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PT94680B - Processo para a obtencao de uma proteina tendo actividade de urato oxidase gene recombinante que a codifica vector de expressao portador deste gene microorganismos procariotas e celulas eucariotas transformados por este vector de expressao - Google Patents

Processo para a obtencao de uma proteina tendo actividade de urato oxidase gene recombinante que a codifica vector de expressao portador deste gene microorganismos procariotas e celulas eucariotas transformados por este vector de expressao Download PDF

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PT94680B
PT94680B PT94680A PT9468090A PT94680B PT 94680 B PT94680 B PT 94680B PT 94680 A PT94680 A PT 94680A PT 9468090 A PT9468090 A PT 9468090A PT 94680 B PT94680 B PT 94680B
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lys
glu
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asp
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Application number
PT94680A
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English (en)
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PT94680A (pt
Inventor
Daniel Caput
Pascual Ferrara
Jean-Claude Guillemot
Mourad Kaghad
Richard Legoux
Gerard Loison
Elisabeth Larbre
Johannes Lupker
Pascal Leplatois
Marc Salome
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from FR8917466A external-priority patent/FR2656530B1/fr
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of PT94680A publication Critical patent/PT94680A/pt
Publication of PT94680B publication Critical patent/PT94680B/pt

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N® 94 680
REQUERENTE: SANOFI, sociedade anónima, francesa, industrial, com sede em 40, avenue George V,75006 Paris, França.
EPÍGRAFE: PROTEÍNA TENDO ACTIVIDADE DE URATO OXIDASE, GENE RECOMBINANTE QUE A CODIFICA,VECTOR DE EXPRESSÃO PORTADOR DESTE GENE .MICRO ORGANISMOS E CÉLULAS TRANSFORMADOS
INVENTORES: Daniel Caput,Pascual Ferrara, Jean-Claude Guil lemot, Mourad Kaghad, Richard Legoux.Gérard Loison, Elisabeth Larbre, Johannes Lupker.Pas cal Leplatois, Marc Salome e Patrick Laurent.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
França, em 13 de Julho de 1989 e 29 de
Dezembro de 1989,sob os nss. 89 09550 e 89 17466 e em 06 de Fevereiro de 1990, sob o ns. 90 01368.
1NPI MOD. 113 Rf 10732
Ψ+6%0
SANOFI
PROCESSO PARA Α OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA TENDO ACTIVIDADE DE URATO OXIDASE, GENE RECOMBINANTE QUE A CODIFICA, VECTOR DE EXPRESSÃO PORTADOR DESTE GENE, MICROORGANISMOS PROCARIOTAS E CÉLULAS EUCARIOTAS TRANSFORMADOS POR ESTE VECTOR DE EXPRESSÃO
MEMÓRIA DESCRITIVA
RESUMO
O presente invento diz respeito a uni processo para a obtençSo de uma proteína, que apresenta uma sequência de aminoácidos seguinte:
Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys
Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gin Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai
Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn
Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala
Lys Gin Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr
His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai
Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro Hi s Ser
Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gin Vai Asp Vai Vai Glu
Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys
Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu
Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gin
T rp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe
Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu
Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gin Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gin Ile
Leu Ala Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly
Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys
Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
precedida eventualmente de uma metionina, e que apresenta uma actividade urato-oxidase especifica de pelo menos 16 U/mg.
invento· diz ainda respeito a um gene recombinante portador de uma sequência de DNA codificadora da referida proteina, a vectores de expressão portadores desse gene, e a niicroorqanismos e células transformados por esse vector.
referido processo de obtenção da proteina, consiste eni se transformar um microorganismo por um vector de expressão, que possui, com os meios necessários à sua expressão, o gene recombinante codificador de uma proteina com uma sequência adequada, se cultivar o referido microrganismo assim transformad e se recuperar a referida proteina.
invento diz respeito a uma nova proteína com actividade de urato-oxidase, um medicamento contendo esta e técnicas de engenharia genética para produzir esta proteína e particularmente um gene recombinante, um vector de expressão portador deste gene, ds rnicroorganismos procarióticos e as células eucarióticas transformadas por este vecotr de expressão.
A urato-oxidase (EC uri case, é uma enzima da via enzima não existe nos primatas
1.7.3.3. ), i gua1men te des i gnada de degradação das purinas.Esta (por exemplo o homem), nas aves, nalguns répteis nem na maioria dos insectos. Certos cães (como sejam os dálmatas) são igualmente desprovidos desta enzima.
No homem as bases puricas, adenina e guanina, são convertidas em xantina. A xantina é oxidada pela xantina-oxidase para formar o ácido úrico de acordo com a reacção;
xantina + H.-.0 + 0..,---> ácido úrico + 0...
radical substrato da superóxido-dismut-ase, transformado por esta última em peróxido de hidrogénio.
ãcido úrico, met-abolito presente no sangue, normalmente encontra-se essencialmente sob a forma de sal monossódico solúvel. No entanto, pode acontecer gue em certas pessoas o ácido úrico precipite e forme cálculos. A hiperuricémia, aumento da quantidade de ácido úrico em circulação no sangue, provoca o depósito de ácido úrico nos tecidos cartilaginosos, ogue provocaa gota. A hiperuricémia pode ter igualmente consequências sobre os rins; um excesso de ácido úrico na urina e nos rins pode conduzir a uma nefrolitíase por ácido úrico, quer dizer à acumuiaçãode de cálculos renais que são muito dolorosos e podem danificar o rim.
Estes cálculos são compostos por ácido úrico eventualmente associado a sais de fosfatos e oxalatos.
A produção excessiva de ácido úrico pode ter origens diversas: defeitos metabólicos congénitos, síndroma de Lesch-Nyhan, a ingestão de um excesso de purinas ou de proteínas, tratamentos com drogas uricosúricas, etc. (Gutman, AS et Yu, T.F. ( 1969 ) Am . J . Med . 45 : 75-6-779) .
A urato-oxidase, enzima gue catalisa a degradação do ácido úrico em alantoina (composto muito mais solúvel gue o ácido úrico, não cristalizando nas concent-racões atingidas nos líguidos biológicos) apresenta pois interesse terapêutico. Utilizada em injecção, ela apresenta numerosas vantagens no tratamento de hiperuricémia nefrolitiases:rapidez de efeito hipo-uricèmico (diminuição da ordem dos 50% da. hiperur i cémia em menos de 24 ho r as), me1ho r pro tec c So do rim c on tra as 1i t i ases r e1a t i vamen te a outras drogas como o alopurinol (inibidor da xantina-oxidase), etc,. Esta enzima é actualmente usada principalmente como adjuvante de agentes citoliticos em quimioterapia.
A urato-oxidase utilizada actualmente como medicamento é obtida de acordo com um processo caracterizado pela cultura de um micélio de Aspergillus flavus e isolamento de urato-oxidase por extracção do meio de cultura e várias etapas de purificação parcial desta proteína. Este processo gue permite a obtenção de urato-oxidase com uma actividade especifica de urato-oxidase de aproximadamente 6 U/rog sem contaminantes tóxicos, apresenta no entanto inconvenientes. Com efeito, a fisiologia e principalmente a genética de A, flavus não são fáceis de trabalhar (WOLOSHUK et al . , (195:9) Applied environ. microbiol. vol.55, p.5'5-90). Não é pois possível obter estirpes gue produzam esta enzima em quantidades importantes. Por outro lado, A. flavus é susceptível de produzir aflatoxinas, as quais são por vezes dificeis de separar.
é, pois, conveniente verificar se o produto purificado está isento destas toxinas.
Existe portanto a necessidade de uma urato-oxids.se de A. flavus mais pura , assim como instrumentos e técnicas de engenharia genética que permitam ultrapassar estes inconvenientes .
requerente purificou urato-oxidase extraída de A. flavus designada daqui em diante como urato-oxidase extractiva, num grau de pureza muito superior ao já conhecido para esta proteina, determinada a sequência parcial desta e construídos dois grupos de sondas marcadas, susceptíveis de hibridarem com os nucleotideos codificadores de duas fracções desta proteina, Construiu-se uma biblioteca de cDNA a partir de ftNA mensageiros de uma estirpe de A, flavus cultivada com a ajuda destes dois grupos de duas sondas, depois sequenciado um cDNA codificador de ur a to-oxi dase.
Em seguida construiu—se um vector de expressão compreendendo este cDNA, transformou-se uma estirpe de E. coli K12 com este último, cultivou-se esta e verificou-se que o lisado das células continha uma proteina recombinante com o peso molecular esperado, que pssuia uma actividade de urato-oxidase (capacidade para degradar o ácido urico em alantoína).
requerente construiu igualmente vários vectores de expressão em células eucarióticas compreendendo um gene recombinante codificador de urato-oxidase cuja sequência comporta variações relativamente ao cDNA isolado, introduzidas com a finalidade de inserir os codões que normalmente se encontram nas células eucarióticas, transformou diferentes células eucarióticas com a ajuda destes vectores,cultivou estas num volume pequeno e também em larga escala <.’ f erment-ador) e constatou que os lisados destas células continham uma proporção importante de uma. proteína recombinante com o peso molecular esperado ossuindo actividade de urato-oxida.se.
Purificou-se esta, proteína recombinante e caracterizou—se parcialmente, de modo comparativo face à urato-oxidase ext ra c t i va.
d invento oicc portanto respeito a uma nova proteína caracterizada por apresentar uma actividade especifica de urato-oxida.se de pelo menos 16 U/mg e por ter a sequência que se segue:
Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys
Vai Hi s Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gin Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai
Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn
Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala
Lys Gin Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr
His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai
Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro Hi s Ser
Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gin Vai Asp Vai Vai Glu
Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys
Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu
Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gin
Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe
Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu
Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gin Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gin Ile
Leu Ala Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly
Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys
Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
De preferência, esta proteína tem uma actividade especifica de urato-oxidase de aproximadamente 30 0/mg.
Orna proteína preferida deste tipo é uma em que, por análise num gel bidimensional apresente uma mancha de peso molecular de aproximadamente 3,5 KDa e de ponto isoeléctrico perto de 3,0, representando pelo menos 30% da massa proteica.
De preferência o grau de pureza desta proteina determinado por cromatografia liquida em coluna de silica C3 é superior a 3D%·.
Orna proteína com interesse deste tipo é uma que tenha um ponto isoeléctrico vizinho de 3,0. De preferência a serina amino-termina 1 tem um grupo bloqueador, preferencialmente com uma massa vizinha de 43 unidades de massa atómica, como seja por exemplo o grupo acetilo.
invento diz igualmente respeito a um medicamento que contem, num veiculo farmacêuticamente aceitável, a. proteina definida atrás. Esta pode substituir com vantagem, nas suas diferentes indicações, a urato-oxidase extractiva de actividade especifica urato-oxidase vizinha de 3 0/mg, vendida em preparação injectável, com a marca Oricoz/me (Vidal 1930).
A actividade especifica de urato-oxidase é a relação entre a actividade de urato-oxidase medida de acordo com o ométodo descrito abaixo no exemplo 3 e a massa das proteinas totais medidas de acordo com o método de Bradford : Anal. Biochem., 72, 243-2-54.
precedida eventualmente de uma metionina ou por apresentar um grau de homologia substanciai com esta sequência.
- y 0 invento diz respeito também a um gene recombinante, caracterizado por possuir uma sequência de DNA codificadora da sequência proteica que se segue:
MetSerAloVfllLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIlfiValAlaThrAspSer IleLysAsnThrllcTyrlloThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe GlyScrT.leLeuGlyThrHisPhencGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal AsnlleValCysHisArgTrpThrArgMftt. AspIleAspGlylysProHisProHisSer PhelleArgAspSorGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLcu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhc TrpGlyPhcLeuArgAspGluTyrThrThr LcuLysGluThrTrpAspArglleLeuSer ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLcuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnlleleu AlaArgGlnGlnleuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLcuSerTrpHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgScrSerLeuLysSer LysLeu
Devido à degeneração do código genético, existe um grande número de sequências de DNA codificadoras de uma proteína cuja sequência corresponde à fórmula dada atrás. Entre estas uma sequência preferida, particularmente adaptada para a expressão nos microorganismos procariotas, é a seguinte:
ATGTCTGCGG
CAAGGTTCAC
CCGTCTGTGT
GACAACAGCG
CACCGCCAAG
TGGGCACACA
AACATTGTCT
CCCTCACTCC
ACGTGGTCGA
ACCGTGCTGA
GTACACCACA
ATGCCACTTG
CACGTGCCTA
GAAGACTTTT
AGATGGCAGA
TACTCGTTGC
GGGCCTCCAA
ACCCCAACGG
AAATTG.
TAAAAGCAGC
AAGGACGAGA
GCTTCTGGAG
TCATTGTCGC
CAGAACCCCG
CTTCATTGAG
GCCACC6CTG
TTCATCCGCG
GGGCAAGGGC
AGAGCACCAA
CTTAAGGAGA
GCAGTGGAAG
AGTTCGATGC
GCTGAAGATA
6CAAATCCTG
CTAACAAGCA
AACACCGGCA
TCTGATCAAG
GCGCTACGGC
AGACCGGTGT
GGTGAGATTG
AACCGACTCC
TTACTCCTCC
AAGTACAACC
GACCC6GAT6
ACAGCGAGGA
ATCGATATCA
CTCGCAGTTC
CCTGGGACCG
AATTTCAGTG
TACCTGGGCC
ACAGTGCCAG
GCGCGCCAGC
CTATTTCGAA
AGAACGCCGA
TGTACCGTCG
AAGGACAATG
CCAGACGGTG
AGACCTCTTA
ATTAAGAACA
CGAGCTGTTC
ACATCCATGC
GACATTGACG
GAAGCGGAAT
AGTCGTCTCT
TGGGGCTTCC
TATCCTGAGC
GACTCCAGGA
ACTGCTCGCG
CGTGCAGGCC
AGCTGATCGA
ATCGACCTGA
GGTCTTCGCT
GCCGGTCCTC
TTCGCGTCTA
TACGAGATGA
CACCAAGGCC
CCATTTACAT
GGCTCCATCC
CGCTCACGTC
GCAAGCCACA
GTGCAGGTGG
GTCCGGCCTG
TGCGTGACGA
ACCGACGTCG
GGTCCGCTCG
AGGTCACTCT
ACTATGTACA
GACTGTCGAG
GCTGGCACAA
CCTCAGTCGG
TCTGAAGTCT
Uma outra sequência de DNA preferida, que e particularmente conveniente para a expressSo em células eucar iót-i cas, como seja a levedura, é a seguinte:
ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GÀCCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT. GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCiCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG.
- 12 Uma outra sequênc mente conveniente para a seguinte:
ia de DNA preferida, que é particularexpressSo em células animais, é a
CAATGTCCGC
CGGTGTACGA
TCTTACACCA
GAACACCATT
TGTTCGGCTC
CATGCCGCTC
TGACGGCAAG
GGAATGTGCA
TCTCTGTCCG
CTTCCTGCGT
TGAGCACCGA
CAGGAGGTCC
TCGCGAGGTC
AGGCCACTAT
ATCGAGACTG
CCTGAGCTGG
TCGCTCCTCA
TCCTCTCTGA
5'-ATGTC
GTCTACAAGG
GATGACCGTC
AGGCCGACAA
TACATCACCG
CATCCTGGGC
ACGTCAACAT
CCACACCCTC
GGTGGACGTG
GCCTGACCGT
GACGAGTACA
CGTCGATGCC
GCTCGCACGT
ACTCTGAAGA
GTACAAGATG
TCGAGTACTC
CACAAGGGCC
GTCGGACCCC
AGTCTAAATT
CGCAGTAAAA
TTCACAAGGA
TGTGTGCTTC
CAGCGTCATT
CCAAGCAGAA
ACACACTTCA
TGTCTGCCAC
ACTCCTTCAT
GTCGAGGGCA
GCTGAAGAGC
CCACACTTAA
ACTTGGCAGT
GCCTAAGTTC
CTTTTGCTGA
GCAGAGCAAA
GTTGCCTAAC
TCCAAAACAC
AACGGTCTGA
G
GCAGCCCGCT
CGAGAAGACC
TGGAGGGTGA
GTCGCAACCG
CCCCGTTACT
TTGAGAAGTA
CGCTGGACCC
CCGCGACAGC
AGGGCATCGA
ACCAACTCGC
GGAGACCTGG
GGAAGAATTT
GATGCTACCT
AGATAACAGT
TCCTGGCGCG
AAGCACTATT
CGGCAAGAAC
TCAAGTGTAC
ACGGCAAGGA
GGTGTCCAGA
GATTGAGACC
ACTCCATTAA
CCTCCCGAGC
CAACCACATC
GGATGGACAT
GAGGAGAAGC
TATCAAGTCG
AGTTCTGGGG
GACCGTATCC
CAGTGGACTC
GGGCCACTGC
GCCAGCGTGC
CCAGCAGCTG
TCGAAATCGA
GCCGAGGTCT
CGTCGGCCGG precedida de uma sequência 5' não traduzida favorável à expressão em células animais. Tal sequência 5' não traduzida preferida é uma que compreende a sequência: AGCTTGCCGCCACT, situada imediatamente a montante da sequência descrita atrás.
