PT96156B

PT96156B - Processo para a preparacao de novos derivados da piperidina

Info

Publication number: PT96156B
Application number: PT96156A
Authority: PT
Inventors: Gilbert Regnier; J F Renaud De La Faverie; Alain Lombet; Jean-Pierre Iliou; Jean-Paul Vilaine; Jean-Pierre Bidouard; Albert Lenaers
Original assignee: Adir
Priority date: 1989-12-12
Filing date: 1990-12-11
Publication date: 1998-05-29
Also published as: US5126356A; JPH07100695B2; CA2031839A1; IE66909B1; PT96156A; AU6793690A; FR2655649A1; FR2655649B1; DE69007045T2; DK0433167T3; AU629076B2; ES2052217T3; ZA909768B; EP0433167B1; DE69007045D1; JPH06340626A; ATE102186T1; NZ236231A; IE904434A1; OA09473A

Description

A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de derivados da piperidina de fórmula geral

R - S (I) na qual:

úm dos substituintes R ou R’ representa um radical de fórmula geral (R.O)m

CH na qual:

m representa um número inteiro compreendido entre 1 e 3 e representa um radical alquilo comportando 1 a 5 átomos de carbono, e

o outro substituinte R ou R' representa quer um radical de fórmula geral

R’ na qual:

A representa uma cadeia hidrocarbonada comportando 1 a 5 átomos de carbono contendo, eventualmente, uma li-2gação dupla ou um átomo de oxigénio ou de enxofre, eventualmente substituída por um radical hidroxi ou um ou vários radicais metilo;

n representa o número 1 ou 2;

R₂, R'₂, R”₂ e R'₂ iguais ou diferentes .representam cada um um átomo de .hidrogénio,ou de halogênio, .tal eomo o 'cloro ou o flúor, ou um radical alquilo ou alcoxi comportando, cada um, 1 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, ou um radical hidroxi;

quer um radical de fórmula geral

- Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre,.

- R” representa um átomo de hidrogénio ou um radical metilo;

- p representa o número zero ou um

- A, R₂, R’₂, ^”2 ^e R^,H2 ^os significados definidos antes.

-30 estado anterior da técnica neste domínio é ilustrado particularmente, pelo pedido de patente de invenção europeia publicado sob o n^ 0149088 que diz respeito aos derivados de fórmula geral ^Rb-L

-X ’ - A ]q;' (0Η₂)η'_χ

N-R / ^G(CH₂)m’^/ na qual:

- R_a e representam substutuíntes clássicos;

- X’ representa, entre outros, um átomo de enxofre;

- Alq' representa uma cadeia alquilénica com 0 a 4 átomos de carbono,

- n' em’ iguais ou diferentes representam números inteiros de 1 a 3 e R_c representa, entre outros, um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo ( C₁ - Cg ), alquenilo ( C^ - Cg ), alquinilo ( - Cg ), cicloalquilo ( C^ - C? ) ou cicloalquenilo ( C^ - C? ) ;

Os quais têm propriedades analgésicas.

Esta patente de invenção europeia não descreve nem sugere os derivados da piperidina preparados pelo processo de acor do oom a presente invenção, os quais encontram aplicação no tratamento das patologias ligadas à isquémia tecidular, o que não é o caso dos derivados da técnica anterior referida antes.

A presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de derivados de fórmula geral I, caracterizado pelo facto de se condensar um derivado de fórmula geral

-4R-S

N-H (II) na qual R tem o significado definido antes, com um composto de fórmula geral

Y-R’ na qual R’ tem o significado definido antes e Y representa um átomo de cloro ou de bromo, ou um radical tosiloxi.

A condensação efectua-se de um modo particularmente adequado no seio de um dissolvente polar tal como, por exemplo, um álcool de baixo peso molecular, a dimetilformamida ou a dimetilacetamida, ou no seio de um dissolvente aprótioo, polar tal como por exemplo o acetonitrilo ou a metiletilcefeona., na presença de um agente de fixação do hidrácido formado durante a reacção, a uma temperatura compreendida entre 80° e 130° C.

Os compostos iniciais de fórmula geral II .podem preparar-se .de. acordo com a técnica descrita na patente de invenção europeia n2 0149088, a partir do derivado de fórmula

H-S

N-CH (IV) por sua vez preparado de acordo com o método descrito por H.BARRERA e R.LYLE J. Org. Chem.” 27, 641-643 (1962).

método mais adequado consiste em condensar um derivado

-5de fórmula geral III com o derivado de fórmula IV previamente sodado por meio de um hidreto alcalino no seio de um dissolvente aprótico polar tal como a dimetilformamida ou a dimetilacetamida, ou por meio de um alcoolato alcalino no seio de um álcool de baixo ponto de abulição, servindo os respectivos dissolventes de meio reaccional, a temperaturas compreendidas entre 80° e 130° C.

Transformam-se os derivados obtidos de fórmula geral

na qual R tem o significado definido antes, em derivados de fórmula geral

R-S V N-COOC₂H₅ (VI) na qual R tem o significado definido antes, que se hidrolisam oom ácido clorídrico concentrado ou com I Si (CH^)^ no seio de um dissolvente aprótico, para se obter os derivados de fórmula geral II.

