[go: up one dir, main page]

RS55595B1 - Metode lečenja dijabetesa sa dll4 antagonistima - Google Patents

Metode lečenja dijabetesa sa dll4 antagonistima

Info

Publication number
RS55595B1
RS55595B1 RS20170036A RSP20170036A RS55595B1 RS 55595 B1 RS55595 B1 RS 55595B1 RS 20170036 A RS20170036 A RS 20170036A RS P20170036 A RSP20170036 A RS P20170036A RS 55595 B1 RS55595 B1 RS 55595B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antagonist
antibody
seq
mice
cells
Prior art date
Application number
RS20170036A
Other languages
English (en)
Inventor
Dimitris Skokos
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55595B1 publication Critical patent/RS55595B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

POZADINA PRONALASKA
Oblast pronalaska
[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na delta-slične ligand 4 (D114) antagoniste za upotrebu u postupcima za lečenje diabetes mellitusa tipa 1. Postupci mogu da spreče, leče ili poboljšaju dijabetes blokiranjem vezivanja D114 za Notch receptor sa D114 antagonistima, na taj način povećavajući broj T regulatornih ćelija. Osim toga, pronalazak se odnosi na D114 antagoniste za upotrebu u postupcima za snižavanje nivoa glukoze u krvi.
Opis srodne tehnike
[0002]Interakcije između Notch receptora i njihovih liganada predstavljaju evoluciono konzervativan put važan ne samo za odluke ćelijske sudbine, ali i u regulisanju odluka loze u hematopoezi i timusa u razvoju (Artavanis-Tsakonas et al., 1999, Science 284: 770-776; Skokos et al, 2007; J Exp Med 204:1525-1531; i Amsen et al, 2004, Cell 117: 515-526). Nedavno je pokazano da D114-Notchl inhibicija vodi do potpunog bloka u razvoju T-ćelija praćeno ektopičnom pojavom B ćelija i ekspanzijom dendritskih ćelija (DC) koje mogu nastati iz Pro-T ćelija do DC sudbinske konverzije unutar timusa (Hozumi et al, 2008, J Exp Med 205 (11):2507-2513; Koch et al, 2008, J Exp Med 205(11):2515-2523; i Fcvcrabcnd ct al., 2009, Immunity 30: 1-13). Prema tome, postoji akumulirani dokaz da je Notch signalizacija kritična za određivanje sudbinskih odluka ćelija iz hematopoetskih progenitorskih ćelija. Staviše, povratna kontrola regulatorne T ćelijske (Treg) homeostaze pomoću DCsin vivoje pokazana (Darrasse Jeze et al., 2009, J Exp Med 206(9): 1853-1862). Međutim, uloga Notch signalizacije u kontroli porekla i razvoja DC ćelija i posledično Treg homeostaze je još uvek nepoznata. Ovo pitanje je klinički važno zbog identifikovanja novih metoda za indukciju Treg ekspanzije koja se može koristiti kao tretman za autoimune bolesti i poremećaje.
[0003]Sekvence nukleinskih kiselina i amino kiselina humanog D114 (hD114) su prikazane u SEK ID BR(i): 1 i 2, respektivno. D114 antagonisti i njihova primena su opisani u WO 2007/143689, WO 2007/070671, WO 2008/076379, WO 2008/042236 i WO/2008/019144.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0004]Predmetni pronalazak je delom zasnovan na posmatranju od strane predmetnog pronalazača da je antitelo, koje specifično vezuje D114 i blokira vezivanje D114 za Notch receptore, u stanju da u potpunosti spreči progresiju Eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE) kod miševa, na životinjskom modelu za ljudsku multiplu sklerozu, dok kontrolno antitelo ne sprečava EAE. Nadalje, predmetni pronalazač je otkrio daje ovaj efekat anti-D114 antitela povezan sa povećanim brojem Treg ćelija. Pored toga, dalje je primećeno da anti-D114 antitelo sprečava povećanje nivoa glukoze u krvi i čuva broj i morfologiju pankrcasnih ostrvaca kod NOD/ ShiLtF miševa, na životinjskom modelu za dijabetes tipa 1 i takvi efekti su, bar delimično, posredovani širenjem T regulatornih ćelija.
[0005]Tako, u prvom aspektu, pronalazak karakteriše delta-like ligand 4 (D114) antagonistu za upotrebu u sprečavanju, lečenju ili poboljšanju diabetes mellitusa tipa 1 kod subjekta, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora i dijabetes je sprečen, lečen ili poboljšan i pri čemu je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
[0006]U drugom aspektu, pronalazak karakteriše upotrebu delta-like ligand 4 (D114) antagoniste u izradi leka za sprečavanje, lečenje ili poboljšanje diabetes mellitusa tipa 1 kod subjekta, pri čemu je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
[0007]U trećem aspektu, pronalazak karakteriše delta-like ligand 4 (D114) antagonistu za upotrebu u snižavanju nivoa glukoze u krvi povezanu sa diabetes mellitusom tipa 1 kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora i nivo glukoze u krvi je snižen i pri čemu je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
[0008]U četvrtom aspektu, pronalazak karakteriše upotrebu delta-like ligand 4 (D114) antagoniste u izradi leka za snižavanje nivoa glukoze u krvi udružene sa diabetes mellitusom tipa 1 kod subjekta, pri čemu je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
[0009]U jednoj realizaciji, D114 antagonist za takvu upotrebu koja je gore opisana je D114 antitelo ili njegov fragment ("anti-D114 At" ili "D114 At") koje specifično vezuje D114 sa visokim afinitetom i blokira vezivanje D114 za Notch receptore i/ili blokira D114-Notch signalne puteve. Antitelo može biti poliklonsko, monoklonsko (mAt), himerno, humanizovano ili u potpunosti humano antitelo ili njegov fragment. Fragment antitela može biti pojedinačni lanac antitela, Fab, ili (Fab')2.
[0010]U jednoj realizaciji, D114 At ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje epitop unutar N-terminalnog domena (ostaci S27-R172) ili Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) domen (ostaci V173-C217) ili N-terminalni-DSL domen (ostaci S27-C217), hD114 (SEK ID BR: 2). U sledećoj varijanti, D114 At ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje epitop unutar jednog od EGF domena, odnosno, oko aminokiselinskih ostataka Q218-N251 (domena 1), E252-D282 (domena 2), D284-E322 (domena 3), E324-E360 (domena 4), S362-E400 (domena 5), K402-E438 (domena 6), H440-E476 (domena 7), ili S480-E518 (domena 8), od hD114 (SEK ID BR: 2). U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela može vezati konformacioni epitop uključujući više od jednog od epitopa koji su gore nabrojani. D114 At ili njegov fragment može biti sposoban da veže humani D114 sa visokim afinitetom i ima ravnotežnu konstantu disocijacijc (KD) od oko 1 nM ili manje, oko 500 pM ili manje, oko 300 pM ili manje, oko 200 pM ili manje, oko 100 pM ili manje, ili oko 50 pM ili manje, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom.
[0011]U jednoj varijanti, D114 At ili njegov fragment sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca, HCDR1, HCDR2 i HCDR3, koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR(i): 22, 24 i 26, respektivno. U jednom drugom izvođenju, antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži tri regiona za utvrđivanje komplementarnosti lakog lanca, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR(i): 30, 32 i 34, respektivno. U sledećoj varijanti, D114 At ili njegov fragment obuhvata CDR sekvence teškog i lakog lanca koje sadrže jednu kombinaciju CDR sekvence iz SEK ID BR(i): 22, 24, 26, 30, 32 i 34. U još jednom izvođenju, D114 At sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20 ili 116, ili LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28 ili 118. U još jednom izvođenju, D114 At sadrži kombinaciju HCVR/LCVR od SEK ID BR: 20/28 (REGN281) ili 116/118 (REGN421).
[0012]U izvesnim izvođenjima, D114 At sadrži kombinaciju CDR1/CDR2/CDR3 teškog lanca i kombinaciju CDR 1 /CDR2/CDR3 lakog lanca odabranu od: SEK ID BR: 6/8/10 i SEK ID BR: 14/16/18, respektivno; SEK ID BR: 38/40/42 i SEK ID BR: 46/48/50, respektivno; SEK ID BR: 54/56/58 i SEK ID BR: 62/64/66, respektivno; SEK ID BR: 70/72/74 i SEK ID BR: 78/80/82, respektivno; SEK ID BR: 86/88/90 i SEK ID BR: 94/96/98, respektivno; i SEK ID BR: 102/104/106 i SEK ID BR: 110/112/114, respektivno. U drugom ostvarenju, D114 At sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 4, 36, 52, 68, 84, ili 100, ili LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 12, 44, 60, 76, 92 ili 108. U još jednom izvođenju, D114 At sadrži kombinaciju HCVR/LCVR izabranu iz: SEK ID BR: 4/12 (REGN279); SEK ID BR: 36/44 (REGN290); SEK ID BR: 52/60 (REGN306); SEK ID BR: 68/76 (REGN309); SEK ID BR: 84/92 (REGN310); i SEK ID BR: 100/108 (REGN289).
[0013]Nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence SEK ID BR(i): 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 i 118, su prikazane kao SEK ID BR(i): 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25, 27, 29,31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 i 117, respektivno.
[0014]U određenim izvođenjima, D114 antagonist iz pronalaska je fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen od D114 fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
[0015]U nekim izvođenjima, pronalazak karakteriše D114 antagonistu kao što je gore opisano za upotrebu u bilo kom postupku koji je gore opisan, pri čemu se D114 antagonist koprimenjuje istovremeno ili sekvencijalno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom, sredstvom za snižavanje glukoze u krvi (npr insulin, insulinski analozi, i slično), imunosupresivnim sredstvom ili imunosuprcsorom, anti-inflamatornim sredstvom, analgetikom i slično, od kojih mnogi mogu da imaju preklapajuće terapeutske efekte jedni sa drugima. Pogodni imunosupresanti koji se koriste u kombinaciji sa DLL4 antagonistom uključuju, ali nisu ograničeni na, glukokortikoide, ciklosporin, metotreksat, interferon P (IFN-beta), takrolimus, sirolimus, azatioprin, merkaptopurin, opijate, mikofenolate, TNF-vezujuće proteine, kao što su infliksimab, eternacept, adalimumab i slično, citotoksične antibiotike, kao što su daktinomicin, antraciklini, mitomicin C, bleomicin, mitramicin, i slično, antitela koja ciljaju imune ćelije, kao što su anti-CD20 antitela, anti-CD3 antitela, i slično. Pogodni antiinflamatorni agensi i/ili analgetici za kombinovane terapije sa antagonistima anti-D114 uključuju, kortikosteroide, nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID), kao što su aspirin, ibuprofen, naproksen i slično, TNF-a antagoniste, IL-1 antagoniste, IL-6 antagoniste, acetaminofen, morfinomimetike, i slično.
[0016]Takođe ovde opisan je jedan farmaceutski preparat koji sadrži jedan antagonist D114, najmanje jedan dodatni terapeutski agens i jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom izvođenju, D114 antagonist je jedno D114 At ili njegov fragment koji se specifično vezuje za D114 sa visokim afinitetom i neutrališe D114 aktivnosti i najmanje jedan dodatni terapeutski agens koji je neki od agenasa za snižavanje glukoze, imunosupresanata, anti-inflamatornih agenasa, analgetika, i slično, gore opisanih.
[0017]Takođe ovde je opisan jedan komplet koji sadrži jedan kontejner koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema sadašnjem pronalasku i jedan dodatak pakovanju sa uputstvom za upotrebu. Komplet može da sadrži jedan kontejner koji u njemu sadrži antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114, drugi kontejner koji u njemu sadrži najmanje jedan dodatni terapeutski agens gore opisan.
[0018]Drugi ciljevi i prednosti postaće očigledne iz pregleda sledećeg detaljnog opisa.