Note-se que a proteína codificada pelas sequências de cDNA apresentadas atrás pode sofrer uma maturação pela metior.il-amino-peptidase aue a corta no seu residuo metionina amino-terminal.
invento diz respeito igualmente a um vector de expressão portador, com os meios necessários à sua expressão, do gene recombinante definido atrás.
Para uma expressão nos microorganismos procarióticos, em particular em Escherichia coli, a sequência codificadora deverá ser inserida num vector de expressão portador de um promotor eficaz, seguido de um sitio de fixação aos ribossomas a montante do gene a exprimir, assim como uma sequência de paragem da transcrição eficaz a seguir ao gene a exprimir. Este plasmideo deve igulamente comportar uma origem de replicacão e uma marca de selecçSo. Todas as sequências devem ser escolhidas em função da célula hospedeira.
Para uma expressão nas células eucarióticas, ovector de expressão de acordo com o invento é portador do gene recombinante definido atrás com os meios necessários á sua expressão, â sua replicacão em células eucariot-as e á selecçSo de células transformadas. De preferência, o vector é portador de uma marca de selecçSo, escolhida por exemplo para complementar uma mutaçSo das células eucarióticas receptoras, que permite a selecçSo das células que integraram o gene recombinante num número de cópias elevado no seu genoma ou num vector de mui ti cópias.
Para uma expressão em células animais, principalmente em células de ovário de hamster chinês CHÚ, a sequência codificadora é introduzida num plasmideo (por exemplo derivado do pSR 322) portador de duas unidades de expressã, uma primeira unidade na qual é inserido o gene recombinante a seguir a um promotor eficaz (por exemplo o promotor precoce do SV40). A sequência è volta da iniciação ATGé de preferência escolhida em função da sequência consensus descrita por KOZAK (Μ. KOZAK (1373) Cell.,15. 1103-1123). Orna sequência intrónica, por exemplo o intrão da «-globina de ratinho, pode ser inserida a montante do gene recombinante assim como uma sequência portadora de um sitio de poliadenilação do SV40, depois do gene recombinante. A segunda unidade de erxpressão é portadora de uma marca de selecção (por exemplo uma sequência de DNA) codificadora da di-hidrofolato reductase (enzima daqui em diante designada DHFR). 0 plasmideo foi transfectado para células animais, por exemplo células CHO DHFR (incapazes de exprimir a DHFR). Seleccionou-se uma linha pela sua resistência ao metotrexato: ela tem integrado no seu genoma um nuero elevado de cópias do gene recombinante e exprime este último num nivel suficiente.
Para uma expressão nas células eucarióticas como sejam as de levedura, por exemplo SaccharoBiycss cerevisiae, é conveniente inserir a sequência codificadora entre, por um lado, sequências reconhecidas como promotores eficazes, por outro lado, um terminador de transcrição. A montagem promotoi—sequência codificadora-terminador, designada cassete de expressão, foi clonada num vector plasmídico (monocôpia ou multicópia) para a 1evedura.
invento diz igualmente respeito a células eucarióticas transformadas pelo vector de expressão anterior. Entre estas,prefere-se as estirpes da espécie Saccharomyces cerevisiae.
eni particular -as que possuem uma mutação num dos genes responsáveis pela síntese da leucina ou do uracilo, por exemplo o gen LEU2 ou o gene URA3.
invento diz também respeito a células animais contendo, juntamente com os meios necessários à sua expressão, o gene recombinante. Este último pode, por exemplo, ter sido introduzido nas células por transfecção pelo vector de expressão abaixo, por infecção por um virus ou por um ret-rovírus dele portadores, ou por microinjeccão.
invento tem igualmente como objectivo um processo para a obtenção de urato-oxidase recombinante que consiste em:
1) pôr em cultura uma estirpe como a definida at-rás;
2) efectuar a lise das células;
3) isolar e purificar urato-oxidase recombinante contida no 1isado.
invento será melhor compreendido com a ajuda dos exemplos que se seguem:
uma grande parte do conjunto de técnicas que se seguem, são conhecidas dos que estão dentro do campo, está descrito det-alhadament-e na obra Maniatis et al.:«Molecular Cloning: a Laboratory Manual» publicado em 1334 pelas edições C-old Spring Harbor Press em New York.
EXEMPLO 1: Isolamento dos RNAs mensageiros de Aspergillus flavus
A estirpe de A. flavus produtora de urato-oxidase foi cultivada em condições de produção de urato-oxidase, ou seja num meio contendo ácido úrico com a seguinte composição: glucose 1-5
- 16 g/L, MgSCU'7H2° 1 9/L' KH2F’O4 0,75 g/L, CaCO... 1,2 g/L, ãcido úrico 1,2 g/L, KSH 0,5 g/L, óleo de soja 0,66 ml/L, FeSO^, ^.-,0 10 rng/L, CuSO „, 5H.-.0 1 mg/L, 2nS0x,7H..,0 3 mg/L, MnSO., 4H,.O lmg/L.
meio foi ajustado a pH 7 com H.-,S04 1M e foi esterilizado a 4
120C durant·e 30 min.
Num erlenmeyer de -6 L semeou-se 1,5 L de meio com aproximadamente 1 a 3 x 107 esporos.
A cultura foi incubada durante cerca de 40 h a 30°C com agitação <120 rpm). 0 micélio foi recuperado por filtração sobre gase, lavado com água e congelado em azoto liquido.
g de micélio (peso húmido) foram descongelados e ressuspensos em 45 ml de tampão de lise depois adicionado igual volume de esferas (0,46· jum de diâmetro). 0 tampão de lise é constit-uido por tiocianato de guanidina 4M, Tris-HCl 10 mM pH7,6, EDTA 10 mM, β-mercaptoet-anol 50 ml/1. A suspensão de micélio foi triturada num moinho Zellmuhle Cvibrogene) durante 5 min.
material triturado foi recuperado e decantadas as esferas. 0 sobrenadante foi ajustado (cerca de 45 ml) e levado a 3 M final de cloreto de lítio e conservado a 0°C.
Passados dois dias, centrifugou-se durante 60 min a 10 000 rpm. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspen— so em 40 ml de LiCl 3 M e recentrifugado a 10 000 rpm durante 1 h 30.
Adicionou-se a proteinase K (SIGMA), 40 jug/ml , SDS (0,1 % p/v) e EDTA a 20 mM. Incubou-se a 37°C durante 3 h.
F'rec ipi tou-se com 2 volumes de etanol, depois fez-se uma lavagem com etanol a 70 %. Ressuspendeu-se o sedimento em 0,5 ml de tampão ΓΕ (tris HC1 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5) extraiu-se duas vezes com clorofórmio e precipitou-se com etanol. Os RNAs foram conservados a -80°C em álcool.
EXEMPLO 2: Purificação da fracção poli A+ dos RNAs
Cerca de 1 mg de RNA foi precipitado 20 min a 4''c <15 000 rpm) depois lavado com etanol a 70% e em seguida seco. 0 sedimento foi ressuspenso em 1 ml de tampão ΓΕ com agitação em vort-ex. Preparou-se oligo dT-celulose tipo 3 (comercializada pela Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) seguindo as recomendações do fabricante. 0 RNA foi colocado na oligo-df, agitado com suavidade para pôr em suspensão as esferas, depois aquecido durante 1 min a 65°C'.
A suspensão foi ajustada a 0,5 M NaCl e depois agitada suavemente durante 10 min. A suspensão foi então centifuqada durante 1 min a 1 000 rpm , o sobrenadante foi rejeitado, o sedimento lavado 2 vezes com 1 ml de tampão l'E contendo 0,5 M naCl. 0s sobrenadantes foram eliminados. A eluição da fraccão poliadenilada do RNA (constituída por RNA mensageiro) foi obtida ressuspendendo as esferas em 1 ml de tampão TE, depois aquecendo esta suspensão a 50C durante 1 min. a 1 000 rpm, o que permite recuperar por um lado o sobrenadante contendo os mRNAs livres em solução e por outro lado o sedimento das esferas de celulose. Repetiu-se o conjunto de operações atrás descrito (a partir da eluição). Os sobrenadantes assim obtidos foram reunidos, eliminou-se o excesso de esferas por centrifugação e precipitou-se o sobrenadante com etanol contendo NaCl seguindo as técnicas habituais. (Maniatis: op. pre.).
EXEMPLO 8: Constituição da Biblioteca de cDNAs
A partir dos rNAs mensageiros isolados como descrito no exemplo anterior, fez-se uma biblioteca de cDNA no vector pT219R (comercializado pela Pharmacia). Este vector é uni plasmideo compreendendo um poliadaptador contendo sítios únicos de restrição .
A técnica de donagem utilizada é a descrita por Caput et al., (técnica do iniciador-adaptador) : (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) (1988) 88, 1870-1874)).
Ela consiste por um lado em digerir o vector com PstI, adicionar uma cauda de polidC na extremidade 8' protuberante, depois digerir os plasmideos assim obtidos com BamHl. 0 fragmento correspondente ao vector foi purificado em coluna de Sépharose CL48 (Pharmacia). Ele compreende portanto uma cauda poli dC numa extremidade, a outra extremidade sendo coesiva, do tipo BarnHI. Por outro lado os RNAs mensageiros são submetidos a transcrição reversa a partir de um iniciador cuja sequência é a . seguinte •5' <GATC.'CGGGCCCT(. )<3 . Assim os cDNAs apresentam na sua extremidade a sequência. 6ATCC complementar da extremidade coesiva BamHi . Os híbridos RNA-DNA obtidos pela acção da transcriptase reversa foram submetidos a uma hidrólise alcalina que permite remover o RNA. Os cDNAs de cadeia simples foram então purificados por 2 ciclos em coluna de Sepharose CL48 e submetidos a um tratamento com tra.nsferase terminal de modo a adicionar polidGem 3' . Os cDNAs foram inseridos na forma de cadeia simples no vector preparado como descrito mais ã frente. Uni segundo ol igonuc leotideo o «adaptador» complementar do iniciador foi necessário para gerar um sitio BarnHI «aberto» na extremidade 5' dos cDNAs. Após hibridação do vector, o cDNA e o «adaptador», as moléculas recombinantes foram recireularizadas pela accão da liqase do fago l4. Repararam-se então as regiões de cadeia simples pela acção da DNA-polimerase do fago T4. 0 conjunto de plasmideos assim obtidos serviu para transformar a estirpe f’1C 1061para a resistência à ampicilina (Casabadan C-hou et Cohen J. Bact-, (1980) 143 páginas 9971-980).
EXEMPLO 4: Determinação da sequência parcial da urato-oxidase
Uma preparação de urat-o-oxidase de A. flavus (comercializada pela SANOFI Chimie) foi repurificada por cromatografia numa coluna de Red-agarose 120 (SIGMA), seguida de uma filtração em gel de acrilamida-agarose Ult-rogel Aca 44 (I8F).
Conm a finalidade de obter informações sobre a sequência de aminoácidos da urat-o-oxidase purificada, para permitir a síntese de sondas necessárias à cionagem do cDNA, foi tentada uma sequenciacão amino-terminal direct-a da proteína. Esta não foi conseguida, provávelmente devido ao bloqueamento amino-terminal da proteína.
A estratégia que se segue foi portanto desenvolvida ) para a obtenção da sequência parcial da urat-o-oxidase:
- corte da proteína por enzimas proteol í t-icas (com a ajuda das enzimas tripsina e protease V8 de Staphylococcus aureus)
- separação dos polipeptideos obtidos por HPLC de fase inversa -sequenciacão dos pept-ideos purificados.
; Hidrólise da urato-oxidase pela tripsina, purificação e sequenc i ação dos pept í deos:
A urato-oxidase a 9 mg/ml num tampão de carbonato de amónio lOOmM pH8,9 foi digerida pela tripsina (Wor thi ngt-on, TPCK)
- 20 com uma relacSo urato-oxidase/tripsina de 30/1 eni peso a 30'C durante 24 horas. Após a hidrólise t-riptica, 60 pg de urato-oxidase digerida foi directamente injectado numa coluna de HPLC de fase inversa de sílica Brownlee 616 (coluna de 10 x 0,2 cm), equilibrada em acetonitrilo a 1% (v/v), ácido trifluoroacéticoO,1 % (v/v) em água. 0s peptideos foram em seguida eluidos por um gradiente linear de acetonitrilo numa solução de ácido trifluoroacét-ico (0,1% v/v) em água variando de 1% a 60% de acetonitrilo em 60 min, com um débito de 150 pl/min. Os peptideos á saída da coluna foram detectados por medição da densidade óptica a 216 nm.
Na figura 1 está apresentado o perfil de eluição, no qual os numeros a seguir à letra T (tripsina) correspondem aos picos i der, t· i f i c ados .
Cada pico foi colhido e conservado a -20°C até ao momento da análise num sequenciador de proteínas ( OniOdelo 470 A da Applied Biosystems) equipado com um cromatógrafo (modelo 430 A da Applied Biosystems), que analisa em continuo os derivados feni1tio-hidantóicos formados, após cada ciclo de degradação. A tabela (1) a seguir apresenta as sequências pept-ídicas dos 3 picos identificados.
2) Hidrólise da urato-oxidase pela protease V6, purificação e sequenciação dos peptideos.
A urato-oxidase numa concentração de 2 mg/ml num tampão acetato de amónio 100 mH pH 6,6:, foi digerida pela protease 06 de Staphylococcus aureus (Boehr inger-Hannheini) com uma relação urato oxidase/protease VS de 60/1 a 30°C durante 72 horas. 160 pg de urato-oxidase digerida foram em seguida injectadas numa coluna de HPLC de fase inversa de sílica Brownlee G1S (coluna de 10 x 0,2 cm); partículas (7 x 0,03 pm) equilibrada em acetonitrilo a 1%, ãcido trif luoroacético a 0,1% <.v/v) em água. Os peptideos foram em seguida eluidos com um gradiente linear de acetonitrilo numa solução de de ácido tr i f luoroacét- i co em água <0,1 % <v/v>> variando de 1% a 60% de acetonitrilo em 60 min., com um débito de 150 ul/min. Os peptideos à saída da coluna foram detectados por medição da densidade óptica a 216 nm.
perfil de eluicSo está apresentado na figura 2, na gual os numeros a seguir à letra V (protease V5> correspondem aos picos identificados.
Cada um dos picos foi colhido e conservado a -20°C até ao momento da análise no seguenciador de proteinas já mencionado.
A tabela (1), a seguir, apresenta as sequências peptidicas dos 5 picos identificados.
TABELA (I)
EXEMPLO 5: Despiste de bactérias
1) Preparação de sondas marcadas
Dois conjuntos de sondas deduzidas das sequências de aminoácidos da proteína foram sintetizados com a ajuda de um sintetizador de DNA Biosearch 4600. 0 primeiro conjunto corresponde a uma sequência de resíduos His-Tir-Fen-Glu-Ile-Asp (parte da sequência de T 27), de 6' para 3':
A T 6 G G
TCGAT TC AA TA fG
T C A A A
Este conjunto é de facto constituido por 2 x 3 = 48 oligonucleotideos diferentes representando todas as combinações possíveis. 0 segundo conjunto corresponde à sequência de resiuos de aminoácidos Gln—Fen—Trp—Gli-Fen-Leu (parte da sequência de V5>, de 6' para 3’:
GG A G T A AAGCCCCA AA TG
AA C AC T
Este conjunto é constituido por 24 x 4 = 64 combinações. As sondas foram marcadas com desoxinucleotidil-terminal-transferase (fdf) (comercializada pela IBI, Inc).
