DK151635B

DK151635B - Endoproteinase-lys-c og fremgangsmaade til dens udvinding og anvendelse

Info

Publication number: DK151635B
Application number: DK369781A
Authority: DK
Inventors: Juergen Schrenk; Peter Wunderwald
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-09-10
Filing date: 1981-08-20
Publication date: 1987-12-21
Also published as: ES504834A0; FR2489838B1; IT8123351A0; GB2083477B; GB2083477A; ES8301275A1; CA1172979A; JPS5779884A; NL8103540A; FR2489838A1; JPS5928394B2; NO161684B; BE890259A; NL186645C; SE8104840L; IT1138134B; NO813068L; DE3034045C2; FI812726L; US4414332A

Description

„ DK 151635B

Til forskellige formål/ især til målrettet spaltning af proteiner og peptider, for eksempel inden for rammerne af sekvensbestemmelse, har endoproteinaser, som spalter på et bestemt sted, teknisk og videnskabelig interesse.

5 Således findes der allerede en endoproteinase fra svampe, som spalter peptidbindingen ved den C-terminale ende af lysin. Dette enzym er dog vanskeligt tilgængeligt og står derfor ikke til rådighed i det ønskede omfang. Der er nu fundet et enzym med samme specificitet i bakterier, 10 der karakteriseres som endoproteinase-Lys-C, og som adskiller sig tydeligt fra andre bakterielle proteaser ved egenskaberne.

Den nye endoproteinase-Lys-C fra bakterier ifølge opfindel-15 sen er ejendommelig ved, at den består af en kæde med molekylvægt 35.000 - 38.000 dalton, har et pH-optimum ved

7,7 og hæmmes af aprotinin, men ikke hæmmes af <X2-makro= globulin, α^-antitrypsin og ethylendiamintetraeddikesyre, og er identisk med den endoproteinase-Lys-C, som dannes ved 20 dyrkning af Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM

1895 (ATCC 27996), og kromatografi af det eventuelt forrensede dyrkningsfiltrat over bærerfikseret a^-makroglobulin-metalkompleks, hvor metallet er valgt blandt Zn, Co, Ni og/ eller Cu, og udvinding af enzymet af filtratet.

25

Enzymet ifølge opfindelsen er under ikke-reducerende betingelser tilbøjeligt til aggregation, hvorved der fortrinsvis dannes tetramere med en molekylvægt på ca.

^ 150.000 D , og oktamere med en molekylvægt på ca. 300.000 D, som er enzymatisk aktive.

pH-optimum for det nye enzym ligger, som allerede nævnt, ved 7,7, bestemt ved 37°C efter Azocoll-metoden.

__ Ved elektrofokusering opspalter enzymet sig i talrige 35 bånd, der strækker sig over næsten det samlede pH-område.

Dette forhold tillader den konklusion, at det drejer sig om et glycoprotein. Enzymets isoelektriske punkt kan derfor ikke bestemmes.

2

DK 151635B

og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) indtil højst _2 10 M ikke. Benzamidin hæmmer derimod ved 2,5 pM ca.

50%. Ved forhøjelse af benzamidinkoncentrationen kan opnås 70% hæmning. En fuldstændig hæmning giver aprotinin.

5

Det nye enzyms substratspecificitet viser tabel 1. Den specifikke aktivitet, målt med tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid ved 25°C er ca. 25 U/mg eller ca. 50 Azo= coll-enheder pr.mg enzym ved 37°C.

10 I modsætning til den fra Lysobacter beskrevne proteinase 11 spalter enzymet ifølge opfindelsen ikke aminostillet, men derimod carboxystillet på lysin. Den høje specificitet viser også det ringe antal bånd, der optræder ved gel-* 15 kromatografi af fibrin-spalteprodukter, fremkommet med dette enzym.

3

DK 151635 B

TABEL 1.

Substratspecificitet af endoproteinase Lys-C.

Nedbrydning med

Substrat_ endoproteinase Lys-C

Azocoll +

Casein + 5 Fibrinogen + Hæmaglobin + TLME ++

Chromozym PLR ++ S 2251R ++ 10 Tos-Arg-Me

R

Chromozym TH BAEE Leu-pNA Lys-pNA 15 ATEE

B-kæde af insulin +

Forkortelser: TLME = tosyl-lysyl-methylester.

20 BAEE = benzoyl-arginyl-ethylester.

ATEE = arginyl-tyrosyl-ethylester.

R

Chromozym PL = tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitro-anilid.

R

Chromozym TH = tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitro-anilid.

