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BRPI0710826A2 - composições farmacêuticas de anticorpo anti-cd40 antagonista - Google Patents

composições farmacêuticas de anticorpo anti-cd40 antagonista Download PDF

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BRPI0710826A2
BRPI0710826A2 BRPI0710826-5A BRPI0710826A BRPI0710826A2 BR PI0710826 A2 BRPI0710826 A2 BR PI0710826A2 BR PI0710826 A BRPI0710826 A BR PI0710826A BR PI0710826 A2 BRPI0710826 A2 BR PI0710826A2
Authority
BR
Brazil
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monoclonal antibody
seq
composition
antibody
chir
Prior art date
Application number
BRPI0710826-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaofeng Lu
Bao-Lu Chen
Kidisti Araya
Augustus Okhamafe
Original Assignee
Novartis Ag
Xoma Technology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38556677&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0710826(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag, Xoma Technology Ltd filed Critical Novartis Ag
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Abstract

COMPOSIçõES FARMACEUTICAS DE ANTICORPO ANTI-CD4O ANTAGONISTA Composições farmacêuticas líquidas estáveis compreendendo um anticorpo anti-CD4O antagonista como um componente terapeuticamente ou farmaceuticamente ativo e métodos úteis na sua preparação são fornecidos. Estas composições compreendem o antagonista anti-CD4O, um agente de tamponamento para manter o pH da composição entre cerca de 5,0 e cerca de 7,0, e uma quantidade de arginina-HCl suficiente para tornar a composição líquida quase isotónica. As composições farmacêuticas contendo anticorpo anti-CD4O antagonista líquido estável da invenção encontram uso em métodos para tratar doenças proliferativas e doenças possuindo um componente autoimune e/ou inflamatório.

Description

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE ANTICORPO ΑΝΤΙ-CD40
ANTAGONISTA
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está direcionada ao campo dasformulações farmacêuticas, mais particularmente acomposições farmacêuticas líquidas estáveis compreendendoanticorpos anti-CD4 0 antagonistas para uso no tratamento dedoenças proliferativas e doenças possuindo um componenteauto-imune ou inflamatório.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Avanços recentes no desenvolvimento de tecnologia deengenharia genética forneceram uma variedade depolipeptídeos biologicamente ativos em quantidadessuficientemente grandes para uso como drogas. Ospolipeptídeos, entretanto, podem perder atividade biológicacomo um resultado de instabilidades físicas, incluindodesnaturação e formação de agregados solúveis e insolúveis,e uma variedade de instabilidades químicas, como hidrõlise,oxidação e desamidação. A estabilidade de polipeptídeos emformulações farmacêuticas líquidas pode ser afetada, porexemplo, por fatores como pH, força iônica, temperatura,ciclos repetidos de corigelamento-descongelamento, eexposição a forças de cisalhamento mecânicas como ocorredurante o processamento. Formação de agregados e perda deatividade biológica podem também ocorrer como um resultadode agitação física e interfaces de moléculas depolipeptídeos em solução e na interação líquido-ar emfrascos de armazenamento. Mudanças adaptáveis adicionaispodem ocorrer nos polipeptídeos adsorvidos a interfaces ar-líquido e sólido-líquido durante a compressão-extensão dasinterfaces resultando da agitação durante o transporte ououtros contextos. Tal agitação pode fazer com que aproteína emaranhe, agregue, forme partículas e, finalmente,precipite com outras proteínas adsorvidas. Para uma análisegeral de estabilidade de produtos farmacêuticos deproteína, ver, por exemplo, Manning e outros, (1989) Pharm.Res. 6:903-918, e Wang e Hanson, (1988) J. Parenteral Sei.Tech. 42:S14.
A instabilidade de formulações farmacêuticas líquidascontendo peptídeos estimulou a embalagem destas formulaçõessob a forma Iiofilizada juntamente a um meio líquidoadequado para reconstituição. Embora a liofilização melhorea estabilidade da composição em armazenamento, muitospolipeptídeos demonstram uma atividade reduzida, sejadurante o armazenamento no estado seco (Pikal, (1990)Biopharm. 27:26-30) ou como um resultado de formação deagregado ou perda de atividade catalítica na reconstituiçãocomo uma formulação líquida (ver, por exemplo, Carpenter eoutros, (1991) Develop. Biol. Standard 74:225-239;Broadhead e outros, (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 75:1169-1206; Mumenthaler e outros, (1994) Pharm. Res. 11:12-20;Carpenter e Crowe, (1988) Cryobiology 25:459-470; e Roser,(1991) Biopharm. 4:47-53). Enquanto o uso de aditivos temmelhorado a estabilidade de proteínas secas, muitasformulações rehidratadas continuam a possuir quantidadesinaceitáveis ou indesejáveis de proteína agregada inativa(ver, por exemplo, Townsend e DeLuca, (1983) J. Pharm. Sei.80:63-66; Hora e outros, (1992) Pharm. Res. 9:33-36;Yoshiaka e outros, (1993) Pharm. Res, 70:687-691). Também,a necessidade de reconstituição é uma inconveniência eintroduz a possibilidade de dosagem incorreta.
Anticorpos monoclonais produzidos de maneirarecombinante estão incluídos nos polipeptídeos úteisfarmaceuticamente. Entre esta classe de agentesterapêuticos, os anticorpos anti-CD4 0 antagonistas tendocomo alvo o membro CD4 0 receptor da família TNF demonstraser uma grande promessa para o tratamento de malignidadesrelacionadas a célula B e malignidades não hematológicas,assim como doenças possuindo um componente auto-imune e/ouinf lamatório. O receptor de CD4 0 é um antígeno desuperfície celular de 50 a 55 kDa presente na superfície decélulas B humanas tanto neoplásticas quanto normais,células dendríticas, monócitos, macrófagos, células T CD8+,células endoteliais, monocíticas e epiteliais, algunscarcinomas epiteliais e muitos tumores sólidos, incluindocânceres de pulmão, mama, ovário, bexiga e cólon. 0antígeno de CD4 0 é também expresso em células T ativadas,plaquetas ativadas, células musculares lisas vascularesinflamadas, eosinófilos, membranas sinoviais em artritereumatóide, fibroblastos dérmicos, e outros tipos de célulanão Iinfóide. Dependendo do tipo de célula expressandoCD4 0, á ligação pode induzir a adesão, diferenciação,ativação e proliferação intercelular.
Por exemplo, a ligação de CD40 a seu ligante cognato,CD4 0L (também denominado CD 154), estimula a proliferação ediferenciação de células B em células de plasma, produçãode anticorpo, mudança de isótipo, e geração de memória decélula B. Durante a diferenciação de células B, CD4 0 éexpresso em células pré-B mas se perde na diferenciação nascélulas de plasma. A expressão de CD4 0 em APCs desempenhaum papel co-estimulador importante na ativação destascélulas. Por exemplo, anticorpos monoclonais de anti-CD40agonistas (mAbs) mostraram imitar os efeitos de células Tauxiliares na ativação de células B. Quando apresentados emcélulas aderentes expressando FcyRII, estes anticorposinduzem a proliferação de célula C (Banchereau e outros,(1989) Science 251:70). Mais ainda, mAbs anti-CD40agonistas podem substituir o sinal de T auxiliar parasecreção de IgM, IgG e IgE na presença de IL-4 (Gascan eoutros, (1991)/. Iwmunol. 147:8). Além disso, mAbs anti-CD4 0 agonistas podem evitar a morte de células programadas(apoptose) de células B isoladas de linfonodos.
Estas e outras observações apoiam a atual teoria deque a interação de CD4 0 e CD40L desempenham um papelessencial na regulação de respostas imunes humoral emediada por célula. Estudos mais recentes revelaram umpapel muito mais amplo da interação CD4 0/CD4 0L em diversosprocessos fisiológicos e patológicos.
Assim, o acoplamento de CD4 0 por CD4 0L e subseqüenteativação da sinalização de CD4 0 são etapas necessárias pararespostas imunes normais; entretanto, a desregulação dasinalização CD40 pode levar à doença. Têm-se mostrado que ocaminho da sinalização CD4 0 está envolvido em doençaautoimune (Ichikawa e outros, (2002) J. Iwmunol. 169:2781-2787 e Moore e outros, (2002) J. Autoimwun. 19:139-145).Adicionalmente, a interação CD4 0/CD4 0L desempenha um papelimportante em processos inflamatórios. Por exemplo, tantoCD4 0 quanto CD4 0L são superexpressados em lesões dearteriosclerose humana e experimental. 0 estímulo de CD40induz a expressão de enzimas de degradação de matriz eexpressão de fator de tecido em tipos de célula associadosa ateroma, como células endoteliais, células musculareslisas e macrófagos. Além disso, o estímulo de CD40 induz aprodução de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 eIL-8 e moléculas de adesão como ICAM-1, E-selectina e VCAM.A inibição da interação CD40/CD4 0L evita a aterogênese emmodelos animais. Em modelos de transplante, o bloqueio dainteração CD40/CD40L evita a inflamação. Foi mostrado que aligação CD40/CD40L age sinergisticamente com o peptídeoamilóide-beta de Alzheimer para promover a ativaçãomicroglial, levando assim a neurotoxicidade. EM pacientescom artrite reumatóide (RA), a expressão de CD40 éaumentada em condrócitos articulares, assim, a sinalizaçãoCD40 provavelmente contribui para a produção de citocinasdanosas e metaloproteinases de matriz. Ver Gotoh e outros,(2004) J. Rheumatol. 31:1506-1512.
De forma similar, células B malignas de tipos de tumorde linhagem de células B expressam CD40 e parecem dependerda sinalização CD40 para sobrevivência e proliferação.Células transformadas de pacientes com linfomas de célulasB de baixo ou alto grau, leucemia linfoblástica aguda decélulas B, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica,macroglobulinemia de Waldenstrom e doença de Hodgkinexpressam CD40. A expressão de CD40 é também detectada emdois terços dos casos de leucemia mieloblástica aguda e 50%dos linfomas relacionados à AIDS.
Um número de carcinomas e sarcomas também exibe altosníveis de expressão de CD40, embora o papel da sinalizaçãoCD40 em relação à expressão de CD40 nestas célulascancerosas seja menos compreendido. Os carcinomasexpressando CD40 incluem carcinoma de bexiga (Paulie eoutros, (1989) J. Immunol. 142:590-595/ Braesch-Andersen eoutros, (1989) J. Immunol. 142:562-567), carcinoma de mama(Hirano e outros, (1999) Blood 93:2999-3007; Wingettef eoutros, (1998) Breast Câncer Res. Treat. 50:27-36); câncerde próstata (Rokhlin e outros, (1997) Câncer Res. 57:1758-1768), carcinoma de célula renal (Kluth e outros, (1997)Câncer Res. 57:891-899), carcinoma indiferenciadonasofaringeal (UNPC) (AgathanggeIou e outros, (1995) Am. J.Pathol. 147:1152-1160), carcinoma de célula escamosa (SCC)(Amo e outros, (2000) Eur. J. Dermatol. 10:438-442; Posnere outros, (1999) Clin. Câncer Res. 5:2261-2270), carcinomapapilar de tireóide (Smith e outros, (1999) Thyroid 9:749-755) , melanoma maligno cutâneo (van den Oord e outros,(1996) Am. J. Pathol. 149:1953-1961), carcinoma gástrico(Yamaguchi e outros, (2003) Int. J. Oncol. 23(6): 1697-702) , e carcinoma de fígado (ver, por exemplo, Sugimoto eoutros, (1999) Hepatology 30 (4) :920-26, discutindocarcinoma hepatocelular humano). Para sarcomas expressandoCD40, ver, por exemplo, Lollini e outros, (1998) Clin.Câncer Res. 4(8): 1843-849, discutindo osteosarcoma humanoe sarcoma de Ewing.
Dados os benefícios terapêuticos potenciais deanticorpos anti-CD40 antagonistas na regulação desinalização de CD40 mediada por CD40L em vários cânceres edoenças auto-imunes/inflamatórias, e os desafios deformular estes polipeptídeos, composições farmacêuticasestáveis compreendendo estes anticorpos se fazemnecessárias.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃOComposições farmacêuticas líquidas estáveiscompreendendo um anticorpo anti-CD40 antagonista como umcomponente terapeuticamente ou profilaticamente ativo emétodos úteis em sua preparação são fornecidos. Estascomposições compreendem o anticorpo anti-CD40 antagonista,um agente de tamponamento para manter o pH da composiçãoentre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0 e uma quantidade dearginina-HCl suficiente pata tornar a composição líquidaquase isotônica. Em algumas modalidades, o agente detamponamento é um tampão citrato/ácido cítricô, o anticorpoanti-CD40 antagonista é o CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 anticorpoanti-CD40 antagonista ou fragmento de ligação a antígenodestes, a composição compreende arginina-HCl como o agenteisotonificante, e a composição compreende ainda umtensoativo não iônico e/ou L-metionina como agentesestabilizantes adicionais. O anticorpo anti-CD40antagonista líquido estável contendo as composiçõesfarmacêuticas da invenção encontram uso em métodos para otratamento de doenças proliferativas e doenças possuindo umcomponente autoimune e/ou inflamatório.
BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra o efeito de espécies de tampões napureza de formulação de mAb CHIR-12.12 armazenadas a 25°Cpor 3 meses ou 5 meses conforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 2 mostra o efeito de espécies de tampões naformação de agregado de mAb CHIR-12.12 nas váriasformulações de anticorpo armazenadas a 25°C por 3 meses ou5 meses conforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 3 mostra o efeito de espécies de tampões nafragmentação de mAb CHIR-12.12 nas várias formulações deanticorpo armazenadas a 25 0C por 3 meses ou 5 mesesconforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 4 mostra o efeito de espécies de tampões napureza de formulação de mAb CHIR-12.12 armazenadas a 40°Cpor 3 meses ou 5 meses conforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 5 mostra o efeito de espécies de tampões naformação de agregado de mAb CHIR-12.12 nas váriasformulações de anticorpo armazenadas a 4O0C por 3 meses ou5 meses conforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 6 mostra o efeito de espécies de tampões nafragmentação de mAb CHIR-12.12 nas várias formulações deanticorpo armazenadas a 4 0°C por 3 meses ou 5 mesesconforme medido por análise de SEC-HPLC.
A Figura 7 mostra termogramas de calorimetriadiferencial de varredura para mAb CHIR-12.12 nasformulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HCl como agenteisotonificante.
A Figura 8 mostra o percentual de forma de monômero demAb CHIR-12.12 restante nas formulações contendo ou NaCl ouL-arginina-HCl como o agente isotonificante quandoarmazenado a 250C por 2, 4 ou 6 meses, conforme medido porSEC-HPLC.
A Figura 9 mostra o percentual de forma de monômero demAb CHIR-12.12 restante nas formulações contendo ou NaCl ouL-arginina-HCl como o agente isotonificante quandoarmazenado a 250C por 2, 4 ou 6 meses, conforme medido porSEC-HPLC.
A Figura 10 mostra o percentual de fragmentos de mAbCHIR-12.12 nas formulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HCl como o agente isotonificante guando armazenadas a 250Cpor 2, 4 ou 6 meses, conforme medido por SEC-HPLC.
A Figura 11 mostra o percentual de forma de monômerode mAb CHIR-12.12 restante nas formulações contendo ou NaClou L-arginina-HCl como o agente isotonificante quandoarmazenadas a 4O0C por 2, 4 ou 6 meses, conforme medido porSEC-HPLC.
A Figura 12 mostra o percentual de agregados de mAbCHIR-12.12 nas formulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HCl como o agente isotonificante quando armazenadas a 40°Cpor 2, 4 ou 6 meses, conforme medido por SEC-HPLC.
A Figura 13 mostra o percentual de fragmentos de mAbCHIR-12.12 nas formulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HCl como o agente isotonificante quando armazenadas a 4O0Cpor 2, 4 ou 6 meses, conforme medido por SEC-HPLC.
A Figura 14 mostra o percentual de pureza de mAb CHIR-12.12 nas formulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HClcomo o agente isotonificante quando armazenadas a 25°C por2, 4 ou 6 meses, conforme medido por CIEX-HPLC.
A Figura 15 mostra o percentual de variantes ácidas demAb CHIR-12.12 restante nas formulações contendo ou NaCl ouL-arginina-HCl como o agente isotonificante quandoarmazenadas a 250C por 2, 4 ou 6 meses, conforme medido porCIEX-HPLC.
A Figura 16 mostra o percentual de variantes básicasde mAb CHIR-12.12 nas formulações contendo ou NaCl ou L-arginina-HCl como o agente isotonificante quandoarmazenadas a 250C por 2, 4 ou 6 meses, conforme medido porCIEX-HPLC.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As presentes invenções serão agora descritas de formamais completa daqui por diante, com referência aos desenhosem anexo, nos quais algumas, mas não todas, modalidades dasinvenções são mostradas. Certamente, estas invenções podemter modalidades de muitas formas diferentes e não devem serinterpretadas como limitadas às modalidades aqui expostas;pelo contrário, estas modalidades são fornecidas de formaque esta divulgação satisfaça exigências legais aplicáveis.Muitas modificações e outras modalidades da invençãoexpostas aqui virão à mente daqueles habilitados na técnicaà qual estas invenções pertencem possuindo o beneficio dosensinamentos apresentados nas descrições supracitadas edesenhos associados. Portanto, deve-se compreender que asinvenções não estão limitadas às modalidades específicasdivulgadas e que modificações e outras modalidades sãoobjetivadas para estarem inclusas dentro do escopo dasreivindicações em anexo. Embora termos específicos sejamaqui empregados, eles são usados em um sentido genérico edescritivo apenas e não para propósitos de limitação.
A presente invenção está direcionada a composiçõesfarmacêuticas líquidas estáveis compreendendo pelo menos umanticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmento de ligação aantígeno deste como um componente terapeuticamente ouprofilaticamente ativo, e a métodos úteis em suaspreparações. Para as finalidades da presente invenção, otermo "líquido", com relação a composições farmacêuticas ouformulações pretende incluir o termo "aquoso/a". Por"componente terapeuticamente ou profilaticamente ativo",pretende-se significar que o anticorpo anti-CD40antagonista ou fragmento de ligação a antígeno deste estátipicamente incorporado na composição para trazer umaresposta terapêutica ou profilãtica desejada em relação atratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença oucondição em um indivíduo quando a composição farmacêutica éadministrada a este indivíduo.
Por "estável" pretende-se significar as composiçõesfarmacêuticas da invenção suprem a estabilidade física e/ouquímica do anticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmente deligação a antígeno deste. Isto ê, o anticorpo anti-CD40antagonista ou fragmento de ligação ao antígeno deste,essencialmente retém sua estabilidade física e/ou química epossui a atividade biológica desejada, isto ê, uma ou maisdas atividades antagonistas definidas aqui em outromomento, incluindo, mas não limitando a: inibição desecreção de imunoglobulina por células B periféricashumanas normais estimuladas pro células T; inibição dasobrevivência e/ou proliferação de células B periféricashumanas normais estimuladas por células T de Jurkat;inibição de sobrevivência e/ou proliferação de células Bperiféricas humanas normais estimuladas por célulasexpressando CD40L ou ligante de CD40 solúvel (sCD40L);inibição de "sobrevivência" de sinais intracelulares anti-apoptóticos em qualquer célula estimulada por SCD40L ouCD40L de fase sólida; inibição de transdução de sinal deCD40 em qualquer célula quando da ligação a SCD40L ou CD40Lde fase sólida; inibição de proliferação de células Bmalignas; indução de deleção, anergia e/ou tolerância decélulas alvo portando CD40 ou células portanto ligantescognatos a CD40 incluindo, mas não limitados a, células T ecélulas Β; indução de expansão ou ativação de células Treguladoras de CD4+CD25+ (ver, por exemplo, rejeição detecido específica de aloantígeno de doador viainterferência de CD40-CD40L, van Maurik e outros, (2002) J.Immunol. 169:5401-5404); citotoxicidade através de qualquermecanismo (incluindo, mas não limitado a, citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC),citotoxicidade dependente de complemento (CDC), regulaçãopara baixo de proliferação e/ou apoptose em células alvo);modulação de secreção de citocina de célula alvo e/ouexpressão de molécula de sup; e combinações destes.
Métodos para monitoramento de estabilidade de proteínasão bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Jones(1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991)Peptide and Protein Drug Delivery (Mareei Dekker, Inc., NewYork, New York); e os ensaios de estabilidade divulgadosaqui abaixo. Geralmente, a estabilidade de proteína émedida a uma dada temperatura para um período de tempoespecífico. Em modalidades preferidas, uma composiçãofarmacêutica de anticorpo estável proporciona estabilidadedo anticorpo anti-CD4 0 antagonista ou fragmento de ligaçãoao antígeno deste quando armazenada à temperatura ambiente(cerca de 25°C) por pelo menos 1 mês, pelo menos 3 meses,ou pelo menos 6 meses, e/ou é estável a cerca de 2 a 8°Cpor pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 12meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses.
Uma proteína como um anticorpo, quando formulada emuma composição farmacêutica, é considerada para reter suaestabilidade física a um dado ponto no tempo se não mostrarnenhum sinal visual (por exemplo, descoloração ou perda declaridade) ou sinais mensuráveis (por exemplo, utilizando-se cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) ou dispersãode luz UV) de precipitação, agregação e/ou desnaturaçãonaquela composição farmacêutica. Com relação a estabilidadequímica, uma proteína como um anticorpo, quando formuladoem uma composição farmacêutica, considera-se que mantenhasua estabilidade química a um dado ponto no tempo semedições de estabilidade química são indicativas de que aproteína (isto é, anticorpo) mantém sua atividade biológicade interesse nesta composição farmacêutica. Métodos paramonitorar mudanças em estabilidade química são bemconhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a,métodos para detectar formas quimicamente alteradas daproteína como resultado de clipagem utilizando, porexemplo, SDS-PAGE, SEC e/ou ionização de dessorção a laserassistida por matriz/espectrometria de massa por tempo devôo; e degradação associada a mudanças na carga molecular(por exemplo, associada a desamidação), utilizando-se, porexemplo, cromatografia de troca iônica. Ver, por exemplo,os métodos divulgados aqui abaixo.
Um anticorpo anti-CD4 0 antagonista ou fragmento deligação ao antígeno deste, quando formulado em umacomposição farmacêutica, deve reter uma atividade biológicadesejada em um dado ponto de tempo se a atividade biológicadesejada naquele ponto de tempo está dentro de cerca de30%, preferivelmente em cerca de 20% da atividade biológicadesejada exibida no momento em que a composiçãofarmacêutica foi preparada conforme determinado em umensaio adequado para a atividade biológica desejada.Ensaios para medir a atividade biológica desejada doanticorpo anti-CD40 antagonista aqui divulgado e fragmentosde ligação ao antígeno deste podem ser executados conformedescrito nos pedidos provisórios intitulados nAntagonistAnti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use",depositados em 4 de novembro de 2003, 26 de novembro de2003 e 27 de abril de 2004, e Patentes U. S. cedidas denúmero 60/517.337 (procuração de número PP20107.001(035784/258442)), 60/525.579 (procuração de númeroPP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (procuração denúmero PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente; ePedidode de Patente Internacional de númeroPCT/US2004/03 7152 (procuração de número PP20107.004(035784/282916)), também intitulada "Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" depositadaem 4 de novembro de 2004 e publicada como WO 2005/044854; oconteúdo de cada uma das quais está aqui incorporado porreferência em sua totalidade. Ver também os ensaiosdescritos no pedido de patente provisório intituladonMethods for Diagnosis and Treatment of ProliferativeDisorders Mediated by CD40 Signaling", depositado em 9 dedezembro de 2005, e Pedido de Patente U.S. cedida de número60/749.285 (procuração de número PP028035.0002(035784/304312)), e Pedido de Patente Internacionaocorrespondente de número PCT/US2006/019414 (procuração denúmero PP028035.0003 (035784/311611)), depositado em 18 demaio de 2006 e publicado como WO 2006/125143; e pedido depatente provisório intitulado "Methods for Diagnosis andTreatment of Diseases Having an Autoimmune and/orInflammatory Component," depositado em 9 de dezembro de2005, e Patente U. S. cedida de número 60/749.336(procuração de número PP028062.0002 (035784/304311)}, ePedido de Patente Internacional correspondente de númeroPCT/US2006/019325 (procuração de número PP028062.0003(035784/311608)), depositado em 18 de maio de 2006 epublicado como WO 2006/125117; o conteúdod e cada uma dasquais está aqui incorporado por referência em suatotalidade. Ver também os ensaios descritos em Schultze eoutros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204;Denton e outros (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans eoutros, (2000) J. Iwmunol. 164:688-697; Noelle, (1998)Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman e outros, (1996)Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligane e outros, (1991)Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom e outros,(1993) Immunology 79:439-444; e Patentes U. S. de número5.674.4 92 e 5.84 7.082, aqui incorporadas por referência.
O anticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmento deligação ao antígeno deste que deve ser formulado de acordocom os métodos da presente invenção, podem ser preparadosutilizando-se qualquer método conhecido na técnica,incluindo aqueles métodos divulgados em outras partesdesta. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD40antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, peproduzido de forma recombinante em uma linhagem celular CHOconforme descrito aqui abaixo.
Após sua preparação e purificação, o anticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmento de ligação ao antígeno destepode ser formulado como uma composição líquida farmacêuticada maneira aqui exposta. Onde o anticorpo anti-CD40antagonista ou fragmento de ligação ao antígeno deste deveser armazenado antes de sua formulação, o mesmo pode sercongelado, por exemplo, abaixo de -20°C e entãodescongelado à temperatura ambiente para posteriorformulação.
As composições farmacêuticas líquidas da invençãocompreendem uma quantidade efetiva terapeuticamente ouprofilaticamente do anticorpo anti-CD40 antagonista oufragmento de ligação a antígeno deste. A quantidade deanticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno destepresente da formulação leva em consideração a via deadministração e volume de dosagem desejado.
Desta forma, as composições farmacêuticas líquidas dapresente invenção compreendem o anticorpo anti-CD40antagonista, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígeno destes a umaconcentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL,de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 40,0 mg/mL, de cerca de1,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, de cerca de 1,0 mg/mL acerca de 30,0 mg/mL, de cerca de 5,0 mg/mL a cerca de 25,0mg/mL, de cerca de 5,0 mg/mL a cerca de 20,0 mg/mL, decerca de 10,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, ou de cerca de15,0 mg/mL a cerca de 25,0 mg/mL. Em algumas modalidades, acomposição farmacêutica líquida compreende o anticorpoanti-CD4 0 antagonista ou fragmento de ligação ao antígenodeste a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de5,0 mg/mL, de cerca de 5,0 mg/mL a cerca de 10,0 mg/mL, decerca de 10,0 mg/mL a cerca de 15,0 mg/mL, de cerca de 15,0mg/mL a cerca de 2 0,0 mg/mL, de cerca de 20,0 mg/mL a cercade 25,0 mg/mL, de cerca de 25,0 mg/mL a cerca de 30,0mg/mL, de cerca de 30,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, decerca de 35,0 mg/mL a cerca de 40,0 mg/mL, de cerca de 40,0mg/mL a cerca de 45,0 mg/mL, ou de cerca de 45,0 mg/mL acerca de 50,0 mg/mL. Em outras modalidades, a composiçãofarmacêutica líquida compreende o anticorpo anti-CD4 0antagonista ou fragmento de ligação ao antígeno deste a umaconcentração de cerca de 15,0 mg/mL, cerca de 16,0 mg/mL,cerca de 17,0 mg/mL, cerca de 18,0 mg/mL, cerca de 19,0mg/mL, cerca de 20,0 mg/mL, cerca de 21,0 mg/mL, cerca de22,0 mg/mL, cerca de 23,0 mg/mL, cerca de 24,0 mg/mL, cercade 25,0 mg/mL, cerca de 26,0 mg/mL, cerca de 27,0 mg/mL,cerca de 28,0 mg/mL, cerca de 29,0 mg/mL, cerca de 30,0mg/mL, cerca de 31,0 mg/mL, cerca de 32,0 mg/mL, cerca de33,0 mg/mL, cerca de 34,0 mg/mL, ou cerca de 35,0 mg/mL.
De acordo com a presente invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 descritos aqui abaixo, ou fragmento deligação ao antígeno destes, é formulado com um tampão quemantém o pH da composição farmacêutica na faixa de cerca pH5,0 a pH 7,0, e uma quantidade de arginina em sua formaácida, aqui chamada de arginina-HCl, suficiente para tornara composição quase isotônica. Por "quase isotônica"pretende-se dizer que a formulação aquosa possui umaosmolalidade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360mmol/kg, preferivelmente cerca de 240 a cerca de 340mmol/kg, mais pref erivelmente cerca de 250 a cerca de 330mmol/kg, ainda mais preferivelmente de cerca de 260 a cercade 320 mmol/kg, ainda mais preferivelmente de cerca de 270a cerca de 310 mmol/kg. Em algumas modalidades, acomposição líquida farmacêutica possui uma osmolalidade decerca de 295 mmol/kg. Métodos para determinar a18/144
isotonicidade de uma solução são conhecidos daqueleshabilitados na técnica. Ver, por exemplo, Setnikar ooutros, (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628.
A arginina-HCl não apenas serve como um agenteisotonificante, mas também serve para estabilizar oanticorpo contra mudanças de conformação, formação deagregados, fragmentação e/ou desamidação durante oarmazenamento das composições farmacêuticas líquidas dainvenção. Por "durante o armazenamento" pretende-se dizerque uma composição ou formulação farmacêutica líquida, umavez preparada, não é imediatamente administrada a umindivíduo. Preferencialmente, após a preparação, a mesma éembalada para armazenamento, ou em forma líquida, em umestado congelado, ou em forma seca para posteriorreconstituição em uma forma líquida ou outra forma adequadapara administração a um indivíduo. Por "forma seca",pretende-se dizer que a composição ou formulaçãofarmacêutica líquida é seca ou por liofilização (ver, porexemplo, Williams e Polli, (1984) J. Parenteral Sei.Technol. 35:48-59), secagem por pulverização (ver Masters,(1991) em Spray-Drying Handbook (5a ed. ; Longman Scientificand Technical, Essez, U.K.), págs. 491-676; e Broadhead eoutros, (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206;Mumenthaler e outros, (1994) Pharm. Res. 77:12-20; ousecagem a ar (Carpenter e Crowe, (1988) Cryohiology 25:459-470; e Roser, (1991) Biopharm. 4:47-53). Mudanças deconformação, formação de agregado, fragmentação e/oudesamidação de um anticorpo durante o armazenamento de umacomposição farmacêutica líquida podem afetar de formaadversa a atividade biológica do anticorpo, resultando emperda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica.Além disso, a formação de agregado pode causar outrosproblemas como bloqueio de tubos, membranas ou bombasquando a composição farmacêutica contendo os anticorpos foradministrada utilizando-se um sistema de infusão.
Qualquer estereoisômero (isto é, isômero L, D ou DL)de arginina ou combinações destes estereoisômeros podeestar presente nas composições farmacêuticas da invençãodesde que a arginina esteja presente em sua forma ácida,isto é, arginina-HCl. Preferivelmente, o estereoisômero L éutilizado. Composições da invenção pode também serformuladas com análogos deste aminoácido. Por "análogo deaminoácido" pretende-se um derivado do aminoácido queocorre naturalmente e que causa o efeito desejado de tornara composição quase isotônica, assim como reduz a formaçãode agregado, fragmentação e/ou desamidação do polipeptídeodurante o armazenamento das composições farmacêuticas dainvenção. Análogos de arginina adequados incluem, porexemplo, aminoguanidina e N-monoetil L-arginina. Assim comocom a arginina, os análogos de aminoácido são incorporadosnas composições em sua forma ácida.