A reacção efectuou-se em 100 ng de uma mistura de o1igonucleotideos em solução (100 mg/ml) num tampão de reacção «Cobalto (fornecido 10 vezes concentrado pela IBI inc. ; 1,4 M de cacodilato de potássio-pH 7,2, 300 mM de ditiotreitol, 1 ;j1 da
- 24 enzima desoxinuc leotidi 1- ter minai -transfer ase <181 inc.) e 50 àiCí de desox i c i t i d i 11· r i f os f a to dCTF' ma r c ado c om P32. A r ea c c ão desenrolou-se a 37°C durante 10 min. e depois foi parada pela adição de 1 ;j1 de EDTA 0,5 M. Extraiu-se com fenol e dialísou-se em coluna de pol iac r i 1 amida BioGel P 10 <BioRad : 150-1050).
2) Hibridacão e detecção de colónias contendo cDNAde urato-oxidase:
Cerca de 40 000 colónias foram despistadas pela técnica de hibridacão i n si tu optimizada por Grunstein et Hogness <1975, Proc. Natl. Acad. Sei. <0.S.A.), 72 3961). Cerca de 6 000 bactérias foram espalhadas sobre caixas de pétri de modo a obter-se colónias isoladas. Após incubação durante 24 horas a 37°C, cada uma das caixas foi replicada para dois filtros, cada filtro sendo destinado a ser tratado com dos 2 conjuntos de sondas em parale1 o.
0s filtros foram postos a hibridar com um dos 2 conjuntos de sondas num tampão contendo 6 x SSC, 10 κ Denhardt e 100/jg/ml de DNA de esperma de salmão sonicado e desnaturado CSIGMA). A temperatura de hibridacão foi de 42°C e a duração de 16 h. A solução 6 x SSC obtem-se por diluição de uma solução 20 x SSC. A preparação do tampão 20 x SSC está descrita em Maniatis, Fritsch e Sambrook <citado atrás). Resumindo, este tampão contem 175,3 g/1 de NaCl; SS,2 g/1 de citrato de sódio e é ajustado a pH7 com algumas gotas de NaOH 10 N. A solução de Denhardt 10 x contem 1 g de Picoil, 1 g de polivinilpirrolidona, lg de albumina
sérica humana para 500 m1 de vo1ume f i na1.
Após lavagem na solução 6 x SSC a 42°C <3 h coni 5
mudanças de banho), os filtros foram enxugados com papel Joseph e
autorradiograf ados. Cs filtros foram revelados passadas 16 horas.
- 25 Parece que uma fracção de aproximadamente 0,5% das colónias hibridava com os dois conjuntos de sondas.
colónias desta foram repicadas e purificadas. Preparou-se DNA de plasmídeo de cada uma destas colónias e analisou-se este DNA por digestão com BamHI, Hindi II ou simultâneamente BamHI e Hindi II.
Após análise em gel de agarose, mostrou—se que os três plasmídeos obtidos eram linearizados com BamHI e HindIII. As digestões duplas permitiram libertar um fragmento correspondendo a todo o cDNA clonado. 0 tamanho deste fragmento é de aproximadamente 1,2 Kb em 3 casos, cerca de 0,9 Kb nos dois outros casos. Para a determinação que se segue seleccionou-se um dos fragmentos de 0,9 Kb e um dos fragmentos de 1,2 Kb que foram reclonados (ver exemplo 6 a seguir).
EXEMPLO 6.' Determinação da sequência de cDNA da urato-oxidase
Por um lado reclonou-se um dos fragmentos de 0,9 Kb (clone 9A) e por outro lado umdos fragmentos de 1,2 Kb, no DNA da forma replicativa do fago M13 de cadeia simples. 0 DNA cos clones M13 contendo por um lado o fragmento de 0,9 Kb e por outro lado o fragmento de 1,2 Kb foi submetido a uma digestão com exonuclease de modo a gerar uma série de clones M13 sobreponiveis (processo «Cyclone I Biosystem» da IB1), Estes últimos foram seguenciados pelo método dos desoxirribonucleotídeos (Sanger et al., P.N.A.S.-U.S.A.-1977, 14, 5453-5467).
A sequência nucleotidica do clone 9C está representada na figura 3 a qual indica igualmente por uma seta o começo do clone 9A e por um símbolo nucleotídico munido de um asterisco’*' os nucleotídeos sequenciados do clone 9A não idênticos aos do clone 9C (quando se faz corresponder as duas sequências e os sítios de restrição Accl e BamHI utilizados nas construções posteriores (c.f. exemplo 10)
Cons ta ta-se que:
A sequência nucleotidica do fragmento mais longo (clone 90 cobre a do fragmento mais curto (clone 9A), tendo no entanto duas diferenças (v figura 3). Uma das diferenças ê silenciosa, aoutra corresponde a uma alteração de um residuo triptofano para um residuo glicina. Estas diferenças podem ser devidas, quer a diferenças nos RNAs mensageiros isolados, (cf. exemplo 2 atrás), quer a erros da transcriptase reversa utilizada quando da construção da biblioteca de cDNA (C-f. exemplo 3 atrás). A sequência do DNA genómico da urato-oxidase de A. flavus permitiu esclarecer esta ambiguidade. Trata-se de um residuo triptofano ( e portanto provavelmente de um erro da transeriptase reversa.
No caso do fragmento mais longo, um codâo ATG (na posição 109 da figura 3) abre uma grelha de leitura correspondendo a um polipeptideo de 302' aminoácidos, de massa molecular vizinha de 34240 Da, cuja sequência corresponde à sequência parcial da urato oxidase de A. flavus purificada (Cf. exemplo 4).
Na figura 4 está representada a pelo codão ATG e o polipeptideo codificado cia peptidica do polipeptideo codificado por hidrólise da urato-oxidase de ÉL_f sequência de , assim como (Cf. exemplo lavus c om a
DNA aberta a sequên4) obtido a j uda de tripsina e da prot-ease 73.
Constatou-se que a sequência do polipeptideo termina num tripleto Ser-Lis-Leu, típica das enzimas que se localizam nos peroxissomas (Gould S.J. et al., J. Cell, Biology 103 (1339)
1657-1664).
EXEMPLO 7.' Construção de um vector de expressão de cDNA da urato-oxidase
Preparou-se o plasmideo p466, vector de expressão em E. coli. Este último compreende um fragmento do pBR327 incluindo a ) origem de replicação e o gene de resistência à ampicilina, ele contem igualmente um promotor sintético de E. coli (R. RODRIGOEZ e M. CHAMBERLIN «Promoters-Struc ture and funct-ion (1332)
Preager), uma sequência de Shine-Dalgarno, seguida de um poliadaptador apresentando os sítios únicos Ndel e Kpnl, um terminador de transcrição (derivado do fago fd) e o gene lac i.
Este plasmideo foi construído a partir de um plasmideo de expressão de hGH em E. coli (p462) por substituição de um fragmento portador do gene da hGH pelo cDNA da urato-oxidase.
A construção do plasmideo p466 vai agora ser descrita mais detalhadamente na exposição que se segue na qual será feita referência às figuras 5, 6, 7, 8, 9.
A figura 5 representa um mapa de restrição do plasmideo pl63,1. Os diferentes segmentos de restrição estão marcados de modo arbitrário de acordo com a legenda abaixo:
= Segmento de DNA derivado do plasmideo pBR322 = Localização da origem de replicacão (ORI)
Segmento de DNA contendo a sequência codificadora de um precursor natural da hGH
Segmento de dNA do fago fdcontendo um terminador da transcricSo = Segmento de DNA contendo um promotor operador híbrido t-riptof ano-lactose UVS
Segmento de DNA codificador da D-lactamase <ApR: resistência à ampicilina).
A figura 6 representa o mapa de restrição de um plasmídeo pl60 cujos fragmentos F‘vul-XhoI-BamHl < 1) e Pvul-ORI-BamHl (2) provêm respectivamente dos plasmideos pl63,l e pBR327 e cujo fragmento pequeno BamHlC2)-BamHl(1) é o fragmento 3 descrito a seguir.
A figura 7 representa o mapa de restrição do plasmideo p373,2. Os diferentes fragmentos de restrição estão marcados de modo arbitrário de acordo com a legenda abaixo.* = Sequência Pvul-BamHl derivada do plasmideo PBR327
Sequência Pvul-Xhol derivada do plasmideo plS3,l
Sequência Xhol-HincII derivada do plasmideo pl63,1 al
Ndel PstI (HincII)
Φ C) (¾ Φ Φ (¾ Fragmento 4 descrito abaixo xxm = Fragmento 3 descrito abaixo
Segmento de DNA do fago fd contendo um terminador de transcrição p4S
A figura ofragmento s
S representa um mapa de restrição do plasmideo ntético BglII-HindlII definido a seguir sendo representado por
A figura 9 representa um mapa de restrição do plasmideo p4SS, o fragmento Ndel-Kpnl compreendendo o gene codificador da urat-o-oxidase sendo representado por: ,1) Construção do plasmideo p373,2
A estratégia posta em prática utiliza fragmentos obtidos a partir de plasmideos pré-existentes acessíveis ao público e fragmentos preparados por síntese de acordo com técnicas convencionais, As técnicas de clonagem empregues foram as descritas por T. MANIATIS EF, FRITSCH e J. SAMBROOK, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). A sintese dos oligonucleotídeos foi realizada com a ajuda de um sintetizador de DNA Biosearch 4 600.
Submeteu-se o plasmideo ρ16·3, 1 (figura 5), descrito no pedido de patente EP-A-0245138 e depositado na CNCM sob a referência 1-530 em 17 de fevereiro de 196:6, a uma digestão pelas enzimas Pvul e BamHI. Este plasmideo contem o gene codificador da hGH. 0 fragmento Pvul-BamHl - daqui em diante fragmento 1 contendo o sítio de acção da enzima de restrição Xhol, representado na figura 5, foi purificado.
Do mesmo modo, conhecido, <cf. SOBERON, X digestão pelas enzimas Pvu dagui em diante fragmento 2 foi purificado.
submeteu-se o et a1., Gene, I e E:amHI . 0 -, contendo
Ρ1 asm i deo P&R327, bem 9 (1980) 237-305) a uma fragmento Pvul-BamHl a o r i sem de rep1i c a c ão,
Depois preparou-se o fragmento 3, que é um sintético BamHIC1)-BamHI(2) contendo o gene lac I e o tor cuja sequência é a que se segue na qual as duas e da cadeia foram assinaladas com os números 1 e 2 para orientação do fragmento nos plasmideos descritosnas f f ragmento seu promoxt-rem idades precisar a iguras 6- e
7.
FRAGMENTO 3
BamHICD
5' GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT
GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACCACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT GGTTAACGGC GGGATATAAC' ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT GTCTG6TCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCA6C TCCGCCATCG CCGCTTCCAC TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G
Os fragmentos 1, 2 e 3 foram então ligados de maneira a obter-se o plasmideo p!60 representado na figura 6.
Este plasmideo foi submetido a uma digestão parcial pelas enzimas de restrição Hindi e F'st-1. 0 fragmento grande Hinc 11-F‘stI, contendo a origem de replicação e representado na figura 6, foi em seguida ligado ao fragmento 4, representado a seguir, que é um fragmento sintético de DNA portador de uma sequência codificadora dos primeiros 44 aminoácidos de um precursor natural da hGH e a montante desta sequência sinais de regulac ão.
FRAGMENTO 4
CI al w
5' TCGAGCTGACTGACCTGTT6ÇHatattacatcga
AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGCT
A
Ndel
TAGCGTATAATGTGTGGAAHGTGAGCGATAACAATHCACACAGTHAACTHAAGAAGGAGATATACAT
ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTA
ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG
TAC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA AAA CCG GAC GAC ACG GAC
A
MATGSRTSLLLAFGLLCL
Xbal
T
CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC KC CCA ACC ATT CCC TTA TCT AGA CTT TTT
GGG ACC GAA GTT CTC CCG TCA CGG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGA TCT 1 GAA AAA
P U L Q E G S A F P T I P L S R L F
-1 1
GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TH GAC ACC TAC
CTG KG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC
D N A M L R A H R L H Q L A F L T Y
Pi >tl
CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA KC CTG CA
GTC CTC AAA CTT CTT CGG ATA TAG GGT KC CK GTC KC ATA AGT AAG G
QEFEEAYIPKEQKYSF
- 34 Neste fragmento, os aminoácidos são designados por letras de acordo com o seguinte código:
A C Alanina Cisteina M N 2S Metionina Asparagina
D = Ácido aspártico P = Proli na
E = Ácido glutâmico 0 = Glutami na
F = Fenilalanina R = Arginina
6 = Glicina Ç; = Serina
H = H i s t i d i na T = Treonina
I Isoleuc ina 0 = Vali na
K = Lisina w = T r iptofano
L = Leuc ina Y = T i rosina
Foram sublinhadas sucessivamente neste fragmento as sequências -35 (TTGCTT) e -10 (TATAAT) da sequência do promotor e a sequência de Shine e Dalgarno bem conhecida.
Obteve-se assim o plasmideo p3S0,1.
plasmideo p3S0,1 foi em seguida submetido a uma digestão pelas enzimas de restrição Cla.I e Ndel de maneira a eliminar o fragmento pequeno Clal-Ndel do fragmento 4 abaixo e a substituir o fragmento Ciai —Ndel a seguir;
Ciai
5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA
TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT
Ndel
ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA
TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT
5' ·:·ε
Ο plasmideo resultante é o plasmideo p373,2 (figura 7).
2) Construção do plasmideo p466:
Ci plasmideo p373,2 foi submetido a uma dupla digestão pelas enzimas BglII e HindIII. 0 fragmento grande derivado desta digestão foi purificado e ligado com um fragmento de DNA sintético, cuja sequência dada a seguir se destina a reconstituir o f inal do gene da hGH seguido em 3’ de sítios de clonagem Kpnl e SnaBI.
i
Β l
I
I
GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT ----+---------+---------+---------+---------+
AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC ---------+---------+---------+---------+—-------+---------+
CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG
F s
Ρ
GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT
Η ί
S η Κ η d ρ a I η Β I
I I £
GGTACCCTGCCCTACGTACCA
---------+---------+----CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA
- 37 Este fragmento compreende as extremidades coesivas E-'glII e HindIII. 0 novo plasmídeo assim formado p462 (Cf. Fig.8) compreende assim um sítio Kpnl e um sítio Ndel que vSo servir à clonagem do fragmento portador do cDNA da urato-oxidase no vector de expressão.
plasmídeo híbrido derivado de pT219R portador do cDNA com cerca de 1,2 Kb (clone 30, da urato-oxidase (ver exemplo 3 compreende um sitio Kpnl único. Este sitio está situado alguns pares de bases antes do sítio de clonagem do cDNA. Por outro lado o cDNA da urat-o-oxidase contem um sítio Accl sit-uado na dade da extremidade 5'.
proximiPortant-o isolou-se e purificou-se o fragmento AccI-Kpnl compreendendo a maior parte deste cDNA. Por outro lado sintetizou-se dois oligonucleotideos complementares cuja sequência é dada a seguir.'
5'-TATGTCTGCGGTAAAA6CAGC6CGCTAC6GCAA66ACAATGTTCGCGT
ACAGACGCCAT ΓΤ FCGTCGCGCGA TGCCGT FCC l‘GT TACAAGCGCAGA-S ’ a qual se destinou fragmento sintético uma outra AccII. 0 ligados com o vector a restituir a assim obtido fragmento e de expressão extremidade 5’ do cDNA. Este possui uma extremidade Ndel e a sequência sintética foram cortado por Kpnl e por Ndel.
Esta ligação de três fragmentos permite obter o vector de expressão, designado p466, da urato-oxidase para E. coli (Cf. figura 9). Este plasmídeo foi submetido a uma série de hidrólises enzimát-icas por enzimas de restrição, o que permitiu confirmar a presença dos sítios de restrição esperados, em particular os incluídos no gene codificador da urato-oxidase.
— :-ím — plasmideo ρ466 contem portanto um gene codificador da urato-oxidase com a sequência que se segue:
ATGTC1GCGG
CAAGGTTCAC
CCGTCTGTGT
GACAACAGCG
CACCGCCAAG
TGGGCACACA
AACATTGTCT
CCCTCACTCC
ACGTGGTCGA
ACCGTGCTGA
GTACACCACA
ATGCCACTTG
CACGTGCCTA
GAAGACTTTT
AGATGGCAGA
TACTCGTTGC
GGGCCTCCAA
ACCCCAACGG
AAATTG.
