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PT2704798T - Formulação para um anticorpo anti-alfa4beta7 - Google Patents

Formulação para um anticorpo anti-alfa4beta7 Download PDF

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PT2704798T
PT2704798T PT127210938T PT12721093T PT2704798T PT 2704798 T PT2704798 T PT 2704798T PT 127210938 T PT127210938 T PT 127210938T PT 12721093 T PT12721093 T PT 12721093T PT 2704798 T PT2704798 T PT 2704798T
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PT
Portugal
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antibody
formulation
ser
dose
vedolizumab
Prior art date
Application number
PT127210938T
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English (en)
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Palaniappan Vaithianathan
T Truong Nobel
M Varga Csanad
Diluzio Willow
Brown Jason
H Fox Irving
Scholz Catherine
Original Assignee
Millennium Pharm Inc
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Publication date
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Application filed by Millennium Pharm Inc filed Critical Millennium Pharm Inc
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Description

DESCRIÇÃO FORMULAÇÃO PARA UM ANTICORPO ANTI -ALFA4BETA7
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório US 61/585.859, depositado em 12 de janeiro de 2012, e pedido provisório US 61/550.545 depositado em 24 de outubro de 2011, e pedido provisório U.S. 61/481.533 depositado em 2 de maio de 2011.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada em formato ASCII via EFS-Web e está incorporado por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 30 de abril de 2012, é nomeada 92596615.txt e é 17.024 bytes em tamanho.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Avanços em biotecnologia têm tornado possível para produzir uma variedade de proteinas para aplicações farmacêuticas usando técnicas de DNA recombinante. Devido ao fato de que proteinas são maiores e mais complexas do que drogas tradicionais orgânicas e inorgânicas (ou seja que possuem vários grupos funcionais além de estruturas complexas tridimensionais), a formulação de ditas proteinas possui problemas especiais. Para uma proteína permanecer biologicamente ativa, uma formulação deve preservar a integridade conformacional de pelo menos uma sequência central dos aminoácidos da proteína, enquanto ao mesmo tempo protege os vários grupos funcionais da proteína de degradação. As proteínas podem sofrer de uma falta de estabilidade e anticorpos monoclonais e policlonais, em particular, podem ser relativamente instáveis (Ver, por exemplo, Wang et al-, J. Pharm Sei. 96:1-26 (2007)) . Um grande número de opções de formulação está disponível e nenhuma abordagem ou sistema está disponível para todas as proteínas. Vários fatores a serem considerados foram relatados (Ver, por exemplo, Wang et al.).
Inúmeras características podem afetar a estabilidade de uma proteína. De fato, mesmo no caso de anticorpos purificados, as estruturas de anticorpos podem ser heterogéneas o que ainda complica a formulação de ditos sistemas. Além disso, os excipientes incluídos em formulações de anticorpo preferencialmente minimizam qualquer resposta imune potencial.
No caso de anticorpos, a preservação da integridade conformacional é ainda mais importante. As vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (ou seja, qualquer processo que envolve modificação da proteína por formação de ligação ou clivagem resultando em uma entidade química nova) ou instabilidade física (ou seja, alterações na estrutura de ordem superior da proteína). A instabilidade química é manifestada em, por exemplo, deamidação, isomerização, hidrólise, oxidação, fragmentação, eliminação de beta glicano ou troca de dissulfeto. A instabilidade química pode resultar de desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. As quatro vias de degradação de proteína mais comuns são fragmentação de proteína, agregação, deamidação e oxidação. Consequências de instabilidade química ou física de proteína terapêutica incluem uma redução da dose efetiva administrada, segurança reduzida da terapia devido a, por exemplo, irritação ou reatividade imunológica e, mais frequente, fabricação devido à meia-vida curta.
Liofilização é uma técnica comummente empregue para preservar proteínas; liofilização serve para remover água da preparação de proteína de interesse. Congelamento-dessecação, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e, então, o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em vácuo. Excipientes podem ser incluídos na formulação pré-liofilizada para estabilizar proteínas durante o processo de liofilização e/ou para melhorar a estabilidade da formulação de proteína liofilizada (Pikal M., Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)). Várias publicações revelaram geralmente vários métodos para tratar doenças intestinais inflamatórias e forneceram esquemas de dosagem para administração de agentes projetados para tratar doença intestinal inflamatória. Por exemplo, WO 96/24673 revela adressinas vasculares de mucosa e tratamento de doenças associadas com recrutamento de leucócitos para o trato gastrointestinal como um resultado de ligação de leucócito às células que expressam MAdCAM. US 2005/0095238 descreve métodos para tratar uma doença associada com infiltração de leucócito de tecido de mucosa e administração a um humano uma quantidade eficaz de uma imunoglobulina humana ou humanizada ou fragmento de ligação ao antigénio contendo especificidade de ligação para α4β7 integrina. US 2005/0095238 ainda descreve várias doses (por exemplo, 0,15, cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5 ou cerca de 2,0 mg de imunoglobulina ou fragmento por kg de peso corporal) e vários intervalos entre doses (7, 14, 21, 28, ou 30 dias). No entanto, as patentes e publicações acima mencionados não revelam as formulações específicas do anticorpo anti-a4p7 ou as doses específicas e regimes de dose e reivindicados aqui. De modo importante, as patentes acima mencionadas não revelam formulações, doses, e regimes de dose que fornecem os métodos de tratamento (suportado por dados de estudos clínicos) descritos e reivindicados aqui.
As formulações de anticorpo da presente invenção podem ser úteis para inibir ligação ao leucócito às células que expressam MAdCAM e, portanto, auxilia no tratamento de doenças intestinais inflamatórios em pacientes. Há, assim, uma necessidade urgente para descobrir dosagens e esquemas de doses apropriadas destes compostos, e para desenvolver formulações, preferencialmente, formulações intravenosas, que geram níveis sanguíneos estáveis, terapeuticamente efetivos das formulações de anticorpo por um período de tempo estendido em uma forma estável e conveniente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona uma fórmula tal como definido nas reivindicações em anexo.
Aqui é descrita a identificação de um açúcar não redutor e, pelo menos um aminoácido, como excipientes uteis para formular formulações de anticorpo anti-a4p7 cuja instabilidade os torna susceptíveis a deamidação, oxidação, isomerização e/ou agregação. A formulação melhora a estabilidade, reduz a formação de agregados e retarda a degradação do anticorpo na mesma.
Assim, em um primeiro aspeto, a invenção refere-se a uma formulação compreendendo uma mistura de um açúcar não redutor, anticorpo anti-a4p7, e pelo menos um aminoácido livre e a razão molar de açúcar não redutor para anticorpo anti-cx4p7 (mol:mol) é maior do que 600:1. A formulação pode ser uma formulação líquida ou uma formulação seca (por exemplo, liofilizada). A formulação pode ainda conter um agente tamponante. Em algumas formas de realização aqui descritas, o açúcar não redutor é manitol, sorbitol, sacarose, trealose, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas formas de realização aqui descritas, o aminoácido livre da formulação é histidina, alanina, arginina, glicina, ácido glutâmico, ou qualquer combinação dos mesmos. A formulação pode compreender entre cerca de 50 mM a cerca de 175 mM do aminoácido livre. A formulação aqui descrita pode compreender entre cerca de 100 mM e cerca de 175 mM do aminoácido livre. A razão molar de aminoácido livre para razão molar de anticorpo ser pelo menos 250:1. A formulação aqui descrita pode ainda conter um surfactante. O surfactante pode ser polissorbato 20, polissorbato 80, um poloxâmero, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em alguns aspectos, a formulação pode minimizar imunogenicidade do anticorpo anti-a4p7. A formulação, por exemplo, no estado secado, pode ser estável por pelo menos três meses a 40°C, 75% de humidade relativa (RH) .
Em outra formulação aqui descrita, a mesma é liofilizada e compreende pelo menos cerca de 5% a cerca de 10% anticorpo anti-a4p7 antes da liofilização. A formulação pode conter pelo menos cerca de 6% de anticorpo 3η^-α4β7 antes da liofilização. A formulação pode ser reconstituída a partir de uma formulação liofilizada (por exemplo, reconstituída para compreender uma formulação liquida estável).
Em outra formulação aqui descrita, uma formulação estável compreende uma mistura de um açúcar não redutor, um anticorpo anti-a4p7 e pelo menos um aminoácido livre, e a razão molar de açúcar não redutor para anticorpo anti-a4p7 (mol:mol) é maior do que 600:1 e a proporção de aminoácido livre para anticorpo anti-a4p7 (mol:mol) é maior do que 250:1.
Em outro aspeto aqui descrito, a invenção refere-se a uma formulação líquida estável compreendendo em solução aquosa com um açúcar não redutor, um anticorpo 3η^-α4β7 e pelo menos um aminoácido livre, em que a razão molar de açúcar não redutor para anticorpo anti-c^7 (mol:mol) é maior do que 600:1. Ainda em outro aspeto aqui descrito, a invenção refere-se a uma formulação líquida compreendendo pelo menos cerca de 40 mg/ml a cerca de 80 mg/ml anticorpo anti-a4p7, pelo menos cerca de 50-175 mM de um ou mais aminoácidos, e pelo menos cerca de 6% a pelo menos cerca de 10% (p/v) de açúcar. A formulação líquida pode ainda conter um agente tamponante. Em algumas formas de realização a formulação líquida ainda compreende um quelante metal. Em algumas formas de realização, a formulação líquida ainda compreende um antioxidante.
Em outra formulação aqui descrita, uma formulação líquida compreende pelo menos cerca de 60 mg/ml anticorpo anti-a4p7, pelo menos cerca de 10% (p/v) açúcar não redutor, e pelo menos cerca de 125 mM de um ou mais aminoácidos livres.
Em outra formulação aqui descrita, a formulação compreende pelo menos cerca de 60 mg/ml anticorpo 3η^-α4β7, pelo menos cerca de 10% (p/v) açúcar não redutor, e pelo menos cerca de 175 mM de um ou mais aminoácidos livres
Ainda em outra formulação aqui descrita, a formulação seca, por exemplo, liofilizada compreende uma mistura de um açúcar não redutor, um anticorpo 3η^-α4β7, histidina, arginina, e polissorbato 80, em que a formulação está na forma sólida, e a razão molar de açúcar não redutor para anticorpo anti-α4β7 (mol:mol) é maior do que 600:1.
Ainda em outra formulação aqui descrita, a formulação liofilizada compreende uma mistura de um açúcar não redutor, um anticorpo 3η^-α4β7, histidina, arginina, e polissorbato 80. Neste aspeto, a razão molar de açúcar não redutor para anticorpo anti-0í4p7 (mol:mol) é maior do que 600 :1. Alémdisso, a razão molar de arginina para anticorpo anti-a4p7 (mol:mol) na formulação é maior do que 250:1.
Um método para preparar uma formulação descrita aqui, compreende manter a temperatura do produto abaixo da temperatura de colapso durante a secagem primária. O método pode ainda conter uma etapa de anelamento.
Um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória aqui descrita, em que o método compreende as etapas de administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma contendo especificidade para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma região de ligação ao antigénio de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma é administrado ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) uma dose inicial de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa; (b) seguida por uma segunda dose subsequente de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa em cerca de duas semanas após a dose inicial; (c) seguida por uma terceira dose subsequente de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa em cerca de seis semanas após a dose inicial; (d) seguida por uma quarta dose subsequente de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa a cada quatro semanas após a terceira dose subsequente de anticorpo humanizado, conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e/ou remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antigénio compreendendo três regiões determinantes de complementaridade {CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida abaixo: cadeia leve: CDRl SEQ ID NO: 9, CDR2 SEQ ID NO: 10, CDR3 SEQ ID NO:11; cadeia pesada: CDRl SEQ ID NO:12, CDR2 SEQ ID NO:13, CDR3 SEQ ID NO:14.
Um regime de dosagem para o tratamento terapêutico da doença intestinal inflamatória é aqui descrito, em que o regime de dosagem compreende a etapa de: administrar à um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma contendo especificidade para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio compreendem uma região de ligação ao antigénio de origem não humana e pelo menos uma porção de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) uma dose inicial de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa; (b) seguida por uma segunda dose subsequente de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa em cerca de duas semanas após a dose inicial; (c) seguida por uma terceira dose subsequente de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa em cerca de seis semanas após a dose inicial; (d) seguida por uma quarta e subsequente doses de 300 mg da imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma como uma infusão intravenosa a cada quatro semanas ou a cada oito semanas apos a terceira dose subsequente do anticorpo humanizado, conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clinica e/ou remissão clinica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antigénio tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antigénio compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDRl, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDRl SEQ ID NO: 9, CDR2 SEQ ID NO: 10, CDR3 SEQ ID NO:11; cadeia pesada: CDRl SEQ ID NO:12, CDR2 SEQ ID NO:13, CDR3 SEQ ID NO:14.
Em um método de tratamento com a formulação de anticorpo 3η^-α4β7, a dose ou o regime de dosagem podem minimizar a imunogenicidade do anticorpo 3η^-α4β7. 0 paciente pode ter tido uma ausência de resposta adequada com, perda de resposta a ou foi intolerante ao tratamento com pelo menos um de um imunomodulador, um antagonista de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) ou combinações dos mesmos. A doença intestinal inflamatória pode ser uma doença de Crohn ou colite ulcerativa. A doença intestinal inflamatória pode ser moderada para colite ulcerativa gravemente ativa. 0 regime de dosagem pode resultar em cura de mucosa em pacientes que sofrem de colite ulcerativa moderada a gravemente ativa. 0 paciente pode ter recebido tratamento anteriormente com pelo menos um corticosteroide para a doença intestinal inflamatória. 0 regime de dosagem pode resultar em uma redução, eliminação ou redução e eliminação de uso de corticosteroide pelo paciente. A imunoglobulina humanizada aqui descrita ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma pode ser administrada em uma forma de dosagem final em uma concentração de entre cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml. A imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma pode ser administrada em uma forma de dosagem final de cerca de 1,2 mg/ml. A imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antigénio pode ser administrada ao paciente em cerca de 30 minutos. A imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma é reconstituída a partir de uma formulação liofilizada. A imunoglobulina imunizada ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma pode ser reconstituída para compreender uma formulação líquida estável.
Em alguns aspectos, o regime de dosagem não altera a razão de CD4 para CD8 no fluido cérebro-espinhal de pacientes recebendo o dito tratamento. 0 paciente pode ser uma pessoa de 65 anos de idade ou mais velho e não requer qualquer ajuste do regime de dose.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma ilustração de uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID N0:1) que codifica a cadeia pesada de uma imunoglobulina anti-oí4p7 humanizada, e a sequência de aminoácido deduzida da cadeia pesada (SEQ ID NO:2) . A sequência de nucleotídeo contém sítios de clonagem (caixa baixa), sequência de Kozak (caixa alta, nucleotideos 18-23 de SEQ ID NO:l) e sequência lider (caixa baixa, nucleotideos 24-86 de SEQ idnq:1) na extremidade 5' da cadeia pesada. A região de leitura aberta da sequência de nucleotideo são nucleotideos 24-1433 de SEQ ID N0:1. A FIG. 2 é uma ilustração de uma sequência de nucleotideo (SEQ ID NO:3) que codifica a cadeia leve de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como vedolizumabe, e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO: 4) da cadeia leve. A sequência de nucleotideo contém sítios de clonagem (caixa baixa), sequência Kozak (caixa alta, nucleotideos 18-23 da SEQ ID NO:3) e sequência líder (caixa baixa, nucleotideos 24-80 da SEQ ID NO:3) na extremidade 5' da cadeia pesada. A região de leitura aberta da sequência de nucleotideo são nucleotideos 24-737 da SEQ ID N0:3. A FIG. 3 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de (A) a cadeia leve humanizada madura (aminoácidos 20-238 da SEQ ID NO:4) de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como vedolizumabe e (B) a cadeia leve humanizada madura de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como LDP-02 (SEQ ID NO:5) . (Com relação a LDP-02, ver, WO 98/06248 e Feagan et al., N. Eng. J. Med. 352:2499-2507 (2005)). Feagan et al. descreve um estudo clínico de LDP-02, mas no artigo referem-se a LDP-02 como MLN02.) 0 alinhamento ilustra que as sequências de aminoácido das cadeias leves de vedolizumabe e LDP-02 diferem em posições 114 e 115 das cadeias leves maduras. A FIG. 4 é um alinhamento de sequências de aminoácidos de (A) uma região constante de cadeia leve capa humana genérica (SEQ ID NO: 6) e (B) uma região constante de cadeia leve capa murina genérica (SEQ ID NO:7) . Os resíduos de aminoácido Thr e Vai (que estão presentes nas posições 114 e 115 da cadeia leve vedolizumabe madura (aminoácidos 133 e 134 da SEQ ID NO:4)) estão presentes na região constante da cadeia leve capa humana, enquanto que os resíduos de aminoácido Ala e Asp (que estão presentes nas posições 114 e 115 da cadeia leve LDP-02 madura (SEQ ID N0:5)) estão presentes na região constante da cadeia leve capa de camundongo. A FIG. 5 é um mapa de vetor pLKTOK38D (ainda referenciado como pT0K38MLN02-TV), que codifica a cadeia pesada humanizada e a cadeia leve humanizada de MLN02, e é apropriado para produzir em células CHO. (Ver, publicação de pedido de patente US 2004/0033561 AI que revela pLKTOK38. pLKTOK38D é uma variante de pLKTOK38 em que os sítios de restrição no mapa flanqueiam a sequência que codifica a região variável de cadeia leve.) A FIG. 6 A mostra os modelos preditivos para alteração no percentual de monómero, alteração em agregado percentual e alteração em percentual de isoforma principal da formulação anti-oí4p7 liofilizado. Os modelos são baseados em análises estatisticas dos dados apresentados no Exemplo 1. A linha central mostra os resultados de modelos preditivos e as linhas externas mostram limite de confiança de 95% para modelos preditivos. A FIG. 6B mostra modelos alternativos baseado na análise estatística de dados de 40°C das Tabelas 1-3 quando os fatores de entrada são pH, razão molar açúcar :proteína, e razão molar arginina:proteína. A linha central mostra os resultados de modelos preditivos e as linhas externas mostram limite de confiança de 95% para modelos preditivos. A FIG. 7 mostra as sequências de aminoácido de (A) região variável de cadeia leve capa de anticorpo GM607'CL maduro humano e (B) região variável de cadeia pesada de 21/28'CL humana. A FIG. 8 é um gráfico que mostra que sólidos e carga afetam tempo de secagem (os números nas linhas representam o número de minutos de tempo de secagem). A FIG 9 é um gráfico que mostra vedolizumabe não atrasou o inicio de sintomas clínicas de encefalomielite autoimune experimental (EAE) em comparação ao controle placebo. Natalizumabe significativamente (p<0,05) atrasou o início de sintomas clínicos de EAE em comparação com controle placebo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se às formulações compreendendo anticorpos anti-a4p7. As formulações estão definidas nas reivindicações em anexo
Definições 0 termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que contém um anticorpo anti-a4p7 de tal forma como permite que a atividade biológica seja efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação poderia ser administrada.
Uma formulação "estável" é uma na qual o anticorpo nesta substancialmente retém sua estabilidade física e/ou sua estabilidade química e/ou sua atividade biológica no armazenamento. Em um aspeto, a formulação substancialmente retém sua estabilidade física e química, bem como sua atividade biológica no armazenamento. 0 período de armazenamento é geralmente selecionado com base na vida útil da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteína estão disponíveis na técnica e são revisadas, em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo.
Um anticorpo monoclonal "deamidado" é urn em que urn ou mais resíduos de asparagine ou glutamina do mesmo foi derivado, por exemplo, a um ácido aspártico ou um ácido isoaspártico.