A concentração de arginina-HCl na composiçãofarmacêutica dependerá da contribuição de outroscomponentes para a tonicidade. Em algumas modalidades, aconcentração de arginina-HCl é de cerca de 50 mM a cerca de300 mM, de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM, de cerca de 50mM a cerca de 200 mM, de cerca de 50 mM a cerca de 175 mM,de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, de cerca de 75 mM acerca de 175 mM, de cerca de 75 mM a cerca de 150 mM, decerca de 100 mM a cerca de 175 mM, de cerca de 100 mM acerca de 200 mM, de cerca de 100 mM a cerca de 150 mM, decerca de 125 mM a cerca de 175 mM, de cerca de 125 mM acerca de 150 mM, de cerca de 130 mM a cerca de 170 mM, decerca de 130 mM a cerca de 160 mM, de cerca de 135 mM acerca de 155 mM, de cerca de 140 mM a cerca de 155 mM, oucerca 145 mM a cerca de 155 mM. Em uma tal modalidade, aconcentração de arginina-HCl é de cerca de 125 mM, cerca de150 mM ou cerca de 175 mM.
O pH de uma composição farmacêutica contendoanticorpos líquida afeta a estabilidade do anticorpocontido na mesma, principalmente através de seu efeito naformação de agregados de polipeptídeo. Assim, a quantidadede agente de tamponamento presente nas composiçõesfarmacêuticas da invenção variará dependendo do pH idealpara a estabilidade de um anticorpo anti-CD4 0 antagonistaparticular de interesse. A determinação deste pH ideal podeser alcançada utilizando-se métodos geralmente disponíveisna técnica, incluindo, por exemplo, CalorimetriaDiferencial de Varredura (DSC), que avalia a estabilidadede conformação; SDS-PAGE e cromatografia de exclusão detamanho (SEC-HPLC), que avalia a agregação e fragmentação;e análise de HPLC de troca catiônica (CIEX-HPLC) , queavalia a degradação relacionada à troca de carga. Os pHpreferidos para as composições farmacêuticas líquidas dainvenção são de cerca de pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5,5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7,6,8, 6,9, 7,0, e outros valores na faixa de cerca de pH 5,0a cerca de pH 7,0. Em algumas modalidades, o agente detamponamento mantém o pH da composição farmacêutica nafaixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, de cerca de pH5,0 a cerca de pH 6,0, de cerca de pH 5,0 a cerca de pH5,5, de cerca de pH 5,5 a cerca de 7,0, de cerca de pH 5,5a cerca de pH 6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0.
Qualquer agente de tamponamento adequado que mantenhao pH da composição farmacêutica de anticorpo anti-CD40antagonista líquida na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca depH 7,0 pode ser utilizado na formulação, desde que aestabilidade fisicoquímica e atividade biológica desejadado anticorpo sejam mantidas conforme observadas aqui acima.Agentes de tamponamento adequados incluem, mas não estãolimitados a, ácidos convencionais e sais destes, onde ocontra-íon pode ser, por exemplo, sódio, potássio, amônio,cálcio ou magnêsio. Exemplos de ácidos convencionais e saisdestes que podem ser utilizados para tamponar a composiçãofarmacêutica líquida incluem, mas não estão limitados a,tampões de ácido cítrico ou citrato, ácido succínico ousuccinato, ácido acêtico ou acetato, ácido tartárico outartarato, ácido fosfórico ou fosfato, ácido glucônico ougluconato, ácido glutâmico ou glutamato, ácido aspártico ouaspartato, ácido maléico ou maleato e ácido málico oumalato. É reconhecido que o agente de tamponamento pode seruma mistura do ácido e da forma de sal do ácido, porexemplo, uma mistura de ácido cítrico e citrato (aquichamado de tampão citrato/ácido cítrico), uma mistura deácido succínico e succinato (aqui chamado de tampãosuccinato/ácido succínico), uma mistura de ácido acético eacetato (aqui chamado de tampão acetato/ácido acético) esimilares para cada um dos pares ácido/sal de ácido acima.A concentração do agente de tamponamento pode ser de cercade 1 mM a cerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM,45 mM, 50 mM, ou outros valores tais na faixa de cerca de 1mM a cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a concentraçãodo agente de tamponamento é de cerca de 5 mM a cerca de 15mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM,11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, ou outros valores taisna faixa de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM.
Em algumas modalidades da invenção, a composiçãofarmacêutica líquida compreende a concentração desejada(isto é, cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL conformeobservado acima) de um anticorpo anti-CD40 antagonistadescrito aqui em outro momento, por exemplo, o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligaçãoao antígeno destes, uma quantidade de arginina-HCl paratornar a composição quase isotônica e um agente detamponamento que é um tampão de ácido cítrico/citrato, ondea concentração do agente de tamponamento é tal que o agentede tamponamento mantém o pH da composição farmacêutica nafaixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, preferivelmentecerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, incluindo cerca de 5,0,5,5, 6,0 e 6,5. Por "citrato" significa um tampãocompreendendo um sal do ácido cítrico. Em uma modalidadepreferida, o contra-íon do citrato é o cátion sódio, eassim o componente de tampão de citrato é um citrato desódio. Entretanto, espera-se que qualquer cátion sejaefetivo. Outros cátions de citrato possíveis incluem, masnão estão limitados a, potássio, amônio, cálcio e magnésio.Conforme observado acima, o tampão citrato/ácido cítricocompreende uma mistura de ácido (isto é, ácido cítrico) e aforma de sal do ácido (isto é, citrato) , onde o contra-íonna forma de sal do ácido pode ser qualquer cátion adequado.Em uma determinada modalidade, o contra-íon para a forma desal do ácido é o cátion sódio, e assim o agente detamponamento compreende uma mistura de ácido cítrico ecitrato de sódio. Conforme observado acima, a concentraçãodo tampão citrato/ácido cítrico pode ser de cerca de 1 mM acerca de 50 mM, incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM,10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50mM, ou outros valores tais na faixa de cerca de 1 mM acerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração dotampão citrato/ácido cítrico é de cerca de 5 mM a cerca de15 mM, incluindo cerca de 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ou cerca de 15 mM.
Em outras modalidades, a composição farmacêuticalíquida compreende um anticorpo anti-CD4 0 antagonista, comoo anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmentode ligação ao antígeno destes, a uma concentração de cercade 0,1 mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL, cerca de 5,0 mg/mL acerca de 35,0 mg/mL, cerca de 10,0 mg/mL a cerca de 35,0mg/mL, ou cerca de 10,0 mg/mL a cerca de 20,0 mg/mL; umaquantidade de arginina-HCl para tornar a composição quaseisotônica; e o agente de tamponamento é um tampão decitrato/ácido cítrico a uma concentração de cerca de 1 mM acerca de 20 mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM,preferivelmente cerca de 10 mM. Ainda em outrasmodalidades, a composição farmacêutica líquida compreendeum anticorpo anti-CD4 0 antagonista como o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou fragmento de ligaçãoao antígeno destes, em uma concentração de cerca de 0,1mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL, cerca de 5,0 mg/mL a cerca de35,0 mg/mL, cerca de IOiO mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, oucerca de 10,0 mg/mL a cerca de 20,0 mg/mL; uma quantidadede arginina-HCl para tornar a composição quase isotônica; eo agente de tamponamento sendo um tampão citrato/ácido cítrico a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 20mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, preferivelmente cercade 10 mM.
Em algumas modalidades preferidas, a composiçãofarmacêutica líquida compreende o anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígeno destes; umagente de tamponamento para manter o pH da composiçãofarmacêutica na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0;e a concentração de arginina-HCl é de cerca de 100 mM a cerca de 200 mM. Em algumas destas modalidades, o agente detamponamento ê um tampão de citrato/ácido cítrico e umaconcentração de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, acomposição farmacêutica líquida compreende o anticorpoanti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígenodestes, e a composição farmacêutica possui um pH de cercade 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0. Em outrasmodalidades, a composição farmacêutica líquida compreende o anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligaçãoao antígeno destes, a uma concentração de cerca de 0,1mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL, cerca de 5,0 mg/mL a cerca de35,0 mg/mL, ou cerca de 10,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL incluindo cerca de 10,0 mg/mL, cerca de 15,0 mg/mL, cercade 20,0 mg/mL, cerca de 25,0 mg/mL, cerca de 30,0 mg/mL oucerca de 35,0 mg/mL; cerca de 150 mM de arginina-HCl; e oagente de tamponamento é de cerca de 10 mM de tampão decitrato de sódio/ácido cítricô; onde a formulação possui umpH de cerca de pH 5,5.
A degradação da proteína devido aocongelamento/descongelamento ou cisalhamento mecânicodurante o processamento de formulações farmacêuticaslíquidas da presente invenção pode ser inibidaincorporando-se tensoativos na formulação a fim de baixar atensão superficial na interface solução-ar. Assim, emalgumas modalidades, a composição farmacêutica líquidacompreende um anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo,anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmentode ligação ao antígeno destes; um agente de tamponamentopara manter o pH da composição farmacêutica na faixa decerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0; uma quantidade dearginina-HCl para tornar a composição farmacêutica líquidaquase isotônica; e ainda compreende um tensoativo. Emoutras modalidades, a composição farmacêutica líquidacompreende um anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo,anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmentode ligação ao antígeno destes; um agente de tamponamentopara manter o pH da composição farmacêutica na faixa decerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0; arginina-HCl e umaconcentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM,ou cercade 100 mM a cerca de 2300 mM; e ainda compreende umtensoativo.
Tensoativos típicos empregados são tensoativos nãoiônicos, incluindo ésteres de polioxietileno sorbitol comopolisorbato 80 (Tween 80) e polisorbato 20 (Tween 20) ;êsteres de polioxipropileno-polioxietileno como PluronicF68; álcoois de polioxietileno como Brij 35; simeticona;polietileno glicol como PEG400; lisofosfatidilcolina; epolioxietileno-p-t-octilfenol como Triton X-100.Estabilização clássica de farmacêuticos por tensoativos ouemulsificantes é descrita, por exemplo, em Levine e outros,(1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3): 160-165, aquiincorporada para referência. Um tensoativo preferidoempregado na prática da presente invenção é o polisorbato20 ou polisorbato 80. Onde um tensoativo é incluído, étipicamente adicionado em uma quantidade de cerca de 0.001% a cerca de 1.0%, de cerca de 0.001% a cerca de 0.5%, decerca de 0.001% a cerca de 0.4%, de cerca de 0.001% a cercade 0.3%, de cerca de 0.001% a cerca de 0.2%, de cerca de0.005% a cerca de 0.5%, de cerca de 0.005% a cerca de 0.2%,de cerca de 0.01% a cerca de 0.5%, de cerca de 0.01% acerca de 0.2%, de cerca de 0.03% a cerca de 0.5%, de cercade 0.03% a cerca de 0.3%, de cerca de 0.05% a cerca de0.5%, ou de cerca de 0.05% a cerca de 0.2%, onde ospercentuais estão em uma base de peso/volume (p/v).
Assim, em algumas modalidades, a composiçãofarmacêutica líquida compreende um anticorpo anti-CD40antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígeno destes; oagente de tamponamento é um tampão de citrato/ácidocítrico, por exemplo, um tampão de citrato de sódio/ácidocítrico, e uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 50mM, cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 5 mM acerca de 15 mM; a composição possui um pH de cerca de pH5,0 a cerca de 7,0 pH, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5,ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0; arginina-HCl estápresente a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de300 mM, cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, ou cerca de 50mM a cerca de 150 mM; e a composição farmacêuticacompreende ainda um tensoativo, por exemplo, polisorbato20, em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%(p/v) ou cerca de 0,001% a cerca de 0,5% (p/v). Em outrasmodalidades, a composição farmacêutica líquida compreende oanticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligaçãoao antígeno destes, a uma concentração de cerca de 0.1mg/mL a cerca de 50.0 mg/mL, de cerca de 5,0 mg/mL a cercade 35,0 mg/mL, ou de cerca de 10,0 mg/mL a cerca de 35,0mg/mL, incluindo de cerca de 10,0 mg/mL, de cerca de 15,0mg/mL, de cerca de 20,0 mg/mL, de cerca de 25,0 mg/mL, decerca de 3 0,0 mg/mL, ou de cerca de 35,0 mg/mL; cerca de 50mM a cerca de 2 00 mM de arginina-HCl, incluindo cerca de150 mM de arginina-HCl; o agente de tamponamento é citratode sódio/ácido cítricô a uma concentração de cerca de 5 mMa cerca de 20 mM, incluindo cerca de 10 mM; e a composiçãofarmacêutica opcionalmente compreende um tensoativo, porexemplo, polisorbato 20, em uma quantidade de cerca de0,001% a cerca de 1,0% (p/v), incluindo cerca de 0,001% acerca de 0,5% (p/v), cerca de 0,01% a cerca de 0,25% (p/v),cerca de 0,1%0,025% a cerca de 0,2% (p/v), cerca de 0,025%a cerca de 0,1% (p/v) ou cerca de 0,05% a cerca de 0,2%(p/v); onde a composição farmacêutica possui um pH de cercade pH 5,0 a cerca de pH 7,0, de cerca de pH 5,0 a cerca depH 6,0, de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, de cerca depH 5,5 a cerca de pH 6,5, de cerca de pH 5,5 a cerca de pH6,0, ou cerca de pH 5,5.
A composição farmacêutica líquida pode estaressencialmente livre de quaisquer conservantes e outrosveículos, excipientes ou estabilizantes. Alternativamente,a composição farmacêutica pode, opcionalmente, incluir umou mais conservantes, por exemplo, agentes antibacterianos,veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ouestabilizantes aqui descritos, contanto que não afetem deforma adversa a estabilidade fisicoquímica do anticorpoanti-CD4 0 ou fragmento de ligação ao antígeno deste.Exemplos de veículos, excipientes e estabilizantesaceitáveis incluem, mas não estão limitados a, agentes detamponamento adicionais, co-solventes, tensoativos,antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina,agentes quelantes como ADTA, complexos metálicos (porexemplo, complexo Zn-proteína) e polímeros biodegradáveiscomo poliésteres. Uma discussão completa de formulação eseleção de veículos, estabilizantes e isomólitosfarmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados emRemingtoWs Pharwaceutical Sciences (18a ed. ; MackPublishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990),aquiincorporado por referência.
Assim, em uma modalidade, as composições farmacêuticaslíquidas de anticorpo anti-CD40 antagonista da invençãocompreendem ainda o aminoácido metionina para inibir aoxidação de resíduos de aminoácidos oxidáveis nas cadeiasde anticorpo de polipeptídeo. Por "inibir" refere-se amínimo acúmulo de espécies oxidáveis ao longo do tempo.Inibir a oxidação resulta em maior retenção do anticorpoanti-CD4 0 antagonista em sua forma molecular apropriada.Qualquer estereoisômero de metionina (isômero L, D ou DL)ou combinações destes podem ser utilizados. A quantidade aser adicionada deve ser uma quantidade suficiente parainibir a oxidação dos resíduos de aminoácidos oxidáveis deforma que a quantidade de espécies oxidáveis seja aceitávelpara agências reguladoras. Tipicamente, isto significa quea composição contém não mais que cerca de 10% a cerca de30% de produtos de oxidação. Geralmente, isto pode seratingido adicionando-se metionina de forma que a razãoentre metionina adicionada e resíduos de metionina variemde cerca de 1:1 a cerca de 1.000:1, mais preferivelmente10:1 a cerca de 100:1.
A quantidade preferida de metionina a ser adicionadapode ser prontamente determinada empiricamente preparando acomposição compreendendo o anticorpo anti-CD40 antagonistade interesse, ou fragmento de ligação ao antígeno deste comdiferentes concentrações de metionina e determinando oefeito relativo na formação de espécies oxidativas dopolipeptídeo utilizando, por exemplo, separaçãocromatográfica da espécie molecular e identificaçãoutilizando-se padrões de peso molecular de polipeptídeo, deforma que com RP-HPLC, ou cromatografia de interaçãohidrofóbica (HIC) conforme descrito abaixo no Exemplo 1.Esta concentração de metionina que maximiza a inibição deoxidação de resíduos de aminoácidos oxidáveis, sem possuirefeitos adversos na inibição relacionada a aminoácido deagregação de anticorpo representaria uma quantidadepreferida de metionina a ser adicionada à composição paraadicionalmente melhorar a estabilidade do anticorpo.Assim, em algumas modalidades da invenção, acomposição farmacêutica líquida compreende um anticorpoanti-CD40 antagonista, por exemplo, o anticorpo monoclonalCHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou fragmento de ligação ao antígenodestes; o agente de tamponamento é um tampão decitrato/ácido cltrico, por exemplo, um tampão de citrato desódio/ácido cítricô, a uma concentração de cerca de 1 mM acerca de 50 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou decerca de 5 mM a cerca de 15 mM; a composição farmacêuticapossui um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, de cercade pH 5,0 a cerca de pH 6,5, ou de cerca de pH 5,5 a cercade pH 6,0; a arginina-HCl está presente em uma concentraçãode cerca de 50 mM a cerca de 3 00 mM, de cerca de 100 mM acerca de 200 mM, ou de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM; umtensoativo está presente, por exemplo, polisorbato 20 oupolisorbato 80, em uma quantidade de cerca de 0,001% acerca de 1,0% (p/v) ou de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%(p/v); e a composição farmacêutica compreende aindametionina a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de20,0 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 10,0 mM, de cerca de1,0 mM a cerca de 20,0 mM, de cerca de 1,0 mM a cerca de10,0 mM, de cerca de 1,0 mM a cerca de 7,0 mM, de cerca de2,0 mM a cerca de 6,0 mM, ou de cerca de 2,5 mM a cerca de5,0 mM. Em outras modalidades, a composição farmacêuticalíquida compreende um anticorpo anti-CD40 antagonista, porexemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 oufragmento de ligação ao antígeno destes, a uma concentraçãode cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL, de cerca de5,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, ou de cerca de 10,0 mg/mLa cerca de 35,0 mg/mL, incluindo de cerca de 10,0 mg/mL, decerca de 15,0 mg/mL, de cerca de 20,0 mg/mL, de cerca de25,0 mg/mL, de cerca de 30,0 mg/mL, ou cerca de 35,0 mg/mL;de cerca de 50 mM a cerca de 200 mM de arginina-HCl,incluindo cerca de 150 mM de arginina-HCl; tampão decitrato de sódio/ácido cítrico a uma concentração de cercade 5 mM a cerca de 20 mM, incluindo cerca de 10mM;opcionalmente um tensoativo, por exemplo, polisorbato20, em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%(p/v), incluindo de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% (p/v),de cerca de 0,01% a cerca de 0,25% (p/v), de cerca de0,025% a cerca de 0,2% (p/v), de cerca de 0,025% a cerca de0,1% (w/v), ou de cerca de 0,05% a cerca de 0,2% (w/v); e,opcionalmente, metionina, por exemplo, a uma concentraçãode cerca de 0,5 mM a cerca de 10,0 mM, de cerca de 1,0 mM acerca de 7,0 mM, de cerca de 2,0 mM a cerca de 6,0 mM, oude cerca de 2,5 mM a cerca de 5,0 mM, incluindo cerca de2,0 mM, cerca de 2,5 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 3,5 mM,cerca de 4,0 mM, cerca de 4,5 mM, cerca de 5,0 mM, ou cercade 5,5 mM; onde a composição farmacêutica líquida possui umpH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, de cerca de pH 5,0qa cerca de pH 6,0, de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5,de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, de cerca de pH 5,5 acerca de pH 6,0, ou cerca de pH 5,5.
Ainda em outra modalidade, a composição farmacêuticalíquida compreende o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ouCHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígeno destes, a umaconcentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50,0 mg/mL,de cerca de 5,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, ou de cerca de10,0 mg/mL a cerca de 35,0 mg/mL, incluindo de cerca de10,0 mg/mL, de cerca de 15,0 mg/mL, de cerca de 20,0 mg/mL,de cerca de 25,0 mg/mL, de cerca de 30,0 mg/mL, ou cerca de35,0 mg/mL; de cerca de 100 mM a cerca de 200 mM dearginina-HCl, incluindo cerca de 150 mM de arginina-HCl;tampão de citrato de sódio/ácido cítrico a uma concentraçãode cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, incluindo cerca de 10mM; opcionalmente um tensoativo, por exemplo, polisorbato20, em uma quantidade de cerca de 0,025% a cerca de 0,1%(p/v); e, opcionalmente, uma metionina, por exemplo, a umaconcentração de cerca de 2,0 mM a cerca de 5,5 mM,incluindo cerca de 5,0 mM; onde a composição farmacêuticalíquida possui um pH of de cerca de pH 5,0 a cerca de pH6,0, incluindo cerca de pH 5,5.
Adicionalmente àqueles agentes divulgados acima,outros agentes estabilizantes, como albumina, ácidoetilenodiaminotetracético (EDTA), podem ser opcionalmenteadicionados para melhorar adicionalmente a estabilidade dascomposições farmacêuticas líquidas. Onde desejável, aquantidade de albumina pode ser adicionada a concentraçõesde cerca de 1,0% p/v ou menos. O EDTA age como um limpadorde íons metálicos conhecidos por catalisarem muitas reaçõesde oxidação, fornecendo assim um agente estabilizanteadicional. Quando desejável, a quantidade de EDTA pode seradicionada a concentrações de cerca de 0,1 a cerca de 5,0 mM.
Quando desejável, açúcares ou álcoois de açúcar podemser também incluídos nas composições farmacêuticasincluindo anticorpo anti-CD40 antagonista líquidas dapresente invenção. Qualquer açúcar como mono-, di- oupolissacarídios, ou glucanos solúveis em água, incluindo,por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose,maltose, Iactose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina,ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietil ecarboximetilcelulose-Na podem ser utilizados. A sacarose éo aditivo de açúcar mais preferido. 0 álcool de açúcar édefinido como um hidrocarboneto de C4 a C8 possuindo umgrupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol,inositol, galacititol, dulcitol, xilitol e arabitol commanitol sendo o álcool de açúcar aditivo mais preferido. Osaçúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem serutilizados individualmente ou em combinação. Não há limitefixo para a quantidade utilizada, desde que o açúcar ouálcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e nãoafete de forma adversa os efeitos estabilizantes utilizandoos métodos da invenção. Preferivelmente, a concentração deaçúcar ou álcool de açúcar está entre cerca de 1,0% e cercade 15,0% (p/v), mais preferivelmente entre cerca de 2,0% ecerca de 10,0% (p/v).
Após a composição farmacêutica líquida descrita aquiser preparada, ela pode ser liofilizada para evitardegradação. Métodos para liofilizar composições líquidassão conhecidos àqueles com habilidades comuns na técnica.Imediatamente antes do uso, a composição pode serreconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer,água destilada ou solução salina estéril, por exemplo) quepode incluir ingredientes adicionais. Durante areconstituição, a composição é preferivelmente administradaa indivíduos utilizando aqueles métodos que são conhecidosàqueles habilitados na técnica.
As composições farmacêuticas líquidas contendoanticorpo anti-CD40 antagonista da invenção são estáveis eassim possuem estabilidade de armazenamento aumentada emrelação a composições de anticorpo anti-CD40 antagonistapreparadas em soluções tamponadas compreendendo cloreto desódio como agente isotonificante. Sem estar limitado pelateoria, acredita-se que esta estabilidade de armazenamentoaumentada é observada na formulação líquida, se armazenadadiretamente nesta forma para posterior uso, armazenada emum estado congelado e descongelada antes do uso oupreparada em uma forma seca, como liofilizada, seca a ar ouseca por pulverização, para posterior reconstituição em umaforma líquida ou outra forma antes do uso. Preferivelmente,composições da invenção são armazenadas diretamente em suaforma líquida para obterem vantagem completa daconveniência de possuir estabilidade em armazenamentoaumentada na forma líquida, facilidade de administração semreconstituição e capacidade de suprir a formulação emseringas pré-preenchidas, prontas para uso ou comopreparações de multidose se a formulação for compatível comagentes bacterioestáticos.
As composições da invenção relacionam-se à descobertaque o uso de arginina-HCl como um agente isotonificante euma mistura de um ácido e sua forma de sal, como citrato desódio/ácido cítricô, como o agente de tamponamento,resultam em uma composição farmacêutica líquida contendoanticorpo anti-CD4 0 antagonista que possui estabilidade dearmazenamento aumentada com relação a uma composiçãofarmacêutica líquida de anticorpo anti-CD40 antagonistapreparada com cloreto de sódio seu respectivo agente detamponamento. A estabilidade de armazenamento aumentada dacomposição é alcançada através da influência da forma ácidade arginina na estabilidade do anticorpo anti-CD40antagonista terapeuticamente ativo, mais particularmentesua influência na agregação de polipeptídeo, fragmentação edesamidação durante o armazenamento em formulaçõeslíquidas. Além disso, a incorporação de arginina-HCl comoum agente isotonificante em uma composição de anticorpoanti-CD40 antagonista líquida tamponada da maneira aquiexposta resulta em composições farmacêuticas líquidas quesão quase isotônicas sem incluírem agentes isotonificantesadicionais, como cloreto de sódio.
A forma ácida de arginina incorporada nas composiçõesfarmacêuticas líquidas estáveis da invenção protege oanticorpo anti-CD40 antagonista terapeuticamente ativo oufragmento de ligação ao antígeno deste contra mudançasfísicas e químicas, aumentando assim a estabilidade doanticorpo durante o armazenamento da composição. Por"aumento de estabilidade" indica-se que uma ou mais entreformação de agregado, fragmentação e desamidação peloanticorpo durante o armazenamento da composiçãofarmacêutica líquida são reduzidas com relação ao que éobservado durante o armazenamento de uma composiçãofarmacêutica líquida compreendendo o anticorpo anti-CD40antagonista e os mesmos componentes de formulação comexceção da ausência deste isotonificante e estabilizante emparticular. O efeito de arginina-HCl na agregação deanticorpo anti-CD40 antagonista durante o armazenamento emuma composição líquida pode ser prontamente determinadomedindo-se a mudança no anticorpo anti-CD40 solúvel emsolução ao longo do tempo. A quantidade de anticorpo anti-CD40 solúvel em solução pode ser quantificada por um númerode ensaios analíticos adaptados para detecção do anticorpode interesse. Tais ensaios incluem, por exemplo, HPLC defase reversa (RP), HPLC de exclusão de tamanho (SEC) eabsorbância UV. A agregação pode ser também monitoradautilizando-se SDS-PAGE. Ver também os Exemplos abaixo.
No caso de agregação, uma quantidade efetiva dearginina-HCl para incorporar em uma composição farmacêuticaliquida contendo anticorpo anti-CD40 antagonista para seobter as composições farmacêuticas estáveis da invençãoseria vista como uma quantidade que resultasse em reduçãoda formação de agregado ao longo do tempo, e assim maiorretenção de anticorpo anti-CD4 0 antagonista solúvel nasolução em sua forma molecular não agregada biologicamenteativa. Desta forma, por exemplo, onde o anticorpo anti-CD40antagonista é o anticorpo anti-CD40 monoclonal CHIR-12.12descrito nos Exemplos abaixo, uma quantidade efetiva dearginina-HCl para uso na preparação de uma composiçãoestável da invenção seria uma quantidade que resultasse emmaior retenção do anticorpo CHIR-12.12 em sua formamolecular monomérica.
Sem estar limitado pela teoria, estabilidade dearmazenamento aumentada das composições contendo anticorpoanti-CD40 antagonista da invenção pode ser tambémassociadas a efeitos inibidores de arginina-HCl emfragmentação de anticorpo e/ou desamidação de glutaminae/ou resíduos de aspargina no anticorpo terapeuticamenteativo durante o armazenamento. 0 efeito de arginina-HCl emfragmentação de anticorpo pode prontamente determinar, pormonitoramento das mudanças na na espécie molecular naformulação ao longo do tempo, por exemplo, utilizando-seanálise por SDS-PAGE e/ou SEX-HPLC; ver Exemplos aquiabaixo. O efeito de arginina-HCl na desamidação dopolipeptídeo do anticorpo anti-CD40 durante o armazenamentoem uma composição líquida pode ser prontamente determinadomonitorando-se a quantidade de anticorpo anti-CD40antagonista presente em sua forma desamidada ao longo dotempo. Métodos para medição de espécie molecular, isto é,nativa ou desamidada, de um polipeptídeo presente na fasede solução, são geralmente conhecidos na técnica. Taismétodos incluem separação cromatográfica da espéciemolecular e identificação utilizando padrões de pesomolecular de polipeptídeo, como através de RP-HPLC oucromatografia de troca catiônica (CIEX-HPLC) conforme aquidescrito nos Exemplos abaixo.
As composições farmacêuticas líquidas contendoanticorpo anti-CD4 0 antagonista da invenção podem conteroutros compostos que aumentam a efetividade ou promovem asqualidades desejáveis no anticorpo anti-CD4 0 antagonista deinteresse que serve como componente terapeuticamente ativodesde que a principal efeito estabilizante atingido com aarginina-HCl não seja afetado de forma adversa. Acomposição deve ser segura para administração através davia escolhida, deve ser estéril e deve reter sua atividadeterapêutica desejada.
As composições farmacêuticas da presente invençãopodem ser preparadas, por exemplo, pela pré-mistura deagente estabilizantes e tamponantes, e quaisquer outrosexcipientes, antes da incorporação do anticorpo anti-CD40antagonista de interesse. Quaisquer excipientes adicionaisque possam ser adicionados para estabilizar adicionalmenteas composições da presente invenção não devem afetar deforma adversa os efeitos estabilizantes do agenteisotonificante e estabilizante principal, isto é, arginina-HCl, adicionalmente em combinação com o agente detamponamento, conforme utilizado para se obter as novascomposições aqui divulgadas. Após a adição da arginina-HClpara atingir a quase isotonicidade e estabilidade aumentadado anticorpo anti-CD4 0 antagonista de interesse, o pH dacomposição líquida é ajustado utilizando-se o agente detamponamento, preferivelmente em uma faixa aqui divulgada,mais preferivelmente ao pH ideal para o anticorpo anti-CD4 0antagonista de interesse, por exemplo, um pH entre cerca depH 5,0 e pH 7,0, preferivelmente de cerca de pH 5,5, para oanticorpo monoclonal CHIR-12.12. Embora o pH possa serajustado após a adição do anticorpo anti-CD40 antagonista àcomposição, preferivelmente o mesmo é ajustado antes daadição deste polipeptídeo, uma vez que isto pode reduzir orisco de desnaturação do polipeptídeo. Dispositivosmecânicos apropriados são então utilizados para se atingiruma mistura apropriada de constituintes.
Assim, a presente invenção fornece um método paraaumentar a estabilidade de um anticorpo anti-CD40antagonista, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, emuma composição farmacêutica. 0 método compreende combinar oanticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmento de ligação aoantígeno deste com um agente de tamponamento que mantenha opH da composição farmacêutica a um pH entre cerca de pH 5,0e pH 7,0 e uma quantidade de arginina-HCl suficiente patatornar a composição líquida quase isotônica. Em algumasmodalidades, o agente de tamponamento é um tampão decitrato/ãcido cítrico, a concentração do agente detamponamento é de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, e aquantidade de arginina-HCl possibilita uma concentraçãodeste agente isotonificante na composição de cerca de 50 mMa cerca de 300 mM de arginina-HCl. Em outras modalidades, oanticorpo anti-CD40 antagonista é o anticorpo CHIR-12.12 ouCHIR-5.9 ou fragmento de ligação ao antígeno destes; oagente de tamponamento é cerca de 5 mM a cerca de 25 mM detampão de citrato de sódio/ácido cítrico; a concentração dearginina-HCl na composição é de cerca de 150 mM, e acomposição possui um pH de cerca de 5,0, cerca de 5,5,cerca de 6,0 ou cerca de 6,5.