KRATAK OPIS SLIKA
[0019] SI. 1A-1Bprikazuju efekte D114 blokade na razvoj T ćelija i B ćelija. Miševima su injektovana anti-D114 antitela (REGN577) ili kontrolni humani Fc fragment (hFc). Četrnaest dana kasnije, timus se sakupi i podgrupe T-ćelija i B-ćelija su ocenjene protočnom citometrijom.SI. 1A:tačkasti dijagrami pokazuju broj CD4 CD8" (dvostruko negativni prekusori timusa ili "DN"), CD4 CD8+
(dvostruko pozitivni prekusori timusa ili "DP"), CD4<+>ili CD8<+>(pojedinačni pozitivni prekusori timusa ili "SP") i DN/CD44<+>CD25" (prekusori timusa u DN1 fazi) T ćelija. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju procenat (srednja vrednost ± SEM) subpopulacije T ćelija među
ukupnim ćelijama timusa. SI. 1 B: Histogrami pokazuju procenat (srednja vrednost ± SD) B ćelija (B220<+>) među DN1 ćelijama (t.j., usmerenih na CD4"CD8" CD44<+>CD25").
SI. 2A-2Bprikazuju efekte D114 blokade na razvojne faze B ćelija u koštanoj srži (SI. 2A) i na B ćelijsku homeostazu u slezini (SI. 2B). Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju procente (srednja vrednost ± SEM) podskupova B ćelija između ukupnih ćelija u koštanoj srži ili u slezini. GC: Germinalni centar B ćelija; TI i T2: B ćelijske podgrupe; M: Marginalne B ćelije; i Fo: folikularne B ćelije.
SI. 3A-3Dprikazuju efekte D114 blokade na razvoj dendritskih ćelija (DC). SI. 3A: Tačkasti dijagrami pokazuju proširenje konvencionalnih DC-a ("cDCs"; B220"CD11C<+>) i
plazmacitoidnih DC-a ("pDCs"; PDCA1<+>B220<+>CD11C<+>) u timusu nakon tretmana sa D114 At. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) DC ćelija među ukupnim ćelijama u 14 danu. SI.3B:Pločasti dijagrami pokazuju kinetiku cDC i pDC ekspanzije u timusu kod D114 At-tretiranih miševa (■) i hFc-kontrolnih miševa koji su tretirani (□). SI. 3C: Tačkasti dijagrami pokazuju efekte D114 At napre-DCs (MHCII<lo>CDllc<int>CD135<+>Sirp-a<mt>) i kasni pre-DCs (MHCIIloCDl lcint) u timusu. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) pre-DCs među ukupnim ćelijama u 14-om danu.Fig. 3D:Tačkasti dijagrami pokazuju prisustvo MHCII<lo>CDllc<int>DCs u DN1 (CD4CD8CD44<+>CD25) pro-T ćelijske populacije u timusu miša tretiranog sa D114 At, ali ne u timusu miševa tretiranih sa hFc kontrolnim At. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečan broj (srednja vrednost ± SEM) od MHCIlloCDl lcint DCs među DN1 pro-T ćelijskom populacijom u 3-em danu.
SI. 4 prikazuje efekat D114 blokade na razvoj unutar timusa alternativne DC loze u nezrele DCs(imDCs) koje potiču od zajedničkog T/ DC DN1 progenitora. DN1 CD45.1<+>Lin" sortirane ćelije su unutar timusa prebačene u CD45.2<+>domaćine miševa tretiranih sa D114 At (■) ili hFc kontrolnim At (□).
SI. 5 prikazuje efekat D114 blokade na serumske nivoe CSF-1 (M-CSF), ključnog citokina uključenog u razvoj DC. Serumski CSF-1 nivoi kod miševa ne tretiranih (<B>), ili tretiranih sa kontrolnim izotipskim At (n), ili D114 At (■) su mereni en zimski-povezan im immunosorbentnim testom (ELISA).
SI. 6 prikazuje efekte brisanja genetskog D114, nakon tamoksifen tretmana, na B ćeliji i DC homeostaze kod DLL4COIN miševa koji sadrže tamoksifen-inducibilni Cre rekombinaze konstrukt, CreERT2. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) B ćelija i pDCs i cDCs između ukupnih ćelija u timusa.
SI.7A-7Cprikazuju efekte D114 blokade/brisanja na Treg homeostazu. SI. 7A: Tačkasti dijagrami pokazuju proširenje Tregs unutar timusa miševa tretiranih sa D114-At tokom dve nedelje u poređenju sa miševima tretiranim sa hFc kontrolnim At. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) od Tregs među CD3<+>CD4<+>T ćelijama u timusu. SI. 7B: Pločasti grafikoni pokazuju kinetiku razvoja Treg u timusu (gornji panel) i slezini (donji panel), respektivno, kod miševa tretiranih sa D114 At (■) i hFc kontrolnim At (□). SI. 7C: Tačkasti dijagrami pokazuju proširenje Tregs unutar timusa kod DLL4COIN miševa tretiranih sa tamoksifenom (TAM) u odnosu na kontrolne DLL4COIN tretirane kontrolnim kukuruznim uljem. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) od Tregs među CD3CD4+ T ćelija u timusu.
SI. 8A-8B prikazuju efekte D114 blokade na DC (SI. 8A) i Treg homeostazu (SI. 8B) u timusu miševa koji eksprimiraju humani D114 (hD114) uočen u danima 7 i 14 nakon tretmana sa D114-At (REGN421) (1 mg/kg ili 5 mg/kg) ili hFc tretmana (5 mg/kg), dva puta nedeljno tokom 2 nedelje i 28-og dana nakon prestanka lečenja. Brojevi u tačkastim dijagramima predstavljaju prosečne procente (srednja vrednost ± SEM) od pDCs i cDCs (SI. 8A) ili Tregs (SI. 8B) među ukupnim ćelijama u timusu.
SI. 9A-9B prikazuju efekte D114 blokade u Eksperimentalnom autoimunom Encefalomijelitisu (EAE) mišjeg modela. SI. 9A: Grafikon prikazuje stopu učestalosti EAE bolesti (%) po grupi za tretman. SI. 9B: Grafikon prikazuje razvoj EAE na osnovu prosečnog bodovanja bolesti. Tretman je bio sa anti-D114 At (REGN577) pre-indukcijom (▼); pre-indukcija izotipskim kontrolnim At (♦);
REGN577 post-indukcija (A); ili anti-VLA-4 At (PS/2) pre-indukcija (■).
SI. 10 prikazuje efekte D114 blokade na IL-17 i produkciju IFN-y u limfnim čvorovima EAE miševa. Nivoi IL-17 (levi panel) i IFN-y (desni panel) u limfnim čvorovima EAE miševa tretiranih sa D114 At (■) ili hFc kontrolnim At (□) su mereni u danima 12 i 18 pomoću ELISA.
SI. 11A-11 E prikazuju efekte D114 At kod NOD mišjeg dijabetičnog modela. SI. 11 A prikazuje % učestalosti dijabetesa (dva uzastopna čitanja nivoa glukoze u krvi veća od 250 mg/dl) među miševima koji su primili ili hFc kontrolno At (•) ili anti-D114 At (REGN577) (■) u 9 nedelji starosti. % učestalosti dijabetesa kod pet miševa koji su lečeni sa D114 At i potom injektovani sa PC61 At u 20 nedelji je takođe prikazan (♦). PC61 At je jedno anti-CD25 antitelo koje smanjuje Treg ćelije. SI. 11 B prikazuje merenje pomoću ELISA stvaranja anti insulinskih autoantitela (□) i anti-glutaminske kiseline dekarboksilaze 65 (GAD65) autoantitela (■) kod NOD miševa tretiranih sa D114 At ili hFc kontrolom, u poređenju sa netretiranim miševima divljeg tipa (WT). SI. 11 C prikazuje sekcije pankreasa bojene sa hematoksilinom i eozinom (H & E) kod NOD miševa tretiranih sa D114 At (levi panel) ili hFc kontrolom (desni panel). Crne strelice ukazuju na pojedinačna ostrvca pankreasa i bela strelica ukazuje na infiltraciju ćelija u okviru ostrvca (desni panel). SI. 11 D prikazuje broj ostrvaca pankreasa (levi panel) ili % ubačenih ostrvaca pankreasa (desno) u pankreasu hFc kontrolno-tretiranog (□) ili D114 At tretiranih (■) miševa. SI. 11 E prikazuje promene u nivou glukoze u krvi kod tretiranih miševa, na početku bolesti, sa D114 At (•) ili hFc kontrolom (□), više od 42 dana nakon tretmana.
DETALJAN OPIS
[0020] Pre nego što su sadašnji postupci opisani, potrebno je da se razume da ovaj pronalazak nije ograničen na posebne metode i eksperimentalne uslove koji su opisani, pošto takve metode i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti daje terminologija ovde korišćena samo u svrhu opisivanja određenih realizacija, a nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim sadašnjeg pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
[0021]Kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "jedan", "izvcstan" i "taj" uključuju množinu referenci ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na "jedan postupak" uključuje jednu ili više metoda, i / ili tipa koraka ovde opisanih i/ili koji će postati očigledni prosečnim stručnjacima u tehnici nakon čitanja ovog opisa.
[0022]Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje obično podrazumeva onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Mada se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni sa onima ovde opisanim mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani.
Definicije
[0023]Izraz "D114 antagonisti", kako se ovde koristi, uključuje antitela prema D114 i njihove fragmente sposobne za blokiranje vezivanja D114 za jedan Notch receptor (kao što su Notch 1 i Notch4) i/ili blokiranje D114-Notch signalnih puteva (videti, na primer, WO 2008/076379), fuzioni proteini sadrže ekstracelularni domen D114 fuzionisan za multimerizovanu komponentu, ili njihove fragmente (videti, na primer, Američku patentnu publikaciju br. 2006/0134121 i 2008/0107648), peptidi i tela peptida (videti, na primer, US patent br 7,138,370.), i slično, koji blokiraju interakciju između D114 i jednog Notch receptora. Izraz takođe obuhvata antagoniste, kao što su mali molekuli, antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, i slično, koja specifično vezuju Notch receptore (npr anti-Notch 1 antitela, anti-Notch4 antitela, itd) i blokiraju D114 -Notch signalne puteve.
[0024]Izraz "antitelo", kako se ovde koristi, namerava da se odnosi na molekule imunoglobulina koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca povezana međusobno disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od jednog varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili Vu) i jednog konstantnog regiona teškog lanca (Cn). Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VHi VLregioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), protkane sa regionima koji su konzervativniji, koji se nazivaju okvirni regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, uređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa prema sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.
[0025]Metode i tehnike za identifikaciju CDR-a unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su poznate u tehnici i mogu se primeniti za identifikaciju CDR-a unutar određenog HCVR i/ ili LCVR aminokiselinskih sekvenci ovde opisanih. Konvencije koje se mogu koristiti za identifikaciju granica CDR-a uključuju Kabat definiciju, definiciju Chothia, i definiciju AbM. Uopšteno govoreći, definicija Kabat je zasnovana na varijabilnosti sekvence, definicija Chothia je zasnovana na lokaciji strukturnih regiona petlje, a AbM definicija je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Videti, na primer, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Nacionalnog instituta za zdravlje, Bethesda, Md. (1991); Al- Lazikani et al, J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); i Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikaciju CDR sekvenci u izvestnom antitelu.
[0026]Supstitucija jednog ili više CDR ostataka ili izostavljanje jednog ili više CDR-a je takođe moguće. Antitela su opisana u naučnoj literaturi u kojima jedan ili dva CDR-a mogu biti izostavljena za vezivanje. Padlan et al. (1995 FASEB J, 9: 133-139) su analizirali kontaktne regione između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih kristalnih struktura, i zaključili da samo oko jedne petine do jedne trećine CDR ostataka u stvari kontaktiraju antigen. Padlan je takođe pronašao mnoga antitela u kojima jedan ili dva CDR-a nisu imali nikakve aminokiseline u kontaktu sa antigenom (videti takođe, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:. 415-428).
