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KR930001117B1 - Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 - Google Patents

Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 Download PDF

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KR930001117B1
KR930001117B1 KR1019850008020A KR850008020A KR930001117B1 KR 930001117 B1 KR930001117 B1 KR 930001117B1 KR 1019850008020 A KR1019850008020 A KR 1019850008020A KR 850008020 A KR850008020 A KR 850008020A KR 930001117 B1 KR930001117 B1 KR 930001117B1
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South Korea
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dna
gene
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yeast
medium
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프레드릭 브러스트 폴
브래들리 엘리스 스티븐
레이몬드 진저러스 토마스
밀러 하아폴 마이클
프리드리히 초프 유에르크
Original Assignee
휘립프스 피트로오리암 캄파니
제이 이이 휘립프스
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Abstract

내용 없음.

Description

DNA 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
제1도는 단백질 p76에 대한 게놈 클론(pPG 6.0)과 cDNA클론(pPC 15.0)과의 상호관계.
제2도는 단백질 p72(알콜 산화효소)에 대한 게놈클론(pPG 4.0)과 cDNA클론 (pPC 8.3 및 pPC 8.0)과의 상호관계.
제3도는 단백질 p40에 대한 게놈클론(pPG 4.8)과 cDNA클론(pPC 6.7)과의 상호관계.
제4도는 클론 pPG 6.0으로부터의 본 발명 조절부위에 대한 절단도(restriction map ; 제한효소에 의한 지도).
제5도는 클론 pPG 4.0으로부터의 본 발명 조절부위에 대한 절단도.
제6도는 클론 pPG 4.8로부터의 본 발명 조절부위에 대한 절단도.
제7도는 p76구조 유전자의 3'말단으로부터 얻은 DNA의 서열에 대한 절단도.
제8도는 p72(알콜 산화효소)구조 유전자의 3'말단으로부터 얻은 DNA의 서열에 대한 절단도.
제9도는 p40 구조 유전자의 3'말단으로부터 얻은 DNA의 서열에 대한 절단도.
제10도는 단백질 p76 구조 유전자 및 그 5' 조절부위에 대한 절단도.
제11도는 단백질 p40 구조 유전자 및 그 5'조절부위에 대한 절단도.
제12도는 단백질 p76 cDNA의 절단도.
제13도는 단백질 p72(알콜 산화효소) cDNA의 절단도.
제14도는 반백질 p40 cDNA의 절단도.
제15도는 본 발명에 의한 두개의 신규 p76 조절부위-lac Z DNA구조의 절단도.
제16도는 본 발명에 의한 신규 p72(알콜 산화효소)조절부위-lac Z DNA구조의 절단도.
제17도는 플라스미드 pSAOH 1의 절단도.
제18도는 플라스미드 pSAOH 5의 절단도.
제19도는 플라스미드 pSAOH 10의 절단도.
제20도는 플라스미드 pTAFH 85의 절단도.
제21도는 플라스미드 pT76H 1의 절단도.
제22도는 플라스미드 pT76H 2의 절단도.
제22a도는 플라스미드 pT76H 3의 절단도.
제22b도는 플라스미드 pT76H 4의 절단도.
제23도는 플라스미드 pYA 2의 절단도.
제24도는 플라스미드 pYA 4의 절단도.
제25도는 플라스미드 pYJ 8의 절단도.
제26도는 플라스미드 pYJ 8△Cla의 절단도.
제27도는 플라스미드 pYJ 30의 절단도.
제28도는 플라스미드 pTAFH 1의 절단도(플라스미드가 어떻게 유도되는 가를 보여줌).
제29도는 플라스미드 pTAO 12의 절단도(플라스미드가 어떻게 유도되는가를 보여줌).
제30도는 플라스미드 pTAO 13의 절단도.
제30a도는 플라스미드 pT76U 1의 절단도.
제31도는 플라스미드 pTAO 1의 절단도(플라스미드가 어떠게 유도되는 가를 보여줌).
제32도는 플라스미드 pTAF 85의 절단도(플라스미드가 어떻게 유도되는 가를 보여줌).
제33도는 플라스미드 YEp 13의 절단도이고,
제34도는 pBpf1의 절단도이다.
본 발명은 재조합 DNA 생물공학 분야에 관한 것이다.
본 발명의 한가지 특색에 있어서, 본 발명은 DNA에서 메신저 RNA로의 전사 및, 메신저 RNA에서 단백질로의 번역 개시 및 종결을 조절하는 DNA 단편에 관한 것이다. 다른 특색에 있어서, 본 발명은 전술한 DNA 단편이 끼워지는 표면 벡터에 관한 것이다. 또 다른 특색에 있어서, 본 발명은 전술한 표현 벡터를 사용하여 형질을 전환시켜 신규의 미생물에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술이 최근 개발됨에 따라, 미생물에 의한 많은 종류의 유용한 폴리펩티드 조절 생산이 가능하게 되었다. 많은 진핵성 폴리펩티드, 예컨대 인간의 성장 호르몬, 백혈구 인터페론, 인간의 인슐린 및 인간의 프로인슐린이 이미 여러 미생물에 의해 생산되었다.
이미 연구중인 기술의 부단한 응용은 장래에 미생물에 의한 여러가지 다른 유용한 폴리펩티드 생성물의 생성을 가능하게끔 하리라고 예기된다.
재조합 DNA 기술분야에 사용되는 기술분적인 기술은 당업자에게 잘 알려진 것이다. 재조합 DNA 기술을 실시하는데 유용한 요소중에 하기(1), (2) 및 (3)이 포함되지만, 단지 여기에만 국한되는 것은 아니다 :
(1) 하나 또는 그 이상의 소요 폴리펩티드(들)을 암호화하며, 숙주 미생물내에서 발현되기 위한 적당한 조절서열이 갖추어진 유전자 ; (2) 유전자가 삽입될 수 있는 벡터(보통은 플라스미드) 벡터는 세포속으로의 유전자 이전 및 세포내에서의 DNA 서열유지뿐 아니라 전술한 유전자의 높은 발현도를 보장하는 역할을 한다. ; (3) 소요의 유전자 운반 벡터로 인해 형질이 전환될 수 있는 적합한 숙주 미생물. 이때 숙주 미생물은 삽입된 유전자에 의해 암호화된 정보를 발현시키게끔 해주는 세포 장치를 갖는다.
재조합 DNA 기술에 사용되는 기본적인 요소는 몇몇 미생물내에서 발견되는 염색체외의 겹가닥 DNA인 플라스미드이다. 플라스미드가 미생물내에서 자연발생한 상태로 발견되는 경우 이들은 종종 세포 1개당 다수의 부(copy)로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 자연발생 플라스미드 이외에, 각종 인종 플라스미드 또는 잡종 벡터가 제조되었다. 플라스미드 DNA내에 암호화된 정보중에는 딸세포내에서 플라스미드를 재생시키기 위해 요구되는 것, 즉 자발적 복제서열 또는 복제의 개시점이 포함된다. 또한 플라스미드내에 암호화된 정보중 포함되는 것으로써, 하나 또는 그 이상의 표현형 선택 형질이 있다. 표현형 선택 형질은 관여되는 플라스미드 함유 숙주세포의 클론(clone)이 선택적 매체내의 선별적 세포성장에 의해 인식되고 선택될 수 있도록 해준다.
플라스미드는 플라스미드 DNA 상의 특이적인 독특한 부위를 인식하는 한개 혹은 또 다른 제한 엔도뉴클리아제(endonuclease)나 제한효소에 의해 특이적으로 절단될 수 있다는 사실이, 플라스미드의 유용성을 입증해준다. 플라스미드 절단후에, 전단부위 또는 절단부위에 인접한 재구성 말단에서 원하는 유전물질과 절단된 플라스미드의 두끝을 맞대어 연결함으로써, 동종 유전자, 이종 유전자(즉, 숙주 이외의 미생물로부터 유래된 유전자) 또는 유전자 단편을 플라스미드 안에 끼워 넣을 수 있다. 생성된 재조합 DNA 물질을 잡종벡터라고 부를 수 있다.
DNA 재조합은 숙주 미생물의 외부에서 수행된다. 생성된 잡종 벡터는 형질전환이라고 알려진 공정에 의해 숙주 미생물내에 도입될 수 있다. 형질전환 미생물을 배양함으로써 다량의 잡종 벡터를 얻을 수 있다. 암호화된 DNA 정보의 전사와 번역을 지배하는 플라스미드 부위에 대해 유전자가 적절하게 삽입되는 경우, 생성된 접종 벡터는 삽입된 유전자가 암호화하는 폴리펩티드 서열 생산을 지시하는데 사용될 수 있다. 이러한 식의 폴리펩티드 생산을 유전자 발현이라고 말한다.
유전자 발현은 프로모터 부위라고 알려진 DNA 부위에서 개시된다. 발현의 전사 단계에서, DNA의 이중 나사선이 풀리어 그 한쪽 가닥이 메신저 RNA 합성을 위한 주형이 된다. RNA 중합효소는 프로모터 부위에 결합하여 이중나사선의 풀린 DNA의 3'말단에서부터 5'말단을 따라 이동하는데, 이때 코우팅 가닥내에 함유된 정보가 메신저 RNA(mRNA)의 5'말단에서부터 3'말단까지 전사된다. 이번에는, mRNA가 폴리펩티드 사슬로 번역되는 곳인 리보솜에 메신저 RNA가 결합된다. 각 아미노산은 구조 유전자(즉, 발현된 생성물의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 부분)라 불리울 수 있는 유전자내의 뉴클레오티드 세글자부호 또는 코돈에 의해 암호화된다. 세개의 뉴클레오티드는 각 아미노산의 생산을 암호화하므로, 한개의 뉴클레오티드 서열은 3가지 다른 방법으로 “해독”될 수 있다. 원하는 폴리펩티드 생성물을 암호화하는 구체적인 해독구조( reading frame)를 고유 해독 구조라고 한다.
프로모터에 결합된 후, RNA 중합효소는 먼저 mRNA의 5'리더(leader) 부위를 전사한 후 번역 개시 또는 출발 코돈, 그리고 다음에는 구조 유전자 자체내의 뉴클레오티드 코돈을 전사한다. 원하는 유전자 생성물을 얻기 위해서, 개시 또는 출발 코돈을 고유 해독구조로 리보솜에 의한 메신저 RNA의 번역을 정확하게 개시해야 한다. 마지막으로, 정지코돈은 구조 유전자의 말단에서 전사되는데, 이것은 mRNA의 추가서열이 RNA 중합효소와 DNA 주형과의 상호작용에 의해 형성되었을 지라도 mRNA의 추가서열이 리보솜에 의해 펩티드로 번역되지 않은 상태로 있게끔 해 준다. 따라서 정지 코돈은 번역의 종점을 결정해주므로 아미노산이 폴리펩티드 생성물에 추가 첨가되는 종점도 결정해준다. 폴리펩티드 생성물은 숙주 세포를 세포용해시키고 다른 미생물 단백질로부터의 적합한 정제나, 또는 특정 경우에 있어서는, 숙주 세포가 배양되고 그안에 폴리펩티드 생성물이 분비된 발효배지의 정제에 의해 생성물을 회수함으로써 수득된다.
실질상 제조합 DNA 기술을 사용하면, 이종 폴리펩티드(즉, 주어진 미생물내에서 통상적으로 발견되지 않거나 그에 의해 생산되지 않는 폴리펩티드)를 완전히 발현할 수 있는 미생물이 만들어질 수 있다(이것을 소위 직접 발현이라고 함). 그와는 달리, 융합 단백질, 즉 동종 폴리펩티드「즉, 야생형(형질전환이 안된) 숙주 미생물내에서 발견 또는 생산되는 폴리펩티드」의 아미노산 서열중의 일부분과 융합된 이종 폴리펩티드가 발현될 수도 있다(이것을 소위 간접 발현이라고 함). 간접 발현에 있어서, 초기에 수득된 융합 단백질 생성물은 융합된 동종 이종 폴리펩티드가 세포외의 환경에서 분리될 때까지 그 의도하는 용도로서의 활성이 없게 된다. 그에 따라, 예컨대, 메티오닌 잔기를 브롬화시아노겐으로 절단하면 융합된 동종/이종 폴리펩티드로부터 소마토스타틴, 티모신 알파 1 및 인간 인슐린의 성분 A와 B사슬이 생성되는 한편, 전술한 잔기를 효소로 절단하면 베타 엔도르핀이 생성된다.
지금까지, 각종 폴리펩티드의 생산을 위해 재조합 DNA를 사용하는 상업상의 노력은 숙주 미생물로 대장균을 사용하는 데에 집중되어 왔다. 그러나 몇몇 상황에서는 대장균이 숙주로서 부적합하다고 증명된다. 예를들어, 대장균은 제약 생성물로서 유용한 어떠한 폴리펩티드에서도 제거되어야 하는 독성 발열요소를 많이 함유하고 있다. 물론, 이러한 정제작업이 성취될 수 있는 효율은 특정 폴리펩티드에 따라 변화할 것이다. 또한 대장균의 단백질 분해 활성은 몇몇 유용한 생성물의 생산을 심각하게 제한할 수 있다. 이를 비롯한 다른 여러가지 동기로 인하여 대체 숙주에 대한 관심이 증가되었고, 특히 폴리펩티드 제품의 생산을 위한 진핵세포 미생물의 사용이 관심을 끌고 있다.
진핵세포 시스템(예:효모)내에서 폴리펩티드 생성물을 생산하기 위한 수단을 이용하면, 재조합 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 생산을 위해 원핵세포 시스템(예 : 대장균)을 사용했을때에 비하여 상당한 장점이 제공될 수 있다. 대규모의 대장균 발효는 비교적 최근에 출현한 것임에 비하여, 효모는 몇세기 동안 대규모 발효시에 사용되어 왔다. 효모는 세균보다 더 높은 세포 농도로 배양될 수 있으며 연속 발효공정에 용이하게 적용될 수 있다. 사실상 매우 높은 세포농도, 즉 100g/L이상의 세포농도까지 효모(예 : 피치아 파스토리스)를 배양하는 것이 Wegner의 U.S. 4,414,329(Phillips Petroleum Co.에 양도됨)에 발표되었다. 효모 숙주의 또 다른 장점중에는, 유기체의 중요한 많은 기능들(예 : 산화성 인산화)이 소기관 안에 존재하며 따라서 야생형 숙주세포와 관계없는 폴리펩티드를 생산하게 되는 해로운 영향에 노출되지 않는다는 사실이 포함된다. 진핵 생물로서의 효모는 발현된 폴리펩티드 생성물을 글리코실화시킬 수 있다는 사실을 알 수 있는데, 그리한 글리코실화는 폴리펩티드 생성물의 생활성에 중요하다. 또한 진핵 생물로서의 효모는 고등 생물과 동일한 코돈 신호성을 나타낼 것얘다. 따라서 포유동물의 유전자 또는, 예컨대, 포유동물의 mRNA로부터의 역전사에 의해 얻은 상보적 DNA (cDNA)로부터의 발현 생성물을 보다 더 효과적으로 생산하는 경향이 있다.
특성이 잘 규명되지 않은 효모 종을 숙주/벡터 시스템을 개발하는 것은, 전사 조건 및 적합한 벡터에 대한 지식의 부족으로 인해 심히 방해를 받는다. 또한 영양요구성 돌연변이는 영양요구 상보성에 의한 형질전환체의 직접선택을 제외하고는 이용이 가능하기 않다. 만일 재조합 DNA 기술이 그의 전제를 완전히 유지시키려면, DNA 조작을 손쉽게 해주고 삽입 DNA 서열의 발현을 최적으로 해줌으로써 원하는 폴리펩티드 생성물을 통제조건하에 높은 수율로 제조할 수 있게끔 하는 새로운 숙주/벡터 시스템이 고안되어야 한다.
본 발명에 따라, 폴리펩티드 생성물의 생산을 위하여 DNA에서 메신저 RNA로의 전사 및 메신저 RNA의 번역을 조절하는 DNA 서열이 발견되고, 분리되고, 규명되었다. 본 발명의 신규 DNA서열은, (a) 탄소원 및 에너지원인 메탄올 상에서 배열될 수 있는 효모균주, (b) 포도당, 에탄올, 과당등에서 배열될 수 있는 효모균주, 그리고 (c) 글리세롤, 갈락토즈, 아세테이트 등에서 배양될 수 있는 효모균주에 의해 폴리펩티드 생성물을 생산하는데에 사용된다.
사용된 제한 효소를 표시하기 위하여 다음과 같은 약어가 명세서 전반에 걸쳐 사용되었다 :
A =AsuII
B =BamHI
B2=Bg1II
BC =BclI
C =ClaI
H2=HincⅡ
H3=HindIII
K =KpnI
Nd1=NdeI
Nr =NruI
Ps =PstI
Pv1=PvuII
Pv2=PvuⅡ
R1=EcoRI
R5=EcoRV
Rs =RsaI
S =SalI
S3=Sau3A I
Sc =SacI
Sm =SmaI
Sp =SphI
Ss =SstI
St =StuI
T =TaqI
Th =ThaI
Xb =XbaI
Xh =XhoI
Xm =XmaI
첨부된 도면에서, DNA 단편의 조작을 위해 사용되며 결찰시 파괴되는 제한 부위(제한 효소에 의한 절단 부위)는 파괴부위에 대한 약어를 괄호안에 넣음으로써 표시된다.
본 발명에 따라서, 하기 조건 중 적어도 하나에 대하여 반응하는 조절부위로 구성된 신규의 DNA 단편이 제공된다 : 메탄올의 존재, 세포가 메탄올 이외의 몇몇 기질상에서 배양될 경우의 탄소원 기아현상, 메탄올 이외의 비-분해 대사질 억제 탄소원의 존재, 본 발명에 의한 DNA 단편의 조절부위는, 메신저 RNA 생산을 암호화하는 DNA의 5'말단에 위치할 경우, 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있다. 또한 본 발명의 법주 내에는 전술한 DNA 단편의 돌연변이체도 포함된다.
더 나아가 본 발명에 의하면, 메신저 RNA의 생산을 암호화하는 폴리펩티드 코우팅 부위의 3'말단에 위치할 경우, 폴리아데닐화, 메신저 RNA의 전사 완료 및 번역 완료를 조절할 수 있는 조절부위로 이루어진 DNA 단편이 제공되는데, 이때 메신저 RNA의 전사 및 번역은 하기 조건중 적어도 하나에 대해 반응하는 조절부위에 의해 조절된다 : 메탄올의 존재, 세포가 메탄올 이외의 몇몇 기질상에서 배양될 경우의 탄소원 기아현상, 메탄올 이외의 비-분해대사질 억제 탄소원의 존재, 또한 본 발명의 범주내에는 전술한 DNA 단편의 돌연변이체도 포함된다.
또한 본 발명의 구체적인 실시상태에 따르면, 암호화된 폴리펩티드가 퍼옥시좀으로 안으로 들어가도록 지시하는 DNA단편이 제공된다. 퍼옥시좀은 메탄올에서 배양된 효모 세포안에 다량 존재하는 세포내 소체이다. 이들 세포내 소체는 통합된 폴리펩티드 생성물을 세포내 유체 및 효소(예 : 단백질효소)로부터 분리시키는 역할을 맡는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라서, 알콜 산화효소, 약 40킬로돌턴의 단백질 및 약 76킬로돌턴의 단백질 생산을 암호화하는 유전자가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에 따라서, 전술한 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 및 형질전환 유기체가 제공된다.
또한 본 발명의 또다른 구체예에 따라서, 본 발명의 플라스미드 및 DNA 단편과 아울러 이종 폴리펩티드(즉, 숙주 유기체에 원래 존재하지 않던 폴리펩티드)를 생산하기 위한 방법이 제공된다.
피치아 파스토리스로부터의 조절성 유전자 분리
유일한 탄소원인 메탄올 내에서 배양된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)세포에서 분리된 폴리 A-RNA를 사용하여 대장균내에서 약 20,000개 cDNA의 라이브러리(library)를 제조한다(실시예 3참조). 메탄올이나 에탄올 내에서 배양된 피치아 파스토리스에서 분리된 활성화 폴리 A+RNA를 사용하는 교잡법에 의해 그 라이브러리를 선별시험한다. 이러한 플러리-마이너스 선별시험을 되풀이한 후에는, 세개의 뚜렷한 비-동종 cDNA클론이 메탄올 특이성 메신저 RNA의 사본(copy)이라고 확인된다. 이들 클론은 pPC 6.4. pPc 8.0 및 pPC 15.0으로 명시되며, 그 길이안에 각기 470, 750 및 1100개의 뉴클레오티드 삽입물을 함유하는 것으로 측정되었다.