A composição farmacêutica líquida estabilizadacompreendendo o anticorpo anti-CD40 antagonista deinteresse, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 antagonistacomo o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, oufragmento de ligação ao antígeno destes, deveria serformulada em uma forma de dosagem e pode ser em uma formainjetável ou de infusão como uma solução, suspensão ouemulsão. Conforme observado anteriormente, ela pode serarmazenada congelada ou preparada sob a forma seca, como umpó liofilizado, que pode ser reconstituído em uma soluçãolíquida, suspensão, ou emulsão antes da administração porqualquer um dos vários métodos incluindo vias oral ouparenteral de administração. Preferivelmente, a mesma éarmazenada na formulação líquida para obter a vantagem daestabilidade de armazenamento aumentada atingida de acordocom os métodos da presente invenção conforme descritoabaixo. A composição farmacêutica estabilizada épreferivelmente esterilizada por filtração por membrana e éarmazenada em recipientes de dose unitária ou dosemúltipla, como frascos ou ampolas seladas. Métodosadicionais para a formulação de uma composição farmacêuticageralmente conhecidos na técnica podem ser utilizados paraadicionalmente melhorar a estabilidade em armazenamento dascomposições farmacêuticas líquidas aqui divulgadas desdeque estes não afetem de forma adversa os efeitos benéficosdos agentes de estabilização e tamponamento preferidosdivulgados e descritos aqui acima. Uma discussão completade formulação e seleção de veículos, estabilizantes,farmaceuticamente aceitáveis, etc. pode ser encontrada emRemington1S Pharmaceutical Sciences (1990) (18a ed. ; MackPub. Co., Eaton, Pennsylvania), aqui incorporada porreferência.
Desta maneira, a presente invenção fornece um artigode produção compreendendo um recipiente contendo umacomposição farmacêutica contendo anticorpo anti-CD40antagonista líquida estável da invenção, e opcionalmentecompreendendo instruções para seu uso. Recipientesadequados incluem, por exemplo, frascos, garrafas eseringas. 0 recipiente pode ser formado de uma variedade demateriais como plástico ou vidro. EM uma modalidade, orecipiente é um frasco de vidro de uso único de 3 a 50 cm3.Alternativamente, para uma formulação pronta para uso, orecipiente pode ser, por exemplo, um frasco de vidro de 3 a100 cm3. 0 recipiente retém a formulação e a etiqueta no ouassociada ao recipiente pode indicar instruções para uso. 0artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiaisdesejáveis de um ponto de vista comercial ou do usuário,incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas,seringas e suplementos na embalagem com instruções deutilização.
Anticorpos Anti-CD40 nas Composições Farmacêuticas daInvenção
As composições farmacêuticas da presente invençãocompreendem anticorpos anti-CD40, particularmente anticorpoanti-CD40 antagonista ou fragmentos de ligação ao antígenodestes que têm como alvo o receptor CD40 e que modulamADCC, interferem com a sinalização de CD4 0, particularmentecaminhos de sinalização de CD40 que são mediados porinteração de CD40 com o ligante de CD40 (CD40L) , ou ambos.Por "antígeno CD40", "antígeno de superfície celular deCD40", "receptor CD40" ou "CD40" diz-se de umaglicoproteína transmembrana que pertence à família dereceptor de fator de necrose de tumor (TNF) (ver, porexemplo, Patentes U. S. de número 5.674.492 e 4.708.871;Stamenkovic e outros, (1989) EMBO 8:1403; Clark, (1990)Tissue Antigens 36:33; Barclay e outros, 1997) TheLeucocyte Antigen Facts Book (2a ed. ; Academic Press, SanDiego)). Foram identificadas duas isoformas de CD40 humano,codificadas por variantes transcritas alternativamenteunidas deste gene. A primeira isoforma (também conhecidacomo "isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressa como umpolipeptídeo precursor de aminoácido 277 (Id. de Seq. n° 12(primeiramente relatado como Acessão GenBank númeroCAA43045, e identificado como isoforma 1 em Acessão GenBanknúmero NP_001241) , codificada por Id. de Seq. n° 11 (verAcessões GenBank número X60592 e NM_001250)), que possuemuma seqüência de sinal representada pelos primeiros 19resíduos. A segunda isoforma (também conhecida como"isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa como umpolipeptldeo precursor de aminoácido 203 (Id. de Seq. n° 10(Acessão GenBank número NP_690593), codificada pela Id. deSeq. n° 9 (Acessão GenBank número NM_152854)), que tambémpossui uma seqüência de sinal representada pelos primeiros19 resíduos. Os polipeptídeos precursores destas duasisoformas de CD4 0 humano compartilham em comum seusprimeiros 165 resíduos (isto ê, resíduos 1 a 165 da Id. deSeq. n° 10 e Id. de Seq. N°: 12). 0 polipeptídeo precursorda isoforma curta (mostrada na Id. de Seq. n° 10) écodificado por uma variante transcrita (Id. de Seq. n° 9) aqual falta um segmento de codificação, que leva a umdeslocamento de quadro de tradução; a isoforma de CD4 0resultante contém um terminação C mais curto e distinto(resíduos 166 a 2 03 de Id. de Seq. n° 10) daquele contidona isoforma longa de CD4 0 (terminação C mostrada nosresíduos 166 a 277 de Id. de Seq. n° 12) . Para asfinalidades da presente invenção, o termo "antígeno CD40","antígeno de superfície celular CD40", "receptor CD40" ou"CD4 0" englobam tanto a isoforma curta quando a longa deCD40.
O antígeno CD4 0 é exibido na superfície de umavariedade de tipos de célula, conforme aqui descrito. Por"exibido na superfície" e "expresso na superfície" diz-seque todo ou uma porção do antígeno CD4 0 está exposto noexterior da célula. O antígeno CD4 0 exibido ou expressopode ser total ou parcialmente glicosilado.
Por "atividade agonista" diz-se que uma substânciafunciona como um agonista. Um agonista combina com umreceptor ou uma célula e inicia uma reação ou atividade queé similar a ou a mesma que aquela iniciada pelo ligantenatural do receptor. Um agonista de CD40 induz qualquer umaou todas, mas não limitado às seguintes respostas:proliferação e diferenciação de célula B, produção deanticorpo, adesão intercelular, geração de memória decélula B, mudança de isótipo, regulação para cima deexpressão de superfície celular de MHC Classe II e CD80/86,e secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-8, IL-12e TNF. Por "atividade antagonista" diz-se que a substânciafunciona como um antagonista. Um antagonista de CD40previne ou reduz a indução de qualquer resposta induzidapela ligação do receptor de CD4 0 a um ligante agonista,particularmente CD4 0L. 0 antagonista pode reduzir a induçãode qualquer uma ou mais das respostas a agonista ligandopor 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferivelmente 40%,45%, 50%, 55%, 60%, mais pref erivelmente 70%, 80%, 85%, emais preferivelmente 90%, 95%, 99% ou 100%. Métodos paramedir a especificidade de ligação do ligante de CD4 0 eatividade antagonista de um agente terapêutico de anti-CD4 0, por exemplo, um anticorpo anti-CD4 0, são conhecidosna técnica e incluem, mas não estão limitados a, ensaios deligação competitiva padrão, ensaios para monitoramento desecreção de imunoglobulina por células B, ensaios deproliferação de células B, ensaios de proliferação decélula B tipo Banchereau, ensaios de ajudantes de célula Tpara produção de anticorpo, ensaios de co-estímulo deproliferação de célula B e ensaios para regulação para cimade marcadores de ativação de célula B. Ver, por exemplo,tais ensaios em WO 00/75348 e Patente U. S. de número6.087.329, aqui incorporados por referência. Ver tambémpedidos provisórios intitulados "Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use",depositado me 4 de novembro de 2003, 26 de novembrod e 2003e 27 de abril de 2004 e Pedidos de Patente U. S. cedidos denúmero 60/517.337 (procuração de número PP20107.001(035784/258442)), 60/525.579 (procuração de númeroPP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (procuração denúmero PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente, ePedido de Patente Internacional de número PCT/US2004/037152(procuração de número PP20107.004 (035784/282916)), tambémintitulada "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies andMethods for Their Use" depositada em 4 de novembro de 2004e publicada como WO 2005/044854; o conteúdo de cada uma dasquais está aqui incorporado por referência em suatotalidade.
Por atividade agonista "significativa" diz-se de umaatividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% superior àatividade agonista induzida por uma substância neutra oucontrole negativo conforme medido em um ensaio de umaresposta de célula B. Preferivelmente, atividade agonista"significativa" é uma atividade agonista que é pelo menosduas vezes superior ou pelo menos 3 vezes superior àatividade agonista induzida por uma substância neutra oucontrole negativo conforme medido em um ensaio de respostade célula B. Assim, por exemplo, onde a resposta de célulaB de interesse é proliferação de célula B, atividadeagonista "significativa" seria a indução de um nível deproliferação de célula B que fosse pelo menos 2 vezessuperior ou pelo menos 3 vezes superior ao nível deproliferação de célula B induzido por uma substância neutraou controle negativo. EM uma modalidade, uma imunoglobulinanão especifica, por exemplo, IgGl, que não se liga a CD40,serve como o controle negativo. Uma substância "livre deatividade agonista significativa" exibiria uma atividadeagonista de não mais que cerca de 25% superior que aatividade agonista induzida por uma substância neutra oucontrole negativo, preferivelmente não mais que cerca de20% superior, 15% superior, 10% superior, 5% superior, 1%superior, 0,5% superior ou mesmo não mais de 0,1% superiorque a atividade agonista induzida por uma substância neutraou controle negativo conforme medido em um ensaio de umaresposta de célula B.
Em algumas modalidades da invenção, as composiçõesfarmacêuticas líquidas estáveis da invenção compreendem umanticorpo anti-CD40 antagonista. Tais anticorpos são livresde atividade agonista significativa conforme observadoacima quando ligados a um antígeno CD4 0 em uma célulahumana. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CD4 0 antagonista está livre de atividade agonistasignificativa em uma resposta celular. Em uma outramodalidade da invenção, o anticorpo anti-CD4 0 antagonistaestá livre de atividade agonista significativa em ensaiosde mais de uma resposta celular (por exemplo, proliferaçãoe diferenciação, ou proliferação, diferenciação e, paracélulas B, produção de anticorpo). Em algumas modalidadesda invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista é, porexemplo, o anticorpo monoclonal totalmente humano CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antígenodestes, conforme observado aqui abaixo.Qualquer um dos ensaios conhecidos na técnica pode serutilizado para determinar se um anticorpo anti-CD40 atuacomo um antagonista de uma ou mais respostas de célula B.Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 atua como um antagonista de pelo menos uma resposta de célula B,selecionada a partir de um grupo consistindo deproliferação de célula B, diferenciação de célula B,produção de anticorpo, adesão intercelular, geração dememória de célula B, mudança de isótipo, regulação para cima de expressão de superfície celular de MHC Classe II eCD80/86, e secreção de citocinas pró-inflamatõrias como IL-8, IL-12 e TNF. De particular interesse são os anticorposanti-CD40 antagonistas que livram de atividade agonistasignificativa com relação à proliferação de célula B quando ligadas ao antígeno CD40 humano na superfície de uma célulaB humana.
Em tal modalidade, o anticorpo anti-CD40 é umantagonista de proliferação de célula B conforme medido emum ensaio de proliferação de célula B como aquele descrito no Exemplo 4 aqui abaixo, e o anticorpo anti-CD40antagonista estimula a proliferação de célula B em um nívelque não é de mais de cerca de 25% superior que aproliferação de célula B induzida por um agente neutro oucontrole negativo, preferivelmente não mais que cerca de20% superior, 15% superior, 10% superior, 5% superior, 1%superior, 0,5% superior ou mesmo não mais de cerca de 0,1%superior que a proliferação de célula B induzida por umasubstância neutra ou controle negativo.
Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 é um antagonista de proliferação de célula B que é induzido poroutro anticorpo anti-CD40, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 S2C6, conforme medido em um ensaio de proliferação decélula B tal como aquele descrito no Exemplo 4 aqui abaixo,e o nível de proliferação de célula B estimulado pelo outroanticorpo anti-CD4 0 na presente do antagonista anticorpoanti-CD40 não é de mais que cerca de 25% da proliferação decélula B induzida pelo outro anticorpo anti-CD40 naausência do anticorpo anti-CD4 0 antagonista (isto é, pelomenos 75% de inibição) , preferivelmente não mais que cercade 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo não mais que cercade 0,1% de proliferação de célula B induzida pelo outroanticorpo anti-CD40 na ausência do anticorpo anti-CD40antagonista.
Ainda em outras modalidades, o anticorpo anti-CD4 0 éum antagonista de proliferação de célula B que é induzidopela linha celular EL4B5 conforme medido no ensaio deativação de célula B descrito no Exemplo 4 aqui abaixo e onível de proliferação de célula B estimulado pela linhacelular EL4B5 na presença do anticorpo anti-CD40antagonista não é superior que cerca de 25% da proliferaçãode célula B induzida por esta linha celular na ausência doanticorpo anti-CD4 0 antagonista (isto é, pelo menos 75% deinibição), preferivelmente não mais que cerca de 20%, 15%,10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo não mais que cerca de 0,1% deproliferação de célula B induzida por esta linha celular naausência do anticorpo anti-CD4 0 antagonista.
Ainda em outra modalidade, o anticorpo anti-CD40 é umantagonista de produção de anticorpo induzida por célula Tpor células B humanas conforme medido no ensaio de ajudantede célula T humana para produção de anticorpo por células Bdescritas no Exemplo 4 aqui abaixo. Desta maneira, o nívelde produção de anticorpo IgG, produção de anticorpo IgM oua produção de ambos os anticorpos IgG e IgM pelas células Bestimuladas pelas células T na presença do anticorpo anti-CD4 0 antagonista não é mais que cerca de 50% da produção deanticorpo respectiva por células B estimuladas por célulasT na ausência do anticorpo anti-CD40 antagonista (isto é,pelo menos 75% de inibição) , preferivelmente não mais quecerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo não maisque cerca de 0,1% da respectiva produção de anticorpo porcélulas B estimuladas por células T na ausência doanticorpo anti-CD4 0 antagonista.
Por uIigante de CD40" diz-se de qualquer peptídeo,polipeptídeo ou proteína que possa se ligar a e ativar umou mais caminhos de sinalização de CD40. Assim, "ligantesCD40" incluem, mas não estão limitados a, proteínasligantes a CD4 0 de comprimento total e variantes efragmentos destas que retenham atividade suficiente paraexecutar a função de ligação a e estimulação da sinalizaçãode CD40 em células que expressam CD40. Modificações a umligante de CD4 0 nativo, por exemplo, ligante de CD4 0 humano(CD4 0L; também conhecido como CD 154), incluem, mas nãolimitadas a, substituições, deleções, truncagens,extensões, proteínas de fusão, fragmentos, peptidomimética,e similares. Em algumas modalidades da invenção, um ensaiopara avaliar a atividade biológica de um anticorpo anti-CD40 antagonista inclui o uso de CD4 0L solúvel, porexemplo, CD4 0L humano recombinante solúvel (AléxisCorporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) para estimular asinalização de CD40 em células que expressam CD40.Por "sinalização de CD40 mediada por CD4 0L" diz-se dequalquer atividade biológica que resulte em interação doreceptor de superfície celular CD40 com um ligante de CD40.Exemplos de sinalização de CD4 0 são sinais que levam àproliferação e sobrevivência de células expressando CD40, eestimulação de um ou mais caminhos de sinalização de CD40em células expressando CD40. Um "caminho de sinalização"ou "caminho de transdução de sinal" de CD40 pretendesignificar que pelo menos uma reação biomecânica ou umgrupo s de reações biomecânicas que resultam da interaçãodo receptor CD4 0 com um ligante de CD40, por exemplo,CD4 0L, e que gera um sinal que, quando transmitido atravésde um caminho de sinal, leva à ativação de uma ou maismoléculas no sentido da corrente na cascata de sinalização.Caminhos de transdução de sinal envolvem um número demoléculas de transdução de sinal que levam à transmissão deum sinal dos receptores CD4 0 de superfície celular atravésda membrana do plasma de uma célula e através de um ou maisem uma série de moléculas de transdução de sinal, atravésdo citoplasma da célula e, em alguns exemplos, para dentrodo núcleo da célula. Os caminhos de transdução de sinal deCD40 incluem, por exemplo, o caminho de sinalização AKT,que leva À ativação de AKT, e finalmente à ativação de NF-KB através do caminho de sinalização de NF-KB; e caminhosde sinalização de cinase de proteína ativada por mitogênio(MAPK), incluindo o caminho de sinalização de MEK/ERK e ocaminho de sinalização de MEK/p38, que leva à ativação deERK e p38, respectivamente. 0 equilíbrio entre ativação ebloqueio destes caminhos de sinalização favorece ou asobrevivência da célula ou sua apoptose.Em algumas modalidades, as composições farmacêuticasestáveis da invenção compreendem anticorpo anti-CD40antagonista que bloqueiam a sinalização de CD40 mediada porCD4 0L. Para uma descrição mais detalhada do papel deanticorpo anti-CD4 0 antagonista no bloqueio de sinalizaçãode CD4 0 mediada por CD40L, ver, por exemplo, os pedidosprovisórios intitulados nAntagonist Anti-CD4 0 MonoclonalAntibodies and Methods for Their Use", depositados em 4 denovembro de 2003, 26 de novembro de 2003 e 27 de abril de2004, e Pedidos de Patente U. S. cedidos de número60/517.337 (procuração de número PP20107.001(035784/258442)), 60/525.579 (procuração de númeroPP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (procuração denúmero PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente, ePedido de de Patente Internacional de númeroPCT/US2004/037152 (procuração de número PP20107.004(035784/282916)), também intitulada "Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" depositadaem 4 de novembro de 2004 e publicada como WO 2005/044854; oconteúdo de cada uma das quais está aqui incorporado porreferência em sua totalidade. Ver também o pedidoprovisório intitulado "Methods for Diagnosis and Treatmentof Proliferative Disorders Mediated by CD40 Signaling",depositado em 9 de dezembro de 2005, e Pedido de PatenteU.S. cedida de número 60/749.285 (procuração de númeroPP028035.0002 (035784/304312)), e Pedido de PatenteInternacional correspondente de número PCT/US2006/019414(procuração de número PP028035.0003 (035784/311611)),depositado em 18 de maio de 2 006 e publicado como WO2006/125143;e pedido de patente provisório intitulado"Methods for Diagnosis and Treatment of Diseases Having anAutoiwmune and/or Inflammatory Component, " depositado em 9de dezembro de 2005, e Patente U. S. cedida de número60/749.336 (procuração de número PP028062.0002(035784/304311)), e Pedido de Patente Internacionalcorrespondente de número PCT/US2006/019325 (procuração denúmero PP028062.0003 (035784/311608)), depositado em 18 demaio de 2006 e publicado como WO 2006/125117; o conteúdo decada uma das quais está aqui incorporado por referência emsua totalidade.
As composições farmacêuticas líquidas estáveis dapresente invenção compreendem anticorpos anti-CD4 0,particularmente anticorpos anti-CD40 antagonistas e/oufragmentos de ligação ao antigeno destes. Os seguintestermos e definições se aplicam a tais anticorpos.
"Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Igs) sãoglicoproteínas possuindo as mesmas característicasestruturais. Os termos são utilizados como sinônimos. Emalguns exemplos, a especificidade do antigeno daimunoglobulina pode ser conhecida.
O termo "anticorpo" é utilizado em seu sentido maisamplo e cobre anticorpos completamente montados, fragmentosde anticorpos que podem se ligar a antígenos (por exemplo,Fab, F(ab')2, Fvi anticorpos de cadeia única, diacorpos,quimeras de anticorpos, anticorpos híbridos, anticorpos bi-espefícicos, anticorpos humanizados, e similares), epeptídeos recombinantes compreendendo os anteriores.
Os termos "anticorpo monoclonal" e "mAb" conforme aquiutilizados, referem-se a um anticorpo obtido a partir deuma população substancialmente homogênea de anticorpos,isto é, os anticorpos individuais compreendendo a populaçãosão idênticos, exceto pelas possíveis mutações que ocorremnaturalmente que podem estar presentes em menoresquantidades.
"Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" sãogeralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de150.000 daltons, composta de duas cadeias leves (L)idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeialeve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dedisulfeto covalente, enquanto o número de ligações dedisulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentesisótipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve podetambém possuir pontes de disulfeto entre as cadeiasregularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui em umaextremidade um domínio variável (V11) seguido por váriosdomínios constantes. Cada cadeia leve possui um domíniovariável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante emsua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leveestá alinhado com o primeiro domínio constante da cadeiapesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhadocom o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se queresíduos de aminoácido particulares formam uma interfaceentre os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas.
0 termo "variável" refere-se ao fato de que certasporções dos domínios variáveis diferem extensivamente emseqüência entre os anticorpos. Regiões variáveis conferemespecificidade de ligação a antígeno. Entretanto, avariabilidade não é uniformemente distribuída por todos osdomínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada emtrês segmentos chamados de regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, ambasnos domínios da cadeia leve e da cadeia pesada. As porçõesmais altamente conservadas de domínios variáveis sãodistribuídas nas regiões de estrutura (FR). Os domíniosvariáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem,cada uma, quatro regiões FR, adotando amplamente umaconfiguração de folha dobrada em "Ρ", conectada por trêsCDRs, que formam círculos se conectando, e em alguns casosformando parte da estrutura de folha dobrada em "P" . As CDRs em cada cadeia são mantidas unidas em estreitaproximidade pelas regiões FR e com as CDRs da outra cadeia,contribuem para a formação do local de ligação de antígenode anticorpos (ver, Kabat e outros, (1991) NIH Publ. N°.91-3242, Vol. I, págs. 647-669). Os domínios constantes são estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo aum antígeno, mas exibem várias funções efetoras, comoligação a receptor Fc (FcR), participação do anticorpo emtoxicidade celular dependente de anticorpo, iniciação decitotoxicidade dependente de complemento, e desgranulaçãode mastócitos.
O termo "região hipervariável", quando aqui utilizado,refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo quesão responsáveis por ligação a antígeno. A regiãohipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma"região determinante de complementaridade" ou "CDR" (istoé, resíduos 23-34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domíniovariável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102(H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat e outros,(1991) Sequences of Proteins of Iwmunological Interest, 5a
Ed. , Public Health Service, National Institute of Health,Bethesda, MD) e/ou aqueles resíduos de um "laçohipervariável" (isto é, respiduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2), e91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e (Hl), 53-55(H2), e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada;Clothia e Leski (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917).Resíduos de "estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos dedomínios variáveis que não os resíduos de regiõeshipervariáveis, conforme aqui avaliados.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo intacto, preferivelmente a região de ligação aantígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos defragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab,F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata eoutros, (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); moléculas deanticorpo de cadeia simples e anticorpos multi-específicosformados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestãode papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligaçãoa antígenos idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada umcom um local de ligação a antígeno único, e um fragmento"Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade decristalizar prontamente. 0 tratamento com pepsina produz umfragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação aantígeno e é ainda capaz de entrecruzamento a antígeno.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umlocal de reconhecimento e ligação de antígeno completo.Esta região consiste de um dímero de um domínio variável deuma cadeia pesada e uma leve em associação não covalenteestreita. É nesta configuração que as três CDRs de cadadomínio variável interagem para definir um local de ligaçãoa antígeno na superfície de um dímero Vh-Vl. Coletivamente,as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígenoao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável(ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRsespecíficos para um antígeno) possui a capacidade dereconhecer e se ligar a antígeno, embora a uma afinidademenor que todo o local de ligação.
O fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (ChI) da cadeiapesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pelaadição de uns poucos resíduos no terminal carbóxi dodomínio ChI cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínasda região de dobradiça de anticorpo. Fab'-SH é a designaçãoaqui utilizada para Fab' onde o(s) resíduo (s) de cisteínados domínios constantes portam um grupo tiol livre.Fragmentos Fab' são produzidos reduzindo-se a ponte dedisulfeto de cadeia pesada de fragmentos F(ab')2. Outrosacoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos sãotambém conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) dequalquer espécie vertebrada pode ser atribuída a um ou doistipos claramente distintos, chamados kapa (K)e lâmbda (λ),baseados nas seqüências de aminoácidos de seus domíniosconstantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínioconstante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podemser atribuídas a diferentes classes. Existem cincoprincipais classes de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD,IgE, IgG, e IgM, e vários destes podem ainda se dividir emsubclasses (isótipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4,IgAl, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada quecorrespondem às diferentes classes de imunoglobulinas sãochamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente.As estruturas de subunidade e configurações tridimensionaisde diferentes classes de imunoglobulinas são bemconhecidas. Diferentes isótipos possuem funções efetorasdiferentes. Por exemplo, isótipos IgGl e IgG3 humanospossuem atividade ADCC (citotoxicidade mediada por céluladependente de anticorpo).
A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se aum composto ou composição detectável que está conjugadadiretamente ou indiretamente ao anticorpo de forma a gerarum anticorpo "marcado". 0 marcador pode ser detectável porsi próprio (por exemplo, marcadores de radioisótopos oumarcadores fluorescentes) ou, no caso de um rótuloenzimático, pode catalisar alteração química de um compostoou composição de substrato que seja detectável.
Uma "célula hospedeira", conforme aqui utilizado,refere-se a um microorganismo ou célula eucariótica oulinha celular em cultura como uma entidade unicelular quepode ser, ou foi, utilizada como um recipiente para umvetor recombinante ou outros polinucleotídeos detransferência, e inclui a progenia da célula original quefoi transfectada. É compreendido que a progenia de umaúnica célula pode não ser necessariamente completamenteidêntica em morfologia ou em complemento genômico ou de DNAtotal como o parente original, devido à mutação natural,acidental ou deliberada.
"Células efetoras humanas" são leucócitos queexpressam um ou mais FcRs e executam funções efetoras.Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII eexecutam função efetora de citotoxicidade mediada procélula dependente de antígeno (ADCC). Exemplos deleucócitos humanos que mediam ADCC incluem célulasmononucleares sangüíneas periféricas (PBMC), célulasnaturalmente citotóxicas (NK), monócitos, macrófagos,eosinófilos, e neutrófilos, com PBMCs e células NK sendopreferidas. Anticorpos que possui atividade ADCC sãotipicamente do isótipo OgGl ou IgG3. Observe queadicionalmente a isolar anticorpos IgGl e IgG3, taisanticorpos mediando ADCC podem ser feitos através deengenharia de uma região variável de um anticorpo de nãoADCC ou fragmento de região variável em a uma regiãoconstante de isótipo IgGl ou IgG3.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são utilizados paradescrever um receptor que se liga à região Fc de umanticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de seqüêncianativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga aum anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantesalélicas e formas alternativamente unidas destesreceptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um
"receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor deinibição"), que possuem seqüências de aminoácidos similaresque diferem principalmente em seus domínios citoplásmicos.O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativaçãobaseado em tirosina de imunoreceptor (ITAM) em seu domíniocitoplásmico. O receptor de inibição FcyRIIB contém ummotivo de inibição baseado em tirosina de imunoreceptor(ITIM) em seu domínio citoplásmico (ver Daeron, (1997)Annu. Rev. Inmunol. 15:203-234). FcRs são analisados emRavetch e Kinet (1991) Annu. Rev. Inmunol. 9:457-492(1991); Capei e outros, (1994) Iwmunomethods 4:25-34; e deHaas e outros, (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341.Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados nofuturo, são abrangidos pelo termo "FcR" aqui utilizado. 0termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que éresponsável pela transferência de IgGs maternos ao feto(Guyer e outros, (1976) J. Immunol. 117:587; e Kim eoutros, (1994) J. Immunol. 24:249 (1994)).
Existem várias maneiras de se produzir anticorposhumanos. Por exemplo, células secretoras podem serimortalizadas por infecção com vírus Epstein-Barr (EBV).Entretanto, células infectadas com EBV são difíceis declonar e geralmente produzem apenas rendimentosrelativamente baixos de imunoglobulina (James e Bell,(1987) J. Immunol. Methods 100:5-40). No futuro, aimortalização de células B humanas pode, possivelmente, seratingida introduzindo-se uma combinação definida de genesde transformação. Tal possibilidade é destacada por umarecente demonstração de que a expressão da subunidadecatalítica de telomerase juntamente à oncoproteína grandeSV4 0 e um alelo oncogênico de H-ras resultou na conversãotumorigênica de células humanas epiteliais e fibroblastosnormais (Hahn e outros, (1999) Nature 4 00:464-468) . Agora épossível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, em imunização, de produziremum repertório de anticorpos humanos na ausência de produçãode imunoglobulina endógena (Jakobovits e outros, (1993)Nature 362:255-258; Lonberg e Huszar, (1995) Int. Rev.Immunol. 13:65-93; Fishwilde e outros (1996) Nat.Biotechnol. 14:845-851; Mendez e outros, (1997) Nat. Genet.15:146-156; Green, (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23;Totnizuka e outros, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. E7SA97:722-727; analisado em Little e outros, (2000) Immunol.Today 21:364-370). Por exemplo, foi descrito que a deleçãode homozigotos do gene de região de união de cadeia pesadade anticorpo (Jh) em camundongos mutantes quiméricos e delinha germinativa resulta em completa inibição de produçãode anticorpo endógeno (Jakobovits e outros, (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-2555) . A transferência dasérie de genes de imunoglobulina de linha germinativahumana em tais camundongos mutantes de linha germinativaresulta na produção de anticorpos humanos sob ataque deantígeno (Jakobovits e outros, (1993) Nature 362:255-258) .Mendez e outros, (1997) (Nature Genetics 15:146-156) gerouuma linha de camundongos transgênicos que, quando atacadoscom um antigeno, geram anticorpos completamente humanos dealta afinidade. Isto foi alcançado por integração de linhagerminativa de Ioei de cadeia pesada e cadeia leve humanade megabase em camundongos com deleção em segmento Jhendógeno conforme descrito acima. Estes camundongos(tecnologia XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, Califórnia))abrigam 1.020 kb de loeus de cadeia pesa humana contendoaproximadamente 66 genes Vh, regiões Dh e Jh completas etrês regiões constantes diferentes e também abriga 800 kbde loeus κ humano contendo 32 genes VK, segmentos Jk egenes Ck . Os anticorpos produzidos nestes camundongoslembram muito aqueles vistos em humanos em todos osaspectos, incluindo rearrumação, montagem e repertório degene. Os anticorpos humanos são preferencialmente expressossobre anticorpos devido à deleção em segmento endógeno queevita a reorganização de genes no locus de rato. Estescamundongos podem ser imunizados com um antígeno deinteresse particular.
Soros de tais animais imunizados podem serselecionados quanto à reatividade de anticorpo contra oantigeno inicial. Linfócitos podem ser isolados delinfonodos ou células do baço e podem ainda ser selecionadaquanto a células B selecionando-se células CD138 negativas e CDl9 positivas. Em um aspecto, tais culturas de células B(BCCs) podem ser fundidas a células de mioma para gerarhibridomas conforme detalhado acima.
Em outro aspecto, tais culturas de células B podem serselecionadas adicionalmente quanto à reatividade contra o antigeno inicial, preferivelmente. Tais seleções incluemensaios de imunoabsorbância ligados à enzima (ELISA) com aproteína alvo/antígeno, um ensaio de competição comanticorpos conhecidos que se ligam ao antígeno de interessee ligação in vitro a CHO transfectada transitoriamente ou outras células que expressam o antígeno alvo.
