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KR101300545B1 - 항 글리피칸 3 항체 - Google Patents

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KR101300545B1
KR101300545B1 KR1020067004261A KR20067004261A KR101300545B1 KR 101300545 B1 KR101300545 B1 KR 101300545B1 KR 1020067004261 A KR1020067004261 A KR 1020067004261A KR 20067004261 A KR20067004261 A KR 20067004261A KR 101300545 B1 KR101300545 B1 KR 101300545B1
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타케시 요시노
준이치 네주
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토모유키 이가와
히로코 코니시
메구미 타나카
이즈미 스고
시게토 카와이
타카히로 이시구로
야스코 키노시타
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츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

글리피칸 3의 특정 영역에 결합할 수 있는 항체, 및, 전기 항체를 기초로 제조된 인간화 항체가 제공된다. 본 발명의 항 GPC3 항체는 종래의 항체와 비교해서 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지고 있으며, 세포증식억제제, 항암제 및 암 진단시약으로서 유용하다.
글리피칸 3, ADCC 활성, CDC 활성, 중쇄가변영역, 경쇄가변영역

Description

항 글리피칸 3 항체{Anti-Glypican 3 Antibody}
본 발명은 항 글리피칸 3 항체 및 전기 항체를 유효성분으로 하는 세포증식억제제 및 항암제에 관한 것이다.
글리피칸 3(GPC3)은 세포 표면에 존재하는 헤파란황산염 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan) 패밀리 중 하나로서, 발생에 있어서 세포분열이나 암세포의 증식에 관여할 가능성이 있음이 시사되고 있으나, 그 기능은 아직 잘 해명되지 않고 있다.
GPC3에 결합하는 어느 종(種)의 항체가 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, 항체의존성 세포장해) 활성 및 CDC(complement-dependent cytotoxicity, 보족체의존성 세포장해) 활성에 의해 세포증식억제작용을 가짐을 알아내었다(참조: WO03/000883). 또한, GPC3이 생체내에서 절단되고 분비형 GPC3으로 혈중에 분비되며, 이것을 검출할 수 있는 항체를 이용하여 암의 진단이 가능함이 시사되고 있다(참조: WO04/022739, WO03/100429, WO04/018667).
항체의 세포독성(cytotoxicity activity)을 이용하여 항암제를 개발하는 경 우, 이용되는 항체는 높은 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 가지고 있는 것이 바람직하므로, GPC3을 인식하는 항체로 높은 세포독성을 가지는 항 GPC3 항체가 바람직하다.
본 발명은 종래의 항체와 비교해서 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지는 항 GPC3 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 CHO 세포, 전장 GPC3 발현 CHO 세포, HepG2, HuH-7에 대한 항 GPC3 항체의 결합활성을 플로우사이토메트리(flow cytometry)에 의하여 평가한 그래프이다. M1E7(실선), M11F1(점선)은 각각 5μg/mL 농도로 사용하였다.
도 2는 경합 ELISA(competitive ELISA)에 의한 에피토프 분류의 결과를 나타낸 표이다. 비오틴화한(biotinylated) 항 GPC3 항체의 결합에 대한 경합적인 저해(competitive inhibition)의 정도를 %로 표시하고, 경합적 저해의 패턴에 따라 a 내지 e까지의 5 그룹으로 분류하였다.
도 3은 항 GPC3 항체가 가용형 GPC3 코어단백질 40kDa의 N말단 단편에 결합하는지, 또는 30kDa의 C말단 단편에 결합하는지를 웨스턴 블럿팅에 의하여 평가한 결과를나타낸 사진이다. L9G11은 N말단 단편에 결합하고, M3C11은 C말단 단편에 결합하는 것을 알 수 있다.
도 4는 HepG2의 배양상등액(culture supernatant) 안에 분비형 GPC3이 존재함을 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)로 검출한 결과를 나타낸다. M6B1, M18D4, M19B11 등의 N말단 단편에 결합하는 항체의 재조합으로 고도(高度)로 검출되고, M3C11, M13B3, M3B8 등의 C말단 단편에 결합하는 항체에서는 강하게는 검출되지 않았다.
도 5는 항 GPC3 항체를 이용하여 HepG2의 배양상등액의 면역침강(immunoprecipitation)을 행하고, 분비형 GPC3을 검출한 결과를 나타내는 사진이다. 대조군으로서 배지(레인 1과 3) 또는 HepG2의 배양상등액(레인 2와 4)을 M1E7(레인 1과 2), M10D2(레인 3과 4)를 이용하여 면역침강을 행하였다. N말단 단편에 결합하는 M10D2에 의하여 분비형 GPC3이 검출되었다.
도 6은 GPC3의 C말단 펩티드와 GST의 융합단백질을 이용하여 GPC3의 C말단 단편에 결합하는 항체의 에피토프를 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 가용형 GPC3 코어단백질(레인 1), GST(레인 2), GC-1(레인 3), GC-2(레인 4), GC-3(레인 5), GC-4(레인 6), GC-5(레인 7)를 환원조건하에서 SDS 전기영동한 후, M3C11, M11F1을 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 검출하였다.
도 7은 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체(anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody)의 GPC3 발현 CHO 세포에 대한 CDC 활성을 평가한 그래프이다.
도 8은 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체의 GPC3 발현 CHO 세포 및 HepG2에 대한 ADCC 활성을 평가한 그래프이다.
도 9는 마우스 골수유래 효과기 세포(effector cell)를 이용하여 GC33의 사람 간암세포주 HuH-7에 대한 ADCC 활성을 평가한 그래프이다.
도 10은 GC33 항체의 사람 간암이식 마우스 모델(mouse model transplanted with human hepatoma)에 대한 항종양 활성을 평가한 그래프이다.
도 11은 GC33의 마우스-사람 키메라항체의 GPC3 발현 CHO 세포에 대한 CDC 활성을 평가한 그래프이다.
도 12는 GC33의 마우스-사람 키메라항체의 HepG2에 대한 ADCC 활성을 평가한 그래프이다.
도 13은 GC33의 에피토프 해석용으로 제작한 GST 융합단백질(GC-4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14)에 포함되는 GPC3 유래서열을 나타낸 그림이다.
도 14는 GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14를 환원조건하에서 SDS-PAGE에 따라 분리한 다음, GC33을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 15는 인간화 GC33의 GPC3에 대한 결합활성을 ELISA에 의하여 평가한 그래프이다.
도 16은 가용형 GPC3 면역마우스유래클론에 대하여, 아이소타입(isotype), ELISA, BIAcore, FACS, 에피토프 해석, 면역침강실험의 결과를 통합한 항체패널(antibody panel)이다.
도 17은 GC-3 면역마우스유래클론에 대하여, 아이소타입, ELISA, FACS, 에피토프 해석의 결과를 통합한 항체패널이다.
도 18은 인간화 GC33 L사슬 가변영역 CDR 1에 위치하는 Gly34를 Cys, Met을 제외한 다른 17 아미노산으로 치환한 개변형 항체의 가용형 GPC3 코어단백질에 대한 결합활성을 ELISA에 의하여 평가한 그래프이다.
도 19는 GC33, M3C11, 및 M1E7 마우스-사람 키메라항체의 전장 GPC3 발현 CHO 세포에 대한 CDC 활성을 평가한 그래프이다.
도 20은 GC33, M3C11 및 M1E7 마우스-사람 키메라항체의 전장 GPC3 발현 사람 간암세포주 SK-03에 대한 ADCC 활성을 평가한 그래프이다.
발명의 개시
본 발명자들은 종래의 항 글리피칸 3 항체와 비교해서 높은 세포독성을 가지는 항체를 얻는데 성공하였다. 또한, 이들 항체의 에피토프(epitope)를 해석하여높은 세포독성을 발휘하는 항체가 인식되는 GPC3의 부위를 발견하는데 성공하였다.
본 발명은 이하 (1) 내지 (12) 중 어느 하나를 가지는 중쇄가변영역(heavy chain variable region)을 포함하는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 123에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 124에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(2) 서열번호 109에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 110에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 111에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(3) 서열번호 106에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 107에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 108에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(4) 서열번호 132에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 133에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(5) 서열번호 106에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 136에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(6) 서열번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 127에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 128에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(7) 서열번호 129에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 130에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 131에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(8) 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 105에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(9) 서열번호 118에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 121에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 122에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(10) 서열번호 115에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 116에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 117에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(11) 서열번호 112에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 113에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 114에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3; 또는,
(12) 서열번호 118에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 119에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 120에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3.
다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (13) 중 어느 하나를 가지는 경쇄가변영역(light chain variable region)을 포함하는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 143에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(2) 서열번호 143에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 145에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(3) 서열번호 140에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 142에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(4) 서열번호 167에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 168에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 169 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(5) 서열번호 170에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 171에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(6) 서열번호 159에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 160에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 161에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(7) 서열번호 162에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 147에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 163에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(8) 서열번호 164에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 165에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 166에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(9) 서열번호 137에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 138에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(10) 서열번호 155에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 156에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 157에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(11) 서열번호 149에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 150에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(12) 서열번호 146에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 147에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 148에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3; 또는,
(13) 서열번호 152에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 154에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 이하 (1) 내지 (13)으로 구성된 군(群)으로부터 선택된다:
(1) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 143, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 각각의 서열번호 109, 110 및 111에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 143, 144 및 145에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 각각의 서열번호 106, 107 및 108에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 140, 141 및 142에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 각각의 서열번호 132, 133 및 134에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 167, 168 및 169에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 각각의 서열번호 106, 135 및 136에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 170, 144 및 171에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 각각의 서열번호 126, 127 및 128에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 159, 160 및 161에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(7) 각각의 서열번호 129, 130 및 131에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 162, 147 및 163에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(8) 각각의 서열번호 129, 130 및 131에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 164, 165 및 166에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(9) 각각의 서열번호 103, 104 및 105에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 137, 138 및 139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(10) 각각의 서열번호 118, 121 및 122에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 155, 156 및 157에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(11) 각각의 서열번호 115, 116 및 117에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 149, 150 및 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(12) 각각의 서열번호 112, 113 및 114에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 146, 147 및 148에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
(13) 각각의 서열번호 118, 119 및 120에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 152, 153 및 154에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
또 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 중쇄가변영역을 가지는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 또는,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역.
또한, 본 발명은 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 이하 (1) 내지 (7)의 항체로 구성된 군(群)으로부터 선택된다:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
또 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (15) 중 어느 하나를 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 174에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(2) 서열번호 175에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(3) 서열번호 176에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(4) 서열번호 177에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(5) 서열번호 178에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(6) 서열번호 179에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(7) 서열번호 180에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(8) 서열번호 181에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(9) 서열번호 182에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(10) 서열번호 183에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(11) 서열번호 184에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(12) 서열번호 185에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(13) 서열번호 186에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3;
(14) 서열번호 187에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3; 또는,
(15) 서열번호 188에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 서열번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 2, 및 서열번호 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3.
또 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (15)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 항체를 제공한다:
(1) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 174, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 175, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 176, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 177, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 178, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 179, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(7) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 180, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(8) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 181, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(9) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 182, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(10) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 183, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(11) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 184, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(12) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 185, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(13) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 186, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(14) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 187, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
(15) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 188, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
또한, 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (15)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 경쇄가변영역을 가지는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 191에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(2) 서열번호 192에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(3) 서열번호 193에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(4) 서열번호 194에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(5) 서열번호 195에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(6) 서열번호 196에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(7) 서열번호 197에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(8) 서열번호 198에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(9) 서열번호 199에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(10) 서열번호 200에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(11) 서열번호 201에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(12) 서열번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(13) 서열번호 203에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(14) 서열번호 204에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및,
(15) 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
또 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 이하 (1) 내지 (15)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 경쇄가변영역:
(1) 서열번호 191에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(2) 서열번호 192에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(3) 서열번호 193에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(4) 서열번호 194에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(5) 서열번호 195에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(6) 서열번호 196에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(7) 서열번호 197에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(8) 서열번호 198에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(9) 서열번호 199에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(10) 서열번호 200에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(11) 서열번호 201에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(12) 서열번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(13) 서열번호 203에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(14) 서열번호 204에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및,
(15) 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역과,
이하 (1) 내지 (7)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 중쇄가변영역을 가지는 항체를 제공한다:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역.
본 발명의 바람직한 항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역, 및 이들의 CDR 1, 2 및 3의 아미노산 서열과 서열번호와의 대응을 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure 112006014937082-pct00001
Figure 112006014937082-pct00002
Figure 112006014937082-pct00003
또한, 상술한 어느 하나의 항체의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되고, 그 항체와 동등한 활성을 가지는 항체도 본 발명의 범위내에 포함된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 즉, 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 글리피칸 3에 결합하는 인간화 항체를 제공한다.
게다가, 본 발명은 글리피칸 3의 아미노산 잔기 524 내지 563의 서열을 가지는 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 글리피칸 3의 아미노산 잔기 537 내지 563의 서열을 가지는 펩티드에 결합한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 글리피칸 3의 아미노산 잔기 550 내지 563의 서열로 구성되는 펩티드에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 글리피칸 3의 아미노산 잔기 544 내지 553의 서열을 가지는 펩티드에 결합하고, 보다 바람직하게는, 글리피칸 3의 아미노산 잔기 546 내지 551의 서열을 가지는 펩티드에 결합한다.
또 다른 관점에 있어서는, 본 발명은 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 143, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체가 결합할 수 있는 에피토프(epitope)에 결합가능한 항체, 즉, 항원과의 결합에서 경합하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 글리피칸 3에 결합하고, 글리피칸 3을 발현시키는 세포에 대하여 높은 CDC 활성을 가지는 항체, 및, 글리피칸 3에 결합하고, 글리피칸 3을 발현시키는 세포에 대하여 높은 ADCC 활성을 가지는 항체를 제공한다.
게다가, 본 발명은 상술한 어느 하나의 항체의 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 11 내지 21, 33 내지 43, 55 내지 59, 65 내지 70, 77 내지 83 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 가진다.
다른 관점에 있어서는, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 유효성분으로 하는 세포증식억제제 및 항암제를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항암제는 간세포암을 치료하기 위하여 이용된다.
또한, 글리피칸 3의 아미노산 잔기 524 내지 563의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 글리피칸 3의 아미노산 잔기 537 내지 563의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 글리피칸 3의 아미노산 잔기 544 내지 553의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 또는 글리피칸 3의 아미노산 잔기 546 내지 551의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드를 제공한다.
발명의 상세한 설명
항체
본 발명은 하기 (I) 내지 (XI)에 기재된 항체를 제공한다.
(I) 이하 (1) 내지 (12) 중 어느 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역을 포함하는 항체:
(1) 서열번호 123, 124 및 125(GC33);
(2) 서열번호 109, 110 및 111(M11F1);
(3) 서열번호 106, 107 및 108(M3B8);
(4) 서열번호 132, 133 및 134(GC199);
(5) 서열번호 106, 135 및 136(GC202);
(6) 서열번호 126, 127 및 128(GC179);
(7) 서열번호 129, 130 및 131(GC194);
(8) 서열번호 103, 104 및 105(M13B3);
(9) 서열번호 118, 121 및 122(L9G11);
(10) 서열번호 115, 116 및 117(M6B1);
(11) 서열번호 112, 113 및 114(M5B9); 및,
(12) 서열번호 118, 119 및 120(M10D2).
상기 (1) 내지 (12)의 항체 중에서 바람직한 것은 (1) 내지 (8)의 항체이고, 더 바람직한 것은 (1) 내지 (5)의 항체이며, 특히 더 바람직한 항체는 (1)의 항체이다. 상기 (1) 내지 (8)의 항체는 글리피칸 3의 C말단측 펩티드(글리피칸 3의 374번째의 아미노산 내지 580번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 치료용 항체로서 유용하다. 또한, 상기 (9) 내지 (12)의 항체는 글리피칸 3의 N말단측 펩티드(글리피칸 3의 1번째의 아미노산 내지 373번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 진단용 항체로서 유용하다.
(II) 이하 (1) 내지 (13) 중 어느 하나의 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체:
(1) 서열번호 143, 144 및 158(GC33)
(2) 서열번호 143, 144 및 145(M11F1);
(3) 서열번호 140, 141 및 142(M3B8);
(4) 서열번호 167, 168 및 169(GC199);
(5) 서열번호 170, 144 및 171(GC202);
(6) 서열번호 159, 160 및 161(GC179);
(7) 서열번호 162, 147 및 163(GC194(1));
(8) 서열번호 164, 165 및 166(GC194(2));
(9) 서열번호 137, 138 및 139(M13B3);
(10) 서열번호 155, 156 및 157(L9G11);
(11) 서열번호 149, 150 및 151(M6B1);
(12) 서열번호 146, 147 및 148(M5B9); 및,
(13) 서열번호 152, 153 및 154(M10D2).
상기 (1) 내지 (13)의 항체 중에서 바람직한 것은 (1) 내지 (8)의 항체이고, 더 바람직한 것은 (1) 내지 (5)의 항체이며, 특히 더 바람직한 항체는 (1)의 항체이다. 상기 (1) 내지 (8)의 항체는 글리피칸 3의 C말단측 펩티드(글리피칸 3의 374번째의 아미노산 내지 580번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 치료용 항체로서 유용하다. 또한, 상기 (9) 내지 (13)의 항체는 글리피칸 3의 N말단측 펩티드(글리피칸 3의 1번째의 아미노산 내지 373번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 진단용 항체로서 유용하다.
