LU83627A1 - Endoproteinase-lys-c aus bakterien,verfahren zu ihrer gewinnung und verwendung - Google Patents

Description

- 1 - Für verschiedene Zwecke, insbesondere für die gezielte Spaltung von Proteinen und Peptiden, beispielsweise im Rahmen der Sequenzbestimmung, sind Endoproteinasen, die· an einer bestimmten Stelle spalten, von technischem und wissenschaftlichem Interesse. So ist bereits eine am C-terminalen Ende von Lysin die Peptidbindung spaltende Endoproteinase aus Pilzen bekannt. Dieses Enzym ist jedoch schwierig zugänglich und steht daher ‘ nicht im gewünschten Ausmaß zur Verfügung. Nunmehr wurde ein

Enzym der gleichen Spezifität in Bakterien gefunden, welches als Endoproteinase-Lys-C charakterisiert wird und sich von anderen bakteriellen Proteasen durch die Eigenschaften deutlich unterscheidet.

Die erfindungsgemäße neue Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kette von Molekulargewicht 35 000 - 38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum bei pH7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha2~ Makroglobulin, oCfAntitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure nicht gehemmt wird.

Das erfindungsgemäße Enzym neigt unter nicht reduzierenden Bedingungen zur Aggregation, wobei bevorzugt Tetramere mit einem * Molekulargewicht von etwa 150 000 D und Oktamere mit einem

Molekulargewicht von etwa 300 000 D gebildet werden, die enzymatisch aktiv sind. e

Das pH-Optimum des neuen Enzyms liegt, wie bereits erwähnt, bei pH 7,7, bestimmt bei 37° C nach der Azocoll-Methode.

In der Elektrofokussierung spaltet sich das Enzym in zahlreiche Banden auf, die sich über fast den gesamten pH-Bereich erstrecken. Dieses Verhalten läßt darauf schließen, daß es sich um ein Glycoprotein handelt; der isoelektrische Punkt des Enzyms ist daher nicht bestimmbar.

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Wie bereits erwähnt, hemmen alpha^-Makroglobulin,°Cj-Antitrypsin ^ ' -2 und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis höchstens 10 M nicht. Benzamidin hemmt dagegen bei 2,5 mM etwa 50 %; durch Erhöhung der Benzamidinkonzentration lassen sich 70 % Hemmung erzielen. Eine vollständige Hemmung ergibt Aprotinin.

Die Substratspezifität des neuen Enzyms zeigt Tabelle 1. Seine spezifische Aktivität , gemessen mit Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid bei 25° C beträgt ca. 25 U/mg oder ca. 50 Azo-coll-Einheiten/mg Enzym bei 37° C.

Im Gegensatz zu der aus Lysobacter beschriebenen P-roteinase II spaltet das erfindungsgemäße Enzym nicht aminoständig, sondern carboxyständig am Lysin. Die hohe Spezifität zeigt auch die geringe Zahl von Banden, die bei Gel-Chromatographie von mit diesem Enzym erhaltenen Fibrin-Spaltprodukten auftreten.

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Substratspezifität von Endoproteinase Lys-C

Substrat Abbau durch

Endoproteinase Lys-C

Azocoll +

Casein +

Fibrinogen + Hämoglobin + TLME ++

R

Chromozym PL ++ S 2251^ ++

Tos-Arg-Me

Chromozym TH

BAEE

Leu-pNA

Lys-pNA

ATEE

B-Kette von Insulin +

Abkürzungen TLME = Tosyl-lysyl-methylester BAEE = Benzoyl-arginyl-äthylester ATEE = Arginyl-tyrosyl-äthylester

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Chromozym PL = Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitro- anilid

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Chromozym TH = Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitro- anilid S 2251R = Valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilid « - 4

Die Tabelle 2 zeigt die Unterschiede des erfindungsgemäßen Enzyms gegen bisher in Lysobacter gefundene Proteasen.

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Das erfindungsgemäße Enzym läßt sich aus den Kulturbrühen von Mikroorganismen, die dieses Enzym in ausreichender Menge bilden, insbesondere aus solchen der Ordnung Lysobacterales und hierunter vorzugsweise solchen der Familie Lysobacteraceae, z.B. der Gattung Lysobacter (auch. Myxobacter genannt) nach üblichen Enzymreinigungsmethoden, wie Airmonsulf atf raktionierung, Acetonfraktionierung und Molekularsiebchromatographie von den meisten Verunreinigungen befreien. Die Abtrennung anderer Proteasen gelingt erfindungsgemäß durch Behandlung mit trägerfixiertem alpha^-Makroglobulin-Metallkomplex. Bei diesem, für Enzymreinigungen neuen Verfahrensschritt werden schwer zu entfernende Verunreinigungen, insbesondere aber die. begleitenden Proteasen, abgetrennt, während die erfindungsgemäße Endopro-teinase Lys-C in Lösung bleibt und aus dieser isoliert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Endoproteinase Lys-C ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man eine filtrierte, oder nach an sich bekannten Methoden gereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes, über trägerfixiertem alpl^-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert, und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.

