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CN1871359B - 使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法 - Google Patents

使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法 Download PDF

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CN1871359B CN2004800312173A CN200480031217A CN1871359B CN 1871359 B CN1871359 B CN 1871359B CN 2004800312173 A CN2004800312173 A CN 2004800312173A CN 200480031217 A CN200480031217 A CN 200480031217A CN 1871359 B CN1871359 B CN 1871359B
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Abstract

本发明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。将第一种表达载体转化到第一种单倍体细胞中；并将第二种表达载体转化到第二种单倍体细胞中。鉴定各自合成不同多肽的这两种经转化单倍体细胞，然后进行遗传杂交或融合。将由此产生的二倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学功能的异聚多亚基蛋白。

Description

使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法
发明背景
重组蛋白生产是高通量筛选、功能验证、结构生物学、和药物多肽生产的一项必需工作。大肠杆菌是广泛用于表达异源蛋白的生物体，因为它易于在便宜的培养基上生长至高细胞密度，且具有完善建立的遗传技术和表达载体。然而，这对高效生产活性生物分子并非总是足够的。为了保持生物学活性，多肽链必需折叠成正确的天然三维结构，包括适当形成二硫键，而且可能还需要正确联合多种链。
尽管蛋白质的活性状态在热力学上可能是有利的，然而折叠的时间量程可以由几毫秒至几天变化。例如对亚基和亚结构域排列的需要导入了动力学屏障。而且，特别是真核蛋白，为了形成正确折叠的蛋白质，必需发生共价反应。后一类反应包括二硫键的形成、脯氨酸肽键周围多肽链的顺式/反式异构化、前蛋白质(preprotein)的加工、和辅基的连接。这些动力学限制可能导致部分折叠中间物的积聚，而它们所包含的暴露的疏水性“粘性”表面促进自我结合和集合体的形成。
抗体是在临床诊断和治疗中具有许多用途的四聚体蛋白质。每个抗体四聚体由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。特定类型的纯粹人源或人源化抗体难以或不可能由天然来源纯化足够数量以用于许多目的。结果是，生物技术和制药公司转向通过基于重组DNA的方法来进行大规模制备。功能抗体的生产不仅需要合成两种多肽，而且需要许多翻译后修饰，包括N端分泌信号序列的蛋白水解加工；多肽正确折叠和组装成四聚体；二硫键的形成；和特定的N-连接糖基化。所有这些事件都发生在真核细胞分泌途径中，即真核细胞独特的细胞器联合体。
这些复杂蛋白质的重组合成必需依赖基于高等真核组织培养的系统来获得生物学活性物质。然而，基于哺乳动物组织培养的生产系统显著比微生物发酵方法更加昂贵和复杂。另外，关于使用衍生自动物副产品的物质来生产治疗性产品仍然存在怀疑。
作为真核细胞，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)具有高等真核表达系统的许多优点，诸如蛋白质加工、蛋白质折叠、和翻译后修饰，同时又像大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)那样易于操作。它比其它真核表达系统诸如杆状病毒或哺乳动物组织培养要更快、更容易、且更便宜，而且通常得到更高表达水平。作为酵母，它享有与糖酵母属一样的分子和遗传操作优势。这些特点使得毕赤氏酵母成为非常有用的蛋白质表达系统。
为糖酵母属开发的许多技术可应用于毕赤氏酵母属，包括互补转化、基因破坏、和基因取代。另外，用于糖酵母属的命名法已应用于毕赤氏酵母属。糖酵母属和毕赤氏酵母属二者基因产物之间还存在交叉互补。来自糖酵母属的几种野生型基因补足了毕赤氏酵母属的对应突变基因。
在巴斯德毕赤氏酵母中进行的异源表达可以是胞内的或分泌的。分泌要求所表达蛋白质上存在信号序列，从而将它靶向分泌途径。尽管已经成功使用了几种不同的分泌信号序列，包括一些异源蛋白上存在的天然分泌信号，然而结果是易变的。异源蛋白分泌的一项潜在优势是巴斯德毕赤氏酵母分泌天然蛋白的水平很低。考虑到毕赤氏酵母基本生长培养基中蛋白质的数量很低，这意味着所分泌异源蛋白占据了培养基中总蛋白质的极大部分，并且作为蛋白质纯化的第一步。
许多酵母物种(包括毕赤氏酵母属)是能够进行交配的。这使得两种不同单倍体菌株能够天然交配并生成具有两个染色体拷贝的二倍体物种。
尽管巴斯德毕赤氏酵母已经成功用于生产多种异源蛋白，例如乙肝表面抗原(Cregg等，1987，Bio/Technology 5：479)、溶菌酶、和转化酶(Digan等，1988，Dev.Indust.Micro.29：59；Tschopp等，1987，Bio/Technology 5：1305)，然而在毕赤氏酵母中生产其它异源基因产物的努力(尤其是通过分泌)得到了不同的结果。在目前对巴斯德毕赤氏酵母表达系统的理解水平，不能预测是否能够在这种酵母中将给定基因表达到明显水平，或者毕赤氏酵母是否能够耐受在它的细胞中存在重组基因产物。另外，尤其难以预报特定蛋白质是否会由巴斯德毕赤氏酵母分泌，以及效率如何(如果分泌的话)。
本发明提供了用于由能交配的酵母(包括毕赤氏酵母属物种)分泌异源异多聚体的改进方法。
发明概述
本发明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。目的异聚多亚基蛋白包含至少两种不同的多肽链，例如抗体的重链和轻链、MHC的α和β链、诸如此类。为每一种不同多肽链提供表达载体。
将每一种表达载体转化到单倍体酵母细胞中。在本发明的有些实施方案中，单倍体酵母细胞是有遗传标记的，其中单倍体酵母细胞是互补对中的一员。将第一种表达载体转化到第一种单倍体细胞中；并将第二种表达载体转化到第二种单倍体细胞中。通过直接遗传融合使单倍体细胞发生交配，或者通过原生质球融合诱导相似事件。