길이가 더 긴 cDNA 클론의 수득하기 위한 시도로써, 첫번째 cDNA 라이브러리를 제조할 때 사용한 것보다 더 온화한 S1뉴클리아제 분해조건을 이용하여 두번째 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이러한 새로운 라이브러리의 각 구성원들을 32p-표지 cDNA 클론 pPC 6.4, pPC 8.0 및 pPC 15.0으로 선별 시험한다. 그 결과 cDNA클론 pPC 6.4와 pPC 8.0에 상응하는 더 긴 cDNA클론이 분리된다. 더 긴 클론인 pPC 6.7과 pPC 8.3은 1200 및 2100개의 뉴클레오티드 삽입물을 함유한다고 밝혀졌다(제2도와 제3도 참조). pPC 15.0의 1100 뉴클레오티드 보다 더 긴 삽입물을 갖는 cDNA 클론은 40,000개 이상의 cDNA클론을 선별 시험한 후에 관찰된다.
이들 cDNA클론의 각각에 상응하는 게놈 DNA 단편의 분리는 먼저 32p-표지 pPC 15.0, pPC 8.0 또는 pPC 6.4와 교잡된 형태인 제한 엔도뉴클리아제-처리 염색체 DNA의 피치아 파스토리스 DNA단편을 잘라내어 아가로스 겔로부터 전기용출시킴으로써 수행된다. 그 다음, 용출된 게놈 DNA단편을 대장균 안에서 클로닝시키고, 상기 cDNA 탐침을 각각 사용하여 수회 선별 시험함으로써 적합한 게놈 클론을 확인한다.
각 cDNA클론과 그에 상응하는 게놈클론의 상호관계가 제 1,2 및 3도에 예증되어 있다. pPC 15.0은 클론 pPC 6.0내에 존재하는 6000뉴클레오티드의HindIII 게놈단편안에 암호화되어 있다(제1도). pPC 15.0로 암호화된 유전자의 5'말단은 pPG 6.0내에 함유된 1300bp 염기쌍의HindIII-EcoR I 단편을 향하고 있는 한편, 그 유전자의 3' 말단은 pPG 6.0내의PstI 자리에 가까이 있다.
cDNA 클론 pPG 8.3은 게놈 클론 pPG 4.0안에 포함되어 있다(제2도). pPG 4.0은 접촉 게놈 DNA의 4000 뉴클레오티드EcoR I-PvuII 삽입물을 함유한다. pPG 4.0내 pPC 8.3에 대한 유전자의 5'말단은BamH I자리 근처를 향하고 있는 한편, 이 유전자의 3'말단은PvuII자리 가까이에 위치한다. pPG 4.0내 pPC 8.0(관련 cDNA클론)의 5'말단은 pPG 4.0의 3'말단에 있는KpnI자리 근처를 향하고 있는 한편, cDNA의 3'말단은PvuII자리 가까이에 위치한다.
cDNA클론 pPC 6.7의 4800개 뉴클레오티드의BamHI-EcoRI 게놈 단편안에 전부 위치한다(제3도). 클론 pPC 6.4는 cDNA클론 pPC 6.7안에 완전히 위치한다. pPC 6.7은 pPC 6.4보다 더 완전한 사본이므로, pPC 6.4에 대해서는 더 자세히 연구하지 않았다. 유전자의 5'말단은 게놈클론 pPG 4.8의EcoR I 말단보다는BamH I 말단 가까이에 위치한다(제3도).
전술한 모든 게놈 클론내에는, 5'에서부터 각 cDNA 클론내에 복사된 구조 유전자까지인 적어도 1200개 염기쌍 플랭캥(flanking) 게놈 DNA 서열이 존재한다.
전술한 각 게놈 클론 및 cDNA 클론은, 본 출원이 특허될시에 대중이 입수할 수 있도록 Northern Regional 연구센터(America, Peoria, Illinois)에 기탁되었다. 모든 클론은 대장균 숙주안에 저장하였다.
Figure kpo00001
상기 모든 미생물들은 결정적으로 기탁되었으며 1984년 8월 31일자로 대중이 입수할 수 있게 되었다.
메탄올 동화 효모에 대한 pPG 6.0, pPG 4.0 및 pPG 4.8의 독특성
전술한 각 cDNA클론을 표지하고, 많은 메탄올 동화 효모 및 메탄올 비-동화 효모에서부터의 염색체 DNA 서열의 탐침(probe)으로 사용한다. 세 cDNA에 대한 동종 유전자가 본질적으로 모든 메탄올 동화 효모내에 존재한다고 밝혀졌으나 메탄올 비-동화 효모(S세레비시애)내에는 분명히 존재하지 않는다. 따라서, 이들 유전자는 메탄올 동화 효모에 대해 독특한 것이라고 생각된다. 또한 실시예 17에 상술된 서던(Southern ) 교잡실험에 의해, 여러가지 메탄올 동화 효모에서 얻은 독특한 메탄올 반응성 유전자들 사이에 고도의 상동체가 존재함이 입증되었다.
pPG 6.0, pPG 4.0 및 pPG 4.8 유전자의 RNA 전사 특성화
클론화된 이들 유전자 각각의 발현에 대한 메탄올의 영향은, 이들 유전자의 전사에 미치는 영향을 연구함으로써 관찰될 수 있다. 유일한 탄소원으로 에탄올이나 메탄올을 사용하여 배양된 피치아파스토리스 세포에서 분리된 폴리 A+RNA를 사용하여 노던(Nothern) 교잡 필터를 제조한다(실시예 4참조).32P-표지 pPC 15.0, pPC 8.0 및 pPC 6.4를 사용하여, 메탄올 및 에탄올에서 배양된 세포에서 얻은 세개의 동일한 필터쌍(실시예 1참조)를 따로따로 탐침한다. 클론 pPC 15.0, pPC 8.0 및 pPC 6.4를 메탄올에서 배양된 세포에서 얻은 RNA 분자들(각기 약 2400, 2300 및 1300개의 뉴클레오티드를 갖는다)과 교잡시킨다. 에탄올 존재하에 배양된 세포에서 얻은 RNA를 사용할 경우에는 클론 pPC 15.0 및 pPC 8.0의 교자이 관찰되지 않는다. 그러나 에탄올에서 배양된 세포로부터 분리된 RNA를 pPC 6.4로 탐침할 경우에는, 클론이 메탄올-배양 세포에서 관찰된 것과 동일한 1300-뉴클레오티드 RNA 분자와 교잡되나, 그 수준은 5배 가량이 낮다(정성적 평가시).
pPG 6.0, pPG 4.0 및 pPG 4.8에 의해 암호화된 단백질 생성물의 크기 측정
전술한 각 cDNA클론에 의해 어떤 단백질 생성물이 암호화되었나를 측정하기 위해서, 메탄올에서 배양된 피치아 파스토리스 세포로부터의 폴리 A+RNA를 각 cDNA 클론과 선택적으로 교잡시킨다. 잡종-선택 mRNA(즉, 각각의 cDNA 클론과 교잡된 mRNA)를 시험관에서 번역하고, SDS-변성조건을 이용하는 전기영동에 의해 각 단백질 생성물을 용해시킨다(실시예 5참조). 이와 같은 시험관내 양성 교잡-번역 실험결과에 의하면, 클론 pPC 15.0, pPC 8.3 및 pPC 6.7이 76,000(p76), 72,000(p72) 및 40,000(p40) 돌턴의 폴리펩티드 각각에 대한 정보를 암호화하는 mRNA를 선택한다는 것이 밝혀졌다. 메탄올에서 배양된 피치아 파스토리스 세포로부터의 전체 폴리 A+RNA(즉, 잡종-선택되지않은)가 동일한 시험관내 시스템에서 번역될 경우에는, 위와 동일한 단백질들이 관찰된다.
p72의 알콜 산화효소로서의 확인
A. 분자량 비교
깨끗하게한 세포 용균물을 H2O에 대해 투석시킴으로써, 알콜 산화효소 단백질이 많이보강된 샘플을 제조한다(실시예 7참조). 이러한 투석으로 인해 생성된 결정성 침전물은 각각 76,000 및 72,000 돌턴의 폴리펩티드 2개를 지배적으로 함유한다는 것이 SDS 전기영동에 의해 밝혀졌다. Sephacryl 200을 통해 크로마토그라피시킴으로써 침전물을 더 정제하면(실시예 7참조), 알콜 산화효소의 활성은 정제된 72,000 돌턴 폴리펩티드의 활성에 해당한다는 것이 입증된다. 이 폴리펩티드의 크기는 cDNA 클론 pPC 8.3에 의해 선택된 단백질 생성물의 크기와 동일하다(실시예 10참조).
B. 면역 침전
클론 pPC 8.3과 pPG 4.0이 알콜 산화효소 구소 유전자를 암호화한다는 사실을 면역학적인 연구에 의해 지지될 수 있다(실시예 11 참조). 피치아 파스토리스에서 분리된 단백질 제제(76,000 및 72,000 돌턴의 폴리펩티드를 모두 함유)를 사용하여 토끼내의 이들 폴리펩티드에 대한 특이적 항혈청을 상승시킨다. 클론 pPC 8.3으로부터의 잡종-선택 폴리 A+RNA가 시험관내에서 번역될 경우에는, 피티아 파스토리스 세포에서 얻은 단백질 제제에 맞서 만들어진 항혈청에 의하여 72,000 돌턴의 번역 생성물만이 침전된다.
C. 추측/실제 아미노산 서열 비교
클론 pPC 8.3이 사실상 파치아 파스토리스 알콜산화효소를 암화화하는 cDNA 클론이라는 것을 더 자세히 입증하기 위해서, 그 단백질의 아미노 말단에 대한 아미노산 서열을 pPC 8.3에 의해 암호화된 추측 아미노산 서열과 비교하였다. 그에따라, 분리된 72,000돌턴 단백질의 NH2-말단 아미노산 서열(서열 A)이 다음과 같이 측정되었다(실시예 8):
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.
서열 A
그와 병행하여, pPC 8.3 및 pPG 4.0내에 암호화된 유전자의 5'말단의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다. 게놈 클론과 cDNA클론의 DNA 서열에서 유래된 아미노산 2-19의 추측 아미노산 서열(서열 B 참조)은 분리된 피치아 파스토리스 알콜 산화효소에 대해 위에서 측정된 아미노산 서열(서열 A)의 처음 18개 아미노산과 완전히 일치하였다.
추측 아미노산 서열 :
뉴클레오티드 서열Met ala ile Pro glu glu phe
(pPC 8.3 및 pPG 4.0) 5'-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT
3'-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
asp ile leu val leu gly gly gly ser ser gly ser
GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3'
CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-5'
서열 B
또한, 알콜 산화효소 유전자의 코우딩 부위에 대한 전체 뉴클레오티드 서열이 측정되었다. 측정된 뉴클레오티드 서열 및 추측 아미노산 서열이 서열 B'로 설명되는데, 그 서열은 다음과 같을 것이라고 생각된다.
추측 아미노산 서열 : Met ala ile pro glu glu phe
뉴클레오티드 서열
(pPC 8.3 및 pPG 4.0) : 5'-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT
3'-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
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GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC
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GGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ATA AAT
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GGG TTC TTT GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGG
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AGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGT
TCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCA
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GGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGA
CCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCT
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CCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAG GTT CGG CTC
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AAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA GGT ATG
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AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGA
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TAC GAG AAG ACC GGT CTT GCT AGA TTC TAA-3'
ATG CTC TTC TGG CCA GAA CGA TCT AAG ATT-5'
서열 B'
상기 뉴클레오티드 서열을 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터의 전술한 알콜 산화효소에 대한 공지의 (Ledeboer 일행) 뉴클레오티드 서열과 비교해보면, 추측 아미노산 서열, 유전자(및 생성된 펩티드)의 실제크기, 코돈의 조합과 배열등을 포함한 여러 가지 상당한 차이가 발생한다는 것을 알 수 있다.
p76의 디히드록시아세톤 합성효소로서의 확인
p76 유전자의 처음 51개 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열이 표준기술에 의해 측정되었다. 이 서열로부터, p76 단백질의 아미노 말단에 대한 아미노산 서열이 추측될 수 있다:
아미노산 서열 : met ala arg ile pro lys
5'-ATG GCT AGA ATT CCA AAA
뉴클레오티드 서열 :
3'-TAC CGA TCT TAA GGT TTT
pro val ser thr gln asp asp ile his glu leu
CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3'
GGT CAT AGC TGT GTT CTA CTG TAA GTA CTT AAC-5'
p76에 대한 추측 아미노산 서열은 한세눌라 폴리모르파에서 얻은 디히드록시아세톤 합성효소(DHAS)에대한 공지의 아미노선 서열(Manowicz 일행)과 비교될 수 있다. 서열내에 몇가지 차이점이 보이지만, 두단백질 사이에는 식별될 수 있는 유사성이 존재한다 :
피 치 아 DHAS:met-ala-arg-ile-pro-lys-pro-
한세눌라 DHAS:met-ser-met-arg-ile-pro-lys-ala-val-ser-thr-gln-asp-asp-ile-his-glu-leu-ala-ser-val-asn-asp-glu-gln-his-gln-arg-ile-
상당한 정도의 상동체 및 피치아 p76 과 한세눌라 DHAS의 유사한 단백질 크기(약 76,000돌턴)에 기초하여, p76이 피치아에서 DHAS로서 시험적으로 확인되었다.
앞서 알콜 산화효소 유전자를 사용했을때와 마찬가지로, 피치아 DHAS 단백질의 처음 51개 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열을 한세눌라 DHAS의 공지된( Janowicz 일행)뉴클레오티드 서열과 비교해보면, 코돈의 조합과 서열, 추측 아미노산 서열, 유전자의 전체 크기등에 있어서 많은 차이점이 나타난다.
피치아 파스토리스로부터의 조절프로모터-함유 DNA단편
본 발명의 5' 조절부위는 제4,5 및 6도에 제시된 절단도에 자세히 나와 있다. 폴리펩티드 p76의 발현을 조절하는 5'조절부위는 제4a도에 도시된 DNA 단편안에 위치한다. 약 2900 염기쌍의HindIII-XhoI 단편은 다음에 보다 자세히 설명될 조절기능을 함유하는 것으로 명백히 입증되었다. cDNA 클론 pPC15.0은 완전한 사본 cDNA가 아니므로, 제4a도에 도시된 DNA 단편중 적어도 일부분은 폴리펩티드 P76에 대한 구조적 코우팅 서열을 포함할 것이라 생각된다. 그에 따라, 조절기능은 제4b도에 도시된 약 1300 염기쌍의HindIII-EccR I 단편내에 존재한다고 생각된다. 아래에 자세히 설명될 신규의 β-갈락토시다제 유전자함유 구조는 이러한 제안을 지지해준다.
폴리펩티드 p72(알콜 산화효소)의 발현을 조절하는 5' 조절부위는 제5도에 도시된 약 2000 염기쌍의EccR I-BamH I DNA 단편안에 위치한다. 다음에 설명될 신규의 β-갈락토시다제 유전자 함유구조는 이러한 DNA 단편의 조절 성질을 입증해준다.
제6도는 폴리펩티드 p40의 생산을 조절하는 5'조절부위를 포함한 약 3000 염기쌍의BamH I -SalI DNA단편에 대한 절단도를 제공해 준다. 이 단편은, 특히 DNA단편내에 위치하는 다른 제한부위들에 근거하여, 제4도 및 제5도에 도시된 5' 조절부위와 분명히 구별된다.
제10,2a 및 11도는 폴리펩티드 p76,p72(알콜 산화효소)와 p40 각각에 대한 구조 유전자 및 조절부위에 대한 제한효소의 자료를 제공해준다. 그러므로, 제10도는 폴리펩티드 p76의 생산을 조절하고 암호화하는 피치아 파스토리스 게놈 DNA의 3800 염기쌍HindII-PstI 단편에 대한 세부 사항을 제공해 준다.
제2a도는 폴리펩티드 p72(알콜 산화효소)의 생산을 조절하고 암호화하는 피치아 파스토리스 게놈 DNA의 4000 염기쌍EcoR I-PvuII 단편에 대해서 다루고 있다. 제11도는 폴리펩티드 p40의 생산을 조절하고 암호화하는 피치아 파스토리스 게놈 DNA의 3700 염기쌍BamH I -EcoR V 단편을 제시해준다.
게놈 클론, pPG6.0, pPg4.0 및 pPG4.8 또한 절단도에 의해 규명되어 있다. 클론 nPG6.0은 제1a도에 자세히 나와 있다. 참고 도면의 한가지 요점으로써, DNA 단편의 5' 말단이 원점이라고 추정된다. 클론pPG6.0은 피치아 파스토리스 염색체 DNA의 약 6000염기쌍HindIII 단편이며, 여러 가지 제한 효소에 의해 다음과 같이 절단된다:
Figure kpo00002
클론 pPG4.0은 제2a도에 상세히 도시되어 있다.
이 클론은 염색체 DNA 의 약 4000 염기쌍EcoR I -PvuII 단편이다. 클론의 5' 말단을 원점으로 하여 다음과 같은 자료를 pPG4.0에 대해 얻었다.
Figure kpo00003
클론 pPG4.8은 제3a도에 상세히 도시되어 있다. 이 클론은 피치아 파스토리스 염색체 DNA의 4800염기쌍BamH I -EcoR I 단편이며, 다음과 같은 추가적 제한 부위를 갖는다:
Figure kpo00004
게놈 클론 pPG6.0, pPG4.0 및 pPG4.8을 대장균 플라스미드 pBR322 상의 독특한 제한부위안에 삽인한다.
HindIII 단편인 클론 pPG6.0을 pBR322의HindIII 부위안에 클론화시킨다. 클론 pPG4.0은 pBR322의EcoR I -PvuII 자리에 클론화시키고, pPG4.0은 pBR322의EcoR I -BamH I부위에 클론화시킨다(실시예 6 참조). 이들 플라스미드로 인해 형질이 전환된 대장균 균주는 본 출원이 특허될시에 대중에게 분양되도록 Northen Regional 연구센터(Peoria, Illinois)에 기탁되었다. 기탁된 균주들에게 다음과 같은 수탁번호가 주어졌다.
Figure kpo00005
제7,8 및 9도는 p76,p72 (알콜 산화효소) 및 p40의 3' 조절부위에 대한 절단도를 제공해준다. 3' 조절부위는 폴리아데닐화, 전술한 뉴클레오티드에 의해 암호화된 메신저 RNA 의 전사종료 및 번역종료의 조절에 유용하다. 그에 따라, 폴리펩티드 p76 유전자의 3' 조절부위(제7도에 도시되어 있는 2700염기쌍EcoR-HindIII단편)는, 폴리아데닐화뿐만 아니라, 폴리펩티드 p76을 암호화하는 mRNA 또는 3' 조절부위 위쪽에 삽입된 유전자로부터 유래된 다른 mRNA의 전사종료 및 번역종료에 있어서 유용하다.
제8a도에 도시되어 있는 p72 유전자로부터의 200 염기쌍StuI -PvaII 단편, 제8b도에 도시되어 있는 p72 유전자로부터의 300 염기쌍StuI -HindIII 단편, 제8c도에 도시되어있는 p72 유전자로부터 3200염기쌍SalI -EcoR I 단편 및, 제9도에 도시되어 있는 p40 유전자로부터의 1900염기쌍 (1.9킬로 염기쌍)SalI -EcoR I 단편은, 그들과 함께 야생형 피치아 파스토리스내에 결합될 수 있는 구조 유전자 및 이들 3' 조절부위의 상부에 삽입될 수 있는 외래(즉, 이종)유전자에 관해 유사한 유용성을 갖는다.
pPG4.0내의 알콜 산화효소(AO) 유전자는 AO 유전자 전사종료 부위의 수백 염기쌍안에서 종지되므로, 제8c도에 도시된 추가의 3'서열은 다음과 같이 얻어진다. 첫단계는,피치아염색체 DNA 를EcoR I 과SalI 로 소화시키고, 소화된 DNA 를 서던 얼룩법(blot method)에 의해 AO 유전자로부터 2000 염기쌍 32P-표지BamH I-HindIII 단편과 교잡시킨다. AO 유전자 탐침과 교잡된 피치아EcoR I -SalI 소화단편중에는 , AO 유전자의 3' 부분 및 그 유전자의 3' 말단 플랭킹 서열을 암호화하는 3200염기쌍 단편이 있다.