(III) 이하 (1) 내지 (13)의 항체로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 항체:
(1) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 143, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC33);
(2) 서열번호 109, 110 및 111에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 143, 144 및 145에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M11F1);
(3) 서열번호 106, 107 및 108에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 140, 141 및 142에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M3B8);
(4) 서열번호 132, 133 및 134에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 167, 168 및 169에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC199);
(5) 서열번호 106, 135 및 136에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 170, 144 및 171에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC202);
(6) 서열번호 126, 127 및 128에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 159, 160 및 161에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC179);
(7) 서열번호 129, 130 및 131에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 162, 147 및 163에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC194(1));
(8) 서열번호 129, 130 및 131에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 164, 165 및 166에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC194(2));
(9) 서열번호 103, 104 및 105에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 137, 138 및 139에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M13B3);
(10) 서열번호 118, 121 및 122에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 155, 156 및 157에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(L9G11);
(11) 서열번호 115, 116 및 117에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 149, 150 및 151에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M6B1);
(12) 서열번호 112, 113 및 114에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 146, 147 및 148에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M5B9); 및,
(13) 서열번호 118, 119 및 120에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 152, 153 및 154에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M10D2).
상기 (1) 내지 (13)의 항체 중에서 바람직한 것은 (1) 내지 (8)의 항체이고, 더 바람직한 것은 (1) 내지 (5)의 항체이며, 특히 더 바람직한 항체는 (1)의 항체이다. 상기 (1) 내지 (8)의 항체는 글리피칸 3의 C말단측 펩티드(글리피칸 3의 374번째의 아미노산 내지 580번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 치료용 항체로서 유용하다. 또한, (9) 내지 (13)의 항체는 글리피칸 3의 N말단측 펩티드(글리피칸 3의 1번째의 아미노산 내지 373번째의 아미노산까지의 펩티드)를 인식하고, 진단용 항체로서 유용하다.
(IV) 이하 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 중쇄가변영역을 가지는 항체:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.a);
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.c);
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.f);
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.h);
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.i);
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.j); 및,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.k).
상기 (1) 내지 (7)의 항체 중에서 특히 바람직한 항체는 (2) 내지 (7)의 항체이다.
(V) 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 가지는 항체.
(VI) 이하 (1) 내지 (7)의 항체로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 항체:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.a) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체;
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.c) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체;
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.f) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체;
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.h) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체;
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.i) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체;
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.j) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체; 및,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(GC33 VH ver.k) 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(GC33 VL ver.a)을 포함하는 항체.
상기 (1) 내지 (7)의 항체 중에서 특히 바람직한 항체는 (2) 내지 (7)의 항체이다.
(VII) 이하 (1) 내지 (15) 중 어느 하나의 항체:
(1) 서열번호 174, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 서열번호 175, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 서열번호 176, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 서열번호 177, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 서열번호 178, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 서열번호 179, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(7) 서열번호 180, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(8) 서열번호 181, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(9) 서열번호 182, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(10) 서열번호 183, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(11) 서열번호 184, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(12) 서열번호 185, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(13) 서열번호 186, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(14) 서열번호 187, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
(15) 서열번호 188, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
상기 (1) 내지 (15)의 항체 중에서 바람직한 항체는 (15)의 항체이다.
(VIII) 이하 (1) 내지 (15) 중 어느 하나의 항체:
(1) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 174, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(2) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 175, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(3) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 176, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(4) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 177, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(5) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 178, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(6) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 179, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(7) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 180, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(8) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 181, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(9) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 182, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(10) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 183, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(11) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 184, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(12) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 185, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(13) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 186, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
(14) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 187, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
(15) 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 서열번호 188, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열로 구성된 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
상기 (1) 내지 (15)의 항체 중에서 바람직한 항체는 (15)의 항체이다.
(IX) 이하 (1) 내지 (15) 중 어느 하나의 항체:
(1) 서열번호 191에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(2) 서열번호 192에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(3) 서열번호 193에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(4) 서열번호 194에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(5) 서열번호 195에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(6) 서열번호 196에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(7) 서열번호 197에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(8) 서열번호 198에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(9) 서열번호 199에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(10) 서열번호 200에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(11) 서열번호 201에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(12) 서열번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(13) 서열번호 203에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체;
(14) 서열번호 204에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체; 및,
(15) 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 가지는 항체.
상기 (1) 내지 (15)의 항체 중에서 바람직한 항체는 (15)의 항체이다.
(X) 이하 (1) 내지 (15)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 경쇄가변영역:
(1) 서열번호 191에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(2) 서열번호 192에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(3) 서열번호 193에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(4) 서열번호 194에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(5) 서열번호 195에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(6) 서열번호 196에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(7) 서열번호 197에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(8) 서열번호 198에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(9) 서열번호 199에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(10) 서열번호 200에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(11) 서열번호 201에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(12) 서열번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(13) 서열번호 203에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(14) 서열번호 204에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및,
(15) 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역과,
이하 (1) 내지 (7)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 중쇄가변영역을 가지는 항체:
(1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역;
(6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및,
(7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역.
상기의 항체 중에서 바람직한 항체는 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 및 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 가지는 항체이다.
(XI) 상기 (I) 내지 (X) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되고, (I) 내지 (X) 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 가지는 항체.
본 발명에 있어서, (I) 내지 (X) 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성이라 함은 사람 글리피칸 3 항체와의 결합활성, 또는 사람 글리피칸 3을 발현시키는 세포(예를 들어, HepG2 또는 사람 글리피칸 3 발현 재조합 CHO 세포 등)에 대한 세포독성이 동등한 것을 의미한다.
인간화 항체
본 발명에 있어서 항체의 바람직한 태양의 하나의 예로서, 글리피칸 3에 결합하는 인간화 항체를 들 수 있다. 인간화 항체는 이미 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
인간화 항체는 재구성 사람 항체(reshaped human antibody)로도 칭하며, 이것은 사람 이외의 포유동물, 예를 들어, 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 사람 항체의 상보성 결정영역에 이식한 것이며, 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 공지되어 있다(참조: 유럽특허 출원공개 EP 125023호 공보 및 WO96/02576호 공보).
구체적으로는, 예를 들어, CDR이 마우스 항체유래인 경우에는 마우스 항체의 CDR과 사람 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 CDR 및 FR 양방의 말단영역에 중복되는 부분을 가지도록 제작한 수개(數個)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용하여 PCR법에 따라 합성한다(참조: WO98/13388호 공보에 기재된 방법).
CDR과 연결되는 사람 항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성되는 것이 선택된다. 필요시, 재구성 사람 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역에서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환하여도 무방하다(참조: Sato, K. et al.,「Cancer Res.」 (1993), 53, p851-p856).
키메라 항체 및 인간화 항체의 C 영역에는 사람 항체의 것이 사용되고, 예를 들어, H사슬에서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3 및 Cγ4를, L사슬에서는 Cκ 및 Cλ를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산 안정성을 개선하기 위하여 사람 항체 C 영역을 수식하여도 무방하다. 인간화인 경우에 이용되는 사람 항체는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등 모든 아이소타입의 사람 항체에서도 무방하지만, 본 발명에서는 IgG를 이용하는 것이 바람직하고, IgG1 또는 IgG3이 더 바람직하며, IgG1이 특히 더 바람직하다. IgG1은 높은 세포독성을 가지고 있다는 점에서 항체를 항암제로 이용하는 경우에 유효하다(참조: 「Chemical immunology」(1997), p65-p88).
게다가, 사람 항체를 제조한 후에 가변영역(variable region, 예를 들어, FR)이나 보존영역(constant region) 안의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여도 무방하다.
인간화 항체에 있어서 CDR의 유래는 특히 한정되지 않고, 어떠한 동물유래에서도 무방하다. 예를 들어, 마우스 항체, 래트(rat) 항체, 토끼 항체, 낙타 항체 등의 서열을 이용하는 것이 가능하지만, 바람직하게는 마우스 항체의 CDR 서열을 이용하는 것이다.
항체의 인간화에서 통상 유래된 항체의 효능(agonist) 활성을 유지한대로 인간화시키는 것은 곤란하지만, 본 발명에서는 유래된 마우스 항체와 동등한 효능 활성을 가지는 인간화 항체의 수득에 성공하였다. 인간화 항체는 사람 체내에서 항원성이 저하되고 있기 때문에, 치료목적 등으로 사람에게 투여하는 경우에 유용하다.
본 발명에서 인간화 항 글리피칸 3 항체의 바람직한 예로서는, 예를 들어, 서열번호 84(GC33 VH ver.a), 서열번호 85(GC33 VH ver.c), 서열번호 86(GC33 VH ver.f), 서열번호 87(GC33 VH ver.h), 서열번호 88(GC33 VH ver.i), 서열번호 89(GC33 VH ver.j) 또는 서열번호 90(GC33 VH ver.k)에 기재된 중쇄가변영역을 가지는 항체, 또는 서열번호 92(GC33 VL ver.a)에 기재된 경쇄가변영역을 가지는 항체를 들 수 있다. 특히 바람직한 예로서는, 서열번호 84(GC33 VH ver.a), 서열번호 85(GC33 VH ver.c), 서열번호 86(GC33 VH ver.f), 서열번호 87(GC33 VH ver.h), 서열번호 88(GC33 VH ver.i), 서열번호 89(GC33 VH ver.j) 또는 서열번호 90(GC33 VH ver.k)에 기재된 중쇄가변영역과 서열번호 92(GC33 VL ver.a)에 기재된 경쇄가변영역을 가지는 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항 글리피칸 3 항체의 바람직한 예로서는, 서열번호 90에 기재된 중쇄가변영역과 서열번호 205에 기재된 경쇄가변영역을 가지는 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 항체의 바람직한 태양의 하나로서, 이하 (1) 내지 (8) 중 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다:
(1) 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC33);
(2) 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 48에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M11F1);
(3) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 47에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(M3B8);
(4) 서열번호 60에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC199);
(5) 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 72에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC202);
(6) 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC179);
(7) 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC194(1)); 및,
(8) 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC194(2)). 더 바람직하게는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체이며, 특히 더 바람직하게는 (1)에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체이다.
상기 나열한 어느 하나의 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체는 특히 높은 세포독성을 가진다는 점에서 유용하다.
상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 항체는 사람 글리피칸 3의 524번째의 아미노산 내지 580번째의 아미노산까지의 영역에 결합하고, 특히 524번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역에 결합한다. 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체는 사람 글리피칸 3의 537번째의 아미노산 내지 563번째의 영역에 결합한다. 상기 (1)에 기재된 항체는 544번째의 아미노산 내지 553번째의 아미노산의 영역에 결합하고, 특히 546번째의 아미노산 내지 551번째의 영역에 결합한다.
상기 에피토프를 인식하는 항체는 높은 세포독성을 가지기 때문에, 암의 질환 등의 치료용으로서 유용하다. 특히, 546번째의 아미노산 내지 551번째의 영역에 결합하는 항체는 특히 세포독성이 높기 때문에 유용하다.
따라서, 본 발명은 사람 글리피칸 3의 524번째의 아미노산 내지 580번째의 아미노산까지의 영역, 바람직하게는 524번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역, 더 바람직하게는 537번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역, 더 바람직하게는 544번째의 아미노산 내지 553번째의 아미노산까지의 영역, 특히 더 바람직하게는 546번째의 아미노산 내지 551번째의 아미노산까지의 영역을 에피토프로 그들의 영역에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명에서 바람직한 다른 태양으로서는, 사람 글리피칸 3의 524번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역을 인식하고, 537번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역을 인식하지 않는 항체를 예로 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 바람직한 다른 태양으로서는, 사람 글리피칸 3의 537번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역을 인식하고, 550번째의 아미노산 내지 563번째의 아미노산까지의 영역을 인식하지 않는 항체를 예로 들 수 있다.
항체가 인식하는 에피토프의 해석은 당업자에게 공지된 방법에 따라 행할 수 있으며, 예를 들어, 실시예에 기재된 웨스턴 블럿팅방법 등에 의하여 행해질 수 있다.
상기 영역을 에피토프로 인식하는 항체는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수득될 수 있으며, 예를 들어, 사람 글리피칸 3의 아미노산 서열을 기초로 목적 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제조하고, 전기 펩티드를 면역원으로 항체를 제조함에 따라, 또는 통상의 방법으로 항체를 제작한 후, 수득된 항체가 인식하는 에피토프를 결정하고, 목적의 에피토프를 인식하는 항체를 선택함에 따라 수득될 수 있다.
본 발명의 항 글리피칸 3 항체의 바람직한 예로서는, 글리피칸 3을 발현시키는 세포에 대하여 높은 ADCC 활성을 가지는 항체 또는 높은 CDC 활성을 가지는 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 "높은 ADCC 활성(high ADCC activity)" 또는 "높은 CDC 활성(high CDC activity)"이라 함은 공지된 항 글리피칸 3 항체보다도 높은 ADCC 활성 또는 높은 CDC 활성을 가지는 것을 의미한다. 공지된 글리피칸 3 항체로서는, WO04/22739에 기재되어 있는 M3C11 또는 M1E07을 예로 들 수 있다.
ADCC 활성 또는 CDC 활성의 측정, 예를 들어, 크롬유리실험(chromium release test) 등 당업자에게 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. ADCC 활성을 측정할 경우의 크롬유리실험의 구체적인 조건으로는 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, 실시예에 기재된 조건을 이용하여 측정할 수 있다.
글리피칸 3을 발현시키는 세포로서는, 예를 들어, HepG2 등의 간암세포, 글리피칸 3을 암호화하는 유전자를 재조합한 CHO 세포 등을 들 수 있다. ADCC 활성을 측정할 경우에는 HepG2 세포를 이용하는 것이 바람직하고, CDC 활성을 측정할 경우에는 GPC3 발현 재조합 CHO 세포를 이용하는 것이 바람직하다. GPC3 발현 재조합 CHO 세포는 어떠한 방법에 따라 제조되어도 무방하지만, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
항 글리피칸 3 항체를 항암제로서 이용할 경우에는, 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC33)와 동일한 정도의 ADCC 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 항 글리피칸 3 항체를 항암제로서 이용할 경우에는, 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄가변영역 및 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체(GC33)와 동일한 정도의 CDC 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다.
게다가, 본 발명은 글리피칸 3으로의 결합활성이 높은 항체를 포함한다.
본 발명에 있어서, 글리피칸 3으로의 결합활성은 당업자에게 공지된 수단을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, BIAcore를 이용한 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 즉, 센서 칩 위에 글리피칸 3 단백질을 고정하여 항체와 반응시키고, 측정치로부터 항체와 글리피칸 3의 상호작용을 반응속도 정수(定數)로 산출할 수 있다. 또한, 결합활성의 평가에는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay, 효소결합면역흡착검정법), EIA(enzyme immunoassay, 효소면역측정법), RIA(radioimmunoassay, 방사면역측정법) 또는 형광항체법(fluorescent antibody technique)을 이용할 수 있다. 예를 들어, 효소면역측정법을 이용할 경우, 피험항체가 결합하는 항원을 코팅한 플레이트에 피험항체를 포함하는 시료, 예를 들어, 피험항체 생산세포의 배양상등액 또는 정제항체(purified antibody)를 첨가한다. 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase) 등의 효소에서 표지된 2차 항체를 첨가하고, 플레이트를 배양하여 세정한 다음, p-니트로페닐 인산(p-nitrophenyl phosphate) 등의 효소기질을 첨가하여 흡광도를 측정하는 것으로 항원결합활성(antigen binding activity)을 평가할 수 있다. 결합활성의 상한은 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, 당업자가 기술적으로 제조가능한 범위의 상한을 설정할 수 있다. 그러나, 기술적으로 제조가능한 범위는 기술의 진보에 따라 확대되는 것이 이해될 것이다.
또한, 본 발명에 있어서는 항체의 안정성을 증가시키는 등의 목적으로 탈아미드화(deamidated)되는 아미노산 또는 탈아미드화되는 아미노산에 인접하는 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 탈아미드화를 억제시켜도 무방하다. 탈아미드화되는 아미노산으로는 아스파라긴과 글루타민을 예로 들 수 있지만, 바람직하게는 아스파라긴이다. 아스파라긴에 인접하는 아미노산으로는 특히 한정되지 않고 어떠한 아미노산에서도 무방하지만, 아스파라긴-글리신 서열은 특히 탈아미드화되기 쉽다는 것이 공지되어 있기 때문에, 아스파라긴에 인접하는 아미노산으로서는 글리신이 바람직하다. 치환후의 아미노산으로는 아스파라긴 및 글루타민 이외의 것이면 특히 한정되지 않고, 모든 아미노산에서도 무방하지만, 바람직하게는 발린(valine), 프롤린(proline) 이외의 아미노산인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에서는 항체의 탈아미드화를 목적으로 하는 경우에는 아스파라긴, 글루타민, 발린, 프롤린 이외의 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 아미노산 치환에 의한 탈아미드화의 억제에 대해서는, 예를 들어, WO03/057881을 참고할 수 있다. 탈아미드화 억제를 목적으로 아미노산을 치환할 경우에는 치환 전의 항원결합활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다.
