onda se određuje efekat testiranog jedinjenja na aktivnost BST1. Testirano jedinjenje koje menja aktivnost BST1 se može identifikovati upoređivanjem bioloških uzoraka subjekata tretiranih sa kontrolnim jedinjenjem sa uzorcima subjekata tretiranih sa testiranim jedinjenjem. Alternativno tome, promene u aktivnosti BST1 se mogu identifikovati upoređivanjem aktivnosti BST1 kod subjekta ili grupe subjekata pre i posle administracije testiranog jedinjenja. Aktivnost BST1 se može odrediti detekcijom u biološkom uzorku (npr. serumu, plazmi, ili urinu) indukcijom putanje celularne transdukcije signala BST1 (npr. intracelularnog Ca2<+>, diacilglicerola, IP3, itd.), katalitičke ili enzimske aktivnosti BST1 ili njegovog partnera za vezivanje, ili ćelijske reakcije, na primer, ćelijske diferencijacije, ili ćelijske proliferacije. Tehnike koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti se mogu upotrebiti za detekciju promena indukcije drugog mesendžera BST1 ili promena u ćelijskoj reakciji. Na primer, RT-PCR se može upotrebiti za detekciju promena indukcije celularnog drugog mesendžera.
[0295]U sledećem primeru, testirano jedinjenje koje menja nivo ili ekspresiju BST1 prema nivoima detektovanim kod kontrolnih subjekata (npr. ljudi koji nemaju npr. bolesti prema pronalasku) se bira za dalje testiranje ili terapeutsku upotrebu. U sledećem primeru, testirano jedinjenje koje menja aktivnost BST1 prema aktivnosti koju ima kod kontrolnih subjekata (npr. ljudi koji nemaju npr. bolesti prema pronalasku)) se bira za dalje testiranje ili terapeutsku upotrebu.
[0296]U sledećem primeru, testirana jedinjenja koja smanjuju ozbiljnost jednog ili više simptoma povezanih npr. sa bolesti prema pronalasku su identifikovana kod humanih subjekata koji imaju npr. bolesti prema pronalasku, a prvenstveno subjekata npr. sa ozbiljnom bolesti prema pronalasku. U skladu sa ovim primerom, testirano jedinjenje ili kontrolno jedinjenje se daje subjektima, i određuje se efekat testiranog jedinjenja na jedan ili više simptoma npr. bolesti prema pronalasku. Testirano jedinjenje koje smanjuje jedan ili više simptoma se može identifikovati poređenjem subjekata tretiranih kontrolnim jedinjenjem sa subjektima tretiranim testiranim jedinjenjem. Tehnike koje su poznate lekarima kojima su poznate npr. bolesti prema pronalasku se mogu upotrebiti za određivanje da li testirano jedinjenje smanjuje jedan ili više simptoma povezanih npr. sa bolesti prema pronalasku. Na primer, testirano jedinjenje koje smanjuje tumorsko opterećenje kod subjekta koji ima npr. bolesti prema pronalasku će biti korisno za takvog subjekta.
[0297]U sledećem primeru, testirano jedinjenje koje smanjuje ozbiljnost jednog ili više simptoma povezanih sa kancerom, npr. bolesti prema pronalasku kod čoveka koji ima jednu od bolesti prema pronalasku je izabrano za dalje testiranje ili terapeutsku upotrebu.
Terapeutske i profilaktičke kompozicije i njihova primena
[0298]Pronalaskom su realizovane metode lečenja (i profilakse) koje sadrže davanje subjektu efektivne količine jedinjenja prema pronalasku.
[0299]U posebnom primeru, jedinjenje se u suštini prečišćava (npr. u suštini ne sadrži supstance koje ograničavaju njegov efekat ili proizvode nepoželjna neželjena dejstva). Subjekt je, na primer, životinja, uključujući, ali bez ograničavanja na životinje kao što su krave, svinje, konji, pilići, mačke, psi, itd. i, na primer, je sisar, kao što je čovek. U specifičnom primeru, nehumani sisar je subjekt.
[0300]Formulacije i načini administracije koji se mogu primeniti kada jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu su opisani gore; dodatne podesne formulacije i načini administracije su opisani dole.
[0301]Poznati su različiti sistemi za davanje i oni se mogu koristiti za davanje jedinjenja prema pronalasku, npr. kapsuliranje u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje mogu da izražavaju jedinjenja, receptorima posredovana endocitoza (vidi npr. Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), konstrukcija nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Metode uvođenja mogu biti enteralne ili parenteralne i obuhvataju, ali nisu ograničene na intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralni, i oralni način primene. Jedinjenja se mogu davati bilo kojim podesnim putem, na primer, infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelni ili mukokutani omotač (npr. oralnu mukozu, rektalnu i intestinalnu mukozu, itd.) i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Administracija može biti sistemska ili lokalna. Pored toga, može biti poželjno da se farmaceutske kompozicije prema pronalasku uvedu u centralni nervni sistem bilo kojim podesnim putem, uključujući intraventrikularnu i intratekalnu injekciju; intraventrikularna injekcija može biti olakšana intraventrikularnim kateterom, na primer, pričvršćenim za rezervoar, kao što je Ommava rezervoar. Pulmonarna administracija se takođe može primeniti, npr. korišćenjem inhalatora ili nebulizatora, i formulacije sa agensom za formiranje aerosola.
[0302]U jednom primeru se nukleinska kiselina upotrebljena u pronalasku može davati u dermis, na primer, korišćenjem epidermalnog davanja posredstvom čestica.
[0303]U specifičnom primeru izvođenja, može biti poželjno da se farmaceutske kompozicije prema pronalasku daju lokalno u oblast gde je potrebno lečenje; ovo se može ostvariti, na primer, i ne kao ograničavajuće, lokalnom infuzijom tokom hirurške intervencije, topičkom aplikacijom, npr. injekcijom, pomoću katetera, ili pomoću implantata, pri čemu je pomenuti implantat porozni, neporozni, ili želatinozni materijal, uključujući membrane, kao što su sijalastične membrane, ili vlakna. U jednom primeru izvođenja, administracija može biti pomoću direktne injekcije npr. u mijeloidno tkivo, tkivo dojke, kolorektalno, bubrežno, plućno ili pankreasno tkivo ili na mestu (ili ranijem mestu) malignog tumora ili neoplastičnog ili pre-neoplastičnog tkiva.
[0304]U sledećem primeru izvođenja, jedinjenje se može davati u vezikuli, a naročito u lipozomu (vidi Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., u Liposomes in the Therapv of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein i Fidler (uredn.), Liss, New York, str. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., str. 317-327; vidi generalnoibid.)
[0305]U još jednom drugom primeru izvođenja, jedinjenje se može davati u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom primeru izvođenja se može upotrebiti pumpa (vidi Langer,supra;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchvvald et al., 1980, Surgerv 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U sledećem primeru izvođenja se mogu upotrebiti polimerni materijali (vidi Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (uredn.), CRC Pres., Boca Raton, Florida
(1974); Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Smolen i Bali (uredn.), Wiley, New York (1984); Ranger i Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; vidi also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Hovvard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). U još jednom drugom primeru izvođenja, sistem za kontrolisano oslobađanje se može postaviti u blizinu terapeutskog cilja, npr. mokraćne bešike, dojke, kolona, glave i vrata, bubrega, jetre, pluća, jajnika, pankreasa, kože ili štitne žlezde, zbog čega je onda potreban samo deo sistemske doze (vidi npr. Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, supra, tom 2, str. 115-138
(1984)). Drugi sistemi za kontrolisano oslobađanje su razmotreni u pregledu koji je dao Langer (1990, Science 249:1527-1533).
[0306]U specifičnom primeru gde je jedinjenje nukleinska kiselina koja kodira protein, nukleinska kiselina se može davatiin vivoda bi se stimulisala ekspresija njenog kodiranog proteina, njenim konstruisanjem kao dela odgovarajućeg vektora ekspresije nukleinske kiseline i njegovim davanjem tako da postane intracelularan, npr. korišćenjem retrovirusnog vektora (vidi US patent br. 4,980,286), ili direktnom injekcijom, ili korišćenjem bombardovanja mikročesticama (npr. genski pištolj; Biolistic, Dupont), ili oblaganjem sa lipidima ili receptorima na ćelijskoj površini ili transfektujućim agensima, ili njenim davanjem povezane sa peptidom u vidu homeokutije za koju je poznato da ulazi u nukleus (vidi npr. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), itd. Alternativno tome, nukleinska kiselina se može uvesti intracelularno i inkorporirati u DNK ćelije domaćina radi ekspresije homologom rekombinacijom.
[0307]Predmetnim pronalaskom su takođe realizovane farmaceutske kompozicije. Takve kompozicije sadrže terapeutski efektivnu količinu jedinjenja, i farmaceutski prihvatljivi nosač. U specifičnom primeru, izraz "farmaceutski prihvatljiv" znači podesan na osnovu odobrenja regulatorne agencije federalne ili državne vlade ili naveden u US farmakopeji ili drugoj generalno priznatoj farmakopeji za primenu kod životinja, a naročito kod ljudi. Izraz "nosač" se odnosi na razređivač, adjuvans, ekscipijens, ili inertnu materiju sa kojom se može terapeutski davati. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je poželjni nosač kada se farmaceutska kompozicija daje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se takođe mogu upotrebiti kao tečni nosači, a naročito za injektabilne rastvore. Podesni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju škrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ako je poželjno, takođe može sadržati male količine agenasa za vlaženje ili emulgovanje, ili pH puferske agense. Ove kompozicije mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim dejstvom i slično. Kompozicija može biti formulisana kao supozitorija, sa uobičajenim vezivima i nosačima, kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može sadržati standardne nosače, kao što su manitol, laktoza, škrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd. farmaceutskog kvaliteta. Primeri podesnih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" autora E.W. Martin. Takve kompozicije će sadržati terapeutski efektivnu količinu jedinjenja, na primer, u prečišćenom obliku, zajedno sa podesnom količinom nosača, tako da se realizuje oblik koji je podesan za administraciju subjektu. Formulacija bi trebalo da odgovara načinu administracije.
[0308]U jednom primeru izvođenja, na primer, gde se koristi jedno ili više antitela, kompozicija se formuliše u skladu sa rutinskim procedurama za farmaceutske kompozicije prilagođene za intravensku administraciju ljudskim bićima. Obično su kompozicije za intravensku administraciju rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je neophodno, kompozicija može sadržati agens za poboljšanje rastvaranja i lokalni anestetik, kao što je lidokain, radi ublaživanja bola na mestu injekcije. Generalno se sastojci dopremaju bilo odvojeno ili se mešaju zajedno u pojedinačni farmaceutski oblik, na primer, kao što je suvi liofilizovani prašak ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili kesica sa naznačenom količinom aktivnog agensa. Kada kompozicija treba da se daje infuzijom, onda se ona može davati pomoću boce za infuziju koja sadrži sterilnu vodu farmaceutskog kvaliteta ili slani rastvor. Kada se kompozicija daje injekcijom, onda može biti pripremljena ampula sterilne vode za injekciju ili slanog rastvora, tako da se sastojci mogu pomešati pre administracije.
[0309]Jedinjenja prema pronalasku se mogu formulisati u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli, kada je podesno, obuhvataju one koje su formirane sa slobodnim amino grupama, kao što su one dobijene od hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one koje su formirane sa slobodnim karboksilnim grupama, kao što su one dobijene od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.
[0310]Količina jedinjenja prema pronalasku koja će biti efektivna u lečenju kancera, na primer, bolesti prema pronalasku se može odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga se mogu opciono primenitiin vitrotestovi za identifikaciju optimalnih opsega doza. Precizna doza koja će biti primenjena u formulaciji takođe zavisi od načina administracije, i ozbiljnosti bolesti ili poremećaja, i treba da bude određena na osnovu rasuđivanja ordinirajućeg lekara i u zavisnosti od uslova svakog pacijenta. Međutim, podesni opsezi doza za intravensku administraciju su generalno oko 20-500 mikrograma aktivnog jedinjenja po kilogramu telesne težine. Podesni opsezi doza za intranazalnu administraciju su generalno od oko 0.01 pg/kg telesne težine do 1 mg/kg telesne težine. Efektivne doze se mogu ekstrapolirati na osnovu krivih doza-reakcija dobijenih pomoću sistema za testiranjein vitroili životinjskih modela.