可以各个校准不同多肽在单倍体细胞中的表达水平，并通过适当的选择、载体的拷贝数、启动子的强度和/或诱导、诸如此类进行调整。在本发明的一个实施方案中，每一种表达载体中的启动子是不同的。在本发明的另一个实施方案中，为每一种表达载体提供了相同的启动子。启动子可以是组成型的或诱导型的。
鉴定各自合成不同多肽的经转化单倍体细胞，然后进行遗传杂交或融合。将由此产生的二倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学功能的异聚多亚基蛋白。二倍体方法学容许优化亚基配对，从而提高全长产物的生成和分泌。
附图描述
图1A-1D。组装完成的全长重组抗体的生成。使用免疫印迹检测方法学来鉴定各自生成抗体一种亚基的亲本单倍体毕赤氏酵母菌株以及生成两种亚基并形成完整组装抗体的目标二倍体菌株。图1A所示酵母菌株显示了各自代表性菌株的静态培养物，其中顶部是分别含有重链(H)和轻链(L)亚基的不同单倍体菌株；底部是生成两种亚基的交配后稳定的二倍体。图1B显示了重链的选择性检测，只发现于亲本重链单倍体以及含有重链和轻链二者的交配后二倍体。图1C显示了重链和轻链的一般检测，它确定了所有三种菌株中生成的蛋白质都是有活性的。图1D显示了二倍体菌株中正确组装的完整抗体的选择性检测，确认了只有二倍体系统能够生成完整组装的抗体。
图2。巴斯德毕赤氏酵母中全长抗体的生成。使用二倍体巴斯德毕赤氏酵母菌株进行全长抗体的异源表达。使用蛋白A亲和层析由条件培养基分离所输出的抗体蛋白。显示了峰级分的等份试样。人IgG标准物衍生自纯化的合并人IgG。
图3。由经改造生成全长小鼠/人嵌合抗体的二倍体巴斯德毕赤氏酵母菌株亚克隆的培养基上清液检测和鉴定组装完成的抗体。用抗人Fc选择性抗体包被微量滴定板，由培养基捕捉抗体。使用识别配对的重链CH1和κ轻链恒定区的人选择性(Fab′)2检测正确组装的抗体。将澄清培养基的连续稀释液施加到板上。通过标准ELISA显像方法进行显影。如图所示，检测是选择性的，mIgG标准物没有产生任何可检测信号。
图4。由毕赤氏酵母生成的重组抗体以及传统哺乳动物衍生抗体将包含CD3的Jurkat T细胞染色。将Jurkat T细胞固定在载波片上，并使用在酵母和哺乳动物细胞中生成的抗CD3抗体进行染色。使用生物素缀合抗啮齿类二抗进行检测，并用HRP-链霉亲和素衍生物进行显影。图像是用各种重组抗体处理的载玻片上的代表性视野。背景是显影的对照，即不使用抗CD3一抗。
实施方案详述
由能交配的酵母的二倍体菌株分泌重组异聚多亚基蛋白。用包含异聚多亚基蛋白的亚基的表达载体转化一对有遗传标记的酵母单倍体细胞。第一种单倍体细胞包含第一种表达载体，且第二种单倍体细胞包含第二种表达载体。任选的是，为了合成异三聚物、异四聚物等，可以将额外的表达载体导入单倍体或二倍体细胞，或者第一种或第二种表达载体可以包含额外的编码序列。可以各个校准不同多肽的表达水平，并通过适当的选择、载体的拷贝数、启动子的强度和/或诱导、诸如此类进行调整。将经转化单倍体细胞进行遗传杂交或融合。将由此产生的二倍体或四倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学活性的异聚多亚基蛋白。
使用二倍体或四倍体细胞来生成蛋白质提供了意想不到的好处。可以出于生产目的即扩大规模，在延长的一段时间里，在可能对单倍体细胞的生长有害的条件下培养细胞，所述条件可以包括：高细胞密度；在基本培养基中生长；在低温生长；在缺乏选择压力下稳定生长；以及为了维持异源基因序列的完整性和长时间维持高水平表达可能提供的条件。这些好处可能至少部分源自由两个不同亲本单倍体菌株形成二倍体菌株。这些单倍体菌株可以包含许多次要的自养突变，这些突变在二倍体或四倍体中得到互补，从而能够在高度选择条件下生长。
定义
应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案、细胞系、动物物种或属、和试剂，因为它们是可以改变的。还应当理解，本文所使用的术语只是出于描述具体实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明范围只受到所附权利要求的限制。
在用于本文时，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非文中另有明确指示。由此，例如，提到“细胞”包括一群这样的细胞，提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质及其本领域技术人员知道的等同物，诸如此类。本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的含义，除非另有明确指示。
能交配的酵母物种：这些酵母物种以单倍体和二倍体形式存在。二倍体细胞在合适条件下可以以二倍体形式增殖无限代。二倍体细胞还能够形成孢子而形成单倍体细胞。另外，通过营养缺陷型二倍体的交配，连续交配可能产生四倍体菌株。
在本发明的一个实施方案中，能交配的酵母是糖酵母科(Saccharomycetaceae)的成员，包括Arxiozyma、Ascobotryozyma、固囊酵母属(Citeromyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、德克氏酵母属(Dekkera)、假囊酵母属(Eremothecium)、伊氏酵母属(Issatchenkia)、Kazachstania、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、Kodamaea、Lodderomyces、Pachysolen、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、Saturnispora、Tetrapisispora、有孢圆酵母属(Torulaspora)、拟威尔氏酵母属(Williopsis)、和接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)。
特别感兴趣的是毕赤氏酵母属。毕赤氏酵母属包括许多物种，包括巴斯德毕赤氏酵母、Pichia methanolica、和多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha，Pichia angusta)。最优选的物种是巴斯德毕赤氏酵母。
单倍体酵母细胞：在其正常基因组(染色体)编制中每种基因只有一个拷贝的细胞。
二倍体酵母细胞：在其正常基因组编制中每种基因有两个拷贝(等位基因)的细胞，通常是通过两个单倍体细胞的融合(交配)过程形成的。