Os derivados de fórmula geral I podem igualmente preparar-se de acordo com uma variante do método descrito anteriormente.

Este processo, que está igualmente incluído na presente invenção, caracteriza-se pelo facto de se condensar um derivado de fórmula geral

R’-N

SH (Ila) na qual R’ tem o significado definido antes, oom um composto de fórmula geral

Y-R (Illa) na qual Y e R têm os significados definidos antes.

A condensação efectua-se de modo particularmente adequado no seio de um dissolvente polar tal como um álcool de baixo ponto de ebulição, o cianeto de acetilo, a metiletilcetona, a dimetilformamida ou a dimetilacetamida, a uma temperatura compreendida entre 80° e 110° C, na presença de um agente alcalino tal como por exemplo o carbonato de sódio ou de potássio .

A condensação pode igualmente realizar-se a partir do deri vado de fórmula geral II previamente sodado por meio de um alcoolato ou de um hidreto de sódio.

Os derivados de fórmula geral I obtidos de acordo com os métodos anteriormente descritos, podem purificar-se mediante cristalização no estádio de sais ou de bases, ou mediante cromatografia rápida sobre sílica (35-70yi) separados por sistemas tais como por exemplo acetato de etilo/ acetona, acetato de etilo/ metanol, acetato de etilo/ diclorometano, diclorometano/ /metanol ou diclorometano/ ciclo-hexano.

Os derivados de fórmula geral I formam sais com ácidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico-sais cuja preparação está incluída na presente invenção.

Os derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção possuem propriedades farmacológicas e terapêu-7ticas interessantes. Em particular, para estes derivados, demonstrou-se, in Vitro a protecção celular face às consequências da acidose intracelular e a inibição dos canais cálcicos lentos; e in Vivo a prevenção e a limitação dos efeitos induzidos pela isquémia miocardíaca.

Estas propriedades permitem a utilização dos derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção como medicamento no tratamento das patologias ligadas à isquémia tecidular, particularmente no domínio cardiovascular: angina de peito; enfarto do miocárdio, consequências das cardiopatias isquémicas; e da patologia vascular periférica.

Os derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção podem igualmente ser utilizados no domínio cerebral, particularmente para o tratamento do acidente vascular cerebral e de manifestações deficitárias ligadas aos distúrbios circulatórios cerebrais crónicos; no domínio oftalmológico: particularmente para o tratamento dos distúrbios retinianos de origem vascular; e nas manisfestações neuro-sensoriais de origem isquémica.

Além disso, para alguns derivados demonstrou-se a sua capacidade para proteger, in Vitro , por um lado as LDL humanas (lipoproteínas de baixa densidade que asseguram o transporte do colesterol), face a modificações oxidativas implicadas na ate rogenese e, por outro lado, as células cardíacas face a uma necrose oxidativa.

Estas propriedades tornam estes compostos particularmente interessantes para a prevenção ou o tratamento das patologias em

-8que uma peroxidação lipídica desempenha uma função iniciadora e/ ou agravante: tais como, por exemplo, as lesões vasculares aterosclerosas particularmente no quandro das dislipidémias, as cardíopatias isquémicas a reperfusão de órgãos compreendendo transplantados, as patologias isquémicas, traumáticas ou degenerativas do sistema nervoso central ou periférico, as doenças inflamatórias agudas ou crónicas e as doenças autoimunes.

A presente invenção tem igualmente por objecto a preparação de composições farmacêuticas contendo como ingrediente activo um derivado de fórmula geral I ou um dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, misturado ou associado a um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, como por exemplo a glucose, a lactose, o amido, o talco, a etilcelulose, o estearato de magnésio ou a manteiga de cacau.

As composições farmacêuticas assim obtidas apresentam-se geralmente sob forma doseada e podem conter entre 1 e 200 mg de ingrediente activo. Podem apresentar, por exemplo, a forma de comprimidos, drageias, gélulas, supositórios, soluções injectáveis ou bebíveis e ser, de acordo com os casos administrados por via oral, rectal ou parenteral em doses compreendidas entre 1 e 200 mg 2 a 3 vezes por dia.

Os exemplos que se seguem ilustram o processo de acordo com a presente invenção, sem contudo a limitarem de modo algum, sendo os pontos de fusão determinados na platina aquecida de Kofler, salvo menção em contrário

Exemplo 1:

( 2,3,4 - trimetoxi-benzil) - 4-tio-1-cinamil -piperidina

Aquece-se, durante 15 horas a refluxo uma mistura de 10g de (2,3,4— trimetoxi-benzil)-4-tio-piperidina e 6,6g de brometo de cinamilo em 300 ml de CH^CN, na presença de 4,64g de carbonato de potássio e 0,5g de iodeto de potássio. Filtra-se em seguida o sal e evapora-se o filtrado sob pressão reduzida. Retoma-se o resíduo com cloreto de metileno/água e após decantação seca-se a fase em diclorometano sobre sulfato de sódio e evapora-se sob pressão reduzida. Purifica-se o resíduo assim obtido (15g) mediante cromatografia sobre 600g de sílica com o sistema tolueno (metanol 95/5). Obtém-se deste modo 10g de base bruta, que se transforma em fumarato em meio etanólico. Obtêm-se deste modo 7g de fumarato de (2,3,4— trimetoxi-benzil)-4-tio-1-cinamil-piperidina, sob a forma de cristais brancos que fundem a 129°C.