Um anticorpo que é "suscetível a deamidação" é um compreendendo um ou mais resíduos que demonstraram ser tendentes a deamidar.
Um anticorpo que é "suscetível a oxidação" é um anticorpo compreendendo um ou mais resíduos que demonstraram ser tendentes à oxidação.
Um anticorpo que é "suscetível à agregação" é um que demonstrou agregar com outras moléculas de anticorpo, especialmente no congelamento, aquecimento, secagem, reconstituição e/ou agitação.
Um anticorpo que é "suscetível a fragmentação" é um que demonstrou ser clivado em dois ou mais fragmentos, por exemplo, em uma região em dobradiça do mesmo.
Por "reduzir deamidação, oxidação, agregação, ou fragmentação" pretende significar prevenir ou reduzir (por exemplo, a 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de) a quantidade de deamidação, agregação, ou fragmentação em relação ao anticorpo monoclonal formulado em um diferente pH ou em um diferente tampão.
Um "agregado", "agregado SEC", ou "agregado solúvel" é mais do que um e menos do que ou igual a dez proteínas de anticorpo e/ou fragmentos associados juntos ou por interações covalentes, iônicas ou hidrofóbicas para formar um corpo proteico maior.
Um "agregado insolúvel" ou "partícula" é maior do que dez proteínas de anticorpo e/ou fragmentos associados ou por interações covalentes, iônicas ou hidrofóbicas para formar um corpo proteico maior.
Como usado aqui, "atividade biológica" de um anticorpo monoclonal refere-se à capacidade do anticorpo em se ligar ao antigénio e resulta em uma resposta biológica mensurável que pode ser medido in vitro ou in vivo. Dita atividade pode ser antagonista ou agonista. A molécula de superfície celular, "α4β7 integrina," ou "α4β7," é um heterodímero de uma cadeia ot4 (CD49D, ITGA4) e uma cadeia β7 (ITGB7). Cada cadeia pode formar um heterodímero com uma cadeia de integrina alternativa, para formar α4βι ou ακβ?. Genes humanos ou e β7 (GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) RefSeq números de acessão NM_000885 e NM_000889, respectivamente) são expressos por linfócitos B e T, particularmente linfócitos de memória CD4+. Típico de muitas integrinas, α4β7 pode existir em um estado de repouso ou ativado. Ligantes para α4β7 incluem molécula de adesão celular vascular (VCAM), fibronectina e adressina de mucosa (MAdCAM, por exemplo, MAdCAM-1).
Como usado aqui, uma imunoglobulina humana ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo que tem "especificidade de ligação para o complexo α4β7" se liga ao α4β7, mas não ao α4β1 ou aEB7.
Como usado aqui, uma formulação "isotônica" tem substancialmente a mesma pressão osmótica que sangue humano. As formulações isotônicas irão geralmente ter uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando uma pressão de vapor ou osmômetro tipo congelamento, por exemplo.
Como usado aqui, "agente tamponante" se refere a um tampão que resiste a mudanças em pH pela ação de seus componentes conjugados ácido-base. O agente tamponante pode estar presente em uma formulação líquida ou sólida da invenção. 0 agente tamponante ajusta o pH da formulação para cerca de 5,0 a cerca de 7,5, para cerca de 5,5 a cerca de 7,5, para cerca de 6,0 a cerca de 6,5, ou para um pH de cerca de 6,3. Em um aspeto, exemplos de agentes de tamponamento que controlarão o pH na faixa de 5,0 a 7,5 incluem acetato, succinato, gluconato, histidina, citrato, fosfato, maleato, cacodilato, ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico (MES), bis(2-hidroxietil)iminotris[hidroximetil]metano (Bis-Tris), ácido N-[2-acetamido]-2-iminodiacético (ADA), glicilglicinae outros tampões de ácidos orgânicos. Em outro aspeto, o agente tamponante aqui é histidina ou citrato.
Um "tampão histidina" é um tampão compreendendo iões de histidina. Exemplos de tampões de histidina incluem soluções de cloreto de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina. O tampão de histidina ou tampão histidina-HCl tem um pH entre cerca de pH 5,5 a 6,5, entre cerca de pH 6,1 a cerca de 6,5, ou cerca de pH 6,3.
Um "sacarideo" aqui é um composto que tem uma fórmula geral (CH2O)n e derivados dos mesmos, incluindo monossacarídeos, dissacarideos, trissacarideos, polissacarídeos, álcoois de açúcar, açúcares redutores, açúcares não redutores, e semelhantes. Em um aspeto, exemplos de sacarideos aqui incluem glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, rafinose, manotriose, estaquiose, maltose, lactulose, maltulose, glucitol, maltitol, lactitol, isomaltulose, e semelhantes. Um sacarideo pode ser um lioprotetor. Em outro aspeto, o sacarideo aqui é um dissacarideo não redutor, como sacarose.
Um "surfactante" aqui refere-se a um agente que reduz a tensão superficial de um liquido. O surfactante pode ser um surfactante não iônico. Em um aspeto exemplos de surfactantes aqui incluem polissorbato (polioxietileno sorbitano monolaurato, por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80) ,-TRITON (t-Octilfenoxipolietoxietanol, detergente não iônico, Union Carbide subsidiária de Dow Chemical Co., Midland MI); dodecil sulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; glicosídeo octil de sódio; laurel-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, ou cetil-betaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-betaina (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-dimetilamina; cocoil metil de sódio, ou oleil-taurato metil dissódico; sorbitano monopalmitato; e a série MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietil glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), e copolimeros de polixietileno e polixipropilene glicol (por exemplo, Pluronics/Polixamer, PF68 etc); etc. Em outro aspeto, o surfactante é polissorbato 80. O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre os anticorpos monoclonais completos, imunoglobulinas, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos de comprimento completo, por exemplo, cada um em um diferente antigénio ou epitopo, e fragmentos de ligação ao antigénio individual, incluindo dAbs, scFv, Fab, F(ab)'2, Fab', incluindo anticorpos humanos e humanizados de espécies não humanas e formas de ligação ao antigénio recombinante como monobodies e diabodies.
Quantidades e razões molares de anticorpo anti-a4p7 para outros excipientes aqui descritos são calculadas assumindo um peso molécula aproximado de cerca de 150.000 daltons para o anticorpo. 0 peso molecular real do anticorpo pode diferir de 150.000 daltons, dependendo da composição de aminoácido ou modificação pós-tradução, por exemplo, como dependente da linhagem de célula usada para expressar o anticorpo. O peso molecular real do anticorpo pode ser +/- 5% de 150.000 daltons. 0 termo "anticorpo humano" inclui um anticorpo que possui uma sequência que é derivada de uma sequência de imunoglobulina germinativa humana, como um anticorpo derivado de camundongos transgênicos contendo genes de imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos XENOMOUSE geneticamente modificados (Abgenix, Fremont, CA) , HUMAB-MOUSE ®, camundongos transcromossômicos KIRIN TC MOUSE™, KMMOUSE® (MEDAREX, Princeton, NJ) ) , bibliotecas de phage display humanos, células de Mieloma humanas, ou células B humanas. 0 termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis variantes que podem surgir durante a produção de anticorpo monoclonal, ditas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antigénio. O modificador "monoclonal" indica a características do anticorpo sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. , Nature, 256: 495 (1975), ou pode ser preparado por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem ainda ser isolados de bibliotecas de anticorpo phage usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. , 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos "quiméricos" em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular ou, enquanto o restante das cadeias é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de ditos anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo sequências de ligação ao antigénio de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, Ape etc) e sequências de região constante humanas. "Fragmentos de ligação ao antigénio" de uma imunoglobulina humanizada preparados na formulação da invenção compreende pelo menos as regiões variáveis de cadeias pesadas e/ou leves de um anticorpo anti-a4p7. Por exemplo, um fragmento de ligação ao antigénio de vedolizumabe compreende resíduos de aminoácido 20-131 da sequência de cadeia leve humanizada de SEQ ID NO:4. Exemplos de ditos fragmentos de ligação ao antigénio incluem fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos scFv e F(ab')2 de uma imunoglobulina humanizada conhecida na técnica. Fragmentos de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina humanizada da invenção podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicas recombinantes. Por exemplo, clivagem por papaína ou pepsina pode ser usada para gerar fragmentos Fab ou F(ab')2, respectivamente. Anticorpos podem ainda ser produzidos em uma variedade de formas truncadas usando genes de anticorpo em que um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sitio de parada natural. Por exemplo, um construto recombinante que codifica a cadeia pesada de um fragmento F(ab')2 pode ser desenhado para incluir sequências de DNA que codificam o dominio CHi e região em dobradiça da cadeia pesada. Em um aspeto, fragmentos de ligação ao antigénio inibem a ligação de uma α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, a adressina MAdCAM de mucosa (por exemplo, MAdCAM-1), fibronectina). A digestão por papaina de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um sitio de ligação ao antigénio único, e um fragmento residual "Fc", cujo nome reflete sua capacidade de prontamente cristalizar. 0 tratamento com pepsina gera um fragmento F (ab') 2 que tem dois sítios de ligação e é ainda capaz de reticular com um antigénio. "Fv" é um fragmento de anticorpo que consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente. 0 fragmento Fab ainda contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Fragmentos Fab1 diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carbóxi do domínio de cadeia pesada CHI incluindo uma ou mais cisteínas da região em dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que os resíduos de cisteína dos domínios constantes que têm pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteinas em dobradiça entre estes. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são ainda conhecidos. "Fv de cadeia simples" ou fragmentos de anticorpo "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia única de polipeptídeo. Em um aspeto, o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de scFv ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds ., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). 0 termo "diabodies" se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio de cadeia variável (Vh) conectados a um domínio leve variável (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl) . Usando um ligante que é muito pequeno para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parearem com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação ao antigénio. Diabodies são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
Um "anticorpo completo" é aquele que compreende uma região variável de ligação ao antigénio bem como um domínio constante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes de cadeia pesada, Chi, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácido das mesmas. Em um aspeto, o anticorpo completo tem uma ou mais funções efetoras.
Um anticorpo de "sequência variante de aminoácido" aqui é um anticorpo com uma sequência de aminoácido que difere do anticorpo da espécie principal. Ordinariamente, variantes de sequência de aminoácido irão possuir pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de homologia com o anticorpo da espécie principal. As variantes de sequência de aminoácido possuem substituições, deleções, e/ou adições em certas posições dentro ou adjacentes à sequência de aminoácido do anticorpo da espécie principal, mas retêm a atividade de ligação ao antigénio. As variações na sequência das regiões constantes do anticorpo irão ter menos efeito na atividade de ligação ao antigénio do que as variações nas regiões variáveis. Nas regiões variáveis, variantes de sequência de aminoácidos serão pelo menos cerca de 90% homólogas, pelo menos cerca de 95% homólogas, pelo menos cerca de 97% homólogas, pelo menos cerca de 98% homólogas, ou pelo menos cerca de 99% homólogas com o anticorpo da espécie principal. "Homologia" é definido como o percentual de resíduos na variante de sequência de aminoácidos que são idênticos após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a homologia de percentual máximo. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica.
Um "anticorpo monoclonal terapêutico" é um anticorpo usado para terapia de um sujeito humano. Anticorpos monoclonais terapêuticos revelados aqui incluem anticorpos anti-a4f}7.
Um anticorpo de "variante de glicosilação" aqui é um anticorpo com uma ou mais frações de carboidratos ligadas a este que diferem de uma ou mais frações de carboidratos ligadas a um anticorpo da espécie principal. Exemplos de variantes de glicosilação aqui incluem anticorpo com uma estrutura de oligossacarideo G1 ou G2, ao invés de uma estrutura de oligossacarideo GO, ligado a uma região Fc do mesmo, anticorpo com uma ou duas frações de carboidratos ligados a uma ou duas cadeias das mesmas, anticorpo sem carboidrato ligado a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, etc, e combinações de alterações de glicosilação. "Funções efetoras" de anticorpo referem-se àquelas atividades de anticorpo atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação Clq; citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao recetor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores de superfície celular (por exemplo, recetor de célula B; BCR), e semelhantes.
Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos completos podem ser designados como de diferentes "classes". Há cinco classes principais de anticorpos completos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser designadas como uma de dois tipos claramente distintos, chamados capa (k) e lambda (λ) , baseados nas sequências de aminoácido de seus dominios constantes. "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se à uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizado na tabela 3 da página 4 64 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 5:457-92 (1991) . Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC In vitro, como o descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337 podem ser realizados. Células efetoras úteis para ditos ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animai como o revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Os termos "recetor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um recetor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em um aspeto, o FcR é um FcR de sequência nativa humana. Em outro aspeto, o FcR é um que se liga a um anticorpo IgG (um recetor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "recetor de ativação") e FcyRIIB (um "recetor de inibição"), que têm sequências semelhantes de aminoácidos que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. Recetor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em um imunoreceptor tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Recetor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em um imunoreceptor tirosina (ITIM) em seu dominio citoplasmático. (Ver, revisão em M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) . FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, .Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et ai., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:33-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles identificados no futuro, são incluídos pelo termo "FcR" aqui. 0 termo ainda inclui o recetor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência dos igGs maternais ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). O termo "região hipervariável" quando usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação ao antigénio. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no dominio variável de cadeia pesada; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Região estrutural" ou resíduos de "FR" são aqueles cujos resíduos de dominio variável além dos resíduos de região hipervariável são aqui definidos. A região hipervariável ou as CDRs das mesmas podem ser transferidas de uma cadeia de anticorpo a outra ou à outra proteína para conferir especificidade de ligação ao antigénio ao anticorpo resultante (compósito) ou proteína de ligação.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos {por exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo do recetor) em que os resíduos de uma região hipervariável do recetor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo do dador) como camundongo, rato, coelho ou primata não humano contendo a especificidade desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recetor ou no anticorpo do dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondente àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente ainda irá compreender pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis das mesmas que resultam em uma melhora na afinidade do anticorpo ao antigénio, em comparação a um anticorpo parente que não possui aquelas alterações. Em um aspeto, anticorpos de afinidade maduros terão afinidades nanomolar ou ainda picomolar para o antigénio alvo.
Anticorpos de afinidade madura são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et ai. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por embaralhamento de domínio VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos estruturais é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995) ; Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Em certas formas de realização, o anticorpo será purificado (1) a mais do que 95% em peso de proteína como determinado pelo método de Lowry, e alternativamente, mais do que 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador em copo giratório, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou corante de prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro da célula recombinante uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, no entanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. "Tratamento" refere-se a ambos tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que já estão doentes bem como aqueles em que a doença ou sua recorrência deve ser prevenida. Assim, o paciente a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticado como tendo a doença ou pode ser predisposto ou suscetível à doença. Os termos "paciente" e "sujeito" são usados de modo intercambiável aqui. 0 anticorpo que é formulado é substancialmente puro e desejavelmente substancialmente homogéneo (ou seja, isento de proteínas contaminantes, etc.)· Anticorpo "substancialmente puro" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% anticorpo em peso, baseado em peso total da proteína na composição, pelo menos cerca de 95% ou 97% em peso. Anticorpo "substancialmente homogéneo" significa uma composição compreendendo proteína em que pelo menos cerca de 99% em peso de proteína é anticorpo específico, por exemplo, anticorpo anti-ot4p7, baseado em peso total da proteína. "Remissão clínica" como usado aqui com referência à sujeitos com colite ulcerativa refere-se a um escore de Mayo completo de 2 ou menos pontos e nenhum subescore do indivíduo maior do que 1 ponto. "Remissão clínica" de doença de Crohn refere-se a um escore CDAI de 150 pontos ou menos.
Uma "resposta clínica" como usado aqui com referência aos sujeitos com colite ulcerativa refere-se a uma redução em escore de Mayo completo de 3 ou mais pontos e 30% do basal, (ou um escore de Mayo parcial de 2 ou mais pontos e 25% ou mais do basal, se o escore de Mayo completo não foi realizado na visita) com uma redução acompanhante no subescore de sangramento retal de 1 ou mais pontos ou escore de sangramento retal absoluto de 1 ou menos pontos. Uma "resposta clínica" como usado aqui com relação aos sujeitos com doença de Crohn refere-se à uma redução de 70 pontos ou mais no escore CDAI do basal (semana 0). "Cura da mucosa" como usado aqui com relação aos sujeitos com colite ulcerativa refere-se a um subescore endoscópico de 1 ponto ou menos.
Como usado aqui, "falha de tratamento" refere-se a uma piora da doença, uma necessidade para medicações de resgate ou intervenção cirúrgica para tratamento de colite ulcerativa ou doença de Crohn. Uma medicação de resgate é qualquer novo medicamento ou qualquer aumento na dose de um medicamento basal requerida para tratar sintomas novas ou não resolvidos de colite ulcerativa ou doença de Crohn (além de antidiarreicos ou diarreia crónica).
Formulações
Como descrito aqui, foi descoberto que anticorpos anti-a4|}7 são altamente estáveis quando em uma formulação seca, por exemplo, liofilizada com excesso (em uma base molar) de açúcar não redutor. Em particular, as formulações liofilizadas em que a proporção de açúcar não redutor para anticorpo anti- α4β7 (mol:mol) é maior do que 600:1 são mostradas aqui sendo estáveis por pelo menos 2 anos. A presente invenção proporciona, em um primeiro aspeto, uma formulação tal como o definido nas reivindicações em anexo.
Se desejado, a formulação pode ainda compreender um quelante metal e/ou um antioxidante, bem como outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Quelantes de metal apropriados incluem, por exemplo, metilamina, etilenodiamina, desferoxamina, trientina, histidina, malato, compostos fosfonatos, por exemplo, ácido etidrônico, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), etilenoglicoltetraacético (EGTA) , e semelhantes. Antioxidantes apropriados incluem, por exemplo, ácido cítrico, ácido úrico, ácido ascórbico, ácido lipoico, glutationa, tocoferol, caroteno, licopeno, cisteína e semelhantes.