[0027]CDR ostaci koji ne dodiruju antigen se mogu identifikovati na osnovu prethodnih studija (npr ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu obavezni), iz regiona Kabat CDRs koji leže izvan Chothia CDRs, molekulskim modelovanjem i/ili empirijski. Ako su jedan CDR ili njegov ostatak (-ci) izostavljeni, obično su supstituisani sa aminokiselinom koja zauzima odgovarajući položaj u drugoj sekvenci humanog antitela ili konsenzusom takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju u CDRs i aminokiseline za supstituciju se mogu odabirati empirijski.
Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili ne-konzervativne supstitucije.
[0028]Izraz "antitelo" takođe obuhvata antitela koja sadrže modifikovani model glikozilacije. U nekim primenama, modifikacija za uklanjanje neželjenih mesta glikozilacije može biti korisna, ili na primer, uklanjanje fukoznih grupa za povećanje funkcije antitelom zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC)
(videti Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). U drugim primenama, uklanjanje mesta N-glikozilacije može da smanji neželjene imune reakcije protiv terapeutskih antitela ili da poveća afinitet antitela. U još drugim aplikacijama, modifikacija galaktozilacije može se izvršiti u cilju modifikacije komplementom zavisne citotoksičnosti (CDC).
[0029]Izraz "antigen-vezujući fragment" antitela (ili jednostavno "fragment antitela"), kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za hD114, ili za bilo koje druge nameravane ciljne proteine. Fragment antitela može da uključuje jedan Fab fragment, jedan F(ab')2fragment, jedan Fd fragment, jedan Fv fragment, jedan jednolančani Fv (scFv) molekul, jedan dAb fragment, lmnimalne jedinice prepoznavanja se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji podražavaju hipervarijabilni region jednog antitela (na primer, jedan fragment koji sadrži CDR, ili izolovani CDR). Drugi projektovani molekuli, poput dijatela, trijatela, tetratela i minitela, su takođe obuhvaćeni izrazom "antigen-vezujući fragment", kako se ovde koristi. U nekim rešenjima, antitelo ili fragmenti antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovani sa jednom terapeutskom grupom ("imunokonjugati"), kao što je jedan citotoksin, jedan hemoterapeutski lek, izvesni imunosupresor ili jedan radioizotop.
[0030]Izvesni antigen-vezujući fragment antitela će tipično sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sadržati najmanje jedan CDR koji je pored ili u okviru sa jednim ili više okvirnih sekvenci. U antigen-vezujućim fragmentima koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VH i VLdomeni se mogu nalaziti u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom aranžmanu. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadrži VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži monomerni VHili VLdomen.
[0031]U nekim rešenjima, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži najmanje jedan varijabilni domen kovalentno vezan za najmanje jedan konstantni domen. Neograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu nalaziti u okviru antigen-vezujućeg fragmenta antitela prema predstavljenom pronalasku obuhvataju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) Vl-Ch-)-Ch2-Ch3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U svakoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koji od primera gore navedenih konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno vezani jedan za drugi ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim ili regionom spojnice. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr, 5,10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje rezultiraju u fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezivanju između susednih promenljivih i/ili konstantnih domena u jednom molekulu polipeptida. Staviše, antigen-vezujući fragment antitela prema predmetnom pronalasku može da sadrži homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena navedenih iznad u nekovalentnoj asocijaciji jedni sa drugima i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (na primer, pomoću disulfidne veze (a)).
[0032]Kao i sa potpunim molekulima antitela, antigen-vezujući fragmenti mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr bispecifični). Multispecifičan antigen-vezujući fragment antitela će tipično sadržati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za poseban antigen ili za različiti epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela može biti prilagođen za upotrebu u kontekstu antigen vezujućeg fragmenta antitela prema predstavljenom pronalasku korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u tehnici.
[0033]Izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, namerava da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione porcklom od humane matične linije imunoglobulinskih sekvenci. Humana mAt iz ovog pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani od strane humane matične linije imunoglobulinskih sekvenci (npr mutacije uvedene slučajnom ili položaj-specifičnom mutagenezomin vitroili putem somatske mutacijein vivo),na primer u CDRs, a naročito u CDR3. Međutim, izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, ne namerava da uključuje mAt-a u kojima su CDR sekvence izvedene iz embrionske linije drugih vrsta sisara (npr miša), nakalemljene na humane FR sekvence.
[0034]Potpuna-humana anti-D114 antitela ovde opisana mogu da obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, umetanja i/ili brisanja u okviru i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama matične linije. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem aminokiselinskih sekvenci ovde opisanih sa embrionskim sekvencama na raspolaganju iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji su izvedeni iz bilo koje aminokiselinske sekvence ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina u okviru jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući ostatak (-ke) embrionske sekvence iz koje je izvedeno antitelo, ili u odgovarajući ostatak (-ke) druge sekvence humane klicine linije, ili u konzervativnoj supstituciji aminokiseline odgovarajućih embrionskih ostataka (takve promene sekvence su ovde označene kolektivno kao "embrionske mutacije"). Osoba sa uobičajenim iskustvom u tehnici, počevši od varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sekvenci ovde opisanih, lako može da proizvede brojna antitela i antigen-vezujuće fragmente koji sadrže jednu ili više pojedinačnih pozadinskih mutacija matične linije ili njihove kombinacije. U nekim rešenjima, svi ostaci okvira i/ili CDR-a unutar VHi/ili VLdomena su mutirani nazad do ostataka nađenih u prvobitnoj embrionskoj sekvenci iz koje je izvedeno antitelo. U drugim izvođenjima, samo izvesni ostaci su mutirani nazad do originalne embrionske sekvence, npr samo mutirani ostaci pronađeni unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim izvođenjima, jedan ili više ostataka iz okvira i/ili CDR-a su mutirani u odgovarajući ostatak (-ke) drugačijih embrionskih sekvenci (tj embrionske sekvence koja se razlikuje od sekvence klicine linije iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Pored toga, antitela prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže bilo koju kombinaciju dve ili više embrionskih mutacija unutar okvira i/ili CDR regiona, npr, gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajuće ostatke određene embrionske sekvence dok su neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne embrionske sekvence održavaju ili su mutirani do odgovarajućih ostataka različite sekvence klicine linije. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigene koji sadrže jednu ili više mutacija klicine linije se mogu lako testirati na jedno ili više željenih svojstva kao što su, poboljšana specifičnost vezivanja, povećani afinitet vezivanja, poboljšane ili povećane antagonističke ili agonističke biološke osobine (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost, itd. Antitela i antigen-vezujući fragmenti dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni sadašnjim pronalaskom.
[0035] Predmetni pronalazak takođe uključuje anti-D114 antitela koja sadrže varijante bilo kojih HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-D114 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, na primer, 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, 2 ili 1, konzervativnom (-ih) aminokiselinskom (-ih) supstitucijom (a) u odnosu na bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCVR, LCVR, i/ili CDR koje su ovde opisane. U jednom rešenju, HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 116 sa 10 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 116 sa 8 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 116 sa 6 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 116 sa 4 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U još jednom izvođenju, HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 116 sa 2 ili 1 konzervativnom supstitucijom aminokiseline u njima. U jednom ostvarenju, LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 118 sa 10 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 118 sa 8 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 118 sa 6 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugom ostvarenju, LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 118 sa 4 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U još jednom izvođenju, LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 118 sa 2 ili 1 konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom (-ama) u njima.
[0036]Jedno "neutrališuće" ili "blokirajuće" antitelo, namerava da se odnosi na antitelo čije vezivanje za D114 rezultira inhibicijom biološke aktivnosti D114. Ova inhibicija biološke aktivnosti D114 se može proceniti merenjem jednog ili više indikatora za D114 biološku aktivnost. Ovi indikatori D114 biološke aktivnosti se mogu proceniti pomoću jednog ili više od nekoliko standardnihin vitroiliin vivotestova koji su poznati u tehnici. Na primer, sposobnost antitela da neutrališu D114 aktivnost se procenjuje inhibicijom D114 vezivanja za receptor Notch. Isto tako, izraz je takođe primenjiv na antitela protiv drugih ciljeva, poput Notch 1 i Notch 4; takva antitela inhibiraju biološke aktivnosti ciljeva, čime se inhibiraju D114-notch interakcije ili signalni putevi.
[0037]Izraz "specifično vezuje" ili slično, označava da antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment formiraju kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pri fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može biti okarakterisano ravnotežnom konstantom disocijacije od najmanje oko 1 x 10"<6>Mili manje (npr manja KR označava čvršće vezivanje). Metode za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su dobro poznata u struci i obuhvataju, na primer, ravnotežne dijalize, površinsku plazmonsku rezonancu, i slično. Izolovano antitelo koje specifično vezuje hD114 može, međutim, da pokaže unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima poput D114 molekula iz drugih vrsta. Staviše, multi-specifična antitela (npr bispecifična) koja se vezuju za hD114 ijedan ili više dodatnih antigena se ipak smatraju antitelima koja "specifično vezuju" hD114, kako se ovde koristi.
[0038]Izraz "KD", kako se ovde koristi, namerava da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitclo-antigcn.
[0039]Izraz antitela "visokog afiniteta" se odnosi na ona antitela koja vezuju D114 sa KDod oko 1 nM ili manje, oko 500 pM ili manje, oko 400 pM ili manje, oko 300 pM ili manje, oko 200 pM ili manje, ili oko 100 pM ili manje, ili oko 50 pM ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr, BIACORE ™ ili afiniteta rastvora ELISA.
[0040]Izraz "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu u realnom vremenu biospecifičnih interakcija detekcijom promena u koncentracijama proteina u okviru matriksa biosenzora, na primer korišćenjem BIACORE ™ sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska i Piscataway, N.J.).
[0041]Izraz "epitop" je region antigena koji je vezan od strane antitela. Epitopi se mogu defmisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu takođe biti konformacioni, to jest, sastavljeni od nelinearnih aminokiselina. U nekim rešenjima, epitopi mogu da uključuju determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil grupe ili sulfonil grupe, a, u nekim rešenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0042]Izraz "tretman" ili "lečenje", kako se ovde koristi, označava obe profilaktičke (ili preventivne) i terapeutske procedure, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Subjekti kojima je potrebno lečenje uključuju ne samo one koji su razvili poseban uslov, poremećaj ili bolest, već i one koji imaju genetske predispozicije ili su podložni razvoju takvog stanja, poremećaja ili bolesti i da su koristi od profilaktičke procedure takve da su pojave ili recidivi, ili progresija, ako se dese, takvog stanja, poremećaja ili bolesti smanjene u poređenju sa onima u odsustvu tretmana.
[0043]Izrazom "terapeutski efikasna količina", "profilaktički efikasna količina" ili "efikasna količina" je označena ona količina koja proizvodi željeni efekat za koji se primenjuje. Tačna količina će zavisiti od svrhe tretmana, starosti i veličine subjekta koji se leči, puta primene i slično, a biće utvrđena od strane stručnjaka u tehnici, korišćenjem poznatih tehnika (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Opšti opis
[0044]Predmetni pronalazak je delom zasnovan na nalazima da blokada D114 od strane D114-specifičnih antitela dovodi do povećanog broja Treg ćelija, što, zauzvrat, sprečava, smanjuje ili odlaže napredovanje EAE ili dijabetesa kod miševa. Za opis potpuno humanog D114 At, uključujući rekombinantno humano D114 At, videti Međunarodnu patentnu publikaciju Br. WO 2008/076379
Terapijska primena i formulacije
[0045]Predmetni pronalazak obezbeđuje delta-like ligand 4 (D114) antagoniste kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupcima za sprečavanje, lečenje ili ublažavanje diabetes mellitusa tipa 1, koji obuhvata primenu izvesne terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist D114. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antagonist D114 može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su imunosupresivni agensi, antiinflamatorna sredstva, analgetici, sredstva za snižavanje glukoze u krvi, i slično (videti sledeće poglavlje). Ovi terapeutski preparati se mogu primenjivati sa pogodnim nosačima, ekscipijensima, i drugim sredstvima koja su inkorporirana u formulacije da obezbede poboljšani transfer, isporuku, toleranciju, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom za sve farmaceutske hemičare: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN ™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje u vodi i voda u ulju emulzije, emulzije Carbowax-a (polietilen glikoli različitih molekulskih masa), polučvrste gelove i polučvrste mešavine koje sadrže Carbowax. Videti takođe Povvell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
[0046]Za sistemsku primenu, izvesna terapeutski efikasna doza se može inicijalno procenitiin vitrotestovima. Na primer, doza može biti formulisana u životinjskim modelima da se postigne opseg cirkulišuće koncentracije koji uključuje IC50kao što jeutvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije se mogu koristiti za tačnije određivanje korisnih doza kod ljudi. Početne doze mogu takođe biti procenjene na osnovuin vivopodataka, npr na životinjskim modelima, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Osoba sa uobičajenim iskustvom u tehnici može lako optimizovati primenu na ljudima na osnovu podataka na životinjama.