Prepara-se a (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-piperidina inicial, cujo fumarato funde a 154°C, mediante hidróxido de potássio e etanol, da (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-1-carbetoxi-piperidina (óleo), preparada mediante reacção de C1COOC₂H,em benzeno com (2,3,4-trimetoxi- benzil)-4-tio-1-metil-piperidina (P.F.: do fumarato correspondente 130°C), por sua vez preparada mediante condensação do cloreto de 2,3, 4-trimetoxi-benzilo em etanol com o sal de sódio da 1-metil-4-piperidina, P.E./^ :70-72°C.

De acordo com o mesmo processo, prepararam-se os derivados

-10objecto dos exemplos 2 a 30.

Exemplos 2-30:

2) A (2,33-trimetoxi-benzil)-4-tio-bis-p. 1-fluorobenzidril-piperidina e o seu fumarato P.F.: 179°C (etanol/ éter).

3) A (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-( 2-benzofuranil)-1-metil- piperidina e o seu cloridrato P.F. (cap): 165°C (etanol).

4) A (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-(5-fluoro-2-benzofuranil) -1-metil-piperidina e o seu cloridrato P.F.: 188°C (etanol)

5) A (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-(2-benzotienil)-1 -met-il-piperidina, P.F.: 115°C.

6) A 4-cinamiltio-1-(2,3,4-trimetoxi-benzil)-piperidina e o seu fumarato P.F.: 1ó5°C (etanol).

7) A (2,3»4-trimetoxi-benzil)-4-tio-1-(4-fluoro-cinamil)-piperidina e o seu cloridrato P.F.: 164°C (etanol/ éter).

8) A ( 3,4,5-trimetoxi-benzil)-4-tio-1 -cinamil-piperidina P.F'.: 92°C.

9) A (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio (À3-cromenil-3)-1-metil-piperidina e o seu cloridrato P.F.: 202°C.(etanol)

10) A (2,4,5-trimetoxi-benzil)-4-tio-1-cinamil-piperidina,

P.F.: 105°C.

11) A 4-benzidriltio-1-(2,3,4- trimetoxi-benzil)-piperidina e o seu fumarato P.F.: 105°C (etanol).

12) A bis-p. 4—fluorobenzidriltio-1-(2,3₇trimetoxi-benzil)- piperidina e o seu fumarato P.F.(cap): 170-172°C (etanol).

-1113) Α (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-benzil)-piperidina e o seu fumarato P.F.: 202°C.

14) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-fenoxi)-propil]- piperidina e o seu fumarato P.F. (cap): 156-158°C.

15) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(3,5- dibutil terc. -4- hidroxi-fenil)- propil]- piperidina e o seu fumarato P.F. (cap): 143-145°C.

16) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-fenil-tio)-2- hidroxi-propil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 120°C.

17) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-fenoxi)-2- hidroxi-propil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 16O°C.

18) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(3,5- dibutil- terc.-4-hidroxi-fenil-tio)-propil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 135°C.

19) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3-(2,3,5 -trimetoxi-4-hidroxi-fenoxi)- propil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 164°C.

20) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[5-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-feniltio)- pentil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 138°C.

21) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[5-( 3,5- dibutil- terc.-4-hidroxi-fenoxi)- pentil]- piperidina e o seu fumarato P.F.: 142°C.

-1222) Α (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-C 3- (3,5 -dibutil terc.-4-hidroxi-feniltio)-3- metil-butil]- piperidina.

23) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[3- (3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-fenoxi)-3-metil-butil]- piperidina.

24) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1- [ 3- (2,3,5- trimetil-4-hidroxi-fenoxi) -3- metil-butil]- piperidina.

25) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[ 3-(3,5- dibutil terc.-4- hidroxi-feniltio)- 2,2- dimetil- propil]- piperidina.

26) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[ 3-(3,5- dibutil terc.-4-hidroxi-fenoxi)- 2,2 - dimetil- propil]- piperidina.

27) A (2,3,4-trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[ 3-(2,3,5- trimetil -4-hidroxi-fenoxi)-2,2 - dimetil - propil] piperidina.

28) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[ (2-metil-5,7,8-trimetil -6- hidroxi-2-cromanil)- metil]- piperidina.

29) A (2,3,4- trimetoxi- benzil)-4-tio-1-[ 2-(2-metil-5,7,8-trimetil -6- hidroxi -2- cromanil)- etil]- piperidina.

30) A (2,3,4- trimetoxi-benzil)-4-tio-1-[ 3-(2- metil-5,7,8trimetil -6- hidroxi -2- cromanil)- propil]- piperidina.

Exemplo 31σ (2,3,4- trimetoxi-benzil) -4-tio-bis-1-p.-fluorobenzidril-piperidina.