약 3200염기쌍의EcoR I-SalI-절단 피치아 DNA 단편을 겔 용출에 의해 회수하고 그 단편을EcoR I 및 -SalI-소화 pBR322 안에 삽입함으로써, 3' AO 유전자 단편을 클로닝시킨다. 끝으로, 표지된 AO 유전자 단편을 탐침으로 사용하는 군체 교잡에 의하여, 3'AO 유전자 단편을 함유하는 재조합 플라스미드터 pPG3.2 를 확인한다. 플라스미드 pPG3.2로 인해 형질이 전환된 대장균 균주를 Northern Regional 연구센터 (Peoria, Illinois)에 기탁하였다. 기탁된 균주에게 NRRL B-15999( KC TC 8247P) 라는 번호가 주어졌다. 제8c도에는 pPG3.2로부터의 피치아 DNA 단편에 대한 제한 엔도뉴클리아제 절단부위도가 도시되어 있다. 이 단편은 AO의 3'부위(SalI로 부터HindIII까지)를 암호화하는 약 1500 염기쌍 및 AO 유전자의 서열 3'에 대한 약 1700 염기쌍을 함유한다.
cDNA 클론의 특성화
피치아 파스토리스로부터의 조절 유전자에 대한 cDNA 클론이 절단도 작성에 의하여 특성화되었다. 제12도에는 p76 cDNA인 1100 염기쌍 단편이 도시되어 있다. DNA 서열의 5' 말단을 원점으로 하면, 제한효소XhoI 은 원점으로부터 약 500염기쌍의 p76 cDNA를 절단하고,HincII는 원점으로부터 약 950염기쌍을 절단하며,EcoR I은 원점으로부터 약 1050-1100 염기쌍의 p76 cDNA 를 절단한다. 제12도에 도시된 cDNA 클론뿐 아니라 제13도 및 제14도에 도시된 cDNA 클론은 모두PstI 종점을 갖는 것으로 나와 있다. 이들은 DNA 단편의 pBR322로의 클로닝을 수월하게 해주기 위하여, 초기에 얻어진 상보적 DNA의 G-C 꼬리달기에 의해 생산된 제한부위를 인공적으로 만들어낸다. 노던 교잡연구 및 폴리펩티드의 크기에 기초하여 cDNA 클론 pPC15.0은 p76 mRNA 의 불완전한 사본(전체 메신저 DNA 서열의 반정도만을 나타냄)이라고 평가된다.
제13도에는 클론 pPC8.3과 pPC8·0이 겹쳐져서 구성된 p72(알콜 산화효소) cDNA의 합성 절단도가 제시되어 있다.
전술한 바와 같이 DNA 서열의 5' 말단을 원점으로 한다. 그에 따라, 알콜 산화효소 cDNA 를 각종 제한효소로 처리하면 다음과 같은 크기의 단편이 수득된다.
Figure kpo00006
클론 pPC8.0과 pPC8.3 내 알콜 산화효소 유전자의 3' 말단에 대한 제한효소 절단도를 작성해보면, cDNA 클론 pPC8.3에는 알콜 산화효소 mRNA 서열의 약 250개 뉴클레오티드가 빠져 있음을 알 수 있다(제2도). 알콜 산화효소 mRNA의 3' 말단에 존재하는 서열은 약 500개의 뉴클레오티드에 의해 pPC8.3과 겹쳐진 cDNA 클론 pPC8.0안에 존재한다.
제14도는 폴리펩티드 p40의 cDNA인 1200염기쌍 단편의 절단도를 제시해준다. cDNA 클론의 5'말단을 원점으로 하면, 클론 pPC6.7은 원점으로부터 약 1000개 염기쌍 Sal I(및 HincII)에 의해 절단된다.
각각의 cDNA 단편은 pBR322로 클론화된 후 대장균의 형질전환을 초래한다. 형질절환 균주는 Northern Regional 연구쎈터(Peoria, Illinois)에 기탁되었다. 기탁된 균주에게 다음과 같은 번호가 주어졌다.
Figure kpo00007
전술한 값 cDNA 클론은, 탄소원 및 에너지원인 메탄올상에서의 효모생장에 독특한 폴리펩티드 생산을 암호화하는 염색체 DNA의 확인 및 분리를 위한 탐침으로서 유용하다. 앞서 기재한 바와 같이, 이들 클론은P.파스토리스를 메탄올에서 배양할 경우 관찰되는 독특한 폴리펩티드에 대한 구조 코우팅정보 및 조절부위를 함유하는P.파스토리스염색체 DNA 단편을 확인하는데 사용된다.
유사한 방식으로, 이들 cDNA 클론은, 다른 메탄올 동화효모[예 : 토룰롭시스 몰리시아나(Torulopsis molischiana), 한세눌라 캡슐타텀(Hansenula capsulatum), H.논퍼만텐스(H.nonfermantes등)로 부터의 유사유전자를 확인하고 분리하기 위한 탐침으로서의 유용성을 갖는다(실시예 17참조).
알콜 산화효소 유전자의 정밀분석
p72 (알콜 산화효소)에 대한 구조 정보가 암호화하는 점의 상부 클론 (5')에 대한 뉴클레오티드 서열을 측정함으로써 클론 pPG4.0의 5' 조절부위를 자세히 규명하였다. mRNA 번역 출발부위 (ATG 코돈) 앞의 처음 250개 뉴클레오티드는 다음과 같을 것이라고 생각된다.
5'ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT
ATTCGAAACG-3'
서열 C
클론 pPG4.0의 프로모터 기능은 이러한 뉴클레오티드 염기서열내에 함유되어 있다고 생각된다.
이러한 신규의 DNA 단편을 보다 자세히 기술하기 위하여 상기 서열 C에 상술된 서열 앞에 있는 추가의 뉴클레오티드 301개를 측정하였다. 그에 따라, mRNA 번역 출발부위 앞의 처음 553개 뉴클레오티드는 다음과 같을 것이라고 생각된다:
5'- AATGGCCCAAA ACTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG AAATCCTAAC GGCCAGTTGG TCAAAAAGAA
ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATT
GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA
AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'
서열 D
서열 D에 포함된 추가의 뉴클레오티드(서열 C와 비교)는, 알려지지 않은 반응 기구에 의하여, 서열 C에 함유된 프로모터 부위에다 추가의 조절기능을 부여하리라고 생각된다. 서열 D는 , 효모내의 유전자 발현을 조절할 수 있는 실시예 14와 15에서의 1100염기쌍 DNA 단편에 대한 부분적 DNA만을 나타낸다는 것을 알아야 할 것이다. 추가의 조절기능은 서열 D에 나와 있지 않은 1100염기쌍 DNA 단편의 부분내에 암호화 되어 있을 것이다.
이러한 신규의 1100염기쌍 DNA 단편을 보다 더 자세히 기술하기 위하여, 추가의 뉴클레오티드를 서열화함으로써, 효모내의 유전자 발현을 조절할 수 있는 실시예 14와 15에서의 전체1100 염기쌍 DNA 단편의 뉴클레오티드를 완전히 묘사하였다. 이러한 뉴클레오티드 서열을 서열 D'라 한다 :
5'-AGATCTAA CATCCAAAGA
CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC
AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG
GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC
CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG
GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG
GCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT
ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC
TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA
TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC
AGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT
GCATTGTCCT CCACATTCTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG
GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA
CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA
AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT
TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAA
GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3'
서열 D'
서열 C와 D에 관련되는 추가의 조절기능은, 서열 C와 D에 나온 뉴클레오티드 서열 훨씬 앞쪽에 있는(즉, 5'방향에 있는)서열 D'의 부분내에 암호화되어 있을 것이라는 사실을 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다.
알콜 산화효소에 대한 RNA 전사가 어디에서 개시되는가를 측정하기 위하여, cDNA 클론 pPC8.3과 게놈 클론 pPC4.0으로 부터의 유전자에 대한 5' 말단 근처의 DNA 서열을 비교하였다. cDNA 클론 pPC8.3은 비-번역 부위5'에서 알콜 산화효소 유전자까지 약 100개의 뉴클레오티드를 함유한다. 이러한 서열에 기초하여, 뉴클레오티드-29에서-43[여기서, 번역 출발부위(ATG 코돈)의 A는 +1로, 5'방향에 있는 G는 -1로 명시됨]에 대해 상보적인 15염기(-CTTCTCAAGTTGTCG-3')의 올리고 뉴클레오티드를 합성하고(실시예9 참조), 5'말단에 이르기 위해 알콜 산화효소 mRNA를 따라 연장되는 프라이머로서 사용한다. 이러한 프라이머-연장 실험으로부터 얻은 cDNA의 서열에 의하면,피치아 파스토리스알콜 산화효소 mRNA 에 대한 세개의 다른 전사 개시점이 나타난다. 주요 전사부위 번역 개시 코돈으로부터 114 뉴클레오티드에서 시작된다. 중요하지 않은 두개의 대체적 전사부위는 알콜 산화효소 AUG 코돈으로부터 117및 111 뉴클레오티드 위족(5')에서 시작된다.
알콜 산화효소 mRNA의 출발점 앞에 있는 55개 뉴클레오티드는 추정상의 Goldberg-Hogness 박스(TATAA 박스)를 함유한다. 서열 TATAAA는 알콜 산화효소 mRNA 에 대한 지배적 전사부위의 5' 말단으로부터 -40위치에서 발생한다(따라서 이러한 단백질에 대한 번역 출발코돈으로부터 154 뉴클레오티드 위쪽).
알콜 산화효소 유전자의 3' 조절부위는, p72(알콜 산화효소)에 대한 구조 유전자가 암호화되는 점의 아래쪽 약 120개 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열을 측정함으로써 자세히 규명되었다. 그 서열은 서열 D''로서 아래에 기재되어 있다.
5'-TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG
GCTTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGT
ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA-3'
서열 D”
p76 유전자의 정밀 분석
또한, P76에 대한 구조 정보가 암호화되는 점의 위쪽(5') 클론의 뉴클레오티드 서열을 측정함으로써 클론 pPG6.0의 5'조절부위가 자세히 규명되었다. mRNA 번역 출발부위(ATG 코돈)앞의 처음 622개 뉴클레오티드는 다음과 같을 것이라고 생각된다. :
5'-TT
CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAATTG AAATAACCCC
AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATTTCCT TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC
CAAATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT
CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA
ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT
CAAACTATCA AACATCAAAA-3'
서열 D'''
클론 pPG6.0의 프로모터 기능은 이러한 뉴클레오티드 염기의 서열안에 포함되어 있으리라 생각되지만, 당업자라면 잘 알 수 있는 바와 같이, 추가적인 조절 특성은 서열 D'''로서 제시된 서열보다 훨씬 위쪽에 있는 서열에 의해 부여될 수 있다.
클론 pPG6.0의 3'조절부위는 p76 구조정보가 암호화되는 점의 아래쪽(3')약 180개 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 서열을 측정함으로써 자세히 규명되었다. 이 서열은 서열 D''''로서 아래에 기재되어 있다 :
5'-GTCAGCAGTG TTTCCTGCCA AAGCCATCAA GAGGACGTAC
ATGCTCTCAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT TCCTCCTTTT CCTTTCCTGT TGCATTTTAT
TTGGTCAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATG
TCAATGGACC TACCACATAG-3'
서열 D''''
형질전환된 효모내에서의 발현
전술한 본 발명의 플라스미드는 형질이 전환될 수 있는 효모 균주내에서 그 유용성을 갖는다. 본 발명의 신규 DNA 단편에 의한 효모내 유전자 발현의 조절은 형질전환 미생물에에 탄소원 기아현상을 겪게 함으로써 성취될 수 있다. 각종 분해 대사질 억제탄소원과 비-분해 대사질 억제탄소원상에서 배양된 후의 탄소원기아현상은 본 발명의 조절부위 조절하에 유지된 유전자 산물의 발현을 유도한다. 적합한 종의 형질전환 효모내에서 원하는 유전자 산물의 발현을 성취시키기 위한 또 다른 방법은, 형질전환 효모를 메탄올상에서 배양시키는 것이다. 원하는 유전자 산물의 발현을 유도하기 위한 또 다른 방법은, 형질전환 효모를 비-분해대사질 억제탄소원을 함유하는 배지상에서 배양시키는 것이다.
본 발명의 조절부위들은 여러가지 조건하에서 유도된다고 밝혀졌으므로, 이들은 모든 효모 균주내에서의 발현에 유용하다. 따라서 메탄올상에서 또는 비-분해 대사질 억제탄소원상에서 배양될 수 있는 효모는 이질, 즉 이종 폴리펩티드를 직접 생산하기 위해 사용될 수 있는 반면, 분해대사질 억제탄소원상에서 배양될 수 있는 효모는 그렇게 배양된 효모세포에게 탄소원 기아현상의 조건을 겪게함으로써 이질 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 공정에 있어서 바람직한 형질전환 효모 균주의 예로써 다음과 같은 속(屬)의 구성원들이 포함된다 :
캔디다(Candida),클로케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyces),시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces),로도토룰라(Rhodotorula),한세눌라(Hansenula),토룰롭시스(Torulopsis),피치아(Pichia) 및클루이버로마이세스(Kluyveromyces). 이와같은 속(屬)에서 유래되는 효모들은 그 취급 안전, 생장조건등이 확립되어 있고 당업자에게 공지된 것이므로 바람직하다.
본 발명 공정의 한가지 실시상태에 사용하기 위한 특히 바람직한 효모 균주는 탄소원 및 에너지원으로서의 메탄올상에서 배양될 수 있는 균주이다. 메탄올 상에서 배양될 수 있다고 알려진 효모의 예로써 다음과 같은 속의 구성원들이 포함된다.
캔디다,클로케라,사카로마이세스,로도토룰라,한세눌라,토룰롭시스및피치아.
본 발명의 조절 부위들은 탄소원 기아현상의 조건뿐만 아니라 비-분해 대사질 억제탄소원상에서의 배양에 의해서 유도될 수도 있으므로, 비-메탄올성 기질, 예컨대 포도당, 아세테이트, 글리세롤, 에탄올, 유당, 갈락토즈, 과당, 자당등과 상기한 것중 어느 둘 또는 그 이상의 혼합물상에서 배양될 수 있는 효모 균주도 본 발명을 실시하는데에 유용하다. 적합한 비-분해대사질 억제성 비-메탄올성 탄소원(예:글리세롤 및 갈락토즈)상에서 숙주 미생물을 배양시킴으로써, 또는 적합한 분해대사질 억제성 탄소원(예:에탄올, 포도당 및 과당)상에서 숙주 미생물을 배양시킨 숙주 미생물에게 탄소원 기아현상을 겪게 함으로써, 본 발명조절부위의 조절하에서 유전자 산물의 발현을 성취시킬 수 있다.
또한 본 발명의 조절부위는 발현의 유도 및 억제의 관점에서 여러가지 배양조건에 대한 반응성이 있으므로, 본 발명 조절부위의 조절하에서 유전자 산물의 조절 발현을 성취시킬 수 있다. 그에 따른 예로써, 이질유전자의 발현을 낮은 수준으로 유도하는 탄소원상에서 세포를 배양시킨 후, 유전자 발현을 강하게 유도할 메탄올로 바꿔 넣을 수 있다. 그와는 달리, 유도/억제 공급물의 혼합물(예:메탄올-포도당 혼합물)을 사용함으로써 조절 유전자 발현을 성취시킬 수도 있다. 또 다른 대체적 방법으로서, 포도당이나 에탄올과 같은 억제성 탄소원을 배지에다 첨가해 줌으로써, 메탄올상의 배양에 의해 초래된 높은 수준의 발현도를 필요해 따라 감소시킬 수도 있다. 물론, 공급 혼합물 및 공급물 도입 순서에 있어서 여러가지 변형이 가능하며, 그러한 변형에 의하면 본 발명 조절부위들로부터 얻은 유전자 발현의 수준에 걸쳐 많은 조절을 할 수 있으리라는 것을 당업자 수준에서 잘 알 수 있을 것이다.
숙주 효모 균주로서 특히 바람직한 것은, 히스티딘 생산 능력이 결여되고 있고 그로 인해 돌연변이체 유전자형His4라고 명명되는, 돌연변이체피치아 파스토리스GS115 이다. GS115 는피치아 파스토리스NRRLY-11430으로부터 유래되며, 본 출원이 특허될시에 대중에게 분양되도록 미합중국 농무성의 Northern Regional 연구센터(Peoria, Illinois)에 기탁되었다.피치아 파스토리스GS115 에게는 1984년 8월 31일 이래로 NRRL Y-15851(KFCC10359)이라는 수탁번호가 주어졌다.
이와 같은 특별한 균주는 히스티딘 경로가 결여된 영양요구성 돌연변이체이기 때문에 유용하다. 다른 DNA 서열중에서도 HIS4 유전자 기능을 함유하는 벡터로 이러한 숙주를 형질전환시키면 형질전환 숙주를 즉시 선택할 수 있게 된다.
본 발명의 조절부위들은사카로마이세스속의 효모 균주내에서 이종 유전자 산물을 발현시키는데에 유용하다고 입증된 이래로 많은 영양요구성 돌연변이체가 알려졌다. 그외의 바람직한 숙주 효모 균주의 예로써 다음과 같은 것들이 있다.
ATCC 24863(atrp1,ade1,his2,leu1,gal1,ural 돌연변이체), ATCC 24684(atrp1,ade1,his7,gal1,ura1, 돌연변이체), ATCC 32810(atrp5,arg4,his5,lys1,ade2,gal2 돌연변이체), ATCC34182(anade3,his,lys,ura돌연변이체), ATCC34352(anura2 돌연변이체), ATCC34353(anura2 돌연변이체), ATCC 38523(anarg1,thr1 돌연변이체), ATCC 38626(aleu2,hist4 돌연변이체), ATCC38660(ahis4,leu2,thr4 돌연변이체), ATCC42243(anura3 돌연변이체), ATCC 42336(anade1,his4,thr4 돌연변이체), ATCC 42403(anarg4,lys7 돌연변이체), ATCC 42404(anade1,his4,leu2 돌연변이체), ATCC 42564(anura1,his6 돌연변이체),
,ATCC 42596(ahis4,leu2,lys1 돌연변이체), ATCC 42957(ahis4,leu2,htr4,trp5 돌연변이체), ATCC 42950(anade돌연변이체),ATCC 42951(anade,leu돌연변이체), ATCC 44069(anura1돌연변이체), ATCC 44070(aleu2,his4 돌연변이체), ATCC 44222(ahis4 돌연변이체), ATCC44376(ahis4 ,ade2 돌연변이체), ATCC 44377(ahis4,leu1 돌연변이체)등 당업자라면 잘 알 수 있는 바와 같이, 유용한 숙주 균주가 영양요구성 돌연변이체에만 국한되는 것은 아니다. 그에따라, 예컨대 항생제 저항성 유전자와 같은 양성 선택 마이커(marker)로 기본유기영양성 균주를 형질전환 시키면 형질전환 균주의 탐지 및 분리를 위한 유용성 수단이 제공된다.
대장균도 본 발명의 플라스미드에 대한 적합한 숙주이다. 많은 대장균 균주가 적합한 숙주로서 사용된다는 것을 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명의 작업에 사용된 몇몇 균주들을 아래에 놓았다.
Figure kpo00008
피치아 파스토리스 형질전환 과정
피치아 파스토리스의 형질전환은 앞서 기술한 바가 없다.피치아 파스토리스형질전환에 대한 실험과정은 하기 실시예12에 보다 더 자세히 제시되어 있다.P.파스토리스용 형질전환 시스템을 개발하기 위하여, 영양요구성 돌연변이체 GS115(NRRL Y - 15851)를 분리해내었으며 이 균주가 감지할만한 히스티니돌 수소이탈효소 활성을 갖지 않는다는 점에서 히스티딘 경로가 결여되어 있음을 측정하였다.
GS115(NRRL Y-15851)은 세포벽의 효소적 소화에 의해 형질전환이 되어 스페로플라스트를 생성시킬수 있는데, 이 스페로플라스트를 형질전환용 DNA와 혼합하고 칼슘이온 및 폴리에틸렌글리콜 존재하에 배양한 후 히스티딘이 결여된 선택적 배지내에서 재생시킨다. 형질전환용 DNA는 숙주 균주에게 결여되어 있는 HIS4유전자를 갖고 있으므로 사용된 선택적 배지 위에는 형질전환된 세포만이 생존한다.
피치아 파스토리스 HIS4유전자의 분리
Sau3A로 전체 염색체 DNA를 부분 소화시킨 후 자당 구배를 통해 원심분리시킴으로써, HIS4유전자를 균주 P. 파스토리스 NRRL Y -11430으로부터 분리해낸다. (실시예 13참조). 5-20kbp 의 단편들을 S.세레비시애-대장균 왕복운행 벡터 YEp13 (ATCC 37115:제33도)의BamHI절단부위로 클론화시키고 대장균으로 형질전환시킨다. 약 50,000개의 군체를 결합시키고 전체 플라스미드 DNA를 추출시킨다. his4ABC돌연변이체S. 세레비시애균주 5799-4D(NRRL Y-15859)의 스페로플라스트를 Hinnen 일행의 방법(1978)에 의해 1μg의 YEp13 피치아 DNA와 혼합한 후 히스티딘이 결여된 배지내에서 재생되도록 하다. 형질전환 결과, 총 재생성 스페로플라스트 5X107으로부터 약 1X103의 기본유기영양성 효모 군체가 생성되었다. DNA없이 배양된 대조용 샘플은 군체를 생산하지 않았다. 전체 효모 DNA를 20개의 His+군체에서추출시키고 다시 대장균으로 형질전환시켰다. 효모 DNA제제중에서 17개가 암피실린 저항성 군체를 생산하였다. 제한효소 크기분류 및 절단도 작성에 의해, 그리고 실시예 13 §G 에 기재된 방법으로 낮은 엄중성하에 (55℃ 하에 2 xSSC 내에서 사후 교잡세척) 표지된S.세레비시애HIS4 단편과 역교잡하는 능력에 의해, 이들 클론화 단편을 보다 더 자세히 규명하였다. HIS4-함유 플라스미드들은S.세레비시애HIS4유전자와 교잡하는 하나 또는 이상의 단편을 각기 함유한다. 그러한 HIS4-함유 플라스미드 하나를 재클론화시켜 pYJ8이라는 HIS4-함유 플라스미드를 얻었는데 이것이 제25도에 나와있다. 플라스미드 pYJ8은 피치아 HIS4 유전자를 비롯하여 클로르암페니콜 및 암피실린 저항성 유전자를 포함한 pBR 325 서열을 함유한다.