[0047]Doza može varirati u zavisnosti od starosti i veličine (npr telesne težine ili površine tela) subjekta na koji se primenjuje, ciljane bolesti, stanja, načina primene i slično. Za sistemsku primenu antagonista D114, posebno, za D114 antitela, tipični dozni opsezi za intravensku primenu su u dnevnoj dozi od oko 0,01 do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 0,1 do oko 50 mg/kg, ili oko 0,2 do oko 10 mg/kg. Za subkutanu primenu, antitela se mogu primenjivati pri oko 1 mg do oko 800 mg, oko 10 mg do oko 500 mg, oko 20 mg do oko 400 mg, oko 30 mg do oko 300 mg, ili oko 50 mg do oko 200 mg , pri koncentraciji antitela od najmanje oko 25 mg/ml, oko 50 mg/ml, oko 75 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 125 mg/ml, oko 150 mg/ml, oko 175 mg/ml, oko 200 mg/ml, ili oko 250 mg/ml, najmanje, 1 do 5 puta dnevno, 1 do 5 puta nedeljno, ili 1 do 5 puta mesečno. Alternativno, antitela mogu biti početno primenjivana putem intravenske injekcije, praćene sekvencijalno subkutanom primenom.
[0048]Razni sistemi za isporuku su poznati i mogu se koristiti za primenu farmaceutske kompozicije prema pronalasku, npr, inkapsulacijom u lipozomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutant viruse, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Postupci uvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve primene. Kompozicija se može primeniti bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom preko epitela ili mukokutanih obloga (npr oralne mukoze, rektalne i crevne sluznice, itd) i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0049]Farmaceutska kompozicija se može dostaviti u vezikuli, naročito lipozomu (videti Langer
(1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler. (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., str. 317-327; videti generalno ibid.).
[0050]U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena u jednom sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom izvođenju, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). U drugom ostvarenju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC pres., Boca Raton, Florida (1974). U još jednom izvođenju, sistem za kontrolisano oslobađanje može biti smešten u blizinu cilja kompozicije, čime je potrebna samo frakcija od sistemske doze (videti, npr Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).
[0051]Injektabilni preparati mogu da uključuju dozne oblike za intravenozne, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ovi injekcioni preparati mogu biti pripremljeni postupcima koji su dobro poznati. Na primer, injekcioni preparati mogu biti pripremljeni, npr rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisanih iznad u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji se konvencionalno koriste za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd, koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za solubilizaciju kao što je neki alkohol (npr etanol), jedan polialkohol (npr propilen glikol, polietilen glikol), jedan nejonski surfaktant [npr polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, korišćeni su, npr, susamovo ulje, sojino ulje, itd, koji se mogu koristiti u kombinaciji sa solubilizacionim agensom kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija tako pripremljena je poželjno napunjena u odgovarajuću ampulu. Farmaceutska kompozicija može biti isporučena subkutano ili intravenski sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u vezi sa subkutanom isporukom, uređaj za isporuku tipa olovke ima laku primenu u isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za isporuku u vidu olovke može biti ponovo korišćen ili za jednokratnu upotrebu. Ponovno korišćen uređaj olovke za dostavu generalno koristi zamenjljivu patronu koja sadrži izvesnu farmaceutsku kompoziciju. Kada su sve farmaceutske kompozicije u patroni primenjene, a kertridž prazan, prazan kertridž može lako biti odbačen i zamenjen sa novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj olovke za isporuku se zatim može ponovo koristiti. U raspoloživom uređaju olovke za isporuku, nema zamenljivog ketridža. Umesto toga, jednokratni uređaj olovke za dostavu isporučuje se napunjen sa farmaceutskom kompozicijom koja se drži u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar farmaceutske kompozicije isprazni, ceo uređaj se odbacuje.
[0052]Brojni ponovo upotrebljivi uređaji olovke i za autoinjektorsku isporuku imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije. Primcri uključuju, ali sigurno nisu ograničeni na AUTOPEN ™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Velika Britanija), DISETRONIC ™ olovka (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25 ™ olovka, HUMALOG ™ olovka, HUMALIN 70 / 30 ™ olovka (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN ™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR ™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD ™ olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN ™, OPTIPEN PRO ™, OPTIPEN STARLET ™, i OPTICLIK ™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Nemačka), da navedemo samo nekoliko. Primeri potrošnih uređaja olovke za isporuku imaju primenu u potkožnoj isporuci farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska uključuju, ali sigurno nisu ograničeni na SOLOSTAR ™ olovku (Sanofi-Aventis), FLEXPEN ™ (Novo Nordisk), KWIKPEN ™ ( Eli Lilly).
[0053]Pogodno, farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu primenu gore opisane se pripremaju u doznim oblicima u jediničnoj dozi primerenoj za podešavanje doze aktivnog sastojka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina D114 antagoniste, kao što je D114 antitelo, sadržana je generalno oko 0,1 do oko 800 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželjno je da je antitelo sadržano u količini oko 5 do oko 100 mg i oko 10 do oko 250 mg za ostale dozne oblike
[0054]U nekim realizacijama, može biti poželjna lokalna primena farmaceutskih kompozicija pronalaska lokalno na površini gde je potreban tretman; ovo se može postići, na primer, a ne kao ograničenje, lokalnom infuzijom u toku operacije, topikalnom primenom, npr injekcijom, pomoću katetera ili pomoću izvesnog implanta, implanta koji je poroznog, neporoznog ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, kao što su silastične membrane, vlakna ili komercijalne zamene za kožu.
Kombi nova ne terapije
[0055]D114 antagonist iz pronalaska može biti obezbeđen sam ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su imunosupresivni agensi ili imunosupresanti, anti-inflamatorni agensi, analgetici, agensi za direktno ili indirektno snižavanje glukoze u krvi, i slično. Pogodni imunosupresanti uključuju, ali nisu ograničeni na, glukokortikoide, ciklosporin, metotreksat, interferon P (IFN-P), takrolimus, sirolimus, azatioprin, merkaptopurin, opijate, mikofenolat, TNF-vezujuće proteine, kao što su infliksimab, eternacept, adalimumab i slično, citotoksične antibiotike, kao što su daktinomicin, antraciklini, mitomicin C, bleomicin, mitramicin, i slično, antitela koja ciljaju imune ćelije, kao što su anti-CD20 antitela, anti-CD3 antitela i slično. Pogodni antiinflamatorni agensi i / ili analgetici za kombinovane terapije sa antagonistima anti-D114 uključuju, kortikosteroide, nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID), kao što su aspirin, ibuprofen, naproksen i slično, TNF-a antagoniste (npr Infliksimab ili REMICADE® od Centocor Inc.; golimumab od Centocor Inc.; etanercept ili ENBREL<®>od Amgen/Wyeth; adalimumab ili HUMIRA® od Abbott Laboratories, i slično), IL-1 antagoniste (npr IL-1-vezujuće fuzione proteine, na primer, ARCALYST<®>od Regeneron Pharmaccuticals, Inc., videti US Patent Br. 6,927,044; KINERET<®>od Amgcna, i slično), IL-6 antagoniste (npr antitela anti-IL-6 receptora na način otkriven u US Patent Br. 7,582,298, i ACTEMRA<®>od Roche), acetaminofen, morfinomimetike, i slično. Pogodni agensi za snižavanje glukoze uključuju, ali nisu ograničeni na, insulin i njegove analoge, bigvanidine, sulfonamide i derivate ureje, inhibitore alfa-glukozidaze, tiazolidindion i njegove derivate, inhibitore dipeptidil peptidaze-4, guar gumu, repaglinid, nateglinid, eksenatid, pramlintid, benfluoreks, liraglutid, mitiglinid, inhibitore aldoza reduktaze, i slično.
[0056]D114 antagonist, kao što je hD114 At ili njegovi fragmenti, i dodatni terapeutski agens (i) gore opisani mogu biti ko-primenjeni zajedno ili odvojeno. Gde se koriste odvojene dozne formulacije, antitelo ili njegov fragment iz pronalaska i dodatni agensi mogu biti primenjeni istovremeno ili odvojeno u naizmeničnim periodima, tj sekvencijalno, prema odgovarajućem redosledu.
Kompleti
[0057] Takođe ovde opisani je artikal proizvodnje ili komplet, koji sadrži materijal za pakovanje, kontejner i farmaceutski agens sadržan u kontejneru, gde farmaceutski agens sadrži najmanje jedan antagonist D114, kao što je D114 antitelo, i najmanje jedan dodatni terapeutski agens, pri čemu materijal za pakovanje sadrži oznaku ili dodatak pakovanju koje pokazuje indikacije i uputstva za upotrebu. D114 antagonist i dodatni terapeutski agens mogu biti sadržani u odvojenim kontejnerima.
PRIMERI
[0058] Sledeći primeri su izneti tako da obezbeđuju stručnjacima sa uobičajenim iskustvom u tehnici kompletno otkrivanje i opis kako da naprave i koriste kompozicije iz ovog pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači ocenjuju njihovim pronalaskom. Napori su učinjeni da se osigura tačnost u vezi sa brojevima koji se koriste (na primer, količine, temperatura, itd), ali neke eksperimentalne greške i devijacije treba da se obračunaju. Ukoliko drugačije nije naznačeno, delovi su težinski delovi, temperatura je u stepenima Celzijusa, pritisak je na ili blizu atmosferskog, greške barova na slikama = srednja vrednost ± SEM.
[0059] U donjim primerima, sledeća antitela u Dulbecco's PBS (GIBCO<®>INVITROGEN ™) 1 X sa dodatkom 3% FCS-a, korišćena su za bojenje ćelija za namenu protočne citometrije: za DCs, antitela protiv signalnog-regulatornog proteina a (Sirp-a; kat # P84; BD Biosciences), B220 (kat # RA3-6B2), PDCA-1 (kat # eBio927), CD8 (kat # 53-6.7), CDllb (kat Ml/70), MHCII (kat M5/114.15.2), CD11 c (kat # N418) i CD135 (kat # A2F10), odnosno; za T, B i NK ćelije, antitela protiv CD4 (kat # GK1.5 ili L3T4), CD3 (kat # 145-2C11), CD25 (kat # PC61 ili 7D4), CD44 (kat # IM7), FoxP3 (kat # FJK16s); i F4 / 80 (kat # BM8), NK1.1 (kat # PK136), IgM (kat # 11/41), IgD (kat 26-llc), CD43 (kat # S7), CD21 (kat # eBio4E3), HSA (kat Ml/69), i CD23 (kat # B3B4), odnosno, (svi iz eBioscience).
Primer 1: EfekatDU4blokade na razvoj B ćelija, dendritskih ćelija i T ćelija
[0060] Pokazalo se da D114-Notchl inhibicija dovodi do potpunog bloka u razvoju T ćelija praćeno ektopičnom pojavom B ćelija i širenjem dendritskih ćelija (DC) koje mogu nastati iz Pro-T ćelije do DC sudbinske konverzije unutar timusa (Hozumi et al., 2008, J Exp Med 205 (11): 2507-2513; Koch et al, 2008, J Exp Med 205 (11):2515-2523; i Feverabend et al, 2009, Immunity 30: 1-13). Međutim, i dalje je nepoznato koja specifična faza razvoja DC je direktno pogođena D114 blokadom.