R

S 2251 = valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilid.

25

Tabel 2 viser forskellene mellem enzymet ifølge opfindelsen 30 og proteaser, der hidtil er fundet i Lysobacter.

4

DK 151635B

TABEL 2.

c* V

P ?-) PS

S-f 0} Q) ·— H

O h (11 P O <tt M

P >ii—i >tH > >i *P

•H ^ H tQ pH 01 iH "ri HG

m ® O O O O -P

® Φ O (1) G H G Η H ‘w O

V ft G — ft-ri P -rj P W G ft ftH G ft g -CD S CD O ft P 3 g h ti ti -ø g -p a m p p G G P O P4 O g ftp 4-1 tn td tndjfdtn cunJCnid ft &> Τ{ Η O Η ΗΛΛ&ιΑΛ&ιΡ 3 η g >ih « >, o « o w o« £ g tn»s

^ O P P OOPCD OPCDP O OG

w £) -p fB ΛΡΟΗ P O Η H3 G Λ-Ρ PGCQ pfl fflH Ό 01 H CO H PCfl O O -H O >t >i O >i >i CD ·Η S G >i

O Gw U A >-) O E H O (G U H

Q) CD

cn cn I G n)

cn CD CD I <D

G cn -p O cd -P

o g o H in O

Ή H p HG -P -P P

-P G ft G G tJ Tift )CG 1 -P -ri G Gi

G P4 G G CD G GG

G G H g -P Μ Λί H

P5 g P IO G G P

G G P A A G

CO bO ft SO D W

I—1

p II Q G Q

Gi G G I Gi H

tø P -P G O I O >,

>Q Q Q -P QG&i Q O CO O P

Η H OH O Ω O O

>i o O OH O g H O · CO · G —» λ; o o οη^οηοι«-.ο oo · m a q

Go o oHOioOG-Porotlro fto H · · .(DG*GO&i*IO*Oc^ 0 O O σι Gi-P in h ft) t" VDp G CO t

s cm Η ^ P H'-'H> H ro·'-' O-'CO

p cm cn o <D H cm ro g · · * g Η σι σι G cm σ\ σι

G · 1 · . I

1 -vT ^ U · ·

|xj CO CO CO

G

ω h

G G Η H

S cn

H G G G

(D G G G G

4J -P G G cn

0 O G G G

P P H HG

ft ft G G H

-P -P G

X M 0 0 -P

cn cn P p o HH ft ftp

-P -p ft O

>i >i H A O I

HH I i Φ cn 1 I PI PI G ΪΡ

a co. < w A

5

DK 151635B

Enzymet ifølge opfindelsen kan befris for de fleste forureninger af kulturvæskerne fra mikroorganismer, som danner dette enzym i tilstrækkelig mængde, især de af ordenen Lysobacterales og herunder fortrinsvis de af 5 familien Lysobacteraceae, for eksempel slægten Lysobacter (også kaldet Myxobacter), ved sædvanlige enzymrensningsmetoder såsom ammoniumsulfatfraktionering, acetonefraktionering og molekularsigtekromatografi. Fraskillelsen af andre proteaser sker ifølge opfindelsen ved behandling 20 med bærerfikseret o^-makroglobulin-metal-kompleks. Ved denne fremgangsmåde, der er ny for enzymrensninger, fraskilles forureninger, der er vanskelige at fjerne, men især de ledsagende proteaser, medens endoproteinase-Lys-C ifølge opfindelsen forbliver i opløsning og kan isoleres 15 af denne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til udvinding af endoprotei-nase-Lys-C er derfor ejendommelig ved, at man kromatograferer en filtreret og eventuelt forrenset kulturvæske indeholdende 20 endoproteinase-Lys-C og andre proteinaser over bærerfikseret c^-makroglobulin-metal-kompleks, hvor metallet er valgt blandt Zn, Co, Ni og/eller Cu, og udvinder enzymet af filtratet.

I ovennævnte (^“makroglobulin-metal-kompleks består metallet 25 af et divalent metal fra gruppen Zn, Co, Ni og/eller Cu.

Anvendelsen af dette kompleks og dets fremstilling er nærmere beskrevet i den samtidige tyske patentansøgning P 30 34 043.3, ifølge hvilken man opløser CL2M i den vandige opløsning indeholdende de endoproteinaser, som skal fraskilles, 30 og behandler denne opløsning med en kationbytter, som er ladet med det divalente metal, altså Zn, Co, Ni og/eller Cu. Alternativt er det også muligt først at bringe o^M i opløsning i kontakt med den med divalent metal ladede kationbytter, hvorved c^M bindes til den faste fase, og derefter blande 35 den faste fase med den proteaseholdige opløsning.