A uma solução de 3,2g de 4- mercapto- bis- 1-p. fluorobenzidril- piperidina em 50 ml de dimetilformamida, adiciona-se 0,5g de hidreto de sódio a 50$ em óleo.

Agita-se durante uma hora e adicionam-se à solução aobtida 2,4g de cloreto de 2,3,4- trimetoxi- benzilo. Aquece-se em seguida a solução durante 3 horas, a 80°C, arrefece-se depois e evapora-se a dimetilformamida.

Trata-se à fase residual com água e diclorometano. Decanta-se a fase em diclorometano e após evaporação obtêm-se 5g de base bruta que se submete a uma cromatografia sobre 200g de sílica eluindo com a mistura tolueno/ metanol (95:5).

Obtêm-se deste modo 3,5g de (2,3,4- trimetoxi- benzil) -4-tio- bis- 1- p.fluorobenzidril- piperidina, sob a forma de base pura, cujo fumarato cristalizado no seio de etanol funde a 170°C. Preparou-se a 4- mercapto- bis- 1-p.-fluorobenzidrilpiperidina inicial (óleo) por analogia com o método descrito por H. BARRERA e Colab. J. Org. Chem. ” 27, 641-643 (1962) a partir da 1-benzidril -4- piperidinona que funde a 108°C.

Os compostos iniciais de fórmula geral II utilizados para a síntese dos derivados exemplificados anteriormente estão reunidos no quadro a seguir:

Derivados de fórmula geral:

\

R-S

NH

Os compostos iniciais halogenados ou tosiloxi utilizados, para a síntese dos derivados exemplificados anteriormente estão reunidos no quadro a seguir:

-15ο fa

Ph

	S
0	0
w	O	fa
o>		S
eti	rH	O
Sh	o
eti	o	s
ex	o	d)
0)	rH
x	'eti	X
ex		ec
	0
<u	XJ	Ph
T3
	o	m
O	kti
Ό	O>	in
O	tf	se
-P	ε	MD
'<D	o	O
S	X
	CQ
	Z—~s
	(X
	eti
	o

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0)	o
rH	MD
<H
O	1

	CO
	m

MD cn in cn cn

CJ sc o

Sh pq

I cn

C\1 sc o

w o

Ό eti >

Ή

Sh ω

o

cn cn

SC o

u

SC

-18Exemplo 32:

ESTUDO FARMACOLÓGICO:

A) ESTUDO IN VITRO :

I. PROTECÇÃO FACE Ã ACIDOSE INTRACELULAR E INIBIÇÃO DOS CANAIS. CÁLCICOS LENTOS:

A acção dos derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção e em particular do derivado objecto do exemplo 1, foi demonstrada sobre células cardíacas de rato. Demonstrou-se os efeitos protectores celulares.contra os acontecimentos as sociados à acidose intracelular (isquémia-anóxia) assim como o efeito inibidor sobre a entrada do cálcio pelos canais cálcicos lentos. Os efeitos protectores do derivado do exemplo 1 foram determinados em relação à sequência primária dos acontecimentos necrosantes induzidos quando da isquémia e esta de modo comparativo com a dos dicloridrato de trimetazidina (DCI) e da cinarizina (DCI) tomados como produto de referência.

Oé) Materiais e métodos

Cultura de células

a) Células cardíacas: as células cardíacas são preparadas a partir de coração de ratos Wistar recém-nascidos (3 dias) de acordo com a técnica descrita por RENAUD JF, MEAUX JP, ROMEY G, SCHMID A, LAZDUNSKI M, Activation of the voltage- dependente Ca²⁺ channels in rat heart cells by dihydropyridine derivative ” - ” Biochem. Biophys. Res. Commum., 125, 405-412, (1984).

-19Isolam-se os cardiomiocitos mediante dissociação enzimatica dos ventrículos e semeiam-se a 185.000 células/ om . Mantêm-se as células a 37°C sobre atmosfera de ar/ dióxido de carbono (95 V/ 5 V) saturada em água. Os cardiomiocitos são utilizados entre o 3² e o 82 dia depois do início da cultura.

b) A^r^ : linhas celulares provenientes da aorta de ratos recém-nascidos ( ATCC n^ CRL 1444 ) cultivadas de acordo com as condições indicadas pelo American Type Culture Collection (ATCC).

Estudo de ligação

Os estudos de ligação efectuam-se sobre fracções microssomais enriquecidas em canais cálcicos do tipo L [ cf. FOSSET M.,

LAZDUNSKI M. Biochemical characterization of the skeletal muscle 2+

Ca channel. In: Receptors Biochemistry and Methodology Venter JC, Triggle D., eds vol. 9, 141-159 (1986) e 0’ BRIEN R.A. Receptor binding in drug research. In: Clinicai pharmacology vol. 5. (1986)].

As experiências de competição entre os diferentes radioligandos e as moléculas de referência são efectuadas de acordo com as condições padrão de ligação segundo 0’ BRIEN R.A. Receptor binding in drug research. In: Clinicai pharmacology vol. 5 DEKKER M. Inc., New York e Basileia, (1986). Em todos os casos, depois do tempo necessário para a associação, a radioactividade ligada separa-se da componente livre mediante filtração sob vazio em filtro GF/C.

