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DE2201993A1 - Enzympraeparat und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Enzympraeparat und Verfahren zu dessen Herstellung

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DE2201993A1
DE2201993A1 DE19722201993 DE2201993A DE2201993A1 DE 2201993 A1 DE2201993 A1 DE 2201993A1 DE 19722201993 DE19722201993 DE 19722201993 DE 2201993 A DE2201993 A DE 2201993A DE 2201993 A1 DE2201993 A1 DE 2201993A1
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phenol
solution
enzyme
acid
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DE19722201993
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Birger Blombaeck
Percs Edmund E
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Stockholm Hessel Geb Lind
Blombaeck Geb Wetter
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Pentapharm AG
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Description

2201933
ΓΛρΙ,-lng. G. Danr*nb««
Dr. V. ScSmiod-Kowarzik Dr. 9. WeInSoId, Dr. D.
P E N T A Γ H A R M A.G. in Basel /Schweiz Engeigass· 109
Enzympräparat und Verfahren zu dessen Herstellung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf. ein je nach Dosierung als Haemootatikun oder Blutantikoar;ulans verwendbares Enzympräparat aus Schlangengift, auf ein Verfahren zu dessen Herstellung, auf ein das genannte .Enzympräparat enthaltendes pharmazeutisches Produkt und auf ein das genannte Enzympräparat enthaltendes Reagens für BlutUntersuchungen in vitro.
Gemäss der britischen Patentschrift Nr. 1.094.301 kann aus dem Gift von Ancistrodon rhodostoma ein Enzym mit thronibinartiger antikoa".ulierender Wirkung gewonnen v/erden, das die folgenden Eigenschaften besitzt: Es besteht aus einem im - einen Zustand praktisch farblosen Protein*, es ist an schwach basische Anionenaustauscher, 3.B. Di- oder Triäthylaminoäthylcellulose, adsorbierbar·, es ist in physiologischer Kochsalzlösung löslich·, es besitzt eine olektrophoretische Mobilität
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von 3,9 χ ΙΟ"5 Volt/cm/Sek. in 0,1-molarem Phosphatpuffer von ρ» 7; es weist in monomerer Form ein (durch Ultrazentrifuration bestimmtes) Molekulargewicht von höchstens 40000 auf·, es besitzt einen Sedimentationskoeffizienten von S^qW =3,4 Svedberg bei einer Konzentration von 4,86 mg/ml; es weist ein partiales spezifisches Volumen von etwa 0,7 bei einer Konzentration von 4,86 mg/nl auf; es besitzt jjn vivo eine thrombinartige und antikoagulierende biologische Wirksamkeit j und cö
-3
wird durch 1 χ 10 -molares Diisopropylfluorophosphat innerhalb 5 Minuten nicht wesentlich gehemmt.
Es wurde nun gefunden, dass man aus den Gift von Schlangen der Gattung Bothrops, insbesondere ßothrops atrox, oder anderen Schienen, deren Gift mit dem Bothrops-atrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, ein Enzympräparat gewinnen kann, welches einerseits bei entsprechend niedriger Dosierung beim Menschen und anderen Säugetieren als Haemostatikum wirkt und andererseits in höheren Dosen auf das Blut von Menschen und anderen Säugetieren eine indirekte gerinnungshemmende Wirkung ausübt, indem es das Fibrinogen weitgehend aus dem Blutkreislauf entfernt, ohne die Haemostase wesentlich zu beeinflussen, und deshalb als Blutantikoagulans verwendbar ist. Dieses Enzympräparat weist gegenüber dem gemäss dem britischen Patent Nr. 1.094.301 erhältlichen Antikoagulanc mehrere wesentliche Vor teile auf, die im Folgenden noch beschrieben werden.
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Das Enzympräparat ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:
a) es übt eine thromb inartige Endopeptidasewirkung aus,
b) es weist eine Peptidkomponente und eine Kohlenhydratkomponente auf, wobei die Peptidkomponente aus einem oder mehreren Polypeptiden mit Molekulargewichten von etwa 18C00 bis 55000 (nach der Methode der Gleichgewichts-Ultrazentrifugierune; bestimmt) zusammengesetzt ist,
c) es weist einen Kohlenhydrat-(bzw. Neutralzucker-)-gehalt von etwa 2-10 Gew.#, bezogen auf den Proteingehalt, auf,
d) es ist in destilliertem Wasser schwer, in physiologischer Kochsalzlösung jedoch leicht löslich,
e) es bildet mit Phenol und Phenolderivaten in Wasser schwer lösliche oder unlösliche Komplexe,
f) es bewirkt die Koagulation von Fibrinogen durch selektive Abspaltung von Fibrinopeptiden A aus Fibrinogen ohne Freisetzung von Fibrinopeptiden B,
g) es weist, je nach Reinheitsgrad, eine Wirksamkeit von etwa 30 bis 450 NIH-Thrombineinheiten auf,
h) es spaltet Tosylarginin-mothylester und Gelatine, jedoch nicht Lysin-methylester, Phenylalanin-äthylestor, N-Acetylmethionin, N-Acetyltyrosin, Leucylglycin und Casein,
i) es wird durch Heparin, Heparinoide, Hirudin, Antithrombine und den polyvalenten Peptidaseinhibitor nach Kunitz (siehe J.Gen.Physiol. 19., 991-1007 [1936]) nicht gehemmt,
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k) es wird bei einer Enzymkonzentration von etwa 5 mg
-3 pro ml durch 2,5 χ 10 -molares Diisopropylfluorophosphat
bei pjj 8 innerhalb 2 Stunden bezüglich seiner Gerinnungsund Esterase-Aktivität zu etwa 95$ gehemmt,
1) es wird durch Tosylarginin-methylester kompetitiv und durch den im Antibothropsserum enthaltenen Antikörper vollständig gehemmt,
m) es wird durch Fibrin nicht gebunden und dadurch nicht inaktiviert,
n) es weist eine beträchtlich längere biologische Halbwertszeit auf als Heparin,
o) es bewirkt die Bildung von mindestens teilweise löslichen Komplexen aus Fibrin und Fibrinogen,
p) es wirkt auf Fibrinogen unter Bildung eines Fibrins, «reiches physikalisch-chemische Eigenschaften besitzt, die von denjenigen des durch Thrombin erzeugten Fibrins verschieden sind, insofern als es 5or;ar in Gegenwart von aktiviertem Faktor XIII und von Ca-Ionen durch fibrinolytische Enzyme, z.B. Plasmin, rasch hydrolysiert wird und in 5-molarem wässrigen Harnstoff löslich ist, und
q) es verursacht In vivo eine Defibrinogenierung und eine sekundäre Fibrinolyse ohne haemorrhagische und thromboembolische Nebenwirkungen.