四倍体酵母细胞：在其正常基因组编制中每种基因有四个拷贝(等位基因)的细胞，通常是通过两个二倍体细胞的融合(交配)过程形成的。四倍体可以携带两种、三种、或四种不同的盒。为了获得这些四倍体，在酿酒酵母中，可以将纯合的异宗配合的a/a与α/α二倍体进行选择性交配；而在毕赤氏酵母中，可以将单倍体连续交配获得营养缺陷型二倍体。例如，可以将[met his]单倍体与[ade his]单倍体交配获得二倍体[his]，将[met arg]单倍体与[ade arg]单倍体交配获得二倍体[arg]，然后将二倍体[his]与二倍体[arg]交配得到四倍体原养型。本领域技术人员应当理解，对二倍体细胞提到的优点和用途也适用于四倍体细胞。
酵母交配：两个单倍体酵母细胞天然融合而形成一个二倍体酵母细胞的过程。
减数分裂：二倍体酵母细胞进行减数的分裂而形成四个单倍体孢子产物的过程。然后，每个孢子可以发芽并形成单倍体无性生长细胞系。
选择标记：选择标记指赋予接受(例如通过转化事件)该基因的细胞以生长表型(物理生长特征)的基因或基因片段。选择标记容许细胞在未接受该选择标记的细胞不能生长的条件下在选择性培养基中存活和生长。选择标记基因通常分成几类，包括：正选择标记基因，诸如赋予细胞以抗生素或其它药物抗性的基因；温度，将两种ts突变体杂交或转化ts突变体时；负选择标记基因，诸如赋予细胞以在不含某种营养物的培养基中生长的能力的生物合成基因，而不含该生物合成基因的所有细胞都需要这种营养物；或诱变生物合成基因，它使得细胞不能像不含野生型基因的细胞般生长；诸如此类。合适的标记包括但不限于ZEO、G418、HIS5、LYS3、MET1、MET3a、ADE1、ADE3、URA3等等。
表达载体：这些DNA种类包含便于为了在靶宿主细胞内表达外源蛋白而进行的操作的元件。为了方便，首先在细菌宿主(例如大肠杆菌)中进行对序列的操作和用于转化的DNA的生成，载体通常包含便于这些操作的元件，包括细菌复制起点和合适的细菌选择标记。选择标记编码经转化宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白质。未用含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不能存活。选择基因通常编码如下性质的蛋白质：(1)赋予针对抗生素或其它毒素的抗性，(2)补足营养缺陷，或(3)供应不能由复合培养基获得的重要营养物。
用于本发明方法的表达载体还将包含酵母特异序列，包括用于鉴定经转化酵母菌株的可选择营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于扩增酵母宿主细胞中的载体拷贝数。
将目的多肽编码序列与为了在酵母细胞中表达多肽而提供的转录和翻译调控序列可操作连接。这些载体成分可以包括但不限于下列一项或多项：增强子元件、启动子、和转录终止序列。还可以包含用于分泌多肽的序列，例如信号序列等。酵母复制起点是可选的，因为表达载体常常整合到酵母基因组中。
在本发明的一个实施方案中，将目的多肽与为了优化酵母二倍体细胞分泌多肽而提供的序列可操作连接或融合。
当核酸与另一段核酸序列在位置上功能相关时，则它们是“可操作连接”的。例如，若信号序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质，则认为它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则认为它与该序列可操作连接。一般而言，“可操作连接”指相连DNA序列是邻近的，而且在分泌前导序列的情况中是邻近的且处于阅读相。但是增强子不必是邻近的。相连是通过本领域技术人员熟悉的便利限制性位点处的连接反应或者通过PCR/重组法实现的(GatewayR Technology；Invitrogen，Carlsbad，California)。如果不存在这些位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)(通常在约100-1000bp内)的非翻译序列，它控制与它可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译。这些启动子分成几类：诱导型、组成型、和可抑制启动子，最后一种在不存在抑制物时提高转录水平。诱导型启动子可以应答培养条件的某些变化(例如营养物的存在与否或温度的变化)而提高受它控制的DNA的转录水平。
酵母启动子片段还可以担当表达载体进入酵母基因组相同位点的同源重组和整合的位点；或者，使用选择标记作为同源重组的位点。毕赤氏酵母的转化见Cregg等，1985，Mol.Cell.Biol.5：3376-3385。
来自毕赤氏酵母的合适启动子的实例包括AOX1启动子(Cregg等，1989，Mol.Cell.Biol.9：1316-1323)、ICL1启动子(Menendez等，2003，Yeast 20(13)：1097-108)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子(Waterham等，1997，Gene 186(1)：37-44)、和FLD1启动子(Shen等，1998，Gene 216(1)：93-102)。GAP启动子是强组成型启动子，而AOX和FLD1启动子是诱导型的。
可以重组生成目的多肽，或是直接的，或是作为与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特异切割位点的其它多肽)的融合多肽。一般而言，信号序列可以是载体的成分，或者它可以是插入载体的多肽编码序列的一部分。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞内标准途径之一识别和加工的信号序列。酿酒酵母α因子前原信号(pre-prosignal)已经证明在用于由巴斯德毕赤氏酵母分泌多种重组蛋白时是有效的。目的分泌信号还包括哺乳动物信号序列，它对于所分泌的蛋白质可以是异源的，或者对于所分泌的蛋白质可以是天然序列。信号序列包括前肽(pre-peptide)序列，而且在有些情况中可以包括原肽(propeptide)序列。本领域知道许多这样的信号序列，包括在免疫球蛋白链中发现的信号序列，例如K28前毒素原(preprotoxin)、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清清蛋白信号序列、人Ig重链、人Ig轻链、诸如此类。例如见Hashimoto等，1998，ProteinEng.11(2)：75；以及Kobayashi等，1998，Therapeutic Apheresis2(4)：257。
可以通过在载体中插入转录激活子序列来提高转录。这些激活子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，作用于启动子以提高其转录。转录增强子相对不依赖取向和位置，发现位于内含子以及自身编码序列中以及转录单位的5′端和3′端。可以将增强子剪接到表达载体中，位于编码序列的5′端或3′端，但是优选位于启动子的5′端。