TAAAAGCAGC
AAGGACGAGA
GCTTCTGGAG
TCATTGTCGC
CAGAACCCCG
CTTCATTGAG
GCCACCGCTG
TTCATCCGCG
GGGCAAGGGC
AGAGCACCAA
CTTAAG6AGA
GCAGTGGAAG
AGTTCGATGC
GCTGAAGATA
GCAAATCCTG
CTAACAAGCA
AACACCGGCA
TCTGATCAAG
GCGCTACGGC
AGACCGGTGT
GGTGAGATTG
AACCGACTCC
TTACTCCTCC
AAGTACAACC
GACCCGGATG
ACAGCGAGGA
ATCGATATCA
CTCGCAGTTC
CCTGGGACCG
AATTTCAGTG
TACCTGGGCC
ACAGTGCCAG
GCGCGCCAGC
CTATTTCGAA
AGAACGCCGA
TGTACCGTCG
AAGGACAATG
CCAGACGGTG
AGACCTCTTA
ATTAAGAACA
CGAGCTGTTC
ACATCCATGC
GACATTGACG
GAAGCGGAAT
AGTCGTCTCT
TGGGGCTTCC
TATCCTGAGC
GACTCCAGGA
ACTGCTCGCG
CGTGCAGGCC
AGCTGATCGA
ATCGACCTGA
GGTCTTCGCT
GCCGGTCCTC
TTCGCGTCTA
TACGAGATGA
CACCAAGGCC
CCATTTACAT
GGCTCCATCC
CGCTCACGTC
GCAAGCCACA
GTGCAGGTGG
GTCCGGCCTG
TGCGTGACGA
ACCGACGTCG
GGTCCGCTCG
AGGTCACTCT
ACTATGTACA
GACTGTCGAG
GCTGGCACAA
CCTCAGTCGG
TCTGAAGTCT (Os nucleotideos diferentes dos nucleotideos do cDNA de A. f1avus foram sublinhados na sequência isolado a partir descrita. Estas sin té t. i c oA c c I -Κρη I nucleotidica mais gene procariótico) di ferencas de modo a parecida com foram introduzidas no fragmento ter à frente do AfG uma sequência as habitualmente encontradas num
EXEMPLO S:
Expressão do cDNA da urato-oxidase
A estirpe de Inc.) foi transformada plasmideo p466 e com o dois casos obtiveram-se
E. coli K12 Rfil (Bethesda Research para a resistência à ampicilina plasmideo testemunha negativo pBR3 colónias resistentes à ampicilina.
Lab.
c om o
22.Nos
Uma colónia de cada tipo foi posta em cultura em meio (LB + ampicilina 100 wg/ml) . Após uma noite a 37°C com agitação, as duas culturas foram diluidas lOOvezes em meio (LE: + ampicilina 100 ;jg/ml). Após 1 hora de cultura adicionou-se IPfG
B-D Tiogalacosido) 1 mM durante 3 h.
(Isopropi1
Imunodeteccão da urato-oxidase por transferências Western:
) F r o to c o 1 o:
Retirou-se do meio de cultura obtido após 3 h de incubação com IPfG uma fraccão pequena correspondendo a 0,2 ml a DO = 1. Centrifugou-se esta última e eliminou-se o sobrenadante. Submeteu-se em seguida o sedimento a uma transferência Western, técnica bem conhecida, que compreende as seguintes etapas:
- Solubilizacão do sedimento por ebulição durante 10 min num tampão designado tampão de amostra constituído por Tris HCl 0,125
Μ pH £,$, SDS 4%, azul de bromofenol 0,002%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 10% (de acordo com o protocolo descrito por
LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685),
- Separação elect-roforética das diferentes proteínas contidas na amostra solubilizada segundo o protocolo descrito por LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685),
- Tranferéncia das referidas proteínas contidas no gel para um filtro de nitrocelulose (segundo a técnica de H. T0WB1N et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 4850-4354),
- A imunodeteccSo, realizada de acordo com a técnica de BURNETTE (W.W. BURNETTE Anal. Biochem. 112 (1981), implica sucessivamente;
. Lavagem do filtro de nitrocelulose durante 10 min com um tampão A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KC1 1 mM).
Contacto do filtro de nitrocelulose durante 30 min a
37’C com um tampão B (tampão A a qus se adicionou albumina do soro bovina numa proporção de 3 g para 100 ml).
. Contacto do filtro de nitrocelulose durante 1 hora a 37°C com um soro imune (anticorpos policlonais que reconhecem a urato-oxidase de A. flavus).
Lavagem do filtro de nitroceiulose com o tampão B.
. Contacto do filtro de nitrocelulose durante 1 hora a 37°C com uma solução de proteína G marcada com iodo· 125 a 0,1 microcurie/ml.
. Lavagem do filtro com o tampão A.
Secagem do filtro entre duas folhas absorventes.
Contacto com um filme de radiografia.
Revelação do filme.
'2) Resu 1 tados :
Constatou-se que a estirpe transformada pelo plasmídeo p43t· produz uma proteína de peso molecular aparente com cerca de
KDa que é reconhecida pelos anticorpos dirigidos contra urato-oxidase de A. flavus e que está ausente na estirpe testemunha. .
EXEMPLO 9; Doseamento da actividade de urato-oxidase
Do meio de cultura obtido após 3 horas de indução com IPTG nas condições de cultura descritas no exemplo anterior retirou-se uma fraccão correspondente ao equivalente de 0,5 ml a DO = 1. Centrifugou-se esta última e eliminou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se ò sedimento em 1 ml de tampão TEA CTrietanolamina) 0,05 m pH 3,9. A suspensão celular foi sonicada 2 vezes durante 30 s em gelo com um sonicador ult-rasonic W10 (regulado para uma potência de 3 e intensidade 4). Os extractos foram centrifugados a 10 000 s durante 10 min, os sobrenadantes foram utilizados para o doseamento.
Efectuaram-se as operações abaixo para quatro colónias escolhidas ao acaso de E. coli K12 transformada pelo plasmídeo p433 (colónias A^, B^, C^ e D^) e uma colónia transformada pelo Ρ1asm í deo pBR322).
Seguiu-se a transformação do ácido úrico em alantoína pela diminuição da absorvância a 292 nm. A reacção foi a ssguin42 ο
Η
U r a to-ox i dase
H20 +
Ácido úrico
C0o
Alantoina (Absorvância a 292 nm)
2) Reagentes
a) Tampão TEA 0,05 M pH S,9/EDTA
- dissolver 7,5 g de TEA (reagente pró-análise Prolabo ref. 287.45.266) em 400 ml de água destilada,
- dissolver 0,372 g de Complexon III (Merck-ref. 8418) em 50 ml de água destilada,
- reunir as duas soluções e completar para 500 ml (solução 1),
- ajustar o pH desta solução a 8,9 com HC1 0,2 N,
- completar para 1 000 ml com água destilada (solução 2).
b) Solução padrão de ácido úrico
- dissolver 100 mg de ácido úrico (Carbiochem ref. 6671) em 50 ml da solução 1,
- ajustar com HC1 0,2 N a pH 8,9,
- completar para 100 ml com água destilada.
A solução obtida pode ser conservada uma semana a 4°C.
c) Solução de ácido úrico substrato
- retirar 1,5 ml de solução padrão de ácido úrico (Carbiochem ref. 6671) e diluir para 100 ml com tampão TEA/reagente pró-aná1 ise Pro1abo ref. 287.46.266).
Esta solução deve ser utilizada no próprio dia.
- 43 3') Método
Introduz-se na cuvete de quartzo de um espectrofotómetro regulado para 292 nm e termost-atizado para 30°C os seguintes vo1umes:
- 600 ;j1 da solução de ácido úrico substrato < pré-aquec i do a
30°C),
- 100 jj 1 dos sobrenadantes abaixo aos quais foram adicionados 200 jj 1 de TEA pH 3,9 <pré-aquecido a 30°C).
Mistura-se e lê-se a densidade óptica de 30 em 30 s durante 5 min. Deduziu-se Z\E, variação da densidade óptica por m i nu to.
) Resultados:
A actividade enzimática de urat-o-oxidase expressa em U/ml D0 1 foi calculada a partir da medição de Z\E com a ajuda da f ó r mu1a:
Z\E x Vr x d A = €! x VpE na qual os símbolos Vr, d, 61 e VpE representam respectivamente o volume de reaccão <0,9 ml), a taxa de diluição <2), o coeficiente de extinção do ácido úrico a 292 nm <12,5) e o volume da amostra de ensaio <0,3 ml).
Os resultados obtidos estão resumidos na tabela <II) a seguir:
TABELA < 11 )
1 1 Estirpe de E. coli K12 1 transformada por Ί 1 1 Actividade urato-oxidase1 | <U/ml DO 1) | 1 I
j pBRx l 22 t 1 1 1 j < 0,001 |
1 J colónia Aj 1 1 I 0,096 j , 1
I p466 1 | colónia Bj | 1 1 1 0,119 |
1 j colónia Cj I 1 I I 0,195 | ! 1
1 1 j colónia 1 I 1 1 0,119 | J 1
coli t r IPTG de Pela tabela atrás pode-se observar gue as células de E. ansformadas pelo plasmideo p466 são capazes em presença de produzir uma actividade de urato-oxidase.
EXEMPLO 10! Construção de trés vedores de expressão do cDNA da urato-oxidase em levedura, os plasmideos PEMR469, p£MR473 e PEMR515
A estratégia usada baseou-se em fragmentos obtidos a partir de plasmideos pré-existentes acessíveis ao público e em fragmentos preparados por sintese de acordo com técnicas convencionais. As técnicas de clonagem empregues estão descritas por T. ΜΑΝΙΑΓΙ9, EF. FRIfSCH e -J. SAMBROOK em «Molecular Cloning, a Laboratory Manual» (Cold Spring Harbor Laboratory, 1994). A sintese dos oligonucleotídeoe foi realizada com a ajuda de um sí.ntetizador de DNA Biosearch 4 500.
A descricSo gue se segue será melhor compreendida observando as figuras 10, 11 e 12 gue representam respeetivamente os mapas de restrição do plasmideo PEMR414 e dos plasmídeos PEMR459 e pEMR473. Os símbolos utilizados nestas figuras serão definidos na exposição gue se segue. No caso de um sitio ter sido tornado cerse pela polimerase Klenow, ele é afectado do índice A; guando os sítios foram suprimidos por ligação, eles estão indicados entre parêntesis.
) Construção do plasmideo PEMR459:
Este plasmideo foi construído a partir do vector vai-vem E. coli-levedura pEMR414, construído por ligações sucessivas dos elementos gue se seguem:
- o fragmento PstI-Hindi 11° - simbolizado por ++++ na figura
- o plasmideo P-JDB207 (BEGGS, 1978: Gene cloning in yeastp. 175-203 em: Genetic Engineering vol. 2 - WILLIAMSON -Academic Press - London UK) compreendendo a parte a montante do gene da resistência á ampicilina Amp^ do pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold Spring Symp. Quart. Biol. 43, 779) e um fragmento de 2/j endógeno forma B portador do gene LEU2 de 9, cerevisiae parcialmente eliminado o seu promotor (designado LEU2d), o locus STB (RLP3) e a origem de replicacão de 2/j HAR TLEY e 00NELS0N, 1980, Nature, 285, 850-855). A extremidade HindIII deste fragmento foi tornada cerse pela acção da polimerase de Klenow. Na figura 10 está assinalado como HindIII0.
- o fragmento HindiII-SmaI - representado por / / / na figura 10 - do cromossoma V de lavedura contendo o gene URAS com o seu promotor (ROSE et al., 1984, Gene, 29, p. 113-124). Este
- 46 fragmento Hindi II-Smal provem do plasmideo pFLl (CHEVALIER etal., 1980, Gene, 11, 11-19)). A extremidade HindlII deste plasmideo foi tornada cerse pela acção da polimerase de Klenow.
- um fragmento SamI-BamHI - simbolizado por ΖΣΣΣΣΞ na figura 10 - contendo uma versão sintética do promotor do gene ACH2 difere da versão natural descrita por RUSSEL e SMiTH (RUSSEL et al . , 1983). J. Biol. Chem. 288, 26.74-2882) em apenas alguns pares de bases destinados a introduzir sítios de restrição. (A sequência natural poderá ser utilizada com alguns resultados pouco di ferentes) . A seguir é apresentada a. sequência deste fragmento:
S Μ m I a u ’gGGBCGCG7C1CCTC7GCCGGBACBCCGGGCBTC7CCBBC T TBTBBGTTGGBG cícTGCGCAGAGGAGACGGCCUGlGGCCCGTAGAGGnGAATAnCAACCTC
BBBT BAGBGABTTTCflGBl TGAGflGflAIGBAflAflAAAABBBAABAAflAflGGCBGBGGBGfi nTAlICICniAAGTCIlAClCKITACnnnimnnnnnCMIClCCTn s
P
n.
gcatagaaatggggttcactttttggtaaagctatagcat gcctatcacaiataaataga
......................................*.......'*·.....
CGT AI CT T T ACCCCAAGTGAAAAACCA7 I TCGAT AT CGT ACGGAT AG T GT AI AT IT ATCT
GTGCC AGI AGCGACT Τ ΤΠ TCACACTCGAGAT ACTCT T ACT ACTGCTCT CT TGT T GT T TT
...........................................*...............
CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCT AT GAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA
T A TC AC T TCTTGTTTCTTCTTGGT A A AT AGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA _____________4_________*-------------------4---------♦-----AT AGT G A AG A AC A A AG A AG AACC AT TTATCTTAT AGT TCGATGTTTTTCGTATGTT AGTT B k
CT AT C AACT AT T AACT AT ATCGAT ACCAT ATGGATCCGTCGACTCT AGAl/gaTCGTC
---4-------------------4---------4---------4------------G AT AG T TGAT AATTGAT AT AGCT ATGGT AT ACCT AGGC AGCTGAGATC TCCT AGCAG
B a
π
H
GACTCTAGAG»
----4—
CTÓAGATCTCCTAG s i mbo1i zado po r na
- o fragmento BglII-HindIII figura 10 - é portador da extremidade 3' do gene PGK de levedura. Este fragmento provem da digestão completa com a ajuda de BglI Ido fragmento Hindi I Ido DNA crornossómico de levedura, é portador do gene PGK descrito por ΗΙΤΣΕΜΑΝ et al . , (1932 Nucleic Acids gual apresenta apenas um sitio
10, 7731-7303) o d i ges tão perω i te
BglII.
obter dois fragmentos Hindi I Ι-Bgl 11, o
Res. , Esta mais pequeno tendo cerca de 0,4 Kb e portador da extremidade 3' do gene PGK de levedura foi guardado. A sequência deste último fragmento foi descrita por ΗΙΤΣΕΜΑΝ et al., (referência citada atrás). 0 sitio BglII foi cionado no sitio BamHl do fragmento anterior (os sítios BamHl e BglII desaparecem portanto) e o sitio Hindi II, tornado cerse pela por acção da polimerase Klenow, foi cionado no sítio PvuII do fragmento PvuII-Pst-I do pBR322 descrito abaixo.
- o fragmento PvuII-Pstl - simbolizado por XXX na figura
- do pBR322 contendo a origem de replicacão e a parte a R jusante do gene de resistência à ampicilina Amp .
plasmideo pEMR'414 assim constituído inclui portanto os seguintes elementos:
- uma origem de replicacão e um gene de resistência à ampicilina AmpR permitindo a replicacão e a selecção do plasmideo em células de E. coli. Estes elementos permitem a transformacão das células de E. coli.
- uma origem de replicacão para levedura ÍARS), o locus 3TB e o gene LEU2 de 3, cerevisiae sem promotor e o gene URAS com o seu promotor de 3. cerevisiae. Estes elementos permitem a repli— cação e a selecção do plasmideo em células de 3. cervisiae assim como uma eficácia de partição suficiente em células contendo p 1 asm i deo 2 ,u endógeno .
O plasmídeo pEMR414 foi submetido a uma digestão completa pelas enzimas de restrição Nhel e Clal.O fragmento pequeno Nhel-BamHI contendo principalmente o gene LEU2d e a origem de replicacão do plasmídeo pBR322, designado daqui em diante fragmento B, foi purificado.
Por outro lado preparou-se o fragmento sintético Clal-Accl contendo o começo de um gene codificador da proteina deduzida da sequência do cDNA da urato-oxidase (clone 90. Este fragmento possui modificações relativamente ao clone 9C, introduzidas com a finalidade de inserir codões prórpios de leveduras (Cf. SHARP et al., 19SS, Nucl. Ac. Res. Vol. 14, 13, pp. 5125-5143) sem alteração dos aminoãcidos codificados. A sequência deste fragmento, designado daqui em diante fragmento C, é a seguinte (os nucleotideos sublinhados são os modificados relativamente ao clone 90.