Das oben definierte Enzympräparat wird gem&ss der Erfindung nach einem Verfahren erhalten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf eine wässrige Lösung des
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Giftes von Bothrops atrox oder einer anderen Schlangenart, deren Gift mit dem Bothrops-atrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, Phenol oder ein Phenolderivat einwirken lässt, um einen in Wasser schwer löslichen oder unlöslichen Komplex zu bilden, und aus dem Komplex das aktive Enzympräparat freisetzt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man
(1) eine isotoniscba wässrige Lösung dea Schlangengiftes mit einem p„ von etwa 4,5 bis 7 herstellt,
(2) entweder
(a) die genannte isotonische Lösung einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion aus- > ; zufallen, die genannte Fraktion in destilliertem Wasser löst, die Lösung *nf ein p„ von etwa 3 bis 4 einstellt, während einiger Minuten bis zu Z Stunden bei Temperaturen von etwa 30-5O0C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt und das p^
der 7 rückbleibenden Lösung auf etwa 4 bis 6 einstellt, oder .
(b) die genannte isotonische Lösung auf ein p^ von 3 bis 4 einstellt und während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30-500C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt, die zurückbleibende Lösung auf ein p» von etwa'4,5 bis 7 einstellt und einer fraktionierten SaIzf al lung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion aus-
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zufallen, die letztere in destilliertem Wasser löst und die Lösung auf ein p„ von etwa 4 bis 6 einstellt, und
(3) der gemäss (a) oder (b) erhaltenen Lösung Phenol oder ein Phenolderivat zusetzt, um einen die V/irksübstanz enthaltenden Komplex auszufällen, und entweder
(c) den Komplex durch Behandlung mit verdünnter Essigsäure in einem polaren organischen Lösungsmittel zerlegt und das freigesetzte, ungelöste Enzympräparat isoliert, oder
(d) den Komplex in einem wässrigen Medium mit einer Base bei einem pjj von etwa 7,5 bis 8,5 behandelt und das freigesetzte Enzympräparat durch Ultrafiltration, Dialyse oder Gelfiltration isoliert, und dass man das erhaltene Präparat gegebenenfalls einer weiteren Reinigung unterzieht.
Als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wirät zv/eckmässigerweise das Gift von Bothrops atrox verwendet. In der Fachliteratur findet man für diese Schlangenart auch andere Bezeichnungen, z.B. Coluber atrox LINNAEUS (Sys. Nat. Ed. 10, 1:222, 1758), Bothrops ' atrox LINNAEUS (DumeYil, Bibron et Dumoril, Erpet. ge"n. 7:1505, 1854), Lachesis lanceolatus BOULENGER (Cat. Snak. Brit. Mus. 3:535, 1856), Lachesis atrox LINNAEUS (Boulenger, Cat. Snak. Brit. Mus., 3:357, 1896), Bothrops atrox atrox (J.A. Peters, Bull. Mus. comp. Zool., Cambridge, Mass., 122:509, 1960 und Bothrops moojeni HOGE (A.R. Hoge, Mem. Inst. Butantan, 32:126, 1965). Man kann auch Gift von anderen Bothrops-Arten,
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wie z.B. Bothrops jararaca, verwenden. Allgemein kann Gift von allen Schlangenarten verwendet werden, deren Gift mit demjenigen von Bothrops atrox eine immunologische Kreuzreaktion eingeht. Der Begriff "immunologische Kreuzreaktion11 ist z.B. in "Einführung in die Immunchemie und Immunologie" von E.A. Kabat, Springer Verlag, 1971, Seite 1 und ff., definiert und erklärt.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:
Getrocknetes Bothropsgift wird in physiologischer Kochsalzlösung bei einem p,, von etwa 4,5 bis 7 aufgelöst. Die Lösung wird durch Zentrifugation oder Filtration von ungelösten Anteilen befreit. Die klare Giftlösung wird mit einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen »»Sure, z.B. Essigsäure, auf einen schwach sauren pjj-Wert, z.B. von 3 bis 4, eingestellt und unter Rühren erhitzt, wodurch ohne Verlust an Wirkstoff Ballastproteine gefällt werden. Das Ausmass dieser Fällung richtet sich nach Erhitzungszeit und Temperatur sowio nach dom eingestellten pu-V/ert. Bei p„ 3 genügen einige I'.inuten, s.B. 10 Minuten bei 300C. Bei pH 3,5 wird zv/eckmässigcrweiae 1 Stunde bei 300C oder 30 Minuten bei 400C erhitzt.
Ausgefällte Proteine werden durch Zentrifugation abgetrennt. Aus dem Filtrat fällt man bei einem p„-Wert von etwa-4,5 bis 7, vorzugsweise bei Pu 6,5, durch fraktionierte Salzfällung vorerst eine Fraktion von Ballaststoffen
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und hierauf die Wirkstofffraktion aus. Für diese fraktionierte Fällung eignen sich Ammonium-, Alkali- oder Srdalkalisalzo von Mineralsäuren, z.B. Natriumchlorid oder -sulfat, Iiagnesiumchlorid oder -sulfat und Amnoniumchlorid odor -sulfat. Bei Verwendung von Ammoniumsulfat bei p„ 6,5 fällt die Ballastfraktion bei AO0Ji Sättigung und die aktive Fraktion bei 55^ Sättigung bei 200C aus. Bei Verwendung and orer Salze, p„-Werte und Fällungstemperaturen weisen die erforderlichen Sättigungsgrade andere Werte auf.
Die aktive Fraktion wird durch Zentrifugation von der Mutterlauge getrennt und in destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wird auf ein p., von etwa 5,0 eingestellt. Die Wirksubstanz wird durch Zugabe von etwa 1% Phenol oder einer entsprechenden Menge eines Phenolderivates gefällt. Geeignet» Phenolderivate sind Phenolcarbonsäuren, z.B. Salicylsäure, alkylierte Phenole, z.B. o-, m- oder p-Kresol, halogenierte Phenole, z.B. o-, m- oder p-Chlorphenol , halogenierte oder alkylierte Phenolcarbonsäuren, ζ B. Kresolsäur.en und Chlorphenolsäuren, oder Salze von Phenolcarbonsäuren oder deren Derivaten, z.B. Natriumsalicylat und die Natriumsalze von Kresolsäuren. Man kann auch Phenol-Formaldehyd-Harze mit freien Phenolgruppen, z.B. Amberlite XE 97, verwenden. Die notwendige Menge an Fällungsmittel ist in der Regel mit der Löslich- keitsgrenze des betreffenden Derivates oder, im Falle von Sauren, mit der LSslichkeitsgrenze der betreffenden freien
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Sälire identisch. Der auf diese Weise gebildete unlösliche Komplex des Wirkstoffe!? wird durch Zentrifugati on abgetrennt und kann nun auf zwei verschiedene Arten (c) und (d) zerlegt werden:
(c) Man wäscht das wasserunlösliche Material mehrmals, mit einer Lösung von 0,1-0,5'/. Essigsäure in einem polaren Lösungsmittel, wodurch der Komplex zerlegt und das Phenol bzw. Phenoldorivat herausgelöst wird, während der Wirkstoff als unlöslicher Rückstand zurückbleibt. Als polare Lösungsmittel eignen sich AlkanoJe mit einer Kettenlilnge
von z.B. G1 bis C4, Dialky.l-Ketone der Formel R1 - CO - R2,
1 ρ
in welcher R und Ii." eine Kettenlänge von '/.B. C-, bis C. auf-
1 ?
weisen, sowie Dialkyläther der Formel R - 0 - R", in welcher
1 ?
