PT1674111E

PT1674111E - Anticorpo anti-glipicano 3

Info

Publication number: PT1674111E
Application number: PT05760156T
Authority: PT
Inventors: Nakano Kiyotaka; Takeshi Yoshino; Jun-Ichi Nezu; Hiroyuki Tsunoda; Tomoyuki Igawa; Hiroko Konishi; Megumi Tanaka; Izumi Sugo; Shigeto Kawai; Takahiro Ishiguro; Yasuko Kinoshita
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2010-12-15
Also published as: RU2011115845A; EP1674111A1; MXPA06002890A; MY145073A; TW200617022A; EP1674111B1; BRPI0506125B8; SI1674111T1; ATE486610T1; IL172938A0; DE602005024502D1; EP2216046A2; RU2611751C2; IL172938A; WO2006006693A1; AU2005256113A8; CA2544692C; NZ579543A; JP5715603B2; TWI455946B

Description

ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpo anti-Glipicano 3" ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um anticorpo anti- glipicano 3, a um inibidor do crescimento celular e a um agente anticanceroso contendo o anticorpo como um ingrediente activo.

Descrição do Estado da Arte 0 glipicano 3 (GPC3) é um dos membros da familia dos glipicanos de proteoglicanos de sulfato de heparano que estão presentes nas superfícies celulares. Está sugerido que o GPC3 possa estar envolvido na divisão celular no desenvolvimento ou crescimento de células cancerosas, contudo, o seu funcionamento ainda não foi bem elucidado.

Verificou-se que um certo tipo de anticorpos que se ligam a GPC3 possuem actividade inibidora do crescimento celular através de uma actividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e de uma actividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) (Pedido Internacional de Patente WO 2003/000883). Em adição, foi sugerido que o GPC3 é clivado in vivo e segregado para o sangue numa forma segregada de GPC3, e que o diagnóstico de cancros pode ser possível por utilização de um anticorpo capaz de detectar a forma segregada de GPC3 (Pedidos Internacionais de Patente WO 2004/022739, WO 03/100429 e WO 2004/018667). Em WO 2004/022597 descrevem-se anticorpos contra os terminais N e C de GPC3.

Quando se desenvolve um agente anticanceroso com base na actividade de citotoxicidade de um anticorpo, prefere-se que o anticorpo que é utilizado tenha uma elevada actividade de ADCC ou actividade de CDC. Assim, um anticorpo anti-GPC3 possuindo uma elevada actividade de citotoxicidade tem sido desejado como anticorpo que reconhece GPC3. 2 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Um objecto da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo anti-GPC3 possuindo uma maior actividade de ADCC e actividade de CDC comparativamente com as de um anticorpo convencional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores conseguiram obter um anticorpo possuindo uma actividade de citotoxicidade mais elevada comparativamente com a de um anticorpo anti-glipicano 3 convencional. Adicionalmente, analisaram epitopos para esse anticorpo e conseguiram identificar as regiões no GPC3 reconhecidas pelo anticorpo com uma elevada actividade de citotoxicidade. A presente invenção proporciona um anticorpo capaz de se ligar a glipicano 3, em que o anticorpo é: (a) um anticorpo que compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada possuindo CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:124, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:125; e (ii) uma região variável da cadeia leve possuindo CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:143, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (b) um anticorpo que compreende (i) e que pode inibir competitivamente a glipicano 3; ligação do anticorpo de (a) ao (c) um anticorpo que compreende (ii) e que pode inibir competitivamente a ligação do anticorpo de (a) ao glipicano 3; (d) um anticorpo possuindo a mesma actividade de ligação ao glipicano 3 que o anticorpo de qualquer uma de (a) a (c), em que um resíduo de aminoácido está substituído, 3 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ eliminado ou adicionado e/ou inserido relativamente à sequências de aminoácidos estabelecidas em (a); (e) um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo ao qual o anticorpo de (a) é capaz de se ligar, em que o referido anticorpo de (a) compreende ambas as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve especificadas em (a); ou (f) um anticorpo capaz de se ligar a um péptido que consiste na sequência dos residuos de aminoácido 546-551 do glipicano 3. É também referido um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 de qualquer uma de (1)-(12): 1) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:124, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:125; 2) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:109, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:110, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:111; 3) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:106, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:107, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:108; 4) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:132, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:133, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:134; 5) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:106, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:135, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:136; 4 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (6) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:126, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:127, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:128; (7) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:129, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:130, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:131; (8) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:103, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:104, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:105; (9) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:118, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:121, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:122; (10) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:115, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:116, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:117; (11) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:112, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:113, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:114; ou (12) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:118, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 119, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:120. É igualmente referido um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 de qualquer uma de (1)-(13): 5 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (1) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:143, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (2) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:143, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:145; (3) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:140, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:141, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:142; (4) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:167, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:168, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:169; (5) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:170, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:171; (6) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:159, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:160, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:161; (7) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:162, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:147, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:163; (8) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:164, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:165, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:166; 6 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (9) CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:137, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:138, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 139; (10) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:155, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:156, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 157; (11) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:149, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:150, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 151; (12) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:146, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:147, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO :148; ou (13) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:152, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:153, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:154. É igualmente referido um anticorpo seleccionado do grupo que consiste em qualquer um de (1)-(13): (1) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 143, 144 e 158, respectivamente; (2) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:109, 110 e 111, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de 7 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 143, 144 e 145, respectivamente; (3) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:106, 107 e 108, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 140, 141 e 142, respectivamente; (4) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 132, 133 e 134, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 167, 168 e 169, respectivamente; (5) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 106, 135 e 136, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:170, 144 e 171, respectivamente; (6) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:126, 127 e 128, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:159, 160 e 161, respectivamente; (7) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:129, 130 e 131, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:162, 147 e 163, respectivamente; (8) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:129, 130 e 131, 8 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 164, 165 e 166, respectivamente; (9) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:103, 104 e 105, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 137, 138 e 139, respectivamente; (10) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:118, 121 e 122, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:155, 156 e 157, respectivamente; (11) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:115, 116 e 117, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:149, 150 e 151, respectivamente; (12) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:112, 113 e 114, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 146, 147 e 148, respectivamente; e (13) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 118, 119 e 120, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 152, 153 e 154, respectivamente. 9 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ É igualmente referido um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada de qualquer um dos pontos (1)-(7): (1) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84; (2) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85; (3) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86; (4) uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:87; a (5) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88; (6) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89; ou (7) uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90. a É ainda referido um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção é seleccionado do grupo que consiste no anticorpo de qualquer um dos pontos (1)- (7) : (1) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (2) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (3) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; 10 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (4) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:87 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (5) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (6) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; e (7) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92. É igualmente referido um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 de qualquer um dos pontos (1)- (15) : (D CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:174, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 15 8; (2) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:175, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 158; (3) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:176, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo 3. sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO : 15 8; 11 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (4) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:177, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (5) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:178, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (6) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:179, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (7) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:180, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (8) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:181, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (9) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:182, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (10) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:183, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (11) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:184, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; 12

ΕΡ 1 674 111/PT (12) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:185, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (13) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:186, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (14) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:187, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; ou (15) CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:188, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo seleccionado do grupo que consiste no anticorpo de (1)-(15): (1) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:174, 144 e 158, respectivamente; (2) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:175, 144 e 158, respectivamente; (3) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, 13 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 176, 144 e 158, respectivamente; (4) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:177, 144 e 158, respectivamente; (5) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:178, 144 e 158, respectivamente; (6) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:179, 144 e 158, respectivamente; (7) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 180, 144 e 158, respectivamente; (8) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 181, 144 e 158, respectivamente; 14 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (9) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:182, 144 e 158, respectivamente; (10) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:183, 144 e 158, respectivamente; (11) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:184, 144 e 158, respectivamente; (12) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:185, 144 e 158, respectivamente; (13) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:186, 144 e 158, respectivamente; (14) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada, possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de 15 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 187, 144 e 158, respectivamente; e (15) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 188, 144 e 158, respectivamente. É igualmente referido um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve seleccionada entre (1)-(15): (1) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:191; (2) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:192; (3) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:193; (4) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:194; (5) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:195; (6) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:196; (7) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:197; (8) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:198; (9) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:199; (10) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:200; (11) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:201; (12) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:202; 16 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (13) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:203; (14) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:204; e (15) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve seleccionada do grupo que consiste em (1)-(15): (1) uma região sequência de (2) uma região sequência de (3) uma região sequência de (4) uma região sequência de (5) uma região sequência de (6) uma região sequência de (7) uma região sequência de (8) uma região sequência de (9) uma região sequência de (10) uma região sequência de (11) uma região sequência de (12) uma região sequência de variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:191; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:192; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:193; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:194; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:195; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:196; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:197: variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:198; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:199; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:200; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:201; variável da cadeia leve compreendendo aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:202; a a a a a a a a a a a a (13) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:203; 17 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (14) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:204; e (15) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205; e uma região variável da cadeia pesada seleccionada do grupo que consiste em ( 1)-(7): (D uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84; (2) uma região variável da cadeia pesada compreendendo; a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85; (3) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86; (4) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:8 7; (5) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88; (6) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89; e (7) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90. A região variável da cadeia pesada, a região variável da cadeia leve, e a sequência de aminoácidos das CDR 1, 2 e 3, assim como as SEQ ID NO, estão resumidas na tabela seguinte.

Anticorpo e regiões variáveis SEQ ID NO M3C11 H 22 M13B3 H 23 M1E7 H 24 M3B8 H 25 M11F1 H 26 M19B11 H 27 M6B1 H 28 M18D4 H 29 M5B9 H 30 18 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo e regiões variáveis SEQ ID NO M10D2 H 31 L9G11 H 32 M3C11 L 44 M13B3 L 45 MlE7 L 4 6 M3B8 L 47 MllFl L 48 M19B11 L 49 ΜβΒΐ L 50 M18D4 L 51 M5B9 L 52 M10D2 L 53 L9G11 L 54 GC199 H 60 GC202 H 61 GC33 H 62 GC179 H 63 GC194 H 6 4 GC199 L 71 GC202 L 72 GC33 L 73 GC179 L 74 GC194 (1) L 75 GC 194(2) L 76 GC33.ver.a H 84 GC33.ver.c H 85 GC33.ver.f H 86 GC33.ver.h H 87 GC33.ver.i H 88 GC33.ver. j H 89 GC33.ver.k H 90 19 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo e regiões variáveis SEQ ID NO GC33.ver.a L 92 M13B3(H) CDRl 103 CDR2 104 CDR3 105 M3B8(H) CDRl 106 CDR2 107 CDR3 108 MllFl(H) CDRl 109 CDR2 110 CDR3 111 M5B9(H) CDRl 112 CDR2 113 CDR3 114 M6B1(H) CDRl 115 CDR2 116 CDR3 117 M10D2(H) CDRl 118 CDR2 119 CDR3 120 L9G11(H) CDRl 118 CDR2 121 CDR3 122 GC33(H) CDRl 123 CDR2 124 CDR3 125 GC179(H) CDRl 126 CDR2 127 CDR3 128 GC194(H) CDRl 129 CDR2 130 CDR3 131 20 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo e regiões variáveis SEQ ID NO GC199(H) CDRl 132 CDR2 133 CDR3 134 GC202(H) CDRl 106 CDR2 135 CDR3 136 M13B3(L) CDRl 137 CDR2 138 CDR3 139 M3B8(L) CDRl 140 CDR2 141 CDR3 142 MllFl(L) CDRl 143 CDR2 144 CDR3 145 M5B9(L) CDRl 146 CDR2 147 CDR3 148 M6B1(L) CDRl 149 CDR2 150 CDR3 151 M10D2(L) CDRl 152 CDR2 153 CDR3 154 L9G11(L) CDRl 155 CDR2 156 CDR3 157 GC33(L) CDRl 143 CDR2 144 CDR3 158 GC179(L) CDRl 159 21 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo e regiões variáveis SEQ ID NO CDR2 160 CDR3 161 GC194(L)1 CDRl 162 CDR2 147 CDR3 163 GC194 (L)2 CDRl 164 CDR2 165 CDR3 166 GC199(L) CDRl 167 CDR2 168 CDR3 169 GC202(L) CDRl 170 CDR2 144 CDR3 171 GC33(L) G34A 174 GC33(L) G34D 175 GC33(L) G34E 176 GC33(L) G34F 177 GC33(L) G34H 178 GC33(L) G34N 179 GC33(L) G34P 180 GC33(L) G34Q 181 GC33(L) G34I 182 GC33(L) G34K 183 GC33(L) G34L 184 GC33(L) G34V 185 GC33(L) G34W 186 GC33(L) G34Y 187 GC33(L) G34R 188 22 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Igualmente, a invenção protagoniza um anticorpo possuindo uma actividade equivalente à actividade do anticorpo descrito acima, em que um ou mais residuos de aminoácido estão substituídos, eliminados ou adicionados e/ou inseridos relativamente às sequências de aminoácidos descritas acima.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado.

Assim, noutro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo humanizado capaz de se ligar a glipicano 3. É igualmente referido um anticorpo capaz de se ligar a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 524-563 de glipicano 3. É igualmente referido um anticorpo capaz de se ligar a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 537-563 de glipicano 3. É igualmente referido um anticorpo que não se liga a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 550-563 de glipicano 3.

Preferivelmente, o anticorpo é capaz de se ligar a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 542-551, 544-553 ou 546-555 de glipicano 3 ou a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 546-551 de glipicano 3.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo ao qual um segundo anticorpo é capaz de se ligar, em que o referido segundo anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:143, 144 e 158, respectivamente. Nomeadamente, o anticorpo da invenção é capaz de competir pela ligação a GPC3 com o segundo anticorpo.

Numa concretização preferida, o anticorpo da invenção é capaz de se ligar a glipicano 3 e tem uma elevada actividade 23 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ de CDC contra uma célula que expressa glipicano 3 e/ou tem uma elevada actividade de ADCC contra uma célula que expressa glipicano 3.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um polinucleótido que codifica para uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve do anticorpo da invenção.

Num aspecto, o polinucleótido é um polinucleótido possuindo qualquer uma das sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 57, 67, 77-83 ou 91.

Preferivelmente, o polinucleótido da invenção possui a sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 e 77-83.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um inibidor do crescimento celular e um agente anticanceroso compreendendo como um ingrediente activo o anticorpo da invenção. Preferivelmente, o agente anticanceroso da invenção é utilizado para tratamento de hepatoma. É também referido um péptido compreendendo a sequência dos resíduos de aminoácido 524-563 de glipicano 3, a sequência dos resíduos de aminoácido 537-563 de glipicano 3, a sequência dos resíduos de aminoácido 544-553 de glipicano 3 ou a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácido 546-551 de glipicano 3. É igualmente proporcionado um vector compreendendo um polinucleótido da invenção. A invenção proporciona ainda uma célula hospedeira compreendendo este vector. A invenção proporciona ainda um método para a produção de um anticorpo compreendendo: (a) a cultura da célula hospedeira da invenção, (b) o isolamento de um anticorpo a partir de uma cultura de (a), e (c) a purificação do seu anticorpo. 24 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ A invenção proporciona também um anticorpo da invenção para utilização no tratamento de cancro. É ainda proporcionado um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácido 546-551 de glipicano 3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 apresenta a actividade de ligação do anticorpo anti-GPC3 para uma célula CHO, uma célula CHO que expressa GPC3 de comprimento completo, HepG2 e HuH-7, que foi avaliada por citometria de fluxo. Utilizaram-se M1E7 (linha continua) e M11F1 (linha tracejada) numa concentração de 5 pg/mL, respectivamente. A Fig. 2 é uma tabela que mostra os resultados da classificação de epitopos através de um ELISA competitivo. Os graus de inibição competitiva contra a ligação do anticorpo anti-GPC3 biotinilado estão indicados em percentagem. Os epitopos foram classificados em 5 grupos, "a" a "e", de acordo com o padrão de inibição competitiva. A Fig. 3 apresenta os resultados da avaliação por Western blotting de se um anticorpo anti-GPC3 se liga ao fragmento N-terminal de 40 kDa da forma solúvel da proteína nuclear GPC3 ou ao seu fragmento C-terminal de 30 kDa. Verificou-se que L9G11 se liga ao fragmento N-terminal e M3C11 se liga ao fragmento C-terminal. A Fig. 4 apresenta os resultados da detecção de se uma forma segregada de GPC3 está presente no sobrenadante da cultura de HepG2 através de um ELISA em sanduíche. Foi fortemente detectada com a combinação de anticorpos que se ligam ao fragmento N-terminal tais como M6B1, M18D4 ou M19B11, e não foi fortemente detectada com um anticorpo que se liga ao fragmento C-terminal tal como M3C11, M13B3 ou M3B8. A Fig. 5 apresenta os resultados de imunoprecipitação do sobrenadante da cultura de HepG2 com a utilização de um anticorpo anti-GPC3 e detecção de uma forma segregada de GPC3. O meio como controlo (pistas 1 e 3) e o sobrenadante da 25 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ cultura de HepG2 (pistas 2 e 4) foram imunoprecipitados utilizando M1E7 (pistas 1 e 2) e M10D2 (pistas 3 e 4) . O GPC3 secretório foi detectado por M10D2 que se liga ao fragmento N-terminal. A Fig. 6 apresenta os resultados da análise de epítopos dos anticorpos que se ligam ao fragmento C-terminal de GPC3 por Western blotting com utilização de uma proteina de fusão do péptido C-terminal de GPC3 e GST. A forma solúvel da proteina nuclear GPC3 (pista 1), GST (pista 2), GC-1 (pista 3), GC-2 (pista 4), GC-3 (pista 5), GC-4 (pista 6) e GC-5 (pista 7) foram submetidos a electroforese em SDS sob condições redutoras, e detectados por Western blotting utilizando M3C11 e MllFl. A Fig. 7 apresenta os resultados da avaliação da actividade de CDC do anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 para uma célula CHO que expressa GPC3. A Fig. 8 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ADCC do anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 para uma célula CHO que expressa GPC3 e HepG2. A Fig. 9 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ADCC de GC33 para uma linha celular de hepatoma humano, HuH-7, utilizando uma célula efectora derivada de medula óssea de ratinho. A Fig. 10 apresenta os resultados da avaliação da actividade antitumoral do anticorpo GC33 para um modelo de ratinho transplantado com hepatoma humano. A Fig. 11 apresenta os resultados da avaliação da actividade de CDC do anticorpo quimérico ratinho-humano GC33 para uma célula CHO que expressa GPC3. A Fig. 12 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ADCC do anticorpo quimérico ratinho-humano GC33 para HepG2. 26 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ A Fig. 13 apresenta sequências derivadas de GPC3 contidas em proteínas de fusão de GST (GC-4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 e 14) preparadas para análise do epítopo de GC33. A Fig. 14 apresenta os resultados de Western blotting com utilização de GC33 após separação de GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 e 14 por SDS-PAGE sob condições redutoras. A Fig. 15 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ligação de GC33 humanizado a GPC3 através de um ELISA. A Fig. 16 apresenta um painel de anticorpos que resume isotipos e os resultados de um ELISA, BIAcore, FACS, uma análise de epítopos e um teste de imunoprecipitação para clones derivados de um ratinho imunizado com uma forma solúvel de GPC3. A Fig. 17 apresenta um painel de anticorpos em que estão resumidos isotipos e os resultados de um ELISA, FACS e uma análise de epítopos para clones derivados de um ratinho imunizado com GC-3. A Fig. 18 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ligação dos anticorpos modificados à forma solúvel da proteína nuclear GPC3 através de um ELISA. A Gly34 localizada em CDRl numa região variável da cadeia L de GC33 humanizado foi substituída por qualquer dos 17 aminoácidos outros que não Cys e Met. A Fig. 19 apresenta os resultados da avaliação da actividade de CDC dos anticorpos quiméricos ratinho-humano GC33, M3C11 e M1E7 a uma célula CHO que expressa GPC3 de comprimento completo. A Fig. 20 apresenta os resultados da avaliação da actividade de ADCC dos anticorpos quiméricos ratinho-humano GC33, M3C11 e M1E7 para uma linha celular de hepatoma humano SK-03 que expressa GPC3 de comprimento completo. 27 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Anticorpo A presente invenção proporciona anticorpos descritos nos seguintes pontos (I) a (XI). (I) Um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 (GC33). 0 anticorpo reconhece o péptido C-terminal do glipicano 3 (um péptido compreendendo do 374° aminoácido ao 580° aminoácido do glipicano 3); e é útil como anticorpo terapêutico. (II) Um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 143, 144 e 158 (GC33). O anticorpo reconhece o péptido C-terminal do glipicano 3 (um péptido compreendendo do 374° aminoácido ao 580° aminoácido de glipicano 3); e é útil como anticorpo terapêutico. (III) Um anticorpo seleccionado do grupo que consiste nos anticorpos descritos nos seguintes pontos (1) a (13): (1) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125, e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 143, 144 e 158 (GC33). O anticorpo descrito reconhece o péptido C-terminal do glipicano 3 (um péptido compreendendo do 374° aminoácido ao 580° aminoácido do glipicano 3); e é útil como anticorpo terapêutico. (IV) Um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada descrita em qualquer dos pontos (1) a (7) seguintes: (1) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84 (GC33 VH ver.a), 28 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (2) uma região variável da de aminoácidos estabelecida (3) uma região variável da de aminoácidos estabelecida (4) uma região variável da de aminoácidos estabelecida (5) uma região variável da de aminoácidos estabelecida (6) uma região variável da de aminoácidos estabelecida (7) uma região variável da de aminoácidos estabelecida

Entre os anticorpos particularmente preferidos (7) .

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:85 (GC33 VH

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:86 (GC33 VH

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:87 (GC33 VH

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:88 (GC33 VH

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:89 (GC33 VH

cadeia pesada contendo a em SEQ ID NO:90 (GC33 VH descritos em (1) a os anticorpos descritos sequência ver.c), sequência ver . f), sequência ver.h), sequência ver.i), sequência ver . j), e sequência ver. k) . (7), são em (2) a (V) Um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a). (VI) Um anticorpo seleccionado do grupo que consiste nos anticorpos descritos nos pontos (1) a (7) seguintes: (1) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84 (GC33 VH ver.a) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), (2) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85 (GC33 VH ver.c) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), (3) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86 (GC33 VH ver.f) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), 29 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (4) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:87 (GC33 VH ver.h) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), (5) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88 (GC33 VH ver.i) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), (6) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89 (GC33 VH ver.j) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a), e (7) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90 (GC33 VH ver.k) e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a).