유사 프로토콜 및 Arg-S. 세레비시에 균주 S2072A를 사용하여P.파스토리스NRRL Y-11430으로 부터 ARG4유전자를 분리해낸다(arg4 leu2 trp1 gal2 Yeast Genetic Stock Center〈Berkely, CA〉로 부터 얻음).
당업자라면 잘 알 수 있는 바와 같이, 적합하게 결함이 있는S.세레비시애균주를 사용하여피치아로부터 다른 마아커 유전자를 유사하게 분리시킬 수 있다.
피치아 파스토리스 자발적 복제 서열의 분리
본 발명에 의한 벡터의 또다른 유용한 성분은 피치아에서 유래된 자발적 복제 서열(PARS)인데, 이들은 GS115(NRRL Y-15851)의 형질전환 횟수를 늘려주고 플라스미드가 안정한 염색체의 요소로서 유지되는 것을 보다 더 증진시켜 준다.
피치아ARS 들을 찾아내기 위하여,TagI로피치아 파스토리스GS115(NRRL Y-15851)유래의 DNA를 부분 소화시킨후 5-10 kbp 단편을 분리해내고 pYJ8 △Cla의 독특한ClaI 부위로 클론화시킨다(제26도 참조). 플라스미드 DNA를 약 10,000개의 His+ 피치아군체에서 회수하여 대장균의 형질전환에 사용한다. 10,000개의 암피실린 저항성 군체로부터 플라스미드를 분리해낸 후 다시 GS115로 형질전환시킨다. 이러한 서브라이브러리(sublibrary) 형질전환으로부터 His+효모 군체 40개를 따로따로 선택적 배지상에 스트리크(streak)한후 선택적 배지내에서 별개의 배양군으로 배양하다. 40개의 이들 배양군에서 전체 효모 DNA를 추출해내어 대장균으로 형질전환시킨다. 그의 효모 DNA제제가 최대의 암피실린 저항성 대장균 군체를 생산했던 두개의 플라스미드 pYA63(PARS1)과 pYA90(PARS2)를 그 다음의 분석용으로 선택한다. 이들 플라스미드는피치아 파스토리스GS115(NRRL Y-15851)을 매우 높은 횟수로 형질전환시키며, 각기 외래 DNA의 삽입물을 함유한다.
플라스미드를피치아내의 자발적 요소로 유지시키기 위한 ARS의 능력 측정법으로서, 각각의 플라스미드로 형질전환된 효모세포의 배양균을 선택적 배지내에서 배양시키고 주기적으로 표본을 채취한다. 세포내 플라스미드 서열의 상태는, 비제한 효모 DNA들을 방사성 표지된 pBR325와 서던 교잡시킴으로써 측정된다. 플라스미드 pYA63과 pYA90은 선택적 배지내에서 적어도 10세대동안피치아내에 존속한다(그러나 50세대로써 존속은 종결됨).
추정상의피치아자발적 복제 서열(PARS1)중 하나를 다른 몇몇피치아벡터에 클론화시킴으로써, 형질전환 DNA를 자발적 요소로서 유지시키는 그의 능력을 조사한다. 플라스미드 pYJ30(제27도)와 pBRf1(제34도)는 선택적 배지 (His-)상에서 20세대의 생장후에 여전히 자발적 요소로서 존재하며 세포 한개당 다수의 부(copy)로 존재한다. PyJ30으로 형질전환된 세포의 서던 얼룩분석 결과, 세포 한개당 약 10부가 존재함이 밝혀졌다.
pYJ30과 pBPf1 각각에 의해 제공된 PARS1을 함유하는 플라스미드 pSAOH5(제18도 참조)와 pT76H4(제22b도 참조)가, 그들이 유래된 플라스미드에 대하여 비슷한 안정성을 나타내는 가를 측정한다. 이들 백터를 함유하는 세포를 포도당 존재하의 선택적 조건(His-)에서 약 50세대동안 배양한다. 다음에, 세포를 비-선택적 조건(His+)으로 옮기고, 기본유기영양성의 손실을 조절한다. 이들 플라스미드의 안정성은 비-선택적 배지로 이동될시 His 기본유기영양성의 신속한 손실을 비롯하여 pYJ30의 안정성과 필적할만하다. 따라서 자발적 복제 서열을 함유하는 플라스미드를 사용하여 수행된 실험은 자발적 플라스미드 DNA로 부터의 유전자 발현에 대한 결과를 제공해준다.
신규의 β-갈락토시다제 유전자를 함유하는 구조
본 발명 조절부위들의 단백질 생성물 생산 조절능력을 입증하기 위하여, 신규의 DNA 구조를 제조한다. 그에따라, 폴리펩티드 p72(알콜 산화효소) 또는 p76을 암호화하는 유전자의 조절부위를 조절하면서 대장균lacZ 유전자를 몇몇 플라스미드에 집어넣는다. 플라스미드P SAOH1, pSAOH5, pSAOH10, pTAFH.85, pT76H1, pT76H2, pT76H3 및 pT76H4의 제법이 실시예 14에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 조절부위 -β-갈락토시다제 융합물을 숙주 효모세포에 도입시키는 것은 플라스미드를 도입용 운반체로 사용하면서 본 명세서에 기재되어 있지만, 당업자라면 잘 알 수 있듯이 조절부위-구조 유선자 구조를 플라스미드를 통해서 세포안으로 도입시키는 것은 필수적인 사항이 아니다. 그에따라, 효모내에서 유지될 수 있는 어떠한 분자라도 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 조절부위-구조 유전자 구조는 숙주 효모세포의 염색체안으로 통합될 수 있다.
또한 본 발명의 범위는 여기에 발표된 조절부위의 조절하에 β-갈락토시다제를 생산하는 것에만 국한되는 것이 아니라는 사실을 당업자 수준에서 이해할 수 있을 것이다. 본 발명 조절부위의 조절하에 생산될 수있는 각종 폴리펩티드는 독자의 상상력에 의해서만 제한된다. 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 제조를 위한 많은 과정들이 존재한다. 예를들어, 여러가지 길이의 올리고뉴클레오티드를 공지의 과정에 의해 합성할 수 있다. 특이적인 염기 짝짓기 성질로 인하여 그러한 몇몇 올리고뉴클레오티드들 더 긴 겹가닥 분자안으로 모을 수 있다. 이러한 겹가닥 분자의 올리고뉴클레오티드 성분은 효모 DNA가 리가제(DNA연결효소)에 의해 연결될 수 있다. 그와는 달리, 원하는 폴리펩티드에 관계되는 메신저 RNA 를 역전사효소의 작용에 대한 주형으로 사용하면서 원하는 코우딩 서열을 갖는 DNA 분자를 역전사효소를 사용하여 합성할 수도 있다. 그외의 또다른 가능성은, 게놈 DNA 단편을 콜로닝시켜 원하는 생성물의 직접 발현이 발생하는 지를 관찰하는 것이다.
조절부위-구조유전자와 구조를 제조하기 위하여, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 여러가지 과정에 의해서 변경시킬 수 있다. 예를들어 전술한 바와 같이 제조된 DNA의 말단을, 특이적 제한 엔도뉴클리아제에 의해 인식된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 짧은 겹가닥 DNA 분자(소위, 연결분자)와 연결시킬 수 있는데 이때 사용되는 효소는 DNA 리가제이다. 이들 분자를 특이적 제한 엔도뉴클리아제로 소화시킨후 연결시키면, 제조된 DNA 서열의 말단에는 명시된 제한 엔도뉴클리아제 인식부위에 해당하는 종점이 생길 것이다.
이러한 과정으로 제조된 세개의 특이적 조절부위-β-갈락토시다제 유전자 구조는 절단도 작성 자료의 관점에서 제 15도와 제16도에 기재되어 있다. 제15a 에 제시된 절단도에는, pPG6.0의 5'조절부위에서 유래된 850 염기쌍의HindIII-BamHI 부분및 대장균으로부터lacZ 유전자(3600염기쌍의BamH-NruI 단편)로 이루어진 구조가 나와 있다. 이와 동일한 구조가 각각의 플라스미드 pTAFH.85, pT76HI 및 pT76H2에 존재하는데, 이것은 다음에 자세히 기술하고자 한다(실시예 14참조). 제15b도에 제시된 절단도에는, pPG.6.0의 5' 조절부위에서 유래된 1300염기쌍의HindIII-EcoRI 부분 및 대장균으로 부터의lacZ 유전자로 이루어진 구조가 나와 있다. 이와 동일한 구조는 각각의 플라스미드 pT76U1, pT76H3 및 pT76H4에 존재하는데, 이것은 다음에 자세히 기술하고자 한다(실시예 14참조).
제16도는 pPC4.0의 5' 조절부위에서 유래된 1100 염기쌍의EcoRI-BamHI 단편 및 대장균으로 부터의lacZ 유전자로 이루어진 구조에 대한 절단도이다. 이 구조는 각각의 플라스미드 pSAOH1, pSAOH5 및 pSAOH10에 존재하는데, 이것은 다음에 자세히 기술하고자 한다(실시예 14참조).
플라스미드 pSAOH은 제17도에 도식적으로 예증되어 있다. 제16도에 자세히 나온 조절부위-β-갈락토시다제 유전자 융합체를 함유하는 것 이외에도, 이 플라스미드는 하기 (a)-(d)를 함유하는 것으로 밝혀졌다:
(a)Amp R유전자를 포함하는 pBR322 서열:
(b)피치아 파스토리스HIS4유전자 :
(c)S.세레비시애2μ환 (circle) DNA ; 및
(d)S.세레비시애로부터의 가로막힌 URA3 유전자.
따라서 상기 플라스미드는 대장균 숙주와 효모 숙주내에서의 형질전환 및 복제 능력을 갖는다. DNA의 조작을 위하여 대장균이나 효모 숙주내에 선택성 마이커가 존재한다.
플라스미드 PSAOH5는 제18도에 도식적으로 예증되어 있다. S.세레비시애2μ환 DNA와 몇몇피치아 파스토리스HIS4 유전자 측면 DNA가 삭제되고 피치아 파스토리스 자발적 복제 서열(pYA63으로 부터의 PARS1)이 첨가되는 것을 제외하고는 이 플라스미드는 전술한 PSAOH1과 유사하다.
플라스미드 pSAOH10은 제19도에 도식적으로 예증되어 있다. 이 플라스미드는 하기 (a)-(c)를 함유한다 :
(a) 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체;
(b)테트라사이클린 저항성, 클로르암페니콜 저항성 및 암피실린 저항성 (tet R,cam R및amp R)을 수여하는 유전자들을 포함한 pBR325 서열; 및
(c)S.세레비시애HIS4 유전자(아래에 기재된 바와 같이 플라스미드 pYA2에서 얻음).
사용된 조절부위-β-갈락토시다제 유전자 융합체가 제15a도에 기재된 것 (제16도에 기재된 융합체 대신)이라는 사실을 제외하고는, 플라스미드 pTAFH.85, pT76H1 및 pT76H2가 전술한 세개의 플라스미드와 유사하다.
사용된 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체가 제15b도에 기재된 것( 제16도에 기재된 융합체 대신) 이라는 사실을 제외하고는, pT76H3 및 pT76H4가 pSAOH1 및 pSAOH5와 각기 유사하다.
플라스미드 pTAFH. 85 는 제20도에 도식적으로 예증되어 있으며, 하기 (a)-(e)로 구성된다:
(a) 제15a도에 도시된 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체:
(b)amp R유전자를 포함하는pBR322 서열:
(c)피치아 파스토리스HIS4 유전자 :
(d)S. 세레비시애2μ환 DNA ; 및
(e)S.세레비시애로부터의 가로막힌 URA3 유전자.
플라스미드 pT76H1은 제21도에 도식적으로 예증되어 있으며, 하기 (a)-(c)로 구성된다 :
(a) 제15a도에 도시된 조절부위 -2-갈락토시다제 유전자 융합체:
(b)amp R유전자를 포함하는 pBR322 서열: 및
(c) 피치아 파스토리스 HIS4 유전자 및 자발적 복제 서열(PARS1).
플라스미드 pT76H1은 제22도에 도식적으로 예증되어 있으며, 하기 (a)-(c)로 구성된다 :
(a) 제15a도에 도시된 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체:
(b) 테트라사이클린 저항성, 클로르암페니콜 저항성 및 암피실린 저항성을 수여하는 유전자들을 포함한 pBR325서열 ; 및
(c)S. 세레비시애 HIS4 유전자 .
플라스미드 pT76H3은 제22a도에 도식적으로 예증되어 있으며, 하기 (a)-(e)로 구성된다 :
(a) 제15a도에 도시된 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체:
(b)amp R유전자를 포함하는 pBR322 서열:
(c)P.파스토리스HIS4 유전자 ;
(d)S.세레비시애2μ환 DNA ; 및
(e)S. 세레비시애로부터의 가로막힌 URA3 유전자.
플라스미드 pT76H1은 제22b도에 도식적으로 예증되어 있으며, 하기 (a)-(d)로 구성된다 :
(a)제15b도에 도시된 조절부위 -β-갈락토시다제 유전자 융합체:
(b)amp R유전자를 포함하는 pBR322 서열:
(c)피치아 파스토리스HIS4 유전자 ; 및
(d)피치아 파스토리스자발적 복제 서열(PARS1).
효모내에서의 β-갈락토시다제 발현
전술한 신규의 β-갈락토시다제 유전자-함유 구조들을 사용하여피치아 파스토리스GS115(NRRL Y-15851)를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환 효모 균주 몇개가 미합중국 농무성의 Northern Regional 연구센터에 기탁되었는데 그 수탁번호는 다음과 같다 :
Figure kpo00009
또한 신규의 β-갈락토시다제 유전자-함유 구조들을 사용하여 대장균을 형질전환시킨다. 형질전환된 세균균주도 Northern Regional 연구센터 (Peoria, Illinois)에 기탁하여, 본 출원인이 특허될시에 대중이 이용할 수 있도록 하였다. 형질전환된 균주에게 다음과 같은 수탁번호가 주어졌다:.
Figure kpo00010
본 발명의 알콜산화효소 및 p76 조절부위-lacZ 유전자 융합체를 함유하는 각각의 전술한 처음 8개 플라스미드로 형질전환된피치아 파스토리스GS115(NRRL Y-15851)를 , 탄소원인 포도당과 비오틴이 보충된 최소배지상에서 정지단계에까지 배양한다. 세포가 정지단계에 도달하면, 탄소원인 메탄올과 비오틴이 보충된 최소배지로 이들을 옮긴다. 30℃에서 약 3-5세대 동안 배양한 후, 비오틴이 보충된 새로운 최소배지로 이들을 옮기고 탄소원으로서 포도당이나 메탄올상에서 배양한다. 별개의 시점에서 배양균의 샘플을 회수하고, 실시예 7과 15에 상술된 방법으로 β-갈락토시다제 및 알콜 산화효소의 존재를 분석한다.
탄소원인 포도당 상에서 배양된 세포는 탐지될 만한 양의 β-갈락토시다제 또는 알콜 산화효소를 생산하지 않는 반면에, 유일한 탄소원인 메탄올 상에서 배양된 세포는 상당량의 알콜 산화효소와 β-갈락토시다제를 발현시킨다는 것이 발견되었다. 또한 포도당에서 배양된 세포에게 탄소원 기아조건을 가해줄 경우, 세포는 측정가능한 양의 알콜 산화효소 및 β-갈락토시다제를 발현시킨다는 것도 발견되었다. 따라서 본 발명의 조절부위는 메탄올의 존재뿐 아니라 탄소원 기아조건에 대한 반응성이 있음이 명백하다.
본 발명의 조절부위들이 비-분해대사질억제 탄소원 상에서의 배양뿐 아니라 탄소원 기아조건에 대해 반응성이 있다는 사실이 증명으로서, 알콜산화효소 조절부위를 함유하는 플라스미드 pTAO13과 p76 조절부위를 함유하는 플라스미드 pT76U1을 사용하여 비-메탄올 이용 효모균주인사카로마이세스 세레비시애를 형질전환시켰다. 사용된 형질전환 균주중의 하나인 SEY 2102-pTAO13(실험실용 번호)를 Northern Regional 연구센터(Peoria, Illinois)에 기탁하여 출원이 특허될 시에 대중에게 이용될 수 있도록 하였다. 형질전환된 균주에게 NRRL Y-15858 이라는 수탁번호가 주어졌다.사카로마이세스 세레비시애NRRLY -15858과 SEY 2102-pT76U1을 포도당, 과당, 에탄올, 글리세롤 및 갈락토즈상에서 약5세대동안 배양한 후 탄소원 기아조건을 가해준다. 5세대후 β-갈락토시다제에 대한 통상적인 분석(실시예 15참조)을 해보면 글리세롤과 갈락토즈에서 배양된 세포가 과량의 β-갈락토시다제를 생산하는 반면 포도당과 과당에서 배양된 세포는 본질적으로 β-갈락토시다제를 전혀 생산하지 않는다는 것을 알 수 있다. 탄소원 기아현상하에서 6시간후 β-갈락토시다제를 측정해보면, 글리세롤 및 갈락토즈에서 배양된 세포에 의해 생산된 상당량의 β-갈락토시다제 뿐 아니라 포도당 및 과당에서 배양된 혈질 전환미생물에 의한 보통량의 β-갈락토시다제 생산이 관찰된다. 따라서 본 발명의 조절부위는 유전적으로 매우 다양한 효모숙주 내에서의 단백질 생성물 생산을 조절할 수 있으며, 메탄올 이용 균주내에서의 이용에만 국한되는 것이 아니다.
[실시예]
하기 실시예들 중에서 사용된 완충액 및 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다 :
1M트리스 완충액:H2O 800mL 내의 121.g 트리스염기 ; 농축(35%) 수성 Hcl을 첨가함으로써 pH를 원하는 값으로 조절함 ; 최종 pH 조절전에 용액을 냉온 내지 실온으로 만듦, 최종 부피가 1L로 되도록 희석.
S-완충액 1.5M솔비톨
0.04M인산나트륨 완충액(pH 6.6)
PK 완충액 0.14MNaCl
1% 도데실황상 나트륨(SDS)
0.01MEDTA
0.05M(pH 8.4) Tris 완충액
ETS 완충액 10mMEDTA
0.2% SDS
0.01M(pH 7.4) Tris 완충액
TE 완충액 1.0mMEDTA
0.01M(pH 7.4) TrIS 완충액
SSC 0.15MNaCl
15mM구연산나트륨
NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조절
TAE 40mMCHTKS
5mMEDTA
0.02M(pH 8.3) Tris 완충액
PBS(인산 완충염수) 10mM인산 나트륨(pH 7.0)
0.15MNaCl
램리 로딩 완충액 62.5mMTris-HCI(pH 6.8)
2% SDS
10% 글리세롤
5% 2-메르캅토 에탄올
0.01% 브로모페놀 블루우
RIPA 완충액 1% NP40(시그마)
1% 데옥시콜산나트륨
0.1% SDS
PBS
20xSSPE 20mMEDTA
0.16MNaOH
0.2MNaH2PO4. H2O
3.6MNaCl
NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조절
덴하르트 용액(50x) 5g 피콜
5g 폴리비닐피롤리돈
5g 소의 혈청 알부민(BSA ; 펜탁스 분액 V )
물을 사용하여 총부피를 500mL로 함.
예비교잡 완충액 5x SSPE
5x 덴하르트 용액
50% 탈이온 포름 아미드
0.2 SDS
200μg/mL 베어낸 변성 청어 정액 DNA
LB (Luria-Bertani) 배지 5g 박토-트립톱
5g 박토-효모 추출액
2.5g NaCl
물 1L, NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조절.