게다가, 항체안정화의 다른 태양으로 글루타민산의 다른 아미노산으로의 치환을 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명에서는 항체중쇄(heavy chain of an antibody)의 6번째가 글루타민산인 경우, 전기 글루타민산을 글루타민으로 치환하여 현저하게 항체를 안정화시킬 수 있음을 알아내었다. 따라서, 본 발명은 항체중쇄의 6번째의 글루타민산을 글루타민으로 치환하여, 항체를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 항체 중의 아미노산 번호매김은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Kabat, E. A. et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Dept. Health and Human Services, 1983).
본 발명의 항체는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 방사성물질(radioactive material), 독소(toxin) 등의 각종 분자와 결합한 결합항체(conjugated antibody)에서도 무방하다. 상기와 같은 결합항체는 수득된 항체에 화학적인 수식을 가함으로써 수득될 수 있다. 게다가, 항체의 수식방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다. 본 발명에서 항체에는 이들의 결합항체도 포함된다.
또한, 본 발명에 사용되는 항체는 2중특이성항체(bispecific antibody)에서도 무방하다(예를 들어,「Journal of Immunology」(1994), 152, p5368-p5374 등). 2중특이성항체는 한쪽이 글리피칸 3을 인식하고, 다른 한쪽이 다른 항원을 인식하여도 무방하며, 글리피칸 3 분자상의 다른 에피토프를 인식하여도 무방하다.
또한, 본 발명의 항체는 그 N말단 또는 C말단에 다른 단백질을 융합시켜도 무방하다(참조:「Clinical Cancer Research」(2004), 10, p1274-p1281). 융합되는 단백질은 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
게다가, 본 발명의 항체는 세포독성이 증강된 항체여도 무방하다. 세포독성이 증강된 항체로는, 예를 들어, 푸코스(fucose)가 결손된 항체, 당쇄(sugar chain)에 바이섹팅 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)(bisecting N-acetylglumcosamine)이 부가된 항체, Fc영역의 아미노산을 치환하여 Fcγ 수용체와의 결합활성을 변화시킨 항체 등을 들 수 있다. 이들 세포독성이 증강된 항체는 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
항체의 작성방법
글리피칸 3에 결합하는 항체는 당업자에게 공지된 방법으로 작성할 수 있다. 예를 들어, 모노클론항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지기술을 사용하고, 이하와 같이 제조할 수 있다. 즉, 글리피칸 3 단백질 또는 글리피칸 3 발현세포를 감작항원(sensitizing antigen)으로 사용하고, 이를 통상의 면역방법에 따라 포유동물을 면역시킨다. 수득되는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의하여 공지된 친세포(parent cell)와 융합시키고, 통상의 스크리닝법으로 모노클론항체 생산세포를 선택할 수 있다.
구체적으로, 모노클론항체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 우선, 서열번호 3 및 4에 나타내는 글리피칸 3 유전자/아미노산 서열에 따라 글리피칸 3 단백질을 수득하고, 이를 항체수득의 감작항원으로 사용한다. 즉, 글리피칸 3을 암호화하는 유전자 서열을 공지된 발현벡터계에 삽입하고, 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포안 또는 배양상등액안에서 목적의 사람 글리피칸 3 단백질을 공지된 방법으로 정제한다.
다음으로, 전기 정제 글리피칸 3 단백질을 감작항원으로 이용한다. 또는, 글리피칸 3의 부분펩티드를 감작항원으로 사용할 수 있다. 이 경우, 부분펩티드는 사람 글리피칸 3의 아미노산 서열에 따라 화학합성으로 수득하는 것도 가능하다.
본 발명의 항 글리피칸 3 항체의 인식되는 글리피칸 3 분자상의 에피토프는 특정한 것에 한정되지 않고, 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피토프라면 어떠한 에피토프를 인식하여도 무방하다. 따라서, 본 발명의 항 글리피칸 3 항체를 제조하기 위한 항원은 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피토프를 포함하는 단편이라면, 어떠한 단편도 이용할 수 있다.
감작항원에서 면역되는 포유동물로는 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 설치류(rodent)동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 원숭이 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역시키는 것은 공지된 방법에 따라 행해진다. 예를 들어, 일반적인 방법으로 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사하여 행해진다. 구체적으로는 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 생리식염수 등에서 적당량으로 희석, 현탁시킨 것에 필요시 통상의 어쥬번트(adjuvant), 예를 들어, 플루언트완전어쥬번트(Freund's complete adjuvant)를 적당량 혼합해서 유화(乳化)시킨 후, 포유동물에 4일 내지 21일동안 매일 수회(數回) 투여한다. 또한, 감작항원면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.
상기와 같이 포유동물을 면역시키고, 혈청 안에 원하는 항체레벨이 상승함을 확인한 후에, 포유동물에서 면역세포를 채취하고, 세포융합으로 첨가된다. 바람직한 면역세포로는 특히 비세포(splenocyte)를 예로 들 수 있다.
전기 면역세포와 융합해야 할 친세포로 포유동물의 골수종세포(myeloma cell)를 이용한다. 전기 골수종세포는 공지된 여러 가지의 세포주, 예를 들어, P3(P3x63Ag8.653)(참조: J. Immnol. (1979), 123, p1548-p1550), P3x63Ag8U.1(참조: Current Topics in Microbiology and Immunology (1978), 81, p1-p7), NS-1(참조: Kohler. G. and Milstein, C. Eur J. Immunol. (1976) 6, p511-p519), MPC-11(참조: Margulies. D.H. et al., Cell (1976), 8, p405-p415), SP2/0(참조: Shulman, M. et al., Nature (1978), 276, p269-p270), FO(참조: deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol Methods (1980), 35, p1-p21), S194(참조: Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978), 148, p313-p323), R210(참조: Galfre, G. et al., Nature (1979), 277, p131-p133) 등이 적절하게 사용된다.
전기 면역세포와 골수종세포와의 세포융합은 기본적으로는 공지된 방법, 예를 들어, 쾰러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)의 방법(참조: Kohler. G. and Milstein, C.,「Methods Enzymol.」(1981), 73, p3-p46) 등에 준하여 행할 수 있다.
보다 구체적으로는 전기 세포융합은, 예를 들어, 세포융합촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액(nutrition culture solution) 내에서 행해진다. 융합촉진제로는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 센다이바이러스(hemagglutinating virus of Japan, HVJ) 등이 사용되며, 또한, 원하는 경우 융합효율을 높이기 위하여 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 등의 보조제를 첨가사용할 수도 있다.
면역세포와 골수종세포와의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들어, 골수종세포에 대하여 면역세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 이용되는 배양액으로는, 예를 들어, 전기 골수종세포주의 증식에 적절한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외, 이 종의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용가능하며, 또한, 우태아혈청(fetal calf serum, FCS) 등의 혈청보조액을 병용할 수도 있다.
세포융합은 전기 면역세포와 골수종세포와의 소정의 양을 전기 배양액 안에서 잘 혼합시키고, 이미 37℃ 정도에 가온한 PEG 용액(예를 들어, 평균 분자량 1000 내지 6000 정도)을 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합하여 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성시킨다. 계속해서, 적당한 배양액을 순차첨가하고 원심하여, 상등액을 제거하는 조작을 반복시켜 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거한다.
이와 같이 수득된 하이브리마는 통상의 선택배양액, 예를 들어, HAT 배양액(하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배양액)에서 배양함에 따라 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적의 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상, 몇일 내지 몇주간)이 계속된다. 다음으로, 통상의 한계희석법(standard limiting dilution method)을 이용하여, 목적의 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일클론을 행한다.
또한, 사람 이외의 동물에 항원을 면역하여 하이브리도마를 수득하는 방법 외에, 사람 림프구를 in vitro의 글리피칸 3에 감작하고, 감작 림프구를 사람유래의 영구분열기능(permanent division potential)을 가지는 골수종세포와 융합시켜, 글리피칸 3으로의 결합활성을 가지는 원하는 사람 항체를 수득할 수도 있다(참조: 특공평 1-59878호 공보). 게다가, 다른 방법으로는 사람 항체 유전자의 모든 레퍼터리(repertory)를 갖는 형질전환 동물(transgenic animal)에 항원이 되는 글리피칸 3을 투여하고, 항 글리피칸 3 항체 생산세포를 수득하여, 이를 불멸화시켜 전기 세포로부터 글리피칸 3에 대한 사람 항체를 수득할 수 있다(참조: 국제특허출원공개번호 WO94/25585호 공보, WO93/12227호 공보, WO92/03918호 공보 및 WO94/02602호 공보).
이와 같이 제조되는 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 내에서 계대배양(passage-cultured)이 가능하며, 또한, 액체질소 안에서 장기보존이 가능하다.
해당 하이브리도마로부터 모노클론항체를 수득하기에는 해당 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상등액으로 수득한 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하고 증식시켜, 그 복수(腹水)로 수득한 방법 등이 이용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 수득하기에 적합하지만, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 재조합하고, 이를 숙주에 도입하고 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합 형태의 항체를 제조하는 것도 가능하다(예를 들어, Vandamme, A. M. et al.,「Eur. J. Biochem.」(1990), 192, p767-p775).
구체적으로는 항 글리피칸 3 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항 글리피칸 3 항체의 가변(V)영역을 암호화하는 mRNA를 분리시킨다. mRNA의 분리는 공지된 방법, 예를 들어, 구아니딘 초원심법(guanidine ultracentrifugal method)(참조: Chirgwin, J. M. et al.,「Biochemistry」(1979), 18, p5294-p5299), AGPC법(참조: Chomczynski, P. et al.,「Anal. Biochem.」(1987), 162, p156-p159) 등에 따라 행하여 모든 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품) 등을 사용하여 목적의 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품)을 이용하여 mRNA를 직접 조제할 수도 있다.
수득된 mRNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사 제품) 등을 이용하여 행한다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 수행하기 위해서는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech사 제품) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(참조: Frohman, M. A. et al.,「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」(1988), 85, p8998-p9002, Belyavsky, A. et al.,「Nucleic Acids Res.」(1989), 17, p2919-p2932) 등을 사용할 수 있다.
수득된 PCR 산물로부터 목적의 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이것에서 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니(colony)를 선택하고 목적하는 재조합 벡터를 조제한다. 그리고, 목적의 DNA의 염기서열을 공지된 방법, 예를 들어, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법(dideoxynucleotide chain termination method) 등에 의하여 확인한다.
목적으로 하는 항 글리피칸 3 항체의 V영역을 암호화하는 DNA를 수득한 후, 이것을 항체보존영역(C영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현벡터에 재조합한다.
본 발명에서 사용되는 항 글리피칸 3 항체를 제조하려면, 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들어, 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter)의 제어 아래에서 발현되도록 발현벡터에 재조합한다. 다음으로, 이 발현벡터에 의하여 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다.
항체 유전자의 발현은 H사슬 또는 L사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 발현벡터에 재조합하고 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는 H사슬 및 L사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 단일의 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(참조: WO94/11523호 공보).
폴리뉴클레오티드
다른 관점에 있어서는, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 내지 21, 33 내지 43, 55 내지 59, 65 내지 70 및 77 내지 83 중 어느 하나의 염기서열을 가진다. 또한, 전기 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화(hybridize)하고, 본 발명의 항체와 동등한 활성을 가지는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 암호화하는 한, 특히 한정되지 않고, 복수의 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid) 또는 리보핵산(ribonucleic acid) 등의 뉴클레오티드로 구성된 중합체이다. 천연 이외의 염기를 포함하고 있어도 무방하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체를 유전 공학적 수법으로 제조하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지는 항체를 스크리닝하기 위하여 탐침으로 이용할 수도 있다. 즉, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 일부를 탐침으로 이용하고, 혼성화기술(hybridization technique), 유전자증폭기술(gene amplification technique)(예를 들어, PCR) 등의 기술에 의하여, 전기 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 본 발명의 항체와 동등한 활성을 가지는 항체를 암호화하는 DNA를 수득할 수 있다. 이와 같은 DNA도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된다.
혼성화기술(참조: Sambrook, J. et al.,「Molecular Cloning 2nd ed.」, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))은 당업자에게 공지된 기술이다. 혼성화기술의 조건으로는, 예를 들어, 덜 엄격한 조건(low stringent condition)을 들 수 있다. "덜 엄격한 조건"이라 함은 혼성화 이후의 세정에서, 예를 들어, 42℃, 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 조건을 의미하며, 바람직하게는 50℃, 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 조건이다. 보다 바람직한 혼성화의 조건으로는 보다 엄격한 조건을 예로 들 수 있다. "보다 엄격한 조건(high stringent condition)"이라 함은, 예를 들어, 65℃, 5×SSC 및 0.1% SDS의 조건을 의미한다. 이들의 조건에 있어서, 온도를 올리는 정도에 높은 상동성(homology)을 가지는 폴리뉴클레오티드가 효율적으로 수득되는 것을 기대할 수 있다. 단, 혼성화의 엄격함에 영향받는 요소로서는 온도 및 염농도 등 다수의 요소가 있으며, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 엄격함을 실현시킬 수 있다.
이들 혼성화기술이나 유전자증폭기술에 의하여 수득되는 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 본 발명의 항체와 기능적으로 동등한 항체는 통상 이들 항체와 아미노산 서열에서 높은 상동성을 가진다. 본 발명의 항체에는 본 발명의 항체와 기능적으로 동등하며, 전기 항체의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지는 항체도 포함된다. "높은 상동성(high homology)"이라 함은 아미노산 레벨에서 통상 적어도 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 85% 이상의 동일성, 특히 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 의미한다. 폴리펩티드의 상동성을 결정하려면, 문헌(참조: Wilbur, W. J. and Lipman, D. J.「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」(1983), 80, p726-p730)에 기재된 연산법(algorithm)에 따르면 무방하다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 이와 같은 벡터는 본 발명의 항체를 제조하기 위하여 이용될 수 있다. 본 발명의 벡터로는, 예를 들어, 대장균을 숙주로 할 경우에는 벡터를 대장균(예를 들어, JM109, DH5α, HB101 또는 XL1Blue) 등에서 대량으로 증폭시켜, 대량 조제하기 위하여, 대장균에서 증폭되기 위한「ori」를 가지며, 또한, 형질전환된 대장균의 선발유전자(gene for selecting)(예를 들어, 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin) 또는 클로람페니콜(choloramphenicol) 등의 약제에 의하여 선별할 수 있는 약제내성 유전자(drug resistance gene))를 가지면 특별히 제한되지 않는다. 벡터의 예로서, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클론닝(subcloning) 및 추출을 목적으로 한 경우, 상기 벡터 이외에 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 벡터로는 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로는, 예를 들어, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 가지는 것 이외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에서는 대장균에서 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터(참조: Ward 등,「Nature」(1989), 341, p544-p546; FASEB J. (1992), 6, p2422-p2427), araB 프로모터(참조: Better 등,「Science」(1988), 240, p1041-p1043), 또는　T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이와 같은 벡터로는, 상기 벡터 이외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사 제품),「QIAexpress system」(Qiagen사 제품), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 중합효소를 발현시키고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 예로 들 수 있다.
또한, 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 신호서열(signal sequence)이 포함되어도 무방하다. 단백질 분비를 위한 신호서열로는 대장균의 페리플라즘(periplasm)으로 생산시킬 경우, pelB 신호서열(참조: Lei, S. P. et al.,「J. Bacteriol.」(1987), 169, p4379)을 사용하면 무방하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들어, 염화칼슘법(calcium chloride method), 전기천공법(electroporation method)을 이용할 수 있다.
대장균 이외에도, 예를 들어, 본 발명의 벡터로는 포유동물유래의 발현벡터(예를 들어, pcDNA3(Invitrogen사 제품), pEGF-BOS(참조:「Nucleic Acids. Res.」(1990), 18(17), p5322), pEF 및 pCDM8), 곤충세포유래의 발현벡터(예를 들어,「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL사 제품) 및 pBacPAK8), 식물유래의 발현벡터(예를 들어, pMH1 및 pMH2), 동물바이러스유래의 발현벡터(예를 들어, pHSV, pMV 및 pAdexLcw), 레트로바이러스(retrovirus)유래의 발현벡터(예를 들어, pZIPneo), 효모유래의 발현벡터(예를 들어,「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사 제품), pNV11 및 SP-Q01), 고초균(Bacillus subtilis)유래의 발현벡터(예를 들어, pPL608 및 pKTH50)를 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위하여 필요한 프로모터, 예를 들어, SV40 프로모터(참조: Mulligan 등,「Nature」(1979), 277, p108), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(참조: Mizushima 등,「Nucleic Acids Res.」(1990), 18, p5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하며, 세포로의 형질전환을 선별하기 위한 유전자(예를 들어, 약제(네오마이신(neomycin) 또는 G418 등)로 판별할 수 있는 약제내성 유전자(drug resistance gent))를 가진다면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 가지는 벡터로는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13 등을 들 수 있다.