Entre os anticorpos descritos em (1) a (7), são particularmente preferidos os anticorpos descritos em (2) a (7) . (VII) Um anticorpo descrito em qualquer dos seguintes pontos (1) a (15): (1) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 174, 144 e 158, (2) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 175, 144 e 158, (3) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 176, 144 e 158, (4) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 177, 144 e 158, 30 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (5) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 178, 144 e 158, (6) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 179, 144 e 158, (7) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 180, 144 e 158, (8) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 181, 144 e 158, (9) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 182, 144 e 158, (10) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 183, 144 e 158, (11) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 184, 144 e 158, (12) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 185, 144 e 158, (13) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 186, 144 e 158, (14) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 187, 144 e 158, e (15) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 188, 144 e 158.

Entre os anticorpos descritos em (1) a (15), prefere-se o anticorpo descrito em (15). (VIII) Um anticorpo descrito em qualquer dos seguintes pontos (1) a (15): 31 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (1) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 174, 144 e 158, (2) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 175, 144 e 158, (3) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 176, 144 e 158, (4) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 177, 144 e 158, (5) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 178, 144 e 158, (6) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 179, 144 e 158, (7) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs : 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 32 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 180, 144 e 158, (8) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 181, 144 e 158, (9) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 182, 144 e 158, (10) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 183, 144 e 158, (11) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 184, 144 e 158, (12) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 185, 144 e 158, (13) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 186, 144 e 158, (14) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de 33 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 187, 144 e 158, e (15) um anticorpo contendo regiões variáveis da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 188, 144 e 158.

Entre os anticorpos descritos em (1) a (15), prefere-se o anticorpo descrito em (15). (IX) Um anticorpo descrito em qualquer dos seguintes pontos (1) a (15): (1) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:191, (2) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:192, (3) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:193, (4) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:194, (5) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:195, (6) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:196, (7) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:197, 34 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (8) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:198, (9) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:199, (10) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:200, (11) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:201, (12) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:202, (13) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:203, (14) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:204, e (15) um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205.

Entre os anticorpos descritos em (1) a (15), prefere-se o anticorpo descrito em (15). (X) Um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve seleccionada do grupo que consiste nas regiões variáveis da cadeia leve descritas nos seguintes pontos (1) a (15): (1) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:191, (2) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:192, (3) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:193, 35 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (4) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:194, (5) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:195, (6) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:196, (7) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:197, (8) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:198, (9) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:199, (10) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:200, (11) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NQ:201, (12) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:202, (13) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:203, (14) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:204, e (15) uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205, e uma região variável da cadeia pesada seleccionada do grupo que consiste nas regiões variáveis da cadeia pesada descritas nos seguintes pontos (1) a (7): (1) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84, (2) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85, (3) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86, (4) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:87, 36 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (5) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88, (6) uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89, e

Entre os anticorpos descritos acima, prefere-se o anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205 e uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90. (XI) Um anticorpo, em que um aminoácido foi substituído, eliminado, adicionado e/ou inserido na sequência de aminoácidos descrita em qualquer um dos pontos acima mencionados (I) a (X), e que possui uma actividade equivalente à do anticorpo descrito em qualquer de (I) a (X).

Na presente invenção, a actividade equivalente à do anticorpo descrito em qualquer de (I) a (X) significa que a actividade de ligação a um anticorpo contra glipicano 3 humano ou a actividade de citotoxicidade numa célula que expressa glipicano 3 humano (e.g., células HepG2 ou CHO recombinantes que expressam glipicano 3 humano, etc.) é equivalente.

Anticorpo Humanizado

Uma concretização preferida do anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo humanizado que se liga a glipicano 3. O anticorpo humanizado pode ser preparado utilizando um método conhecido. O anticorpo humanizado é também referido como um anticorpo humano reformulado, que é preparado por transplante da região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo de um mamífero não humano, por exemplo um anticorpo de ratinho, na CDR de um anticorpo humano. A tecnologia geral de ADN recombinante para a preparação destes anticorpos é também conhecida (veja-se o Pedido de Patente Europeia EP 125023 e o Pedido Internacional de Patente WO 96/02576).

Especificamente, por exemplo, no caso em que uma CDR é derivada de um anticorpo de ratinho, uma sequência de ADN que 37 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ foi desenhada para ligar as CDR do anticorpo de ratinho à região de esqueleto (FR, "Framework Region") de um anticorpo humano é sintetizada pelo método da PCR utilizando vários oligonucleótidos como iniciadores, que foram preparados de modo a terem porções sobrepostas umas nas outras em ambas as extremidades da CDR e da FR (veja-se o método descrito no Pedido Internacional de Patente WO 98/13388).

Quanto à região de esqueleto de um anticorpo humano a ligar à CDR, selecciona-se aquela que permite que uma região determinante de complementaridade forme um local de ligação ao antigénio favorável. Se necessário, um aminoácido na região de esqueleto de uma região variável do anticorpo pode ser substituído de modo a que a região determinante de complementaridade de um anticorpo humano reformulado possa formar um local de ligação ao antigénio apropriado (Sato, K. et al.f Câncer Res. (1993) 53_, 851-856). A região C de um anticorpo humano pode ser utilizada como a região C de um anticorpo quimérico ou de um anticorpo humanizado, por exemplo, Cyl, Cy2, Cy3, e Cy4 podem ser utilizadas na cadeia H, e Ck e CÀ podem ser utilizadas na cadeia L. A região C de um anticorpo humano pode também ser modificada de modo a melhorar a estabilidade do anticorpo ou a sua produção. 0 anticorpo humano a utilizar na humanização pode ser qualquer isotipo de anticorpo humano, por exemplo, igG, IgM, IgA, igE e igD, preferivelmente, igG, mais preferivelmente IgGl ou IgG3, e em particular, preferivelmente IgGl. 0 IgGl da presente invenção é eficaz quando se utiliza um anticorpo como agente anticanceroso em termos de possuir uma elevada actividade de citotoxicidade (Chemical Immunoloqy, 65: 88 (1997)).

Em adição, depois de preparado o anticorpo humanizado, um aminoácido numa região variável (e.g., FR) ou numa região constante pode ser substituído por outro aminoácido. A origem da CDR num anticorpo humanizado não está particularmente limitada, e a CDR pode ser derivada de quaisquer animais. Por exemplo, é possível utilizar uma sequência derivada de um anticorpo de ratinho, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de camelo ou 38 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ similar. Prefere-se uma sequência de CDR de um anticorpo de ratinho.

Em relação à humanização de um anticorpo, é geralmente difícil humanizá-lo enquanto mantendo a actividade agonista do anticorpo original. Na presente invenção, contudo, foi adquirido com sucesso um anticorpo humanizado possuindo uma actividade agonista equivalente à do anticorpo de ratinho original. Como a antigenicidade do anticorpo humanizado no corpo humano é reduzida, é útil para sua administração ao ser humano para fins terapêuticos.

Os exemplos preferidos do anticorpo humanizado anti-glipicano 3 na presente invenção incluem, por exemplo, um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada estabelecida em SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO:86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO:87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO:88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO:89 (GC33 VH ver.j) ou SEQ ID NO:90 (GC33 VH ver.k) ou um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia leve estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a). Os seus exemplos particularmente preferidos incluem um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada estabelecida em SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO:85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO:86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO:87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO:88 (GC33 VH ver.i). SEQ ID NO:89 (GC33 VH ver.j) ou SEQ ID NO:90 (GC33 VH ver.k) e uma região variável da cadeia leve estabelecida em SEQ ID NO:92 (GC33 VL ver.a).

Em adição, um exemplo preferido do anticorpo anti-glipicano 3 humanizado inclui um anticorpo possuindo uma região variável da cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90 e uma região variável da cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205.

Uma concretização preferida do anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga ao epítopo ao qual o anticorpo estabelecido em (1) se liga: (1) um anticorpo contendo uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:62 e uma região variável da cadeia leve 39 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:73 (GC33). O anticorpo que se liga ao epítopo ao qual o anticorpo acima mencionado se liga é útil porque tem uma citotoxicidade particularmente elevada. O anticorpo descrito em (1) liga-se a uma região do 524° aminoácido ao 580° aminoácido do glipicano 3 humano. Em particular, liga-se a uma região do 524° aminoácido ao 563° aminoácido. O anticorpo descrito em (1) liga-se a uma região do 537° aminoácido ao 563° aminoácido do glipicano 3 humano. O anticorpo descrito em (1) liga-se a uma região do 544° aminoácido ao 553° aminoácido do glipicano 3 humano. Em particular, liga-se a uma região do 546° aminoácido ao 551° aminoácido.

Os anticorpos que reconhecem os epitopos acima mencionados têm uma elevada citotoxicidade, e portanto são úteis no tratamento de uma doença tal como o cancro. Em particular, o anticorpo que se liga a uma região do 546° aminoácido ao 551° aminoácido é útil pois tem uma citotoxicidade particularmente elevada

Assim, a presente invenção inclui os anticorpos que se ligam a um epitopo numa região do 524° aminoácido ao 580° aminoácido do glipicano 3 humano, preferivelmente uma região do 524° aminoácido ao 563° aminoácido, mais preferivelmente uma 563° aminoácido, ainda 544° aminoácido ao preferivelmente uma 551° aminoácido. região do 537° aminoácido ao mais preferivelmente uma região do 553° aminoácido, em particular, região do 546° aminoácido ao

Outra concretização preferida de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece uma região do 524° aminoácido ao 563° aminoácido do glipicano 3 humano e não reconhece uma região do 537° aminoácido ao 563° aminoácido.

Uma outra concretização preferida de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece uma região do 40 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 537° aminoácido ao 563° aminoácido do glipicano 3 humano e não reconhece uma região do 550° aminoácido ao 563° aminoácido. A análise de um epitopo reconhecido por um anticorpo pode ser realizada através de um método conhecido dos peritos na especialidade, por exemplo, por Western blotting descrito nos Exemplos adiante. O anticorpo que reconhece como epitopo as regiões acima mencionadas pode ser obtido através de um método conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, pode ser obtido preparando um péptido contendo uma sequência de aminoácidos de uma região alvo baseada numa sequência de aminoácidos do glipicano 3 humano e preparando um anticorpo com a utilização do péptido como imunogénio, ou preparando um anticorpo através de um método usual e determinando um epitopo que o anticorpo obtido reconhece, e depois seleccionando um anticorpo que reconhece o epitopo alvo.

Um exemplo preferido do anticorpo anti-glipicano 3 da presente invenção é um anticorpo possuindo uma elevada actividade de ADCC ou um anticorpo possuindo uma elevada actividade de CDC para uma célula que expressa glipicano 3.

As frases "uma elevada actividade de ADCC" ou "uma elevada actividade de CDC", como aqui utilizadas, significam que o anticorpo da invenção tem uma actividade de ADCC mais elevada ou uma actividade de CDC mais elevada do que a de um anticorpo anti-glipicano 3 conhecido. Os anticorpos contra glipicano 3 conhecidos incluem, por exemplo, M3C11 e M1E07 descritos no Pedido Internacional de Patente WO 2004/22739. A actividade de ADCC ou a actividade de CDC podem ser medidas através de um método conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, podem ser medidas através do teste de libertação de crómio. As condições específicas do teste de libertação de crómio para medição da actividade de ADCC não estão particularmente limitadas, contudo, por exemplo, esta pode ser medida utilizando as condições descritas nos Exemplos adiante. 41 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Os exemplos das células que expressam glipicano 3 incluem, por exemplo, uma linha celular de hepatoma tal como HepG2, uma linha celular de CHO possuindo incorporado um gene que codifica glipicano 3 e similares. Para medir a actividade de ADCC, prefere-se utilizar uma linha celular de HepG2, e para medir a actividade de CDC, prefere-se utilizar uma linha celular de CHO recombinante que expressa GPC3. A linha celular de CHO recombinante que expressa GPC3 pode ser preparada através de qualquer método, contudo, pode ser preparada, por exemplo, pelo método descrito nos Exemplos adiante.

No caso em que o anticorpo anti-glipicano 3 é utilizado como agente anticanceroso, prefere-se que tenha uma actividade de ADCC ao mesmo nivel que a de um anticorpo contendo uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:62 e uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:73 (GC33). No caso em que o anticorpo anti-glipicano 3 é utilizado como agente anticanceroso, prefere-se que tenha uma actividade de CDC ao mesmo nível que a de um anticorpo contendo uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:62 e uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:73 (GC33).

Adicionalmente, a presente invenção inclui um anticorpo possuindo uma elevada actividade de ligação a glipicano 3.

Na presente invenção, a actividade de ligação do anticorpo a glipicano 3 pode ser medida utilizando um método conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, pode ser medida utilizando a ressonância plasmonónica de superfície com BlAcore. Especificamente, uma proteína glipicano 3 é imobilizada num chip sensor para reagir com um anticorpo, e a interacção entre o anticorpo e o glipicano 3 pode ser calculada como uma constante de velocidade da reacção a partir do valor da medição. Em adição, em relação à avaliação da actividade de ligação, podem utilizar-se um ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA), um imunoensaio enzimático (EIA), um radioimunoensaio (RIA) ou uma técnica com anticorpos fluorescentes. Por exemplo, no caso em que se 42 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ utiliza um imunoensaio enzimático, adiciona-se uma amostra contendo um anticorpo a testar, por exemplo, um sobrenadante de cultura de uma célula que produz um anticorpo a testar ou um anticorpo purificado, a uma placa que foi revestida com um antigénio ao qual o anticorpo a testar se liga. Depois, adiciona-se um anticorpo secundário marcado com uma enzima tal como fosfatase alcalina, e a placa é incubada e lavada. Depois, adiciona-se um substrato da enzima tal como fosfato de p-nitrofenilo e mede-se a absorvância, através do que se pode avaliar a actividade de ligação a um antigénio. 0 limite superior da actividade de ligação não está particularmente limitado. Contudo, por exemplo, o limite superior pode ser definido dentro da gama que é tecnicamente possível pelos peritos na especialidade. Notar-se-á que a gama que é tecnicamente possível será expandida pelo avanço da tecnologia.

Adicionalmente, na presente invenção, um aminoácido que vai ser desamidado ou um aminoácido adjacente a um aminoácido que vai ser desamidado, pode ser substituído por outro aminoácido para fins, por exemplo, de suprimir a desamidação para aumentar a estabilidade do anticorpo. 0 aminoácido que vai ser desamidado inclui, asparagina e glutamina, preferivelmente asparagina. Um aminoácido adjacente a asparagina não está particularmente limitado e pode ser qualquer aminoácido. Sabe-se que uma sequência asparagina-glicina é particularmente susceptível a desamidação, e assim, a glicina é preferida como aminoácido adjacente a asparagina. Um aminoácido utilizado para substituição não está particularmente limitado e pode ser qualquer aminoácido outro que não asparagina e glutamina. Prefere-se um aminoácido outro que não valina e prolina. Portanto, na presente invenção, no caso em que o anticorpo é desamidado, prefere-se substituir o aminoácido por um aminoácido outro que não asparagina, glutamina, valina e prolina. A supressão da desamidação por substituição de aminoácidos pode ser realizada com referência, por exemplo, ao Pedido internacional de Patente wo 03/057881. No caso em que a substituição de aminoácidos é realizada com o fim de suprimir a desamidação, prefere-se que a actividade de ligação ao antigénio anterior à substituição seja mantida. 43 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Outra concretização de estabilização do anticorpo inclui a substituição de ácido glutâmico por outro aminoácido. Em adição, na presente invenção, verificou-se que, no caso em que o 6° aminoácido da cadeia pesada de um anticorpo é ácido glutâmico, o anticorpo pode ser significativamente estabilizado por substituição do ácido glutâmico por glutamina. Assim, a presente invenção refere-se também a um método de estabilização de um anticorpo por substituição do ácido glutâmico na 6a posição da cadeia pesada do anticorpo por glutamina. A numeração de aminoácidos do anticorpo é conhecida dos peritos na especialidade (e.g., Kabat, E.A. et al.f "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983). 0 anticorpo da invenção pode ser um anticorpo conjugado em que o anticorpo é conjugado com várias moléculas, tais como polietilenoglicol (PEG), materiais radioactivos e toxinas. Este anticorpo conjugado pode ser preparado através de modificação química do anticorpo obtido como acima. Métodos para a modificação de anticorpos foram já estabelecidos na especialidade. 0 anticorpo da invenção abrange estes anticorpos conjugados. 0 anticorpo da invenção pode também ser um anticorpo biespecífico (veja-se, por exemplo, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374). 0 anticorpo biespecífico pode reconhecer o glipicano 3 e outro antigénio, ou pode reconhecer diferentes epitopos numa molécula de GPC3.

Adicionalmente, o anticorpo da invenção pode possuir uma determinada proteína fundida com o terminal N ou C do anticorpo (Clinicai Câncer Research, 2004, _10, 1274-1281). A proteína a fundir ao anticorpo pode ser convenientemente seleccionada pelos peritos na especialidade.

Em adição, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo com uma citotoxicidade melhorada. Exemplos do anticorpo com uma citotoxicidade melhorada incluem um anticorpo a que falta fucose, um anticorpo possuindo N-acetilglucosamina (GlcNAc) de bissecção ligada à sua cadeia de açúcar, e um anticorpo possuindo actividade de ligação alterada para com o receptor de Fcy obtido por substituição de um ou mais aminoácidos na 44 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ região Fc. Estes anticorpos com uma citotoxicidade melhorada podem ser preparados através de um método conhecido na especialidade. Método de preparação do anticorpo 0 anticorpo que se liga a glipicano 3 pode ser preparado por um método conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, um hibridoma que produz anticorpo monoclonal pode ser preparado como se segue, utilizando basicamente uma técnica conhecida. Ou seja, o hibridoma pode ser preparado por imunização de um mamífero de acordo com um método de imunização usual utilizando uma proteína glipicano 3 ou uma célula que expressa glipicano 3 como antigénio de sensibilização. 0 imunócito assim obtido é fundido com uma célula progenitora conhecida através de um método de fusão celular usual, e depois é seleccionada uma célula produtora de anticorpo monoclonal através de um método de rastreio usual.

Especificamente, um anticorpo monoclonal pode ser preparado como se segue. Primeiro, é obtida uma proteína glipicano 3 com base nas sequências de gene/aminoácidos do glipicano 3 apresentadas em SEQ ID NOs: 3 e 4, que é utilizada como antigénio de sensibilização para obter um anticorpo. Mais especificamente, a sequência do gene que codifica o glipicano 3 é inserida num sistema vector de expressão conhecido, e uma célula hospedeira apropriada é transformada com o vector, e depois uma proteína glipicano 3 humano alvo é purificada através de um método conhecido a partir da célula hospedeira ou do sobrenadante da cultura.

Subsequentemente, esta proteína glipicano 3 purificada é utilizada como antigénio de sensibilização. Alternativamente, pode-se utilizar um péptido parcial de glipicano 3 como agente de sensibilização. Neste caso, o péptido parcial pode também ser obtido por síntese química de acordo com a sequência de aminoácidos do glipicano 3 humano.

Um mamífero a imunizar com um antigénio de sensibilização não está particularmente limitado, mas é preferivelmente seleccionado tendo em vista a compatibilidade com uma célula progenitora a utilizar para a fusão celular. Por exemplo, são 45 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ geralmente utilizados roedores tais como ratinhos, ratos e hamsters, coelhos ou macacos. A imunização de um animal com um antigénio de sensibilização é realizada de acordo com um método conhecido. Por exemplo, a imunização é realizada através de um método geral em que um mamífero é injectado intraperitonealmente ou subcutaneamente com um antigénio de sensibilização. Especificamente, um antigénio de sensibilização é diluido com, ou suspenso em, uma quantidade apropriada de PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato), solução salina fisiológica ou similar, uma quantidade apropriada de um adjuvante padrão tal como adjuvante completo de Freund é misturada com o produto se necessário, e depois a solução é emulsionada e é administrada a um mamífero várias vezes de 4 em 4 a 21 em 21 dias. Em adição, um transportador apropriado pode também ser utilizado após imunização com um antigénio de sensibilização.

Um mamífero é imunizado como descrito acima, e depois é confirmado no soro um nível aumentado de um anticorpo alvo. Subsequentemente, colhem-se imunócitos do mamífero, e depois submetem-se a fusão celular. Um imunócito particularmente preferido é um esplenócito.

Como célula parceira progenitora para a fusão com o imunócito acima mencionado, utiliza-se uma célula de mieloma de mamífero. Os exemplos de uma linha celular da célula de mieloma que é preferivelmente utilizada aqui incluem várias linhas celulares conhecidas tais como P3 (P3x63 Ag8.653) (J.

Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63 Ag8U.l (Current Topics in Microbioloqy and Immunoloqy (1978) 8_1, 1-7), NS-1 (Kohler. G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6_, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8_, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 3J5, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133). A fusão celular dos imunócitos acima mencionados com células de mieloma pode ser basicamente realizada de acordo com um método conhecido, por exemplo, o método de Kohler e 46 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Milstein et al. (Kohler. G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, a fusão celular acima mencionada é realizada numa solução de cultura de nutrição normal na presença de, por exemplo, um acelerador de fusão celular. Como acelerador de fusão celular utiliza-se, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), um virus hemaglutinante do Japão (HVJ). Se desejado, pode adicionar-se um adjuvante tal como dimetilsulfóxido para adicionalmente melhorar a eficiência da fusão. A razão de imunócitos para células de mieloma pode ser apropriadamente seleccionada. Por exemplo, prefere-se que o número de imunócitos seja 1 a 10 vezes maior do que o de células de mieloma. A solução de cultura a utilizar para a fusão celular acima mencionada inclui, por exemplo, uma solução de cultura RPMI1640 ou uma solução de cultura MEM que é adequada para o crescimento da linha celular de mieloma acima mencionada, ou outra solução de cultura normal que é utilizada para este tipo de cultura celular. Adicionalmente, pode utilizar-se em combinação um suplemento sérico tal como soro fetal de vitelo (FCS). A fusão celular é realizada como se segue. Quantidades predeterminadas dos imunócitos e células de mieloma acima mencionados são bem misturadas na solução de cultura acima mencionada, uma solução de PEG (e.g., com um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000) (uma concentração geral de 30 a 60% (p/v)), que tenha sido pré-aquecida a aproximadamente 37°C, é adicionada, e depois a solução é misturada, pelo que se forma uma célula de fusão alvo (hibridoma). Subsequentemente, adiciona-se uma solução de cultura apropriada sucessivamente, e depois repete-se um passo de remoção do sobrenadante por centrifugação para remover um reagente para fusão celular ou similar que seja desfavorável para o crescimento do hibridoma. O hibridoma assim obtido é seleccionado por cultura do hibridoma numa solução de cultura selectiva padrão tal como uma solução de cultura HAT (uma solução de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura na solução de 47 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ cultura HAT acima mencionada é continuada durante um período de tempo suficiente para as células (células não fundidas) outras que não o hibridoma alvo morrerem (normalmente, vários dias a várias semanas). Subsequentemente, conduz-se um método de diluição limitante padrão para o rastreio e monoclonagem do hibridoma que produz um anticorpo alvo.