Anticorpos monoclonais a CD40 são conhecidos natécnica. Ver, por exemplos, as seções dedicadas a antígenode célula B em McMichael, ed. (1987; 1989) Leukocyte TypingIII and IV (Oxford University Press, New York); Patentes U.S. de número 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; WO00/63395; Publicação Internacional de número WO 02/28905 eWO 02/28904; Gordon e outros, (1988) J. Inmunol. 140:1425;Valle e outros (1989) Eur. J. Immuno. 19:1463; Clark eoutros, (198 6) PNAS 83:44 94; Paulie e outros, (198 9) J. Immunol. 142:590; Gordon e outros, (1987) Eur. J. Immuno.17:1535; Jabara e outros, (1990)/. Exp. Med. 172:1861;Zhang e outros, (1991)/. Immunol. 146:1836; Gascan eoutros, (1991)/. Immunol. 147:8; Banchereau e outros,(1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8; e Banchereau e outros,(1991) Science 251:70; todos os quais estão aquiincorporados por referência. Outros anticorpos monoclonaisanti-CD40 incluem, mas não estão limitados a, anticorposanti-CD40 humanizados, como SGN-40 (Tai e outros, (2004)Câncer Res. 64:2846-52; Patente U. S. de número 6.838.261),que é a forma humanizada do anticorpo anti-CD40 de ratosSGN-14 (Francisco e outros, (2000) Câncer Res. 60:3225-31)e os anticorpos agonista e antagonista divulgados no Pedidode Patente U. S. de número 2004/0120948; aqui incorporadaspor referencia em sua totalidade.
De interesse particular à presente invenção são osanticorpos anti-CD40 antagonistas ou fragmento de ligaçãoao antígeno destes que servem para bloquear sinalização deCD4 0 mediada por CD4 0L e que podem também modular ADCC,como ocorre, por exemplo, com o anticorpo chil212 aquidescrito, abaixo.
Anticorpos anti-CD4 0 antagonistas para uso emcomposições líquidas estáveis da invenção incluemanticorpos monoclonais ou fragmento de ligação ao antígenodestes que são capazes de se ligar especificamente aantígeno CD4 0 humano expresso na superfície de uma célulahumana. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD40antagonistas nas composições farmacêuticas líquidasestáveis exibem uma forte afinidade de ligação de sítioúnico para o antígeno de superfície celular CD40. Taisanticorpos monoclonais exibem uma constante de equilíbriode dissociaçao (Kd) para CD40 de pelo menos 10 5 M, pelomenos 3 x 10-5 Μ, preferivelmente pelo menos 10-6 M a 10-7 M,mais pref erivelmente pelo menos 10-8 M a cerca de 10-12 M,medido utilizando-se um ensaio padrão como Biacore™. Aanálise Biacore é conhecida na técnica e detalhes sãofornecido em "BIAapplications handbook". Os métodosdescritos em WO 01/27160 podem ser utilizados para modulara afinidade de ligação.
De particular interesse são os anticorpos anti-CD4 0antagonistas que são livres de atividade agonistasignificativa conforme aqui definido acima, mas exibematividade agonista quando ligados a antígeno CD4 0 emcélulas humanas, particularmente quando ligados a antígenoCD40 em células B humanas neoplásticas. Em uma modalidadeda invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista está livrede atividade agonista significativa em uma resposta decélula B. Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpoanti-CD40 antagonista está livre de atividade agonistasignificativa em ensaios de mais de uma resposta de célulaB (por exemplo, proliferação e diferenciação, ouproliferação, diferenciação e produção de anticorpo).Anticorpos anti-CD4 0 antagonistas adequados possuem regiõesconstantes humanas; preferivelmente eles também possuemregiões de estrutura totalmente ou parcialmentehumanizadas; e mais preferivelmente são anticorpostotalmente humanos ou fragmentos de ligação ao antígenodestes. Exemplos de tais anticorpos monoclonais sãoanticorpos aqui chamados de CHIR-5.9 e CHIR-12.12.
Assim, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40antagonista presente nas composições farmacêuticas líquidasestáveis da invenção é o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ouCHIR-12.12. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 sãoanticorpos monoclonais anti-CD40 completamente humanos doisótipo IgG1 produzidos a partir de linhas celulares dehibridoma 131.2F8.5.9 (aqui chamada de linha celular 5.9) e153.8E2.DlO.D6.12.2 (aqui chamada de linha celular 12.12).Estas linhas celulares foram criadas utilizando-seesplenócitos de camundongos xenotípicos imunizados contendolocus de cadeia pesada IgGi humana e o locus de cadeia κhumana (XenoMouse® technology; Abgenix; Fremont,Califórnia). As células do baço foram fundidas com ascélulas do mieloma SP2/0 (Sierra Biosource). Os hibridomasresultantes foram sub-clonados diversas vezes para criar aslinhas celulares monoclonais estáveis 5.9 e 12.12. Outrosanticorpos da invenção podem ser preparados de formasimilar utilizando-se transgênico de camundongos para Iocide imunoglobulina humana ou por outros métodos conhecidosna técnica e/ou aqui descritos.
0 nucleotídio e seqüências de aminoácido das regiõesvariáveis do anticorpo CHIR-12.12 e as seqüências deaminoácido das regiões variáveis do anticorpo CHIR-5.9 sãoaqui descritas. Mais particularmente, as seqüências deaminoácido para as regiões líder, variável e constante paraa cadeia leve e cadeia pesada para mAb CHIR-12.12 sãoexpostas na Id. de Seq. n°2 (seqüência completa para acadeia leve CHIR-12.12), Id. de Seq. n° 4 (seqüênciacompleta para a cadeia pesada para mAb CHIR-12.12), e Id.de Seq. n°5 (seqüência completa para uma variante dacadeia pesada para mAb CHIR-12.12 exposta na Id. de Seq. n°4, onde a variante compreende uma substituição de serinapara o resíduo alanina na posição 153 da Id. de Seq. n° 4).As seqüências de nucleotldios codificando a cadeia leve ecadeia pesada para mAb CHIR-12.12 são expostas na Id. deSeq. n° 1 (seqüência de codificação para a cadeia leve paramAb CHIR-12.12) e Id. de Seq. n° 3 (seqüência decodificação para a cadeia pesada para mAb CHIR-12.12). Asseqüências de aminoácido para as regiões líder, variável econstante para a cadeira leve e cadeia pesada da CHIR-5.9mAb são expostas na Id. de Seq. n° 6 (seqüência completapara a cadeia leve de mAb CHIR-5.9), Id. de Seq. n° 7(seqüência completa para a cadeia pesada de mAb CHIR-5.9) eId. de Seq. n° 8 (seqüência completa para uma variante dacadeia pesada de mAb CHIR-5.9 exposta na Id. de Seq. n° 7,onde a variante compreende uma substituição para o resíduoalanina na posição 158 da Id. de Seq. n° 7) .Adicionalmente, hibridomas expressando CHIR-5.9 (anticorposde linha de hibridoma de camundongos 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) e CHIR-12.12 (linha de hibridoma de camundongo153.8E2.DlO.D6.12.12 (CMCC# 12056) foram depositados com aATCC (American Type Culture Collection; 10801 UniversityBlvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (E.U.A.))em 17 desetembro de 2003, com uma designação de depósito de patentede PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.
Adicionalmente à atividade antagonista, anticorposanti-CD40 para uso nas composições farmacêuticas líquidasestáveis da presente invenção podem possuir outro mecanismode ação contra uma célula tumorosa. Por exemplo, anticorposCHIR-5.9 e CHIR-12.12 nativos possuem atividade ADCC.Alternativamente, as regiões variáveis dos anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 podem ser expressas em outro isótipo deanticorpo que possua atividade ADCC. É também possívelconjugar formas nativas, formas recombinantes ou fragmentosde ligação ao antígeno de CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 a umacitotoxina, um agente terapêutico ou um íon metálicoradioativo ou radioisótopo, conforme observado abaixo.
Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 ou CHIR-12.12ligam-se a CD4 0 solúvel em ensaios do tipo ELISA, evitam asligações de ligantes de CD40 a CD40 de superfície celular edeslocam o ligante de CD40 pré-ligado, conforme determinadopor ensaios citométricos de fluxo. Anticorpos CHIR-5.9 eCHIR-12.12 competem entre si para se ligarem a CD40 mas nãocom 15B8, o anticorpo monoclonal anti-CD40 descrito noPedido de Patente Provisório U. S. de número de série60/237.556, intitulado"Human Anti-CD40 Antibodies"depositado em 2 de abril de 2000 e Pedido Internacional PCTde número PCT/US01/30857, também intitulado "Human Anti-CD40 Antibodies", depositado em 2 de outubro de 2001(procuração de número PP16092.003), ambos os quais estãoaqui incorporados em sua totalidade por referência. Quandotestados in vitro quanto a efeitos na proliferação decélulas B de indivíduos humanos normais, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 atuam como antagonistas de anticorpos anti-CD40. Alémdisso, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 não induzem a forteproliferação de linfõcitos humanos a partir de indivíduosnormais. Estes anticorpos são capazes de matar células alvoexpressando CD40 por citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). A afinidade de ligação de CHIR-5.9 paraCD40 humano é de 1,2 χ 10-8 Mea afinidade de ligação deCHIR-12.12 é de 5 χ 10-10 M, conforme determinado peloensaio Biacore™.Outros anticorpos anti-CD40 antagonistas quecompartilham das características de ligação dos anticorposmonoclonais CHIR-5.9 e CHIR-5.9 descritos acima incluem,mas não estão limitados, aos seguintes: (1) os anticorposmonoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridomadesignadas 131.2F8.5.9 (aqui chamada de linha celular 5.9)e 153.8E2.DlO.D6.12.12 (aqui chamada de linha celular12.12), depositadas com a ATCC como Depósito de Patentenúmero PTA-5542 e Depósito de Patente número PTA-5543,respectivamente; (2) um anticorpo monoclonal compreendendouma seqüência de aminoácido selecionada a partir de umgrupo consistindo da seqüência mostrada na Id. de Seq. n°2, a seqüência mostrada na Id. de Seq. n° 4, a seqüênciamostrada na Id. de Seq. n° 5, ambas as seqüências mostradasem Id. de Seq. n° 2 e Id. de Seq. np 4, e ambas asseqüências mostradas em Id. de Seq. n° 2 e Id. de Seq. n°5; (3) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência mostrada em Id. de Seq. n° 6, a seqüênciamostrada na Id. de Seq. n° 7, a seqüência mostrada na Id.de Seq. n° 8, ambas as seqüências mostradas na Id. de Seq.n° 6 e Id. de Seq. n° 7 e ambas as seqüências mostradas emId. de Seq. n° 6 e Id. de Seq. n° 8; (4) um anticorpomonoclonal possuindo uma seqüência de aminoácido codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotídio selecionada a partir do grupoconsistindo da seqüência mostrada na Id. de Seq. n° 3 eambas as seqüências mostradas na Id. de Seq. n° 1 e Id. deSeq. n° 3; (5) um anticorpo monoclonal que se liga a umepítopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal produzidopela linha celular de hibridoma 5.9 ou linha celular dehibridoma 12.12; (6) ura anticorpo monoclonal que se liga aum epítopo compreendendo os resíduos 82-87 da seqüência deaminoácido mostrada na Id. de Seq. n° 10 ou Id. de Seq. n°:12; (7) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antigeno do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ouCHIR-5.9 ou os anticorpos monoclonais anteriores nos itensprecedentes (1) a (7) , onde o fragmento retém a capacidadede se ligar especificamente ao antigeno humano CD40.
Aqueles habilitados na técnica reconhecem que osanticorpos e fragmentos de ligação a antigeno destesanticorpos descritos aqui incluem anticorpos e fragmentosde ligação a antigeno que são produzidos de formarecombinante utilizando métodos bem conhecidos na técnica eaqui descritos abaixo e incluem, por exemplo, anticorposmonoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 que foram produzidos deforma recombinante.
Anticorpos anti-CD40 antagonistas adicionais incluemos anticorpos monoclonais aqui chamados de 5D12, 3A8 e 3C6,que são secretados por um hibridoma possuindo números deacessão ATCC HB 11339, HB 12024 e HB 11340,respectivamente. Ver, por exemplo, Patente U.S. de número6.315.998, aqui incorporada por referência em suatotalidade.
Outros anticorpos anti-CD40 antagonistas sãoconhecidos na técnica. Ver, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 humano produzido pelo hibridoma denominado F4-465divulgado nos Pedidos de Patente U. S. de número20020142358 e 20030059427; aqui incorporadas por referênciaem sua totalidade. 0 F4-4 65 foi obtido a partir docamundongo HAC (Kuroiwa e outros, (2000) Nature Biotech.10:1086 (2000)) e conseqüentemente expressa a cadeia levelâmbda humana.
Produção de Anticorpos para Composições Farmacêuticas da
Invenção
Os anticorpos para uso nas composições farmacêuticasda presente invenção, por exemplo, os anticorpos anti-CD4 0antagonistas aqui divulgados, podem ser produzidosutilizando-se qualquer método de produção de anticorpoconhecido àqueles habilitados na técnica. Assim, sorospoliclonais podem ser produzidos por métodos convencionais.Em geral, uma solução contendo o antígeno de interesse, oantígeno CD40, é primeiramente usada para imunizar umanimal adequado, preferivelmente um camundongo, rato,coelho ou cabra. Coelhos ou cabras são preferidos para apreparação de soros policlonais devido ao volume de soroque se pode obter, e a disponibilidade de anticorpos deanti-coelho e anti-cabra marcados.
Soros policlonais podem ser preparados em um animaltransgênico, preferivelmente um camundongo portanto loci deimunoglobulina humana. Em uma modalidade preferida, célulasSf9 expressando a proteína de interesse, por exemplo, CD40,são utilizadas como o imunogene. A imunização pode serexecutada misturando-se ou emulsificando-se uma soluçãocontendo antígeno em solução salina, preferivelmente em umadjuvante como adjuvante completo de Freund, e injetando-sea mistura ou emulsão de forma parenteral (geralmente deforma subcutânea ou intramuscular) . Uma dose de 500 a 200μg/injeção é tipicamente suficiente. A imunização égeralmente acelerada de 2 a 6 semanas depois com uma oumais injeções da proteína em solução salina,preferivelmente utilizando-se adjuvante completo de Freund.Pode-se alternativamente gerar anticorpos por imunização invitro utilizando-se métodos conhecidos na técnica o que,para o propósito desta invenção, é considerado equivalenteà imunização in vivo. Os Anti-soros policlonais são obtidossangrando-se o animal imunizado em um recipiente de vidroou plástico, incubando-se o sangue a 25°C por uma hora,seguido por incubação a 40C por 2 a 18 horas. O soro érecuperado por centrifugação (por exemplo, 1.000 χ g por 10minutos). Pode-se obter cerca de 20 a 50 mL por sangramentoa partir de coelhos.
A produção de células Sf9 (Spodoptera frugiperda) édivulgada na Patente U. S. de número 6.004.552, aquiincorporada por referência. No caso de CD4 0, resumidamente,seqüências codificando CD40 humano foram recombinadas em umbaculovirus utilizando-se vetores de transferência. Osplasmídeos foram co-transfectados com DNA de baculovirus dotipo selvagem em células Sf9. As células Sf9 infectadas combaculovirus recombinante foram identificadas e purificadasde forma clonal.
Preferivelmente, o anticorpo é monoclonal na natureza.Por "anticorpo monoclonal" diz-se que um anticorpo obtido apartir de uma população substancialmente homogênea deanticorpos, isto é, os anticorpos individuais compreendendoa população são idênticos, exceto pelas possíveis mutaçõesque ocorrem naturalmente que podem estar presentes emmenores quantidades. O termo não está limitado em relação àespécie ou fonte do anticorpo. O termo englobaimunoglobulinas completas assim como fragmentos como Fab,F(ab')2, Fv e outros que retém a função de ligação doanticorpo ao antígeno. Anticorpos monoclonais são altamenteespecíficos, sendo direcionados contra um único localantigênico; por exemplo, no caso de anticorpos anti-CD40, oantígeno de superfície celular de CD40. Além disso, aocontrário às preparações de anticorpo convencionais(policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorposdirecionados contra diferentes determinantes (epítopos),cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um únicodeterminante no antígeno. O modificador "monoclonal" indicao caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de umapopulação substancialmente homogênea de anticorpos, e nãodeve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpopor qualquer método em particular. Por exemplo, osanticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com apresente invenção podem ser produzidos pelo métodohibridoma primeiramente descrito em Kohler e outros, (1975)Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de DNArecombinantes (ver, por exemplo, Patente U. S. de número4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem ser tambémisolados a partir de bibliotecas de anticorpos fagoutilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clarcksone outros, (1991) Nature 352:624-628; Marks e outros,(1991)/. Mol. Biol. 222:581-597; e Patente U. S. de número5.514.548.
Por "epítopo", diz-se da parte de uma moléculaantigênica para a qual um anticorpo é produzido e à qual oanticorpo se ligará. Epítopos podem compreender resíduos deaminoácido lineares (isto é, resíduos no epítopo sãodispostos seqüencialmente um após o outro de uma madeiralinear), resíduos de aminoácidos não lineares (chamadosaqui de "epítopos não lineares"; estes epítopos não estãodispostos seqüencialmente), ou tanto resíduos deaminoácidos lineares e não lineares.
Anticorpos monoclonais podem ser preparadosutilizando-se o método de Kohler e outros, (1975) Nature256:495-496, ou uma modificação deste. Tipicamente, umcamundongo é imunizado com uma solução contendo umantígeno. A imunização pode ser executada misturando-se ouemulsificando-se uma solução contendo antígeno em soluçãosalina, preferivelmente em um adjuvante como adjuvantecompleto de Freund, e injetando-se a mistura ou emulsão deforma parenteral. Qualquer método de imunização conhecidona técnica pode ser utilizado para se obter os anticorposmonoclonais da invenção. Após a imunização do animal, obaço (e, opcionalmente, vários linfonodos grandes) é/sãoremovido(s) e dissociado(s) em células únicas. As célulasdo baço podem ser selecionadas aplicando-se uma suspensão auma placa ou cavidade revestida com os antígenos deinteresse. As células B expressando imunoglobulina ligada aimunoglobulina específica para o antígeno se liga à placa enão são rinsadas. As células B resultantes, ou todas ascélulas do baço dissociadas, são então induzidas a fundircom células de mieloma para formarem hibridomas, e sãopostas em cultura em um meio seletivo. As célulasresultantes são colocadas em placas por diluição serial esão submetidas a ensaio para a produção de anticorpos quese liguem especificamente ao antígeno de interesse (e quenão se liguem a antígenos não relacionados). Os hibridomasque secretam o anticorpo (mAb) monoclonal selecionado sãoentão colocadas em cultura seja in vitro (por exemplo, emgarrafas de cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ouin vivo (como ascites em camundongos) .
Onde os anticorpos anti-CD40 antagonistas devem serpreparados utilizando-se métodos de DNA recombinante, o DNAcodificando os anticorpos monoclonais é prontamente isoladoe seqüenciado utilizando-se procedimentos convencionais(por exemplo, utilizando-se marcadores de oligonucleotideosque são capazes de se ligar especificamente a genescodificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos deratos). As células de hibridoma aqui descritas servem comouma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA podeser colocado em vetores de expressão, que são entãotransfectados em células hospedeiras como células E. Coli,células COS de macacos, células ovarianas de HamstersChineses (CHO), ou células de mieloma que de outra formanão produzam proteína imunoglobulina para obter a síntesede anticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. Artigos de análise sobre expressãorecombinante em bactérias de DNA codificando o anticorpoincluem Skerra e outros, (1993) Curr. Opinion in Iwmunol.5:256 e Phickthun, (1992) Iwmunol. Revs. 130:151.Alternativamente, o anticorpo pode ser produzido em umalinha celular como uma linha celular CHO, conformedivulgado nas Patentes U. S. de número 5.545.403;5.545.405; e 5.998.144; aqui incorporadas por referência.De forma resumida, a linha celular é transfectada comvetores capazes de expressar uma cadeia leve e uma cadeiapesada, respectivamente. Ao transfectar as duas proteínasem vetores separados, pode-se produzir anticorposquiméricos. Outra vantagem é a correta glicolização doanticorpo.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40antagonista, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligação ao antigeno destes, éproduzido em células CHO utilizando o sistema de expressãode gene GS (Lonza Biologies, Portsmouth, New Hampshire) ,que usa glutamina sintetase como um marcador. Ver também,as Patentes U. S. de número 5,122,464; 5,591,639,-5,658,759; 5,770,359; 5,827,739; 5,879,936; 5,891,693; e5,981,216; cujas divulgações estão aqui incorporadas porreferência em sua totalidade.
Adicionalmente, anticorpos para uso nas composiçõesfarmacêuticas da invenção podem ser anticorpos quiméricosque possuem as características de ligação desejadas. Assim,por exemplo, anticorpos anti-CD40 quiméricos para uso nosmétodos da invenção poderiam possuir as características deligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12aqui descritos. Por anticorpos "quiméricos", diz-se deanticorpos que são, mais preferivelmente, derivadosutilizando técnicas de ácido desoxirribonucléicorecombinantes e que compreendam componentes humanos(incluindo espécies "relacionadas" imunologicamente, porexemplo, chimpanzés) e não humanos. Assim, a regiãoconstante do anticorpo quimérico é mais preferivelmentesubstancialmente idêntica à região constante de umanticorpo humano natural; a região variável do anticorpoquimérico é, mais preferivelmente, derivada de uma fontenão humana e possui a especificidade antigênica desejadapara o antigeno de interesse, isto é, o antigeno CD4 0. Afonte não humana pode ser qualquer fonte vertebrada quepossa ser utilizada para gerar anticorpos a um antígenohumano ou material compreendendo um antígeno CD40 humano.Tais fontes não humanas incluem, mas não estão limitadas a,roedores (por exemplo, coelho, rato, camundongo, etc.; ver,por exemplo, Patente U. S. de número 4.816.567, aquiincorporada por referência) e primatas não humanos (porexemplo, primatas do Velho Mundo, macacos, etc.; ver, porexemplo, Patentes U. S. de número 5.750.105 e 5.756.096,aqui incorporadas por referência). Conforme aqui utilizada,a frase "imunologicamente ativo", quando utilizado emreferência, por exemplo, a anticorpos anti-CD4 0 quiméricos,significa um anticorpo quimérico que se liga a CD40 humano.
Por "humanizado", diz-se de formas de anticorpos quecontêm seqüência mínima derivada de seqüências deimunoglobulina não humana. Em sua maioria, anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorporeceptor) no qual resíduos de uma região hipervariável(também conhecida como região determinante complementar ouCDR) do receptor são substituídos por resíduos de umaregião hipervariável de uma espécie não humana (anticorpodo doador) como camundongo, rato, coelho ou primata nãohumano possuindo especificidade, afinidade e capacidadedesejadas. A frase "região determinante decomplementaridade" refere-se a seqüências de aminoácidosque, juntas, definem a afinidade e a especificidade deligação da região Fv natural de um sítio de ligação deimunoglobulina nativo. Ver, por exemplo, Cothia e outros,(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat e outros, (1991) U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication N°91-3242) . A frase "região constante" refere-se à porção damolécula de anticorpo que confere as funções efetoras. Emtrabalho anterior direcionado à produção de anticorpos nãoimunogênicos para uso em terapia de doença humana, regiõesconstantes de camundongos foram substituídas por regiõesconstantes humanas. As regiões constantes dos anticorposhumanizados de interesse foram derivadas de imunoglobulinashumanas. Entretanto, estes anticorpos humanizados aindaextraíam uma resposta imune indesejada e potencialmenteperigosa em humanos e havia uma perda de afinidade.Anticorpos humanizados, por exemplo, anticorpos anti-CD40humanizados, para uso nas composições farmacêuticas dapresente invenção possuem características de ligaçãosimilares àquelas exibidas pelo anticorpo parente deinteresse, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9e CHIR-12.12 aqui descritos.
A humanização pode ser essencialmente executadaseguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones eoutros, (1986) Nature 321:522-525; Riechmann e outros,(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen e outros, (1988)Science 239:1534-1536), substituindo-se CDRs ou seqüênciasde CDRs de roedores ou roedores mutantes pelas respectivasseqüências de um anticorpo humano. Ver também, as PatentesU. S. de número 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5,693,762;5,859,205; aqui incorporadas por referência. Em algunsexemplos, resíduos nas regiões de estrutura de uma ou maisregiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídaspor resíduos não humanos correspondentes (ver, por exemplo,Patentes U. S. de número 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; e6,180,370). Além disso, anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorporeceptor ou no anticorpo doador. Estas modificações sãofeitas para refinar adicionalmente o desempenho doanticorpo (por exemplo, para obter afinidade desejada). Emgeral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmentetodos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, dos quais todas ou substancialmente todas asregiões hipervariáveis correspondem àquelas deimunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todasas regiões de estrutura são aquelas de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmentecompreenderá pelo menos uma porção de uma região constantede imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela de umaimunoglobulina humana. Para detalhes adicionais ver Jones eoutros, (1986) Nature 331:522-525; Riechmann e outros,(1988) Nature 332:323-329; e Presta, (1992) Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596; aqui incorporados por referência.
Desta forma, tais anticorpos "humanizados" podem incluiranticorpos onde substancialmente menos de um domíniovariável humano intacto tenha sido substituído pelaseqüência correspondente de uma espécie não humana. Naprática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorposhumanos nos quais alguns resíduos CDR, e possivelmentealguns resíduos de estrutura, são substituídos por resíduosde sítios análogos em anticorpos de roedores. Ver, porexemplo, as Patentes U. S. de número 5.225.53 9; 5.585.089;5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Ver também Patente U. S.de número 6.180.370 e Publicação Internacional de número WO01/27160, onde anticorpos humanizados e técnicas paraprodução de anticorpos humanizados possuindo afinidademelhorada para um antígeno predeterminado são divulgados.
A presente invenção pode ser também praticadautilizando-se anticorpos xenogênicos ou modificadosproduzidos em um hospedeiro mamífero não humano, maisparticularmente um camundongo transgênico caracterizado porimunoglobulina endógena desativada. EM tais animaistransgênicos, os genes endógenos competentes para aexpressão de subunidades leves e pesadas de imunoglobulinashospedeiras tornam-se não funcionais e substituídas com osloci de imunoglobulina humana análogos. Estes animaistransgênicos produzem anticorpos humanos na ausênciasubstancial de subunidades de imunoglobulinas hospedeiraleve ou pesada. Ver, por exemplo, as Patentes U. S. denúmero 5.877.397 e 5.939.598, aqui incorporadas porreferência.
Em algumas modalidades, anticorpos para CD40completamente humanos, por exemplo, são obtidos imunizando-se os camundongos transgênicos. Tal camundongo é obtidoutilizando-se tecnologia XenoMouse® (Abgenix; Fremont7Califórnia), e é divulgada nas Patentes U. S. de número6.075.181, 6.091.001, e 6.114.598, todas as quais estãoaqui incorporadas por referência. Para produzir osanticorpos aqui divulgados, camundongos transgênicos para olocus de cadeia pesada IgGa humano e locus de cadeia leve κhumano foram imunizados com células Sf9 expressando CD40humano. Camundongos podem ser também transgênicos paraoutros isótipos. Anticorpos anti-CD40 totalmente humanosúteis nas composições farmacêuticas líquidas da presenteinvenção são caracterizadas pelas propriedades de ligaçãosimilares àquelas exibidas pelos anticorpos monoclonaisCHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui divulgados.
Fragmentos de um anticorpo particular de interesse,por exemplo, um anticorpo anti-CD40, incluindo anticorpoanti-CD40 antagonista, são adequados para uso nascomposições farmacêuticas líquidas estáveis da invençãodesde que retenham a afinidade necessária do anticorpo decomprimento total. Assim, por exemplo, um fragmento de umanticorpo anti-CD4 0 reterá a capacidade de se ligar aoantIgeno de superfície de célula B CD4 0. Tais fragmentossão caracterizados por propriedades similares às doanticorpo de comprimento total correspondente. Assim, porexemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD4 0 antagonistade comprimento total se ligará especificamente a umantígeno CD4 0 humano expresso na superfície de uma célulahumana e está livre de atividade agonista significativa,mas exibe atividade antagonista quando ligado a um antígenoCD40 em uma célula humana que expressa CD40. Taisfragmentos são também chamados aqui de fragmentos de"ligação a antigênico".
Fragmentos de ligação a antígeno adequados de umanticorpo compreendem uma porção de um anticorpo decomprimento total, geralmente a região de ligação aantígeno ou variável deste. Exemplos de fragmentos deanticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentosFab, F(ab')2 e Fv e moléculas de anticorpo de cadeiasimples. Por "Fab" diz-se de um fragmento de ligação aantígeno monovalente de uma imunoglobulina que é compostada cadeia leve e parte da cadeia pesada. Por "F(ab')2" diz-se de um fragmento de ligação a antígeno bivalente de umaimunoglobulina que contém ambas as cadeias leves e parte deambas as cadeias pesadas. Por fragmentos de anticorpo "Fvde cadeia simples" ou "sFv", diz-se de fragmentoscompreendendo os domínios Vh e Vl de um anticorpo, ondeestes domínios estão presentes em uma cadeia depolipeptídeo simples. Ver, por exemplo, as Patentes U. S.de número 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030, e 5.856.456,aqui incorporadas por referência. Geralmente, opolipeptídeo Fv compreende ainda um agente de ligação depolipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que possibilitem queo sFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno.Para uma análise de sFv, ver see Pluckthun, (1994) em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed.Rosenburg e Moore (Springer-Verlag, New York), págs. 269-315. Fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos anti-CD4 0 antagonistas aqui divulgados podem ser tambémconjugados a uma citotoxina para efetuar a morte dascélulas cancerosas alvo, conforme descrito aqui abaixo.
Anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem serisolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpoutilizando as técnicas descritas, por exemplo, emMcCafferty e outros, (1990) Nature 348:552-554, (1990) ePatente U. S. de número 5.514.548. Clarckson e outros,(1991) Nature 352:624-628 e Marks e outros, (1991) J. Mol.Biol. 222:581-597, descrevem o isolamento de anticorpos deratos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas defago. Publicações subseqüentes descrevem a produção deanticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) porembaralhamento de cadeia (Marks e outros, (1992)Bio/Technology 10:779-783), assim como infecçãocombinatória e recombinação in vivo como uma estratégiapara construção de bibliotecas de fagos muito grandes(Waterhouse e outros, (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266) . Assim, estas técnicas são alternativas viáveis atécnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionaispara isolamento de anticorpos monoclonais.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produçãode fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estesfragmentos foram derivados através de digestão proteoliticade anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto eoutros, (1992) Journal of Biochemical and BiophysiealMethods 24:107-117 (1992) e Brennan e outros, (1985)Science 229:81). Entretanto, estes fragmentos podem serproduzidos agora diretamente células hospedeirasrecombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpopodem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpodiscutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab7-SHpodem ser diretamente recuperados de E. Coli e quimicamenteacoplados para formarem fragmentos F(ab')2 (Carter eoutros, (1992) Bio/Technology 10:163-167). De acordo comoutra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isoladosdiretamente por cultura de cultura de célula hospedeirarecombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentosde anticorpo serão aparentes àqueles habilitados naprática.
Anticorpos anti-CD40 antagonistas para uso nascomposições farmacêuticas líquidas estáveis da presenteinvenção incluem anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui divulgados assim como anticorpos diferindo desteanticorpo mas retendo as CDRs; e anticorpos com um ou maisadições, deleções ou substituições de aminoácidos, onde aatividade antagonista é medida por inibição de proliferaçãoe/ou diferenciação de células Β. A invenção também englobaanticorpos desimunizados, particularmente anticorpos anti-CD40 antagonistas desimunizados, que podem ser produzidosconforme aqui descrito, por exemplo, nas PublicaçõesInternacionais de número WO 98/52976 e WO 0034317; aquiincorporadas por referência. Desta forma, resíduos nosanticorpos anti-CD4 0 antagonistas da invenção sãomodificados de forma a tornarem os anticorpos não ou menosimunogênicos a humanos enquanto retêm sua atividadeantagonista em relação a células expressando CD4 0 humano,onde tal atividade é medida por ensaios aqui observados emoutro momento. Também estão incluídas no escopo da presenteinvenção a fusão de proteínas compreendendo um anticorpo deinteresse, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 antagonistaou um fragmento de ligação ao antígeno deste, cuja fusão deproteínas pode ser sintetizada ou expressa a partir devetores de polinucleotídeo correspondentes, conforme éconhecido na técnica. Tais proteínas de fusão são descritascom referência à conjugação de anticorpos conforme aquiobservado.