또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 세포내에서의 유전자의 복제수(copy number) 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산합성경로(nucleic acid synthetic pathway)를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 가지는 벡터(예를 들어, pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)에 의하여 증폭시킬 수 있다. 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현시키는 유전자를 염색체상에 가지는 COS 세포를 이용하여, SV40의 복제기ㅇ원rigin of replicaton)을 가지는 벡터(예를 들어, pcD 등)에서 형질전환할 수 있다. 게다가, 복제개시로는 폴리오마바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 소유듀종바이러스(bovine papillom virus, BPV) 등의 유래의 것을 이용할 수도 있다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 복제수 증폭을 위하여, 발현벡터는 선택마커(selectable marker)로서, 아미노글리코사이드 트랜스페라제(aminoglycoside transferase, APH) 유전자, 티미딘 카이네이스(thymidine kinase, TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌포스포리보실 트랜스페라제(E. coli xanthine guaninephosphoribosyl transferase, Ecogpt) 유전자, 이(二)수소폴레이트환원효소(dihydrofolate reductase, dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체를 제조하기 위해서는 전기벡터를 숙주세포에 도입시킨다. 벡터가 도입되는 숙주세포로는 특히 제한되지 않고, 예를 들어, 대장균 또는 각종 동물세포 등을 이용할 수 있다. 숙주세포는, 예를 들어, 본 발명의 항체의 제조 또는 발현을 위한 생산계로 사용할 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생산계는 in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로는 진핵세포(eukaryotic cell)를 사용하는 생산계 및 원핵세포(prokaryotic cell)를 사용하는 생산계를 예로 들 수 있다.
진핵세포를 사용할 경우, 예를 들어, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 숙주로 이용할 수 있다. 동물세포로는 포유류세포, 예를 들어, CHO(참조:「J. Exp. Med.」(1995), 108, p945), COS, 3T3, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, 양생류세포(amphibian cell), 예를 들어, 남아프리카산 발톱개구리(Xenopus oocyte) 난모세포(참조: Valle, et al.,「Nature」(1981), 291, p358-p340), 또는 곤충세포, 예를 들어, Sf9, Sf21, Tn5를 들 수 있다. 본 발명에서는 CHO-DG44, CHO-DXB11, COS7 세포, BHK 세포가 적합하게 이용된다. 동물세포에서 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들어, 인산칼슘법(calcium phosphate method), DEAE 덱스트란법(DEAE-dextran method), 양이온 리보솜 DOTAP(cationic ribozome DOTAP)(Boehringer Mannheim사 제품)를 이용한 방법, 전기천공법(electroporation method), 리포펙션(lipofection) 등의 방법에서 수행하는 것이 가능하다.
식물세포로는, 예를 들어, 니코티아나ㆍ타바컴(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 단백질 생산계로서 알려져 있으며, 이것을 칼러스(callus) 배양하면 무방하다. 진균세포로는, 효모, 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들어, 사카로마이세스ㆍ세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스ㆍ폼베(Saccharomyces pombe) 사상균(filamentous fungi), 예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들어, 아스퍼질러스ㆍ나이거(Aspergillus niger)를 들 수 있다.
원핵세포를 사용할 경우, 세균세포를 이용하는 생산계를 사용할 수 있다. 세균세포로는 대장균(E. coli), 예를 들어, JM109, DH5α, HB101 및 고초균을 들 수 있다.
재조합 항체의 제조
본 발명의 항체는 상기 숙주세포를 배양시켜 제조할 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 실험실 조건(in vitro)에서 배양시킴으로써 항체가 수득된다. 배양은 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들어, 동물세포의 배양액으로 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 이 경우, FBS, 우태아혈청(FCS) 등의 혈청보조액을 병용할 수도 있으며, 무혈청배양에서도 무방하다. 배양시의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 200시간 수행하며, 필요시 배지의 교환(medium change), 통기(aeration) 및 교반(agitation)을 첨가한다.
한편, 생체내 조건(in vivo)에서 폴리펩티드를 생산시키는 시스템으로는, 동물을 사용하는 생산계 및 식물을 사용하는 생산시스템을 예로 들 수 있다. 이들의 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시키고 회수한다. 본 발명에서의 "숙주(host cell)"라 함은 이들의 동물, 식물을 포함하는 의미로 사용되었다.
동물을 사용하는 경우, 포유류 동물 또는 곤충을 사용하는 생산시스템이 있다. 포유류동물로는 염소, 돼지, 양, 마우스 및 소를 사용할 수 있다(참조: Vicki Glaser,「SPECTRUM Biotechnology Applications」(1993)). 또한, 포유류동물로서 형질전화 동물(transgenic animal)을 사용할 수 있다.
예를 들어, 목적의 폴리뉴클레오티드를 염소 β 카세인(goat β casein)과 같은 우유 안에 고유(固有)하게 생산되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자와의 융합유전자로 조제한다. 다음으로, 이 융합유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배아에 주입하고, 이 배아를 암컷 염소에 이식시킨다. 배아를 수용한 염소로부터 태어난 형질전환 염소 또는 그의 자손이 생산하는 우유로부터, 목적하는 항체를 수득할 수 있다. 형질전환 염소로부터 생산되는 항체를 포함하는 우유 양을 증가시키기 위하여, 적절한 호르몬을 형질전환 염소에 사용하여도 무방하다(참조: Ebert, K. M. et al.,「Bio/Technology」(1994), 12, p699-p702).
또한, 곤충으로는, 예를 들어, 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입한 바큘로바이러스(baculovirus)를 누에에 감염시켜, 상기 누에의 체액으로부터 목적의 항체를 수득할 수 있다(참조: Susumu, M. et al.,「Nature」(1985), 315, p592-p594).
식물을 사용하는 경우, 예를 들어, 담배(tobacco)를 이용할 수 있다. 담배를 이용할 경우, 목적하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물발현용 벡터, 예를 들어, pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움ㆍ튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입시킨다. 이 박테리아를 담배, 예를 들어, 니코티아나ㆍ타바컴(Nicotiana tabacum)에 감염시켜서 담배잎으로부터 원하는 항체를 수득할 수 있다(참조: Julian K. C. Ma et al.,「Eur. J. Immunol.」(1994), 24, p131-p138).
이상과 같이 수득된 항체는 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 분리되며, 실질적으로 순수하게 균일한 항체로 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 통상의 폴리펩티드의 정제로 사용되고 있는 분리 및 정제방법을 사용하여도 무방하다. 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼, 필터(filtration), 한외여과(ultrafiltration), 염석(salting-out), 용매침전(solvent precipitation), 용매추출(solvent extraction), 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis), 등전점전기영동(isoelectric focusing), 투석(dialysis), 재결정(recrystallization) 등을 적절히 선택, 재조합하면 폴리펩티드를 분리 및 정제할 수 있다.
크로마토그래피로는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 수소성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(참조: Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이 크로마토그래피들은 액상 크로마토그래피, 예를 들어, HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 친화성 크로마토그래피로 이용되는 컬럼으로는 프로틴 A 컬럼(protein A column), 프로틴 G 컬럼(protein G column)을 들 수 있다. 예를 들어, 프로틴 A를 이용한 컬럼으로 Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Pharmacia사 제품) 등을 들 수 있다.
또한, 항체의 정제전 또는 정제후에 적당한 단백질 수식효소를 작용시켜 임의의 수식을 더하거나 부분적으로 펩티드를 제거할 수도 있다. 단백질 수식효소로는, 예를 들어, 트립신, 키모트립신(chymotrypsin), 라이실 엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase), 단백질 키나아제(protein kinase), 글루코시다아제(glucosidase) 등이 이용된다.
진단방법
다른 관점에 있어서는, 본 발명은 본 발명의 항체를 이용하여 피험시료중의 GPC3 단백질을 검출하고, 암 등의 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
"검출(detection)"이라 함은 정량적 또는 비정량적인 검출을 포함하며, 예를 들어, 비정량적인 검출로는, 단순히 GPC3 단백질이 존재하는지의 여부를 측정, GPC3 단백질이 일정량 이상 존재하는지의 여부를 측정, GPC3 단백질의 양을 다른 시료(예를 들어, 대조군시료 등)와 비교하는 측정 등을 들 수 있으며, 정량적인 검출로는 GPC3 단백질의 농도측정, GPC3 단백질 양의 측정 등을 들 수 있다.
"피험시료(test sample)"라 함은 GPC3 단백질이 포함되는 가능성이 있는 시료라면 특히 제한되지 않지만, 포유류 등의 생물체로부터 채취된 시료가 바람직하며, 더 바람직하게는 사람으로부터 채취된 시료이다. 피험시료의 구체적인 예로는, 혈액, 간질액, 혈장, 혈관외액(extravascular fluid), 뇌척수액(cerebral fluid), 활액(joint fluid), 흉막액, 혈청, 림프액(lymph fluid), 타액(saliva) 등을 들 수 있지만, 바람직한 것은 혈액, 혈청 및 혈장이다. 또한, 생물체로부터 채취된 세포의 배양액 등의 피험시료로부터 수득된 시료도 본 발명의 피험시료에 포함된다.
진단되는 암은 특히 제한되지 않고, 구체적으로는 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 유암, 전립선암, 백혈병, 림프종 등을 예로 들 수 있지만, 바람직한 것은 간암이다. 검출되는 GPC3은 특히 한정되지 않고, 전장 GPC3에서도, 그 단편에서도 무방하다. GPC3 단편을 검출하는 경우에는 N말단 단편에서도, C말단 단편에서도 무방하지만, 바람직하게는 N말단 단편이다. 또한, 헤파란황산 등이 부가된 GPC3 단백질에서도, GPC3 코어단백질에서도 무방하다.
피험시료에 포함되는 GPC3 단백질의 검출방법은 특히 한정되지 않지만, 항 GPC3 항체를 이용한 면역학적 방법에 따라 검출하는 것이 바람직하다. 면역학적 방법으로는, 예를 들어, 방사면역측정법(radioimmunoassay), 효소면역분석법(enzyme immunoassay), 형광면역분석법(fluorescence immunoassay), 발광면역분석법(luminescence immunoassay), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역비탁법(turbidimetric immunoassay) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 효소면역분석법이며, 특히 더 바람직한 것은 효소결합면역흡착정량법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(예를 들어, sandwich ELISA)이다. ELISA 등의 상술한 면역학적 방법은 당업자에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
항 GPC3 항체를 이용한 일반적인 검출방법으로는, 예를 들어, 항 GPC3 항체를 지지체에 고정하고, 여기에 피험시료를 첨가하여 배양되는 항 GPC 항체와 GPC3 단백질을 결합시킨 후에 세정하고, 항 GPC3 항체를 개입시켜 지지체에 결합한 GPC3 단백질을 검출하여, 피험시료 중의 GPC3 단백질을 검출하는 방법을 들 수 있다.
항 GPC3 항체와 GPC3 단백질과의 결합은 통상 완충용액 안에서 행해진다. 완충용액으로는, 예를 들어, 인산완충용액, Tris 완충용액 등이 사용된다. 또한, 반응조건으로는 이미 공지되어 있는 조건, 예를 들어, 4℃ 내지 실온에서 1시간 내지 24시간 동안 반응시킨다. 배양 후의 세정은 GPC3 단백질과 항 GPC3 항체의 결합을 방해하지 않는 것이면 무엇이든 무방하고, 예를 들어, Tween 20 등의 계면활성제를 포함하는 완충용액 등이 사용된다.
본 발명의 GPC3 단백질 검출방법에서는 GPC3 단백질을 검출하고 싶은 검출시료 이외에, 대조군시료를 설치하여도 무방하다. 대조군시료로는 GPC3 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군시료나 GPC3 단백질을 포함하는 양성 대조군시료 등이 있다. 이 경우, GPC3 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군시료에서 수득된 결과와 GPC3 단백질을 포함하는 양성 대조군시료에서 수득된 결과를 비교하여 피험시료중의 GPC3 단백질을 검출할 수 있다. 또한, 대조군시료 및 피험시료의 검출결과를 수치로 수득하고, 그들의 수치를 비교하여 피험시료에 포함되는 GPC3 단백질을 정량적으로 검출하는 것도 가능하다.
항 GPC3 항체를 개입시켜 지지체에 결합한 GPC3 단백질의 검출이 바람직한 태양으로, 표지물질에서 표지된 항 GPC3 항체를 이용하는 방법을 예로 들 수 있다. 예를 들어, 지지체에 고정된 항 GPC3 항체에 피험시료를 접촉시켜, 세정후에 GPC3 단백질을 특이적으로 결합하는 표지항체를 이용하여 GPC3을 검출할 수 있다.
항 GPC3 항체의 표지는 통상의 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 표지물질로는, 형광색소, 효소, 보조효소(coenzyme), 화학발광물질, 방사성 물질 등의 당업자에게 공지된 표지물질을 이용할 수 있으며, 구체적인 예로는, 방사성 동위원소(32P, 14C, 125I, 3H, 131I 등), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 댄실 클로라이드(dansyl choloride), 움벨리페론(umbelliferone), 루시페라제(luciferase), 페록시다아제(peroxidase), 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), 호스래디시 페록시다아제(horseradish peroxidase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 리소자임(lysozyme), 사카라이드 옥시다아제(saccharide oxidase), 마이크로페록시다아제(microperoxidase), 비오틴(biotin) 등을 들 수 있다. 표지물질로 비오틴을 이용할 경우에는 비오틴 표지항체를 첨가한 후에, 알칼리포스파타제 등의 효소를 결합시킨 아비딘(avidin)을 첨가하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하여, 항 GPC3 항체를 고정시킨다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위하여, 예를 들어, BSA 등으로 블로킹한다. 다시 세정하고, 피험시료를 플레이트에 가한다. 배양후, 세정하고 표지 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 배양한 후, 플레이트를 세정하고, 플레이트에 남은 표지 항 GPC3 항체를 검출한다. 단백질의 검출은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 행할 수 있고, 예를 들어, 방사성 물질에 의한 표지의 경우에는 액체 신틸레이션(scintillation)이나 RIA법에 따라 검출할 수 있다. 효소에 의해 표지된 경우에는 기질을 가하고, 기질의 효소적 변화, 예를 들어, 발색을 흡광도계(absorbance reader)에 의하여 검출할 수 있다. 형광물질의 경우에는 형광광도계(fluorometer)에 의하여 검출할 수 있다.
본 발명의 GPC3 단백질 검출방법 중에 특히 바람직한 태양으로 비오틴으로 표지된 항 GPC3 항체 및 아비딘을 이용하는 방법을 예로 들 수 있다. 구체적으로는, 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하고, 항 GPC3 항체를 고정시킨다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여, 예를 들어, BSA 등으로 블로킹한다. 다시 제어하고, 피험시료를 플레이트에 가한다. 배양후, 세정하고 비오틴 표지 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 배양한 후, 플레이트를 세정하고, 알칼리포스파타제 또는 페록시다아제 등의 효소와 결합한 아비딘을 가한다. 배양후, 플레이트를 세정하고, 아비딘에 결합하고 있는 효소에 대응한 기질을 가하고, 기질의 효소적 변화 등을 표지로 GPC3 단백질을 검출한다.
본 발명의 GPC3 단백질 검출방법의 다른 태양으로, GPC3 단백질을 특이적으로 결합하는 1차 항체, 및 전기 1차 항체를 특이적으로 결합하는 2차 항체를 이용하는 방법을 예로 들 수 있다. 예를 들어, 지지체에 고정된 항 GPC3 항체에 피험시료를 접촉시키고, 배양한 후, 세정하고, 세정후에 결합하고 있는 GPC3 단백질을 1차 항 GPC3 항체 및 전기 1차 항체를 특이적으로 결합하는 2차 항체에 의하여 검출한다. 이 경우, 2차 항체는 바람직하게는 표지물질에 의하여 표지되어 있다.
구체적으로는, 항 GPC3 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하여, 항 GPC3 항체를 고정시킨다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여, 예를 들어, BSA 등으로 블로킹한다. 다시 세정하고, 피험시료를 플레이트에 가한다. 배양후, 세정하고 1차 항 GPC3 항체를 가한다. 적당히 배양한 후, 플레이트를 세정하고, 다음으로 1차 항체를 특이적으로 결합하는 2차 항체를 가한다. 적당히 배양한 후, 세정하고 플레이트에 남은 2차 항체를 검출한다. 2차 항체의 검출은 상술한 방법에 의하여 행해질 수 있다.
의약조성물
다른 관점에 있어서는, 본 발명은 본 발명의 항체를 함유하는 의약조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 함유하는 의약조성물은 암 등의 세포증식에 관련하는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하며, 특히 간암의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 항체를 의약조성물로 이용할 경우에는 당업자에게 공지된 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들어, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 용액과의 무균성 용액, 또는 현탁액(suspension)의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수(sterile water), 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 운반제(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적절히 재조합하여, 일반적으로 인정된 제약실시(Drug Implementation)에 요구되는 단위용량형태로 혼화(混化)되어 제제화됨을 생각할 수 있다. 이들 제조에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 투여할 수 있도록 선택한다.
주사를 위한 무균조성물은 주사용 증류수와 같은 운반제를 이용하여 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로는, 예를 들어, 생리식염수, 포도당 및 그 외의 보조약을 포함하는 등장액(isotonic liquid), 예를 들어, D-솔비톨(D-sorbitol), D-만노스(D-mannose), D-만니톨(D-mannitol), 염화나트륨을 들 수 있으며, 적당한 용해보조제, 예를 들어, 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들어, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant), 예를 들어, 폴리솔비톨 80 (TM), HCO-50과 병용하여도 무방하다.