R" und R" eine Kettenlänge von z.B. C0 bis Cn aufweisen.
(d) Man löst den aus dem Wirkstoff und Phenol bzw. dem Phenolderivat bestehenden Komplex in Wasser bei einem p„ von c L v/a 7,5 bis 8,5. vorzugsweise 8, wobei der pj.-'tfert mittels eines Alkalihydroxyds, A1kai.iacetηto , Alkalicifrats, Alkalicarbonat;; cider -bicarbonati;, Di- oder Trialkaliphosph'-ts oder eines anderen basischen Puffers oder mittels Ammoniumhydrc. <;ryd oder Ammoniak ο in--es t ^H t werden lcarm. Man filtriert unter N0-Dr1UcI; durch oin IJ] traf L] tor , dessen P or en weite so bo!uor,.:on i:..t, dans el 131 · -V' Lrl::'.i..ff f (d.h. rl,-...?. Lmu'/iü) zurückbleibt- und d:;:; Phenol hv.vi. I'hcnol.lorivat da.:> i'i).t'-;r in p;elöst'jr Form ρ a f.'. f. i er-t. Oc.c i j;ii;i te I'M ] ter sind be i.r;pie:l avr: i r <:>
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- ίο -
"Diaflo"-Filter der Typenbeseichnung UM-05, UM-2, UM-IO und PIi-10. ("Diaflo"-Filter sind Ultrafilter, d.h. Membranen aun synthetischen Polymeren*, Lieferant: AMICON, Oousterhout [N.B.j, Holland). Der auf dem Filter verbleibende V/irkstoff wir) nit mehreren Portionen de5jtillieri.ru1 '7-issei' odor einer geeigneten Konservierungsmittellösung gewaschen, um restliches Phenol bzw. Phenolderivat zu entfernen.
Der von Phenol bzw. dessen Derivaten befreite Wirkstoff der Reinheitsstufe I ist in diesem Zustand bereits soweit gereinigt, dass 1 m/r eine Aktivität von otv.ra 10-15 ϊίΙΙΙ-Thrombineinheiten besitzt , im Irninunopherogramni jedoch noch drei Präzipitinzonen und im Acrylanmlphorograiniii vier Proteinzonen erkennen lässt und eine gelbe Farbe aufweist. Der V/irkstoff der Reinheitsstufe I weist auch eine thromboplastische Aktivität auf.
Zur weiteren Reinigung wird das Enzympräparat in Tris(hydroxymethyl)aininomothan-Phosphatpuf fer (p,, 6,()/ 0,02 molar) zu einer 5$~igon Lösung aufgelöst und an einer Kolonne von DEAE-"3ophridex" A-50 (UEA1-5 = Diäthylamino^hyl \ "Sephadex" = Warenzeichen für PolydexXranprodukto:, Lieferant: Pharmacia, Uppsala, Schweden), welche zuvor in die PO.-Forrr. übergeführt und mit TRI.'5-Phosphatpuffer [py 6,0/0,02 tr.olur) äfiu Llihriert wux'do , cliromal;. cigraphirr I. Da'.vi wird so vorge;-angen , dass man zuri<:lchr> t die F'Inr.ymlc'.'r.ing auf rlicj iläul·? bringt» hierauf durch Mnchwaschc-n mit. 4 ίί-iu] envroluü'ina TRIiJ-. Phosphatpuffer (pM G,0/(),02 molar) BaI Lm: l.:;toffe r.-ntiOr-nt
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BAD ORfGINAL
und hierauf durch Eluieren mit 2 Säulenvolumina THIS-Phcsphatpuffer (p„ 6,0/0,04 molar) den Wirkstoff herauslöst [TRIS = Tris(hydroxymethyl)nminorethan]. Dieses aktive Eluat wird durch Ultrafiltration von Salzen befreit. Lyophili.siert man diese Lö.sung, so erhält man ein Präparat der Reinheitsstufe II, welchen eine Aktivität von etwa 100-200 NIll-Thrombinoinheiten pro mg Fj'-M.einschalt auiVc L f31. Im Immunopherogramm ist nur noch eine einzige Präzipi tinzone nachweisbar, während das Acrylamid pherosrarnm zwei Zonen aufweist.
Das Enzym kann in kristalliner Form erhalten werden, indem man das durch Ultrafiltration ^ewonnene salzfreie Konzentrat (Reinheitsstufe II) während 4 8 Stunden bei +20C stehen lässt, die abgeschiedenen Kristalle durch Zentrif us; at i on unter Kühlung sammelt und dieselben mit eisgekühlten destilliertem Wasser wäscht. Man erhält auf diese V/eise in geringer Ausbeute rechteckige Plättchen, die beirr· Trocknen im Vakuum rasch, an der Luft allmählich amorphe Teilchen bilden. Trocknet man solche Kristallsuspensioneii, so erhält man ein Enzympräparat der Roinheitsstufe III mit einer Aktivität von mehr als 200 NIH-Thronibincinheiten pro mg Proteinnehält.