As formulações líquidas podem ser soluções ou suspensões aquosas, preparadas em um solvente aquoso apropriado, como água ou uma mistura aquosa/orgânica, como misturas de álcool e água. As formulações líquidas podem ter um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5, entre cerca de 6,0 e cerca de 7.0, ou entre cerca de 6,0 e cerca de 6,5, tal como cerca de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ou 6, 5 . As formulações liquidas podem ser refrigeradas (por exemplo, 2-8°C) , ou congeladas (por exemplo, a -20°C ou -80°C) para armazenamento. Formulações sólidas podem ser preparadas de qualquer modo apropriado e pode estar na forma de uma torta ou pó, por exemplo. A formulação sólida é preparada por secagem de uma formulação liquida como descrito aqui, por exemplo, por liofilização, secagem por spray, secagem por ar em uma pelicula (por exemplo, para libertação transdérmica) , misturando em uma emulsão de lipídeo e secagem como esferas para libertação oral ou filme para libertação transdérmica. Quando a formulação é uma formulação sólida, a formulação pode ter um teor de humidade de não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 4,5%, não mais do que cerca de 4%, não mais do que cerca de 3,5%, não mais do que cerca de 3%, não mais do que cerca de 2,5%, não mais do que cerca de 2%, não mais do que cerca de 1,5%, não mais do que cerca de 1%, ou é substancialmente anidra. Formulações sólidas podem ser dissolvidas, ou seja, reconstituídas, em um meio apropriado ou solvente para se tornar um líquido apropriado para administração. Solventes apropriados para reconstituição da formulação sólida incluem água, salina isotônica, tampão, por exemplo, salina tampão fosfato, solução de Ringer (lactato ou dextrose), meio essencial mínimo, soluções de álcool/aquosas, solução de dextrose, etc. A quantidade de solvente pode resultar em uma concentração de proteína terapêutica maior, igual ou inferior à concentração antes da secagem. Em um aspeto, a concentração de anticorpo anti-a4p7 reconstituída é a mesma concentração que na formulação líquida pré-secagem. A formulação pode ser estéril, e isto pode ser obtido de acordo com os procedimentos conhecidos aos especialistas para gerar as formulações farmacêuticas apropriadas para administração ao sujeitos humanos, antes, ou após a preparação da formulação. A formulação pode ser esterilizada como um liquido, por exemplo, antes da secagem e/ou após a reconstituição por filtração por poros pequenos, por processamento asséptico ou por exposição à radiação ultravioleta. Tamanhos de poro do filtro podem ser 0,1 pm ou 0,2 pm para filtrar micro-organismos ou 10 a 20 nm para filtrar partículas virais. Alternativamente, ou adicionalmente, a formulação seca pode ser esterilizada, por exemplo, por exposição à radiação gama. Em um aspeto, a formulação líquida de anticorpo anti-o^7 é esterilizada por filtração antes de secagem. A formulação aqui descrita é estável no armazenamento. A formulação aqui descrita é estável no armazenamento no estado seco. A estabilidade pode ser testada por avaliação da estabilidade física, estabilidade química, e/ou atividade biológica do anticorpo na formulação em torno do tempo de formulação bem como após o armazenamento das temperaturas notadas. Estabilidade física e/ou química de uma formulação líquida ou um pó seco reconstituído pode ser avaliado qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de formas diferentes (ver, por exemplo, Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development, Rodriguez-Diaz et al. eds. Informa Healthcare (2005)), incluindo avaliação de formação de agregado (por exemplo, usando cromatografia por exclusão de tamanho (ou filtração em gel) (SEC), espectrometria de massa de tempo de voo em ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) , ultracentrifugação analítica, espalhamento de luz (espectroscopia por correlação por fóton, espalhamento de luz dinâmica (DLS), espalhamento de luz por laser em multi-ângulo (MALLS)), imageamento microscópico baseado em fluxo, impedância eletrónica (coulter), obscurecimento de luz ou outro sistema de contagem de partícula líquida, ao medir a turbidez, por centrifugação de gradiente densidade e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade de carga usando cromatografia de troca catiônica (ver ainda Vlasak and Ionescu, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468-481 (2008) e Harris et al. J. Chromatogr. B Biomed. Sei. Ãppl. 752:233-245 (2001)), focagem isoelétrica (IEF), por exemplo técnica capilar (cIEF), ou eletroforese de zona capilar, análise de sequência amino terminal ou carbóxi terminal; análise de espectrometria de massa, SDS-PAGE ou análise SEC para comparar anticorpo fragmentado, intacto e multimérico (ou seja, dimérico, trimérico, etc.); mapa de peptídeo (por exemplo, tríptico ou LYS e semelhantes); avaliando atividade biológica ou função de ligação ao antigénio do anticorpo; e semelhantes. Atividade biológica ou função de ligação ao antigénio, por exemplo, ligação do anticorpo anti-oí4p7 ao MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) ou inibição de ligação de uma célula que expressa α4β7 integrina ao MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), por exemplo, MAdCAM imobilizada (por exemplo, MAdCAM-1), pode ser avaliada usando várias técnicas disponíveis ao praticante especialista (ver, por exemplo, Soler et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 330:864-875 (2009)). A estabilidade de uma formulação no estado sólido pode ainda ser avaliada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de formas, incluindo testes diretos, como identificação de estrutura de cristal por Difração em Pó de Raio X (XRPD) ; avaliação da estrutura do anticorpo no estado sólido usando Espectroscopia de Infravermelho em Transformada de Fourier (FTIR); e medição de transições térmicas no sólido liofilizado (fusão, transição vítrea, etc.) usando Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC, por exemplo, para avaliar a desnaturação) e testes indiretos como medição do teor de humidade por teste de Karl Fisher, por exemplo, para extrapolar a possibilidade de instabilidade química através de hidrólise. A medição do teor de humidade de uma formulação seca pode indicar como provavelmente uma formulação sofrerá degradação química ou física, com humidade mais alta levando a mais degradação. A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Em um aspeto, uma formulação seca (por exemplo, liofilizada) é estável em cerca de 40°C, 75% RH por pelo menos cerca de 2-4 semanas, pelo menos cerca de 2 meses, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, ou pelo menos cerca de 18 meses. Em outro aspeto, a formulação (líquida ou seca (por exemplo, liofilizada)) é estável em cerca de 5'C e/ou 25*C e 60% RH por pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses, pelo menos cerca de 24 meses, pelo menos cerca de 30 meses, pelo menos cerca de 36 meses, ou pelo menos cerca de 48 meses. Em outro aspeto, a formulação (líquida ou seca (por exemplo, liofilizada)) é estável em cerca de -20°C por pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses, pelo menos cerca de 24 meses, pelo menos cerca de 30 meses, pelo menos cerca de 36 meses, pelo menos cerca de 42 meses, ou pelo menos cerca de 48 meses. Além disso, a formulação líquida pode, em algumas formas de realização, ser estável após congelamento (a, por exemplo, -80*C) e descongelamento, como, por exemplo, após 1, 2 ou 3 ciclos de congelamento e descongelamento. A instabilidade pode envolver qualquer uma ou mais de: agregação (por exemplo, agregação solúvel não covalente (causada por interações hidrofóbicas ou de carga), agregação solúvel covalente (por exemplo, rearranjo/embaralhamento de ligação dissulfeto), agregação insolúvel (causa por desnaturação da proteina nas interfaces de liquido/ar e líquido/sólido)), deamidação (por exemplo deamidação Asn), oxidação (por exemplo oxidação Met) , isomerização (por exemplo isomerização Asp), desnaturação, corte/hidrólise/fragmentação (por exemplo fragmentação em região em dobradiça), formação de succinimida, extensão N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, e semelhantes.
Uma formulação estável pode contribuir para uma baixa imunogenicidade de um anticorpo anti-a4p7. Um anticorpo anti-α4β7 imunogênico pode levar a uma resposta d anticorpo humano-anti-humano (HAHA) em sujeitos ou pacientes humanos. Os pacientes que desenvolvem uma resposta HAHA a um anticorpo anti-a4p7 podem ter eventos adversos (por exemplo, reação no local da infusão) no tratamento ou podem eliminar anticorpo anti-oí4β7 rapidamente, resultando em uma dose menor do que a planejada pelo tratamento. Um relato (Feagen et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352 :2499-2507) de estudo precoce de um tratamento com anticorpo 3η^-α4β7 indicou que anticorpos anti-humanos se desenvolveram pela semana 8 em 44% dos pacientes tratados. O anticorpo neste estudo foi armazenado como um líquido e não continha qualquer polissorbato.
Em algumas formas de realização, a formulação pode aumentar a proporção de pacientes negativos para HAHA em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos pacientes em comparação com os resultados HAHA de uma formulação menos estável.
Em algumas formas de realização, uma formulação de anticorpo 3η^-α4β7 tem > 50% de isoforma principal carregada, > 55% de isoforma principal carregada, ou 65 a 70% de isoforma principal carregada. Em outros aspectos, uma formulação estável de anticorpo anti-oí437 tem £ 45% de isoformas carregadas ácidas, < 40% de isoformas carregadas ácidas, £ 30% de isoformas carregadas ácidas ou 22 a 28% de isoformas ácidas. Ainda em outros aspectos, uma formulação estável de anticorpo anti-a4p7 tem < 25% de isoformas básicas, £ 20% de isoformas básicas, £ 15% de isoformas básicas, cerca de 5% de isoformas básicas ou cerca de 10% de isoformas básicas. Em um aspeto, uma formulação estável de anticorpo 3η1ί-α4β7 tem > 55% de isoforma principal, £ 30% de isoformas ácidas e/ou £ 20% de isoformas básicas, por exemplo, como determinado por CEX. Em outro aspeto, uma formulação estável de anticorpo anti-o¢4β7 tem >50% de isoforma principal, £45 % de isoformas ácidas e/ou <10% de isoformas básicas, por exemplo, como determinado por cIEF.
Em alguns aspectos, uma formulação sólida, seca de anticorpo 3η^-0ί4β7 tem £10% teor de humidade, £5% teor de humidade ou <2,5% teor de humidade. 0 tempo requerido para reconstituição é £60 minutos, £50 minutos ou £40 minutos ou £30 minutos ou £20 minutos.
Teor monomérico e/ou teor de agregado (por exemplo, como dimeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, oligômeros e agregados de ordem maior), ou seja, na formulação liquida, ou em uma formulação seca após reconstituição, pode ser medido por SEC, MALDI-TOF MS, ultracentrifugação analítica, espalhamento de luz (DLS ou MALLS), ou medição em nanoescala, como análise de rastreamento de nanopartícula NT A, NanoSight Ltd, Wiltshire, UK) . Resolução, caracterização e quantificação de agregado podem ser obtidas em um número de formas, incluindo aumentar o comprimento da separação em coluna SEC, por exemplo, por uma coluna maior ou por ligação serial de uma segunda ou mais colunas SEC em linha com a coluna SEC analítica inicial, quantificação de SEC complementar de monômeros com dispersão de luz, ou usando NTA.
Em uma modalidade, uma formulação de anticorpo anti-a4p7 tem > 90% de anticorpo monomérico, >95% de anticorpo monomérico, ou 97 a 99% de anticorpo monomérico. Em outra modalidade, a maior parte do material em uma formulação de anticorpo anti-cx4p7 tem um raio médio de ^ 20 nm, ^ 15 nm, ^ 10 nm, ou cerca de 5 a cerca de 7 nm. Em um aspeto, uma formulação de anticorpo anti-a4p7 tem > 80% de quantidade de cadeia pesada mais leve por análise de proteína. Em um aspeto, há > 90% de cadeia pesada mais leve. Em outro aspeto, uma formulação de anticorpo anti-a4p7 tem < 10% de agregado, ^ 5% de agregado, £ 2,5% de agregado, ^ 1,5% de agregado, £ 1,0% de agregado ou ^ 0,5% de agregado. Em outro aspeto, a formulação estável de anticorpo anti-a4p7 tem > 96% de monómero e/ou ^ 2,5% de agregado. Ainda em outro aspeto, uma formulação estável de anticorpo anti-ot4p7 tem cerca de 99% de monómero e/ou cerca de < 1% de agregado.
Tamanhos de partículas, por exemplo, de agregados ou excipiente não dissolvido, ou seja, na formulação reconstituída podem ser medidos por obscurecimento (por exemplo, sistema de contagem de partícula líquida (HIAC) por Hach Ultra Analytics (Grants Pass, OR)), microscopia, contador coulter, ou digital (por exemplo, baseado em fluxo) sistema baseado em imagem microscópica como imagem microfluídico (MFI) por Brightwell (Ottawa, CA) ou analisador de partícula por imagem FLOWCAM® por Fluid Imaging Technologies (Yarmouth, ME) . Em um aspeto, tamanho de partícula em uma preparação de anticorpo anti-a4p7 é cerca de 30 pm, cerca de 25 pm, cerca de 10 pm, cerca de 5 pm, cerca de 2 pm ou 1 pm ou menos. A quantidade de partículas deve ser minimizada em formulações de anticorpo. Em um aspeto, a formulação de anticorpo anti-a4p7 tem menos do que < 6000 partículas > 10 pm e/ou menos do que 600 partículas > 25 pm em uma dose (U.S. Pharmacopoeia Chp. 788, método de contagem por obscurecimento; metade daquelas quantidades por método de quantificação microscópica) . Ainda em outro aspeto, uma quantidade de partículas por mililitro, por exemplo, por medição MFI, em uma dose de uma formulação de anticorpo anti-ot4p7, por exemplo, formulação reconstituída é cerca de 500 a cerca de 2000 ou cerca de 1000 a cerca de 3000 de partículas de 2-10 pm por ml, cerca de 50 a cerca de 350 de partículas £10 pm por ml e cerca de 0 a cerca de 50 de partículas > 25 pm por ml.
Em uma modalidade, uma formulação de anticorpo 3ηίί-α4β7 tem uma afinidade de ligação de cerca de 60% a cerca de 140% do anticorpo padrão de referência anti-a4p7. Em um aspeto, um anticorpo anti-a4p7 em uma formulação descrita aqui se liga a α4β7, por exemplo, em uma célula {WO98/06248 ou patente US 7.147.851) , em um valor de cerca de 80% a cerca de 120% do padrão de referência. Em outra modalidade, uma formulação de anticorpo anti-oí4p7 tem a capacidade de inibir pelo menos 50%, ou pelo menos 60% da ligação de uma célula que expressa α4β7 integrina a MAdCAM, por exemplo, MAdCAM-1, a MAdCAM-Ig quimera (ver publicação de pedido de patente US 20070122404, ainda para exemplos de padrão de referência).
Como notado acima, congelamento da formulação é especificamente contemplado aqui. Assim, a formulação pode ser testada para estabilidade no congelamento e descongelamento. Assim, o anticorpo em uma formulação líquida pode ser estável no congelamento e descongelamento da formulação, por exemplo, o anticorpo pode ser estável após um, dois, três, quatro, cinco ou mais ciclos de congelamento/descongelamento.
Um ou mais carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis como os descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition,
Hendrickson, R. Ed. (2005) podem ser incluídos na formulação fornecida contanto que não afetam adversamente as características desejadas da formulação. Carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregues e incluem; agentes de tamponamento adicionais; cossolventes; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes como EDTA; complexos de metais (por exemplo, complexos de proteína Zn) ; polímeros biodegradáveis como poliésteres; preservativos; e/ou contraíons formadores de sal como sódio.
Anticorpos α4β7
Anticorpos anti-a4(37 descritos na presente incluem anticorpos de qualquer fonte desejada, como anticorpos completamente humanos, anticorpos murinos, anticorpos de coelho e semelhantes, e quaisquer anticorpos modificados desejados, como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, e semelhantes. Fragmentos de ligação ao antigénio de qualquer um destes tipos de anticorpos, como fragmentos Fab, Fv, scFv, Fab' e F(ab')2, são ainda apropriados para uso nas formulações. O anticorpo anti-a4p7 pode se ligar a um epitopo na cadeia a4 (por exemplo, MAb 21.6 humanizado (Bendig et ai., Patente US 5.840.299)), na cadeia β7 (por exemplo, FIB504 ou um derivado humanizado (por exemplo, Fong et al., patente US 7.528.236)), ou a um epitopo combinatorial formado pela associação de uma cadeia a4 com a cadeia β7. Em um aspeto, o anticorpo se liga a um epitopo combinatorial no complexo α4β7, mas não se liga a um epitopo na cadeia a4 ou a cadeia β7 salvo se as cadeias estão em associação com cada outro. A associação de a4 integrina com β7 integrina pode reagir a um epitopo combinatorial, por exemplo, por ligação em ponte nos resíduos de proximidade presentes em ambas as cadeias que juntas compreendem o epitopo ou por exposição conformacionalmente em uma cadeia, por exemplo, a cadeia a4 integrina ou a cadeia β7 integrina, um sitio de ligação ao epitopo que é inacessível à ligação do anticorpo na ausência do parceiro apropriado de integrina ou na ausência de ativação de integrina. Em outro aspeto, o anticorpo anti-ot4p7 se liga a ambas cadeia a4 integrina e a cadeia β7 integrina, e, assim, é especifica para o complexo α4β7 integrina. Ditos anticorpos podem se ligar a α4β7 mas não se ligam a α4β1, e/ou não se ligam a αεβ7, por exemplo. Em outro aspeto, o anticorpo 3ηΡϊ-α4β7 se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epitopo como o anticorpo Act-1 (Lazarovits, A. I. et al., J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984), Schweighoffer et al., J. Immunol., 151(2): 717-729, 1993; Bednarczyk et al., J. Biol. Chem., 269(11): 8348-8354, 1994) . Linhagem de célula de hibridoma ACT-1, que produz o anticorpo monoclonal Act-1 murino, foi depositado sob as provisões do Tratado de Budapeste em 22 de agosto de 2001, em nome de Millennium Pharmaceuticals, Inc., 40 Landsdowne Street, Cambridge, Mass. 02139, EUA, no American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., sob N.° de acessão PTA-3663. Em outro aspeto, o anticorpo anti-c^7 é um anticorpo humano ou uma proteína de ligação a α4β7 usando as CDRs fornecidas na publicação do pedido de patente US 2010/0254975.
Em um aspeto, o anticorpo anti-α4β7 inibe a ligação de α4β7 a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, a adressina de mucosa, por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), fibronectina, e/ou adressina vascular (VCAM)). MAdCAMs de primata são descritas na publicação PCT WO 96/24673, os ensinamentos completos dos quais são incorporados aqui por esta referência. Em outro aspeto, o anticorpo βη^-0£4β7 inibe a ligação de α4β7 a MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) e/ou fibronectina sem inibição da ligação de VCAM.
Os anticorpos anti-a4p7 aqui descritos são versões humanizadas do anticorpo de Act-1 de camundongo. Métodos apropriados para preparar anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica. Geralmente, o anticorpo anti-ct4p7 humanizado conterá uma cadeia pesada que contém as 3 regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs, CDRl, SEQ ID NO:8, CDR2, SEQ ID NO: 9 e CDR3, SEQ ID NO:10) do anticorpo Act-1 de camundongo e regiões estruturais de cadeia pesada humana apropriadas; e ainda contém uma cadeia leve que contém as 3 cadeias leves CDRs (CDR1, SEQ ID NO:11, CDR2, SEQ ID NO:12 e CDR3, SEQ ID NO :13) do anticorpo Act-1 de camundongo e regiões estruturais de cadeia leve humanas apropriadas. 0 anticorpo Act-1 humanizado pode conter qualquer região estrutural humana apropriada, incluindo região estrutural consenso, com ou sem substituições de aminoácidos. Por exemplo, um ou mais dos aminoácidos estruturais podem ser substituídos com outro aminoácido, como o aminoácido na posição correspondente no anticorpo Act-1 de camundongo. A região constante humana ou porção da mesma, se presente, pode ser derivada das cadeias leves k ou λ, e/ou as cadeias pesadas γ (por exemplo, γΐ, γ2, γ3, γ4) , μ, α (por exemplo, αΐ, α2), δ ou ε de anticorpos humanos, incluindo variantes alélicas. Uma região constante particular (por exemplo, IgGl), variante ou partes das mesmas podem ser selecionadas para configurar a função efetora. Por exemplo, uma região constante mutada (variante) pode ser incorporada em uma proteína de fusão para minimizar a ligação aos receptores Fc e/ou capacidade de fixar complemento (ver, por exemplo, Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, Dec. 22, 1994) . Versões humanizadas de anticorpo Act-1 foram descritas em publicações PCT WO98/06248 e W007/61679.
Os anticorpos humanizados anti-a4p7 aqui descritos para uso na formulação compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo aminoácidos 20 a 140 da SEQ ID NO:2, e uma região variável de cadeia leve compreendendo aminoácidos 20 a 131 da SEQ ID NO:4 ou aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO:5. Se desejado, uma região constante humana apropriada pode estar presente. Por exemplo, o anticorpo humanizado anti-a4p7 pode compreender uma cadeia pesada que compreende aminoácidos 20 a 470 da SEQ ID NO:2 e uma cadeia leve compreendendo aminoácidos 21 a 239 da SEQ ID NO:5. Em outro exemplo, o anticorpo humanizado anti-a4p7 pode compreender uma cadeia pesada que compreende aminoácidos 20 a 470 da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve compreendendo aminoácidos 20 a 238 da SEQ ID NO:4. Figura 4 mostra um alinhamento que compara as cadeias leves genéricas de anticorpos humanos com anticorpos murinos. O alinhamento ilustra que a cadeia leve humanizada de vedolizumabe (por exemplo, Chemical Abstract Service (CAS, American Chemical Society) Número de registro 943609-66-3) , com dois resíduos de camundongo trocados para resíduos humanos, é mais humana do que a cadeia leve de LDP-02 (Figura 3) . Além disso, LDP-02 tem de algum modo um sítio hidrofóbico, flexível alanina 114 e um hidrofílico (Aspartato 115) que é substituído em vedolizumabe com o resíduo treonina 114 contendo hidroxil ligeiramente hidrofílico e resíduo valina 115 hidrofóbico, potencialmente faceando para dentro.