유성액으로는 참깨유 및 대두유를 예로 들 수 있으며, 용해보조제로서 안식향산 벤질(benzyl benzoate) 또는 벤질 알코올(benzyl alcohol)과 병용하여도 무방하다. 또한, 완충제, 예를 들어, 인산염 완충용액, 아세트산나트륨 완충용액, 무통화제(pain-killer), 예를 들어, 염산 프로카인(procaine hydrochloride), 안정제, 예를 들어, 벤질 알코올, 페놀, 산화방지제와 결합하여도 무방하다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플(ampule)에 충진시킨다.
투여는 바람직하게는 비경로투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비투여제형(transnasal administration), 경폐투여제형(transpulmonary administration), 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 처방은, 예를 들어, 정맥내주사, 근육내주사, 복강내주사, 피하주사 등에 따라 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약조성물의 투여량으로는, 예를 들어, 1회에 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위에서 선택이 가능하다. 또는, 예를 들어, 환자당 0.001 내지 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동하지만, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다.
본 명세서에서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고문헌의 내용은 전부 본 명세서의 일부로서 여기에 인용되었다. 또한, 본 출원이 가지는 우선권주장의 기초가 되는 출원인 일본특허출원 2004-203637호의 명세서 및 도면에 기재된 내용은 전부 본 명세서의 일부로서 여기에 인용되었다.
이하의 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
사람 글리피칸 3( GPC3 )의 cDNA 클로닝
사람 GPC3을 암호화하는 전장 cDNA는 대장암세포주 Caco2로부터 통상의 방법에 의해 제조된 1st strand cDNA를 주형으로 하여, Advantage2 kit(CLONTECH사 제품)을 사용한 PCR 반응에 의하여 증폭하였다.
즉, 2μl의 Caco2 유래의 cDNA, 1μl의 센스프라이머(GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: 서열번호 1), 1μl의 안티센스프라이머(GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: 서열번호 2), 5μl의 Advantage2 10 x PCR 완충용액, 8μl의 dNTP mix(1.25mM) 및 1.0μl의 Advantage polymerase Mix를 포함하는 50μl의 반응액을 94℃에서 1분, 63℃에서 30초, 68℃에서 3분으로 구성된 사이클을 35회 수행하였다. PCR 반응에 의한 증폭산물은 pGEM-T Easy VectorSystem I(Promega사 제품)를 이용하여, TA 벡터 pGEM-T easy에 삽입하였다. ABI3100 DNA 시퀀스를 이용하여 서열을 확인한 결과, 사람 GPC3의 전장을 암호화하는 cDNA를 분리하였다. 서열번호 3으로 나타내어지는 서열은 사람 GPC3 유전자의 염기서열을, 서열번호 4로 나타내어지는 서열은 사람 GPC3 단백질의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
실시예 2
가용형 GPC3 의 제조
항 GPC3 항체 제조를 위한 면역 단백질로서, C말단측의 소수성 영역(564-580 아미노산)을 결손시킨 가용형 GPC3 단백질을 제조하였다.
완전장 사람 GPC3 cDNA를 주형으로 안티센스프라이머(ATA GAA TTC CAC CAT GGCCGG GAC CGT GCG C: 서열번호 5)와 EcoRI 인식서열, Kozak 서열을 가한 센스프라이머(ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C: 서열번호 6)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 수득한 PCR 단편(1711bp)을 pCXND2-Flag에 클로닝하였다. pCXND2-Flag는 pCXN2(참조: Niwa 등,「Gene」(1991), 108, p193-p199)의 HindIII 부위에 pCHOI(참조: Hirata 등,「FEBS letter」(1994), 356, p244-p248)의 DHFR 유전자 발현영역을 삽입하고, 또한, 멀티클로닝 사이트(multicloning site)의 하류에 Flag 태그서열을 부가하고, Flag 태그 부가단백질로 발현되도록 설계하였다. 제조된 발현 플라스미드 DNA를 CHO 세포 DXB11주에 도입시켜, 500μg/mL Geneticin으로 선발하여, 가용형 GPC3 고발현 CHO주를 수득하였다. 1700㎠의 롤러바틀(roller bottle)을 이용하여 가용형 GPC3 고발현 CHO주를 대량 배양하고, 배양상등액을 회수하여 정제하였다. 배양상등액을 DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham사 제품)에 충진하고, 세정후, 500mM NaCl을 포함하는 완충용액으로 용출시켰다. 다음으로, Anti-Flag M2 agarose affinity gel(SIGMA사 제품)을 이용하여 친화성 정제를 수행하였다. 용출은 200μg/mL의 FLAG 펩티드로 수행하였다. Centriprep-10(Millipore사 제품)으로 농축한 다음, Superdex 200 HR 10/30(Amersham사 제품)에 의한 겔 여과를 수행하여, FLAG 펩티드를 제거하였다. 마직막으로, DEAE Sepharose Fast Flow 컬럼을 이용하여 농축하고, 동시에 Tween 20을 포함하지 않은 PBS(500mM의 NaCl을 포함한다)로 용출시켜 완충용액을 치환하였다.
실시예 3
가용형 GPC3 코어단백질의 제조
GPC3은 헤파란황산에 의한 수식을 받아 거대분자(macromolecule)가 된다. 항 GPC3 항체의 스크리닝에서 헤파란황산에 대한 항체를 배제하기 위하여, 헤파란황산 부가부위(heparan sulfate-binding site)에 점변이(point mutation)를 도입한 가용형 GPC3 코어단백질을 제조하고, 스크리닝으로 사용하였다.
상기 가용형 GPC3(1-563)을 주형으로 하고, 어셈블리 PCR법(assembly PCR method)에 따라 495번째와 509번째의 Ser을 Ala로 치환시킨 cDNA를 제조하였다. 이 때, C말단에 His 태그가 부가되도록 프라이머를 설계하고, 수득된 cDNA를 pCXND3 벡터에 클로닝하였다. pCXND3은 pCXN2의 HindIII 부위에 pCHOI의 DHFR 유전자 발현부위를 삽입하여 제조하였다. 제조된 발현 플라스미드 DNA를 DXB11주에 도입하고, 500μg/mL Geneticin으로 선발하여, 가용형 GPC3 코어단백질 고발현 CHO주를 수득하였다.
1700㎠ 롤러바틀을 이용하여 대량 배양하고, 배양상등액을 회수하여 정제하였다. 배양상등액을 Q Sepharose Fast Flow(Amersham사 제품)에 충진하고, 세정후, 500mM NaCl을 포함하는 인산완충용액으로 용출시켰다. 다음으로, Chelating Sepharose Fast Flow(Amersham사 제품)를 이용하여 친화성 정제를 수행하였다. 10 내지 150mM의 이미다졸로 구배(gradient) 용출시켰다. 마지막으로, Q Sepharose Fast Flow를 이용하여 농축하고, 500mM NaCl을 포함하는 인산완충용액으로 용출시켰다.
환원조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)한 결과, 70kDa, 40kDa 및 30kDa의 3개의 밴드가 수득되었다. ABI492 protein sequencer(Applied Biosystems사 제품)를 이용하여 아미노산 시퀀싱을 수행한 결과, 30kDa 밴드는 GPC3의 359번째 이후, 또는 375번째 이후의 아미노산 서열과 일치하며, GPC3은 Arg358과 Ser359 사이, 또는 Lys374와 Val375 사이에서 절단되며, 40kDa의 N말단 단편과 30kDa의 C말단측 단편으로 분할되고 있음을 알 수 있었다.
실시예 4
전장 사람 GPC3 발현 CHO 세포주의 제조
플로우사이토메트리(flow cytometry)를 이용한 결합활성 평가용의 세포주를 수득하기 위하여, 전장 GPC3을 발현시키는 CHO 세포주를 수립하였다.
10μg의 전장 사람 GPC3 유전자 발현벡터와 60μL의 SuperFect(QIAGEN사 제품)을 혼합하고, 복합체를 형성시킨 후에, CHO 세포 DXB11주에 첨가하여, 유전자를 도입하였다. CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 다음, 최종농도 0.5mg/mL의 Geneticin 및 10% FBS를 포함하는 αMEM(GIBCO BRL사 제품)을 이용하여 선발하였다. 수득된 Geneticin 내성 콜로니(Geneticin-resistant colony)를 모아, 한계희석법으로 세포의 클로닝을 수행하였다. 각각의 세포 클론을 가용화하고, 항 GPC3 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅으로 전장 사람 GPC3의 발현을 확인하여, 안정발현 세포주(stably expressing cell line)를 수득하였다.
실시예 5
ELISA에 의한 결합활성의 평가
가용형 GPC3 코어단백질을 1μg/mL가 되도록 코팅용 완충용액(0.1mol/L NaHCO3 (pH 9.6), 0.02%(w/v) NaN3)으로 희석시킨 것을 임뮤노플레이트(immunoplate)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 코팅시켰다. 희석 완충용액(50mmol/L Tris-HCl (pH 8.1), 1mmol/L MgCl2, 150mmol/L NaCl, 0.05%(v/v) Tween 20, 0.02%(w/v) NaN3, 1%(w/v) BSA)으로 블로킹시킨 후, 항 GPC3 항체를 첨가하여 실온에서 1시간 방치하였다. 린스용 완충용액(0.05%(v/v) Tween 20, PBS)으로 세정한 후, 알칼리포스파타제 표지 항 마우스 IgG 항체(ZYMED사 제품)를 가하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 린스용 완충용액으로 세정한 후, SIGMA104(SIGMA사 제 품)를 1mg/mL가 되도록 기질 완충용액(50mmol/L NaHCO3 (pH 9.8), 10mmol/L MgCl2)으로 희석시킨 것을 첨가하여 실온에서 1시간 발색시킨 후, Benchmark Plus(BIO-RAD)를 이용하여 흡광도(405nm, 참조파장 655nm)를 측정하였다.
실시예 6
가용형 GPC3 의 면역 및 하이브리도마의 선발
사람 GPC3와 마우스 GPC3의 호몰로지(homology)는 아미노산 수준에서 94%의 높은 상동성을 나타내기 위하여, 통상의 마우스에 면역시켜도 항 GPC3 항체를 수득하기 어려울 가능성을 고려하여, 자기면역질환 마우스인 MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr 마우스(이하, MrL/lpr 마우스, 일본 찰스ㆍ리버사에서 구입)를 면역동물로 이용하였다. 7주령, 또는 8주령에서 면역을 시작하여, 초회면역(the first immjunization)에는 가용형 GPC3을 100μg/head가 되도록 조제하고, 플루언트완전어쥬번트(FCA, Becton Dickinson사 제품)를 이용하여 에멀젼화시킨 것을 피하에 투여하였다. 2주 후에 50μg/head 가 되도록 조제한 것을 플루언트불완전어쥬번트(FIA, Becton Dickinson사 제품)에서 에먼젼화된 것을 피하에 투여하였다. 이후, 1주간 간격으로 추가면역을 총 5회 수행하였다. 그 중에 2마리에 대하여, 최종면역으로 50μg/head가 되도록 PBS로 희석시켜 꼬리정맥내에 투여하였다. 최종면역의 4일후, 비 장세포를 적출하여 마우스 골수종세포 P3-X63Ag8U1(P3U1, ATCC에서 구입)과 2:1이 되도록 혼합하고, PEG1500(Roche Diagnostic사 제품)를 서서히 첨가하여 세포융합을 수행하였다. 신중하게 RPMI1640 배지(GIBCO BRL사 제품)을 첨가하여 PEG1500을 희석시키고, 원심조작(centrifugation)으로 PEG1500을 제거한 후, 10% FBS을 넣어 RPMI1640에서 현탁시킨 것을 100μL/웰이 되도록 96 공배양 플레이트(96-well culture plate)에 분주하였다. 다음날, 100μL/웰이 되도록 10% FBS, 1 x HAT media supplement(SIGMA사 제품), 0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement(Roche Diagnostic사 제품)를 포함하는 RPMI1640(이후, HAT 배지)을 첨가하였다. 2, 3 및 5일후에 배양액의 절반을 HAT 배지로 치환시키고, 7일후의 배양상등액을 이용하여 스크리닝하였다. 스크리닝은 가용형 GPC3 코어단백질을 고상화한 임뮤노플레이트를 이용한 ELISA에 의하여 행하였다. 양성 클론에 대해서는 한계희석법으로 모노클론화하였다. 그 결과, GPC3에 대하여 강한 결합활성을 가지는 항체를 11클론(즉, M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9 및 M10D2)을 수득하였다.
실시예 7
항 GPC3 항체의 아이소타입(isotype)의 결정 및 정제
아이소타입은 Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I(PIERCE사 제 품)를 이용한 항원의존적 ELISA에 의하여 결정되었다. 항체의 정제는 FBS(Ultra low IgG)(GIBCO BRL사 제품)를 첨가한 HAT 배지에서 배양한 하이브리도마의 배양상등액을 Hi Trap ProteinG HP(Amersham사 제품)에 흡착시킨 후, 결합용 완충용액(20mM Sodium phosphate (pH 7.0))으로 세정한 다음, 용출용 완충용액(0.1M Glycine-HCl (pH 2.7))으로 용출시켰다. 용출액은 바로 중화용 완충용액(1M Tris-HCl (pH 9.0)으로 중화시켰다. PBS에서 하룻밤 투석시켜 완충용액을 치환하였다.
실시예 8
ELISA에 의한 결합활성의 평가
수득된 항 GPC3 항체의 결합활성을 간편하게 평가하기 위하여, 가용형 GPC3 코어단백질을 고상화한 임뮤노플레이트에 대한 항체농도 의존적인 결합을 검출하였다. 정제항체를 10μg/mL에서 3배씩 12단계로 희석시킨 것을 더하고, 2차 항체로 항 마우스 IgG 항체를 첨가하여, SIGMA104에 의한 발색을 수행하였다. 발색의 정도는 발색시간에 따라 변화하기 때문에, 데이타는 정확하게 1시간 후에 측정한 것을 해석하였다. 각 항체는 모두 농도 의존적인 발색을 나타내었다. 항체농도와 발색의 정도와의 상관을 플로팅하고, 해석 소프트웨어 GraphPad Prism을 이용하여 근사곡선을 작성하여, 그 EC50 값을 결합활성의 지표로 결정하였다. 도 16에 모든 클론의 EC50 값을 나타내었다.
실시예 9
플로우사이토메트리(folw cytometry)에 의한 결합활성의 평가
1mM EDTA pH 8.0(GIBCO사 제품)/PBS로 세포를 박리하고, 1 x 106세포/mL이 되도록 FACS 완충용액(1% FBS/PBS)으로 현탁시켰다. 100μL/웰이 되도록 Multiscreen-HV Filter Plates(Millipor사 제품)에 분주하고, 원심조작으로 상등액을 제거하였다. 적당한 농도로 희석시킨 항 GPC3 항체를 더하여, 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. 세포를 FACS 완충용액에서 1회 세정하고, FITC 표지 항 마우스 IgG 항체를 첨가하여, 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. 반응후, 500rpm에서 1분간 원심하고 상등액을 제거하여, FACS 완충용액 400μL로 혼탁시켜, 플로우사이토메트리에 공여하였다. 플로우사이토메터(flow cytometer)는 EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter)를 이용하였다. 전방산란법(forward scatter) 및 측방산란법(side scatter)의 히스토그램으로 생세포집단(living cell population)에 게이트(gate)를 설정하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 항 GPC3 항체(M3C11, M11F1)는 GPC3을 발현시킨 CHO 세포에 강하게 결합하고, 친주(parent)인 CHO 세포에는 결합하지 않는 것이므로, 세포막상에 제시된 GPC3에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다. 또한, 간암세포주인 HepG2(ATCC에서 구입) 및 HuH-7(Health Science Research Resources Bank에서 구입)에 대하여 결합을 나타낸 것이므로, 간세포암을 특이적으로 인식할 가능성이 나타났다. 가용형 GPC3 면역마우스 유래클론의 플로우사이토메트리에 의한 결합활성에 대해서는 항체농도 5μg/mL에서의 히스토그램의 X-mode 값을 도 16에 나타내었다.
실시예 10
경합 ELISA에 의한 에피토프 분류
수득된 항체에 대하여 에피토프에 의한 분류를 위하여, 경합 ELISA를 실시하였다. 항체의 비오틴화는 Biotin Labeling Kit(Roche사 제품)를 이용하였다. 가용형 GPC3 코어단백질을 1μg/mL가 되도록 코팅용 완충용액으로 희석시킨 것을 100μL/웰이 되도록 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 보관하여 코팅시켰다. 다음날 200μL의 기질 완충용액을 첨가하여 블로킹시켰다. 4℃에서 하룻밤이상 방치한 플레이트에 항 GPC3 항체를 100μL/웰이 되도록 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 플레이트의 세정없이 10μg/mL의 비오틴 표지 항 GPC3 항체 10μL을 첨가하여 1시간 반응시켰다. 300μL/웰의 린스용 완충용액으로 3회 세정하고, 희석 완충용액으로 1000배 희석시킨 AP-스트렙트아비딘콘쥬게이트(AP-streptavidin conjugate)(ZYMED사 제품)를 100μL/웰이 되도록 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 300μl/웰의 린스용 완충용액으로 5회 세정하고, SIGMA104를 1mg/mL이 되도 록 기질 완충용액으로 희석시킨 것을 100μL/웰이 되도록 첨가하였다. 1시간 실온에서 배양한 후, 흡광도(405nm, 참조파장 655nm)를 측정하였다.