用于真核宿主细胞的表达载体还可包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可以由翻译终止密码子的3′端在真核或病毒DNA或cDNA的非翻译区中获得。这些区域包含转录成mRNA非翻译部分中的多聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
采用标准连接技术或PCR/重组方法来构建包含一种或多种上文所列成分的合适载体。以期望的形式将分离的质粒或DNA片段切割、剪裁、并重新连接或者通过重组方法生成所需质粒。为了确认所构建质粒中的序列是正确的，使用连接混合物转化宿主细胞，如果合适，通过适当的抗生素抗性(例如氨苄青霉素或Zeocin)选择成功的转化子。由转化子制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化和/或测序进行分析。
作为将片段限制性切割和连接的替换方法，可以使用基于att位点和重组酶的重组方法将DNA序列插入载体。这些方法见例如Landy，1989，Ann.Rev.Biochem.58：913-949；而且是本领域技术人员知道的。这些方法利用由λ噬菌体和大肠杆菌编码的重组蛋白的混合物介导的分子间DNA重组。重组发生在相互作用的DNA分子上的特异附着(att)位点之间。关于att位点的描述见Weisberg和Landy，1983，Site-Specific Recombination in Phage Lambda，在《Lambda II》中，Weisberg编，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Press，第211-250页。重组位点侧翼的DNA区段发生转换，使得重组后att位点变成杂合序列，包含由每一种亲本载体提供的序列。重组可以发生在具有任何拓扑学的DNA之间。
为了将att位点导入目的序列，可以将目的序列连接到合适的载体中；使用特异引物生成包含att B位点的PCR产物；在含有att位点的合适载体中生成cDNA文库；等等。
折叠：在用于本文时指多肽和蛋白质的三维结构，其中氨基酸残基之间的相互作用起到了稳定结构的作用。尽管非共价相互作用在决定结构时是重要的，然而目的蛋白常常含有由两个半胱氨酸形成的分子内和/或分子间共价二硫键。对于天然存在的蛋白质和多肽或其衍生物和变体，正确的折叠通常指产生最佳生物学活性的排列，而且可以通过活性(例如配体结合、酶促活性等)测定法方便的监测。
在有些情况中，例如当期望的产物源自合成时，基于生物学活性的测定法的意义将降低。可以根据物理特性、能量约束(energeticconsiderations)、建模研究、诸如此类来确定这些分子的正确折叠。
还可以通过导入编码增强折叠和二硫键形成的酶(即折叠酶、陪伴蛋白等)的一种或多种序列来修饰表达宿主。可以使用本领域已知的载体、标记等在酵母宿主细胞中组成性或诱导性表达这些序列。优选的是，通过靶向方法学将包括足以实现期望表达型式的转录调控元件在内的序列稳定整合到酵母基因组中。
例如，真核PDI不仅是蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的有效催化剂，而且还展示陪伴分子的活性。PDI的共表达能够促进具有多个二硫键的活性蛋白质的生成。同样感兴趣的还有BIP(免疫球蛋白重链结合蛋白)、亲环素、诸如此类的表达。在本发明的一个实施方案中，每一种单倍体亲本菌株表达一种不同的折叠酶，例如一种菌株可能表达BIP，另一种菌株可能表达PDI。
术语“期望蛋白”或“靶蛋白”可以互换使用，通常指具有两条或多条不同多肽链的任何分泌蛋白，其中这些链是独立合成的，即不是由一条多肽链的翻译后切割产生的。多肽对于酵母是异源的，即外来的。优选的是，使用哺乳动物多肽，即在哺乳动物基因组中编码的多肽。
在一个优选的实施方案中，蛋白质是抗体。术语“抗体”意图包括任何含多肽链的分子结构，所述分子结构具有适合且识别表位的特定形状，其中一处或多处非共价结合相互作用稳定了分子结构与表位之间的复合物。原型抗体分子是免疫球蛋白，而且认为来自所有来源(例如人、啮齿类、兔、牛、绵羊、猪、犬、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等)的所有类型(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)的免疫球蛋白都是“抗体”。已经描述了许多抗体编码序列，而且通过本领域众所周知的方法还会增加。
例如，可以通过遗传工程生成抗体或抗原结合片段。在这种技术中，正如其它方法一样，使抗体生成细胞对期望抗原或免疫原敏化。使用由抗体生成细胞分离的信使RNA作为模板通过PCR扩增生成cDNA。通过将扩增得到的免疫球蛋白cDNA的合适区段插入表达载体生成了每个载体都包含保留最初抗原特异性的一种重链基因和一种轻链基因的文库。通过联合重链基因文库和轻链基因文库构建组合文库。这导致了共表达重链和轻链(组装抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆的文库。将携带这些基因的载体共转染到宿主细胞中。在经转染宿主中诱导抗体基因合成后，重链和轻链蛋白自我组装，生成可以通过抗原或免疫原筛选检测的活性抗体。
目的抗体编码序列包括由天然序列编码的，以及由于遗传密码简并性因而序列与所公开核酸不同的核酸，及其变体。变体多肽可以包含氨基酸(aa)替代、添加、或删除。氨基酸替代可以是保守的氨基酸替代，或者是清除非必需氨基酸的替代，诸如为了改变糖基化位点，或者为了通过替代或删除一个或多个不是功能必需的半胱氨酸残基而将错误折叠降至最低。变体可以设计成保留或提高蛋白质特定区域(例如功能结构域、催化氨基酸残基等)的生物学活性。变体还包括本文公开的多肽的片段，特别是生物学活性片段和/或对应于功能结构域的片段。用于对克隆的基因进行体外诱变的技术是已知的。本发明还包括通过普通分子生物学技术的修饰而提高了对蛋白水解降解作用的抵抗力或优化了溶解特性或者使之更适于作为治疗剂的多肽。
可以通过重组方法生成嵌合抗体，即将由一种物种的抗体生成细胞得到的轻链和重链可变区(VK和VH)与由另一种物种得到的轻链和重链恒定区结合在一起。通常，嵌合抗体采用啮齿类或兔的可变区和人的恒定区，从而生成人结构域占主体的抗体。这种嵌合抗体的生成在本领域是众所周知的，而且可以通过标准方法来完成(见例如美国专利号5,624,659，完整收入本文作为参考)。