6 DK 151635 E

Som allerede nævnt, kan man gå direkte ud fra kulturvæsken og foretage behandlingen ifølge opfindelsen med bærerfikseret c^-makroglobulin-metal-kompleks. Det er dog mere hensigts-mæssigt først at skille proteinerne fra andre stoffer og udføre en for-fraktionering.

Fraskillelsen af proteinerne fra kulturfiltratet sker hensigtsmæssigt ved. fældning med ammoniumsulfat, selv om også andre sædvanlige proteinfældningsmidler, der ikke 10 skader den enzymatiske aktivitet af de deri indeholdte aktive proteiner, kan anvendes. Ved tilsætning af ammo= niumsulfat tilsætter man dette hensigtsmæssigt til en koncentration på 2,5 - 3,5 M, fortrinsvis 3 - 3,2 M.

Det derved dannede bundfald fraskilles, for eksempel fra-filtreres, og indeholder den samlede søgte aktivitet. Efter opløsning med vand og fortrinsvis fjernelse af resterende ammoniumsulfat ved dialyse kan man enten underkaste den fremkomne opløsning o^-makroglobulin-metal-kompleks-kromatografi eller underkaste den en yderligere for-rens- 20 ning.

Hvis en yderligere for-rensning ønskes, udfører man hensigtsmæssigt en ammoniumsulfatfraktionering, hvorved den mellem 2 og 3 M ammoniumsulfatkoncentration udfældende fraktion 25 indeholder den ønskede aktivitet. Herved tilsættes hensigtsmæssigt i et første trin ammoniumsulfat til 0,7 - 1,3 M, bundfaldet fraskilles, og ammoniumsulfatkoncentra-tionen forhøjes til 3 M, fortrinsvis til 2,25 - 2,32 M, og det derved fremkomne aktive bundfald fraskilles på sæd-30 vanlig made og renses ved dialyse for tilbageblevet ammo= niumsulfat.

Hvis den således fremkomne opløsning ikke underkastes a^-makroglobulin-metal-kompleks-behandlingen, kan der også først indskydes en acetonefraktionering og en molekular-sigtekromatografi. Hvis det drejer sig om en acetonefraktionering, fælder man ved tilsætning af 0,3 - 1,5 rumfang, fortrinsvis 0,5 - 1,2 rumfang acetone, fraskiller bundfaldet og tilsætter yderligere 1,2 rumfang acetone, fraskiller bundfaldet og opløser det i en stødpude med pH 7,5 - 9. Stødpudekoncentrationen ligger hensigtsmæs- 7

DK 151635B

resterende acetone og eventuel inddampning af den fremkomne opløsning kan der kromatograferes over en molekular-sigte,for eksempel tværbundet dextran, såsom Sephadex-G-100, hvorved den ønskede aktivitet elueres af syren i begyndelsen/ medens den kendte AL-1 proteinase I først 5 elueres mod slutningen. Eluatet bliver/ eventuelt efter koncentrering/ kromatograferet over bærerfikseret c^-makro-globulin-metal-komplekS/ hvorved den søgte endoproteinase-Lys-C løber igennem. Elueringen sker fortrinsvis i pH-området 7,0 - 8,5 med en stødpudekoncentration på 0,03 -10 0,08 M. De sædvanlige, i dette område virksomme stødpude stoffer er egnede, og tris-stødpude, hepes-stødpude og phosphat-stødpude foretrækkes. Gode resultater opnås ved pH 6,5 - 9 og 0,01 - 0,1 stødpude-indhold. Eluatet indeholder ren endoproteinase-Lys-C og stødpude og kan direkte 15 lyofiliseres.

Det nye enzym ifølge opfindelsen er især anvendeligt til sekvensbestemmelse af proteiner og peptider. På grund af dets meget specifikke spaltningsaktivitet kan det og-20 så anvendes terapeutisk, for eksempel ved koagulerings forstyrrelser eller andre sygdomme, ved hvilke der tilstræbes spaltning af proteinkæder.

De følgende eksempler belyser udvindingen af enzymet iføl-ge opfindelsen og dets bestemmelse.

EKSEMPEL 1.

Udvinding af endoproteinase-Lys-C af Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796).

Udgangsmateriale: 206 1 Lysobacter-kulturfiltrat.