Outras substituições à sequência de anticorpo podem ser, por exemplo, mutações às regiões estruturais de cadeia pesada e leve, como uma mutação de isoleucina para valina no resíduo 2 da SEQ ID NO: 14; uma mutação de metionina para valina no resíduo 4 da SEQ ID NO: 14; uma mutação de alanina para glicina no resíduo 24 da SEQ ID NO:15; uma mutação de arginina para lisina no resíduo 38 da SEQ ID NO: 15; uma mutação de alanina para arginina no resíduo 40 da SEQ ID NO:15; uma mutação de metionina para isoleucina no resíduo 48 da SEQ ID NO: 15; uma mutação de isoleucina para leucina no resíduo 69 da SEQ ID NO:15; uma mutação de arginina para valina no resíduo 71 da SEQ ID NO:15; uma mutação de treonina para isoleucina no resíduo 73 da SEQ ID NO: 15; ou qualquer combinação dos mesmos; e substituição das CDRs de cadeia pesada com as CDRs (CDR1, SEQ id NO: 8, CDR2, SEQ ID NO: 9 e CDR3, SEQ ID NO:10) do anticorpo Act-1 de camundongo; e substituição das CDRs de cadeia leve com as CDRs de cadeia leve (CDR1, SEQ ID NO:11, CDR2, SEQ ID NO:12 e CDR3, SEQ ID NO:13) do anticorpo Act-1 de camundongo.
Os anti-oi4p7 anticorpos humanizados aqui descritos compreendem uma região variável de cadeia pesada que tem cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência aos aminoácidos 20 a 140 da SEQ ID NO:2, e uma região variável de cadeia leve que tem cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência aos aminoácidos 20 a 131 da SEQ ID NO: 4 ou aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID N0:5. Identidade de sequência de aminoácido pode ser determinada usando um algoritmo de alinhamento de sequência apropriado, como o sistema Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), usando os parâmetros padrões. Em uma modalidade, o anticorpo anti-a4p7 para uso na formulação é vedolizumabe (CAS, American Chemical Society, Número de registro 943609-66-3).
Outros anticorpos α4β7 podem ainda ser usados nas formulações e esquemas de dosagem descritos aqui. Por exemplo, os anticorpos α4β7 descritos em US 2010/0254975 (Amgen, Inc.), são apropriados para uso nas formulações e métodos para tratar doença intestinal inflamatória em um indivíduo. O anticorpo 3η1ϊ-α4β7 aqui descrito pode ser produzido por expressão de sequências de ácido nucleico codificando cada cadeia em células vivas, por exemplo, células em cultura. Uma variedade de sistemas de vetor de expressão hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpo da invenção.
Os sistemas de expressão em hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas ainda representam as células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressam um anticorpo anti-a4p7 in situ. Estes incluem, entre outros, micro-organismos como bactéria (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichiá) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectado com vetores de expressão de virus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de planta infectada com vetores de expressão de virus recombinante (por exemplo, virus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformada com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de célula mamífera (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NSO) contendo construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células mamíferas (por exemplo, promotor metalotioneina) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; o promotor 7,5K de vírus vaccinia). Por exemplo, células mamíferas como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor como o principal elemento promotor de gene precoce intermediário de citomegalovírus humano, é um sistema de expressão efetivo para anticorpos (Foecking et al.r Gene 45:101 (1986); Cockett et ai., Bio/Technology 8:2 (1990)).
Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de dita uma proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Ditos vetores incluem, entre outros, ao vetor de expressão E. coli pUR278 (Ruther et al.r EMBO J. 2:1791 (1983)), em que a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codificação lac Z de modo que uma proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye &amp; Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke &amp; Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX podem ainda ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, ditas proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas de células lisadas por adsorção e ligação às esferas de matriz de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou sítios de clivagem de Xa protease de modo que o produto do gene clonado pode ser liberado da fração GST.
Em um sistema de inseto, vírus poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O virus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocado sob o controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedrina).
Em células hospedeiras mamíferas, um número de sistemas de expressão a base de virus pode ser utilizado. Nos casos onde um adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartite. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovirus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma virai (por exemplo, região El ou E3) irá resultar em um virus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan &amp; Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355-359 (1984)). Sinais de iniciação específicos podem ainda ser requeridos para tradução eficiente de sequências de codificação de anticorpo inseridas. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o códon de iniciação deve estar na fase com a região de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução do inserto completo. Estes sinais de controle de tradução exógenos e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto natural quanto sintético. A eficiência da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos melhoradores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).
Além disso, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processo o produto do gene no modo específico desejado. Ditas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para esta finalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para processamento do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Ditas células hospedeiras mamíferas incluem, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), NSO, HeLa, VERY, renais de hamster recém-nascido (BHK), renais de macacos (COS) , MDCK, 293, 3T3, WI38, células de carcinoma hepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2), linhagens de célula de cancro de mama como, por exemplo, linhagem de célula BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e de glândula mamária normal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst. A máquina de glicosilação de diferentes tipos de células pode produzir anticorpos com diferente composição de glicosilação além de outro tipo de célula, ou sem glicosilação, como com células bacterianas. Em um aspeto, os tipos de célula para a produção do anticorpo ηη^-α4β7 são células de mamíferos, como células NSO ou CHO. Em um aspeto, as células mamíferas podem ainda compreender a deleção de uma enzima envolvida no metabolismo celular e o gene exógeno de interesse pode ser operacionalmente ligado a uma enzima de substituição, por exemplo, em um construto ou vetor para introdução nas células, por exemplo, por transformação ou transfecção. 0 construto ou vetor com o gene exógeno confere às células que hospedam o construto ou vetor uma vantagem de seleção para encorajar a produção do polipeptídeo codificado pelo gene exógeno. Em uma modalidade, células CHO são células DG44 (Chasin and Urlaub (1980) PNAS USA 77:4216), compreendendo a deleção ou inativação do gene di-idrofolato redutase gene. Em outra modalidade, as células CHO são células CHO Kl compreendendo a deleção ou inativação do gene glutamina sintase (ver, por exemplo, patentes US 5.122.464 ou 5.827.739).
Formulações sólidas
As formulações sólidas aqui descritas são geralmente preparadas por secagem de uma formulação líquida. Qualquer método apropriado de secagem pode ser usado, como liofilização ou secagem por spray. A liofilização envolve congelar uma formulação líquida, geralmente no recipiente que será usado para armazenar, transportar e distribuir uma formulação (por exemplo, um frasco). (Ver, por exemplo, Gatlin and Nail em Protein Purification Process Engineering, ed. Roger G. Harrison, Marcel Dekker Inc., 317-367 (1994).) Uma vez que a formulação é congelada, a pressão atmosférica é reduzida e a temperatura é ajustada para permitir a remoção do solvente congelado, por exemplo, através de sublimação. Esta etapa do processo de liofilização é algumas vezes referenciada como uma secagem primária. Se desejado, a temperatura pode então ser elevada para remover qualquer solvente que é ainda ligada à formulação seca por evaporação. Esta etapa do processo de liofilização é algumas vezes referenciada como uma secagem secundária. Quando a formulação atingiu o grau desejado de secagem, o processo de secagem é concluído e os recipientes são vedados. A formulação sólida final é algumas vezes referenciada como uma "formulação liofilizada" ou uma "torta." O processo de liofilização pode ser realizado usando qualquer equipamento apropriado. 0 equipamento de liofilização apropriado é disponível de um número de fontes comerciais (por exemplo, SP Scientific, Stone Ridge, NY).
Uma variedade de aparatos apropriados pode ser usada para secar formulações líquidas para produzir uma formulação sólida (por exemplo, liofilizada). Geralmente, as formulações liofilizadas são preparadas pelos especialistas na técnica usando uma câmara vedada que contém prateleiras, em que os frascos da formulação liquida a serem secos são colocados. A temperatura das prateleiras, vem como taxa de resfriamento e aquecimento podem ser controladas, assim como a pressão dentro da câmara. Será entendido que vários parâmetros de processo discutidos aqui se referem aos processos realizados usando este tipo de aparelho. Os especialistas na técnica podem facilmente adaptar os parâmetros descritos aqui a outros tipos de aparelhos de secagem se desejado.
Temperaturas apropriadas e uma quantidade de vácuo para secagem primária e secundária podem ser prontamente determinadas por um especialista na técnica. Em geral, a formulação é congelada em uma temperatura de cerca de -30°C ou menos, como -40°C ou -50°C. A taxa de resfriamento pode afetar a quantidade e tamanhão de cristais de gelo na matriz. A secagem primária é geralmente conduzida em uma temperatura que é cerca de 10°C, cerca de 20°C, cerca de 30°C, cerca de 40°C ou cerca de 50“C mas quente do que a temperatura de conge lament ο. Em um aspeto, as condições de secagem primárias podem ser ajustadas para manter o anticorpo anti-a4p7 abaixo da temperatura de transição vítrea ou temperatura de colapso da formulação. Acima da temperatura de colapso, a matriz congelada amorfa pode fluir (colapsar) , com um resultado que as moléculas de proteína podem não ser circundadas por uma matriz rígida, sólida e as moléculas de proteína podem não ser estáveis na matriz colapsada. Ainda, a formulação pode ser difícil para secar totalmente se ocorrer o colapso. As quantidades maiores resultantes de humidade na formulação podem levar às taxas maiores de degradação de proteína e uma redução na quantidade de tempo que o produto liofilizado pode ser armazenado antes de suas qualidades diminuírem a níveis inaceitáveis. Em um aspeto, a temperatura de prateleira e pressão da câmara são selecionadas para manter a temperatura do produto abaixo da temperatura de colapso durante secagem primária. A temperatura de transição vítrea de uma formulação congelada pode ser medida por métodos conhecidos técnica, por exemplo, por calorimetria de varredura diferencial (DSC). A temperatura de colapso pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia de liofilização. A proporção de açúcar não redutor para proteína (mol:mol) e as quantidades de outros componentes de formulação irão impactar a temperatura de transição vítrea e temperatura de colapso. Em algumas formas de realização, uma temperatura de transição vítrea para uma formulação de anticorpo α4β7 é cerca de -35°C a cerca de -10°C, cerca de -35°C a cerca de -25°C, ou cerca de -35°C a cerca de -29°C. Em outra modalidade, a temperatura de transição vítrea de uma formulação de anticorpo α4β7 é cerca de -29°C. Em algumas formas de realização, a temperatura de transição vítrea de uma formulação de anticorpo 0ί4β7 é cerca de -30°C, cerca de -31°C, cerca de -32°C, cerca de -33°C, cerca de -34°C, cerca de -35°C ou cerca de -36°C. Em algumas formas de realização, uma temperatura de colapso de uma formulação de anticorpo α4β7 é cerca de -30°C a cerca de 0°C, cerca de -28°C a cerca de -25°C, ou cerca de -20°C a cerca de -10°c. Em outra modalidade, a temperatura de colapso de uma formulação de anticorpo α4β7 é cerca de -26°C. Sem querer se ligar em qualquer teoria particular, quanto maior a taxa de elevação maior a temperatura de colapso do produto. A etapa de secagem primária pode remover pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou mais do solvente. Em um aspeto, a etapa de secagem primária remove mais do que 80% do solvente da formulação de anticorpo ηη^-α4β7. A secagem primária é dependente da temperatura de prateleira e pressão. As condições para secagem primária podem ser determinadas empiricamente com liofilização e parâmetros de processo diferentes A secagem primária pode ainda ser matematicamente modalidade baseado em temperatura de produto. Equações de massa e transferência de calor (Milton, et al. (1997) PDA J of Pharm Sei &amp; Tech, 51: 7-16), acoplado com conhecimento de Rp e Kv, permitem o entendimento da combinação e interação de variáveis de entrada incluindo variáveis de entrada de processo como temperatura de prateleira e pressão e variáveis de formulação que são capturadas no valor Rp. Estes modelos podem ajudar na determinação dos parâmetros a serem usados para um processo eficiente baseado nas limitações da temperatura do produto pela temperatura de colapso e capacidade do equipamentoi
Equação .1 Equação 2
Equação 3 Equação 4 A equação 1 refere-se à taxa de sublimação (dm/dt) durante secagem primária à área transversal interna do recipiente (Ap), a pressão de vapor de gelo (PD), a pressão da câmara (Pc) , e uma área normalizada de resistência de transferência de massa para a torta e tampa (Rp) . PQ na interface de sublimação pode ser determinada a partir da equação 2, onde P0 está relacionado à temperatura do produto gelo na interface de sublimação, que está em aproximação a partir da temperatura do produto (Tp.) , que pode ser medida com um termopar no fundo do frasco ou pode ser derivada das equações acima quando as outras variáveis são determinadas. A Equação 3 refere-se à taxa de transferência de calor a partir da prateleira aos frascos, onde Av é a área do frasco, Kv é o coeficiente de transferência de calor do frasco, Ta é a temperatura da prateleira, e Tp é a temperatura do produto. Equação 4 acopla as equações de transferência de massa e calor, onde AHS é o calor de sublimação.
Como observado a partir das equações para secagem primária, a temperatura de prateleira (T3) , a temperatura do produto (TP) , a pressão da câmara (Pc), a resistência de transferência de massa da torta (RP), e o coeficiente de transferência de calor (Kv) pode afetar a taxa de sublimação.
Uma etapa opcional após congelamento e antes de secagem primária é anelamento. Nesta etapa a temperatura de prateleira do liofilizador é elevada acima da transição vitrea da formulação por um período de tempo curto, por exemplo, cerca de 2 a 6 horas, cerca de 3 a 5 horas, ou cerca de 4 horas, então a temperatura de prateleira é reduzida novamente abaixo da temperatura de transição vítrea da formulação. 0 anelamento pode ser usado para cristalizar agentes de volume e para formar cristais de gelo maiores e mais uniformes. 0 processo de anelamento pode afetar a reconstituição de tempo porque a torta seca anelada tem uma área de superfície maior do que a torta seca não anelada. Uma etapa de anelamento de uma formulação de anticorpo α4β7 pode ser cerca de -30°C a cerca de -10°C ou cerca de -25°C a cerca de -15°C. Em um aspeto, uma temperatura de anelamento para uma formulação de anticorpo α4β7 é cerca de -20°C. A secagem secundária é geralmente conduzida em uma temperatura que é acima da temperatura de congelamento da formulação líquida. Por exemplo, secagem secundária pode ser conduzida em cerca de 10°C, cerca de 20°C, cerca de 30°C, cerca de 40“C ou cerca de 50°C. Em um aspeto, a temperatura para secagem secundaria é temperatura ambiente, por exemplo, 20-30°C. 0 tempo para secagem secundária deve ser suficiente para reduzir a quantidade de humidade a <5%. 0 ciclo de liofilização pode incluir congelamento em cerca de -45°C, anelamento em cerca de -20°C, recongelamento em cerca de -45°C, secagem primária em cerca de -24°C e 150 mTorr, e secagem secundária em cerca de 27°C e 150 mTorr.
Rp é afetado pelo teor de sólidos do DP congelado e o histórico termal DP (estágios de congelar, anelar, e novamente congelar) que afeta a estrutura de poro da torta 0 histórico térmico pode ainda afetar o estágio de secagem secundário, onde uma área de superfície mais larga pode ajudar na dessorção da água (Pikal, et al. (1990) Int. J. Pharm., 60: 203-217). Parâmetros úteis de processo para controle durante os estágios de liofilização primários e secundários podem ser a temperatura de prateleira e pressão de câmara durante cada estágio do ciclo de secagem.
Para escalonar, a carga de liofilizador e o teor de sólidos podem afetar o ciclo de secagem. O tempo de secagem primário pode ser afetado pelo teor de sólidos na formulação. Em teores de sólidos maiores, por exemplo, onde as concentrações de sólidos gerais (excipientes e/ou proteína) variam mais do que 10 p/v% ou mais do que 15 p/v%, por exemplo, 50 a 100% de variância de formulações cujo tempo de secagem é determinado, o tempo de secagem pode ser afetado. Por exemplo, uma formulação com alto teor de sólidos pode ter um tempo de secagem do que uma formulação de teor de sólidos. Em algumas formas de realização, o percentual de uso de capacidade de freeze dryer pode variar de cerca de 25 a cerca de 100%. Em % de carregamento maior de capacidade, o tempo de secagem primário pode aumentar até 2 vezes em comparação a um % de carregamento menor de capacidade. As diferenças entre os tempos de secagem primário em % de carga diferente aumenta conforme o teor de sólidos aumenta. Em uma modalidade, o teor de sólidos é menos do que 20-25% e a carga é de 25-100%. O tamanho do frasco pode ser selecionado com base na área de superfície que será exposto à prateleira e à liofilização durante vácuo. O tempo de secagem é diretamente proporcional à altura da torta, assim, o tamanho do frasco pode ser escolhido com base no que é determinado para ser uma altura de torta variável. Um frasco com um diâmetro grande em relação ao volume pode fornecer uma quantidade alta de contato com a prateleira para eficiente transferência de calor durante o ciclo de liofilização. Uma solução de anticorpo diluída em um alto volume de líquido irá requerer mais tempo para secagem. Um equilíbrio no tamanho do frasco versos volume de formulação precisa ser atingido, porque frascos maiores podem ser mais caros para armazenar e transportar e têm uma maior proporção de espaço aéreo para formulação, e podem expor uma alta proporção da formulação aos efeitos de degradação de humidade durante armazenamento de longo prazo. Para uma dose de 300 mg, o tamanho do frasco da formulação de anticorpo anti-a4£7 pode ter um volume de 3 ml, 5 ml, 6 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml ou 100 ml antes da liofilização. Em um aspeto, o tamanho do frasco é 20 ml para uma solução de 60 mg/ml em uma dose de 300 mg.
Após a liofilização, o frasco pode ser vedado, por exemplo, recravados, em um vácuo. Alternativamente, um gás, por exemplo, ar seco ou nitrogénio, pode ser permitido no frasco antes da vedação. Onde a oxidação é uma preocupação, o gás permitido na câmara de liofilização pode compreender um gás que retarda ou previne a oxidação do produto liofilizado. Em um aspeto o gás é um gás não oxigenado, por exemplo, nitrogénio, ou um gás inerte, por exemplo, hélio, neônio, argônio, criptônio ou xenônio. Em outro aspeto, o gás é nitrogénio ou argônio.
Em algumas formas de realização, o volume da formulação pré-liofilização do anticorpo anti-a4p7 é o mesmo que o volume de solução reconstituído pré-administração. Por exemplo, uma formulação que é cerca de 5,5 ml pré-liofilização pode ser reconstituída a um volume de cerca de 5,5 ml, adicionando uma quantidade de liquido, por exemplo água ou salina, que ocorre na contabilidade de volume dos sólidos secos. Em outras formas de realização, pode ser desejável liofilizar a formulação de anticorpo anti-a4p7 em um volume diferente do que o volume de solução reconstituída. Por exemplo, a formulação do anticorpo anti-oí4p7 pode ser liofilizada como uma solução diluída, por exemplo 0,25x, 0,5x, ou 0,75x e reconstituída a lx por adição de menos líquido, por exemplo, 75% menos, metade, ou 25% menos do que o volume pré-liofilização. Em uma modalidade, uma dose de 300 mg pode ser liofilizada como uma solução de anticorpo a 30 mg/ml em 5% de sacarose e reconstituído a uma solução de anticorpo 60 mg/ml em 10% de sacarose. Alternativamente, a formulação liofilizada de anticorpo anti-a4p7 pode ser reconstituída em uma solução mais diluída do que a formulação pré-liofilizada.