[0311]Supozitorije generalno sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0.5% do 10% tež.; oralne formulacije prvenstveno sadrže od 10% do 95% aktivnog sastojka.
[0312]Pronalaskom je takođe realizovano farmaceutsko pakovanje ili kit koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih sa jednim ili više sastojaka farmaceutske kompozicije prema pronalasku. Opciono takvom kontejneru, odnosno kontejnerima može biti pridruženo uputstvo u obliku koji je propisan od strane vladine regulatorne agencije za proizvodnju, primenu ili prodaju farmaceutika ili bioloških produkata, pri čemu to uputstvo sadrži (a) odobrenje agencije za proizvodnju, primenu ili prodaju za humanu administraciju, (b) instrukcije za primenu, ili oba.
[0313]Shodno tome u jednom primeru kit sadrži antitela koja se primenjuju prema pronalasku, na primer, antitela mogu biti liofilizovana radi rekonstitucije pre administracije ili upotrebe. Kada je kit za primenu u terapiji/lečenju kancera, onda antitelo ili antitela mogu biti rekonstituisani sa izotoničnim vodenim rastvorom, koji opciono može biti obezbeđen zajedno sa kitom. U jednom primeru kit može sadržati polipeptid, kao što je imunogeni polipeptid prema pronalasku, koji može biti, na primer, liofilizovan. Zadnje pomenuti kit može dalje sadržati adjuvans za rekonstituisanje imunogenog polipeptida.
[0314]Pronalazak takođe obuhvata kompoziciju koja je ovde opisana, na primer, farmaceutsku kompoziciju i/ili kompoziciju vakcine za primenu u indukovanju imune reakcije kod subjekta.
Određivanje količine BST1 tehnologijom snimanja
[0315]Prednost određivanja količine BST1 tehnologijom snimanja može biti ta što je takav postupak neinvazivan (čini nepotrebnim davanje reagenasa) i nema potrebe da se iz subjekta ekstrahuje uzorak.
[0316]Podesne tehnologije snimanja obuhvataju pozitronsku emisionu tomografiju (PET) i pojedinačnu fotonsku emisionu kompjutersku tomografiju (SPECT). Vizualizacija BST1 uz korišćenje takvih tehnika zahteva inkorporaciju ili vezivanje podesnog markera npr. radiotrejsera, kao što su<18>F,<11>C ili<123>l (vidi npr. NeuroRx - The Journal of the American Societv for Experimental NeuroTherapeutics (2005) 2(2), 348-360 iidemstrane 361-371 za dalje detalje u vezi ovih tehnika). Radiotrejseri ili markeri mogu biti inkorporirani u BST1 administracijom subjektu (npr. injekcijom) podesno obeleženog specifičnog liganda. Alternativno tome, oni se mogu inkorporirati u vezujući afinitetni reagens (npr. antitelo) koji je specifičan za BST1, a koji se može dati subjektu (npr. injekcijom). Za diskusiju u vezi primene afitela za snimanje vidi npr. Orlova A, Magnusson M, Eriksson TL, Nilsson M, Larsson B, Hoiden-Guthenberg I, VVidstrom C, Carlsson J, Tolmachev V, Stahl S, Nilsson FY, Tumor imaging using a picomolar affinitv HER2 binding affibodv molecule, Cancer Res. 15 apr. 2006;66(8):4339-48).
Dijagnoza i lečenje kancera uključujući bolesti prema pronalasku korišćenjem imunohistohemije
[0317]Imunohistohemija je odlična tehnika detekcije i zato može biti veoma korisna u dijagnozi i lečenju kancera, uključujući bolesti prema pronalasku. Imunohistohemija se može koristiti za detekciju, dijagnozu ili praćenje kancera, kao što su oni koji su gore navedeni, putem lokalizacije BST1 antigena u sekcijama tkiva primenom obeleženih antitela (ili drugih afinitetnih reagenasa), njihovih derivata i analoga, koji se specifično vezuju za BST1, kao specifični reagensi putem interakcija antigen-antitelo koje se vizualizovane pomoću markera kao što su fluorescentna boja, enzim, radioaktivni element ili koloidno zlato.
[0318]Napredovanje tehnologije monoklonskih antitela ima veliki značaj za obezbeđivanje mesta imunohistohemije u modernoj pouzdanoj mikroskopskoj dijagnozi humanih neoplazmi. Identifikacija rasejanih neoplastično transformisanih ćelija imunohistohemijom omogućava jasniju sliku invazije i metastaza kancera, kao i evolucije imunofenotipa povezanog sa tumorskim ćelijama prema povećanom malignitetu. Budući antineoplastični terapeutski pristupi mogu obuhvatati raznovrsne individualizovane imunoterapije, specifične za posebni imunofenotipski obrazac povezan sa neoplastičnom bolesti svakog pojedinog pacijenta. Za dalju diskusiju vidi npr. Bodey B, The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms, Expert Opin Biol Ther. 2002 Apr; 2(4):371-93.
[0319]Poželjne karakteristike svakog aspekta pronalaska su za svaki od drugih aspekatamutatis mutandis.Pronalazak je ilustrovan pomoću sledećih neograničavajućih primera.
PRIMER 1: IDENTIFIKACIJA BST1 IZRAŽENOG U TKIVU KOD HRONIČNE LIMFOCITNE
LEUKEMIJE, KANCERA DOJKE, KOLOREKTALNOG KANCERA, KANCERA BUBREGA, KANCERA
PLUĆA I KANCERA PANKREASA KORIŠĆENJEM TEČNE HROMATOGRAFIJE- MASENE
SPEKTROMETRIJE ( LC/ MS)
[0320]Korišćenjem sledećeg referentnog protokola su bili digestirani membranski proteini ekstrahovani iz uzoraka tkiva kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera pluća i kancera pankreasa, a rezultujući peptidi su bili sekvencirani tandem masenom spektrometrijom.
1.1 MATERIJALI I METODE
1. 1. 1 Frakcionisanje ćelijskih membrana
[0321]Sve procedure su bile izvedene na 4°C. Ćelije uzete iz tkiva hronične limfocitne leukemije, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera pluća i kancera pankreasa su bile homogenizovane i podvrgnute centrifugiranju na 1000G. Bio je uzet supernatant, pa je centrifugiran na 49500G u ultracentrifugi. Zatim je uzeta rezultujuća peleta, te je stavljena na 1.4 M saharozno jastuče. Mikrozomi/ćelijska membrana su bili uzeti sa fazne granice, pa su repuferovani i zatim su ponovo podvrgnuti centrifugiranju na 49500G. Peleta (frakcija ćelijske membrane) je bila onda analizirana tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC/MS) (vidi odeljak 2.1.2 dole).
7. 1. 2 Metodologija za tečnu hromatografiju- masenu spektrometriju ( LC/ MS)
[0322]Uzorci frakcija ćelijskih membrana tkiva hronične limfocitne leukemije, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera pluća i kancera pankreasa suspendovanih u PBS su bili centrifugirani na 12-14°C tokom 45 min na maksimalnoj brzini od 21460G na vrhunskoj centrifugi. Supernatant je bio odstranjen, pa je količina supernatanta koja je bila potrebna da se dobije koncentracija od 4mg/ml bila dodata nazad peleti. Onda je bila dodata ekvivalentna količina 1% w/v SDS. Zatim su uzorci bili vrtloženi na sobnoj temperaturi i onda su centrifugirani na 21460G tokom 30 min na 12-15°C. Uzorak je bio izvađen, dok je peleta ostavljena. Zapremini svakog rastvora proteina koja je bila jednaka 50ug je bilo dodato 150ul 0.5M rastvora trietilamonijum bikarbonata (TEAB). Svakom uzorku je bilo dodato 3ul 50mM tris-(2-karboksietil)fosfina, pa je smeša bila inkubirana na 60°C tokom 1 h. Onda su bili dodati 1ul reagensa za blokiranje cisteina, 200mM metil metantiosulfonata (MMTS) u izopropanolu. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 10 min, svakom uzorku je bilo dodato 15ul 1ug/ul tripsina, što je bilo praćeno inkubacijom na 37°C preko noći. Digestirani uzorci su bili osušeni pod vakuumom, pa im je bilo dodato 40ul 0.1% vodene mravlje kiseline, što je bilo praćeno sa dovoljno trifluorosirćetne kiseline (TFA) da bi se smanjio pH rastvora na <3 pre jonoizmenjivačkog frakcionisanja.
1. 1. 3 Frakcionisanje i analiza obeleženih peptida
[0323]Uzorak je bio frakcionisan jakom katjonsko izmenjivačkom hromatografijom uz korišćenje Agilent 1200 hromatografa (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Uzorci su bili eluirani na Agilent Zorbax Bio-SCXII koloni (3.5um; 50 x 0.8mm) uz korišćenje 20ul/min gradijenta od 0-100mM natrijum acetata preko 20 min, a onda do 1M preko 10 min, pa su zatim držani na 1M tokom 25 min. Frakcije od 1 min su bile sakupljane preko 40 min. Svakoj frakciji je bilo dodato 2ul 1% TFA rastvora. Frakcije su onda bile čuvane na -80°C. Svaka frakcija je bila analizirana tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom uz korišćenje Ekigent Tempo hromatografa snabdevenog sa PepMap 100 C 18, 3um, 100A kolonom, 150mm x 75mm (LC Packings/Dionex) i QStar Elite quadrupole-time-of-flight instrumentom (Applied Biosystems/MDS Sciex). Peptidi su bili eluirani sa gradijentom od 300nl/min uz povećanje od 5% do 40% acetonitrila preko 60 min. Podaci su bili prikupljeni u auto MS/MS modu tako da su bila izabrana do 3 prekursorska jona iznad graničnog intenziteta i proizvod jonskih spektara je bio akumulisan da bi se olakšalo sekvenciranje peptida. Bila su izvršena tri prolaza, svaki u auto MS/MS modu sa drugim i trećim prolazom koji su takođe isključivali mase koje su već bile detektovane u prethodnom prolazu.
1. 1. 4 Analiza aminokiselinskih sekvenci obeleženog peptida
[0324]Sirovi podaci generisani iz QSTAR-a su bili obrađeni pomoću Protein Pilot softvera (Applied Biosvstems / MDS Analvtical Technologies) koji primenjuje Paragon™ algoritam da bi odredio aminokiselinske sekvence na osnovu liste pikova pretraživanjem baze podataka sekvenci koja se sastoji od IPI verzije 3.58 (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) i kontaminirajućih tripsinskih sekvenci. Kriterijumi za identifikaciju peptida su obuhvatali digestiju tripsina i različite biološke i hemijske modifikacije (oksidisani metionin, modifikacija cisteina pomoću MMTS ili jodoacetamida i fosforilacija serina, treonina i tirozina). Peptidi sa skorom poverenja od 60% ili većim su bili prerađeni u grupe proteina po kriterijumu da ako je samo jedan peptid iz grupe proteina bio identifikovan, onda skor mora biti 80% ili veći.1. 1. 5 Diskriminacija proteina povezanih sa hroničnom limfocitnom leukemijom, kancerom dojke,
kolorektalnim kancerom, kancerom bubrega, kancerom pluća, kancerom pankreasa
[0325]Proces za identifikaciju BST1 koristi peptidne sekvence dobijene eksperimentalno gore opisanom masenom spektrometrijom prirodnih humanih proteina da bi se identifikovali i organizovali kodirajući egzoni u publikovanoj sekvenci ljudskog genoma.