I I !
CGATATACACAATGTCTGCTGTTAAGGCTGCTAGATACGGTAAGGACAACGTTAGAGT ---+---------+---------+---------+---------+---------+---TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA
Submeteu-se o plasmídeo do clone 9C (Cf. figura 3)a uma digestão pelas enzimas Accl e BamHI. 0 fragmento AccI-BamHI que contem o fim do cDNA da urato-oxidase, daqui em diante designado fragmento D, foi purificado. Este fragmento tem a seguinte sequênc i a:
Acc I Ύ CTACAAGGTTCACAAGGACGAGAAC (TGTTCCAACTGTTCCTCCTCTTC ACCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG
--------------------+ ---------4-----TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC ACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCGCAACCGACTCCATTAAGAACACC
---------+ _---—---+---------+ ---------+-------— + ---------4.
TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG
---------- ---------4 ----4 -------4--------- + ---------4.
TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC
---------4-........4---------+...................+..........
CCGTGTGTGAAGTAACTCTTCATGTTGGTG TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG
CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC
---------4---------4---------4---------4---------4---------4
GTGGCGACCTGGGCCTACCTGTAACTGCCG TTCGGTGTGGGAGTGAGGAAGTAGGCGCTG AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAXG
---------4---------4---------4-------------------4---------4
TCGCTCCTCTTCGCCTTACACGTCCACCTG CACCAGCTCCCGTTCCCGTAGCTATAGTTC
TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTG
- — - — .--4---..----4---------4 ---------4---------4---------4
AGCAGAGACAGGCCGGACTGGCACGACTTC TCGTGGTTGAGCGTCAAGACCCCGAAGGAC
CGTGACGAGTACACCACACTTAAGGAGACC TGGGACCGTATCCTGAGCACCGACGTCGAT
---------4---------4---------4---------4---------4---------4
GCACTGCTCATGTGGTGTGAATTCCTCTGG ACCCTGGCATAGGACTCGTGGCTGCAGCTA
GCCACTTGGCAGTGGAAGAATTTCAGTGGA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG
---------4---------4---------4---------4---------4---------4
CGGTGAACCGTCACCTTCTTAAAGTCACCT GAGGTCCTCCAGGCGAGCGTGCACGGATTC
TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG GTCACTCTGAAGACTTTTGCTGAAGATAAC
---------4---------4---------4---------4---------4---------4
AAGCTACGATGGACCCGGTGACGAGCGCTC CAGTGAGACTTCTGAAAACGACTTCTATTG
AGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAG ATGGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAG
---------4---------4---------4---------4---------4---------4
TCACGGTCGCACGTCCGGTGATACATGTTC TACCGTCTCGTTTAGGACCGCGCCGTCGTC
CTGATCGAGACTGTCGAGTACTCGTTGCCT AACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGAGC
---------4---------4---------4---------4---------4--------.4
GACTAGCTCTGACAGCTCATGAGCAACGGA TTGTTCGTGATAAAGCTTTAGCTGGACTCG
TGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGAC
---------4---------4---------+---------4---------+---------♦
ACCGTGTTCCCGGAGGTTTTGTGGCCGTTC TTGCGGCTCCAGAAGCGAGGAGTCAGCCTG
CCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGC CGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAAACC
---------4---------4---------+---------4---------+---------♦
GGGTTGCCAGACTAGTTCACATGGCAGCCG GCCAGGAGAGACTTCAGATTTAACATTTCG
AACATGATTCTCACGTTCCGGAGTTTCCAA GGCAAACTGTATATAGTCTGGGATAGGGTA
-------------------+ ---------+ .........+---------+---------+
TTGTACTAAGAGTGCAAGGCCTCAAAGGTT CCGTTTGACATATATCAGACCCTATCCCAT
TAGCATTCATTCACTTGTTTTTTACTTCCA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
---------4---------4---------4---------4------------------- ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAAATGAAGGT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCCCG'
SomH |
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCGGGCCT AG
Os fragmentos A, B, C e D foram ligados de maneira a obter-se o plasmideo pEMR469 representado na figura 11, na qual os símbolos têm o mesmo significado que na figura 10, os novos fragmentos Clal-Accl e AccI-BamHI estão simbolizados por |
2) Construção do plasmideo pEHR473:
plasmideo pEMR’469 foi submetido a uma digestão completa pelas enzimas MluI e Sphl. 0 fragmento grande Mlul-Sphl contendo o gene da urato-oxidase foi em seguida ligado ao fragmento sintético, da sequência descrita atrás, cor respondendo a uma par te<200 pb) da sequência a montante do elementoTAfA do promotor GAL 7 de S. cerevisiae, a qual compreende as sequências de activacão a montante (sequências de activacão a montante: MAS) .
M
I u I
CGCGTCTATACT TCGGAGCACTGΤ TGAGCGAAGGCTCAT TAGATAT AT TTTCTGTCAT
AGATATGAAGCC TCGTGACAAC TCGC T TCCGAGT AA T C TA T AT AAAAGAC AGT A
T T TCC τ τ aacccaaaaataagggagaggg tccaaaaagcgc tcggac AAC TG r TGACCGT
......--- — ...............------AAAGGAAT1 GGGT TT TTAT TCCCTCTCCCAGGT TT TTCGCGAGCCTGT TGACAACTGGCA
GA TCCGAAGGAC TCGCT AT AC AG TGT TCACAAAAT AGCC AAGC TGAAAAT AATGTGT AGC
.......... — ......... — .............. — ........... .......
CT aggc t tcctgaccgat A TGTCAÇAAGTGT τ Τ τ AtCCGT TCGACT Τ Τ τ AT T ACACATCG s
P h J
CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATG·
GAAATCGATACAAGTCAATCAAACC· |J plasmideo pEMR47d assim obtido está representado na 12, na qual os símbolos têm o mesmo significado que na fi gura figura 11, o novo fragmento Mlul-Sphl introduzido sendo simbolizado por
3) ConstrucSodo plasmídeo pEMR-515 !
plasmídeo pEMR473 foi submetido a uma digestão parcial pela enzima Xbal e a uma digestão total pela enzima MluI. 0 fragmento grande Xbal-Mlul foi purificado. Este fragmento contem principalmente as sequências da origem de replicacão e o locus STB do 2;j, o gene LEU2d, o gene de resistência à ampicilina Amp , a origem de replicacão do pE:R322 e a cassete de expressão da urato-oxidase. Ele não contem o gene URA3, nem a parte de 2jucompreendida entre os sítios Xbal e Nhel.
fragmento através de um adaptador grande Xbal-Mlul foi reci rcularizado com a sequência que se segue portadora das extremidades coesivas Xbal modificada e MluI:
XbaI mod i f i c ado ▼ CTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA
CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGC £ MluI plasmídeo pEMR-515 assim obtido só possui um dos três elementos do sítio FRT alvo da recombinase codificada pelo gene FLP de 2μ.
Os plasmideos pEMR 469, pEMR473 e pEMR-513 possuem o gene codificador da urato-oxidase da sequência que se segue:
ATGTCTGCTG
CAAGGTTCAC
CCGTCTGTGT
GACAACAGCG
CACCGCCAAG
TGGGCACACA
AACATTGTCT
CCCTCACTCC
ACGTGGTCGA
ACCGTGCTGA
GTACACCACA
ATGCCACTTG
CACGTGCCTA
GAAGACTTTT
AGATGGCAGA
TACTCGTTGC
GGGCCTCCAA
ACCCCAACGG
AAATTGTTAAGGCTGC
AAGGACGAGA
GCTTCTGGAG
TCATTGTCGC
CAGAACCCCG
CTTCATTGAG
GCCACCGCTG
TTCATCCGCG
GGGCAAGGGC
AGAGCACCAA
CTTAAGGAGA
GCAGTGGAAG
AGTTCGATGC
GCTGAAGATA
GCAAATCCTG
CTAACAAGCA
AACACCGGCA
TCTGATCAAG
TAGATACGGT
AGACCGGTGT
GGTGAGATTG
AACCGACTCC
TTACTCCTCC
AAGTACAACC
GACCCGGATG
ACAGCGAGGA
ATCGATATCA
CTCGCAGTTC
CCTGGGACCG
AATTTCAGTG
TACCTGGGCC
ACAGTGCCAG
GCGCGCCAGC
CTATTTCGAA
AGAACGCCGA
TGTACCGTCG
AAGGACAACG
CCAGACGGTG
AGACCTCTTA
ATTAAGAACA
CGAGCTGTTC
ACATCCATGC
GACATTGACG
GAAGCGGAAT
AGTCGTCTCT
TGGGGCTTCC
TATCCTGAGC
GACTCCAGGA
ACTGCTCGCG
CGTGCAGGCC
AGCTGATCGA
ATCGACCTGA
GGTCTTCGCT
GCCGGTCCTC
TTAGÀGTCTA
TACGAGATGA
CACCAAGGCC
CCATTTACAT
GGCTCCATCC
CGCTCACGTC
GCAAGCCACA
GTGCAGGTGG
GTCCGGCCTG
TGCGTGACGA
ACCGACGTCG
GGTCCGCTCG
AGGTCACTCT
ACTATGTACA
GACTGTCGAG
GCTGGCACAA
CCTCAGTCGG
TCTGAAGTCT
EXEMPLO 11i fransformação da estirpe de levedura EMY761, pelos plasmídeos pEMR469, PEMR473 e pEMR-515 Transformação de estirpes de levedura EMY500 e
GRF1S pelo plasmideo pEMR515 - fransformação com selecção para prototrofia do uracilo e por prototrofia de leucina
Utilizou-se como estirpes receptoras três estirpes SaccharoBiyces cerevisiae não i s o g é n i c a s ;
de
- a esti rpe EMY761 (Mata, leu2, ura3, h i s3, ga1)
a estirpe EMY500 < Ma ta, leu2, ura3, pep4)
“ a esti rpe GRF1S ι : Mata, leu2, his3);
A estirpe GRF18 é bem conhecida dos fami 1 iarizados com a área (Gerry F1NK, MiT, USA). As estirpes EMY761 e EMYSOO são semelhantes á estirpe GRF18. Elas foram obtidas por crescimento sucessivo da estirpe GRF18 com uma estirpe ura3 derivada da estirpe FL1OO (depositada na ATCC com ο N2 28 383) e com a estirpe 20812 (Mata, tspl, pep4)descrito por E.W. JONES (E.W. JONES et al . (1977) Genetics, 85, 23).
Pode-se obter a estirpe GRF18 por limpando o plasmideo pEMRSIS da estirpe GRF18 pEMRSIS (leu+) depositada na CNCM com a referência n2 1-920, em 28 de Dezembro de 1989 e a estirpe EMYSOO por limpeza do plasmideo pEMRSIS da estirpe EMYSOO pEMRSIS (leu+) depositada na CNCM sob a referência nà 1-919, em 28 de Dezembro.
As estirpes contêm de serem complementadas pela pela marca de selecção URA3,
F-EMR463 e PEMR473.
mutações (Leu2 e ura.3), susceptíveis marca de seleccão detectora LEU2d e presente em cada um dos plasmideos ) TransformaçSo com selecção para a prototrofia do uracilo:
Uma colónia da estirpe EMY761 serviu para semear 100 ml de um meio designado meio IPG liquido (Cf. tabelaiII a seguir). Quando da obtenção de uma densidade celular de 10? células por ml, as células foram tratadas com acetato de lítio 0,2M para a transformação segundo uma técnica bem conhecida, descrita por I Γ0 te al . (IT0 et al . , 1933, J. Bact-erioly 153, 163-158).
As células EMY761 foram transformadas em paralelo com cerca de 1 ;jg de cada um dos plasmideos pEMR469 e pEMR473. As células transformadas foram seleccionadas para a característica de auxotrofia do uracilo (ura ) num meio desiqnado meio sólido sem uracilo, (Cf. Tabela III a seguir). Obteve-se assim um transformado EMY761 pEMR473 (ura+).
2) Transformação com selecção para prototrofia de leucina
A técnica de transformação utilizada é uma variante da descrita por Beggs et al . (Beggs et al . <1578), Nature 27-5, 104-103). Ela consiste em submeter as leveduras a um tratamento de protoplastização em presença de um estabilizador osmótico, o sorbitol na concentracão de 1 M.
protocolo preciso da transformação está descrito a segui r:
a) 200 ml de meio YF‘G liquido (Cf. Tabela III) foram inoculados com aproximadamente -5 x 10b células de uma cultura em fase estacionária e acultura assim inoculada foi colocada uma noite sob agitação a 30C.
b) Logo que a cultura atingiu cerca de 107 células por mi, as células foram centri fugadas a 4 000 rpm durante -5 min e o sedimento lavado com sorbitol 1 M.
c) As células foram ressuspensas em 5 ml de solução de sorbitol 1 M contendo 25 mM EDTA e 50 mM de ditiotreitol e incubadas durante 10 min a 30°C.
d) As células foram lavadas uma vez com 10 ml de sorbitol 1 M e ressuspensas em 20 ml de sorbitol. Adicionou-se Zimolase-100T (preparação obtida por purificação parcial numa coluna de afinidade do sobrenadante de cultura de Ar thobac ter luteus e contendo 8-1,3-glucano-laminar ipenta-hidrola.se, comercializada por SEYKAGAKU KOGYO Co. Ltd) numa concentracão final de >jg/ml e incubou-se a suspensão á temperatura ambiente durante cerca de 15 min.
- Ρ.Ρ. contendo segu i r)
e) As células foram ressuspensas em 20 mi de um meio sorbitol designado meio YPG sorbitol (Cf. tabela III a e incubadas durante 20 min a 30°C com agitação suave.
f) Cen trif ugou-se durante min a 2 500 rpm.
g) Ressuspendeu-se em 9 ml de tampão de transformação (sorbitol 1 M, Tris-HCl pH 7,5 10 mM e CaC12 W mM)‘
h) Adicionou-se 0,1 ml de células e 5 jj! de solução de DNA (cerca de 5 ;jg) e deixou-se a suspensão obtida durante 10 a 15 min à temperatura ambiente.
i) Adicionou-se 1 ml da solucSo,' pol iet-i lenogl i col PEG 4000 20%, Tris-HCl de pH 7,5 10 mM e CaCl.., 10 mM.
j) Verteu-se 0,1 ml da suspensão obtida em i) num tubo contendo meio sólido de regeneração sem leucina (Cf. Tabela III a seguir?préviamente fundido e mantido líguido a cerca de 45°C. Verteu-se a suspensão sobre uma cixa de pet-ri contendo uma camada solidificada de 15 ml de meio de regeneração sólido sem leucina.
k) Repetiu—se a etapa j) com o resto da suspensão celular obtida em i).
Os transformados começaram a aparecer ao fim de três dias .
Obteve-se assim os transformados EMY761 pEMR469 (leu+), EMY751 PEMR473 Cleu+), EMY761 pEMR-515 Cleu+), GRF13 p£MR515 (leu+> e EMY500 pEMR515 (leu+).
fABELA III
Principais meios utilizados nos exemplos 11, 12, 13 e 14
- meio sólido sem uracilo
6,7 g de base azotada de levedura sem aminoácidos (Yeast· nitrogen base without Amino Acids da DIFCO)
5,0 g de hidrolisado de caseína (Casamino acids da DIFCO) g de glucose ' 20 g de agar misturar todos os ingredientes em água destilada, completar o volume final para 11 com água destilada. Autoclavar 15 min a 120°C.
- meio 1í guido sem urac i1 o
Utilizar a fórmula do meio sólido sem uracilo omitindo o agar. Autoc lavar 15 min a 120°C.
- meio sólido sem leucina
6,7 S de t15 55 èZOtcíd?. Óí
(Yeast nitrogen
20 mg de adenina
20 mg de uracilo
20 mg de L-tr iptofano
20 mg de L-h i s t i d ina
20 mg de L-arginina
20 mg de L-metionina
30 mg de L-ti rosina
30 mg de L-isoleuc ina
30 mg de L-lisina
50 mg de L-f en i1a1an i na
100 mg de ácido L-glutâmico 150 mg de L-vaiina
400 mg de L-leucina g de glucose g de agar misturar todos os ingredientes em água destilada. Completar o volume final para 1 1 com água destilada - Autoc lavar 1-5 min a
12O’-’C. Após autoc lavagem, adicionar 200 mg de L-treonina e 100 mg de ácido L-aspártico.