Tratamento com a formulação de anticorpo
Em um aspeto, a invenção fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito a formulação de anticorpo 3η^-α4β7 descrita aqui em uma quantidade eficaz para tratar a doença ou distúrbio, por exemplo, em humanos. O sujeito humano pode ser um adulto (por exemplo, 18 anos de idade ou mais), um adolescente, ou uma criança. O sujeito humano pode ser uma pessoa de 65 anos de idade ou mais. Em contraste aos esquemas de dosagem terapêuticos alternativos, um sujeito humano de 65 anos de idade ou mais não requer qualquer modificação do regime de dosagem descrito aqui, e podem ser administrados à formulação convencional de anticorpo anti-a4p7 descrita aqui. 0 sujeito pode ter tido uma falta de uma resposta adequada com, perda de resposta a, ou foi intolerante ao tratamento com um imunomodulador, um antagonista TNF-α, ou combinações dos mesmos. 0 paciente pode ter recebido tratamento anterior com pelo menos um corticosteroide (por exemplo, prednisona) para a doença intestinal inflamatória. Uma resposta inadequada aos corticosteroides refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de uma história de pelo menos um regime de indução de 4 semanas que incluiu uma dose equivalente a prednisona 30 mg diariamente via oral por 2 semanas ou via intravenosa por 1 semana. Uma perda de resposta aos corticosteroides refere-se às duas tentativas falhas de reduzir os corticosteroides abaixo de uma dose equivalente a prednisona 10 mg diariamente via oral. A intolerância de corticosteroides inclui u histórico de sindrome de Cushing, osteopenia/osteoporose, hiperglicemia, insónia e/ou infecção.
Um imunomodulador pode ser, por exemplo, azatioprina oral, 6-mercaptopurina, ou metotrexato. Uma resposta inadequada a um imunomodulador refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de um histórico de pelo menos um regime de 8 semanas ou azatioprina oral (^1,5 mg/kg), 6-mercaptopurina (^0,75 mg/kg), ou metotrexato (^12,5 mg/semana). A intolerância de um imunomodulador inclui, entre outros, náusea/vômito, dor abdominal, pancreatite, anormalidades LFT, linfopenia, mutação genética de TPMT e/ou infecção.
Em um aspeto, o sujeito pode ter tido uma falta de uma resposta adequada com, perda de resposta a, ou foi intolerante ao tratamento de um antagonista TNF-α. Um antagonista TNF-α é, por exemplo, um agente que inibe a atividade biológica de TNF-cx, e preferencialmente se liga a TNF-α, como um anticorpo monoclonal, por exemplo, REMICADE {infliximabe), HUMIRA (adalimumabe), CIMZIA (certolizumabe pegol), SIMPONI (golimumabe) ou uma proteína de fusão do recetor como ENBREL (etanercepte). Uma resposta inadequada a um antagonista de TNF-oí refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de um histórico de pelo menos um regime de indução de 4 semanas de infliximabe 5 mg/kg IV, 2 doses pelo menos 2 semanas afastadas; uma dose de 80 mg subcutânea de adalimumabe, seguido por uma dose de 40 mg pelo menos duas semanas afastadas; ou 400 mg via subcutânea de certolizumabe pegol, 2 doses pelo menos 2 semanas afastadas. Uma perda de resposta a um antagonista TNF-ot refere-se à recorrência de sintomas durante a dosagem de manutenção após benefício clínico anterior. A intolerância de um antagonista TNF-α inclui, entre outros, a reação relacionada à infusão, desmielinização, insuficiência cardíaca congestiva, e/ou infecção.
Uma perda de manutenção de remissão, como usado aqui para sujeitos com colite ulcerativa, refere-se a um aumento em escore de Mayo de pelo menos 3 pontos e um Escore de Baron Modificado de pelo menos 2.
As formulações de anticorpo anti-oí4β7 aqui descritas que (1) podem ligar α4β7 integrina in vitro e/ou in vivo; e (2) podem modular uma atividade ou função de uma α4β7 integrina, como (a) função de ligação (por exemplo, a capacidade de α4β7 integrina em se ligar a MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) , fibronectina e/ou VCAM-1) e/ou (b) função de infiltração de leucócito, incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos (por exemplo, a capacidade de inibir migração de linfócito ao tecido da mucosa intestinal). Em uma modalidade, um anticorpo na formulação pode ligar uma α4β7 integrina, e pode inibir a ligação de α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), VCAM-1, fibronectina), assim inibindo a infiltração de leucócito de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos) . Em outra modalidade, um anticorpo na formulação pode ligar a uma α4β7 integrina, e pode seletivamente inibir a ligação da α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), VCAM-1, fibronectina), assim inibindo infiltração de leucócito de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos). Ditas formulações de anticorpo anti-ct4$l podem inibir adesão celular de células contendo uma α4β7 integrina às células endoteliais vasculares em tecidos de mucosa, incluindo tecidos associados ao intestino, órgãos linfoides ou leucócitos (especialmente linfócitos como células T ou B) in vitro e/ou in vivo. Ainda em outra modalidade, a formulação de anticorpo 3η^-α4β7 da presente invenção pode inibir a interação de α4β7 com MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) e/ou fibronectina. Ainda em outra modalidade, a formulação de anticorpo anti-o^7 da presente invenção pode inibir a interação de α4β7 com MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) e/ou fibronectina seletivamente, por exemplo, sem inibir a infecção de α4 β7 com VCAM.
As formulações de anticorpo aqui descritas podem ser usadas para modular (por exemplo, inibir (reduzir ou prevenir)) a função de ligação e/ou função de infiltração de leucócito (por exemplo, linfócito, monócito) de α4β7 integrina. Por exemplo, imunoglobulinas humanizadas que inibem a ligação de α4β7 integrina a um ligante (ou seja, um ou mais ligantes) podem ser administradas de acordo com o método no tratamento das doenças associadas com infiltração de leucócito (por exemplo, linfócito, monócito) de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos), particularmente de tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1).
Uma quantidade eficaz de uma formulação de anticorpo anti-o(4p7 (ou seja, uma ou mais) pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um humano ou outro primata) para tratar dita uma doença. Por exemplo, doenças inflamatórias, incluindo doenças que são associadas com infiltração de leucócito do trato gastrointestinal (incluindo endotélio associado ao intestino), outros tecidos de mucosa, ou tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) (por exemplo, tecidos associados ao intestino, como vênulas da lamina própria do intestino delgado e grosso; e glândula mamária (por exemplo, glândula mamária de lactação) ) , podem ser tratadas de acordo com o presente método. De modo semelhante, um indivíduo contendo doença associada com infiltração de leucócito de tecidos como um resultado de ligação de leucócitos às células (por exemplo, células endoteliais) que expressam MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) pode ser tratado de acordo com a presente invenção.
As doenças que podem ser tratadas incluem doença intestinal inflamatória (IBD), como colite ulcerativa, doença de Crohn, ileíte, doença celíaca, espru não tropical, enteropatia associada com artropatia soronegativa, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica, ou pouchite resultando após protocolectomia, e anastomose ileoanal. Preferencialmente, a doença intestinal inflamatória é doença de Crohn ou colite ulcerativa. A colite ulcerativa pode ser colite ulcerativa moderada a gravemente ativa. 0 tratamento pode resultar em cicatrização da mucosa em pacientes que sofrem de colite ulcerativa moderada a gravemente ativa. 0 tratamento pode ainda resultar em uma redução, eliminação ou redução e eliminação de uso de corticosteroide pelo paciente.
Pancreatite e diabetes mellitus dependente de insulina são outras doenças que podem ser tratadas usando as formulações da invenção. Foi reportado que MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) é expresso por alguns vasos no pâncreas exócrino de camundongos NOD (diabéticos não obesos), bem como de camundongos BALB/c e SJL. A expressão de MAdCAM-1 foi reportadamente induzida em endotélio em ilhotas inflamadas do pâncreas do camundongo NOD, e MAdCAM-1 foi a adressina predominante expressa por endotélio de ilhota de NOD em estágios inicias de insulite (Hanninen, A., et ai., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). O tratamento de camundongos NOD com anticorpos anti-MAdCAM (por exemplo, anti MAdCAM-1) ou anticorpos anti βΠ preveniu o desenvolvimento de diabetes (Yang et al., Diabetes, 46:1542-1547 (1997)). Ainda, o acúmulo de linfócitos que expressam α4β7 dentro das ilhotas foi observado, e MAdCAM-1 foi envolvido na ligação das células de linfoma via α4β7 aos vasos de ilhotas inflamadas (Hanninen, A., etal., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)) ou ao trato gastrointestinal em linfoma de célula do manto (Geissmann et al., Am. J. Pathol., 153:1701-1705 (1998)).
Exemplos de doenças inflamatórias associadas com tecidos de mucosa que podem ser tratadas usando uma formulação da invenção incluem colecistite, colangite (Adams e Eksteen Nature Reviews 6:244-251 (2006) Grant et al., Hepatology 33:1065-1072 (2001)), por exemplo, colangite esclerosante primária, doença de Behcet, por exemplo, do intestino, ou pericolangite (duto biliar e tecido circundante do figado), e doença de enxerto versus hospedeiro (por exemplo, no trato gastrointestinal (por exemplo, após um transplante de medula óssea) (Petrovic et al. Blood 103:1542-1547 (2004) ) . Como observado na doença de Crohn, a inflamação geralmente se estende além da superfície de mucosa, assim, as doenças inflamatórias crónicas, como sarcoidose, gastrite crónica, por exemplo, gastrite autoimune (Katakai et al,r Int. Immunol., 14:167-175 (2002)) e outras condições idiopáticas podem ser passiveis de tratamento.
Um método para inibir a infiltração de leucócito de tecido de mucosa é aqui descrito. Um método para tratar cancro (por exemplo, um tumor positivo a α4β7, como linfoma) é aqui descrito. Outros exemplos de doenças inflamatórias associadas com tecidos de mucosa que podem ser tratados usando uma formulação da invenção incluem mastite (glândula mamária) e sindrome do intestino irritável.
As doenças ou patógenos cujas etiologias exploram a interação de MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) com α4β7 podem ser tratadas com um anticorpo anti-c^7 em uma formulação descrita aqui. Exemplos de ditas doenças incluem distúrbios de imunodeficiência, como causados por virus da imunodeficiência humana (ver, por exemplo, W02008140602).
Uma formulação da invenção é administrada em uma quantidade eficaz que inibe a ligação de α4β7 integrina a um ligante do mesmo. Para a terapia, uma quantidade eficaz será suficiente para atingir o efeito terapêutico desejado (incluindo profilático) (como uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir ligação e/ou sinalização mediada por α4β7 integrina, assim inibindo a adesão de leucócito e infiltração e/ou respostas celulares associadas). Uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-α4β7, por exemplo, um titulo efetivo suficiente para manter saturação, por exemplo, neutralização, de α4β7 integrina, pode induzir resposta clinica ou remissão em doença intestinal inflamatória. Uma formulação da invenção pode ser administrada em uma dose unitária ou várias doses. A dosagem pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica e pode ser dependente, por exemplo, da idade do indivíduo, sensibilidade, tolerância e bem estar geral. Exemplos de modos de administração incluem vias tópicas como administração nasal ou inalação ou transdérmica, vias enterais, como por um tubo de alimentação ou supositório, e vias parenterais, como administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-arterial, intraperitoneal, ou intravítrea. As dosagens apropriadas para anticorpos podem ser de cerca de 0,1 mg/kg peso corporal a cerca de 10,0 mg/kg peso corporal por tratamento, por exemplo, cerca de 2 mg/kg a cerca de 7 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 6 mg/kg, ou cerca de 3,5 a cerca de 5 mg/kg. Em formas de realização particulares, a dose administrada é cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg.
Uma dose de 300 mg de anticorpo anti-a4p7 pode ser diluida em 250 ml de salina ou 5% de solução de dextrose para administração.
Em alguns aspectos, o regime de dosagem tem duas fases, uma fase de indução e uma fase de manutenção. Na fase de indução, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo é administrado em uma via que rapidamente fornece uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo apropriado para certos fins, como induzir tolerância imune ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo ou para induzir uma resposta clinica e amenizar os sintomas da doença intestinal inflamatória. Um paciente pode ser administrado com um tratamento em fase de indução quando primeiro estiver sendo tratado por um anticorpo anti-ot4p7, quando estiver sendo tratado após uma ausência longa da terapia, por exemplo, mais do que três meses, mais do que quatro meses, mais do que seis meses, mais do que nove meses, mais do que um ano, mais do que dezoito meses ou mais do que dois anos uma vez que a terapia de anticorpo anti-a4p7 ou durante a fase de manutenção da terapia de anticorpo anti-a4p7 se há um retorno dos sintomas da doença intestinal inflamatória, por exemplo, uma recorrência da remissão da doença. Em algumas formas de realização, o regime de fase de indução resulta em uma concentração minima média maior, por exemplo, a concentração imediatamente antes da dose seguinte, do que a concentração minima média no estado de equilíbrio mantida durante o regime de manutenção.
Na fase de manutenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo é administrado de uma forma que continua a resposta obtida por terapia de indução com um nível estável de anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma. Um regime de manutenção pode prevenir o retorno dos sintomas ou recorrência da doença intestinal inflamatória. Um regime de manutenção pode fornecer conveniência ao paciente, por exemplo, ser um regime de dosagem simples ou requerer excursões pouco frequentes para o tratamento. Em algumas formas de realização, o regime de manutenção pode incluir administração do anticorpo anti-a4p7 ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma, por exemplo, em uma formulação descrita aqui, por uma estratégia selecionada do grupo que consiste em dose baixa, administração pouco frequente, autoadministração e uma combinação qualquer dos anteriores.
Em uma modalidade, por exemplo, durante uma fase de indução de terapia, o regime de dosagem fornece uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-a4p7 ou fragmento de ligação ao antigénio em uma formulação descrita aqui para induzir a remissão de uma doença intestinal inflamatória em um paciente humano. Em algumas formas de realização, a quantidade eficaz do anticorpo anti-a4p7 é suficiente para atingir cerca de 5 pg/ml a cerca de 60 pg/ml, cerca de 15 pg/ml a cerca de 45 pg/ml, cerca de 20 μ9/πι1 a cerca de 30 pg/ml, ou cerca de 25 pg/ml a cerca de 35 pg/ml concentração sérica mínima média do anticorpo 3η^-α4β7 pelo fim da fase de indução. A duração da fase de indução pode ser cerca de quatro semanas, cerca de cinco semanas, cerca de seis semanas, cerca de sete semanas, ou cerca de oito semanas de tratamento. Em algumas formas de realização, o regime de indução pode utilizar uma estratégia selecionada do grupo que consiste em dose alta, administração frequente, e uma combinação de dose alta e administração frequente do anticorpo βη^-θί4β7 ou fragmento de ligação ao antigénio da mesma, por exemplo, em uma formulação descrita aqui. O regime de indução pode ser uma vez, ou uma pluralidade de mais do que uma dose, por exemplo, pelo menos duas doses. Durante a fase de indução, uma dose pode ser administrada uma vez por dia, dia sim dia não, duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada dez dias, uma vez a cada duas semanas ou a cada três semanas. Em algumas formas de realização, as doses de indução são administradas dentro das primeiras duas semanas de terapia com o anticorpo 3η^-α4β7. Em uma modalidade, regime de indução pode ser uma vez no início de tratamento (dia 0) e uma vez cerca de duas semanas após o início do tratamento. Em outra modalidade, a duração da fase de indução é de seis semanas. Em outra modalidade, a duração da fase de indução é de seis semanas e uma pluralidade de doses de indução é administrada durante as primeiras duas semanas.
Em algumas formas de realização, por exemplo, quando iniciando o tratamento de um paciente com doença intestinal inflamatória grave (por exemplo, em pacientes que falharam na terapia anti-TNFoí, a fase de indução precisa ter uma duração maior do que para os pacientes com doença grave ou moderada. Em algumas formas de realização, a fase de indução para um paciente com uma doença grave pode ter uma duração de pelo menos 6 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 12 semanas ou pelo menos 14 semanas. Em uma modalidade, um regime de indução para um paciente com uma doença grave pode incluir uma dose na semana 0 (inicio do tratamento), uma dose na semana 2 e uma dose na semana 6. Em outra modalidade, um regime de indução para um paciente com uma doença grave pode compreender uma dose na semana 0 (inicio do tratamento), uma dose na semana 2, uma dose na semana 6 e uma dose na semana 10.
Em uma modalidade, por exemplo, durante uma fase de manutenção de terapia, o regime de dosagem mantém uma concentração sérica minima no estado de equilíbrio média, por exemplo, a concentração platô imediatamente antes da dose seguinte, de cerca de 5 a cerca de 25 pg/mL, cerca de 7 a cerca de 20 pg/mL, cerca de 5 a cerca de 10 pg/mL, cerca de 10 a cerca de 20 pg/mL, cerca de 15 a cerca de 25 pg/mL ou cerca de 9 a cerca de 13 pg/mL of anticorpo anti-a4p7. Em outra modalidade, o regime de dosagem, por exemplo, durante uma fase de manutenção de terapia, mantém uma concentração sérica média no estado de equilíbrio de cerca de 20 a cerca de 30 pg/mL, cerca de 20 a cerca de 55 pg/mL, cerca de 30 a cerca de 45 pg/mL, cerca de 45 a cerca de 55 pg/mL ou cerca de 35 a cerca de 40 pg/mL de anticorpo anti-ot4p7. A dose pode ser administrada uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 8 semanas ou uma vez a cada 10 semanas. Uma dose maior ou mais frequente, por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas ou uma vez a cada 4 semanas pode ser útil para induzir a remissão de doença ativa ou para tratar um novo paciente, por exemplo, para induzir tolerância ao anticorpo anti-cx4p7 . Uma dose menos frequente, por exemplo, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 5 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 8 semanas ou uma vez a cada 10 semanas, pode ser útil para terapia preventiva, por exemplo, para manter a remissão de um paciente com doença crónica. Em um aspeto, o regime de tratamento é tratamento no dia 0, cerca de semana 2, cerca de semana 6 e cada 4 ou 8 semanas após isso. Em uma modalidade, o regime de manutenção inclui uma dose a cada 8 semanas. Em uma modalidade em que um paciente em uma dose a cada oito semanas de regime de manutenção experimenta um retorno de um ou mais sintomas da doença, por exemplo, tem uma recidiva, a frequência de dosagem pode ser aumentada, por exemplo, para uma vez a cada 4 semanas. A dose pode ser administrada ao paciente em cerca de 20 minutos, cerca de 25 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 35 minutos, ou cerca de 40 minutos. O regime de dosagem pode ser otimizado para induzir uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente. Em algumas formas de realização, o regime de dosagem não altera a razão de CD4 para CD8 no fluido cerebroespinal de pacientes que recebem tratamento.
Em alguns aspectos, uma remissão clínica durável, por exemplo, uma remissão clínica que é sustentada por pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro visitas com um médico cuidador dentro de um período de seis meses ou um ano após início do tratamento, pode ser obtida com um regime de dosagem otimizado.
Em alguns aspectos, uma resposta clínica durável, por exemplo, uma resposta clínica que é sustentada por pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos um ano, após o início de tratamento, pode ser obtida com um regime de dosagem otimizado.
Em uma modalidade, o regime de dosagem compreende uma dose inicial de 300 mg, uma segunda dose subsequente de 300 mg cerca de duas semanas após a dose inicial, uma terceira dose subsequente de 300 mg em cerca de seis semanas após a dose inicial, seguido por uma quarta doses subsequentes de 300 mg a cada quatro semanas ou a cada oito semanas após a terceira dose subsequente.