In dem oben erwähnten alpha2-Makroglobulin-Metall-Komplex besteht das Metall aus einem zweiwertigen Metall der Gruppe Zn,

Co, Ni oder/und Cu. Die Verwendung dieses Komplexes und seine Herstellung ist in der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung P 30 34 043.3 (int. Nr. 2380) näher beschrieben.

Wie bereits erwähnt, kann direkt von der Kulturbrühe ausgehend die erfindungsgemäße Behandlung mit trägerfixiertem alpha2-Makroglobulin-Metall-Komplex vorgenommen werden. Zweckmäßiger ist es jedoch, die Proteine vorher von anderen Substanzen abzutrennen und eine Vorfraktionierung durchzuführen.

Die Abtrennung der Proteine aus dem Kulturfiltrat erfolgt zweckmäßigerweise durch Fällung mit Ammonsulfat, obwohl auch - 6 - andere übliche Proteinfällungsmittel, welche die enzymatische Aktivität der darin enthaltenen, aktiven Proteine nicht beeinträchtigt, verwendet werden können. Bei Zusatz von Ammonsulfat gibt man dieses zweckmäßig bis zu einer Konzentration von 2,5 - 3,5 M, vorzugsweise 3 - 3,2 M zu. Der dabei gebildete Niederschlag wird abgetrennt, beispielsweise abfiltriert, und enthält die gesamte gesuchte Aktivität. Nach Auflösen mit Wasser und vorzugsweise Entfernung von restlichem Ammonsulfat durch Dialyse kann man die so erhaltene Lösung entweder der alpl^-Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatographie unterwerfen, oder einer weiteren Vorreinigung unterziehen.

Wird eine weitere Vorreinigung gewünscht, so führt man zweckmäßig eine Ammonsulfatfraktionierung durch, wobei die zwischen 2 und 3M Ammonsulfatkonzentration ausfallende Fraktion die gewünschte Aktivität enthält. Dabei wird zweckmäßig in einer ersten Stufe Ammonsulfat auf 0,7 - 1,3 M zugegeben, der Niederschlag abgetrennt und dann die Ammonsulfatkonzentration auf 3 M, vorzugsweise auf 2,25 - 2,32 M, erhöht, und der dabei erhaltene aktive Niederschlag in üblicher Weise abgetrennt und durch Dialyse von verbliebenem Ammonsulfat gereinigt.

Falls die so erhaltene Lösung nicht der alpl^-Makroglobulin-Metall-Komplex-Behandlung unterworfen wird, kann auch noch * eine Acetonfraktionierung und eine Molekularsiebchromatographie vorgeschaltet werden. Im Falle einer Acetonfraktionierung fällt man durch Zusatz von 0,3 - 1,5 Vol., vorzugsweise 0,5 - 1,2 Vol. Aceton, trennt den Niederschlag ab und gibt weitere 1,2 Vol. Aceton zu, trennt den Niederschlag ab und löst ihn in Puffer pH 7,5 - 9 auf. Die Pufferkonzentration liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,05 M. Nach Dialyse zur Entfernung von restlichem Aceton und ggf. Einengung der erhaltene! Lösung kann über ein Molekular sieb, beispielsweise vernetztes Dextran, wie Sephadex-G-100 chromatographiert werden, wobei die gewünschte Aktivität zu Beginn aus der Säure eluiert wird, während die - 7 - bekannte AL-1 Proteinase I erst gegen Ende eluiert wird. Das Eluat wird, ggf. nach Konzentrierung, über trägerfixiertem alpha2“Makroglobulin-Metall-KOiaplex chromatographiert, wobei die gesuchte Endoproteinase-Lys-C durchläuft. Die Elution erfolgt vorzugsweise im pH-Bereich 7,0 - 8,5 bei einer Pufferkonzentration von 0,03 - 0,08 M. Die üblichen in diesem Bereich wirksamen Puffersubstanzen sind geeignet, bevorzugt werden Tris-Puffer, Hepes-Puffer und Phosphat-Puffer. Gute Ergebnisse werden bei pH 6,5 - 9 und 0,01 - 0,1 Puffergehalt erreicht. Das * Eluat enthält reine Endoproteinase-Lys-C und Puffer und kann direkt lyophilisiert werden.

Das erfindungsgemäße neue Enzym ist insbesondere zur Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden anwendbar. Auf Grund seiner ·% sehr spezifischen Spaltungsaktivität läßt es sich auch therapeutisch einsetzen, beispielsweise bei Gerinnungsstörungen, beziehungsweise anderen Erkranknungen, bei denen die Spaltung von Proteinketten angestrebt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms und seine Bestimmung.