Em adição ao método de imunização de um animal não humano com um antigénio para obter o hibridoma, pode também obter-se um anticorpo humano desejado possuindo uma actividade de ligação a glipicano 3 através da sensibilização de um linfócito humano com glipicano 3 in vitro, e permitindo que o linfócito sensibilizado se funda com uma célula de mieloma derivada de humano possuindo um potencial de divisão permanente (veja-se JP-B-1-59878) . Noutro método, o antigénio de glipicano 3 é administrado a um animal transgénico possuindo todos os repertórios de genes de anticorpos humanos para obter células produtoras de anticorpo anti-glipicano 3, que são então imortalizadas, e pode obter-se um anticorpo humano para glipicano 3 a partir das células produtoras de anticorpo anti-glipicano 3 imortalizadas (vejam-se os Pedidos Internacionais de Patente WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 e WO 94/02602). O hibridoma assim preparado que produz um anticorpo monoclonal pode ser cultivado por passagens numa solução de cultura padrão, ou pode ser armazenado durante um longo período em azoto líquido.

Um exemplo de um método empregue para obter um anticorpo monoclonal a partir do hibridoma envolve a cultura do hibridoma e a obtenção de um anticorpo monoclonal a partir do sobrenadante da cultura de acordo com um método padrão. Outro método envolve a administração do hibridoma a um mamífero que é compatível com o hibridoma para lhe permitir proliferar, e a obtenção de um anticorpo monoclonal a partir das ascites. O primeiro método é adequado para obter um anticorpo de elevada pureza, enquanto o último método é adequado para a produção em massa de anticorpos. É igualmente possível preparar um anticorpo recombinante por clonagem do gene do anticorpo a partir do hibridoma, 48 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ incorporação do gene num vector apropriado, introdução do vector num hospedeiro, e depois deixando o hospedeiro produzir o anticorpo recombinante através de uma técnica de manipulação genética (e.g., veja-se Vandamme, a.m. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).

Especificamente, o ARNm que codifica uma região variável (V) de um anticorpo anti-glipicano 3 é isolado a partir de um hibridoma que produz o anticorpo anti-glipicano 3. O ARNm é isolado através de um método conhecido tal como um método ultracentrifugo de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) _18, 5294-5299) ou um método de AGPC (Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), e é preparado o ARN total, e depois o ARNm alvo é preparado utilizando um Kit de Purificação de ARNm (Pharmacia) ou similar. Em adição, o ARNm pode também ser directamente preparado utilizando um Kit de Purificação de ARNm QuickPrep (Pharmacia). O ADNc da região V do anticorpo é sintetizado utilizando uma transcriptase inversa a partir do ARNm assim obtido. O ADNc pode ser sintetizado utilizando um Kit de Síntese de ADNc de Primeira Cadeia com Transcriptase Inversa AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) ou similar. Em adição, por exemplo, pode empregar-se um Kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), o método 5'-RACE utilizando PCR (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) S5_, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 11_, 2919-2932) para a síntese e amplificação de ADNc.

Um fragmento de ADN alvo é purificado a partir do produto de PCR assim obtido, e depois é ligado a um vector de ADN. Prepara-se um vector recombinante a partir do produto, e depois o vector é introduzido em E. coli ou similar, e é seleccionada uma colónia, desse modo preparando um vector recombinante desejado. A sequência de nucleótidos do ADN alvo é então determinada por um método conhecido tal como um método de terminação de cadeias com didesoxinucleótidos.

Depois de obtido o ADN que codifica a região V do anticorpo anti-glipicano 3 alvo, este ADN é incorporado num 49 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ vector de expressão contendo ADN que codifica a região constante (região C) do anticorpo alvo.

Para produzir o anticorpo anti-glipicano 3 utilizado na presente invenção, o gene do anticorpo é incorporado num vector de expressão de modo a que o gene seja expresso sob a regulação da região de controlo da expressão génica incluindo, por exemplo, um potenciador e um promotor. Em seguida, transforma-se uma célula hospedeira com o vector de expressão, desse modo permitindo que o hospedeiro expresse o anticorpo.

Um gene de anticorpo pode ser expresso por incorporação de um polinucleótido que codifica a cadeia H ou de um polinucleótido que codifica a cadeia L separadamente num vector de expressão, e depois transformação simultânea de uma célula hospedeira com os vectores, ou por incorporação de polinucleótidos que codificam a cadeia H e a cadeia L num único vector de expressão, e depois transformação de uma célula hospedeira com o vector (veja-se o Pedido Internacional de Patente WO 94/11523) .

Polinucleótido

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido que codifica uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve do anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o polinucleótido da presente invenção possui uma sequência de nucleótidos descrita em qualquer uma de SEQ ID NOs: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 e 77-83. Em adição, um polinucleótido que é hibridado com o polinucleótido acima mencionado sob condições rigorosas e codifica um anticorpo possuindo uma actividade equivalente à do anticorpo da presente invenção está também dentro do âmbito da presente invenção. O polinucleótido da presente invenção não está particularmente limitado desde que codifique o anticorpo da presente invenção. É um polímero composto por uma pluralidade de nucleótidos, tais como ácidos desoxirribonucleicos (ADN) ou ácidos ribonucleicos (ARN) . Pode conter uma base que não uma base de ocorrência natural. O polinucleótido da presente invenção pode ser utilizado para a produção de um anticorpo 50 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ através de uma técnica de engenharia genética. Em adição, o polinucleótido da presente invenção pode ser utilizado como uma sonda para o rastreio de um anticorpo possuindo uma função equivalente à do anticorpo da presente invenção. Ou seja, um polinucleótido que codifica o anticorpo da presente invenção ou um seu fragmento parcial, podem ser utilizados como sonda para obter ADN que é hibridado com o polinucleótido sob condições rigorosas e codifica um anticorpo possuindo uma actividade equivalente à do anticorpo da presente invenção por técnicas tais como uma técnica de hibridação, uma técnica de amplificação de genes (e.g., PCR). Este ADN está também incluído no polinucleótido da presente invenção. A técnica de hibridação (Sambrook, J. et ai., Molecular

Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) é bem conhecida dos peritos na especialidade. Exemplos das condições de hibridação incluem, por exemplo, condições de baixo rigor. As condições de baixo rigor são, por exemplo, as condições de 42°C, SSC 0,lx e SDS a 0,1%, preferivelmente as condições de 50°C, SSC 0,lx e SDS a 0,1% quando a lavagem é realizada após a hibridação. Exemplos mais preferidos das condições de hibridação incluem, por exemplo, condições de elevado rigor. As condições de elevado rigor são, por exemplo, as condições de 65°C, SSC 5x e SDS a 0,1%. Sob estas condições, pode esperar-se que um polinucleótido possuindo uma maior homologia possa ser eficientemente obtido a temperatura mais elevada, incidentalmente, existem uma pluralidade de factores que afectam o rigor da hibridação, tais como a temperatura e a concentração salina, e os peritos na especialidade podem conseguir um rigor similar por selecção apropriada destes factores.

Um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção codificado por um polinucleótido obtido através desta técnica de hibridação e uma técnica de amplificação de genes possui usualmente uma elevada homologia com o anticorpo em termos da sequência de aminoácidos. O anticorpo da presente invenção inclui também um anticorpo que é funcionalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção e possui uma elevada homologia com a sequência de aminoácidos do anticorpo. Uma elevada homologia significa geralmente pelo menos 50% ou maior identidade, preferivelmente 75% ou maior 51 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ identidade, mais preferivelmente 85% ou maior identidade, e ainda mais preferivelmente 95% ou maior identidade ao nivel dos aminoácidos. Para determinar a homologia de polipéptidos, pode ser empregue o algoritmo descrito na literatura (Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730). A presente invenção proporciona também um vector contendo o polinucleótido da presente invenção. Este vector pode ser utilizado para a preparação do anticorpo da presente invenção. Quanto ao vector da presente invenção, no caso em que se utiliza E. coli como hospedeiro, por exemplo, não está particularmente limitado desde que possua uma "ori" para utilização na amplificação em E. coli para produzir e amplificar o vector numa grande quantidade em E. coli (e.g., JM109, DH5a, HB101 ou XLIBlue), e possua um gene marcador para selecção de uma E. coli transformada (e.g., um gene de resistência a um fármaco que possa ser identificado por um fármaco como ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol) . Os exemplos do vector incluem os vectores da série M13, os vectores da série pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script e similares. Em adição, podem também utilizar-se pGEM-T, pDIRECT e pT7 para a subclonagem e extraeção de ADNc assim como os vectores acima descritos.

Como vector da presente invenção, é particularmente útil um vector de expressão. Por exemplo, um vector de expressão para ser expresso em E. coli deverá ter as caracteristicas anteriores para ser amplificado em E. coli. Em adição, no caso em que se utiliza E. coli, tal como JM109, DH5a, HB101 ou XLl-Blue como célula hospedeira, é indispensável que o vector tenha um promotor, por exemplo, o promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), o promotor araB (Better et al. , Science (1988) 240, 1041-1043), o promotor de T7 ou similares, que possam eficientemente expressar o produto desejado em E. coli. Os exemplos destes vectores incluem pGEX-5X-l (Pharmacia), o sistema "QIAexpress System" (Qiagen), pEGFP, pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa ARN-polimerase de T7) e similares, assim como os vectores acima descritos. 52 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Em adição, ο vector pode também conter uma sequência de sinal para a secreção do polipéptido. Quanto à sequência de sinal para a secreção da proteina, no caso em que é produzido um polipéptido no periplasma de E. coli, pode utilizar-se a sequência de sinal pelB (Lei S.P. et al., J. Bacteriol (1987) 169, 4379). A introdução do vector numa célula hospedeira pode ser realizada utilizando, por exemplo, o método do cloreto de cálcio e o método de electroporação.

Em adição a E. coli, por exemplo, podem utilizar-se como vector da presente invenção vectores de expressão derivados de mamíferos (e.g., pcDNA3 (Invitrogen) e pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18_(17), p5322), pEF e pCDM8), vectores de expressão derivados de células de insecto (e.g., o sistema de expressão de baculovirus "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL) e pBacPAK8), vectores de expressão derivados de plantas (e.g., pMHl e pMH2), vectores de expressão derivados de vírus de animais (e.g., pHSV, pMV e pAdexLcw), vectores de expressão derivados de retrovírus (e.g., pZIPneo), vectores de expressão derivados de levedura (e.g., o kit de expressão em Pichia, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNVll e SP-Q01), e vectores de expressão derivados de Bacillus subtilis (e.g., pPL608 e pKTH50).

Para fins de expressão do vector numa célula animal tal como uma célula CHO, uma célula COS, uma célula NIH3T3 ou similares, é indispensável que o vector tenha um promotor necessário para a expressão numa célula tal como o promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), o promotor de MMTV-LTR, o promotor EFla (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 1_8, 5322), o promotor de CMV ou similares, e mais preferivelmente que tenha um gene marcador (tal como um gene de resistência a um fármaco que possa ser identificado por um fármaco tal como neomicina ou G418) para selecção da transformação na célula. Os exemplos de vectores possuindo estas características incluem, por exemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOPl3.

Adicionalmente, para fins de expressão estável de um gene e, ao mesmo tempo, amplificação do número de cópias do gene na célula, um vector (e.g., pCHOI, etc.) possuindo o gene DHFR é introduzido na célula CHO deficiente na via sintética de ácido 53 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ nucleico para complementar a deficiência e é amplificado com metotrexato (MTX). Em adição, para fins de expressão transiente de um gene, a transformação é efectuada com um vector (tal como pcD) possuindo a origem de replicação para SV40 utilizando uma célula COS possuindo no cromossoma um gene que expressa o antigénio T de SV40. Como origem de replicação, podem igualmente utilizar-se a derivada de um poliomavírus, de um adenovirus, de um papilomavirus bovino (BPV) e similares. Adicionalmente, para a amplificação dos números de cópias dos genes no sistema de células hospedeiras, o vector de expressão pode incluir, como marcador seleccionável, o gene da aminoglicósido-transferase (ΑΡΗ), o gene da timidina-quinase (TK), o gene da xantina-guanina-fosforibosil-transferase de E. coli (Ecogpt), o gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) e similares.

Para preparar o anticorpo da presente invenção, o vector é introduzido numa célula hospedeira. A célula hospedeira em que o vector é introduzido não está particularmente limitada, mas inclui, por exemplo, E. coli ou qualquer das várias células animais. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser utilizada como sistema de produção para a produção ou expressão do anticorpo da presente invenção. Quanto ao sistema de produção de preparação de polipéptidos, existe um sistema de produção in vitro e um sistema de produção in vivo. Os sistemas de produção in vitro incluem um sistema de produção que emprega células eucariotas e um sistema de produção que emprega células procariotas.

No caso em que se utiliza uma célula eucariota, pode utilizar-se, por exemplo, uma célula animal, uma célula vegetal ou uma célula fúngica. As células animais conhecidas incluem uma célula de mamifero tal como uma célula CHO (J, Exp. Med. (1995) 108, 945), uma célula COS, uma célula 3T3, uma célula de mieloma, uma célula de rim de hamster bebé (BHK), uma célula HeLa e uma célula Vero, uma célula anfibia tal como um oócito de Xenopus (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), ou uma célula de insecto tal como Sf9, Sf21 e Tn5. Na presente invenção, utilizam-se preferivelmente CHO-DG44, CHO-DXBll, uma célula COS7, uma célula BHK. Entre as células animais, para fins de realizar uma grande quantidade de expressão, prefere-se particularmente uma célula CHO. A 54 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ introdução do vector na célula hospedeira pode ser realizada, por exemplo, pelo método do fosfato de cálcio, o método do DEAE-dextrano, o DOTAP de ribozoma catiónico (Boehringer Mannheim), o método de electroporação, o método de lipofecção ou similares.

Quanto à célula vegetal, por exemplo, uma célula derivada de Nicotiana tabacum é conhecida como um sistema de produção de proteínas, que pode ser submetida a cultura de calos. Os exemplos das células fúngicas incluem leveduras tais como o género Saccharomyces, mais especificamente Saccharomyces cerevistae e Saccharomyces pombe, e fungos filamentosos tais como o género Aspergillus, mais especificamente Aspergillus niger.

No caso em que se utiliza uma célula procariota, pode ser empregue um sistema de produção utilizando uma célula bacteriana. Os exemplos das células bacterianas incluem Escherichia coli (E. coli) tais como JM109, DH5a e HB101, e Bacillus subtilis.

Preparação de anticorpo recombinante 0 anticorpo da presente invenção pode ser preparado por cultura das células hospedeiras acima mencionadas. 0 anticorpo pode ser obtido por cultura in vitro de uma célula transformada com um polinucleótido desejado. A cultura pode ser realizada de acordo com um método conhecido. Os meios de cultura para células animais incluem, por exemplo, DMEM, MEM, RPMI 1640 e IMDM. Um suplemento de soro tal como FBS ou soro fetal de vitelo (FCS) pode ser utilizado em combinação, ou pode ser utilizado meio isento de soro. O pH durante a cultura é preferivelmente de cerca de 6 a 8. A cultura é usualmente realizada a cerca de 30 a 40°C durante cerca de 15 a 200 horas com, se necessário, mudança de meio, arejamento e agitação.

Por outro lado, os sistemas para a produção de um polipéptido in vivo incluem, por exemplo, um sistema de produção que emprega um animal e um sistema de produção que emprega uma planta. O polinucleótido alvo é introduzido nesse animal ou nessa planta, e o polipéptido é produzido no corpo do animal ou da planta e é recuperado. A expressão "célula 55 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ hospedeira", como aqui se utiliza, abrange esse animal e essa planta.

Quando é utilizado o animal, estão disponíveis sistemas de produção que empregam um mamífero ou um insecto. Como mamífero, podem utilizar-se cabras, porcos, ovelhas, ratinhos e gado (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Pode também utilizar-se um animal transgénico como mamífero.

Por exemplo, o polinucleótido alvo é preparado na forma de um gene de fusão com um gene que codifica um polipéptido que é inerentemente produzido no leite tal como uma caseína β de cabra. Então, o fragmento de ADN contendo este gene de fusão é injectado num embrião de cabra, e o embrião é transplantado para uma cabra fêmea. 0 anticorpo alvo pode ser obtido a partir do leite produzido pela cabra transgénica nascida da cabra que recebeu o embrião ou da sua descendência. Para aumentar a quantidade de leite contendo o anticorpo produzido pela cabra transgénica, pode dar-se uma hormona à cabra transgénica conforme necessário. (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 1_2, 699-702) .

Em adição, como insecto, pode utilizar-se por exemplo, um bicho-da-seda. No caso em que se utiliza um bicho-da-seda, um bicho-da-seda é infectado com um baculovírus no qual foi inserido o polinucleótido que codifica o anticorpo alvo. O anticorpo alvo pode ser obtido a partir do fluido corporal do bicho-da-seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

No caso em que se utiliza uma planta, pode utilizar-se por exemplo, tabaco. No caso em que se utiliza tabaco, um polinucleótido que codifica o anticorpo alvo é inserido num vector de expressão para uma planta, por exemplo pMON 530, e depois o vector é introduzido numa bactéria tal como Agrobacterium tumefaciens. Depois, o tabaco tal como Nicotiana tabacum é infectado com a bactéria, pelo que o anticorpo alvo pode ser obtido a partir das folhas do tabaco (Julian, K. -C. Ma et ai., Eur. J. Immunol. (1994) 2_4, 131-138). O anticorpo assim obtido pode ser isolado a partir do interior ou do exterior (meio de cultura, etc.) da célula 56 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ hospedeira e depois pode ser purificado num anticorpo substancialmente puro e uniforme. A separação e a purificação do anticorpo podem ser realizadas através de um método de separação e um de purificação usualmente utilizados na purificação de polipéptidos. Por exemplo, os polipéptidos podem ser separados e purificados por quaisquer métodos incluindo colunas de cromatografia, filtração, ultrafiltração, dessalinização, precipitação com solventes, extracção com solventes, destilação, imunoprecipitação, electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focagem isoeléctrica, diálise, recristalização, e uma sua combinação.

Os exemplos da cromatografia incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrófoba, filtração em gel, cromatografia de fase inversa, cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografias podem ser realizadas utilizando uma cromatografia em fase liquida tal como HPLC e FPLC. Os exemplos de uma coluna para cromatografia de afinidade incluem uma coluna de proteína A ou uma coluna de proteína G. Um exemplo da coluna de proteína A é a Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia).

Adicionalmente, antes ou depois da purificação do anticorpo, o anticorpo pode ser modificado ou podem ser parcialmente removidos péptidos conforme necessário permitindo que uma enzima modificadora de proteínas adequada actue. A enzima modificadora de proteínas para este fim inclui, por exemplo, tripsina, quimiotripsina, lisil-endopeptidase, proteína-quinase, glucosidase.

Composição Farmacêutica

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica contendo o anticorpo da presente invenção. A composição farmacêutica contendo o anticorpo da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença associada com proliferação celular tal como o cancro, e particularmente é útil no tratamento e/ou prevenção de cancro do fígado. No caso em que o anticorpo da presente invenção é 57 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ utilizado como uma composição farmacêutica, o anticorpo pode ser formulado numa forma de dosagem por um método conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser utilizada parentericamente na forma de uma injecção de uma solução ou uma suspensão estéril com água ou outra solução farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o anticorpo pode ser formulado numa forma de dosagem por mistura apropriada com um transportador ou solvente farmaceuticamente aceitáveis, tais como água estéril, solução salina fisiológica, um óleo vegetal, um emulsionante, um agente de suspensão, um tensioactivo, um estabilizante, um aromatizante, um excipiente, um veiculo, um conservante, um aglutinante, para preparar uma forma de dosagem unitária necessária para Implementação do Fármaco genericamente aceite. A quantidade de ingredientes activos nestas preparações é seleccionada para permitir a administração de uma dosagem adequada dentro da gama indicada.

Uma composição estéril para injecção pode ser formulada utilizando um veículo tal como água destilada para injecção de acordo com a Implementação de Fármacos geral.

Os exemplos da solução aquosa para injecção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica, glucose, e outros líquidos isotónicos incluindo adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Podem ser utilizados em combinação com um solubilizante adequado, tal como um álcool, especificamente etanol, um poliálcool tal como propilenoglicol e polietilenoglicol, e um tensioactivo não iónico tal como Polissorbato 80 (TM) e HCO-50. Óleo de sésamo ou óleo de soja podem ser utilizados como líquido oleaginoso e podem ser utilizados em combinação com benzoato de benzilo ou álcool benzílico como solubilizante. Podem ser formulados com um tampão tal como um tampão de fosfato ou um tampão de acetato de sódio, um analgésico tal como um cloridrato de procaína, um estabilizante tal como álcool benzílico ou fenol, ou um antioxidante. A injecção preparada é geralmente enchida numa ampola adequada. O método de administração é preferivelmente parentérico, e os seus exemplos específicos incluem injecção, administração 58 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ transnasal, administração transpulmonar, administração transdérmica e similares. A formulação para injecção pode ser administrada sistemicamente ou topicamente por injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção intraperitoneal, injecção subcutânea ou similar. 0 método de administração pode ser apropriadamente seleccionado de acordo com a idade e os sintomas de um paciente. Por exemplo, uma dose da composição farmacêutica contendo o anticorpo ou o polinucleótido que codifica o anticorpo pode ser seleccionada entre a gama de 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, por exemplo, a dose pode ser seleccionada entre a gama de 0,001 mg a 100 000 mg/corpo por paciente, embora não esteja sempre limitada a esses valores numéricos. A dose e o método de administração variam de acordo com o peso corporal, a idade e os sintomas de um paciente, e são apropriadamente seleccionados pelos peritos na especialidade.