도 2에 경합 ELISA의 결과를 나타내었다. 비오틴화 항체의 결합을 50%이상 경합적으로 저해시킨 항체에 대해서는 에피토프가 입체적으로 근처에 있다고 판단되었다. 8종류의 비오틴화 항체의 결합에 대한 경합적인 발색의 저해 패턴에 의해 그룹을 나눈 결과, 가용형 GPC3 면역마우스 유래의 11클론은 5개의 그룹(a, b, c, d 및 e)으로 분류되었다(참조: 도 16).
실시예 11
웨스턴 블럿팅에 의한 에피토프 분류
가용형 GPC3 코어단백질을 환원조건하에서 10% SDS-PAGE mini(TEFCO사 제품)에 충진하고 전기영동을 행한 다음, Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell(BIO-RAD사 제품)을 이용하여 임모빌론-P(Immobilon-P)(Millipore사 제품)로 옮겼다. 막을 TBS-T(0.05% Tween 20, TBS)로 가볍게 세정한 후, 5%의 스킴밀크(skim milk)를 넣고 TBS-T로 1시간 진동시켰다. TBS-T로 약 10분간 진동시킨 후, 1%의 스킴밀크를 넣고 TBS-T로 희석시킨 각 항 GPC3 항체를 더하여 1시간 진동시켰다. TBS-T로 세정한 후, 1%의 스킴밀크를 넣고 TBS-T로 희석시킨 HRP-항 마우스 IgG 항체(Amersham사 제품)로 1시간 진동시킨 후, TBS-T로 세정하였다. 발 색은 ECL-Plus(Amersham사 제품)를 이용하고, Hyperfilm ECL(Amersham사 제품)을 이용하여 검출하였다.
도 3에 보여지는 바와 같이, L9G11은 40kDa 부근의 밴드에 결합하는 것이므로, N말단측 결합항체라고 판단되었다. M3C11은 30kDa 부근의 밴드에 결합하는 것이므로, C말단측에 결합하는 항체로 판단되었다. 경합 ELISA에서 c, d 또는 e 그룹에 속하는 항체는 모두 N말단에 결합하고, a 또는 b 그룹은 모두 C말단에 결합하였다(참조: 도 16). L9G11은 다른 N말단측 결합항체와 비교해서 웨스턴 블럿팅의 검출감도가 높고, N말단측 단편을 웨스턴 블럿팅에 의하여 검출하기에 유용한 항체라고 생각되었다.
실시예 12
분비형 GPC3 의 검출
GPC3이 358번째의 아미노산 부위, 또는 374번째의 아미노산 부위에서 절단되는 사실을 알아내고, 분비형 GPC3이 간암환자의 혈중에 분비된다는 가설을 세웠다. 따라서, 분비형 GPC3을 검출하기 위하여, GPC3 샌드위치 ELISA시스템을 구축하였다.
임뮤노플레이트에 10μg/mL이 되도록 항 GPC3 항체를 코팅하고, 기질 완충용액을 이용하여 블로킹시켰다. 실온에서 수시간후, 또는 4℃에서 하룻밤 보관한 후 , HepG2의 배양상등액을 가하여 1시간 실온에서 배양하였다. 300μL/웰의 린스용 완충용액으로 3회 세정후, 10μg/mL이 되도록 희석시킨 비오틴 표지 항 GPC3 항체를 가하여 1시간 실온에서 배양하였다. 300μL/웰의 린스용 완충용액으로 3회 세정후, AP-스트렙트아비딘(AP-streptavidin)을 가하여, 1시간 실온에서 배양하였다. 300μL/웰의 린스용 완충용액으로 5회 세정한 후, 첨부된 프로토콜에 따라 AMPAK(DAKO사 제품)를 이용하여 발색시키고, 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 측정하였다. N말단 단편에 결합하는 항체(즉, M6B1, M19B11 및 M18D4)와 C말단 단편에 결합하는 항체(즉, M3C11, M13B3 및 M3B8)을 재조합하여 5종류의 샌드위치 ELISA시스템을 구축하였다. 어느 재조합도 분비형 GPC3을 이용한 스탠다드 유선에서는 동등한 감도를 나타내었다. HepG2의 배양상등액을 이용하여 평가한 결과, N말단 단편에 결합하는 항체의 재조합으로 1μg/mL 정도와 고농도로 분비형 GPC3이 검출되었다(참조: 도 4). C말단에 결합하는 항체의 재조합에서는 검출농도가 낮았기 때문에, 분비형 GPC3에서는 N말단 단편이 우위하게 존재한다고 생각되었다.
다음으로, 항 GPC3 항체를 이용하여 HEPg2의 배양상등액의 면역침강을 행하고, 분비형 GPC3을 검출하였다. N말단 단편에 결합하는 M10D2를 이용한 경우, 40kDa의 분비형 GPC3이 검출되었다(참조: 도 5). 이에 반하여, C말단 단편에 결합하는 M1E7을 이용한 경우, 분비형 GPC3은 검출되지 않았다. 수득한 전 GPC3 항체에 대하여 면역침강실험을 한 결과, N말단 단편에 결합하는 모든 항체는 분비형 GPC3을 강하게 검출하고, C말단 단편에 결합하는 항체에서는 검출되지 않는지, 약하게 검출되었다(참조: 도 16). 면역침강에 의하여 분비형 GPC3을 검출할 수 있는 항체는 간세포암의 진단용 항체로 유용하다고 생각된다. 또한, 분비형 GPC3을 검출하기 어려운 항체는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지는 치료용 항체로 개발하는데 있어서, 혈액중의 분비형 GPC3에 트랩(trap)되지 않고, 간세포암으로 이행할 수 있다는 점에서 유용하다고 생각되었다.
실시예 13
항 GPC3 항체 가변영역의 클로닝
항 GPC3 항체 생산 하이브리도마에서 추출된 Total RNA를 이용하여, 항 GPC3 항체 가변영역을 RT-PCR법에 따라 증폭시켰다. Total RNA는 RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN사 제품)를 이용하여, 1 x 107 세포의 하이브리도마에서 추출하였다. 1μg의 Total RNA를 사용하여, SMART RACE cDNA Amplification Kite(CLONTECH사 제품) 및 이하의 합성 올리고뉴클레오티드을 이용하여, 5' 말단측 유전자단편을 증폭시켰다.
마우스 IgG1 보존영역서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG1 : GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG(서열번호 7);
마우스 IgG2a 보존영역서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2a: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(서열번호 8);
마우스 IgG2b 보존영역서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2b: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATC(서열번호 9); 또는,
마우스 κ사슬 보존영역염기서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 kappa: GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(서열번호 10).
역전사반응(reverse transcription reaction)은 42℃에서 1시간 30분동안 반응하였다. PCR 용액 50μL은 5μL의 10 x Advantage 2PCR Buffer, 5μL의 10 x Universal Primer A Mix, 0.2mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), 1μL의 Advantage 2 Polymerase Mix(이상, CLONTECH사 제품), 2.5μL의 역전사반응산물, 10 pmole의 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG1, MHC-IgG2a, MHC-IgG2b 또는 kappa를 함유하였다. PCR은 94℃의 초기온도에서 30초간, 그리고 94℃에서 5초간, 72℃에서 3분간의 사이클을 5회 반복하고, 94℃에서 5초간, 70℃에서 10초간, 72℃에서 3분간의 사이클을 5회 반복하며, 또한, 94℃에서 5초간, 68℃에서 10초간, 72℃에서 3분간의 사이클을 25회 반복하였다. 마지막으로, 반응산물을 72℃에서 7분간 가열하였다. 각 PCR 산물은 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 이용하고, 아가로스 겔로 정제한 후, pGEM-T Easy 벡터(Promega사 제품)에 클로닝하여, 염기서열을 결정하였다.
M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2 및 L9G11의 H사슬 가변영역의 염기서열을 각각 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21에, 아미노산 서열을 각각 서열번호 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32에, L사슬 가변영역의 염기서열을 서열번호 33, 34, 35, 36, 37 38, 39, 40, 41, 42 및 43에, 아미노산 서열을 각각 서열번호 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 및 54에 나타내었다.
실시예 14
GST 융합단백질을 이용한 에피토프 분류
C말단 단편에 결합하는 항체에 대해서는 에피토프의 상세한 해석을 하기 위하여, 단계적으로 짧게 한 GPC3의 C말단 단편펩티드와 GST의 융합단백질 GC-1(Ser 495 내지 Lys563), GC-2(Gly510 내지 Lys563), GC-3(Ala524 내지 Lys563), GC-4(Gly537 내지 Lys563) 및 GC-5(Ser550 내지 Lys563)를 제조하였다. GPC3의 C말단영역을 pGEX-4T-3(Amersham사 제품)에 클로닝하고, GST의 C말단측에 GPC3의 C말단영역을 연결한 플라스미드 DNA를 구축하였다. 플라스미드 DNA를 DH5α에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 대수증식기(logarithmic growth phase)에 있는 형질전환체의 배양물에 1mM가 되도록 IPTG를 첨가하여, GST 융합단백질의 발현을 유도하고, 2시간 배양후에 균체를 회수하였다. 초음파 처리에 의해 파쇄된 후, XL-80 초원심분리기(Beckman, 로터 70.1 Ti)를 이용하여 35,000rpm에서 30분 원심후의 배양상등액을 회수하고, GST Purification Modules(Amersham사 제품)를 이용하여 정제하였다. 이와 같이 정제한 GST 융합단백질을 환원조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 항 GPC3항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅하였다(참조: 도 6). M3C11 및 M1E7은 GC-1과 GC-2를 검출하고, GC-3, GC-4 및 GC-5를 검출하지 않았다. 이들 항체의 에피토프는 GC-2의 영역에 포함되어 있고, GC-3의 영역에서는 불충분한 영역이라 하겠다. M3B8 및 M11F1은 GC-1, GC-2, GC-3 및 GC-4를 검출하고, GC-5를 검출하지 않았다. 이들 항체의 에피토프는 GC-4의 영역에 포함되어 있고, GC-5의 영역에서는 불충분한 영역이라 하겠다. 각 항체의 결합할 수있는 GST 융합단백질의 최소영역에 대하여 도 16의 웨스턴 블럿팅의 항에 기재하였다.
실시예 15
항 GPC3 마우스-사람 키메라항체의 제조
항 GPC3 항체의 H사슬 및 L사슬 가변영역서열을 사람 IgG1 및 κ사슬 보존영역서열에 연결하였다. 각 항체의 H사슬 가변영역의 5' 말단측 염기서열에 상보적으로 코작서열(Kozak sequence)을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드 및 NheI 부위를 가지는 3' 말단측 염기서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR을 행하고, 수득된 PCR 산물을 사람 IgG1 보존영역이 pBluescript KS(+)벡터(Toyobo사 제품)에 삽입되어 있는 pB-CH벡터에 클로닝하였다. NheI 부위에 따라, 마우스 H사슬 가변영역과 사람 H사슬(γ1사슬) 보존영역이 연결되어 있다. 제조된 H사슬 유전자단편을 발현벡터 pCXND3에 클로닝하였다. 또한, 각 항체의 L사슬 가변영역의 5' 말단측 염기서열에 상보적으로 코작서열을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR을 행하고, 수득된 PCR 산물을 사람 kappa사슬 보존영역이 pBluescript KS(+)벡터(Toyobo사 제품)에 삽입되어 있는 pB-CL벡터에 클로닝하였다. BsiWI 부위에 따라, 사람 L사슬 가변영역과 보존영역이 연결되어 있다. 제조된 L사슬 유전자단편을 발현벡터 p-UCAG 클로닝하였다. 본 벡터 p-UCAG는 pCXN(참조: Niwa 등,「Gene」(1991), 108, p193-p200)을 제한효소 BamHI에서 소화시켜 수득된 2.6kbp의 단편을 pUC19벡터(Toyobo사 제품)의 제한효소 BamHI 부위에 연결하여 클로닝한 벡터이다.
항 GPC3 마우스-사람 키메라항체 발현벡터를 제조하기 위하여, L사슬 유전자단편이 삽입된 pUCAG벡터를 제한효소 HindIII(Takara Shuzo사 제품)에서 소화시켜 수득된 유전자 단편을 H사슬 유전자가 삽입된 pCXND3의 제한효소 HindIII 절단부위에 연결하여 클로닝하였다. 본 플라스미드는 동물세포내에서 네오마이신 내성유전자(neomycin-resistance gene), DHFR 유전자 및 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체 유전자를 발현시킨다.
항체를 안정하게 발현시키는 CHO 세포(DG44주)의 제조는 다음과 같이 수행하였다. Gene PulserII(Bio Rad사 제품)을 이용한 전기천공법(electroporation)에 따라 세포에 유전자를 도입시켰다. 25μg의 각 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체 발현벡터와 PBS에 현탁된 CHO 세포(1 x 107세포/ml)의 0.75ml를 혼합시킨 것을 얼음 위에서 10분간 냉각시키고, 큐벳(cuvette)에 옮긴 후에 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스(pulse)를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간후, 전기천공 처리된 세포를 HT supplement(Invitrogen사 제품)를 1배 농도로 포함하는 CHO-S-SFMII 배지(Invitrogen사 제품) 40mL에 현탁시켰다. 동일한 배지에서 50배 희석용액을 조제하여, 96웰 배양용 플레이트에 100μl/웰에서 분주하였다. CO2 인큐베이터(5% CO2)에서 24시간 배양후, Geneticin(Invitrogen사 제품)을 0.5mg/mL이 되도록 첨가하고 2주간 배양하였다. Geneticin 내성을 나타내는 형질전환세포의 콜로니가 관찰된 웰의 배양상등액안을 추출하고, IgG 양에 대해서 이하에 나타내는 농도정량법으로 측정하였다. 고생산세포주(high-producing cell line)를 순차적으로 확대 배양하고, 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체 안정발현세포주를 수득하여, 대량 배양을 행하고 배양상등액을 수득하였다. 각 항 GPC3 마우스-사람 키메라항체의 정제는 Hi Trap ProteinG HP(Amersham사 제품)를 사용하였다.
실시예 16
보족체 (complement) 의존성 세포독성( CDC 활성)의 측정
16. 1 사람 알부민ㆍ 베로날 ㆍ완충용액(human albumin veronal buffer, HAVB )의 제조
NaCl(특급, 와코준야쿠코교주식회사) 12.75g, Na-바르비탈(Na-Barbital)(특 급, 와코준야쿠코교주식회사) 0.5625g 및 바르비탈(특급, 와코준야쿠코교주식회사) 0.8625g을 밀리-Q(milli-Q) 물에 용해시켜, 200mL로 한 다음, 오토클레이브(autoclave) 처리(121℃, 20분간)하였다. 오토클레이브 처리한 100mL의 뜨거운 밀리-Q 물을 가하여, pH 7.43을 확인하였다(추천: pH 7.5). 이를 5 x 베로날 완충용액으로 사용하였다. CaCl2ㆍ2H2O(특급, 준세이카가쿠주식회사) 0.2205g을 50mL 밀리-Q 물에 CaCl2 용액의 최종농도 0.03mol/L로 용해시켰다. MgCl2ㆍ6H2O(특급, 준세이카가쿠주식회사) 1.0165g을 50mL 밀리-Q 물에 MgCl2 용액의 최종농도 0.1mol/L로 용해시켰다. 5 x 베로날 완충용액 100mL, 사람혈청 알부민(25% 알부민염(buminate)(등록상표)), 사람혈청 알부민농도 250mg/mL, 백스터주식회사) 4mL, CaCl2 용액 2.5mL, MgCl2 용액 2.5mL, KCl(특급, 준세이카가쿠주식회사) 0.1g, 글루코스(glucose)(D(+)-글루코스, 포도당무수(anhydrous glucose), 특급, 와코준야쿠코교주식회사) 0.5g을 밀리-Q 물에 HAVB의 500mL으로 용해시켰다. 여과 멸균후, 설정온도 5℃에서 보존하였다.
16. 2 표적세포의 조제
실시예 4에서 제조된 전장 사람 GPC3 발현 CHO 세포는 10% FBS와 0.5mg/mL Geneticin(GIBCO사 제품)을 첨가한 α-MEM 핵산 (+) 배지(GIBCO사 제품)에서 배양하고, 세포박리용 완충액(cell dissociation buffer)(Invitrogen사 제품)을 이용하 여 디쉬(dish)로부터 박리시키고, 96웰 평저(平底) 플레이트(Falcon사 제품)의 각 웰에 1 x 104세포/웰로 분주하고, 3일간 배양하였다. 배양후, 5.55MBq의 클론-51을 가하여, 5% CO2인큐베이터에서 37℃로 1시간 배양하고, 이 세포를 HAVB에서 2회 세정하고 50μL의 HAVB를 가하여 표적세포로 사용하였다.