Qualquer anticorpo conhecido possuindo aespecificidade de ligação de interesse pode possuirvariações de seqüência produzidas utilizando-se os métodosdescritos, por exemplo, nas Publicações de Patentes denúmero EP 0 983 303 Al, WO 00/34317, e WO 98/52976, aquiincorporadas por referência. Por exemplo, foi mostrado queseqüências na CDR podem fazer co que um anticorpo se liguea MHC Classe II e disparem uma resposta de célula Tajudante indesejada. Uma substituição conservativa podepermitir que o anticorpo retenha a atividade de ligação eainda peca sua capacidade de disparar uma resposta decélula T indesejada. Quaisquer substituições conservativasou não conservativas podem ser realizadas utilizando-semétodos reconhecidos na técnica, como aqueles aquiobservados e os anticorpos resultantes podem ser tambémutilizados nas composições farmacêuticas líquidas estáveisda presente invenção. Os anticorpos variantes podem sertestados de forma rotineira quanto a atividade particular,por exemplo, atividade antagonista, afinidade eespecificidade utilizando métodos aqui descritos.
O anticorpo anti-CD4 0 antagonista produzido porqualquer dos métodos descritos acima, ou qualquer outrométodos não divulgado aqui, pode ser utilizado de umamaneira similar ao anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ondepossuem pelo menos uma das seguintes atividades biológicas:inibição de secreção de imunoglobulina por células Bperiféricas humanas normais estimuladas pro células T;inibição da sobrevivência e/ou proliferação de células Bperiféricas humanas normais estimuladas por células T deJurkat; inibição de sobrevivência e/ou proliferação decélulas B periféricas humanas normais estimuladas porcélulas expressando CD40L ou ligante CD40 solúvel (sCD40L);inibição de "sobrevivência" de sinais intracelulares anti-apoptóticos em qualquer célula estimulada por sCD4 0L ouCD40L de fase sólida; inibição de transdução de sinal deCD40 em qualquer célula quando da ligação a sCD4 0L ou CD4 0Lde fase sólida; inibição de proliferação de células Bmalignas; indução de deleção, anergia e/ou tolerância decélulas alvo portando CD40 ou células portanto ligantescognatos a CD4 0 incluindo, mas não limitados a, células T ecélulas B; indução de expansão ou ativação de células Treguladoras de CD4+CD25+ (ver, por exemplo, rejeição detecido específica de aloantígeno de doador viainterferência de CD4 0-CD4 0L, van Maurik e outros, (2 002) J.Immunol. 169:5401-5404); citotoxicidade através de qualquermecanismo (incluindo, mas não limitado a, citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC),citotoxicidade dependente de complemento (CDC), regulaçãopara baixo de proliferação e/ou apoptose em células alvo);modulação de secreção de citosina de célula alvo e/ouexpressão de molécula de superfície; e combinações destes.Ensaios para medir a atividade biológica desejada doanticorpo de anti-CD40 antagonista aqui divulgado efragmentos de ligação ao antígeno deste podem serexecutados conforme descrito nos pedidos provisóriosintitulados "Antagonist Anti-CD4 0 Monoclonal Antibodies andMethods for Their Use", depositados em 4 de novembro de2003, 26 de novembro de 2003 e 27 de abril de 2004, e Patentes U. S. designadas de número 60/517.337 (procuraçãode número PP20107.001 (035784/258442)), 60/525.579(procuração de número PP20107.002 (035784/271525)), e60/565.710(procuração de número PP20107.003(035784/277214)), respectivamente; e Pedido de de PatenteInternacional de número PCT/US2004/037152 (procuração denúmero PP20107.004 (035784/282916)), também intitulada"Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods forTheir Use" depositada em 4 de novembro de 2004 e publicadacomo WO 2005/044854; o conteúdo de cada uma das quais estáaqui incorporado por referência em sua totalidade. Vertambém os ensaios descritos no pedido de patente provisóriointitulado "Methods for Diagnosis and Treatment ofProliferative Disorders Mediated by CD4 0 Signalingn,depositado em 9 de dezembro de 2 005, e Pedido de PatenteU.S. cedida de número 60/749.285 (procuração de númeroPP028035.0002 (035784/304312)), e Pedido de PatenteInternacional correspondente de número PCT/US2006/019414(procuração de número PP028035.0003 (035784/311611)),depositado em 18 de maio de 2006 e publicado como WO2006/125143;e pedido de patente provisório intitulado"Methods for Diagnosis and Treatment of Diseases Having anAutoimmune and/or Inflammatory Component," depositado em 9de dezembro de 2005, e Patente U. S. cedida de número60/749.336 (procuração de número PP028062.0002
(035784/304311)), e Pedido de Patente Internacionalcorrespondente de número PCT/US2006/019325 (procuração denúmero PP028062.0003 (035784/311608)), depositado em 18 demaio de 2006 e publicado como WO 2006/125117; o conteúdo decada uma das quais está aqui incorporado por referência emsua totalidade. Ver também os ensaios descritos em Schultzee outros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204;Denton e outros (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans eoutros, (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle, (1998)Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman e outros, (1996)Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan e outros (1991)Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom e outros,(1993) Immunology 79:439-444; e Patentes U. S. de número5.674.492 e 5.847.082, aqui incorporadas por referência.
Um ensaio representativo para detectar os anticorposanti-CD40 antagonista específico aos epitopos do antígenode CD40 identificados aqui como um "ensaio de ligaçãocompetitivo". Os ensaios de ligação competitivos sãoensaios sorológicos em que desconhecidos não detectados equantificados por sua capacidade de inibir a ligação de um ligante conhecido marcado ao seu anticorpo especifico. Istoé também referido como um ensaio de inibição competitivo.Em um ensaio de ligação competitivo representativo, opolipeptídeo CD40 marcado é precipitado por anticorpocandidatos em uma amostra, por exemplo, em combinação com anticorpos monoclonais provocados contra um ou maisepitopos dos anticorpos monoclonais da invenção. Anticorposanti-CD40 que reagem especificamente com um epitopo deinteresse podem ser identificados selecionando-se uma sériede anticorpos preparada contra uma proteína CD40 ou fragmento da proteína compreendendo o epitopo particular daproteína CD40 de interesse. Por exemplo, para CD40 humano,epitopos de interesse incluem epitopos compreendendoresíduos de aminoácido não lineares ou lineares da isoformacurta de CD40 humano (veja, Acesso de GenBank No. NP_690593) exposto em Id. de Seq. n°:10, codificado pelaseqüência exposta em Id. de Seq. n°:9, veja também o acessode GenBank No. NM_152854) , ou da isoforma longa de CD40humano (veja os acessos de GenBank Nos. CAA43045 eNP_001241, expostos em Id. de Seq. n°:12 codificado pela seqüência exposta em Id. de Seq. n° : 11; ver Acesso deGenBank número X60592 e NM_001250). Alternativamente,ensaios de ligação competitivos com anticorpos anti-CD40antagonista adequado identificados previamente poderão serusados para selecionar os anticorpos monoclonaiscomparáveis aos anticorpos identificados previamente.Os anticorpos empregados em tais imunoensaios podemser marcados ou não marcados. Anticorpos não marcados podemser empregados na aglutinação, anticorpos marcados podemser empregados em uma ampla variedade de ensaios,empregando-se uma ampla variedade de marcadores. A detecçãoda formação de um complexo anticorpo-antígeno entre umanticorpo anti-CD40 e um epitopo de interesse pode serfacilitada fixando-se uma substância detectável aoanticorpo. Meios de detecção adequados incluem o uso demarcadores tais como radionuclídeos, enzimas, coenzimas,agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, cromogenes,substratos de enzima ou co-fatores, inibidores de enzima,complexos de grupo prostético, radicais livres, partículas,corantes e etc. Exemplos de enzimas adequadas incluemperoxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de grupoprostético adequados incluem estreptavidina/biotina eavidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentesadequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianatode fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminafluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; umexemplo de um material luminescente é luminol; exemplos demateriais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina,e aequorina; e exemplos de material radioativo adequadoincluem 125I, 131I, 35S, ou 3H. Tais reagentes marcador podemser usados em uma variedade de ensaios bem conhecidos, taiscomo radioimunoensaios, imunoensaios com enzima, porexemplo, ELISA, imunoensaios fluorescentes e etc. Veja, porexemplo, as Patentes U. S. de números 3.766.162; 3.791.932;3.817.837; e 4.233.402.Quaisquer anticorpos anti-CD40 antagonista descrito oufragmentos de ligação de antigeno destes, podem serconjugados antes do uso nas composições farmacêuticas dapresente invenção. Métodos para produzir anticorposconjugados são conhecidos na técnica. Assim, o anticorpopode ser marcado usando-se marcação indireta ou um métodode marcação indireta. Por "marcação indireta" ou "método demarcação indireta" quer-se dizer que um agente quelante éligado de forma covalente a um anticorpo e pelo menos umradionuclídeo é inserido no agente quelante. Veja, porexemplo, os agentes quelantes e radionuclídeos descritos emSrivagtava e Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603, aquiincorporado por referência. Marcadores adequados incluemfluoróforos, cromõforos, átomos radioativos(particularmente 32P e 125I) , reagentes densos de elétrons,enzimas, e ligantes possuindo companheiros de ligaçãoespecíficos. As enzimas são tipicamente detectadas por suaatividade. Por exemplo, a peroxidase de raiz forte éfreqüentemente detectada por sua capacidade de converter a3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) em um pigmento azul,quantificável com um espectrofotômetro. "Companheiro deligação específico" refere-se a uma proteína capaz de seligar a uma molécula de ligante com alta especificidade,como por exemplo no caso de um antigeno e um anticorpomonoclonal específico deste. Outros companheiros de ligaçãoespecíficos incluem biotina e avidina ou estreptavidina,IgG e proteína A, e as numerosas duplas receptor-liganteconhecidas na técnica. Deve-se compreender que a descriçãoacima não pretende categorizar os vários marcadores emclasses distintas, uma vez que um mesmo marcador por servirde vários diferentes modos. Por exemplo, 125I pode servircomo um marcador radioativo ou como um reagente denso deelétrons. HRP pode servir como enzima ou como antígeno paramAb. Também, pode-se combinar vários marcadores para oefeito desejado.
Por exemplo, mAbs e avidina também requerem marcadoresna prática desta invenção: assim, pode-se marcar um mAb combiotina, e detectar sua presença com avidina marcada com125I, ou com um mAb antibiotina marcado com HRP. Outraspermutações e possibilidades serão facilmente aparentesàqueles habilitados na técnica, e são considerados comoequivalentes dentro do escopo da presente invenção.
Alternativamente, um anticorpo anti-CD4 0 antagonistade interesse pode ser marcador usando-se "marcação direta"ou um "método de marcação direta", onde um radionuclídeo écovalentemente ligado diretamente a um anticorpo(tipicamente através de um resíduo de aminoácido) .RadionuclIdeos preferidos são fornecidos em Srivagtava eMease (1991) supra. O método de marcação indireta éparticularmente preferido. Veja também, por exemplo, asPublicações Internacionais de números WO 00/52031 e WO00/52473, onde um agente de ligação é usado para ligar ummarcador radioativo aos anticorpos, e as formas marcadasdos anticorpos anti-CD40 descrita na Patente U. S. denúmero 6.015.542; aqui incorporada por referência.
Variantes e Anticorpos
As composições farmacêuticas da presente invençãopodem ser formuladas usando-se variantes de um anticorpoanti-CD4 0 antagonista conhecido na técnica. Tais variantesirão reter as propriedades de ligação desejadas doanticorpo de origem. Assim, por exemplo, onde um anticorpoanti-CD4 0 antagonista a ser formulado é um variante doanticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 de origem, o anticorpovariante irá reter as propriedades de ligação do anticorpoCHIR-12.12 ou CHIR-5.9 de origem. Métodos para fazer asvariantes do anticorpo estão geralmente disponíveis natécnica.
Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácido deum anticorpo anti-CD40 antagonista, por exemplo, oanticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descrito,podem ser preparados por mutações na seqüência de DNAclonada codificando o anticorpo de interesse. Métodos paramutagênese e alterações da seqüência de nucleotídeo são bemconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Technigues in Molecular Biology (MacMillanPublishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e outros (1987) MethodsEnzymol. 154:367-382; Sambrook e outros (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente U. S. de número 4.873.192; e as referêncascitadas nesta; aqui incorporadas por referência. Orientaçãopara as substituições de aminoácidos apropriadas que nãoafetam a atividade biológica do polipeptídeo de interessepode ser encontrada no modelo de Dayhoff e outros (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res.Found., Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.Substituições conservativas, tal como a troca de umaminoácido com um outro possuindo propriedades similares,podem ser preferíveis. Exemplos de substituições conservativas incluem, mas não estão limitadas a Gly<=>Ala,Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln ePhe<=>Trp<=>Tyr.
Na construção de variantes de um polipeptídeo doanticorpo anti-CD4 0 antagonista de interesse, por exemplo,o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, modificações são feitasde forma que as variantes continuem a possuir a atividadedesejada, isto é, afinidade de ligação similar e, no casode anticorpos anti-CD4 0 antagonistas, são capazes deligarem-se especificamente a um antígeno CD40 humanoexpressado na superfície de uma célula humana, e estandolivre de atividade agonista significante mas exibindoatividade antagonista quando ligado a um antígeno CD4 0 emuma célula expressando CD4 0 humano. Obviamente, quaisquermutações feitas no DNA que codifica o polipeptídeo variantenão devem colocar a seqüência fora do quadro de leitura epreferivelmente não criarão regiões complementares quepoderiam produzir estrutura de mRNA secundária. Ver, aPublicação do Pedido de Patente EP de n° 75.444.
Além disso, a região constante de um anticorpo anti-CD4 0 antagonista pode ser mudada para alterar a funçãoefetora de várias formas. Por exemplo, veja Patente U. S.de número 6.737.056 Bl e Publicação de Pedido de Patente U.S. de número 2004/0132101A1, que divulgam mutações em Fcque otimizam a ligação do anticorpo aos receptores Fc.
Preferivelmente, variantes de um anticorpo anti-CD4 0antagonista de referência possuem seqüências de aminoãcidoque possuem pelo menos 70% ou 75% de identidade deseqüência, preferivelmente pelo menos 80% ou 85% deidentidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade de seqüência àseqüência de aminoácido para o anticorpo de referÊncia, porexemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aquidescrito, ou a uma porção mais curta da molécula doanticorpo de referência. Mais preferivelmente, as moléculascompartilham pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidadede seqüência. Para os propósitos da presente invenção, aidentidade de seqüência percentual é determinada usando-seo algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman usando-se uma pesquisa de gap affine com uma penalidade de gapaberto de 12 e uma penalidade de extensão de gap de 2,matriz BlOSUM de 62. 0 algoritmo de pesquisa de homologiaSmith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman (1981) Adv.Appl. Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo,diferir do anticorpo anti-CD40 antagonista de referênciapor alguns, de 1 a 15, resíduos de aminoácido, apenas de 1a 10 resíduos de aminoácido, tal como 6-10, apenas 5,apenas 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.
Com relação ao alinhamento ideal de duas seqüências deaminoácido, o segmento contínuo da seqüência de aminoácidovariante pode ter resíduos de aminoácido adicionais ouresíduos de aminoácido deletados em relação à seqüência deaminoácido de referência. O segmento contínuo usado paracomparação à seqüência de aminoácido de referência iráincluir pelo menos 20 resíduos de aminoácido contínuos epode ser de 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácido.Correções para identidade de seqüência associada com assubstituições do resíduo conservativo ou gaps podem serfeitas (veja, o algoritmo de pesquisa de homologia deSmith-Waterman).
Métodos de terapia usando-se as composiçõesfarmacêuticas da invenção
As composições farmacêuticas da presente invençãoencontram uso no tratamento de um indivíduo possuindocâncer ou condição pré-malígna que está associada com ascélulas que expressam CD40, ou para tratar uma doençaantiinflamatória e/ou doença autoimune que está associadacom as células que expressam CD40. "Tratamento" está aquidefinido como a aplicação ou administração de umacomposição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD40antagonista a um indivíduo, ou a aplicação ou administraçãode uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpoanti-CD4 0 antagonista a um tecido isolado ou linha decélula de um indivíduo, onde o indivíduo possui uma doença,um sintoma de uma doença, ou uma pré-disposição a umadoença, onde o propósito é curar, sarar, aliviar, abrandar,alterar, remediar, melhorar, restabelecer ou afetar adoença, os sintomas da doença ou a pré-disposição à doença.
Por "indivíduo" objetiva-se qualquer animal.Preferivelmente, o indivíduo é um mamífero, maispreferivelmente, o indivíduo é um humano. Mamíferos deimportância particular que não humanos incluem, mas nãoestão limitados a cachorros, gatos, vacas, cavalos, ovelhase porcos.
Quando a administração é para propósito de tratamento,a administração pode ser para um propósito profilático outerapêutico. Quando fornecida de forma profilática, acomposição farmacêutica é fornecida antes de qualquersintoma. A administração profilática da composiçãofarmacêutica serve para impedir ou atenuar qualquer sintomasubseqüente. Quando fornecida terapeuticamente, acomposição farmacêutica é fornecida no começo (ou logoapós) de um sintoma.
A administração terapêutica da composição farmacêuticaserve para atenuar qualquer sintoma real.
Rotas tipicas de administração incluem, mas não estãolimitadas à administração oral e parenteral, incluindointravenosa, intramuscular, intratecal, intranasal,sublingual, intra-arterial e injeção ou infusãointraperitoneal, e injeção subcutânea. Métodos paraexecutar esta administração são bem conhecidos daqueleshabilitados na técnica.
Nas modalidades preferidas, as composiçõesfarmacêuticas da invenção são administradas de formaintravenosa. A administração intravenosa ocorrepreferivelmente por infusão durante um período de cerca de1 a cerca de 10 horas, mais preferivelmente de cerca de 1 acerca de 8 horas, ainda mais preferivelmente de cerca de 2a cerca de 7 horas, ainda mais preferivelmente de cerca de4 a cerca de 7 horas, dependendo do anticorpo anti-CD4 0antagonista sendo administrado. A infusão inicial com acomposição farmacêutica pode ser dada por um período decerca de 4 a cerca de 6 horas com infusões subseqüentessendo entregues mais rapidamente. As infusões subseqüentespodem ser administradas por um período de cerca de 1 acerca de 6 horas, incluindo, por exemplo, cerca de 1 acerca de 4 horas, cerca de 1 a cerca de 3 horas, ou cercade 1 a cerca de 2 horas.
Uma quantidade farmaceuticamente efetiva de umacomposição farmacêutica da invenção é administrada a umindivíduo. Por "quantidade farmaceuticamente efetiva"objetiva-se uma quantidade que ê útil no tratamento de umadoença ou condição, onde o tratamento pode ser parapropósito profilático ou terapêutico conforme notado aquiacima. Desta maneira, uma quantidade farmacêutica efetivada composição irá administrar uma dose ou quantidadeterapeuticamente efetiva do anticorpo anti-CD40 antagonistaao indivíduo em necessidade de tratamento. Por "dose ouquantidade terapeuticamente efetiva" ou "quantidadeefetiva" é objetivado uma quantidade do anticorpo anti-CD4 0antagonista que, quando administrada causa uma respostaterapêutica positiva em relação ao tratamento de umpaciente com uma doença compreendendo células que expressamCD40. Em algumas modalidades da invenção, a dose efetivaterapeuticamente do anticorpo anti-CD4 0 antagonista, porexemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 oufragmento de ligação a antígeno deste, está na faixa decerca de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 0,01mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de30 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cercade 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cercade 25 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, decerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou de cerca de 7mg/kg a cerca de 12 mg/kg. É reconhecido que o método detratamento pode compreender uma única administração de umadose terapeuticamente efetiva ou administrações múltiplasde uma dose terapeuticamente efetiva do anticorpo anti-CD40antagonista, ou fragmento de ligação a antígeno deste.
As composições farmacêuticas da invenção encontram usono tratamento de qualquer indivíduo que possui câncer oucondição pré-maligna que seja responsiva ao tratamento comum agente terapêutico de anti-CD40, mais particularmente,um anticorpo anti-CD40 antagonista. Métodos paradeterminada a resposta de um câncer ou condição pré-malígnaao tratamento com um anticorpo anti-CD4 0 incluem ensaios dediagnóstico e prognósticos, por exemplo, os ensaiosdescritos no pedido de patente provisória comumente cedidoe copendente intitulado nMethods for Diagnosis andTreatment of Proliferative Disorders Mediated by CD4 0Signaling", depositado em 9 de dezembro de 2005, e Pedidode Patente U. S. cedido de número 60/749.285 (ProcuraçãoNo. PP028035.0002 (035784/304312), e Pedido de Patenteinternacional correspondente de número PCT/US2006/019414(Procuração No. PP028035.0003 (035784/311611)), depositadoem 18 de maio de 2006, e publicado como WO 2006/125143;cujos conteúdos estão aqui incorporado por referênciaintegralmente. Similarmente, a composição farmacêutica dainvenção encontra uso no tratamento de qualquer indivíduoque possui uma doença inflamatória ou autoimune que sejaresponsiva ao tratamento com um agente terapêutico de anti-CD4 0, particularmente, um anticorpo anti-CD4 0 antagonista.Métodos para determinar a resposta de uma doençainflamatória ou autoimune ao tratamento com um anticorpoanti-CD40 incluem ensaios de diagnóstico e prognósticos,por exemplo, os ensaios descritos no pedido de patenteprovisória comumente cedido e co-pendente intituladonMethods for Diagnosis and Treatment of Diseases Having anAutoimmune and/or Inflammatory Component", depositado em 9de dezembro de 2005, e Pedido de Patente U. S. cedido denúmero 60/749.336 (Procuração No. PP028062.0002(035784/304311)), e Pedido de Patente internacionalcorrespondente de número PCT/US2006/019325 (Procuração No.PP028062.0003 (035784/311608)), depositado em 18 de maio de2006, e publicado como WO 2005/125117; cujos conteúdosestão aqui incorporado por referência integralmente.
"Tumor", conforme aqui usado" refere-se a todocrescimento e proliferação de células neoplásicas, semalignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerígenos ou cancerígenos.
"Neoplasia", conforme aqui usado, refere-se a qualquerforma de crescimento celular desregulado ou não regulado,se maligno ou benigno, resultante de crescimento anormal detecido. Assim "células neoplásicas" incluem célulasmalignas e benignas possuindo crescimento celulardesregulado ou não regulado.
Por "atividade antitumor" é objetivada uma redução nataxa de proliferação de célula expressando CD40 malignanteou acúmulo, e por conseguinte, um declínio na taxa decrescimento de um tumor existente ou em um tumor que surgedurante a terapia, e/ou destruição de células neoplásicas(tumor) existentes ou de células neoplásicas recentementeformadas, e por conseguinte um decréscimo no tamanho totalde um tumor durante a terapia. A terapia com as composiçõesfarmacêuticas contendo anticorpo anti-CD4 0 antagonista dainvenção causa uma resposta fisiológica que é benéfica comrelação ao tratamento de cânceres e condições pré-malignasassociadas com o estímulo da sinalização de CD40 em célulasque expressam CD4 0 em um humano.
Os termos "câncer" e "cancerígeno" referem-se a oudescrevem a condição fisiológica em mamíferos que étipicamente caracterizada por crescimento celular nãoregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estãolimitados,a linfoma e leucemia, e tumores sólidos. Por"câncer relacionado à célula B" ou "câncer de linhagem decélula B" pretende-se dizer qualquer tipo de câncer em queo crescimento celular desregulado ou não regulado estáassociado com as células B.
Por "refratário" no contexto de um câncer, objetiva-sedizer que o câncer particular é resistente a, ou nãoresponsivo à terapia com um agente terapêutico particular,por exemplo, um anticorpo anti-CD40 antagonista deinteresse. Um câncer pode ser refratário à terapia com umagente terapêutico particular ou no início do tratamentocom o agente terapêutico particular (isto é, não responsivoà exposição inicial ao agente terapêutico), ou como umresultado de desenvolvimento de resistência ao agenteterapêutico, ou durante o curso de um primeiro período detratamento com o agente terapêutico ou durante um períodode tratamento subseqüente com o agente terapêutico.
As composições farmacêuticas da presente invençãoencontram uso no tratamento de um indivíduo que está emnecessidade de intervenção terapêutica para um câncer oucondição pré-maligna que é mediada pelo estímulo desinalização de CD40 em células que expressam CD40 ou paraqualquer doença inflamatória ou autoimune que seja mediadapela sinalização de CD40 em células que expressam CD40. Por"células que expressam CD4 0" é objetivado células normais,pré-malígna e malignas expressando o antígeno CD40. Emalgumas modalidades, a célula que expressa CD4 0 é umacélula B maligna. Por célula B "maligna" quer-se dizerqualquer célula B neoplásica, incluindo mas não limitada àscélulas B derivadas de linfomas incluindo linfomas decélula B de baixo grau, de grau intermediário e de altograu, linfomas imunoblásticos, e linfomas que não deHodgkin, doença de Hodgkin, linfomas induzidos por vírusEpstein-Barr (EBV), e linfomas relacionados a AIDS, assimcomo leucemias linfoblásticas aguda de célula B, mielomas,leucemias linfociticas crônicas e etc. Em outrasmodalidades, a célula que expressa CD40 é uma célula decarcinoma ou de sarcoma. Por "célula de carcinomaexpressando CD40" ou "célula de sarcoma expressando CD40"quer-se dizer qualquer célula de carcinoma ou sarcomamaligna (isto é, neoplástica) ou pré-maligna de um tumorsólido que expressa o antígeno de superfície de célulaCD40. Para propósitos da presente invenção, célulascancerosas e pré-cancerosas ou pré-malignas que expressam oantígeno CD40 são referidas aqui como "células neoplásicasque expressam CD40". Métodos para detectar a expressão deCD40 nas células são bem conhecidos na técnica e incluem,mas não estão limitados a técnicas de PCR,imunohistoquímica, citometria de fluxo, mancha do Norte,ELISA e etc. Onde o tratamento com um anticorpo anti-CD40antagonista ou fragmento de ligação de antígeno deste éassegurados, a composição farmacêutica compreendendo oanticorpo anti-CD40 antagonista ou fragmento de ligação deantígeno deste pode ser administrada por qualquer rotaadequada de administração.
O indivíduo que está em necessidade de intervenção dotratamento com uma composição farmacêutica da presenteinvenção pode ser afligido com, ou estar em risco dedesenvolver ou ter recidiva com, qualquer câncer oucondição pré-maligna que seja mediada por sinalização deCD40 nas células neoplásicas que expressam CD40. Exemplosde tais cânceres e condições pré-malignas incluem, mas nãoestão limitados a, quaisquer dos cânceres da linhagem de célula B, malignidade hematológica de célula não B, etumores sólidos que são bem conhecidos por serem mediadosatravés de sinalização de CD40 em células neoplásicas queexpressam CD40.
Exemplos de cânceres de linhagem de célula B que compreendem células neoplásicas que expressam CD4 0 sãoleucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocíticacrônica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia decélula pilosa, doença de Hodgkin, mieloma múltiplo,macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, e os Iinf ornas, incluindo, mas não limitados a, linfomalinfocítico pequeno difuso, folicular, DLBCL, linfoma detecido linfóide associado com mucosa, linfoma de célula Bmonocitóide, linfoma esplênico, granulomatose linfomatóide,linfomatose intravascular, linfoma imunoblástico, linfoma relacionado a AIDS e etc.
Assim, as composições farmacêuticas da invençãoencontram uso no tratamento de indivíduos que possuemIinfomas de não Hodgkin relacionado à proliferação ouacúmulo de célula B incontrolável, anormal. Para os propósitos da presente invenção, tais linfomas serãoreferidos de acordo com o esquema de classificação WorkingFormulation, isto é, estes linfomas de célula B sãocategorizados como de baixo grau, grau intermediário e altograu (veja, uThe Non-Hodgkin's Lymphoma PathologicClassification Project", Câncer 49 (1982) :2112-2135) . Assim,os linfomas de célula B de baixo grau incluem linfomaslinfocítico pequeno, folicular de células pequenas clivadase linfomas foliculares misturados de células grandes epequenas clivadas; linfomas de grau intermediário incluemlinfomas folicular de célula grande, difuso de célulapequena clivada, difuso misturado de célula pequena egrande e difuso de célula grande; e linfomas de alto grauincluem linfomas imunoblásticos de célula grande,linfoblásticos e linfomas de célula pequena não clivadas dotipo Burkitt e não-Burkitt.
É reconhecido que as composições farmacêuticas dainvenção são úteis no tratamento terapêutico de linfomas decélula B que são classificados de acordo com o sistemaRevised European and American Lymphoma Classification(REAL) . Tais linfomas de célula B incluem, mas não estãolimitados aos linfomas classificados como neoplasmas decélula B precursores, tal como leucemia/linfomalinfoblástico B; neoplasmas de célula B periférico,incluindo leucemia linfocitica crônica de célula B/linfomalinfocítico pequeno, linfomalinfoplasmacitóide/imunocitoma, linfoma de célula manto(MCL), linfoma de centro de folículo (folicular) (incluindolinfomas difusos de célula pequena, difusos misturados decélula pequena e grande, e difusos de célula grande),linfoma de célula B da zona marginal (incluindo os tiposextranodal, nodal e esplênico), plasmacitoma/mieloma,linfoma difuso de célula B e célula grande subtipo primáriodo médiastino (tímico), linfoma de Burkitt, e linfoma decélula B de alto grau tipo Burkitt; e linfomas de célula Bde baixo grau ou alto grau não classificável.As composições farmacêuticas da presente invençãopodem também ser usados para tratar os indivíduos possuindoa condição pré-maligna conhecida como MGU S (gamopatiamonoclonal de significância indeterminada). Aproximadamente25% dos pacientes com MGUS eventualmente desenvolverammieloma múltiplo (MM) ou uma disfunção de célula de plasmarelacionada (Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc. 68:26-36). Aproliferação de células de plasma malignas na medula óssea,detecção de um soro ou proteína monoclonal de urina(proteína Μ), anemia, hipercalcemia, insuficiência renal elesões líticas de ossos são manifestações clínicas de MM,embora a MGUS seja clinicamente reconhecida como a presençade proteína M no soro ou urina sem outras característicasclínicas de MM (veja, por exemplo, Kyle and Lust (1989)Semin. Hematol. 26:176-200; Greipp and Lust Stem Cells(1995) 13:10-21). Pacientes com MGUS são assintomáticos epossuem medições estáveis de proteína M (Kyle (1993) MayoClinic. Proc. 68:26-36). Uma vez que MGUS é identificada emum indivíduo, a terapia de manutenção com uma composiçãofarmacêutica apropriada da presente invenção, por exemplo,uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD4 0antagonista aqui divulgado, pode bloquear o desenvolvimentode mieloma múltiplo nestes indivíduos.
Particulairmente, as composições farmacêuticas dainvenção são úteis para tratar Iinfomas de célula B,incluindo aqueles listados acima, que são refratários aos(isto é, resistentes aos, ou tornaram-se resistentes aos)tratamentos oncoterapêuticos de primeira linha. O termo"oncoterapêutico" pretende significar um tratamento paracâncer tal como quimioterapia, cirurgia, terapia comradiação, terapia de anticorpo anticâncer único ecombinações destes. Subpopulação de pacientes para quem aintervenção do tratamento com um ou mais anticorpos anti-CD40 que modula(m) a sinalização de CD40 mediada por CD4 0L,modula(m) ADCC ou ambos é desejável.