YPD 배지 1%박토 - 효모 추출액
2% 박토-펩톤
2% 덱스트로즈
SD배지 아미노산이 없는 효모 질소염기
6.75g (DIFCO)
2% 덱스트로즈
물 1L
SED 1M솔비톨
25mMEDTA
50mMDTT
SCE 완충액 9.1g 솔비톨
1.47g 구연산나트륨
0.168g EDTA
50mL H2O
--HCl을 사용하여 pH 5.8로 조절
CaS 1M솔비톨
10mMCaCl2
--여과 살균
PEG 용액 20% 폴리에틸렌글리콜-3350
10mMCaCl2
10mMTris-HCI (pH 7.4)
--여과살균
SOS 1M솔비톨
0.3 x YPD 배지
10mMCaCl2
포름아미드 염료 혼합물 0.1% 크실렌 실레놀 FF
0.2% 브로모페놀 블로우
10mMEDTA
95% 탈이온 포름아미드
상단 겔 76.8 gm 요소
24mL 아크릴아미드 스톡
8mL 10x TBE
최종 부피를 160mL로함.
아크릴아미드 스톡 38gm 아크릴아미드
2gm 비스 (N,N,-메틸렌 비스아크릴 아미드)물을 첨
가하여 총부피를 100mL로함.
하단 겔 14.4gm 요소
3.0gm 수크로즈
7.5mL 10x TBE
4.5mL 아크릴아미드 스톡
0.3mL 브로모페놀 블루우 용액(0.01g/mL)
물을 첨가하여 총 부피를 30mL로함.
교잡 선택용 예비교잡 완충액 50% 포름아미드
0.75%MNaCl
0.1MTRIS, pH 7.4
0.008MEDTA
0.05% SDS
200μ/mL 토끼간 tRNAs(시그마 )
0.5M NETS 완충액 0.5MNaCl
10mMEDTA
10mMTRIS, pH 7.4
0.02% SDS
10x RT 완충액 500mMNaCl
340mMTRIS, pH 8.3
60mMMgCl2
50mMDTT(디티오트레이톨)
묽은 RT 4μL H2O
1μL 10x RT 완충액
5μL 역전사효소 , 15U/μL (Life Sciences,
Inc.)
디데옥시 :
dd ATP 0.49mM
dd CTP 0.1165 mM
dd GTP 0.369mM
dd TTP 0.82 mM
dNTP 0.82 mM
dNTP 혼합물 0.625mMdGTP
0.625mMdGTP
0.625mMTTP
추적물 1.125 mMdATP
1.125 mMdCTP
1.125 mMdGTP
1.125 mMTTP
1x RT 완충액
다른 언급이 없는 한 상기 용액들은 사용된 기본(1x)농도를 나타낸다. 실시예 전반에 걸쳐 다른 농도가 사용될 경우에는, 용액을 기본(1x) 농도의 배수로 표시해 준다.
다음과 같은 약어들이 실시예 전체에 걸쳐 사용되었다 :
EDTA 에닐렌디아민테트라초산
TEMED N,N,N',N'-테트라메틸렌디아민
DTT 디티오트레이톨
BSA 소의 혈청 알부민
EtBr 브롬화 에티디늄
Ci 퀴리
dATP 데옥시아데노신 트리인산
dGTP 데옥시구아노신 트리인산
TTP 티미딘 트리인산
dCTP 데옥시시티신 트리인산
dXTP “총칭적인” 데옥시트리인산 뉴클레오티드
올리고(dT)12-18 공급원 : Collaborative Research, Inc.
지몰라제 60,000 공급원 : Miles Laboratories
일상적인 기본에 따라 몇몇 과정이 수행된다. 원심분리는 투명한 상청액을 제공하기에 충분한 회전속도하에 충분한 시간동안 수행된다. 효모세포의 원심분리는 적어도 1500g하에 적어도 5분동안 수행된다.
페놀/클로로포름/이소아밀알콜을 이용한 핵산 추출은 핵산함유 용액을 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜의 50:48:2(부피비)혼합물의 동일 부피와 접촉시킴으로써 수행된다. 클로로포름/이소아밀알콜을 이용한 추출은, 처리될 용액을 클로로포름과 이소아밀알콜의 48:2(부피비)혼합물의 동일부피와 접촉시킴으로써 수행된다.
겔, 여과기등이 지정된 용액내에 침지 또는 세척되는 것으로 기재된 경우에는, 전체 겔, 여과기등을 적합한 용기(팬, 접시, 유리병등)에 침지시켜 겔, 여과기등의 전체표면이 용액과 접촉되도록 해준다. 핵산의 에탄올 침전은, 먼저 헥산-함유용액의 염함량을 조절한 후 용액을 두부피의 차가운 에탄올과 접촉시킴으로써 수행된다.
[실시예 1]
효모 세포의 제조 및 배양
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)NRRL Y-11430을 30℃에서 웨너에 의해 미국특허 제4,414,329호에 기재된 IM1염 최소배지(IM1최소배지는 배지 1ℓ당 KH2PO436mM, (NH4)2SO423mM, MgSO42mM, kCl 6.7mM, CaCl20.7mM, CuSO4.5H2O 0.2μM, KI 1.25μM, MnSo44.5μM, Na2MoO42μM, H3BO30.75μM, ZnSO417.5μM, FeCl244.5μM 및 바이오틴 1.6μM을 포함한다)에서 탄소원으로 메탄올 혹은 에탄올을 이용하는 연속 배양기하의 탄소제한 조건하에서 배양한다. 메탄올에서 배양하는 세포는 약 12시간 보지시켜 세포밀도가 140g/I(건조 무게)가 되도록 배양한다. 에탄올에서 배양하는 세포는 약 11.5시간 보지시켜 세포밀도가 90g/l 되도록 배양한다. 메탄올 혹은 에탄올을 발효조에 주입할때, 각각 20% 및 45%의 농도인 알코올을 포함하는 배양재를 사용한다.
발효물 10g을 원심분리하여 성장시킨 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)세포를 수집하고, 1% 2-메르캅토에탄올을 포함하는 0.1M Tris(pH 8.0)에 거의 108세포/ml로 재현탁시킨다. 세포를 37℃에서 5-10분간 배양하고 원심분리하여 수집한다. 수집물을 S-완충액 30ml로 한 번 세척하고 세포 g당 S-완충액 5ml에 재현탁시킨다. 지몰리아제(Miles Biochemicals)을 세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 500μg/ml가 되게 한다. 세포를 37℃에서 20분간 배양하고 원심분리한다 ; 상등액을 버리고 세포 알갱이를 수집한다. 이 알갱이를 질소용액에 결빙시키고 후에 사용할 수 있도록 -70℃에서 저장한다.
[실시예 2]
효모 RNA의 분리
세포의 총 RNA는 실시예 1의 기재에 따라 제조된 결빙 알갱이를 절구와 공이로 분쇄하고 결빙 알갱이를 질소용액 존재하에서 월링 블렌더에서 약 2-5분간 더욱 부수어서 제조한다. 분쇄된 알갱이를 세포 g당 7.5ml의 농도로 pk완충액에 첨가한다. 프로티나제 k(Boehringer Mannheim)을 재현탁 알갱이에 첨가하여 최종농도가 400μg/ml가 되게하고, 현탁액을 상온에서 10분간 항온시킨다. 이 혼합액을 페놀/클로로포름/이소아밀알코올로 추출하고 이어서 클로로포름/이소아밀알코올로 추출한다. 용액을 0.25M NaCl이 되게 조절하고 에탄올을 첨가하여 핵산을 침전시킨다. 알갱이를 ETS완충액의 최소량(핵산을 용해시키기에 충분한 완충액의 양 일반적으로 용액 ml당 DNA약 100μg에서 약 1mg)에 현탁시킨다. 이 용액을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 다음에 클로로포름/이소아밀 알코올로 재추출하고, 마지막에 에탄올로 침전시킨다.
핵산을 TE완충액의 최소량에 재용해시킨다. 이 용액에 존재하는 RNA는 4ml CsCl완충물(10mM Tris(pH 7.4)완충액에 1g CsCl/ml 및 1mM EDTA를 포함한다)을 통하여 원심분리시키거나 용액을 2M LiCl만들고, 4-8℃에서 밤새도록 유지시켜서 침전시킴으로 풍부하게 하고, 원심분리하여 수집한다. 폴리 A+RNA를 올리고 (dT)셀로로오스컬럼상에서 친화 크로마토그라피하여 용액으로부터 분리한다. 일반적으로 크로마토그라피를 하기 위한 총 RNA 5-10mg당 올리고 (dT)셀루로오스, 타이프 3(Collabora-tive Research)0.25gm을 준비한다. 올리고(dT)셀루로오스 0.25g을 ETS완충액 2ml에 슬러리화 하고 실리콘화된 작은 유리컬럼에 넣는다. 이 올리고(dT)셀루로오스 컬럼은 올리고(dT)셀루로오스위에 0.1M NaOH 10ml를 층으로 흘러내리게 하고 세척용액을 올리고(dT)셀루로오스 매트릭스로 통과하도록 하여 세척한다. 올리고(dT)셀루로오스를 같은 방법으로 ETS 완충액 10ml로 세척하고 마지막으로 0 .5M NETS완충액으로 세척한다.
총RNA (5-10mg)을 10mg/ml보다 크지 않는 농도로 ETS 완충액에 현탁시키고, 65℃물중탕에 2분간 놓고 그후, 얼음에 직접적으로 놓는다. RNA 용액을 상온까지 데우고 5M NaCl의 모액을 첨가하여 RNA용액 최종 염농노가 0.5M NaCl이 되게 한다. 결과 생선된 RNA 용액을 준비된 올리고(dT)셀루로오스 컬럼상에 층으로 흘러내리게하고 약 1방울/5초의 속도로 천천히 컬럼을 통과하도록 한다. 컬럼 바닥으로 부터 흘러나오는 물질을 관에 수집하고 컬럼상단으로 부터 다시 층으로 흘러내리도록 한다. 컬럼 바닥으로부터 수집한 물질을 두번째로 상단으로부터 다시 층으로 흘러내리도록 하여서 결과 RNA용액이 전부 3번 올리고(dT)셀루로오스 컬럼을 통과하도록 한다. 컬럼을 마지막으로 통과시킨후, 물질을 수집하고 폴리 A-예를들면 비-폴리 A RNA로 이름을 붙인다. 컬럼을 0.5M NETS 30ml로 세척하고 ETS완충액 5ml를 컬럼에 붓고, 이 완충액을 천천히 통과하도록 하여서 최종적으로 폴리 A+RNA를 용출시키고 컬럼의 바닥으로부터 5ml 분액에 있는 폴리 A+RNA 분율을 수집한다. 폴[ A+ RNA 분액에 NaCl이 없다고 가정하고, 이 분액의 NaCl 농도를 0.25M NaCl로 조절하고 에탄올로 RNA를 침전시킨다.
[실시예 3]
cDNA 라이브러리의 구성
상보적인 DNA(cDNA)클론은 다음과 같이 합성한다. 실시예 2의 기재에 따라 제조된 폴리 A+RNA 10μg을 H2O 7μl에 재현탁시키고 최종농도가 2.7mM CH3HgOH가 되게한후, 상온에서 5분간 항온처리한다. cDNA의 첫번째 가닥은 42℃에서 Tris 50mM(42℃에서 pH 8.3), MgCl210mM, 2-메르캅토에탄올 30mM, kcl 70mM, dATP,dGTP 및 TTP 각각 500μM, dCTP 200μM, 올리고(dT)25μg/ml, 악티노마이신 D 60μ/ml, RNasin(Biotec,Inc.)25단위, α-32PdCTP 25μCi(32.5pmoles) 및 역전사효소 120단위를 포함하는 용액 50μl하에서 15분에 합성된다. 이 반응혼합물을 37℃에서 15분간 더 항온 처리한다. 반응은 0.5M EDTA 2μ1 및 20% SDS 0.5μ1를 첨가함으로 종결시킨다. 반응혼합물은 0.3M NaOH이 되게 조절하고 65℃에서 30분간 항온처리한다. 반응 혼합물을 1M Tris(pH 7.4)10μ1를 첨가하여 중화시키고, 반응혼합물을 0.21M HC1이 되도록 조절한다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 최종적으로 세파덱스 G50 컬럼상 TE완충액하에서 크로마토그라피한다. 방사성 단일가닥 cDNA를 하나의 분액으로 수집하고 부탄올 추출이나 진공하에서 원심분리에 의한 증발로 100μ1로 농축시킨다. 단일가닥 cDNA용액를 농축용액으로 부터 에탄올로 침전시키고 cDNA를 원심분리하여 단일 수집하고 물 100μl에 재현탁시킨다.
단일가닥 cDNA수용액을 2.5M초산암모늄이 되게 조절하고, 에탄올로 침전시키고, 원심분리하여 수집하고, 물 20μl에 재현탁시킨다. 이 단일가닥 DNA용액을 50mM인산칼륨 완충제(pH 7.4)와 함께 MgCl25mM, 2-메르캅토에탄올 1mM, dATP, dGTP 및 TTP를 각각 250μM, dCTP 125μM, α-32P-dCTP 25μCi ( 32.5pmoles) 및 크레노 단편 DNA pol 1(New England Biolabs) 8단위를 포함하는 최종부피 50μ1인 용액이 되게한다. 결과 생성된 반응혼합물을 37℃에서 1시간동안 항온 처리하여 단일가닥 cDNA에 상보적인 두번째 DNA가닥을 합성한다. 이 반응은 0.5M EDTA 2μ1를 첨가하여 종결시킨다. 이중가닥 cDNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 세파덱스 G50컬럼상 TE완충액하에서 크로마토그라피한다. 이중가닥 cDNA분액을 수집하고 이 분액을 단일가닥 cDNA에 기재된 것과 같이 농축시키고 침전시킨다.
최종적으로 에탄올에 침전시키고 원심분리에 의해 이중가닥 cDNA를 수집한후에, 알갱이를 물 20,25μ1에 재현탁시키고 50mM Tris(42℃에서 pH 8.3)와 함께 MgCl210mM, 2-메르캅토에탄올 30mM, KCl 70mM, dXTP 500μM 및 역전사효소 150단위를 포함하는 최종부피 50μ1인 용액으로 만든다. 결과 생성된 용액을 42℃에서 15분간 항온처리하여 cDNA의 2번째 가닥의 합성의 완료를 확실히 한다. 반응을 0.5MEDTA 2μl를 첨가함으로 종결시키고 단일가닥 cDNA반응에 기재된 것과 같이 농축시키고 침전시킨다.
이중 가닥 cDNA알갱이를 H2O 42μl에 재현탁시키고, 이용액에 NaCl 2.8M, NaOAc 200mM 및 ZnSO445mM을 포함하는 모액 5μl를 첨가하여 최종부피가 47μl가 되게 한다. 머리핀 루프를 소화하기 위해서 3개의 분리된 반응을 S1뉴클리아제(시그마)의 3개의 다른 농도에서 행한다. S1뉴클리아제 1단위, 10단위 혹은 100단위를 첨가하여 반응부피가 50μl되게하고 반응을 22℃에서 30분간 항온처리한다. 반응을 0.5MEDTA 2μl 및 2M Tris 염기 2.67μl를 첨가하여 종결시킨다. 토끼간 tRNA 6μg을 담체로 첨가하고 DNA 알갱이를 물보다 TE완충액에 재현탁시키는 것을 제외하고는 상기한 것과같이 반응혼합물을 농축시키고 침전시킨다. 최종적으로 침전시킨후에 알갱이를 TE완충액 20μl에 재현탁시키고, α-32P-dCTP 10pmoles, dCTP 2μM 및 말단 번역효소(Ratliff Biochem)21단위를 포함하는 말단 번역효소완충액(BRL)으로 최종부피가 50μl가 되게 한다. 결과 생성된 용액을 37℃에서 약 30분간 항온처리하여 이중가닥 cDNA의 3'-OH 말단에 폴리 d(c)꼬리를 붙인다. 반응을 0.5M EDTA 5μl를 첨가하여 종결시키고 추출하고 크로마토그라피하고 에탄올 침전물로 저장한다.
이중가닥인, d(c)꼬리가 달린 cDNA를 Pst 1위치가 열린폴리d(G)꼬리가 달린 pBR 322에 직접적으로 재아닐링하거나 먼저 세파로스 CL4B-200컬럼(25μl분액)상에서 크기를 분별한다. 분별되지 않은 라이브러리에 대해서는 이중가닥의 폴리d(c)꼬리가 달린 cDNA 150ng을 NaCl 0.1M 및 EDTA 1mM을 포함하는 10mM Tris(pH 7.4)180μl에서 Pst 1위치에서 열린 d(G)꼬리가 달린 pBR 322 900ng에 아닐링시킨다. 분별된 라이브러리 각 25μl 분액을 상기한 것과 같은 아닐링 혼합물의 최종부피 50μl 상에서 폴리 d(G)꼬리가 달린 pBR 322 125ng에 아닐링 시킨다. 아닐링 반응물을 65℃에서 3분간 항온처리한 후 42℃에서 2시간 항온처리하고 천천히 상온까지 식힌다.
아닐링된 cDNA리이브러리를 다음에 따라 준비된 컴패턴트 대장균(CompetentE.coli) LE 392(ATCC 33572)으로 전이시킨다. LE 392 접종원을 2×LB배지에서 37℃에서 밤새 배양한다. 이 밤새 배양시킨 배양물 5ml를 새 2×LB 배지 200ml에 주입하고, 37℃에서 OD600이 0.2-0.3이 되도록 배양된다. 이 배양물을 얼음에 10분간놓고 세포를 4℃에서 원심분리시켜서 수집한다. 세포알갱이를 얼음의 찬 0.1M CaCl280ml에 재현탁시키고 4℃에서 25분간 항온처리한다. 세포를 4℃에서 원심분리하여 수집하고, 세포 알갱이를 얼음의 찬 0.1M CaCl22ml에 재현탁시키고 사용에 앞서 4℃에서 적어도 2시간동안 항온처리한다. 형질전환을 위해서 아닐링 혼합물 50μl당 컴페턴트 세포 200μl를 사용한다. 컴페턴트 세포와 DNA를 결합시키고 약 4℃에서 10분간 항온 처리하고 이어서 37℃에서 5분간 배양하고, 최종적으로 얼음에 10분간 놓는다. 2×LB배지동량을 혈질전환 혼합물에 첨가하고 37℃에서 45분간 배양한다. 형질전환된 세포를 15μg/ml의 테트라사이클린을 포함하는 150mm 2×LB평판상에 250μl/평판으로 평판도말한다. 평판을 37℃에서 24시간 동안 배양하고 4℃에서 저장한다.
복사여과기는 평판으로부터 집락을 끌어들이는데 사용되는 원 여과기에 니트로셀루로오스 여과기를 도장찍어 제조한다. 이 복사 여과기를 2×LB-Tet(15μg/ml의 테트라시이클린)평판상에서 배양한다. 여과기상의 집락을 여과기를 클로람페니콜 200μg/ml을 포함하는 2×LB-Tet 평판에 옮겨서 시험하고, 여과기를 37℃에서 적어도 12시간동안 배양한후, 여과기를 NaCl 1.5M 및 NaOH 0.5M을 포함하는 수용액에 10분간 띄워서 집락을 용해시킨다. 여과기를 NaCl 1.5M 및 Tris(pH 7.4)0.5M을 포함하는 수용액에 띄워서 중화시키고, 이 중화를 다시 반복한다. 여과기를 공기에 건조시키고 최종적으로 진공하 70℃에서 2시간동안 건조시킨다.
[실시예 4]
집락 교잡
cDNA 라이브러리를 포함하는 진공건조된 니트로셀루로오스 여과기를(앞의 실시예의 기재에 따라 제조됨)예비교잡 완충액에서 42℃에서 5시간 예비교잡시킨다. 여과기를 예비교잡 완충액에서 꺼내서, 손에 장갑을 끼고 5×SSPE로 가볍게 문질러서 세포 파편들을 제거시킨다. 여과기를 교잡 완충액(1×Denhardt's을 제외한 예비교잡 완충액과 같다)에 넣는다. 32p-표지된 단일가닥 cDNA(106cpm/ml)나 말단 표지된 폴리 A+RNA을 42℃에서 17시간동안 여과기에 교잡시킨다. 교잡후에 여과기를 22℃에서 2×SSPE에 간단히 씻고 65℃에서 0.1×SSPE에 각각 10분간 2번 씻는다. 말단이 표지된 폴리 A+mRNA 2μg을 50M Tris(pH 9.5)을 포함하는 50μl부피액에 첨가하고 3분간 100℃까지 가열하고, 얼음상에서 급속히 냉각시키는 처리를 한다. 이 RNA용액을 최종부피가 200μl가 되게 희석하고 Tris 50mM(pH 9.5), MgCl210mM, DDT 5mM, 32p-α-ATP 50pmole로 되게 조절한다. T4폴리 뉴클레오티드 키나제(Boechringer Mannheim)10단위를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 키나제 반응은 0.5M EDTA 10μl를 첨가하여 종결시키고 페놀/클로로포롬/이소아밀 알코올로 추출하고 세파덱스 G50으로 크로마토그라피하여 방사성 표지가 붙어있지 않은 것을 제거한다.