[0326]Ove eksperimentalno određene sekvence su bile upoređene sa OGAP® bazom podataka, koja je bila kompilirana preradom i integracijom peptidnih masa, peptidnih signatura, ESTs i podataka o genomskim sekvencama koji su u javnom domenu, kao što je opisano u međunarodnoj prijavi patenta VVO2009/087462. Proces je bio upotrebljen za generisanje približno 1 miliona peptidnih sekvenci da bi se identifikovali geni koji kodiraju protein i njihovi egzoni, što je rezultovalo identifikacijom proteinskih sekvenci za 18083 gena u 67 različitih tkiva i 57 bolesti uključujući 506 gena u kanceru mokraćne bešike, 4,713 gena u kanceru dojke, 766 gena u Burkitovom limfomu, 1,371 gena u kanceru grlića materice, 949 gena u kolorektalnom kanceru, 1,782 gena u hepatocelularnom karcinomu, 2,424 gena u CLL, 978 gena u kanceru pluća, 1,764 gena u melanomu, 1,033 gena u kanceru jajnika, 2,961 gena u kanceru pankreasa i 3,307 gena u kanceru prostate.
1.2 REZULTATI
[0327]Ovim eksperimentima je identifikovan BST1, kao što je ovde dalje opisano. BST1 cele dužine je bio detektovan u ćelijskoj membrani u uzorcima kod hronične limfocitne leukemije, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera pluća, kancera jajnika i kancera pankreasa, a nije bio detektovan u citozolu (Fig. 1a i 1g). Poređenje eksperimentalno određenih sekvenci sa sekvencama u OGAP® bazi podataka je ukazalo da je BST1 pokazao visoki stepen specifičnosti za kancer dojke (Tabela la), kolorektalni kancer (Tabela 1b), kancer bubrega (Tabela Ic), kancer pluća (Tabela 1d), kancer pankreasa (Tabela 1e), kancer glave i vrata (Tabelalf), kancer jajnika (Tabelalg) i hroničnu limfocitnu leukemiju (Tabela 1h), što je indikativno za prognostičku i dijagnostičku prirodu ovog proteina.
PRIMER 2: IDENTIFIKACIJA MEMBRANSKIH PROTEINA IZRAŽENIH U UZORCIMA TKIVA
KANCERA PLUĆA UZ KORIŠĆENJE IZOTOPSKOG OBELEŽAVANJA ZA APSOLUTNU I
RELATIVNU KVANTITACIJU ( iTRAO)
[0328]Korišćenjem sledećeg referentnog protokola su bili digestirani membranski proteini ekstrahovani iz tkiva kolorektalnog kancera, kancera bubrega ili kancera pluća i uzoraka normalnog susednog tkiva, pa su obeleženi reagensima za izotopsko obeležavanje za apsolutnu & relativnu kvantitaciju (engl. Absolute & Relative Ouantitation, skr. iTRAO; Applied Biosvstems, Foster City, CA, USA), a rezultujući peptidi su sekvencirani tandem masenom spektrometrijom.
2.1 Materijali i metode
2.1.1 Frakcionisanje ćelijske membrane
[0329]Ćelije sakupljene iz kancera pluća i normalnog susednog tkiva iz pluća su bile lizirane, pa su podvrgnute centrifugiranju na 1000G. Bio je uzet supernatant, i zatim je bio centrifugiran na 3000G. Supernatant je bio uzet još jednom, pa je onda bio centrifugiran na 100 000G. Rezultujuća peleta je bila uzeta i stavljena na 15-60% gradijent saharoze. Vestern blot je bio upotrebljen za identifikaciju subcelularnih markera, a frakcije ćelijske membrane su bile objedinjene. Objedinjeni rastvor je onda bio analiziran direktno pomoću iTRAO (vidi odeljak 2.1.2 dole).
2.1.2 iTRAO metodologija
[0330]Pelete membranskih proteina iz tkiva kancera pluća i normalnih susednih tkiva iz pluća su bile rastvorene u puferu za uzorke (2-4 ug/ul u 0.5% SDS) dodavanjem pufera, a zatim zagrevanjem do 95°C tokom 3 min. Zapremini rastvora svakog proteina koja je bila jednaka 50mg, bilo je dodato 150ul 0.5M trietilamonijum bikarbonatnog (TEAB) rastvora. Svakom uzorku je bilo dodato 3ul 50mM tris-(2-karboksietil)fosfina, pa je smeša bila inkubirana na 60°C tokom 1 h. Onda joj je bilo dodato 1ul reagensa za blokiranje cisteina, 200mM metil metantiosulfonata (MMTS) u izopropanolu. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 10 min, svakom uzorku je bilo dodato 15ul 1 ug/ml tripsina, što je bilo praćeno inkubacijom na 37°C preko noći. Digestirani uzorci su bili osušeni pod vakuumom, pa su rekonstituisani sa 30ul ili 0.5M TEAB rastvora. Bilo je dodato 70ul etanola svakom od četiri iTRAO reagenasa (114/115/116/117) i po jedan reagens je bio dodat svakom od četiri analizirana uzorka (svaki uzorak koji je sadržao dva uzorka kancerskog tkiva i dva odgovarajuća uzorka normalnog susednog tkiva), a zatim su ostavljeni na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Specifični reagens koji je bio dodat svakom uzorku je bio zabeležen. Četiri obeležena uzorka su bila sjedinjena & vrtložena. Sjedinjeni uzorci su bili upareni do suvog pod vakuumom, pa su desalinizovani stavljanjem na C18 obrtnu kolonu, te su isprani sa vodenim rastvaračem, a zatim eluiranji sa 70% acetonitrila. Frakcija uzorka je bila ponovu uparena do suvog i zatim ponovo rastvorena u 40ul rastvarača A (97.9 voda, 2% acetonitril, 0.1% mravlja kiselina) pre jonoizmenjivačkog frakcionisanja.
2.1.3 Frakcionisanje i analiza obeleženih peptida
[0331]Uzorak je bio frakcionisan jakom katjonsko izmenjivačkom hromatografijom uz korišćenje Agilent 1200 hromatografa (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Uzorci su bili eluirani na Agilent Zorbax Bio-SCXII koloni (3.5um; 50 x 0.8mm) uz korišćenje 20ml/min gradijenta od 0-100mM natrijum acetata preko 20 min, a onda od 1M preko 10 min. Tokom rada od 30 min su bile sakupljane frakcije od 1 min.
[0332]Svaka frakcija je bila analizirana tečnom hromatografijom/masenom spektrometrijom uz korišćenje Agilent 1200 hromatografa opremljenog sa Zorbax 300SB-C18 (150mm x 75um) i Agilent 6510 quadrupole-time-of-flight instrumentom (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Peptidi su bili eluirani sa 300nl/min gradijentom uz povećanje od 15% do 45% acetonitrila u 60 min. Podaci su bili prikupljeni u auto MS/MS modu tako da su do 3 prekursorska jona iznad graničnog intenziteta bila izabrana i proizvod jonskih spektara je bio akumulisan da bi se olakšalo sekvenciranje peptida. Sirovi podaci su bili obrađeni tako što su napravljene liste pikova uz korišćenje Spectrum Mili softvera (Agilent, Santa Clara, CA, USA).
2.1.4 Analiza aminokiselinskih sekvenci obeleženih peptida
[0333]Za parcijalno sekvenciranje aminokiselina i identifikaciju ADP-ribozil ciklaze 2 (BST1; CD157), bili su pretraženi tandem maseni spektri tripsinskih peptida uz korišćenje SEOUEST programa za pretraživanje (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5:976-989). Bili su uključeni sledeći kriterijumi za identifikaciju u bazi podataka: odvajanje specifičnosti tripsina; detekcija niza od a, b i y jona u peptidima dobijenim iz baze podataka, i maseni inkrement za sve cisteinske ostatke da bi se ubrajala modifikacija sa metil metantiosulfonatom i dodavanje iTRAO. markera slobodnim aminima (N-terminus & lizin). Podaci su bili pretraživani pomoću IPI Human v3.23 (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html).
2.1.5 Diskriminacija proteina povezanih sa tkivima kancera pluća
[0334]Proces za identifikaciju BST1 je korišćen za peptidne sekvence dobijene eksperimentalno masenom spektrometrijom, kao što je gore opisano, prirodnih humanih proteina da bi se identifikovali i organizovali kodirajući egzoni u publikovanim sekvencama humanog genoma. Ove eksperimentalno određene sekvence su bile upoređene sa OGAP® bazom podataka, koja je bila kompilirana preradom i integracijom peptidnih masa, peptidnih signatura, ESTs i podataka o genomskim sekvencama koji su u javnom domenu, kao što je opisano u međunarodnoj prijavi patenta VVO2009/087462
2.2 REZULTATI
[0335]Eksperimentalno identifikovani BST1, kao što je ovde dalje opisano (Tabela 2). BST1 je bio detektovan u ćelijskoj membrani kancera ne-malih ćelija pluća uzorci (Fig. 2). iTRAO. analiza je pokazala da je nivo BST1 u uzorcima kancera bio viši nego u odgovarajućim uzorcima normalnog susednog tkiva.
PRIMER 3: IMUNOHISTOHEMIJA KORIŠĆENJEM ANTITELA ZA BST1
[0336]Korišćenjem sledećeg referentnog protokola je bila izvršena imunohistohemija na tkivima FFPE tumora i normalnim tkivima uz korišćenje kozjeg poliklonskog antitela za BST1 (R&D Svstems Europe, Abingdon, UK).
3.1 Materijali i metode
3.1.1 Deparafinizacija i rehidracija
[0337]Slajdovi, odn. pločice su bile zagrevane tokom 2h na 60°C u 50 ml Falcons-a u vodenom kupatilu bez pufera. Svaki Falcon je imao jednu pločicu ili dve pločice međusobno okrenute svojim zadnjim stranama sa dugačkim vrhom za stavljanje gela između njih da bi se sprečilo da se pločice međusobno zalepe. Pločice su bile deparafinizovane u EZ-DeWax-u (BioGenex, CA, USA) tokom 5 min u crnom nosaču za pločice, pa su onda dobro isprane sa istim DeWax rastvorom uz korišćenje 1 ml pipete, a zatim su isprane sa vodom. Pločice su bile stavljene u koplin teglu napunjenu vodom sve dok uređaj za kuvanje pod pritiskom nije bio spreman; voda je bila promenjena nekoliko puta.
3.1.2 Izdvajanje antigena
[0338]Voda je bila zamenjena sa rastvorom za izdvajanje antigena = 1 x citratni pufer, pH 6 (DAKO). Antigen je bio izdvojen metodom sa uređajem za kuvanje pod pritiskom. Pločice u plastičnoj koplin tegli u rastvoru za izdvajanje antigena su bili stavljene u uređaj za kuvanje pod pritiskom koji je onda bio zagrejan do pozicije 6 (najviša vrednost). Posle 15-20 min u inkubaciji, temperatura je bila smanjena do pozicije 3 i ostavljena je na njoj (kada je temperatura unutar uređaja za kuvanje pod pritiskom bila 117°C) sledećih 20-25 min. Onda je ploča za kuvanje bila isključena, a zatim je uređaj za kuvanje pod pritiskom bio stavljen na ohlađenu ploču za kuvanje i pritisak je bio smanjen pažljivim pomeranjem ručice između pozicija "otvoreno" i "zatvoreno". Ceo sistem je bio ostavljen sve dok pritisak nije opao i ohladio se tokom još 20 min. Poklopac je bio otvoren, pa su uzorci izvađeni da bi mirovali na klupi. Pločice su bile isprane 1x5min sa PBS-3T (0.5 L PBS + 3 kapi Tween-20), pa su zatim pločice bile stavljene u PBS.
3.1.3 Bojenje
[0339]Posle izdvajanja antigena, pločice su bile montirane u Shandon Coverplate sistem. Zadržavanje mehurića vazduha između pločice i plastične pločice za pokrivanje je bilo sprečeno postavljanjem pločice za pokrivanje u koplin teglu napunjenu sa PBS i nežnim klizanjem pločice sa sekcijama tkiva u pločicu za pokrivanje. Pločica je bila izvađena iz koplin tegle, pri čemu je čvrsto držana zajedno sa pločicom za pokrivanje. Ovako pripremljena pločica je bila stavljena u nosač, pri čemu je ostavljeno da PBS koji je zaostao u levku i između pločice i pločice za pokrivanje isteče. Pločice su bile isprane sa 2x2 ml (ili 4x1 ml) PBS-3T i 1x2 ml PBS, pa je sačekano sve dok sav PBS nije istekao iz pločice i dok praktično uopšte nije ostalo PBS u levku.