Das Enzympräparat der Reinheitsstufe II erscheint im Papiorelektropherogräjr.m, im Membranelektrcpherogramm, in der Gelchron:ato!^raphie, im Ioneuaustauschchromatogramm und im liTimunodiffusoPxamm nach OUCHTEH-LOHNY als einheitliche
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Substanz. Durch Elektrophorese im Polyacrylamidgel lässt sich jedoch eine inaktive, durch Amidosc'nwarz färbbare Polypept-iäfraktion als Begleitsubstanz von der thrernb inartig aktiven Enzymfraktion abtrennen. Die Abtrennung der inaktiven Begleit substanz kann dadurch erzielt werden, dass man dan Enzympräparat der Reinheitsstufe II einer Gelohromatographie unter Verwendung einer Mischung einer aliphatischen Carbon? ä'ure mit Wasser oder einer Mischung einer wäasriasn PufFeriösun~ mit einem mit Wasser mischbaren organischen I ösun■■>. srrit.v,el als Flicss- bzw. Eluierungsmittel unterwir.fr,. 2.\u- i: :.-chi'üa:"jng dieser Gelchromatographie eigner) sich rc'-'chJ hyäroohile irIr. auch hydrophobe Gele. Als Beispiele ν er: hydrrp: :11er; Oc-λ? r können Polydextrangele , wie "Sephadcx" (:_ · ■: Γ ■ ■ ara.: r;ha.r ί';η■■'.·? ; Upppala, Schweden), Pc] yacry] ,n.iac^l^ > ^ir "1^o-Oe''" i',.afer£,nt: Fio-Il^d Laboratories, Ri .rh.-Ί·:·. ,", .. ;... " ; ,■: ■.-. i:, ! y uir: Aparose- cd ei' Agar.tele, wie !;'h;'hr:iri::; [:\^ ■■■'.-:' ■ I-r-.r-rr· :' "i .a 1-civ-:e:ieri; , genannt werden, hi~ Ce] c\\r :■■·■· . ■: r,. ;:;■ -'ird ;:--·;·:- märsi^erweise br:i konstanter' .vas;:c: o- "· ■'. — -.■".;:.'.- .;... 'i : c:· , z.V.. im p.,-Bereich von οΐν;\ι c bj
2 bis β, durchgeführt - Π.ε ·..; ι *//■■. η -..:! ^ ■-:■·.·'. '■. .;■ . - ., r-.-\:n ■. :—;:: sich beispielsweise i':-)nr:.c5rbc-!u-.,HureT- ' :' ■■ ■■■ ' ';; τ j ar V^rzweigter Kohlenst of f kett e und 3. bis ' ■> : . :. . ' -ί'"■■■', ■;-.?::■. ·■ . Pie üblichen Puffer, die in Gemischen von .V.i.s .- I'. -·:·;» sehen Lösungsmitteln löslich sind, heispj,- ■'. .rwv. ■. ■..■ i^orrriiaa ^, Acetate, Phosphate, Citrate und Carbamate von anorganischen Basen, wie Alkalimetallen oder Ammoriiurr., ede: von organischen
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Basen, wie Pyridin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan, können verwendet werden. Da man den Verlauf der Chromatographie vorzugsweise durch densitometrische Analyse der Eluate verfolgt, ist es zweckmässig, Puffersysteme zu verwenden, die im UV-Bereich nicht ■ absorbieren. Da ferner die aktiven fluate vorzugsweise durch Gefriertrocknung (Lyophilisierung) konzentriert werden, empfiehlt es sich, im Vakuum verhältnismässig leicht flüchtige Puffer zu verwenden. Als Beispiele von Puffern, welche diese Bedingungen erfüllen, seien Ammoniumformiat und Ammoniumacetat angeführt. Die aliphatischen Garbonsäuren können in Konzentrationen von etwa 5-95 Vol.$ in Wasser verwendet werden. Bei Verwendung von hydrophilen Gelen für die Chromatographie eignen sich Garbonsäurekonzentrationen von etwa 5-50 VoI .$. Bei Verwendung von wässrigen Puffern wird ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, zweckmassigerweise in Mengen von etwa 5-95 Vol.5^, zugesetzt. Ist das für die Chromatographie verwendete Gel hydrophil, so liegt die Konzentration an Lösungsmittel zweckmassigerweise zwischen etwa 10; und 50 Vol.#. Als organische Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Alkanole mit gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette und 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Ketone, wie Aceton, Diäthylketon oder Methyläthyl-keton, Alkylamine, wie Mono-, Di- oder Trimathyl-, -äthyl- oder -propyl-amin, Urethane, wie Aethylurethan. Da die Eluate vorzugsweise lyophilisert werden, ist es zweckmässig, Lösungsmittel zu verwenden, welche ira Vakuum ver-
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hältnismässig leicht flüchtig sind und den Gefrierpunkt der zu lyophilisierenden Lösung möglichst wenig erniedrigen , beispielsweise tert.-Butanol und Cyclohexanol.
Das durch die oben beschriebene Gelchromatographie erhältliche Enzymprä'parat weist eine Aktivität von etwa 20n bis 400 NIH-Thrombineinheiten (Reinheitsstufe III) pro mg Proteingehalt auf. Durch die Gelchromatographie wird die inaktive Fraktion weitgehend oder vollständig von dem aktiven Enzympräparat abgetrennt.
Die mit II und III gekennzeichne ten Reinheitsstufen
können wie fol Reinheit
heiten pro mg Reinheit
Die Wert
definiert werden: istufe II = etwa 100 - 200 NIH-Thrombinein-Jroteingehalt des Enzympräparates; J8tufe III = etwa 200 - 400 NIH-Thrombinein-
heiten pro mg 'roteingehalt des Enzymprkparates.
der Aminosäureanalysen des erfindungsge-
mäseen Enaymprlparates schwanken je nach dessen Reinheitsgrad durchschnittlich zwischen den nachstehend angegebenen Grenzen, die jedoch nicht als absolute Werte aufzufassen sind. Die Anjinpsäureanalysen wurden durch Hydrolyse des Enzympräparat^» mit konstant siedender Salzsäure (5,7-.bis 6-normal)\bei\ 1100C während 22 bis 72 Stunden in einer Stick stoffatmdsphfl
> durchgeführt.
ORIGINAL INGPECTED
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Aminosäuren Asparaginsäure
Threonin
Serin
Glutaminsäure
Prolin
Glycin
Alanin
Cystin 1/2
Valin
Methionin
Isoleucin
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin
Histidin
Lysin
Arginin Mikromol pro mg Peptidkomponente
1 - 1,3 0,35 - 0,55 0,4 - 0,5 0,65 - 0,75 0,55 - 0,9 0,65 - 0,9 0,4 - 0,65 0,35 - O1S 0,45 - 0,6 0,1 - 0,2 0,45 - 0,75 0,45 - 0,65 0,3 - 0,5 0,3 - 0,45 0,2 - 0,25 0,45 - C ,65 0,3 - 0,45
Zusätzlich werden nachstehend als Beispiele einige Aminosäureanalysenwerte für Enzympräparat?. (Λ und B) mitverschiedenen Reinheitsgraden angeführt, A = Enzympräparat von Reinheitsstufe II, B = Enzympräparat von Reinheitsstufe III,
Aminosäuren
Mikromol_promg P e'pfTi d κ omponer, I c A
Asparaginsäure
Threonin
Serin
Glutaminsäure
Prolin I8OB -""1,1 1,17 - 1,25 0,35 - 0,41
0,43 - 0,45
0,67 - 0,7
0,58 - 0,76
G ,42 - 0,54 0}41 .- 0,5 0,66 - 0,71
0,79 - 0,37
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Aminosäuren (Forts.) . Mikromol pro reg
Peptidkonporente (Forts.
Glycin % 0,67 - 0,76 0,76 - 0,9
Alanin 0,41 - 0,5 0,63 - 0,64
Cystin 1/2 0,47 - 0,6 0,35 - 0,42
Valin 0,47 - 0,55 0,55 - 0,6
Methionin 0,17 - 0,2 0,13 - 0,17
Isoleucin 0,45- 0,55 0,65 - 0,72
Leucin 0,46 - 0,47 0,6 - 0,G4
Tyrosin 0,33-0,5 0,3 - o,36
Phenylalanin 0,33 - 0,43 0,33 - 0,38
Histidin 0,2 - 0,22 0,21 - 0,23
Lysin 0,5 - 0,64 0,48 - 0,53
Arginin 0,3 - 0,4 0,32 - 0,36
Die Kohlenhydratkomponente des erfindungsgemässen Enzympräparates ist sehr wahrscheinlich mindestens teilweise als Glykopeptid(e) an ein oder mehrere Polypetid(e) gebunden. Die Bestimmung des Kohlenhydrat-(Neutralzucker)-gehaltes wurde nach der sogen. Orcin-Methode (siehe L.F. Hewitt, Biochem. J. 3^L, 360, 1937) durchgeführt.