Em algumas formas de realização, o método de tratamento, dose ou regime de dosagem reduz a probabilidade que um paciente desenvolverá uma resposta HAHA ao anticorpo anti-a4p7. O desenvolvimento de HAHA, por exemplo, como medido por anticorpos reativos ao anticorpo anti-a4|37, pode aumentar a depuração do anticorpo anti-a4p7, por exemplo, reduz a concentração sérica do anticorpo anti-a4p7, por exemplo, reduzir o número de anticorpo ηη^-α4β7 ligado a α4β7 integrina, assim, tornando o tratamento menos efetivo. Em algumas formas de realização, para prevenir HAHA, o paciente pode ser tratado com um regime de indução seguido por um regime de manutenção. Em algumas formas de realização, não há quebra entre o regime de indução e o regime de manutenção. Em algumas formas de realização, o regime de indução compreende administrar uma pluralidade de doses de anticorpo 3η1ϊ-α4β7 ao paciente. Para prevenir HAHA, o paciente pode ser tratado com uma dose inicial alta, por exemplo, pelo menos 1,5 mg/kg, pelo menos 2 mg/kg, pelo menos 2,5 mg/kg, pelo menos 3 mg/kg, pelo menos 5 mg/kg, pelo menos 8 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou cerca de 2 a cerca de 6 mg/kg, ou administrações iniciais frequentes, por exemplo, cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez a cada duas semanas ou cerca de a cada três semanas, do dose padrão quando iniciando a terapia com um anticorpo 3η1ί-α4β7. Em algumas formas de realização, o método de tratamento mantém pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos pacientes como HAHA-negativo. Em outras formas de realização, o método de tratamento mantém pacientes como HAHA-negativos por pelo menos 6 semanas, pelo menos 10 semanas pelo menos 15 semanas, pelo menos seis meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, ou pela duração da terapia. Em algumas formas de realização, os pacientes, ou pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% de pacientes que desenvolveram HAHA mantêm um titulo baixo, por exemplo, ^125, de anticorpo ηηόί-α4β7. Em uma modalidade, o método de tratamento mantém pelo menos 70% dos pacientes como HAHA-negativos por pelo menos 12 semanas após início da terapia com um anticorpo anti-a4p7. A formulação pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um humano) isolado ou em conjunto com outro agente. Uma formulação da invenção pode ser administrada antes, junto com ou subsequente à administração do agente adicional. Em uma modalidade, mais do que uma formulação que inibe a ligação de α4β7 integrina ao seu ligante é administrada. Em dita uma modalidade, um agente, por exemplo, um anticorpo monoclonal, como um anti-MAdCAM (por exemplo, anti-MAdCAM-1) ou um anticorpo monoclonal anti-VCAM-1 pode ser administrado. Em outra modalidade, o agente adicional inibe a ligação de leucócitos a um ligante endotelial em uma via diferente da via de α4β7. Dito um agente pode inibir a ligação, por exemplo, de linfócitos que expressam recetor 9 de quimiocina (motivo C-C) (CCR9) à quimiocina expressa pelo timo (TECK ou CCL25) ou um agente que previne a ligação de LFA-1 à molécula de adesão intercelular (ICAM). Por exemplo, um anticorpo anti-TECK ou anti-CCR9 ou um inibidor de molécula pequena CCR9, como inibidores revelados na publicação PCT WO03/099773 ou W004/046092, ou anticorpo anti-ICAM-1 ou um oligonucleotídeo que previne a expressão de ICAM, é administrado além de uma formulação da presente invenção. Ainda em outra modalidade, um ingrediente adicional ativo (por exemplo, um composto anti-inflamatório, como sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, ácido 5-aminosalicílico contendo anti-inflamatórios, outro composto anti-inflamatório não esteroidal, um composto anti-inflamatório esteroidal, ou antibióticos comumente administrados para controle de IBD (por exemplo, ciprofloxacina, metronidazol), ou outro agente biológico (por exemplo, antagonistas de TNF alfa) pode ser administrado em conjunto com uma formulação da presente invenção.
Em uma modalidade, a dose de medicamento coadministrado pode ser reduzida ao longo do tempo durante o período de tratamento por uma formulação compreendendo p anticorpo anti-o4p7. Por exemplo, um paciente sendo tratado com um esteroide (por exemplo, prednisona, prednisolona) no início, ou antes de, tratamento com a formulação de anticorpo 3η1ϊ-α4β7 submeter-se a um regime de doses decrescentes de esteroide começando o mais cedo como 6 semanas de tratamento com a formulação de anticorpo anti-cx487. A dose de esteroide será reduzida em cerca de 25% dentro de 4-8 semanas do início da redução, em 50 % em cerca de 8-12 semanas e 75% em cerca de 12-16 semanas da redução durante o tratamento com a formulação do anticorpo 3η1ϊ-α4β7. Em um aspeto, em cerca de 16-24 semanas de tratamento com a formulação de anticorpo anti-a487, dose de esteroide pode ser eliminada. Em outro exemplo, um paciente sendo tratado com um composto anti-inflamatório, como 6-mercaptopurina no início, ou antes, do tratamento com a formulação de anticorpo anti-a487 poderia se submeter a um regime de doses reduzidas de composto anti-inflamatório semelhante ao regime de redução para a dosagem de esteroide como notado acima.
Em uma modalidade, o método compreende administrar via subcutânea ou administrar via uma quantidade eficaz de uma formulação da invenção a um paciente. Se a formulação está em um estado sólido, por exemplo, seco, o processo de administração pode compreender uma etapa de conversão de uma formulação a um estado líquido. Em um aspeto, uma formulação seca pode ser reconstituída, por exemplo, por um liquido como descrito acima, para uso em injeção, por exemplo, injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em outro aspeto, uma formulação sólida ou seca pode ser administrada via tópica, por exemplo, em um adesivo, creme, aerossol ou supositório. A invenção ainda refere-se a um método para tratar uma doença associada com infiltração de leucócito de tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) . 0 método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma formulação de anticorpo anti-oí4β7 da invenção. Em uma modalidade, a doença é doença do enxerto versus hospedeiro. Em algumas formas de realização, a doença é uma doença associada com infiltração de leucócito de tecidos como um resultado de ligação de leucócitos que expressam α4β7 integrina ao endotélio associado ao intestino que expressa a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1). Em outras formas de realização, a doença é gastrite (por exemplo, gastrite eosinofílica ou gastrite autoimune), pancreatite, ou diabetes melitus dependente de insulina. Ainda em outras formas de realização, a doença é colecistite, colangite, ou pericolangite.
Um método para tratar doença intestinal inflamatória em um paciente é aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de uma formulação de anticorpo 3η^-α4β7 da invenção. Em algumas formas de realização, a doença intestinal inflamatória é colite ulcerativa ou doença de Crohn. Em outras formas de realização, a doença intestinal inflamatória é doença celíaca, enteropatia associada com artropatias soronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite (por exemplo, gastroenterite eosinofílica), ou pouchite.
Em algumas formas de realização, tratamento com um anticorpo anti-ot4p7 não altera a proporção de linfócitos CD4:CD8. Proporções de CD4:CD8 podem ser medidas em sangue, aspirato de linfonodo, e fluido cerebroespinal (CSF). As proporções de linfócitos CSF CD4+:CD8+ em indivíduos saudáveis são tipicamente mais do que ou iguais a cerca de 1. (Svenningsson et al., J. Neuroimmunol. 1995; 63:39-46; Svenningsson et al., Ann Neurol. 1993; 34:155-161) . Um imunomodulador pode alterar a proporção de CD4:CD8 a menos do que 1.
Artigos de Fabricação
Um artigo de fabricação que contém a formulação farmacêutica da presente invenção e fornece instruções para seu uso é aqui descrito. 0 artigo de fabricação compreende um recipiente. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de duas câmaras, um frasco de formulação líquida com ou sem uma agulha, um frasco de formulação sólida com ou sem um frasco de líquido de reconstituição com ou sem uma agulha) , seringas (como seringas de duas câmaras, seringas pré-carregadas) e tubos de teste. 0 recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais como vidro, metal ou plástico. 0 recipiente mantém a formulação e um rótulo em, ou associado com, o recipiente pode indicar instruções para uso. Em outra modalidade, a formulação pode ser preparada para autoadministração e/ou conter instruções para autoadministração. Em um aspeto, o recipiente mantendo a formulação pode ser um frasco de uso único. Em outro aspeto, o recipiente mantendo a formulação pode ser um frasco de vários usos, que permite administração repetida (por exemplo, de 2-6 administrações) da formulação, por exemplo, usando mais do que uma parte de uma formulação reconstituída. 0 artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso como notado na seção acima.
Análise Clinica e de Qualidade
Um método para determinar que uma formulação farmacêutica atinge padrões de qualidade de produto é aqui descrito. 0 método pode compreender avaliação de uma formulação farmacêutica liofilizada (por exemplo, anticorpo anti-a4p7 humanizado) compreendendo inspecionar a formulação para avaliar a aparência, determinar o tempo de reconstituição, determinar o teor de humidade de formulação liofilizada, medir agregados na formulação liofilizada, medir a fragmentação, medir a oxidação /deamidação, e opcionalmente avaliar a atividade biológica e potência, em que a obtenção de padrões pré-determinados demonstra que o produto é indicado para uso clínico. Níveis de qualidade aceitáveis incluem ^5,0% de humidade, ^40 minutos de tempo de reconstituição, pH 6,3 ±0,3 de liquido reconstituído, 54,0 a 66,0 mg/ml de concentração de anticorpo, ^55,0% de isoforma principal por CEX, ^96,0% de monómero por SEC, ^2,5% alto peso molecular (agregados), ^90% cadeias H+L por SDS-PAGE, 60 - 140% da adesão padrão de referência. A invenção será mais bem entendida por referência aos seguintes exemplos. Não deve, no entanto, ser interpretados como limitando o âmbito da invenção.
PROTOCOLO DE DESENVOLVIMENTO PARA PREPARO DA FORMULAÇÃO A. Uma Solução de Anticorpo Anti-a4p7
Garrafas de preparação congelada de anticorpo anti-a4p7 de alta concentração (vedolizumabe, 50 mM histidina, 125 mM arginina, 0,06% polissorbato 80, pH 6,3) são descongeladas em temperatura ambiente por 16-24 horas. As garrafas descongeladas são agrupadas em um vaso de manipulação de aço inoxidável e misturadas . A preparação é então diluida com tampão de diluição A (50 mM histidina, 125 mM arginina, 0,06% polissorbato 80, pH 6,3) a 80 mg/mL de vedolizumabe e misturada. Sacarose é, então, adicionada diluindo a preparação com tampão de diluição B que contém sacarose (50 mM histidina, 125 mM arginina, 40% sacarose, 0,06% polissorbato 80, pH 6,3) . Esta etapa dilui a preparação de anticorpo anti-a4p7 à uma formulação liquida de 60 mg/mL vedolizumabe, 50 mM histidina, 125 mM arginina, 10% sacarose, 0,06% polissorbato 80, pH 6,3. B. Liofilização
Formulação liquida de anticorpo 3ηΡΐ-α4β7 a 60 mg/ml em 50 mM histidina, 125 mM arginina, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH6,3 é envasada em frascos de vidro de 20 mL com 5,52 mL por frasco e as tampas são colocadas na posição de liofilização. Os frascos são carregados em prateleiras ajustadas a cerca de 20°C em um liofilizador. Após carregamento de todos os frascos e fechada a porta, a temperatura da prateleira é reduzida até congelar a solução, cerca de -45°C. Após 3 horas nesta temperatura, a temperatura das prateleiras é elevada para -20eC para anelamento. Após anelamento por quatro horas, a temperatura das prateleiras é reduzida para novamente congelar a solução, cerca de -45°C. Após equilíbrio dos frascos a esta temperatura, o ar é evacuado a partir da câmara. Quando a pressão é 150 mTorr, a temperatura de prateleira é elevada para a temperatura de secagem primária, cerca de -24eC. A secagem primária procede até que todo o gelo cristalino tenha sublimado a partir dos frascos. Então a temperatura de prateleira é elevada para 27°C para secagem secundária por 16 horas, até que a humidade seja aproximadamente menos do que 2,5% da formulação liofilizada.
Quando a secagem secundária é completa, o gás de nitrogénio é preenchido de volta na câmara até que a pressão ambiente seja atingida. Os frascos são fechados e removidos do liofilizador. C. Armazenamento e Uso de Anticorpo anti-a4p7 Liofilizado
Os fracos liofilizados de anticorpo anti-a4p7 são armazenados a -70°C, -20°C, 2-8°C ou 25°C por períodos de tempo desejados. Quando pronto para uso, um frasco é equilibrado em temperatura ambiente. Então os conteúdos do frasco são reconstituídos com uma seringa contendo água para injeção ("WFI") usando uma seringa de 21 G. A quantidade de WFI é determinada de modo que o volume final da solução de anticorpo reconstituído é o mesmo volume da solução pré-liofilizada. Para um volume de 5,52 ml pré-liofilização, 4,8 ml de WFI é adicionado. 0 frasco é suavemente agitado e então mantido por 10-30 minutos para permitir que a formulação reconstitua, então a solução de anticorpo é removida usando uma seringa e é adicionada a uma bolsa IV para infusão IV a um paciente.
EXEMPLIFICAÇÃO EXEMPLO 1
DADOS COMPARATIVOS PARA % VARIANTE DE AÇÚCAR E AMINOÁCIDOS EM FORMULAÇÕES LIOFILIZADAS
Um projeto de abordagem de experimentos foi realizada para observar o efeito de variação de razão molar de açúcar (sacarose e manitol) para proteína, a razão molar de arginina para a proteína, e a quantidade molar de tampão histidina. Histidina e arginina são conhecidas por não cristalizarem durante o processo de liofilização, tornando-as crio ou lio protetoras. 1,5 mL de formulação foram preenchidos em frascos de 5 mL liofilizados com secagem primária a -30°C, 150 mT e Secagem Secundária a 20°C, 150 mT. A estabilidade das formulações liofilizadas reconstituídas a 1,5 ml após condições de armazenamento diferentes é mostrada nas tabelas 1-3 (compilando resultados de 60 mg/ml de dois experimentos). A Figura 6A mostra os modelos preditivos para alterações em monómero percentual, agregados percentuais e percentual de isoforma principal quando armazenados a 40°C quando pH e a razão molar de açúcar e arginina foi variada. A estabilidade da formulação foi melhor em pH baixo e razão molar alta de (açúcar + arginina) para a proteína. Nas quantidades molares de histidina avaliadas, histidina não afetou a estabilidade da formulação. Todas as formulações tinham 1-2% de humidade durante o armazenamento.
Tabela 1: Alteração em percentual de monómero quando armazenado a 5°C, 25°C/60% RH, e 40°C/75% RH por 3 meses. Percentual de monómero foi medido usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).
Tabela 2: Alteração em percentual de agregados quando armazenados a 5°C, 25°C/60% RH, e 40°C/75% RH por 3 meses. Percentual de monómero foi medido usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).
Tabela 3: Alteração em percentual de isoforma principal quando armazenado a 5°C, 25°C/60% RH, e 40°C/75% RH por 3 meses. Isoforma principal foi medida usando cromatografia de troca catiônica (CEX).
FIG. 6A mostra os modelos preditivos baseados em análise estatística de dados de 40°C das Tabelas 1-3. 0 modelo para alteração em monómero percentual por mês a 40°C por análise SEC é -3,10 + (0,386)*pH + 0,000516* ((moles de açúcar + moles de arginina)/moles de proteína) ) . 0 modelo para alteração em percentual de agregado por mês a 4Q°C por análise SEC é 2,43 (0,263)*pH - 0,000787* ((moles de açúcar tmoles arginina)/moles de proteína)). 0 modelo para alteração é percentual de isoforma principal por mês a 40°C por análise CEX é -2,54 + (0,109)*pH - 0,00130* ((moles de açúcar+moles arginina)/moles de proteína)). A linha central mostra os resultados para os modelos preditivos e as linhas externas mostram o limite de confiança de 95% para os modelos preditivos. FIG. 6B mostra modelos alternativos baseado em análise estatística de 40°c das Tabelas 1-3 quando os fatores de entrada são pH, razão molar de açúcar:proteína, e razão molar de argininarproteína. O modelo para alteração em percentual de monómero por mês a 40°C por análise SEC é -3,02 + (0,370)*pH + 0,000482* ((moles de açúcar)/(moles de proteína) + 0,000657* ((moles de arginina/moles de proteína). O modelo para alteração em percentual de agregado por mês a 40°C por análise SEC é 2,35 - (0,244)*pH - 0, 000727*((moles de açúcar)/(moles de proteína) - 0,00102* ((moles de arginina)/(moles de proteína)) . O modelo para alteração no percentual de isoforma principal por mês a 40°C por análise CEX é -2.92 + (0,210)*pH + 0,00164* ((moles de açúcar)/)/(moles de proteína) - 0,000220*((moles de arginina)/(moles de proteína)). A linha central mostra os resultados para os modelos preditivos e as linhas externas mostram o limite de confiança de 95% para os modelos preditivos.
Exemplo 2
Dados de Estabilidade
Três lotes de estabilidade primária da formulação (Lote A, B, e C) foram testados para estabilidade após armazenamento na condição prescrita de armazenamento (5 e 25°C/60% RH por até 24 meses). Todos os três lotes contêm a mesma formulação liquida que liofilizada: 60 mg/mL anticorpo anti-0í4p7, 50 mM histidina, 125 mM arginina, 10% sacarose, 0,06% polissorbato 80, pH 6,3. Para o Lote A, 3,5 mL de solução foram envasados em frascos de 20 mL e liofilizada, para Lotes B e C, 5,52 mL da solução foram envasados em frascos de 20 mL e liofilizados.
Em um estudo separado, uma formulação de droga única de 60 mg/ml anticorpo anti-a4p7, 50 mM histidina, 125 mM arginina, 10% sacarose, 0, 06% polissorbato 80, pH 6,3 foi liofilizada em dois volumes, 3,5 ml e 9,5 ml, respectivamente, para gerar Lotes R e S para amostras de estabilidade, que foram analisadas por 38 meses. Os brancos são NT (não testados).
Os dados (Tabelas 4-19) mostraram que as formulações de anticorpo permaneceram estáveis quando armazenadas por até 38 meses a 5"C e até 30 meses a 25°C/60% RH. Todos os atributos do produto permaneceram dentro das especificações até o ponto de tempo de 38 meses.
Tabela 4: Alteração em percentual de monómero por SEC quando armazenado a 5°C.
Tabela 5: Alteração em percentual de agregados por SEC quando armazenado a 5°C.
Tabela 6: Alteração em percentual de isoforma principal por CEX quando armazenada a 5°C.
Tabela 7: Alteração em percentual de isoformas acídicas por CEX quando armazenadas a 5°C.
Tabela 8: Alteração em percentual de isoformas básicas por CEX quando armazenadas a 5°C.
Tabela 9: Alteração em % (H+L) por SDS Page reduzido quando armazenado a 5°C.
Tabela 10: Alteração em eficácia de ligação quando armazenado a 5°C.
Tabela 11: Alteração em % de humidade por KF quando armazenado a 5°C
Tabela 12 : Alteração em percentual de monómero por SEC quando armazenado a 25°C/60%RH.
Tabela 13: Alteração em percentual de agregados por SEC quando armazenado a 25°C/60%RH
Tabela 14: Alteração em percentual de isoforma principal por CEX quando armazenada a 25°C/60%RH.
Tabela 15: Alteração em percentual de isoformas ácidas por CEX quando armazenada a 25°C/60%RH.
Tabela 16: Alteração em percentual de isoformas básicas por CEX quando armazenada a 25°C/60%RH.
Tabela 17: Alteração em % (H+L) por SDS Page reduzido quando armazenada a 25eC/60%RH
Tabela 18: Alteração em eficácia de ligação quando armazenado a 25°C/60%RH.