人源化抗体是经过改造包含甚至更多人样免疫球蛋白结构域，而且只掺入动物衍生抗体的互补决定区。这是通过仔细检查单克隆抗体可变区超变环的序列并使之适合人抗体链的结构而完成的。虽然表面上看有些复杂，但是实践过程是直截了当的。见例如美国专利号6,187,287，完整收入本文作为参考。
除了完整免疫球蛋白(或其重组副本)以外，还可以合成包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如Fab′、F(ab′)2、或其它片段)。可以利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小免疫球蛋白。例如，可以通过合成轻链和重链可变区来生成用于本发明的“Fv”免疫球蛋白。对抗体的联合同样感兴趣，例如包含两个不同Fv特异性的diabody。
可以在翻译后修饰免疫球蛋白，例如添加化学接头、可检测模块(诸如荧光染料、酶、底物、化学发光模块、诸如此类)、或特异结合模块(诸如链霉亲和素、亲和素、或生物素)、诸如此类，它们可用于本发明的方法和组合物。
多肽合成方法
经转化的能交配的单倍体酵母细胞提供了能够对期望蛋白进行亚基配对的遗传方法。用两种表达载体中的每一种转化单倍体酵母菌株，第一种载体指导一种多肽链的合成，而第二种载体指导第二种不同多肽链的合成。将两种单倍体菌株交配以提供二倍体宿主，从而获得优化的靶蛋白生成。
任选的是，提供额外的不同编码序列。这些序列可以存在于额外的表达载体上，或者存在于第一种或第二种表达载体中。正如本领域已知的，可以由各个启动子独立表达多种编码序列；或者可以通过包含“内部核糖体进入位点”或“IRES”而进行并列表达，该元件促进核糖体直接进入顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子诸如ATG，由此导致不依赖帽的基因翻译。在酵母中有功能的IRES元件见Thompson等，2001，PNAS 98：12866-12868。
在本发明的一个实施方案中，联合分泌性J链生成抗体序列，该J链提供了增强的IgA稳定性(见美国专利号5,959,177和5,202,422)。
两种单倍体菌株各自是营养缺陷的，为了单倍体细胞的生长需要补充培养基。成对的营养缺陷型是互补的，使得二倍体产物将在缺乏单倍体细胞所需要的补充物的条件下生长。已知酵母中的许多这种遗传标记，包括对氨基酸(例如met、lys、his、arg等)、核苷酸(例如ura3、ade1等)、诸如此类的需要。对于本发明的方法而言，氨基酸标记物可能是优选的。
可以将两种经转化单倍体细胞遗传杂交，并通过它们的杂合营养需求选择源自此交配事件的二倍体菌株。或者，将两种经转化单倍体菌株的群体制成原生质球并融合，重建并选择二倍体后代。通过这两种方法，可以鉴定并选择性培养二倍体菌株，因为与它们的单倍体亲本不同，它们没有相同的营养需求。例如，可以在基本培养基中培养二倍体细胞。二倍体合成策略具有某些优势。二倍体菌株具有通过潜在突变的更广泛互补而提高异源蛋白水平的潜力，其中所述突变可能影响重组蛋白的生成和/或分泌。
在本发明的一个实施方案中，用多肽文库(例如抗体重链或轻链文库)转化每一种单倍体菌株。将合成多肽的经转化单倍体细胞与互补的单倍体细胞进行交配。对由此产生的二倍体细胞筛选功能蛋白。二倍体细胞提供了集合大量多肽组合进行功能检验的快速、方便、且便宜的手段。这种技术尤其可用于生成异聚多亚基蛋白产物，其中优化的亚基合成水平对于功能蛋白的表达和分泌是至关重要的。
在本发明的另一个实施方案中，调整两种亚基的表达水平比例，从而将产物生成最大化。先前已经证明了异二聚亚基蛋白水平影响终产物生成(Simmons LC，2002年5月1日，J Immunol Methods 263(1-2)：133-47)。可以在交配步骤之前通过选择表达载体上存在的标记物来完成调整。通过稳定增加载体的拷贝数，可以提高表达水平。在有些情况中，可能希望相对于一种链提高另一种链的水平，从而在多肽的亚基之间达到平衡的比例。抗生素抗性标记可用于此目的，例如Zeocin抗性标记、G418抗性等，并提供了通过对转化子选择对更高水平Zeocin或G418的抗性来富集含多个整合的拷贝的表达载体的菌株的手段。亚基基因的适当比例(例如1∶1、1∶2等)对于高效蛋白质生成可能是重要的。甚至在使用相同启动子来转录两种亚基时，许多其它因素促成了所表达蛋白质的最终水平，因此相对于一种编码基因增加另一种的拷贝数可能是有用的。或者，通过将都具有多个拷贝表达载体的两种单倍体菌株交配来产生相对于单拷贝载体菌株生成更高水平多肽的二倍体菌株。
用上文所述表达载体转化宿主细胞，交配而形成二倍体菌株，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而适当改进的常规营养培养基中培养。本领域已知适于培养酵母的许多基本培养基。可以根据需要向这些培养基中添加盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素、和葡萄糖或相当的能源。还可以以合适浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。诸如温度、pH、诸如此类的培养条件就是先前用于宿主细胞(用于选择表达)的条件，而且对于本领域普通技术人员而言是明白的。
由培养基回收所分泌的蛋白质。蛋白酶抑制物诸如苯甲基磺酰氯(PMSF)可用于在纯化过程中抑制蛋白水解降解，而且可以包含抗生素以预防外来污染物的生长。可以使用本领域已知方法将组合物浓缩、过滤、透析、等。
出于生产目的培养本发明的二倍体细胞。这些生产目的希望包括在基本培养基中进行的培养，所述培养基缺乏预先形成的氨基酸和其它复杂生物分子，例如包含氨作为氮源、葡萄糖作为能源和碳源、和盐作为磷酸盐、钙、诸如此类的来源的培养基。优选的是，这种生产培养基缺乏选择剂，诸如抗生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。可以将二倍体细胞培养至高细胞密度，例如至少约50g/L；更常见的是至少约100g/L；而且可以是至少约300、约400、约500g/L或更多。
在本发明的一个实施方案中，出于生产目的进行的受试细胞培养是在低温进行的，对数期、稳定期、或二者的温度可能更低。术语“低温”指温度为至少约15℃，更常见的是至少约17℃，而且可以是约20℃，且通常不超过约25℃，更常见的是不超过约22℃。培养温度可能影响生产培养物中全长分泌蛋白的生成，而且降低培养物的培养温度能够大大提高完整产物的产量。温度降低似乎有助于通过宿主用于生成目标产物的折叠和翻译后加工途径的胞内交通，并且降低细胞蛋白酶的降解作用。
本发明的方法提供了用于表达分泌型活性蛋白的方法，特别是分泌型活性抗体，其中“活性抗体”在用于本文时指至少两种正确配对链的正确折叠的多聚物，它能够精确结合它的相关抗原。活性蛋白的表达水平通常是至少约50mg/升培养物，更常见的是至少约100mg/升，优选至少约500mg/升，而且可以是1000mg/升或更多。
