PT2329020E

PT2329020E - Apresentação na superfície celular de isoformas de polipéptidos através da transleitura de codões de terminação

Info

Publication number: PT2329020E
Application number: PT97781777T
Authority: PT
Inventors: Thomas Jostock; Hans-Peter Knopf; Burkhard Wilms; Audrey Josiane Nommay
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2013-06-20
Also published as: IL211105A0; AU2009286956B2; AU2009286956A1; RU2011111580A; IL211105A; EP2329020B1; CN102197136B; ES2413379T3; JP2012500637A; WO2010022961A1; MX2011002273A; US9758779B2; PL2329020T3; DK2329020T3; KR20110058850A; CN102197136A; JP5788796B2; CA2734340A1; US10724033B2; CA2734340C

Description

2 ΡΕ2329020 apresentado na superfície da célula. São igualmente proporcionadas células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos heterólogos respectivamente projectados e métodos para a produção de um polipéptido usando as respectivas células hospedeiras. ΡΕ2329020 1

DESCRIÇÃO

"APRESENTAÇÃO NA SUPERFÍCIE CELULAR DE ISOFORMAS DE POLIPÉPTIDOS ATRAVÉS DA TRANSLEITURA DE CODÕES DE TERMINAÇÃO" 0 presente invento diz respeito a um método para a selecção de células hospedeiras de mamífero altamente produtoras, assim como vectores e células hospedeiras adequadas para usar no respectivo método. Ainda, o presente invento diz respeito a um método para produzir eficientemente polipéptidos com elevado rendimento. A selecção de linhas celulares altamente produtoras é um primeiro passo importante no desenvolvimento de qualquer bioprocesso e é um dos maiores desafios em biotecnologia. Um problema é que tais clones de produção elevada são raros, podem gastar muita da sua energia na produção do polipéptido e assim possuem velocidades de crescimento reduzidas. Isto conduz ao crescimento excessivo de células não produtoras ou de baixa produção. No entanto, na produção de polipéptidos é desejável obter linhas celulares produtoras dos polipéptidos de interesse com um elevado rendimento. Tradicionalmente, as linhas celulares altamente produtoras são seleccionadas através de ciclos de clonagem por diluição limite, seguido de análise do produto. No entanto, esta via tradicional tem várias ΡΕ2329020 desvantagens pois é trabalhosa e não é garantido que o clone da linha celular seja estável e portanto útil para bioprocessamento industrial. Ainda, a selecção das células mais produtoras pode ser comprometida por limitações práticas relativamente ao número de células que pode ser testado, reduzindo assim potencialmente a eficiência da selecçao de células altamente produtoras pouco abundantes.

Desta forma, tem havido muitos esforços para conseguir métodos alternativos para a selecçao de clones altamente produtores. Por exemplo, a citometria de fluxo tornou mais fácil monitorizar a produtividade e isolar células com caracteristicas especificas. Vantagens importantes da citometria de fluxo incluem a capacidade para testar grandes números de células rapidamente, com a capacidade para distinguir subpopulações celulares e a capacidade para eficientemente seleccionar células pouco abundantes apresentando as caracteristicas pretendidas. A maioria das abordagens tradicionais para selecção de células altamente produtoras utilizando a citometria de fluxo foram estabelecidas para a selecção de células de hibridoma.

Uma abordagem baseia-se no teor dos anticorpos de superfície das células de hibridoma que apresentam uma quantidade crescente de anticorpos na superfície celular que podem ser identificadas e recuperadas através do uso de anticorpos marcados com fluorescência. No entanto, uma correlação quantitativa não foi largamente documentada. 3 ΡΕ2329020 US 2005/0059082 descreve bibliotecas de células baseadas em hibridomas que expressam anticorpos numa forma ligada à membrana e numa forma secretada. O sistema descrito baseia-se num mecanismo de processamento alternativo que usa intrões específicos.

Foram desenvolvidas outras abordagens para seleccionar células baseadas em anticorpo secretado como uma estratégia alternativa para ultrapassar algumas limitações da selecção de anticorpos na superfície das células. Uma abordagem baseia-se numa matriz de afinidade; a outra usa uma tecnologia de microgotículas de gel. O primeiro método baseia-se na criação de uma matriz de afinidade artificial, específica para o produto secretado com interesse. As moléculas secretadas ligam-se à matriz de afinidade na superfície da célula secretora e são subsequentemente marcadas com reagentes fluorescentes específicos para análise por citometria de fluxo e separação de células. A encapsulação em microgotículas envolve a enca-psulaçao completa de células individuais em esferas de aga-rose. Estas esferas possuem anticorpos de captura específicos e assim simultaneamente capturam o produto secretado e inibem a transferência cruzada do produto entre células.

Outros métodos baseiam-se na co-expressão de genes marcadores, os quais são detectáveis por citometria 4 ΡΕ2329020 de fluxo. As desvantagens são uma associação fraca da expressão do gene marcador (por exemplo proteína fluorescente verde) à expressão do gene de interesse. Ainda, a expressão do gene marcador custa à célula energia adicional e pode induzir stress.

Um método alternativo baseia-se na co-expressão induzível de proteínas de captura ligadas à membrana. As proteínas de captura ligadas à membrana são ancoradas à superfície celular e capturam o polipéptido secretado logo que são expostos na superfície da célula. As moléculas capturadas podem ser então detectadas na superfície da célula. No entanto, são necessárias células hospedeiras manipuladas geneticamente e também deve ocorrer transferência cruzada de células não produtoras. WO 2005/07337 descreve um sistema de selecção para o rastreio e selecção de células que expressam um nível elevado de polipéptido usando FACS. Para permitir a separação por FACS, é usada uma cassete de expressão, em que o gene codificador da proteína de interesse é separado da sequência de ancoragem à membrana celular através de um codão de terminação. Se a tradução ocorrer para além do codão de terminação é expressa uma proteína de fusão em que a âncora da membrana celular liga a proteína de fusão à membrana celular. Esta proteína de fusão pode ser detectada por FACS. A taxa de leitura ignorando o codão de terminação é estimulada pela adição de um agente de supressão da terminação. A âncora da membrana celular preferida é a âncora GPI. Ainda, descreve-se a âncora PDGFR. ΡΕ2329020

Igualmente, foram usados produtos secretados transitoriamente associados à membrana celular de forma a seleccionar as células produtoras. No entanto, ocorre transferência cruzada para células não produtoras e este método tem uma actividade de fundo muito elevada.

Assim, existe a necessidade de desenvolver uma tecnologia para a selecção de células hospedeiras altamente produtoras. É portanto o objectivo do presente invento proporcionar um método para a detecção de células hospedeiras recombinantes altamente produtoras dentro de uma população grande de células com produção média, baixa e/ou sem produção e proporcionar um método para a produção de polipéptidos com um rendimento elevado. 0 presente invento soluciona este problema ao proporcionar um método de enriquecimento ou selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica que expresse um nivel pretendido de um polipéptido de interesse, compreendendo: a) obtenção de uma pluralidade de células hospedeiras eucarióticas compreendendo um ácido nucleico heteró-logo compreendendo pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina; 6 ΡΕ2329020 b) cultura das células hospedeiras eucarióticas para permitir a expressão do polipéptido de interesse de forma que pelo menos uma porção do polipéptido de interesse seja expressa como um polipéptido de fusão compreendendo a âncora transmembranar de imunoglobulina, em que o referido polipéptido de fusão é apresentado na superfície da referida célula hospedeira; c) selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica baseada na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superfície celular.

Um "ácido nucleico heterólogo" refere-se a uma sequência polinucleotídica que foi introduzida numa célula hospedeira, e.g. através do uso de técnicas recombinantes tais como transfecção. A célula hospedeira pode ou não compreender um polinucleótido endógeno correspondendo ou sendo idêntico ao polipéptido heterólogo. No entanto, em particular o termo "ácido nucleico heterólogo" refere-se ao polinucleótido estranho introduzido na célula hospedeira. A introdução pode ser conseguida, e.g., através da transfecção de um vector adequado que pode integrar-se no genoma da célula hospedeira (transfecção estável). No caso do ácido nucleico heterólogo não ser inserido no genoma, o ácido nucleico heterólogo pode perder-se numa fase posterior, e.g. quando as células sofrem mitose (transfecção transitória). Ambas as variantes são adequadas, no entanto prefere-se a transfecção estável. Vectores adequados podem 7 ΡΕ2329020 ser igualmente mantidos na célula hospedeira sem se integrarem no genoma, e.g., através da replicação epissómica. No entanto, são igualmente conhecidas outras técnicas de trabalhos anteriores para a introdução de um ácido nucleico heterólogo numa célula hospedeira, as quais são igualmente descritas mais detalhadamente abaixo.

Um "polinucleótido" é um polímero de nucleótidos que estão geralmente ligados entre desoxirriboses ou riboses e refere-se a DNA e RNA, dependendo do contexto. 0 termo "polinucleótido" não compreende quaisquer restrições de tamanho.

Uma "cassete" descreve um grupo de elementos polinuceotidicos, ligados operacionalmente uns aos outros, compreendendo, e.g., um polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, um polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina, um polinucleótido codificador de uma marca, elementos reguladores e/ou outros polinucleótidos aqui descritos. Uma "cassete", como aqui usado, compreende pelo menos dois elementos polinucleotidicos. Uma cassete pode ou não compreender elementos reguladores polinucleotidicos, tais como e.g., um promotor, um estimulador e/ou um local poliA. De acordo com uma realização, a cassete é uma "cassete de expressão" adequada para a expressão de um polipéptido. Uma cassete de expressão compreende pelo menos um elemento de iniciação da transcrição, e.g. um promotor, como elemento regulador operacionalmente ligado a uma região codificadora, e.g. um 8 ΡΕ2329020 polinucleótido (Pn-POI) codificador de um polipéptido de interesse, o qual está então sob o controlo transcricional do referido elemento de iniciação da transcrição. Uma cassete de expressão pode também compreender elementos reguladores adequados para terminação da transcrição, como seja, e.g., um local poliA. A "cassete (Cas-POI)" compreende pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. De preferência, a cassete (Cas-POI) é uma cassete de expressão (Exp-POI). A "cassete de expressão (Exp-POI)" define uma cassete de expressão adequada para a expressão de um polipéptido de interesse (POI). Como cassete de expressão compreende pelo menos um elemento de iniciação da transcrição. A referida cassete de expressão (Exp-POI) compreende pelo menos um elemento de iniciação da transcrição. A referida cassete de expressão (Exp-POI) compreende o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse como parte da região codificadora ou compreende um local adequado para a inserção de um polinucleótido respectivo (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse - dependendo da realização do presente invento usada, que estão descritas mais detalhadamente abaixo. 9 ΡΕ2329020 0 conceito geral do presente invento é colocar um codão de terminação entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e o polinucleótido codificador da âncora transmembranar de imunoglobulina que permite a ancoragem do polipéptido à superfície celular. 0 termo "âncora transmembranar de imunoglobulina" e "domínio transmembranar de imunoglobulina" são aqui usados como sinónimos. 0 codão de terminação constitui ou é parte de um sinal de terminação da tradução e pode ser o codão de terminação natural do polinucleótido codificador do polinucleótido de interesse e também o codão de terminação que é naturalmente usado para terminar a tradução. 0 desenho da cassete (Cas-POI) resulta, quando esta é expressa, na geração de dois polipéptidos diferentes quando o primeiro e o segundo polinucleótidos são transcritos num transcrito, o qual é facultativamente processado e subsequentemente traduzido. De acordo com uma variante da tradução, a tradução do transcrito é abortada em pelo menos um codão de terminação situado entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e o polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. A terminação da tradução no referido codão de terminação resulta num produto polipeptídico - não compreendendo a âncora transmembranar. De acordo com a segunda variante da tradução, a tradução lê para além do referido codão de terminação, obtendo-se um produto de tradução compreendendo o polipéptido de interesse fundido à âncora transmembranar de imunoglobulina que é capaz de ancoragem do polipéptido de fusão à membrana celular. Tal 10 ΡΕ2329020 polipéptido de fusão é transferido e fixado à superfície celular através da âncora transmembranar de imunoglobulina nele contida. É uma característica importante do presente invento que quando da expressão da cassete (Cas-POI) a terminação da tradução no referido codão de terminação em grelha é até certo ponto não estanque ("leaky") uma vez que ocorre leitura para além do codão de terminação, dando assim origem ao polipéptido de fusão. Uma vez que esta leitura para além do codão de terminação ocorre numa proporção definida - a qual pode também ser influenciada pela escolha e número de codões de paragem e pelas regiões adjacentes ao codão de terminação, em particular o nucleótido que se segue ao codão de terminação, assim como pelas condições de cultura - o nível de polipéptido de fusão ligado à superfície está directamente relacionado com o nível de expressão do polipéptido de interesse. A quantidade do polipéptido de fusão presente na superfície da célula é assim, até certo ponto, proporcional ao nível de expressão global do polipéptido de interesse pela respectiva célula, uma vez que existe uma forte associação entre a expressão na superfície do polipéptido de fusão e a produtividade da célula hospedeira para expressar o polipéptido de interesse. O nível de polipéptido de fusão ligado à superfície é assim representativo da produtividade global da célula individual e permite a selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica com base na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superfície celular. Um ciclo de selecção compreendendo os passos a) , b) e c) permite a identificação eficiente e ΡΕ2329020 reprodutível e o isolamento de células hospedeiras eucarió-ticas altamente produtoras. Métodos de detecção/selecção adequados, tais como imunocoloração, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, MACS, métodos baseados em afinidade, tais como esferas magnéticas, e técnicas semelhantes permitem a identificação, selecção e/ou enriquecimento em células altamente produtoras com base na presença e nivel de polipéptido de fusão ligado à superfície. Assim, o presente invento conduz a uma redução drástica nos esforços de rastreio ao permitir a selecção e também o enriquecimento de pelo menos uma célula altamente produtora ou população de células altamente produtoras a partir de uma população de células não produtoras ou de produção baixa ou média. É igualmente possivel realizar vários ciclos de selecção e/ou enriquecimento, de preferência dois ou três. Por exemplo, uma célula hospedeira ou população de células hospedeiras eucarióticas com expressão suficiente ou mesmo elevada pode ser seleccionada usando um composto de detecção, como seja e.g. um anticorpo ou fragmento do mesmo que reconhece o polipéptido de fusão ancorado à membrana. 0 referido composto de detecção pode ser portador de uma marca e pode assim ser detectado através de métodos de detecção comuns.

De acordo com os ensinamentos do presente invento, pelo menos um fragmento de uma âncora/dominio transmembranar de imunoglobulina é usado para ancorar o polipéptido de interesse à superficie celular. No caso de 12 ΡΕ2329020 ser usado um fragmento em vez de uma âncora transmembranar completa de imunoglobulina, o respectivo fragmento deverá permitir a ancoragem do polipéptido de fusão à superfície celular. A âncora/domínio transmembranar de imunoglobulina ou seu fragmento funcional está embebido e portanto fortemente ancorado à membrana celular. Esta ancoragem forte distingue as âncoras do presente invento de, e.g., uma âncora GPI. A âncora transmembranar de imunoglobulina de acordo com o presente invento proporciona uma ancoragem muito robusta, e portanto durável, do polipéptido de fusão à superfície celular, o qual não é susceptível ou é menos susceptível de libertação proteolítica. Isto é confirmado pela análise do produto obtido após purificação. Nenhumas espécies de cadeia pesada contendo a âncora transmembranar de imunoglobulina (ou fragmento da âncora transmembranar de imunoglobulina) são encontradas quando se faz análise de espectrometria de massa. Isto é uma vantagem importante relativamente a trabalhos anteriores, uma vez que também o risco de contaminações do polipéptido de interesse solúvel secretado com polipéptidos de fusão libertados é reduzido. Ainda, de acordo com as características analisadas dos polipéptidos de interesse expressos, também não são encontradas diferenças significativas relativamente ao material de sistemas convencionais de clonagem/expressão.

As células obtidas pelo método do presente invento possuem um nível de expressão média mais elevado do que as células clonadas por diluição limite ou métodos semelhantes. Também possuem um nível de expressão média 13 ΡΕ2329020 superior às células clonadas por exemplo através de cito-metria de fluxo após transfecção de um vector convencional sem compreender o domínio/âncora transmembranar especifico de acordo com o presente invento.