[실시예 5]
노던 교잡
폴리 A+mRNA 2-5μg을 포름아미드 50%포름 알데히드 2.2M 및 EDTA 0.5mM을 포함하는 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 10mM에서 65℃에서 5분간 가열한다. 결과 생성된 용액을 상온까지 냉각시키고 5×시료완충액(0.5% SDS, 0.025%브로모페놀 블루우, 25%글리세롤, 25mM EDTA)의 적당량(일반적으로 처리되는 시료부피를 기준으로 약 0.2부피)을 첨가한다. 시료를 포름알데히드 1.1M을 포함하는 인산나트륨 완충액(pH 7.4)10mM에 준비된 1.5%한천 겔상에 놓고 동일 완충액하에서 전기영동시킨다. 겔을 10mM인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 아크리딘 오렌지(33μg/ml)로 염색하고, 겔을 같은 완충액에 10분간 담가서 탈염색시키고, 10×SSPE에 적어도 10분간 담그고 실시예 6의 기재에 따라 RNA를 니트로셀룰로오스를 옮긴다.
[실시예 6]
게놈 DNA 및 클론의 분리
피치아 게놈 DNA는 피치아 RNA분리를 위해 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 분리한다. 핵산 알갱이를 최소부피의 TE완충액에 재현탁시키고 37℃에서 30분간 20μg/ml RNase A와 함께 항온처리한다. 용액에 0.14M NaCl을 첨가하고 프로티나제 K 200μg/ml로 22℃에서 15분간 처리한다. 결과 생성된 용액을 처음에 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 다음에 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 최종적으로 에탄올로 침전시킨다. 침전한 DNA를 최소부피의 TE완충액에 재침전시키고 원심분리하여 DNA용액을 청정한다.
앞 단락의 기재에 따라 제조된 피치아 게놈 DNA 10μg을 여러가지 제한효소(BRL)로 소화하고 TAE를 포함하는 1%한천 겔상에서 전기영동시킨다. 겔에 있는 DNA단편을 1.5M NaCl, 0.5M NaOH에 20분간 담가서 변성시킨다. 겔을 1.5M NaCl, 0.5M Tris(pH 7.4)에 20분간 담가서 중화시킨다. 옮기기전에 겔을 10×SSPE에 적어도 5분간 담근다. 니트로셀루로오스판을 겔의 크기로 자르고 물에 적시고 10×SSPE에 간단히 담근다. 이 여과기를 겔의 상단에 놓고 겔을 다시 파라필름의 조각위에 놓는다. 왓트만 여과지 1장과 종이탑 1개를 니트로셀루로오스 상단에 놓아서 겔로부터 DNA를 끌어내어 니트로셀루로오스로 옮긴다. 이러한 방법으로 적어도 3시간동안 DNA를 옮긴다. 이러한 방법으로 적어도 3시간동안 DNA를 옮긴다. 옮긴후에 여과기를 5×SSPE에 간단히 담그고, 공기로 건조시키고, 진공하 70℃에서 2시간 건조시킨다. 상보적인 게놈 단편을 실시예 4에 기재된 것과 같은 예비교잡, 교잡 및 완충액 세척을 사용하여 홈을 가지고 번역된 cDNA클론 pPC 8.0, pPC 6.4 및 pPC 15.0에 교잡하여 확인한다.
cDNA클론 200ng을 Tris-HCl 50mM(pH 7.4), MgSO410mM, DTT 100μM, BSA 50μg/ml dGTP, TTP 및 dATP 각각 30μm 32P-α-dCTP 31.25pmoles(3200Cilmmol, NEN), 대장균 DNA Poll(BRL)2단위 및 DNase I 0.02ng을 포함하는 용액 30μl에서 14℃에서 90분간 홈을 가지고, 번역되게 한다. 반응을 0.5M EDTA 1μl 및 20% SDS 1μl을 첨가하여 종결시킨다.
표지된 DNA용액을 최종농도가 0.3M NaOH가 되게 하고 끊는 물에 3분간 놓는다. 이혼합물을 세파덱스 G50컬럼에 크로마토그라피한다. 표지된 DNA 단편을 수집하고 특이활성을 결정하고 교잡시험을 한다.
cDNA탐침에 교잡되는 게놈단편은 피치아 게놈 DNA 200μg을 여러가지 제한효소(BRL)로 소화하고 소화물을 TAE완충액에서 1% 한천겔상에서 전기영동시켜서 분리한다. 적당한 크기의 띠를 한천겔로부터 얇게 썰어내고 DNA를 엘루팁 컬럼 (Schleicher 및 Schuell)을 통과하여 전기용출시키고, 에탄올로 침전시킨다.
전기용출된 단편을 물에 재현탁시키고 단편 200ng을 적당한 제한 위치에서 자르고 필요한 경우에는 탈인 산화된 PBR322 500ng에 연결시킨다. 연결반응은 MgCl26.6mM DTT 10mM,, ATP 0.4mM, BSA 25μg/ml 및 T4DNA리가제 40-80단위를 포함하는 66mM Tris(pH 7.4) 300μl에서 수행하고, 4℃에서 24시간동안 항온처리한다. 연결 혼합물을 직접적으로 컬페턴트 LE 392대장균(E coli) 세포에 도입시킨다. 세포는 컬페턴트로 되고 형질전환은 실시예 3의 기재에 따라 행한다. 3개의 형질전환은 PBR322 10, 40 및 100ng으로 행하고 각 형질전환은 컬페턴트 세포 100μl에서 행한다. 항원적 선택은 암피실린 50μg/ml에서 하는 것을 제외하고는 세포를 실시예 3의 기재와 같이 평판도 말한다.
클론을 니트로셀루로오스로 옮기고, 복제하고 실시예 3에 기재된 것과 같이 교잡을 위해 제조한다. 적당한 크기의 홈을 갖고 있는 번역된 cDNA 단편을 여과한다. 교잡반응에서 양성인 평판도말법에 의해 정제된 집락을 다음과 같이 부가적으로 플라스미드를 제조하는데 사용한다.
LE 392 대장균(E coli)를 생성하는 플라스미드를 암피실린 50μg/ml를 포함하는 1×LB 배지에서 OD600이 1.0이 되기까지 배양하고 클로람페니콜을 최종농도가 200μg/ml가 되도록 첨가하여 밤새 증식시킨다. 세포를 0.8% NaCl, 20mM Tris(pH 8.0) 20mM EDTA에 씻고 25% 수크로오스, 50mM Tris(7.4) 및 20mM EDTA에서 450μg/ml 라이소좀으로 처리한다. 5M NaCl을 첨가하여 최종농도가 2.0M이 되게하여 용균시키고 EDTA 40mM 및 동량의 0.2% 트리콘 X-100을 첨가한다. 20000PRM으로 45분간 회전시켜 제조물을 청정한다. 상등액을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 알갱이를 TE 완충액에 재현탁시키고, RNase A로 처리하고, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출한다.
고형의 CsCl을 최종농도가 800μg/ml가 되게 첨가하고 EtBr을 최종농도가 1mg/ml가 되게 첨가한다. 결과 생성된 용액을 회전자(Vti 50rotor)에서 49,000PRM으로 20℃에서 18-20시간동안 회전시킨다.
플라스미드 띠는 UV 형광성으로 인해서 식별되며, 바늘과 주사기를 사용하여 관으로부터 끌어낸다. 플라스미드 용액을 n-부탄올로 4번 추출하고 에탄올로 -20℃에서 침전시킨다. 에탄올 침전을 적어도 2번 반복하여 모든 CsCl을 제거한다. 플라스미드를 에탄올 침전물로서 -20℃에서 저장한다.
[실시예 7]
알코올 산화효소의 정제
실시예 1의 기재에 따라 메탄올에서 배양한 피치아 파스토리스 세포로부터의 단백질 시료를 다음과 같이 효모세표를 용균시키고, 회전시켜 세포 파편을 제거하여 청정하게 하여 제조한다.
발효 유출물의 일부분을 취하여, 수산화암모늄으로 pH 7.5으로 조절하고, 0.6ι 용기를 사용하여 벨트조합 #3 및 20-300ml/hr의 유동속도를 이용하여 계속적 공정하 30℃에서 디노-밀 모델 KDL상에서 균질화 한다. 분쇄기내의 구슬은 직경이 0.3-0.5mm인 분리된 유리구슬이다. 결과 생성된 균질물은 5℃에서 20,000xg로 30분간 원심분리시켜서 무세포 상등액을 생산한다.
130ml 분액의 무세포 상등액 6개를 셀룰로오스 아세테이트 투석백에 넣고 5℃에서 증류수 약 8l에 대하여 투석시킨다. 4일후에 각 백의 수성의 층을 살며시 따라낸다. 백에 남아있는 고형분은 2가지 형태로 구성 되어 있다. 얇은 백색의 상층을 조심스럽게 제거하여 버린다. 바닥의 고형분은 황갈색이고 결정성 알코올 산화효소이다. 결정성 알코올 산화효소의 일부분은 증류수(고형분 부피의 약 10배)에 용해시키고 염료-과산화효소법으로 시험측정 하면 94EU/ml의 활성을 나타낸다.
알코올 산화효소의 비활성(specific activity)은 10.4EU/단백질 mg이다. 상기한 투석으로부터 형성된 결정성 침전물을 0.05M 인산칼륨 완충액(pH 7.5)에 대하여 투석하고, 같은 완충액으로 평형된 2x200cm 세파크릴 200(Pharmacia)컬럼에 작용시킨다. 3.5ml 분액을 10ml/hr의 유동속도로 수집하고 알코올 산화효소 활성을 측정한다.
메탄올과의 반응에서 알코올 산화효소의 활성은 다음의 측정공정(염료-과산화효소법)으로 결정한다. 염료-완충제 혼합물을 0-디아니시딘 용액(물에 o-디아니시딘 1중량%가 녹아있음) 0.1ml를 공기를 쏘인 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 12ml와 혼합하여 제조한다. 측정 혼합물을 염료-완충제 혼합물 2.5ml, 메탄올 50μl, 과산화효소 용액(말-무우 과산화효소-시그마 II형 1mg) 10μl 및 알코올 산화효소 용액 25μl로 제조된다. 측정 혼합물은 4x1x1cm 큐벳에서 25℃로 유지시키고 460nm에서 염료의 흡수 증가분을 2-4분에 기록한다. 효소활성은 다음의 식으로 계산된다.
활성도(u mole/분/ml 혹은 효소 units/ml)=
Figure kpo00011
×11.5 상기식에서, 11.5는 과산화수소의 알려진 분취액으로 형성된 표준곡선을 기초로한 인자이고 △A는 실험간격중에 흡수율의 변화분이다.
각 분액으로부터 총 단백질 0.1μg의 총량은 SDS-폴리아크릴아미드(12%)로 겔 전기영동하여 알코올 산화효소 함량을 측정할 수 있다.
[실시예 8]
DNA와 단백질 서열화
DNA서열결정은 박테리오파지 M13(Sanger 등, 1980)을 사용하여 디데옥시 사슬연장법이나 화학적 변경법(Maxam 및 Gilbert 1980으로 수행한다. 알코올 산화효소 유전자의 5'말단의 관련 DNA 단편을 M13mp8 및 M13mp9 벡터 내로 삽입되거나 이 지역에 유용한 위치에 제한효소를 사용하여 화학적 변경법에 의해 말단을 표지한다.
710bp HindIII/pPG4.0으로부터의 Sal I 단편은 먼저 HindIII으로 플라스미드 33μg을 소화하여 막삼-길버트 서열화에 의해 말단을 표지한다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. DNA를 원심분리하여 수집하고 물 31μl에 재현탁시킨다. 32p-α-dCTP 100μ Ci(3200Ci/mmol 및 크레노우 단편 DNA polI 2단위를 반응혼합물에 첨가하고 dATP 400μM, dGTP 400μM, Tris 50mM(pH 7.4) MgSO410mM 및 DTT 1mM을 포함하는 최종부피가 50μl인 것이 되게 한다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간동안 항온처리하고 0.5M EDTA 2μl을 첨가하여 종결시킨다.
혼합물을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 세파텍스 G-50컬럼에서 크로마토그라피하고 표지된 핵산 단편을 모으고, 에탄올로 침전시킨다.
원심분리후 DNA알갱이를 물에 재현탁시키고 Sal1으로 소화한다. 소화물을 TAE완충액에서 1% 한천겔상에서 전기영동하고 710bp 띠를 겔로부터 잘라내고 DNA를 전기용출시키고 부탄올로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 단편을 TE완충액 100μl에 재현탁시키고, 2.5M 초산암모늄이 되게 조절하고 에탄올로 침전시킨다. 결과 생성된 DNA 단편을 TE완충액에 50,000cpm/μl로 재현탁시킨다.
4개의 염기 변경반응은 다음과 같이 수행한다. (a) G(구아닌) 반응은 22℃에서 8분간 항온처리 하고 표지된 DNA단편 1μl(50,000CPM), 물 4μl, 50mM 카코딜산 나트륨염(pH 8.0) 200μl, EDTM(DMS% 완충제) 1mM 및 황산디메틸 1μl을 첨가한다. 반응을 초산나트륨(pH 7.0) 1.5M, 2-메르캅토에탄올 1M 및 tRNA 100μg/ml를 포함하는 DMS 정지 완충액 50μl를 첨가하여 종결시키고 에탄올(750μl)을 첨가하고 반응 혼합물을 -70℃에서 적어도 15분간 유지시킨다. (b) G/A(구아닌/아데닌)반응은 22℃에서 10분간 항온 처리하고 표지된 DNA 단편 2μl(100,000cpm), 물 8μl 및 포름산 30μl를 첨가한다. 반응을 Hz정지 완충액(0.3M 초산나트륨(pH 5.5), 0.1M EDTA 및 25μg/ml tRNA) 200μl를 첨가하여 종결시키고 에탄올(750μl)을 첨가하고 반응혼합물을 -70℃에서 적어도 15분간 유지시킨다. (c) T/C(티민/시토신)반응은 22℃에서 10분 항온처리하고 표지된 DNA 단편 2μl(1000,000cpm), 물 18μl 및 히드라진 30μl를 첨가한다. 반응을 (b)에 상기한 것과 같이 종결시킨다.
(d) C(시토신)반응은 22℃에서 10분간 항온처리하고 표지된 DNA 단편 1μl(50,000cpm) 물 4μl, 5M NaCl 15μl 및 히드라진 30μl를 첨가한다. 반응을(b)에 상기한 바와 같이 종결시킨다.
DNA알갱이를 원심분리하여 수집하고, 0.3M 초산나트륨(pH 5.5) 250μl에 dp 재현탁시키고 95% 에탄올 750μl로 침전시킨다. 알갱이를 원심분리하여 수집하고 진공하에서 약 5분간 건조시키고, 알갱이를 피페리딘 1-10(v/v)희석액 100μl에 재현탁시켜서 DNA를 분열시킨다. 분열반응을 90℃에서 30분간 항온처리하고 98% 에탄올 500μl 초산나트륨(pH 5.5) 60mM 및 tRNA 10μg/ml를 첨가하여 종결시킨다. 반응혼합물을 드라이아이스/에탄올 중탕(약 -70℃)에 약 5분간 놓고 DNA 단편을 원심분리하여 수집한다. 단편을 0.3M 초산나트륨(pH 5.5) 50μl에 재현탁시키고 95% 에탄올 100μl로 에탄올 침전시킨다. 이 에탄올 침전을 반복하고 알갱이를 95% 에탄올로 씻고, 진공하에서 원심분리하여 증발시킨다. 알갱이를 80% 포름아미드 10μl, NaOH 10mM, EDTA 1mM, 시아놀 크실렌 0.1%, 및 블루우 브로모페놀 블루우 0.1%에 재현탁시킨다. 2-3μl를 TBE 완충액에서 0.4mm 두께의 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다.
알코올 산화효소의 아미노산 서열을 피치아 파스토리스부터 얻은 정제된 알코올 산화효소 2mg을 사용하여 시궤맵(Sequemat : Watertown. Mass)로 결정한다. 숙성한 단백질의 처음 18 아미노산은 다음가 같이 결정되었다. : Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
[실시예 9]
알코올 산화효소 전사 개시부위의 결정
알코올 산화효소 nRNA의 시작점을 결정하기 위해서, 프라이머로서 알코올 산화효소 유전자의 5'말단의 DNA 서열로부터 복사된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하고 주형으로 폴리 A+ 피치아 파스토리스 mRNA 10μg을 사용하여 프라이머 확장 실험을 한다. 피치아 파스토리스 폴리 A+mRNA 10μg을 NaCl 43mM, Tris(pH 8.3) 29.2mM, MgCl25.2mM 및 DTT 4.3mM을 포함하는 9.3μl 부피액에서 프라이머(5'-CTT CTC AAG TTG TCG-3') 3ng과 결합시킨다. 헥산을 70℃에서 5분간 처리하여 변성시키고 서서히 22℃까지 냉각시켜 재생시킨다. 재생혼합물을 dNTP혼합물 4μl, RT 완충액 0.8μl 및 32p-α-dCTP 1μl(800Ci/mmol)을 포함하는 튜우브에 첨가한다. 이 혼합액 3μl를 각각 ddWTP 1μl에 첨가한다. 혼합액의 마지막 3μl는 물 1μl에 첨가한다. 반응을 dilRT 1μl를 첨가함으로 시작하고 42℃에서 15분간 항온처리한다. 반응을 포름아미드 염료혼합물 7.5μl를 첨가함으로 정지시키고 4-5μl를 1×TBE에서 0.4mm 두께의 구배 겔(gradient gel)상에서 전기 영동시킨다. 전기영동 후에 10% 초산에서 10% 메탄올로 20분간 고정시킨다. 겔을 진공하에서 건조시키고 XAR X-ray 필름에 노출시킨다.
구배 겔은 다음과 같이 제조한다 : 10% 과황산 암모늄염 300μl 및 TEMED 14μl를 상단 겔 30ml에 첨가한다 : 10% 과황산 암모늄염 75μl 및 TEMED 3.5μl를 하단 겔 7ml에 첨가하고 상단 겔 6ml를 피펫에 끌어들이고 하단 겔 6ml를 동일 피펫에 끌어들인 이 겔을 겔평판 사이에 붓고 이어서 상단 겔 22ml를 붓는다.
[실시예 10]
m-RNA교잡-선택 및 시험관내의 번역
양성 교잡-번역 시험은 여러가지 제한 엔도뉴클리아제에 의해 소화시킨 클론화된 피치아 게놈 DNA(실시예 6의 기재에 따라 제조된) 20μg을 일렬로 배열하여 수행한다. 이 DNA는 0.3M NaOH 용액으로 변성시키고, 65℃에서 10분간 항온처리한다. 변성된 DNA를 포함하는 용액을 얼음상에서 급속히 냉각시키고 0.M Tris.HCl(pH 7.4)로 조절하여 중화시킨다. 20x SSPE동량을 DEA가 니트로셀룰로오스 여과기에 접착하기전에 직접 변성 DNA에 첨가한다. DNA를 니트로셀룰로오스 여과기(Schleicher 및 Schuell BA83, 9mm dia)에 적용하기 전에, 여과기를 H2O로 적시고, 10분간 끊이고, 10x SSPE에서 3번 씻어서 준비한다. DNA를 여과기에 적용시키고 공기전조시키고 최종적으로 여과기를 진공하 70℃에서 2시간 건조시켜 DNA 10μg을 각 여과기에 결합시킨다.
예비교잡에 앞서, DNA가 결합된 여과기를 살균수 1ml에 놓고 100℃에 1분간 가열하고 얼음으로 냉각하고 살균수 1ml에 휘저어 씻고 예비교잡 완충액 1ml에 씻는다. 여과기를 예비교잡 완충액 1ml로 예비교잡하고 폴리 A+mRNA 40μg(2μg/ml ETS)을 직접 예비교잡 완충액에 첨가한다. 교잡 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하고, 42℃에서 24시간 항온처리한다.
교잡에 이어서, 여과기를 22℃에서 0.5% SDS를 포함하는 1xSSPE에 간단히 2번씻고, 50℃에서 0.5% SDS를 포함하는 1xSSPE에 각각 5분씩 7번 씻고, 50℃에서 0.1xSSPE에 각 5분씩 3번 씻고, 65℃에서 0.1xSSPE에 10분간 1번 씻는다. RNA를 토끼간 tRNA 15μg을 포함하는 H2O 300μl에서 1분간 끊여서 여과기로부터 용출시킨다. 용출된 RNA를 드라이아이스 에탄올 중탕에서 급속히 빙결시킨다.
RNA혼합물을 상온까지 데우고 여과기를 제거한다.
RNA혼합물을 배지를 2.5M 초산암모늄으로 조절하고 에탄올로 2번 침전시키고 최종적으로 냉각시키기전에 H2O 100μl에 재현탁시킨다.
번역은 본 기술분야에 능숙한 사람들에게 잘 알려진 표준기술 예를들면, 뉴잉글랜드 뉴클리어에 의해 시험관내 토끼 망상 적혈구 용균 번역물 실험으로 제공된 기술에 따라 수행한다.