本发明的方法能够提高宿主和异源编码序列在生产过程中的稳定性。稳定性是通过例如长时间维持高表达水平而证明的，其中在时间延长约20倍、50倍、100倍、或更长时间后起始表达水平降低不超过约20％，通常不超过10％，而且可能降低不超过约5％。
菌株稳定性还能够长时间维持异源基因序列完整性，其中在时间延长约20倍、50倍、100倍、或更长时间后活性编码序列和必需转录调控元件的序列在至少约99％的二倍体细胞中得到维持，通常是至少约99.9％的二倍体细胞，而且优选至少约99.99％的二倍体细胞。优选的是，基本上所有的二倍体细胞都维持活性编码序列和必需转录调控元件的序列。
应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案、细胞系、动物物种或属、构建体、和试剂，因为它们当然可以改变。还应当理解，本文所用术语学只是出于描述具体实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明范围只受所附权利要求的限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的含义。尽管可以在实践或检验本发明时使用与本文所述相似或相当的任何方法、装置、和材料，然而本文描述了优选的方法、装置、和材料。
出于描述和公开例如发表物中描述的可用于本发明的细胞系、构建体、和方法学的目的，将本文提及的所有发表物收入本文作为参考。提供上文和全文讨论的发表物只是因为它们是在本发明的提交日期之前公布的。这里没有任何内容可以解释为承认发明人由于先前的发明没有权力获得这样的公开内容。
列举下面的实施例是为了给本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的完整公开书和说明书，而非意图限制本发明所关注的范围。为了在所用数值(例如数量、温度、浓度等)方面确保精确性已经做出了努力，但是有些实验误差和偏差应当是容许的。除非另有说明，份数指重量份数，分子量指平均分子量，温度指摄氏度，而压力指处于或接近大气压。
实施例1
为了证明二倍体抗体生产方法的功效，制备了下列试剂。
抗体基因：克隆并构建了指导三种形式的嵌合人源化小鼠单克隆抗体OKT3合成的基因。这些构建物中所使用的可变区的来源可以在基因库中找到。编号A22261；小鼠OKT3重链(国际专利申请WO9109967-A3，1991年7月11日)。编号A22259；小鼠OKT3轻链(国际专利申请WO 9109967-A3，1991年7月11日)。
所有三种形式都采用相同的VκCκ轻链基因(SEQ ID NO：10)。三种重链基因都编码相同的小鼠可变区(Vh)，但是彼此因人重链恒定区的氨基酸序列而有所不同。第一种构建物指导全长野生型重链(Cγ1)的合成，它只存在一个正常N-连接糖基化位点(全长糖基化重链)(SEQID NO：13和14)。第二种基因指导非糖基化重链的合成，即通过将序列中的核苷酸突变使得糖基化位点识别序列(ASN-X-Thr/Ser)中的第301位苏氨酸变成丙氨酸(全长非糖基化重链)(SEQ ID NO：15)。第三种基因构建物指导其中铰链区后的大部分恒定区删除的重链的合成(Fab重链)(SEQ ID NO：16)。
表达载体：载体包含下列功能元件：1)突变型ColE1复制起点，它促进质粒载体在细菌大肠杆菌的细胞中复制；2)细菌Sh ble基因，它赋予抗生素Zeocin抗性且担当大肠杆菌和巴斯德毕赤氏酵母二者转化的选择标记；3)表达盒，它由甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子、与之融合的编码酿酒酵母α交配因子前原分泌前导序列的序列、随后的来自巴斯德毕赤氏酵母乙醇氧化酶I基因(AOX1)的编码巴斯德毕赤氏酵母转录终止信号的序列组成。Zeocin抗性标记基因提供了通过选择抵抗高水平Zeocin的转化子来富集包含多个整合拷贝的表达载体的菌株的手段。
巴斯德毕赤氏酵母菌株：本实施例中所使用的营养缺陷型菌株是巴斯德毕赤氏酵母ade1和ura3株，它们的生长分别需要补充腺嘌呤和尿嘧啶。还使用了菌株met1和lys3。尽管可以使用这两个营养缺陷型菌株互补组中的任一对来构建和维持二倍体菌株，然而这两种菌株出于两个原因尤其适于本方法。第一，它们比交配或融合所得的二倍体菌株生长更加缓慢。由此，如果培养物中残留或由减数分裂或其它机制产生少量的单倍体ade1或ura3细胞，那么培养物中二倍体菌株应当比它们长得快。
第二是易于监测这些菌株的性状态，因为由它们交配产生的二倍体的菌落是正常白色或奶油色，而培养物中单倍体ade1突变体的任何菌株的细胞形成颜色为独特粉红色的菌落。另外，单倍体ura3突变体的任何菌株抵抗药物5-氟-乳清酸(FOA)，而且可以通过将培养物样品涂布在含FOA的基本培养基+尿嘧啶平板上灵敏鉴定。在这些平板上，只有需要尿嘧啶的ura3突变体(推测是单倍体)菌株能够生长并形成菌落。由此，使用ade1和ura3标记的单倍体亲本菌株，可以容易的监测由此产生的抗体生成二倍体菌株的性状态(单倍体对二倍体)。
方法
用于转录轻链和重链抗体基因的pGAPZ-α表达载体的构建。为了克隆轻链和重链可变区，培养小鼠OKT3 CD3杂交瘤细胞系的细胞，并提取总RNA。然后进行两个RT-PCR反应，一个对OKT3抗体基因的轻链可变区编码序列特异，一个对重链特异。用于扩增重链和轻链可变区的引物是(SEQ ID NO：1)5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3′和(SEQID NO：3)5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC-3′，以及(SEQ ID NO：2)5′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3′和(SEQ ID NO：4)5′-GACAGATGGTGCAGCCACAGCCCGGTTTATTTCCAACTTTGTCC-3′。
至于人重链和轻链恒定区基因，人白细胞5′-stretch plus cDNA文库购自Clontech(HL 5019t)。分别使用对重链和轻链恒定区特异的引物对该文库进行两个PCR反应(重链：(SEQ ID NO：6)5′-GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCA-3和(SEQ ID NO：5)5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3′(用于全长)以及(SEQ ID NO：7)5′-TGCGGCCGCTCATGGGCACGGTGGGCATGTGT-3′(用于Fab)；轻链：(SEQ ID NO：9)5′-GGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTC-3′和(SEQ IDNO：8)5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3′)。