Das Enzympräparat der Reinheitsstufe III (d.h. das Präparat, welches weitgehend oder vollständig von inaktiver Substanz befreit ist) enthält eine Peptidkomponente mit einem Molekulargewicht von etwa 38000 bis 55000. Die Peptidkomponente des Enzympräparates von Reinheitsstufe II weist ein Molekulargewicht von etwa 2 8000 bis 55000 auf.
Das Enzympräparat von Reinheitsstufe II enthält offenbar eine Komponente, die den Faktor XIII aktiviert.
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In einem höher gereinigten Zustand (z.B. bei Reinheitsstufe III) weist die Peptidkomponente des Enzympräparates die nachstehend wiedergegebene Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-terminalen Kottenende, auf: Valin —> Isoleucin —t Glycin —> Glycin —+ Asparaginsäure —> Glutaminsäure. Diese Aminosäuresenuenz wurde nach der Edman1sehen Abbanmethode (siehe "Protein Sequence Determination" von S.B. Needleman, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, New York, 1970, Seiten 211 und ff.) bestimmt.
Das erfindungsgemässe Enzympräparat zeichnet sich ferner dadurch aus, dass es frei von auf das Nervensystem schädliche Wirkungen ausübenden Neurotoxinen, Bradykinin bildenden Proteasen (Bradykinin übt eine blutdrucksenkende Wirkung aua), Phospholipasen (welche haemolytisch wirken und Nierenschäden verursachen) , Aminosäureoxydasen und Phosphatasen ist.
Das Enzympräparat gemäss der Erfindung kann als Reagens und Hilfsmittel für gerinnungsphysiologischo Untersuchungen ijn vitro verwendet werden, 25.B. für die Untersuchung der Fibrinogen-Fibrin-Umwandlung in Anwesenheit von Heparin und Antithrombinen, für Untersuchungen über Fibrinopeptide, pathologische Fibrinogenstrukturen, Fibrinogenspaltprodukte, Faktor VIII und Faktor XIII.
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In vivo, in verhältnismässig niedrigen- Dosen verabreicht, bewirkt das erfindungsgemässe Enzympräparat eine Verkürzung der Blutungs- und Gerinnungszeiten bei Versuchstieren r.cwia bei Patienten mit normalem oder pathologischem Haeinostasestatuo . In massigen Dosen an gesunde Menschen intravenös verabreicht, bewirkt das Enzympräparat die Bildung von löslichen Fibrinogen-Fibrin-Komplexen im zirkulierenden Blut, was im positiven Cryofibrin- und Parakoagulaticnstest im Plasma zum Ausdruck kommt. Die Bildung soldier Komplexe lässt sich -auch durch N-torminale Analysen von Plasmafraktionen aus dem'Blut von Patienten bestätigen. Das erfindungsgemässe Enzympräparat ist deshalb als Haomostatikum verwendbar.
Verabreicht man das neue Enzympräparat in höheren Dosen an "Hunde, so beobachtet man eine rasche Defibrinogenierung sowie eine sekundäre Fibrinolyse und das Auftreten von Fibrinogendegradationsprodukten (FDP) im Blut. Defibrinogenierung und Fibrinolyse erfolgen ohne Schocksyrnptoma , ohne Thrombozytopenie und ohne thromboombolische oder haemorrhagische Komplikationen. Klinische Versuche an Patienten mit Beinvenenthrombosen oder mit Thrombosen der Rotinavenon haben gezeigt, dass das erfindurigsgemässe Enzympräparat sich besonders gut für die defibrinogenierende.. und fibrinolytische Therapie eignet.
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Als Reagens kann das neue Enzympräparat unseres Wissens in seinem speziellen Anwendungsgebiet durch kein anderes vergleichbares Präparat ersetzt werden. Zwar ist auch die über ein Staphylokokken-Enzym gewonnene Thrombinkoagulase ein thrombinartiges Enzym, welches durch Antithrombine nicht gehemmt wird, andererseits aus dem Fibrinogenmolekül sowohl Peptid A als auch Peptid B abspaltet, im Gegensatz zu dem erfindimgsgemä.SGcn Enzympräparat, das nur Peptid A abspaltet.
Unter den thrombinartig v/irksamen Haemostatika nimmt das erfindungsgemässe Enzympräparat durch seine Injizierbarkeit eine Sonderstellung ein. Thrombin, Thrombinkoagulase und thrombinerzeugende Stoffe, wie komplette Thromboplastino und das Gift der Russel-Viper, bewirken beo/parenteraler Verabreichung thromboembo] ische SympuoB-a und Thrombozytopenie", sie können deshalb nur lokal ν -abreicht werden.
Wird das erfindungsgemässe Enzympräparat in höheren Dosen zur defibrinogenierenden und fibrinolytinchen Behandlung thromboembolischer Leiden verwendet, go wirkt es als Antikoagulans und bewirkt gleichzeitig Fibrinolyse. Infolge des Entzuges und des Abbaus des grossten Teiles des Fibrinogens verliert das Blut seine Kcagulierfähigkeit. Die als Folge der induzierten Fibrinolyse gebildeten Fibrinogenspaltprodukte üben ausserden: eins gerinnungshemmende Wirkung aus. Wach einsr mehrtügigen (z.B. 2- bis
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3-tägigen Behandlung) ist die Konzentration an Fibrinogenspaltprodukten so klein, dass die Blutungstendenz nicht erhöht ist. Im Verlaufe der Defibrinogenierung tritt keine Thrombozytopenie auf, und die Patienten zeigen keine wesentlich verstärkte Blutungstendenz bei einem Fibrinogenspiegel von 0,01-0,05 g pro 100 ml Plasma. Diese Patienten können ohne Gefahr von Blutungen chirurgischen Eingriffen unterworfen werden. Die Tatsache, dass das erfindungsgemässe Enzympräparat, wenn es in entsprechender Dosierung als Antikoagulans verwendet wird, die Haemostase nicht merklich beeinträchtigt, stellt einen grossen Vorteil gegenüber den Antikoagulantien der Heparingruppe und der Dicumarolgruppe dar, welche die Synthese verschiedener Koa°;ulat ions faktor en in der Leber hemmen und die Haemostasevorgänge stark beeinträchtigen. Infolge seiner hohen Antikoagulationsaktivität eignet sich das erfindungsgemässe Enzympräparat besonders gut zur Verhinderung der Thrombusbildung während chirurgischen Eingriffen. Bisher wurden bei Patienten, denen das Enzympräparat intravenös verabreicht worden war, keine Resistenzerscheinungen beobachtet. Dosierung und Ueberwach· ung der Therapie sind bei Verwendung des erfindungsgemässen Enzympräparates äiBserst einfach.