단백질 생성물은 4.5% 적층 겔을 포함하는 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동한다.
[실시예 11]
항혈청 제조 및 면역침전물
p72(알코올 산화효소) 및 p76 폴리펩티드를 함유하는 피치아파스토리스 세포로부터의 추출물에 대하여 토끼에 생긴 항혈청은 표준 공정표를 사용하여 제조한다. 추출물을 주사하기 전에 PBS에 투석한다. 8주에 걸쳐서 각각의 토끼에 포로인드 완전 보조액 0.2ml와 함께 0.1ml 부피액에 총잔백질 1mg으로 구성된 것을 3번 주사한다. 토끼의 6-10 부위에 피내적으로 주사한다.
8주 끝에 토끼에서 피를 뽑고 혈장을 오흐터로니 이중 확산 공정으로 정제된 피치아 파스토리스 알코올 산화효소에 대하여 시험하였다.
정제된 토끼 항-p72(알코올 산화효소) 및 항-p76단백질 항체는 CNBr과 짝지어진 p72(알콜올 산화효소)-p76세파로스 4B 컬럼(팔마시아)을 통하여 전 항혈청을 친화 크로마토그라피하여 제조한다. CNBr 1g으로 활성화된 겔을 겔은 1mM HCl 20ml에서 15분간 수화하고, 결합 완충액(0.1M 탄산나트륨(pH 8) 및 0.5M NaCl)에서 3x50ml로 씻는다. 결합 완충액에 6mg/ml로 용해된 p72-p76용액 5ml를 겔에 첨가하고 4℃에서 밤새도록 가볍게 진탕한다. 결합되지 않은 단백질은 결합 완충액과 함께 3x50ml로 세척하여 제거한다. 잔존 활성기는 1M 에탄올아민(pH8)에 2시간 항온처리하여 제거한다.
비-공유적으로 결합된 물질은 PBS에서 티오시안산 나트륨 50ml로 세척하여 겔로부터 제거한다. 항혈청의 크로마토그라피에 앞서서 겔을 최종적으로 PBS 3x50ml로 씻는다. 정제된 항 p72-p76 항혈청 5ml를 겔과 혼합하고 4℃에서 2시간 동안 살며시 진탕하면서 항온처리한다. 항혈청-겔 혼합물을 1x8cm 컬럼에 피펫으로 넣고, PBS 150ml로 씻는다. 정제된 항체를 PBS에 용해된 2M 티오시안산 나트륨염 6ml로 컬럼으로부터 용출시킨다. 겔로부터 용출시킨 후 정제한 항체를 0.02% 아지드나트륨을 포함하는 PBS에 대해 투석시킨다.
친화-정제된 항혈청을 PBS, 1% NP40에 용해된 시험관내 번역 혼합물에 첨가하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 항체-항원 복합체는 얼음상에서 2.5시간 동안 판소르빈(Calbiochem)으로 침전시킨다. 판소르빈은 RIPA 완충액에서 세척하여 제조하고 판소르빈 침전물은 RIPA완충액에서 4번 세척하고 전기영동하기전에 램리 로딩(Laemmli Loading) 완충제에 용해시킨다.
[실시예 12]
피치아 파스토리스(Pichia Pastoris)형질전환 공정
A. 세포배양
1. 피치아 파스토리스 GS115(NRRL-Y-15851)의 집락을 YPD배지 약 10ml에 주입하고 30℃에서 12-20시간 동안 배양기를 흔들어 준다.
2. 약 12-20시간 후에 OD600이 약 0.01-0.1이 되도록 세포를 희석시키고 YPD배지에서 30℃에서 약 6-8시간동안 세포를 대수생장기로 유지시킨다.
3. 약 6-8시간 후에, YPD배지 100ml에 OD600이 약 0.1(혹은 동량)에서 배양종균 0.5ml를 주입한다. 30℃에서 약 12-20시간동안 흔들어 준다.
4. OD600이 약 0.2-0.3인(약 16-20시간후에) 배양균을 1500g에서 5분간 원심분리하여 얻는다.
B. 스페로 플라스트의 제조
1. 세포를 살균수에 1번 씻는다(1-5단계의 모든 원심분리는 1500g에 5분간 행한다.)
2. 세포를 새로 준비된 SED 10ml에 1번 씻는다.
3. 세포를 살균한 1M 솔비톨 10ml에 2번 씻는다.
4. 세포를 SCE 완충액 10ml에 재현탁시킨다.
5. 4mg/ml 지몰리아제 60,000(Miles Laboratories) 5-10μl를 첨가한다. 세포를 30℃에서 약 30-60분간 항온처리한다.
스페로플라스트의 제조는 형질전환공정에서 중요한 단계이기 때문에 다음과 같이 스페로플라스트 형성을 감시해야 한다. 세포의 100μl 분취액을 5% SDS 900μl 및 1M 솔비톨 900μl에 지몰리아제 첨가 전 혹은 직후에 배양기간중 여러번 첨가한다. 세포가 SDS에서는 분해되고 솔비톨에서는 분해되지 않을 때(보통 배양 30-60분 사이) 배양을 멈춘다.
6. 1000g에서 5-10분간 원심분리하여 살균한 1M 솔비톨 10ml에 스페로플라스트를 2번 씻는다(원심분리의 시간 및 속도는 다를 수 있다) ; 스페로플라스트를 알갱이로 만들기에 충분할 정도로 원심분리하여야 하나 원심분리력으로 그것들이 깨지지 않도록 한다).
7. 세포를 살균한 CaS 10ml에 1번 씻는다.
8. 세포를 CaS 총 0.6ml에 재현탁시킨다.
C. 형질전환
1. DNA 시료(20μl까지)를 12×75mm 살균한 폴리프로필렌 관에 첨가한다(DNA는 물 혹은 TE 완충액에 용해되어 있어야 한다. DNA소량으로 형질전환 빈도를 최대로 하기 위해서는 5mg/ml의 고주파 처리된 대장균(E coli) DNA 1μl을 각 시료에 첨가하는 것이 바람직하다).
2. 스페로플라스트 100μl를 각 DNA 시료에 첨가하고 상온에서 약 20분간 항온처리한다.
3. PEG용액 1ml를 각 시료에 첨가하고, 상온에서 약 15분간 항온처리한다.
4. 시료를 1000g에서 5-10분간 원심분리하고 PEG용액을 따른다.
5. 시료를 SOS 150μl에 재현탁시키고 상온에서 30분간 항온처리한다.
6. 살균한 1M 솔비톨 850μl를 첨가하고 하기한 것과 같이 시료의 분취액을 평판도말한다.
D. 스페로플라스트의 재생
1. 재생 한천 배지의 처방전.
2a. 한천-솔비톨-9g 박토-한천, 솔비톨 54.6g, H2O 240ml, 가압솥.
b. 10x 클루코오스-20g 덱스트로오스, H2O 100ml, 가압솥.
c. 10x SC-6.75g 아미노산을 제외한 효모 질소 기초제, H2O 100ml, 가압솥(바람직한 아미노산이나 핵산을 200μg/ml의 농도까지 가압전에나 후에 첨가한다).
d. 10x 클루코오스 30ml 및 10x SC 30ml를 용해된 한천-솔비톨 용액 240ml에 첨가한다. 0.2ml/ml 바이오틴 0.6ml 및 바람직한 아미노산 혹은 핵산을 20μg/ml의 농도로 첨가한다. 용해된 재생 한천을 55-60℃에서 유지시킨다.
2. 형질전한 시료의 평판도말법.
형질전환 시료가 준비되기 전 적어도 30분에 평판당 10ml 재생 한천의 바닥 한천층을 붓는다. 형질전환 시료가 SOS에 용해되어 있는 기간동안 재생한천 10ml 분취액을 45-50℃ 중탕에서 관에 넣는다. 상기한 형질전환 시료들의 분취액을 재생한천과 함께 관에 첨가하고 평판의 바닥 한천층위에 붓는다. 45-50℃를 유지하면서 각 시료의 양을 재생한천 10㎖ 분취액에 첨가하고 재생한천의 고형의 10㎖ 바닥 한천층을 포함하는 평판에 각각 붓는다.
3. 스페로플라스트 제조의 질 결정
10μl의 시료 하나를 취하고 1M 솔비톨 990μl에 첨가하고 100배 희석한다. 100배 희석액 10μl를 취하고 1M 솔비톨 990μl 두번째 분취액에 첨가하여 또 100배 희석한다. YPD한천 배지에 두 희석액 100μl를 평판도말하여 제조물에 잔존하는 스페로 플라스트되지 않은 전 세포의 농도를 결정한다. 각 분취액 100μl를 40μg/ml 히스티딘으로 충전된 재생 한천 10ml에 첨가하여 총재생가능한 스페로플라스트 수를 결정한다. 형질전환 실험의 양호한 값은 1-10×107총 재생가능한 스페로플라스트수/ml 및 약 1×103전세포수/ml
4. 30℃에서 3-5일간 평판을 항온처리한다.
[실시예 13]
피치아 파스토리스(Pichia pastoris) HIS4 유전자 분리와 자율적인 복제 서열
A. 균주
균주는 다음과 같은 것을 사용한다.
(a) 피치아 파스토리스 균주 NRRL Y-11430 :
(b) 피치아 파스토리스 GS115(his4 : NRRL Y-15851) :
(c) S. 세레비시애(S.Cerevisiae) 균주 5799-4D(his4-260 his4-39 ; NRRL Y-15859) :
(d)E.콜리(E.coli)) 균주 848(F-met thi galT1 Rψ80shsdR-hsdM+)
B. 플라스미드
pYA2(23도를 참조 ; pBR325pstI 부위에 삽입딘 9.3kbpPatI 단편상에 있는S.세레비시애HIS4 유전자로 구성됨)은S.세레비시애HIS4 유전자 단편의 원료이고E.콜리숙주에 침착시켜 왔고, 공공에는 NRRL B-15874로 알려져 있다.
YEp13은 미국형 배양수집소로부터 얻을 수 있고 기탁번호 ATCC 37115로 정해져 있다.
C. 배지
피치아 파스토리스를 YPD(풍부한) 혹은 IMG(최소) 배지에서 배양한다. IMG, 최소 배지는 다음과 같이 구성되어 있다.
1. 최종농도가 KH2PO436.7mM, (NH4)2SO422.7mM, MgSO4·7H2O 2.0mM, KCl 6.7mM, CaCl2·2H2O 0.7mM인 1M2염 10x 모액으로 제조하고 가압처리한다 ;
2. 최종농도가 CuSO4·5H2O 0.2μM, KI 1.25μM, MnSO4·H2O 4.5μM, NaMoO4·2H2O 2.0μM, H3BO30.75μM, ZnSO4·7H2O 17.5μM, FeCl3·6H2O 44.5μM인 미량의 염을 400x모액으로 제조하고 여과 살균한다 ;
3. 0.4μg/ml 바이오틴 ; 및
4. 2% 덱스트로스
대장균(E.coli)을 100μg/ml 트립토판 및 0.2% 카사민산이 보충된 LB배지 혹은 2B배지(NH4PO40.2%, Na2HPO41.2%, MgSO4·7H2O 0.013%, CaCl2·2H4O 0.074%, 티아민 1μg/ml, 및 덱스트로스 0.4%)에서 배양한다.
D. DNA 분리
1. 효모 DNA의 대규모 제조
피치아 파스토리스 및S.세레비시애DNA제조는 효모세포를 최소 배지 100ml에 A600이 1-2가 되기까지 배양하고, 세포를 2000g에서 5분간 원심분리하여 얻음으로 수행한다. 세포를 물에 한번 씻고 SED에 씻고 1m 솔비톨에 씻고 솔비톨 1M이 있는 0.1M Tris-HCl(pH 7.0) 5ml에 재현탁시킨다. 세포를 지몰라제 60,000(Miles Laboratories) 4mg/ml용액 50-100μl와 혼합하고 30℃에서 1시간 배양하여 세포벽을 소화한다. 스페로플라스트 제조는 1000g에서 5-10분간 원심분리하고 용해 완충액(0.1% SDS, 10mM Tris-HCl(pH 7.4) 5mM EDTA 및 50mM NaCl)에 현탁시킨다. 프로티나제 K(보에린거 만하임) 및 RNase A(시그마)를 100μg/ml에 각각 첨가하고 혼합액을 37℃에서 30분간 배양한다. DNA는 이소아밀 알코올(24 : 1v/v)을 포함하는 동량의 클로로포름과 그 제조물을 가볍게 혼합하여 탈단백질화하고 층을 12,000g에서 20분간 원심분리하여 분리한다.
윗층을 새로운 관에 옮기고 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 동량으로 추출한다. 층을 분리하여 상층을 찬 100% 에탄올 2-3부피를 포함하는 관에 넣는다. 시료를 가볍게 섞어주고 DNA를 플라스틱 막대에 감아서 수집한다. DNA를 TF, 완충액 1ml에 직접 용해시키고 4℃에서 TE 완충액 100부피에 대하여 밤새 투석시킨다.
2. 소규모의 효모 DNA 제조
최소 배지의 효모 배양액 5ml를 A600이 1-5가 될 때까지 배양시키고 2,000g에서 5분간 원심분리시켜서 얻는다. 세포를 SED 1ml에 현탁시키고 1.5ml 마이크로퓨지 관에 옮기고, 1M 솔비롤에 씻고, 0.1M Tris-HCl(pH 7.4) 0.5ml에 재현탁시키고, 지몰라제 60,000(4mg/ml용액 10μl)을 더하고 세포를 30℃에서 30-60분간 배양한다. 세포를 1분간 원심분리하고 용해 완충액에 현탁시키고, 65-70℃에서 배양한다. 15분 후에 시료를 5M 초산칼륨 100μl와 혼합하고 얼음중탕에서 15분간 유지시키고, 5분간 원심분리시킨다. 상등액을 100% 에탄올 1ml를 포함하는 새로운 마이크로퓨지 관에 따르고 10초간 원심분리한다. 최종적으로 DNA알갱이를 10-15분간 공기건조하고 TE완충액 50μl에 용해시킨다.
3. 대규모 대장균(E. Coli) DNA 분리
대규모(0.5-1ℓ) 플라스미드 제조의 대장균 배양액을 상기한 바와 같이 보충한 2B 배지에서 흔들어주면서, 적당한 항생제와 함께 37℃에서 배양한다. 플라스미드로부터 유도된, pBR322를 포함하는 세포 배양액을 A550이 약 0.7이 되도록 배양하고, 배양시 충분한 클로람페니콜을 100μg/ml 농도로 첨가하고 약 15시간 후에 세포를 수확한다. 플라스미드로부터 유도된pBR325를 포함하는 균주를 보충된 2B 배지에 A550 약 0.01-0.05로 주입하고 수확하기 전에 20-24시간동안 37℃에서 흔들어주면서 배양한다.
4. 소규모 대장균(E. coli) DNA 제조
소규모의 신속한 플라스미드 분리를 위해서는 항생제를 포함하는 보충된 2B 배지에 있는 배양액 2ml를 흔들어 주면서 37℃에서 밤새 배양하고, 1.5ml 마이크로퓨지 관에서 원심분리하여 수확한다. 모든 제조물로 부터의 플라스미드를 빈보임 및 돌리(1979)에 의해 기재된 알카리분해법으로 분리한다.
E. DNA 제한 및 단편 분리
제한효소는 뉴잉글랜드 바이오랩 및 베테스다 연구 실험실로부터 얻고 소화는 일상적 기술에 의해 수행한다. 절단도 작성은 삽입 DNA 있거나 혹은 없이 플라스미드 소화물의 평행 비교에 의해 수행한다. 제한된 단편을 한철겔로 부터 뒤에 투석관에 의해 지지되어 있는 왓트만 3MM지에 용출시켜 정제한다. 단편을 종이로부터 회수하고 NaCl 0.1 M, Tris-HCl(pH 8.0) 50mM 및 EDTA 1mM을 포함하는 용액 0.1-0.2ml로 3-4회 씻는다. 최종적으로 단편을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 에탄올로 침전시키고 TE완충액 소량에 재현탁시킨다.
F. 대장균 내에 P. 파스토리스(P. pastoris) 라이브러리구성
피치아 파스토리스 DNA-YEp13 라이브러리 구성을 위해 YEp13 100μg을BamHI로 완전히 소화하고 송아지 위 알카리성 포스파타제로 처리하여 DNA의 말단 5'-인산을 제거한다. 피치아 파스토리스 NRRLY-11430로 부터의 야생형 피치아 파스토리스 DNA의 100μg 분취액을 총부피 1ml액에서 37℃에서 5분간 항온처리하며Sau3AI 10단위로 부분 소화한다. 5-10Kb 단편은 5-20% 수크로오스 구배로 원심분리하여 크기를 선택한다. 벡터 1μg 및 피치아Sau3AI 단편 2μg을 총부피 200μl 액에서 T4 DNA 리가제(베테스다 연구 실험실) 20단위와 혼합하고 4℃에서 밤새 항온처리한다. 전 연결 반응 혼합물을 컴페턴트 대장균 2ml에 첨가하고 0℃에서 15분간 항온처리하여 연결 DNA를 대장균에 이전시킨다. LB 배지 40ml를 첨가한후 혼합물을 5분간 37℃까지 데우고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 암피실린을 총농도가 100μg/ml가 되게 첨가하고 다시 1시간동안 항온 처리한다. 최종적으로 세포를 3,000g에서 10분간 원신분리시키고 새로운 LB 배지 1ml에 재현탁시키고 100μg/ml 암피실린을 포함하는 10LB 한천 평판상에 동량 분취액으로 도말한다. 형성된 약 50,000 집락을 평판으로부터 벗겨내고 세포의 일부분을 A550이 약 0.1인 보충된 2B배지 500ml에 넣는다. 배양기를 배양하고 상기한 바와 같이 플라스미드를 추출한다. 라이브러리로부터 수집한 집락중, 시험한 100중 96은 테트라사이클린에 민감하고 10중 7은 삽입 DNA를 갖는 플라스미드를 포함하고 있다.
피치아 파스토리스 DNA-pYJ8 △ CIa 라이브러리 구성을 위해서 pYJ18 △ CIa 50μg을 CIaI로 완전히 소화하고, 송아지 위 알칼리성 포스파라제로 처리하여 DNA의 말단 5' 인산을 제거한다. 피치아 파스토리스 NRRL Y-15851의 DNA 100μg 분취액을 총부피 1ml로 65℃에서 5분간 항온처리하여TagI 20단위로 부분 소화한다. 5-10Kbp 단편을 0.5% 한천겔(실시예 2, E 부분 참조)로 전기용출시켜 크기를 선택한다. 벡터 1μg 및 피치아 탁 I(Pichia Tag)I 단편 2μg을 총부피 200μg에서 T4 DNA 리가제(비테스다 연구 실험실) 20단위와 혼합하여 4℃에서 밤새 항온처리 한다. 전 연결 반응 혼합액을 컴페턴트 대장균 848세포 2ml에 첨가하고 0℃에서 15분간 항온처리하여 연결 DNA를 대장균으로 전이시킨다. LB 배지 40ml를 첨가한 후 혼합물을 5분간 37℃까지 데우고 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 암피실린을 첨가하여 100μg/ml의 총농도가 되게하고 다시 1시간 항온처리한다. 최종적으로 세포를 3,000g에서 10분간 원심분리하고 새로운 LB 배지 1ml에 재현탁시키고 100μg/ml의 암피실린을 포함하는 10LB 한천평판상에 동량의 분취액을 도말한다. 형성된 약 10,000 집락을 평판으로부터 벗겨내고 세포의 일부분을 A550이 약 0.1인 보충된 2B 배지 500ml에 넣는다. 배양기를 배양하고 플라스미드를 상기한 것과 같이 추출한다.
G. 서던 교잡
큰 혹은 거대코일화된 DNA 분자를 니트로셀룰로오스에 옮기기 위해서, DNA를 알칼리 변성에 앞서서 0.25 M HCl에 용해된 한천 겔에 담가서 먼저 부분 가수분해시킨다.S. 세레비시애 HIS4 유전자의 표지된 단편과 피치아 파스토리스 DNA과의 교잡은 50% 포름아미드, 6xSSC, 5x Denhardt's, 0.1% SDS, 1mM EDTA 및 100μg/ml 변성된 청어 혈장 DNA 존재하, 42℃에서 행한다. 교잡후 세척은 65℃에서 1xSSC, 1mM EDTA, 0.1% SDS 및 1.0% 피로인산 나트륨염에서 행한다. DNA는 실시예 4에서 기재한 것과 같이 32p-표지되었다.
H. DNA 서열화
DNA 서열화는 생거등(1980)의 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종단법으로 수행한다.
I. 효모 형질전환
S. 세레비시애 형질전환은 힌넨등(1978)의 스페로플라스트 형성법으로 수행한다.
피치아 파스토리스 형질전환은 상기한 공정에 따라 행한다.
J. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 형질전환의 분석
피치아 파스토리스 세포내에 자율적 요소로서 남아있는 각 플라스미드의 능력은 다음과 같이 결정된다 : 형질전환된 집락을 재생성 한천 평판으로버터 집어내고 SD 배지 한천 평판상에 도말하고, IMG 배지 용액내로 주입한다. SD 평판을 30℃에서 3일간 배양하고 이후에 이 평판으로부터 단일 집락을 집어내고, 두번째 DC 평판에 도말하고 IMG 배지의 두번째 플라스크내로 주입한다. 이 공정을 3번 반복한다. 3IMG 배양기를 흔들어주면서 A600이 약 1-2가 되도록 30℃에서 배양하고 원심분리하여 얻는다. 효모 배양기로 부터의 DNA를 상기한 바와 같이 추출하고 30볼트 30밀리암페어에서 10-15시간동안 0.8% 한천겔안으로 전기 영동하고, 니트로셀루로오스로 이전시키고, 상기한 바와 같이 32p- 표지된 pBR322 혹은 pBR325와 교잡한다. 조절하면서 대장균으로부터 분리한 플라스미드 10ng을 포함하는 시료 및 형질전환되지 않은 피치아 파스토리스 GS115 DNA 1-2μg을 포함하는 시료를 실험시료와 병렬적으로 전기 영동한다.
K. 피치아(Pichia) DNA 서열의 분리
피치아 HIS4 유전자를 포함하는 DNA 단편을 컴패턴트S. 세레비시애 his4 균주에 대한 능력으로 피치아 DNA 라이브러리로부터 분리해낸다. 라이브러리는S. 세레비시애-E. 콜리 왕복 벡터 YEp13의BamHI 부위에 삽입된 야생형 피치아 DNA의 5-20KbSau3AI 부분 소화 단편으로 구성되어 있다. S. 세레비시애 NRRL Y-15859(5799-4D ; his4ABC-균주)의 스페로플라스트를 힌넨 등(1978)의 기술에 의해 생성하고, 피치아 DNA 라이브러리와 혼합하고, 히스티딘이 없는 배지에서 재생성한다. 형질전환은 5×107총 재생성 스페로플라스트 집단에 대해 약 1×103자가영양 효모 집락으로 생성된다. 총 효모 DNA는 His+집락 20으로부터 추출하고 대장균으로 전이시킨다. 효모 DNA 제조물중 17은 암피실린 저항 집락을 형성하고, 각각은 YEp13과 삽입 DNA로 구성된 플라스미드를 포함한다. 피치아 HIS4 유전자를 함유하나 억제 활성을 갖는 DNA 단편은 가지고 있지 않은 His+ 형질전환 플라스미드를 확정하기 위해 플라스미드의 제한 소화물을S. 세레비시애(S. Cerevisiae) HIS4 유전자의 많은 부분을 함유하는 표지된 DNA 단편과 교잡하고 적당히 씻는다. his4 S. 세레비시애 균주에 상보적인 플라스미드 각각은S. 세레비시애 HIS4 유전자에 교잡된 서열을 포함한다. 피치아 ARS 활성을 함유하는 DNA 단편을 조사하기 위해, 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851)의 DNA를TagI으로 부분 소화하고 5-10Kbp 단편을 분리하고 pYJ8 △Cla의 유일한 ClaI 부위에 클론화한다(26도 참조). 플라스미드 DNA를 약 10,000 HIs+피치아 집락으로부터 회수하고 대장균을 형질전환하는데 사용한다.
약 10,000개의 암피실린 저항 집락으로부터 플라스미드를 분리하고 GS115 안으로 다시 전이시킨다. 부라이브러리 형질전환으로 부터 His+효모 집락 40을 선택배지상에 분리하고 도말하고 선택배지에서 분리 배양시킨다. 총 효모 DNA를 40배양기 각각으로 부터 추출하고 대장균 안으로 전이시킨다. 효모 DNA 제조물이 임피실린 저항 대장균 집락을 형성하는 2개의 플라스미드 pYA63(PARS1) 및 pYA90(PARS2)를 더욱더 분석하여 선택한다. 이 플라스미드 둘다 매우 높은 빈도수로 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851)을 형질전환시키고 각각은 상이한 DNA 삽입을 포함하고 있다.
[실시예 14]
조절지역-lacZ 유전자 융합의 구성
A. P72(알코올 산화효소) 조절지역 구성
플라스미드pPG 4.0 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로 부터의 4천염기 쌍 EcoR1-PvuII 게놈 DNA 단편을 함유하는pBR322 벡터를PstI로 자르고, S1 뉴클리아제로 처리하여 절단부분에 짧은 무딘말단을 발생시키고BamH I로 절단하여 알코올 산화효소 조절지역 및 알코올 산화효소의 처음 15 아미노산의 코팅 정보를 함유하는 1.12kbp DNA 단편을 생성한다. 1.12kbp DNA 단편은 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
Figure kpo00012
1.12kbp는 E. 콜리-S. 세레비시애 왕복 벡터pSEY101(도우글라스 등 : 1984)의EcoRI/SmaI/BamHI 링커내로 연결된다. 벡터 pSEY101은 대장균lacZ 유전자 및 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리링커를 갖고
Figure kpo00013
교잡 플라스미드pTA011(29도 참조)를 얻는다.
pTA011의 조절지역-lacZ 유전자 융합이 서열 E에 기재된 β-갈락토시다제의 생산에 관한 것으로 나온것이므로 :
서열 E
Figure kpo00014
벡터pTA011이 유일한 BamHI 부위에서 절단되고 다음의SmaI 링커가 삽입된다 :
Figure kpo00015
그러므로 잡종 벡터pTA012를 생산하고 이것은 조절지역-lacZ 융합에 관한 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
서열 F
Figure kpo00016
그러므로pTA012 조절지역-lacZ 융합은 LacZ 해독구조에 관한 것으로 부터 나왔다. 알코올 산화효소 구조 유전자를 위한 N-말단 코딩 정보를 구조lacZ 유전자와 함께 열린 해독 구조내로 넣기 위하여pTA012를 EcoRI-SmaI으로 처리하고 결과 생성된 DNA단편을 EcoRI 및 SmaI으로 비슷하게 처리된pSEY101 안으로 연결시켜서 잡종벡터pTA013(30도 및 하기 뉴클레오티드 서열 참조)을 생성한다.
서열 G
Figure kpo00017
Figure kpo00018
벡터pTA013은S. 세레비시OH SEY2102를 형질전환시키는데 사용되고 더욱 상세한 것은 하기 실시예 15에 기재한다.
벡터pTA013은PstI 혹은PstI-NruI으로 자르고 절단된 단편과 왕복 벡터 pTAFHI(28도 참조),pYJ30(27도 참조), 혹은pTA2(23도 참조)의 HIS4 유전자-포함 단편과의 연결에 조절지역-lacZ 융합이 포함되고 각각 플라스미드pSAOH 1,pSAOH 1 및pSAOH 10을 생성한다.
Figure kpo00019
B.p76 조절지역 구성
조절지역-lacZ 유전자 융합은p76 조절지역으로 다음과 같이 제조한다.
1.pPG 6.0의 전체 5'부분 사용
pPG 6.0의 1.35 Kb쌍 EcoR I 단편을 대장균-S.세레비시애 왕복 벡터,pSEY101의 유일한 EcoR I 부위내로 클론화하여 플라스미드pT76U1(30a도 참조)를 얻는다. 벡터pT76U1을PstI-NruI로 자르고, 큰 DNA 단편을 상기한 바와같이 왕복 벡터pTAFH1(28도 참조)의 HIS4 유전자-포함 단편과 연결시켜서pT76H3을 얻고 ; 혹은 왕복 벡터pBPf1(34도 참조)의PstI-EcoRI 단편에EcoRI-말단 채운 것과 연결시켜pT76H4를 얻는다.
2. 5'-pPG 6.0의Bal31 소화물 사용
pPG 6.0의 1.35 Kb쌍 EcoR I을pSEY8, 피치아 DNA가 삽입되는 EcoR I 부위에 인접한 유일한Sal1 부위를 가진 대장균-S.세레비시애 왕복벡터의 유일한 EcoR I 부위내로 클론화하여, 플라스미드pTA01(31도 참조)를 얻는다. 플라스미드pTA01을SalI으로 자르고Bal31 엑소뉴클리아제로 처리하여 여러가지 길이의, 폴리펩티드p76 조절지역의 끝이 무딘 단편을 생성한다. 끝이 무딘 단편을EcoRI으로 절단하여 잔존하는 플라스미드pSEY8로 부터 유리시킨다. 결과 생성된 DNA 단편을pSEY101의EcoRI-SmaI 링커내로 클론화하여 다른것과 함께 플라스미드pTAF.85(32도 참조)를 얻는다. 플라스미드pTAF.85는p72(알코올 산화효소) 조절지역 대신에p76 조절지역을 가지고 있고, 29도에 나타난pTA011와 유사하다.
벡터pTAF.85를 벡터pTA013과 유사한 방법으로 처리하여 플라스미드pTAFH.85,pT76H1 및pT76H2를 형성한다. 그러므로 다음의 벡터를 자르고, 연결시킨다.
Figure kpo00020
[실시예 15]
피치아 파스토리스 내의 β-갈락토시다제 생성의 조절
다른 탄소원 및 다른 조건하에서 배양된 여러가지의 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851) 형질변환 균주에 의한 β-갈락토시다제의 생성이 연구되었다. 형질변환된 균주를 정지기에 도달하기까지 30℃에서 바이오틴 0.5μg/ml 및 글루코오스 0.1%를 포함하는 최소배지에서 배양한다. 세포를 원심분리하여 수집하고 바이오틴 0.5μg/ml 및 메탄올 0.5%를 함유하고 최소배지에 옮기고 30℃에서 약 3-5세대 동안 배양 시킨다. 메탄올에서의 초기 배양후에 세포를 원심분리하여 수집하고 바이오틴 0.5μg/ml 및 탄소원으로 글루코오스 0.1% 혹은 메탄올 0.3%를 포함하는 새로운 최소배지에 옮긴다. 시료를 규칙적으로 회수하여 알코올 산화효소 및 β-갈락토시다제의 수준을 유지시키면서 세포를 30℃에서 약 80시간동안 배양한다. 약 20-50시간후에 탄소원이 고갈되고 따라서 세포는 탄소원이 고갈된 상태하에 놓이게 된다. 결과는 표I에 기재했다.
[표 1]
피치아 파스토리스 NRRL Y-15851의 형질전환 균주내의 β-갈락토시다제 및 알코올 산화효소(Units/OD600)의 최대수준(배양시간 hrs)
Figure kpo00021
a세포는 다른 시간점에서 회수하고 β-갈락토시다제 및 알코올 산화효소 활성 측정은 본문에 기재된 것과 같이 수행한다.
알코올 산화효소는 상기한(실시예 7 참조) 염료-과산화효소법에 의해 결정하고 β-갈락토시다제는 다음과 같이 결정한다.
Figure kpo00022
11로 만든다 : pH는 7이어야 함.
O-니트로페닐-β-D-갈락토시드(ONPG) :
ONPG(시그마 N-1127) 400mg을 증류수 100ml에 용해시켜서 4mg/ml의 ONPG 용액을 만든다.
B. 측정공정 :
1. 배지(효모세포의 OD600이 0.1-0.5이다)로 부터 분취액을 취하여, 원심분리하고 물로 세포알갱이를 씻는다.
2. Z 완충액 1ml를 세포 알갱이에 첨가하고, CHCl3, 30μl 및 0.1% SDS 30μl로 휘젖고, 30℃에서 5분간 배양한다.
3. ONPG(4mg/ml) 0.2ml를 첨가하여 반응을 개시시키고, 휘젖는다.
4. 1M Na2CO3 용액 0.5ml를 A420〈1인 적당한 시간점에서 첨가하여 반응을 종결시킨다.
5. 420mn에서 상등액의 흡광도를 측정한다.
C. β-갈락토시다제 활성 단위의 계산
1U=30℃ pH 7에서 1분동안에 오르토니트로페놀(ONP)이 1nmol 생성된 것.
ONP 1nmole는 1cm 통과길이로 420mn(A420)에서 0.0045의 흡광도를 가진다 ; 420nm에서 흡광도 1은 분석된 상등액의 총부피가 1.7ml이므로 222nmole ONP/ml 혹은 378nmole/1.7ml이다. 그러므로 표에 나타난 단위는 다음과 같이 계산된다.
Figure kpo00023
표 1에 기재한 결과는 효모에 이질 단백질이(예를들면 β-갈락토시다제) 영양배지내의 메탄올 존재로 조절되거나 혹은 분해대사질억제 탄소운상에서 배양한 후 탄소원 고갈로 조절된 피치아 파스토리스 내에 생성될 수 있음을 나타낸다.
[실시예 16]
S. 세레비시애내에 β-갈락토시다제 생성의 조절
사카로마이세스 세레비시애 SEY2102, 생존을 위해 우라실, 로이신 및 히스티딘을 필요로 하는 균주를 폴라스미드pTA013 및 PT76U1로 형질전환시킨다. 형질전환된 균주는 성장을 위해 우라실을 필요로 하지 않으므로 집락으로부터 선택함으로 쉽게 분리할 수 있다. 분리한 형질전환체에는 각각 실험실 명칭 SEY2102-pTA013 및 SEY2102-PT76U1이 주어졌다. SEY2102-pTA013은 일리노이스 페오리아에 있는 노던 리젼얼 리써취 쎈타에 보존되고 공공에는 보존일이 1984. 8. 31로 확정되었다. 이 균주는 기탁번호 NRRL Y-15858로 매겨졌다.
NRRL Y-15858 및 SEY2102-PT76U1의 세포를 히스티딘 20μg/ml 로이신, 글루코오스 5%를 포함하는 최소배지에서 약 3-4세대동안 30℃에서 배양한다. 세포를 옮긴다. 즉 원심분리하여 수집하고 표2에 기재된 탄소원 3%가 있는 YP 배지에 이전시키고 30℃에서 5세대동안 배양한다. 세포를 탄소원이 고갈된 상태에서 50시간 더 배양시키고 정기적으로 β-갈락토시다제를 시료화한다. 결과는 표 2에 기재했다.
[표 2]
Figure kpo00024
Figure kpo00025
이러한 결과는 효모의 이질 단백질(예를들면 β-갈락토시다제)는 분해대사질 억제 탄소원이 성장을 위해 사용될 때 탄소원 고갈 상태하에서p72(알코올 옥시다제) 및p76 조절 지역이 조절되거나 혹은 글리세롤 또는 갈락토스와 같은 비교적 비-분해대사질 억제 탄소원상에서 형질전환된S.세레비시애를 성장시켜 조절된 사카로마이세스 세레비시애에 의해 생성될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 조절지역 조절하에서S.세레비시애내의 β-갈락토시다제의 생성수준은 프로모터가 조절된 다른S.세레비시애와 생성수준을 비교할 수 있다.
Figure kpo00026
본 발명의 조절지역은 적어도S.세레비시애 프로모터 만큼이나 효과적이거나 혹은S.세레비시애 고유의 프로모터보다 더욱 효과적이다.
[실시예 17]
효모 게놈 DNA 의 서던 교잡
9개의 다른 메탄올 동화효모 및 하나의 메탄올 비-동화효모를 최소배지(IM1 실시예 1 참조)에 각각 메탄올 0.75% 혹은 글루코오스 1.0%를 더한 것에서 배양한다. 총 염색체 DNA를 실시예 4에 기재한 것과 같이 분리한다. 즉, 총 핵산을 분리하고 RNase A로 철하고, 먼저 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 다음에 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 최종적으로 에탄올로 침전시킨다. 침전한 DNA를 TE 완충액 최소량에 재현탁시키고 원심분리하여 DNA 용액을 청정한다.
서던 교잡 여과물은 실시예 4의 기재에 따라 제조한다. 즉 여러가지 효모종으로부터의 총 DNA 10μg을 과량의HindIII으로 소화하고, 전기영동하고, DNA를 변성시키고, 겔을 중화하고 DNA를 니트로셀루로오스 여과기로 옮긴다. 이 여과물의 예비교잡조건은 탈이온화된 포름아미드, SSC 6X, Denhardt's 5X, EDTA 1mM, SDS 0.1% 및 변성된 연어 혈장 DNA 100μg/ml로 42℃에서 밤새 처리하는 것을 포함한다. 같은 조건을 최종농도 106cpm/ml에서32P-홈을 가지고 번역된 탐침체를 사용하여, 교잡배지에도 사용한다. 탐침제는 클론pPC 8.3,pPC 15.0 및pPC 6.7로 부터의 cDNA 삽입(PstI 단편) 뿐만아니라P.파스토리스 HIS4 유전자의 2.7 kbpBglII DNA 단편을 포함한다. 이러한 탐침체 각각은 교잡에 사용된 똑같은 여과기 상에서 42℃에서 24시간 지속시켜서 분리한다. 교잡후에 여과기를 상온에서 15분간 2번 씻고, 65℃에서 15분간 2x SSC, 1mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.1% 피로인산나트륨을 포함하는 용액으로 3번 씻는다. 또다른 세척은 적당히 예를들면 55℃ 및 42℃에서 행하여 교잡결과를 확정한다. 여과기를 72시간동안 가압처리한다. 교잡의 결과를 표 3에 기재했다.
[표 3]
Figure kpo00027
표 3에 기재된 결과는p76,p72 및p40과 유사한 폴리펩티드의 유전자는 모든 메탄올-동화 효모에 존재한다는 것을 나타낸다. 이 세개의 유전자중 어느것도 메탄올 비-동화효모,S.세레비시애와의 교잡이 발견되지 않았고 반면에P.파스토리스 HIS4 유전자 및S.세리비시애로 부터의 HIS4 유전자 사이의 상동성은 쉽게 관찰되었음은 놀랄만한 것이다.
상기 본문에 다음에 열거한 것이 참고되었다.
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Claims (16)

  1. 재조합 DNA 물질 유래의 삽입된 폴리펩티드 코우팅 서열을 발현시킬 수 있는 형질전환 효모균주를 영양배지내에서 배양하는 것으로 구성되는 폴리펩티드 제조방법에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기(1)과 (2)로 구성됨을 특징으로 하는 방법 : (1) 하기 조건(i),(ii) 및 (iii)중 적어도 하나에 대한 반응성이 있는 조절부위 : (i) 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 존재 : (ii) 상기 DNA 단편을 위한 숙주미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 이외의 비-분해 대사질억제 탄소원 존재 ; 및, (iii) 분해대사질억제 탄소 및 에너지원상에서 숙주 미생물을 배양한후, 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 탄소원 기아현상 ; (2) 폴리펩티드 코우딩 부위 : (여기서, 상기 조절부위는, 메신저 RNA의 생산을 암호화 하는 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치할 경우 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있으며, 상기 영양배지는 상기(1)에 정의된 조건을 제공하는 그러한 배지이다).
  2. 제1항에 있어서, 상기 영양 배지는 메탄올을 함유하고, 상기 재조합 DNA 물질은 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치한 메탄올 반응성 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로에커라, 사카로마이세스, 로도토룰라, 한세눌라, 토룰롭시스 및 피치아 속(genera)으로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 영양배지는 적어도 하나의 분해대사질 비-억제 탄소원으로 구성되고; 상기 재조합 DNA 물질은, 형질전환 효모균주와 접촉되는 배지내의 분해대사질 비-억제 탄소원 존재에 대한 반응성이 있고 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치하는 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분해대사질 비-억제 탄소원이 글리세롤과 갈락토즈로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로에케라, 사카로마이세스, 로도토룰라, 한세눌라, 토룰롭시스, 피치아, 시조사카로마이세스 및 클루이베로마이세스로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 영양 배지는 적어도 하나의 탄소 및 에너지원으로 구성되고 ; 상기 재조합 DNA 물질은, 형질전환 효모균주를 전술한 바와같은 적어도 하나의 분해대사질 억제 탄소 및 에너지원 상에서 배양한 후 형질전환 효모균주와 접촉되는 배지내에서의 탄소원 기아현상에 대한 반응성이 있고 상기 폴리펩티드 코우딩 부위의 5'말단에 위치하는 조절부위로 구성되며 ; 단계(a)의 생성물에 탄소원 기아조건을 가해줌을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 분해대사질억제 탄소 및 에너지원이 포도당, 에탄올 및 과당으로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 분해대사질억제 탄소원이 포도당임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로에케라, 사카로마이세스, 로도토룰라, 한세눌라, 토룰롭시스, 피치아, 시조사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 속(genera)으로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 분리하고 정제하는 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조절부위가 효모에서 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 효모가 피치아(Pichia) 속(genera)에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 효모가 피치아 파스토리스 종(species)의 일원임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조절부위가 알콜 산화효소의 생산을 암호화하는 메신저 RNA의 전사를 조절한다는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 숙주 효모 균주로 히스티딘 생산 능력이 결여된 피치아 파스토리스종이 사용되는 방법.
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