- meio sólido de regeneração sem leucina utilizar a fórmula do meio sólido sem leucina misturando 30 g de sgar ern vez de 20e adicionando à mistura 182 g de sorbitol.
~ rosio liquido sem leucina utilizar a fórmula do meio sólido sem leucina omitindo o agar. Autoclavar 15 min. a 120°C. Após autoclavagem, adicionar 200 mg de L-treonina e 100 mg de ácido L-aspártico.
- me i o YF' 1 i gu i do g de extracto de levedura <Bacto-yeast da DIFCO) g de peptona <Bact-o-peptone da DIFCO) misturar os ingredientes em água destilada. Completar o volume final para 1 1 com a água destilada. Autoc lavar 1-5 min a 120°C.
- me i o YF~6 I i qu i do utilizar a fórmula do meio YP liquido ao qual se adiciona, após autoclavagem, glucose numa concentração de 20 g/1.
” ^ei'-1 YF‘G sorbitol utilizar a fórmula do meio YF‘ liquido. Após autoc lavagem, adicionar 10 ml de etanol a 100% < 1% final) e 30g de glicerol.
- meio YP et-anol-gl icerol utilizar a fórmula do meio YF‘ liquido. Após autoc1avagem,
- 53 adie ionar ml de etanol a 100%<1% final) e 30 g de glicerol.
- meio YP etanol-glicerol-galactose utilizar a fórmula do meio YP liquido. Após aut-oc lavagem, adicionar 10 ml de etanol a 100%, 30 gde glicerol e 30 g de galac tose.
EXEMPLO 12:
Expressão em erlenmeyer do cDNA da urato-oxidase pelas estirpes EMY751 pEMR453 (ura*), Ε1ΊΥ751 PEMR473 (ura+), EMY761 pEMR453 (leu*) e EMY751 PEMR473 <leu+)
-Imunodet-eccSopor transferências Western, doseamento da actividade de urat-o-oxidase e de proteínas so1úve i s.
) Expressão do cDNA da urat-o-oxidase :
a) Estirpes seleccionadas em meio sem uracilo
Uma colónia de cada uma das estirpes EMY761 pEMR4£S> (ura+) e EMY761 pEMR473 <ura+) foi colocada em cult-ura em 20 ml de meio liquido sem uracilo (.Cf. tabela III, exemplo 11). Após } uma noite a 30°C sem agitação, as duas culturas foram centrifugadas durante 10 min a 7 000 rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de água destilada estéril e novament-e centrifugados durante 10 min a 7 000 rpm. A expressSo da urato-oxidase foi induzida ressuspendendo as células em 20 ml de meio YP etanol glicerol (Cf. fabela III, exemplo 11) para a estirpe EMY761 pEMR4£9 (ura+) e 20 ml de meio YP etanol-glicerol-galactose <Cf. tabela III, exemplo 11) para a estirpe EMY761 pEMR473 (ura+). As culturas foram novamente colocadas a 30°C com agitação durante 22 h.
- bO b) Estirpes seleccionadas em meio seni leucina
Numa primeira fase, uma colónia de cada uma das estirpes EMY761 pEMR469 <leu+) e EMY761 pEMR473 <leu+) foi colocada em cultura em 20 ml de meio líquido sem leucina (Cf. Tabela III, exemplo 11). Isto permitiu obter e manter um número elevado de cópias de plasmideo fazendo a seleccão para a complementacSo da mutação leu2 pelo gene LEU2d inserido nos plasmideos pEI*IR469 e pEMR 473.
Após uma noite a 30°C com agitação, as duas culturas foram centrifugadas durante 10 min a 7 000 rpm. A expressão da urato-oxidase foi induzida ressuspendendo as células em 10 ml de água destilada estéril e novamente centrifugadas durante 10 min a 7 000 rpm. A expressão da urato-oxidase foi induzida, ressuspendendo em 20 ml de meio YP etanol-gl icerol para a estirpe ΕΙΊΥ761 PEMR489 (leu ) e 20 ml de meio YP etanol-glicerol-galactose (Cf. tabela III, exemplo 11) para a estirpe EMY761 PEMR473 (leu+). As culturas foram novamente colocados a 30°C sob agitação durante 22 h.
c ) Estirpe testemunha
A estirpe EMY761 não transformada, ou seja sem plasmideo, foi cultivada como atrás. Ela sofreu por um lado a indução em 10 ml de meio liquido YP etanol-glicerol e, por outro lado a indução em 10 ml de meio liquido YP etanol-glicerol-galactose.
2) Preparação das amostras:
a) As células cultivadas em la), 1b) e lc) foram cent-rifugadas e o sobrenadante foi rejeitado. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de água destilada e centrifugados durante 10 min a 7 000 rpm. Os sedimentos assim lavados foram ressuspensos em cerca de 1 ml de tampão trietanolamina TEA de pH 8,9. Cerca de 300 aj 1 de células assim ressuspensas foram lisadas na presença de esferas de vidro <400 a 500 wm de diâmetro) representando cerca de metade do volume final. Esta mistura foi vortexada fortemente durante 1 min, 4 vezes, as amostras sendo colocadas durante 30 s em gelo entre cada agitação. 0 líquido foi retirado dos tubos com uma pipeta Pasteur e transferido para um microtubo. As esferas de vidro foram então lavadas 1 vez com aproximadamente 200 wl de tampão TEA de pH 8,9. As esferas foram então agitadas num vort-ex durante 1 min, 1 vez, e o liquido foi retirado com pipeta de pasteur para ser adicionado ao lisado precedente. 0 lisado foi em seguida centrifugado num microtubo durante 5 min a 7 000 rpm sobrenadante foi então cuidadosamente retirado e
IJ a
-20°C para a transferência Western, a dosagem da actividade de urato-oxidase e doseamento das proteínas. 0 sedimento das células lisadas foi conservado separadamente a -20°C para a transferência Western <Cf. 3 abaixo).
conservado
Por outro lado, as realizadas em la) e lb) foram amostras retiradas às culturas tratadas como se seque antes da indução; 2 ml da cultura foram centrifugadas durante 10 min a 7 OOOrpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 500 wl de áqua destilada e novamente centrifugados durante 5 min a 7 000 rpm. 0= sedimentos foram ressuspensos em cerca de 200 wl de tampão fEA de pH 8,9 e lisados como abaixo em presença de esferas de vidro. Os sobrenadantes e os sedimentos das células lisadas foram conservado0 C separadamente.
dos a
3) Imumodeteccão da urato-oxidase por trnsferências Western;
a) Protocolo
Os sedimentos e os sobrenadantes das diferentes amostras foram submetidos a uma transferência Western, técnica bem conhecida dos familiarizados com a matéria, gue se caracteriza pelos passo gue seguem:
- solubi1ização do sedimento por ebulição durante 10 min num tampão designado tampão de amostra constituído por Tris-HCl 0,125 M pH 6,3, SDS 4%, azul de bromofenol 0,002%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 10% (de acordo com o protocolo descrito por LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 630-635)), (paso usado apenas para os sedimentos),
- separação electroforética das diferentes proteinas contidas no solubi1izadode acordo com o protocolo descrito por LAEMMLI (U.K: LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 630-635),
- fransferência das referidas proteinas contidas no gel para um filtro de ni trocelul ose (segundo a técnica de BURNETTE (W.W. BURNETÍE Anal. Biochem. 112 (1931) 195-203), implica sucessivamente:
- Lavagem do filtro de nitrocelulose durante 10 min com um tampão A (tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KC1 1 mM).
- Incubação do filtro de nitrocelulose durante 30 min a 37°C com um tampão B (tampão A a que se adicionou albumina do sérica bovina numa proporção de 3 g para 100 ml).
- Incubação do filtro de nitrocelulose durante lha 37C com um soro imune (anticorpos policlonais gue reconhecem a urato-oxidase de A, flavus).
- Lavagem do filtro de nitrocelulose com o tampão 6.
- Incubação do filtro de nitrocelulose durante lha 37°C com uma solução de proteína G marcada com iodo 125 a 0,1 mi crocur ie/ml.
- Lavagem do filtro com tampão A.
— C‘O “ duas folhas absorventes, radiograf ia.
- Secagem do filtro entre
- E.xpos i c So a um fil me de
- Revelação do filme.
b) Resu1tados
Observou-se que as estirpes EMY761 pEMR469 (ura+), EMY761 PEMR473 (ura+), EMY761 PEMR469 (leu+) e £1*1 Y 761 pEMR473 (leu+) produzem uma proteína de peso molecular aparente de aproximadamente 33 KDa que é reconhecida pelos anticorpos dirigidos contra a urato-oxidase de A. flavus e que esta ausente na estirpe testemunha.
Constatou-se igualmente que não produzem ou produzem muito pouca atrás.
as estirpes não induzidas da proteína aqui descrita
A comparacSo entre as quantidades desta proteína para os sedimentos e sobrenadantes permite deduzir que aproximadamente ©0% desta está sob a forma solúvel no lisado.
4) Doseamento da actividade de urato-oxidase:
A actividade de urato oxidase foi medida nos sobrenadantes das células lisadas de acordo com descrito no exemplo 9 atrás.
Os resultados obtidos estão resumidos no quadro (IV) a sequir. Este descreve para cada estirpe induzida com glicerol-etanol, induzida com glicerol-etanoi-galactose ou não induzido, a actividade de urato-oxidase em U/ml.
TABELA IV
Estirpe / Indutor Actividade urato-oxidase
(U/ml)
EMY761/YP etanol-gli cerol-galac tose < 0, 1
EMY761/YP etanol-glicerol < 0,1
EMY761 pEMR'469 (ura+)/não induzida 0,4
EMY761 PEMR469 (ura+)/YP etanol-glicerol 12
EMY761 PEMR469 (leu+)/(não induzida) 0,17
EMY761 pEMR’469 (leu+)/YP etanol-gl i cerol 36
EMY761 pEMR’473 (ura+)/(não induzida) < 0, 1
EMY761 PEMR473 (ura+)/YP etanol-
gli cerol-galactose 12,5
EMY761 pEMR473 <1eu+)/(não induzida) < 0, 1
EMY761 PEMR473 (leu+)/YP etanol-
glicerol-qalactose 15,3
Da tabela atrás pode-se ver claramente que as células de levedura transformadas por estes plasmídeos PEMR469 e PEMR473 sSo capazes, após indução, de produzir uma actividade urato-oxidase .
5) Doseamento das proteínas totais solúveis nos lisados
Utilizou-se o kit de ensaio de proteínas da BIORAD para dosear as proteinas totais presentes no sobrenadante das células lisadas. Ele baseia-se na observação de que a absorvância máxima para uma solução ácida de azul brilhante de Coomassie g-2SQ passa de 466 nm a 596 nm quando as proteínas se fixam nele (Cf. Reisner et al . , Anal Biochem, 64, -509 (1975)).
a) Protocolo
Introduz-se na cuvete de um para 595 nm,os seguintes volumes:
- 1 Oju 1 de amostra à qual se adicionou
- 200 àiI de «Dye reagent»concentrado espe c to f o t-órne t ro, r egu lado
790 jul de água destilada (Biorad).
Mistura-se e lê-se a assim uma curva padrão com uma de BSA (Albumina Sérica Bovina) concentração desconhecida das p densidade óptica a 695 nm.Fez-se gama de concentrações crescentes . Leu-se na curva padrão obtida a roteínas totais dos lisados.
b) Resultados
Os principais resultados obtidos estão resumidos na Tabela V a seguir. Esta descreve para cada estirpe induzida por glícerol-etanol, induzida com glicerol-etanol-galactose ou não induzida, a quantidade (em mg/ml)de proteínas totais solúveis assim como a percentagem de urato-oxidase nas proteínas totais solúveis (admite-se aqui que a actividade especifica da proteína recombinante é idêntica à da urato-oxidase obtida a partir de A. flavus: 30 U/ml).
- bt· TABELA V
Proteínas totais % de urato oxidase nas proteínas totais solúveis
Estirpe / Indutor so1úve i s mg/ml
EMY761/YP et-anol-gl i cerol 5,3 <0,05
EMY761/YP et-anol-glicerol-galactose c o ·-* I ··* <0,05
EMY761 pEMR'469 (ura )/não induzida •9,5 0,25
EMY761 pEMR'469 <ura+)/etanol-gl icerol 5,3 4,7
EMY761 PEMR469 <1eu+)/(nSo i nduz i da) 1,7 0,3
EMY761 PEMR469 < leu+)/et-anol-gl icerol •5,9 20
EMY761 PEMR473 (ura+)/<nSo induzida) 10,3 <0,05
EMY761 PEMR473 (ura+)/et-anolgl icerol-galactose 5,5 6,4
EMY761 PEMR473 <1eu+)/< não i nduz ida) 0,5 <0,05
EMY761 pEMR'473 < leu+)/et-anolgl i c e r o 1 -ga1ac tose 3,9 13
Observou-se que a taxa de produção da urato-oxidase varia de 5 a 20% segundo os transf ormant-es e o modo de seleccão dos transformados <leu+).
- 57 EXEMPLO 13; Expressão em fermentador de 2,5 1 do cDNA da urato-oxidase pela estirpe EMY751 PEMR473 (ura*)
1) Protocolo de fermentação:
a) Meio
Meio de inóculo
Uma colónia da estirpe EMY751 pEMR473 <ura+) foi colocada em cultura em 200 ml de meio líquido sem uracilo (Cf. tabela III, exemplo 11). A cultura prosseguiu durante uma noite sob agitação até uma densidade óptica de aproximadamente 3.
Meio de cultura A para 1 1 de água purificada num aparelho tipo Milli-g glucose 30 g glicerol 30 g hidrolisado de caseína 30 g (Casam i no-ac i ds da DIFC0) base azotada de levedura 15 g (Yeast· Nitrogen Base da DIFCO) extrato de levedura 2,5 g (Yeast extract da DIFCO)
K..,HP04 3,0 g
MgS04,7H,,0
0,5 g
- t-y Meio adicional B para 100 ml de égua purificada num aparelho do tipo Mi11i-Q glicerol 30 g hidrolisado de pept-ona 30 g (a Primatone de 6. Sheffield) base azotada de levedura 15 g (Yeast Nitrogen Base da DIFCO) extrato de levedura 5 g (Yeast extract da DIFCO)
K.-,HFO„ 3 g
4
MgS04,7H...0 0,5 g
b) Parâmetros de fermentação
Bio-reactor de 2,5 1 de volume total equipado com duas turbinas temperatura = 30°C PH = 5 pressão parcial em oxigénio = 30 mmHg débito de ar = 1 1/min.
bio-reactor foi cheio com 1,5 1 do meio A e foi semeado com 150 ml de inóculo.
Uma vez que a glucose se esgota de D0 2,5 até D0 17, a indução deu-se pela adição de um volume de ISO ml de galactose a
- t-3 20% peso/volume. 0 crescimento continuou e o meio adicional 8 foi adicionado a aproximadamenteDO 30.
* crescimento prolongou-se durante mais quinze horas e a colheita fez-se a uma DO 104.
2) Preparação e análise das amostras
As amostras 2) a> a partir da amostras do meio de segundo após 22 h de foram preparadas como descrito no exemplo 3 cultura do fermentador. Retiraram-se duas cultura: o primeiro após 7 h de indução, o i ndução.
Nestes dois lisados obtidos após lise realizaram-se os testes que se seguem descritos no
- imunodeteccão por transferências western
- doseamento da actividade biológica
- doseamento das proteinas totais das células, exemplo 9:
Os resultados obtidos são os que se seguem.
a) Imunodeteccão por transferências Western
Observou-se que a estirpe EMY761 PEMR473 (ura+) cultivada em fermentador de 2 1 produz uma proteina de péSo molecular aparente 33 KDa que é reconhecida pelos anticorpos dirigidos contra a urat-o-oxidase de A. flavus: (preparados em coelho de acordo com técnicas bem conhecidas; Cf. VA1TUKAITIS et al., (1981) «Methods in Enzymology* Academic Press, New York, vol. 73, p.48) e que está ausente na estirpe testemunha.
b) Doseamento da actividade biológica
Os resultados obtidos estão resumidos na tabela VI que se segue:
I.ftS£Uft VI
) 1 I Estirpe / Tempos de -j- inducão | L 1 U/ml |
1 JEMY761 1 PEMR473 <ura+) / 7 h 1 1 q
1 (EMY76Í PEMR473 (ura+) / 22 h 1 1 1 12,5 1
Observou-se que a estirpe EMY761 PEMR761 + <.ura f,
cultivada em fermentador, é capaz, após indução, de produzir uma a c ti v idade de ura to-ox i dase.
c) Doseamento das proteínas totais solúveis
Os resultados estão resumidos na Tabela VII gue se segue:
TA&ELA VII
1 r ί 1 Proteínas -! % de ura.to I
1 ί totais oxidase nas 1
J Estirpe / Tempos de Indução j solúveis proteínas I
1 1 mg/ml totais 1
1 f L I solúveis I
1 j JEMY761 PEMR473 <ura+) / 7 h j 5,2 5,7 |
[EMY761 PEMR473 <ura+) / 21 h | 1 1 5,2 6,6 | _1
Os resultados indicam gue a taxa de síntese de urato-oxida.se da estirpe EMY761 pEMR473 (ura+) cultivada em fermentador é de aproximadamente 5 % das proteínas totais da. célula apôs 7 h e 21 h ds indução.