As composições farmacêuticas da presente invenção sãotambém úteis para tratar malignidades hematológicasrelacionada a célula não-B. Tais malignidades incluem, masnão estão limitadas a leucemias agudas; leucemiasmieloblásticas, leucemias mielocíticas agudas; leucemiapromielócito; leucemia mielomonocítica; leucemiamonocítica; eritroleucemia; leucemia granulocítica(leucemia mielocítica crônica); policitemia vera, e etc.
Os tumores sólidos que compreendem as célulasneoplásicas que expressam CD4 0, e desta forma respondembeneficamente ao tratamento com as composiçõesfarmacêuticas, mas não estão limitadas a câncer de ovário,pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequenado carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma e carcinomade célula grande e câncer de pulmão de célula pequena,mama, colo, rim (incluindo, por exemplo, carcinomas decélula renal), bexiga, fígado (incluindo, por exemplo,carcinomas hepatocelulares), gástrico, cervical, próstata,nasofaringeal, de tiróide (por exemplo, carcinoma papilarde tireóide) , cânceres de pele tal como melanoma, esarcoma, incluindo, por exemplo, osteossarcomas e sarcomasde Ewing.
Resultados benéficos que podem ser alcançadosadministrando-se uma composição farmacêutica da invenção aum indivíduo com um câncer ou uma condição pré-malignaincluem qualquer resposta terapêutica positiva com relaçãoàquele câncer ou condição. Por "resposta terapêuticapositiva" no contexto do tratamento de câncer é objetivadoum melhoramento na doença em associação com a atividadeantitumor do agente terapêutico anti-CD40 e/ou ummelhoramento nos sintomas associados com a doença deinteresse. Isto é, um efeito antiproliferativo, a prevençãode desenvolvimento de tumor adicional, uma redução notamanho do tumor, uma redução no número de célulascancerígenas, e/ou um decréscimo em um ou mais sintomasmediados pela estimulação de células que expressam CD40pode ser observado. Assim, por exemplo, uma respostaterapêutica positiva irá referir-se a um ou mais dosseguintes melhoramentos na doença: (1) uma redução notamanho do tumor; (2) uma redução no número de célulascancerígenas (isto é, neoplásicas); (3) um aumento na mortede células neoplásicas; (4) inibição da sobrevivência decélula neoplásica; (4) inibição (isto é, retardo a algumgrau, preferivelmente suspensão) de crescimento de tumor;(5) inibição (isto é, retardo a algum grau, preferivelmentesuspensão) de infiltração de célula de câncer em órgãosperiféricos; (6) inibição (isto é, retardo a algum grau,preferivelmente suspensão) de metástase de tumor; (7)prevenção de desenvolvimento de tumores adicionais; (8) umataxa de sobrevivência de paciente aumentada; e (9) algumgrau de melhora de um ou mais sintomas associados com ocâncer. Respostas terapêuticas positivas em qualquermalignidade dada podem ser determinadas por critérios deresposta padronizados específicos àquela malignidade. Aresposta tumoral pode ser avaliada por mudanças namorfologia do tumor (isto é, carga tumoral total, tamanhodo tumor e etc.) usando-se técnicas de seleção tal comoescaneamento de imagem por ressonância magnética (MRI),imagem x-radiográfica, escaneamento por tomografiacomputadorizada (CT), imagem de escaneamento de osso,endoscopia e amostragem de biopsia de tumor incluindoaspiração de medula óssea e contagem de células tumorais nacirculação. Além destas respostas terapêuticas positivas, oindivíduo que está passando por terapia com composiçãofarmacêutica contendo anticorpo anti-CD40 antagonista dainvenção pode experimentar o efeito benéfico de ummelhoramento nos sintomas associados com a doença. Assim,para os tumores de célula Β, o indivíduo pode experimentarum decréscimo nos assim chamados sintomas B, isto é, suoresnoturnos, febre, perda de peso e/ou urticária. Para ascondições pré-malignas, a terapia com um agente terapêuticoanti-CD4 0 pode bloquear e/ou prolongar o tempo antes dodesenvolvimento de uma condição maligna relacionada, porexemplo, desenvolvimento de mieloma múltiplo em indivíduossofrendo de gamopatia monoclonal de significânciaindeterminada (MGUS).
Por "atividade antiinflamatória" é objetivada umaredução ou prevenção de inflamação. A terapia com umacomposição farmacêutica contendo anticorpo anti-CD40antagonista da invenção causa uma resposta fisiológica queé benéfica com relação ao tratamento de uma doençaautoimune e/ou doença inflamatória, onde a doença envolvecélulas que expressam o antígeno CD40. É reconhecido que ascomposições da invenção podem ser úteis na prevenção demudança fenotípica nas células tal como proliferação,ativação e etc.
O indivíduo que está experimentando intervenção detratamento com uma composição farmacêutica líquida contendoanticorpo anti-CD4 0 antagonista da invenção pode serafligido com, ou estar em risco de desenvolver ou terrecidiva com qualquer doença inflamatória ou autoimune queseja mediada por sinalização de CD40 nas células queexpressam CD40. Doenças inflamatórias são caracterizadaspor inflamação e destruição do tecido, ou uma combinaçãodestes. "Doença inflamatória" inclui qualquer processoinflamatório imune-mediado onde o evento de iniciação oualvo da resposta imune envolve não-autoantígeno(s) ,incluindo, por exemplo, aloantígenos, xenoantígenos,antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenosdesconhecidos ou alérgenos.
Também, para os propósitos da presente invenção, otermo "doença(s) inflamatória(s)" inclui "doença(s)autoimune(s)". Conforme aqui usado, o termo "autoimunidade"é geralmente compreendido como abrangendo processosinflamatórios imune-mediados envolvendo "autoantígenos". Emdoenças autoimunes, o(s) autoantígeno(s) despertam asrespostas imunes do hospedeiro.
Também, as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem ser usadas para o tratamento de inflamaçãoassociada com rejeição a transplante de tecido. "Rejeição atransplante" ou "rejeição a enxerto" refere-se a qualquerresposta imune montada em hospedeiro contra um enxertoincluindo mas não limitada a antígenos HLA, antígenos dogrupo sangüíneo e etc.
As composições farmacêuticas da invenção podem tambémser usadas para o tratamento de enxerto versus doençahospedeira, tal como aquela associada com transplante demedula óssea, por exemplo. Em tal doença hospedeira versusenxerto, a medula óssea do doador inclui Iinfócitos ecélulas que amadurecem como linfócitos. Os linfócitos dodoador reconhecem os antígenos do receptor como não-próprios e despertam uma resposta inflamatória imune. Porconseguinte, conforme aqui usado, "doença hospedeira versusenxerto" ou "reação hospedeira versus enxerto" refere-se aqualquer resposta imune mediada por célula T em que oslinfócitos do doador reagem aos antígenos do hospedeiro.
Exemplos de disfunções autoimunes e/ou inflamatóriasincluem, mas não estão limitadas a lúpus sistêmicoeritematoso (SLE), lúpus discóide, nefrite por lúpus,sarcoidose, artrite inflamatória, incluindo artritejuvenil, artrite reumatóide, artrite psoriática, síndromede Reiter, espondilite anquilosante, gota artrite, rejeiçãode transplante de órgão ou tecido, rejeição hiperaguda,aguda ou crônica e/ou doença hospedeira versus enxerto,esclerose múltipla, síndrome hiper IgE, poliarteritenodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória dointestino, doença de Crohn, doença celíaca (enteropatiasensível a glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa,anemia hemolítica autoimune, psoríase, escleroderma,miastenia grave, púrpura trombocitopênica autoimune,tiroidite autoimune, doença de Graves, tiroidite deHashimoto, doença do complexo imune, síndrome de disfunçãoimune de fadiga crônica (CFIDS), polimiosite edermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise,cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticialpulmonar, diabetes melitus Tipo I e Tipo II,hipersensibilidade do tipo retardado tipos 1, 2, 3 e 4,alergia ou doenças alérgicas, respostas imunes indesejadas/não objetivadas a proteínas terapêuticas (veja, porexemplo, Pedido de Patente U. S. de número US 2002/0119151e Koren e outros, (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:349-60), asma, síndrome de Churg-Strausswsqsq (granulomatosealérgica), dermatite atópica, dermatite de contato alérgica eirritante, urticária, alergia mediada por IgE, aterosclerose,vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doençahemolítica, doença de Alzheimer e polineuropatia desmielinizanteinflamatória crônica e etc. Em algumas outras modalidades, ascomposições farmacêuticas da presente invenção são usadaspara tratar inflamação pulmonar em indivíduos, incluindomas não limitado a rejeição de enxerto de pulmão, asma,sarcoidose, enfisema, fibrose cística, fibrose pulmonaridiopática, bronquite crônica, rinite alérgica e doençasalérgicas do pulmão tal como pneumonite hipersensibilidade,pneumonia eosinofílica, bronquiolite obliterante devido atransplante de medula óssea e/ou pulmão ou outras causas,aterosclerose de enxerto/flebosclerose de enxerto, assimcomo fibrose pulmonar resultando de doenças do colágeno,vascular e autoimune tal como artrite reumatóide e lúpuseritematoso.
Em outras modalidades, as composições farmacêuticas dapresente invenção são úteis para tratar doenças autoimunese doenças inflamatórias que são inicialmente resistentes a,ou que desenvolvem resistência a outros tratamentosterapêuticos conhecidos cujo modo de ação é outro queatravés da modulação de sinalização de CD4 0 mediada porCD40L, modulação de ADCC ou ambos. As composiçõesfarmacêuticas da invenção podem ser usadas para tratar asubpopulação de pacientes para quem a intervenção dotratamento com um ou mais anticorpos anti-CD4 0 antagonistasque modula(m) a sinalização de CD40 mediada por CD40L,modula(m) ADCC ou ambos é desejável.
Resultados benéficos que podem ser alcançadosadministrando-se as composições farmacêuticas da invenção aum indivíduo com uma doença inflamatória ou doençaautoimune incluem qualquer resposta terapêutica positivacom relação àquela doença. Por "resposta terapêuticapositiva" no contexto de uma doença autoimune e/ou doençainflamatória é objetivado um melhoramento na doença emassociação com a atividade antiinflamatória destesanticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes,e/ou um melhoramento nos sintomas associados com a doença.Isto é, um efeito antiproliferativo, a prevenção deproliferação adicional da célula que expressa CD4 0, umaredução na resposta inflamatória incluindo mas não limitadoà secreção reduzida de citoquinas inflamatórias, moléculasde adesão, proteases, imunoglobulinas (em exemplos onde acélula que porta CD4 0 é uma célula Β), combinações destes,e etc., produção aumentada de proteínas antiinflamatórias,uma redução no número de células autorreativas, um aumentona tolerância imune, inibição de sobrevivência de célulaautorreativa, e/ou um decréscimo em um ou mais sintomasmediados pelo estímulo de células que expressam CD4 0 podemser observados. Tais respostas terapêuticas positivas nãoestão limitadas à rota de administração e podem compreenderadministração ao doador, o tecido do doador (tal como, porexemplo, perfusão de órgão), o hospedeiro, qualquercombinação destes, e etc.
A resposta clínica pode ser avaliada usando-setécnicas de seleção tal como escaneamento de imagem porressonância magnética (MRI), imagem x-radiográfica,escaneamento por tomografia computadorizada (CT) ,citometria de fluxo ou análise por separação celularativada por fluorescência (FACS), histologia, patologiatotal e química do sangue, incluindo mas não limitado amudanças detectáveis por ELISA, RIA, cromatografia e etc.Além destas respostas terapêuticas positivas, o indivíduoque está passando por terapia com uma composiçãofarmacêutica líquida contendo anticorpo anti-CD40antagonista da invenção pode experimentar o efeito benéficode um melhoramento nos sintomas associados com a doença.
Os seguintes exemplos são oferecidos por meio deilustração e não por meio de limitação.EXPERIMENTAL
CHIR-12.12 é um anticorpo monoclonal IgGx anti-CD40humanizado completamente produzido por um processo decultura de célula CHO. A molécula possui um peso molecularde 150 kDa, e a estrutura molecular consiste de duascadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas juntas porligações de dissulfeto. CHIR-12.12 tem como alvo a proteínareceptora de superfície de célula CD40 humana. Ela é umantagonista forte e inibe a proliferação mediada peloligante de CD4 0 de células B normais, assim como inibe aproliferação mediada pelo ligante de CD40 in vitro decélula cancerígenas de pacientes com NHL e CLL. Linha dehibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC# 12056) expressando oanticorpo CHIR-12.12 foi depositada com a American TypeCulture Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas,Virginia 20110-2209 (USA)] em 17 de setembro de 2003 sob oDepósito de Patente de número PTA-5543.
Sem estar preso pela teoria, o anticorpo CHIR-12.12 éum anticorpo monoclonal anti-CD4 0 antagonista de ação duplapossuindo uma combinação única de atributos. Este anticorpomonoclonal completamente humano bloqueia as rotas desinalização de CD4 0 mediada por CD4 0L para sobrevivência eproliferação de células B; este antagonismo leva à mortecélula final. CHIR-12.12 também media o reconhecimento eligação por células efetoras, iniciando a citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC) Uma vez que CHIR-12.12 está ligado às células efetoras, enzimas citolíticassão liberadas, levando à apoptose e Iise da célula B.
Para uma descrição mais detalhada das atividadesbiológicas de CHIR-12.12, e os ensaios usados para medi-las, veja os pedidos intitulados nAntagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use" depositadoem 4 de novembro de 2003, 26 de novembro de 2003 e 27 deabril de 2004 e Pedido de Patente U. S. cedidos de números60/517.337 (procuração de número PP20107.001(035784/258442)), 60/525.579 (procuração de númeroPP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (procuração denúmero PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente; ePedido de Patente Internacional de número PCT/US2004/037152(procuração de número PP20107.004 (035784/282916)), tambémintitulada nAntagonist Anti-CD4 0 Monoclonal Antibodies andMethods for Their Use" depositada em 4 de novembro de 2004e publicada como WO 2005/044854; o conteúdo de cada uma dasquais está aqui incorporado por referência em suatotalidade. Veja também, as Publicações Internacionais denúmeros WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307 e WO 2005/044294; cujosconteúdos de cada uma estão aqui incorporados porreferência integralmente. Ver também os ensaios descritosno pedido de patente provisório intitulado nMethods forDiagnosis and Treatment of Proliferative Disorders Mediatedby CD40 Signaling", depositado em 9 de dezembro de 2005, ePedido de Patente U. S. cedida de número 60/749.285(procuração de número PP028035.0002 (035784/304312)), ePedido de Patente Internacional correspondente de númeroPCT/US2006/019414 (procuração de número PP028035.0003(035784/311611)), depositado em 18 de maio de 2006 epublicado como WO 2006/125143;e pedido de patenteprovisório intitulado nMethods for Diagnosis and Treatmentof Diseases Having an Autoimmune and/or InflammatoryComponent", depositado em 9 de dezembro de 2005, e PatenteU. S. cedida de número 60/749.336 (procuração de númeroPP028062.0002 (035784/304311)), e Pedido de PatenteInternacional correspondente de número PCT/US2006/019325(procuração de número PP028062.0003 (035784/311608)),depositado em 18 de maio de 2006 e publicado como WO2006/125117; o conteúdo de cada uma das quais está aquiincorporado por referência em sua totalidade.
As aplicações clínicas primárias de CHIR-12.12 são otratamento de malignidades relacionadas à célula B,incluindo leucemia linfocítica crônica (CLL), mielomamúltiplo (MM) e linfoma de não-Hodgkin (NHL), e doençasautoimunes e/ou inflamatórias associadas com células queexpressam CD4 0. O produto da droga de CHIR-12.12 paraestudos clínicos é formulado a 20 mg/mL de anticorpo CHIR-12.12 em uma formulação líquida. Os estudos a seguir foramexperimentados para determinar o tampão ideal, agenteisotonizante e vários excipientes para estabilizar oanticorpo na formulação líquida.
Exemplo 1: Efeitos de várias espécies de tampão emetionina na estabilização de CHIR-12.12
As condições da solução (por exemplo, pH, espécie detampão e força iônica) e excipientes (por exemplo,tensoativos e estabilizantes) são fatores importantes paraestabilidade de uma proteína em formulação líquida. Aestabilidade fisicoquímica de CHIR-12.12 é ideal a um pH de5,5.
Entretanto, a proteína de CHIR-12.12 pode degradar-seatravés da agregação e fragmentação sob condições desolução desfavoráveis; ela pode também oxidar,especialmente na presença de impurezas de peróxido e/ouquantidades de traços de metais introduzidas com asmatérias primas do excipiente tal como Tween. Os seguintesexperimentos foram conduzidos para identificar a melhorespécie de tampão e excipientes apropriados paraestabilizar o anticorpo monoclonal CHIR-12.12 contraagregação, fragmentação e oxidação quando formulado no pHmáximo de 5,5.
Materiais
Os lotes da substância da droga (DS) de CHIR-12.12para o estudo onde o lote de volume # CD021105A purificadoderivado de CHO e lote # PDOlO 7 05A. Os lotes de DS oramproduzidos em Xoma, Ltd (Berkeley, CA) . As amostras daformulação para este estudo foram preparadas por diálise daDS contra as respectivas soluções tampão seguida porreforço com a quantidade desejada de Tween. A concentraçãoda proteína de CHIR-12.12 em todas as amostras era deaproximadamente 20 mg/mL.Métodos Analíticos
Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
SEC-HPLC separa as moléculas a fim de diminuir o pesomolecular. Conseqüentemente, os agregados de CHIR-12.12 sãoos primeiros a eluir da coluna de HPLC, seguido pelomonômero, com os fragmentos eluindo por último. Pureza,agregação e fragmentação de CHIR-12.12 foram analisados porum HPLC Waters Alliance usando-se a coluna Tosohaas TSK-GEL3OOOSWxi, fosfato de sódio 50 mM, NaCl 200 mM, pH = 7,0como fase móvel a uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min.Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)A oxidação de CHIR-12.12 foi medida usando-se umsistema de HPLC Waters Alliance com uma coluna Tosoh TSKgel butil-NPR, sulfato de amônio 2M/Tris 20 mM, pH = 7,0como a fase móvel A e Tris 20 mM, pH = 7,0 como a fasemóvel B a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. 0 anticorpoCHIR-12.12 é digerido com papaína para produzir osfragmentos Fab e Fc. Os produtos da oxidação de CHIR-12.12são fragmentos Fc oxidados (metSO), que são espécies pré-Fceluindo entre as espécies Fab principal e as espécies Fcprincipal a partir da coluna de HPLC.
EXPERIMENTOS E RESULTADOS
Efeito da estabilização de tampão de citrato naagregação e fragmentação
CHIR-12.12 do lote de DS #PD010705A foi formulado a 20mg/mL de solução tampão de citrato, acetato, succinato oufosfato 10 mM com NaCl 150 mM, 0,1% (p/v) de Tween 80 e pH= 5,5. As amostras da formulação foram cheias como soluçõesde 1,2 mL em frascos de vidro de 3 cm3 e armazenadas a 5°C,25°C e 40°C. A estabilidade das amostras de CHIR-12.12 foianalisada em momentos determinados pelo ensaio por SEC.
As Figuras 1-3 mostram a análise por SEC para pureza,agregados e fragmentos, respectivamente, nas amostrasarmazenadas a 25°C. As Figuras 4-6 resumem a análise porSEC para pureza, agregados e fragmentos, respectivamente,nas amostras armazenadas a 40°C. Todos os resultadosmostram que as amostras da formulação baseada em citratopermaneceram no mais alto nível de pureza e mais baixosníveis de agregação e fragmentação entre as quatroformulações testadas. Embora tenha havido pouca mudançadetectada para as amostras armazenadas a 5°C por 5 meses(dados não mostrados), os dados de SEC acelerados prevê queo tampão citrato será provavelmente superior às outras trêsespécies de tampão usadas no melhoramento da estabilidadeem tempo real de longa duração do CHIR-12.12 contraagregação e fragmentação.
Efeito de Inibição de Oxidação de Tampão de Citrato emCHIR-12.12.
As amostras de estabilidade de CHIR-12.12 forampreparadas em tampões de citrato, acetato e succinato com0,1% e 0,2% (p/v) de Tween 80. As amostras foramarmazenadas a 5°C, 25°C e 40°C e analisadas porCromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) quanto aoxidação nos pontos de tempo predeterminados. Os produtosde oxidação de CHIR-12.12 foram medidos como um percentualde somas das espécies de pico Pré-Fc, isto é, % Pré-Fc. Osresultados na Tabela 1 mostram que a formulação baseada emcitrato geraram menos produtos de oxidação que asformulações tamponadas com succinato e acetato, indicando que o tampão de citrato minimizou a oxidação de CHIR-12.12.Estes resultados sugerem que o ácido citrico provavelmenteserviu como um agente quelante para inibir a oxidaçãoinduzida por metal de traço.
A análises SEC e HIC indicaram que o tampão de citrato é superior às espécies de tampão de succinato, acetato efosfato na proteção de CHIR-12.12 da agregação efragmentação. O tampão de citrato é também superior aostampões de succinato e acetato uma vez que minimiza aoxidação da proteína CHIR-12.12.
Tabela 1. Efeito de espécies de tampão na oxidação de
CHIR-12.12 (20 mg/mL) conforme medido por ensaio de HIC.
<table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table>
*N/D, não determinado.
E£eito de Inibição de Oxidação de L-Metionina em CHIR-12.12.
DS lote #CD021105A foi formulado a 20 mg/mL em citratode sódio/ácido cítrico 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 80 ouTween 20 a 0,1%, assim como várias quantidades (0 a 5 mM)de L-metionina. As amostras de formulação foram preenchidasa 2m5 mL em frascos de 3 cm3 e armazenadas a 4O0C. A Tabela2 mostra os resultados de HIC para as amostras no momentoinicial e a 40°C por 3 meses. No momento inicial, aoxidação de CHIR-12.12 em todas as formulações foicomparável à da substância de droga original (DS) de lote#CD 021105 A. Os níveis de oxidação na formulação sem a L-metionina foram mais que dobrados sob armazenamento a 40°Cpor 3 meses. Entretanto, o nível de oxidação nasformulações contendo L-metionina teve pouca alteração aolongo dos 3 meses de armazenagem a 40°C.
Os resultados indicam que L-metionina a 5 mM foiefetiva e suficiente na prevenção da oxidação de CHIR-12.12sob as condições de armazenamento de alto stress. 0 efeitode inibição de oxidação de L-metionina em CHIR-12.12 foiconfirmado por mapa de peptídeo licina.
Tabela 2. Efeito de Inibição de L-Metionina emoxidação de CHIR-12.12.<table>table see original document page 118</column></row><table>
*N/D, não determinado.
EM resumo, o tampão de citrato minimiza a agregação,fragmentação e oxidação de CHIR-12.12 e, desta forma,representa um tampão ideal para a formulação líquida deCHIR-12.12. A L-metionina efetivamente inibe a oxidação deCHIR-12.12 com L-metionina 5 mM sendo preferida.
Exemplo 2:_Efeitos Estabilizante de Arginina-HCl emCHIR-12.12.
O seguinte estudo foi direcionado a selecionar umagente tonificante e estabilizante para estabilidade dearmazenamento de longo prazo de CHIR-12.12 formulado comouma composição farmacêutica líquida pretendida paraadministração através de infusão intravenosa. Embora NaClseja o agente isotonificante mais comumente utilizado paraprodutos parenterais de proteína, o mesmo pode não possuirefeitos de estabilização ideais na terapêutica comanticorpo. Este estudo relata os efeitos estabilizantescomparativos de cloreto de sódio e da forma ácida dearginina (arginina-HCl) em CHIR-12.12 em uma formulaçãoaquosa.
A substância de droga de anticorpo em volume de CHIR-12.12 foi formulada com um tampão de citrato a pH 5,5,empregando ou NaCl 150 mM ou L-arginina-HCl 150 mM paraatingir a osmolalidade alvo de 295 mOsm/kg para aformulação líquida de CHIR-12.12 e Calorimetria Diferencialde Varredura (DSC), cromatografia de exclusão por tamanho(SEC-HPLC), SDS-PAGE, e HPLC de Troca Catiônica (CIEX-HPLC)foram utilizados para avaliar a estabilidade biofísica e/oubioquímica do anticorpo CHIR-12.12. 0 estudo demonstra queL-arginina-HCl 150 mM não apenas fornece isotonicidade auma formulação aquosa de CHIR-12.12, como também aumenta aestabilidade de conformação de CHIR-12.12 contra agregação,fragmentação e desaminação. L-arginina-HCl provou sersuperior a NaCl sob condições de estabilidade acelerada.Além disso, os dados de estabilidade acelerada previram umavida de armazenagem maior para a formulação de CHIR-12.12com L-arginina-HCl.
Materiais:
A substância de droga (DS) CHIR-12.12 utilizada paraeste estudo foi um lote de volume purificado derivado deCHO #CD021105A. 0 lote de DS foi produzido por Xoma Ltd.(Berkeley, CA).CHIR-12.12 do lote de DS foi utilizado nas seguintesformulações:
Formulação 1: 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato desódio/ácido cítrico 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 80 a 0,1% ePH 5,5
Formulação 2: 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato desódio/ácido cltrico 10 mM, L-arginina-HCl 150 mM, Tween 80a 0,1% e pH 5,5
Métodos Analíticos
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) .
A estabilidade de conformação das amostras daformulação de CHIR-12.12 foram avaliadas utilizando-se umMicroCal VP-DSC sob aquecimento de 15°C a 90°C aIoC/minuto.
Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC-HPLC)
Pureza, agregação e fragmentação de CHIR-12.12 foramanalisados por um RPLC Waters Alliance com uma colunaTosohaas TSK-GEL 3000SWXL, sódio 50 mM, fosfato, NaCl 200mM, pH 7,0 como fase móvel a uma taxa de fluxo de 0,7mL/minuto.
SDS-PAGE (Não reduzida e Reduzida).
A pureza de CHIR-12.12 foi também avaliada utilizando-se géis de tris-glicina a 12% sob condições de não reduçãoe de redução. A proteína foi detectada por tingimento azulde Coomassie.
Cromatografia de Troca Catiônica (CIEX-HPLC) .
A desaminação relacionada à mudança de carga de CHIR-12.12 foi pedida utilizando-se um sistema HPLC WatersAlliance com uma coluna Dionex Propac WCX-IO, HEPES 50 mM,pH 7,3 como fase móvel A e HEPES 50 mM contendo NaCl 500mM, pH 7,3 como fase móvel B a uma taxa de fluxo de 0,8mL/minuto.
O que segue é uma chave para as abreviações nasfiguras referidas na seção de resultados aqui abaixo:Succinato, NaCl, TW80 = tampão succinato de sódio/ácido
süccínico 10 mM, NaCl 150 mM,Tween 80 a 0,1%, pH 5,5
Citrato, NaCl, 0,1% > = tampão citrato de sódio/ácidoTW80 cítrico 10 mM, NaCl 150 mM,
Tween 80 a 0,1%, pH 5.5
Acetata, NaCl, 0,1% > = tampão acetato de sódio/ácidoTW80 acético, NaCl 150 mM, Tween 80a 0,1%, pH 5,5
Fos, NaCl, 0,1% > TW80 = tampão fosfato de sódio
dibásico/ fosfato de sódiomonobásico 10 mM, NaCl 150 mM,Tween 8 0 a 0,1%, pH 5,5
Citrato, Arg, 0,1% > = tampão citrato de sódio/ácidoTW80 cítrico 10 mM, L-arg NaCl 150
mM, Tween 8 0 a 0,1%, pH 5,5
Resultados
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC).
A Figura 7 mostra termogramas DSC para CHIR-12.12 nasduas formulações conforme descrito na seção "Materiais"acima. 0 desdobramento térmico de CHIR-12.12 exibiu pelomenos duas transições térmicas, provavelmente representandodesdobramento/fusão dos domínios Fab e Fc, respectivamente.A uma temperatura mais alta, as proteínas presumivelmenteagregaram, resultando em perda de sinal de DSC. Nesteestudo, a temperatura de transição térmica mais baixa foidefinida como a temperatura de fusão, Tm. A formulaçãocontendo L-arginina-HCl exibiu uma Tm superior à formulaçãocontendo NaCl, sugerindo que a L-arginina-HCl fornece CHIR-12.12 com uma estabilidade de conformação superior à doNaCl.
Análise SEC-HPLC.
Após incubação a 50C por 6 meses, o SEC-HPLC detectouquantidades desprezíveis de agregados de proteína efragmentos (< 0,5%) nas formulações contendo L-arginina-HCle NaCl e nenhuma diferença de estabilidade entre as duasformulações (dados não mostrados). Sob condições dearmazenamento aceleradas, isto é, 25 0C por 6 meses, aformulação contendo L-arginina-HCl continha um percentualmais alto de monômero, conforme mostrado na Figura 8. àscustas do monômero, o conteúdo de agregados e fragmentoslentamente aumenta com o tempo de armazenamento.Entretanto, a formulação contento L-arginina-HCl geroumenos agregados e fragmentos do que a formulação contendoNaCl conforme mostrado na Figura 9 e 10, respectivamente.De forma similar, quando armazenada a 40°C, a formulaçãocontento L-arginina-HCl exibiu um percentual mais alto demonômero e percentuais menores de agregados e fragmentosque a formulação contendo NaCl, conforme mostrado nasFiguras 11, 12 e 13, respectivamente. Sob armazenamento a40°C por 4 meses, a formulação contendo L-arginina-HClpossuía 91,8% de monômero restante, 1,7% de agregados e6,5% de fragmentos, enquanto a formulação contendo NaClpossuía 87,9% de monômero, 2,2% de agregados e 9,9% defragmentos. Os resultados de SEC-HPLC demonstram que L-arginina-HCl melhora a estabilidade da proteína CHIR-12.12em comparação ao NaCl.
SDS-PAGE (Não reduzida e Reduzida) .
A Tabela 3 apresenta resultados de SDS-PAGE para asformulações contendo L-arginina-HCl e NaCl analisadas sobcondições não reduzidas (MR) e reduzidas (R) . A pureza deCHIR-12.12 foi medida como um percentual da banda principalsob condições não reduzidas ou como um percentual da somadas bandas das cadeias pesada e leve sob condiçõesreduzidas. Exceto no tempo 0, a formulação contendo L-arginina-HCl mostrou pureza mais alta que a formulaçãocontendo NaCl tanto sobre condições não reduzidas quantoreduzidas. A observação do SEC-HPLC foi consistente com osresultados do SEC-HPLC onde a L-arginina-HCl aumentou aestabilidade da proteína CHIR-12.12 em comparação ao NaCl.
Tabela 3. Comparação de análise de L-arginina-HCl e
NaCl por SDS-PAGE.
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Análise CIEX-HPLC.O CIEX-HPLC separa as moléculas com base na carga deforma que as variantes ácidas eluem antes da espécie depico principal e as variantes básicas eluem após a espéciede pico principal. A pureza de CHIR-12.12 e seu conteúdo deprodutos de desaminação foram medidos como percentuais dopico principal e percentual de variantes ácidas,respectivamente.