Tabela 19: Alteração em % de humidade por KF quando armazenado a 25°C/60%RH
Cromatografia de troca catiônica (CEX)
Um gradiente de fosfato/cloreto de sódio em uma coluna de troca catiônica fraca é usado em um sistema de cromatografia liquida de alto desempenho para separar espécies carregadas em formulações de anticorpo anti-a4p7 e determinar a composição de carga das espécies de anticorpo. Isoformas ácidas eluem antes da isoforma principal e isoformas básicas eluem após a isoforma principal.
Os dados de estabilidade para todos os lotes de vedolizumabe gerados usando um ensaio CEX são apresentados nas Tabelas 3, 6-8 e 14-16. As Tabelas mostram, que nestas condições de armazenamento, não houve tendência da redução de % Isoforma Principal abaixo de 55,0%.
Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) SEC é realizada usando uma coluna analítica SEC (Tosoh Bioscience, LLC, King of Prussia, PA) . A fase móvel é uma solução de salina tamponada em fosfato e a absorbância é monitorada a 280 nm.
Os dados de estabilidade gerados usando um ensaio SEC são apresentados nas Tabelas 1, 2, 4, 5, 12 e 13. As Tabelas mostram que nenhuma das condições de armazenamento listadas resultou em redução do % de monómero abaixo de 96, 0%. De modo semelhante, o % de Agregados permaneceu ^2,5% para todos os lotes em todas as condições de armazenamento listadas.
Ensaio SDS-PAGE SDS-PAGE é realizado usando um Invitrogen (Carlsbad, CA) Tris-Glicina gel, 4-20% para condição redutora e 4-12% para condição não redutora. A formulação de anticorpo reconstituído é diluída em tampão de formulação líquida, em seguida, diluída uma a duas com tampão de amostra Tris-Glicina SDS (Amostra 2X, Invitrogen) com 10% 2-mercaptoetanol (tampão de amostra redutor) ou sem 2-mercaptoetanol (tampão de amostra não redutor) . As amostras são brevemente aquecidas e carregadas em comparação com um marcador de alto peso molecular (Invitrogen) . Os géis são corados com azul Coomassie coloidal (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As bandas de proteína são analisadas por densitometria para identificar o % de cadeia pesada e cadeia leve e % IgG para géis não reduzidos.
Os dados de estabilidade gerados usando um ensaio SDS-PAGE reduzido são apresentados nas Tabelas 9 e 17. Nenhuma alteração notável foi observada para o % de cadeias Pesada + Leve (H+L) em todas as condições de armazenamento para todos os lotes de estabilidade. 0 padrão de bandas foi semelhante ao do padrão de referência e o % (H+L) permaneceu em um nível ^90%.
Eficácia de ligação Células HuT78 (células de linfoma de célula T humana, American Type Culture Collection, Manassas, VA) suspensas em 1% BSA em PBS, 0,01% azida sódica são contatadas com diluições seriais de anticorpo de teste primário. Após incubação em gelo, as células são lavadas e tratadas com anticorpo secundário fluorescentemente marcado. Após outra lavagem, as células são fixadas e suspensas em reagente FACS para análise por citometria de fluxo (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ) ; ver ainda patente US 7.147.851.
Eficácia de ligação de vedolizumabe foi medida em relação ao padrão de referência e reportado como % de padrão de referência a EC50. Os dados de estabilidade são apresentados nas Tabelas 10 e 18. Os dados para o % de padrão de referência mostraram variabilidade mas permaneceram dentro dos limites de especificação em todas as condições de armazenamento. Nenhum lote avaliado de vedolizumabe apresentou uma tendência de eficácia de ligação reduzida nas condições de armazenamento listadas.
Humidade por Karl Fischer A formulação é titulada com metanol para uma determinação de humidade coulométrica de Karl Fischer. Os dados de humidade são apresentados nas Tabelas 11 e 19. Todos os lotes avaliados tiveram menos do que 5% de humidade em todas as condições de armazenamento listadas.
Focagem isoelétrica capilar (cIEF) clEF é realizado usando uma coluna completa ÍCE280 em sistema de detecção cIEF (Convergent Biosciences, Toronto, Ontario). A escolha do anfolito pode ser recomendada pelo fabricante ou pode ser uma combinação de anfolitos comercialmente disponíveis. Uma combinação útil é uma mistura de 3-10 e 5-8 PHARMALYTE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Exemplo 3: Modelagem de Escalonamento do processo de liofilização
Qualidade por projeto foi usada enquanto a manipulação da carga no liofilizador e o teor de sólidos da formulação. A carga foi variada de 33 a 100%. Um teor de sólidos da formulação foi variado de 9 a 27% incluindo nas cargas uma formulação que foi de 0,5x, l,0x e l,5x da formulação alvo. Estas formulações tinham Tg'semelhante. Com maior % de sólidos, o tempo de secagem primário é aumentado. Além disso, o teor de sólidos maior, a temperatura do produto aumentou devido ao maior Rp. A carga ainda teve um efeito em ambos os estágios de secagem (FIG. 8) .
Exemplo 4: Estudo de segurança não clinico
Um estudo foi desenhado para comparar o efeito de natalizumabe e vedolizumabe em sobrevida imune do SNC em EAE Rhesus. Oito animais foram dosados com um placebo controle, uma vez por semana. Sete animais foram dosados a 30 mg/kg, uma vez por semana, como natalizumabe. Sete animais foram dosados a 30 mg/kg, uma vez por semana, como vedolizumabe. Os sintomas clínicos de EAE foram observados; a frequência e proporção de subconjuntos de leucócitos em CSF foram medidos por citometria de fluxo; a carga de lesão T2 total no cérebro foi medida usando MRI; e a carga de lesão e desmielinização do cérebro foi medida usando histopatologia.
Vedolizumabe não atrasou o início de sintomas clínicos de EAE em comparação com placebo controle. Este não inibiu a incidência de EAE, nem a magnitude de escores clínicos. Natalizumabe significativamente (p<0,05) reduziu o início de sintomas clínicos de EAE em comparação ao controle com placebo. Este inibiu a incidência de EAE, a magnitude de escores clínicos. (FIG. 9)
Vedolizumabe não preveniu a infiltração de CSF pelos leucócitos, linfócito T (linfócitos T helper, linfócitos T citotóxicos), linfócitos B, células natural killer, ou monócitos . Em contraste, natalizumabe inibiu a infiltração de CSF.
Vedolizumabe não inibiu o acúmulo de lesões cerebrais, como detectado por T2 aumentada e valores de MTR reduzidos via MRI. Natalizumabe preveniu a formação de lesão em todos exceto um animal. Inibição significativa (p<0,05) em infiltrados do cérebro e desmielinização foi medida por histologia. A α4β7 integrina foi saturada por vedolizumabe durante a investigação, como mostrado por um ensaio de ligação competitivo entre vedolizumabe dosado in vivo e em anticorpo monoclonal analítico anti-a4p7 adicionado ex vivo. 0 mAb analítico 3η^-α4β7 não liga aos linfócitos T helper de memória em animais dosados com vedolizumabe. A ausência dos efeitos de vedolizumabe em CNS é portanto devido à biologia trópica gastrointestinal da α4β7 integrina.
Em resumo, vedolizumabe (um antagonista α4β7) não inibe EAE. Em contraste, natalizumabe (antagonista α4β1 e α4β7) inibe EAE. A α4β1 integrina medeia a infiltração de SNC em EAE. Assim, vedolizumabe pode ter um risco inferior de pacientes predispostos a PML do que natalizumabe porque este não antagoniza a α4β1 integrina e confere sobrevida imune do SNC em EAE Rhesus.
Exemplo 5: Estudo Clinico de Fase I com Vedolizumabe
Quarenta e nove sujeitos saudáveis foram randomizados e recebidos em uma dose única de medicação do estudo: 39 sujeitos receberam vedolizumabe (5 mg/mL anticorpo, 20 mM citrato/ácido cítrico, 125 mM cloreto de sódio, 0,05% polissorbato 80, pH 6,0 (armazenado em longo prazo -70eC e até 3 meses a -20°C)) e 10 sujeitos receberam placebo. Dos 39 sujeitos que receberam vedolizumabe, 8 sujeitos cada um receberam uma dose a 0,2, 2,0, 6,0, e 10,0 mg/kg e 7 sujeitos receberam vedolizumabe a 0,5 mg/kg. Todos os 49 sujeitos completaram o estudo. Não houve diferenças notáveis através de coortes de vedolizumabe para qualquer característica demográfica ou basal. A idade média variou de 35,4 a 51,0 anos; as idades dos sujeitos individuais variaram de 21 a 63 anos.
Resultados PK
Vedolizumabe foi administrado como uma infusão intravenosa de 30 minutos de 0,2 a 10,0 mg/kg. O Cmax e área sob a curva de valores séricos de concentração-tempo de droga (AUC) aumentaram com o aumento da dose. O Cmax corrigido por dose foi aproximadamente o mesmo entre as coortes, indicando a proporcionalidade de dose para este parâmetro. A área normalizada por dose sob o valor de concentração sérica da droga do tempo zero ao infinito (AUCo-inf) aumentou com o aumento da dose até 2,0 mg/kg, indicando que houve um aumento não linear em AUCo-inf com a dose crescente sobre a faixa inferior de doses administradas neste estudo. Em seguida, AUCo-inf aumentou proporcionalmente com a dose, indicando a linearidade de AUCo-inf sobre a faixa de dose 2,0 a 10,0 mg/kg. 0 aumento em AUCo-inf foi de aproximadamente 2,4 vezes maior do que o esperado na dose de 10,0 mg/kg comparado com a dose de 0,2 mg/kg.
De modo semelhante, estimativas de clearance, volume de distribuição, e meia-vida terminal foram dependentes da dose sobre a faixa de dose 0,2 a 2,0 mg/kg. Conforme a dose aumentava, o clearance foi reduzido, o volume de distribuição aumentou e, consequentemente, a meia-vida de eliminação de terminal foi prolongada. No entanto, de 2 a 10,0 mg/kg, não houve alteração aparente nestes parâmetros, o que sugere uma saturação de um processo de eliminação rápido para vedolizumabe em baixas concentrações. Os processos de eliminação lineares mais lentos possivelmente contam para uma grande fração de clearance de vedolizumabe em doses maiores.
Em alguns sujeitos que desenvolveram HAHA a vedolizumabe, um clearance mais rápido de vedolizumabe foi observado em comparação aos sujeitos negativos HAHA dentro do nível de dose respectivo.
Tabela 20: Visão geral de PK de Vedolizumabe por coorte de dose após administração IV de 0,2-10,0 mg/kg vedolizumabe em sujeitos saudáveis (conjunto de análise PK)
Abreviações: AUCo-inf=área sob a curva de concentração de droga-tempo, extrapolado ao infinito; AUCo-tiast= área sob a curva de concentração de droga-tempo do tempo de administração até o último ponto de tempo de medição em que a concentração é acima do limite inferior de quantificação; CL= total clearance; Cmax=concentração da droga máxima; ti/2= meia-vida terminal; Vz=volume de distribuição baseado em fase terminal.
Após atingir as concentrações séricas Cma*, de Vedolizumabe caem em um mono geral moo exponencial até as concentrações atingirem aproximadamente 1 a 10 mg/L. Em seguida, as concentrações pareceram estar em um modo não linear.
Os valores de Cmax e AUC aumentaram com o aumento da dose. Para os dados disponíveis, o Cmax corrigido por dose foi aproximadamente o mesmo através das coortes, indicando a proporcionalidade de dose para este parâmetro. A AUCo-inf normalizada por dose com aumento de dose até 2,0 mg/kg, indicando que houve um aumento não linear em AUCo-inf com dose crescente sobre a faixa inferior de doses administradas neste estudo. Em seguida, AUCo-inf aumentou a proporcionalidade com a dose, indicando linearidade de AUCO-inf sobre a faixa de dose 2,0 a 10,0 mg/kg. O aumento em AUCo-inf foi de aproximadamente 2,4 vezes maior do que o esperado na dose de 10,0 mg/kg comparado com a dose de 0,2 mg/kg.
Resultados PD
Os parâmetros PD de Vedolizumabe após uma infusão intravenosa de 30 minutos de 0,2 a 10,0 mg/kg vedolizumabe por coorte são sumarizados na Tabela 21 e Tabela 22 para Act-1 e MAdCAM respectivamente.
Tabela 21: visão geral de farmacodinâmica de vedolizumabe, inibição percentual de %Act-l+ [CD4+ CD45ROalto] , por coorte de dose após administração IV de 0,2-10,0 mg/kg vedolizumabe em sujeitos saudáveis (conjunto de análise PD)
AUECo-inf=área sob curva de efeito da droga versus tempo do tempo 0 ao tempo da última concentração não zero; Emax= efeito de droga máxima
Tabela 22: visão geral de farmacodinâmica de vedolizumabe, inibição percentual de %MADCAM+[CD4+ CD45ROalta], por coorte de dose após administração IV de 0,2-10,0 mg/kg vedolizumabe em sujeitos saudáveis (conjunto de análise PD)
AUECo-inf=área sob curva de efeito da droga versus tempo do tempo 0 ao tempo da última concentração não zero; Emax= efeito de droga máxima.
Vedolizumabe inibiu os parâmetros PD, Act-1 e MAdCAM-l-Fc, quase ao máximo em todos os pontos de tempo onde vedolizumabe foi medida em soro. Uma vez as concentrações de vedolizumabe caíram abaixo do limite de detecção do ensaio, a inibição de Act-1 e MAdCAM-l-Fc retornou para aproximadamente o nível basal.
Em alguns sujeitos que desenvolveram HAHA a vedolizumabe, uma perda mais rápida de saturação do recetor α4β7 foi observado em comparação aos sujeitos negativos HAHA dentro do nível de dose respectivo.
Resultados de segurança
Vedolizumabe foi geralmente seguro e bem tolerado em doses únicas IV até 10,0 mg/kg. Nenhum óbito, eventos adversos sérios (SAEs) ou AEs que levam a descontinuação do estudo ocorreram durante o estudo.
Imunogenicidade / Formação de Anticorpo Anti-humano Humano (HAHA)
Um sujeito (10%) no grupo placebo e 21 (54%) sujeitos nos grupos de dose combinadas de vedolizumabe tiveram um haha positivo em algum ponto durante o estudo. Embora amostras de HAHA positiva tenham sido observadas em todas as coortes de dose, títulos de HAHA >125 foram encontrados somente nos 2 grupos de dose mais baixas de vedolizumabe. A supressão dependente da dose de formação HAHA foi observada anteriormente com vedolizumabe. Dezenove dos 22 sujeitos tratados com vedolizumabe que foram positivos para HAHA tiveram HAHA neutralizante presente.
Tabela 23: visão geral de achados de anticorpos antihumanos humanos: População de segurança
Um sujeito no grupo placebo e 11 sujeitos no grupo vedolizumabe foram persistentemente positivos para HAHA.
Tabela 24: Visão geral de status de anticorpo antihumano humano (população de segurança)
a HAHA Negativo: Sujeitos sem resultados de HAHA positivos b HAHA isolado: Sujeitos como somente 1 amostra positiva para HAHA com titulo <25 c HAHA Persistente: Sujeitos como somente 2 ou mais amostras positivas para HAHA, ou 1 amostra positiva com título ^25
Conclusões
Este estudo de fase 1 caracterizou os perfis PK/PD e inicial de vedolizumabe derivado de células CHO. Os resultados deste estudo foram usados para suportar a seleção de dose para estudos pivotais de fase 3 em doença intestinal inflamatória.
Vedolizumabe demonstrou proporcionalidade de dose sobre a faixa de dose testada para o parâmetro de Cmax; no entanto, alterações dependentes de dose emAUCO-inf, CL, Vz, e tl/2 foram observadas de 0,2 a 2,0 mg/kg, sugerindo comportamento PK não linear de vedolizumabe. Em níveis de dose maiores do que 2,0 mg/kg, nenhuma outra alteração nestes parâmetros foi observada, o que sugere um processo rápido de eliminação para vedolizumabe em concentrações baixas. Processos de eliminação mais lentos possivelmente contam para uma fração grande de clearance de vedolizumabe em doses maiores.
Vedolizumabe inibiu os parâmetros PD, Act-1 e MAdCAM-l-Fc, em ou quase níveis máximos em todos os pontos de tempo quando vedolizumabe foi medida em soro. Uma vez as concentrações de vedolizumabe caíram abaixo do limite de detecção do ensaio, a inibição de Act-1 e MAdCAM-l-Fc retornou para aproximadamente o nível basal.
Em alguns sujeitos que desenvolveram HAHA a vedolizumabe, um clearance mais rápido de vedolizumabe e perda de saturação do recetor α4β7 foi observado em comparação aos sujeitos negativos HAHA dentro do nível de dose respectivo.
Vedolizumabe foi bem tolerado. Nenhum óbito, SAEs, ou AEs levando à descontinuação da administração da droga do estudo ocorreu durante o estudo, nem foi observada qualquer relação de dose e toxicidade. Nenhuma infecção oportunista sistémica (incluindo PML) ou neoplasmas foram reportados.
Diferente de antagonistas oí4 não específicos, vedolizumabe não foi associado com linfocitose ou aumentos médios em eosinófilos em circulação, basófilos ou monócitos, nem houve qualquer evidência de depleção de linfócitos.
Vedolizumabe não induziu a formação de HAHA, mas os titulos mais altos (>125) foram observados somente nos 2 grupos de dose mais baixos, um achado que suporta as observações de uma redução dependente da dose em imunogenicidade. Estes dados mostram que a administração de doses maiores de vedolizumabe podem inimizar a formação clinicamente significativa de HAHA.
Em conclusão, vedolizumabe foi geralmente seguro e bem tolerado quando administrado em doses únicas de 0,2 a 10,0 mg/kg aos sujeitos saudáveis.
Exemplo 6: Determinação de vedolizumabe na proporção CD4:CD8
Sujeitos saudáveis de idades 18-45 foram tratados com uma dose única de 450 mg de vedolizumabe reconstituído de uma formulação liofilizada de 10% sacarose e diluída em um sistema de infusão de 0,9% salina. Fluido cerebroespinal (CSF) foi coletado por punção lombar antes (basal) e 5 semanas após a dose única 450-mg de vedolizumabe. Cada sujeito serviu como seu próprio controle.
Um ponto de tempo de 5 semanas foi selecionado baseado em um estudo anterior que mostrou que pacientes com MS tratados com natalizumabe demonstraram efeitos em proporção de CSF CD4+:CD8+ linfócito e redução em número de lesões cerebrais após somente uma dose {Stuve et al. Arch Neurol,2006;63:1383-1387; Stuve et al. Ann Neurol. 2006;59:743-747. Miller et al. N Engl J Med. 2003/348(1):15-23); e ainda porque em 5 semanas, uma dose de 450 mg de vedolizumabe é suficiente para saturar o alvo e fornece concentrações séricas que excedem os níveis mínimos no estado de equilíbrio estimado associado com a fase 3 do regime de doses de 300 mg a cada 4 semanas.
Aproximadamente 15 mL de CSF foram obtidos de cada sujeito para imunofenotipagem. Amostras de CSF foram incluídas para análises se atingem os critérios seguintes: ^10 RBCs/pL por amostra (para minimizar contaminação de sangue periférico); resultado negativo para cultura CSF; número adequado de linfócito T em cada amostra de citometria de fluxo; e sem detecção de anticorpos séricos a vedolizumabe.
Mediana na semana 5 (34,80 pg/mL) e concentrações séricas de vedolizumabe dos sujeitos individuais (faixa 24,9-47,9 pg/mL) foram maiores do que a concentração mínima no estado de equilíbrio (—24 pg/mL) para o regime de dose da fase 3. Um grau alto (>90%) de saturação de recetor 0ί4β7 foi observado na semana 5 como medido por MAdCAM-l-Fc, indicado a saturação de vedolizumabe de seu alvo no tempo da avaliação do ponto de avaliação.