[0061]Da bi odgovorili na ovo pitanje, 6 nedelja odraslim C57B1/6 miševima (Jackson Labs) injektovano je subkutano 5 ili 25 mg/kg anti-D114 At (REGN577) (n = 5) ili humanog Fc fragmenta (kontrola) (n = 5), dva puta nedeljno tokom dve nedelje. REGN577 je pripremljen u kući na osnovu objavljene sekvence (WO 2007/143689). REGN 577 se vezuje za humani i mišji D114, ali nema dctcktovanog vezivanja humanog DM i JAG1. Četrnaest (14) dana nakon injekcije, timus i slezina su sakupljeni i vareni na 37°C tokom 30 min u kompletnom RPMI 1640 medijumu (Invitrogen) sa dodatkom 10% seruma telećeg fetusa (FCS) koji sadrži Collagenase D (Sigma Aldrich). Da se zaustavi reakcija, 2 mM EDTA je dodato i suspenzija organa je propuštena kroz ćelijsku cediljku od 70-mm. Koštana srž (BM) je sakupljena od svakog miša ispiranjem butnih kosti i kosti potkolenica u kompletnom RPMI 1640 medijumu obogaćenom sa 10% FCS i ćelije su resuspendovane u RPMI medijumu. T ćelije, B ćelije i DC podgrupe su procenjivane protočnom citometrijom nakon što su ćelije obojene antitelima protiv određenih markera gore opisanih. Obojene ćelije su proticale na BD ™ LSRII protočnom citometru (BD Biosciences) i podaci su analizirani korišćenjem FlovvJo softvera (verzija 8.8.6; Tree Star Inc.).
[0062]SI. 1A i 1B pokazuju ćelijske populacije T i B u timusu. Kao što je prikazano na si. 1A D114 blokada indukuje značajan porast broja dvostruko negativnih ("DN"; CD4"CD8") T ćelija i smanjenje broja dvostruko pozitivnih ("DP", CD4<+>CD8<+>) T ćelija unutar timusa. Pored toga, isti tretman indukuje ektopičan izgled B ćelija unutar timusa, koji proizilazi iz Pro-T ćelija (tj, CD44<+>CD25"CD4"CD8" ćelija u DN1 fazi) (videti si. 1B). Nasuprot tome, D114 blokada nije uticala na razvoj B ćelija u koštanoj srži (si. 2A) ili u perifernim slezinskim B ćelijskim subpopulacijama (SI. 2B). Osim toga, D114 blokada indukuje širenje konvencionalnih DCs ("cDCs"; B220"CD1 lc*) i plazmacitoidnih DCs ("pDCs"; PDCA1<+>B220<+>CD11C<+>) u timusu (si. 3A) sa značajnom ekspanzijom sa početkom 7 dana (p<0,001) do 14 dana (p<0,001) i nastavljenom do dana 21 (p <0,01) (SI. 3B) nakon početne injekcije D114 At. Brojevi u tačkastim dijagramima na si. 3A predstavljaju prosečne procente DC-a među ukupnim ćelijama 14-og dana. Dalje, DC ćelije su proširene na periferiji miševa tretiranih sa D114 At (REGN577). Onoliko puta se povećava procenat i apsolutni broj DC ćelija u slezini nakon tretmana sa D114 At, u poređenju sa kontrolnim miševima (hFC-tretiranim), koji su prikazani u Tabeli 1.
[0063]Poznato je da limfoidno tkivo cDCs, pDCs i monociti dele zajedničkog progenitora koji se zove "makrofag i DC prekusor" ili "MDP", koji se može prepoznati po svojoj fenotipskoj površini "Lin"cKitMCDl 15+FLT3+", dok je poseban progenitor pod nazivom" zajednički DC prekusor" ili "CDP" sa "Lin-cKitloCDl 15+FLT3+" ograničen na proizvodnju cDCs i pDCs. Iako monociti mogu da razviju mnoge od fcnotipskih karakteristika DC ćelija u inflamatornim stanjima, cDC, pDC i monociti loze odvojeni su u vreme kada su dostigli tkiva, pri čemu se ni monociti ni pDCs razvijaju u cDCs u uslovima stabilnog stanja. Za razliku od monocita i pDCs, za cDCs u limfnom tkivu se smatralo da se pojavljuju iz koštane srži kao nezrele ćelije koje se dalje trebaju diferencirati i podeliti u limfnim organima. Pre-DC ćelije (MHCII<lo>CDllc<int>CD135<+>SIRP-a<int>) i kasne pre-DC ćelije (MHCII<lo>CDllc<int>), su prekursori pre svega cDC ćelija koje se javljaju u koštanoj srži ( Liu et al., 2009, Science 324:392-397).
[0064]Da se identifikuju bilo koji efekti D114 At na DC progenitorsku homeostazu, nivoi MDP i CDP u timusu, koštanoj srži i slezini su ocenjeni protočnom citometrijom. MDP i CDP su detektovani samo u koštanoj srži, ali ne u timusu ni u slezini (podaci nisu prikazani). Nadalje, D114 blokada ne indukuje ekspanziju ranih progenitora u koštanoj srži u poređenju sa miševima koji su kontrolno tretirani. Tako, rezultat predlaže da D114 At mogu da deluju u kasnijoj fazi, tj, pre-DC fazi, u DC razvoju nego MDP i
CDP.
[0065]Shodno tome, pre-DC ćelije i kasne pre-DC ćelije u timusu i koštanoj srži su istraživane korišćenjem protočne citometrije. Kao što je prikazano na si. 3C, MHCII<lo>CDllC<int>DCs, koje su normalno prisutne u koštanoj srži, su proširene samo u timusu 14 dana nakon tretmana sa D114 At (p
<0,001), dok ne širenje MHCII<lo>CDllc<int>DCs je otkriveno u koštanoj srži istog miša (podaci nisu prikazani). Tako, DC ekspanzija nastala od pre-DC faze je bila ograničena na timus. Da bi se procenilo poreklo MHCII<lo>CDllc<mt>DCs u timusu, protočna citometrija je sprovedena za identifikaciju MHCII<lo>CDllc<mt>DCs u DN1 (CD4"CD8"CD44<+>CD25") pro-T ćelijske populacije. Kao što je prikazano na si. 3D, MHCIl'°CDl lcmt DCs su otkrivene unutar DN1 pro-T ćelijske populacije nakon D114 blokade 3-eg dana. MHCIIloCDl lcint DCs nisu otkrivene u odsustvu lečenja sa D114 At, kao i unutar DN2, DN3 i DN4 T ćelijskih populacija nakon D114 At tretmana (podaci nisu prikazani). Nema promena u perifernoj DC homeostazi primećenoj nakon D114 At tretmana (podaci nisu prikazani). Tako, D114 blokada indukuje značajno proširenje MHCIIloCDl lcmt DCs unutar DN1 pro-T ćelijske populacije u timusu u 3 danu (p <0,01) (si. 3D) sa pikom ekspanzije u 14 danu (p <0,001) (podaci nisu prikazani). U međuvremenu, zrele DC podgrupe su proširene u 7 danu (p <0,001), preko 21 dana (p <0,01) u timusu, kao što je već izneto (videti si. 3B).
[0066]Da se ispita da li bi DC ekspanzija mogla da potiče iz neangažovanih T-ćelijskih prekursora, DN1 CD45.1 Lin" sortirane ćelije su intra-timusno prebačene u CD45.2<+>miševe domaćine tretirane sa anti-D114 At. Nađeno je da su CD45.1<+>ćelije akumulirane u DN1 fazi (podaci nisu prikazani) i nezrele DC ćelije (imDCs) su otkrivene i proširene u timusu (si. 4) (p <0,01). Nisu detektovane ćelije kod kontrolnih At-tretiranih miševa, verovatno zbog većine DN1-transferavanih ćelija koje su eliminisane negativnom selekcijom od strane T ćelija. Zaključeno je da D114 blokada promoviše razvoj unutar timusa alternativne DC ćelijske linije koja potiče od zajedničkogTIDC DN1 progenitora.
[0067]Fms-like tirozin kinaze 3 ligand (Flt3-L) je dovoljan i neophodan za diferencijaciju progenitora koštane srži u DC ćelijama i razvoj perifernih DC ćelija. Serumski nivoi Flt3-L su nepromenjeni kod anti-D114 At-trctiranih WT životinja (podaci nisu prikazani). Stavišc, kao što je prikazano u Tabelama 2 i 3 niže, procenti DC u timusu su ekspandirani kod miša divljeg-tipa (WT) (Tabele 2 i 3), Flt3-L knock-out miševa (Flt3-L"</>_) (p <0,05) (Tabela 2), i Flt3-R knock-out miševa (Flt3-R"</>_) (p <0,001) (Tabela 3), koji su svi tretirani sa D114 At, u poređenju sa onima koji su tretirani sa kontrolnim At. Stoga, D114 blokada izaziva DC ekspanziju koja je Flt3-nezavisna u timusu.
[0068]Sposobnost ranih T ćelijskih progenitora da ponovo izvedu prema ne-T ćelijskom fenotipu je primećena (James P. Di Santo, 2010, Science 329: 44-45). Analiza niza gena je izvedena u timocitima i pro-T ćelijama da se odredi efekat tretmana anti-D114 At u genima umešanim u T nasuprot B i DC opisu ćelijske loze. Utvrđeno je da su geni esencijalni za T ćelijsko obavezivanje (nprTcf7, Gata3, i Etsl)nishodno regulisani, dok su geni( Lyll, Sfpil)od kojih svaki može da blokira razvoj T ćelija, ushodno-regulisani (podaci nisu prikazani; videti Di Santo, 2010, supra). Interesantnije, geni koji kontrolišu DC( PU. 1 i spi- B)i razvoj B ćelija su takođe ushodno-regulisani (podaci nisu prikazani; videti M. Merad et al. 2009, Bood. 113: 3418-3427). Pored toga, ekspresijaRelB i ID2kao i interferon regulatornih faktora (IRFs) 2, 4 i 8 -ključnih transkripcionih faktora uključenih u razvoj DC podskupa su bile povećane (podaci nisu prikazani; videti Merad et al, 2009, gore.). Konačno, ekspresija gena CSF-1 (M-CSF), ključnog citokina uključenog u razvoj DCs, je nađeno da je regulisana nakon anti-D114 At tretmana (p<0,05; podaci nisu prikazani). Nadalje, CSF-1 serumski nivoi su povećani nakon anti-D114 At tretmana (Slika 5; p <0,05) (videti B. Francke et al, 2008, Blood 111:150-159). Prema tome, može se zaključiti da blokada D114-Notch signalizacije nishodno-reguliše transkripcione faktore specifične za obavezivanja T ćelijske linije, dok je ushodno regulisanje drugih ključno u razvoju DC.
Primer 2: UticajD114brisanja na razvoj T ćelija
[0069] Za procenu da li je efekat D114 na razvoj DC primećen u Primeru 1 gore svojstven za D114, pripremljeni su DLL4COIN miševi, u kojima je D114 uslovno inaktiviran. "Uslovni po inverziji (COIN)" aleli su uslovni aleli koji se oslanjaju na inverzibilni element ("COIN element") da obezbede rekombinazom-posredovane uslovne mutacije. DLL4COIN miševi sadrže tamoksifen-inducibilni Cre rekombinaze konstrukt, CreERT2, koji kodira Cre rekombinazu fuzionisanu sa mutant estrogenim ligandom-vezujućeg domena (ERT2). CreERT2 je suštinski neaktivan u odsustvu tamoksifena i takođe nije aktiviran endogenim estrogenima. Tretman miševa tamoksifenom će aktivirati CreERT2 i izazvati inverziju COTN elementa, koji ukida transkripciju svih egzona nishodno od tačke COIN umetanja, čime je nokautiran D114. Za detalje o CreERT2 rekombinaza sistemu, pogledajte Feil et al., 1997, Biochemical and Biophvsical Research Communications 237:752-757.