EXEMPLO 14:
Expressão em erlenmeyer do cDNA da urato-oxidase pelas estirpes EMY781 pEMR-515 (léu^), EMY500 pEMR-515 (1eu+) e GRF18 pEMRE-51-5 (1 eu*)
Uma colónia de cada uma das três estirpes abaixo foi cultivadaem 20 ml de meio liquido sem leucina.
Após uma noit-e a 30°C com agit-ação, as t-rês cult-uras foram centrifugadas durante 10 min a 7 000 rpm. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 10 ml de água dest-ilada estéril e novamente centrifugados durante 10 min. A expressão da urato—oxida.se foi induzida ressuspendendo as células em 20 ml de meio YP etnol-glicerol-galactose (Cf. tabela III, exemplo 11). As culturas foram novamente colocadas a 30° C- com agitação durante cerca de 20 h. Para testemunha fez-se a cultura de cada uma das estirpes hospedeiras não transformadas.
As células de cada uma das seis culturas foram sedimentadas por centrifugação e regei t-ado o sobrenadante. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml durante 10 min a 7 000 rpm de água destilada e centrifugados Os sedimentos assim lavados foram ressupensos em cerca de 1 ml de tampão TEA de pH 8,9 e trituração assim como a eliminação das partículas por centrifugação foram realizados como descrito no exemplo 9, 2). 0 sobrenadante de cada cultura foi usado como atrás no doseament-oda urato-oxidase e das proteínas totais. Os principais resultados obtidos est-So resumidos na Tabela VIII a seguir:
TABELA VIII
1-1-1
I Estirpe/Condições I Actividade J Proteínas j Jtotais j I solúveis | 1 (mg/ml) J 1 1 % de urato oxidase nas proteínas solúveis
1 de cultura lu 1 1 1 1 1 1 rato-oxidase ( U/ml)
1 1 JGRF18 pEMRS15 (leu+)/a) j <0, 1 1 1 1 2 *’2 * i <0,05
j EMYSOO pEMRS15 (1 eu+ ) /a ) | <0, 1 1 °·9 1 <0,05
j EMY761 pEMRS15 (1eu+)/a)j <0, 1 1 1,8 | <0,05
JGRF18 pEMRS15 (leu+)/b) j oo i 5,4 | 23%
|EMYSOO PEMRS15 (1eu+) /b ) | 20 ί 2’5 * 1 26%
j EMY761 pEMRS15 (1eu+)/b)| 7» O 1 4'2 1 26%
: As estirpes foram cultivadas em presença de glucose (c ondi c fies de não i nduç So) ; As estirpes foram cultivadas na ausência de glucose e em presença de galactose (indução).
Estes resultados mostram que se pode obter um elevado nivel de expressão de urat-o—oxidase com três estirpes recipientes não isogénicas transformadas pelo vector de expressão do invento.
EXEMPLO 15: Construção de um vector de expressão do cDNA da urato-oxidase em células animais, o plasmideo pSVBSO
Este vector foi obtido por:
- Ligação do fragmento pequeno AccI-SnaBI contendo codificadora da urato-oxidase com excepcão dos aminoácidos, derivado do plasmideo p466; vector de urato-oxidase de A. flavus em E. co1i disponível no uma equência 16 primeiros expressão da laboratório e aqui descrito a seguir, com um fragmento sintético Hindi II-AccI, o que permitiu obter um fragmento HindlII-SnaBl contendo uma sequência completa codificadora da urato-oxidase de A. flavus e uma sequência 5' não traduzida favorável à expressão em células animais.
- Inserção do fragmento Hindi II-SnaBI do poli-sítio de clonagem <igualmente designado poli-adaptador) do vector de expressão para as células animais, o plasmídeo pSE^
A exposição que se segue apresenta sucessivamente a construção do plasmídeo p466, a do plasmídeo pSE^ e montagem do p1asm í deo p8V860.
) Construção do plasmídeo p466
Preparou-se o plasmídeo cDNA da urato-oxidase em E. coli <R. RODRIGUEZ e M. «Promoters-Strucutre and function <1982) Preager), uma p466, vector de expressão do CHAMBERLIN sequência de Shine-Dalgarno, seguidode um poli-adaptador tendo os sítios únicos Ndel e Kpnl, um fago fd) e o gene lac i .
terminador de transcrição (derivad·:
do
Este plasmídeo foi construído a partir de um plasmídeo de expressão da hGH em E. coli <p462) por substituição de fragmento portador do gene da hGH pelo cDNA da urato-oxidase.
um
A construção do plasmídeo p466 foi descrita detalhadamente no exemplo 7 atrãs.
2) Construção de um vector de e?x;pressão para as células animais, o plasmideo pSE^
A estratégia abordada baseia-se em fragmentos obtidos a partir de plasmideos pré-existentes acessíveis ao público e em fragmentos preparados por sintese de acordo com técnicas correntemente utilizadas. As técnicas de clonagem empregues são as desrit-as por T. MANIATIS, EF. FRIT8CH e J. SAMBROOK em «Molecular Cloning, a Laboratory Manual» (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984). A sintese dos oligonucleotideos foi realizada com a ajuda de um sintetizador de DNA Biosearch 4800.
A descrição que se segue será melhor compreendida em referência ã figura 18, que representa um mapa de montagem do plasmideo pSE*, os sítios tendo desaparecido por ligação estando entre parêntesis. Os símbolos utilizados nesta figura serão descritos na exposição que se seque.
Este plasmideo foi construído por ligações sucessivas dos elementos que se seguem:
1) - um fragmento FvuII-F'vuII - simbolizado por ++++++. na figura ) 13 - de 2525 pb, obtido por digestão completa do plasmideo pTZISR (Pharmacia) com a ajuda da enzima de restrição PvuII. Este fragmento contem a origem de replicacão do fago F1 (designado ORI F1 na figura 13), um gene (designado AmpR na figura 13) portador da resistência á ampicilina e da origem de replicacão· (designada ORI pBR322 na figura 13) permitindo a replicacão deste plasmideo em E. coli. 0 primeiro sitio cerse PvuII desaparece por ligação ao sítio cerse Eco RV (que desaparece igualmente) do· fragmento descrito em 7).
2) - um fragmento PvuII-Hpal - simbolizado por ¢555 na fi^ura 13 - de 1060 pb do ONA do adenovírus tipo 5 entre as posiçdes 11233 (sitio de restrição PvuII) e 10233 (sitio de restrição Hpal) (DEKKER & VAN ORMONDT, Gene 27, 1334, 115-120) contendo a informação para os RNAs VA-I e VA-II. 0 sitio cerse Hpal desaparece por ligação com o sitio cerse PvuII (que desaparece igualmente), do fragmento descrito em 3).
3) - um fragmento PvulI-HindlII - simbolizado por / / / / / na figura 13 - de 344 pb, derivado do DNA do virus SV40 obtido por digestão completa com a ajuda das enzimas de restrição PvuII e Hindi II. Este fragmento é portador da origem de replicação e o promotor precoce do DNA do virus SV40 (ref. 8. J. BYRNE et al . , PNA5-USA (1383), 80, 721-725).
sitio Hindi II desaparece por ligacSo ao sitio de ligação a HindIII do fragmento descrito em 4).
4) um fragmento sintético «sitio de ligacSo a Hindi II»-Hindl11 simbolizado por ΖΣΞΣΣΖ na Figura 13 - de 413 pb cuja sequência dada a seguir estã próxima da sequência 5' não traduzida do virus HTLV1 (ref. WEISS et al., «Molecular Biology of Tumor Viruses parte 2-2e ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboratory- p. 1057).
sitio deligação a Hindi II
AGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCC — — — - + — --—------+ -----+---------+ òQ
CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG
GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA
---------+---------+---------+---------+---------+---------+120
CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT
GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA
121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+180
CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT
GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+240
CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA
CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+300
GCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA
CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC
GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG
CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA + + +---------+-------------------+ 420
GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT
GA
CTTCGA
A
HindIII •5) - um fragmento sintético HindIII «sitio de ligação a BamHl» simbolizado por XXXXX na figura 13 - contendo o promotor da RNS-polimerase do fago T7 assim como um poli-adaptador contendo o sitio de clonagem Smal.
AGCTTGTCGACTAATACGACTCACTATAG6GCGGCCGCGG6CCCCTGCAGGAATTC
ACAGC fGA fTA TGC TGAG Γ6Α ΓΑ fCCCGCCGGCGCCCGGGGACG TCC TTAAG
A
HindIII
Smal sitio de ligação a BamHl ▼ V
GGATCCCCCGGGTGACTGACT
CCTAGGGGGCCCACTGACTGACTAG
6) - um fragmento BamHl-Bell de 240 pb - representado por ▼▼▼▼ na figura 13 fragmento pequeno obtido por digestão completa com a ajuda das enzimas Bell e BamHl do vírus SV40 que contem o sítio de poliadenilacSo tardio deste último. CM. FITZERALD et al., Cell, 24, 1331, 251-260). 3s sítios BamHl e Bell desaparecem por ligações respectivamente com o sitio de ligação a BamHído fragmento descrito em 5) e o sitio BamHl (que desaparece igualmente do fragmento descrito em 7).
7) - um fragmento BamHI-EcoRV - simbolizado por uijijÇi na. figura 13 - de 190 pb, o fragmento pequeno derivado do plasmídeo pBR322 após digestão completa com a. ajuda das enzimas EcoRV e BamHl .
3) Construção do plasmídeo pSV360 plasmídeo p466 (Cf. figura 3) foi submetido a uma digestão completa com a ajuda das enzimas Accl e Sna.BI. 0 fragmento pequeno AccI-SnaBI, que contem uma sequência de DNA
- 79 codificador da urato-oxidase com excepcão dos 16 primeiros aminoácidos amino-terminais, foi purificado e ligado ao fragmento sintético HindIII-AccI da sequência seguinte:
indiII Accl ▼
AGCTTGCC6CCACTAÍGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCÍACGGCAAGGACAATGTCCGCGT
----— -----1-------— H———— — —----j-----------1-----------1-----------(.
ACGGCG6TGATACAGGC6TCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCC TGT TACAGGCGCAGA
Esta ligação permite obter o fragmento Hindi 11-Snabl, que contem uma sequência codificadora da urato-oxidase idêntica à do clone 9C e uma sequência 5' não traduzida favorável à expressão em células animais (KOZAK, M., Nucl. Acids Res., 12, 2, 19-94,
957-972).
fragmento HindiII-SnaBI contem a sequência:
5' -AGCTTGCCG CCACTATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT
CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC
CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA
TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG
GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT
TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA
CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC
TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC
GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA
TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC
CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG
TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT
CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT
TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT
AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG
ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT
CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC
TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC
TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G
ACGGCAAGGA
GGTGTCCAGA
GATTGAGACC
ACTCCATTAA
CCTCCCGAGC
CAACCACATC
GGATGGACAT
GAGGAGAAGC
TATCAAGTCG
AGTTCTGGGG
GACCGTATCC
CAGTGGACTC
GGGCCACTGC
GCCAGCGTGC
CCAGCAGCTG
TCGAAATCGA
GCCGAGGTCT
CGTCGGCCGG
- 31 0 f raqmento H i ndIII-SnaBI foi em seguida inserido no vector p3Ej préviamente incubado com as enzimas Hindi II e Smal. Obteve-se assim o plasmideo pSVS60, representado na figura 14, na qual os símbolos têm o mesmo significado que na figura 13, o novo fragmento Hindi I I-SnaBI sendo simbolizado por os sítios SnaBI e Smal desapareceram pela ligação).
Exemplo 16: Expressão transitória do cDNA da urato-oxidase em células COS. Doseamento da actividade de urato-oxidase no 1isado celular
As células COS são células de rim de macaco exprimindo o antigénio T do vírus SV40 (Gluzman, Y. Cell 23, 1931, 175-132).
Estas células, que permitem a replicação destes vectores contendo a origem de replicação do DNA do virus 3V40, constituem hospedeiros preferidos para o estudo da expressão de genes em células & Π 1 Π) θ 1 s .
1) Transfecção das células COS e expressão transitória do cDNA da u ra to-oxi dase.
x 105 células COS foram semeadas numa caixa de petri de 6 cm de diâmetro (Corning) em 5 ml de meio modificado de Eagle segundo Dulbecco daqui em diante designado DMEM (o Dulbecco's modified Eagles médium da. GIBCO), o qual contem 0,6 g/1 de glutamina, 3,7 g/1 de NaHCO.-, e foi complementado com soro fetal de vitela (GIBCO) a 5%. Após cerca de 16 h de cultura a 37‘’C numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, o meio de cultura foi removido por aspiração e as células foram lavadas com 3 ml de tampão PBS (o Phosphate Buffer Sai ine da GIBCO). Adiciona-se então a seguinte mistura: 1000 ,ul de CDMEM + 10% de soro fetal de vitela (GIBCO)), 110 jul de dietilaminoeti1-dextrano de peso molecular médio 500 000, numa concentração de 2 mg/ml (Pharmacia), 1,1 jjI de cloroquina 100 mM (SIGMA) e 3 jjg de DNA do plasmídeo pSVS‘60 ou do plasmídeo pSEj (para testemunha). Após 5 h de incubacão a 37’_C numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono, a mistura foi retirada das células. Adicionou-se então 2 ml de tampão PBS contendo 10% de dimeti lsul f óxido (qualidade Spectroscopie, MercK). Após 1 min de incubação à temperatura ambiente, a mistura foi retirada e as células lavadas duas vezes com tampão PBS. Adicionou-se 5 ml de DMEM complementado com soro fetal de vitela a 2%. A incubação prosseguiu durante 4 dias a 37°C numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono.
2) Preparação das amostras
D meio de cultura foi aspirado e as células COS foram lavadas duas vezes com 3 ml de tampão PBS. As células foram então recolhidas raspando com uma espátula de borracha (um «Policeman») em 1 ml de tampão PBS. Após raspagem, a caixa foi lavada com 1 ml de tampão PBS. As duas suspensões celulares foram combinadas e centrifugadas durante 10 min a 1 000 rpm. 0 sobrenadante foi retirado e o sedimento celular ressuspenso em 1 ml de tampão de tr ieta.no lam ina (ΓΕΑ) 0,05M de pH 8,9/EDfA.
As células foram lisadas por sonicacão (em gelo) por pulsações de 10 s com um sonicador (o Vibra Cell da Sonics and Materials Inc. USA) regulado para uma potência de 12 W. 0 1isado celular foi centrifugado durante 10 min a 10 000 rpm e o sobrenadante foi recuperado por doseamento da urato-oxidase.
3) Doseamento da actividade de urato-oxidase.
doseamento da actividade de urato-oxidase foi efectuado como descrito no exemplo 9.
Os resultados estão apresentados na tabela que segue:
1 1 j Células COS J j fectadas por [ 1 I Actividade urato-oxidase 1 I U/ml j
1 1 | pSVSSO | | | 0, 105
1 1 1 ρ-;Ει 1 1_L <0,01
Observou-se que as células COS transfectadas pelo plasmídeo pSV860, portador do cDNA da urato-oxidase, exprimem um nivel apreciável de actividade urato-oxidase, enquanto que nenhuma actividade de urato-oxidase é detectada na testemunha. Verifica-se pois a. expressão do cDNA da urato-oxidase.