Beispiel 1

Gewinnung von Endoproteinase-Lys-C aus Lysobacter ^ . enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796)

Ausgangsmaterial: 206 Ltr. Lysobacter-Kulturfiltrat 206 Ltr. Lysobacter-Kulturfiltrat werden langsam mit festem Ammonsulfat auf 3 - 3,2 M ausgefällt. Der geringe flockige Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag auf den Filtern wird mit wenig dest. Wasser gelöst und mit festem Ammonsulfat auf 0,9 M (1,3 - 3 M) ausgefällt und zentrifugiert. Den über-' stand fällt man nun weiter auf 2,25 - 2,32 M Ammonsulfat aus, und filtriert oder zentrifugiert den Niederschlag, löst ihn mit « t - 8 -

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ca. 400 ml dest. Wasser und dialysiert gegen fließendes Leitungswasser.

Das Dialysat wird mit 0,5 -1,2 Vol. -20° C kaltem Aceton versetzt und abzentrifugiert. Den Überstand (klar) versetzt man nun mit weiteren 1,2 Vol. (berechnet aus Anfangsvol.) Aceton, zentrifugiert den Niederschlag ab und löst ihn so konzentriert . wie möglich mit 0,025 M Tris, pH 9 auf und dialysiert gegen 10 Ltr. desselben Puffers.

Das Dialysat wird auf eine Sephadex-G-100-Säule aufgetragen mit folgenden Abmessungen: 0 5 cm, Länge 150 cm, Säulenvol. ca. 2,9 Ltr.

Die Säule wird mit 0,025 M Tris, pH 9,0 äquilibriert und nach dem Aufziehen mit demselben Puffer nachgewaschen.

Lysobacter-Protease wird zu Beginn eluiert.

Die Eluate werden mit festem Ammonsulfat auf 3,2 M ausgefällt und zentrifugiert. Der konzentriert aufgenommene Niederschlag wird gegen 0,05 M Tris pH 8,0 dialysiert.

Alpha2-Makroglobulin-Zn-Komplex, kovalent an Agarose gebunden, . wird zur Weiterreinigung verwendet. 110 ml dieses Trägermaterials werden in 3 cm 0 Säule, Länge 17,5 cm, eingefüllt und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 gewaschen, bis sich kein Protein im Durchlauf befindet.

Nun wird das Dialysat aufgezogen und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 nachgewaschen; Proteinase-Lys-C läuft durch·.

Der Durchlauf wird gegen 0,05 M Glycin, pH 8,0 dialysiert und auf 0,4 mg/ml mit demselben Puffer verdünnt und lyophilisiert.

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Gesamt-Ausbeute: ca. 50 - 140 mg Protein

6 - 23 U/mg Proteinase Lys-C

Chromozym TH Aktivität <0,2 %

Beispiel 2

Bestimmung der Endoproteinase Lys-C

Herstellung der Lösungen: 1 . 0,025 M Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7 0,303 g Tris, 37,2 mg EDTA werden in ca. 80 ml bidest. Wasser gelöst und pH mit 2 N HCl auf 7,7 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt.

2. Chromozym-PL ( 14μΜ/ια1 ) 9 mg Chromozym-PL in 1 ml bidest. H20 auflösen.

3. Endoproteinase-Lys-C-Lösung 10 mg Lyophilisat in 1 ml bidest. H20 lösen. Vor Gebrauch 1:100 mit Lösung 1 verdünnen.

Ausführung: 405 nm 1 cm Halbmikroküvette 25° C Testvolumen 1,07 ml ir -10- «

In Küvette pipettieren: Lösung 1 1 ml Lösung 2 0,05 ml mischen, ca. 2 min. bei 25° C temperieren. Probelösung 3 0,02 ml mischen, aus linearer Phase nach ca. 5 min.

ΔΕ/min berrechnen.

Berechnung: Z\E/min x 1 ,07

- · 100 = U/ml Endoproteinase-Lys-C

10,4 x 0,02 «

Claims (7)

1. Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kette vom Molekulargewicht 35 000 - 38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum bei » pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha2_ Makroglobulin, ßC -Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure nicht gehemmt wird.

2. Verfahren zur Gewinnung der Endoproteinase-^ys-C von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man filtrierte oder nach üblichen Methoden vorgereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes über trägerfixierten alph^-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in 0,01 - 0,1 M Puffer pH 6,5 - 9 chromatographiert.

* 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch g .e- kennzeichnet, daß man Kulturbrühe aus Lysobacterales-e Züchtung verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der filtrierten Kulturbrühe das Protein durch Ammonsulfat fällt, den Niederschlag nach erneutem Auflösen zwischen 1,3 und 3 M Ammonsulfat fraktioniert und die in diesem Bereich unlösliche Fraktion in Wasser auflöst und nach Dialyse mit Aceton zwischen 1,2 und 2,4 Vol. Aceton fraktioniert. « - 2 - ï «

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Niederschlag der Aceton-Fraktionierung nach Auflösung über einem Molekularsieb chromato-graphiert und die zu Beginn der Chromatographie eluierte Proteinfraktion der alpha2_Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatographie unterwirft.

’ 7. Verwendung der Endoproteinase-Lys-C von Anspruch 1 zur Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden. « r