Gegenüber dem Antikoagulans gemäss dem britischen Patent Nr. 1.094.301 weist das erfindungsgemässe Enzym-
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präparat wesentliche Vorteile auf, insofern als es eine wesentlich langer andauernde biologische Wirksamkeit aufweist. Bei vergleichbarer Dosierung weist das erfindungsgemässe Enzympräparat bezüglich der defibrinogenierenden Wirksamkeit eine wesentlich längere Wirkungsdauer auf. Während das im britischen Patent Nr, 1.094.301 beschriebene Antikoagulans in einer Dosierung von vier- bis sechsmal 60 Einheiten (1 Einheit = Enzymmenge, die an Humanfibrinogen die gleiche Gerinnungszeit wie 1 NIH-Thrombineinheit ergibt\ NIH = National Institute of Health) pro 60 kg Körpergewicht während 24 Stunden verwendet v/erden muss, genügt eine einzige Dosis von etwa 14 Einheiten des erfindungsgemässen Enzympräparates pro 60 kg Körpergewicht, um bei erwachsenen Menschen während 24 Stunden den Zustand der Defibrincgenierung aufrechtzuerhalten. Während Heparin alle 4 bis 6 Stunden verabreicht werden muss, wird mit einer einzigen Verabreichung des erfindungsgemässen Enzympräparates eine mindestens 24 Stunden andauernde Wirkung erzielt. Nach intravenöser Verabreichung bewirkt das neue Enzympräparat keine aktive Immunisierung (Resistenz)♦
Die Wirksamkeit des erfindungsgemässen Enzympräparates wird auf Grund seiner thrombinartigen Wirkung gegenüber Humanfibrinogen gemessen und angegeben. 1 Einheit des erfindungsgemässen Enzympräparates entspricht jener Menge, welche eine Fibrinogenlösung in der bleichen Zeit zur
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Gerinnung bringt wie 1 NIH-Einheit Standard-Thrombin.
In gereinigtem Zustand ist das erfindungsgemässe Enzympräparat in verdünnten Salzlösungen leicht, in destilliertem Wasser jedoch schwer löslich. Aus wässrigen Lösungen ist es mittels Salzen oder mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln fällbar. Es lässt sich an basische Ionenaustauscher reversibel binden und bildet mit Phenol und seinen Derivaten wasserunlösliche Komplexe. Es zeichnet sich ferner durch eine hohe Wärmebeständigkeit und eine ausgeprägte Beständigkeit gegenüber Säuren aus.
Als Haem<>statikum wird das erfindungßgemässe Enzympräparat zweckinässigerweise in täglichen Dosen von etwa 0,25 bis 1,5 NlH-Einheiten pro 60 kg Körpergewicht verabreicht. Als Ölutantikoagulans wird das Enzympräparat zweckmässigerweise in täglichen Dosen von etwa 2 bis 100 NIH-Einheiten, vorzugsweise etwa 7 bis 14 NIH-Einheiten, pro 60 kg Körpergewicht verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein pharmazöutisches Produkt, welches das erfindungsgemässe Enzympräparat als Wirkstoff enthält. Wird dieses Produkt als Blutantikoagulans verwendet, so enthält es pro Dosiseinheit zweckmässigerweise etwa 10 bis 500 Mikrogramm, vorzugsweise etwa 40-80 Mikrogramm, des Wirkstoffes. Das Enzympräparat wird zweckmässigerweise in einem für parenterale Verabreichung geeigneten wässrigen Medium gelöst. Für praktiaeh· Zwecke eignen sich beispielsweise besonders
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gut Ampullen mit 2 ml wässriger Lösung des Enzympräparates. Diese Lösung enthält zweckmässigerweise etwa 0,9 Gew.# NaCl, etwa 0,3-0,5 Gew.% Phenol oder etwa 0,3-0,5 Gew.% Trichlorisobutanol und etwa 0,01-0,2 Gew.^ partiell hydrolysierter Gelatine oder Humanalbumin (als Stabilisator) und weist ein p„ von etwa 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 645, auf.
Die Erfindung betrifft ferner ein Reagens, das für BlutUntersuchungen in vitro (LabOratoriumsversuche) verwendbar ist. Dieses Reagens eignet sich für Untersuchungen von menschlichem Blut und von Blut anderer Säugetiere, beispielsweise zur Bestimmung der Fibrinbildung, zur Feststellung von Anomalien in der Fibrinbildung, zur raschen Bestimmung des Fibrinogenspiegels in Gegenwart von Heparin, zur raschen Bestimmung von Fibrin und Fibrinspaltprodukten im Plasma, oder anstelle von Thrombin {Thrombinersatz) in Blutkoagulationsprüfungen.
Für praktische Zwecke weist das erfindungsgemässe Reagens zweckmässigerweise die Form eines Präparates auf, das beispielsweise 10 - 50 Mikrogramm lyophilisiertes (durch Gefrieren getrocknetes) Enzympräparat, 1 mg partiell hydrolysierter Gelatine (Stabilisator), 2 mg p-Hydroxybenzoesäure-methylester, 8,5 mg NaCl und Glycin ad 34 mg in 1 ml destilliertem Wasser enthält.
Beispiel 1
20 g Bothrops-atrox-Gift wurden in 1000 ml 0,9#iger NäCl-Lösung gelöst. Die Lösung wurde während 10 Minuten
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bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen. Das Zentrifugat wurde mit verdünnter Essigsäure auf p„ 3,5 eingestellt, in einem Wasserbad während 1 Stunde auf 3O0C erhitzt und anschliessend zentrifugiert. Der Rückstand wurde verworfen, und das Zentrifugat wurde mit NaOH auf p„ 6,5 eingestellt und mit 0,9^-iger NaCl-Lösung auf ein Volumen von 1000 ml ergänzt. Der Lösung wurden unter stetem Rühren 670 ml gesättigte Arnmoniumsulfatlösung zugesetzt. Nach 1-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zentrifugiert, um den entstandenen Niederschlag abzutrennen. Das Zentrifugat wurde mit weiteren 552 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt und nach 1 Stunde zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde verworfen. Der Niederschlag wurde in 100 ml destilliertem V/asser gelöst und das p„ der Lösung mittels verdünnter Essigsäure auf 5,0 eingestellt, worauf die Lösung unter stetem Rühren mit 7,7 ml Phenol(90$) versetzt wurde. Man liess das Gemisch während 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen und trennte hierauf den gefällten Enzym-Phenol-Komplex durch Zentrifugation ab. Das Zentrifugat wurde verworfen. Der Niederschlag wurde zweimal mit je 10 ml von mit Phenol gesättigtem V/asser gewaschen, zentrifugiert, in 50 ml 1^-iger Essigsäure in Aethanol aufgenommen, während 1 Stunde gerührt und hierauf auf einer Glasfilternutsche abfiltriert. Der Filterrückstand wurde mit mehreren Portionen von 20 ml Aethanol nachgewaschen
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und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 2-2,5 g lagerfähiges Enzympräparat der Reinheitsstufe I mit einer Aktivität von etwa 10-12 NIH-Einheiten pro mg Trockensubstanz.