Claims (3)

  1. - 64 REIVINDICAÇÕES:
    ja — Processo para a obtençSo de uma proteína, que apresenta uma actividade urato oxidase especifica de pelo menos
    16 U/ms e que possui a sequência de aminoáeidos seguinte:
    Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai Gin Thr Vai Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys 6ln Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr Hi s Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ite Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gin Vai Asp Vai Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Vai Arg Ser Hi s Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gin Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gin Ile Leu Ala Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gin Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gin Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
    precedida eventualmente de uma metionina, ou que apresenta um grau de homologia substancial com a sequência, caracterizado por compreender a transformação de um microorganismo por um vector de expressão, que possui, juntamente com os meios necessários à sua expressão, o gene recombinante que codifica a proteína com a sequênci a que se segue:
    Met Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai
    Tyr Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Vai 3ln Thr Vai Tyr Glu
    Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys
    Ala Asp Asn Ser Vai Ile Vai Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr
    Ile Thr Ala Lys Gin Asn Pro Vai Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile
    Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Vai
    Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro
    His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Vai Gin
    Vai Asp Vai Va Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Se' Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gin Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp
    Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai
    Asp Ala Thr Trp Gin Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gin Glu Vai Arg Ser
    His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu
    Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gin Ala Thr Met Tyr Lys
    Met Ala Glu Gin Ile Leu Ala Arg Gin Gin Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr
    Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly
    Leu Gin Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro úln Ser Asp Pro
    Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu L/s Ser Lys Leu a cultura dos referidos microorganisntos deste modo transformados e a recuperação da referida proteína.
    . 2à. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracte rizado por a referida proteina apresentar uma actividade urat-o oxidase especifica de cerca de 30 U/nig.
    3*. - Processo de acordo com uma das Reivindicações 1 e
    2, c a rac te r izado referida proteina por, por análise sobre gel bidimensional, a apresentar uma mancha de massa molecular de cerca de 33,5 kDa e de ponto isoeléctrico próximo de 3,0, representando pelo menos 90% da massa proteica.
    4s. - Processo de acordo com uma das Reivindicações 1 a 3, caracterizado por a referida proteina apresentar um grau de pureza, determinado por cromatografia liquida sobre uma coluna de silica enxertada Co, superior a 80%.
    5à. - Processo de acordo 4, caracterizado por a proteína isoeléctrico próximo de 8,0.
    com uma das Rei vindicações 1 a obtida apresentar um ponto
    6â. - Processo 4, caracterizado por a bloqueador, de preferênc unidades de massa atómica de acordo com uma das Reivindicações 1 a proteina obtida possuir um agrupamento ia de massa molecular próxima de 43 , na se r i na ami no terminal.
    7ê. - Processo para a obtenção de um medicamento, caracterizado por compreender a mistura da proteína obtida de acordo com uma das Reivindicações 1 a 6, com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
    8à. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracte rizado por se transformarem microorganismos procaríotas e por o gene recombinante transportado pelo vector de expressão permitir uma expressão nos referidos microorganismos.
    . - Processo de acordo com qualquer das Reivindicações la 7 e 8, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora da proteína conter a sequência que se segue!
    - 87 ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAA6TCT AAATTG.
    lOê. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se transformarem células eucariotas e por o gene recombinante transformado pelo vector de expressão permitir uma expressão nas células eucariotas.
    llà. - Processo de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 7 e 10, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora da proteína conter a sequência que se segue:
    ATGTCTGCTG
    CAAGGTTCAC
    CCGTCTGTGT
    GACAACAGCG
    CACCGCCAAG
    TGGGCACACA
    AACATTGTCT
    CCCTCACTCC
    ACGTGGTCGA
    ACCGTGCTGA
    GTACACCACA
    ATGCCACTTG
    CACGTGCCTA
    GAAGACTTTT
    AGATGGCAGA
    TACTCGTTGC
    GGGCCTCCAA
    ACCCCAACGG
    AAATTG.
    TTAAGGCTGC
    AAGGACGAGA
    GCTTCTGGAG
    TCATTGTCGC
    CAGAACCCCG
    CTTCATTGAG
    GCCACCGCTG
    TTCATCCGCG
    GGGCAAGGGC
    AGAGCACCAA
    CTTAAGGAGA
    GCAGTGGAAG
    AGTTCGATGC
    GCTGAAGATA
    GCAAATCCTG
    CTAACAAGCA
    AACACCGGCA
    TCTGATCAAG
    TAGATACGGT
    AGACCGGTGT
    GGTGAGATTG
    AACCGACTCC
    TTACTCCTCC
    AAGTACAACC
    GACCCGGATG
    ACAGCGAGGA
    ATCGATATCA
    CTCGCAGTTC
    CCTGGGACCG
    AATTTCAGTG
    TACCTGGGCC
    ACAGTGCCAG
    GCGCGCCAGC
    CTATTTCGAA
    AGAACGCCGA
    TGTACCGTCG
    AAGGACAACG
    CCAGACGGTG
    AGACCTCTTA
    ATTAAGAACA
    CGAGCTGTTC
    ACATCCATGC
    GACATTGACG
    GAAGCGGAAT
    AGTCGTCTCT
    TGGGGCTTCC
    TATCCTGAGC
    GACTCCAGGA
    ACTGCTCGCG
    CGTGCAGGCC
    AGCTGATCGA
    ATCGACCTGA
    GGTCTTCGCT
    GCCGGTCCTC
    TTAGAGTCTA
    TACGAGATGA
    CACCAAGGCC
    CCATTTACAT
    GGCTCCATCC
    CGCTCACGTC
    GCAAGCCACA
    GTGCAGGTGG
    GTCCGGCCTG
    TGCGTGACGA
    ACCGACGTCG
    GGTCCGCTCG
    AGGTCACTCT
    ACTATGTACA
    GACTGTCGAG
    GCTGGCACAA
    CCTCAGTCGG
    TCTGAAGTCT
    - yy 125. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se transformarem células animais e por o gene recombinante permitir uma expressão nas referidas células.
    135. - Processo de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 7 e 12, caracterizado por a referida sequência de DNA codificadora da proteína conter a sequência que se segue:
    -ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC TGA6CACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC CGTCGGCCGG TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G
    - yo precedida de uma sequência 5’ não traduzida favorável à expressão nas células animais.
    14*. - Processo de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por a sequência 5' não traduzida favorável à expressão nas células animais compreender a sequência: AGCTTGCCGCCACT situada imediatamente a montante da sequência explicitada na Reivindicação 13.
    15â. - Gene recombinante, caracterizado por possuir uma sequência de DNA codificadora da proteina de acordo com a Reivindi cacão 1.
    16*. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por permitir a expressão em microorganismos procar iotas.
    17*. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicacão 15, caracterizado por possuir uma sequência de DNA codificadora da proteina de acordo com a Rei vindicação 3.
    13*. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por permitir a expressão em microorganismos eucariotas.
    19*. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por possuir uma sequência de DNA codificadora da proteina de acordo com a Reivindicacão 11.
    20*. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por permitir a expressão em células animais.
    211. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação
    20, caracterizado por possuir uma sequência codificadora da proteína de acordo com a Reivindicação 13.
    221. - Gene recombinante de acordo com a Reivindicação
    21, caracterizado por possuir uma sequência codificadora da proteína de acordo com a Reivindicação 14.
    231. - Vector de expressão, caracterizado por possuir, juntamente com os meios necessários à sua expressão, um gene recombinante de acordo com qualquer uma das Reivindicações 15 a
    241. - Vector de expressão de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por possuir pelo menos uma marca de seleccão.
    251. - Vector de expressão de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por possuir as características de um dos Plasmideos PEMR469, PEMR473 e p£MR515.
    261. - Microorganismos procariotas, caracterizados por estarem transformados por um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 23, portador de um gene recombinante de acordo com a Reivindicação 16.
    271. - Células eucarióticas, caracterizadas por estarem transformadas por um dos vectores de expressão de acordo com as Rei vindicações 23 a 25, portadores do gene recombinante de acordo com a Reivindicação 18.
    2Sâ.
    zada por estar acordo com uma
    - Estirpe de Saccharomyces cerevisiae, caracteritransformada por um dos vectores de expressão de das Reivindicações 23 a 25.
    29*. - Estirpe de acordo com a Reivindicação '28, caracterizada por ser portadora de uma mutação em pelo menos um dos genes responsáveis pela síntese da leucina ou do uracilo.
    30*. - Estirpe de acordo com a Reivindicação 29, caracterizada por ser portadora de uma mutação em pelo menos um dos genes LEU2 e URAS.
    31*. - Processo para obter a urato-oxidase recombinante, caracterizado por compreender:
    1) a colocacão em cultura de uma estirpe de acordo com uma das Reivindicações 2-3 a 30;
  2. 2) a li se de células,1
  3. 3) o isolamento e a purificação da urato-oxidase recombinante contida no lisado.
    32* . - Células animais, caracterizadas por possuírem, com os meios necessários à sua expressão, um gene recombinante de acordo com a Reivindicação 20.
    33*. - Células animais, caracterizadas por possuírem um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 23, portador de um gene recombinante de acordo com a Reivindicação 21.
    Lisboa, 12 de Julho de 1990
    Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10A 3 ° 1200 LISBOA
    FOLHA 1 (14 folhas )
    Perfil de eluição por medição da densidade óptica a 218 nm do produto da digestão tríptica da urato-oxidase.
    FIG.1
    FOLHA 2 (14 folhas)
    _)-1-,-!-1-1-1-1-1 1-1-H
    5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
    Perfil de eluição por medição da densidade óptica a 218 nm do produto da digestão da urato-oxidase pela protease V8.
    FIG. 2
    FOLHA 3 (14 folhas)
    AAACCC7CAC7GCC7C7C7CA77CC77CCG G7GCCCCCGA7CC7CAA7CCAAC77G7ACA €0
    TAC77CTCCCAAC7C7C7GC7A7A7CC77C A7A77CCCA7AC7ACAAGA7G7CCGCAG7A 120
    AAAGCAGCCCGC7ACGGCAAGGACAATG7C CGCG7C7ACAAGG77CACAAGGACGAGAAG 180
    ACCGG7G7CCAGACGG7G7ACGAGA7GACC G7C7G7G7GC77C7GGAGGG7GAGAT7GAG 240
    ACC7C7TACACCAAGGCCGACAACAGCG7C A77G7CGCAACCGAC7CCA77AAGAACACC 300
    A777ACA7CACCGCCAAGCAGAACCCCG77 AC7CC7CCCGAGC7G77CGGC7CCA7CC7G 360
    GGCACACAC77CA77GAGAAG7ACAACCAC A7CCA7GCCGC7CACG7CAACA77G7C7GC 420
    CACCGC7GGACCCGGA7GGACA77GACGGC AAGCCACACCC7CAC7CC77CX7CCGCGAC 480
    A*
    AGCGAGGAGAAGCGGAA7G7GCAGG7GGAC G7GG7CGAGGGCAAGGGCA7CGA7A7CAAG 540
    TCGTCTCTG7CCGGCC7GACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAG7TCIGGGGC7TCC7G 600
    CGTGACGAG7ACACCACAC77AAGGAGACC 7GGGACCG7A7CC7GAGCACCGACG7CGA7 660
    GCCAC77GGCAG7GGAAGAX777CAG7GGA C7CCAGGAGG7CCGC7CGCACG7GCC7AAG 720 TTCGATGCTACC7GGGCCACTGC7CGCGAG G7CAC7C7GAAGAC77T7GC7GAAGA7AAC 780 AGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAG ATGGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAG 840
    C7GATCGAGAC7G7CGAG7AC7CG77GCC7 AACAAGCAC7AT77CGAAA7CGACC7GAGC 900
    G*
    TGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGAC 960 CCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGC CGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAAACC 1020 AACATGATTCTCACGTTCCGGAGTTTCCAA GGCAAACTGTATATAGTCTGGGATAGGGTA 1080
    TAGCATTCATTCACTTGTTTTTTACTTCCA AAAAAAAAAAA. . :
    FIG.3
    Sequência nucleotídica do clone 9C e de uma parte do clone 9A
    1 : começo do clone 9A
    FOLHA 4 (14 folhas )
    10 9 A7G7CCGCAG7AAAAGCAGCCCGC7ACGGC AAGGACAA7G7CCGCG7C7ACAAGG77CAC 168
    1 MetSerAlaValLyaAlaAl&Arg7yrGly- LyaAjpAenValArgVal7yrLyaV»lHia 20
    169 AAGGACGAGAAGACCGGTGTCCAGACGGTG 7ACGAGATGACCG7C7G7G7GC77C7GGAG 228
    21 LyaAapGluLyaThrGlyValClnThrVal TyrCluMetThrValCyaValLauLeuGlu 40
    229 GGTGAGATTGAGACCTCTTACACCAAGGCC GACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCC 288
    41 GlyGluIleGluThrSezTyrThzLyaAla AapAanSerValIlaValAlaTbzAapSar 60
    289 ATTAAGAACACCATTTACATCACCGCCAAG CAGAACCCCCTTACTCCTCCCGAGCTGTTC 348
    61 IleLyaAanThrlleTyrlleThrAlaLya ClnAanProValThrProProGluLeuPha 80
    349 GGCTCCATCCTGGGCACACACTTCATTGAG AAGTACAACCACATCCATGCCGCTCACGTC 406
    81 ClySTllaLauClyThrHiaghelleGiu LyaTyzAanKiallaKiaAlaAlaBiaVal 100
    4 09 AACATTGTCTGCCACCGCTGGACCCGGATG GACATTGACGGCAAGCCACACCCTCACTCC 4 68
    101 AanlleValCyaHiaAxgTzpTlizArgMet AaplleAapGlyLyaProHiaPro&iaSer 120
    4 69 TTCATCCGCGACAGCGAGGAGAAGCGGAAT CTGCAGGTGGACGTGGTCGAGGGCAAGGGC 528
    121 PhallftAjgAapSerGluGluLyaAxgAan ValGlnValAapValValGlMGlyLyaGly 140 τι» ------‘ 529 ATCGATATCAAGTCCTCTCTGTCCGGCCTG ACCGTGCTGAAGAGCACCAACTCGCAGTTC 588
    141 XleAaplleLysSarSarLeuSezGlyLau 'ThrValLauLyagarThrAanSarGlnPha 160 —— — »jy“< “” —— —
    58 9 TGGGGCTTCCTGCGTGACGAGTACACCACA CTTAAGGAGACCTGGGACCGTATCCTGAGC 64 8
    161 TrpGlyPheLeuArgAapGluTyzThrThj LaoLyaCluThrTzpAapArglleLeuSer 180
    64 9 ACCGACGTCGATGCCACTTGGCAGTGGAAG AATTTCAGTGGACTCCAGGAGCTCCGCTCG 708
    181 ThrAapValAapAlaThrTrpGlnTrpLye AanPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer 200 tjí * Tle ’
    709 CACGTGCCTAAGTTCGATGCTACCTGGGCC ACTGCTCGCGAGGTCACTCTGAAGACTTTT 768
    201 HiaValgroLyaPhaAapAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLyaTLrPh· 220
    769 GCTGAAGATAACAGTGCCAGCGTGCAGGCC ACTATGTACAAGATGGCAGAGCAAATCCTC 828
    221 AlaGluAapAanSerAlaSerValGlnAla 7hrM«t7yzLyaMetAlaGluGlnXleL«u 240 ——— vi *
    82 9 GCGCGCCAGCAGC7GA7CGAGAC7G7CGAG 7AC7CG77GCC7AACAAGCAC7A777CGAA 88 8
    241 AJ.aArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSarLeuProAanLyaHiaTyrPhaGlu^ ^260
    88 9 ATCGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTCCAA AACACCGGCAAGAACGCCGAGGTCTTCGCT 94 8
    261 ^.IleAapLeuSerTrpHiaLyaGlyLauGln Aar.ThzGlyX.yaA3nAlaGluValÍheAla 280
    94 9 CC7CAG7CGGACCCCAACGG7C7GA7CAAG 7G7ACCC7CGGCCGG7CCTC7C7GAAGTC7 1008
    281 ProGlnSerAapPzoAanGlyI.euIleLya CyaThrValGlyArgSarSerLeuLyaSer 300 »
    - 1009 AAA77G7AA
    301 X,ysLeuSnd
    FIG.4
    Sequência de DNA aberta por ATG em posição 109 na figura 3
PT94680A 1989-07-13 1990-07-12 Processo para a obtencao de uma proteina tendo actividade de urato oxidase gene recombinante que a codifica vector de expressao portador deste gene microorganismos procariotas e celulas eucariotas transformados por este vector de expressao PT94680B (pt)

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