As Figuras 14, 15 e 16 mostram a pureza, o conteúdo deproduto de desaminação e o conteúdo de variantes básicas,respectivamente, nas duas formulações. No tempo 0, as duasformulações possuíam 68,6% de pureza e 15,5% de produto dedesaminação assim como 15,9% de variantes básicas. Quandoarmazenadas a 25°C, a formulação contendo L-arginina-HClpermaneceu em pureza mais alta e a conteúdo de variantesbásicas mais alto e exibiu um percentual mais baixo deprodutos de desaminação que a formulação contendo NaCl. Sobarmazenamento a 25°C por 6 meses, a formulação contendo L-arginina-HCl possuía 47,3 % de pureza, 12,5 % de variantesbásicas e 40,0 % de produto de desaminação gerado, enquantoa formulação contendo NaCl possuía 45,6 % de pureza, 11,7%de variantes básicas e 42,7 % de produto de desaminação.Embora as formulações contendo L-arginina-HCl e NaCl tenhammostrado pouca mudança ao longo de 6 meses de armazenamentoa 5 °C, os resultados de CIEX-HPLC sob condições dearmazenamento aceleradas (25°C) previram que a L-arginina-HCl será provavelmente superior ao NaCl em melhorar aestabilidade de CHIR-12.12 contra desaminação em tempo reala longo prazo.
Em resumo, este estudo mostra que L-arginina-HCl 150mM não apenas fornece isotonicidade à formulação líquida deCHIR-12.12, mas também aumenta a estabilidade deconformação de CHIR-12.12 contra agregação, fragmento deligação ao antígeno deste e desaminação. A L-arginina-HCl ésuperior ao NaCl sob condições de estabilidade aceleradas,e os dados de estabilidade acelerada ainda predizem umavida útil sob armazenamento mais longa para a formulação deCHIR-12.12 com L-arginina-HCl.
Exemplo 3:_Efeitos de Tween 80 e Tween 20 em Minimizara Agregação de Substância de Droga de Volume de CHIR-12.12a Partir de Armazenamento Congelado
Armazenamento congelado de substância de droga devolume de CHIR-12.12 é preferida sobre armazenamentolíquido por diversas razões, incluindo estabilidade e vidaútil de armazenamento aumentada do produto, crescimentomicrobial reduzido, assim como eliminação de espumaçãodurante o transporte. Entretanto, congelar esubseqüentemente descongelar com induzir a stress nasolução de proteína introduzindo interfaces gelo-líquido egradientes de concentração de solutos. Os estresses podemdesnaturar as proteínas e levar a agregação e, em casospiores, a formação de particulados ou precipitadosvisíveis. À medida que os agregados de proteína têm sidofreqüentemente associados a potência de droga reduzida eimunogenicidade aumentada, minimizar a agregação e otimizaros componentes da formulação de proteína e condições decongelamento-descongelamento é muito crítico.
Excipientes de formulação, como açúcares, ãlcooispolihídricos, aminoácidos e tensoativos podem possivelmenteestabilizar as proteínas e anticorpos da agregação. Em umestudo de anticorpo monoclonal, descobriu-se que algunsaçúcares comumente utilizados, álcoois polihídricos eaminoácidos são mais efetivos que tensoativos na redução deagregação disparada por congelamento-descongelamento.Entretanto, estudos com CHIR-12.12 mostram que o uso deaçúcar (por exemplo, trihalose), um álcool polihídrico (porexemplo, sorbitol) ou um aminoácido (por exemplo glicina)sozinho não reduzem de forma significativa a agregação deCHIR-12.12 durante congelamento e descongelamento.
Este estudo focalizou em abordagens de formulação paraminimizar a agregação de CHIR-12.12 durante o congelamentoe descongelamento. Desta maneira, vários tensoativos foramavaliados a fim de minimizara agregação induzida porcongelamento e descongelamento de CHIR-12.12. Embora sejaimprovável que a substância de droga de CHIR-12.12congelada experimentasse múltiplos ciclos de congelamento edescongelamento conforme avaliado neste estudo, estudos destress de congelamento e descongelamento extensivos sãoavaliações do pior dos casos, utilizados para prever se opotencial para a droga de volume formulada agregar semultiplicaria se múltiplos congelamentos e descongelamentosocorressem inadvertidamente durante armazenamento de longoprazo e transporte.
Materiais:
Lotes de volume de CHIR-12.12 # UA7870, # TC23-2, # UB1291, # PD010705A, e #CD083005A foram utilizados para esteestudo. Tween 80, Tween 20, Brij 35 e Pluronic F68 foramadquiridos de Sigma, J.T. Baker, Alfa Aesar, e MediaTechCellgro, respectivamente. A garrafa de policarbonato (PC)para armazenamento congelado da substância de droga deCHIR-12.12 foi adquirida de Nalgene.Métodos:
Exceto pelas amostras de controle, todas as outrasamostras foram submetidas a congelamento completo a -20°Cou -60°C seguido por completo descongelamento à temperaturaambiente por múltiplos ciclos.
Três métodos analíticos foram empregados para detectara proteína CHIR-12.12 variando de monômero a agregadosvisíveis. Observação visual foi executada sob luz Tyndal(M.W. Technologies, Inc.) para detecção de particuladosvisíveis. Um Sistema de Contagem de Partícula Líquida(HIAC/Royco) foi utilizado para contar agregados sub-visíveis £ 10 μπι e a 25 μπι. Um Analisador de Dispersão deLuz Dinâmico (Malvern Nano Series) foi empregado paradeterminar diâmetros hidrodinâmicos de monômeros eagregados e a distribuição de tamanho de partícula.
Avaliação de Partículas Visíveis
As amostras para o estudo de congelamento edescongelamento foram preparadas a partir do lote desubstância de droga de CHIR-12.12 #UA7870 e lote # TC23-2.Todas as amostras foram formuladas em solução de tampão decitrato de sódio/acido cítrico 10 mM, NaCl 150 mM e pH 5,5por diálise, seguido pela adição de percentuais variáveis(0 a 0,5% p/v) de um dos seguintes tensoativos não iônicos:Tween 80, Tween 20, Brij 35 e Pluronic F68 . Cada amostra de2,5 mL foi preenchida em frascos de vidro e submetidas acongelamento durante a noite a -600C e completodescongelamento à temperatura ambiente por até oito ciclos.As amostras no tempo inicial (tempo 0) e após cada ciclo decongelamento e descongelamento foram examinadas visualmentequanto a limpidez e precipitados/agregados visíveis.Contagem de Partículas Sub-Visiveis.
Os lotes de substância de droga de CHIR-12.12 # UB1291 e # PD010705A foram formulados na solução (20 mg/mL deCHIR-12.12, citrato de sódio/ácido cítricô 10 mM, NaCl 150mM, a pH 5,5), seguido pela adição de 0% a 0,5% (p/v) deTween 80 ou Tween 20. Alíquotas de amostras de formulaçãode 20 mL foram preenchidas em garrafas de policarbonato de125 cm3 e submetidas a congelamento a -60°C edescongelamento à temperatura ambiente. Após cinco ciclosde congelamento/descongelamento, as amostras foram medidasquando a agregados sub-visíveis a 10 μπι e a 25 μπ\utilizando um Sistema de Contagem de Partícula LíquidaHiac-Royco.
Análise de Dispersão de Luz Dinâmica.
Antes e depois de 5 ciclos decongelamento/descongelamento, as formulações (20 mg/mL deCHIR-12.12, citrato de sódio/ácido cítrico 10 mM, L-arginina-HCl 150 mM, L-metionina 5 mM, Tween 20 a 0% a 0,2%e pH 5,5) foram avaliadas quanto a agregados utilizando-seum Analisador de Dispersão de Luz Dinâmica.
A espectroscopia de Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)calcula o diâmetro hidrodinâmico de partículas incluindomonômero e agregados do coeficiente de difusão medido daspartículas utilizando a equação de Stokes-Einstein eassumindo que as partículas são esféricas. Os números deespécies agregadas e polidispersidade são também obtidos apartir de estudos de DLS.
Resultados
Avaliação de Partículas Visíveis
A Tabela 4 resume os resultados da observação visual.No tempo 0, que foi antes do início dos ciclos decongelamento e descongelamento, todas as amostras estavamligeiramente opalescentes sem agregados/precipitadosvisíveis. Após um ciclo de congelamento e descongelamento,alguns agregados/precipitados visíveis se formaram em todasas formulações sem qualquer tensoativo adicionado e nasformulações contendo de 0% a 0,5% (p/v) de Tween 80 e nasformulações contendo de 0 a 0,1% (p/v) de Brij 35 assimcomo nas amostras contendo de 0% a 0,5% (p/v) de PluronicF68. As amostras contendo de 0,05% a 0,5% (p/v) de Tween 20não mostraram qualquer agregado ou precipitado por todos osoito ciclos de congelamento e descongelamento. Isto sugereque Tween 20 é mais efetivo que Tween 8 0 em evitar aformação de agregados insolúveis grandes a partir demúltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Brij 35e Pluronic F68 foram muito menos efetivos que Tween 80 eTween 20.
Tabela 4. Aspecto visual de CHIR-12.12 nas formulaçõestamponadas com citrato com concentrações variáveis de tensoativo.
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Legendas: XFT= N0 de ciclos de
congelamento/descongelamento; SO = ligeiramente
opalescente; ppt = precipitado/agregado
Contagem de Partículas Sub-Visíveis.
A Tabela 5 mostra as contagens de agregados sub-
visíveis por mL de formulações tamponadas com citrato/acidocítrico contendo concentrações variáveis de Tween 80. Umatendência decrescente nas contagens de partículas sub-vislveis foi observada à medida que a concentração de Tween80 aumentava; a redução nas contagens de partículas sub-visíveis era modesta quando Tween 80 estava acima de 0,1%(p/v), sugerindo que a concentração apropriada para uso deTween 80 fosse de 0,1% a 0,2% (p/v).
Tabela 5. Contagens de partícula sub-visível nasformulações contendo 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato desódio/acido cítrico 10 mM, NaCl 150 mM e concentraçõesvariáveis (0% a 0,2% p/v) de Tween 80 a pH 5,5.
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A Tabela 6 mostra as contagens de agregados sub-visíveis por mL de formulações tamponadas com citrato/acidocítrico com ou sem Tween 20. As contagens de agregadosforam enormemente reduzidas com a adição de Tween 20 naformulação. Quando o Tween era de 0,05% (p/v) e superior, aredução nas contagens de agregados sub-visíveis quaseatingiu um platô, sugerindo que a concentração apropriadade Tween 20 fosse em torno de 0,05% a 0,2% (p/v).
Tabela 6. Contagens de partícula sub-visível nasformulações contendo 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato desódio/acido cítrico 10 mM, NaCl 150 mM e concentraçõesvariáveis (0% a 0,2% p/v) de Tween 20 a pH 5,5.
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Adicionalmente, As Tabelas 5 e 6 mostram queformulações contendo Tween 80 e Tween 20 geraram muitopoucos agregados > 25 μm, e a formulação contendo Tween 20gerou menos agregados > 10 μm que a formulação contendoTween 8 0 após 5 ciclos de congelamento e descongelamento.Os resultados indicam que Tween 20 é mais efetivo que Tween80 em minimizar a formação de agregados sub-visíveis naformulação tamponada com citrato/ácido cítrico de CHIR-12.12.
Com base nos resultados das Tabelas 4, 5 e 6, Tween 20representa um excipiente preferido sobre Tween 80 paraminimizar a formação de agregados em formulações de CHIR-12.12. Desta forma, estudos adicionais foram conduzidospara otimizar adicionalmente as concentrações de Tween 20necessárias para prevenir a formação de agregados emformulações de CHIR-12.12. As formulações (20 mg/mL deCHIR-12.12, citrato de sódio/ácido cítrico 10 mM, L-arginina-HCl 150 mM, L-metionina 5 mM, Tween 20 de 0% a0,2% e pH 5,5) foram preparadas a partir de substância dedroga de CHIR-12.12 de lote # CD083005A. 20 mL de amostrasda formulação foram preenchidas em garrafas depolicarbonato de 125 cm3 e submetidas a congelamento a -20̊C e descongelamento à temperatura ambiente. Antes edepois de cinco ciclos de congelamento e descongelamento,as amostras da formulação foram medidas quanto a contagensde partículas sub-visíveis utilizando um contador departícula líquida HIAC-Royco. Os resultados estão resumidosna Tabela 7.
Tabela 7. Contagens de partícula sub-visível nasformulações contendo 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato desódio/acido cítrico 10 mM, L-arginina-HCl 150 mM, L-metionina 5 mM, Tween 20 de 0% a 0,2%, a pH 5,5.<table>table see original document page 135</column></row><table>
*Legenda: XFT = N° de ciclos de congelamento edescongelamento.
Após cinco ciclos de congelamento e descongelamento,as amostras contendo L-arginina-HCl e L-metionina gerarammuito menos agregados que as formulações sem L-arginina-HCle L-metionina, isto é, 169 partículas / mL a 10 μηι contra1.439 ou 1.671 partículas / mL a 10 μπ\ na ausência de Tween20 (ver Tabelas 6 e 7) . Entretanto, até que Tween 20 fosseintroduzido, L-arginina-HCl e L-metionina não reduziramsignificativamente os agregados induzidos por congelamentoe descongelamento a um nível mínimo. Isto sugere que a L-arginina-HCl e L-metionina não são suficientementeeficientes em minimizar agregação de CHIR-12.12 induzidapor congelamento e descongelamento.
A partir dos dados resumidos nas Tabelas 5 a 7, ascontagens de agregados sub-visíveis de amostra congelamentoe descongelamento contendo de 0,025% a 0,1% (p/v) de Tween20 permaneceram comparáveis às suas amostras respectivasantes dos ciclos de congelamento e descongelamento. Istoindica que as formulações contendo Tween 20 em combinaçãocom L-arginina-HCl e L-metionina geraram um mínimo deagregados sub-visíveis. Assim, Tween 20 é o excipiente naformulação que efetivamente minimiza a geração de agregadossub-visíveis de CHIR-12.12 durante congelamento edescongelamento. A concentração efetiva de Tween 20 foideterminada como sendo de 0,025% a 0,1% (p/v).
Análise de Dispersão de Luz Dinâmica.
A Tabela 8 mostra o diâmetro hidrodinâmico médio daspartículas, polidispersidade e percentual de intensidade daespécie de monômero de CHIR-12.12. A análise de Dispersãode Luz Dinâmica detectou apenas espécie de monômero emtodas as amostras antes e depois de cinco ciclos decongelamento e descongelamento, conforme mostrado por 100%de intensidade da espécie de monômero. Isto sugere quetodas as amostras foram compostas principalmente demonômeros. Após 5 ciclos de estudos de congelamento edescongelamento, alguns agregados (possivelmente dímeros etrímeros) podem coexistir com o monômero nas amostras semTween 20 e com 0,005% (p/v) de Tween 20, conforme mostradopelos aumentos no diâmetro hidrodinâmico epolidispersidade. As amostras que continham de 0,025% a0,1% (p/v) de Tween 20 mostraram pouca mudança em valoresde diâmetro hidrodinâmico e polidispersidade, indicando quese mantiveram nos níveis anteriores de monômeros semformação de agregados notável.
Tabela 8. Análise de Dispersão de Luz Dinâmica deCHIR-12.12 antes e depois de 5 ciclos de congelamento edescongelamento da formulação contendo 20 mg/mL de CHIR-12.12, citrato de sódio/acido cítrico 10 mM, L-arginina-HCl150 mM, L-metionina 5 mM, e concentrações variáveis deTween 20 (0% a 0,2%), apH 5,5
<table>table see original document page 137</column></row><table>
♦Legenda: FT = congelamento e descongelamento; XFT =
N0 de ciclos de congelamento e descongelamento.
Com base na observação visual, contagens de partículasub-visíveis e a analise de Dispersão de Luz Dinâmica, aconcentração ideal de Tween 20 foi determinada como sendode 0,025% a 0,1% (p/v) para minimizar a agregação de CHIR-12.12 induzida por congelamento e descongelamento.
Em resumo, descobriu-se que tanto Tween 20 quantoTween 8 0 minimizam a agregação de CHIR-12.12 durantecongelamento e descongelamento. As concentrações ideais deTween 20 e Tween 80 são de 0,025% a 0,1% (p/v) e 0,1% a0,2% (p/v), respectivamente. Tween 20 é mais efetivo queTween 80, em que uma concentração mais baixa de Tween 20reduz o número e extensão da formação de agregados a umnível mais baixo. Este estudo demonstrou que a adição deuma concentração ideal de Tween, pref erivelmente emcombinação com L-arginina-HCl e L-metionina, possibilita oarmazenamento de substância de droga de volume de CHIR-12.12 tamponada por citrato/ácido cítrico a -20°C ou abaixosem agregação significativa.
Exemplo 4: Ensaios para Atividade Antagonista eAnticorpos Anti-CD40
Os seguintes ensaios podem ser utilizados para avaliara atividade antagonista de um anticorpo anti-CD40. Células B humanas para este ensaio podem ser obtidas, por exemplo,por isolamento a partir de amídalas obtidas de indivíduossubmetidos a amigdalectomia, essencialmente conformedescrito em De Groot e outros, (1990) Lymphokine Research(1990) 9:321. De forma resumida, o tecido é disperso combisturis, células fagocíticas e NK são removidas portratamento com éster metiIico de L-Ieucina e células T sãoremovidas por um ciclo de "rosetting" com eritrócitos deovelha (SRBC) tratados com brometo de 2-aminoetilisotiourônio. A pureza das preparações de linfócito B resultantes pode ser verificada por marcação deimunofluorescência indireta com anti(CD20) mAb Bl (CoulterClone, Hialeah, FA) ou (CD3) mAb OKT3 (Ortho, Raritan, NJ)e um fragmento de F(ab')2 conjugado com FITC de coelhoanti-(Ig de camundongo) (Zymed, San Francisco, CA) eanálise FACS.Ensaio de Proliferação de Célula B
Células B (4 χ IO4 por cavidade) são colocadas emcultura em 200 μL de suplemento IMDM com 10% de soro fetalde bezerro em placas de microtitulação de 96 cavidades defundo plano. As células B são estimuladas pela adição deanticorpos anti-(IgM) imobilizadas (Immunobeads; 5μg/mL;BioRad, Richmond, Califórnia). Quando desejado, 100 U/mL deIL-2 recombinante é adicionado. Concentrações variáveis deanticorpos monoclonais de teste (mAbs) são adicionados nocomeço das microculturas e a proliferação é avaliada no dia3 medindo-se a incorporação de [3HJtimidina após 18 horasde pulsação.
Um anticorpo anti-CD40 antagonista não co-estimula deforma significativa a proliferação de célula B humana napresença de anti-IgM imobilizado ou na presença de anti-IgMimobilizado e IL-2.
Ensaio de Proliferação de Célula B Tipo Banchereau
Para testar a capacidade de anticorpos monoclonaisanti-CD40 estimularem a proliferação de células B em umsistema de cultura análogo àquele descrito por Banchereau eoutros, (1991) Science (1991) 251:70, célulastransfectantes 3T6 de camundongo expressando a formaalélica HR de FcyRII são utilizadas. Células B (2 χ IO4 porcavidade) são colocadas em cultura em microcavidades defundo plano na presença de 1 χ IO4 células transfectantes(irradiadas com 5.000 Rad) em 200 μL de IMDM suplementadocom 10% de soro de fetal de bezerro e 100 U/mL de IL-4recombinante. Antes da adição de células B, as células 3T6são deixadas para aderirem ao plástico de cultura por pelomenos 5 horas. mAbs anti-CD40 são adicionados emconcentrações variando de 10 ng/mL a 2.000 ng/mL e aproliferação de células B é avaliada medindo-se aincorporação de timidina no dia 7, sob 18 horas de pulsaçãocom [3HJtimidina.
Inibição de Proliferação de Célula B estimulada porS2C6 Usando mAbs Anti-CD40 Antagonista.
Anticorpos monoclonais anti-CD40 antagonistas (mAbs)podem ser também caracterizados por sua capacidade deinibir o estimulo de proliferação de célula B por umanticorpo anti-CD4 0 como S2C6 (também conhecido como SGN-14, que é conhecidamente um agonista CD40 de estimulo deproliferação de células B normais; Francisco e outros,(2000) Câncer Res. 60:3225-3231) utilizando o Ensaio deProliferação de Célula B descrito acima. Células Btonsilares humanas (4 χ IO4 por cavidade) são colocadas emcultura em microcavidades de 200 μΐι na presença de anti-IgMacoplados a grânulos de Sefarose (5 μg/mL) e mAb anti-CD40S2C6 (1,25 μg/mL). Concentrações variáveis de um mAb anti-CD4 0 de interesse são adicionadas e a incorporação de[3H] timidina é avaliada após 3 dias. Como um controle,pode-se adicionar mAb anti-(glucocerebrosidase) 8E4 emconcentrações similares. Barneveld e outros, (1983) Eur. J.Biochem. 134:585. Um anticorpo anti-CD40 antagonista podeinibir a co-estimulação de proliferação de célula B humanainduzida por anti-IgM por S2C6, por exemplo, em pelo menos75% ou mais (isto é, a proliferação estimulada por S2C6 napresença de um anticorpo anti-CD4 0 antagonista não ésuperior a 25% daquela observada na ausência do anticorpoanti-CD40 antagonista). Em contrapartida, nenhuma inibiçãosignificativa seria vista com quantidades equivalentes demAb 8Ε4 não relevante, direcionado a β-glucocerebrosidase.Barneveld e outros, supra. Tal resultado indicaria que osmAbs anti-CD40 não fornecem sinais estimulantes para aproliferação de células B humanas mas, de forma oposta,podem inibir os sinais estimulantes exercidos acionando-seCD4 0 com outro mAb.
Ensaio de Ativação de Célula B com Células EL4B5.
Zubler e outros, (1985) J. Iwmunol. (1985) 134:3662,observou que um sub-clone mutante do linha de EL-4 detimoma de camundongo, conhecida como EL4B5, poderiaestimular fortemente células B de origem murina e humanapara se proliferarem e diferenciarem em células de plasmasecretando imunoglobulina in vitro. Descobriu-se que estaativação é independente de antígeno e não restrita por MHC.Para estímulo ideal de células humanas, a presença desobrenadante de células T humanas ativadas foi necessáriamas uma resposta de célula B também ocorreu quando célulasEL4B5 foram pré-ativadas com forbol-12-miristato-13-acetato(PMA) ou IL-I. Zubler e outros, (1987) ImmunologicalReviews 99:281; e Zhang e outros, (1990) J. Immunol.144:2955. A ativação de células B neste sistema de culturaé eficiente - experimentos de limitação de diluiçãomostraram que a maioria das células B humanas pode serativada para se proliferarem e se diferenciarem em célulassecretando anticorpo. Wen e outros, (1987) Eur. J. Immunol.17:887 .
As células B (1.0 00 por cavidade) são colocadas emcultura juntas com células EL4B5 (5 χ IO4 por cavidade)irradiadas (5.000 Rad) em placas de microtitulação de fundoplano em 200 μ]^ de IMDM suplementados com 10% de soro fetalde bezerro desativado por calor, 5 ng/mL de forbol-12-miristato-13-acetato (Sigma) e 5% de sobrenadante de célulaT humana. São adicionados mAbs em concentrações variáveisno início das culturas e a incorporação de timidina éavaliada no dia 6 após 18 horas de pulsação com[3H]timidina. Para a preparação de sobrenadante de célulaT, células T purificadas são colocadas em cultura a umadensidade de 106/mL por 3 6 horas na presença de 1 μg/mL dePHA e 10 ng/mL de PMA. Wen e outros, (1987) Eur. J.Immunol. (1987) 17:887. O sobrenadante de célula T é obtidocentrifugando-se as células e armazenando-as a -20°C. Aeficácia de sobrenadantes de células T em melhorar aproliferação de células B humanas em culturas de célulaEL4B5 é testada e os sobrenadantes mais efetivos são unidospara uso em experimentos. Ao se avaliar o efeito de umanticorpo anti-CD4 0 em proliferação de célula B humanainduzida por EL4B5, um anticorpo monoclonal como MOPC-141(IgG2b) pode ser adicionado como um controle.
Um anticorpo anti-CD40 antagonista pode inibir aproliferação de célula B estimulada por linha celularEL4B5, por exemplo, em pelo menos 75% ou mais (isto é, aproliferação celular induzida por EL4B5 na presença de umanticorpo anti-CD40 antagonista não é superior a 25%daquela observada na ausência do anticorpo anti-CD40antagonista). Em contrapartida, um anticorpo de controlecomo MOPC-141 não possuiria qualquer efeito significativona proliferação de célula B induzida por EL4B5.
Ensaio de Ajudante de Célula T Humana para Produção deAnticorpo por Células B.Um anticorpo anti-CD40 antagonista pode funcionarcomo um antagonista de produção de imunoglobulina porcélulas B. Um anticorpo anti-CD40 pode ser testado paraeste tipo de atividade antagonista avaliando-se acapacidade do anticorpo de inibir a produção deimunoglobulina por células B que foram estimuladas demaneira dependente de contato com células T ativadas em umensaio de ajudante de célula T. Desta forma, placas decultura de tecido de 96 cavidades são revestidas com umadiluição de 1:500 de fluido de ascites de mAb anti-CD3 CLB-T3/3 (CLB, Amsterdã, Holanda) . Conforme indicado, mAbs co-estimulantes são adicionados: mAbs anti-CD2 CLB_T11.1/1 eCLB-Tll.2/1 (CLB, Amsterdã, Holanda), ambas as ascites1:1000 e mAb anti-CD28 CLB-28/1 (CLB, Amsterdã, Holanda).Subseqüentemente, células T tonsilares (irradiadas, 3.000 Rad; IO5 por cavidade) , células B tonsilares (IO4 porcavidade), e rIL-2 (20 U/mL) são adicionadas. 0 volumefinal da cada cultura de célula é de 200 μL. Após 8 dias,as células estão voltadas para baixo e um sobrenadantelivre de células é colhido. As concentrações de IgM e IgGhumanos em amostras (diluídas) é estimado por ELISAconforme descrito abaixo.
Em uma modalidade, células tonsilares humanas(IO4/cavidade) são colocadas em cultura juntas com célulasT purificadas irradiadas (3.000 Rad, 105/cavidade) emplacas de 96 cavidades, revestidas com mAb anti-CD3 e comou sem mAbs diferentes para co-estimular as células T. Após8 dias de cultura os sobrenadantes são colhidos para adeterminação de produção de imunoglobulina pelas células B.A produção de imunoglobulina pelas células B é avaliadapelo ensaio ELISA descrito abaixo. 0 anticorpo anti-CD40 deinteresse é adicionado em concentrações variáveis a partirdo início das culturas. Como um controle, mAb MOPC-141 podeser adicionado.
Um anticorpo anti-CD40 antagonista pode inibirprodução de anticorpo IgG e IgM de células B, estimuladapor células T humanas em pelo menos 50% ou mais (isto é, aprodução de anticorpo induzida por célula T por células Bna presença de um anticorpo anti-CD40 antagonista não é demais de 50% daquela observada na ausência do anticorpoanti-CD40 antagonista). Em contrapartida, um anticorpo decontrole como MOPC-141 não possuiria qualquer efeitosignificativo na produção de anticorpo por células Binduzida por células T.
Ensaio ELISA para Quantificação de Imunoglobulina.
As concentrações de IgM e IgG humanos são estimadaspor ELISA. Placas de ELISA de 96 cavidades são revestidascom 4 μg/mL de IgG anti-humano de camundongo mAb MH 16-01(CLB, Amsterdã, Holanda) ou comi,2 μg/mL de IgM anti-humanode camundongo mAb 4102 (Tago, Burlingame, CA) em tampãocarbonato 0,05 M (pH = 9,6), incubando-se por 16 h a 4°C.As placas são lavadas 3 vezes com PBS-Tween 20 0,05% (PBS-Tween) e saturadas com BSA por 1 hora. Após 2 lavagens asplacas são incubadas por 1 h a 37°C com diluiçõesdiferentes das amostras de teste. Após 3 lavagens,imunoglobulina ligado é detectado incubando-se por lha37°C com 1 μg/mL de IgG anti-humano mAb MH 16-01 (CLB) decamundongo marcado por peroxidase ou IgM anti-humano mAb MH15-01 (CLB) de camundongo. As placas são lavadas 4 vezes ea atividade de peroxidase ligada é revelada pela adição deO-fenilenodiamina como um substrato. Soro padrão humano(HOO, CLB) é utilizado para estabelecer uma curva padrãopara cada ensaio.
Os artigos "um/uns" e "uma/umas" são aqui utilizadospara se referirem a um ou mais de um (isto é, a pelo menosum) dos objetos gramaticais do artigo. Por meio de exemplo,"um elemento" significa um ou mais deste elemento.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosna especificação são indicativos do nível daqueleshabilitados na técnica a qual esta invenção pertence. Todasas publicações e pedidos de patente estão aqui incorporadospara referência na mesma medida como se cada publicação oupedido de patente individual fosse especificamente eindividualmente indicada para ser incorporada parareferência.