[0070] DLL4COIN miševima (n = 6) ubrizgan je intraperitonealno (i.p.) tamoksifen (TAM) (kat # T 5648, Sigma), 3 mg/150 ul kukuruznog ulja po mišu tri (3) puta nedeljno tokom 2 nedelje. DLL4COIN kontrolnim miševima (n = 6) dato je kukuruzno ulje bez tamoksifena. Isto tako, divlji tip C5B1/6 miševa je tretiran sa tamoksifenom (n = 6) ili samo sa kukuruznim uljem (n = 6). Miševi su praćeni na znake distresa (npr izgled krzna, nisku aktivnost, itd), infekcije, i preterani gubitak telesne težine. Miševi su mereni otprilike tri puta nedeljno. Svaki miš koji je izgubio više od 20% telesne težine je bio uklonjen iz eksperimenta. Nakon 2 nedelje tretmana, timusi se sakupe i ćelije timusa su analizirane protočnom citometrijom.
[0071] Kao što je prikazano na si. 6, u odsustvu D114 (tj, kod miševa tretiranih tamoksifenom), B ćelije i obe pDCs i cDCs su ekspandirane u timusu, u poređenju sa miševima koji su tretirani kukuruznim uljem, što ukazuje da su efekti D114 na razvoj DC i homeostazu primećeni u Primeru 1 zaista svojstveni za D114. Stoga, D114-Notch signalizacija izgleda da podržava T ćelijsku posvećenost suprimiranjem potencijala ne-T ćelijske linije unutar pro-T ćelijske populacije.
Primer 3: EfekatDU4blokade iliD114brisanja na Tregs homeostazu
[0072] Nedavno je pokazano da su Tregs od suštinskog značaja za održavanje normalnog broja DC ćelija. Nakon Treg iscrpljivanja postoji kompenzatorna Fms nalik tirozin kinaza 3 (Flt3)-zavisno povećanje DCs (Liu et al., 2009, supra). Osim toga, dve nezavisne grupe su pokazale povratnu kontrolu regulatorne T ćelijske homeostaze od strane DCsin vivo;tj, povećanje broja DCs dovodi do povećane podele i akumulacije Treg, koji bi mogao da spreči razvoj autoimune bolesti (Darrasse-Jeze G. et al., 2009, J Exp. Med. 206 (9): 1853-1862; i Swee LK et al., 2009, Blood 113 (25): 6277-6287).
[0073]Da bi se utvrdilo da li bi D114 blokada mogla uticati na Treg homeostazu, Treg brojevi timusa miševa tretiranih sa D114 At ili humanim Fc (kontrola) u Primeru 1 su bili mereni protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na slici 7A, D114 blokada je dovela do snažnog proširenja Tregs unutar timusa u 14 danu nakon početne injekcije. Sirenje Tregs je započeto u 7 danu (p <0,001) i dostignut je maksimalan efekat 14-og dana u timusu (p <0,001) nakon početne injekcije (videti si. 7B), dok su na periferiji (tj, slezine) T regulatorne ćelije započele pojavljivanje samo između 14-og i 21-og dana (p <0,05) (SI. 7B i Tabela 4). U tabeli 4, višestruko se povećava procenat i apsolutni broj Tregs u slezini nakon tretmana sa D114 At, u poređenju sa kontrolnim miševima (hFc- tretiranim), koji su prikazani.
[0074]Za procenu da li je posmatrana Treg ekspanzija bila svojstvena D114 molekulu, Treg brojevi u timusima DLL4COFN miševa iz Primera 2 su takođe mereni protočnom citometrijom. Kao što je primećeno sa D114 blokadom pomoću D114 At, uslovna inaktivacija D114 pomoću tamoksifen tretmana je takođe dovela do ekspanzije Tregs u timusu, u poređenju sa miševima koji su tretirani kukuruznim uljem (videti si. 7C) kao i kod divljeg tipa miševa tretiranih tamoksifenom (podaci nisu prikazani). Stoga, D114-Notch signalizacija održava DCs i posledično Treg homeostazu i T ćelijsko obavezivanje.
[0075]Sličan eksperiment je sproveden na miševima koji eksprimiraju humani D114 ("humanizovani D114 miševi") korišćenjem anti-D114 At (REGN421 koja imaju HCVR i LCVR sekvence od SEK ID BR: 116 i 118, respektivno) koji je poznat da se vezuje za N -terminalni-DSL domen humanog D114. Humanizovani D114 miš je pripremljen zamenom celog ekstracelularnog domena mišjeg D114 gena sa odgovarajućim ekstracelularnim regionom humanog D114 gena (7 kb) u embrionskim stem (ES) ćelijama Fl C57BL/6/129. Homozigotni hD114 miševi su generisani i odrastali su u C57BL/6 pozadini. Humanizovani D114 miševi su tretirani sa 5 mg/kg hFc (kontrola; n = 6), ili 1 mg/kg (n = 6) ili 5 mg/kg (n = 6) REGN421 At dva puta nedeljno tokom dve nedelje. Dva miša iz svake grupe tretmana su žrtvovana 7-og dana i još 2 miša po grupi su žrtvovana 14-og dana. Timusi su bili sakupljeni i ćelije su obojene i ispitane protočnom citometrijom. Preostali miševi su ostavljeni da se oporave tokom narednih 4 nedelja bez ikakvog tretmana i, u 28-om danu nakon prestanka tretmana, žrtvovani su i ćelije timusa su analizirane protočnom citometrijom. Nakon dve nedelje lečenja, povećanje cDC i pDCs (si. 8A) kao i značajno povećanje u Treg populaciji (si. 8B) je primećeno u timusu kod anti-D114 At-tretiranih miševa (p<0,01). U timusu miševa koji su primili D114 At tokom 2 nedelje, a nakon toga 4 nedelja nisu tretirani, i DC i Treg brojevi su bili vraćeni na normalan nivo na kraju perioda (si. 8A i 8B). U međuvremenu, ekspanzija DCs i Tregs je takođe primećena na periferiji kod D114-At tretiranih miševa, u poređenju sa hFc tretiranim miševima (podaci nisu prikazani).
Primer 4: Efekat blokade Notch receptora na Tregs
[0076] Pokazalo se da ekspanzija DC ćelija dovodi do ekspanzije T regulatornih ćelija (Darrasse-Jeze G. et al., 2009). Kao što je gore navedeno, primećeno je da su nakon D114 blokade i ćelije DC i Tregs ekspandirane u timusu (slika 3A i slika 7A). Pored toga, proširenje i u procentima i u apsolutnim brojevima ćelija DC i Tregs je takođe pronađeno na periferiji kod D114-At tretiranih miševa (Tabele 1 i 4). Kako bi se utvrdilo da li će blokada Notch receptora dovesti do istog fenotipa kao D114 brisanje, Nikastrin knockout (KO) miševi (Nic<v>~) su bili ispitivani. Nikastrin je molekul uključen u Notch signalni put i genetske ablacije nikastrina kod nikastrin deficitarnih miševa rezultiraju u blokadi signala transdukcije nishodno od Notch receptora 1, 2, 3 i 4 (Aifantis et al., neobjavljeni podaci). Nikastrin KO miševi su prikazani da ispoljavaju slični fenotip kao D114-brisani/blokirani miševi sa povećanim brojem Tregs, kako u procentima i u apsolutnom broju, u timusu kao i u slezini (videti Tabelu 5).
[0077]Konačno, kada su ćelije koštane srži (BM) iz Nik_/" miševa prebačene u smrtno ozračene WT miševe, ekspanzija timusa Tregs je primećena u Nik<7>" —>WT himerc, sugerišući daje takva ekspanzija bila jedan ćelijski-autonomni efekat; i D114 blokada primaoca miševa sa anti-D114 At nije imala dodatni efekat (videti tabelu 6).
[0078]Ovi rezultati sugerišu da prekid D114-Notch signalizacije blokiranjem bilo D114 ili Notch receptora dovodi do sličnih fenotipova u pogledu širenja T regulatornih ćelija.
[0079]Da se odredi da li ekspanzija Tregs nakon D114 blokade stoji u korelaciji sa DC brojevima (Darrasse-Jeze G. et al, 2009, supra), miševi kojima nedostaju DC ćelije su pripremljeni i testirani sa D114 At kao u Primeru 1. Transgcni miševi koji izražavaju receptor difteričnog toksina primata (DTR) se daju sa difterija toksinom (DT) osetljivim prema njihovim ćelijama, koje su DT-neosetljive na neki drugi način. DT ulazi u ćelije putem interakcije njene B podjedinice sa celularnim DTR i nakon endocitoze DT A podjedinica se oslobađa i katalizuje ADP-ribozilaciju elongacionog faktora 2, rezultirajući u inhibiciji sinteze proteina praćenu brzom apoptozom i u mitotskim i u terminalno diferenciranim ćelijama. Specifičnost i vreme ćelijske ablacije se mogu odrediti pomoću ćelijskog tipa-ograničenog pokretača/inhenser elemenata i pomoću režima primene toksina, respektivno. Ciljanje DT osetljivosti na DC, Jung et al. (2002, Irnmunitv 17:211-220) su generisali miševe (CD11 cre-DTR miševi) koji nose transgen koji kodira majmunski DTR-GFP (zeleni fluorescentni protein) fuzioni protein pod kontrolom mišjeg CD 11c promotera. Pošto CD 11c kodira za sve DCs, sve mišje DC podgrupe koje izražavaju CD1 lc se brišu nakon primene DT.
[0080]Tako pripremljeni transgeni miševi kojima nedostaju ćelije DC su tretirani sa D114 At-ima ili kontrolnim hFc prema protokolu opisanom u Primeru 1. Četrnaest (14) dana posle tretmana, timusi i slezine su prikupljeni i pripremljeni za analizu. Nivo ekspresije D114 na površinama pojedinih DC ili T ćelijskih podskupova je procenjen protočnom citometrijom u cilju određivanja za koje specifične podskupove se vezuju D114 At. Rezultati su pokazali da DC ćelije i T ćelije ne eksprimiraju detektabilne nivoe D114 na svojoj površini (podaci nisu prikazani). Ovo zapažanje potvrđuje i izveštaj da se D114 eksprimira na površini epitelnih ćelija timusa (TECs) (Koch et al. 2008, supra). Najvažnije je, međutim, utvrđeno da tretman D114 At kod miševa kojima nedostaju DC ćelije nije mogao da indukuje širenje Treg, dok kod divljeg tipa miševa (tj DC ne-brisani miševi) tretman D114 At značajno povećava udeo T regulatornih ćelija među CD3<+>CD4<+>ćelijama (p <0,001), što ukazuje daje širenje T regulatornih ćelija nakon D114 At tretmana bilo bar delimično posredovano putem DC ekspanzije.
Primer 5: Uticaj D114 blokade kod Eksperimentalnog Autoimunog Encefalomijelitisa(EAE)
[0081]CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>prirodne regulatorne T ćelije (tj Tregs) igraju važnu ulogu u održavanju samotolerancije i suzbijanju autoimunih bolesti, kao što su tip 1 dijabetesa, autoimuni eneefalomijelitis, GVHD i inflamatorna bolest creva (IBD) (Darrassc-Jczc G. ct al., 2009, gore navedeno; Swcc LK ct al., 2009, gore navedeno i McGreachy et al, 2005, 175 (5):3025- 3032).