[0340]Endogena peroksidna blokada je bila izvršena uz korišćenje reagensa za blokiranje peroksidaze (S2001, DAKO). Bilo je upotrebljeno 1-4 kapi rastvora peroksida po pločici, i onda je inkubirana tokom 5 minuta. Pločice su bile isprane sa vodom, a zatim jednom sa 2 ml PBS-3T i jednom sa 2 ml PBS; bilo je važno da se sačeka sve dok praktično uopšte nije ostalo tečnosti u levku pre dodavanja nove šarže pufera za ispiranje.
[0341]Primarno antitelo je bilo razređeno sa reagensom za razređivanje antitela (DAKO). Utvrđeno je da je optimalno razređivanje bilo 1:100. 50-200 ml razređenog primarnog antitela je bilo naneto na svaku grupu sekcija i/ili tkiva; vođeno je računa da bude pokriveno celo tkivo. Pločica je bila nežno tapkana da bi se antitelo ravnomerno rasporedilo po sekciji ili je bio upotrebljen vrh pipete na gornjoj strani sekcije. Pločica je bila inkubirana tokom 45 min u vlažnoj komori na sobnoj temperaturi. Pločice su bile ispirane sa 2x2 ml (ili 4x1 ml) PBS-3T i onda sa 1x2 ml PBS, pa je sačekano sve dok sav PBS nije istekao kroz pločicu i dok praktično nije ostalo nimalo PBS u levku. Odgovarajući magareći anti-kozji lgG:HRP (OBT1500P, 1 mg/ml, Serotec) je bio nanet u 1:1000 i zatim je izvršena inkubacija tokom 35 min na sobnoj temperaturi. Pločice su bile isprane kao i gore. DAB supstrat je bio sjedinjen sa puferom za razređivanje; 2 ml koja su sadržala 2 kapi supstrata je bilo dovoljno za 10 pločica. DAB reagens je bio nanet na pločice nanošenjem nekoliko kapi istovremeno. Sav DAB je bio raspoređen na pločicama. Pločice su bile inkubirane tokom 10 min. Pločice su bile isprane sa 1x2 ml (ili 2x1 ml) sa PBS-3T i 1x2 ml (ili 2x1 ml) sa PBS, pa je sačekano sve dok sav PBS nije istekao kroz pločicu i dok praktično više nije ostalo PBS u levku. Bio je nanet hematoksilin (DAKO); 1 ml je bio dovoljan za 10 pločica, pa su pločice bile inkubirane tokom 1 min na sobnoj temperaturi. Levkovi Shandon Coverplate sistema su bili napunjeni sa 2 ml vode i ostavljeno je da ona prođe kroz njih. Kada na pločicama više nije bilo viška hematoksilina, sistem je bio rastavljen, a sekcije i/ili grupe tkiva su bile isprane sa vodom iz boce, te su stavljene u crni nosač za pločice. Tkiva su bila rehidrirana inkubacijom u EZ-DeWax tokom 5 min, a onda u 95% etanola tokom 2-5 min. Ostavljeno je da se pločice osuše na klupi na sobnoj temperaturi, a onda su stavljene u medijum za stavljanje i pokrivene su sa pločicama za pokrivanje.
3.2 REZULTATI
[0342]Imunohistohemijska analiza je otkrila specifično bojenje tumorskih ćelija u sekcijama tkiva kancera pluća. U uzorcima tkiva pluća koji su predstavljali 59 pacijenata sa kancerom pluća, povišeno bojenje BST1 u ćelijama kancera je bilo uočeno kod 28 pacijenata (47%). Shodno tome, antitela usmerena na BST1 mogu imati primenu kao terapeutici i dijagnostici kod ovog kancera i drugih tipova kancera koji ispoljavaju ekspresiju BST1.
PRIMER 4: RNK PROFILISANJE BST1
4.1 Materijali i metode
[0343]Različita normalna i kancerska tkiva su bila podvrgnuta skiningu za BST1 mRNK ekspresiju uz korišćenje kvantitativne lančane reakcije polimeraze primenom reverzne transkriptaze (RT-PCR).
4.2 REZULTATI
[0344]Fig. 3a prikazuje RT-PCR rezultate za BST1 za različita normalna i kancerska tkiva. Vertikalna osa prikazuje kopiju # /5 ng cDNK od BST1. mRNK profilisanje je otkrilo izuzetno visok nivo ekspresije cilja u NPBmonocitima i CD33+ ćelijama, za razliku od veoma niskog profila ekspresije u većini normalnih tkiva. Ekspresija mRNK je indikator ekspresije BST1 proteina. Fig. 3b prikazuje rezultate dalje analize ekspresije mRNK, koji ponovo prikazuju visoke nivoe BST1 ekspresije kod monocita i CD33+ ćelija. Utvrđeno je da su nivoi u NPB-monocitima i CD33+ ćelijama bili 20-30 puta viši nego u bilo kom drugom tipu tkiva/ćelija.
[0345]Fig. 3c prikazuje rezultate komparativnog RT-PCR profilisanja koje je bilo izvedeno na skupu normalnih tkiva koja su ispoljavala BST1 ekspresiju zajedno sa CD33, transmembranskim receptorom koji se izražava na ćelijama mijeloidne loze, i cilj je gemtuzumab ozogamicina (Mvlotarg), na monoklonskom antitelu baziranog lečenja akutne mijeloidne leukemije. Otkriveno je da BST1 ima veoma ograničen profil normalne ekspresije u poređenju sa CD33.
PRIMER 5: KONSTRUKCIJA BIBLIOTEKE ZA ISPOLJAVANJE NA FAGIMA
[0346]Rekombinantni protein sastavljen od aminokiselina 29-292 BST1 (SEQ ID NO: 13) je bio eukariotski sintetizovan standardnim rekombinantnim metodama i primenjen je kao antigen za imunizaciju.
Imunizaciia i mRNK izolacija
[0347]Biblioteka za ispoljavanje na fagima za identifikaciju molekula koji se vezuju za BST1 je bila konstruisana kao što sledi. A/J miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) su bili imunizovani intraperitonealno sa rekombinantnim BST1 antigenom (ekstracelularni domen), uz korišćenje 100 mg proteina u Frojndovom kompletnom adjuvansu, 0. dana, i sa 100 ug antigena 28. dana. Uzorci krvi miševa za testiranje su bili dobijeni punkturom retro-orbitalnih sinusa. Ako bi, testiranjem titara, bilo utvrđeno da su visoki pomoću ELISE uz korišćenje biotinilovanog BST1 antigena imobilizovanog pomoću neutravidina (Reacti-Bind™) NeutrAvidin™-Coated Polystyrene Plates, Pierce, Rockford, III), onda bi miševima bilo dodatno dato još 100 mg proteina 70., 71. i 72. dana, posle čega je usledilo usmrćivanje i vađenje slezine 77. dana. Ako titri antitela nisu bili smatrani zadovoljavajućim, onda je miševima bilo dodatno dato još 100 ug antigena 56. dana, a uzimanje krvi za testiranje je izvršeno 63. dana. Ako su bili dobijeni zadovoljavajući titri, onda je životinjama bilo dodatno dato još 100 mg antigena 98., 99., i 100. dana, pa su slezine uzete 105. dana.
[0348]Slezine su bile sakupljene u poklopcu sa laminarnim strujanjem, pa su prenete u petrijeve šolje, isečene su, pa su odbačeni mast i vezivno tkivo. Slezine su bile brzo macerirane sa klipom iz sterilnog šprica od 5 cc u prisustvu 1.0 ml rastvora D (25.0 g gvanidin tiocijanata (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 29.3 ml sterilne vode, 1.76 ml 0.75 M natrijum citrata pH 7.0, 2.64 ml 10% sarkozila (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 0.36 ml 2-merkaptoetanola (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). Ova suspenzija slezine je onda bila propuštana kroz iglu veličine 18 sve dok sve ćelije nisu bile lizirane, a viskozni rastvor je bio prenet u epruvetu za mikrocentrifugiranje. Petrijeva šolja je bila isprana sa 100 ml rastvora D da bi se prikupila eventualno preostala slezina. Ova suspenzija je zatim bila propuštana kroz iglu veličine 22 dodatnih 5-10 puta.
[0349]Uzorak je bio podeljen na jednake delove između dve epruvete za mikrocentrifugiranje, pa mu je dodato sledeće, po redosledu, uz mešanje preokretanjem posle svakog dodavanja: 50 ul 2 M natrijum acetata pH 4.0, 0.5 ml vodom zasićenog fenola (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa), 100 ul hloroforma/izoamil alkohola 49:1 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). Rastvor je bio vrtložen tokom 10 sek i onda je inkubiran na ledu tokom 15 min. Posle centrifugiranja na 14 krpm tokom 20 min na 2-8°C, vodena faza je bila preneta u novu epruvetu. Bila je dodata ista zapremina vodom zasićenog fenola:hloroforma:izoamil alkohola (50:49:1), i epruveta je zatim bila vrtložena tokom deset sekundi. Posle 15 min inkubacije na ledu, uzorak je bio centrifugiran tokom 20 min na 2-8°C, pa je vodena faza bila preneta u novu epruvetu i istaložena je sa istom zapreminom i izopropanola na -20°C tokom minimalno 30 min. Posle centrifugiranja na 14 krpm tokom 20 min na 4°C, supernatant je bio aspiriran, pa su epruvete kratko obrtane i odstranjeni su svi tragovi tečnosti iz RNK pelete.
[0350]Svaka RNK peleta je bila rastvorena u 300 ul rastvora D, pa je sjedinjena i istaložena sa istom zapreminom izopropanola na -20°C tokom minimalno 30 min. Uzorak je bio centrifugiran na 14 krpm tokom 20 min na 4°C, pa je supernatant bio aspiriran kao pre, a uzorak je bio ispran sa 100 ul ledeno hladnog 70% etanola. Uzorak je bio ponovo centrifugiran na 14 krpm tokom 20 min na 4°C, pa je bio aspiriran 70% rastvor etanola, i RNK peleta je bila osušena in vacuo. Peleta je bila resuspendovana u 100 ml sterilne, sa dietil pirokarbonatom tretirane vode. Koncentracija je bila određena pomoću A260 uz korišćenje apsorbanse od 1.0 za koncentraciju od 40 mg/ml. RNKs su bile čuvane na -80°C.
Priprema komplementarne DNK ( cDNK)
[0351]Sva RNK prečišćena iz mišijih slezina kao što je gore opisano je bila upotrebljena direktno kao matrica za pripremu cDNK. RNK (50 ug) je bila razređena do 100 uL sa sterilnom vodom, i onda je bilo dodato 10 pL 130 ng/uL oligo dT12 (sintetizovan na Applied Biosvstems Model 392 DNK sintetizatoru). Uzorak je bio zagrevan tokom 10 min na 70°C, a onda je ohlađen na ledu. Bilo je dodato četrdeset mL 5<*>pufera za prvi lanac (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), zajedno sa 20 pL 0.1 M ditiotreitola (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), 10 pL 20 mM deoksinukleozidnih trifosfata (dNTP's, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i 10 uL vode na ledu. Uzorak je onda bio inkubiran na 37°C tokom 2 min. Bilo je dodato deset uL reverzne transkriptaze (Superscript™) II, Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.), pa je inkubacija bila nastavljena na 37°C tokom 1 h. cDNK produkti su bili upotrebljeni direktno za lančanu reakciju polimeraze (PCR).