Fluxos ionicos

2+

Determinam-se os influxos de Ca sobre as A^r.. na preI b sença ou ausência de D 888 (inibidor específico do canal Ca²⁺do tipo L) e na presença ou ausência de concentrações variáveis do derivado do exemplo 1 de acordo com as condições publicadas sobre o coração por RENAUD J.F., KAZASOGLOU T., SCHMID A., ROMEY G., LAZDUNSKI M. Differentiation of [3H] nitrendipine receptor sites in chick hearts and physiological relation to the slow Ca²⁺ channel and to excitation - contraction coupling. Eur.J. Biochem., 139 673-681, (1984).

Eleotrofisiologia

Os estudos foram realizados sobre a linha celular A^r,7 5 utilizando a técnica de ” Whole cell patch-Clamp descrita por HAMILL D., MARTY A., WEHER E., SAKMANN B., SIGWORTH F.F. Improved patch clamp techniques for high resolution ourrent recording from cells and cell from membrane patches. Pflugers arch., 391, 85-100, (1981).

Determinação do índíoe de protecção depois da indução de uma acidose intracelular.

A acidose intracelular é induzida de acordo com as condições publicadas por RENAUD JF. ” Internai pH Na⁺ and Ca²⁺ regulation by trimetazidine during cardiac cell acidosis. Cardiovasc. Drugs and Ther.’’, 1, 667-689, ( 1988) na presença ou ausência dos compostos a ensaiar. Determina-se a necrose tecidular mediante medida da cinética de libertação no meio extracelular de uma enzima citosólioa a hidroxibutirato-desidrogenase HBDH) mediante espectrometria utilizando o con-21junto Boerhinger 124800.

|3l) Resultados

1) Efeito do derivado do exemplo 1 sobre a fixação do PN 200-110 e do D888 ao nível do canal Ca^⁺.

Comparação com o dicloridrato de trimetazidina e da cinarizina.

	Referência	Derivado do	Trimetazidina	Cinarizina
	^K0₎₅(M)	exemplo 1	2 HCI	^K0,5^(M)
		^K0,5^(M)	^K0,5^(M)
[3H] PN	Nifedipina	10^-6	> 10⁴	3,4 10“⁷
200-110	2,5 10“⁸
E3H ]	D888	1,3 10“⁶	>10^-4	5,2 10~⁷
D888	2,5 10“⁹

Os valores de K0,5 são expressos em Molar (mole/ litro) e correspondem à concentração para a qual 50$ da radioactividade fixada de modo específico é deslocada pelo composto considerado.

2) Efeito do derivado do exemplo 1 sobre a inibição do influxo de Ca^⁺ passando pelo canal Ca^⁺.

Comparação com	o dicloridrato	de trimetazidina e	a cinari-
Referência	Derivado do	Trimetazidina,	Cinarizina
^K0,5^(M)	exemplo 1 ^K0,5^(M)	2 HCI ^K0,5^(M)	Κ_θ)5(Μ)
2,3 10'⁸	3 10⁶	1O~⁴	1,2 10⁷

Os valores de K0,5 são expressos em Molar (mole/ litro) e

-22correspondem à concentração para a qual 50$ do influxo de

2+ 2+ '

Ca que passa pelo canal Ca e inibido pelo composto considerado.

3) Efeito do derivado do exemplo 1 sobre os receptores de neurotransnássores. Comparação com o dicloridrato de trimetazidina.

( cf. quadro a seguir).

•Η tsi

Ή

Ρ

G •Η

Ο kC3

I ο

• kO 1 ο ο

C—

I ο

kO

I ο

ν—

Cd

Ζ3I ο

t- οι I ο ο cn

I •Η

Ν ρ> 3 Φ G S ·Η •Η X Ρ Η

3· ζ- 4I I I ο ο ζΤ

I \ ο ο ι—I ο ω

χ	ε s	kO	ω	kO	kO	C—	kO	ο-	C-
3	φ	1	1	1	I	1	1	1	1
>	X ω	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο
•Η	φ <— -	Τ—	τ—	Τ~	Ç—	Τ—	’Γ—	Γ—	V—
ρ	ο
φ	Ο fcd	cn			Ω	σ	Ω	cn	cn
Ω	Ό
								ο
	ζ“\				Ο	co	σ	t—	σ
	2		C0	σι	τ—	ι	ι	1	ι
	'•S	σ	1	ι	I	ο	ο	ο	ο
		ι	ο	ο	ο	<—	tr—		τ—
	ω	ο	ϊ—	τ—	V—
	**	Τ—			«k		Γ—	ο-
	ο		ω	Ω	kO	•k	•k
	W	cn	•χ			cn	Ω
			cn	00
				3
	cd		cd	G			Γ—1		ΐ“Η
	♦rd	Η	G	Ή	3	εΰ	0	ο	ο
	ο	<	«Η	Ρ	G	G	Ω	σ	ε
	G	Ω	G	Φ	•Η	•Η	Ο	cn	εΰ
	<Φ	Ω	Ο	εο	εο	X	G	cn	rd
			+3	G	ο	ε	Φ	Ω	03
	Φ	X	Ο	3	Ν	•Η	Ρ		εΰ
	Ο-ι	Ο	Ρ	Ρ)	3	X	Ω	X	Ρ>
	03		03	03	Ρ	ο	γ*Ή	ο	3
	X	00	W	ω	Ω		<!	W	X
					3			ο
				I	G	1		σ
		Η		φ	•Η	C0		cn	τ—
		<		C0	εο	rH		cn	ο
		Ω		G ·	Ο	ο		Ω	Ω
		Ω	Ω	3 Φ	Ν	5 εΰ
			>Η	-Ρ G	εΰ	3 G		X	Ω
	Ο	X	Ο	03 ·Η	Ρ	εΰ ·η	X	ο	Ο
	Ό	Ο		Μ G		X Φ	Ω	W	Ω
	cd		Γ“~1
	&0		ω	Γ1	Γ“1	Γ~1	Γ“1	Γ—₁	Γ—,
	•Η	X	Ω	X	X	X	X	X	X
	ι-4	cn	τ—	cn	cn	cn	cn	cn	cn
		1_1	1_1	1—J	U._ι	1_1	t—,1	1__1	U-J