Das rohe Enzympräparat wurde in 40 ml TRIS-Phosphatpuffer (ρ« 6,0/0,02 molar) aufgenommen und während 15 Minuten gerührt. Ungelöste Anteile wurden durch Zentrifugati on von der Lösung abgetrennt. Das klare Zentrifugat wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von 0,8-1,0 ml/Min, in eine Säule von 200 ml von in TRlS-P04~Puffer äquilibriertem DEAE-"Sephadex" einfliessen gelassen und hierauf mit 800 ml der gleichen Pufferlösung eluiert. Das erste Eluat wurde verworfen. Dann wurde die aktive Substanz mit 400 ml TRIS-PO4-PUffer (0,04 molar) eluiert. Das aktive Eluat wurde auf einem Ultrafilter UM-IO (AMICON) unter Druck konzentriert und salzfrei gewaschen. Das salzfreie Konzentrat wurde im Vakuum über P2^s 0&er durch Einfrieren getrocknet. Man erhielt 200-250 mg Enzympräparat der Reinheitsstufe II mit einer Aktivität von etwa lCO-150 NIH-Einheiten pro mg Proteingehalt.
Durch Einengen des salzfreien Konzentrates auf dem Ultrafilter auf etwa 5 ml, Filtration der Lösung durch eine GlasfiIternutsche der Porosität G-4 und Stehenlassen der klaren Lösung während mindestens 24 Stunden im Kühlschrank bei +20C, lieiis sich das Enzympräparat in rechteckigen Kristallen abscheiden, welche durch Zentrifugati on bei
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0-20C abgetrennt, mehrmals mit 0,5 ml destilliertem Wasser unter Eiskühlung gewaschen und schliesslich über P2O5 getrocknet wurden. Man erhielt 45 mg farbloses Enzympräparat mit einer Aktivität von etwa 150-200 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt.
Bei s ρ i e 1 2
20 g Bothrops-atrox-Gift wurden in 1000 ml 0,9^-iger NaCl-Lösung gelöst. Das p„ der Lösung wurde auf 6,5 eingestellt. Nach Zugabe von 670 ml gesättigter wässriger Ammoniumsuifatlösung wurde das Gemisch während 1 Stunde bei 200C gehalten und dann zentrifugiert. Dem Zentrifugat wurden weitere 552 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt und in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Einstellung des p„ auf 3,5 mittels verdünnter Essigsäure wurde die Lösung während 1 Stunde auf 3O0C erhitzt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Zentrifugat wurde auf pH 5,0 eingestellt, mit 3 ml m-Kresol versetzt und während 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt, zweimal mit je 10 ml von mit Kresol gesättigtem Wasser gewaschen und in 50 ml destilliertem Wasser unter Zugabe von 1-n NaOH b:i Pu 8,0 gelöst. Durch Zentrifurcation wurden ungelöste Anteile entfernt. Das Zentrifugal wurde hierauf durch ein
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Ultrafilter "AMICON" UM-IO filtriert und so lange mit destilliertem Wasser nachgewaschen, bis im abfliessenden Filtrat durch Eisen- -chlorid-Reaktion kein Kresol mehr nachweisbar war. Der enzymhaltige Filterüberstand wurde in 20 ml TRIS-PO4-PUffer (pH 6,0/0,02 molar) aufgenommen, durch Zentrifugation von ungelösten Anteilen befreit und hierauf bei einer Fliessgeschwindigkeit von 0,8-1 ml/Minute in eine Säule von 200 ml von mit dem gleichen Puffer äquilibrierten DEAE-"Sephadex" A-50 einfliessen gelassen und hierauf mit 800 ml TRIS-PO4-PUffer (pu 6,0/0,02 molar) nachgewaschen. Dann wurde die aktive Substanz mit 400 ml TRIS-PO4-PUffer (pH 6,0/0,04 molar) eluiert. Das aktive Eluat wurde auf einem Ultrafilter UM-IO unter Druck konzentriert und salzfrei gewaschen.
Das derart gewonnene Konzentrat kann entweder direkt zu einer sterilen Injektionslösung verarbeitet oder im Vakuum getrocknet werden. Man erhält nach Trocknung etwa 200 mg Enzym mit einer Aktivität von etwa 120-160 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt.
Beispiel 3
?
Eine Kolonne von 1,8 cm' Querschnitt und 92 cm Länge
wurde mit "Sephadex" G-100 beschickt. Das "Sephadex"-Gel
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wurde mit 10$-iger wässriger Essigsäure äquilibriert. G,26 mg des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Enzympräparates (Reinheitsstufe II) wurden in 0,3 ml 10$*-iger Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf die Kolonne aufgetragen. Als Eluierungsmittel wurde 10/6-ige Essigsäure verwendet, die bei einer Fliessgeschwindigkeit von 5,6 ml/Stunde.aufsteigend durch die Gelsäule geleitet wurde. Es bildeten sich zwei im UV (2 80 ηιμ) absorbierende Zonen. Das der ersten Zone entsprechende Eluat wurde durch Einfrieren im Vakuum getrocknet. Man erhielt 4,25 mg Enzympräparat mit einer Aktivität von 200-250 NIH-Thrombineinheiten pro mg Proteingehalt.
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Claims (14)

PATENTANSPRUCHS ίί\ Enzympräparat, welches bei Verabreichung an Menschen und andere Säugetiere in niedrigen Dosen eine haemostatische Aktivität und in höheren Dosen eine blutantikoagulierende Aktivität aufweist und welches die folgenden Eigenschaften besitzt: a) es übt eine thrombinartige Endopeptidasewirkung aus, b) es weist eine Peptidkomponente und eine Kohlenhydratkomponente auf, wobei die Peptidkomponente aus einem oder mehreren Polypeptiden mit Molekulargewichten von etwa 18000 bis 55000 (nach der Methode der Gleichgewichts-Ultrazentrifugation bestimmt) zusammengesetzt ist, c) es weist einen Kohlenhydrat-(bzw. Neutralzuckcr-)-gehalt von etwa 2-10 Gew.^, bezogen auf den Proteingehalt, auf, d) es ist in destilliertem Wasser schwer, in physiologischer Kochsalzlösung jedoch leicht löslich, e) es bildet mit Phenol und Phenolderivaten in Wasser schwer lösliche oder unlösliche Komplexe, f) es bewirkt die Koagulation von Fibrinogen durch selektive Abspaltung von Fibrinopeptiden A aus Fibrinogen ohne Freisetzung von Fibrinopeptiden B, g) es weist, je nach Reinheitsgrad, eine Wirksamkeit von etwa 30 bis 450 NIH-Thrombineinheiten auf, h) es spaltet Tosylarginin-methylester und Gelatine , /jedoch nicht Lysin-methylester, Phenylalanin-äthylester, N-Acetylmethionin , N-Acetyltyrosin, Leucylglycin und Casein, 209833/1028 — JU "" i) es wird durch Heparin, Heparinoide, Hirudin, Antithrombine und den polyvalenten Peptidaseinhibitor nach Kunitz nicht gehemmt, k) es wird bei einer Enzymkonzentration von etwa 5 mg -3 pro ml durch 2,5 χ 10 -molares Diisopropylfluorophosphat bei ρ,, 8 innerhalb 2 Stunden bezüglich seiner Gerinnurigs- und Esterase-Aktivität zu etwa 95% gehemmt,
1) es wird durch Tosylarginin-methylester kompetitiv und durch den im Antibothropaserum enthaltenen Antikörper vollständig gehemmt,
m) es wird durch Fibrin nicht gebunden und dadurch nicht inaktiviert,
n) es weist eine beträchtlich längere biologische Halbwertszeit auf als Heparin,
o) es bewirkt die Bildung von mindestens teilweise löslichen Komplexen aus Fibrin und Fibrinogen ,
p) es wirkt auf Fibrinogen unter Bildung eines Fibrins, welches physikalisch-chemische Eigenschaften besitzt, die von denjenigen des durch Thrombin erzeugten Fibrins verschieden sind, insofern als es sogar in Gegenwart von aktiviertem Faktor XIII und von Ca-Ionen durch fibrinolytische Enzyme, z.B. Plasmin, rasch hydrolysiert wird und in 5-molar cm wässrigem Harnstoff löslich ist, und
q) es verursacht ij^ vivo eine Defibrinogenierung und eine sekundäre Fibrinolyse ohne haemorrhagische und thromboembolische Nebenwirkungen.