16. 3 크롬유리실험( Chromium release test )( CDC 활성)
각 키메라 항체를 HAVB로 희석시키고, 40μg/mL의 항체용액으로 사용하였다. 표적세포에 항체용액을 50μL씩 첨가하고, 얼음 위에서 15분간 방치시켰다. 계속해서, 각 웰에 HAVB로 희석시킨 건장한 지원자의 말초혈액(peripheral blood) 유래의 사람 혈청을 최종농도 25%가 되도록 100μL씩 첨가하고(항체의 최종농도 10μg/mL), 5% CO2인큐베이터에서 37℃로 90분간 정치하였다. 플레이트를 원심분리한 후, 각 웰에서 상등액을 100μL씩 회수하고, 감마카운터로 방사활성을 측정하였다. 하기식으로부터 특이적 크롬유리율(specific chromium release)을 구하였다:
특이적 크롬유리율(%) = (A-C) x 100/(B-C)
상기 식에서, A는 각 웰에서의 방사활성(cpm), B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet P-40, Code No. 252-23, 나카라이테스크주식회사)을 100μL, HAVB를 50μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 HAVB를 150μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 실험은 3번씩 반복적으로 행하여, CDC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 9종류의 항 GPC3 키메라 항체 중, C말단 인식항체인 M3B8 및 M11F1이 GPC3 발현 CHO 세포에 대하여 강한 CDC 활성을 나타낸 것에 대해, 그 다른 항체에서는 CDC 활성이 인정되지 않았다. M3B8 및 M11F1은 Competition ELISA에서「b」로 칭하는 그룹에 속하고 있으며, 강한 CDC 활성을 나타냄에 중요한 에피토프를 발견할 수 있었다.
실시예 17
사람 말초혈액 유래 PBMC 를 이용한 ADCC 활성의 측정
17. 1 사람 PBMC 용액의 조제
건장한 지원자로부터 헤파린혈액을 첨가한(heparinized peripheral blood) 말초혈액을 PBS(-)에서 2배로 희석시키고, Ficoll-Paque TM PLUS(Amersham사 제품)으로 덮어씌웠다. 이를 원심(500 x g, 30분간, 20℃)한 후, 단핵구 분획(mononuclear leukocyte fraction)인 중간층을 분취하였다. 3회 세정한 후, 10% FBS/RPMI로 현탁하고, 사람 PBMC 용액으로 사용하였다.
17. 2 표적세포의 조제
10% FBS/RPMI1640 배지에서 배양시킨 HepG2 세포를 트립신ㆍEDTA(Invitrogen사 제품)를 이용하여 디쉬로부터 박리시키고, 96웰 U자 바닥 플레이트(96-well U-bottomed plate)(Falcon사 제품)의 각 웰에 1 x 104세포/웰로 분주하고, 2일간 배양하였다. 실시예 4에서 제조된 전장 사람 GPC3 발현 CHO 세포는 10% FBS와 0.5mg/mL Geneticin(GIBCO사 제품)을 첨가한 α-MEM 핵산 (+) 배지(GIBCO사 제품)에서 배양하고, 세포박리용 완충액(Invitrogen사 제품)을 이용하여 디쉬로부터 박리시키고, 96웰 평저 플레이트(Falcon사 제품)의 각 웰에 1 x 104세포/웰로 분주하고, 3일간 배양하였다. 두 세포는 모두 배양후, 각각 5.55MBq의 클론-51을 가하고, 5% 탄산가스인큐베이터에서 37℃로 1시간 배양하여, 이 세포를 배지에서 1회 세정하고 50μL의 10% FBS/RPMI 1640 배지를 가하여 표적세포로 사용하였다.
17. 3 크롬유리실험( ADCC 활성)
표적세포에 각 농도로 조제한 항체용액 50μL를 첨가하고, 얼음 위에서 15분간 반응시킨 후에, 사람 PBMC 용액 100μL(5 x 105세포/웰)을 가하여, 5% CO2인큐베 이터에서 37℃로 4시간 배양하고, 배양후, 플레이트를 원심분리하여 배양상등액 100μL중의 방사활성을 감마카운터로 측정하였다. 하기식으로부터 특이적 크롬유리율을 구하였다:
특이적 크롬유리율(%) = (A-C) x 100/(B-C)
상기 식에서, A는 각 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet P-40, Code No. 252-23, 나카라이테스크주식회사)을 100μL, 10% FBS/RPMI 배지를 50μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 10% FBS/RPMI 배지를 150μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 실험은 3번씩 반복적으로 행하여, ADCC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 9종류의 항 GPC3 키메라 항체 중, C말단 인식항체가 강한 ADCC 활성을 나타내는 경향을 알 수 있었다.
실시예 18
GC -3의 면역 및 하이브리도마의 선발
수득된 항 GPC3 항체 중, M11F1 및 M3B8만이 강한 CDC 활성을 나타내었기 때문에, CDC 활성에는 에피토프 의존성이 있음을 알 수 있었다. ADCC 활성, CDC 활 성을 겸비한 항체의 수득을 목적으로 하고, M11F1 및 M3B8의 에피토프를 포함하는 GST 융합단백질인 GC-3을 이용하여 면역하였다. GC-3은 상기 방법에 따라 대량으로 정제하고, Superdex 75(Amersham사 제품)를 이용하여 겔 여과를 행하고, 완충용액을 PBS로 치환한 것을 면역단백질로 사용하였다. Balb/c(일본 챨스ㆍ리버사에서 구입) 3마리, MRL/lpr 3마리를 상기 방법에 따라 GC-3으로 면역시켰다. 초회면역에는 GC-3을 100μg/head가 되도록 조제하고, FCA를 이용하여 에먼젼화한 것을 피하에 투여하였다. 2주 후에 50μg/head가 되도록 조제한 것을 FIA에서 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 5회 면역한 후, 모든 마우스에 대하여 최종면역(50μg/head)을 꼬리정맥내에 수행하였다. 세포융합을 행하여, 가용형 GPC3 코어단백질을 고상화한 임뮤노플레이트를 이용한 ELISA에 의하여 스크리닝하였다. 양성 클론에 대해서는 한계희석법에 따라 모노클론화하였다. 그 결과, GPC3에 대하여 강한 결합활성을 가지는 항체를 5클론(즉, GC199, GC202, GC33, GC179 및 GC194)을 수득하였다.
하이브리도마의 배양상등액에서 Hi Trap ProteinG HP를 이용하여 항체를 정제하고, 상기 방법에 따라 해석하였다. 가용형 GPC3 코어단백질을 고상화한 임뮤노플레이트를 이용한 ELISA에 의하여 EC50 값을 산출하고, 플로우사이토메트리에 의하여 5μg/mL에서의 히스토그램의 X-mode 값을 측정하였다(참조: 도 17). 경합 ELISA에 의한 에피토프 분류의 결과, b에 속하는 것(GC199, GC202 및 GC33)과 새로운 에피토프 그룹 f(GC179 및 GC194)로 분류되었다. GST 융합단백질을 이용한 에피토프 분류의 결과, GC199, GC202 및 GC33은 GC-1, GC-2, GC-3 및 GC-4를 검출하 고, GC-5를 검출하지 않았다. 이들 항체의 에피토프는 M11F1 및 M3B8의 에피토프와 동일하게, GC-4의 영역에 포함되어 있으며, GC-5의 영역에서는 불충분한 영역이라 하겠다. 한편, GC179 및 GC194는 GC-1, GC-2 및 GC-3을 검출하고, GC-4 및 GC-5를 검출하지 않았다. 이들 항체의 에피토프는 GC-3의 영역에 포함되어 있으며, GC-4의 영역에서는 불충분한 영역이라 하겠다. 각 항체의 결합할 수 있는 GST 융합단백질의 최소영역에 대하여, 도 17의 웨스턴 블럿팅의 항에 기재되어 있다.
GC199, GC202, GC33, GC179 및 GC194에 대하여 상기 방법에 따라, H사슬, L사슬의 가변영역을 클로닝하고, 서열을 결정하였다. GC194의 L사슬에 대해서는 2종류의 서열이 클로닝되었다. GC199, GC202, GC33, GC179 및 GC194의 H사슬 가변영역의 염기서열을 각각 서열번호 55, 56, 57, 58 및 59로, 아미노산 서열을 각각 서열번호 60, 61, 62, 63 및 64로 나타낸다. GC199, GC202, GC33, GC179, GC194(1) 및 GC194(2)의 L사슬 가변영역의 염기서열을 각각 서열번호 65, 66, 67, 68, 69 및 70으로, 아미노산 서열을 각각 서열번호 71, 72, 73, 74, 75 및 76으로 나타낸다.
또한, 이들의 아미노산 서열을 공지된 항체의 아미노산 서열의 데이터베이스와 비교해서 상동성을 조사하여, CDR 영역을 이하 표 2와 같이 결정하였다.
Figure 112006014937082-pct00004
Figure 112006014937082-pct00005
실시예 19
마우스 골수유래 효과기 세포를 이용한 ADCC 활성의 측정
19. 1 마우스 골수유래 효과기 세포용액의 조제
SCID 마우스(일본 CLEA사, 수컷, 10주령)의 대퇴골로부터 골수세포를 채취해서, 10% FBS/RPMI 1640 배지중 5 x 105개/mL이 되도록 현탁하고, 마우스 GM-CSF(PeproTech사) 및 사람 IL-2(PeproTech사)를 각각 10ng/mL, 50ng/mL이 되도록 첨가하여, 5% CO2인큐베이터에서 37℃로 5일간 배양하였다. 배양후, 스크레퍼(scraper)로 벗겨 배지에서 1회 세정하고, 10% FBS/RPMI 1640 배지중 5 x 106/mL이 되도록 현탁하여, 마우스 골수유래 효과기 세포용액으로 사용하였다.
19. 2 표적세포의 조제
사람의 간암세포주 HuH-7은 10% FBS(ThermoTrace사 제품)를 포함하는 DMEM 배지(SIGMA사 제품)에서 유지계대하고, 세포박리용 완충용액(Invitrogen사 제품)를 이용하여 디쉬로부터 박리시키고, 96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사 제품)의 각 웰에 1 x 104세포/웰로 분주하고, 1일간 배양하였다. 배양후, 5.55MBq의 크롬-51을 가하여, 5% CO2인큐베이터에서 37℃로 1시간 배양하고, 이 세포를 배지에서 1회 세정하여, 50μL의 10% FBS/RPMI 1640 배지를 가하여 표적세포로 사용하였다.
19. 3 크롬유리실험( ADCC 활성)
표적세포에 각 농도로 조제된 항체용액 50μL를 첨가하고, 얼음 위에서 15분 반응시킨 후에, 마우스 골수유래 효과기 세포용액 100μL(5 x 105세포/웰)을 가하여, 5% CO2인큐베이터에서 37℃로 4시간 배양하고, 배양후, 플레이트를 원심분리하여 배양상등액 100μL 중의 방사활성을 감마카운터로 측정하였다. 하기 식으로부터 특이적 크롬유리율을 구하였다:
특이적 크롬유리율(%) = (A-C) x 100/(B-C)
상기 식에서, A는 각 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet P-40, Code No. 252-23, 나카라이테스크주식회사)을 100μL, 10% FBS/RPMI 배지를 50μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 10% FBS/RPMI 배지를 150μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 실험은 3번씩 행하여, ADCC 활성(%)에 대하여 평균치 및 표준편차를 산출하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다. GC33 항체는 0.1μg/mL 이상의 항체농도에서 ADCC 활성을 나타내고, GC199 항체와 비교해서 강한 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 20
GC33 항체의 사람 간암이식 마우스모델에 대한 항종양 활성
20. 1 사람 간암이식 마우스모델의 제조
사람 간암세포주 HuH-7은 DMEM 배지와 MATRIGEL(BD Bioscience사 제품)을 1:1로 포함하는 용액으로 5 x 107개/mL이 되도록 조제하였다. 전날에 항 아시아로 GM1 항체(anti-asialo GM1 antibody)(와코준야쿠사 제품, 1 바이알(vial)을 1mL의 주사용 증류수에서 용해시킨 후, 4mL의 생리적 식염수를 첨가) 100μL을 복강내에 투여한 SCID 마우스(수컷, 5주령)(일본 CLEA사)의 복부피하에 상기 세포현탁액 100μL(5 x 106개/마우스)을 이식하였다.
20. 2 항체조제 및 투여
사람 간암이식 마우스모델에 대하여, 투여 당일에 PBS(-)로 0.5mg/mL(5mg/kg 투여군) 및 0.1mg/mL(1mg/kg 투여군)이 되도록 조제한 항체용액을 세포이식후 20일째부터 주에 1회, 3주간 10mL/kg으로 꼬리정맥에 투여하였다. 음성 대조군으로 PBS(-)(Vehicle)를 동일하게 주에 1회, 3주간 10mL/kg으로 꼬리정맥에 투여하였다. 두 군(群) 모두 각각 6마리로 수행하였다.
20. 3 항종양 효과의 평가
GC33 항체의 사람 간암이식 마우스모델에서의 항종양 효과에 대해서는 종양체적(tumor weight)의 경시적 변화 및 최종투여일로부터 1주간후의 종양 중량으로 평가하였다. 종양체적은 하기 식으로부터 산출하였다:
종양체적 = 장경(major axis) x 단경(minor axis) x 단경(minor axis)/2
그 결과, 도 10에 보여지는 바와 같이, GC33 항체 투여군에서는 Vehicle 투여군과 비교해서 유의한 종양증식이 억제되는 것을 알 수 있었다.
이상과 같이, GC33 항체가 사람 간암이식 마우스모델에 대하여, 항종양 효과를 가짐을 나타내었다.
실시예 21
GC33 마우스-사람 키메라항체의 제조
GC33의 H사슬 및 L사슬은 5' 말단측 염기서열에 상보적으로 코작서열, HindIII 부위를 가지는 합성 올리고뉴클레오티드, 및 3' 말단측 염기서열에 상보적으로 BamHI 부위를 가지는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의하여 증폭되었다. 수득된 PCR 산물을 HindIII 및 BamHI 처리후, 사람 IgG1 보존영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgγ1, 및 사람의 κ사슬 보존영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgκ로 클로닝하였다(참조: Sato 등,「Mol Immunol.」(1994), p371-p381). 상기 방법에 따라, CHO 세포(DG44주)로 도입하여 안정발현 세포주를 수립하였다. 배양상등액에서 Hi Trap ProteinG HP(Amersham사 제품)를 이용하여 항체를 정제하였다. 배양상등액 중의 IgG 농도의 측정은 염소 항-사람 IgG(goat anti-human IgG)(BIOSOURCE사 제품)와 염소 항-사람 IgG 알칼리포스파타제 콘쥬게이트(goat anti-human IgG alkaline phosphatase conjugate)(BIOSOURCE사 제품)를 이용한 사람 IgG 샌드위치 ELISA를 행하고, 시판되는 정제의 사람 IgG(Cappel사 제품)와 비교하여 정량하였다.
실시예 22
GC33 마우스-사람 키메라항체를 이용한 CDC 활성, ADCC 활성의 측정
실시예 16 및 17에 기재된 방법에 따라, GC33, M3C11 및 M1E7 마우스-사람 키메라항체의 CDC 활성 및 ADCC 활성을 측정하였다. 표적세포로서, CDC 활성은 전장 GPC3 발현 CHO 세포를, ADCC 활성은 HepG2를 각각 이용하였다. 각각의 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다. 어느 실험계에서도 GC33은 다른 2 항체와 비교해서 강한 CDC 활성 및 ADCC 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 23
GC33 의 에피토프 해석
GC33에 대해서는 에피토프를 상세하게 결정하기 위하여, 짧은 GPC3의 C말단 펩티드와 GST의 융합단백질을 제조하여, 웨스턴 블럿팅으로 해석하였다. 제조된 GST 융합단백질에 포함되는 GPC3 유래 펩티드서열을 도 13에 나타내었다. GC33은 GC-4(aa 537-563)에 결합하고, GC-5(aa 550-563)에 결합할 수 없으므로, 에피토프가 aa 537-550의 영역을 적어도 일부 포함하는 영역이라고 생각할 수 있다. 우선, GC-6(G N S Q Q A T P K D N E I S(서열번호 93)), GC-7(G N S Q Q A T P(서열번호 94)), GC-8(Q Q A T P K D N(서열번호 95)) 및 GC-9(T P K D N E I S(서열번호 96))를 제조하였다. 5' 말단에 EcoRI, 3' 말단에 SalI 인식서열의 절단 단편이 부가되도록 설계한 정방향 올리고(forward oligo) DNA와 역방향 올리고(reverse oligo) DNA를 제조하였다. 올리고 DNA는 에스펙 올리고 주식회사(Espec Oligo Service)에 합성을 위탁하고, C-18 카트리지로 정제하여, 5' 말단 인산화된 것을 사용하였다. 10μM의 정방향 올리고 DNA 25μL과 10μM의 역방향 올리고 DNA 25μL을 혼합하고, 94℃에서 5분간 반응후, 37℃에서 10분간, 실온에서 15분간 반응시킨 다음, 4℃에서 10분 방치하여, 정방향 올리고 DNA와 역방향 올리고 DNA를 아닐링시켰다. 흡광도 측정에 의하여 농도를 결정한 후, 인서트(insert): 벡터의 몰비가 3:1이 되도록 EcoRI 및 SalI 처리한 pGEX4T-3에 클로닝하였다. 염기서열을 확인한 후, 상기 방법에 따라, GST 융합단백질을 조제하고, Glutathione Sepharose 4B를 이용하여 정제하였다. 이를 환원조건하에서 SDS-PAGE에 의하여 분리하고, GC33을 이용하는 웨스턴 블럿팅에 의하여 해석되었다. 어느 GST 융합단백질도 강하게는 검출할 수 없고, GC33에 의한 결합은 더욱 C말단측의 서열이 필요하다는 것을 알 수 있었다(참조: 도 14). 따라서, GC-11(A T P K D N E I S T(서열번호 97)), GC-12(P K D N E I S T F H(서열번호 98)), GC-13(D N E I S T F H N L(서열번호 99)) 및 GC-14(E I S T F H N L G N(서열번호 100))를 제조하여 동일하게 평가한 결과, GC-11, GC-12 및 GC-13이 GC33에 의하여 강하게 결합되었다. 이 결과에서, GC33은 GPC3의 C말단 544번째 내지 553번째의 서열(P K D N E I S T F H)내에 그 에피토프가 존재함을 알 수 있었다.