将编码小鼠轻链可变区的DNA序列与编码人轻链恒定区的序列按读码框融合(SEQ ID NO：11和12)。通过pGAPZ-α中5′-XhoI和3′-NotI位点的连接，将编码最终融合构建物的片段插入巴斯德毕赤氏酵母表达载体pGAPZ-α。将编码小鼠重链可变区的DNA序列与各自编码三种人重链恒定区的序列按读码框融合。然后使用类似的5′-XhoI和3′-NotI策略将这些融合产物插入pGAPZ-α(SEQ ID NO：13和14用于糖基化形式；SEQ ID NO：15用于非糖基化形式；SEQ ID NO：16用于Fab片段)。在下一步工作前通过直接DNA测序确认所有载体中的抗体基因DNA序列是正确的。
将表达载体转化到巴斯德毕赤氏酵母的单倍体ade1 ura3、met1、和lys3宿主菌株中。用于转化单倍体巴斯德毕赤氏酵母菌株和基因操作巴斯德毕赤氏酵母性周期的所有方法见Higgins，D.R.和Cregg，J.M.编，1998，Pichia Protocols.Methods in Molecular Biology.HumanaPress，Totowa，NJ。
转化前，用AvrII将每一种表达载体在GAP启动子序列内线性化以指导载体整合到巴斯德毕赤氏酵母基因组的GAP启动子基因座中。然后通过电穿孔将每一种载体的样品各自转化到ade1、ura3、met1、和lys3菌株的电感受态培养物中，并通过它们对Zeocin抗生素的抗性在YPDZeocin平板上选择成功的转化子。选择由此产生的菌落，在YPD Zeocin平板上划线分离单菌落，然后为了检验每一种菌株中插入了正确的抗体基因，通过PCR测定法对由每一种菌株提取的基因组DNA检验抗体基因插入片段的存在和/或通过菌落转移/免疫印迹法(Wung等，1996，Biotechniques 21：808-812)检验每一种菌株合成抗体链的能力。收集表达三种重链构建物之一的单倍体ade1、met1、和lys3菌株，与表达轻链基因的单倍体ura3菌株一起用于构建二倍体。将表达重链基因的单倍体与适当的轻链单倍体ura3交配以生成分泌蛋白质的二倍体。
合成单一抗体链的单倍体菌株的交配和合成四聚体功能抗体的二倍体衍生物的选择。为了将巴斯德毕赤氏酵母单倍体菌株进行交配，将待杂交的每一种ade1或met1或lys3重链生成菌株在丰富YPD平板上划线，且将ura3轻链生成菌株在第二个YPD平板上划线(每个平板约10条线)。于30℃保温一或两天后，以交叉划线型式将来自含重链菌株的一块平板和含ura3轻链菌株的一块平板的细胞转移到复制涂板模块上的无菌天鹅绒布上，使得每一种重链菌株含有与每一种轻链菌株混合的一片细胞。然后将交叉划线的复制涂板细胞转移到交配板上，并于25℃保温以刺激菌株间交配的开始。两天后，将交配板上的细胞再次转移到复制涂板模块上的无菌天鹅绒上，然后转移到基本培养基平板上。将这些平板于30℃保温三天，从而容许原养型二倍体菌株的选择性生长。挑取出现的菌落，并在第二块基本培养基平板上划线以分离单菌落和纯化每一种二倍体菌株。然后对由此产生的二倍体细胞系检验抗体生成。
测试假定的二倍体菌株以证明它们是二倍体且包含用于生成抗体的两种表达载体。对于二倍体，将菌株的样品涂布在交配板上以刺激它们进行减数分裂并形成孢子。收集单倍体孢子产物并测试表型。如果由此产生的孢子产物中的显著百分比是单一或双重营养缺陷型，那么我们得出结论，最初的菌株肯定是二倍体。通过由每一种菌株提取基因组DNA并在对每一种基因特异的PCR反应中使用这种DNA，对二倍体菌株检验两种抗体基因的存在。
合成单一抗体链的单倍体菌株的融合和合成四聚体功能抗体的二倍体衍生物的选择。作为上文所述交配流程的替换方法，将单链抗体生成单倍体ade1和ura3菌株的各自培养物制成原生质球，并使用聚乙二醇/CaCl2将由此产生的原生质球融合。然后将融合的单倍体菌株包埋在含1M山梨醇和基本培养基的琼脂中，容许二倍体菌株重建它们的细胞壁并生长成可见菌落。由琼脂挑取由此产生的菌落，在基本培养基平板上划线，并将平板于30℃保温两天，由二倍体细胞系的单个细胞生成菌落。然后如上所述对由此产生的假定二倍体细胞系检验二倍体性和抗体生成。
抗体的纯化和分析。使用上文所述方法通过将ura3轻链菌株2252和lys3重链菌株2254交配衍生出用于生成全长抗体的二倍体菌株。收集二倍体巴斯德毕赤氏酵母表达菌株摇瓶或发酵罐培养物的培养基，并通过SDS-PAGE和免疫印迹使用针对人IgG重链和轻链的抗体或特异针对IgG重链的抗体检验抗体蛋白的存在。数据显示于图2。
为了纯化酵母分泌的抗体，使来自抗体生成培养物的澄清培养基流过蛋白A柱，用20mM磷酸钠pH7.0结合缓冲液清洗后，用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液pH 3.0洗脱蛋白A结合的蛋白质。通过考马斯蓝染色SDS-PAGE和抗体蛋白的免疫印迹检验含有最多总蛋白质的级分。还通过ELISA测定法检验级分，其中首先用F(ab′)2山羊抗人IgG即Fcγ(Jackson Immuno，产品目录编号109-006-008)包被微量滴定板，接着将板与选定稀释度的酵母生成抗体进行反应，最后将板与HRP缀合的山羊抗人IgG F(ab′)2片段(Jackson Immuno，产品目录编号109-036-097)进行反应。然后将板用TMP底物(Sigma Chemical)显影，并用0.5M HCl淬灭反应。在BioRad微量滴定板读板仪上于415nm将结果量化。数据图示于图3。
抗体活性的测定法。通过含靶抗原细胞的免疫组化染色对重组酵母衍生的嵌合抗体评估功能活性。嵌合抗体选择性识别在T细胞上发现的CD3复合物。采用Jurkat T细胞作为抗原的来源，并使用Andersson和Sander(1989年1月31日，Immunol Lett 20(2)：115-20)或Andersson等(1988年12月，Eur J Immunol 18(12)：2081-4)中所述流程进行细胞表面染色。
将Jurkat T细胞固定在载玻片上，用适当的封闭血清进行封闭，并用哺乳动物和酵母生成的重组一抗染色1小时。然后用过氧化物酶封闭剂处理固定好的样品，随后用对每一种形式的抗体特异的生物素化Fc选择性二抗进行染色(抗小鼠二抗用于哺乳动物生成的抗体而抗人二抗用于酵母生成的抗体)。使用HRP-链霉亲和素系统进行检测。进行数字成像以收集每一个染色样品的数据。经由在哺乳动物和酵母衍生的OKT-3的小图中观察到细胞的暗染色，在样品中检测到阳性信号。数据显示于图4。