ra φ

ρ ο

-Ρ ω

φ ο

ο κ

I ρ

				'Φ			ιφ
3	<	X		G			G
G	τ—	τ—	Ω	Φ			Φ
•Η	Η	Ε-Η	Η	Ρ			Ρ		3
G	X	X	X	Ό	Τ—	Ω	X		G
Ο	Ω	Ω	Ω	3			3	CQ-	•Η
-Ρ					Ή	-Η			ε
Ο				3	ο 0	ο	3	0	3
Ρ				Ω	03		Ω	03	Ω
Φ				Ω	•Η		Φ	•Η	Ο
X					&0		X	&0	Ω

C\J

-244) Efeito protector do derivado do exemplo 1 sobre as consequências associadas a uma acidose intracelular.

Comparação com o dicloridrato de trimetazidina.

Concentrações /CM	0.3	1	3	10	20	30	100	500
Derivado do exemplo 1	143,99 ± 26,72 (n=4)	21,95 ± 1,19 (n=4)	1,42 ± 0,74 (n=4)	2,14 + 0?8 (n=4)	/	9,68 ± 2,69 (n=4)	/	/
Trimetazidina 2 HCI	/	/	/	/	94,58 + 12?53 (n=3)	/	75,76 + 7,79 (n=3)	58,26 + 8?13 (n=3)
Controlo antes da acidQ se.	0 $ ± 0,86 n=3
Controlo depois da acidose só	100 % í 11,10 n=4

sinal medido corresponde à amplitude da neorose induzida pela acidose. Os valores são as médias Í sem. 0 número de experiências está indicado entre parênteses.

5) Estudos electrofisiológicos realizados a partir de uma linha de células aórticas de rato (A„r-).

ί b

Os estudos demonstram, nas condições descritas em ” Whole cell patch clamp , uma inibição da corrente de entrada cálcica lenta com um semi-efeito (EC_rn) para o derivado do exemplo bu a 10“⁵M.

-256) Em conclusão:

Os resultados obtidos em 1,2 e 5 demonstram que o derivado do exemplo 1 se associa aos receptores do canal Ca^⁺lento e que esta associação induz, por um lado, a inibição do influxo de Ca²⁺ e, por outro lado, a inibição da corrente de entrada de Ca²⁺ de modo dose-dependente.

Estes resultados diferenciam o derivado do exemplo 1 do dicloridrato de trimetazidina pelas suas propriedades anticálcicas e aproximam-no da cinarizina com uma boa relação dose-efeito. Os resultados representados em 3 demonstram que o derivado do exemplo 1 interactua de um modo pouco específico e com uma fraca afinidade ao nível dos receptores de neurotransmissores (5 HT ) com excepção dos receptores dopaminérgicos. Os resultados apresentados em 4 demonstram que o derivado do exemplo 1 protege a célula cardíaca da necrose induzida pela acidose intracelular. Esta protecção tem lugar a partir deJí^M para ser máxima entre 3 β 1O^it/M de derivado do exemplo 1 com 99 a 98% de protecção. Nas mesmas condições, o diclorodrato de trimetazidina, para uma concentração 500 vezes superior (500yLM), apenas protege 42% da população celular submetida à acidose intracelular.

II. PROTECÇÃO FACE A MODIFICAÇÕES OXIDATIVAS DAS LDL E DA NECROSE OXIDATIVA DE CÉLULAS CARDÍACAS.

A actividade dos compostos de acordo com a presente invenção foi demonstrada in Vitro ” sobre a modificação oxi-26dativa das LDL humanas induzida pelo sulfato de cobre e sobre a necrose das células cardíacas.

) Materiais e métodos

a) Modificação das LDL pelo sulfato de cobre

Incubam-se as LDL humanas durante 24 horas na presença de sulfato de cobre (5.10^-oM) e na ausência ou na presença

-7 -4 dos compostos ensaiados (10 M a 10 M).