EXEMPLOS A presente invenção será descrita com mais detalhes com referência aos Exemplos que se seguem. Contudo, a presente invenção não está limitada a estes Exemplos.

Exemplo 1

Clonagem de ADNc do qlipicano 3 humano (GPC3)

Amplificou-se um ADNc de comprimento completo que codifica GPC3 humano através de uma reacção PCR com um kit Advantage 2 (CLONTECH) utilizando ADNc de primeira cadeia preparado por um método usual a partir de uma linha celular de cancro do cólon, Caco2, como molde. Mais especificamente, 50 pL de uma mistura reaccional contendo 2 pL de ADNc derivado de Caco2, 1 pL de um iniciador de sentido directo (GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEQ ID NO:l), 1 pL de um iniciador anti-sentido (GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEQ ID NO:2), 5 pL de tampão de PCR lOx Advantage 2, 8 pL de mistura de dNTP (1,25 mM) e 1,0 pL de Mistura de polimerases Advantage, foram submetidos a 35 ciclos consistindo em 94°C durante 1 minuto, 63°C durante 30 segundos e 68°C durante 3 minutos. O produto amplificado da reacção PCR foi inserido num vector de TA, 59 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ pGEM-T Easy, utilizando o sistema pGEM-T Easy Vector System I (Promega). Confirmou-se a sequência utilizando um sequenciador de ADN ABI 3100. Desta maneira, isolou-se um ADNc que codifica GPC3 humano de comprimento completo. A sequência apresentada em SEQ ID NO:3 indica a sequência de nucleótidos do gene de GPC3 humano e a sequência apresentada em SEQ ID NO:4 indica a sequência de aminoácidos da proteína GPC3 humana.

Exemplo 2

Preparação da forma solúvel de GPC3

Como imunoproteína para a geração de um anticorpo anti-GPC3, preparou-se uma forma solúvel de proteína GPC, em que a região hidrófoba do lado C-terminal (564-580 aminoácidos) estava eliminada.

Utilizando o ADNc de GPC3 humano de comprimento completo como molde, realizou-se uma reacção PCR utilizando um iniciador anti-sentido (ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C: SEQ ID NO:5) e um iniciador de sentido directo, ao qual se adicionaram uma sequência de reconhecimento de EcoRI e uma sequência Kozak, (ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C: SEQ ID NO:6). O fragmento de PCR obtido (1711 pb) foi clonado em pCXND2-Flag. O pCXND2-Flag foi desenhado para expressar uma proteína marcada com Flag por inserção da região para expressão do gene de DHFR de pCHOI (Hirata et al., FEBS letter 1994; 356; 244-248) no local tfíndIII de pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) e adição de uma sequência marcadora Flag a jusante do local de clonagem múltipla. O ADN do plasmídeo de expressão construído foi introduzido numa linha celular de CHO, DXBll, e obteve-se uma linha celular de CHO altamente expressora da forma solúvel de GPC3 através de selecção com Geneticina a 500 pg/mL. A cultura em larga escala da linha celular de CHO altamente expressora da forma solúvel de GPC3 foi realizada utilizando um frasco rotativo de 1700 cm2, e recuperou-se o sobrenadante da cultura para a purificação do anticorpo. O sobrenadante da cultura foi aplicado numa coluna Fast Flow de DEAE Sepharose (Amersham) e, após lavagem, eluíu-se o anticorpo com um tampão contendo NaCl 500 mM, e purificou-se por afinidade utilizando gel de afinidade de agarose Anti-Flag M2 (SIGMA). A eluição foi realizada com péptido FLAG a 200 pg/mL. Depois de concentrado 60 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ ο eluato com Centriprep-10 (Millipore), removeu-se o péptido FLAG por filtração em gel utilizando Superdex 200 HR 10/30 (Amersham). Finalmente, concentrou-se o filtrado utilizando uma coluna Fast Flow de DEAE Sepharose e eluíu-se com PBS (contendo NaCl 500 mM) sem Tween 20 para efectuar a troca de tampão.

Exemplo 3

Preparação da forma solúvel da proteína nuclear GPC3 O GPC3 é modificado por sulfato de heparano para se tornar numa macromolécula. Para eliminar um anticorpo contra o sulfato de heparano num rastreio de um anticorpo anti-GPC3, preparou-se, e utilizou-se no rastreio, uma forma solúvel da proteina nuclear GPC3 que tinha uma mutação pontual no local de ligação ao sulfato de heparano.

Utilizando a forma solúvel de GPC3 (1-563) acima mencionada como molde, preparou-se um ADNc em que os resíduos Ser nas 495a e 509a posições foram substituídos por Ala, pelo método de PCR de montagem, em que os iniciadores foram desenhados para adicionar o marcador de His ao terminal C. O ADNc obtido foi clonado no vector pCXND3. O pCXND3 foi construído inserindo a região de expressão do gene de DHFR de pCHOI no local Hindlll de pCXN2. O ADN do plasmídeo de expressão construído foi introduzido na linha celular DXB11 e obteve-se uma linha celular de CHO altamente expressora de uma forma solúvel da proteína nuclear GPC3 por selecção com Geneticina a 500 pg/mL. A cultura em larga escala foi realizada utilizando um frasco rotativo de 1700 cm2 e recuperou-se o sobrenadante de cultura para purificação do anticorpo. O sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna Q de Sepharose Fast Flow (Amersham). Após lavagem, o anticorpo foi eluído com um tampão de fosfato contendo NaCl 500 mM, e purificado por afinidade utilizando uma coluna quelante de Sepharose Fast Flow (Amersham). O anticorpo foi eluído com um gradiente de 10 a 150 mM de imidazole. Finalmente, concentrou-se o eluato utilizando uma coluna Q de Sepharose Fast Flow e, eluíu-se com um tampão de fosfato contendo NaCl 500 mM. 61 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida sob condições redutoras apresentou três bandas de 70 kDa, 40 kDa e 30 kDa. O resultado da sequenciação de aminoácidos utilizando um sequenciador de proteínas ABI492 (Applied Biosystems) indicou que a banda de 30 kDa correspondia à sequência de aminoácidos do 359° e seu a jusante ou do 375° e seu a jusante de GPC3, sugerindo que o GPC3 foi clivado entre Arg358 e Ser359 ou entre Lys374 e Val375, e portanto foi separado em 40k Da do fragmento N-terminal e 30 kDa do fragmento C-terminal.

Exemplo 4

Preparação de uma linha celular de CHO que expressa GPC3 humano de comprimento completo

Para obter uma linha celular para avaliação da actividade de ligação utilizando citometria de fluxo, estabeleceu-se uma linha celular de CHO que expressa o GPC3 de comprimento completo.

Misturaram-se dez microgramas de um vector de expressão do gene do GPC3 humano de comprimento completo e 60 pL de SuperFect (QIAGEN). Após a formação de um complexo, a introdução do gene foi realizada através da sua adição a uma linha celular de CHO, DXBll. Após uma cultura de 24 horas numa incubadora com CO2, iniciou-se a selecção utilizando aMEM (GIBCO BRL) contendo Geneticina numa concentração final de 0,5 mg/mL e FBS a 10%. As colónias resistentes a Geneticina resultantes foram recolhidas e a clonagem das células foi efectuada pelo método da diluição limitante. Cada clone celular foi solubilizado e a expressão de GPC3 humano de comprimento completo foi confirmada por Western blotting utilizando um anticorpo anti-GPC3. Desta maneira, obteve-se uma linha celular estavelmente expressora.

Exemplo 5

Avaliação da actividade de ligação por ELISA A forma solúvel da proteína nuclear GPC3 foi diluída para 1 pg/mL com um tampão de revestimento (NaHCCh a 0,1 mol/L (pH 9,6), NaN3 a 0,02% (p/v)) e adicionada a uma imunoplaca e deixada a 4°C durante a noite para revestir a placa. Depois de 62 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ a placa ser bloqueada com um tampão de diluição (Tris-HCl a 50 mmol/L (pH 8,1), MgCl2 a 1 mmol/L, NaCl a 150 mmol/L, Tween 20 a 0,05% (v/v), NaN3 0,02% (p/v), BSA a 1% (p/v)), adicionou-se um anticorpo anti-GPC3 e deixou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem com um tampão de enxaguamento (Tween 20 a 0,05% (v/v), PBS), adicionou-se um anticorpo igG anti-ratinho (ZYMED) marcado com fosfatase alcalina e deixou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem com o tampão de enxaguamento, adicionou-se SIGMA 104 (SIGMA) diluído para 1 mg/mL com um tampão de substrato (NaHCCg a 50 mmol/L (pH 9,8), MgCl2 a 10 mmol/L) e deixou-se à temperatura ambiente durante 1 hora para desenvolvimento de cor. Depois mediu-se a absorvância (a 405 nm, comprimento de onda de referência de 655 nm) utilizando um Benchmark Plus (BIO-RAD).

Exemplo 6

Imunização com forma solúvel de GPC3 e selecção de hibridoma

Como o GPC3 humano e o GPC3 de ratinho apresentam uma elevada homologia de 94% ao nivel dos aminoácidos, foi considerado dificil obter um anticorpo anti-GPC3 se fosse imunizado um ratinho normal. Portanto, utilizou-se como animal imunizado um ratinho com doença auto-imune, o ratinho MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr, (daqui em diante referido como ratinho MRL/lpr, adquirido a Charles River Japan, Inc.). A imunização foi iniciada com a idade de 7 semanas ou 8 semanas. Para a primeira imunização, preparou-se uma forma solúvel de GPC3 a 100 pg/cabeça e emulsionou-se utilizando adjuvante completo de Freund (FCA, Becton Dickinson) e administrou-se subcutaneamente. Duas semanas mais tarde, preparou-se uma forma solúvel de GPC3 a 50 pg/cabeça e emulsionou-se utilizando adjuvante incompleto de Freund (FIA, Becton Dickinson) e administrou-se subcutaneamente. Depois disso, realizou-se uma imunização adicional semana sim, semana não, um total de 5 vezes. Para dois dos ratinhos imunizados, a forma solúvel de GPC3 foi diluida com PBS a 50 pg/cabeça, e depois administrada intravenosamente através da cauda como imunização final. No quarto dia após a imunização final, excisou-se o baço para obter uma célula esplénica, que se misturou com uma célula de mieloma de ratinho, P3-X63Ag8Ul (P3U1, adquirida a ATCC), numa razão de 2:1. A fusão celular 63 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ foi realizada adicionando gradualmente PEG 1500 (Roche Diagnostic). Adicionou-se cuidadosamente meio RPMI 1640 (GIBCO BRL) para diluir o PEG 1500, e depois de removido o PEG 1500 por centrifugação, suspenderam-se as células em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e inoculou-se numa placa de cultura de 96 poços a 100 pL/poço. No dia seguinte, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, suplemento de meio HAT lx (SIGMA) e suplemento de clonagem de Hibridoma BM-Condimed Hl 0,5x (Roche Diagnostic) (daqui em diante referido como meio HAT) a 100 pL/poço. Após 2, 3 e 5 dias, substituiu-se metade da solução de cultura pelo meio HAT. Após 7 dias, realizou-se o rastreio utilizando o sobrenadante da cultura. O rastreio foi realizado através de um ELISA utilizando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel da proteina nuclear GPC3. Um clone positivo foi monoclonado pelo método da diluição limitante. Como resultado, obtiveram-se 11 clones de anticorpos (M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, MllFl, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9 e M10D2) que possuem uma forte actividade de ligação contra GPC3.

Exemplo 7

Determinação do isotipo e purificação do anticorpo anti-GPC3

Determinou-se o isotipo através de um ELISA dependente de antigénio utilizando um Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (PIERCE). A purificação dos anticorpos foi realizada como se segue. O sobrenadante da cultura do hibridoma cultivado com o meio HAT suplementado com FBS (Ultra low IgG) (GIBCO BRL) foi adsorvido em Hi Trap ProteinG HP (Amersham), e lavado com um tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM (pH 7,0)). O anticorpo foi eluido com um tampão de eluição (glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7)). O eluato foi imediatamente neutralizado com um tampão de neutralização (Tris-HCl 1 M (pH 9,0)), e dialisado contra PBS durante dia e noite para troca do tampão.

Exemplo 8

Avaliação da actividade de ligação por ELISA

Para avaliar convenientemente a actividade de ligação do anticorpo anti-GPC3 assim obtido, detectou-se a ligação dependente da concentração do anticorpo contra uma imunoplaca 64 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ contendo a forma solúvel da proteína nuclear GPC3 nela imobilizada. Adicionou-se uma diluição em série de 3 vezes (12 diluições no total) do anticorpo purificado numa concentração de 10 pg/mL, e um anticorpo igG anti-ratinho como anticorpo secundário. Realizou-se o desenvolvimento de cor utilizando SIGMA 104. Como o grau de desenvolvimento de cor varia dependendo do tempo de desenvolvimento de cor, analisaram-se os resultados medidos precisamente 1 hora depois. Todos os anticorpos apresentaram um desenvolvimento de cor dependente da concentração. A correlação entre a concentração de anticorpo e o grau de desenvolvimento de cor foi representado em gráfico e obteve-se uma curva aproximada utilizando um software de análise, GraphPad Purism. O seu valor de EC50 foi determinado como o índice da actividade de ligação. Os valores de EC50 para todos os clones estão apresentados na Fig. 16.

Exemplo 9

Avaliação da actividade de ligação por citometria de fluxo

As células foram dissociadas com EDTA 1 mM pH 8,0 (GIBCO)/PBS e suspensas em tampão FACS (FBS/PBS a 1%) a 1 x 106 células/mL. Dispensou-se a suspensão numa placa Multiscreen-HV Filter Plate (Millopre) a 100 pL/poço e removeu-se o sobrenadante por centrifugação. Adicionou-se um anticorpo anti-GPC3 diluído para uma concentração apropriada e fez-se reagir em gelo durante 30 minutos. Lavaram-se as células uma vez com tampão FACS e adicionou-se um anticorpo IgG anti-ratinho marcado com FITC e fez-se reagir em gelo durante 30 minutos. Após a reacção, centrifugaram-se as células a 500 rpm durante 1 minuto, e removeu-se o sobrenadante. Suspenderam-se as células em 400 pL de tampão FACS e submeteram-se a citometria de fluxo. Utilizou-se um EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) como citómetro de fluxo. Estabeleceu-se um portal na população de células vivas com o histograma de dispersão frontal e dispersão lateral. Como mostrado na Fig. 1, um anticorpo anti-GPC3 (M3C11, MllFl) ligou-se fortemente à célula CHO que expressa GPC3 e não se ligou à célula CHO progenitora, indicando que o anticorpo se liga especificamente a GPC3 apresentado na membrana celular. Em adição, o anticorpo apresentou a actividade de ligação a uma linha celular de hepatoma, HepG2 (adquirida a ATCC) e 65 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

HuH-7 (adquirida a Health Science Research Resources Bank), sugerindo que o anticorpo pode reconhecer especificamente o hepatoma. A actividade de ligação dos clones derivados do ratinho imunizado com uma forma solúvel de GPC3 medida por citometria de fluxo está apresentada na Fig. 16, onde estão indicados os valores de moda-X do histograma à concentração de anticorpo de 5 pg/mL.

Exemplo 10

Classificação de epítopos por ELISA competitivo

Os anticorpos obtidos foram classificados de acordo com os epitopos através de um ELISA competitivo. Os anticorpos foram biotinilados utilizando um kit de marcação com biotina Biotin Labeling Kit (Roche). A forma solúvel da proteína nuclear GPC3 foi diluída para 1 pg/mL com o tampão de revestimento e adicionou-se a uma placa a 100 pL/poço e armazenou-se a 4°C durante a noite para revestir a placa. No dia seguinte, adicionaram-se 200 pL do tampão de substrato para bloquear. Deixou-se a placa a 4°C durante a noite ou mais tempo e adicionou-se um anticorpo anti-GPC3 à placa a 100 pL/poço e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois disso, sem lavagem da placa, adicionaram-se 10 pL de anticorpo anti-GPC3 marcado com biotina a 10 pg/mL e deixou-se voltar a reagir durante 1 hora. Lavou-se a placa com 300 pL/poço do tampão de enxaguamento 3 vezes. Diluiu-se conjugado AP-estreptavidina (ZYMED) 1000 vezes com o tampão de diluição e adicionou-se a 100 pL/poço e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 1 hora. Lavou-se a placa com 300 pL/poço do tampão de enxaguamento 5 vezes. Diluiu-se SIGMA 104 para 1 mg/mL com o tampão de substrato e adicionou-se a 100 pL/poço. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, mediu-se a absorvância (a 405 nm, comprimento de onda de referência de 655 nm).

Os resultados do ELISA competitivo estão apresentados na Fig. 2. Quanto ao anticorpo que inibiu competitivamente a ligação do anticorpo biotinilado em 50% ou mais, considerou-se que os seus epítopos estão localizados próximos uns dos outros na conformação tridimensional. Como resultado da classificação de acordo com o padrão de inibição competitiva de desenvolvimento de cor contra a ligação dos 8 tipos de 66 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ anticorpos biotinilados, os 11 clones derivados do ratinho imunizado com a forma solúvel de GPC3 foram classificados em 5 grupos (a, b, c, d e e) (Fig. 16).

Exemplo 11

Classificação de epítopos por Western blotting

A forma solúvel da proteína nuclear GPC3 foi aplicada num mini SDS-PAGE a 10% (TEFCO) e submetida a electroforese sob condições redutoras. Foi transferida para Immobilon-P (Millipore) utilizando Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD). Depois de lavar brevemente a membrana com TBS-T (Tween 20 a 0,05%, TBS), agitou-se em TBS-T contendo 5% de leite desnatado durante 1 hora. Agitou-se a membrana em TBS-T durante cerca de 10 minutos, depois adicionou-se cada anticorpo anti-GPC3 diluído com TBS-T contendo 1% de leite desnatado e agitou-se a membrana durante 1 hora. Lavou-se a membrana com TBS-T e agitou-se numa solução de HRP-anticorpo IgG anti-ratinho (Amersham) diluído com TBS-T contendo 1% de leite desnatado durante 1 hora, e depois lavou-se com TBS-T. Realizou-se o desenvolvimento da cor utilizando ECL-Plus (Amersham) e detectou-se utilizando Hyperfilm ECL (Amersham).

Como mostrado na Fig. 3, determinou-se que L9G11 é um anticorpo que se liga ao lado N-terminal porque se ligou à banda de cerca de 40 kDa. Determinou-se que M3C11 é um anticorpo que se liga ao lado C-terminal porque se ligou à banda de cerca de 30 kDa. Todos os anticorpos pertencentes aos grupos c, d ou e, com base no ELISA competitivo, ligaram-se ao lado N-terminal, e todos os pertencentes aos grupos a ou b ligaram-se ao lado C-terminal (Fig. 16). L9G11 tinha maior sensibilidade de detecção em Western blotting do que os outros anticorpos que se ligam ao lado N-terminal, sugerindo que este anticorpo é útil para detecção do fragmento N-terminal por

Western blotting.

Exemplo 12

Detecção da forma segregada de GPC3

Como se verificou que o GPC3 é clivado no 358° resíduo de aminoácido ou no 374° resíduo de aminoácido, os inventores colocaram a hipótese de que uma forma segregada de GPC3 é 67 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ segregada para ο sangue de um paciente com cancro do fígado. Portanto, construiu-se um sistema de ELISA em sanduíche para GPC3 de modo a detectar uma forma segregada de GPC3.

Revestiu-se uma imunoplaca com um anticorpo anti-GPC3 a 10 pg/mL e bloqueou-se através do tampão de substrato. Após a imunoplaca ser armazenada durante várias horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C, adicionou-se o sobrenadante de cultura de HepG2 e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavou-se a imunoplaca com 300 pL/poço do tampão de enxaguamento 3 vezes, e adicionou-se um anticorpo anti-GPC3 marcado com biotina diluído para 10 pg/mL e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavou-se a imunoplaca com 300 pL/poço do tampão de enxaguamento 3 vezes, e adicionou-se AP-estreptavidina e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavou-se a imunoplaca com 300 pL/poço do tampão de enxaguamento 5 vezes. Realizou-se o desenvolvimento da cor utilizando AMPAK (DAKO) de acordo com o protocolo anexo e mediu-se a absorvância utilizando uma leitor de microplacas. Os anticorpos que se ligam ao lado N-terminal (M6B1, M19B11 e M18D4) e os que se ligam ao lado C-terminal (M3C11, M13B3 e M3B8) foram combinados para construir cinco sistemas de ELISA em sanduíche. Cada uma destas combinações apresentou uma sensibilidade equivalente na curva padrão utilizando a forma segregada de GPC3. Estes sistemas foram avaliados utilizando o sobrenadante de cultura de HepG2. A forma segregada de GPC3 foi detectada com uma concentração elevada de cerca de 1 pg/mL com uma combinação dos anticorpos que se ligam ao lado N-terminal (Fig. 4). A concentração detectada com uma combinação dos anticorpos que se ligam ao lado C-terminal foi baixa, sugerindo que o fragmento N-terminal estava dominantemente presente na forma segregada de GPC3.