실시예 24
GC33 의 인간화
공지된 Kabat Database(참조: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/), 및 ImMunoGeneTics Database(IMGT)에서 항체의 서열 데이터를 입수하고, H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역으로 나누어 호몰로지(homology) 검색을 수행하였다. 그 결과, H사슬 가변영역은 DN13(참조: Smithson 등,「Mol. Immunol.」(1999), 36, p113-p124)과 높은 상동성을 가지는 것을 알아내었다. 또한, L사슬 가변영역은 Accession number AB064105의 homo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clon: K64와 높은 상동성을 가지는 것을 알아내었다. 또한, L사슬의 신호서열에 대해서는 AB064105와 상동성이 높은 Accession Number S40357의 신호서열을 이용하였다. 이들의 사람 항체의 프레임워크 영역(이하, FR)에 GC33의 상보성 항원결정영역(complementarity determining region)(이하, CDR)을 이식하여, 인간화 항체를 제조하였다.
구체적으로는, 50base 정도의 합성 올리고 DNA를 약 20base 정도 혼성화되도록 설계하고, 이들의 합성 올리고 DNA를 PCR법에 의하여 혼성화시킨 각 가변영역을 암호화하는 유전자를 제조하였다. 5' 말단의 합성 올리고 DNA의 말단에 삽입된 HindIII 부위, 및 3' 말단의 합성 올리고 DNA의 말단에 삽입된 BamHI 부위에서 절단하고, 사람 IgG1 보존영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgγ1, 사람 κ사슬 보존영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgκ에 클로닝하였다(참조: Sato 등,「Mol Immunol.」(1994), p371-p381). 이와 같이 제조된 인간화 GC33은 H사슬, L사슬을 각각 ver.a라고 명명하였다. H사슬, L사슬과 함께 ver.a의 인간화 GC33(ver.a/ver.a)은 마우스 GC33 가변영역의 항체(mouse/mouse)와 비교해서 결합활성이 낮았다(참조: 도 15). H사슬과 L사슬에 대하여 마우스 GC33 서열과 ver.a 서열을 키메라로 재조합한 항체(mouse/ver.a, ver.a/mouse)를 제조하여 결합활성을 평가한 결과, ver.a/mouse에서 결합활성의 저하가 인정되었으며, 아미노산 치환에 의한 결합활성의 저하는 H사슬에 기인함을 알 수 있었다. 따라서, H사슬의 개변체 ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k를 제조하였다. 이들 모두의 인간화 GC33은 마우스 GC33 가변영역을 가지는 키메라 항체와 동등한 결합활성을 나타내었다(참조: 도 15). 인간화 GC33 H사슬 가변영역 ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k의 염기서열을 서열번호 77, 78, 79, 80, 81, 82 및 83에, 아미노산 서열을 서열번호 84, 85, 86, 87, 88, 89 및 90에 나타낸다. 인간화 GC33 L사슬 가변영역 ver.a의 염기서열을 서열번호 91에, 아미노산 서열을 서열번호 92에 나타낸다. 인간화 GC33 H사슬 가변영역 ver.i, ver.j, ver.k에서는 6번째의 글루타민산이 글루타민으로 치환되어 있지만, 이들 항체는 열 안정성이 현저하게 증가되고 있었다.
실시예 25
인간화 GC33 L사슬의 개변
단백질의 탈아미드화에 대해서는, 1차 서열 의존적인 탈아미드화의 반응속도정수가 알려져 있으며, Asn-Gly가 특히 탈아미드화하기 용이한 서열로서 알려져 있다(참조: Rocinson 등,「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」(2001), 98, p944-p949). 서열번호 91에 나타나는 인간화 GC33 L사슬 ver.a 가변영역의 CDR 1 내에 있는 Asn33에 대해서는, 1차 서열이 Asn-Gly인 것이므로, 탈아미드화가 용이하게 일어나기 쉬운 서열인 것이 예상되었다.
Asn33의 탈아미드화에 의한 결합활성에 대한 영향을 평가하기 위하여, Asn33을 Asp로 치환한 개변항체를 제조하였다. 점돌연변이(point mutation)의 도입에는 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene사 제품)를 사용하였다. 즉, 125ng의 센스프라이머(CTT GTA CAC AGTGAC GGA AAC ACC TAT: 서열번호 172), 125ng의 안티센스프라이머(ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: 서열번호 173), 5μL의 10 x reaction buffer, 1μL의 dNTP mix, 10ng의 인간화 GC33 L사슬 ver.a가 클로닝된 HEFgκ, 1μL의 Pfu Turbo DNA 중합효소를 포함하는 50μL의 반응용액을 이용하여, 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 9분으로 구성된 사이클을 12회의 PCR을 수행하였다. 그 후, 제한효소 DpnI를 가하여 37℃에서 2시간 처리한 것을 킷트에 첨부된 XL1-Blue 컴피턴트(competent) 세포에 도입하여 형질전환을 수득하였다. 바르게 개변 도입된 클론에 대하여, 가변영역을 추출하고, 재차 HEFgκ에 클로닝을 행하였다. 이를 인간화 GC33 H사슬 ver.k가 클로닝된 HEFgγ1과 함께 Fugene 6(Roche사 제품)을 이용하여 COS7 세포에 도입하고, 일과성(transient) 발현시킨 항체를 배양상등액으로부터 회수하였다. 항 사람 IgG 항체를 이용한 샌드위치 ELISA에 의하여 항체농도를 정량하고, 가용형 GPC3 코어단백질을 고상화한 임뮤노플레이트를 이용한 ELISA에 의하여 개변항체의 결합활성을 평가하였다. 도 18에 보여지는 바와 같이 Asn33을 Asp로 치환한 개변항체(N33D)에서는 결합활성이 소실되고 있으며, Asn33에서 탈아미드화가 일어난 경우, 결합활성에 주는 영향은 크다고 생각할 수 있다.
Asn33의 탈아미드화를 억제하는 방법으로서, Gly34를 다른 아미노산에 개변하는 방법이 보고되어 있다(참조: WO03/057881 A1). 상기 방법에 따라, Quick Change Site-Diected Mutagenesis Kit를 이용하여, Gly34를 Cys, Met을 제외한 다른 17 아미노산으로 치환하고, 일련의 개변항체 G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S 및 G34T를 제조하였다. 이를 COS7 세포에서 일과성 발현시키고, 그 배양상등액을 이용하여 결합활성을 평가하였다. 그 결과, Pro(G34P), Val(G34V) 이외에서는 G34를 다른 아미노산으로 치환하여도 결합활성이 유지되고 있음을 알 수 있었다.
상술한 개변항체의 경쇄 CDR 1의 아미노산 서열을 각각의 서열번호 174(G34A), 서열번호 175(G34D), 서열번호 176(G34E), 서열번호 177(G34F), 서열번호 178(G34H), 서열번호 179(G34N), 서열번호 180(G34T), 서열번호 181(G34Q), 서열번호 182(G34I), 서열번호 183(G34K), 서열번호 184(G34L), 서열번호 185(G34S), 서열번호 186(G34W), 서열번호 187(G34Y), 서열번호 188(G34R), 서열번호 189(G34V) 및 서열번호 190(G34P)으로 기재하였다. 또한, 상술한 개변항체의 경쇄가변영역의 아미노산 서열을 각각의 서열번호 191(G34A), 서열번호 192(G34D), 서열번호 193(G34E), 서열번호 194(G34F), 서열번호 195(G34H), 서열번호 196(G34N), 서열번호 197(G34T), 서열번호 198(G34Q), 서열번호 199(G34I), 서열번호 200(G34K), 서열번호 201(G34L), 서열번호 202(G34S), 서열번호 203(G34W), 서열번호 204(G34Y), 서열번호 205(G34R), 서열번호 206(G34V) 및 서열번호 207(G34P)로 기재하였다.
실시예 26
전장 사람 GPC3 발현 사람 간암세포주(SK-03)의 제조
항 GPC3 항체의 생물활성 평가용의 세포주를 수득하기 위하여, 전장 GPC을 발현시키는 사람 간암세포주를 수립하였다.
PvuI로 처리한 1μg의 전장 사람 GPC3 유전자 발현벡터를 2μL의 FuGENE(Roche사 제품)과 혼합하고, 복합체를 형성시킨 후에, SK-HEP-1 세포(ATCC에서 구입)에 첨가하여, 유전자를 도입하였다. CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 최종농도 1mg/mL의 Geneticin 및 10% FBS를 포함하는 듈베코 MEM(Dulbecco's MEM)(D-MEM, SIGMA사 제품)을 이용하여, GPC3 발현주를 선별하였다. 수득된 Geneticin 내성 콜로니를 모아, 한계희석법에 의하여 세포의 클로닝을 행하였다. 각각의 세포 클론의 사람 GPC3의 발현은 키메라 GC33 항체와 FITC 표지 염소 항-사람 IgG 항체(ICN사)를 이용한 플로우사이토메트리에 의하여 확인하고, 안정발현세포주 SK-03을 수득하였다.
실시예 27
마우스-사람 키메라항체를 이용한 CDC 활성 및 ADCC 활성의 비교
실시예 22에서 나타낸 GC33, M3C11 및 M1E7 마우스-사람 키메라항체의 CDC 활성 및 ADCC 활성을 직접 비교하는 목적으로, 3항체의 ADCC, CDC 활성의 측정을 동일실험계로 실시예 16 및 17에 기재된 방법에 따라 행하였다. 표적세포로, CDC 활성은 전장 GPC3 발현 CHO 세포를, ADCC 활성은 SK-03을 각각 사용하였다. 각각의 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다. 어느 실험계에서도 GC33은 다른 2항체와 비교해서 강한 CDC 활성 및 ADCC 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
본 발명의 항체는 세포증식억제제, 항암제, 및, 암 진단시약으로서 사용할 수 있다.
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKIKAISHA <120> Anti-Glypican 3 Antibody <130> FP0534/O&P/JP <150> JP2004-203637 <151> 2004-07-09 <160> 207 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c 31 <210> 3 <211> 1743 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60 ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120 ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180 gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240 taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300 aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360 catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420 gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480 atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540 cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600 gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660 aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc 720 aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 780 tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840 gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt 900 ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg 960 cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020 ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct 1080 tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat 1140 gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc 1200 ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc 1260 ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320 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atgaacttcg ggctcacctt gattttcctc gtccttactt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggaccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggatccac tttcagtaac tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcagccatt gatagtaatg gaggtaccac ctactatcca 240 gacactatga aggaccgatt caccatttcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaggtc tgaagacaca gccttttatc actgtacaag acataatgga 360 gggtatgaaa actacggctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1416 <210> 17 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc attaatagta atggaggtac cacctactat 180 ccagacacta tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaagac tcagccttgt attactgtac aagacataat 300 ggagggtatg aaaactacgg ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 18 <211> 1413 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 atggaatcta actggatact tccttttatt ctgtcggtag cttcaggggt ctactcagag 60 gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac ctttactggc tactggatgc gctgggtaaa acagaggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggcgctatt tatcctggaa atagtgatac aacatacaac 240 cagaagttca agggcaaggc caaactgact gcagtcacat ctgtcagcac tgcctacatg 300 gaactcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgttcaag atcgggggac 360 ctaactgggg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tacagccaaa 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca 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tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc ggctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactaactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catctgccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctgac aaatgaggac gctgcggtct atcactgtac aagatcgggg 300 gacctaactg gggggcttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 20 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaactg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctactgga tgcattgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tacttactac 180 aatcaaaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagatcaaat 300 ctgggtgatg gtcactaccg gtttcctgcg tttccttact ggggccaagg gactctggtc 360 actgtctctg ca 372 <210> 21 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaaac ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagagg 120 cctggacaag gccttgaatg gattggtaca attgaccctt ctgatagtga aactcactac 180 aatctacagt tcaaggacac ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtat aagaggcgcc 300 ttctatagtt cctatagtta ctgggcctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 360 actgtctctg ca 372 <210> 22 <211> 463 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Ile Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn 85 90 95 Thr Leu His Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val 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agtgatggaa agacatattt gaattggttg 180 ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa attggactct 240 ggagcccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagt 300 agagtggagg ctgaggattt gggaatttat tattgctggc aaggtacaca ttttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 717 <210> 34 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gatgttgtga tgacccagtc tccactcact ttgtcgatta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttctc actgaaaatc 240 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gtgttga 717 <210> 36 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aactatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaattaatta ttgtctacag tgtgatgagt ttcctccgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca agctggaaat caaa 324 <210> 37 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 38 <211> 705 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 atgagaccct ccattcagtt cctggggctc ttgttgttct ggcttcatgg tgttcagtgt 60 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 120 atcacttgca aggcaagtca ggacattaac aagaatatag tttggtacca acacaagcct 180 ggaaaaggtc ctaggctgct catatggtac acatctacat tacagccagg catcccatca 240 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 300 gaagatattg caacttatta ctgtctacag tatgataatc ttccacggac gttcggtgga 360 ggcaccaaac tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 705 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60 atcacttgca aggcaagtca ggacattaac aagaatataa tttggtacca acacaagcct 120 ggaaaaggtc ctaggctgct catatggtac acatctacat tacagccagg catcccatca 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240 gaagatattg caacttatta ctgtctacag tatgataatc ttccacggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 40 <211> 720 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 atgaggttct ctgctcagct tctggggctg cttgtgctct ggatccctgg atccactgca 60 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcaacttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 180 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 360 tatacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag 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musculus <400> 66 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 67 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 67 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 68 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 68 gatattgtga tgactcagtc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca agtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgaattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa ctcctgattt attggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatat agaataccct 300 ttcacgttcg gcacggggac aaaattggaa ataaaa 336 <210> 69 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 69 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagttatg acatcactta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 70 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 70 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ttccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgttagt tacatgtact ggtaccagca gaagtcagga 120 tcctccccca gactcctgat ttatgacaca 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cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 78 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 78 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 79 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 79 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag 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75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 200 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 200 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 201 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 201 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 202 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 202 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ser Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 203 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 203 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Trp Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 204 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 204 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Tyr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 205 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 205 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 206 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 206 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Val Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 207 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody L chain <400> 207 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Pro Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (42)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 143, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 이하 (1) 내지 (7)의 항체로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 항체:
    (1) 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (2) 서열번호 85에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (3) 서열번호 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열 번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (4) 서열번호 87에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (5) 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (6) 서열번호 89에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
    (7) 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 92에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
  7. 삭제
  8. 제3항 또는 제6항에 있어서,
    인간화 항체(humanized antibody)인 것을 특징으로 하는 항체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제8항에 있어서,
    글리피칸 3에 결합하고, 글리피칸 3을 발현시키는 세포에 대하여 CDC(complement-dependent cytotoxicity) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
  18. 제8항에 있어서,
    글리피칸 3에 결합하고, 글리피칸 3을 발현시키는 세포에 대하여 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제8항에 개시된 항체를 유효성분으로 하는 항암제.
  23. 제 22항에 있어서,
    간세포암을 치료하는 것을 특징으로 하는
    항암제.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 이하 (1) 내지 (15)로 구성된 군(群)으로부터 선택되는 항체:
    (1) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 174, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (2) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 175, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (3) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 176, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (4) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 177, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (5) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 178, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (6) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 179, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (7) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 180, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (8) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 181, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (9) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 182, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (10) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 183, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (11) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 184, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (12) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 185, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (13) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 186, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체;
    (14) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 187, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체; 및,
    (15) 각각의 서열번호 123, 124 및 125에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 중쇄가변영역, 및, 각각의 서열번호 188, 144 및 158에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 가지는 경쇄가변영역을 포함하는 항체.
  30. 삭제
  31. (1) 서열번호 191에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (2) 서열번호 192에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (3) 서열번호 193에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (4) 서열번호 194에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (5) 서열번호 195에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (6) 서열번호 196에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (7) 서열번호 197에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (8) 서열번호 198에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (9) 서열번호 199에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (10) 서열번호 200에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (11) 서열번호 201에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (12) 서열번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (13) 서열번호 203에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (14) 서열번호 204에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및,
    (15) 서열번호 205에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역으로부터 선택되는 경쇄가변영역과, 서열번호 90에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 가지는 항체.
  32. 제29항 또는 제31항에 있어서,
    인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  33. 삭제
  34. 제32항에 있어서,
    글리피칸 3을 발현하는 세포에 대하여 CDC 활성을 가지는 것을 특징으로 하는
    항체.
  35. 삭제
  36. 제32항에 있어서,
    글리피칸 3을 발현하는 세포에 대하여 ADCC 활성을 가지는 것을 특징으로 하는
    항체.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 제32항에 개시된 항체를 유효성분으로 하는 항암제.
  41. 삭제
  42. 제40항에 있어서,
    간세포암을 치료하는 것을 특징으로 하는
    항암제.
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