[0082]Da se vidi da li bi povećan broj Tregs kao rezultat D114 blokade sprečio autoimune bolesti, uticaj D114 blokade na EAE je ispitivan na modelu miša. EAE model miša je uspostavljen injektiranjem u nožni uložak C57B1/6 miševa sa mijelin oligodendrocitnim glikoproteinskim (MOG) peptidom emulgovanom u kompletnom Freundovom adjuvansu (CFA) praćeno (24 sata kasnije) Pertusis toksin (PTKS) injekcijom da indukuju bolest. Rezultat bolesti je određen na osnovu sledećih simptoma: (0) bez simptoma; (1) mlitavi rep; (2) mlitav rep sa slabošću zadnjih nogu; (3) delimična paraliza zadnjih nogu; (4) kompletna paraliza zadnjih nogu; (5) paraliza svih udova; i (6) uginuće. Dvanaest do dvadeset četiri sata pre imunizacije, miševi u pre-indukcionoj grupi (n = 10) su takođe primili subkutanu injekciju od 25 mg/kg ili anti-D114 At (REGN577) ili izotipskog kontrolog At (humano antitelo specifično za CD20, pripremljenih u kući u skladu sa opisom u US 2008/0260641) ili PS/ 2 (pacova/miša IgG2b protiv mišjeg integrin-like ćelijskog adhezionog molekula VLA-4; ATCC # CRL-1911), dok su miševi u post-indukcionoj grupi (n = 10) primali isto u danu kada su se pojavili simptomi. PS/2 At je poznato da pogoršava povratak bolesti i povećava akumulaciju CD4<+>T ćelija u centralnom nervnom sistemu kod mišjeg modela za povratni eksperimentalni autoimuni eneefalomijelitis (R-EAE)
(Theien BE et al, 2001, J Clin Invest 107 (8):995- 1006). Injekcije antitela su vođene dva puta nedeljno, tokom dve nedelje. Na kraju eksperimenta, kičmene moždine ovih miševa su pažljivo uklonjene, drobljene i zatim inkubirane u RPMI 1640 medijumu koji sadrži Collagenase D (Sigma Aldrich). EDTA na 2 mM se dodaje da se zaustavi reakcija i smeša je propuštena kroz ćelijsku cediljku od 70-mm i sadržaj ćelija je analiziran pomoću protočne citometrije.
[0083]Kao što je prikazano na si. 9A i 9B, miševi tretirani sa kontrolnim izotipskim At su razvili simptome (tj, imaju rezultat bolesti viši od "0") počev od oko 10-14 dana i dostižu pikove između 15 i 21 dana nakon injekcije MOG. Nasuprot tome, miševi tretirani sa D114 At su u potpunosti zaštićeni od progresije bolesti u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnim At. Tabela 7 prikazuje onoliko puta-povećanje u procentima i u apsolutnom broju Tregs u timusu i slezini miševa tretiranih sa D114 At-om, u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnim At-om.
[0084]Tregs izgleda da se primarno proširuju unutar timusa u oko 18 danu i značajna ekspanzija je viđena na periferiji (tj, slezini) tek nakon 21 dana.
[0085]Pod ovim posebnim eksperimentalnim stanjem, tretman D114 At u post-indukcionoj fazi nije pokazao značajno poboljšanje u progresiji bolesti. Doze i/ili učestalost primene D114 At se mogu dalje podešavati u okviru znanja stručnjaka sa iskustvom u tehnici. Važnije, međutim, miševi koji su primili pre-indukciono D114 At su ispoljili značajno smanjenje u infiltraciji ćelija u kičmi u 18 danu, u poređenju sa onima koji su primili kontrolna At (videti Tabelu 8 ispod). Celijska infiltracija primećena u kičmenoj moždini miševa tretiranih sa kontrolnim At može biti glavni doprinos procesu bolesti kod ovih miševa.
[0086]Kao što je prikazano u tabeli 8, bilo je smanjenje za 8 puta (p <0,0001) u makrofagima (F4/80<+>), 2,7 puta smanjenje (p <0,0001) u NK ćelijama, 1,7 puta smanjenje (p <0,001) u CD1 lb ćelijama, i 2,5 puta smanjenje (p <0,001) u B ćelijama u kičmenoj moždini miševa tretiranih sa D114 At, u poređenju sa kičmenom moždinom miševa tretiranih sa kontrolnim At u 21-om danu.
[0087]Nadalje, proizvodnja IL-17 i IFN-y u limfnim čvorovima miševa tretiranih sa D114 At je bila značajno smanjena (p <0,001) (si. 10). Tako, D114 može biti uključen u patogenezu EAE posredovanjem razvoja Thl i D114 At tretman može sprečiti indukciju bolesti blokiranjem sekrecije Thl i Thl7 citokina.
Primer 6. UticajDU4blokade na dijabetes
[0088] Uticaj D114 blokade na dijabetes je takođe testiran na NOD/ShiLtJ miševima ("NOD miševima"), jednom poligenskom modelu za dijabetes tip 1 (Makino S et al., 1980, Jikken Dobutsu 29 (1):1-13; Serreze DV et al, 1997, J Immunol 158 (8): 3978-86). Dijabetes kod NOD/ShiLtJ miševa je karakterisan insulitisom i leukocitnom infiltracijom ostrvaca pankreasa. Označeni pad u pankreasnom sadržaju insulina se dešava spontano kod ženki oko 12 nedelja starosti i nekoliko nedelja kasnije kod mužjaka. Shodno tome, nivoi glukoze u plazmi se povećavaju do više od 250mg/dl. NOD miševi su proveravani dva puta nedeljno na nivo glukoze u krvi, korišćenjem ONETOUCH<®>Mini (LifeScan, Inc.). Miševi su bili smatrani kao dijabetični nakon dva uzastopna čitanja preko 250 mg/dL glukoze u krvi. Početak dijabetesa je datirao od prvog od uzastopnih merenja dijabetesa. Miševima su injektovani hFc (n = 5) ili anti-D114 At (Regn577) (n = 10) 25 mg/kg dva puta nedeljno tokom 7 nedelja sa početkom u 9 nedelji starosti. Nivoi glukoze u krvi su praćeni jednom nedeljno sa uzorcima krvi iz repa.
[0089] Kao što je prikazano na si. 11 A, miševi tretirani sa hFc su počeli da razvijaju spontani dijabetes sa nivoima glukoze u krvi većim od 250 mg/dL nakon 13 nedelja starosti (•). Nasuprot tome, miševi tretiram sa anti-D114 At (REGN577) nisu pokazali znake povećanja nivoa glukoze tokom 25 nedelja starosti (■) i merenja su bila nastavljena tokom dodatnih 10 nedelja. D114-At tretman pre početka dijabetesa je sprečio razvoj dijabetesa i činilo se da tretirane životinja neće nikada razviti dijabetes. Zanimljivo, kada je 5 od 10 miševa tretiranih sa D114 At injektovano sa anti-CD25 (PC61) mAt u 20 nedelji starosti u cilju smanjenja Tregs (♦), njihovi nivoi glukoze u krvi su počeli da se povećavaju 1-2 nedelja kasnije i miševi su postali dijabetični. Ovo ukazuje da preventivno dejstvo D114 At na dijabetes tipa 1 je posredovano, bar delimično, pomoću ćelija Tregs (si 11A).
[0090] Insulin i GAD65 su dva standardna auto-antitela koja se nalaze u serumima NOD miševa sa dijabetesom kao i kod pojedinaca sa dijabetesom. Prema tome, serumski nivoi autoantitela kod miševa tretiranih sa hFc kontrolom ili D114 At su bili mereni pomoću ELISA. Kao što je prikazano na si. 11B, D114-At tretman je blokirao proizvodnju anti-insulinskih (□) i anti-GAD65 (■) auto-antitela pri nivoima sličnim onima kod netretiranih WT C57B1/6 (tj ne-NOD miševa; negativne kontrolne životinje). Nasuprot tome, NOD (dijabetični) miševi koji su primili hFc kontrolu su imali visoke nivoe autoantitela u njihovim serumima. Pored toga, kada su delovi pankreasa 23-nedelja starih miševa, koji su tretirani sa D114 At i koji ne pokazuju nikakve simptome dijabetesa, bojeni sa H & E (hematoksilinom i eozinom), normalni brojevi ostrvaca pankreasa (ćelija koje proizvode insulin ili glukagon i njihovo uništenje je u direktnoj korelaciji sa pojavom dijabetesa) sa očuvanom morfologijom su posmatrani (si. 11 C, levi panel, i si. 1 ID, levi panel). Nadalje, nije bilo zapažene ćelijske infiltracije unutar ostrvaca kod D114 At-tretiranih miševa (si. 11C, levi panel i si. 11D, desni panel). Nasuprot tome, dijabetične životinje, tretirane sa hFc kontrolom su imale značajno niže brojeve ostrvaca pankreasa (si. 11C, desni panel i si. 11D, levi panel) u njihovom pankreasu nego kod D114 At-tretiranih miševa i preostala veoma retka ostrvca su sadržala visoke nivoe ćelijske infiltracije (si. 11C, desni panel i si. 1 ID, desni panel). Stoga, D114 At je sposobno da u potpunosti spreči dijabetes u produženom periodu i njegov efekat izgleda da je, bar delimično, posredovan ekspanzijom ćelija Tregs; međutim, moguće je da dodatni mehanizam (i) mogu biti uključeni u zaštitnom dejstvu D114 At na ostrvca pankreasa i/ili insulin.
[0091] Stvarni nivo glukoze u krvi dijabetičnih miševa tretiranih sa D114 At su određeni i poređeni sa onim miševima koji su tretirani sa hFc kontrolom. Dijabetični miševi su tretirani sa 25 mg/kg D114 At (n = 3) ili kontrolom hFc (n = 4) na početku bolesti (dan 0). Nakon D114 At tretmana, dijabetični miševi su značajno smanjili nivoe glukoze od oko 350 mg/dL na normalan nivo (oko 120-130 mg/dL) (si. 11E). Ovaj efekat je trajao u prošeku od 4 do 5 nedelja. Uopšteno, dalje je primećeno da kada dijabetični miševi koji imaju manje od 350 mg/dL glukoze u krvi su bili tretirani sa D114 At, njihovi nivoi glukoze su pali na normalan nivo i ovaj efekat je trajao duže od onih koji su imali više od 350 mg/dL glukoze u krvi za vreme tretmana. Ovo ukazuje da postoji određeni prozor mogućnosti za produženi i efikasan tretman za kontrolu nivoa glukoze u krvi sa D114 At. Tako, bez vezivanja od strane drugih, specifičnih mehanizama koji su ovde opisani, ova zapažanja sugerišu da D114 antitela imaju veliki terapeutski potencijal za dijabetes tipa 1.
[0092] Rezultati iz gornjih eksperimenata su otkrili postojanje do tada nepoznate regulatorne petlje koja kontroliše brojeve Treg ćelija i DC ćelijain vivo.Ovo regulatorno kolo je verovatno od suštinskog značaja za ravnotežu između imuniteta i tolerancije, ali što je najvažnije čini, po prvi put, vezu između tri važne komponente imunog sistema, tj, D114-DCs-Tregs. Stoga, terapija sa antagonistima D114 predstavlja efikasnu metodologiju za kontrolu broja ćelija Tregin vivoi posledično kontrolu progresije autoimunih bolesti i srodnih stanja.

Claims (9)

1. Delta-like ligand 4 (D114) antagonist za upotrebu u prevenciji, lečenju ili poboljšanju diabetes mellitusa tipa 1 kod subjekta, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora i dijabetes jc sprečen, lcčcn ili poboljšan i gde je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen iz D114 koji je fuzionisan za Fc domen humanog IgG.
2. Delta-like ligand 4 (D114) antagonist za upotrebu u snižavanju nivoa glukoze u krvi povezane sa diabetes mellitusom tipa 1 kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora i nivo glukoze u krvi je snižen, naznačen time što je D114 antagonist antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve, ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je fuzionisan sa Fc domenom humanog IgG.
3. D114 antagonist za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji obuhvata sekvence teškog lanca CDR1, CDR2 i CDR3 od SEK ID BR: 22, 24 i 26, respektivno i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata sekvence lakog lanca CDR1, CDR2 i CDR3 od SEK ID BR: 30, 32 i 34, respektivno.
4. D114 antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu antitelo ili njegov fragment obuhvataju (a) HCVR sekvencu od SEK ID BR: 20 ili 116 i LCVR sekvencu od SEK ID BR: 28 ili 118, ili (b) kombinaciju HCVR/LCVR od SEK ID BR: 20/28 ili 116/118.