As células que são identificadas como resultado do procedimento de rastreio/selecção do presente invento serão, de um modo geral, isoladas e podem ser enriquecidas a partir de células não seleccionadas da população de células original. Podem ser isoladas e cultivadas como células individuais. Podem também ser usadas num ou mais ciclos de selecção, facultativamente para análise qualitativa ou quantitativa adicional ou podem ser usadas, e.g. no desenvolvimento de uma linha celular para a produção de proteínas. De acordo com uma realização, uma população enriquecida de células altamente produtoras seleccionada como atrás descrito é directamente usada como população para a produção do polipéptido de interesse com rendimento elevado.

Vantajosamente, o comportamento de crescimento observado e a produtividade dos clones que co-expressam a variante transmembranar do polipéptido de interesse, em particular anticorpos e clones derivados de uma vector clássico que não co-expressa a variante transmembranar do polipéptido de interesse parece ser o mesmo. Ainda, igualmente a estabilidade da produção clonal parece ser igualmente boa. 14 ΡΕ2329020 É igualmente proporcionado um método para a produção de um polipéptido de interesse com rendimento elevado, o método compreendendo: a) obtenção de uma pluralidade de células hospedeiras eucarióticas compreendendo um ácido nucleico heterólogo compreendendo pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do primeiro codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina ou uma sua variante funcional; b) cultura das células eucarióticas hospedeiras para permitir a expressão do polipéptido de interesse de forma que pelo menos uma porção do polipéptido de interesse seja expressa como um polipéptido de fusão compreendendo a âncora transmembranar de imunoglobulina ou uma sua variante funcional, em que o referido polipéptido de fusão é apresentado na superfície da referida célula hospedeira; c) selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica baseada na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superfície da célula; d) cultura da célula hospedeira eucariótica seleccionada em meio de cultura em condições que permitam a expressão do polipéptido de interesse. 15 ΡΕ2329020 0 polipéptido de interesse expresso pode ser obtido através da disrupção das células hospedeiras. 0 polipéptido pode igualmente ser expresso, e.g. secretado para o meio de cultura e pode ser obtido a partir do mesmo. São igualmente possíveis combinações do respectivo método. Assim, podem ser produzidos polipéptidos e obtidos/isolados eficazmente com rendimento elevado. Os polipéptidos obtidos podem também ser sujeitos a outros passos de processamento tais como, e.g., passos de purificação e/ou modificação de forma a produzir o polipéptido de interesse na qualidade pretendida. De acordo com uma realização, as referidas células hospedeiras são cultivadas em condições sem soro. Como descrito atrás, através da inserção de pelo menos um codão de terminação entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e o segundo polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina ou seu fragmento funcional, é possível a selecção de células hospedeiras de elevada expressão, permitindo assim a produção do polipéptido de interesse com rendimento elevado. 0 passo de selecção/enriquecimento do presente invento é assim uma componente integral e importante do processo de produção global. A utilização de uma âncora transmembranar de imunoglobulina ou seu fragmento funcional de acordo com ensinamentos do presente invento é particularmente vantajoso quando da produção de moléculas de imunoglobulina, uma vez que a referida âncora transmembranar de 16 ΡΕ2329020 imunoglobulina é naturalmente adequada para fixar as moléculas de imunoglobulina à superfície celular. Surpreendentemente, encontrou-se que a âncora transmembranar de imunoglobulina pode ser usada quando da expressão de moléculas de imunoglobulina em células hospedeiras de mamifero tais como células CHO. Isto é surpreendente, uma vez que os estudos anteriores assumiam que a co-expressão das cadeias do receptor de Ig alfa e beta é necessária nas referidas células de forma a conseguir-se a expressão de anticorpos na superfície - e portanto ancorados à membrana celular quando da utilização do dominio transmembranar como âncora. Estes co-receptores são e.g., naturalmente expressos nas células B e em derivados das células B tais como células de hibridoma ou de mieloma (e. g., células SP2/0) mas não se espera que sejam expressos em células não B tais como células CHO No entanto, encontrou-se que apesar da ausência de expressão dos co-recptores a apresentação na superfície dos polipéptidos de interesse e, em particular, das moléculas de imunoglobulina funciona bem em derivados de células não B tais como células CHO quando se usa a âncora/domínio transmembranar. Assim, de acordo com uma realização é usada uma célula hospedeira eucariótica que não é uma célula B ou um derivado de célula B. Assim, uma célula hospedeira eucariótica, de preferência de mamífero, usada não expressa naturalmente as cadeias alfa e beta do receptor de Ig. Assim, de preferência, a célula hospedeira é uma célula CHO. Além do mais, de acordo com uma realização, não ocorre co-expressão artificial das cadeias alfa e beta do receptor de Ig na referida célula hospedeira eucariótica. 17 ΡΕ2329020

Qualquer âncora transmembranar de Ig ou seu fragmento funcional pode ser usado de acordo com os ensinamentos do presente invento. Em particular, a âncora transmembranar de imunoglobulina é seleccionada do grupo consistindo em âncoras transmembranares de imunoglobulina derivadas de IgM, IgA, IgE e/ou IgD ou variantes funcionais das mesmas. De preferência, a âncora transmembranar de imunoglobulina deriva de IgGl, IgG2, IgG3 e/ou IgG4. É particularmente adequada uma âncora transmembranar derivada de IgGl ou uma variante funcional da mesma. Exemplos preferidos de uma âncora transmembranar derivada de IgG estão mostrados em SEQ ID N0:2 e SEQ ID N0:7.

De acordo com uma realização, a âncora transmembranar de imunoglobulina compreende um domínio citoplas-mático. 0 uso de uma âncora transmembranar de imunoglobulina compreendendo um domínio citoplasmático é preferida, uma vez que proporciona uma ancoragem muito forte do polipéptido de fusão à superfície celular. É particularmente adequado o uso de um domínio citoplasmático de imunoglobulina. De acordo com uma realização, o domínio citoplasmático de imunoglobulina deriva de IgG, IgA e IgE ou de variantes funcionais das mesmas. Estes domínios citoplasmá-ticos de imunoglobulina são maiores do que os derivados de IgD ou de IgM. SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6 mostram sequências aminoácidos adequadas de domínios citoplasmáti-cos derivados de IgG que podem ser usados como domínio citoplasmático. Um exemplo preferido de uma âncora transmem- 18 ΡΕ2329020 branar derivada de IgG que compreende um domínio citoplas-mático derivado de IgG está apresentado em SEQ ID NO:3. A sequência nucleotídica de uma secção de uma cassete adequada (Cas-POI) está apresentada como SEQ ID N0:1. 0 detalhe mostrado compreende um codão de terminação em grelha, adequado para a tradução para além dele (transleitura) e um polinucleótido codificador de um domínio transmembranar de imunoglobulina (Ig) particularmente adequado que pode ser usado de acordo com os ensinamentos do presente invento. 0 codão de terminação está situado em grelha a jusante do polinucleótido codificador do polipé-ptido de interesse e assim a sequência polinucleotídica é transcrita e processada numa sequência de aminoácidos. A sequência codificadora refere-se à sequência que é traduzida em aminoácidos. Desta forma, o codão de terminação não pertence à sequência codificadora e consequentemente ao polinucleótido codificador do polipéptido de interesse. 0 codão de terminação pode ser o codão de terminação natural do polinucleótido codificador do polipéptido de interesse. Neste caso, não são necessários mas podem estar presentes codões de paragem adicionais (ver atrás). 0 segundo polinucleótido da cassete (Cas-POI) pode codificar uma âncora transmembranar de imunoglobulina, a qual compreende uma sequência polipeptídica mostrada como SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 mostra mais uma variante de um domínio transmembranar de imunoglobulina adequado, compreendendo igualmente um domínio citoplasmático (o domínio 19 ΡΕ2329020 citoplasmático sozinho está também apresentado como SEQ ID NO:4), os aminoácidos putativos correspondendo ao codão de terminação que é lido e o codão adicional (WL) e uma região de ligação (a região de ligação sozinha está também apresentada como SEQ ID N0:5). Igualmente, podem estar presentes outros aminoácidos na posição correspondente a pelo menos um codão de terminação e o codão adjacente, dependente do codão de terminação escolhido e/ou do número de codões de paragem e do uso de codões adjacentes. Uma vez que estes aminoácidos estão presentes apenas no polipéptido de fusão, eles não alteram a sequência de aminoácidos do polipéptido de interesse. Assim, um domínio transmembranar de imunoglobulina compreendendo uma sequência polipeptídica como se mostra em SEQ ID NO:2 ou 3 pode ser usado como uma âncora transmembranar de acordo com os ensinamentos do presente invento e, assim, nos métodos descritos, assim como nos vectores e células hospedeiras descritos.

Um sinal de terminação da tradução e portanto um codão de terminação de entre qualquer um dos três codões de terminação que sinalizam a terminação da síntese proteica (TAA (UAA) , TAG (UAG) e TGA (UGA) - igualmente em vários contextos de tetranucleótidos, ver abaixo) podem ser usados entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do plipéptido de interesse e o polinucleótido codificador da âncora transmembranar de imunoglobulina, dependendo do nível de supressão (leitura não interrompida) pretendido. Como descrito atrás, o codão de terminação pode também ser o codão de terminação natural do polinucleótido codificador 20 ΡΕ2329020 do polipéptido de interesse. De preferência, o referido sinal de terminação da tradução possui uma eficiência de terminação incompleta de forma a promover a leitura para além do codão de terminação. 0 não estancamento ("leakyness") do codão de terminação é igualmente influenciado por um ou mais codões adjacentes e portanto a jusante de pelo menos um codão de terminação, em particular o primeiro nucleótido pode influenciar a tradução para além do codão de terminação (ver abaixo). A cassete (Cas-POI) necessita de ser transcrita para permitir a expressão do polipéptido de interesse. De acordo com uma realização, a cassete (Cas-POI) é assim uma cassete de expressão. De acordo com uma outra realização, a cassete (Cas-POI) é integrada no genoma da célula hospedeira de forma que a cassete (Cas-POI) esteja sob o controlo transcricional de um elemento de iniciação da transcrição da célula hospedeira, como seja um promotor. A transcrição do ácido nucleico compreendido na cassete (Cas-POI) resulta num transcrito compreendendo pelo menos - um primeiro polinucleótido, em que a tradução do referido primeiro polinucleótido resulta no polipéptido de interesse; - pelo menos um codão de terminação a jusante do referido primeiro polinucleótido; - um segundo polinucleótido a jusante do referido codão de terminação, em que a tradução do referido segundo 21 ΡΕ2329020 polinucleótido resulta na âncora transmembranar de imuno-globulina.

Pelo menos uma porção do transcrito é traduzida num polipéptido de fusão compreendendo o polipéptido de interesse e a âncora transmembranar de imunoglobulina através da leitura para além do codão de terminação de pelo menos um codão de terminação. A tradução para além do codão de terminação pode ocorrer naturalmente devido à escolha do codão de terminação/desenho do sinal de terminação da tradução ou pode ser induzida através da adaptação das condições de cultura, e.g., através da utilização de um agente de supressão da terminação (ver abaixo). A cassete (Cas-POI) usada no método do invento pode compreender apenas um único codão de terminação a montante da sequência codificadora da âncora transmembranar de imunoglobulina ou seus fragmentos. No entanto, é igualmente possível usar uma série de dois ou mais codões de paragem, e.g. dois ou três, ou quatro codões de paragem, os quais podem ser iguais ou diferentes. Igualmente, o contexto do codão de terminação, i.e. os trinucleótidos do próprio codão de terminação assim como os nucleótidos do codão imediatamente a jusante do codão de terminação, tem influência nos níveis de leitura para além do codão de terminação. No entanto, é necessário ser assegurado que um determinado nível de tradução para além do codão de terminação ainda ocorre, de forma a permitir a produção do polipéptido de fusão que pode ser conseguido de acordo com uma realização através do ajuste das condições de cultura. 22 ΡΕ2329020 0 transcrito primário pode ser um pré-mRNA compreendendo intrões. Um respectivo pré-mRNA será processado (cortado) em mRNA. Como alternativa, a transcrição pode resultar directamente em mRNA. Durante a tradução do transcrito de mRNA existe geralmente um nivel natural de fundo da leitura para além do codão de terminação ou um determinado nivel de tradução para além do codão de terminação pode ser induzido através da adaptação das condições de cultura. Este nivel de tradução para além do codão de terminação resulta numa determinada proporção de polipé-ptidos de fusão que também depende do número e natureza dos codões de paragem usados, do codão de terminação a jusante e do contexto particular de tetranucleótidos do codão de terminação e das condições de cultura. Assim, uma determinada proporção do polipéptido de fusão é produzida de acordo com os ensinamentos do presente invento, apesar da presença do codão de terminação. Estes polipéptidos de fusão compreendem a âncora transmembranar de imunoglo-bulina, que ancora fortemente o polipéptido de fusão à superfície da célula. Como resultado, os polipéptidos de fusão são apresentados na superfície das células hospedeiras e as células que apresentam níveis elevados de polipéptidos de fusão recombinantes ancorados à membrana (indicando um nível elevado do polipéptido secretado) podem ser seleccionadas e.g., por citometria de fluxo, em particular através da separação de células activada por fluorescência (FACS) quando postas em contacto com um composto de detecção adequadamente marcado. 23 ΡΕ2329020

Sinais de terminação da tradução adequados e assim codões de paragem e ambientes de codões de paragem com eficiência de terminação da tradução incompleta podem ser projectados como descrito em trabalhos anteriores (ver e.g., Li et al. 1993, Journal of Virology 67 (8), 5062-5067; McCughan et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sei. 92, 5431-5435; Brown et al 1990, Nucleic Acids Research 18 (21)6339-6345, aqui incluídos por referência).

De acordo com uma realização, é usado o ambiente de codão de terminação que se segue; o codão de terminação está mostrado a negrito e sublinhado: TGACTA sequência de nucleótidos do ambiente do codão de terminação na sequência codificadora e assim ao nível do DNA; o codão de terminação está apresentado a negrito e sublinhado

UGACUA sequência de nucleótidos do ambiente do codão de terminação ao nível do RNA WL aminoácidos putativos correspondendo ao codão de terminação e ao codão adjacente se ocorrer leitura ignorando o codão de terminação; está apresentado o produto mais provável da tradução ignorando o codão de terminação do polinucleótido apresentado.

Outros aminoácidos que são incorporados no poli-péptido de fusão devido à transleitura do codão de termi- - 24 - ΡΕ2329020 nação podem ser de qualquer tipo desde que a proteína de fusão seja apresentada na superfície da célula. Uma vez que os referidos aminoácidos adicionais são apenas incorporados no polipéptido de fusão, o aminoácido do polipéptido de interesse permanece inalterado.

Para além de ser possível usar os múltiplos codões de paragem após o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, será normalmente vantajoso usar os múltiplos codões de paragem a jusante da sequência codificadora da âncora transmembranar de imunoglo-bulina ou um seu fragmento funcional. 0 uso de múltiplos codões de paragem nesta posição, e.g. até cerca de dez codões de paragem, como seja até cerca de seis ou oito codões de paragem, como seja até cerca de dois, três, quatro ou cinco codões de paragem, assegurará terminação eficiente da tradução. A quantidade de polipéptido de fusão presente, e assim detectável, na superfície da célula geralmente aumenta durante a síntese do polipéptido uma vez que o polipéptido de fusão permanece ancorado à membrana celular e assim acumula-se na superfície da célula à medida que a expressão prossegue. De acordo com uma realização, a cassete (Cas-POI) é construída de forma que a leitura que ignora o codão de terminação resulta em aproximadamente <50%, <25%, <15%, <10%, <5%, <2,5%, <1,5%, <1% ou menos de < 0,5%do polipéptido de fusão. A restante porção é produzida na forma de polipéptido não compreendendo a 25 ΡΕ2329020 âncora transmembranar de imunoglobulina. Como descrito, o nível de leitura para além do codão de terminação pode ser influenciado pela escolha e número dos codões de paragem e das regiões adjacentes ao codão de terminação, em particular o nucleótido que se segue ao codão de terminação, assim como pelas condições de cultura usadas durante o passo b). Dependendo de factores tais como o nível natural de fundo da leitura para além do codão de terminação para um determinado codão de terminação numa determinada construção, pode nalguns casos ser desejável usar mais de um codão de terminação entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e o polinucleótido codificador da âncora transmembranar de imunoglobulina de forma a reduzir mais os níveis de leitura para além do codão de terminação (ver atrás) . A vantagem geral de um nível baixo de leitura para além do codão de terminação é uma restringência mais elevada no subsequente processo de selecção/enriquecimento e separação, o qual é de preferência efectuado por FACS, conduzindo a uma melhor resolução de clones de elevada produção versus clones de produção ultra-elevada. Se os níveis de leitura para além do codão de terminação forem muito elevados, pode ocorrer saturação da capacidade da superfície celular para os polipéptidos ligados à membrana, o que pode impedir a descriminação dos níveis de expressão, em particular dos níveis de expressão elevada. Assim, um nível de leitura ignorando o codão de terminação relativamente baixo é vantajoso de forma a seleccionar clones de expressão ultra-elevada. Assim, de preferência, apenas <5%, <5% ou mesmo <1,5% do transcrito é traduzido num polipéptido de fusão. 26 ΡΕ2329020

No entanto, é também possível aumentar o nível de leitura para além do codão de terminação se necessá-rio/pretendido, e.g., através da utilização de um agente supressor da terminação durante a cultura. 0 uso de um agente de supressão da terminação no meio de cultura durante o passo b) é uma forma de influenciar o nível de leitura para além do codão de terminação pelas condições de cultura. Um agente de supressão da terminação é um agente químico que é capaz de suprimir a terminação da tradução resultante da presença de um codão de terminação. Em particular, o agente de supressão da terminação é um antibiótico pertencente ao grupo dos aminoglicósidos. Os antibióticos aminoglicósidos são conhecidos pela sua capacidade para permitir a inserção de aminoácidos alternativos no local de um codão de terminação, resultando assim na transleitura de um codão de terminação ou do contexto de um codão de terminação que, de outra forma, normalmente resultaria na terminação da tradução. Os antibióticos aminoglicósidos incluem G-418, gentamicina, paromomicina, higromicina, amicacina, canamicina, neomi-cina, netilmicina, estreptomicina e tobramicina. No entanto, como é vantajoso um nível baixo de tradução ignorando o codão de terminação, a selecção é de preferência realizada na ausência de um agente de supressão da terminação. 0 presente invento é aplicável a qualquer tipo de célula hospedeira em que a tradução ignorando o codão de terminação ocorra pelo menos numa percentagem pequena ou 27 ΡΕ2329020 possa ser induzida pela adição de um agente de supressão da terminação. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas adequadas são células hospedeiras de mamifero, as quais incluem, e.g., linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares de macaco verde (COS), células de murganho (por exemplo NS/0), linhas celulares de rim de hamster bebé (BHK) e células e linhas celulares humanas. De preferência, a célula hospedeira é uma linha celular CHO.

Ainda que um ciclo de selecção seja suficiente para identificar células hospedeiras boas produtoras, de acordo com uma realização são realizados dois ou mais ciclos de selecção, em que em cada ciclo de selecção pelo menos uma célula hospedeira eucariótica é seleccionada com base na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superfície celular. Os resultados experimentais demonstram que um segundo ciclo de selecção conduz geralmente a melhores resultados.

De acordo com uma realização, o passo de selecção c) compreende o contacto de uma pluralidade de células hospedeiras com um composto de detecção usado para a ligação do polipéptido de fusão, o qual pode ter pelo menos uma das seguintes caracteristicas: - o referido composto é marcado; - o referido composto é marcado com fluorescência; - o referido composto é um antigénio; 28 ΡΕ2329020 - o referido composto é uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento de ligação; - o referido composto é proteína-A, -G e/ou -L. 0 composto de detecção usado para a ligação do polipéptido de fusão na superfície celular pode, por exemplo, ser uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento, como seja um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que reconhece o polipéptido de fusão. Basicamente todas as porções acessíveis do polipéptido de fusão podem ser detectadas, consequentemente também a porção correspondente ao polipéptido de interesse que é secretada em paralelo com o polipéptido de fusão na forma solúvel.

De acordo com uma realização, o composto de detecção é um antigénio. Esta realização é adequada, se o polipéptido de interesse expresso for, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento, como seja um anticorpo que se liga ao respectivo antigénio.

De forma a permitir a detecção e selecção, o referido composto de detecção usado para a ligação ao polipéptido de fusão pode ser marcado. 0 composto de detecção marcado liga-se ao polipéptido de fusão apresentado na superfície celular marcando assim a superfície da célula. Quanto maior a quantidade de polipéptido de fusão que é expresso pela célula hospedeira mais composto de detecção marcado se liga. Isto tem a vantagem de a selecção das células hospedeiras poder ser facilmente efec- 29 ΡΕ2329020 tuada, uma vez que não só a presença como também a quantidade do composto de detecção ligado podem ser determinadas devido à marca. Para seleccionar células hospedeiras altamente produtoras, as células hospedeiras são seleccionadas da população de células hospedeiras que estão, respectivamente, mais marcadas eficazmente e intensamente pelo composto de detecção. Prefere-se uma marca fluorescente uma vez que esta permite a detecção fácil pelos métodos de detecção de fluorescência tais como por exemplo citometria de fluxo. Marcas fluorescentes adequadas são conhecidas dos familiarizados com a matéria.

De acordo com uma realização, um ou mais ciclos de selecção, de preferência dois ou três, podem ser realizados para seleccionar pelo menos uma célula hospedeira eucariótica com base no grau de ligação do composto de detecção à superfície celular. De acordo com esta realização, pelo menos uma célula hospedeira eucariótica é seleccionada em cada ciclo de selecção baseado na quantidade do composto de detecção ligado. Assim, as células hospedeiras que foram mais eficazmente/intensamente marcadas são seleccionadas com base no grau da quantidade respectiva de coloração da superfície celular. Por exemplo, podem ser seleccionadas os 5% ou os 2% de células hospedeiras mais coradas.

No caso de serem seleccionadas várias células hospedeiras eucarióticas em lote (o chamado enriquecimento de lote), várias células, e.g. pelo menos 50, pelo menos 30 ΡΕ2329020 500, pelo menos 1000 ou pelo menos 50000 são seleccionadas e incluídas num lote de células. Esta realização é particularmente vantajosa para a obtenção rápida de grandes quantidade do polipéptido de interesse uma vez que o lote de células compreendendo várias células hospedeiras altamente produtoras, seleccionadas de acordo com os ensinamentos do presente invento, podem ser expandidas mais rapidamente do que, e.g., um clone celular.

Assim, para além da aplicação da clonagem selectiva de células, o presente invento pode também ser usado para o enriquecimento em lote de células altamente produtoras, pelo que títulos comparáveis a linhas celulares clonais podem ser conseguidos. Células hospedeiras altamente produtoras podem ser isoladas e/ou uma população de células altamente produtoras pode ser enriquecida com base no grau de ligação do composto de detecção à superfície da célula, em particular ao polipéptido de fusão. A ligação do composto de detecção ao polipéptido de fusão de fusão na superfície da célula hospedeira pode ser detectada por citometria de fluxo, de preferência por separação de células activada por fluorescência (FACS).

Numa realização preferida, as células hospedeiras compreendendo uma elevada quantidade de polipéptidos de fusão que apresentem uma sinal elevado são separadas através da separação de células activada por fluorescência 31 ΡΕ2329020 (FACS). No contexto do presente invento, a separação por FACS é particularmente vantajosa, uma vez que permite o rastreio rápido de grandes números de células hospedeiras para identificar e enriquecer nas células que expressam o polipéptido de interesse com um rendimento elevado. Uma vez que, de acordo com a realização preferida, aproximadamente apenas 5% ou menos do polipéptido é produzido como um polipéptido de fusão, uma fluorescência mais elevada detectada na superfície da células corresponderá a uma expressão mais elevada também do polipéptido de interesse, o qual pode ser, e.g., secretado para o meio de cultura. As células que apresentem taxas de fluorescência mais elevadas podem ser identificadas e isoladas por FACS. Uma correlação positiva e estatisticamente significativa entre fluorescência, determinada por FACS, e a quantidade de polipéptido produzido foi encontrada e confirmada pelos exemplos. Assim, a separação por FACS pode ser usada não só para uma análise qualitativa para identificar células que expressam um polipéptido de interesse em geral, como também pode ser usada quantitativamente para identificar as células hospedeiras que expressam niveis elevados do polipéptido de interesse. Assim, células hospedeiras altamente produtoras podem ser seleccionadas/enriquecidas com base no grau de ligação do composto de detecção marcado ao polipéptido de fusão, o qual está ancorado à superficie celular. Assim, as melhores células produtoras podem ser seleccionadas/enriquecidas. Os resultados experimentais mostram que usando o processo de selecção de acordo com o presente invento em combinação com a análise por FACS conduziu a uma 32 ΡΕ2329020 redução significativa dos clones não produtores nas populações celulares seleccionadas. Ainda, a produtividade média altamente aumentada dos clones permite a redução drástica dos esforços de rastreio de clones, e.g. no processo de desenvolvimento de linhas celulares para a produção biofarmacêutica. Assim, linhas celulares para um número muito mais elevado de candidatos ou projectos podem ser desenvolvidas com menos fundos, comparativamente com as abordagens de rastreio clássicas. Igualmente, este processo permite a avaliação do potencial de produtividade e da distribuição clonal de conjuntos de células transfectadas e seleccionadas através da coloração na superfície e análise por FACS em vez dos ensaios de produtividade demorados. A coloração de superfície pode também ser usada para analisar a estabilidade da produção clonal relativamente à homogeneidade da população de células. Subpopulações não produtoras ou de baixa produção que possam surgir serão facilmente detectáveis.

De acordo com uma realização, a cassete (Cas-POI) e/ou (Cas-POI') ainda compreende - um polinucleótido (Pn-TAG) codificador de uma marca de afinidade situada a jusante de pelo menos um codão de terminação, o qual está situado a jusante do primeiro polinucleótido, e em que o referido polinucleótido (Pn-TAG) está situado a montante do segundo polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina e/ou 33 ΡΕ2329020 - um polinucleótido (Pn-MARKER) codificador de uma marca seleccionável. A obtenção do polinucleótido (Pn-TAG) como atrás definido entre o codão de terminação e o polinucleótido codificador da âncora transmembranar de imunoglobulina tem a vantagem de ser incorporada uma marca de afinidade na proteína de fusão. Uma vez que a marca de afinidade está situada a jusante de pelo menos um codão de terminação, é incluída apenas na variante de fusão do polipéptido de interesse. Uma "marca de afinidade" refere-se a uma sequência de aminoácidos curta que pode ser detectada/ligada através da ligação de compostos/agentes tais como anticorpo. Basicamente, a marca de afinidade serve como alvo para os agentes de captura e/ou compostos de detecção. Uma vez que está localizada entre o polipéptido de interesse e a âncora transmembranar de imunoglobulina, é também apresentada na superfície celular e está assim acessível, e.g., aos compostos de detecção. A marca de afinidade pode assim funcionar também como alvo para o composto de detecção de forma a permitir a selecção de células hospedeiras eucarióticas adequadas. Usar, e.g., uma marca de afinidade bem caracterizada para a detec-ção/selecção é vantajoso uma vez que podem ser usados na detecção compostos de detecção já existentes e bem caracterizados. Ainda, o mesmo composto de detecção pode ser usado para diferentes tipos de polipéptidos de interesse a serem expressos. A geração de compostos de detecção específicos para os diferentes polipéptidos de ΡΕ2329020 interesse seria obsoleto de acordo com esta realização, uma vez que o mesmo composto de detecção especifico para a marca de afinidade poderá ser usado. Uma vez que a marca de afinidade constitui uma parte integral do polipéptido de fusão está também fortemente ancorada à superfície da célula hospedeira eucariótica devido à presença da âncora transmembranar. Os polipéptidos de fusão fortemente ligados não deverão ser susceptíveis à libertação (ver atrás). A libertação de proteínas de fusão ligadas a membranas pode constituir - dependendo do uso pretendido para o polipéptido secretado - um problema de contaminação, mesmo se a libertação for um evento raro quando se usa uma âncora transmembranar de imunoglobulina. Por exemplo, quando da expressão de polipéptidos/proteínas terapêuticas, é desejável obter o produto secretado tão puro quanto possível. Quando se usa uma marca de afinidade como seja, e.g., uma marca de His, a referida marca de afinidade estaria, pelo menos parcialmente, incluída na proteína libertada. Devido à presença da marca de afinidade é possível remover os polipéptidos de fusão libertados (se presentes) da amostra de polipéptidos secretados usando procedimentos convencionais de purificação por afinidade (e.g. Ni-NTA no caso de uma marca de His). A marca de afinidade é portanto útil de forma a facilmente remover potenciais contaminações da amostra.

Ainda, a marca de afinidade pode ser usada de forma a controlar a pureza do polipéptido expresso/obtido. 35 ΡΕ2329020

Para aplicações em que sejam necessárias proteínas/poli-péptidos altamente puros pode também ser vantajoso/obri-gatório proporcionar ensaios adequados para demonstrar que o produto obtido está puro e assim não compreende contaminações devido aos polipéptidos de fusão libertados. Tal ensaio poderá ser baseado na detecção da marca de afinidade. Uma vez que a marca de afinidade está apenas presente no polipéptido de fusão, pode servir como uma marca especifica para a presença de polipéptidos de fusão (ou versões degradadas/libertadas dos mesmos) na amostra. Se a marca de afinidade ainda puder ser detectada no produto obtido quando se usa um composto de detecção especifico para uma marca de afinidade, existem ainda vestígios de polipéptido de fusão libertado na amostra e a amostra pode necessitar - dependendo da quantidade - de ser mais purificada. A não detecção de qualquer marca de afinidade na amostra, ou se as respectivas quantidades de polipéptido de fusão libertado forem muito baixas na amostra analisada, assegura que a amostra está suficientemente pura para a aplicação pretendida.

Assim, quando da produção do polipéptido de interesse, o polipéptido de interesse obtido pode ainda ser processado através de remoção das contaminações de polipéptido de fusão libertado por purificação de afinidade tendo como alvo a marca de afinidade e/ou - detecção da presença ou ausência da proteína de fusão libertada através do detecção da marca de afinidade. ΡΕ2329020

Exemplos adequados de marcas de afinidade são, e.g., V5, uma cauda de His, FLAG, Strep, HA, c-Myc ou similares. Marcas de afinidade adequadas podem ser criadas artificialmente.

De acordo com uma outra realização, a cassete (Cas-POI) e/ou (Cas-POI') compreende um outro polinucleó-tido (Pn-MARKER) codificador de uma marca seleccionável. De preferência, a referida marca seleccionável está situada a jusante do polinucleótido codificador da âncora transmem-branar de imunoglobulina e quando da expressão da construção está situada no lado citoplasmático da membrana celular quando o polipéptido de fusão é apresentado. De acordo com uma realização, não existe codão de terminação entre o polinucleótido codificador da âncora/dominio transmembranar de imunoglobulina e o polinucleótido (Pn-MARKER), como é suposto estar para serem expressos como uma fusão. Codões de paragem adequados e sinais de terminação da transcrição adequados deverão ser proporcionados a jusante da sequência codificadora do polinucleótido (Pn-MARKER) para assegurar transcrição e terminação da tradução eficientes após expressão do polinucleótido (Pn-MARKER). 0 referido polinucleótido (Pn-MARKER) pode, e.g., ser um gene de resistência a fármacos ou um gene repórter. Exemplos adequados são aqui descritos. De acordo com uma realização, a proteína fluorescente verde (GFP) ou a luciferase são usados como repórteres. Isto permite a selecção das células hospedeiras eucarióticas com base em duas características da proteína de fusão. 37 ΡΕ2329020

De acordo com uma realização, a cassete (Cas-POI) e/ou (Cas-POI') é uma cassete de expressão. Os familiarizados com a matéria serão capazes e seleccionar vectores adequados, sequências de controlo da expressão e hospedeiros para a realização dos métodos do invento. Por exemplo, na selecção de um vector, o hospedeiro deve ser considerado devido ao vector poder necessitar de se replicar nele e/ou ser capaz de se integrar no cromossoma. Vectores adequados que podem ser usados nos métodos de selecção e produção de acordo com o presente invento estão também descritos abaixo e nas reivindicações. É igualmente proporcionado um ácido nucleico vector adequado para a expressão de pelo menos um polipéptido de interesse numa célula hospedeira eucarió-tica, de preferência numa célula hospedeira de mamífero, compreendendo pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo um local de inserção para um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e/ou um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador de um polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina.

Um "ácido nucleico vector" de acordo com o presente invento é um polinucleótido capaz de ser portador de pelo menos um fragmento de ácido nucleico estranho. Um 38 ΡΕ2329020 ácido nucleico vector funciona como um "veiculo molecular", entregando os fragmentos de ácidos nucleicos numa célula hospedeira. Pode compreender pelo menos uma cassete de expressão compreendendo sequências reguladoras. De preferência, o ácido nucleico vector compreende pelo menos uma cassete de expressão. Os polinucleótidos estranhos podem ser inseridos nas cassetes de expressão do ácido nucleico vector de forma a serem expressos a partir dele. 0 ácido nucleico vector de acordo com o presente invento pode estar presente na forma circular ou linear. 0 termo "ácido nucleico vector" compreende igualmente cromossomas artificiais ou polinucleótidos respectivos semelhantes que permitam a transferência de fragmentos de ácido nucleico estranho .

Um vector respectivo pode ser usado como vector de expressão para se executar os métodos de rastreio e produção atrás descritos. As vantagens de um ácido nucleico vector respectivo estão igualmente descritas conjuntamente com o método de rastreio. 0 referido ácido nucleico vector pode ainda compreender pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse; - uma cassete de expressão (Exp-MSM) compreendendo um gene de marca seleccionável para mamífero; e/ou - uma cassete de expressão (Exp-MASM) compreendendo um gene de marca seleccionável amplificável para mamífero. 39 ΡΕ2329020 A cassete de expressão (Exp-MSM) define a cassete de expressão compreendendo um gene de uma marca seleccionável para mamífero (mammalian selectable marker). A cassete de expressão (Exp-MASM) define a cassete de expressão compreendendo um gene de uma marca seleccionável e amplificável em mamífero (mammalian amplifiable, selectable marker).

Os termos "5'" e "3'" é uma convenção usada para descrever as características de uma sequência de ácido nucleico relacionada coma posição dos elementos genéticos e/ou a direcção de eventos (5' para 3'), como seja e.g. transcrição pela polimerase de RNA ou tradução pelo ribossoma que prossegue na direcção 5' para 3'. Sinónimos são a montante (5') e a jusante (3'). Convencionalmente, as sequências de DNA, os mapas de genes, os mapas dos vectores e as sequências de RNA são desenhadas de 5' para 3', da esquerda para a direita ou a direcção 5' para 3' é indicada com setas, em que a seta aponta na direcção 3'. Assim, 5' (montante) indica elementos genéticos posicionados no lado esquerdo e 3' (jusante) indica elementos genéticos posicionados no lado direito, quando se segue esta convenção. 0 arranjo e orientação das cassetes de expressão é igualmente um aspecto importante, de acordo com uma realização, a cassete de expressão (Exp-MASM) situa-se 5' e a cassete de expressão (Exp-MSM) situa-se 3' relativamente 40 ΡΕ2329020 à cassete de expressão (Exp-POI). Outras cassetes de expressão podem ser inseridas entre as cassetes de expressão (Exp-POI) e (Exp-MSM), como seja, e.g. uma cassete de expressão adicional (Exp-POI') para a expressão de um poli-péptido de interesse adicional (descrito mais detalha-damente abaixo). As cassetes de expressão (Exp-MASM), (Exp-POI) e (Exp-MSM) estão, de preferência, todas arranjadas na mesma direcção 5' para 3' . Os inventores encontraram, que esta configuração de ácido nucleico vector particular permite a geração rápida de linhas celulares de elevada produção.

De acordo com uma outra alternativa, a cassete de expressão (Exp-POI) não compreende o polinucleótido (pPn-POI) codificador do polipéptido de interesse. Assim, é proporcionado um vector de expressão "vazio" com uma cassete de expressão (Exp-POI) que não compreende ainda o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse. No entanto, o referido polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse pode ser incorporado na cassete de expressão (Exp-POI) usando métodos de clonagem adequados, por exemplo usando enzimas de restrição de forma a inserir o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse na cassete de expressão (Exp-POI). Para este fim, a cassete de expressão (Exp-POI) pode compreender, e.g., um local de clonagem múltipla (MCS) que pode, e.g., ser usado em todas as grelhas de leitura. Um ácido nucleico vector respectivo "vazio" pode, e.g., ser proporcionado aos clientes, os quais inserem depois o seu 41 ΡΕ2329020 polinucleótido de interesse específico na cassete de expressão (Exp-POI). 0 polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse é inserido de forma que um codão de terminação esteja presente entre o polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e o polinucleótido codificador da âncora transmembranar. A cassete de expressão (Exp-POI) pode igualmente compreender um polinucleótido de substituição ou uma sequência de ácido nucleico de preenchimento, a qual pode ser removida e substituída pelo polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse. 0 presente invento também proporciona um ácido nucleico vector como descrito atrás, compreendendo uma cassete de expressão (Exp-POI) compreendendo um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. Esta realização diz respeito basicamente ao ácido nucleico vector de expressão final. Basicamente, o mesmo se aplica no caso de ser usada uma cassete (Cas-POI) em vez de uma cassete de expressão (Exp-POI).

De acordo com uma realização, o ácido nucleico vector é circular e a cassete de expressão (Exp-MSM) está localizada 3' relativamente à cassete de expressão (Exp-POI) e a cassete de expressão (Exp-MASM) está localizada 3' relativamente à cassete de expressão (Exp-MSM). 42 ΡΕ2329020 0 vector de expressão de acordo com o presente invento pode compreender uma cassete de expressão adicional (Exp-POI') para a expressão de um polipéptido de interesse. No ácido nucleico vector final, a referida cassete de expressão adicional (Exp-POI') compreende o polinucleótido adicional para expressão do polipéptido adicional de interesse. Dependendo dos polipéptidos a serem expressos, a referida cassete de expressão adicional (Exp-POI') pode ou não compreender um polinucleótido codificador de uma âncora membranar (ou um péptido sinal para ligação da respectiva âncora, como seja uma âncora GPI) , a qual é separada do polinucleótido codificador do polipéptido adicional de interesse através de um codão de terminação. Assim, é igualmente possivel que várias cassetes de expressão para expressar diferentes polipéptidos estejam arranjadas no vector de expressão de acordo com o presente invento. No entanto, apenas a cassete de expressão (Exp-POI) necessita de ter a montagem do codão de terminação não estanque e assim um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina, a cassete de expressão adicional (Exp-POI') pode ou não ter uma montagem do respectivo codão de terminação.

Uma realização correspondente usando pelo menos duas cassetes de expressão (Exp-POI) e (Exp-POI') para a expressão dos polipéptidos de interesse é particularmente 43 ΡΕ2329020 vantajosa, no caso de ser expressa uma molécula de imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma. Assim, é proporcionado um ácido nucleico vector para a expressão de pelo menos uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional, compreendendo uma cassete de expressão (Exp-POI) compreendendo um primeiro polinucleótido codificador da cadeia pesada e/ou leve de uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de pelo menos uma âncora transmembranar de imunoglobulina; e/ou - uma cassete de expressão adicional (Exp-OPI') compreendendo um polinucleótido codificador da cadeia pesada e/ou leve de uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional. A cassete de expressão (Exp-POI') codifica a cadeia de imunoglobulina que corresponde à cadeia de imunoglobulina da cassete de expressão (Exp-POI) (i.e. se a cassete de expressão (Exp-POI) codificar a cadeia pesada, a cassete (Exp-POI') codifica a cadeia leve e vice versa). Assim, uma molécula de imunoglobulina funcional (ou seu fragmento) pode ser expressa a partir do vector.

Prefere-se que a cadeia pesada um ou seu fragmento funcional seja expressa a partir da cassete de expressão (Exp-POI) e é assim até certo grau expressa como um polipéptido de fusão. A correspondente cadeia leve ou 44 ΡΕ2329020 seu fragmento funcional está de acordo com uma realização expressa a partir de uma cassete de expressão (Exp-POI' ) . A referida cassete de expressão (Exp-POI') pode estar situada no mesmo ácido nucleico vector. No entanto, pode também estar situada num ácido nucleico vector separado. No entanto, prefere-se que as cassetes de expressão (Exp-POI) e (Exp-POI') estejam situadas num ácido nucleico vector. É igualmente possivel expressar ambas as cadeias (a cadeia pesada e a correspondente cadeia leve) a partir de uma cassete de expressão. Por exemplo, podem ser expressas como um polipéptido de fusão compreendendo um sinal de auto-processamento ou um local susceptivel a proteases de forma a obter duas cadeias separadas. Também é possivel ser uma construção bicistrónica ou multicistrónica, em que dois ou mais polipéptidos (POI e POI' ) são obtidos a partir de um mRNA que pode compreender e.g., um ou mais locais internos de entrada do ribossoma.

De acordo com uma realização, é proporcionado um ácido nucleico vector que expressa pelo menos uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional, compreendendo uma cassete de expressão (Exp-POI) compreendendo um primeiro polinucleótido codificador da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de pelo menos uma âncora transmembranar de imunoglobulina; e/ou 45 ΡΕ2329020 - uma cassete de expressão adicional (Exp-OPI') compreendendo um polinucleótido codificador da cadeia leve correspondente de uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional.

De preferência, a cassete de expressão (Exp-POI) compreende a cadeia pesada e ambas as cassetes de expressão (Exp-POI) e (Exp-POI') arranjadas na mesma orientação. De preferência, a cassete de expressão (Exp-POI') está localizada 5' relativamente à cassete de expressão (Exp-POI) . Posicionar a cassete de expressão da cadeia leve 5' relativamente à cassete de expressão da cadeia pesada provou ser benéfico no que respeita à taxa de expressão das moléculas de imunoglobulina. De acordo com uma realização, é também desenhado o vector de expressão de forma que a cassete de expressão já inclua a âncora transmembranar de imunoglobulina e pelo menos um codão de terminação não estanque (e.g. incluido numa sequência de preenchimento) e, facultativamente, pelo menos parte das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina. Os fragmentos codificadores das partes variáveis das moléculas de imunoglobulina podem ser então inseridos pelo utiliza-dor/cliente nas cassetes de expressão, usando estratégias de clonagem adequadas, de forma a obter o vector de expressão final.

Exemplos não limitantes de genes para marcas seleccionáveis em mamifero que podem estar incluídos na 46 ΡΕ2329020 cassete de expressão (Exp-MSM) incluem genes de resistência a antibióticos, e.g. que conferem resistência a G418; higromicina (hyg ou hph, vendida pela Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.); neomicina (neo, vendida pela Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.); zeocina (Sh Ble, vendida pela Pharmingen, San Diego Calif.); puromicina (pac, puromicina-N-acetiltransferase, disponível na Clontech, Paio Alto Calif.), oubaína (oua, disponível na Pharmingen); e blasticidina (disponível na Invitrogen). Os referidos genes de marcas seleccionáveis em mamífero permitem a selecção de células hospedeiras de mamífero compreendendo os referidos genes e, consequentemente, as células hospedeiras compreendendo o vector. 0 termo "gene" como aqui usado não só se refere à sequência codificadora do gene selvagem como também se refere à sequência de ácido nucleico codificadora de uma variante funcional da marca seleccionável proporcionando a resistência pretendida. Assim, igualmente versões truncadas ou mutadas de um gene selvagem estão incluídas desde que proporcionem a resistência pretendida. 0 gene da marca seleccionável em mamífero, de preferência, compreende elementos reguladores estranhos tais como, e.g., um promotor constitutivo forte. De acordo com uma realização preferida, a referida cassete de expressão (Exp-MSM) compreende um gene codificador de uma fosfotransferase de neomicina enzimaticamente funcional (I ou II) que, de preferência, compreende elementos reguladores estranhos tais como, e.g., um promotor forte constitutivo como seja o promotor do SV40. Esta realização funciona bem em combinação com o uso de um gene codificador 47 ΡΕ2329020 de uma DHFR enzimaticamente funcional como um gene de marca amplificável e seleccionável em mamífero.

Genes de marcas amplificáveis em mamífero incorporadas na cassete de expressão (Exp-MASM) permitem a selecção de células hospedeiras contendo vector assim como a amplificação de genes. Um exemplo não limitante de um gene de marca amplificável e seleccionável em mamífero é o gene da redutase do di-hidrofolato (DHFR) codificador da enzima DHFR. 0 gene da marca amplificável e seleccionável em mamífero compreende elementos reguladores estranhos tais como, e.g., um promotor constitutivo forte. Outros sistemas normalmente usados são, entre outros, o sistema da sintetase de glutamina (gs) (Bebbington et al., 1992) e o sistema de selecção dirigido pelo histidinol (Hartmann e

Mulligan, 1988). Estas marcas amplificáveis são igualmente seleccionáveis e podem assim ser usadas para seleccionar as células hospedeiras que adquiriram o vector. DHFR e sintetase de glutamina dão bons resultados. Em ambos os casos a selecção ocorre na ausência do metabolito adequado (hipoxantina e timidina no caso de DHFR, glutamina no caso de GS) , prevenindo o crescimento das células não transformadas. Com sistemas amplificáveis tais como o sistema DHFR, a expressão de uma proteína recombinante pode ser aumentada pela exposição das células a determinados agentes que promovem a amplificação de genes tais como e.g., metotrexato (MTX) no caso do sistema DHFR. Por exemplo, pode ser usada a sequência codificadora do gene DHFR selvagem ou de um mutante de DHFR permitindo, e.g., uma 48 ΡΕ2329020 selecção de linhas celulares dhfr+. Um inibidor adequado para GS que promova a amplificação de genes é a metionina sulfoximina (MSX). A exposição a MSX também resulta na amplificação de genes.

De acordo com uma realização, a referida cassete de expressão (Exp-MASM) compreende um gene codificador de uma redutase de di-hidrofolato (DHFR) enzimaticamente funcional que é, preferencialmente, usada conjuntamente com o promotor de SV40.

Assim, são proporcionados ácidos nucleicos vectores em que as cassetes de expressão compreendem pelo menos um elemento promotor e/ou promotor/estimulador. Apesar das fronteiras físicas entre estes dois elementos de controlo nem sempre serem claras, o termo "promotor" geralmente refere-se a um local na molécula de ácido nucleico ao qual uma RNA polimerase e/ou quaisquer factores associados se ligam e onde se inicia a transcrição. Os estimuladores potenciam a actividade do promotor, tanto temporalmente como espacialmente. Muitos promotores são transcricionalmente activos numa larga gama de tipos celulares. Os promotores podem ser divididos em duas classes, os que funcionam constitutivamente e os que são regulados pela indução ou desrepressão. Os promotores usados para elevado nível de produção de proteínas em células de mamífero deverão ser fortes e, de preferência, activos numa larga gama de tipos celulares. Promotores fortes constitutivos que dirigem a expressão em muitos 49 ΡΕ2329020 tipos celulares incluem mas não estão limitados ao

principal promotor tardio de adenovirus, ao promotor precoce imediato de citomegalovirus humano, ao promotor de SV40 ou do virus do Sarcoma de Rous e o promotor da cinase de 3-fosfoglicerato murino, EFla. São conseguidos bons resultados com o vector de expressão do presente invento quando o promotor e/ou o estimulador são obtidos de CMV e/ou de SV40.

De acordo com uma realização, a cassete de expressão para a expressão dos polipéptidos de interesse compreende um promotor e/ou um estimulador mais fortes que os das cassetes de expressão para a expressão das marcas seleccionáveis. Este arranjo tem o efeito de ser gerado mais transcrito do polipéptido de interesse dos que as marcas de selecção. É vantajoso que a produção do polipéptido de interesse que é secretado seja dominante relativamente à produção das marcas de selecção, uma vez que a capacidade das células individuais para a produção de proteínas heterólogas não é ilimitada e deverá ser focada no polipéptido de interesse.

De acordo com uma realização, as cassetes de expressão (Exp-POI) e (Exp-POI') (se presente) que são usadas para a expressão do polipéptido de interesse compreendem um promotor/estimulador de CMV como elementos reguladores. As cassetes de expressão (Exp-MSM) e (Exp-MASM) que, de preferência, expressam DHFR e os genes da marca neomicina, compreendem um promotor de SV40 ou um 50 ΡΕ2329020 promotor/estimulador de SV40. O promotor de CMV é conhecido como sendo um dos promotores mais fortes disponíveis para a expressão em mamífero e conduz a uma taxa de expressão muito boa. É considerado como dando significativamente mais transcritos do que o promotor do SV40. A maioria dos mRNAs nascentes eucarióticos possuem uma cauda poli A no seu extremo 3' que é adicionada durante um processo complexo que envolve o processamento do transcrito primário e uma reacção de poliadenilação acoplada. A cauda poli A é vantajosa para a estabilidade e transporte do mRNA. Assim, as cassetes de expressão do vector de acordo com o presente invento geralmente compreendem um local de poliadenilação. Existem vários sinais poli A eficientes que podem ser usados em vectores de expressão de mamífero, incluindo os derivados da hormona de crescimento bovina (bgh), beta-globina de murganho, a unidade de transcrição precoce do SV40 e o gene da cinase de timidina do vírus herpes simples. No entanto, são igualmente conhecidos locais de poliadenilação sintéticos (ver e.g., o vector de expressão pCI-neo da Promega que se baseia em Levitt ei al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) . O local de poliadenilação pode ser seleccionado do grupo consistindo em local poli A do SV40, como seja o local poli A tardio ou precoce do SV40 (ver, e.g., o plasmídeo pSV2-DHFR como descrito em Subramani et al., 1981, Mol.Cell. Biol. 854-864), um local poli A sintético (ver e.g., o vector pCI-neo da Promega que se baseia em Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) e um local poli A de bgh (hormona de crescimento bovina). ΡΕ2329020

Ainda, as cassetes de expressão podem compreender um local de terminação da transcrição adequado. Isto devido à transcrição continuada a partir de um promotor a montante através de uma segunda unidade de transcrição poder inibir a função do promotor a jusante, um fenómeno conhecido como oclusão do promotor ou interferência transcricional. Este evento foi descrito em procariotas e eucariotas. A colocação correcta dos sinais de terminação da transcrição entre duas unidades de transcrição pode evitar a oclusão do promotor. Os locais de terminação da transcrição estão bem caracterizados e a sua incorporação em vectores de expressão demonstrou-se ter efeitos benéficos na expressão de genes.

As cassetes de expressão podem compreender um estimulador (ver atrás) e/ou um intrão. De acordo com uma realização, a(s) cassete(s) de expressão para a expressão do polipéptido de interesse compreendem um intrão. A maioria dos genes de eucariotas superiores possui intrões que são removidos durante o processamento do RNA. As construções genómicas são expressas mais eficientemente em sistemas transgénicos do que em construções idênticas sem intrões. Geralmente, os intrões são colocados no extremo 5' da grelha de leitura aberta. Assim, um intrão pode estar compreendido numa ou mais cassetes de expressão para a expressão de um ou mais polipéptidos de interesse de forma a aumentar a taxa de expressão. 0 referido intrão pode estar situado entre elementos do promotor e/ou promo- 52 ΡΕ2329020 tor/estimulador e o extremo 5' da grelha de leitura aberta do polipéptido a ser expresso. Assim, é proporcionado um ácido nucleico vector em que pelo menos a cassete de expressão (Exp-POI) compreende um intrão que está arranjado entre o promotor e o codão de iniciação do polinucleótido para expressão do polipéptido de interesse. Na área são conhecidos vários intrões adequados que podem ser usados conjuntamente com o presente invento.

De acordo com uma realização, o intrão usado nas cassetes de expressão para a expressão de polipéptidos de interesse, é um intrão sintético como seja o intrão SIS ou RK. 0 intrão RK é um intrão sintético forte que é, de preferência, colocado antes do codão de iniciação ATG do gene de interesse. 0 intrão RK consiste no local dador de "splicing" do intrão do promotor CMV e no local aceitador de "splicing" da região variável da cadeia pesada de IgG de murganho (ver, e.g., Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378; pode ser obtido a partir do vector pRK-5 (BD PharMingen)).

Surpreendentemente, a colocação de um intrão no extremo 3' da grelha de leitura aberta do gene DHFR tem efeitos vantajosos na taxa de expressão/amplificação da construção. 0 intrão usado na cassete de expressão de DHFR conduz a uma variante mais pequena não funcional do gene DHFR (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). Assim, o nivel de expressão do gene DHFR é reduzido. Isto conduz a um aumento da sensibilidade para MTX e condições 53 ΡΕ2329020 de selecção mais restringentes. Assim, proporciona-se um ácido nucleico vector em que a cassete de expressão (MASM) compreende um intrão que está situado 3' relativamente ao gene da marca amplificável e seleccionável. Um intrão adequado pode ser obtido a partir do vector pSV2-DHFR (ver e.g. atrás) . 0 referido vector pode compreender pelo menos uma cassete de expressão adicional (Exp-PSM) compreendendo um gene de marca seleccionável em procariotas. A referida cassete de expressão (Exp-PSM) pode estar situada entre as cassetes de expressão (Exp-MSM) e (Exp-MASM). A referida marca seleccionável pode proporcionar uma resistência a antibióticos como sejam, e.g., ampicilina, canamicina, tetraciclina e/ou cloranfenicol. A referida cassete de expressão (Exp-PSM) está, de preferência, arranjada na mesma orientação 5' para 3' das outras cassetes de expressão (Exp-POI), (Exp-MSM) e (Exp-MASM).

De acordo com uma realização, a cassete de expressão (Exp-POI) e/ou (Exp-POI') incluida no vector ainda compreende - um polinucleótido (Pn-TAG) codificador de uma marca de afinidade situada a jusante de pelo menos um codão de terminação que está situado a jusante do primeiro polinucleótido e em que o referido polinucleótido (Pn-TAG) está situado a montante do segundo polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina e/ou 54 ΡΕ2329020 - um polinucleótido (Pn-MARKER) codificador de uma marca seleccionável.

As vantagens estão descritas abaixo. 0 ácido nucleico vector pode ser usado na sua forma circular para transfectar a célula hospedeira. As moléculas de vector super-enrolado geralmente serão convertidas em moléculas lineares dentro do núcleo devido à actividade de endonucleases e de exonucleases. No entanto, a linearização do ácido nucleico vector antes da trans-fecção freguentemente melhora a eficiência de uma trans-fecção estável. Isto implica que o ponto de linearização pode ser controlado se o vector for linearizado antes da transfecção.

Assim, de acordo com uma realização do presente invento, o vector de expressão compreende um local de restrição pré-definido, o qual pode ser usado para a linearização do ácido nucleico vector antes da transfecção. A colocação inteligente do referido local de restrição para linearização é importante, devido ao referido local de restrição determinar onde o ácido vector é aber-to/linearizado e assim determina a ordem/arranjo das cassetes de expressão quando a construção é integrada no genoma da célula eucariótica, em particular de mamifero.

Assim, o ácido nucleico vector pode compreender um local de restrição para linearização do vector, em que o 55 ΡΕ2329020 referido local de restrição para linearização está situado entre as cassetes de expressão (Exp-MSM) e (Exp-MASM) . De preferência, o referido local de restrição para linearização é único e está presente apenas uma vez no ácido nucleico vector de expressão. Por exemplo, um local de restrição para linearização pode ser usado de forma a ser reconhecido por uma enzima de restrição tendo uma frequência de corte baixa para assegurar que o vector seja cortado apenas uma vez no local de restrição para linearização mas não (ou apenas raramente) e.g. dentro de uma cassete de expressão ou no esqueleto do vector. Isto pode ser encorajado, e.g., ao proporcionar-se um local de restrição para uma enzima de restrição que tem uma sequência de reconhecimento de mais de seis pares de bases ou que reconhece sequências que estão sub-representadas no DNA cromossómico. Um exemplo adequado é a enzima SwaI e o vector pode portanto incorporar um local SwaI como local de restrição de linearização único. No caso do referido local de restrição para linearização estar presente mais de uma vez na sequência do ácido nucleico vector (incluindo os polinucleótidos codificadores do polipéptido de interesse) ou no caso de se usar uma enzima de restrição que corta várias vezes na sequência de ácido nucleico vector, está igualmente no âmbito do presente invento, e.g., alte-rar/mutar os locais de restrição em excesso relativamente ao local de restrição para linearização que está situado entre as cassetes de expressão (Exp-MSM) e (Exp-MASM) , de forma a eliminar os locais de restrição adicionais e obter um único local de restrição ou um local raro para linearização. 56 ΡΕ2329020

No caso do vector ser usado como vector de expressão padrão destinado, e.g., a ser uma ferramenta para a expressão de vários polipéptidos diferentes, é vantajoso proporcionar um local de restrição para linearização compreendendo múltiplos locais de reconhecimento para enzimas que possuam uma baixa frequência de corte. As enzimas de restrição escolhidas para a linearização, de preferência, não deverão cortar dentro das cassetes de expressão para as marcas seleccionáveis ou noutras sequências esqueleto do vector de forma a assegurar que a enzima corta apenas uma vez para linearização correcta do vector. Ao proporcionar-se um local de restrição para linearização compreendendo múltiplos locais de reconhecimento para as enzimas de restrição tendo uma baixa frequência de corte, o utilizador pode escolher uma enzima de restrição adequada para linearização de entre as múltiplas opções, de forma a evitar em segurança a restrição dentro do polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse. No entanto, como sublinhado atrás, outros locais de restrição podem ser mutados ou pode ser realizada uma digestão parcial. A colocação do local de restrição para linearização entre a cassete de expressão (Exp-MSM) e a cassete de expressão (Exp-MASM) tem o efeito de a cassete de expressão (Exp-POI) (e outras cassetes de expressão para a expressão dos polinucleótidos de interesse - se presentes) ser flanqueada em 5' pela cassete de expressão 57 ΡΕ2329020 (Exp-MASM). A cassete de expressão (Exp-MSM) está situada 3' relativamente à cassete de expressão (Exp-POI) quando da linearização. Assim, as cassetes de expressão (MSM) e (MASM) são separadas quando da linearização do ácido nucleico vector circular. Se uma cassete de expressão (Exp-PSM) e (Exp-MASM) . Isto tem o efeito de o gene da marca de selecção em bactérias estar 3' e portanto "fora" das partes de "mamífero" do ácido nucleico vector linearizado. Este arranjo é favorável uma vez que os genes bacterianos não são presumivelmente vantajosos para a expressão em mamífero uma vez que as sequências bacterianas podem conduzir ao aumento da metilação ou de outros efeitos de silenciamento em células de mamífero. 0 polipéptido de interesse não está limitado a qualquer proteína particular ou grupo de proteínas, mas pode, pelo contrário, ser qualquer proteína, de qualquer tamanho, função ou origem, que se pretenda seleccionar e/ou expressar pelos métodos aqui descritos. Assim, vários polipéptidos de interesse diferentes podem ser expressos/produzidos. 0 termo polipéptido refere-se a uma molécula compreendendo um polímero de aminoácidos ligados uns aos outros através de ligações peptídicas. Os polipéptidos incluem polipéptidos de qualquer tamanho, incluindo proteínas (e.g. tendo mais de 50 aminoácidos) e péptidos (e.g. 2-49 aminoácidos). Os polipéptidos incluem proteínas e/ou péptidos de qualquer actividade ou bioactividade, incluindo e.g. polipéptidos bioactivos tais como proteínas ou péptidos enzimáticos (e.g. proteases, 58 ΡΕ2329020 cinases, fosfatases), proteínas ou péptidos receptores, proteínas ou péptidos transportadores, proteínas bacteri-cidas e/ou de ligação a endotoxinas, proteínas ou péptidos estruturais, polipéptidos imunes, toxinas antibióticos, hormonas, factores de crescimento, vacinas ou similares. 0 referido polipéptido pode ser seleccionado do grupo consistindo em hormonas peptídicas, interleucinas, activadores do plasminogénio tecidular, citocinas, imunoglobulinas, em particular anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou variantes dos mesmos.

Como aqui usado, uma "molécula de imunoglobulina" como exemplo de um polipéptido de interesse refere-se a uma proteína compreendendo um ou mais polipéptidos substancialmente ou parcialmente codificados pelos genes de imunoglobulinas ou fragmentos dos genes de imunoglobulinas, e.g. um fragmento contendo um ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR). Os genes de imunoglobulina conhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como uma miríade de genes da região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são tipicamente classificadas e.g. como capa ou lambda.

As cadeias pesadas são tipicamente classificadas, e.g., como gama, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. A referida imunoglobulina pode ser de qualquer isotipo. Muito frequentemente são produzidas/ne- ΡΕ2329020 cessárias moléculas de IgG (e.g., IgGl) como proteínas terapêuticas. Uma unidade estrutural típica de imunoglo-bulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Na natureza, cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 KD). O extremo N de cada cadeia define uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos essencialmente responsável pelo reconhecimento do antigénio. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leve e pesada, respec-tivamente.

Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como uma série de fragmentos bem caracterizados que podem, e.g., ser produzidos por digestão com várias peptidases. Um fragmento de anticorpo é qualquer fragmento de um anticorpo que compreende pelo menos 20 aminoácidos do referido anticorpo completo, de preferência pelo menos 100 aminoácidos que pelo menos ainda possuem capacidade de ligação ao antigénio. O fragmento de anticorpo pode compreender a região de ligação do anticorpo, como seja um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, multicorpos compreendendo múltiplos domínios de ligação tais como diacorpos, triacorpos ou tetracorpos, anticorpos de cadeia simples ou aficorpos. Uma variante de anticorpo é um derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a mesma função de ligação mas, e.g., uma sequência de aminoácidos alterada. Tal anticorpo e/ou fragmento de anticorpo pode compreender 60 ΡΕ2329020 uma cadeia leve murina, cadeia leve humana, cadeia leve humanizada, cadeia pesada humana e/ou cadeia pesada murina, assim como fragmentos activos ou seus derivados. Assim, pode ser, e.g., murina, humana, quimérica ou humanizada. Ainda que vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, os familiarizados com a área sabem que tais fragmentos Fab' ou F(ab)2 podem ser sintetizados de novo quimicamente ou através da utilização de metodologia de DNA recombinante, apresentação de péptidos, ou similares. Assim, o termo anticorpo, como aqui usado, também inclui fragmentos de anticorpos produzidos através da modificação de anticorpos completos ou sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante. Os anticorpos também incluem anticorpos monoclonais compostos de braços simples, anticorpos de cadeia simples, incluindo anticorpos de cadeia simples Fv(scFv) em que uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável são ligadas uma à outra (directamente ou através de um elemento de ligação peptídico) para formar um polipéptido continuo, assim como diacorpos, tricorpos e tetracorpos (ver, e.g., Pack et ai. J Mol Biol. 1995 Feb 10;246(1):28-34; Pack et al. Biotechnology (NY). 1993 Nov;11(11):1271-7; Pack & Plueckthun Biochemistry. 1992 Feb 18;31(6):1579-84). Os anticorpos são, e.g., policlonais, monoclonais, quiméricos, humanizados, de cadeia simples, fragmentos Fab, Fab de cadeia simples (Hust et al., BMC Biotechnol (2007) 7:14), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab ou similares. 61 ΡΕ2329020

Os polipéptidos produzidos de acordo com o invento podem ser recuperados por métodos conhecidos na área. Por exemplo, o polipéptido pode ser recuperado a partir de meio nutritivo através de procedimentos convencionais incluindo, mas não estando limitado a centrifugação, filtração, ultrafiltração, extracção ou precipitação. A purificação pode ser realizada através de uma variedade de procedimentos conhecidos na área incluindo, mas não estando limitado a cromatografia (e.g. permuta iónica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão pelo tamanho), procedimentos electroforéticos (e.g., focagem isoeléctrica preparativa), solubilidade diferencial (e.g., precipitação com sulfato de amónio) ou extracção. Ainda, o polipéptido pode ser obtido a partir de células hospedeiras por disrupção celular. É igualmente proporcionado um método para a produção de um ácido nucleico vector como descrito atrás compreendendo o passo de montagem de pelo menos uma cassete (Cas-POI), de preferência uma cassete de expressão (Exp-POI), num vector de forma que a referida cassete compreenda um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. 0 referido método pode ainda compreender a montagem 62 ΡΕ2329020 - uma cassete de expressão (Exp-MSM) compreendendo um gene de marca seleccionável para mamífero, - uma cassete de expressão (Exp-MASM) compreendendo um gene de marca seleccionável amplificável para mamífero, de preferência, de forma que a cassete de expressão (Exp-MASM) esteja situada em 5' e a cassete de expressão (Exp-MSM) esteja situada em 3' relativamente à cassete de expressão (Exp-MASM), (Exp-POI)e (Exp-MSM) estão arranjados na mesa orientação 5' para 3'. É igualmente proporcionada uma célula hospedeira eucariótica, de preferência de mamífero, que compreende uma cassete (Cas-POI) compreendendo um polinucleótido hete-rólogo e portanto estranho codificador de um polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do referido polinucleótido heterólogo e um polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. A cassete (Cas-POI) pode ser introduzida e.g. através do ácido nucleico vector de acordo com o presente invento. De preferência, a cassete (CAS-POI) e/ou a cassete (CAS-POI') é uma cassete de expressão.

Outras características da cassete (Cas-POI) e detalhes de vectores adequados estão descritos atrás e também se aplicam à célula hospedeira do presente invento. Células hospedeiras eucarióticas adequadas estão descritas atrás. De preferência, a célula hospedeira eucariótica é ΡΕ2329020 uma célula hospedeira de mamífero. De acordo com uma realização a célula hospedeira eucarióticas não é uma célula B ou um derivado de célula B. Assim, a célula hospedeira eucariótica, de preferência de mamífero é uma célula hospedeira que não expressa naturalmente as cadeias do receptor de Ig alfa e de Ig beta. Ainda, de acordo com uma realização, não ocorre co-expressão artificial da cadeia do receptor Ig alfa e Ig beta na referida célula hospedeira. As células CHO são as células hospedeiras preferidas. É igualmente proporcionado um método para a produção de uma célula hospedeira eucariótica como atrás descrito, em que a célula hospedeira eucariótica é transfectada com o ácido nucleico vector de acordo com o presente invento e/ou um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma cassete (Cas-POI) de acordo com o presente invento. Existem vários métodos adequados conhecidos na área para a introdução de um vector de expressão numa célula hospedeira de mamífero. Os métodos respectivos incluem mas não estão limitados a transfecção com fosfato de cálcio, electroporação, lipofecção, transferência de genes mediada por biolística e por polímeros. Para além de métodos baseados na integração aleatória tradicional, podem ser também usadas abordagens mediadas por recombinação para transferir a cassete (CAS-POI) para o genoma da célula hospedeira. Tais métodos de recombinação podem incluir a utilização de recombinases específicas de sítio como Cre, Flp ou (£>C31 (ver e.g. Oumard 64 ΡΕ2329020 et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108) que pode mediar a inserção dirigia de transgenes. Como alternativa, o mecanismo de recombinação homóloga pode ser usado para inserir a cassete (CAS-POI) (revisto em Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469). A inserção de genes baseada em recombinação permite minimizar o número de elementos a serem incluídos no ácido nucleico heterólogo que é transferido/introduzido na célula hospedeira. Por exemplo, deve ser usado um locus de inserção que já proporcione promotor e local poli A (exógeno ou endógeno) de forma que apenas os elementos restantes (e.g. polinucleótido de interesse, o codão de terminação e o polinucleótido codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina) necessite de ser transferido/transfectado para a célula hospedeira. Mesmo a transferência de partes da cassete (Cas-POI) será suficiente se as partes em falta estiverem no local de inserção. As realizações de um vector de expressão adequado de acordo com o presente invento assim como células hospedeiras adequadas e polipéptidos de interesse estão descritos detalhadamente abaixo; referimo-nos à descrição acima. É igualmente proporcionado um polipéptido obtido através de um método de acordo com o presente invento como definido atrás e nas reivindicações. Tal polipéptido é, de preferência, uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento. Os polipéptidos produzidos de acordo com os métodos do presente invento descrevem boas propriedades de estabilidade. Os resultados também mostram que os polipé- 65 ΡΕ2329020 ptidos são expressos numa forma funcional e portanto na conformação correcta. Assim, o invento proporciona igualmente polipéptidos obtidos através de um método de produção de acordo com o presente invento usando o vector de expressão descrito detalhadamente atrás. Como está descrito atrás, os polipéptidos são obtidos com um bom rendimento devido à inclusão de um passo de selecção/ras-treio. 0 polipéptido é, de preferência, uma molécula de imunoglobulina como seja um anticorpo ou um fragmento do mesmo. 0 invento é ainda ilustrado pelos exemplos não limitantes que se seguem, os quais no entanto, descrevem realizações preferidas do invento.

Exemplos

Exemplo 1: Construção de vectores da versão transmembranar de Ig

Um fragmento de DNA sintético de 1113 pb, codificador de parte da região constante da cadeia pesada de IgGl mais a sequência de preenchimento com o codão de terminação não estanque e o dominio transmembranar e citoplasmático de Ig foram inseridos em pBW201 (um vector padrão contendo uma cadeia pesada e uma cadeia capa leve de IgGl) através de Agel e Ascl gerando pNTll (ver tabela 1) . A sequência nucleotidica do dominio transmembranar de Ig usada está apresentada em SEQ ID N0:1, a sequência de 66 ΡΕ2329020 preenchimento com o codão de terminação não estanque está indicada. Certamente, podem ser igualmente usadas variantes do domínio transmembranar de Ig codificadas de acordo com os princípios do presente invento que proporcionam a mesma função de ancoragem à membrana. As referidas variantes são homólogas do domínio transmembranar de Ig codificado e podem, e.g. ser obtidas através de substituição conservada de aminoácidos. Elas partilham, de preferência, pelo menos 80%, 85%, 90% de homologia. Os polinucleótidos codificadores das respectivas variantes, e.g., hibridam com a sequência mostrada em condições restringentes. O gene da marca de selecção DHFR wt de pNTll e pBW201 pode ser substituído por um fragmento sintético de 1252 pb codificador de um mutante pontual L23P de DHFR através de SwaI e BglII, gerando assim pNT29 e pBW478. O mutante DHFR permite a selecção de linhas celulares dhfr+.

Os vectores FACS (pNTll, pNT29) são baseados nos vectores padrão para a expressão de anticorpos (pBW201, pBW478). pNTl e pBW201 são diferentes de pNT29 e de pBW478 na cassete da marca de selecção DHFR da qual são portadores. No entanto os esqueletos são idênticos. O vector possui uma montagem monocistrónica em "tandem" e possui cassetes de expressão da cadeia leve e da cadeia pesada de anticorpo, ambas dirigidas pelo promotor/estimulador de CMV. A única modificação para gerar os vectores FACS foi a inserção de um domínio transmembranar de IgGl e do domínio citoplasmático 3' o cDNA da cadeia pesada (HC) de anti- 67 ΡΕ2329020 corpo. Uma sequência de preenchimento curta com um sinal de terminação da tradução não estanque é colocada entre HC e o dominio transmembranar. 0 ambiente da sequência seleccio-nada para o codão de terminação espera-se que conduza à tradução para além do codão de terminação até 5% das vezes. Os quatro vectores codificam o mesmo anticorpo IgG humano.

Como descrito atrás, os ácidos nucleicos vectores usados na expressão e, em particular, a orientação e arranjo dos elementos dos vectores permitem uma expressão muito eficiente das moléculas de imunoglobulina. Vectores adequados que podem ser usados conjuntamente com o presente invento e que estão descritos atrás estão ilustrados na tabela que se segue (as setas indicam a orientação 5' para 3' dos elementos genéticos):

Tabela 1: Mapa do vector pNTll - "Vector FACS" CMVprom/est

Intrão RK

mAB-LC SV4 OpoliA- CMVprom/est

Intrão RK

mAB-HC

Sequência de preenchimento + codão de terminação não estanque Domínio transmembranar e domínio citoplasmático de Ig -> 68 ΡΕ2329020

As abreviaturas na Tabela 1 possuem o significado normalmente atribuido, como é aparente para os familiarizados com a área e como descrito atrás e possuem em particular o seguinte significado: CMVprom/est = promotor/estimulador precoce imediato de citomegalovirus humano intrão RK = compreende o local dador de "spli-cing" do intrão do promotor de CMV e o local aceitador de "splicing" da região variável da cadeia pesada de IgG de murganho (ver e.g. Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378; pode ser obtido a partir do vector pRK-5 (BD Pharmingen)) mAB-LC =cadeia leve do anticorpo monoclonal mAB-HC = cadeia pesada do anticorpo monoclonal 69 ΡΕ2329020 SV40poli A = local poli A do SV40 SV40prom/est = promotor/estimulador do SV40 Neo = fosfotransferase de neomicina

PoliA sint = local de poliadenilação sintético

Amp = gene de resistência ao antibiótico beta- lactamase DHFR = gene da redutase do di-hidrofolato

Exemplo 2: Transfecção e selecção de células CHO A cultura, transfecção e rastreio de células foram realizados em frascos de agitação usando células CHO de crescimento em suspensão num meio de cultura comercial quimicamente definido, As células são transfectadas por lipofecção ou por electroporação (nucleofecção) seguindo as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção foi testada através da transfecção de um plasmideo repórter com GFP (proteina fluorescente verde) seguindo as instruções do fabricante e análise de citometria de fluxo das células transfectads. Dependendo da viabilidade celular, a selecção é iniciada 24-48 h após a transfecção através da adição às células de meio selectivo contendo G418. Logo que as células recuperam a viabilidade para mais de 80%, aplica-se um segundo passo de selecção através da passagem das células em meio sem G418 contendo MTX (metotrexato) . Após 70 ΡΕ2329020 recuperação das células da selecção MTX, a cultura continuou em meio contendo MTX através de ciclos de enriquecimento FACS, clonagem por FACS ou clonagem por diluição limite e rastreio. A viabilidade celular e o crescimento foram monitorizados usando um sistema automático (ViCell, Beckmann Coulter).

Exemplo 3: Análise FACS, enriquecimento e clonagem de células

Marcação de células: 2 x 107 células por lote transfectado foram centrifugadas e lavadas com 5 ml de PBS (soro fisiológico tamponado com fosfatos) e ressuspensas em 1 ml de PBS frio. Uma quantidade adequada de anticorpo anti-IgG marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceina) foi adicionada às células que foram incubadas em gelo, durante 30 minutos, no escuro. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes à temperatura ambiente com 5 ml de PBS, ressuspensas em 1 ml de PBS, filtradas e colocadas num tubo FACS para análise, separação e clonagem.

Análise, separação e clonagem de células: A separação de células foi realizada com um FACSAria (Becton Dickinson) equipado com uma Unidade de Deposição Automática de Células (ACDU) usando o programa FACSDiva. Um laser de baixa potência arrefecido com ar e de estado sólido (estado sólido Coherent® Sapphire™) ajustado para 488 nm foi usado 71 ΡΕ2329020 para excitar corantes de fluoresceína ligados ao anticorpo secundário. A intensidade relativa da fluorescência de FITC foi medida num detector E através de um filtro 530/30 BP. Cinco por cento das células mais fluorescentes para FITC foram canalizadas e separadas em bloco ou como células isoladas em placas de 96 alvéolos.

Exemplo 4: Determinação da produtividade e estabilidade clonal A produtividade dos clones foi analisada em experiências de bloco ("batch") e de bloco alimentado usando diferentes formatos. O rastreio inicial de clones foi realizado em ensaios de bloco em placas de 24 alvéolos através da sementeira das células em placas de 24 alvéolos com agitação. As concentrações de anticorpos no sobrena-dante da cultura celular foram determinadas por proteína A-HPLC 10 dias após o início da cultura. Os clones com produção mais elevada foram igualmente analisados em modelos de frasco de agitação em bloco e no modo de bloco alimentado. As culturas em bloco foram semeadas em frascos de agitação de 50 0 ml com 100 ml de volume de trabalho e foram cultivadas num câmara com agitação (não humidificada) a 150 rpm e 10% C02. A viabilidade das células deverá ser >90% quando se começa o ensaio. A densidade da cultura semeada foi de 2 x 105 c/ml. A determinação da concentração do produto/número de células/viabilidade decorreu nos dias 3-7, 10 e 13. Foram realizadas experiências em bloco alimentado usando as mesmas condições mas com uma densidade de células de partida de 4 x 105 c/ml e com adição regular 72 ΡΕ2329020 de nutrientes. A estabilidade clonal foi avaliada através da cultura das células ao longo de um periodo de 14 semanas com medições de produtividade usando o modelo de bloco em frasco de agitação cada duas semanas.

Exemplo 5: Análise das células transitoriamente transfectadas

Para testar se os produtos de tradução ligados à membrana estão presentes na superficie celular após transfecção com o novo vector FACS (aqui pNTll ou pNT29), as células transitoriamente transfectadas foram analisadas por imunocoloração e citometria de fluxo. 48 horas após transfecção, as células foram coradas com um anticorpo marcado com FITC dirigido contra IgG humanas. As células transfectadas com um vector de expressão foram usadas como controlo da transfecção, a eficiência da transfecção foi calculada como sendo cerca de 60%. As células não transfectadas com o vector padrão (não compreendendo um dominio transmembranar) não apresentam niveis significativos de anticorpo associado à superficie, enquanto 16% das células transfectadas com o vector FACS foram coradas acima no nivel de fundo. Isto mostra que o péptido de fusão, aqui uma molécula de anticorpo, ancorada à membrana celular pode ser detectado na superficie celular.

Exemplo 6: Análise e enriquecimento de células transfectadas estáveis

Tendo mostrado a presença de anticorpo ligado à 73 ΡΕ2329020 membrana em células transfectadas transitoriamente, foi analisado o nivel de expressão na superfície e a distribuição em lotes seleccionados de células transfectadas. Assim, pôde-se mostrar que as células produtoras podem ser selectivamente enriquecidas através da separação por FACS. Assim, as células após transfecção foram seleccionadas com G418 e subsequentemente com MTX. os lotes resultantes de células resistentes foram corados com anticorpo anti-IgG marcado com FITC e analisados por citometria de fluxo. Como controlo, células não transfectadas foram coradas e analisadas. Sub-populações de células positivas foram detectadas nos lotes seleccionados transfectados com o vector FACS. A distribuição de células positivas diferiu assim entre os dois lotes analisados. Para avaliar se células altamente produtoras podem ser enriquecidas com base no seu sinal de fluorescência ( e portanto permitindo uma selecção quantitativa) , as células tendo a intensidade de fluorescência mais elevada (5% mais coradas) foram separadas de cada um dos lotes e subcultivadas para comparar a produtividade com o lote antes do enriquecimento .

Exemplo 7: Análise da produtividade de células enriquecidas e não enriquecidas

As análises de produtividade dos lotes seleccionados, antes e após o enriquecimento por citometria de fluxo, foram feitas em culturas em bloco em frascos de agitação para comparar a concentração do produto final no 74 ΡΕ2329020 dia 13. No dia 13, o sobrenadante foi colhido e analisado relativamente ao teor de IgG por Proteína-A-HPLC. Ambos os lotes mostraram um aumento significativo do nivel de produção já após realização de um ciclo de enriquecimento por FACS, de acordo com os ensinamentos do presente invento. Ainda que a concentração do produto do lote 1 tenha aumentado por um factor de aproximadamente 2, o lote 2 aumentou por um factor de quase 10 permitindo que células altamente produtoras fossem selectivamente detectadas durante a coloração e separação. Já no primeiro ciclo de enriquecimento foram obtidas concentrações de anticorpo de quase 250 mg/ml.

Exemplo 8: Citometria de fluxo baseada na clonagem selectiva de células altamente produtoras A citometria de fluxo pode ser usada para separar e semear células individuais coradas de acordo com o seu perfil de coloração. Para analisar se tal clonagem selectiva resulta num maior número de clones altamente produtores do que a clonagem por diluição limite, foram gerados clones usando ambos os métodos e a produtividade foi analisada em culturas em placas de 24 alvéolos. Foram feitas culturas em bloco em placas de 24 alvéolos e no dia 10 os sobrenadantes foram colhidos e medidos relativamente ao teor de IgG por Proteína A-HPLC. Os resultados são como se segue: 75 ΡΕ2329020

Tabela 2: Separação por FACS versus diluição limite (DL) Método 0-25 mg/1 26-50 mg/1 51-75 mg/1 76-100 mg/1 101-125 mg/1 126-150 mg/1 LD-clones obtidos 12 0 1 0 1 0 í£CS-clcnes obtidos 2 2 2 2 0 1

Os clones derivados da citometria de fluxo tinham uma produtividade média maior comparativamente com os clones derivados da diluição limite, a qual também se reflectiu na distribuição clonal da gama de produtividade.

Exemplo 9: Comparação de vector FACS e padrão

Para confirmar o efeito benéfico do enriquecimento por citometria de fluxo das células transfectadas e para comparar o uso do vector FACS (pNT2 9) com um vector padrão, as células foram transfectadas e seleccionadas com G418 e MTX. Três lotes de células transfectadas com o vector FACS (amostras 1, 2 e 3) e três lotes de células transfectadas com o vector convencional (amostras 7,9 e 9) foram analisados por citometria de fluxo e 5% tendo o sinal de coloração mais elevado foram separados. Foram realizadas culturas em bloco em frascos de agitação para comparar o aumento da concentração do produto após enriquecimento. Os lotes transfectados e seleccionados foram corados e separados por citometria de fluxo para enriquecimento nos 5% mais produtores com base na intensidade de fluorescência. Antes e após enriquecimento, foram feitas culturas em bloco em frascos de agitação e, após 13 dias, os sobrenadantes foram analisados por Proteína A-HPLC. Os resultados são os seguintes (aproximadamente): 76 ΡΕ2329020

Tabela 3: Resultados obtidos com o vector FACS

Amostra Corifrpr^riç^o do predito Amostra Cbnoentragão do produto Amostra Cbnoentragão do produto Amostra 1; 10 mg/ml Amostra 2; 40 mg/ml Amostra 3; 15 mg/ml Vector EACS, Vector EACS, Vector EACS, antes do antes do antes do enriquecirmento enriquecirmento enriquecirmento Amostra 1; 55 mg/ml Amostra 2; 65 mg/ml Amostra 3; 95 mg/ml Vector EACS, 1° Vector EACS, 1° Vector EACS, 1° enriquecimento enriquecimento enriquecimento Amostra 1; 100 mg/ml Amostra 2; 90 mg/ml Amostra 3; 155 mg/ml Vector FPCS, 2° Vector EACS, 2o Vector EACS, 1° enriquecimento enriquecimento enriquecimento Amostra 1; 365 mg/ml Amostra 2; 340 mg/ml Amostra 3; 855 mg/ml Vector FACS, 3° Vector EACS, 3o Vector EACS, 3o enriquecimento enriquecimento enriquecimento

Tabela 4: Resultados obtidos com o vector padrão

Amostra Cbnoentragão do produto Amostra Cbnoentragão do produto Amostra Cbnoentragão do produto Amostra 7; 40 mg/ml Amostra 8; 5 mg/ml Amostra 9; 5 mg/ml Vector padrão, Vector padrão, Vector padrão. antes do antes do antes do enriquecirmento enriquecirmento enriquecirmento Amostra 7; 55 mg/ml Amostra 8; 10 mg/ml Amostra 9; 2 mg/ml Vector padrão, 1° Vector padrão, 1° Vector padrão, 1° enriquecimento enriquecimento enriquecimento Amostra 7; 50 mg/ml Amostra 8; 12 mg/ml Amostra 9; 10 mg/ml Vector EACS, 2o Vector EACS, 2o Vector EACS, 1° enriquecimento enriquecimento enriquecimento Amostra 7; 25 mg/ml Amostra 8; 15 mg/ml Amostra 9; 10 mg/ml Vector padrão, 3o Vector padrão, 3° Vector padrão, 3o enriquecimento enriquecimento enriquecimento 77 ΡΕ2329020

Como demonstrado pelos resultados, o nível de produção das células transfectadas com o vector FACS aumentou significativamente para os três lotes testados, enquanto no caso do vector padrão apenas um lote apresentou um aumento significativo na concentração do produto. A média das concentrações do produto após enriquecimento com o vector FACS é significativamente superior à do vector padrão. Foram feitos dois ciclos adicionais de enriquecimento sequencial por FACS para enriquecimento em células altamente produtoras, mostrando que apenas no caso do vector FACS a produtividade das populações de células foi aumentada. Finalmente, as concentrações de produto puderam ser aumentadas em 4 a 20 vezes.

Para comparação da adequabilidade de ambos os vectores para a clonagem selectiva, os clones de lotes não enriquecidos com produtividade comparável foram selectiva-mente separados por citometria de fluxo. Subsequentemente, a produtividade dos clones foi analisada em culturas em bloco de 24 alvéolos. Encontrou-se que os clones derivados dos lotes transfectados com o vector FACS possuíam um nível de expressão média mais alto relativamente aos clones dos lotes transfectados com o vector padrão. A distribuição clonal da produtividade mostrou que no caso do vector FACS é obtido um número mais elevado de clones produtores bons (ver Tabela 5): 78 ΡΕ2329020

Tabela 5: Vector padrão versus vector FACS (pNT29) Métcdo 0-50 mg/1 51-100 mg/1 101-150 mg/1 151-200 mg/1 201-250 mg/1 251-300 mg/1 301-350 mg/1 Vector padrão 31 7 0 2 0 1 0 Vector ESCs 21 20 4 4 4 2 1

Exemplo 10: Outras comparações entre o vector FACS e vectores de expressão padrão a) Construção do vector

Os vectores pBW201, pNTll, pBW478 e pNT29 foram obtidos como descrito no exemplo 1. b) Transfecção, selecção e clonagem de células

CHO

Isto foi efectuado como descrito no exemplo 2. c) Análise FACS, enriquecimento e clonagem de células

Isto foi efectuado como descrito no exemplo 3. d) Determinação da produção de anticorpos e estabilidade clonar A produtividade dos clones e lotes foi analisada 79 ΡΕ2329020 em experiências de blocos e blocos alimentados usando diferentes formatos. Os lotes antes e após enriquecimento por FACS foram analisados em ensaios de bloco em frascos de agitação através da sementeira de 1 x 105 células por ml (c/ml) em 50 ml de volume de trabalho usando frascos de agitação com 250 ml de capacidade. O teor de IgG foi analisado por Proteina-A HPLC a partir de amostras colhidas no dia 13 da cultura em bloco. O rastreio inicial de clones foi efectuado em ensaios de bloco em placas de 24 alvéolos através da sementeira das células em placas de 24 alvéolos com agitação. As concentrações de anticorpos no sobrena-dante de cultura foram determinadas por Proteína A-HPLC quantitativa 10 dias após o início da cultura. Os clones com produção mais elevada foram analisados em modelos de frascos de agitação em bloco e no modo de bloco alimentado. As culturas em bloco foram semeadas em frascos de agitação (capacidade 500 ml) com 100 ml de volume de trabalho e foram cultivadas numa câmara de agitação (não humidificada) a 150 rpm, 36,5°C e 10% CO2. A viabilidade celular era >90% quando se iniciou o ensaio. A densidade celular de sementeira foi de 2 x 105 c/ml. As concentrações de anticorpos, número de células e viabilidade foram determinados nos dias 3-7, 10 e 13. As experiências de bloco alimentado foram feitas usando as mesmas condições mas com um tempo de corrida de 17 dias e com uma densidade celular de partida de 4 x 105 c/ml e com a adição regular de nutrientes começando em densidades de células viáveis acima de 7 x 106 c/ml. A estabilidade clonal foi avaliada através da cultura das células ao longo de um período de 12 80 ΡΕ2329020 semanas com medições de produtividade usando o modelo de bloco em frasco de agitação cada duas semanas. e) Análise e enriquecimento de células trans-fectadas estáveis A expressão na superfície em populações de células estavelmente transfectadas foi analisada para testar se as células produtoras podem ser selectivamente enriquecidas através da separação por FACS. Assim, as células após transfecção foram seleccionadas com G418 e subsequentemente com MTX. Os lotes resultantes (10 por vector) de células resistentes foram corados como descrito atrás e analisados por citometria de fluxo. Com o protocolo de coloração usado puderam ser detectadas subpopulações de células em lotes de células transfectadas com pBW478 e com pNT29. Como esperado, encontrou-se uma proporção maior de células positivas por FACS com o vector FACS.

Para mostrar que as células altamente produtoras podem ser enriquecidas com base no seu sinal de fluorescência, as células com a intensidade de fluorescência mais elevada foram separadas (5% mais elevadas) a partir de lotes de células individuais e subcultivadas para comparar a produtividade com o lote antes do enriquecimento. Um segundo ciclo de enriquecimentos foi realizado após expansão e reunião das populações de células separadas uma vez. A percentagem de células positivas por coloração, 81 ΡΕ2329020 surpreendentemente, aumentou principalmente com o vector padrão no primeiro ciclo de enriquecimento. Os lotes transfectados com o vector FACS mostraram factores de enriquecimento semelhantes com o protocolo de coloração usado e, de um modo geral, foi observada variação significativa de lote para lote. Após o segundo ciclo de enriquecimento, foram obtidas populações homogéneas de células positivas por FACS (Ver Tabela 6a e 6b).

Tabela 6a: Análise por FACSS das células coradas antes e após ciclos de enriquecimento por FACS % de células acima da pBW478 (vector referência) pNT29 (vector íACS) coloração de fundo FI1C San ESCS 1XEACS 2XESCS San EACS IX ESCS 2XEACS AVG 5,9 83,2 90,4 14,2 46,6 90,5 STDD 3,396403 15,80158 1,126795 8,974284 13,51148 1,422439

Tabela 6a: Lotes de células transfectadas e seleccionadas foram coradas para IgG de superfície. É apresentada a percentagem média de células coradas acima do nível das células não transfectadas. Antes do enriquecimento encontrou-se uma percentagem mais elevada de células positivas com o vector FACS. Após o primeiro ciclo de enriquecimento dos 5% mais corados, a proporção de células positivas por coloração foi mais elevada com o vector padrão. Após o segundo ciclo de enriquecimento, mais de 90% de todas as células eram positivas com ambas as abordagens. Abreviaturas: AVG: Média e STDD: desvio padrão. ΡΕ2329020

Tabela 6b: Produtividades do modelo de bloco em frasco de agitação antes e após ciclos de enriquecimento por FACS mAb (mg/1) pE5í478 (vector referência) pNT29 (vector FACS) San FACS 1XF.ACS 2XFACS San EA.CS IX FACS 2XEACS AVG 38,5 123,4 68,3 46,5 171,8 363 STDD 17,66509 101,8563 6,592926 15,30614 114,1936 70,19259

Tabela 6b: A produtividade dos lotes de células foi analisada a partir de culturas de bloco em frascos de agitação através de Proteína-A HPLC no dia 13 da cultura. O primeiro ciclo de enriquecimento conduziu a um aumento significativo da produtividade em ambos os casos. Após o segundo enriquecimento, apenas as células transfectadas com o vector FACS mostraram aumento adicional na produtividade. f) Análise da produtividade de células enriquecidas e não enriquecidas A análise de produtividade dos lotes seleccio-nados antes e após enriquecimento por citometria de fluxo foi realizada em culturas de bloco em frascos de agitação para comparar os titulos limites no dia 13. A produtividade dos lotes antes do enriquecimento situa-se numa gama muito comparável para ambos os vectores usados. Com o primeiro ciclo de enriquecimento dos lotes individuais foi conseguida uma melhoria significativa da produtividade média com todas as abordagens e novamente, existe uma variação substancial entre lotes individuais (ver Tabela 6b) . Surpreendentemente, a produtividade dos lotes transfectados com vector padrão não é superior comparativamente aos ΡΕ2329020 transfectados com o vector FACS ainda que um nível muito mais elevado de células positivas coradas por FACS fosse observado anteriormente. Através da separação uma segunda vez a partir das populações de células separadas e reunidas, não se conseguiu melhoria da produtividade com o vector padrão. Pelo contrário, foi obtida uma produtividade mais baixa apesar do resultado de coloração por FACS sugerisse que quase 100% das células deveria estar a produzir anticorpo (Ver Tabela 6a).A produtividade dos lotes transfectados com o vector FACS poderá ser significativamente melhorada através de uma segunda separação. O procedimento FACS usado conduziu a enriquecimento mais selectivo de células altamente produtoras com um aumento da produtividade de aproximadamente pelo menos 8 vezes comparativamente com a população não separada e pelo menos 2 vezes comparativamente com os lotes após uma separação. g) Citometria de fluxo baseada na clonagem selec-tlva de células altamente produtoras A citometria de fluxo pode ser usada para separar e semear células coradas individuais de acordo com o seu perfil de coloração. Para analisar se tal clonagem selec-tiva resulta num número maior de clones altamente produtores quando se usa o vector FACS comparativamente com o vector padrão, foram gerados clones usando ambos os métodos e a produtividade foi analisada em culturas de bloco em placas de 24 alvéolos.

Num primeiro ciclo, as células foram directamente 84 ΡΕ2329020 clonadas por FACS a partir de lotes de células seleccio-nadas com MTX sem qualquer passo de pré-enriquecimento. Foram escolhidos três lotes por vector com base no seu perfil de coloração. Foram gerados clones a partir dos 5% com maior intensidade dos lotes de células coradas e no total cerca de 500 clones foram analisados. Ainda que a produtividade média dos clones com o vector de referência fosse de 39 mg/1, os clones com o vector FACS produziram uma média de 87 mg/1. Como se mostra na Tabela 7a, isto é também reflectido na distribuição clonal que confirma que uma proporção muito maior de clones altamente produtores é obtida com o vector FACS. É interessante que um de entre 270 clones analisados derivados da transfecção com o vector padrão tinha uma produtividade quase 2 vezes superior comparativamente aos outros. Este clone excepcional foi designado LP. A identificação de tal clone de células altamente produtoras com o vector padrão em combinação com o procedimento de rastreio por FACS é assim, de um modo geral, possivel. No entanto, é um evento muito raro e portanto muito dependente da sorte. Esta é também a diferença decisiva para o processo de selecção de acordo com os ensinamentos do presente invento. Ainda que o padrão permita a selecção de produtores (muito) elevados apenas em casos excepcionais, e portanto raros, o método de acordo com o presente invento permite a selecção de produtores (muito) elevados de forma reprodutível e portanto fiável.

Desta vez

Uma segunda experiência de clonagem por FACS foi realizada partindo de 10 populações reunidas por vector após o primeiro ciclo de enriquecimento. ΡΕ2329020 aproximadamente 240 clones foram testados em culturas em bloco de 24 alvéolos. Novamente, os clones obtidos com o vector FACS tinham uma produtividade média superior relativamente ao vector padrão de referência. Não foi conseguida qualquer melhoria comparativamente com a clona-gem sem pré-enriquecimento com o vector de referência com uma produtividade média do clone de 40 mg/1. O clone LP não foi novamente identificado. No caso dos clones trans-fectados com o vector FACS, uma produtividade média de 275 mg/1 foi obtida com o método FACS usado. A distribuição clonal claramente demonstra a superioridade do sistema vector FACS relativamente à clonagem selectiva de altos produtores (ver Tabela 7b).

Tabela 7a e 7b: Comparação da produtividade dos clones

Tabela 7a: Distribuição clonal: lotes em 24 alvéolos pBW4 7 8 pNT2 9 0-50 mg/1 196 163 51-100 mg/1 70 22 101-150 mg/1 8 11 151-200 mg/1 2 5 201-250 mg/1 0 13 251-300 mg/1 2 9 301-350 mg/1 1 10 351-400 mg/1 1 6 401-450 mg/1 0 5 451-500 mg/1 0 2 501-550 mg/1 0 1 551-600 mg/1 1 0 ΡΕ2329020

Tabela 7a: Foram gerados clones através de citometria de fluxo a partir dos 5% dos três lotes com a percentagem mais elevada de coloração das células coradas positivamente após selecção. Para avaliação da produtividade, foram feitas culturas de lotes em placas de 24 alvéolos e no dia 10 os sobrenadantes foram colhidos e medido o teor de IgG por Proteina-A-HPLC. É aqui apresentada a distribuição clonal da gama de produtividade. Uma proporção significativamente superior de clones altamente produtores foi obtida quando se usou o vector FACS (pNT29).

Tabela 7b: lotes reunidos após clonagem FACS: lotes em 24 alvéolos pBW478 pNT2 9 0-50 mg/1 102 22 51-100 mg/1 17 2 101-150 mg/1 13 5 151-200 mg/1 5 3 201-250 mg/1 2 7 251-300 mg/1 0 11 301-350 mg/1 0 11 351-400 mg/1 0 15 401-450 mg/1 0 9 451-500 mg/1 0 7 501-550 mg/1 0 7 551-600 mg/1 1 1 601-650 mg/1 0 3 87 ΡΕ2329020

Tabela 7b: Foram analisados clones obtidos por clonagem FACS a partir dos 5% mais intensos de entre os lotes combinados e corados após um ciclo de enriquecimento. Não se observou benefício no pré-enriquecimento para as células transfectadas com o vector referência (pBW478), enquanto no caso das células transfectadas com o vector FACS (pNT29), o pré-enriquecimento conduziu a uma redução significativa de não produtores e a um aumento da produtividade média dos clones. h) Caracterização dos clones 0 clone LP derivado do vector padrão, assim como 10 clones altamente produtores do vector FACS foram expandidos para frascos de agitação e testados em bloco em frascos de agitação genéricos e em modelos de bloco alimentado para avaliar o seu potencial de fabrico. A produtividade das culturas em bloco encontrou-se ser aproximadamente a mesma na gama de 1 g/1 para todos os clones testados. As produtividades em bloco alimentado foram também muito comparáveis para todos os clones e na gama de 3,5-4 g/1 (ver tabela 8). Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de crescimento quando da comparação dos clones transfectados com o vector FACS com os clones transfectados com o vector padrão (LP e clones de experiências anteriores). Igualmente, encontrou-se que a estabilidade da produção é elevada para os clones derivados do vector FACS, apenas um de 10 clones analisados 88 ΡΕ2329020 mostrou uma queda da produtividade superior a 25% após 12 semanas em cultura, o que é uma proporção mais baixa de clones instáveis tal como foi observado com o vector padrão em experiências anteriores (dados não apresentados).

Tabela 8: Produtividades dos lotes: modelo de fasco com agitação em bloco alimentado (SF) mAb (g/1) Bloco SF Bloco Sf alimentado 1= LP 1,1 4,3 2 0, 9 3,7 3 1,0 3,9 4 1,0 3, 8 5 1,0 00 00 6 1,0 3,9 7 1,2 3,3 8 1,0 00 00 9 0,9 3, 6 10 1,0 3,7 11 0,9 3, 3

Tabela 8: 0 clone com produção mais elevada obtido com o vector padrão (pBW478) e 10 clones derivados do vector FACS (pNT29) foram analisados em culturas de frascos de aqitação em bloco e bloco alimentado. 0 teor de IgG foi analisado por Proteina A-HPLC no dia 13 (culturas de bloco) ou no dia 17 (culturas de bloco alimentado) . Todos os clones analisados produziram numa gama comparável. 89 ΡΕ2329020

Exemplo 11: Produção em larga escala de poli-péptidos usando células CHO transfectadas A produção de polipéptidos em larga escala pode ser feita, por exemplo, em biorreactores ondulados de vidro ou de aço inoxidável. Para tal, as células foram expandidas, geralmente partindo de uma única ampola congelada, por exemplo uma ampola de um Banco de Células Principal. As células foram descongeladas e expandidas em vários passos. Biorreactores de diferentes escalas foram inoculados com quantidades adequadas de células. A densidade celular pode ser aumentada pela adição de soluções de nutrientes e aditivos ao biorreactor. As células foram mantidas com uma viabilidade elevada durante um tempo prolongado. As concentrações de produto conseguidas no reactor variaram entre algumas centenas de miligrama por litro e várias gramas por litro em larga escala. A purificação pode ser feita através de metodologia de cromatografia convencional, a qual pode incluir passos de cromatografia de afinidade, permuta iónica, interacção hidrofóbica ou exclusão por tamanho. 0 tamanho do bio-reactor pode ser até vários milhares de litros de volume na escala final (ver também, e.g. F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Novartis AG <120> Sistema de expressão

<130> 50 858 K <150> EP08163161.6 <151> 2008-08-28 90 ΡΕ2329020 < 16 0 > 7 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 219 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência de polinucleótido de um domínio transmembranar de IgGl humana incluindo sequência de preenchimento <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Sequência de preenchimento incluindo codão de terminação <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Codão de terminação <22 0> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> Codão adicional para mediar o não estancamento do codão de terminação a montante <400> 1 tgactagagc tgcaactgga ggagagctgt gcggaggegc aggacgggga gctggacggg 6Ô ctgJEggacga ccatcaccat cttcatcaca ctcttcctgt tiagtgtgtg ctacagtscc 120

accgtcacct tcttoaggt ptôgtggatc ttctcctcgg tggtggacct gaagcagacc ISO atcatccccg actacaggaa catgatcgga cagggggcc 21$

<210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência polipeptídica de uma região transmembranar putativa derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana <400> 2

Leu Trp Thr Thr i1« Thr xle Phe ιΊ* Thr leu fhe Leu Leu Ser vai I 5 1Ô 15

Cys Tyr ser Ala Thr vai thr Phe Phe 20 2:5 91 ΡΕ2329020

<210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência polipeptidica de uma região transmembranar derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana compreendendo os aminoácidos derivados do codão de terminação e do codão adjacente, uma região de ligação e uma região transmembranar putativa <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> aminoácidos que com maior probabilidade são usados no codão de terminação TGA e no codão a jusante no caso de ignorância do codão de terminação <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(20) <223> Região de ligação putativa derivada do domínio transmembranar de IgGl humana <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(45) <223> Região transmembranar putativa derivada do domínio transmembranar de IgGl humana - a referida região pode também considerada como compreendendo os dois aminoácidos seguintes <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(73) <223> Região citoplasmática putativa derivada de IgGl humana - os dois primeiros aminoácidos podem também ser considerados como pertencentes ao domínio transmembranar <400> 3 Trp teu Glu teu teu Glu Glu i 5

Glu teu Asp Gly teu Trp Tt»r fhr 20 teu teu ser vai cys Tyr ser a1« 31 40 rrp ile phe ser ser vai vai Asp 50 S$ ser 3* Ala Glu Ala m n ASP 15 6ly Ile fhr 11« Ahe ile Thr teu Phe 25 * 30> Tfer vai Thr Phe ehe tjrs Vãl tys 45 teu tys Gin Thr ile ile ΡΓΟ Asp m

Ala

Tvr Ara Asn mt lie Qly Gin Gly el ?o 92 ΡΕ2329020

<210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> região citoplasmática derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana <400> 4 iyf vai tys Trp ile Pite Ser Ser Vai vai Asp teu tys Glo Thr ile 1 5 10 15 lie pro asp Tyr Aro aso «et ll* 61 y 61 o 61 y Ala 20 25

<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> região de ligação derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana <400> 5 6¾ Gin: teu Glu ser çys Ala Glit Ala Gin Asp sly Glu te** i 5 IO 15 ÃSp 6ly

<210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> região citoplasmática derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana <400> 6 tys rrp lie phet ser ser vai vai Asp ua tys gIb Ttir lie lie Prc* 1 5 10 15

Asp Tyr Arg Aso Het lie 61y 6lo 6ly Ala 20 25 <210> 7 <211> 27 93 ΡΕ2329020

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência polipeptidica de uma região transmembranar utativa derivada de um domínio transmembranar de IgGl humana <400> 7

Ley irp Thr Thr 11« Thr Ite lis Thr usm Pi t« teu tev Ser vai 1 S 10 iS cys Tyr mt Ala m Thr vai Thr Phi Lys vai " ' 2S Lisboa, 11 de junho de 2013

Claims

ΡΕ2329020 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica que expressa um nivel pretendido de um polipéptido de interesse, compreendendo: a) obtenção de uma pluralidade de células hospedeiras eucarióticas compreendendo um ácido nucleico hete-rólogo compreendendo pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do primeiro codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina; b) cultura das células eucarióticas hospedeiras para permitir a expressão do polipéptido de interesse, de forma que pelo menos uma porção do polipéptido de interesse seja expressa como um polipéptido de fusão compreendendo a âncora transmembranar de imunoglobulina ou uma sua variante funcional, em que o referido polipéptido de fusão é apresentado na superficie da referida célula hospedeira; c) selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica baseada na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superficie da célula. 2 ΡΕ2329020
2. Um método para a produção de um polipéptido de interesse com elevado rendimento, o método compreendendo : a) obtenção de uma pluralidade de células hospedeiras eucarióticas compreendendo um ácido nucleico hete-rólogo compreendendo pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do primeiro codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina; b) cultura das células eucarióticas hospedeiras para permitir a expressão do polipéptido de interesse, de forma que pelo menos uma porção do polipéptido de interesse seja expressa como um polipéptido de fusão compreendendo a âncora transmembranar de imunoglobulina ou uma sua variante funcional, em que o referido polipéptido de fusão é apresentado na superfície da referida célula hospedeira; c) selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica baseada na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superfície da célula; d) cultura da célula hospedeira eucariótica seleccionada em meio de cultura em condições que permitam a expressão do polipéptido de interesse. 3 ΡΕ2329020 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a expressão da cassete (Cas-POI) resulta num transcrito compreendendo pelo menos - um primeiro polinucleótido, em que a tradução do referido primeiro polinucleótido resulta no polipéptido de interesse; - pelo menos um codão de terminação a jusante do referido primeiro polinucleótido; - um segundo polinucleótido a jusante do referido codão de terminação, em que a tradução do referido segundo polinucleótido resulta na âncora transmembranar de imunoglobulina, em que pelo menos uma porção do transcrito é traduzida num polipéptido de fusão compreendendo a âncora transmembranar de imunoglobulina, ou uma sua variante funcional, através da transleitura de pelo menos um codão de terminação. 4. 0 método de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 3, em que a âncora transmembranar de imunoglobulina é seleccionada do grupo consistindo em a) uma âncora transmembranar derivada de IgA, IgE, IgM, IgG e/ou IgD, b) uma âncora transmembranar de imunoglobulina compreendendo um domínio citoplasmático e c) uma âncora transmembranar de imunoglobulina 4 ΡΕ2329020 compreendendo uma sequência como se mostra em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 7.
5. O método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que o passo c) compreende o contacto de uma pluralidade de células hospedeiras eucarióticas com um composto de detecção que se liga ao polipéptido de fusão e selecção de pelo menos uma célula hospedeira eucariótica com base na presença ou quantidade do composto de detecção ligado. 6. 0 método de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 5, em que os resultados da transleitura dos codões de paragem resultam em aproximadamente <50%, <25%, <15%, <10%, <5%, <2,5%, <1,5%, <1% ou inferior a <0,5% do polipéptido de fusão.
7. O método de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 6, em que são realizados dois ou mais ciclos de selecção, em que em cada ciclo de selecção pelo menos uma célula hospedeira eucariótica é seleccionada com base na presença ou quantidade do polipéptido de fusão apresentado na superficie da célula.
8. O método de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 7, em que a ligação do composto de detecção à superficie da célula hospedeira eucariótica é detectada por citometria de fluxo. 5 ΡΕ2329020
9. Um ácido nucleico vector adequado para a expressão de pelo menos um polipéptido de interesse numa célula hospedeira eucariótica e adequado para usar no método de selecção de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 8, compreendendo a) pelo menos uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, e/ou um primeiro polinucleótido codificador de um polipéptido de interesse, b) pelo menos um codão de terminação a jusante do referido primeiro polinucleótido; c) um segundo polinucleótido a jusante do referido codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina.
10. O ácido nucleico vector de acordo com a reivindicação 9, compreendendo pelo menos uma das seguintes caracteristicas: - um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse na cassete (Cas-POI); - uma cassete de expressão (MSM) compreendendo um gene de uma marca seleccionável em mamífero; e/ou - uma cassete de expressão (MASM) compreendendo um gene de uma marca amplificável e seleccionável em mamífero. 6 ΡΕ2329020 11. 0 ácido nucleico vector de acordo com a reivindicação 9 ou 10 para expressão de pelo menos uma molécula de imunoglobulina ou de uma sua variante funcional, compreendendo - uma cassete de expressão (Exp-POI) compreendendo um primeiro polinucleótido codificador da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento funcional, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina; e - uma cassete de expressão adicional (Exp-POI') compreendendo um polinucleótido codificador da correspondente cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou de um seu fragmento funcional.
12. Um método para a produção de um ácido nucleico vector de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 11, em que o método compreende a montagem de pelo menos uma cassete (Cas-POI) num vector, de forma que a referida cassete (Cas-POI) compreende um primeiro polinucleótido (Pn-POI) codificador do polipéptido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina. 7 ΡΕ2329020
13. Uma célula hospedeira eucariótica tendo pelo menos uma das seguintes características: a) é obtida pelo método de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 8; b) compreende uma cassete (Cas-POI) compreendendo pelo menos um polinucleótido heterólogo codificador de um polinucleótido de interesse, pelo menos um codão de terminação a jusante do referido polinucleótido heterólogo e um polinucleótido a jusante do codão de terminação codificador de uma âncora transmembranar de imunoglobulina; e/ou c) compreende um ácido nucleico vector de acordo com pelo menos uma das reivindicações 9 a 11.
14. Um método para a produção de um polipéptido de interesse, em que uma célula hospedeira eucariótica de acordo com a reivindicação 13 é cultivada para expressão do polipéptido de interesse. 15. 0 método para a produção de um polipéptido de interesse de acordo com uma das reivindicações 2 a 8 ou 14, em que é realizado pelo menos um dos seguintes passos: - o polipéptido é obtido a partir da cultura de células; o polipéptido é secretado para o meio de cultura e obtido a partir dele; ΡΕ2329020 - as células hospedeiras eucarióticas são destruídas para se obter o polipéptido expresso; - o polipéptido expresso é isolado; - o polipéptido expresso é purificado; e/ou - o polipéptido expresso é ainda processado e/ou modificado. Lisboa, 11 de junho de 2013 1 ΡΕ2329020 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * US 28850658082 A * EP 05183161 A * WQ 20650783? A Literatura que não é de patentes citada na Descrição U et sL JssumS of IW® 1893, vot. 87 (8), 5082-9567 * :MCCy@H&N st aí. Proe, MM Asssí. Ssl, 1995, vol 8¾. 5431-8435 * BROWN et sl> :¾¾¾¾ Acàfe Rsmm:-h, 1895. vot 18 £21), 8339-6348 - LBWTT. Bmes Qm.t 18», vsl. 3 £?}, 1819-1028 . SUBRAMAM1 et al MslCM’. SM, 1981* 854-884 * EATON eí st Btod&mmy, 188®, ml 25,8343-8347 * KEU8ERBER st s«. EMBQ J., 1883, vM 2 £8), 1373-1378 * SStLLARÍ et at J. SMscMM, 2001, vot 61, 58-85 * FACK «t sL J Moí EiaL. 1 δ Fefenaw* 1935, set 246 (1), 28-34· * P.ACK etat BiatsshmÍDgy (M ¥, Noveotíser 18®8s W3t. 11 {11),1271-7 » PACK ; PLUECKTHUIÍ. Ε&δ8®Β®8$Κ. 18 FstRiSfV 19S2, íM 31 {% 157S-84 * HiUST st et BMC SMscísssí, 2007. vM 7.14 * OUMARD «» C&oteehMSkm 2SS6, vol S0< 93-1:88 * S0RRELL ei ai BkÉKáMak^A&mess, 2065, «s* 23, 431-469