Amplifikacija gena antitela pomoću PCR
[0352]Da bi se amplifikovali u suštini svi geni H i L lanaca uz korišćenje PCR, bili su izabrani prajmeri koji odgovaraju u suštini svim publikovanim sekvencama. Pošto nukleotidne sekvence amino terminusa H i L sadrže značajan diverzitet, bilo je sintetizovano 33 oligonukleotida da bi služili kao 5' prajmeri za H lance, i 29 oligonukleotida je bilo sintetizovano da bi služili kao 5' prajmeri za kapa L lance, kao što je opisano u US 6,555,310. Nukleotidne sekvence konstantnog regiona svakog lanca su zahtevale samo jedan 3' prajmer za H lance i jedan 3' prajmer za kapa L lance.
[0353]Bila je izvedeno reakcija od 50 pL za svaki par prajmera sa 50 pmol 5' prajmera, 50 pmol 3' prajmera, 0.25 pL Taq DNK Polimeraze (5 jedinica/pL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 3 pL cDNK (pripremljena kao što je opisano), 5 pL 2 mM dNTP's, 5 uL 10<*>Taq DNK polimeraznog pufera sa MgCI2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i H20 do 50 ml_. Amplifikacija je bila izvršena uz korišćenje GeneAmp(R) 9600 termičkog ciklizatora (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) sa sledećim programom za termociklizaciju: 94°C tokom 1 min; 30 ciklusa od 94°C tokom 20 sek, 55°C tokom 30 sek, i 72°C tokom 30 sek, 72°C tokom 6 min; 4°C.
[0354]dsDNK produkti PCR procesa su onda bili podvrgnuti asimetričnoj PCR uz korišćenje samo 3' prajmera za generisanje u suštini samo anti-sensnog lanca ciljnih gena. Bila je izvedena 100 ml_ reakcija za svaki dsDNK produkt sa 200 pmol 3' prajmera, 2 pL ds-DNK produkta, 0.5 pL Taq DNK Polimeraze, 10 pL 2 mM dNTP's, 10 pL 10<*>Taq DNK polimeraznog pufera sa MgCI2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i H20 do 100 pL. Isti PCR program kao što je gore opisano je bio upotrebljen za amplifikaciju jednolančane (ss)-DNK.
Prečišćavanje iednolančane DNK pomoću tečne hromatografiie visokih performansi i kinaziranja
jednolančane DNK
[0355]H lanac ss-PCR produkata i L lanac jednolančanih PCR produkata su bili istaloženi etanolom dodavanjem 2.5 zapremine etanola i 0.2 zapremine 7.5 M amonijum acetata i inkubacijom na -20°C tokom najmanje 30 min. DNK je bila peletirana centrifugiranjem u Eppendorf centrifugi na 14 krpm tokom 10 min na 2-8°C. Supernatant je bio pažljivo aspiriran, pa su epruvete bile kratko obrtane 2. put. Zadnja kap supernatanta je bila odstranjena sa pipetom. DNK je bio sušen in vacuo tokom 10 min na srednjoj toploti. H lanci produkata su bili objedinjeni u 210 pL vode, dok su L lanci produkata bili objedinjeni odvojeno u 210 pL vode. Jednolančana DNK je bila prečišćena tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) uz korišćenje Hewlett Packard 1090 HPLC i a Gen-Pak™) FAX anjonsko izmenjivačke kolone (Millipore Corp., Milford, Mass.). Gradijent upotrebljen za prečišćavanje jednolančane DNK je prikazan u Tabeli 3, a temperatura peći je bila 60°C. Apsorbansa je bila praćena na 260 nm. Jednolančana DNK eluirana iz HPLC je bila sakupljena u frakcijama od 0.5 min. Frakcije koje su sadržale jednolančanu DNK su bile istaložene etanolom, pa su peletirane i osušene kao što je gore opisano. Osušene DNK pelete su bile objedinjene u 200 pL sterilne vode.
[0356]Jednolančana DNK je bila 5'-fosforilovana u pripremi za mutagenezu. Dvadesetčetiri pL 10<*>kinaznog pufera (United States Biochemical, Cleveland, Ohio), 10.4 pL 10 mM adenozin-5'-trifosfata (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), i 2 pL polinukleotidne kinaze (30 jedinica/mL, United States Biochemical, Cleveland, Ohio) je bilo dodato svakom uzorku, i epruvete su bile inkubirane na 37°C tokom 1 h. Reakcije su bile zaustavljene inkubacijom epruveta na 70°C tokom 10 min. DNK je bila prečišćena jednom ekstrakcijom pomoću Tris uravnoteženog fenola (pH>8.0, United States Biochemical, Cleveland, Ohio):hloroforma:izoamil alkohola (50:49:1) i jednom ekstrakcijom sa hloroformom:izoamil alkoholom (49:1). Posle ekstrakcija, DNK je bio istaložen etanolom i peletiran kao što je gore opisano. DNK pelete su bile osušene, pa su onda rastvorene u 50 pL sterilne vode. Koncentracija je bila određena merenjem apsorbanse za alikvot DNK na 260 nm uz korišćenje 33 mg/ml za apsorbansu od 1.0. Uzorci su bili čuvani na -20°C.
Priprema uracil matrica korišćenih u generisanju biblioteka za ispoljavanje antitela slezine na fagima
[0357]Jedan mlE. coli CJ236(BioRAD, Hercules, Calif.) kulture preko noći je bio dodat u 50 ml 2<*>YT u bocu za mućkanje od 250 ml sa pregradama. Kultura je rasla na 37°C do OD600=0.6, pa je inokulisana sa 10 pl 1/100 pripremljenog rastvora BS45 vektora faga (opisan u US 6,555,310) i onda je rast nastavljen tokom 6 h. Približno 40 ml kulture je bilo centrifugirano na 12 krpm tokom 15 min na 4°C. Supernatant (30 ml) je bio prenet u novu epruvetu za centrifugiranje, pa je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 15 min posle dodavanja 15 pl 10 mg/ml RNaseA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.). Fagi su bili istaloženi dodavanjem 7.5 ml 20% polietilen glikola 8000 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.)/3.5M amonijum acetata (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) i inkubacijom na ledu tokom 30 min. Uzorak je bio centrifugiran na 12 krpm tokom 15 min na 2-8°C. Supernatant je bio pažljivo odliven, pa je epruveta kratko obrtana da bi se odstranili svi tragovi supernatanta. Peleta je bila ponovo suspendovana u 400 pl veoma slanog pufera (300 mM NaCI, 100 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), i zatim je preneta u epruvetu od 1.5 ml.
[0358]Pripremljeni fagi su bili ekstrahovani više puta sa jednakom zapreminom uravnoteženog fenola:hloroforma:izoamil alkohola (50:49:1) sve dok je bio vidljiv trag bele kontaktne površine, a onda su bili ekstrahovani sa jednakom zapreminom hloroforma:izoamil alkohola (49:1). DNK je bio istaložen sa 2.5 zapremine etanola i 1/5 zapremine 7.5 M amonijum acetata i onda je inkubiran 30 min na -20°C. DNK je bio centrifugiran na 14 krpm tokom 10 min na 4°C, a peleta je bila isprana jednom sa hladnim 70% etanolom, i osušena je in vacuo. Uracil matrica DNK je bila rastvorena u 30 pL sterilne vode i koncentracija je određena pomoću A260 uz korišćenje apsorbanse od 1.0 za koncentraciju od 40 mg/ml. Matrica je bila razređena do 250 ng/pL sa sterilnom vodom, pa je alikvotirana i čuvana na -20°C.
Mutageneza uracil matrice sa ss- DNK i elektroporacijom uE . colida bi se generisale biblioteke za
ispoljavanje antitela na fagima
[0359]Biblioteke za ispoljavanje antitela na fagima su bile generisane istovremeno uvođenjem gena jednolančanih teških i lakih lanaca na uracil matricu kao vektor za ispoljavanje na fagima. Tipična mutageneza je bila izvršena u razmeri od 2 pg mešanjem sledećeg u PCR reakcionoj epruveti od 0.2 ml: 8 pl (250 ng/pL) uracil matrice, 8 pL 10<*>anelacionog pufera (200 mM Tris pH 7.0, 20 mM MgCI2, 500 mM NaCI), 3.33 ml kinaziranog inserta jednolančanog teškog lanca (100 ng/pL), 3.1 pl kinaziranog inserta jednolančanog lakog lanca (100 ng/pL), i sterilne vode do 80 pl. DNK je bila anelirana u GeneAmp(R) 9600 termičkom ciklizatoru uz korišćenje sledećeg termičkog profila: 20 sek na 94°C, 85°C tokom 60 sek, 85°C do 55°C granici preko 30 min, držanje na 55°C tokom 15 min. DNK je bila preneta na led posle završetka programa. Esktenzija/ligacija je bila izvedena dodavanjem 8 pl 10<*>pufera za sintezu (po 5 mM dNTP, 10 mM ATP, 100 mM Tris pH 7.4, 50 mM MgCI2, 20 mM DTT), 8 pL T4 DNK ligaze (1 U/pL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 8 pL razređene T7 DNK polimeraze (1 U/mL, New England BioLabs, Beverlv, Mass.) i inkubacijom na 37°C tokom 30 min. Reakcija je bila zaustavljena sa 300 ml_ pufera za zaustavljanje mutageneze (10 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA). Mutageneza DNK je bila ekstrahovana jednom sa uravnoteženim fenolom (pH>8):hloroformom:izoamil alkoholom (50:49:1), jednom sa hloroformom:izoamil alkoholom (49:1), i DNK je bio istaložen etanolom na -20°C tokom najmanje 30 min. DNK je bio peletiran, a supernatant je bio pažljivo odstranjen kao što je opisano gore. Uzorak je bio ponovo kratko obrtan, a svi tragovi etanola su bili uklonjeni pipetom. Peleta je bila osušena in vacuo. DNK je bila resuspendovana u 4 pL sterilne vode.
[0360]Jedan pL mutageneze DNK (500 ng) je bio prenet u 40 ml elektrokompetentne E. co//DH12S (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) uz korišćenje elektroporacije. Transformisane ćelije su bile pomešane približno sa 1.0 ml preko noći kultivisanih XL-1 ćelija koje su bile razređene sa 2<*>YT bujona u 60% originalne zapremine. Ova smeša je onda bila preneta u 15-ml sterilnu epruvetu za kultivaciju, pa je odozgo dodato 9 ml agara radi stavljanja na 150-mm LB ploču sa agarom. Ploče su bile inkubirane tokom 4 h na 37°C, a onda su bile prenete na 20°C preko noći. Prva runda faga antitela je bila napravljena eluiranjem faga sa ovih ploča u 10 ml 2<*>YT, obrtanjem ostataka i uzimanjem supernatanta. Ovi uzorci su biblioteke za ispoljavanje antitela na fagima koje su upotrebljene za selekciju antitela protiv BST1. Efikasnost elektroporacija je bila merena stavljanjem na ploče 10 ml 10~<4>razređenja suspendovanih ćelija LB ploče sa agarom, što je bilo praćeno inkubacijom ploča preko noći na 37°C. Efikasnost je bila izračunata množenjem broja plakova na ploči sa 10~<4>razređenjem sa 106. Efikasnosti elektroporacije biblioteka su obično bile veće od 1*107 faga pod ovim uslovima.
TransformacijaE. colielektroporacijom
[0361]ElektrokompetentneE. coli ćelijesu bile otopljene na ledu. DNK je bio pomešan sa 40 L ovih ćelija nežnim pipetiranjem ćelija gore i dole 2-3 puta, pri čemu je vođeno računa da se ne uvede mehurić vazduha. Ćelije su bile prenete u Gene Pulser kivetu (0.2 cm zazor, BioRAD, Hercules, Calif.) koja je bila ohlađena na ledu, pri čemu je ponovo vođeno računa da se ne uvede mehurić vazduha bubble pri prenošenju. Kiveta je bila stavljena u E. coli Pulsator (BioRAD, Hercules, Calif.) i onda je elektroporirana sa naponom podešenim na 1.88 kV prema preporukama proizvođača. Preneti uzorak je bio odmah resuspendovan u 1 ml 2<*>YT bujona ili 1 ml smeše 400 pl 2<*>YT/600 ml preko noći kultivisanih XL-1 ćelija i prerađen je onako kako su diktirale procedure.