Embora a invenção acima tenha sido descrita em algunsdetalhes por meio de ilustração e exemplos para propósitosde clareza de compreensão, será óbvio que certas mudanças emodificações podem ser praticadas dentro do escopo dasreivindicações em anexo.Listagem de Seqüência
<110> Lu, XiaofengChen, Bao-LuAraya, Kidisti
Okhamafe, Augustus
<120> Composições Farmacêuticas De Anticorpo Anti-Cd40Antagonista
<130> PP028228.0002 (325023)
<150> 60/794,011
<151> 21/04/2006
<160> 12
<170> FastSEQ para versão de Windows 4.0
<210> 1
<211> 720<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência de Codificação para cadeia leve de anticorpoanti- CD40 humano 12.12
<221> CDS<222> (1)...(720)<400> 1
atg gcg ctc cct gct cag ctc48
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu1 5
gga tcc agt ggg gat att gtg96
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val
20
gtc acc cct gga gag ccg gcc144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala35
ctc ctg tat agt aat gga tac192
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr50 55
cca ggg cag tct cca cag gtc240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val65 70
tcc ggg gtc cct gac agg ttc288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct
Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser10 15
atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc
Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr 30
tcc ate tcc tgc agg tcc agt cag age
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser40 45
aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag
Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
60
ctg ate tct ttg ggt tct aat cgg gcc
Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala75 80
agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95
aca ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110
tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa384
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys115 120 125
gtg gat ate aga cga act gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg432
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140
cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga act gcc tet gtt gtg tgc ctg480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190
age aag gac age aee tac age etc age age acc ctg acg ctg age aaa624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
gea gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220
ggc ctg age tcg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *
225 230 235
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Cadeia Leve de anticorpo anti-CD40 humano 12.12
<400> 2
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys115 120 125
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210> 3<211> 2016<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<22 0 >
<223> Seqüência de Codificação para cadeia pesada de anticorpoanti-CD40 humano 12.12 (com íntrons)
<400> 3
atg gag ttt ggg ctg age tgg gtt ttc ctt gtt gct att tta aga ggt48
gtc cag tgt cag gtg cag ttg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag96
cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gea gcc tet gga ttc acc ttc144
agt age tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg192
gag tgg gtg gea gtt ata tca tat gag gaa agt aat aga tac cat gea240
gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag ate288
acg ctg tat ctg caa atg aac age ctc aga act gag gac acg gct gtg336
tat tac tgt gcg aga gat ggg ggt ata gea gea cct ggg cct gac tac384
tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gea agt acc aag ggc432
cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc gct age aag age acc tet ggg ggc480aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg528
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc age ggc gtg cac acc ttc576
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc age age gtg gtg624
acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg672
aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aga gtt ggt gag agg720
cca gea cag gga ggg agg gtg tet gct gga age cag gct cag cgc tcc768
tgc ctg gac gea tcc cgg cta tgc agt ccc agt cca ggg cag caa ggc816
agg ccc cgt ctg cct ctt cac ccg gag gcc tet gcc cgc ccc act cat864
gct cag gga gag ggt ctt ctg gct ttt tcc cca ggc tet ggg cag gea912
cag gct agg tgc ccc taa ccc agg ccc tgc aca caa agg ggc agg tgc960
tgg gct cag acc tgc caa gag cca tat ccg gga gga ccc tgc ccc tga1008
cct aag ccc acc cca aag gcc aaa ctc tcc act ccc tca gct cgg aca1056
cct tet ctc ctc cca gat tcc agt aac tcc caa tet tet ctc tgc aga1104
gcc caa ate ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg ccc agg taa1152
gcc age cca ggc ctc gcc ctc cag ctc aag gcg gga cag gtg ccc tag1200agt age ctg cat cca ggg aca1248
cct cca tet ctt cct cag cac1296
tcc tet tcc ccc caa aac cca1344
ctg agg tca cat gcg tgg tgg1392
tca agt tca act ggt acg tgg1440
caa age cgc ggg agg age agt1488
tcc tca ccg tcc tgc acc agg1536
gea agg tet cca aca aag ccc1584
cca aag cca aag gtg gga ccc1632
ggc cgg ctc ggc cca ccc tet 1680
tet gtc cct aca ggg cag ccc1728
cca tcc cgg gag gag atg acc1776
gtc aaa ggc ttc tat ccc age1824
ggg cag ccg gag aac aac tac1872
gac ggc tcc ttc ttc ctc tat1920
8/28
ggc ccc age cgg gtg ctg aca cgt cca
ctg aac tcc tgg ggg gac cgt cag tet
agg aca ccc tca tga tet ccc gga ccc
tgg acg tga gcc acg aag acc ctg agg
acg gcg tgg agg tgc ata atg cca aga
aca aca gea cgt acc gtg tgg tca gcg
act ggc tga atg gea agg agt aca agt
tcc cag ccc cca tcg aga aaa cca tet
gtg ggg tgc gag ggc cac atg gac aga
gcc ctg aga gtg acc gct gta cca acc
cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc
aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg
gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat
aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc
age aag ctc acc gtg gac aag age aggtgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg1968
cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga2016
<210> 4<211> 469<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano 12.12
<400> 4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30
20 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala25 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys465
<210> 5
<211> 469
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<22 0 >
<223> Cadeia pesada de variante de anticorpo anti-CD40 humano12.12
<400> 5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly15 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val5 290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
10 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Glá Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln15 370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
2 0 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser25 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys465
30
<210> 6<211> 239<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220><223> Cadeia Leve de anticorpo anti-CD40 humano 5.9
<400> 6
Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro20 25 30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45
Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly .Thr Asp Phe 85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110
Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205
5 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235
<210> 7<211> 474<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<22 0 >
<223> Cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano 5.9
<400> 7
20 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu1 5
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu20
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile25 35
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp
50 55
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr65 70
3 0 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val
Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
10 15
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
25 30
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe40 45
Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
60
Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
75 80
Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuHis Gln Asp
Lys Ala Leu 355
Gln Pro Arg
370Met Thr Lys385
Pro Ser Asp
Asn Tyr Lys
Leu Tyr Ser 435
Val Phe Ser
450Gln Lys Ser465
325
Trp Leu Asn Gly340
Pro Ala Pro Ile
Glu Pro Gln Val375
Asn Gln Val Ser390
Ile Ala Val Glu405
Thr Thr Pro Pro420
Lys Leu Thr Val
Cys Ser Val Met455
Leu Ser Leu Ser470
330
Lys Glu Tyr Lys Cys345
Glu Lys Thr Ile Ser360
Tyr Thr Leu Pro Pro
380
Leu Thr Cys Leu Val395
Trp Glu Ser Asn Gly410
Val Leu Asp Ser Asp425
Asp Lys Ser Arg Trp440
His Glu Ala Leu His
460
Pro Gly Lys
335
Lys Val Ser Asn350
Lys Ala Lys Gly365
Ser Arg Glu Glu
Lys Gly Phe Tyr400
Gln Pro Glu Asn415
Gly Ser Phe Phe430
Gln Gln Gly Asn445
Asn His Tyr Thr
<210> 8
<211> 474
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Cadeia pesada de variante de anticorpo anti-CD40 humano5 . 9<400> 8
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
15 10 15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys5 20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
10 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met15 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140
20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser25 180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220
3 0 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225
Arg ValPro Ala
Lys Pro
Val Val290
Tyr Val305
Glu GlnHis Gln
Lys Ala
Gln Pro370
Met Thr
385
Pro SerAsn Tyr
Leu Tyr
Val Phe450
Gln Lys
Glu Pro Lys245
Pro Glu Leu260Lys Asp Thr275
Val Asp Val
Asp Gly Val
Tyr Asn Ser325
Asp Trp Leu
340Leu Pro Ala355
Arg Glu Pro
Lys Asn Gln
Asp Ile Ala405
Lys Thr Thr
420Ser Lys Leu435
Ser Cys SerSer Leu Ser
230
Ser Cys Asp
Leu Gly Gly
Leu Met Ile280
Ser His Glu
295Glu Val His310
Thr Tyr Arg
Asn Gly Lys
Pro Ile Glu360
Gln Val Tyr
375Val Ser Leu390
Val Glu Trp
Pro Pro Val
Thr Val Asp440
Val Met His
455Leu Ser Pro
235
Lys Thr His
250Pro Ser Val265
Ser Arg Thr
Asp Pro Glu
Asn Ala Lys315
Val Val Ser
330Glu Tyr Lys345
Lys Thr Ile
Thr Leu Pro
Thr Cys Leu395
Glu Ser Asn
410Leu Asp Ser425
Lys Ser ArgGlu Ala LeuGly Lys
Thr Cys Pro
Phe Leu Phe270
Pro Glu Val
285Val Lys Phe300
Thr Lys Pro
Val Leu Thr
Cys Lys Val350
Ser Lys Ala
365Pro Ser Arg380
Val Lys Gly
Gly Gln Pro
Asp Gly Ser430
Trp Gln Gln
445His Asn His460
240Pro Cys255
Pro Pro
Thr Cys
Asn Trp
Arg Glu320Val Leu335
Ser Asn
Lys Gly
Glu Glu
Phe Tyr400Glu Asn415
Phe PheGly AsnTyr Thr465
470
<210> 9<211> 612<212> DNA<213> Homo sapiens
<220><221> CDS
<222 > (1) . . . (612)
<221> característica_misc<222> (0) . . . (0)
<223> Seqüência de Codificação para isoforma de CD40 humanocurto
<400> 9
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144Ile Asn Ser35
agt gac tgc192
Ser Asp Cys50
age gaa ttc 240
Ser Glu Phe65
aaa tac tgc288
Lys Tyr Cys
tca gaa aca336
Ser Glu Thr
agt gag gcc 384
Ser Glu Ala115
ttt ggg gtc432
Gln Cys Cys Ser
aca gag ttc act
Thr Glu Phe Thr55
cta gac acc tgg
Leu Asp Thr Trp70
gac ccc aac cta
Asp Pro Asn Leu85
gac acc ate tgc
Asp Thr Ile Cys100
tgt gag age tgtCys Glu Ser Cys
aag cag att gct
Leu Cys Gln Pro Gly
gaa acg gaa tgc ctt
Glu Thr Glu Cys Leu
60
aac aga gag aca cac
Asn Arg Glu Thr His75
ggg ctt cgg gtc cag
Gly Leu Arg Val Gln90
acc tgt gaa gaa ggc
Thr Cys Glu Glu Gly105
gtc ctg cac cgc tca
Val Leu His Arg Ser120
aca ggg gtt tet gat
Gln Lys Leu Val
cct tgc ggt gaaPro Cys Gly Glu
tgc cac cag cac
Cys His Gln His80
cag aag ggc acc
Gln Lys Gly Thr95
tgg cac tgt acg
Trp His Cys Thr110
tgc tcg ccc ggc
Cys Ser Pro Gly125
acc ate tgc gagPhe Gly Val Lys Gln130
ccc tgc cca gtc ggc480
Pro Cys Pro Val Gly145
tgt cac cct tgg aca528
Cys His Pro Trp Thr
165
gat ccc cat cat ctt576
Asp Pro His His Leu180
ctt tat caa aaa ggt612
Leu Tyr Gln Lys Gly195
<210> 10<211> 203<212> PRT
<213> Homo sapiens
Ile Ala Thr Gly Val135
ttc ttc tcc aat gtg
Phe Phe Ser Asn Val150
agg tcc cca gga tcg
Arg Ser Pro Gly Ser
170
cgg gat cct gtt tgc
Arg Asp Pro Val Cys185
ggc caa gaa gcc aac
Gly Gln Glu Ala Asn200
Ser Asp Thr Ile Cys Glu140
tca tct gct ttc gaa aaa
Ser Ser Ala Phe Glu Lys155 160
gct gag age cct ggt ggt
Ala Glu Ser Pro Gly Gly
175
cat cct ctt ggt gct ggt
His Pro Leu Gly Ala Gly190
caa taaGln
<400> 10Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly
1 5 10
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu20 25
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly35 40
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His65 70 75
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln
85 90
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly100 105
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser115 120
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser145 150 155
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu
165 170
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro180 185
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln195 200
Cys Leu Leu Thr15
Lys Gln Tyr Leu30
Gln Lys Leu Val45
Pro Cys Gly Glu
Cys His Gln His80
Gln Lys Gly Thr95
Trp His Cys Thr110
Cys Ser Pro Gly125
Thr Ile Cys Glu
Ala Phe Glu Lys160
Ser Pro Gly Gly175
Leu Gly Ala Gly190
<210 > 11<211> 834<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220><221> CDS
<222> (1) . . . (834)
<221> característica_misc<222> (0) . . . (0)
<223> Seqüência de Codificação para isoforma de CD40 humanolongo
<400> 11
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr15 10 15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192Ser Asp Cys50
age gaa ttc240
Ser Glu Phe65
aaa tac tgc288
Lys Tyr Cys
tca gaa aca336
Ser Glu Thr
agt gag gcc384
Ser Glu Ala115
ttt ggg gtc432
Phe Gly Val130
ccc tgc cca480
Thr Glu Phe Thr55
cta gac acc tgg
Leu Asp Thr Trp70
gac ccc aac cta
Asp Pro Asn Leu85
gac acc ate tgc
Asp Thr Ile Cys100
tgt gag age tgtCys Glu Ser Cys
aag cag att gct
Lys Gln Ile Ala135
gtc ggc ttc ttc
Glu Thr Glu Cys Leu
60
aac aga gag aca cac
Asn Arg Glu Thr His75
ggg ctt cgg gtc cag
Gly Leu Arg Val Gln90
acc tgt gaa gaa ggc
Thr Cys Glu Glu Gly105
gtc ctg cac cgc tca
Val Leu His Arg Ser120
aca ggg gtt tet gat
Thr Gly Val Ser Asp
140
tcc aat gtg tca tet
Pro Cys Gly Glu
tgc cac cag cac
Cys His Gln His80
cag aag ggc acc
Gln Lys Gly Thr95
tgg cac tgt acg
Trp His Cys Thr110
tgc tcg ccc ggc
Cys Ser Pro Gly125
acc ate tgc gagThr Ile Cys Glu
gct ttc gaa aaaPro Cys Pro Val Gly145
tgt cac cct tgg aca528
Cys His Pro Trp Thr
165
gca ggc aca aac aag576
Ala Gly Thr Asn Lys180
aga gcc ctg gtg gtg624
Arg Ala Leu Val Val195
ctc ttg gtg ctg gtc672
Leu Leu Val Leu Val210
aag gcc ccc cac ccc720
Lys Ala Pro His Pro225
gat ctt cct ggc tcc768
Phe Phe Ser Asn Val150
age tgt gag acc aaa
Ser Cys Glu Thr Lys
170
act gat gtt gtc tgt
Thr Asp Val Val Cys185
ate ccc ate ate ttc
Ile Pro Ile Ile Phe200
ttt ate aaa aag gtg
Phe Ile Lys Lys Val215
aag cag gaa ccc cag
Lys Gln Glu Pro Gln230
aac act gct gct cca
Ser Ser Ala Phe Glu Lys155 160
gac ctg gtt gtg caa cag
Asp Leu Val Val Gln Gln
175
ggt ccc cag gat cgg ctg
Gly Pro Gln Asp Arg Leu190
ggg ate ctg ttt gcc ate
Gly Ile Leu Phe Ala Ile205
gcc aag aag cca acc aat
Ala Lys Lys Pro Thr Asn220
gag ate aat ttt ccc gac
Glu Ile Asn Phe Pro Asp235 240
gtg cag gag act tta catAsp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc ate tca816
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270
gtg cag gag aga cag tga834
Val Gln Glu Arg Gln *275
<210> 12<211> 277<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400 > 12
Met Val Arg1
Ala Val His
Ile Asn Ser35
Ser Asp Cys50
Ser Glu Phe65
Leu Pro Leu Gln5
Pro Glu Pro Pro20
Gln Cys Cys Ser
Thr Glu Phe Thr55
Leu Asp Thr Trp70
Cys Val Leu Trp Gly10
Thr Ala Cys Arg Glu25
Leu Cys Gln Pro Gly40
Glu Thr Glu Cys Leu
60
Asn Arg Glu Thr His75
Cys Leu Leu Thr15
Lys Gln Tyr Leu30
Gln Lys Leu Val45
Pro Cys Gly Glu
Cys His Gln His80Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275

Claims (62)

1. Composição farmacêutica líquida estávelcaracterizada pelo fato de compreender:a) um anticorpo monoclonal anti-CD40 antagonista comoum componente ativo terapeuticamente ou profláticamente,onde o referido anticorpo monoclonal é capaz de ligar-seespecificamente a um antígeno CD40 humano sendo livre deatividade agonista significante quando ligado ao antígenoCD4 0 expressado na superfície da referida célula B;b) uma quantidade de arginina na sua forma ácida(arginina-HCl) suficiente para tornar a referida composiçãoquase isotônica; ec) uma agente de tamponamento para manter o pH dareferida composição dentro de uma faixa de pH de cerca de5,0 a cerca de 7,0, onde o referido agente de tamponamentoé um tampão citrato/ácido cítrico.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida composição possuiuma osmolalidade de cerca de 24 0 mmol/kg a cerca de 3 60mmol/kg.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento éde cerca de 5 mM a cerca de 100 mM.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento éde cerca de 5 mM a cerca de 20 mM.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento éde cerca de 10 mM.
6. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato deque o referido agente de tamponamento é um tampão citratode sódio/ácido cítrico.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a referida composição possuium ph de cerca de 5,5.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende arginina-HCl a uma concentração de cerca de 50mM a cerca de 200 mM.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende arginina-HCl a uma concentração de cerca de 100mM a cerca de 175 mM.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende arginina-HCl a uma concentração de cerca de 150mM.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a concentração do agente detamponamento é de cerca de 5 mM a cerca de 2 0 mM.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o referido agente detamponamento é um tampão citrato de sódio/ácido cítrico, eonde a concentração do referido agente de tamponamento é decerca de 10 mM, e a referida composição possui um pH decerca de 5,5.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende arginina-HCl a uma concentração de cerca de 150mM.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por também compreender um tensoativo.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que o referido tensoativo épolissorbato 20.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que o referido tensoativo épolisorbato 20 a uma concentração de cerca de 0,001% acerca de 1,0% (w/v).
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende polisorbato 20 a uma concentração de cerca de-0,025% a cerca de 0,1% (w/v).
18. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 14, caracterizada pelo fato de tambémcompreender metionina em uma quantidade suficiente parainibir oxidação de pelo menos um resíduo de aminoácidooxidizável no referido anticorpo monoclonal anti-CD40durante a armazenagem da referida composição.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende metionina a uma concentração de cerca de 0,5 mMa cerca de 20,0 mM.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende metionina a uma concentração de cerca de 1,0 mMa cerca de 2 0,0 mM.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende metionina a uma concentração de cerca de 5,0 mM.
22. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizada pelo fatode que o referido anticorpo monoclonal anti-CD4 0antagonista é selecionado a partir do grupo consistindo de:a) anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12;b) anticorpo monoclonal produzido pela linha de célulade hibridoma 5.9 ou 12.12;c) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:6, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:7, a seqüência exposta em Id. de Seq.n°:8, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°:6 eId. de Seq. n°:7, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:6 e Id. de Seq. n°:8;d) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:2, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:4, a seqüência exposta em Id. de Seq.n°:5, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°:2 eId. de Seq. n°:4, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:2 e Id. de Seq. n°:5;e) um anticorpo monoclonal possuindo uma seqüência deaminoácido codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada apartir do grupo consistindo da seqüência exposta em Id. deSeq. n° : 1, a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:3, eambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°: Ie Id. deSeq. N°:3;f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pelalinha de célula de hibridoma 5.9 ou 12.12;g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 8 7 da seqüência CD4 0 humanaexposta em Id. de Seq. n°: 10 ou Id. de Seq. N°:12;h) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 87 da seqüência CD40 humanaexposta em Id. de Seq. n°: 10 ou Id. de Seq. N°:12;i) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpomonoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitivo; .j) o anticorpo monoclonal do item precedente a) ou umanticorpo monoclonal de qualquer um dos itens precedentesc)-i) onde o referido anticorpo é recombinantementeproduzido; ek) um anticorpo monoclonal que é um fragmento que seliga a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquer umados itens precedentes a)-j), onde o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao referidoantígeno CD4 0 humano.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que o referido fragmento éselecionado a partir do grupo consistindo de um fragmentoFab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv e um fragmentoFv de cadeia única.
24. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadapelo fato de que o referido anticorpo monoclonal anti-CD40antagonista está presente na referida composição a umaconcentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24,caracterizada pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD40 antagonista está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 1,0 mg/mL a cercade 3 5 mg/mL.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD4 0 antagonista está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 10,0 mg/mL acerca de 35 mg/mL.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida composição éestável a uma temperatura de cerca de 20C a cerca de 8°Cpor um período de pelo menos 18 meses.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida composição éestável a uma temperatura de cerca de 250C por um períodode pelo menos 3 meses.
29. Composição farmacêutica líquida estávelcaracterizada pelo fato de compreender um anticorpomonoclonal anti-CD4 0 antagonista como um componente ativoterapeuticamente ou proflaticamente, arginina em sua formaácida (arginina-HCl) a uma concentração de cerca de 50 mM acerca de 200 mM, e um agente de tamponamento para manter opH da referida composição dentro de uma faixa de cerca de 5a cerca de 7, onde o referido agente de tamponamento é umtampão citrato de sódio/ácido cítrico a uma concentração decerca de 5 mM a cerca de 20 mM, onde o referido anticorpomonoclonal anti-CD40 antagonista é selecionado a partir dogrupo consistindo de:a) anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12;b) anticorpo monoclonal produzido pela linha de célulade hibridoma 5.9 ou 12.12;c) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:6, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:7, a seqüência exposta em Id. de Seq.n° : 8, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n° : 6 eId. de Seq. n°:7, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:6 e Id. de Seq. n°:8;d) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:2, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:4, a seqüência exposta em Id. de Seq.n° : 5, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°:2 eId. de Seq. n°:4, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:2 e Id. de Seq. n°:5;e) um anticorpo monoclonal possuindo uma seqüência deaminoácido codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada apartir do grupo consistindo da seqüência exposta em Id. deSeq. n° : 1, a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:3, eambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°: 1 e Id. deSeq. N0:3;f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pelalinha de célula de hibridoma 5.9 ou 12.12;g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 8 7 da seqüência CD4 0 humanaexposta em Id. de Seq. n°: 10 ou Id. de Seq. N°:12;h) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 8 9 da seqüência CD4 0 humanaexposta em Id. de Seq. n° : 10 ou Id. de Seq. N°: 12;i) anticorpo monoclonal que concorre com o anticorpomonoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitivo;j) anticorpo monoclonal do item precedente a) ou umanticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itensprecedentes c)-i), onde o referido anticorpo érecombinantemente produzido; ek) um anticorpo monoclonal que é um fragmento que seliga a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquer umdos itens precedentes a)-j), onde o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao referidoantígeno CD4 0 humano.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato de que o referido fragmento éselecionado a partir do grupo consistindo de um fragmentoFab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv e um fragmentoFv de cadeia única.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato de que a referida composiçãocompreende arginina-HCl a uma concentração de cerca de 150mM e o agente de tamponamento é citrato de sódio/ácidocítricô a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 2 0mM, onde a referida composição possui um pH de cerca de 5,0a cerca de 6,0 e uma osmolalidade de cerca de 250 mmol/kg acerca de 330 mmol/kg.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato de que a referida composição tambémcompreende metionina, polissorbato 20 ou ambos, metionina epolissorbato 20, onde a referida metionina quando presenteestá presente na referida composição a uma concentração decerca de 0,5 mM a cerca de 20,0 mM, e onde o referidopolissorbato 20 quando presente está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 0,025% a cerca de 0,1% (p/v).
33. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 29, 30, 31 ou 32, caracterizada pelo fato deque o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 antagonistaestá presente na referida composição a uma concentração decerca de 10,0 mg/mL a cerca de 35 mg/mL.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD4 0 antagonista é o anticorpo monoclonalCHIR-5.9 OU CHIR-12.12.
35. Método para tratar um indivíduo possuindo câncerou condição pré-maligna que está associada com células queexpressam CD4 0, o referido método caracterizado porcompreender administrar uma quantidade farmaceuticamenteefetiva da composição farmacêutica de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33 OU 34.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que referido câncer écaracterizado pelo desenvolvimento de célula B neoplástica.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que o referido câncer éselecionado a partir do grupo consistindo de linfoma nãoHodgkin, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo,linfoma de célula B, linfoma de célula B de alto grau,linfoma de célula B de grau intermediário, linfoma decélula B de grau baixo, leucemia linfoblástica aguda decélula B, doença de Hodgkin, plasmacitoma, linfomafolicular, linfoma clivado pequeno folicular, linfoma decélula grande folicular, linfoma clivado pequeno misturadofolicular, linfoma difuso de célula clivada pequena,leucemia prolinfocitica, linfoma Iinfoplasmacítico, linfomade zona marginal, linfoma de tecido Iinfóide associado àmucosa, linfoma de célula B monocitóide, linfoma esplênico,leucemia de células pilosas, linfoma de célula grandedifuso, linfoma de grande célula B mediastinico,granulomatose linfomatóide, linfomatose intravascular,linfoma de células misturadas, linfoma difuso de grandescélulas, linfoma imunoblástico, linfoma de Burkitt, linfomarelacionado a AIDS, Macroglobulinemia de Waldenstrom,linfoma de células do manto, e doença de corrente pesada.
38. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que referido câncer é umamalignidade hematológica de células não B.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a referida malignidade éselecionada a partir de um grupo consistindo de leucemiasagudas, leucemias mieloblásticas, leucemias mielociticasagudas, leucemia promielocitica, leucemia mielomonocitica,leucemia monocítica, eritroleucemia, leucemia mielocíticacrônica e policitemia vera.
40. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato do referido câncer ser um tumorsólido compreendendo células neoplásticas expressando oantigeno CD4 0.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato do referido tumor sólido serselecionado a partir de um grupo consistindo de carcinomapulmonar, carcinoma mamario, carcinoma ovariano, carcinomade pele, carcinoma de cólon, carcinoma de bexiga urinária,carcinoma hepático, carcinoma gástrico, câncer de próstata,carcinoma de célula renal, carcinoma nasofaríngeo,carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar datireóide, carcinoma cervical e sarcomas.
42. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato da condição pré-malígna sergamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS).
43. Método para tratar um indivíduo possuindo umadoença inflamatória ou doença auto-imune que está associadacom células que expressam CD4 0, o referido métodocaracterizado por compreender administrar uma quantidadeterapeuticamente efetiva da composição farmacêutica dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,-25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença auto-imune é selecionada a partir dogrupo consistindo de lúpus sistêmico eritematoso (SLE),lúpus discóide, nefrite por lúpus, sarcoidose, artritejuvenil, artrite reumatóide, artrite psoriática, síndromede Reiter, espondilite anquilosante, gota artrite, rejeiçãode transplante de órgão ou tecido, doença de hospedeiroversus enxerto, esclerose múltipla, síndrome hiper IgE,poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doençainflamatória do intestino, doença de Crohn, doença celíaca(enteropatia sensível a glúten), hepatite autoimune, anemiaperniciosa, anemia hemolítica autoimune, psoríase,escleroderma, miastenia grave, púrpura trombocitopênicaautoimune, tiroidite autoimune, doença de Graves, tiroiditede Hashimoto, doença do complexo imune, síndrome dedisfunção imune de fadiga crônica (CFIDS), polimiosite edermatomiosite, crioglobulinemia, thrombólise,cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticialpulmonar, sarcoidose, diabetes melitos Tipo I e Tipo II,hipersensibilidade do tipo retardado tipos 1, 2, 3 e 4,alergia ou doenças alérgicas, asma, síndrome de Churg-Strausswsqsq (granulomatose alérgica), dermatite atópica,dermatite de contato alérgica e irritante, urticária,alergia mediada por IgE, aterosclerose, vasculite,miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolítica,doença de Alzheimer e polineuropatia desmielinizanteinflamatória crônica.
45. Método para aumentar a estabilidade de umanticorpo monoclonal anti-CD4 0 em uma composiçãofarmacêutica líquida, o referido método caracterizado porcompreender formular a referida composição combinando-se oreferido anticorpo monoclonal anti-CD40, uma quantidade dearginina-HCl suficiente para tornar a referida composiçãoquase isotônica, e um agente de tamponamento para manter opH da referida composição entre cerca de 5 e cerca de 7,onde o referido agente de tamponamento é um tampãocitrato/ácido cítrico.
46. Método para preparar uma composição farmacêuticalíquida compreendendo um anticorpo monoclonal anti-CD40, o referido método caracterizado por compreender formular areferida composição combinando-se o referido anticorpomonoclonal anti-CD40, uma quantidade de arginina em suaforma ácida (arginina-HCl) suficiente para tornar areferida composição quase isotônica, e um agente detamponamento para manter o pH da referida composição entrecerca de 5 e cerca de 7, onde o referido agente detamponamento é um tampão citrato/ácido cítrico.
47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 5 ou 46, caracterizado pelo fato de que a referida composição possui uma osmolalidade de cerca de 240mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg.
48. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 5 ou 46, caracterizado pelo fato de que areferida concentração do referido agente de tamponamento é de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, e cerca de 50 mM acerca de 200 mM de arginina-HCl é combinada com o referidoanticorpo monoclonal anti-CD40 e o referido agente detamponamento.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a referida concentração doreferido agente de tamponamento é de cerca de 5 mM a cercade 20 mM, e cerca de 100 mM a cerca de 175 mM de arginina-HCl é combinada com o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 e o referido agente de tamponamento.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de que a referida concentração doreferido agente de tamponamento é de cerca de 10 mM, ecerca de 150 mM de arginina-HCl é combinada com o referidoanticorpo monoclonal anti-CD4 0 e o referido agente detamponamento.
51. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45, 46, 47, 48, 49 ou 50, caracterizado pelofato de que o referido agente de tamponamento é um tampãocitrato de sódio/ácido cítrico.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que a referida composição possuium ph de cerca de 5,5.
53. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 5 ou 46, caracterizado pelo fato de que areferida composição é formulada para também compreendermetionina, polissorbato 20 ou ambos, metionina epolisorbato 20, onde a referida metionina quando presenteestá presente na referida composição a uma concentração decerca de 0,5 mM a cerca de 20,0 mM, e onde o referidopolisorbato 2 0 quando presente está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 0,025% a cerca de0,1% (p/v).
54. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 ou 53,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD40 antagonista é selecionado a partir dogrupo consistindo de:a) anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12;b) anticorpo monoclonal produzido pela linha de célulade hibridoma 5.9 ou 12.12;c) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:6, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:7, a seqüência exposta em Id. de Seq.n° : 8, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°:6 eId. de Seq. n°:7, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:6 e Id. de Seq. n°:8;d) um anticorpo monoclonal compreendendo uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência exposta em Id. de Seq. n°:2, a seqüência expostaem Id. de Seq. n°:4, a seqüência exposta em Id. de Seq.n°:5, ambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°:2 eId. de Seq. n°:4, e ambas as seqüências expostas em Id. deSeq. n°:2 e Id. de Seq. n°:5;e) um anticorpo monoclonal possuindo uma seqüência deaminoácido codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotideo selecionada apartir do grupo consistindo da seqüência exposta em Id. deSeq. n° : 1, a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:3, eambas as seqüências expostas em Id. de Seq. n°: Ie Id. deSeq. N0:3;f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de se ligar ao anticorpo monoclonal produzido pelalinha de célula de hibridoma 5.9 ou 12.12;g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 87 da seqüência CD40 humanaexposta em Id. de Seq. n° : 10 ou Id. de Seq. N°:12;h) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocompreendendo os resíduos 82 a 89 da seqüência CD40 humanaexposta em Id. de Seq. n°: 10 ou Id. de Seq. N°:12;i) anticorpo monoclonal que concorre com o anticorpomonoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitivo;j) anticorpo monoclonal do item precedente a) ou umanticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itensprecedentes c)-i) , onde o referido anticorpo érecombinantemente produzido; ek) um anticorpo monoclonal que é um fragmento que seliga a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquer umdos itens precedentes a)-j), onde o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao referidoantígeno CD4 0 humano.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54,caracterizado pelo fato de que o referido fragmento éselecionado a partir do grupo consistindo de um fragmentoFab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv e um fragmentoFv de cadeia única.
56. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou-55, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD4 0 antagonista está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cercade 5 0 mg/mL.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD4 0 antagonista está presente na referidacomposição a uma concentração de cerca de 10,0 mg/mL acerca de 3 5 mg/mL.
58. Composição farmacêutica líquida estávelcaracterizada pelo fato de compreender o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou fragmento de ligaçãoa antígeno deste, como um componente ativo terapeuticamenteou proflaticamente, arginina em sua forma ácida (arginina-HCl) a uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 200mM, e um agente de tamponamento para manter o pH dareferida composição dentro de uma faixa de cerca de 5 acerca de 7, onde o referido agente de tamponamento é umtampão citrato de sódio/ãcido cítrico a uma concentração decerca de 5 mM a cerca de 2 0 mM.
59. Método para tratar um indivíduo possuindo câncerou condição pré-maligna que está associada com células queexpressam CD40, o referido método caracterizado porcompreender administrar uma quantidade farmaceuticamenteefetiva da composição farmacêutica de acordo com areivindicação 58.
60. Método para tratar um indivíduo possuindo umadoença inflamatória ou autoimune que está associada comcélulas que expressam CD40, o referido método caracterizadopor compreender administrar uma quantidadefarmaceuticamente efetiva da composição farmacêutica deacordo com a reivindicação 58.
61. Método para aumentar a estabilidade do anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou fragmento de ligação aantígeno deste, em uma composição farmacêutica líquida, oreferido método caracterizado por compreender formular areferida composição através da combinação do referidoanticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígenodeste com cerca de 50 mM a cerca de 200 mM de arginina emsua forma ácida (arginina-HCl) e um agente de tamponamentopara manter o pH da referida composição entre cerca de 5 acerca de 7, onde o referido agente de tamponamento é umtampão citrato de sódio/ácido cítrico a uma concentração decerca de 5 mM a cerca de 2 0 mM.
62. Método para preparar uma composição farmacêuticaliquida caracterizado por compreender o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou fragmento de ligação aantígeno deste, o referido método compreendendo formular areferida composição através da combinação do referidoanticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígenodeste com cerca de 50 mM a cerca de 200 mM de arginina emsua forma ácida (arginina-HCl) e um agente de tamponamentopara manter o pH da referida composição entre cerca de 5 acerca de 7, onde o referido agente de tamponamento é umtampão citrato de sódio/ácido cítrico a uma concentração decerca de 5 mM a cerca de 20 mM.
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