Claims (35)

1.用于在毕赤氏酵母属二倍体细胞中合成和回收包含至少两个不同亚基多肽链的分泌型异聚多亚基蛋白的方法，该方法包括：用第一种表达载体转化第一种毕赤氏酵母属单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第一种亚基且其可操作连接第一种酵母启动子；用第二种表达载体转化第二种毕赤氏酵母属单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第二种亚基且其可操作连接第二种酵母启动子；由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体毕赤氏酵母属细胞；在所述第一种和第二种亚基稳定表达且以所述多亚基蛋白的形式分泌的条件下，在培养基中培养所述二倍体毕赤氏酵母属细胞，并从所述培养基中回收所述分泌型异聚多亚基蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述毕赤氏酵母属细胞选自下组：巴斯德毕赤氏酵母、Pichia methanolica和Pichia angusta。
3.权利要求2的方法，其中所述毕赤氏酵母属细胞是巴斯德毕赤氏酵母。
4.权利要求1的方法，其中异聚多亚基蛋白是抗体或抗原结合抗体片段。
5.权利要求4的方法，其中抗体是选自人、嵌合和人源化抗体的完整抗体。
6.权利要求1的方法，其中将所述表达载体整合入所述二倍体毕赤氏酵母属细胞的基因组。
7.权利要求1的方法，其中所述第一或第二表达载体是质粒。
8.权利要求1的方法，其中第一或第二启动子是组成型的。
9.权利要求1的方法，其中第一或第二启动子是诱导型的。
10.权利要求1的方法，其中将二倍体毕赤氏酵母属酵母培养在使二倍体毕赤氏酵母属以高细胞密度或长时间稳定生长的培养基中。
11.权利要求10的方法，其中所述培养基是基本培养基。
12.权利要求11的方法，其中所述基本培养基缺乏选择剂。
13.权利要求11的方法，其中所述基本培养基缺乏预先形成的氨基酸或其它复杂生物分子。
14.权利要求1的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至高细胞密度。
15.权利要求14的方法，其中所述高细胞密度是至少50g/L。
16.权利要求15的方法，其中所述高细胞密度是至少100g/L。
17.权利要求16的方法，其中所述高细胞密度是至少300g/L。
18.权利要求17的方法，其中所述高细胞密度是至少400g/L。
19.权利要求18的方法，其中所述高细胞密度是至少500g/L。
20.权利要求1的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养在一定条件下，从而产生所述生物学活性异聚多亚基蛋白的水平是至少50mg/L。
21.权利要求20的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养在一定条件下，从而产生所述生物学活性异聚多亚基蛋白的水平是至少100mg/L。
22.权利要求21的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养在一定条件下，从而产生所述生物学活性异聚多亚基蛋白的水平是至少500mg/L。
23.权利要求22的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养在一定条件下，从而产生所述生物学活性异聚多亚基蛋白的水平是至少1000mg/L。
24.权利要求1的方法，其中将二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少20倍的延长时间，并且在所述至少20倍的延长时间后保持所述异聚多亚基蛋白的高水平表达。
25.权利要求24的方法，其中将二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少50倍的延长时间，并且在所述至少50倍的延长时间后保持所述异聚多亚基蛋白的高水平表达。
26.权利要求25的方法，其中将二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少100倍的延长时间，并且在所述至少100倍的延长时间后保持所述异聚多亚基蛋白的高水平表达。
27.权利要求1的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少20倍的延长时间，并且在所述至少20倍的延长时间后至少99％的所述二倍体细胞包含所述表达载体，所述表达载体提供构成所述异聚多亚基蛋白的所述链的表达。
28.权利要求27的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少50倍的延长时间，并且在所述至少50倍的延长时间后至少99％的所述二倍体细胞包含所述表达载体，所述表达载体提供构成所述异聚多亚基蛋白的所述链的表达。
29.权利要求28的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少100倍的延长时间，并且在所述至少100倍的延长时间后至少99％的所述二倍体细胞包含所述表达载体，所述表达载体提供构成所述异聚多亚基蛋白的所述链的表达。
30.权利要求1的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少20倍的延长时间，并且在所述至少20倍的延长时间后以相对于起始表达水平的降低不超过20％的表达水平表达所述异聚多亚基蛋白。
31.权利要求30的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少50倍的延长时间，并且在所述至少50倍的延长时间后以相对于起始表达水平的降低不超过20％的表达水平表达所述异聚多亚基蛋白。
32.权利要求31的方法，其中将所述二倍体毕赤氏酵母属细胞培养至少100倍的延长时间，并且在所述至少100倍的延长时间后以相对于起始表达水平的降低不超过20％的表达水平表达所述异聚多亚基蛋白。
33.权利要求30、31或32的方法，其中所述二倍体毕赤氏酵母属细胞以相对于起始表达水平的降低不超过10％的表达水平表达所述异聚多亚基蛋白。
34.权利要求30、31或32的方法，其中所述二倍体毕赤氏酵母属细胞以相对于起始表达水平的降低不超过5％的表达水平表达所述异聚多亚基蛋白。
35.权利要求1的方法，其中将包含所述二倍体毕赤氏酵母属细胞的培养基培养在不超过22℃的温度下。
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