Zasejavanje M13 faga ili ćelija transformisanih sa reakcijom mutageneze vektorom za ispoljavanje
antitela na fagima
[0362]Uzorci faga su bili dodati u 200 pL preko noći kultivisane E. coli XL1-Blue kada su zasejani na 100 mm LB pločama sa agarom ili u 600 pL preko noći kultivisanih ćelija kada su zasejani na 150 mm ploče u sterilnim epruvetama za kultivaciju od 15 ml. Posle dodavanja LB agara sa gornje strane (3 ml za 100 mm ploče ili 9 ml za 150 mm ploče, agar za stavljanje sa gornje strane je bio čuvan na 55°C (vidi Dodatak A1, Sambrook et al., supra.), a smeša je bila ravnomerno raspoređena na LB ploči sa agarom koja je bila prethodno zagrejana (37°C-55°C) da bi se odstranio eventualni višak vlage sa površine agara. Ploče su bile hlađene na sobnoj temperaturi sve dok agar sa gornje strane nije očvrsnuo. Ploče su bile preokrenute, pa su inkubirane na 37°C kao što je naznačeno.
Priprema biotinilovanog tirozin- proteinskih kinaznih transmembranskih receptora BST1 i biotinilovanih
antitela
[0363]Koncentrovani rekombinantni BST1 antigen (ekstracelularni domen cele dužine) je bio ekstenzivno dijaliziran u BBS (20 mM borata, 150 mM NaCI, 0.1% NaN3, pH 8.0). Posle dijalize, 1 mg BST1 (1 mg/ml in BBS) je reagovao sa 15-strukim molskim viškom biotin-XX-NHS estra (Molecular Probes, Eugene, Oreg., gotov rastvor sa 40 mM u DMSO). Reakcija je bila inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 90 min, a onda je prekinuta sa taurinom (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) sa finalnom koncentracijom od 20 mM. Biotinilaciona reakciona smeša je onda bila dijalizirana prema BBS na 2-8°C. Posle dijalize, biotinilovani BST1 je bio razređen u puferu za ispiranje (40 mM Tris, 150 mM NaCI, 20 mg/ml BSA, 0.1% Tween 20, pH 7.5), pa je alikvotiran i čuvan na -80°C sve dok je bio potreban.
[0364]Antitela su reagovala sa 3-(N-maleimidilpropionil)biocitinom (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) uz korišćenje slobodnog cisteina lociranog na karboksi terminusu teškog lanca. Antitela su bila redukovana dodavanjem DTT do finalne koncentracije od 1 mM tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Redukovano antitelo je bilo propušteno kroz Sephadex G50 desalinizacionu kolonu uravnoteženu u 50 mM kalijum fosfata, 10 mM borne kiseline, 150 mM NaCI, pH 7.0. Bio je dodat 3-(N-maleimidilpropionil)-biocitin do finalne koncentracije od 1 mM i ostavljeno je da se reakcija nastavi na sobnoj temperaturi tokom 60 min. Uzorci su onda bili ekstenzivno dijalizirani prema BBS i čuvani su na 2-8°C.
Priprema avidin magnetnog lateksa
[0365]Magnetni lateks (Estapor, 10% čvrste materije, Bangs Laboratories, Fishers, Ind.) je bio temeljno resuspendovan i 2 ml je alikvotirano u konusnoj epruveti od 15 ml. Magnetni lateks je bio suspendovan u 12 ml destilovane vode i izdvajan je iz rastvora tokom 10 min uz korišćenje magneta (PerSeptive Biosvstems, Framingham, Mass.). Dok je održavano izdvajanje magnetnog lateksa sa magnetom, tečnost je bila pažljivo odstranjena uz korišćenje sterilne pipete od 10 ml. Ovaj proces ispiranja je bio ponovljen još dodatna tri puta. Posle finalnog ispiranja, lateks je bio resuspendovan u 2 ml destilovane vode. U posebnoj konusnoj epruveti od 50 ml je bilo rastvoreno 10 mg avidina-HS (NeutrAvidin, Pierce, Rockford, III.) u 18 ml 40 mM Tris, 0.15 M natrijum hlorida, pH 7.5 (TBS). Pri vrtloženju je razređenom avidinu-HS bilo dodato 2 ml ispranog magnetnog lateksa i smeša je bila mešana još dodatnih 30 sek. Ova smeša je bila inkubirana na 45°C tokom 2 h, uz trešenje svakih 30 min. Avidinski magnetni lateks je bio izdvojen iz rastvora uz korišćenje magneta i ispran je tri puta sa 20 ml BBS kao što je opisano gore. Posle finalnog ispiranja, lateks je bio resuspendovan u 10 ml BBS i čuvan je na 4°C.
[0366]Neposredno pre upotrebe, avidinski magnetni lateks je bio uravnotežen u puferu za ispiranje (40 mM Tris, 150 mM NaCI, 20 mg/ml BSA, 0.1% Tvveen 20, pH 7.5). Avidinski magnetni lateks potreban za eksperiment ispiranja (200 ml/uzorku) je bio dodat u sterilnu epruvetu za centrifugiranje od 15 ml i dopunjen je do 10 ml sa puferom za ispiranje. Epruveta je bila stavljena na magnet tokom 10 min da bi se lateks izdvojio. Rastvor je bio pažljivo odstranjen sa sterilnom pipetom od 10 ml kao što je opisano gore. Magnetni lateks je bio resuspendovan u 10 ml pufera za ispiranje da bi se započelo sa drugim ispiranjem. Magnetni lateks je bio ispran ukupno 3 puta puferom za ispiranje. Posle finalnog ispiranja, lateks je bio resuspendovan u puferu za ispiranje do polazne zapremine.
PRIMER 6: SELEKCIJA REKOMBINANTNIH POLIKLONSKIH ANTITELA ZA BST1 ANTIGEN
[0367]Vezujući reagensi koji se specifično vezuju za BST1 su bili izabrani iz biblioteka za ispoljavanje na fagima napravljenih od hiperimunizovanih miševa kao što je opisano u Primeru 5.
Ispiranje
[0368]Prva runda antitela za ispoljavanje na fagima je bila pripremljena kao što je opisano u Primeru 5 uz korišćenje BS45 uracil matrice. Elektroporacije mutageneza DNK su bile izvršene da bi se dobili uzorci faga poreklom od različitih imunizovanih miševa. Da bi se ostvarila veća raznovrsnost u rekombinantnoj poliklonskoj biblioteci, svaki uzorak faga je paniran, odn. ispiran odvojeno.
[0369]Pre prve runde funkcionalnog ispiranja sa biotinilovanim BST1 antigenom, biblioteke antitela za ispoljavanje na fagima su bile selekcionisane u pogledu ispoljavanja na fagima i teških i lakih lanaca na svojoj površini ispiranjem sa 7F11-magnetnim lateksom (kao što je opisano u Primerima 21 i 22 iz US 6,555,310). Funkcionalno ispiranje ovih obogaćenih biblioteka je bilo izvršeno u principu onako kao što je opisano u Primeru 16 iz US 6,555,310. Posebno, 10 mL 1<*>10-6 M biotinilovanog BST1 antigena je bilo dodato uzorcima faga (približno 1<*>10-8 M finalne koncentracije BST1), i ostavljeno je da se smeša uravnoteži preko noći na 2-8°C.
[0370]Posle dostizanja ravnoteže, uzorci su bili isprani sa avidinskim magnetnim lateksom da bi se uhvatio fag sa antitelom vezanim za BST1. Uravnoteženi avidinski magnetni lateks (Primer 5), 200 mL lateksa po uzorku, je bio inkubiran sa fagom tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Posle 10 min svakom uzorku faga je bilo dodato približno 9 ml pufera za ispiranje, i magnetni lateks je bio izdvojen iz rastvora korišćenjem magneta. Posle deset minuta izdvajanja, nevezani fag je bio pažljivo odstranjen uz korišćenje sterilne pipete od 10 ml. Magnetni lateks je onda bio resuspendovan u 10 ml pufera za ispiranje da bi započelo drugo ispiranje. Lateks je bio ispran ukupno tri puta kao što je gore opisano. Za svako ispiranje, epruvete su bile u kontaktu sa magnetom tokom 10 min da bi se izdvojio nevezani fag od magnetnog lateksa. Posle trećeg ispiranja, magnetni lateks je bio resuspendovan u 1 ml pufera za ispiranje, pa je prenet u epruvetu od 1.5 mL. Cela zapremina magnetnog lateksa za svaki uzorak je bila onda sakupljena i resuspendovana je u 200 ml 2<*>YT, a zatim je zasejana na 150 mm LB ploče kao što je opisano u Primeru 1 da bi se amplifikovalo vezivanje faga. Ploče su bile inkubirane na 37°C tokom 4 h, a onda preko noći na 20°C.
[0371]150 mm ploče koje su bile upotrebljene za amplifikaciju vezanog faga su bile upotrebljene za generisanje sledeće runde faga antitela. Posle inkubacije preko noći, druga runda faga antitela je bila eluirana iz 150 mm ploča pipetiranjem 10 mL 2<*>YT medijuma na površinski sloj i blagim trešenjem ploče na sobnoj temperaturi tokom 20 min. Uzorci faga su onda bili preneti u sterilne epruvete za centrifugiranje za jednokratnu upotrebu od 15 ml sa utičnim čepom, pa su ostaci LB ploče peletirani centrifugiranjem epruveta tokom 15 min na 3500 rpm. Supernatant koji je sadržao drugu rundu faga antitela je onda bio prenet u novu epruvetu.
[0372]Druga runda funkcionalnog ispiranja je bila postavljena razređivanjem 100 pL svakog skladišta faga u 900 pL pufera za ispiranje u sterilnim epruvetama za centrifugiranje za jednokratnu upotrebu od 15 ml. Biotinilovani BST1 antigen je onda bio dodat svakom uzorku kao što je bilo opisano za prvu rundu ispiranja, pa su uzorci faga bili inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Uzorci faga su onda bili isprani sa avidinskim magnetnim lateksom kao što je opisano gore. Napredovanje ispiranja je bilo u ovom trenutku praćeno zasejavanjem svakog uzorka lateksa na 100 mm LB ploče sa agarom da bi se odredio procenat kapa pozitivnih. Najveći deo lateksa iz svakog ispiranja (99%) je bio zasejan na 150 mm LB ploče sa agarom da bi se amplifikovano vezivanje faga za lateks. 100 mm LB ploče sa agarom su bile inkubirane na 37°C tokom 6-7 h, pošto su ploče bile prenete na sobnu temperaturu, a zatim su nitrocelulozni filteri (veličina pora 0.45 mm, BA85 Protran, Schleicher i Schuell, Keene, N.H.) bili položeni na plakove.
[0373]Ploče sa nitroceluloznim filterima su bile inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi, a onda su bile razvijene sa kozjim anti-mišijim kapa alkalna fosfataza konjugatom da bi se odredio procenat kapa pozitivnih kao što je dole opisano. Uzorci faga sa manjim procentima (<70%) kapa pozitivnih u populaciji su bili podvrgnuti rundi ispiranja sa 7F11-magnetnim lateksom pre nego što je izvedena treća funkcionalna runda ispiranja preko noći na 2-8°C uz korišćenje biotinilovanog BST1 antigena sa približno 2<*>10"<9>M. Ova runda ispiranja je bila takođe praćena u pogledu kapa pozitivnih. Pojedinačni uzorci faga koji su imali procente kapa pozitivnih veće od 80% su bili objedinjeni i podvrgnuti finalnoj rundi ispiranja preko noći na 2-8°C sa 5<*>10"<9>M. Geni BST1 antitela sadržani u eluiranom fagu iz ove četvrte runde funkcionalnog ispiranja su bili subklonirani u vektor ekspresije, pBRncoH3.