Subsequentemente, o sobrenadante da cultura de HepG2 foi imunoprecipitado utilizando um anticorpo anti-GPC3 para detectar a forma segregada de GPC3. No caso em que se utilizou M10D2 que se liga ao fragmento N-terminal, foi detectada a forma segregada de GPC3 de 40 kDa (Fig. 5). Por outro lado, no caso em que se utilizou M1E7 que se liga ao fragmento C-terminal, não se detectou a forma segregada de GPC3. O teste de imunoprecipitação foi realizado para todos os anticorpos de GPC3 obtidos. Cada anticorpo que se liga ao fragmento N- 68 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ terminal detectou fortemente a forma segregada de GPC3, enquanto a forma segregada de GPC3 não foi detectada ou foi fracamente detectada com a utilização dos anticorpos que ligam ao fragmento C-terminal (Fig. 16). Espera-se que o anticorpo que consegue detectar a forma segregada de GPC3 por imunoprecipitação seja útil como anticorpo para o diagnóstico de hepatoma. Em adição, espera-se que o anticorpo que detecta dificilmente a forma segregada de GPC3 seja útil no desenvolvimento de um anticorpo terapêutico possuindo uma actividade de ADCC e uma actividade de CDC, porque um tal anticorpo pode migrar para a lesão do hepatoma sem ser aprisionado na forma segregada de GPC3 presente no sangue.

Exemplo 13

Clonagem da região variável do anticorpo anti-GPC3

Amplificou-se uma região variável do anticorpo anti-GPC3 através do método RT-PCR utilizando o ARN total extraído de um hibridoma produtor de anticorpo anti-GPC3. 0 ARN total foi extraído de 1 x 107 células do hibridoma com a utilização de Kits RNeasy Plant Mini (QIAGEN). Utilizando 1 pg do ARN total, amplificou-se o fragmento génico 5'-terminal com utilização de um Kit de Amplificação de ADNc SMART RACE (CLONTECH) e qualquer dos seguintes oligonucleótidos sintéticos: um oligonucleótido sintético MHC-IgGl complementar à sequência de uma região constante de igGl de ratinho: GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEQ ID NO:7); um oligonucleótido sintético MHC-IgG2a complementar à sequência de uma região constante de lgG2a de ratinho: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEQ ID NO:8); um oligonucleótido sintético MHC-IgG2b complementar à sequência de uma região constante de IgG2b de ratinho: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (SEQ ID NO:9); e um oligonucleótido sintético capa complementar à sequência de uma região constante da cadeia capa de ratinho: GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEQ ID NO:10). 69 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Realizou-se uma reacção de transcrição inversa a 42°C durante 1 hora e 30 minutos. A mistura de PCR (50 μΐι) continha 5 pL de tampão de PCR lOx Advantage 2, 5 pL de Mistura

Universal de iniciadores A lOx, dNTP 0,2 mM (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 1 pL de mistura de polimerases Advantage 2 (todos de CLONTECH), 2,5 pL do produto da reacção de transcrição inversa e 10 pmol do oligonucleótido sintético MHC-IgGl, MHC-IgG2a, MHC-IgG2b ou capa. A PCR foi realizada com 5 ciclos consistindo em 94°C durante 30 segundos, 94°C durante 5 segundos e 72°C durante 3 minutos, 5 ciclos consistindo em 94°C durante 5 segundos, 70°C durante 10 segundos e 72°C durante 3 minutos, e 25 ciclos consistindo em 94°C durante 5 segundos, 68°C durante 10 segundos e 72°C durante 3 minutos. Finalmente, aqueceu-se o produto da reacção a 72°C durante 7 minutos. Cada produto de PCR foi purificado a partir do gel de agarose utilizando um Kit de extracção em gel QIAquick (QIAGEN), clonado no vector pGEM-T Easy (Promega), e foi determinada a sequência de nucleótidos.

As sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia H de M3C11, M13B3, M1E7, M3BB, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2 e L9G11 estão apresentadas em SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, respectivamente, as suas sequências de aminoácidos estão apresentadas em SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 e 32, respectivamente. As sequências de nucleótidos das suas regiões variáveis da cadeia L estão apresentadas em SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43, respectivamente, e as suas sequências de aminoácidos estão apresentadas em SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 e 54, respectivamente.

Exemplo 14

Classificação de epítopos utilizando proteína de fusão com GST

Para realizar uma análise detalhada dos epítopos para os anticorpos que se ligam ao fragmento C-terminal, prepararam-se proteínas de fusão de péptidos C-terminais de GPC3 sucessivamente mais curtos, com GST, nomeadamente GC-1 (de Ser495 a Lys563), GC-2 (de Gly510 a Lys563), GC-3 (de Ala524 a Lys563), GC-4 (de Gly537 a Lys563) e GC-5 (de Ser550 a

Lys563). A região C-terminal de GPC3 foi clonada em pGEX-4T-3 70 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (Amersham) para construir um ADN plasmídico em que a região exterminai de GPC3 está ligada ao lado C-terminal de GST. O ADN plasmidico foi introduzido em DH5a, pelo que se obteve um transformante. Então, adicionou-se IPTG a 1 mM a uma cultura do transformante na fase de crescimento logarítmica para induzir a expressão de uma proteina de fusão com GST. As células bacterianas foram recolhidas após 2 horas de cultura. As células foram homogeneizadas com ultra-sons, e centrifugadas a 35 000 rpm durante 30 minutos numa ultracentrifuga XL-80 (Beckman, rotor 70.1 Ti). Depois, recuperou-se o sobrenadante de cultura e purificou-se com Módulos de Purificação de GST (Amersham). As proteínas de fusão com GST assim purificadas foram separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras, e realizou-se um Western blotting com os anticorpos anti-GPC3 (Fig. 6). M3C11 e M1E7 detectaram GC-1 e GC-2, enquanto não detectaram GC-3, GC-4 e GC-5, indicando que os epítopos destes anticorpos estão contidos na região de GC-2, e que a região de GC-3 não é suficiente. M3B8 e M11F1 detectaram GC-1, GC-2, GC-3 e GC-4, enquanto não detectaram GC-5, indicando que os epítopos destes anticorpos estão contidos na região de GC-4, e que a região de GC-5 não é suficiente. A região mínima da proteína de fusão com GST a que cada anticorpo se consegue ligar está listada na coluna intitulada "Western blotting" da Fig. 16.

Exemplo 15

Preparação de anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3

As sequências das regiões variáveis da cadeia H e da cadeia l dos anticorpos anti-GPC3 foram ligadas às sequências de regiões constantes de uma IgGl humana e uma cadeia capa. Realizou-se uma PCR utilizando um oligonucleótido sintético, que é complementar à sequência de nucleótidos 5'-terminal da região variável da cadeia H de cada anticorpo e possui uma sequência Kozak, e um oligonucleótido sintético, que é complementar à sequência de nucleótidos 3'-terminal e possui um local NheI. O produto obtido da PCR foi clonado no vector pB-CH em que uma região constante de IgGl humana foi inserida no vector pBluescript KS(+) (Toyobo). A região variável da cadeia H de ratinho e a região constante da cadeia H humana (cadeia γΐ) são ligadas através do local NheI. O fragmento génico da cadeia H preparado foi clonado num vector de 71 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ expressão, pCXND3. Por outro lado, realizou-se uma PCR utilizando um oligonucleótido sintético, que é complementar à sequência de nucleótidos 5'-terminal da região variável da cadeia L de cada anticorpo e possui uma sequência Kozak, e um oligonucleótido sintético, que é complementar à sequência de nucleótidos 3'-terminal e possui um local BsiWI. 0 produto obtido da PCR foi clonado no vector pB-CL em que a região constante da cadeia capa humana foi inserida no vector pBluescript KS(+) (Toyobo). A região variável da cadeia L humana e a região constante são ligadas através do local BsiWI. 0 fragmento génico da cadeia L preparado foi clonado num vector de expressão, pUCAG. Este vector pUCAG foi obtido por clonagem de um fragmento de 2,6 kpb obtido por digestão de pCXN (Niwa et al.r Gene 1991; 108: 193-200) com uma enzima de restrição BamRI, no local BamRI do vector pUC19 (Toyobo).

Para preparar um vector de expressão para um anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3, obteve-se um fragmento génico por digestão do vector pUCAG contendo o fragmento génico da cadeia L com uma enzima de restrição HindIII (Takara Shuzo), e clonou-se no local HindIII do pCXND3 contendo o gene da cadeia H. Este plasmídeo irá expressar um gene de resistência a neomicina, o gene de DHFR e um anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 numa célula animal.

Preparou-se como se segue uma linha celular de CHO (linha celular DG44) que expressa estavelmente o anticorpo. Introduziu-se o gene nas células pelo método da electroporação utilizando Gene Pulser II (Bio-Rad). Arrefeceu-se em gelo durante 10 minutos uma mistura obtida por mistura de 25 pg do vector de expressão para cada anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 e 0,75 mL de uma solução de células CHO suspensas em PBS (1 x 107 células/mL), e transferiu-se para uma cuvete. Depois, aplicou-se um pulso a 1,5 kv e uma capacitância de 25 pFD. Após um período de recuperação de 10 minutos à temperatura ambiente, suspenderam-se as células electroporadas em 40 mL de meio CHO-S-SFM ii (invitrogen) contendo suplemento HT lx (Invitrogen). Diluiu-se a suspensão 50 vezes com o mesmo meio, e dispensou-se numa placa de cultura de 96 poços a 100 pL/poço. Após uma cultura de 24 horas numa incubadora com C02 (5% de C02), adicionou-se Geneticina (Invitrogen) a 0,5 mg/mL e cultivaram-se as células 72 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ durante 2 semanas. Tomou-se o sobrenadante da cultura do poço possuindo uma colónia de células transformadas resistentes a Geneticina e mediu-se a quantidade de IgG pelo método de determinação da concentração descrito adiante. Uma linha celular de alta produção foi sucessivamente expandida para obter uma linha celular que expressa estavelmente um anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3. A linha celular foi cultivada em larga escala e recolheu-se o sobrenadante da cultura. A purificação de cada anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 foi realizada utilizando Hi Trap Protein G HP (Amersham).

Exemplo 16

Medição da actividade de citotoxicidade dependente do complemento (actividade de CDC) 16.1 Preparação de tampão veronal de albumina humana (HAVB)

Em água milli-Q, dissolveram-se 12,75 g de NaCl (qualidade superior, Wako Pure Chemicals), 0,5625 g de Barbital de Na (qualidade superior, Wako Pure Chemicals) e 0,8625 g de Barbital (qualidade superior, Wako Pure Chemicals) num volume final de 200 mL e autoclavou-se a 121°C durante 20 minutos. Depois, adicionaram-se 100 mL de água milli-Q autoclavada quente. O pH era de 7,43 (pH recomendado: 7,5). Utilizou-se a solução como tampão veronal 5x. Em 50 mL de água milli-Q, dissolveram-se 0,2205 g de CaCl2-2H20 (qualidade superior, Junsei Chemical) numa concentração final de 0,03 mol/L, que se utilizou como solução de CaCl2. Em 50 mL de água milli-Q, dissolveram-se 1,0165 g de MgCl2-6H20 (qualidade superior, Junsei Chemical) numa concentração final de 0,1 mol/L, que se utilizou como solução de MgCl2. Em água milli-Q, 100 mL do tampão veronal 5x, 4 mL de albumina sérica humana (Buminate a 25% (marca registada), a concentração de albumina sérica humana: 250 mg/mL, Baxter Healthcare), 2,5 mL da solução de CaCl2, 2,5 mL da solução de MgCl2, dissolveram-se 0,1 g de KC1 (qualidade superior, Junsei Chemical) 0,5 g de glucose (D(+)-glucose, glucose anidra, qualidade superior, Wako Pure Chemicals) num volume final de 500 mL, que se utilizou como havb. Após esterilização por filtração, armazenou-se o HAVB a uma temperatura predeterminada de 5°C. 73 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 16.2 Preparação da célula alvo A célula CHO que expressa GPC3 humano de comprimento completo preparada no Exemplo 4 foi cultivada em meio a-MEM contendo ácido nucleico (+) (GIBCO) suplementado com 10% de FBS e 0,5 mg/mL de Geneticina (GIBCO). As células foram dissociadas da placa utilizando um tampão de dissociação de células (Invitrogen Corp), dispensadas em cada poço de uma placa de fundo liso de 96 poços (Falcon) a 1 x 104 células/poço, e cultivou-se durante 3 dias. Após a cultura, adicionaram-se 5,55 MBq de crómio-51, e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono, a 37°C durante 1 hora. Lavaram-se estas células com HAVB duas vezes, e adicionaram-se 50 pL de HAVB e utilizaram-se como célula alvo. 16.3 Teste de libertação de crómio (actividade de CDC)

Cada anticorpo quimérico foi diluído com HAVB para preparar uma solução de anticorpo a 40 pg/mL. Adicionaram-se à célula alvo 50 pL de cada solução de anticorpo, e deixou-se em gelo durante 15 minutos. Subsequentemente, a cada poço, adicionaram-se 100 pL do soro humano do sangue periférico de um voluntário saudável, que tinha sido diluído com HAVB, numa concentração final de 25% (a concentração final de anticorpo: 10 pg/mL), e deixou-se numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 90 minutos. Após centrifugação da placa, recolheram-se 100 pL do sobrenadante de cada poço, e mediu-se a radioactividade utilizando um contador gama. A taxa específica de libertação de crómio foi obtida pela fórmula seguinte. taxa específica de libertação de crómio (%) = (A-C) x 100/(B-C) "A" representa a radioactividade (cpm) em cada poço, "B" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 100 pL da solução aquosa a 2% de NP-40 (Nonidet P-40, Código N.° 252-23, Nacalai Tesque) e 50 pL de HAVB foram adicionados à célula alvo, e "C" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 150 pL de HAVB foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicado e foram calculados o valor médio e o desvio padrão para a actividade de CDC (%). 74 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Os resultados estão apresentados na Fig. 7. Entre 9 tipos dos anticorpos quiméricos anti-GPC3, ο M3B8 e o MllFl, que são anticorpos que reconhecem o lado C-terminal, apresentaram uma forte actividade de CDC contra a célula CHO que expressa GPC3, contudo, a actividade de CDC não foi observada nos outros anticorpos. 0 M3B8 e o MllFl pertencem ao grupo denominado "b" com base no ELISA competitivo, e pôde ser encontrado um epitopo importante para apresentar forte actividade de CDC.

Exemplo 17

Medição da actividade de ADCC utilizando PBMC derivadas de sangue periférico humano 17.1 Preparação de solução de PBMC humanas 0 sangue periférico heparinizado obtido de um voluntário saudável foi diluído 2 vezes com PBS(-), e colocado na forma de sobrecamada em Ficoll-Paque TM PLUS (Amersham). Após centrifugação a 500 x g durante 30 minutos a 20°C, recolheu-se a camada do meio, que é a fracção de leucócitos mononucleares. Lavaram-se as colunas 3 vezes, suspenderam-se em FBS/RPMI a 10% e utilizou-se como solução de PBMC humanas. 17.2 Preparação de células alvo

As células HepG2 cultivadas em meio FBS/RPMI 1640 a 10% foram dissociadas da placa utilizando Tripsina-EDTA (Invitrogen), dispensadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U (Falcon) a 1 x 104 células/poço, e cultivadas durante 2 dias. A célula CHO que expressa GPC3 humano de comprimento completo preparada no Exemplo 4 foi cultivada em meio α-MEM ácidos nucleicos (+) (GIBCO) suplementado com 10% de FBS e 0,5 mg/mL de Geneticina (GIBCO). As células foram dissociadas da placa utilizando um tampão de dissociação de células (Invitrogen Corp), dispensadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano (Falcon) a 1 x 104 células/poço, e cultivadas durante 3 dias. Adicionou-se crómio-51 (5,55 MBq) a cada célula e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 1 hora. Estas células foram lavadas com o meio uma vez, e adicionaram-se 50 pL de meio FBS/RPMI 1640 a 10% e utilizaram-se como célula alvo. 75

ΕΡ 1 674 111/PT 17,3 Teste de libertação de crómio (actividade de ADCC)

Adicionaram-se à célula alvo 50 pL de uma solução de anticorpo preparada em diferentes concentrações, e fez-se reagir em gelo durante 15 minutos. Subsequentemente, adicionaram-se 100 pL da solução de PBMC humanas a 5 x 105células/poço, e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 4 horas. Após a cultura, centrifugou-se a placa, e mediu-se a radioactividade em 100 pL do sobrenadante da cultura utilizando um contador gama. A taxa especifica de libertação de crómio foi obtida pela fórmula seguinte. taxa específica de libertação de crómio (%) = (A-C) x 100/(B-C) "A" representa o valor médio das radioactividades (cpm) em cada poço, "B" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 100 pL de solução aquosa a 2% de NP-40 (Nonidet P-40, Código N.° 252-23, Nacalai Tesque) e 50 pL de meio FBS/RPMI a 10% foram adicionados à célula alvo, e "C" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 150 pL de meio FBS/RPMI a 10% foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicado e calcularam-se o valor médio e o desvio padrão para a actividade de ADCC (%) . Os resultados estão apresentados na Fig. 8. Entre 9 tipos dos anticorpos quiméricos anti-GPC3, os anticorpos que reconhecem o lado C-terminal tinham uma tendência para apresentar uma forte actividade de ADCC.

Exemplo 18

Imunização com GC-3 e selecção de hibridoma

Entre os anticorpos anti-GPC3 obtidos, apenas o M11F1 e o M3B8 apresentaram uma forte actividade de CDC, indicando que a actividade de CDC é dependente dos epítopos. Para obter um anticorpo possuindo tanto actividade de ADCC como actividade de CDC, foi utilizada para a imunização uma proteína de fusão com GST contendo o epítopo para M11F1 e M3B8, referida como GC-3. Purificou-se uma grande quantidade de GC-3 pelo método acima mencionado. O tampão foi mudado para PBS por filtração em gel utilizando Superdex 75 (Amersham). Utilizou-se o 76 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ produto obtido como imunoproteína utilizando três ratinhos Balb/c (adquiridos a Charles River Japan, Inc.) e três ratinhos MRL/lpr foram imunizados com GC-3 de acordo com o método acima mencionado. Para a primeira imunização, preparou-se GC-3 a 100 pg/cabeça e emulsionou-se utilizando FCA, que foi administrado subcutaneamente. Duas semanas mais tarde, preparou-se GC-3 a 50 pg/cabeça e emulsionou-se utilizando FIA, que foi administrado subcutaneamente. Após a quinta imunização, a imunização final (50 pg/cabeça) foi realizada para todos os ratinhos por administração intravenosa da imunoproteína através da cauda. Após a fusão celular, rastrearam-se os hibridomas através de um ELISA utilizando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel da proteína nuclear GPC3. Monoclonou-se um clone positivo pelo método de diluição limitante. Como resultado, obtiveram-se 5 clones de anticorpos (GC199, GC202, GC33, GC179 e GC194) que têm uma forte actividade de ligação contra GPC3. O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura do hibridoma utilizando Hi Trap proteinG HP, e analisou-se de acordo com o método acima mencionado. O valor de EC50 foi calculado através de um ELISA utilizando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel da proteína nuclear GPC3, e o valor de moda-X do histograma a 5 pg/mL foi medido

por citometria de fluxo (Fig. 17! ) · De acordo com a classificação de epítopos por um ELISA competitivo, os anticorpos foram classificados no grupo b (GC199, GC202 e GC33) e num novo grupo de epítopos f (GC179 e GC194). A classificação de epítopos utilizando as proteínas de fusão com GST indicou que GC1999, GC202 e GC33 detectaram GC-1, GC-2, GC-3 e GC-4, mas não detectaram GC-5, sugerindo que os epítopos para estes anticorpos estão contidos na região de GC-4 da mesma maneira que os epítopos para MllFl e M3B8, e que a região de GC-5 não é suficiente. Por outro lado, o GC179 e o GC194 detectaram GC-1, GC-2 e GC-3, mas não detectaram GC-4 e GC-5, sugerindo que os epítopos para estes anticorpos estão contidos na região de GC-3, e que a região de GC-4 não é suficiente. A região mínima da proteína de fusão com GST a que cada anticorpo se consegue ligar está listada na coluna intitulada "Western blotting" da Fig. 17. 77 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

As regiões variáveis da cadeia H e da cadeia L de GC199, GC202, GC33, GC179 e GC194 foram clonadas de acordo com o método acima mencionado, e as suas sequências foram determinadas. Quanto à cadeia L de GC194, foram clonados 2 tipos de sequências. As sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia H de GC199, GC202, GC33, GC179 e GC194 estão apresentadas em SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 58 e 59, respectivamente, e as suas sequências de aminoácidos estão apresentadas em SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63 e 64, respectivamente. As sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia L de GC199, GC202, GC33, GC179, GC194(1) e GC194(2) estão apresentadas em SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 68, 69 e 70 respectivamente, e as suas sequências de aminoácidos estão apresentadas em SEQ ID NOs: 71, 72, 73, 74, 75 e 76, respectivamente.

Adicionalmente, estas sequências de aminoácidos foram examinadas quanto a homologia por comparação com a base de dados das sequências de aminoácidos de anticorpos conhecidos, pelo que as suas regiões CDR foram determinadas como se segue.