206 1 Lysobacter-kulturfiltrat udfældes langsomt med fast ammoniumsulfat til 3 - 3,2 M. Det lidt fnuggede bundfald •3 5 frafiltreres. Bundfaldet på filteret opløses med lidt 8

DK 151635B

destilleret vand og udfældes med fast ammoniumsulfat til 0,9 M (1,3 - 3 M) og centrifugeres. Den ovenstående væske udfælder man nu igen til 2,25 - 2,32 M ammoniumsulfat og filtrerer eller centrifugerer bundfaldet, opløser det 5 med ca. 400 ml destilleret vand og dialyserer over for strømmende ledningsvand.

Til dialysatet sættes 0,5 - 1,2 rumfang -20°C kold acetone, og der centrifugeres. Til den ovenstående væske (klar) 10 sætter man nu yderligere 1,2 rumfang (beregnet på begyndel sesrumfanget) acetone, fracentrifugerer bundfaldet og opløser det så koncentreret som muligt med 0,025 M tris, pH 9, og dialyserer over for 10 1 af samme stødpude.

15 Dialysatet føres på en Sephadex-G-100-søjle med følgende dimensioner:

Diameter: 5 cm, længde: 150 cm, søjlerumfang: ca. 2,9 1.

Søjlen bringes i ligevægt med 0,025 M tris, pH 9,0, og ef- 20 ter påføringen eftervaskes med samme stødpude. Lysobacter-proteasen elueres i begyndelsen.

Eluaterne udfældes med fast ammoniumsulfat til 3,2 M og 25 centrifugeres. Det koncentrerede optagne bundfald dialyseres over for 0,05 M tris, pH 8,0.

c^-makroglobulin-Zn-kompleks, bundet covalent til agarose, anvendes til den videre rensning. 110 ml af dette bærer-30 materiale fyldes i 3 cm Ø-søjle, længde 17,5 cm, og vaskes med 0,05 M tris, pH 8,0, indtil der ikke findes noget protein i gennemløbet.

35

DK 151635 B

9

Nu påføres dialysatet og eftervaskes med 0,05 M tris, pH 8,0. Proteinase-Lys-C løber igennem.

Gennemløbet dialyseres over for 0,05 M glycin, pH 8,0, og fortyndes til 0,4 mg/ml med samme stødpude og lyofilise-5 res.

Samlet udbytte: ca. 50-140 mg protein.

6 - 23 U/mg proteinase-Lys-C.

Chromozym TH-aktivitet mindre end 0,2%.

10

Bestemmelse af endoproteinase-Lys-C.

15 Fremstilling af opløsningerne: 1. 0,025 M tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7.

0,303 g tris, 37,2 mg EDTA opløses i ca. 80 ml redestilleret vand og indstilles til pH 7,7 med 2N HC1 20 og fyldes op til 100 ml.

2. Chromozym-PL (14 uM/ml).

9 mg chromozym-PL opløses i 1 ml re-des ti lieret ^0.

25 3. Endoproteinase-Lys-C-opløsning« 10 mg lyofilisat opløses i 1 ml re-destilleret H^O.

Før brugen fortyndes 1:100 med opløsning 1*

Udførelse: 405 nm - 1 cm halvmikro-cuvette.

50 25°C - prøverumfang 1,07 ml.

Claims

2. Fremgangsmåde til udvinding af endoproteinase-Lys-C ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man kromato-graferer en filtreret og eventuelt forrenset kulturvæske indeholdende endoproteinase-Lys-C og andre proteaser over bærer-3^ fikseret a^-makroglobulin-metal-kompleks, hvor metallet er valgt blandt Zn, Co, Ni og/eller Cu, og udvinder enzymet af DK 151635B u filtratet.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man kromatograferer i 0,01 - 0,1 M stødpude, pH 6,5 - 9.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at kulturvæsken stammer fra dyrkning af en stamme af slægten Lysobacter.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendetegnet 10 ved, at forrensningen er udført ved, at man fælder proteinet af den filtrerede kulturvæske med ammoniumsulfat, fraktionerer bundfaldet efter fornyet opløsning med mellem 1,3 og 3 M ammoniumsulfat og opløser den i dette område uopløselige fraktion i vand og efter dialyse fraktionerer med mellem 1,2 15 og 2,4 rumfang acetone.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at bundfaldet fra acetonefraktioneringen efter opløsning kro-matograferes over en molekularsigte, idet man udvinder den i 2o begyndelsen af kromatografien eluerede proteinfraktion. 1 Anvendelse af endoproteinase-Lys-C ifølge krav 1 til sekvensbestemmelse af proteiner og peptider.