[0374]Proces subkloniranja je generalno bio izvršen kao što je opisano u Primeru 18 iz US 6,555,310. Posle subkloniranja, vektor ekspresije je bio elektroporiran u DH10B ćelije i smeša je rasla preko noći u 2<*>YT koji je sadržao 1% glicerola i 10 mg/ml tetraciklina. Posle druge runde rasta i selekcije u tetraciklinu, alikvoti ćelija su bili zamrznuti na -80°C kao izvor za proizvodnju BST1 poliklonskog antitela. Monoklonska antitela su bila selekcionisana iz ovih poliklonskih smeša zasejavanjem uzorka smeše na LB pločama sa agarom koje su sadržale 10 mg/ml tetraciklina i skriningom antitela koja prepoznaju BST1.
Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnih antitela protiv BST1
[0375]Inokulat u balonu za mućkanje je bio generisan preko noći od banke ćelija na -70°C u Innova 4330 inkubatorskom tresaču (New Brunsvvick Scientific, Edison, NJ.) postavljenom na 37°C, 300 rpm. Inokulat je bio upotrebljen za zasejavanje fermentora od 20 L (Applikon, Foster City, Calif.) koji je sadržao definisani medijum za kultivaciju [Pack et al. (1993) BioTechnology 11: 1271-1277] kome je bilo dodato 3 g/L L-leucina, 3 g/L L-izoleucina, 12 g/L kazeinskog digesta (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L glicerola i 10 mg/ml tetraciklina. Temperatura, pH i rastvoreni kiseonik u fermentoru su bili kontrolisani na 26°C, 6.0-6.8 i 25% zasićenja, respektivno. Pena je bila kontrolisana dodavanjem polipropilen glikola (Dow, Midland, Mich.). Glicerol je bio dodat u fermentor u modu dodavanja šarže. Fab ekspresija je bila indukovana dodavanjem L(+)-arabinoze (Sigma, St. Louis, Mo.) do 2 g/L tokom kasne logaritamske faze rasta. Gustina ćelija je bila izmerena optičkom gustinom na 600 nm u UV-1201 spektrofotometru (Shimadzu, Columbia, Md.). Posle završetka procesa i podešavanja pH na 6.0, kultura je bila propuštena dva puta kroz M-210B-EH Microfluidizer (Microfluidics, Nevvton, Mass.) na 17,000 psi. Homogenizacijom ćelija pod visokim pritiskom su oslobođena Fab u supernatant kulture.
[0376]Prvi korak u prečišćavanju je bila imobilizovana metalna afinitetna hromatografija na ekspandovanom sloju (EB-IMAC). Streamline ™ helatirajuća smola (Pharmacia, Piscataway, NJ.) je bila snabdevena sa 0.1 M NiCI2 i onda je bila ekspandovana i uravnotežena u 50 mM acetata, 200 mM NaCI, 10 mM imidazola, 0.01% NaN3, na pH 6.0 puferu koji je strujao u smeru naviše. Skladišni rastvor je bio upotrebljen da se homogenat kulture dovede do 10 mM imidazola, posle čega je on bio razređen dvostruko ili više u puferu za uravnoteženje da bi se smanjio sadržaj vlažnih čvrstih materija na manje od 5 tež. %. On je onda bio stavljen na Streamline kolonu sa strujanjem u smeru naviše sa površinskom brzinom od 300 cm/h. Ćelijski ostaci su prošli neometano, ali su Fab bila uhvaćena pomoću visokoafinitetne interakcije između nikla i heksahistidinskog markera na teškom lancu Fab. Posle ispiranja, ekspandovani sloj je bio preveden u pakovani sloj, a Fab je bio eluiran sa 20 mM borata, 150 mM NaCI, 200 mM imidazola, 0.01% NaN3, pH 8.0 pufera koji je strujao u smeru naniže.
[0377]Drugi korak u prečišćavanju je primenjivao jonoizmenjivačku hromatografiju (IEC). Q Sepharose FastFlovv smola (Pharmacia, Piscataway, NJ.) je bila uravnotežena u 20 mM borata, 37.5 mM NaCI, 0.01% NaN3, pH 8.0. Fab pul od eluiranja iz EB-IMAC koraka je bio razređen četvorostruko u 20 mM borata, 0.01% NaN3, pH 8.0 i stavljen je na IEC kolonu. Posle ispiranja, Fab je bio eluiran sa 37.5-200 mM NaCI gradijentom soli. Frakcije od eluiranja su bile evaluirane u pogledu čistoće uz korišćenje Xcell II™ SDS-PAGE sistema (Novex, San Diego, Calif.) pre objedinjavanja. Konačno, Fab pul je bio koncentrovan i dijafiltriran u 20 mM borata, 150 mM NaCI, 0.01% NaN3, pH 8.0 pufera za čuvanje. Ovo je bilo ostvareno u Sartocon Sliče™ sistemu opremljenom sa 10,000 MWCO kasetom (Sartorius, Bohemia, N.Y.). Prinosi finalnog prečišćavanja su iznosili obično 50%. Koncentracija prečišćenog Fab je bila izmerena pomoću UV apsorbanse na 280 nm, pretpostavljajući apsorbansu od 1.6 za rastvor od 1 mg/ml.
PRIMER 7: SPECIFIČNOST MONOKLONSKIH ANTITELA ZA BST1 ODREĐENA ANALIZOM
PROTOČNOM CITOMETRIJOM
[0378]Analiza protočnom citometrijom je bila izvršena na CD33+ ćelijama periferne krvi od AML pacijenata uz korišćenje kozjeg poliklonskog antitela sc7113 (Santa Cruz Biotechnologv, Ine, CA). Komparativne FACS studije su bile takođe izvedene na podskupu humanih leukocita poređenjem BST1 sa CD33.
[0379]Specifičnost antitela protiv BST1 selekcionisanih u Primeru 6 je takođe bila testirana protočnom citometrijom. Da bi se testirala sposobnost antitela da vezuju za ćelijsku površinu BST1 proteina, antitela su bila inkubirana sa ćelijama koje izražavaju BST1, H226 (humani skvamozni karcinom pluća) i A549 (humani adenokarcinom pluća). Ćelije su bile isprane u FACS puferu (DPBS, 2% FBS), pa su centrifugirane i resuspendovane u 100pl razređenog primarnog BST1 antitela (takođe razređenog u FACS puferu). Kompleks antitelo-A549 i kompleks antitelo-H226 su bili inkubirani na ledu tokom 60 min, a onda su bili isprani dva puta sa FACS puferom kao što je opisano gore. Peleta ćelije-antitelo je bila resuspendovana u 100pl razređenog sekundarnog antitela (takođe razređenog u FACS puferu) i inkubirana je na ledu tokom 60 min. Peleta je bila isprana kao i pre, pa je resuspendovana u 200pl FACS pufera. Uzorci su bli stavljeni na BD FACScanto II protočni citometar, a podaci su analizirani korišćenjem BD FACSdiva softvera. Vezivanje BST1_A1 i BST1_A2 za BST1 izraženo na A549 i H226 ćelijama je bilo analizirano korišćenjem protočne citometrije.
REZULTATI
[0380]Fig. 4a prikazuje analizu protočnom citometrijom za 6 AML uzoraka. Ona prikazuje CD33+ perifernih krvnih ćelija AML pacijenata obojenih sa anti-BST1 antitelima (neobojena površina ispod krive), ili obojenih (siva površina). Rezultati prikazuju pozitivno bojenje sa anti-BST1 antitelom kod 6 od 6 AML pacijenata.
[0381]Fig. 4b prikazuje analizu protočnom citometrijom za BST1 i CD33 na podskupu humanih leukocita. Rezultati otkrivaju uporedivi profil vezivanja za dva cilja u ovim klasama ćelija. Jako vezivanje BST1 je bilo uočeno kod granulocita i monocita, od kojih se oba mogu povezati i aktivirani su u bolestima kao što su astma, giht, kron, lupus i dijabetes. Monociti su takođe uključeni u razvoj aterosklerotičnih plakova.
[0382]Rezultati analize protočnom citometrijom su pokazali da se 4 monoklonska antitela označena sa BST1A1 i BST1A2 vezuju efektivno za humani BST1 na ćelijskoj površini. Fig. 4c prikazuje specifičnosti vezivanja i BST1A1, i BST1A2 za BST1 na A549 i H226 ćelijama, respektivno. Rezultati ukazuju na jako vezivanje ovih antitela protiv BST1 na A549 i H226.
PRIMER 8: STRUKTURNA KARAKTERIZACIJA MONOKLONSKIH ANTITELA ZA TIROZIN-PROTEINSKI KINAZNI TRANSMEMBRANSKI RECEPTOR BST1
[0383]cDNK sekvence koje kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca BST1A1 i BST1A2 monoklonskih antitela su bile dobijene uz korišćenje standardnih PCR tehnika i bile su sekvencirane uz korišćenje standardnih tehnika sekvenciranja DNK.
[0384]Sekvence antitela se mogu mutagenizovati da bi se vratili nazad ostaci germinativnih linija na jednom ili više ostataka.
Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca BST1A1 su SEQ ID NO:
18 i 14, respektivno.
Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca BST1A1 su SEQ ID NO:
19 i 15, respektivno.
Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca BST1A2 su SEQ ID NO:
20 i 16, respektivno.
Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca BST1A2 su SEQ ID NO:
21 i 17, respektivno.
PRIMER 9: INTERNALIZACIJA I MABZAP ZA BST1 A1 I BST1 A2 U A549 I H226 ĆELIJAMA.
[0385]Internalizacija BST1_A1 i BST1_A2_ sa H226 i A549 su bile ispitane uz korišćenje MabZap testa. MabZAP test je pokazao internalizaciju anti-BST1 monoklonskih antitela putem vezivanja anti-humanog IgG sekundarnog antitela konjugovanog sa toksinom saporinom. (Advanced Targeting Svstem, San Diego, CA, IT-22-100). Prvo je BST1 Fab bio vezan za površinu ćelija. Onda su MabZAP antitela bila vezana za primarna antitela. Sledeće, MabZAP kompleks je bio internalizovan pomoću ćelija. Ulazak saporina u ćelije je rezultovao inhibicijom sinteze proteina i eventualnom smrti ćelija.
[0386]MabZAP test je bio izveden kao što sledi. Svaka od ćelija je bila zasejana sa gustinom od 5x10<3>ćelija po bunarčiću. Anti-BST1 monoklonsko antitelo ili izotipski kontrolni humani IgG je bio serijski razređen, pa je onda dodat ćelijama i one su inkubirane tokom 15 min na 25°C. Onda je bio dodat MabZAP, pa je bilo izvršeno inkubiranje tokom 72h na 37°C. Vijabilnost ćelija u pločama je bila detektovana sa CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viabilitv Test kitom (Promega, G7571), a ploče su bile očitane i analizirane uz korišćenje Promega Glomax. Smrt ćelija je bila proporcionalna koncentraciji anti-BST1 monoklonskih antitela. Fig. 5a i 5b prikazuju da su anti-BST1 monoklonska antitela, BST1A1 i BST1A2 bila efikasno internalizovana pomoću H226 i A549 ćelija, u poređenju sa anti-humanim IgG izotipskim kontrolnim antitelom.
PRIMER 10: SPECIFIČNOST MONOKLONSKIH ANTITELA ZA BST1 ODREĐENA ANALIZOM
PROTOČNOM CITOMETRIJOM KOD AML PACIJENATA
[0387]Sposobnost BST_A2 da se vezuje za limfoblaste pacijenata sa AML je bila testirana analizom protočnom citometrijom. Krv je bila uzeta od 20 AML pacijenata. Korišćenjem procedure koja je opisana u Primeru 7, bilo je pokazano da se BST_A2 vezuje za AML blaste pribl. 80% AML pacijenata.