Após incubação, determina-se a peroxidação das LDL mediante electroforese sobre gel de agar e pela formação de um dos produtos da peroxidação lipídica: o malondialdeído (MDA) (Parthasarathy S., Young S.G., Witztum J:L., Pittman R.C., e Steinberg D., J. Clin. Invest». 77; 641-644, 1986).

Determina-se a actividade dos compostos ensaiados mediante cálculo das concentrações que reduzem de 50$ (ΟΙ^θ) a produção de MDA em relação às experiências controlo na ausência de composto .

b) Necrose oxidativa das células cardíacas

As células cardíacas de ratos recém-nascidos são ..utilizadas entre os 5² e 7² dias depois da cultura. A necrose oxidativa é induzida pelo sistema enzimático produtor de radicais livres hipoxantina (HX, 1mM) e xantina-oxidase (XO, 10mU/ml). Determina-se a necrose 4 horas depois da adição de XO/HX mediante medida espectrofotométrica da actividade citolítica - hidroxi-butirato-desidrogenase (0(.-HBDH) libertada no sobrenadante. Ensaiaram-se duas moléculas de referência (probucol, vitamina E) e 2 moléculas representativas do processo de acor-27do com a presente invenção (correspondendo aos exemplos 13 e 19)· As células são tratadas com as moléculas 16 horas e 1 hora antes do início da experiência após renovação do meio.

No início da experiência, renova-se o tratamento uma última vez.

β ^J ) Resultados

1) Efeito sobre a modificação das LDL:

quadro a seguir reúne as CIj-θ, demonstrando o poder iniciador da peroxidação lipídica das LDL humanas, obtidas com uma amostra dos derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção e os compostos antioxidantes de referência: probucol e vitamina E, sobre o ensaio de oxidação das LDL pelo sulfato de cobre (Cu²⁺).

Compostos	CI50(M) (Cu2+)
Exemplo 13	3 10-6
Exemplo 14	10-6
Exemplo 15	3 10-6
Exemplo 16	3 10-6
Exemplo 17	2 10“⁶
Exemplo 18	2 10-6
Exemplo 19	3 10-7
Exemplo 20	10-6
Exemplo 21	8 10-7
Probucol	3 10-6
Vitamina E	> 10⁴

-28Estes resultados indicam claramente a maior potência particularmente do composto do exmplo 19 em relação ao probucol ou à vitamina E para proteger as LDL humanas face a modificações induzidas pelo sulfato de cobre.

2) Efeito sobre a necrose oxidativa das células cardíacas.

quadro seguinte reúne os índices de necrose das células cardíacas induzidos pelo sistema hipoxantina/ xantina oxidase só ou na presença de concentrações crescentes dos compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção ensaiados ou dos compostos de referência : probucol e vitamina E.

Compostos	Controlo XO + HX	10-7 m X0 + HX	10-6 _M XO + HX	10“⁵ M X0 + HX
Exemplo 13	100,0ΐ 19,2	75,7l 19,7	52,41 18,2	16,1+ 5,6
Exemplo 19	100,01 6.8	86,01 11,5	38,4+ 13,7	7,9t 4,1
Probucol	100,01 11.9		95,0t 1,7	68,Ol 0,9
Vitamina E	100,0+ 10,6	97,1Í 2,6	87,6+ 5,7	54,9Í 11,3

índice de necrose 100 corresponde a uma libertação de 46,7 - 5,3% em 4 horas de conteúdo citosólico em bií-HBDH no sobrenadante.

Os resultados são expressos sob a forma de média í sem ( 2<n^ 4, 3 a 4 repetições por experiência).

Os compostos dos exemplos 13 e 19 que reduzem de 50$ ou —6 mais a necrose oxidativa dos cardiomiocitos a partir de 10 M são nitidamente superiores aos compostos antioxidantes de re-29- -5 ferencia cuja actividade, mais fraca, apenas aparece a 10 M.

B) ESTUDO IN VIVO

DEMONSTRAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTI-ISQUÉMICA.

1) METODOLOGIA

Os estudos são realizados sobre cães beagle com 9 a 12 Kg, anestesiados oom pentobarbital sódico 30 mg/Kg por via intravenosa, entubados e ventilados, submetidos a uma toracotomia no 52 espaço intercostal esquerdo.

Coloca-se um anel electromagnético religado a um debímetro electromagnético Gould SP 2202 ao redor da ramificação circunflexa da artéria coronária esquerda; coloca-se igualmente um balãozinho inflável imediatamente a jusante deste anel para a realização das estenoses coronárias sob controlo do débito coronário.

Implantam-se cristais piezoeléctricos (5MHz) religados a um sonomicrómetro Triton no sub-endocárdio da parede ventricular esquerda, em uma zona que se tornará isquémica, para medir a contractilidade regional miocárdica; nesta mesma zona colocam-se eléctrodos epicárdicos para recolher 0 electrocardiograma epicárdico.

Ligam-se dois eléctrodos ao nível da aurícula direita na região do modo sinusal para os protocolos que incluem sequências de pacing.

- PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

Realizaram-se dois tipos de protocolos de isquêmia

-30miocárdica.