Anticorpo CDR Sequência de aminoácidos SEQ ID NO M13B3(H) CDRl NYAMS 103 CDR2 AINNNGDDTYYLDTVKD 104 CDR3 QGGAY 105 M3B8(H) CDRl TYGMGVG 106 CDR2 NIWWYDAKYYNSDLKS 107 CDR3 MGLAWFAY 108 MllFl(H) CDRl IYGMGVG 109 CDR2 NIWWNDDKYYNSALKS 110 CDR3 IGYFYFDY 111 M5B9(H) CDRl GYWMH 112 CDR2 AIYPGNSDTNYNOKFKG 113 CDR3 SGDLTGGLAY 114 M6B1(H) CDRl SYAMS 115 CDR2 AINSNGGTTYYPDTMKD 116 CDR3 HNGGYENYGWFAY 117 78 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo CDR Sequência de aminoácidos SEQ ID NO M10D2(Η) CDR1 SYWMH 118 CDR2 EIDPSDSYTYYNQKFRG 119 CDR3 SNLGDGHYRFPAFPY 120 L9G11(Η) CDR1 SYWMH 118 CDR2 TIDPSDSETHYNLQFKD 121 CDR3 GAFYSSYSYWAWFAY 122 GC33(Η) CDR1 DYEMH 123 CDR2 ALDPKTGDTAYSQKFKG 124 CDR3 FYSYTY 125 GC179(Η) CDR1 INAMN 126 CDR2 RIRSESNNYATYYGDSVKD 127 CDR3 EVTTSFAY 128 GC194(Η) CDR1 ASAMN 129 CDR2 RIRSKSNNYAIYYADSVKD 130 CDR3 DPGYYGNPWFAY 131 GC199(Η) CDR1 DYSMH 132 CDR2 WINTETGEPTYADDFKG 133 CDR3 LY 134 GC202(Η) CDR1 TYGMGVG 106 CDR2 NIWWHDDKYYNSALKS 135 CDR3 IAPRYNKYEGFFAF 136 Μ13Β3(L) CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLN 137 CDR2 LVSKLDS 138 CDR3 WQGTHFPLT 139 Μ3Β8(L) CDR1 KASQDINNYLS 140 CDR2 RANRLVD 141 CDR3 LQCDEFPPWT 142 M11F1(L) CDR1 RSSQSLVHSNGNTYLH 143 CDR2 KVSNRFS 144 CDR3 SQSTHVPWT 145 Μ5Β9(L) CDR1 RSSKSLLHSNGITYLY 146 79 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Anticorpo CDR Sequência de aminoácidos SEQ ID NO CDR2 QMSNLAS 147 CDR3 AQNLELPYT 148 Μ6Β1(L) CDRl KASQDTNKNII 149 CDR12 YTSTLQP 150 CDR3 LQYDNLPRT 151 M10D2(L) CDRl RASHSISNFLH 152 CDR2 YASQSIS 153 CDR3 QQSNIWSLT 154 L9G11(L) CDRll RASESVEYYGTSLMQ 155 CDR2 GASNVES 156 CDR3 QQSRKVPYT 157 GC33(L) CDRl RSSQSLVHSNGNTYLH 143 CDR2 KVSNRFS 144 CDR3 SQNTHVPPT 158 GC179(L) CDRl KSSKSLLHSNGNTYLN 159 CDR2 WMSNLAS 160 CDR3 MQHIEYPFT 161 GC194 (L)1 CDRl RSSKSLLHSYDITYLY 162 CDR2 QMSNLAS 147 CDR3 AQNLELPPT 163 GC194(L)2 CDRl SASSSVSYMY 164 CDR2 DTSNLAS 165 CDR3 QQWSSYPLT 166 GC199(L) CDRl KSSQSLLHSDGKTFLN 167 CDR2 LVSRLDS 168 CDR3 CQGTHFPRT 169 GC202(L) CDRl RSSQSIVHSNGNTYLE 170 CDR2 KVSNRFS 144 CDR3 FQGSHVPWT 171 80 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Exemplo 19

Medição da actividade de adcc utilizando uma célula efectora derivada de medula óssea de ratinho 19.1 Preparação da solução de célula efectora derivada de medula óssea de ratinho

Recolheram-se células de medula óssea do fémur de um ratinho SCID (CLEA Japan, Inc., macho, 10 semanas de idade), e suspenderam-se em meio FBS/RPMI 1640 a 10% a 5 x 105 células/mL. Adicionaram-se GM-CSF de ratinho (PeproTech) e IL-2 humana (PeproTech) a 10 ng/mL e 50 ng/mL, respectivamente, e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 5 dias. Após a cultura, rasparam-se as células com um raspador e lavaram-se com o meio uma vez. Depois, suspenderam-se as células em meio FBS/RPMI 1640 a 10% a 5 x 106células/mL, e utilizaram-se como solução de células efectoras derivadas de medula óssea de ratinho. 19.2 Preparação da célula alvo

Uma linha celular de hepatoma humano, HuH-7, foi mantida e subcultivada com meio DMEM (SIGMA) contendo FBS a 10% (ThermoTrace). As células foram dissociadas da placa utilizando Tampão de Dissociação de Células (Invitrogen), dispensadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U (Falcon) a 1 x 104 células/poço, e cultivaram-se durante 1 dia. Após a cultura, adicionaram-se 5,55 MBq de crómio-51, e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 1 hora. Estas células foram lavadas com o meio uma vez, e adicionaram-se 50 pL de meio FBS/RPMI 1640 a 10% e utilizou-se como célula alvo. 19.3 Teste de libertação de crómio (actividade de ADCC)

Adicionaram-se à célula alvo 50 pL de uma solução de anticorpo preparada em diferentes concentrações, e fez-se reagir em gelo durante 15 minutos. Subsequentemente, adicionaram-se 100 pL da solução de células efectoras derivadas de medula óssea de ratinho (5 x 105 células/poço), e cultivaram-se as células numa incubadora de gás com 5% de dióxido de carbono a 37°C durante 4 horas. Após a cultura, 81 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ centrifugou-se a placa, e mediu-se a radioactividade em 100 pL do sobrenadante da cultura utilizando um contador gama. Obteve-se a taxa específica de libertação de crómio pela fórmula seguinte. taxa específica de libertação de crómio (%) = (A-C) x 100/(B-C) "A" representa o valor médio das radioactividades (cpm) em cada poço, "B" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 100 pL de solução aquosa a 2% de NP-40 (Nonidet P-40, Código N.° 252-23, Nacalai Tesque) e 50 pL de meio FBS/RPMI a 10% foram adicionados à célula alvo, e "C" representa o valor médio das radioactividades (cpm) nos poços em que 150 pL de meio FBS/RPMI a 10% foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicado e calcularam-se o valor médio e o desvio padrão para a actividade de ADCC (%).

Os resultados estão apresentados na Fig. 9. Foi revelado que o anticorpo GC33 apresenta uma actividade de ADCC quando a concentração de anticorpo é de 0,1 pg/mL ou superior, e apresenta actividade mais forte que o anticorpo GC199.

Exemplo 20

Actividade antitumoral de anticorpo GC33 no modelo de ratinho transplantado com hepatoma humano 20.1 Preparação de modelo de ratinho transplantado com hepatoma humano

Preparou-se uma linha celular de hepatoma humano, HuH-7, a 5 x 107 células/mL numa solução contendo meio DMEM e MATRIGEL (BD Bioscience) numa razão de 1:1. No dia anterior, 100 pL de uma solução de anticorpo anti-asialo GMl (Wako Pure Chemicals, um frasco foi dissolvido com lmL de água destilada para injecção e depois adicionou-se 4 mL de solução salina fisiológica) foram administrados intraperitonealmente a um ratinho SCID (macho, 5 semanas de idade, CLEA Japan, Inc.). O ratinho foi transplantado com 100 pL da suspensão celular acima mencionada (5 x 106 células/ratinho) subcutaneamente na área abdominal. 82 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 20.2 Preparação e administração de anticorpo

Começando no 20° dia após a transplantação das células, administrou-se uma solução de anticorpo preparada no dia da administração a 0,5 mg/mL (grupo de administração de 5 mg/kg) e a 0,1 mg/mL (grupo de administração de 1 mg/kg) com PBS(-), ao modelo de ratinho transplantado com células de hepatoma humano a 10 mL/kg através da veia da cauda uma vez por semana durante 3 semanas. Como controlo negativo, administrou-se PBS(-) (veiculo) a 10 mL/kg através da veia da cauda uma vez por semana durante 3 semanas de uma maneira similar. Ambos os grupos consistiam em 6 ratinhos cada um. 20.3 Avaliação do efeito antitumoral O efeito antitumoral do anticorpo GC33 no modelo de ratinho transplantado com células de hepatoma humano foi avaliado com a alteração do volume do tumor ao longo do tempo e o peso do tumor a 1 semana após a administração final. O volume tumoral foi calculado pela fórmula seguinte.

Volume tumoral = (eixo principal) x (eixo menor) x (eixo menor)/2

Como mostrado na Fig. 10, observou-se uma inibição significativa do crescimento tumoral no grupo do anticorpo GC33 comparativamente com o grupo de veiculo.

Consequentemente, mostrou-se que o GC33 tem um efeito antitumoral no modelo de ratinho transplantado com células hepatoma humano.

Exemplo 21

Preparação de anticorpo quimérico ratinho-humano GC33 A cadeia H e a cadeia L de GC33 foram amplificadas por PCR utilizando um oligonucleótido sintético, que é complementar às sequências de nucleótidos 5'-terminais e tem uma sequência Kozak e um local HindiII, e um oligonucleótido sintético, que é complementar às sequências de nucleótidos 3'-terminais e tem um local Bamtil. Após digestão com Hindlll e BamRI, o produto de PCR obtido foi clonado num vector de expressão, HEFgYl, em que foi inserida uma região constante de igGl humana, e num vector de expressão, HEFgK, em que foi 83 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ inserida uma região constante da cadeia capa humana (Sato et al., Mol Immunol. 1994; 371-381). Os vectores foram introduzidos numa célula CHO (linha celular DG44) de acordo com o método acima mencionado, e estabeleceu-se uma linha celular expressora estável. 0 anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura utilizando Hi Trap ProteinG HP (Amersham). A concentração de igG no sobrenadante da cultura foi medido por um ELISA em sanduiche com IgG humana utilizando IgG de cabra anti-humana (BIOSOURCE) e conjugado de IgG de cabra anti-humana com fosfatase alcalina (BIOSOURCE), e determinou-se a concentração através da comparação com uma IgG humana comercialmente disponível (Cappel).

Exemplo 22

Medição da actividade de CDC e da actividade de ADCC utilizando anticorpo quimérico ratinho-humano GC33

De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 16 e 17, mediram-se as actividades de CDC e as actividades de ADCC dos anticorpos quiméricos ratinho-humano GC33, M3C11 e MlE7.

Quanto à célula alvo, utilizou-se a célula CHO que expressa GPC3 de comprimento completo para medir a actividade de CDC e utilizou-se HepG2 para medir a actividade de ADCC. Os resultados estão apresentados na Fig. 11 e Fig. 12, respectivamente. Foi revelado que, em cada um dos sistemas de teste, o GC33 apresenta uma forte actividade de CDC e actividade de ADCC comparativamente com os outros dois anticorpos.

Exemplo 23

Análise de epítopos para GC33

Para determinar o epítopo para GC33 em detalhe, prepararam-se proteínas de fusão de um péptido C-terminal de GPC3 ainda mais curto e GST, e analisaram-se por Western blotting. As sequências peptídicas derivadas de GPC3 preparadas contidas na proteína de fusão com GST estão apresentados na Fig. 13. Como GC33 se consegue ligar a GC-4 (aa 537-563), mas não se liga a GC-5 (aa 550-563),

considerou-se que o epítopo está localizado numa região contendo pelo menos parte da região aa 537-550. Primeiro, prepararam-se os péptidos GC-6 (GNSQQATPKDNE I S 84 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ (SEQ ID ΝΟ:93)), GC-7 (GNSQQATP SEQ ID ΝΟ:94)), GC-8 (Q Q A Τ Ρ Κ D Ν (SEQ ID ΝΟ:95)) e GC-9 (TPKDNEIS (SEQ ID ΝΟ:96)). Prepararam-se um oligo de ADN directo e um oligo de adn inverso que foram desenhados de maneira a que o local de clivagem da sequência de reconhecimento de £coRI ficasse ligado à extremidade 5' e o local de clivagem da sequência de reconhecimento de Sal I ficasse ligado à extremidade 3', respectivamente. A sintese dos oligo de ADN foi realizada por Espec Oligo Service. 0 adn foi purificado com cartucho C-18, fosforilado na extremidade 5' e utilizado para a análise. Misturaram-se vinte e cinco microlitros do oligo de ADN directo (10 μΜ) e 25 pL do oligo de ADN inverso (10 μΜ) e fez-se reagir a 94°C durante 5 minutos, a 37°C durante 10 minutos, e à temperatura ambiente durante 15 minutos, e depois deixou-se a 4°C durante 10 minutos para hibridar o oligo de ADN directo e o oligo de ADN inverso. A concentração dos oligos foi determinada por medição da absorvância numa razão molar da inserção para vector de 3:1. Os oligos foram clonados em pGEX4T-3 digerido com EcoRi e Sali, e a sequência de nucleótidos foi confirmada. Preparou-se uma proteína de fusão com GST de acordo com o método acima mencionado, e purificou-se utilizando Glutationa-Sepharose 4B. Separaram-se as proteínas purificadas por SDS-PAGE sob condições redutoras, e analisou-se por Western blotting utilizando GC33. Como resultado, o anticorpo GC33 não conseguiu detectar nenhuma proteína de fusão com GST fortemente, sugerindo que é necessária uma sequência mais longa no lado C-terminal para a ligação de GC33 (Fig. 14). Com base na previsão anterior, prepararam-se GC-11 (ATPKDNEIST (SEQ ID NO:97)), GC-12 (PKDNEISTFH (SEQ ID NO:98)), GC-13 (D Ν E I S T F Η N L (SEQ ID NO:99)) e GC-14 (EISTFHNLGN (SEQ ID NO:100)) e avaliaram-se da mesma maneira. Como resultado, GC-11, GC-12 e GC-13 ligaram-se a GC33 mais fortemente, sugerindo que o epítopo para GC33 está localizado na sequência do 544° ao 553° (PKDNEISTFH) no terminal C de GPC3.

Exemplo 24 Humanização de GC33

Os dados da sequência do anticorpo foram obtidos da base de dados Kabat publicamente disponível (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/base de dadoss/kabat/) e da Base de 85 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ dados ImMunoGeneTics (IMGT). A região variável da cadeia H e a região variável da cadeia L foram separadamente submetidas a pesquisa de homologia. Como resultado, verificou-se que a região variável da cadeia H tem uma elevada homologia com DN13 (Smithson et al., Mol Immunol. 1999; 3_6: 113-124), e verificou-se que a região variável da cadeia L tem uma elevada homologia com o ARNm de IGK de Homo sapiens para a região VLJ da cadeia leve capa de imunoglobulina, cds parcial, clone: K64 do número de acesso de AB064105. A sequência de sinal do número de acesso de S40357 que tem uma elevada homologia com AB064105 foi utilizada como sequência de sinal da cadeia L. A região determinante de complementaridade (daqui em diante referida como CDR) de GC33 foi transplantada para as regiões de esqueleto (daqui em diante referidas como FR) destes anticorpos humanos para preparar um anticorpo humanizado.

Especificamente, os oligo de ADN sintéticos de aproximadamente 50 bases foram desenhados de maneira a que aproximadamente 20 bases delas estavam hibridadas e estes oligo de ADN sintéticos foram montados pelo método PCR para preparar genes que codificam cada uma das regiões variáveis. Foram digeridos no local HindiII inserido na extremidade do oligo de ADN sintético 5'-terminal e no local BamRI inserido na extremidade do oligo de ADN sintético 3'-terminal. Os fragmentos foram clonados num vector de expressão, HEFgYl, em que foi clonada uma região constante de IgG humana, ou num vector de expressão, HEFgxl, em que foi clonada uma região constante da cadeia capa humana (Sato et al., Mol Immunol. 1994; 371-381). A cadeia H e a cadeia L do GC33 humanizado construído como acima foram denominadas ver.a, respectivamente. A actividade de ligação do GC33 humanizado, cuja cadeia H e cadeia L eram ambas ver.a (ver.a/ver.a), foi inferior à de um anticorpo com regiões variáveis de GC33 de ratinho (ratinho/ratinho). Foram construídos anticorpos em que a sequência de GC33 de ratinho e a sequência de ver.a foram combinadas quimericamente (ratinho/ver.a, ver.a/ratinho) em relação à cadeia H e à cadeia L, e avaliaram-se as suas actividades de ligação. Como resultado, observou-se uma diminuição na actividade de ligação em ver.a/ratinho, indicando que a diminuição na actividade de ligação devida a substituição de aminoácidos era atribuída à cadeia H (Fig. 15). Depois, prepararam-se cadeias H modificadas, ver.c, 86 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ ver. f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k. Todos estes GC33 humanizados apresentaram uma actividade de ligação equivalente à de um anticorpo quimérico possuindo a região variável de GC33 de ratinho (Fig. 15) . As sequências de nucleótidos das regiões variáveis da cadeia H de GC33 humanizado ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k estão apresentadas em SEQ ID NOs: 77, 78, 79, 80, 81, 82 e 83, respectivamente, e as suas sequências de aminoácidos estão apresentadas em SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 87, 88, 89 e 90, respectivamente. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia L de GC33 humanizado, ver.a, estão apresentadas em SEQ ID NOs: 91 e 92, respectivamente. Nas regiões variáveis da cadeia H de GC33 humanizado ver.i, ver.j e ver.k, o 6o resíduo de ácido glutâmico está substituído pelo resíduo de glutamina. A estabilidade térmica destes anticorpos foi significativamente aumentada.

Exemplo 25

Modificação da cadeia L de GC33 humanizado

Quanto à desamidação da proteína, sabe-se que a constante de velocidade da reacção de desamidação é dependente da sequência primária. Sabe-se também que Asn-Gly é particularmente susceptível a desamidação (Rocinson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2001; _98_; 944-949) . Quanto a Asn33 na CDRl de uma cadeia L de GC33 humanizado, ver.a, apresentada em SEQ ID NO:91, a sequência primária é Asn-Gly, que se prevê ser muito susceptível a desamidação.

Para avaliar o efeito da desamidação de Asn33 sobre a actividade de ligação, preparou-se um anticorpo modificado em que Asn33 foi substituído por Asp. Foi introduzida uma mutação pontual utilizando um Kit de Mutagénese dirigida ao local Quick Change (Stratagene). Mais especificamente, 50 pL de uma mistura reaccional contendo 125 ng de um iniciador de sentido directo (CTT GTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT: SEQ ID NO :172), 125 ng de um iniciador anti-sentido (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEQ ID NO: 173), 5 pL de tampão de reacção lOx, 1 pL de mistura de dNTP, 10 ng de HEFgK em que foi clonada uma cadeia L de GC33 humanizado ver.a e 1 pL de ADN-Polimerase Pfu Turbo, foram submetidos a PCR de 12 ciclos consistindo em 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto e 68°C durante 87 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 9 minutos. Subsequentemente, adicionou-se uma enzima de restrição, DpnI, e realizou-se a digestão a 37°C durante 2 horas, e o produto digerido foi introduzido em células XLl-Blue competentes ligadas ao kit, pelo que se obteve um transformante. A região variável foi clivada do clone em que cada mutação foi correctamente introduzida, e clonada novamente em HEFgic. Introduziu-se numa célula C0S7 utilizando Fugene 6 (Roche) juntamente com HEFgYl, em que uma cadeia H de GC33 humanizado ver.k tinha sido clonada. 0 anticorpo expresso transientemente na célula foi recuperado do sobrenadante da cultura. A concentração de anticorpo foi determinada através de um ELISA em sanduíche utilizando o anticorpo igG anti-humano. A actividade de ligação do anticorpo modificado foi avaliada através de um ELISA utilizando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel da proteína nuclear GPC3. Como apresentado na Fig. 18, a actividade de ligação foi perdida no anticorpo modificado (N33D) em que Asn33 tinha sido substituído por Asp, sugerindo que o efeito da desamidação de Asn33 sobre a actividade de ligação era significativo.

Como método de supressão da desamidação de Asn33, foi relatada a substituição de Gly34 por outro aminoácido (Pedido Internacional de Patente WO 03057881A1). De acordo com o método acima mencionado, substituiu-se G34 por qualquer dos 17 aminoácidos que não Cys e Met utilizando um Kit de Mutagénese dirigida ao local Quick Change para preparar uma série de anticorpos modificados, nomeadamente, G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S e G34T. Estes anticorpos foram expressos transientemente em células C0S7, e a actividade de ligação foi avaliada utilizando o sobrenadante da cultura. Verificou-se que a actividade de ligação é mantida mesmo quando G34 é substituído por outro aminoácido, excepto por Pro (G34P) e Vai (G34V).

As sequências de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve dos anticorpos modificados acima mencionados estão apresentadas em SEQ ID NO: 174 (G34A), SEQ ID NO:175 (G34D), SEQ ID NO:176 (G34E) , SEQ ID NO:177 (G34F), SEQ ID NO:178 (G34H), SEQ ID NO:179 (G34N), SEQ ID NO:180 (G34T), SEQ ID NO:181 (G34Q), SEQ ID NO:182 (G34I), SEQ ID NO:183 (G34K), SEQ ID NO:184 (G34L), SEQ ID NO:185 (G34S), SEQ ID NO:186 (G34W), SEQ ID NO:187 88 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

(G34Y) , SEQ ID ΝΟ:188 (G34R), SEQ ID ΝΟ:189 (G34V) e SEQ ID ΝΟ:190 (G34P), respectivamente. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos

modificados acima mencionados estão apresentadas em SEQ ID NO:191 (G34A), SEQ ID NO:192 (G34D), SEQ ID NO:193 (G34E), SEQ ID NO:194 (G34F), SEQ ID NO:195 (G34H), SEQ ID NO:196 (G34N), SEQ ID NO: 19 7 (G34T), SEQ ID NO:198 (G34Q), SEQ ID NO:199

(G34I), SEQ ID NO:200 (G34K), SEQ ID NO:201 (G34L), SEQ ID

NO:202 (G34S), SEQ ID NO:203 (G34W), SEQ ID NO:204 (G34Y), SEQ ID NO:205 (G34R), SEQ ID NO:206 (G34V) e SEQ ID NO:207 (G34P), respectivamente. O anticorpo da presente invenção pode ser utilizado como um inibidor do crescimento celular, um agente anticanceroso ou um agente para diagnóstico de cancros.

Exemplo 26

Preparação da linha celular de hepatoma humano (SK-03) que expressa GPC3 humano de comprimento completo

Para obter uma linha celular para avaliação de uma actividade biológica dos anticorpos anti-GPC3, estabeleceu-se uma linha celular de hepatoma humano que expressa GPC3 de comprimento completo.