PRIMER 11 CELULARNA CITOTOKSIČNOST ZAVISNA OD ANTITELA POSREDOVANA SA ANTI-BST1 MABS
[0388]Prvo je bilo dodato 25ul parentalnih i nefukozilovanih anti-BST1 antitela (BST1_A2 i BST1A2 NF) u koncentracijama u opsegu od 10nm/L do 0.1 nm/L u posebne bunarčiće ploče sa 96 bunarčića sav dnomzajedno sa 50pl A549 i U937 ćelija (histiocitnih ćelija limfoma) koje su izražavale BST1. Onda je bilo dodato 25pl efektorskih ćelija u bunarčiće da bi se dobio finalni efektor: ciljni (E: T) odnos od 10:1 i 25:1. Ploča je onda bila nežno obrtana na 1000rpm tokom 2 minuta, posle čega je bila inkubirana tokom 4h u 37°C, 5% C02 inkubatoru. 3h posle inkubacije je bilo dodato 10pl rastvora za lizu u svaki od bunarčića koji je sadržao ćelije koje su izražavale BST1 da bi se izmerilo maksimalno oslobađanje LDH, a jedna grupa bunarčića je sadržala samo medijum za zapreminsku korektivnu kontrolu.
[0389]Posle inkubacije, ćelije su bile blago obrtane na 1000rpm tokom 2 minuta, posle ćega je 50pl supernatanta bilo preneto u ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. Korišćenjem CytoTox 96® neradioaktivnog citotoksičnog testa koji se može nabaviti od firme Promega (Cat #: G1780), komponente kita su bile rekonstituisane u skladu sa specifikacijama proizvođača, a onda je bilo dodato 50 pl mešavine supstrata u svaki bunarčić. Ploča je onda bila pokrivena i ostavljeno je da se inkubira tokom 30 minuta na 25°C zaštićena od svetlosti. Posle ovoga je bilo dodato 50 pl zaustavnog rastvora u svaki bunarčić, pa je snimljena apsorbansa na 490nm uz korišćenje varioskan čitača ploča.
[0390]Korišćenjem antitela za koje je poznato da podstiče ubijanje ćelija pomoću ADCC kao pozitivne kontrole i humane lgG1 izotipske kontrole kao negativne kontrole, rezultati pokazuju da su BST1A2 i BST1_A2_NF mogli da pobude ADCC na A549 i U937 ćelijama koje su izražavale BST1. Na A549 ćelijama koje su izražavale BST1, BST1A2 NF je ispoljio približno 45% ubijanje za 10nmol/L (Fig. 6). Na U937 ćelijama koje su izražavale BST1, BST1A2 je ispoljio približno 20% ubijanje za 1nmol/L i BST1A2 NF je ispoljio približno 45% ubijanje za 1nmol/L (Fig. 6b), čime je pokazano da bi BST1_A2_NF mogao imati terapeutski efekat kod pacijenata sa AML i kancerom pluća.

Claims (13)

1.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela koji se vezuju za BST1 za primenu u lečenju ili profilaksi bolesti izabrane iz liste koja se sastoji od akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije B-ćelija, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća ili kancera pankreasa.
2.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuta bolest akutna mijeloidna leukemija (AML).
3.Antitelo za primenu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo.
4.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela himerično antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, jednolančano antitelo, defukozilovano antitelo ili bispecifično antitelo.
5.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela sadrži ili je konjugovano sa terapeutskom grupom; a prvenstveno, pri čemu je terapeutska grupa citotoksična grupa ili radioaktivni izotop; pri čemu je antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela opciono konjugat antitelo-lek.
6.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu afinitetni reagens pobuđuje jednu ili više ćelijskih citotoksičnosti zavisnih od antitela (ADCC), citotoksičnosti zavisnih od komplementa (CDC) i/ili citotoksičnosti zavisnih od T-ćelija.
7.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela indukuje apoptozu ćelija kancera, ubija ili smanjuje broj matičnih ćelija kancera i/ili ubija ili smanjuje broj cirkulišućih ćelija kancera.
8.Antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela moduliše fiziološku funkciju BST1, inhibira vezivanje liganda za BST1 i/ili inhibira put transdukcije signala posredovan sa BST1.
9.Postupak detekcije, dijagnostikovanja i/ili skrininga bolesti, pri čemu se BST1 izražava u pomenutoj bolesti, ili praćenja efekta leka ili terapije, pri čemu se BST1 izražava u pomenutoj bolesti, u uzorku dobijenom od subjekta koji sadrži; detekciju prisustva ili nivoa BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, koji sadrži detekciju promene njegovog nivoa kod pomenutog subjekta; pri čemu je pomenuta bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije B-ćelija, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, kancera glave i vrata, kancera pluća, i kancera pankreasa.
10.Postupak prema zahtevu 9, koji sadrži detekciju prisustva BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, u kome je (a) prisustvo povišenog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata kod subjekta u poređenju sa nivoom kod zdravog subjekta, ili (b) prisustvo detektabilnog nivoa BST1 ili pomenutog jednog ili više njegovih fragmenata kod subjekta u poređenju sa odgovarajućim nedetektabilnim nivoom kod zdravog subjekta indikator prisustva kancera, pri čemu se BST1 izražava u pomenutom kanceru, kod pomenutog subjekta.
11.Postupak prema zahtevu 9 ili 10, se prisustvo BST1, ili jednog ili više njegovih fragmenata, detektuje primenom antitela, njegovog funkcionalnog fragmenta ili mimetika antitela koji se vezuje za BST1; a prvenstveno antitela, njegovog funkcionalnog fragmenta ili mimetika antitela definisanih u jednom od zahteva 3 ili 4.
12.Postupak prema zahtevu 11, pri čemu antitelo, njegov funkcionalni fragment ili mimetik antitela sadrži detektabilni marker ili je konjugovan sa njim.
13.Primena prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili postupak prema bilo kom od zahteva 9 do 12, pri čemu je subjekt čovek.
RS20170147A 2011-06-28 2012-06-28 Terapeutski i dijagnostički cilj RS55716B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161502160P 2011-06-28 2011-06-28
PCT/IB2012/001680 WO2013001369A2 (en) 2011-06-28 2012-06-28 Therapeutic and diagnostic target
EP12770215.7A EP2726094B1 (en) 2011-06-28 2012-06-28 Therapeutic and diagnostic target

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55716B1 true RS55716B1 (sr) 2017-07-31

Family

ID=47008644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170147A RS55716B1 (sr) 2011-06-28 2012-06-28 Terapeutski i dijagnostički cilj

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9447178B2 (sr)
EP (1) EP2726094B1 (sr)
JP (1) JP6113721B2 (sr)
CY (1) CY1118596T1 (sr)
DK (1) DK2726094T3 (sr)
ES (1) ES2615256T3 (sr)
HR (1) HRP20170220T1 (sr)
HU (1) HUE033713T2 (sr)
LT (1) LT2726094T (sr)
ME (1) ME02632B (sr)
PL (1) PL2726094T3 (sr)
PT (1) PT2726094T (sr)
RS (1) RS55716B1 (sr)
SI (1) SI2726094T1 (sr)
SM (2) SMT201700103T1 (sr)
WO (1) WO2013001369A2 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9175092B2 (en) 2011-06-28 2015-11-03 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies to bone marrow stromal antigen 1
US10072300B2 (en) 2013-05-21 2018-09-11 Biomerieux Kit for the prognosis of colorectal cancer
CN110393790B (zh) * 2018-04-24 2023-03-28 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 促黄体生成素在抑制髓系白血病发展的用途
CN113640520A (zh) * 2021-07-16 2021-11-12 南方医科大学珠江医院 一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用
WO2023135177A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 T.J.Smith And Nephew, Limited Self-calibration with dynamic therapy performance for negative pressure wound therapy devices
EP4499143A4 (en) * 2022-03-31 2025-07-16 Univ Ramot TARGETING IMMUNE INFILTRATION IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM (CNS)

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
CA1323293C (en) 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
IL91501A (en) 1988-09-02 1998-03-10 Dyax Corp Generation of a variegated library of mutant potential binding proteins and screening of said library for proteins with a desired binding activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9106048D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DE69123848T2 (de) 1990-10-22 1997-07-10 Abbott Lab Stabile sauerstoff-freie reagenzienlösung für diagnostik
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2223040T3 (es) 1991-04-10 2005-02-16 The Scripps Research Institute Bibliotecas de receptor heterodimerilo que usan fagemidos.
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP2224006A1 (en) 1991-12-02 2010-09-01 MedImmune Limited Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2148252C (en) 1992-10-30 2007-06-12 Roger Brent Interaction trap system for isolating novel proteins
US5807683A (en) 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5738996A (en) 1994-06-15 1998-04-14 Pence, Inc. Combinational library composition and method
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
GB9608510D0 (en) 1996-04-25 1996-07-03 Medical Res Council Calcium dependent binding ligands
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US6555310B1 (en) 1997-04-04 2003-04-29 Biosite Diagnostics, Inc. Polyclonal libraries
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6602684B1 (en) 1998-04-20 2003-08-05 Glycart Biotechnology Ag Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JPH11310596A (ja) * 1998-04-28 1999-11-09 Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk 骨髄間質細胞抗原結合蛋白質
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
AU2002218166A1 (en) 2000-09-08 2002-03-22 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP3690043A1 (en) 2000-10-06 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US7087600B2 (en) 2001-05-31 2006-08-08 Medarex, Inc. Peptidyl prodrugs and linkers and stabilizers useful therefor
JP4303105B2 (ja) 2001-06-28 2009-07-29 ドマンティス リミテッド 二重特異性リガンドとその利用
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
AU2003236022A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells with modified genome
EP2135879A3 (en) 2002-06-28 2010-06-23 Domantis Limited Ligand
BRPI0316092B8 (pt) 2002-11-08 2021-05-25 Ablynx Nv anticorpos de domínio único direcionados contra o fator de necrose tumoral alfa e usos para os mesmos
AU2003290330A1 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
AU2004239065B2 (en) 2003-05-14 2008-05-15 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
EP1639011B1 (en) 2003-06-30 2008-11-12 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies (dAb)
CA2543360A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Joost A. Kolkman Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
JP2005295921A (ja) 2004-04-14 2005-10-27 Pharma Design Inc 新規ｂｓｔ１選択的スプライシング変異体及びその用途
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
MX2007005884A (es) 2004-11-16 2008-02-12 Amgen Mountain View Inc Andamios de proteina y usos de los mismos.
JP2008528010A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
CA2605781A1 (en) 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
US7521195B1 (en) * 2005-07-21 2009-04-21 Celera Corporation Lung disease targets and uses thereof
JP2009509535A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
JP2011509079A (ja) 2007-12-24 2011-03-24 オックスフォード ビオトヘラペウトイクス エルティーディー． エフリンａ型受容体１０タンパク質
WO2011027310A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Novel tumor markers
US9002545B2 (en) 2011-01-07 2015-04-07 Wabtec Holding Corp. Data improvement system and method
US9175092B2 (en) 2011-06-28 2015-11-03 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies to bone marrow stromal antigen 1

Also Published As

Publication number Publication date
US20140193333A1 (en) 2014-07-10
HRP20170220T1 (hr) 2017-04-07
SMT201700103T1 (it) 2017-03-08
PL2726094T3 (pl) 2017-06-30
JP2014527034A (ja) 2014-10-09
HUE033713T2 (en) 2017-12-28
ES2615256T3 (es) 2017-06-06
JP6113721B2 (ja) 2017-04-12
EP2726094A2 (en) 2014-05-07
CY1118596T1 (el) 2017-07-12
SI2726094T1 (sl) 2017-04-26
ME02632B (me) 2017-06-20
SMT201700103B (it) 2017-03-08
EP2726094B1 (en) 2016-12-14
US9447178B2 (en) 2016-09-20
WO2013001369A4 (en) 2013-07-11
WO2013001369A3 (en) 2013-05-16
WO2013001369A2 (en) 2013-01-03
PT2726094T (pt) 2017-02-10
DK2726094T3 (en) 2017-02-06
LT2726094T (lt) 2017-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7479435B2 (ja) 癌治療および判断ターゲットとしてのｌｙ７５
US20210079114A1 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents
US9447178B2 (en) Therapeutic and diagnostic target
EP2958590B1 (en) Bispecific antibody binding to naaladl2 and cd3 for use as a therapeutic in treating prostate cancer
US20150210770A1 (en) Therapeutic and diagnostic target
HK1196092B (en) Therapeutic and diagnostic target
HK1196092A (en) Therapeutic and diagnostic target
NZ710248B2 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents