PT1678314E - Métodos de síntese de polipéptidos heteromultiméricos em levedura utilizando uma estratégia de conjugação haplóide - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE SÍNTESE DE POLIPÉPTIDOS HETEROMULTIMÉRICOS EM LEVEDURA UTILIZANDO UMA ESTRATÉGIA DE CONJUGAÇÃO HAPLÓIDE"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A produção de proteína recombinante é uma actividade essencial para rastreio de elevada produtividade, validação funcional, biologia estrutural e produção de polipéptidos farmacêuticos. A Escherichia coli é um organismo amplamente utilizado para a expressão de proteínas heterólogas, porque cresce facilmente até uma elevada densidade celular em substratos pouco dispendiosos e tem técnicas genéticas e vectores de expressão bem estabelecidos. Contudo, para a produção eficiente de biomoléculas activas, tal não é sempre suficiente. De modo a serem biologicamente activas, as cadeias polipeptídicas têm que se enrolar na estrutura tridimensional nativa correcta, incluindo a formação apropriada de ligações dissulfureto e podem, ainda, requerer a associação correcta de múltiplas cadeias.

Embora o estado activo da proteína possa ser termodinamicamente favorecido, a escala de tempo para o enrolamento pode variar desde milissegundos a dias. As barreiras cinéticas são introduzidas, por exemplo, pela necessidade para alinhamento de subunidades e subdomínios. E, particularmente com proteínas eucarióticas, devem realizar-se reacções covalentes para que a proteína correctamente enrolada se forme. Os últimos tipos de reacção incluem formação de ligação dissulfureto, 1 isomerização cis/trans da cadeia polipeptídica em torno de ligações peptídicas de prolina, processamento de preproteína e a ligação de grupos protéticos. Estas limitações cinéticas podem resultar na acumulação de intermediários parcialmente enrolados, que contêm superfícies "coesivas" hidrófobas expostas, que promovem a auto-associação e formação de agregados.

Os anticorpos são proteínas tetraméricas que têm muitas utilizações em diagnóstico clínico e terapia. Cada tetrâmero de anticorpo é composto por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Para muitas finalidades, os anticorpos puros humanos ou humanizados de um tipo específico, são difíceis ou impossíveis de purificar desde fontes naturais em quantidades suficientes. Como consequência, as empresas biotecnológicas e farmacêuticas voltaram-se para os métodos baseados em ADN recombinante para os preparar em grande escala. A produção de anticorpos funcionais requer, não só a síntese dos dois polipéptidos, mas também um número de modificações pós-tradução, incluindo processamento proteolítico da sequência sinal de secreção N-terminal; enrolamento e montagem apropriadas dos polipéptidos em tetrâmeros; formação de ligações dissulfureto; e glicosilação específica ligada a N. Todos estes eventos realizam-se na via secretória celular eucariótica, um complexo de organelos, único de células eucariotas. A síntese recombinante dessas proteínas complexas teve que se basear em sistemas baseados em cultura de tecidos de eucariotas superiores para material biologicamente activo. Contudo, os sistemas de produção baseados em cultura de tecidos de mamífero são significativamente mais dispendiosos e complicados do que os métodos de fermentação microbiológicos. Além disso, continuam a existir questões quanto aos produtos 2 terapêuticos produzidos utilizando materiais derivados de subprodutos animais.

Como um eucariota, a Pichia pastoris tem muitas das vantagens dos sistemas de expressão eucariotas superiores, tais como processamento de proteína, enrolamento de proteína e modificação pós-tradução, sendo tão fácil de manipular quanto a E. coli ou Saccharomyces cerevisiae. É mais rápida, fácil e menos dispendiosa de utilizar do que outros sistemas de expressão eucariotas, tal como a cultura de tecidos de baculovírus ou mamífero e, em geral, proporciona níveis de expressão mais elevados. Como uma levedura, partilha as vantagens das manipulações moleculares e genéticas com Saccharomyces. Estas características tornam a Pichia muito útil como um sistema de expressão de proteína.

Muitas das técnicas desenvolvidas para Saccharomyces podem ser aplicadas a Pichia. Estas incluem transformação por complementação; dissociação génica e substituição génica. Além disso, a nomenclatura genética utilizada para Saccharomyces tem sido aplicada a Pichia. Também há complementação cruzada entre produtos génicos em Saccharomyces e Pichia. Vários genes de tipo selvagem de Saccharomyces complementam genes mutantes comparáveis em Pichia. A expressão heteróloga em Pichia pastoris pode ser intracelular ou segregada. A secreção requer a presença de uma sequência sinal na proteína expressa para a direccionar para a via secretória. Embora várias sequências sinal de secreção diferentes tenham sido utilizadas com sucesso, incluindo o sinal de secreção nativo presente em algumas proteínas heterólogas, o sucesso tem sido variável. Uma potencial vantagem da secreção de 3 proteínas heterólogas é que a Pichia pastoris segrega níveis muito baixos de proteínas nativas. Isso, combinado com a quantidade muito baixa de proteína no meio mínimo de crescimento de Pichia, significa que a proteína heteróloga segregada compreende a grande maioria da proteína total no meio e serve como a primeira etapa na purificação da proteína.

Muitas espécies de levedura, incluindo Pichia, são competentes para conjugação. Tal possibilita que duas estirpes haplóides distintas se conjuguem de um modo natural e gerem uma espécie diplóide possuindo duas cópias cromossómicas.

Embora a P. pastoris tenha sido utilizada com sucesso para a produção de diversas proteínas heterólogas, e. g., antigénio de superfície de hepatite B (Cregg et al. (1987) Bio/Technology 5:479), lisozima e invertase (Digan et al. (1988) Dev. Indust. Micro. 29:59; Tschopp et al. (1987) Bio/Technology 5:1305), iniciativas para produzir outros produtos génicos heterólogos em Pichia, especialmente por secreção, deram resultados mistos. No presente nível de compreensão do sistema de expressão de P. pastoris, é imprevisível se um determinado gene pode ser expresso a um nível apreciável nesta levedura ou se a Pichia tolera a presença do produto génico recombinante nas suas células. Além disso, é especialmente difícil prever se uma proteína particular será segregada por P. pastoris e, se for, com que eficiência. O documento WO 00/23579 divulga a produção de anticorpo monoclonal recombinante por transformação de uma única estirpe haplóide de levedura P. pastoris haplóide com genes de imunoglobulina de murganho/humano codificando as cadeias pesada e leve. 4 0 documento US-A-6306625 ensina a transformação de diferentes estirpes de levedura S. cerevisiae haplóides com vectores de expressão codificando partículas mistas de antigénio de superfície de hepatite B.

No documento WO 03/018761, é proposta a possibilidade de conjugação de uma primeira população de células de levedura transportando um vector de expressão com uma segunda população de células de levedura transportando outro vector de expressão.

Blaise et ai., Gene, Vol. 342, pp. 211-218, 2004, referem-se à expressão de fragmentos de anticorpo Fab multicadeia na superfície de estirpes de levedura, tal como Pichia. 0 documento US-A-6204023 divulga hospedeiros de levedura transformados para a produção de moléculas quiméricas de imunoglobulina ou seus fragmentos ou derivados. A presente invenção proporciona métodos melhorados para a secreção de heteromultímeros heterólogos de espécies de levedura Pichia competentes para conjugação. SUMÁRIO DA INVENÇÃO: São proporcionados métodos para a síntese e secreção de proteínas heteromultiméricas recombinantes em levedura Pichia competente para conjugação. As proteínas heteromultiméricas de interesse compreendem, pelo menos, duas cadeias polipeptídicas não idênticas, e. g., cadeias pesada e leve de anticorpo, 5 cadeias alfa e beta de MHC; e semelhantes. É proporcionado um vector de expressão para cada cadeia polipeptidica não idêntica.

Cada vector de expressão é transformado dentro de uma célula de levedura Pichia haplóide. Em algumas formas de realização da invenção, a célula de levedura haplóide é geneticamente marcada, onde a célula de levedura haplóide é uma de um par complementar. Um primeiro vector de expressão é transformado dentro de uma célula haplóide e um segundo vector de expressão é transformado dentro de uma segunda célula haplóide. Quando as células haplóides devam ser conjugadas, tal será ocorrerá por fusão genética directa ou um evento semelhante é induzido com fusão de esferoplastos.

Os niveis de expressão dos polipéptidos não idênticos nas células haplóides podem ser calibrados individualmente e ajustados através de selecção, número de cópia de vector, resistência de promotor e/ou indução apropriados e semelhantes. Numa forma de realização da invenção, o promotor em cada vector de expressão é diferente. Noutra forma de realização da invenção, o mesmo promotor é proporcionado para cada. Os promotores podem ser constitutivos ou indutiveis.

As células haplóides transformadas, cada sintetizando individualmente um polipéptido não idêntico, são identificadas e, depois, geneticamente cruzadas ou fundidas. As estirpes diplóides resultantes são utilizadas para produzir e segregar proteína heteromultimérica totalmente agrupada e biologicamente funcional. A metodologia diplóide permite o emparelhamento de subunidade optimizado para melhorar a produção e secreção de produto de comprimento total. 6 A presente invenção é definida nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras 1A-1D. Produção de anticorpo recombinante de comprimento total agrupado. A metodologia de detecção de imunotransferência foi utilizada para caracterizar as estirpes de Pichia haplóides parentais, cada produzindo uma subunidade do anticorpo e a estirpe diplóide alvo produzindo ambas as subunidades que formam o anticorpo totalmente agrupado. As estirpes de levedura mostradas na Figura IA mostram uma cultura estática de cada das estirpes representativas, onde a porção de topo são as estirpes haplóides distintas contendo subunidades de cadeia Pesada (H) e Leve (L) , respectivamente; a de baixo, o diplóide estável conjugado produzindo ambas as subunidades. A Figura 1B mostra a detecção selectiva da cadeia H, que se verifica apenas no haplóide de cadeia H parental, e o diplóide conjugado contendo H e L. A Figura 1C mostra a detecção geral das cadeias H & L, que estabelece que a produção de proteína está activa em todas as três estirpes. A Figura 1D mostra a detecção selectiva na estirpe diplóide de anticorpo completo correctamente agrupado, confirmando que apenas o sistema diplóide é capaz de gerar anticorpo totalmente agrupado.

Figura 2. Produção de anticorpo de comprimento total em Picchia pastoris. A expressão heteróloga de anticorpo de comprimento total foi conduzida utilizando uma estirpe de Pichia pastoris diplóide. A proteína de anticorpo exportada foi isolada de meios condicionados utilizando cromatografia de afinidade de Proteína A. É mostrada uma alíquota da fracção de pico. 0 padrão de IgG humana foi derivado de IgG humana agregada purificada. 7

Figura 3. 0 anticorpo agrupado foi detectado e caracterizado a partir de sobrenadantes de meios de subclones de estirpes de Pichia pastoris diplóides, que foram manipuladas para produzir anticorpo quimérico de murganho/humano de comprimento total. As placas de microtitulação foram revestidas com anticorpos selectivos Anti-Fc humanos para capturar o anticorpo dos meios de cultura. 0 anticorpo agrupado correctamente foi detectado através da utilização de um (Fab')2 selectivo humano, que reconhecia as regiões constantes emparelhadas de cadeia pesada CHI e leve k. As diluições em série de meios clarificados foram aplicadas à placa. 0 desenvolvimento foi através de métodos padrão de visualização de ELISA. A detecção é selectiva, como mostrado pela ausência de qualquer sinal detectável no padrão de mlgG.

Figura 4. A Pichia gerou colorações CD3 de anticorpo recombinante contendo células T de Jurkat, assim como anticorpo derivado de mamífero tradicional. As células T de Jurkat foram imobilizadas em lâminas de vidro e a coloração foi conduzida utilizando o anticorpo anti-CD3 produzido em células de levedura e de mamífero. A detecção foi realizada utilizando um anticorpo secundário anti-roedor conjugado biotinilado e revelado com um derivado de HRP-estreptavidina. As imagens são um campo representativo de lâmina tratada com cada anticorpo recombinante. 0 fundo é o controlo para a revelação e conduzido na ausência do anticorpo primário anti-CD3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO

As proteínas heteromultiméricas recombinantes são segregadas de estirpes diplóides de levedura Pichia competente para conjugação. Um par de células haplóides de levedura Pichia geneticamente marcadas é transformado com vectores de expressão compreendendo subunidades da proteína heteromultimérica. Uma célula haplóide compreende um primeiro vector de expressão e uma segunda célula haplóide compreende um segundo vector de expressão. Opcionalmente, podem ser introduzidos vectores de expressão adicionais dentro das células haplóides ou diplóides; ou o primeiro ou segundo vector de expressão pode compreender sequências codificantes adicionais; para a síntese de heterotrímeros; heterotetrâmeros; etc. Os níveis de expressão dos polipéptidos não idênticos podem ser calibrados individualmente e ajustados através de selecção, número de cópia de vector, resistência de promotor e/ou indução apropriados e semelhantes. As células haplóides transformadas são geneticamente cruzadas ou fundidas. As estirpes diplóides ou tetraplóides resultantes são utilizadas para produzir e segregar proteína heteromultimérica totalmente agrupada e biologicamente funcional. A utilização de células diplóides ou tetraplóides para produção de proteína proporciona benefícios inesperados. As células podem ser cultivadas para efeitos de produção, i. e., expandidas, e durante períodos de tempo prolongados, em condições que podem ser deletérias ao crescimento de células haplóides, cujas condições podem incluir elevada densidade celular; crescimento em meios mínimos; crescimento a temperaturas baixas; crescimento estável na ausência de pressão selectiva; e que podem contribuir para a manutenção de 9 integridade da sequência génica heteróloga e manutenção de elevado nível de expressão ao longo do tempo. Estes benefícios podem surgir, pelo menos em parte, da criação de estirpes diplóides a partir de duas estirpes haplóides parentais distintas. Essas estirpes haplóides podem compreender numerosas pequenas mutações autotróficas, cujas mutações são complementadas no diplóide ou tetraplóide, possibilitando o crescimento sob condições altamente selectivas.

DEFINIÇÕES

Deve ser compreendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais e reagentes particulares descritos, como tal pode variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é apenas para efeitos de descrição de formas de realização particulares e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será apenas limitado pelas reivindicações anexas.

Como aqui utilizado, as formas singulares "um", "e" e "o/a" incluem referentes no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Deste modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade dessas células e a referência a "a proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e seus equivalentes, conhecidos dos especialistas na técnica e assim por diante. Salvo indicação claramente em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o geralmente compreendido por alguém com conhecimentos gerais na técnica à qual esta invenção pertence. 10

Espécies de levedura competentes de conjugação. Essas espécies de levedura existem numa forma haplóide e numa diplóide. As células diplóides podem, sob condições apropriadas, proliferar durante um número indefinido de gerações na forma diplóide. As células diplóides também podem esporular para formar células haplóides. Além disso, a conjugação sequencial pode resultar em estirpes tetraplóides através de conjugação adicional dos diplóides auxotróficos.

De acordo com a invenção, a levedura competente para conjugação é um membro do género Pichia. 0 género Pichia é de interesse particular. Pichia compreende um número de espécies, incluindo as espécies Pichia pastoris, Pichia methanolica e Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . É muito preferida a espécie Pichia pastoris. Célula de Levedura Haplóide: Uma célula tendo uma única cópia de cada gene do seu complemento genómico (cromossómico) normal. Célula de Levedura Diplóide: Uma célula tendo duas cópias (alelos) de cada gene do seu complemento genómico normal, tipicamente formado pelo processo de fusão (conjugação) de duas células haplóides. Célula de Levedura Tetraplóide: Uma célula tendo quatro cópias (alelos) de cada gene do seu complemento genómico normal, tipicamente formado pelo processo de fusão (conjugação) de duas células haplóides. Os tetraplóides podem transportar duas, três ou quatro cassetes diferentes. Esses tetraplóides poderão ser 11 obtidos em Pichia por conjugação sequencial de haplóides, para se obterem diplóides auxotróficos. Por exemplo, um haplóide [met his] pode ser conjugado com haplóide [ade his] para se obter diplóide [his]; e um haplóide [met arg] pode ser conjugado com haplóide [ade arg] para se obter diplóide [arg]; depois, o diplóide [his] x diplóide [arg] para se obter um prototrófico tetraplóide. Será compreendido pelos especialistas na técnica que a referência aos benefícios e utilizações de células diplóides também se pode aplicar a células tetraplóides.

Conjugação de Levedura: 0 processo pelo qual duas células de levedura haplóides se fundem, de um modo natural, para formar uma célula de levedura diplóide.

Meiose: 0 processo pelo qual uma célula de levedura diplóide sofre divisão redutora para formar quatro produtos de esporos haplóides. Cada esporo pode, depois, germinar e formar uma linha celular haplóide crescendo vegetativamente.

Marcador Seleccionável: Um marcador seleccionável é um gene ou fragmento génico que confere um fenótipo de crescimento (característica de crescimento física) numa célula recebendo esse gene como, por exemplo, através de um evento de transformação. 0 marcador seleccionável permite que essa célula sobreviva e cresça num meio de crescimento selectivo, sob condições nas quais as células que não recebem esse gene marcador seleccionável não conseguem crescer. Os genes marcadores seleccionáveis, em geral, dividem-se em vários tipos, incluindo genes marcadores seleccionáveis positivos, tal como um gene que confere resistência, numa célula, a um antibiótico ou outro fármaco, temperatura quando dois mutantes ts são cruzados ou um mutante ts é transformado; genes marcadores seleccionáveis 12 negativos, tal como um gene biossintético, que confere, numa célula, a capacidade de crescer num meio sem um nutriente especifico necessário por todas as células que não têm esse gene biossintétic,o ou um gene biossintético mutagenizado que confere, numa célula, a incapacidade de crescer por células que não têm o gene de tipo selvagem; e semelhantes. Os marcadores adequados incluem mas não estão limitados a: ZEO; G418; HIS 5; LYS3; METI; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; e semelhantes.

Vector de Expressão. Estas espécies de ADN contêm elementos que facilitam a manipulação para a expressão de uma proteína estranha dentro da célula hospedeira alvo. Convenientemente, a manipulação de sequências e produção de ADN para transformação é, em primeiro lugar, realizada num hospedeiro bacteriano, e. g., E. coli e, habitualmente, os vectores incluirão sequências para facilitar essas manipulações, incluindo uma origem de replicação bacteriana e marcador de selecção bacteriano apropriado. Os marcadores seleccionáveis codificam proteínas necessárias para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas, cultivadas num meio de cultura selectivo. As células hospedeiras não transformadas com o vector contendo o gene de selecção não sobreviverão no meio de cultura. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.

Os vectores de expressão para utilização nos métodos da invenção incluirão ainda sequências específicas de levedura, incluindo um auxotrófico seleccionável ou marcador de fármaco para identificar estirpes de levedura transformadas. Um marcador 13 de fármaco pode, ainda, ser utilizado para amplificar número de cópia do vector numa célula hospedeira de levedura. A sequência codificante polipeptídica de interesse está ligada, de um modo operativo, a sequências regulatórias transcricionais e traducionais que proporcionam para expressão do polipéptido em células de levedura. Estes componentes de vector podem incluir mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: um elemento estimulador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. As sequências para a secreção do polipéptido também podem estar incluídas, e. g., uma sequência sinal e semelhantes. Uma origem de replicação de levedura é opcional, visto que os vectores de expressão estão, frequentemente, integrados dentro do genoma da levedura.

Numa forma de realização da invenção, o polipéptido de interesse está, de um modo operativo, ligado ou fundido a sequências proporcionando para secreção optimizada do polipéptido de células diplóides de levedura Pichia.

Os ácidos nucleicos estão "ligados de um modo operativo" quando colocados dentro de uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, ADN para uma sequência sinal está ligado, de um modo operativo, a ADN para um polipéptido se for expresso como uma preproteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está ligado, de um modo operativo, a uma sequência codificante se afectar a transcrição da sequência. Em geral, "ligado de um modo operativo" significa que as sequências de ADN sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. Contudo, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada pela ligação a sítios de restrição 14 convenientes ou, alternativamente, por meio de um método de PCR/recombinação familiar aos especialistas na técnica (Gateway11 Technology; Invitrogen, Carlsbad Califórnia). Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com prática convencional.

Os promotores são sequências não traduzidas, localizadas a montante (5') do codão de iniciação de um gene estrutural (em geral dentro de cerca de 100 a 1000 pb), que controlam a transcrição e tradução de uma particular sequência de ácidos nucleicos à qual estão ligados de um modo operativo. Esses promotores dividem-se em várias classes: promotores indutíveis, constitutivos e repressíveis que aumentam os níveis de transcrição em resposta à ausência de um repressor. Os promotores indutíveis podem iniciar níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob o seu controlo, em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, e. g., a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração em temperatura. O fragmento promotor de levedura também pode servir como o sítio para recombinação homóloga e integração do vector de expressão dentro do mesmo sítio no genoma de levedura; alternativamente, é utilizado um marcador seleccionável como o sítio para recombinação homóloga. A transformação de Pichia é descrita em Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.

Exemplos de promotores adequados de Pichia incluem ο A0X1 e promotor (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20 (13):1097-108) ; promotor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); e promotor FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1) :93-102) . O promotor GAP é um 15 forte promotor constitutivo e os promotores AOX e FLD1 são indutiveis.

Os polipéptidos de interesse podem ser produzidos de modo recombinante, não apenas directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, e. g., uma sequência sinal ou outro polipéptido tendo um sitio de clivagem específico na terminação N da proteína ou polipéptido maduros. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte da sequência codificante polipeptídica que é inserida dentro do vector. A sequência sinal heteróloga seleccionada é, de um modo preferido, uma que seja reconhecida e processada através de uma das vias padrão disponíveis dentro da célula hospedeira. 0 sinal pre-pro do factor alfa de S. cerevisiae provou ser eficaz na secreção de uma variedade de proteínas recombinantes de P. pastoris. Os sinais de secreção de interesse também incluem sequências sinal de mamífero, que podem ser heterólogas à proteína sendo segregada, ou podem ser uma sequência nativa para a proteína sendo segregada. As sequências sinal incluem sequências pré-péptido e, em alguns casos, podem incluir sequências de propéptido. Muitas dessas sequências sinal são conhecidas na técnica, incluindo as sequências sinal verificadas nas cadeias de imunoglobulina, e. g., sequência de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, sequências sinal de albumina sérica humana, cadeia pesada de Ig humana, cadeia leve de Ig humana e semelhantes. Por exemplo, ver Hashimoto et al. Protein Eng 11 (2) 75 (1998); e Kobayashi et al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998). A transcrição pode ser aumentada pela inserção de uma sequência activadora transcricional dentro do vector. Estes activadores são elementos actuantes em cis de ADN, habitualmente 16 desde cerca de 10 a 300 pb, que actuam num promotor para aumentarem a sua transcrição. Os estimuladores transcricionais são independentes em relação à orientação e posição, tendo sido verificados 5' e 3' em relação à unidade de transcrição, dentro de um intrão, assim como dentro da própria sequência codificante. O estimulador pode ser excisado dentro do vector de expressão numa posição 5' ou 3' em relação à sequência codificante mas, de um modo preferido, está localizado num sítio a 5' do promotor.

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas também podem conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do ARNm. Essas sequências estão, geralmente, disponíveis a partir de 3' em relação ao codão de terminação de tradução, em regiões não traduzidas de ADN ou ADNc eucariotas ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm. A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas de ligação padrão ou métodos de PCR/recombinação. Os plasmídeos ou fragmentos de ADN isolados são clivados, adaptados e re-ligados na forma desejada, para produzir os plasmídeos requeridos ou por meio de métodos de recombinação. Para análise para confirmar sequências correctas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação são utilizadas para transformar células hospedeiras e os transformantes bem-sucedidos seleccionados por resistência antibiótica (e. g., ampicilina ou zeocina) onde apropriado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão por endonuclease de restrição e/ou sequenciados. 17

Como uma alternativa à restrição e ligação de fragmentos, podem ser utilizados métodos de recombinação baseados em sítios att e enzimas de recombinação para inserir sequências de ADN dentro de um vector. Esses métodos são descritos, por exemplo, por Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; e são conhecidos dos especialistas na técnica. Esses métodos utilizam recombinação de ADN intermolecular que é mediada por uma mistura de proteínas de recombinação codificadas por lambda e E. coli. A recombinação ocorre entre sítios de conjugação (att) específicos nas moléculas de ADN que interagem. Para uma descrição de sítios att, ver Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Os segmentos de ADN flanqueando os sítios de recombinação são trocados, de modo a que, após recombinação, os sítios att sejam sequências híbridas compreendidas por sequências doadas por cada vector parental. A recombinação pode ocorrer entre ADN de qualquer topologia.

Os sítios att podem ser introduzidos dentro de uma sequência de interesse pela ligação da sequência de interesse dentro de um vector apropriado; geração de um produto de PCR contendo sítios att B, através da utilização de iniciadores específicos; geração de uma biblioteca de ADNc clonada dentro de um vector apropriado contendo sítios att; e semelhantes.

Enrolamento, como aqui utilizado, refere-se à estrutura tridimensional de polipéptidos e proteínas, onde as interacções entre resíduos de aminoácidos actuam para estabilizar a estrutura. Embora as interacções não covalentes sejam importantes na determinação da estrutura, habitualmente as proteínas de interesse terão ligações dissulfureto covalentes 18 intramoleculares e/ou intermoleculares, formadas por dois resíduos de cisteína. Para proteínas e polipéptidos de ocorrência natural ou seus derivados e variantes, o enrolamento apropriado é, tipicamente, a disposição que resulta em actividade biológica óptima e pode, convenientemente, ser monitorizado por ensaios para actividade, e. g., ligação de ligando, actividade enzimática, etc.

Em alguns casos, por exemplo, onde o produto desejado é de origem sintética, os ensaios baseados em actividade biológica serão menos significativos. 0 enrolamento apropriado dessas moléculas pode ser determinado com base em propriedades físicas, considerações energéticas, estudos de modelação e semelhantes. 0 hospedeiro de expressão pode ser, ainda, modificado pela introdução de sequências codificando uma ou mais enzimas que melhoram o enrolamento e formação de ligação dissulfureto, i. e., foldases, chaperoninas, etc. Essas sequências podem ser expressas de um modo constitutivo ou indutível na célula hospedeira de levedura, utilizando vectores, marcadores, etc., como conhecido na técnica. De um modo preferido, as sequências, incluindo elementos regulatórios transcricionais suficientes para o padrão de expressão desejado, são integradas, de um modo estável, no genoma de levedura, através de uma metodologia direccionada.

Por exemplo, a PDI eucariótica não é apenas um catalisador eficiente da oxidação da proteína cisteína e isomerização de ligação dissulfureto, mas também exibe actividade de chaperone. A co-expressão de PDI pode facilitar a produção de proteínas activas tendo múltiplas ligações dissulfureto. Também é de interesse a expressão de BIP (proteína de ligação de cadeia 19 pesada de imunoglobulina); ciclofilina; e semelhantes. Numa forma de realização da invenção, cada das estirpes parentais haplóides expressa uma enzima de enrolamento distinta, e. g., uma estirpe pode expressar BIP e a outra estirpe pode expressar PDI.

Os termos "proteína desejada" ou "proteína alvo" são utilizados com o mesmo significado e referem-se, em geral, a gualquer proteína segregada tendo 2 ou mais cadeias polipeptídicas não idênticas, onde essas cadeias são sintetizadas independentemente, i. e., não resultando de clivagem pós-tradução de uma única cadeia polipeptídica. Os polipéptidos são heterólogos, i. e., estranhos à levedura. De um modo preferido, são utilizados polipéptidos de mamífero, i. e., polipéptidos codificados num genoma de mamífero.

Numa forma de realização preferida, a proteína é um anticorpo. 0 termo "anticorpo" pretende incluir qualquer estrutura molecular contendo cadeia polipeptídica, com uma forma específica que se ajusta e reconhece um epitopo, onde uma ou mais interacções de ligação não covalente estabilizam o complexo entre a estrutura molecular e o epitopo. A molécula de anticorpo arquetípica é a imunoglobulina e todos os tipos de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, igE, IgD, etc., de todas as fontes, e. g., humano, roedor, coelho, vaca, ovelha, porco, cão, outros mamíferos, galinha, outras aves, etc., são considerados como sendo "anticorpos". Foram descritas numerosas sequências codificantes de anticorpo; e outras podem ser deduzidas por métodos bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antigénio podem ser produzidos por engenharia genética. Nesta 20 técnica, como com outros métodos, as células produzindo anticorpos são sensibilizadas ao antigénio ou imunogénio desejado. 0 ARN mensageiro isolado de células produzindo anticorpos é utilizado como um molde para preparar ADNc utilizando amplificação por PCR. Uma biblioteca de vectores, cada contendo um gene de cadeia pesada e um gene de cadeia leve retendo a especificidade antigénica inicial, é produzida por inserção de secções apropriadas do ADNc de imunoglobulina amplificado dentro dos vectores de expressão. Uma biblioteca combinatória é construída pela combinação da biblioteca génica de cadeia pesada com a biblioteca génica de cadeia leve. Isto resulta numa biblioteca de clones que co-expressa uma cadeia pesada e leve (assemelhando-se ao fragmento Fab ou fragmento de ligação de antigénio de uma molécula de anticorpo). Os vectores que transportam estes genes são co-transfectados para dentro de uma célula hospedeira. Quando a síntese génica de anticorpo é induzida no hospedeiro transfectado, as proteínas das cadeias pesada e leve auto-agrupam-se para produzir anticorpos activos que podem ser detectados pelo rastreio com o antigénio ou imunogénio.

As sequências codificantes de anticorpo de interesse incluem as codificadas por sequências nativas, assim como ácidos nucleicos que, em virtude da degenerescência do código genético, não são idênticos em sequência aos ácidos nucleicos divulgados e seus variantes. Os polipéptidos variantes podem incluir substituições, adições ou deleções de aminoácido (aa) . As substituições de aminoácido podem ser substituições de aminoácido conservativas ou substituições para eliminar aminoácidos não essenciais, de forma a alterar um sítio de glicosilação ou a minimizar o enrolamento incorrecto por substituição ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína que 21 não são necessários para função. Os variantes podem ser concebidos de modo a reterem ou terem actividade biológica melhorada de uma região particular da proteína (e. g., um domínio funcional, resíduos de aminoácido catalíticos, etc.). Os variantes também incluem fragmentos dos polipéptidos aqui divulgados, particularmente fragmentos biologicamente activos e/ou fragmentos correspondendo a domínios funcionais. As técnicas para mutagénese in vitro de genes clonados são conhecidas. Também estão incluídos na invenção submetida polipéptidos que foram modificados utilizando técnicas ordinárias de biologia molecular, de modo a melhorar a sua resistência à degradação proteolítica ou a optimizar as propriedades de solubilidade ou para os tornar mais adequados como agente terapêutico.

Os anticorpos quiméricos podem ser preparados por meios recombinantes, pela combinação das regiões variáveis das cadeias leve e pesada (VK e VH) , obtidas de células produzindo anticorpos de uma espécie, com as regiões constantes das cadeias leve e pesada de outra. Tipicamente, os anticorpos quiméricos utilizam regiões variáveis de roedor ou coelho e regiões constantes humanas, de modo a produzir um anticorpo com domínios predominantemente humanos. A produção desses anticorpos quiméricos é bem conhecida na técnica e pode ser alcançada por meios padrão (como descrito, e. g. , na Patente U.S. N° 5624659).

Os anticorpos humanizados são manipulados para conterem ainda mais domínios de imunoglobulina do tipo humano e incorporam apenas as regiões determinantes de complementaridade dos anticorpos derivados de animais. Tal é alcançado pela examinação cuidadosa da sequência dos ganchos hipervariáveis das regiões variáveis do anticorpo monoclonal e seu ajuste à 22 estrutura das cadeias de anticorpo humano. Embora facialmente complexo, o processo é, na prática, simples. Ver, e. g., Patente U.S. N° 6187287.

Além das imunoglobulinas integrais (ou seus eguivalentes recombinantes), podem ser sintetizados fragmentos de imunoglobulina compreendendo o sitio de ligação de epitopo (e. g., Fab', F(ab')2 ou outros fragmentos). Imunoglobulinas de "fragmento" ou minimas podem ser concebidas utilizando técnicas recombinantes de imunoglobulina. Por exemplo, as imunoglobulinas ”Fv" para utilização na presente invenção podem ser produzidas pela síntese de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. Combinações de anticorpo também são de interesse, e. g., diacorpos, que compreendem duas especificidades de Fv distintas.

As imunoglobulinas podem ser modificadas de um modo pós-tradução, e. g., para adicionar ligantes químicos, porções detectáveis, tais como corantes fluorescentes, enzimas, substratos, porções quimioluminescentes e semelhantes, ou porções de ligação específica, tais como estreptavidina, avidina ou biotina e semelhantes, podem ser utilizadas nos métodos e composições da presente invenção.

MÉTODOS DE SÍNTESE POLIPEPTÍDICA

As células de levedura Pichia haplóides competentes de conjugação transformadas proporcionam um método genético que possibilita o emparelhamento de subunidade de uma proteína desejada. As estirpes de levedura Pichia haplóides são transformadas com cada dos dois vectores de expressão, um 23 primeiro vector para dirigir a síntese de uma cadeia polipeptídica e um segundo vector para dirigir a síntese de uma segunda cadeia polipeptídica, não idêntica. As duas estirpes de Pichia haplóides são conjugadas para proporcionar um hospedeiro diplóide, onde a produção de proteína alvo optimizada pode ser obtida.

Opcionalmente, é (são) proporcionada(s) sequência(s) codificante(s) não idêntica(s) adicional (adicionais). Essas sequências podem estar presentes em vectores de expressão adicionais ou no primeiro ou no segundo vectores de expressão. Como é conhecido na técnica, múltiplas sequências codificantes podem ser expressas independentemente a partir de promotores individuais; ou podem ser expressas coordenadamente, através da inclusão de um "local interno de entrada do ribossoma" ou "IRES", que é um elemento que promove a entrada interna directa do ribossoma para o codão de iniciação, tal como ATG, de um cistrão (uma região codificando proteína) conduzindo, desse modo, à tradução independente de cap do gene. Os elementos de IRES funcionais na levedura são descritos por Thompson et al. (2001) P.N.A.S. 98:12866-12868.

Numa forma de realização da invenção, as sequências de anticorpo são produzidas em combinação com uma cadeia J secretória, que proporciona para estabilidade melhorada de IgA (ver as Patentes U.S. n° 5959177; e 5202422).

As duas estirpes de levedura haplóides são cada auxotróficas e requerem suplementação de meios para crescimento das células haplóides. O par de auxotróficos é complementar, de modo a que o produto diplóide cresça na ausência dos suplementos requeridos para as células haplóides. Muitos desses marcadores 24 genéticos são conhecidos na levedura, incluindo requisitos para aminoácidos (e. g., met, lys, his, arg, etc.)λ nucleósidos (e. g., ura3, adel, etc.); e semelhantes. Os marcadores de aminoácido podem ser preferidos para os métodos da invenção.

As duas células haplóides transformadas podem ser geneticamente cruzadas e as estirpes diplóides surgindo deste evento de conjugação seleccionadas pelos seus requisitos nutricionais híbridos. Alternativamente, as populações das duas estirpes haplóides transformadas são convertidas em esferoplastos e fundidas e a progénie diplóide regenerada e seleccionada. Por qualquer método, as estirpes diplóides podem ser identificadas e selectivamente cultivadas porque, ao contrário dos seus haplóides parentais, não têm os mesmos requisitos nutricionais. Por exemplo, as células diplóides podem ser cultivadas em meio mínimo. A estratégia de síntese diplóide tem determinadas vantagens. As estirpes diplóides têm o potencial para produzirem níveis melhorados de proteína heteróloga através de complementação mais ampla a mutações subjacentes, o que pode ter impacto na produção e/ou secreção de proteína recombinante.

Numa forma de realização da invenção, cada das estirpes haplóides de Pichia é transformada com a biblioteca de polipéptidos, e. g., uma biblioteca de cadeias pesadas ou leves de anticorpo. As células haplóides transformadas que sintetizam os polipéptidos são conjugadas com as células haplóides complementares. As células diplóides resultantes são rastreadas para proteína funcional. As células diplóides proporcionam um meio de rapidamente, convenientemente e economicamente reunir um grande número de combinações de polipéptidos para testagem funcional. Esta tecnologia é especialmente aplicável para a 25 geração de produtos proteicos heterodiméricos, onde os níveis de síntese de subunidade optimizados são críticos para expressão e secreção de proteína funcional.

Noutra forma de realização da invenção, a razão do nível de expressão das duas subunidades é regulada de modo a maximizar a geração de produto. Demonstrou-se que os níveis de proteína de subunidade de heterodímero têm impacto na geração de produto final (Simmons LC, J Immunol Methods. 1 de Maio de 2002; 263(1-2):133-47). A regulação pode ser alcançada antes da etapa de conjugação por selecção de um marcador presente no vector de expressão. Pelo aumento de um modo estável do número de cópia do vector, o nível de expressão pode ser aumentado. Em alguns casos, pode ser desejável aumentar o nível de uma cadeia relativamente à outra, de modo a atingir-se uma proporção equilibrada entre as subunidades do polipéptido. Os marcadores de resistência antibiótica são úteis para este efeito, e. g., marcador de resistência de Zeocina, resistência de G418, etc. e proporcionam um meio de enriquecimento para estirpes que contêm múltiplas cópias integradas de um vector de expressão numa estirpe, pela selecção para transformantes que sejam resistentes a níveis superiores de Zeocina ou G418. A razão apropriada, e. g., 1:1; 1:2; etc., dos genes de subunidade pode ser importante para a produção eficiente de proteína. Mesmo quando é utilizado o mesmo promotor para transcrever ambas as subunidades, muitos outros factores contribuem para o nível final de proteína expressa e, por conseguinte, pode ser útil aumentar o número de cópias de um gene codificado relativamente ao outro. Alternativamente, são criadas estirpes diplóides que produzem níveis superiores de um polipéptido relativamente a estirpes de vector de cópia única, pela conjugação de duas 26 estirpes diplóides, tendo ambas múltiplas cópias dos vectores de expressão.

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão descritos acima, conjugadas para formar estirpes diplóides e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado, para a indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. Um número de meios mínimos adequados para o crescimento de levedura é conhecido na técnica. Qualquer destes meios pode ser suplementado, conforme necessário, com sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos, oligoelementos e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Também podem ser incluídos quaisquer outros suplementos necessários, a concentrações apropriadas, que seriam conhecidas dos especialistas na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para o especialista com conhecimentos gerais na técnica.

As proteínas segregadas são recuperadas do meio de cultura. Um inibidor de protease, tal como fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), pode ser útil para inibir a degradação proteolítica durante a purificação e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição pode ser concentrada, filtrada, dialisada, etc., utilizando métodos conhecidos na técnica.

As células diplóides de Pichia da invenção são cultivadas para efeitos de produção. Esses efeitos de produção incluem, 27 desejavelmente, crescimento em meios mínimos, cujos meios são desprovidos de aminoácidos pré-formados e outras biomoléculas complexas, e. g., meios compreendendo amónia como uma fonte de azoto e glucose como uma fonte de energia e carbono e sais como uma fonte de fosfato, cálcio e semelhantes. De um modo preferido, esses meios de produção são desprovidos de agentes selectivos, tais como antibióticos, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc. As células diplóides podem ser cultivadas até elevada densidade celular, por exemplo, pelo menos, cerca de 50 g/L; de um modo mais habitual, pelo menos, cerca de 100 g/L; e pode ser, pelo menos, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500 g/L ou mais.

Numa forma de realização da invenção, o crescimento das células submetidas, para efeitos de produção, é realizado a baixas temperaturas, cujas temperaturas podem ser diminuídas durante a fase log, durante a fase estacionária ou ambas. O termo "baixa temperatura" refere-se a temperaturas de, pelo menos, cerca de 15 °C, de um modo mais habitual, pelo menos, cerca de 17 °C e podem ser cerca de 20 °C e, habitualmente, não mais de cerca de 25 °C, de um modo mais habitual não mais de cerca de 22 °C. A temperatura de crescimento pode ter impacto na produção de proteínas segregadas de comprimento total em culturas de produção e a diminuição da temperatura de crescimento da cultura pode melhorar fortemente o rendimento de produto intacto. A temperatura diminuída parece auxiliar o tráfico intracelular, através das vias de enrolamento e processamento pós-tradução utilizadas pelo hospedeiro para gerar o produto alvo, juntamente com redução da degradação de protease celular. 28

Os métodos da invenção proporcionam para expressão de proteína segregada, activa, particularmente anticorpos segregados, activos, onde "anticorpos activos", como aqui utilizado, se refere a um multímero correctamente enrolado de, pelo menos, duas cadeias apropriadamente emparelhadas, que se ligam, de um modo preciso, ao seu antigénio correlacionado. Os níveis de expressão de proteína activa são, habitualmente, pelo menos, cerca de 50 mg/litro de cultura, de um modo mais habitual, pelo menos, cerca de 100 mg/litro, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 500 mg/litro e podem ser 1000 mg/litro ou mais.

Os métodos da invenção podem proporcionar para estabilidade aumentada das sequências codificantes de hospedeiro e heterólogas de Pichia durante a produção. A estabilidade é evidenciada, por exemplo, por manutenção de elevados níveis de expressão de tempo, onde o nível de partida de expressão é diminuído em não mais de cerca de 20%, habitualmente não mais de 10% e pode estar diminuído em não mais de cerca de 5%, ao longo de cerca de 20 duplicações, 50 duplicações, 100 duplicações ou mais. A estabilidade da estirpe de Pichia também proporciona para manutenção de integridade de sequência génica heteróloga ao longo do tempo, onde a sequência da sequência codificante activa e elementos regulatórios transcricionais requeridos é mantida em cerca de 99% das células diplóides, habitualmente em, pelo menos, cerca de 99,9% das células diplóides e, de um modo preferido, em, pelo menos, cerca de 99,99% das células diplóides, ao longo de cerca de 20 duplicações, 50 duplicações, 100 duplicações ou mais. De um modo preferido, substancialmente todas as células diplóides mantêm a sequência da sequência 29 codificante activa e elementos regulatórios transcricionais requeridos.

Deve ser compreendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, espécies ou géneros animais, construções e reagentes particulares descritos, como tal pode, certamente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é apenas para efeitos de descrição de formas de realização particulares e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será apenas limitado pelas reivindicações anexas.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o geralmente compreendido de alguém com conhecimentos gerais na técnica, a que esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testagem da invenção, são agora descritos os métodos, dispositivos e materiais preferidos.

Todas as publicações aqui mencionadas são para efeitos de descrição e divulgação, por exemplo, das linhas celulares, construções e metodologias que são descritas nas publicações que poderão ser utilizadas com respeito à invenção presentemente descrita. As publicações discutidas acima e através do texto são unicamente proporcionadas para a sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como um reconhecimento de que a requerente não tem o direito de antedatar essa divulgação em virtude de invenção anterior. 30

Os exemplos seguintes são propostos de modo a proporcionar a alguém com conhecimentos gerais na técnica uma completa divulgação e descrição de como realizar e utilizar a invenção submetida e não se destinam a limitar o âmbito do que é considerado como a invenção e definido nas reivindicações. Foram realizados esforços para garantir a exactidão com respeito aos números utilizados (e. g., quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser admitidos. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados; e pressão é à pressão atmosférica ou aproximada.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Para demonstrar a eficácia do método de produção de anticorpo diplóide, foram preparados os seguintes reagentes.

Genes de anticorpo: Foram clonados e construídos genes que dirigiam a síntese de três formas de um anticorpo monoclonal 0KT3 de murganho humanizado quimérico. As fontes das regiões variáveis para utilização nestas construções podem consultar-se no Genbank. Número de acesso A22261; cadeia pesada 0KT3 de murganho (Pedido de Patente Internacional WO 9109967-A 3, ll-JUL-1991). Número de Acesso A22259; cadeia leve 0KT3 de murganho (Pedido de Patente Internacional WO 9109967-A 3, ll-JUL-1991) . 31

Todas as três formas utilizavam o gene de cadeia leve VKCK idêntico (SEQ ID N°: 10). Para os três genes de cadeia pesada, todos codificavam a região variável (Vh) de murganho idêntica mas diferiam entre si na sequência de aminoácidos das regiões constantes de cadeia pesada humana. A primeira construção dirigia a síntese de uma cadeia pesada (CYi) de tipo selvagem de comprimento total com o seu único sítio de glicosilação ligada a N normal presente (cadeia pesada glicosilada de comprimento total) (SEQ ID N°: 13 e N° 14). O segundo gene dirigia a síntese de uma cadeia pesada não glicosilada, criada pela mutação de um nucleótido na sequência, de modo que uma treonina na posição 301 fosse alterada para uma alanina na sequência de reconhecimento do sítio de glicosilação (ASN-X-Thr/Ser) (cadeia pesada não glicosilada de comprimento total) (SEQ ID N°: 15). A terceira construção génica dirigia a síntese de uma cadeia pesada, na qual a maioria da região constante foi delecionada a seguir à região de articulação (cadeia pesada de Fab) (SEQ ID N°: 16).

Vector de expressão. O vector contém os seguintes componentes funcionais: 1) uma origem de replicação de ColEl mutante, que facilita a replicação do vector plasmídico em células da bactéria Escherichia coli; 2) um gene Sh ble bacteriano, que confere resistência ao antibiótico Zeocina e serve como o marcador seleccionável para transformação de E. coli e P. pastoris; 3) uma cassete de expressão composta pelo promotor do gene da gliceraldeido desidrogenase (gene GAP) , fundida a sequências codificando a sequência líder de secreção do factor pre pro de conjugação alfa de Saccharomyces cerevisiae, seguida de sequências codificando um sinal de terminação de transcrição de P. pastoris do gene da álcool oxidase I (AOXl) de P. pastoris. O gene marcador de resistência de Zeocina proporciona um meio de enriquecimento para estirpes 32 que contêm múltiplas cópias integradas de um vector de expressão numa estirpe, pela selecção para transformantes que sejam resistentes a níveis superiores de Zeocina.

Estirpes de P. pastoris: As estirpes auxotróficas utilizadas para este exemplo são as estirpes adel e ura3 de P. pastoris, que requerem suplementação com adenina e uracilo, respectivamente, para crescimento. Também foram utilizadas as estirpes meti e lys3. Embora quaisquer dois conjuntos de complementação de estirpes auxotróficas de Pichia possam ser utilizados para a construção e manutenção de estirpes diplóides, estas duas estirpes são especialmente adequadas para este método, por duas razões. Primeira, crescem mais lentamente do que estirpes diplóides que sejam o resultado da sua conjugação ou fusão. Deste modo, se um pequeno número de células adel ou ura3 haplóides permanecer presente numa cultura ou surgir através de meiose ou outro mecanismo, a estirpe diplóide deverá crescer mais depressa que elas em cultura. A segunda é que é fácil monitorizar o estado sexual destas estirpes, visto que as colónias do produto diplóide da sua conjugação têm uma cor branca ou creme normal, ao passo que as células de quaisquer estirpes que sejam mutantes adel haplóides numa cultura formam uma colónia com cor-de-rosa distinto em cor. Além disso, quaisquer estirpes que sejam mutantes ura3 haplóides são resistentes ao fármaco ácido 5-fluoro-orótico (FOA) e podem ser identificadas, de um modo sensitivo, pelo plaqueamento de amostras de uma cultura em meio mínimo + placas de uracilo com FOA. Nestas placas, apenas as estirpes do mutante ura3 requerendo uracilo (presumivelmente, haplóides) conseguem crescer e formar colónias. Deste modo, com as estirpes parentais haplóides marcadas com adel e ura3, pode facilmente 33 monitorizar—se o estado sexual das estirpes diplóides produzindo anticorpos resultantes (haplóide versus diplóide). Métodos

Construção dos vectores de expressão pGAPZ-alfa para transcrição de genes de anticorpo de cadeia leve e pesada. Para clonagem das regiões variáveis das cadeias leve e pesada, as células de uma linha celular de hibridoma de CD3 0KT3 de murganho foram cultivadas e o ARN total extraído. Duas reacções de RT-PCR foram, depois, realizadas, uma específica da cadeia leve e uma específica da cadeia pesada, ambas da região variável, codificando sequências dos genes de anticorpo 0KT3. Os iniciadores empregues para amplificar a região variável das cadeias pesada e leve foram (SEQ ID N°: 1) 5' -CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3' e (SEQ ID N°: 3) 5'-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC-3', juntamente com (SEQ ID N°: 2) 5'-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3' e (SEQ ID N°: 4) 5'-GACAGATGGTGCAGCCACAGCCCGG TTTATTTCCAACTTTGTCC-3', para as respectivas regiões variáveis.

Para os genes de região constante das cadeias pesada e leve humanas, uma biblioteca de ADNc leucocitária humana 5'-stretch plus foi adquirida à Clontech (HL 5019t) . Duas reacções de PCR foram realizadas nesta biblioteca, utilizando iniciadores específicos para as regiões constantes das cadeias pesada e leve, respectivamente (Cadeia pesada: (SEQ ID N° : 6) 5'-GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCA-3 e (SEQ ID N°: 5) 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3' para comprimento 34 total juntamente com (SEQ ID N°: 7) 5'-TGCGGCCGCTCATGGGCACGGTGGGCATGTGT-3' para geração de FAB; Cadeia leve: (SEQ ID N°: 9) 5'-GGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTC-3' e (SEQ ID N°: 8) 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3'.

Uma sequência de ADN codificando a região variável de cadeia leve de murganho foi fundida, em fase, a uma sequência codificando a região constante de cadeia leve humana (SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12). Um fragmento codificando a construção de fusão final foi inserido dentro do vector de expressão pGAPZ-alfa de P. pastoris por meio de ligação através dos sítios 5'-XhoI e 3'-NotI em pGAPZ-alfa. A sequência de ADN codificando a região variável pesada de murganho foi fundida, em fase, a sequências codificando cada das três regiões constantes de cadeia pesada humana. Estes produtos de fusão foram, depois, inseridos utilizando uma estratégia de 5'-XhoI e 3'-NotI semelhante dentro de pGAPZ-alfa. (SEQ ID N°: 13 e SEQ ID N°: 14 para a versão glicosilada; SEQ ID N°: 15 para a versão aglicosilada; SEQ ID N°: 16 para o fragmento Fab). As sequências de ADN de genes de anticorpo apropriadas em todos os vectores foram confirmadas por sequenciação de ADN directa, antes de trabalho posterior.

Transformação de vectores de expressão dentro de estirpes hospedeiras adel ura3, meti e lys3 haplóides de P. pastoris. Todos os métodos utilizados para transformação de estirpes de P. pastoris haplóides e manipulação genética do ciclo sexual de P. Pastoris foram como descrito em Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Ed. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ. 35

Antes da transformação, cada vector de expressão foi linearizado dentro das sequências promotoras GAP com Avrll para dirigir a integração dos vectores dentro do lócus do promotor GAP do genoma de P. pastoris. As amostras de cada vector foram, depois, individualmente transformadas para dentro de culturas electrocompetentes das estirpes adel, ura3, meti e lys3 por electroporação e os transformantes bem-sucedidos foram seleccionados em placas de YPD Zeocina pela sua resistência a este antibiótico. As colónias resultantes foram seleccionadas, riscadas para colónias únicas em placas de YPD Zeocina e, depois, examinadas para a presença do gene de anticorpo inserido por um ensaio de PCR em ADN genómico extraído de cada estirpe para o inserto génico de anticorpo apropriado e/ou pela capacidade de cada estirpe sintetizar uma cadeia de anticorpo por um método de descolamento/imunotransferência de colónias (Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996). As estirpes adel, meti e lys3 haplóides expressando uma das três construções de cadeia pesada foram recolhidas para construções diplóides, juntamente com a estirpe ura3 haplóide expressando o gene de cadeia leve. O haplóide expressando genes de cadeia pesada foi conjugado com o ura3 haplóide de cadeia leve apropriado para gerar proteína segregando diplóide.

Conjugação de estirpes haplóides sintetizando uma única cadeia de anticorpo e selecção de derivados diplóides sintetizando anticorpos funcionais tetraméricos. Para conjugar estirpes haplóides de P. pastoris, cada estirpe produzindo cadeia pesada de adel (ou meti ou lys3) a ser cruzada foi riscada através de uma placa rica em YPD e a estirpe produzindo cadeia leve de ura3 foi riscada através de uma segunda placa de YPD (—10 riscados por placa). Após incubação de um ou dois dias, a 30 °C, células de uma placa contendo estirpes de cadeia pesada 36 e uma placa contendo estirpes de cadeia leve de ura3 foram transferidas para um tecido de veludo estéril, num bloco de plaqueamento em duplicado num padrão sombreado em cruz, de modo que cada estirpe de cadeia pesada contivesse uma camada de células misturada com cada estirpe de cadeia leve. As células plaqueadas em duplicado riscadas em cruz foram, depois, transferidas para uma placa de conjugação e incubadas, a 25 °C, para estimular a iniciação da conjugação entre estirpes. Após dois dias, as células nas placas de conjugação foram novamente transferidas para um veludo estéril num bloco de plaqueamento em duplicado e, depois, transferidas para placas de meio mínimo. Estas placas foram incubadas a 30 °C, durante três dias, para permitir o crescimento selectivo de colónias de estirpes diplóides prototróficas. As colónias que surgiram foram recolhidas e riscadas sobre uma segunda placa de meio mínimo para isolar colónias únicas e purificar cada estirpe diplóide. As linhas celulares diplóides resultantes foram, depois, examinadas para produção de anticorpo.

As putativas estirpes diplóides foram testadas para demonstrar que eram diplóides e continham ambos os vectores de expressão para a produção de anticorpo. Para diploidia, as amostras de uma estirpe foram dispersas em placas de conjugação para as estimular a entrarem em meiose e formarem esporos. Os produtos de esporos haplóides foram recolhidos e testados para fenótipo. Se uma percentagem significativa dos produtos de esporos resultantes fosse de auxotróficos únicos ou duplos, concluía-se que a estirpe original devia ter sido diplóide. As estirpes diplóides foram examinadas para a presença de ambos os genes de anticorpo, pela extracção de ADN genómico de cada e utilizando este ADN em reacções de PCR específicas para cada gene. 37

Fusão de estirpes haplóides sintetizando uma única cadeia de anticorpo e selecção de derivados diplóides sintetizando anticorpos funcionais tetraméricos. Como uma alternativa ao processo de conjugação descrito acima, culturas individuais de estirpes adel e ura3 haplóides produzindo anticorpo de cadeia simples foram convertidas em esferoplastos e os seus esferoplastos resultantes fundidos utilizando polietileno glicol/CaCl2. As estirpes haplóides fundidas foram, depois, embebidas em ágar contendo sorbitol a 1 M e meio mínimo para permitir que as estirpes diplóides regenerem a sua parede celular e cresçam em colónias visíveis. As colónias resultantes foram repicadas do ágar, riscadas sobre uma placa de meio mínimo e as placas incubadas, durante dois dias, a 30 °C, para gerar colónias a partir de células únicas de linhas celulares diplóides. As putativas linhas celulares diplóides resultantes foram, depois, examinadas para diploidia e produção de anticorpo, como descrito acima.

Purificação e análise de anticorpos. Uma estirpe diplóide para a produção de anticorpo de comprimento total foi derivada através da conjugação da estirpe 2252 de cadeia leve ura3 e estirpe 2254 de cadeia pesada lys3, utilizando os métodos descritos acima. Os meios de cultura de culturas de frascos de agitação ou fermentador de estirpes de expressão de P. pastoris diplóides foram recolhidos e examinados para a presença de proteína de anticorpo, por meio de SDS-PAGE e imunotransferência, utilizando anticorpos dirigidos contra cadeias pesadas e leves de IgG humana ou, especificamente, contra a cadeia pesada de IgG. Os dados são mostrados na Figura 2 . 38

Para purificar os anticorpos segregados por levedura, os meios clarificados de culturas produzindo anticorpos foram passados através de uma coluna de proteína A e, após lavagem com fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,0, tampão de ligação, a proteína ligada a proteína A foi eluída utilizando tampão de glicina-HCl a 0,1 M, pH 3,0. As fracções contendo a maioria da proteína total foram examinadas por SDS-PAGE corado com azul de Coomasie e imunotransferência para proteína de anticorpo. As fracções também foram examinadas por meio de um ensaio ELISA, no qual placas de microtitulação foram, em primeiro lugar, revestidas com IgG de cabra anti-humano de F(ab')2, Fcy (Jackson Immuno, Cat N° 109-006-008). Em seguida, as placas foram colocadas em reacção com diluições seleccionadas de anticorpos feitos por levedura. Finalmente, as placas foram colocadas em reacção com o fragmento F(ab')2 de cabra anti-humano conjugado a HRP de F(ab')2 de IgG (Jackson Immuno, Cat N° 109-036-097). As placas foram, depois, reveladas com substrato de TMP (Sigma Chemical) e as reacções foram neutralizadas com HC1 a 0,5 M. Os resultados foram quantificados num leitor de placa de microtitulação BioRad, a 415 nm. Os dados são ilustrados na Figura 3.

Ensaio para actividade de anticorpo. 0 anticorpo quimérico derivado de levedura recombinante foi avaliado para actividade funcional, através de coloração imuno-histoquímica de células contendo o antigénio alvo. O anticorpo quimérico reconhece, selectivamente, o complexo de CD3 encontrado em células T. As células T de Jurkat foram empregues como uma fonte de antigénio e a coloração de superfície celular foi conduzida utilizando processos descritos em Andersson and Sander (Immunol Lett. 31 de Janeiro de 1989; 20(2):115-20) ou Andersson et al. (Eur J Immunol. Dez. de 1988; 18(12):2081-4). 39

As células T de Jurkat foram imobilizadas em lâminas de vidro, bloqueadas com o soro de bloqueio apropriado e coradas com anticorpo primário recombinante gerado por mamífero e levedura, durante 1 hora. As amostras imobilizadas foram, depois, tratadas com agente de bloqueio de peroxidase, seguido de coloração com um anticorpo secundário selectivo de Fc biotinilado que é específico para cada forma do anticorpo (anti-murganho para o mamífero e anti-humano para a levedura). A detecção foi realizada utilizando um sistema de HRP-Estreptavidina. A imagiologia digital foi realizada para recolher os dados para cada amostra corada. 0 sinal positivo é detectado em amostras por meio de uma coloração escura das células observadas nos painéis para OKT-3 derivado de mamífero e derivado de levedura. Estes dados são mostrados na Figura 4. 40

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Cregg, James M.

Latham, John Litton, Mark Schatzman, Randall Tolstorukov, Ilya <120> Métodos de síntese de polipéptidos heteromultiméricos em levedura utilizando uma estratégia de conjugação haplóide

<130> ALDR-OOIWO <140> não atribuído <141> 2004-10-22 <150> 60/513876 <151> 2003-10-22 <160> 16 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 47 <212> ADN <213> murganho <400> 1 ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcag gtcoagctgc agcagtc 47 41 <210> 2 <211> 41 <212> ADN <213> murganho <400> 2 tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gagagtggtg c 41 <210> 3 <211> 50 <212> ADN <213> murganho <400> 3 ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcaa attgttctca cccagtctcc 50 <210> 4 <211> 44 <212> ADN <213> murganho <4 0 0> 4 gacagatggt gcagccacag cccggtttat ttccaacttt gtcc 44 <210> 5 <211> 38 <212> ADN <213> homo sapien <400> 5 ataagaatgc ggccgctcat ttacccggag acagggag 38 <210> 6 <211> 41 42 41 <212> ADN <213> homo sapien <4 Ο Ο> 6 gcaccactct cacagtctcc tcagcctcca ccaagggccc a <210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> homo sapien <400> 7 tgcggccgct catgggcacg gtgggcatgt gt 32 <210> 8 <211> 39 <212> ADN <213> homo sapien <400> 8 ataagaatgc ggccgctaac actctcccct gttgaagct 39 <210> 9 <211> 44 <212> ADN <213> homo sapien <400> 9 ggacaaagtt ggaaataaac cgggctgtgg ctgcaccatc tgtc 44 <210> 10 <211> 212 <212> PRT <213> homo sapien 43 <4 Ο 0> 10 Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met Asn 20 25 30 Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Vai Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai 130 135 140 Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 145 150 155 160 Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys A.la Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Vai Thr His Gin Gly ' Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205

Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 321 <212> ADN <213> murganho <400> 11 caaattgttc tcacccagtc atgacctgca gtgccagctc acctccccca aaagatggat ttcaggggca gtgggtctgg gatgctgcca cttattactg acaaagttgg aaataaaccg tccagcaatc atgtctgcat aagtgtaagt tacatgaact ttatgacaca tccaaactgg gacctcttac tctctcacaa ccagcagtgg agtagtaacc g ctccagggga gaaggtcacc 60 ggtaccagca gaagtcaggc 120 cttctggagt ccctgctcac 180 tcagcggcat ggaggctgaa 240 cattcacgtt cggctcgggg 300 321 <210> 12 <211> 321 44 <212> ADN <213> homo sapien <400> 12 gctgtggctg actgcctctg aaggtggata aaggacagca cacaaagtct ttcaacaggg caccatctgt ttgtgtgcct acgccctcca cctacagcct acgcctgcga gagagtgtta cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 g 321 <210> 13 <211> 449

<212> PRT <213> homo sapien <400> 13

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Leu Ala Arg Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Met 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Arg Tyr Thr Met His 35 Trp Vai Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Tyr 50 Ile Asn Pro Sex Arg 55 Gly Tyr Thr Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Phe Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Thr Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80 Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Tyr Tyr 100 Asp Asp His Tyr Cys 105 Leu Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Thr Leu 115 Thr Vai Sex Ser Ala 120 Ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser Vai Phe Pro Leu 130 Ala Pro Ser Sex Lys 135 Ser Thr Ser Gly Gly 140 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu Vai Lys Asp 150 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 Vai Thr Vai Ser Trp 160 Asn Ser Gly Ala Leu 165 Thx Ser Gly Vai His 170 Thr Phe Pro Ala Vai 175 Leu 45

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai 290 295 300 Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Lys <210> 14 <211> 1350 <212> ADN <213> homo sapien <400> 14 46 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa tcctgcaagg cttctggcta cacctttact cctggaoagg gtctggaatg gattggatac aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg atgcaactga gcagcctgac atctgaggac gatgatcatt actgccttga ctactggggc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc gccaaagggc agccccgaga accacaggtg ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120 attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 tacaccctgc ctccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350 <210> 15 <211> 1350 <212> ADN <213> homo sapien <4 0 0> 15 47 caggtccagc tcctgcaagg cc-tggacagg aa tcagaagt atgcaactga gatgatcatt tccaccaagg acagcggccc aactcaggcg ct ctactccc atctgcaacg t c t t gt ga c a tcagtcttcc gtcacatgcg gtggacggcg gcctaccgtg tacaagtgca gccaaagggc accaagaacc gtçrgagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctct tgoagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 cttctggcta cacctttact aggtacacga tgoactgggt aaaacagagg 120 gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360 gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggotc tgcacaacca ctacacgcag 1320 ccctgtctcc gggtaaatga 1350 <210> 16 <211> 6 9 9 <212> ADN <213> homo sapien <400> 16 caggtccagc tgcagcagtc tcctgcaagg cttctggcta cctggacagg gtctggaatg aatcagaagt tcaaggacaa atgcaactga gcagcctgac gatgatcatt actgccttga tccaccaagg gcccatcggt acagcggccc tgggctgcct aactcaggcg ccctgaccag ctctactccc tcagcagcgt atctgcaacg tgaatcacaa tcttgtgaca aaactcacac tggggctgaa ctggcaagac cacctttact aggtacacga gattggatac attaatccta ggccacattg actacagaca atctgaggac tctgcagtct ctactggggc caaggcacca cttccccctg gcaccctcct ggtcaaggac tacttccccg cggcgtgcac accttcccgg ggtgaccgtg ccctccagca gcccagcaac accaaggtgg atgcccaccg tgcccatga ctggggcctc agtgaagatg 60 tgcactgggt aaaacagagg 120 gccgtggtta tactaattac 180 aatcctccag cacagcctac 240 attactgtgc aagatattat 300 ctctcacagt ctcctcagcc 360 ccaagagcac ctctgggggc 420 aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 ctgtcctaca gtcctcagga 540 gcttgggcac ccagacctac 600 acaagaaagt tgagcccaaa 660 699 48

Claims (37)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a síntese e recuperação de uma proteína heteromultimérica heteróloga (não levedura) segregada, biologicamente activa, que é constituída por, pelo menos, duas cadeias polipeptídicas subunitárias não idênticas, caracterizado por as seguintes etapas: (i) produção de uma célula ou células de levedura Pichia diplóide estável, por conjugação ou fusão de esferoplastos de células de Pichia haplóides, sob condições tais que os referidos eventos de conjugação ou fusão de esferoplastos resultem na produção de uma célula ou células de Pichia diplóide, em que a referida célula ou células de Pichia diplóide, após a referida conjugação ou fusão, compreende construções de expressão que proporcionam para a expressão e secreção das, pelo menos, duas cadeias polipeptídicas não idênticas que constituem a referida proteína heteromultimérica e cujas células de Pichia diplóides estáveis são capazes de agrupamento e expressão e secreção prolongadas da referida proteína heteromultimérica para um meio de cultura contendo a ou as referidas células de Pichia diplóides estáveis, quando a referida célula ou células de Pichia diplóide é ou são cultivadas sob condições de cultura apropriadas; (ii) após se efectuar a referida conjugação ou fusão de esferoplastos, identificação e isolamento da célula ou células de levedura Pichia diplóide resultante que contém construções de expressão que proporcionam para a expressão e secreção estáveis das, pelo menos, duas 1 cadeias polipeptídicas não idênticas que constituem a referida proteina heteromultimérica, quando a referida célula ou células de Pichia diplóide é ou são cultivadas sob condições de cultura apropriadas; (iii) cultivo da referida célula ou células de Pichia diplóide isolada ou sua progenia diplóide num meio de cultura, sob condições que resultem na expressão, agrupamento e secreção da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa para o meio de cultura; e (iv) recuperação da proteína heteromultimérica resultante do meio de cultura.
2. 2. Método da reivindicação 1, caracterizado por a referida conjugação ou fusão de esferoplastos ser efectuada pela conjugação ou fusão de uma primeira célula haplóide de levedura contendo uma primeira construção de expressão, a referida primeira construção de expressão contendo sequências de ácidos nucleicos codificando para a expressão de, pelo menos, uma subunidade da referida proteina heteromultimérica ligada, de um modo operativo, a um primeiro promotor de levedura; e uma segunda célula haplóide de levedura contendo uma segunda construção de expressão, a referida segunda construção de expressão compreendendo sequências de ácidos nucleicos codificando para a ou as restantes subunidades da referida proteína heteromultimérica ligada, de um modo operativo, a um segundo promotor de levedura. 2
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas células de Pichia serem seleccionadas do grupo consistindo em Pichia pastoris, Pichia methanolica e Pichia angusta.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as referidas células de Pichia serem Pichia pastoris.
5. 5. Método da reivindicação 1, caracterizado por a proteína heteromultimérica ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo de ligação de antigénio.
6. 6. Método da reivindicação 1, caracterizado por as referidas construções genéticas estarem integradas no genoma das referidas células de Pichia diplóides.
7. 7. Método da reivindicação 1, caracterizado por as referidas construções genéticas estarem contidas num elemento extracromossómico (plasmídeo).
8. 8. Método da reivindicação 1, caracterizado por o primeiro ou segundo promotores serem constitutivos.
9. 9. Método da reivindicação 1, caracterizado por o primeiro ou segundo promotores serem indutíveis.
10. 10. Método da reivindicação 1, caracterizado por as células de levedura diplóides serem cultivadas em meios de produção.
11. 11. Método da reivindicação 10, caracterizado por os referidos meios de produção serem meios mínimos. 3
12. 12. Método da reivindicação 11, caracterizado por os referidos meios mínimos serem desprovidos de agentes selectivos.
13. 13. Método da reivindicação 11, caracterizado por os referidos meios mínimos serem desprovidos de aminoácidos pré-formados ou outras biomoléculas complexas.
14. 14. Método da reivindicação 1, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas até uma elevada densidade celular.
15. 15. Método da reivindicação 14, caracterizado por a referida elevada densidade celular ser, pelo menos, 50 g/L.
16. 16. Método da reivindicação 15, caracterizado por a referida elevada densidade celular ser, pelo menos, 100 g/L.
17. 17. Método da reivindicação 16, caracterizado por a referida elevada densidade celular ser, pelo menos, 300 g/L.
18. 18. Método da reivindicação 17, em que a referida elevada densidade celular é, pelo menos, 400 g/L.
19. 19. Método da reivindicação 18, caracterizado por a referida elevada densidade celular ser, pelo menos, 500 g/L.
20. 20. Método da reivindicação 1, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas sob condições resultando em níveis da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa que são, pelo menos, 50 mg/L. 4
21. 21. Método da reivindicação 20, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas sob condições resultando em níveis da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa no meio de cultura que são, pelo menos, 100 mg/L.
22. 22. Método da reivindicação 21, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas sob condições resultando em níveis da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa no meio de cultura que são, pelo menos, 500 mg/L.
23. 23. Método da reivindicação 22, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas sob condições resultando em níveis da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa no meio de cultura que são, pelo menos, 1000 mg/L.
24. 24. Método da reivindicação 1, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 20 duplicações e mantendo elevados níveis de expressão da referida proteína heteromultimérica após as referidas, pelo menos, 20 duplicações.
25. 25. Método da reivindicação 24, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 50 duplicações e mantendo elevados níveis de expressão da referida proteína heteromultimérica após as referidas, pelo menos, 50 duplicações.
26. 26. Método da reivindicação 25, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 5 100 duplicações e mantendo elevados níveis de expressão da referida proteína heteromultimérica após as referidas, pelo menos, 100 duplicações.
27. 27. Método da reivindicação 1, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 20 duplicações e após as referidas, pelo menos, 20 duplicações, pelo menos, 99% das referidas células diplóides compreendem as referidas construções de expressão que proporcionam para a expressão das referidas cadeias constituindo a referida proteína heteromultimérica.
28. 28. Método da reivindicação 27, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 50 duplicações e após as referidas, pelo menos, 50 duplicações, pelo menos, 99% das referidas células diplóides compreendem as referidas construções de expressão que proporcionam para a expressão das referidas cadeias constituindo a referida proteína heteromultimérica.
29. 29. Método da reivindicação 28, caracterizado por as referidas células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 100 duplicações e após as referidas, pelo menos, 100 duplicações, pelo menos, 99% das referidas células diplóides compreendem as referidas construções de expressão que proporcionam para a expressão das referidas cadeias constituindo a referida proteína heteromultimérica.
30. 30. Método da reivindicação 1, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 20 duplicações e após as referidas, pelo menos, 20 duplicações expressam a proteína heteromultimérica a um 6 nível de expressão que é reduzido em não mais de 20% em relação ao nível de expressão de partida.
31. 31. Método da reivindicação 30, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 50 duplicações e após as referidas, pelo menos, 50 duplicações expressam a proteína heteromultimérica a um nível de expressão que é reduzido em não mais de 20% em relação ao nível de expressão de partida.
32. 32. Método da reivindicação 31, caracterizado por as células de Pichia diplóides serem cultivadas durante, pelo menos, 100 duplicações e após as referidas, pelo menos, 100 duplicações expressam a proteína heteromultimérica a um nível de expressão que é reduzido em não mais de 20% em relação ao nível de expressão de partida.
33. 33. Método da reivindicação 30, 31 ou 32, caracterizado por as células de Pichia diplóides expressarem a proteína heteromultimérica a um nível de expressão que é reduzido em não mais de 10% em relação ao nível de expressão de partida.
34. 34. Método da reivindicação 30, 31 ou 32, caracterizado por as células de Pichia diplóides expressarem a proteína heteromultimérica a um nível de expressão que é reduzido em não mais de 5% em relação ao nível de expressão de partida.
35. 35. Método da reivindicação 1, caracterizado por a referida cultura contendo as referidas células de Pichia diplóides, ser cultivada a uma temperatura que não é mais de 22 graus C. 7
36. 36. Meio de cultura contendo uma cultura de Pichia diplóide estável de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, caracterizado por o meio de cultura compreender níveis de expressão da referida proteína heteromultimérica biologicamente activa que são, pelo menos, cerca de 50 mg/litro, 100 mg/litro, 500 mg/litro ou 1000 mg/litro ou mais.
37. 37. Meio de cultura contendo uma cultura de Pichia diplóide estável, de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4, caracterizado por expressar a referida proteína heteromultimérica para um meio de cultura, em que a densidade celular das referidas células de Pichia diplóides na referida cultura é, pelo menos, cerca de 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L ou mais. 8