Um micrograma de um vector de expressão de genes de GPC3 humano de comprimento completo tratado com Pvul foi misturado com 2pL de FuGENE (Roche) para permitir a formação do complexo. O complexo foi adicionado a células SK-HEP-1 (adquiridas a ATCC) para introdução do gene. Após incubação numa incubadora com C02 durante 24 horas, seleccionaram-se as células que expressam GPC3 utilizando MEM de Dulbecco (D-MEM, SIGMA) contendo Geneticina numa concentração final de 1 mg/mL e 10% de FBS. As colónias resistentes a Geneticina resultantes foram recolhidas e realizou-se a clonagem de células pelo método da diluição limitante. A expressão de GPC3 humano de cada clone celular foi ensaiada por citometria de fluxo utilizando o anticorpo quimérico GC33 e anticorpo IgG de cabra anti-humano marcado com FITC (ICN). Desta maneira, obteve-se uma linha celular de expressão estável, SK-03. 89 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Exemplo 27

Comparação da actividade de CDC e da actividade de ADCC de anticorpos quiméricos ratinho-humano

De modo a comparar directamente a actividade de CDC e a actividade de ADCC dos anticorpos quiméricos ratinho-humano GC33, M3C11, e M1E7 descritos no Exemplo 22, mediu-se a actividade de CDC e a actividade de ADCC de três anticorpos no mesmo sistema de teste de acordo com o método descrito nos Exemplos 16 e 17. Quanto à célula alvo, foi utilizada a célula CHO que expressa GPC3 de comprimento completo para medição da actividade de CDC e foi utilizada a SK-03 para medição da actividade de ADCC. Os resultados estão apresentados na Fig. 19 e na Fig. 20, respectivamente. Foi revelado que, em cada sistema de teste, o GC33 apresenta uma actividade de CDC e uma actividade de ADCC mais fortes comparativamente com os outros dois anticorpos.

Aplicabilidade Industrial O anticorpo da presente invenção pode ser utilizado como um inibidor do crescimento celular, um agente anticanceroso e um agente para o diagnóstico de cancros. 90 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Anticorpos Anti-Glipicano 3

<130> N96765 GCW <150> JP 2004-203637 <151> 2004-07-09 <16 0> 173 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 1 gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t < 210 > 2 < 211> 31

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 2 gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c < 210 > 3 <211> 1743

< 212 > ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 3 atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagágg cctttgaaat tgttgttcgc catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ceaggtttcc aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 91 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ tactgctctt gtcatgcaag ctgtcccttg cttggtctct ctgaccacca tattatcctg gaagaaacct ttctatagtg ctttgctgga atgaaaaacc caaattattg ggtagagttc gatgaagatg cgcttccttg caggcaactc ccgctgaagc tga actgccaggg gctgtatggc aagaacttgt tttcaacaat ctattggcaa aagatctctt tatccagccg ctttgcctgg atggacaaga agttcaatct acaaactgaa tggataaaaa agtgcattgg cagaactggc cgaaggacaa ttctcaccag actgatgatg aggtgtggtg gaatggcatg ccatgattct gttatgtgcc tattgacaag aagaagggaa ctacatctgc actcgtggag ccatgagctg gcacattaac cctggatgag aggctctggt ctatgatctg cgagataagc catggccatc gttaaaccct gagattgaca tacagaatct atccagtatg cattctcaac aaagtattaa ctaattcaga agccatagcc agatacagcc aaaatgaagg cagctcctga gaagggtttg gatggaatga gatgtggatg acctttcaca tcggtggtgt gtggcggtta agtactggag atgacatgga tccagaagaa aacgccaata aagttgctca agttgaagtc ctgtggcgga aaaaggcagc gccctgagcc gaaccatgtc aaagtggaga taaaagtgaa atgcgcctgg acctcgggaa gcttcttctt ctgcaatgtg agaatacatt gaacgtactg tgcaggaaag tagatctgct tgtagaacat tttcatcagc aaacgacacc aaggaatgga agtggtcagt tatgcccaaa ctgcggtgat gaatcagctc aaacagtcag cgttcattcc cctggtgcac 1743 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 < 210 > 4 <211> 580

<212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4

Met Ala Gly Thr Vai Arg Thr Ala Cys Leu Vai Vai Ala Met Leu Leu 15 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gin Ala Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30

Ala Thr Cys His Gin Vai Arg Ser Phe Phe Gin Arg Leu Gin Pro Gly 35 40 45

Leu Lys Trp Vai Pro Glu Thr Pro Vai Pro Gly Ser Asp Leu Gin Vai 50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80

Tyr Gin Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gin Leu Leu Gin Ser Ala 85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu lie lie Gin Asn Ala Ala Vai Phe Gin 100 105 110

Glu Ala Phe Glu Ile Vai Vai Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gin Ala Phe Glu Phe 130 135 140

Vai Gly Glu Phe Phe Thr Asp Vai Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 155 92 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Ile Asn Vai Asp Asp Met Vai Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175

Vai Ile Tyx Thr Gin Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190

Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Vai Phe 195 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gin Vai Ser Lys Ser Leu Gin 210 215 220

Vai Thr Arg Ile Phe Leu Gin Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Vai Ile 225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gin Gly Leu Met Met Vai Lys 260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Vai Vai Met Gin Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285

Vai Vai Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300

Glu Leu Vai Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyx Asp Met Glu Asn Vai Leu 305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gin Tyr Vai Gin Lys 325 330 335

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350

Gin Gin Arg Gin Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile 355 360 365

Asp Lys Lys Vai Leu Lys Vai Ala His Vai Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gin Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser 385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Vai Ala 405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gin Glu Leu Vai Glu Arg Tyr 420 425 430

Ser Gin Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gin Phe Asn Leu His 435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Vai Vai Ser Gin Ile Ile Asp 450 455 460

Lys Leu Lys His Ile. Asn Gin Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480

Gly Arg Vai Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 93 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510

Met Ile Lys Vai Lys Asn Gin Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525

Asp Leu Asp Vai Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro 530 535 540

Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Vai His Ser 545 550 555 560

Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Vai Vai Cys Phe Phe 565 570 575

Phe Leu Vai His 580

<210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 5 atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c 31

<210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 6 ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c 31 <210> 7 < 211> 21

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 7 gggccagtgg atagacagat g 21 <210> 8 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 8 caggggccag tggatagacc gatg 24 94 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 9 caggggccag tggatagact gatg 24

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 10 gctcactgga tggtgggaag atg 23

<210> 11 <211> 1392 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 11 atgaacttcg ggctcacctt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcaactgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gaggatccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtcgc tatgccatgt cttgggttcg ccagattcca 180 gagaagatac tggagtgggt cgcagccatt gatagtagtg gtggtgacac ctactattta 240 gacactgtga aggaccgatt caccatctcc agagacaatg ccaataatac cctgcacctg 300 caaatgcgca gtctgaggtc tgaggacaca gccttgtatt actgtgtaag acaggggggg 360 gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgcag otagcaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag. cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggaç cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 95 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 < 210 > 12 <211> 342

< 212 > ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 12 gaggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attaataata atggtgatga cacctactat 180 ttagacactg tgaaggaccg attcaccatc tccagagàca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acagccctgt attactgtgt aagacaaggg 300 ggggcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 342 <210> 13 <211> 1413

<212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 13 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tactacatgc actgggtgaa gcaaagtcct gaaaagagcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca ctggtggtac tacctacaac cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag gaggggcgga ttaactggga cgagcttctt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagaçc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaágc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

< 210 > 14 <211> 354 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 14 caggtcactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatggta tgggtgtagg ttggattcgt 120 cagccttcag ggatgggtct ggagtggctg gccaacattt ggtggtatga tgctaagtac 180 tataactctg acctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggtg 240 ttcctcaaga tctccagtgt ggacacttca gatactgcca catactactg tgctcaaatg 300 ggactggoct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 < 210 > 15 <211> 354

< 212 > ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 15 caggtcactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc atttatggta tgggtgtagg ttggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gccaacattt ggtggaatga tgataagtac 180 tataactcag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggta 240 ttcctcaaga tctccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcaaata 300 ggttacttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354

<210> 16 <211> 1416 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 16 atgaacttcg ggctcacctt gattttcctc gtccttactt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggaccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggatccac tttcagtaac tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcagccatt gatagtaatg gaggtaccac ctactatcca 240 gacactatga aggaccgatt caccatttcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaggtc tgaagacaca gccttttatc actgtacaag acataatgga 360 gggtatgaaa actacggctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 720 97 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ cccaaatctt gtgacaaaac ggaccgtcag tcttcctctt cctgaggtca catgcgtggt tggtacgtgg acggcgtgga aacagcacgt accgtgtggt aaggagtaca agtgcaaggt tccaaagcca aagggcagcc gagctgacca agaaccaggt atcgccgtgg agtgggagag gtgctggact ccgacggctc tggcagcagg ggaacgtctt acgcagaaga gcctctccct <210> 17 <211> 366

<212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 17 gaggtgcagc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagagaaga ggctggagtg ccagacacta tgaaggaccg ctgcaaatga gcagtctgag ggagggtatg aaaactacgg tctgca <210> 18 <211> 1413

<212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 18 atggaatcta actggatact gttcagctcc agcagtctgg tgcaaggctt ctggctacac ggacagggtc tggaatggat cagaagttca agggcaaggc gaactcagca gcctgacaaa ctaactgggg ggtttgctta gctagcacca agggcccatc ggcacagcgg ccctgggctg tggaactcag gcgccctgac ggactctact ccctcagoag tacatctgca acgtgaatca aaatcttgtg acaaaactca tcacacatgc ccaccgtgcc ccccccaaaa cccaaggaoa ggtggacgtg agccacgaag ggtgcataat gccaagacaa cagcgtcctc accgtcctgc ctccaacaaa gccctcccag ccgagaacca caggtgtaca cagcctgacc tgcctggtca caatgggcag ccggagaaca cttcttcctc tacagcaagc ctcatgctcc gtgatgcatg gtctccgggt aaatga tgggggagac ttagtgaagc cactttcagt agctatgcca ggtcgcagcc attaatagta attcaccatc tccagagaca gtctgaagac tcagccttgt ctggtttgct tactggggcc tccttttatt ctgtcggtag gactgtgctg gcaaggcctg ctttactggc tactggatgc tggcgctatt tatcctggaa caaactgact gcagtcacat tgaggactct gcggtctatt ctggggccaa gggactctgg ggtcttcccc ctggcaccct cctggtcaag gaçtacttcc cagcggcgtg cacaccttcc cgtggtgacc gtgccctcca caagcccagc aacaccaagg cacatgccca ccgtgcccag cagcacctga actcctgggg ccctcatgat ctcccggacc accctgaggt caagttcaac agccgcggga ggagcagtac accaggactg gctgaatggc cccccatcga gaaaaccatc ccctgccccc atcccgggat aaggcttcta tcccagcgac actacaagac cacgcctccc tcaccgtgga caagagcagg -aggctctgca caaccactac 1416 ctggagggtc cctgaaactc tgtcttgggt tcgccagact atggaggtac cacctactat atgccaagaa caccctgtac attactgtac aagacataat aagggactct ggtcactgtc 366 cttcaggggt ctactcagag gggcttcagt gaagatgtcc gctgggtaaa acagaggcct atagtgatac aacatacaac ctgtcagcac tgcctacatg actgttcaag atcgggggac tcactgtctc tacagccaaa cctccaagag cacctctggg ccgaaccggt gacggtgtcg cggctgtcct acagtcctca gcagcttggg cacccagacc tggacaagaa agttgagccc cacctgaact cctgggggga 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 60 120 180 240 300 360 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 98 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ ccgtcagtct tcctcttccc gaggtcacat gcgtggtggt tacgtggacg gcgtggaggt agcacgtacc gtgtggtcag gagtacaagt gcaaggtctc aaagccaaag ggcagccccg ctgaccaaga accaggtcag gccgtggagt gggagagcaa ctggactccg acggctcctt cagcagggga acgtcttctc cagaagagcc tctccctgtc

<210> 19 <211> 357 <212> ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 19 gaggttcagc tccagcagtc tcctgcaagg cttctggcta cctggacagg gtctggaatg aaccagaagt tcaagggcaa atggagctca gcagcctgac gacctaactg gggggcttgc cccaaaaccc aaggacaccc ggacgtgagc cacgaagacc gcataatgcc aagacaaagc cgtcctcacc gtcctgcacc caacaaagcc ctcccagccc agaaccacag gtgtacaccc cctgacctgc ctggtcaaag tgggcagccg gagaacaact cttcctctac agcaagctca atgctccgtg atgcatgagg tccgggtaaa tga tcatgatctc ccggacccct 840 ctgaggtcaa gttcaactgg 900 cgcgggagga gcagtacaac 960 aggactggct gaatggcaag 1020 ccatcgagaa aaccatctcc 1080 tgcccccatc ccgggatgag 1140 gcttctatcc cagcgacatc 1200 acaagaccac gcctcccgtg 1260 ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 ctctgcacaa ccactacacg 1380 1413 tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60 cacctttacc ggctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactaactac 180 ggccaaactg actgcagtca catctgccag cactgcctac 240 aaatgaggac gctgcggtct atcactgtac aagatcgggg 300 ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 20 <211> 372 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaactg 60 tcctgcaagg ctt.ctggata caccttcact agctactgga tgcattgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tacttactac 1BO aatcaaaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagatcaaat 300 ctgggtgatg gtcactaccg gtttcctgcg tttccttact ggggccaagg gactctggtc 360 actgtctctg ca 372 < 210 > 21 <211> 372

< 212 > ADN <213> Mus musculus < 4 0 0 > 21 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaaac ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagagg 120 cctggacaag gccttgaatg gattggtaca attgaccctt ctgatagtga aactcactac 180 99 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 240 300 360 aatctacagt tcaaggacac ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtat aagaggcgcc ttctatagrtt cctatagtta ctgggcctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 372

<210> 22 <211> 463 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Vai Leu Thr Leu Lys Gly 15 10 15

Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin lie Pro Glu Lys Ile Leu 50 55 60

Glu Trp Vai Ala Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80

Asp Thr Vai Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn 85 90 95

Thr Leu His Leu Gin Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110

Tyr Tyr Cys Vai Arg Gin Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125

Vai Thr Vai Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 130 135 140

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 145 150 155 160

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 165 170 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 195 200 205

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn 210 215 220

Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 100 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 260 265 270

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val Ser 305 310 315 320 Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 4Q5 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 435 440 445 Hls Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 23 <211> 114 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 23

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp val 35 40 45 Ala Ala lie Asn Asn Asn Gly Asp Asp Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 101 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Vai Arg Gin Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 100 105 . 110

Ser Ala

<210> 24 <211> 470 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 24

Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe lie Leu Ile Leu Ser Vai Thr Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Vai Lys Gin Ser Pro Glu Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Phe Ala 115 120 125 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 195 200 205 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 102 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 265 260

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 270

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 275 280 285

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 295 300

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365

Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380

Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400

Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415

Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430

Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 25 <211> 118 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 25

Gin Vai Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pio Gly Ile Leu Gin Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Met Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Ala Lys Tyr Tyr Asn Ser Asp 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Vai 65 70 75 80 103 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Phe Leu Lys Ile Ser Ser Vai Asp Thr Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Gin Met Gly Leu Ala Trp Phe Ala Tyr·Trp Gly Gin Gly Thr 10.0 105 110

Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115

Glu Ser Gly Pro Gly 10 Cys Ser Phe Ser Gly 25 Trp Ile Arg Gin Pro 40 Trp Trp Asn Asp Asp 55 60 Thr Ile Ser Lys Asp 75 Ser Vai Asp Thr Ala 90 Tyr Phe Tyr Phe Asp 105 Ser

<210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Gin Vai Thr Leu Lys 1 5

Thr Leu Ser Leu Thr 20

Gly Met Gly Vai Gly 35

Trp Leu Ala Asn Ile 50

Leu Lys Ser Arg Leu 65 70

Phe Leu Lys Ile Ser 85

Cys Ala Gin Ile Gly 100

Thr Leu Thr Vai Ser 115

Ile Leu Gin Pro Ser Gin 15

Phe Ser Leu Ser Ile Tyr 30

Ser Gly Lys Gly Leu Glu 45

Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala

Thr Ser Asn Asn Gin Vai 80

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 95

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <210> 27 <211> 471 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21

Met Asn Phe Gly Leu 1 5

Vai Gin Cys Glu Vai 20

Pro Gly Gly Thr Leu 35

Ser Asn Tyr Ala Met 50

Glu Trp Vai Ala Ala 65 70

Thr Leu Ile Phe Leu 10

Gin Leu Vai Glu Ser 25

Lys Leu Ser Cys Ala 40

Ser Trp Vai Arg Gin 55 60

Ile Asp Ser Asn Gly

Vai Leu Thr Leu Lys Gly 15 Gly Gly Asp Leu Vai Lys 30 Ala Ser Gly Ser Thr Phe 45 Thr Pro Glu Lys Arg Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro 80 75 104 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 90 95 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe 105 110 Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe 120 125 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala Ala Ser Thr 135 140 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 150 155 160

Asp Thr Met Lys 85

Thr Leu Tyr Leu . 100

Tyr His Cys Thr 115

Ala Tyr Trp Gly 130

Lys Gly Pro Ser 145

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175

Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His 180- 185 190

Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205

Vai.Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 210 215 220

Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys vai Glu 225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 275 280 285

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 290 295 ,300

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser Vai Leu Thr vai Leu His Gin Asp 325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 355 360 365

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380

Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400

Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415

Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430

Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser 435 440 445

Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 105 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 28 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Asp Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120

<210> 29 <211> 470 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 29

Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Vai Ala Ser Gly 1 5 10 15

Vai Tyr Ser Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Vai Leu Ala Arg 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Gly Tyr Trp Mét Arg Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 106 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Thr Ala Lys Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro .165 170 175 Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr -Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Vai Asn Hls Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr. Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 107

ΕΡ 1 674 111/PT

Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415

Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430

Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Vai Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Vai Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ala Ala Vai Tyr His Cys 85 90 95

Thr Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115

<210> 31 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 108 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr· Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Ser Asn Leu Gly Asp Gly His Tyr Arg Phe Pro Ala Phe Pro 100 105 110 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120

<210> 32 <211> 124 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 32

Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 10 15 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 40 45 Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Leu Gin Phe 55 60 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Ala Trp Phe Ala 105 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala ' 120

Gin Vai Gin Leu Gin 1 5

Ser Vai Lys Leu Ser 20

Trp Met His Trp Vai 35

Gly Thr Ile Asp Pro 50

Lys Asp Thr Ala Thr 65 70

Met Gin Leu Ser Ser 85

Ile Arg Gly Ala Phe 100

Tyr Trp Gly Gin Gly 115 <210> 33 <211> 717 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 33 60 120 180 240 300 360 atgagtcetg cceagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac caacggtgat gttgtgatga cccagactcc actcactttg tcggttacca ttggacaacc agcctccatc tcttgcaagt caagtcagag cctcttagat agtgatggaa agacatattt gaattggttg ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa attggactct ggagccoctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagt agagtggagg ctgaggattt gggaatttat tattgctggc aaggtacaca ttttccgctc 109 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa • aataacttct atcccagaga ggccaaagta ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag agcaccctga cgctgagcaa agcagactac acccatcagg gcctgagctc goccgtcaca

<210> 34 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 34 gatgttgtga tgaoccagtc tccactcact atctcttgca agtcaagtca gagcctctta ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag

<210> 35 <211> 717 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 35 atgagtcctg tccagttcct gtttctgtta gttgtgatga cccagactcc actgtctttg tcttgcaagt caagtcagag cctcttatat caacagaggc ctggccaggc tccaaagcac ggcatccctg acaggttcag tggcagtgga agagtggagg ctgaagattt gggagtttat acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa aataacttct atcccagaga ggccaaagta ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag agcaccctga cgctgagcaa agcagactac acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca

<210> 36 <211> 324 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 36 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat gggaaatctc ctáagaccct gatctatcgt aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 aagagcttca acaggggaga gtgttga 717 ttgtcgatta ccattggaca accagcctcc 60 gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 ggatcaggga cagatttctc actgaaaatc 240 tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctgaaa 336 atgctctgga ttcaggaaac caacggtgat 60 tcggttacca ttggacaacc agcctctatc 120 agtaatggaa agacatattt gaattggtta 180 ctaatgtatc aggtgtccaa actggaccct 240 tcagaaacag attttacact taaaatcagc 300 tactgcttgc aaagtacata ttatccgctc 360 aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 aagagcttca acaggggaga gtgttga 717 atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 aactatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 110 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaattaatta ttgtctacag tgtgatgagt ttcctccgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca agctggaaat caaa 324

<210> 37 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 37 tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagqctcc 60 gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 caagctggaa atcaaa 336 gatgttgtga tgacccaaac atctcttgca gatctagtca tacctgcaga agccaggcca tctggggtcc cagacaggtt agcagagtgg aggctgagga tggacgttcg gtggaggcac

<210> 38 <211> 705 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 38 atgagaccct ccattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg tgttcagtgt 60 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 120 atcacttgca aggcaagtca ggacattaac aagaatatag tttggtacca acacaagcct 180 ggaaaaggtc ctaggctgct catatggtac acatctacat tacagccagg catcccatca 240 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 300 gaagatattg caacttatta ctgtctacag tatgataatc ttccacggac gttcggtgga 360 ggcaccaaac tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagrt gttga 705

<210> 39 <211> 321 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 39 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60 atcacttgca aggcaagtca ggacattaac aagaatataa tttggtacca acacaagcct 120 ggaaaaggtc ctaggctgct catatggtac acatctacat tacagccagg catcccatca 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240 gaagatattg caacttatta ctgtctacag tatgataatc ttccacggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 40 <211> 720 <212> ADN <213> Mus musculus 111 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 40 atgaggttct ctgctcagct tctggggctg cttgtgctct ggatccctgg atccactgca 60 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcaacttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 180 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagoagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 360 tatacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaà 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 720 <210> 41 <211> 336 <212> ADN<213> Mus musculus < 4 0 0 > 41 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg tttctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg tatacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaa <210> 42 <211> 321 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 42 gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctttcctgca gggccagcça tagtattagc aacttcctac catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt aggttcagtg gcaatggatc agggacagat ttcactctca gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacatct gggaccaagc tggagctgaa a <210> 43 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 43 • gacattgtgc tcacccaatc atctcctgca gagccagtga caacagaaac caggacagcc ggggtccctg ccaggtttag cctgtggagg aggatgatat acgttcggat cggggaccaá ctcttggaac atcagcttcc 60 gcatcactta tttgtattgg 120 atcagatgtc caaccttgcc 180 ctgatttcac actgagaatc 240 ctcaaaatct agaacttccg 30Ò 336 ctccaggaga cagagtcagt 60 actggtatcc acaaaaatca 120 ccatctctgg gatcccctcc 180 gtatcaacag tgtggagact 240 ggtcgctcac gttcggtgct 300 321 tccaacttct aagtgttgaa acccaaactc tggcagtggg tgcaatgtat gctggaaata ttggctgtgt tattatggca ctcatctatg tctgggacag ttctgtcagc aaa ctctagggca ctagtttaat gtgcatccaa acttcagcct aaagtaggaa gagtgtcacc gcagtggtac cgtagaatct caacatccat ggttccgtat 333 60 120 180 240 300 112 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <210> 44 <211> 238