5. D114 antagonist za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim agensom odabranim od sredstva za snižavanje glukoze u krvi, imunosupresora, anti-inflamatornog sredstva i analgetika, opciono naznačen time: (i) dodatni terapeutski agens je najmanje jedan odabran iz grupe koja se sastoji od insulina ili njegovih analoga, glukokortikoida, ciklosporina, metotreksata, nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAIDs), antagonista TNF-a, antagonista IL-1, antagonista IL-6 i opioida; i/ili (ii) D114 antagonist i najmanje jedan dodatni teraputski agens su za istovremenu ili sekvencijalnu primenu.
6. Upotreba delta-like ligand 4 (D114) antagoniste u izradi leka za prevenciju, lečenje ili poboljšanje diabetes mellitusa tipa 1 kod subjekta, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora, i gde je D114 antagonist antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je spojen sa Fc domenom humanog IgG.
7. Upotreba delta-like ligand 4 (D114) antagoniste u izradi leka za snižavanje nivoa glukoze u krvi koji je povezan sa diabetes mellitusom tipa 1 kod subjekta, pri čemu antagonist blokira interakciju između D114 i Notch receptora, i gde je D114 antagonist antitelo ili fragment antitela koji specifično vezuje hD114 i blokira D114-Notch signalne puteve ili fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen D114 koji je spojen sa Fc domenom humanog IgG.
8. Upotreba prema patentnim zahtevima 6 ili 7, naznačena time što antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji obuhvata teškog lanca CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence od SEK ID BR: 22, 24 i 26, respektivno i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata lakog lanca CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence od SEK ID BR: 30, 32 i 34, respektivno.
9. Upotreba prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što antitelo ili njegov fragment sadrže (a) HCVR sekvencu od SEK ID BR: 20 ili 116 i LCVR sekvencu od SEK ID BR: 28 ili 118, ili (b) kombinaciju HCVR/LCVR od SEK ID BR: 20/28 ili 116/118.
RS20170036A 2010-01-29 2011-01-28 Metode lečenja dijabetesa sa dll4 antagonistima RS55595B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29980110P 2010-01-29 2010-01-29
US36168710P 2010-07-06 2010-07-06
US38869710P 2010-10-01 2010-10-01
EP11701735.0A EP2528945B1 (en) 2010-01-29 2011-01-28 Methods of treating diabetes with dll4 antagonists
PCT/US2011/022817 WO2011094467A2 (en) 2010-01-29 2011-01-28 Methods of treating diabetes with dll4 antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55595B1 true RS55595B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=43925413

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170036A RS55595B1 (sr) 2010-01-29 2011-01-28 Metode lečenja dijabetesa sa dll4 antagonistima
RS20170142A RS55715B1 (sr) 2010-01-29 2011-01-28 Metode lečenja autoimunih bolesti sa dll4 antagonistima

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170142A RS55715B1 (sr) 2010-01-29 2011-01-28 Metode lečenja autoimunih bolesti sa dll4 antagonistima

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8889133B2 (sr)
EP (2) EP2528945B1 (sr)
JP (2) JP5883801B2 (sr)
KR (2) KR101832118B1 (sr)
CN (2) CN102884081A (sr)
AR (1) AR080026A1 (sr)
AU (2) AU2011210771B2 (sr)
BR (2) BR112012018766A2 (sr)
CA (2) CA2787394C (sr)
CY (2) CY1118223T1 (sr)
DK (2) DK2528946T3 (sr)
ES (2) ES2609663T3 (sr)
HR (2) HRP20170130T1 (sr)
HU (2) HUE031432T2 (sr)
IL (2) IL220889A (sr)
JO (2) JO3183B1 (sr)
LT (2) LT2528946T (sr)
MX (2) MX343553B (sr)
MY (2) MY156353A (sr)
PL (2) PL2528946T3 (sr)
PT (2) PT2528946T (sr)
RS (2) RS55595B1 (sr)
RU (2) RU2587624C2 (sr)
SG (4) SG182527A1 (sr)
SI (2) SI2528945T1 (sr)
SM (3) SMT201700021T1 (sr)
TW (2) TWI600433B (sr)
UY (1) UY33206A (sr)
WO (2) WO2011094467A2 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2448979C2 (ru) * 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
TWI465250B (zh) 2009-08-29 2014-12-21 Abbvie Inc 治療用之ｄｌｌ４結合蛋白質
EP3072526B1 (en) 2009-10-16 2018-09-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination and use of dll4 antagonist antibodies and anti-hypertensive agents
JO3183B1 (ar) 2010-01-29 2018-03-08 Regeneron Pharma طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4
EP2542582A4 (en) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4
EP2758073B1 (en) 2011-09-23 2018-10-31 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Vegf/dll4 binding agents and uses thereof
KR101535341B1 (ko) 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
KR20190096459A (ko) 2012-11-01 2019-08-19 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AR093445A1 (es) * 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
ES2742855T3 (es) 2013-07-09 2020-02-17 Ablbio Nueva proteína de objetivo doble que se une específicamente a DLL4 y CEGF, y uso de la misma
JP6560200B2 (ja) * 2013-10-17 2019-08-14 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 自己免疫疾患の治療に応答性の対象を同定する方法およびそれを治療するための組成物
WO2015154795A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Combination therapy for the treatment of autoimmune diseases
CN107530419B (zh) 2014-10-31 2021-05-18 昂考梅德药品有限公司 治疗疾病的组合疗法
JP6967003B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-17 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド がんの処置のための方法および組成物
US11446262B2 (en) 2018-11-29 2022-09-20 Debora Zucco Sassi Yonezawa Siviglia Neuroquiescence—a treatment for neurodevelopmental and neurodegenerative bioelectrical dysregulation and demyelination
EP3886856A4 (en) 2018-11-29 2022-01-19 Zucco Sassi Yonezawa Siviglia, Debora METHOD FOR TREATING OR PREVENTING SEIZURES ASSOCIATED WITH AN EPILEPTIC DISORDER
US20240287173A1 (en) * 2021-03-30 2024-08-29 National University Corporation Kumamoto University Therapeutic agent for muscular atrophy
WO2023159166A1 (en) * 2022-02-18 2023-08-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Single-domain antibodies (nanobodies) targeting the notch ligand dll4 and methods of their use
WO2025212726A2 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Compass Therapeutics, Inc. Combination of antibodies targeting dll4/vegf and cd137 agonists or anti-pd1/anti-pd-l1 antibodies for the treatment of cancer

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
WO2003099281A2 (en) * 2002-05-21 2003-12-04 Cv Therapeutics, Inc. Administration of a partial fatty acid inhibitor such as ranolazine for the treatment of diabetes
JP5848861B2 (ja) 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
US20060134121A1 (en) 2004-10-29 2006-06-22 Gavin Thurston DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
NZ568739A (en) 2005-12-16 2010-09-30 Regeneron Pharma Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with delta-like ligand 4 antagonists
MX2008014804A (es) 2006-06-02 2009-01-27 Regeneron Pharma Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano.
RU2008152435A (ru) 2006-06-06 2010-07-20 Дженентек, Инк. (Us) Композиции и способы регулирования развития сосудов
WO2008060705A2 (en) * 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
CN101500605B (zh) 2006-08-07 2014-04-30 瑞泽恩制药公司 Dll4拮抗剂在治疗局部缺血性损伤中的用途
AU2007305443B2 (en) 2006-09-29 2012-08-23 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
RU2448979C2 (ru) * 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
TWI465250B (zh) * 2009-08-29 2014-12-21 Abbvie Inc 治療用之ｄｌｌ４結合蛋白質
JO3183B1 (ar) 2010-01-29 2018-03-08 Regeneron Pharma طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4

Also Published As

Publication number Publication date
LT2528946T (lt) 2017-01-25
JO3183B1 (ar) 2018-03-08
SMT201600412B (it) 2017-01-10
EP2528945A2 (en) 2012-12-05
CA2787394C (en) 2019-01-08
WO2011094467A2 (en) 2011-08-04
RU2012136817A (ru) 2014-03-10
HUE032985T2 (en) 2017-11-28
KR20130008017A (ko) 2013-01-21
MX2012008638A (es) 2012-12-05
TWI600433B (zh) 2017-10-01
TW201136601A (en) 2011-11-01
IL220889A0 (en) 2012-09-24
EP2528946B1 (en) 2016-11-16
AU2011210773B2 (en) 2015-11-19
CY1118223T1 (el) 2017-06-28
EP2528946A1 (en) 2012-12-05
SI2528945T1 (sl) 2017-01-31
SMT201700021T1 (it) 2017-03-08
JP5997613B2 (ja) 2016-09-28
ES2609663T3 (es) 2017-04-21
CA2787615C (en) 2019-01-15
SG182528A1 (en) 2012-08-30
SG182527A1 (en) 2012-08-30
WO2011094465A4 (en) 2011-09-22
JP2013518122A (ja) 2013-05-20
SG10201500416RA (en) 2015-04-29
CA2787615A1 (en) 2011-08-04
AU2011210771B2 (en) 2015-12-10
US20110189200A1 (en) 2011-08-04
PL2528945T3 (pl) 2017-02-28
SI2528946T1 (sl) 2017-01-31
US8889133B2 (en) 2014-11-18
RU2587620C2 (ru) 2016-06-20
AU2011210773A1 (en) 2012-08-23
CN102947336A (zh) 2013-02-27
RU2012136816A (ru) 2014-03-10
DK2528945T3 (en) 2017-02-06
BR112012018820A2 (pt) 2017-01-10
HUE031432T2 (en) 2017-07-28
TWI564019B (zh) 2017-01-01
PT2528946T (pt) 2016-12-14
IL220887A (en) 2017-07-31
JP2013518123A (ja) 2013-05-20
CN102947336B (zh) 2015-12-02
HRP20170249T1 (hr) 2017-04-07
US20140255429A1 (en) 2014-09-11
JP5883801B2 (ja) 2016-03-15
US8765125B2 (en) 2014-07-01
AR080026A1 (es) 2012-03-07
MY156538A (en) 2016-02-26
WO2011094467A3 (en) 2011-12-22
JO3242B1 (ar) 2018-03-08
PT2528945T (pt) 2016-12-14
DK2528946T3 (en) 2017-02-20
WO2011094465A1 (en) 2011-08-04
BR112012018820A8 (pt) 2018-03-13
PL2528946T3 (pl) 2017-04-28
CA2787394A1 (en) 2011-08-04
MX343553B (es) 2016-11-10
RS55715B1 (sr) 2017-07-31
BR112012018766A2 (pt) 2017-01-10
CY1118551T1 (el) 2017-07-12
CN102884081A (zh) 2013-01-16
KR101797918B1 (ko) 2017-11-15
US20110189176A1 (en) 2011-08-04
MX343555B (es) 2016-11-10
SG10201500404QA (en) 2015-03-30
EP2528945B1 (en) 2016-10-26
IL220889A (en) 2017-07-31
UY33206A (es) 2011-08-31
KR20120123745A (ko) 2012-11-09
KR101832118B1 (ko) 2018-02-26
MY156353A (en) 2016-02-15
SMT201700021B (it) 2017-03-08
ES2605430T3 (es) 2017-03-14
MX2012008740A (es) 2012-08-31
AU2011210771A1 (en) 2012-08-23
LT2528945T (lt) 2017-01-25
RU2587624C2 (ru) 2016-06-20
HRP20170130T1 (hr) 2017-03-24
TW201615207A (zh) 2016-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2787615C (en) Methods of treating diabetes with dll4 antagonists
US20240309100A1 (en) Anti-Trkb Monoclonal Antibodies And Methods Of Use
HK1179629A (en) Methods of treating diabetes with dll4 antagonists
HK1179629B (en) Methods of treating diabetes with dll4 antagonists
HK1179630A (en) Methods of treating autoimmune diseases with dll4 antagonists
HK1179630B (en) Methods of treating autoimmune diseases with dll4 antagonists