Vedolizumabe não foi detectado em qualquer amostra CSF (limite de detecção = 0,125 pg/mL).
Efeito em números e razão de linfócitos T CD4+ e CD8+
Vedolizumabe não reduziu significativamente proporção de CD4+:CD8+ (Tabela 25). Nenhum dos sujeitos teve uma proporção após a dose CD4+:CD8+ <1 (p < 0,0001 (teste de t de 1 lado)) . Vedolizumabe não reduziu significativamente o número de linfócitos T CD4+ ou CD8+ T em CSF. Além disso, não houve alterações significativas em % CSF de linfócitos T CD4+ e % CD8+ T (Tabela 26). Ainda, nenhuma alteração significativa em WBC de sangue periférico, linfócitos T de memória CD4+ e CD8+ (Tabela 27) foram observados.
Tabela 25: Efeito de tratamento na proporção de CSF CD4+:CD8+ (população avaliável, n=13)
CI=intervalo de confiança *p<0,0001 (teste t de uma amostra de um lado para Η0:μ<1 vs Hl: μ>=1)- tDiferença é definida como proporção de semana 5 menos proporção basal
Tabela 26: Efeito de tratamento em contagem de linfócito CD4+ e CD8+ em CSF (população avaliável, n=13)
Tabela 27: Contagens de Linfócitos T de memória em sangue periférico (R0+) (População avaliável, n=13)
Sumário
Vedolizumabe não afetou contagens de células CSF CD4+ e CD8+ ou proporção de CD4+:CD8+ em voluntários saudáveis após uma dose única de 450 mg. Nenhum dos sujeitos teve uma redução na razão após dose CSF CD4+:CD8+ a menos do que 1. Vedolizumabe não foi detectado em CSF. Além disso, não houve alteração observada nos WBCs totais ou subgrupos de linfócitos T de memória CD4+ e CD8+ no sangue periférico. A saturação de alvo (α4β7) no sangue ocorreu em todos os sujeitos no momento da avaliação do ponto de avaliação. Os níveis de linfócitos CSF CD4+ e CD8+ e proporção foram semelhantes aos anteriormente reportados na literatura.
Estes resultados são consistentes com falta de efeito de vedolizumabe em ambos sobrevivência imune em CNS fisiológico e inflamação de CNS patológica de macacos (Ver Exemplo 4)
Exemplo 7: Experiência clínica de longo prazo com Vedolizumabe para o tratamento de IBD
Um estudo de extensão de segurança aberto de fase 2 foi concluído para avaliar a farmacocinética de longo prazo (PK) , farmacodinâmica (PD), segurança, e eficácia de vedolizumabe. Os pacientes tinha idades de 18 a 75 anos, e tinham participado anteriormente em um estudo precoce de PK/PD/segurança em pacientes com colite ulcerativa ou tinham sintomas de IBD por pelo menos 2 meses confirmados por endoscopia e/ou histopatologia e/ou radiologia em 36 meses de triagem.
Todos os pacientes receberam um regime de dosagem intravenosa de ou 2 mg/kg ou 6 mg/kg de vedolizumabe (5 mg/mL de anticorpo, citrato 20 mM/ácido cítrico, cloreto de sódio 125 mM, 0,05% polissorbato 80, pH 6,0 (armazenado em longo prazo -70°C e até 3 meses a -20°C)) nos dias 1, 15 e 43, seguido por uma dose a cada 8 semanas por até um total de 78 semanas. Os pacientes foram aqueles de colite ulcerativa de tratamento naive ou pacientes com doença de Crohn, ou pacientes com colite ulcerativa que tinham participado de estudo clínico anterior. A eficácia/qualidade de vida (QoL); escore de Mayo parcial (PMS), índice de atividade de doença de Crohn (CDAI), e questionário de doença intestinal inflamatória (IBDQ) foram usados para avaliar os resultados do estudo.
Resultados PK
As concentrações médias de vedolizumabe pré-infusão foram dose proporcional, e permaneceram estáveis e detectáveis ao longo do estudo.
Resultados PD
Receptores (%ACT-1 + [CD4+CD45RO HIGH] e % MADCAM+ [CD4+CD45RO HIGH] foram quase totalmente inibidos ao longo do período do estudo em todos os níveis de dose.
Escore de Mayo parcial PMS médio basal foi maior para o tratamento de pacientes com colite ulcerativa sem tratamentos (5,4) do que para pacientes colite ulcerativa em prorrogação (2,3) . Pelo dia 43, PMS médio mostrou uma redução pronunciada para ambos pacientes com colite ulcerativa sem tratamento e em prorrogação. Pelo dia 155, escores médios dos dois grupos foram semelhantes. PMS médio continuou a reduzir até o dia 267, e nivelou em seguida. índice de atividade de doença de Crohn CDAI médio de pacientes CD reduziu de 294,6 em basal a 237,7 no Dia 43, e continuou a reduzir até o dia 155 (156,1).
IBDQ
Pacientes com colite ulcerativa em prorrogação tiveram os escores médios IBDQ maiores em basal. Pelo dia 43, escores IBDQ médios aumentaram em todos os três grupos de doença. Escores IBDQ médios continuaram a aumentar ao longo do tempo em todos os 3 grupos de doença, atingindo um máximo no dia 155 para pacientes com doença de Crohn, e no dia 491 para pacientes com colite sem tratamento e pacientes com colite ulcerativa em prorrogação.
Proteína C reativa
Ambos os pacientes com colite ulcerativa em prorrogação e doença de Crohn mostraram níveis reduzidos médios de CRP ao longo do dia 155 e então nivelaram. Pacientes com colite ulcerativa sem tratamento tiveram um nivel CRP médio menor em basal do que pacientes com colite ulcerativa em prorrogação (2,28 v. 7,09). Níveis CRP médios dos pacientes com colite ulcerativa sem tratamento permaneceram relativamente constantes em todos os pontos de tempo avaliados.
Outros resultados de segurança
Nenhuma infecção oportunista sistémica (incluindo PML) foi reportada durante o estudo. Um paciente teve teste positivo para viremia JC em um único ponto de tempo, embora fosse negativo para JCV em todos os outros pontos de tempo. Três de 72 pacientes (4%) tiveram resultados HAHA positivos (dois destes foram transitoriamente positivos) . 0 estudo não mostrou evidência de toxicidade hepática, linfocitose, ou linfopenia, ou qualquer outra alteração associada à droga.
Conclusões
Vedolizumabe administrado a 2,0 ou 6,0 mg/kg uma vez a cada 8 semanas por até 78 semanas atingiu as saturações do recetor alvo, foi associado com reduções médias duráveis na atividade da doença e melhorou os escores IBDQ, foi geralmente seguro e bem tolerado, e demonstrou imunogenicidade aceitável.
Exemplo 8: Indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com Doença de Crohn moderada a gravemente ativa
Um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo multicêntrico foi concluído para avaliar o efeito de indução de vedolizumabe em doses de 300 mg (reconstituído de uma formulação de 60 mg/mL de anticorpo em 50 mM histidina, 125 mM arginina, 0, 06% polissorbato 80, 10% sacarose, empH6,3 que foi liofilizado) , em pacientes com falha de antagonista de TNFa na semana 6 (após 2 doses—0 e 2 semanas) e na semana 10 (após 3 doses) . O estudo consistiu de 416 pacientes, 75% dos quais foram falhas em antagonista TNFa, e 25% dos quais foram virgens de TNFa. Demografia e medicação para IBD concomitante foram equilibrados através dos grupos de tratamento. As caracteristicas basais da doença foram ainda equilibradas através dos grupos de tratamento para doença basal, exceto para atividade de doença basal. O ponto de avaliação primário desenhado para o estudo foi a semana 6 de remissão (%) em população de falha de antagonista de anti-TNF-α. Os pontos de avaliações chaves secundários que foram avaliados (procedimento de teste sequencial procedure) foram: semana 6 de remissão (%) na população geral, semana 10 de remissão (%) em falha de antagonista anti-TNF-α e população geral (usando procedimento Hochberg), semana 6 e 10 remissão sustentada (%) na falha de antagonista anti-TNF-α e população geral (usando procedimento Hochberg), e semana 6 de resposta melhorada (%) na população com falha de antagonista anti-TNF-a.
Tabela 28: CDAI Basal:
Tabela 29: resultados de estudo de indução: Pontos de avaliação chaves primários e secundários
Tabela 30: Resultados em pacientes naive de antagonista Anti-TNF-oí (n=101, 24% do geral)
Tabela 31: Resultados do estudo: Remissão clinica nas Semanas 6 e 10, Subgrupo chave - Falhas Tx anteriores, ITT geral
0 estudo mostrou que pacientes com falha de antagonista TNF-a requereu 3 doses para indução de remissão. As taxas de remissão em pacientes com falha em antagonista TNF-α aumentaram entre semana 6 e semana 10, mas somente para o grupo vedolizumabe (não placebo). Taxas de remissão para pacientes virgens de antagonista TNF-α não aumentaram substancialmente entre semana 6 e 10 . Da população de falha antagonista TNF-α com um alto grau de gravidade da doença, 43% nunca responderam a um antagonista TNF-α, e 45% de perda de resposta.
Exemplo 9: Indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa
Um estudo único compreendendo dois estudos randomizados, duplo-cego, multicêntricos desenhados para avaliar a indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa. Características demográficas e basais da doença foram comparáveis através de todos os grupos de tratamento. O estudo de indução, usando administração intravenosa, comparou placebo contra vedolizumabe, em uma dose de 300 mg reconstituída de uma formulação liofilizada de 60 mg/mL de anticorpo em 50 mM histidina, 125 mM arginina, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH 6,3, com um ponto de avaliação em 6 semanas após 2 doses de vedolizumabe. 0 estudo de manutenção, usando a mesma formulação e via de administração como o estudo de indução, comparou placebo contra vedolizumabe dosado a cada quatro semanas, e placebo contra vedolizumabe dosado a cada oito semanas. Cada paciente tinha idade 18-80, diagnosticado com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa, no período anterior de 5 anos, uma resposta inadequada para, perda de resposta a, ou intolerância de pelo menos uma terapia convencional (por exemplo corticosteroides) ; e podem receber uma dose terapêutica das terapias convencionais para IBD. 0 ponto de avaliação deste estudo foi em 52 semanas, analisando a população respondente à indução. mbas as fases do estudo atingiram os pontos de avaliação primários, nomeadamente, resposta clínica em indução e remissão clínica em manutenção.
Amostras de sangue foram coletadas para medir as concentrações de vedolizumabe durante o estudo. A concentração sérica média de vedolizumabe ao fim da fase de indução foi 20 a 30 pg/mL. As concentrações séricas médias de vedolizimabe no estado de equilíbrio após 30 min de infusão IV de administração de dose de 300mg foram entre 9 a 13 pg/mL para o regime de q8wks e entre 35 a 40 pg/mL para o regime de q4wks. Ao fim da infusão, as concentrações plasmáticas medianas de vedolizimabe foram entre 98 e 101 pg/mL para o regime de q8ks (8 semanas) e ao redor de 129 e 137 pg/mL para q4 wks (4 semanas).
Os sumários da resposta dos estudos de indução e manutenção são fornecidos nas tabelas 32-35. Uma proporção significativamente maior de pacientes tratados com vedolizumabe atingiu resposta clínica, remissão, e cicatrização de mucosa em 6 semanas, em comparação com placebo (Tabela 32) . 39% da população com intenção de tratar em fase de indução teve falha anti-TNFoí anterior. A resposta clinica e taxas de remissão foram maiores em pacientes com vedolizumabe do que com placebo entre ambos aqueles com falha de anti-TNF antes e aqueles sem exposição a anti-TNF antes. Em análises preliminares na semana 6, as taxas de eventos adversos (AEs), AEs graves, e eventos adversos que levam à descontinuação do estudo foram maiores no grupo placebo do que no grupo vedolizumabe. Uma proporção significativamente maior de pacientes com vedolizumabe do que pacientes com placebo atingiram remissão clinica, cicatrização de mucosa, e remissão isenta de corticosteroide em 52 semanas e resposta e remissão durável (Tabela 33). 32% do população do estudo de manutenção teve falha anti-TNFa antes. Remissão clinica e taxas de resposta clinica durável foram maior com vedolizumabe do que com placebo em ambos os pacientes com falha de TNF e sem TNF. Na população de segurança (N=895) por semanas 0 a 52, as taxas de eventos adversos (AEs) , AEs graves, e infecções sérias foram semelhantes entre grupos de vedolizumabe e placebo. Nenhum aumento nas taxas de infecções oportunistas ou entéricas foi observado no grupo vedolizumabe.
Tabela 32: Resultados de estudo de indução - pontos de avaliações chaves primários e secundários
Tabela 33: Resultados de estudo de manutenção - pontos de avaliações chaves primários e secundários
Tabela 34: Estudo de indução: Resposta e remissão clínica em 6 Semanas em pacientes com falha de antagonista anti-TNF-oí
antes e sem exposição a anti-TNF, população ITT
Tabela 35: Remissão Clinica e resposta clinica duráveis em 52 Semanas: Pacientes com falha anterior ao antagonista
Anti-TNF-a ou sem exposição ao antagonista Anti-TNF-α em população ITT
Exemplo 10: Indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa
Um estudo único compreendendo dois estudos randomizados, duplo-cego, multicêntricos desenhados para avaliar a indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa. Caracteristicas demográficas e basais da doença foram comparáveis através de todos os grupos de tratamento. 0 estudo de indução, usando administração intravenosa, comparou placebo contra vedolizumabe, em uma dose de 300 mg reconstituída de uma formulação liofilizada de 60 mg/mL de anticorpo em histidina 50 mM, arginina 125 mM, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH 6,3, com um ponto de avaliação em 6 semanas após 2 doses de vedolizumabe. 0 estudo de manutenção, usando a mesma formulação e via de administração como o estudo de indução, comparou placebo contra vedolizumabe dosado a cada quatro semanas, e placebo contra vedolizumabe dosado a cada oito semanas. O ponto de avaliação deste estudo foi em 52 semanas, analisando a população respondente à indução.
Surpreendentemente, este estudo mostrou que os grupos Q4 e Q8 semanas gerou resultados muito semelhantes. Sumários das respostas dos estudos de indução e manutenção são fornecidos nas Tabelas 36 a 39. Uma proporção significativamente maior de pacientes tratados com vedolizumabe atingiu remissão clinica e resposta melhorada, em comparação com placebo {Tabela 36). Taxas melhoradas de remissão e resposta foram maiores em vedolizumabe do que pacientes com placebo entre ambos aqueles com falha anterior a anti-TNF e aqueles sem exposição anterior a anti-TNF. As taxas de eventos adversos (AEs), AEs graves, e infecções graves foram semelhantes entre os grupos vedolizumabe e placebo. Nenhum aumento nas taxas de infecções oportunas ou entéricas foi observado no grupo vedolizumabe.
Tabela 36: Resultados de estudo de indução - pontos de avaliações primários e secundários
Tabela 37: Resultados de estudo de manutenção - pontos de avaliações chaves primários e secundários
Tabela 38: Resposta e remissão clinica melhoradas em 6 Semanas em pacientes com falha de antagonista Anti-TNF-α antes e sem exposição a Anti-TNF, população ITT
Tabela 39: Remissão Clínica e resposta melhorada em 52 Semanas: Pacientes com falha anterior ao antagonista Anti-TNF-ot ou sem exposição ao antagonista Anti-TNF-α em população ITT
Tabela 40. Sumário de sequências
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC. <120> FORMULAÇÃO PARA UM ANTICORPO ANTI-ALFA-4BETA-7 <130> 079259-0615 <140> <141> <150> 61/585,859 <151> 2012-01-12 <150> 61/550,545 <151> 2011-10-24 <150> 61/481,533 <151> 2011-05-02 <160> 15 <170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 1445 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> origem <223> /nota="Descrição da Sequência Artificial: Polinucleotido Sintético" <400> 1 gaattctcga gatcgatctc accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa 60 cagctacagg tgtccactcc caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gttaagaagc 120 ctggggcttc agtgaaggtg tcctgcaagg gttctggcta caccttcacc agctactgga 180 tgcattgggt gaggcaggcg cctggccaac gtctagagtg gatcggagag attgatcctt 240 ctgagagtaa tactaactac aatcaaaaat tcaagggacg cgtcacattg actgtagaca 300 tttccgctag cacagcctac atggagctct ccagcctgag atctgaggac actgcggtct 360 actattgtgc aagagggggt tacgacggat gggactatgc tattgactac tggggtcaag 420 gcaccctggt caccgtcagc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 480 cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact 540 tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct 600 tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct 660 ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 720 aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780 cagcacctga actcgcgggg gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140 ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc 1320 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataatcta 1440 gagca 1445
<210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> origem <223> /nota="Descrição da Sequência Artificial: Polinucleotido Sintético" <400> 2
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Glu lie Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp lie Ser Ala Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala lie Asp 115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255
Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile 385 390 395 400
Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 3 <211> 751 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> origem <223> /nota="Descrição da Sequência Artificial: Polinucleotido Sintético" <400> 3 gaattctcga gatcgatctc accatgggat ggagctgtat catcctcttc ttggtagcaa 60 cagctacagg tgtccactcc gatgtagtga tgactcaaag tccactctcc ctgcctgtca 120 cccctggaga accagcttct atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aagagttatg 180 ggaacaccta tttgtcttgg tacctgcaga agcctggcca gtctccacag ctcctcatct 240 atgggatttc caacagattt tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga 300 cagatttcac actcaagatc tcgcgagtag aggctgagga cgtgggagtg tattactgct 360 tacaaggtac acatcagccg tacacgttcg gacaggggac caaggtggag atcaagcgta 420 cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 480 ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 540 aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 600 aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgaccctgag caaagcagac tacgagaaac 660 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 720 tcaacagggg agagtgttag tctagagcag c 751
<210> 4 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> origem <223> /nota="Descrição da Sequência Artificial: Polinucleotido Sintético" <400> 4
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45
Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly lie Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 115 120 125
Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140
Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175
Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 5 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> origem <223> /nota="Descrição da Sequência Artificial: Polinucleotido Sintético" <400> 5
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Lys Ser 20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu 15 10 15
Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Lys Asp He Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45
Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95
Pro He Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 8 <2ll> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8
Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9
Glu lie Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10
Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp Tyr 15 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser 15 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12
Gly lie Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr 1 5
<210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Leu Gin Thr Pro Gin Thr Phe Gly Gin Gly Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uma formulação compreendendo uma dose de 300 mg de vedolizumab de 60 mg / ml de vedolizumab a em histidina 50 mM, arginina a 125 mM, 0,06% de polissorbato 80, 10% de sacarose a pH 6,3 reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.
  2. 2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação liofilizada possui ^55% de isoforma carregado principal.
  3. 3. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação liofilizada possui ^ 95% de anticorpo monomérico.
  4. 4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação liofilizada possui £ 2,5% de agregado.
  5. 5. Formulação de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 para utilização no tratamento de uma doença ou desordem num indivíduo humano, em que a referida formulação está em uma quantidade eficaz para tratar a doença ou desordem.
  6. 6. Formulação da reivindicação 5, para utilização no tratamento de uma doença ou desordem num indivíduo humano, em que a formulação sólida é dissolvida num meio ou solvente adequado para se tornar uma formulação líquida antes da administração.
  7. 7. Formulação da reivindicação 6, para utilização no tratamento de uma doença ou desordem num indivíduo humano, em que o meio ou solvente adequado é solução salina isotónica.
  8. 8. Formulação da reivindicação 6 para utilização no tratamento de uma doença ou desordem num indivíduo humano, em que o meio ou solvente adequado é a solução de Ringer.
  9. 9. A formulação de qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, para utilização no tratamento da doença inflamatória intestinal.
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