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2. Enzympräparat nach Anspruch 1, welches nach Hydrolyse mittels konstant siedender Salzsäure bei 1100C während 22 bis 72 Stunden die folgende Aminosäureanalyse aufweist: Aminosäuren Mikromol pro mg
P e pt i d k omponen te Asparaginsäure 1 - 1,3 Threonin 0,3b - 0,55 Serin 0,4 - 0,5 Glutaminsäure 0,65 - 0,75 Prolin 0,55 - 0,9 Glycin 0,65 - 0,9 Alanin 0,4 - 0,65 Cystin 1/2 0,35 - 0,6 Valin 0,45 - 0,6 Methionin 0,1 - 0,2 Isoleucin 0,45 - 0,75 Leucin 0,45 - 0,65 Tyrosin 0,3 - 0,5 Phenylalanin 0,3 - 0,45 Histidin 0,2 - 0,25 Lysin 0,45 - 0,65 Arginin 0,3 - 0,45 3. Enzympräparat gemäss Anspruch 1 , dessen Peptid- komponente ein Molekulargewicht von etwa 38000 bis 55000 aufweist.
4. Enzympräparat gemäss Anspruch 1, welches in hochgereinigtem Zustand die folgende Aminosäuresequenz, ausgehend vom N-terminalen Kettenende, aufweist: Valin —^ Isoleucin —^ Glycin —y Glycin —*■ Asparaginsäure —^-Glutaminsäure.
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5. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates gemäss Anspruch 1, dadür.ch gekennzeichnet, dass man auf eine wässrige Lösung des Giftes von Bothrops atrox oder einer anderen Schlangenart, deren Gift mit dem Bothropsatrox-Gift eine immunologische Kreuzreaktion eingeht, Phenol oder ein Phenolderivat einwirken lässt, um einen in Wasser schwer löslichen oder unlöslichen Komplex zu bilden, und aus dem Komplex das aktive Enzympräparat freisetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man
(1) eine isotonischewässrige Lösung des Schlangengiftes mit einempu von etwa 4,5 bis 7 herstellt,
(2) entweder
(a) die genannte isotonische Losung einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die genannte Fraktion in destilliertem Wasser löst, die Lösung auf ein p„ von etwa 3 bis 4 einstellt, während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa
30 bis 5O0C erhitzt, ausgefällte Proteine abtrennt und das pH der zurückbleibenden Lösung auf etwa 4 bis 6 einstellt, oder
(b) die genannte isotonische Lösung auf ein p„ von 3 bis 4 einstellt und während einiger Minuten bis zu 2 Stunden bei Temperaturen von etwa 30 bis 500C erhitzt, ausgefällte
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Proteine abtrennt, die zurückbleibende Lösung auf ein p„ von etwa 4,5 bis 7 einstellt und einer fraktionierten Salzfällung unterzieht, um zuerst Ballaststoffe auszuscheiden und dann eine die Wirksubstanz enthaltende Fraktion auszufällen, die letztere in destilliertem Wasser löst und die Lösung auf ein p„ von etwa 4 bis 6 einstellt , und
(3) der gemäss (a) oder (b) erhaltenen Lösung Phenol oder ein Phenolderivat zusetzt, um einen die Wirksubstanz enthaltenden Komplex auszufällen, und entweder
(c) den Komplex durch Behandlung mit verdünnter Essigsäure in einem polaren organischen Lösungsmittel zerlegt und das freigesetzte, ungelöste Enzympräparat isoliert, oder
(d) den Komplex in einem wässrigen Medium mit einer Base bei einem p„ von etwa 7,5 bis 8,5 behandelt und das freigesetzte Enzympräparat durch Ultrafiltration, Dialyse oder Gelfiltration isoliert, und dass man das erhaltene Präparat gegebenenfalls einer weiteren Reinigung unterzieht.
7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reinigung des Enzympräparates durch Chromatographie an einem basischen Ionenaustauscher durchführt .
8. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass man für die genannten fraktionierten Salzfällungen Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze von Mineralsäuren verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 5, 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die fraktionierten Salzfällungen mittels Ammoniumsulfat bei einem p^ von etwa 5 bis 7, vorzugsweise etwa 6,5, durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phenolderivate Phenolcarbonsäuren, Alkylphenole, halogenierte Phenole, halogenierte oder alkylierte Phenolcarbonsäuren oder Salze von Phenolcarbonsäuren oder Derivaten derselben verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 5, 6 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Phenol, Kresol oder Natriumsali cylat verwändet.
12. Verfcä
zeichnet, dass
Chr omat οgraphit
Agarose- oder
hren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennman die Reinigung des Enzympräparates durch >an Gelen, a.B. an ELydextran-, Polyacrylamid-, gar-Gelen, unter Verwendung von Gemischen
aliphatischer Carbonsäuren mit Wasser oder Gemischen von wässrigen Puffern mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln als Fliese- oder Eluierungsmittel durchführt.
13. Pharmazeutisches Produkt, welches bei Verabreichung an Menschen und andere: Säugetieren in niedrigen Dosen als Haemostatikum und in höheren Dosen als Blutantikoagulans wirkt, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff ein Enzympräparat gemäss Anspruch 1 enthält.
ORIGINAL INSPECTED
14. Reagens mit thront»inartiger Wirksamkeit, welches für Untersuchungen des Blutes von Menschen und anderen Säugetieren in vitro verwendbar und dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Wirkstoff ein Enzympräparat gemäss Anspruch 1 enthält.
DerPatentanwah»
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