Protocolo 1

A isquémia miocárdica é induzida por uma estenose coronária apertada que reduz de cerca de 70% o débito coronário.

Realizaram-se dois períodos de 10 minutos desta mesma estenose coronária, com efeitos reversíveis e reprodutíveis, no mesmo animal, separados por um intervalo de recuperação de 45 minutos.

Os tratamentos são administrados por via intravenosa 2 minutos depois da estenose coronária:

- injecção de dissolvente depois da primeira estenose coronária que serve de controlo,

- injecção de composto ensaiado depois da segunda estenose coronária .

Protocolo 2

Estabelece-se uma estenose coronária moderada, reduzindo o débito coronário entre 30 e 50$, insuficiente para provocar, por si só, uma isquémia.

A isquémia miocárdica é induzida pela aceleração da frequência cardíaca em cerca de 90 batimentos por minuto, mediante pacing auricular mantido durante 2 minutos.

Realizam-se duas sequências de pacing com efeitos reversíveis e reprodutíveis, no mesmo animal, uma primeira, precedida da injecção, de dissolvente, serve de testemunha, e uma segunda, após 45 minutos de recuperação, é utilizada para o

-31composto a ensaiar.

Os tratamentos são administrados por via intravenosa 3 minutos antes da sequência de pacing.

- PARÂMETROS DETERMINADOS.

A contractibilidade miooárdica é determinada pela fracção de encolhimento sistólico dos comprimentos segmentares compreendidos entre os cristais piezoeléctricos.

A hipocinésia em zona isquémica é expressa pela percentagem de variação em relação à contractibilidade medida em período controlo.

A modificação do ECG epicárdico em zona isquémica consiste em um aumento do segmento ST epicárdico medido em milivolt (mV).

- Resultados

Protocolo 1

Parâmetros	Tratamento	Estenose	10 minutos depois do tratamento
Contractibilidade delta $	Dissolvente derivado do	- 45,8	- 44,5
	exemplo 1 1 mg/kg iv	- 45	- 24,3
ST epicárdico delta mV	Dissolvente derivado do	+ 4,5	+ 4
	exemplo 1 1 mg/kg	+ 4,5	+ 2

-32Protocolo 2

Parâmetros	Tratamento	Pacing 2 minutos
C on t r a c ti-bilidad e delta $	Dissolvente derivado do	- 62,6
	exemplo 1 1 mg/kg iv	- 42,2
ST epicárdico delta mV	Dissolvente derivado do	+ 6,0
	exemplo 1 1 mg/kg iv	+ 0,5

Em conclusão:

Administrado por via intravenosa, o derivado do exemplo 1 reduz nitidamente as modificações electrocardiográficas e a contractibilidade miocárdica induzidas pela isquémia quer como preventivo quer como curativo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de derivados de pipe ridina de fórmula geral um dos símbolos R ou R' representa um radical de fórmula geral (H-O)c

C?r 34 na qual:

- m representa um numero inteiro de 1 a 3 e

- R^ representa um radical alquilo comportando 1 a 3 átomos de carbono e o outro símbolo R ou R’ representa quer um ra dical de fórmula geral

?.5 •t'2

A representa uma cadeia hidrocarbonada com 1 a 3 átomos de carbono comportando eventualmente, uma ligação dupla ou um átomo de oxigénio, ou de enxofra, eventualmente substituída. por um radical hidroxi ou um ou vários radicais metilo;

n representa o número 1 ou 2; e

R , R’₂, R₂ e R‘” 2> iÇ^ais ou diferentes, re prasentam, cada um, um átomo de hidrogénio, um átomo de halogéneo tal como o cloro ou o flúor, um radical alquilo ou alcoxi comportando, cada um, 1 a 3 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, ou um radical hidroxi, quer um radical de fórmula geral na qual:- Z representa um átomo de oxigénio ou da enxofre; R representa um átomo de hidrogénio ou um radicai metilo;

- p representa o número zero ou um; a

A, R^, 3·'2' ^2 ^e ₇ tém os significados definidos antes, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com ácidos apropriados;

caracterizado pelo facto de se condensar:

- um derivado de formula geral èí-H ’-5 na qual:

R tem os significados definidos antes 's...

- com um composto de formula geral Y-R' (III) na qual:

R' tem os significados definidos antes e Y representa um átomo de cloro ou de bromo, ou um radical tosiloxí.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se efectuar a condensação dos derivados de fórmulas gerais II e III no seio de um dissolvente polar, na presença de um agente de fixação, do hidrãcido formado durante a- reacção, a uma temperatura·compreendida entre 30^a e 130°C.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de. compostos de fórmula geral I, caracterizado pelo facto de se condensar um derivado de fórmula geral.

na qual:

R' tem os significados definidas antes, com um composto de fórmula geral

Y-R (Illa) na qual:

R e Y têm os significados definidos antes.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado peio facto de se efectuar a condensação dos derivados de fórmulas gerais lia e ílla, no seio de um dissolvente polar, a uma temperatura compreendida entre 80° e 110°C, na prs sença de um agente alcalino.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo, facto de sa efectuar a condensação a partir ds um derivado de fórmula geral lia previamente sodado.