< 212 > PRT <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 44

Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Vai Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Asn Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Vai 20 25 30 Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 Gly Ala Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus 113 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 45

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Thr Leu Ser Ile Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly ile Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95 Thr Hls Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110

<210> 46 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46

Met Ser Pro Vai Gin Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gin Glu 15 10 15

Thr Asn Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Vai 20 25 30

Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45

Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg Pro 50 55 60

Gly Gin Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gin Vai Ser Lys Leu Asp Pro 65 70 75 80

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys 100 105 110

Leu Gin Ser Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 114 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 130 135 140

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 165 170 175

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 47 <211> 108 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 47

Asp Ile Lys Mèt Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser. Gin Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Vai Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Asn Tyr Cys Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48

Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 115 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 > 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 49 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49

Met Arg Pro Ser He Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Vai Gin Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Asn Ile Vai Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 116 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Lys Asn 20 25 30 ile Ile Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 < 210 > 51 <211> 239

< 212 > PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 51

Met Arg Phe Ser Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Vai Leu Trp lie Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Ala Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro 20 25 30 ,Val Thr Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60

Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80

Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr 100 105 110

Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 115 120 125 117 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro 130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu 145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin 210 215 . 220 Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 52 <211> 112 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 52

Asp ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53

Leu Ser Vai Thr Pro Gly 15 His Ser Ile Ser Asn Phe 30

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr 15 10

Asp Arg Vai Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser 20 25 118 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Leu His Trp Tyr Pro Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Vai Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ile Trp Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 54 <211> 111 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 54

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Thr Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Ser Vai Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Vai Glu Ser Gly Vai Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Vai Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg 85 90 95 Lys Vai Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 55 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 55 cagatccagt tggagcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctggtta tattttcaga gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agacgggtga gccaacatat gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtac tagcctttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 333

<210> 56 <211> 372 <212> ADN <213> Mus musculus 119 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <4Ο Ο> 56 atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttatggta tgggtgtagg ttggattcgt 120 gccaacattt ggtggcatga tgataagtac 180 atctccaagg atatctccaa caaccaggta 240 gatactgcca catactactg tgctcaaata 300 tttgctttct ggggccaagg gactctggtc 360 372 ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca .120 cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 tctgccgtct attactgtac aagattctac 300 gtcactgtct ctgca 345 ctggtgcagc ctgaagggtc attgaaactc 60 atcaatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ataagaagtg aaagtaataa ttatgcaaca 180 accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240 gaggacacag ccatatatta ctgtgtgaga 300 caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 caggtcactc tgaaagagtc tggccctggg àcttgttctt tctctgggtt ttcactgagc cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg tataactcag ccctgaagag ccggctcaca ttcctcaaga tctccagtgt ggacactgca gcccctcgat ataataagta cgaaggcttt actgtctctg ca <210> 57 <211> 345

<212> ADN <213> Mus musculus <400> 57 caggttcaac tgcagcagtò tggggctgag tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact cctgtgcatg gcctaaaatg gattggagct agtcagaagt tcaagggcaa ggccacactg atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tcctatactt actggggcca agggactctg <210> 58 <211> 357

< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 58 gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga tcatgtgcag cttctggatt cagcttcaat ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc tattatggcg attcagtgaa agacaggttc ctctatctac aaatgaacaa cttgaaaact gaggtaacta catcgtttgc ttattggggc <210> 59 <211> 369

< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 59 gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat gccagtgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaata 180 tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240 ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga 300 120 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ gatccgggct actatggtaa cccctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369

<210> 60 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60

Gin Ile Gin Leu Glu Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Arg Asp Tyr 20 25 30

Ser Met His Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 100 105 110 <210> 61 < 211> 124

< 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 61

Gin Vai Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin Pro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Met Gly Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp His Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu rhr Ile Ser Lys Asp Ile Ser Asn Asn Gin Vai 65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ser Ser Vai Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Gin Ile Ala Pro Arg Tyr Asn Lys Tyr Glu Gly Phe Phe Ala 100 105 110

Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 121 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 62 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Glu Met His Trp Vai Lys Gin Thr Pro Vai His Gly Leu Lys Trp Ile 35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ala 115

<210> 63 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Glu Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ile Asn 20 25 30

Ala Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Glu Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp 50 55 60

Ser Vai Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Asn Met 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95

Tyr Cys Vai Arg Glu Vai Thr Thr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 HO

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115

<210> 64 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus 122

ΕΡ 1 674 111/PT < 4 Ο Ο > 64

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Lys Gly 1 . 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Ser 20 25 30

Ala Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60

Ser Vai Lys Asp Airg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95

Tyr Cys Vai Arg Asp Pro Gly Tyr Tyr Gly Asn Pro Trp Phe Ala Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr Vai Ser Ala 115 120

<210> 65 <211> 336 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 65 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta cccttggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacatt tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tagactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct gccaaggtac acattttcct 300 cggacgttcg gtggaggcac caggctggaa atcaaa 336

<210> 66 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 66 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 123 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 67 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 67 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt cctacgttcg gatcggggac caagctggaa <210> 68 <211> 336 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 68 gatattgtga tgactcagtc tgcaccctct atctcctgca agtctagtaa gagtctcctg ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt ttcacgttcg gcacggggac aaaattggaa <210> 69 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 69 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa <210> 70 <211> 318 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 70 caaattgttc teacccagtc tccagcaatc atgacctgca gtgccagctc aagtgttagt tcctccccca gactcctgat ttatgacaca ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc tatttctgct ctcaaaatac acatgttcct ataaaa 336 60 120 180 240 300 gtácctgtca ctcctggaga gtcagtatcc catagtaatg gcaacactta cttgaattgg ctcctgattt attggatgtc caaccttgcc gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc tattactgta tgcaacatat agaataccct ataaaa 336 60 120 180 240 300 aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc catagttatg acatcactta tttgtattgg ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc tattactgtg ctcaàaatct agaacttcct atcaaa 336 60 120 180 240 300 atgtctgcat ttccagggga gaaggtcacc tacatgtact ggtaccagca gaagtcagga tccaacctgg cttctggàgt ccctgttcgc 60 120 180 124

ΕΡ 1 674 111/PT 240 300 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttacc cgctcacgtt cggtggtggg accgagctgg agctgaaa 318

<210> 71 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 71

Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Vai Thr Leu Gly 10 15 Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 25 30 Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 40 45 Tyr Leu Vai Ser Arg Leu Asp Ser Gly Vai Pro 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80 Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Cys Gin Gly 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 105 110

Asp Vai Vai Met Thr 1 5

Gin Pro Ala Ser Ile 20

Asp Gly Lys Thr Phe 35

Pro Lys Arg Leu Ile 50

Asp Arg Phe Thr Gly 65 70

Ser Arg Vai Glu Ala 85

Thr His Phe Pro Arg 100 <210> 72 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72

Asp Vai Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75' 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 125 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 73 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73

Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp < Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser . Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr 1 His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 : 210 > 74 :211> 112 :212> PRT :213> Mus musculus A O O 74 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Ala Pro Ser vai Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus 126 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 75

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly 1 5. 10 . ' 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Hls Ser 20 25 30 Tyr Asp Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100. 105 110

<210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76

Gin lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Vai Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 77 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 77 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 127 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 78 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 78 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 79 <211> 345

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 79 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300. tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 80 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 80 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgac atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 128 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 81 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano < 4 0 0 > 81 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 82 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 82 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 83 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 83 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgac atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 84 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial 129 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Cadeia Η de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 84

Gin val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115

<210> 85 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 85

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser'Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Glu Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110 130 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Vai Ser Ser 115

<210> 86 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> de anticorpo quimérico ratinho-humano

<223> Cadeia H

Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 30 Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 40 45 Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 55 60 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 105 110 <400> 86 Gin Vai Gin Leu 1 5

Ser Vai Lys Vai 20

Glu Met His Trp 35

Gly Ala Leu Asp 50

Lys Gly Arg Vai 65

Met Glu Leu Ser 85

Thr Arg Phe Tyr 100

Vai Ser Ser 115 <210> 87 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 87

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Glu Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 131 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115

<210> 88 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 88

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu ASP Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Mét Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110 Vál Ser Ser 115.

<210> 89 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 89

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 45 40

Glu Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 132

ΕΡ 1 674 111/PT

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 . 60 Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115

<210> 90 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência Artificial . <220> <223> Cadeia H de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 90

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met HlS Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115

<210> 91 <211> 336 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia L de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 91 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 133 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ tacctgcaga agccagggca gtctccacag tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt cctacgtttg gccaggggac caagctggag

<210> 92 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> <400> 92

Asp Vai Vai Met 1 5

Glu Pro Ala Ser 20

Asn Gly Asn Thr 35

Pro Gin Leu Leu 50

Asp Arg Phe Ser 65

Ser Arg Vai Glu 85

Thr His Vai Pro 100 ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc tattactgct ctcaaaatac acatgttcct atcaaa 336 quimérico ratinho-humano 180 240 300

Cadeia L de anticorpo Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 10 15 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45 Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 70 75 80 Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 90 95 Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110

<210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93

Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser 15 10 <210> 94 <211> 8 <212> PRT < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 94 Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro 1 5 < 210 > 95 < 211 > 8 < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens 134 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <4Ο Ο> 95

Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96

Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Homo <400> 97 sapiens

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr 1 5 LO <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Homo <400> 98 sapiens

Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His 15 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99

Asp Asn Glu lie Ser Thr Phe His Asn Leu 15 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 100

Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn 1 5 10 <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens 135 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 101

Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe 1 5 10 15

His Asn Leu Gly Asn Vai His Ser Pro Leu Lys 20 25

<210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 102

Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Vai His Ser Pro Leu Lys 15 10

<210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103

Asn Tyr Ala Met Ser 1 5

<210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 104

Ala Ile Asn Asn Asn Gly Asp Asp Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Vai Lys 15 10 15

Asp

<210> 105 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 105

Gin Gly Gly Ala Tyr 1 5

<210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 106

Thr Tyr Gly Met Gly Vai Gly 5 1 136 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 107

Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Ala Lys Tyr Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 108

Met Gly Leu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5

<210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 109

Ile Tyr Gly Met Gly Vai Gly 1 5

<210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 110

Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15

<210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111

Ile Gly Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 112

Gly Tyr Trp Met His 1 5 137 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 210 > 113 <211> 17

< 212 > PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 113

Ala He Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 114

Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Leu Ala Tyr 15 10

<210> 115 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 115

Ser Tyr Ala Met Ser 1 5

<210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 116

Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Lys 15 10 15

Asp

<210> 117 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 117

His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr 15 10

<210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 118

Ser Tyr Trp Met His 1 5 138 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

<210 > 119 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 119

Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gin Lys Phe Arg 15 10 15

Gly

<210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120

Ser Asn Leu Gly Asp Gly His Tyr Arg Phe Pro Ala Phe Pro Tyr 1 5 10 15

<210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121

Thr Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Leu Gin Phe Lys 15 10 15

Asp

<210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 122

Gly Ala Phe Tyr Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Ala Trp Phe Ala Tyr 15 10 15 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 124 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus 139 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 124

Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 125

Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr 1 5

<210> 126 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 126

Ile Asn Ala Met Asn 1 5

<210> 127 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 127

Arg Ile Arg Ser Glu Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser 15 10 15

Vai Lys Asp

<210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 128

Glu Vai Thr Thr Ser Phe Ala Tyr 1 5

<210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 129

Ala Ser Ala Met Asn 1 5

<210> 130 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus 140 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 0 0 > 130

Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Vai Lys Asp ·

<210> 131 <211> 12 <212> PRT '<213> Mus musculus < 4 0 0 > 131

Asp Pro Gly Tyr Tyr Gly Asn Pro Trp Phe Ala Tyr 15 10

<210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 132

Asp Tyr Ser Met His ’ 1 5

<210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 133

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys' 15 10 15

Gly

<210> 134 <211> 2 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 134

Leu Tyr 1

<210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 135

Asn Ile Trp Trp His Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus 141 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <4Ο Ο> 136

Ile Ala Pro Arg Tyr Asn Lys Tyr Glu Gly Phe Phe Ala Phe

1 5 10 <210> <211> <212> 137 16 PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 137

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> <211> 138 7 <212> <213> PRT Mus musculus < 4 0 0 > 138

Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 139 9 PRT Mus musculus < 4 0 0 > 139

Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> 140 11 <212> <213> PRT Mus musculus < 4 0 0 > 140

Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 141 7 PRT Mus musculus < 4 0 0 > 141

Arg Ala Asn Arg Leu Vai Asp 1 5

<210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus 142 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <4Ο Ο> 142

Leu Gin Cys Asp Glu Phe Pro Pro Trp Thr 15 10

<210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 143

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Gly· Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15

<210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 144

Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 1 5

<210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 145

Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr 1 5

<210> 146 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 146

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 . 15

<210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 147

Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus 143 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 148

Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr 1 5

<210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 149

Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Lys Asn Ile Ile 1.5 10

<210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 150

Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro 1 5

<210> 151 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 151

Leu Gin Tyr Asp Asn Leu 1 5

<210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 152

Arg Ala Ser His Ser Ile Ser Asn Phe Leu His 15 10

<210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 153

Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser 1 5

<210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus 144 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 154

Gin Gin Ser Asn Ile Trp Ser Leu Thr 15

<210> 155 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 155

Arg Ala Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gin 15 10 15

<210> 156 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 156

Gly Ala Ser Asn Vai Glu Ser 1 5

<210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 157

Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Tyr Thr 1 5

<210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 158

Ser Gin Asn Thr His Vai Pro Pro Thr 15

<210> 159 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 159

Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 15 10 15

<210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus 145 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 160

Trp Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 161

Met Gin His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 162 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 162

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Tyr Asp Ile Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15

<210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 163

Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr 1 5

<210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 164

Ser Ala Ser Ser Ser. Vai Ser Tyr Met Tyr 15 10 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 165 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus 146 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 166

Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 167 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 167

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn 1 5 10 15

<210> 168 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 168

Leu Vai Ser Arg Leu Asp Ser 1 5

<210> 169 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 169

Cys Gin Gly Thr His Phe 1 5

<210> 170 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 170

Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15

<210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 171

Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Trp Thr 15

<210> 172 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> iniciador de PCR 147 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο> 172 cttgtacaca gtgacggaaa cacctat 27 <210> 173 <211> 27

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> iniciador de PCR < 4 0 0 > 173 ataggtgttt ccgtcactgt gtacaag 27

<210> 174 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 174

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

<210> 175 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 175

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Asp Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15

<210> 176 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 176

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Glu Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

<210> 177 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante 148 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 177

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

<210> 178 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 178

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn His Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

<210> 179 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 179

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Asn Asn Thr Tyr Leu His 1.5 10 15

<210> 180 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 180

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

<210> 181 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 181

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Gin Asn Thr Tyr Leu His 1 5 . 10 15

<210> 182 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial 149 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 182

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Gly Ile Asn Thr Tyr Leu 1 5 10 15

His

<210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 183

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15

<210> 184 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 184

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15 <210> 185 <211> 16 <212> PRT < 213 > Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 185

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Ser Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15

<210> 186 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 186

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Trp Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 150 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <210> 187 <211> 16

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 187

Arg ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Tyr Asn Thr Tyr Leu His 1 5 .10 15

<210> 188 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 188

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15

<210> 189 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 189

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Vai Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15

< 210 > 190 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 190

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser Asn Pro Asn Thr Tyr Leu His l 5 10 15 <210> 191 <211> 112

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante 151 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 191

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 GlU Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val HiS Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 < 210 > 192 <211> 112 < 212 > PRT < 213 > Sequência Artificial < 2 2 0 > < 2 2 3 > cadeia L de anticorpo < 4 0 0 > 192

Asp val Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Asp Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 . 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 193 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante 152 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ

Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 10 15 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45 Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 70 75 80 Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 90 95 Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 lio <400> 193 Asp vai Vai Met 1 5

Glu Pro Ala Ser 20

Asn Glu Asn Thr 35

Pro Gin Leu Leu 50

Asp Arg Pbe Ser 65

Ser Arg Vai Glu 85

Thr His Vai Pro 100

<210> 194 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 194

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30

Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 195 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante 153 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 195

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn His Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 196 <211> 112

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 196

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu ser Leu Pro Vai Thr Pro Giy 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Gys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30

Asn Asn Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

< 210 > 197 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante 154 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 197

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Thr Asn Thr Tyr Leu HiS Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 < 210 > 198 <211> 112 <212> PRT < 213 > Sequência Artificial <220> < 2 2 3 > cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 198 Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gin Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 199 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> cadeia L de anticorpo mutante 155 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 199 ASp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn Ile Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 200 <211> 112

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 200

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 201 <211> 112 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante 156 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 201

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 202 <211> 112

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante <400> 202

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn Ser Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thi Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 203 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante 157 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 203

Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 30 Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45 Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 60 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 80 Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 95 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu 15 10

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 20 25

Asn Trp Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr 35 40

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser 50 55

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70 75

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly 85 90

Gin Gly Thr 100 105 <210> 204 <211> 112 <212> PRT < 213 > Sequência Artificial < 2 2 0 > < 2 2 3 > cadeia L de anticorpo < 4 0 0 > 204

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vál His Ser 20 25 30

Asn Tyr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 205 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> cadeia L de anticorpo mutante 158 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ <400> 205

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai HiS Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Tzp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 206 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência i Artificial <220> <223> cadeia L de anticorpo mutante < 4 0 0 > 206 Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai His Ser 20 25 30 Asn Vai Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr His Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 207 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia L de anticorpo mutante 159 ΕΡ 1 674 111/ΡΤ < 4 Ο Ο > 207

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Pro Asn Thr Tyr Leu Hls Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95 Thr Hls Vai Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Léu Glu Ile Lys 100 105 1L0

Lisboa, 2010-12-09

Claims

ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo capaz de se ligar a glipicano 3, em que o anticorpo é: (a) um anticorpo que compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada possuindo CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 123, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:124, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:125; e (ii) uma região variável da cadeia leve possuindo CDRl compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 143, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:144, e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:158; (b) um anticorpo que compreende (i) e que pode inibir competitivamente a ligação glipicano 3; do anticorpo de (a) a (c) um anticorpo que compreende (íí: ) e que pode inibir competitivamente a ligação glipicano 3; do anticorpo de (a) a (d) um anticorpo possuindo a mesma actividade de ligação ao glipicano 3 que o anticorpo de qualquer um de (a) a (c), em que um resíduo de aminoácido está substituído, eliminado ou adicionado e/ou inserido relativamente às sequências de aminoácidos estabelecidas em (a); (e) um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo ao qual o anticorpo de (a) é capaz de se ligar, em que o referido anticorpo de (a) compreende ambas as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve especificadas em (a); ou (f) um anticorpo capaz de se ligar a um péptido consistindo na sequência dos resíduos de aminoácido 546-551 de glipicano 3.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 seleccionado entre: ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 2/7 (1) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:84 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (2) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:85 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (3) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:86 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (4) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:87 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (5) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:88 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; (6) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:89 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92; ou (7) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:92.
3. Anticorpo da reivindicação l(f), em que o anticorpo se liga ao péptido separado por SDS-PAGE sob condições redutoras é analisado por Western blotting. ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 3/7
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 seleccionado entre: (1) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ id NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ id NO:174, 144 e 158, respectivamente; (2) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:175, 144 e 158, respectivamente; (3) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:176, 144 e 158, respectivamente; (4) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:177, 144 e 158, respectivamente; (5) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:178, 144 e 158, respectivamente; (6) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 4/7 respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 179, 144 e 158, respectivamente; (7) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 180, 144 e 158, respectivamente; (8) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:181, 144 e 158, respectivamente; (9) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:182, 144 e 158, respectivamente; (10) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 183, 144 e 158, respectivamente; (11) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 184, 144 e 158, respectivamente; ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 5/7 (12) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:185, 144, e 158, respectivamente; (13) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:186, 144 e 158, respectivamente; (14) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:187, 144 e 158, respectivamente; ou (15) um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve possuindo CDR 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 188, 144 e 158, respectivamente.
5. Anticorpo de acordo com reivindicação 1 possuindo uma região variável da cadeia leve seleccionada entre: (1) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:191; (2) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:192; (3) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:193; (4) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:194; ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 6/7 (5) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:195; (6) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:196; (7) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:197; (8) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:198; (9) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:199; (10) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:200; (11) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:201; (12) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:202; (13) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:203; (14) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:204; ou (15) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:205; e uma região variável da cadeia pesada seleccionada entre: (1) uma região variável da sequência de aminoácidos (2) uma região variável da sequência de aminoácidos (3) uma região variável da sequência de aminoácidos (4) uma região variável da sequência de aminoácidos (5) uma região variável da sequência de aminoácidos (6) uma região variável da sequência de aminoácidos cadeia pesada compreendendo a estabelecida em SEQ ID NO:84; cadeia pesada compreendendo; a estabelecida em SEQ ID NO:85; cadeia pesada compreendendo a estabelecida em SEQ ID NO:86; cadeia pesada compreendendo a estabelecida em SEQ ID NO:87; cadeia pesada compreendendo a estabelecida em SEQ ID NO:88; cadeia pesada compreendendo a estabelecida em SEQ ID NO:89; ou ΕΡ 1 674 111/ΡΤ 7/7 (7) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:90.
6. Anticorpo das reivindicações 1 ou 4 que é um anticorpo humanizado.
7. Polinucleótido que codifica para uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável da cadeia leve do anticorpo reivindicado nas reivindicações 2, 5 ou 6.
8. Polinucleótido como reivindicado na reivindicação 7 possuindo qualquer uma das sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 57, 67, 77-83 ou 91.
9. Vector compreendendo um polinucleótido como reivindicado na reivindicação 7 ou 8.
10. Célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 9.
11. Método para produção de um anticorpo compreendendo: (a) a cultura da célula hospedeira como reivindicada na reivindicação 10, (b) o isolamento de um anticorpo a partir da cultura de (a), e (c) a purificação do seu anticorpo.
12. Inibidor do crescimento celular compreendendo como ingrediente activo o anticorpo reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-6.
13. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-6 para utilização no tratamento do cancro.
14. Anticorpo da reivindicação 13 para utilização no tratamento de hepatoma.
15. Péptido consistindo na sequência de aminoácidos dos residuos de aminoácido 546-551 de glipicano 3. Lisboa, 2010-12-09