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KR970001235B1 - 스트렙토마이세테스(Streptomycetes)에서 외래성 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

스트렙토마이세테스(Streptomycetes)에서 외래성 단백질을 제조하는 방법 Download PDF

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KR970001235B1
KR970001235B1 KR1019880005131A KR880005131A KR970001235B1 KR 970001235 B1 KR970001235 B1 KR 970001235B1 KR 1019880005131 A KR1019880005131 A KR 1019880005131A KR 880005131 A KR880005131 A KR 880005131A KR 970001235 B1 KR970001235 B1 KR 970001235B1
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KR
South Korea
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tendamistat
gene
amino acid
plasmid
fusion protein
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KR1019880005131A
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Inventor
콜러 클라우스-페터
요한네스 리스 귄터
Original Assignee
훽스트 아크티엔게젤샤프트
하인리히 벡커, 베른하르트 벡크
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Publication date
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Abstract

내용 없음.

Description

스트렙토마이세테스(Streptomycetes)에서 외래성 단백질을 제조하는 방법
제1도는 일부의 텐다미스태트(tendamistat) 아미노산 서열 다음에 아미노산 7개로 된 가교원(bridging member)이 위치하고, 그 다음에 멍키 프로인슐린의 아미노산 서열이 위치하는 융합 단백질을 암호화하는 하이브리드 플라즈미드 pKK 310의 작제 과정을 도시한 것이다.
제2도는 플라즈미드 pKK 310에서 출발하는 발현 플라즈미드 pTF1의 작제를 도시한 것이다.
제3도는 일부의 텐다미스태트 유전자 다음에 pUC18로부터의 폴리링커가 위치하는 플라즈미드 pRS10의 작제 및 이 플라즈미드의 발현 플라즈미드 pTF10으로의 제작제를 나타낸다(여기에서 mcs는 pUC18의 폴리링커 영역(복수 클론화 부위)를 의미한다).
제4도는 텐다미스태트의 완전한 아미노산 서열 다음에 11개의 아미노산 가교원이 위치하고, 그 다음에 멍키 프로인슐린의 아미노산 서열이 위치하는 융합 단백질을 암호화하는 플라즈미드 pKK 400의 작제 및 이 플라즈미드의 발현 플라즈미드 pGF1으로의 제작제를 나타낸다.
여기에서 도면은 실제 척도로 제도한 것은 아니다.
본 발명은 유전공학 기술을 사용하여, 스트랩토마이세테스(Streptomycetes)에서 외래성 단백질을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
유럽 공개특허공보(EP-A) 제0,161,629호 및 남아프리카공화국 특허 제85/3672호는 스트랩토마이세테스 세포가 폴리팹타이드, 특히 텐다미스태트(tendamistat)를 분비하도록 하기 위한, α-아밀라제 억제제 텐다미스태트의 시그날 팹타이드(프리팹타이드 ; prepeptide)를 암호화하는 DNA의 용도를 기술하고 있다. 원칙상, 텐다미스태트를 생성하는 모든 균주로부터 적합한 DNA를 수득할 수 있으나, 독일연방공화국 공개특허공보 제3,331,860호의 실시예 3에서와 같이 수득한 DNA를 사용하는 것이 바람직하다.
대한민국 특허원 제88-2281호(1987년 3월 6일자 출원된 독일연방공화국 특허원 제P37 07 150.5호에 상응)에는 경우에 따라 변형시킨 암호화 서열을 도입하고 이러한 재조합 유전자를 스트렙토마이세테스 세포내에서 발현시킴을 특징으로 하는, 스트렙토마이세테스로부터 융합 단백질을 분비시키는 방법이 이미 제시되어 있다. 그러므로, 텐다미스태트 구조 유전자가 또다른 유전자에 대한 캐리어(carrier)로서 사용되는 경우, 이로써 수득된, 또다른 단백질의 아미노산 서열을 지닌 융압 단백질이 텐다미스태트 아미노산 서열내에 위치한다. 결과적으로, 다른 단백질을 유리시키기 위한 이러한 융합 단백질의 화학적 또는 효소적 절단으로, 2개의 텐다미스태트 부분-서열이 수득된다. 상기 선행 특허원은 또한 텐다미스태트 유도체에 관한 것이기도 하며, 이것은 현저히 단축된 아미노산 쇄를 지니는 것으로 이해된다. 이러한 종류의 유도체는 가역적인 방법으로 경쟁적 억제 기작의 형태로 특정의 수용체와 반응할 수 있다.
본 발명에, 이르러, 목적하는 단백질의 구조 유전자가 텐다미스태트 유전자(경우에 따라 변형되어 있음)의 (암호화 쇄의) 3'말단에 커플링된 융합 단백질 유전자를 작제함으로써 스트렙토마이세테스에서 외래성 단백질을 제조할 수 있음이 밝혀졌다. 텐다미스태트 유전자의 변형에는 특히 C-말단 단축화가 포함될 수 있다.
텐다미스태트를 암호화하는 DNA는 유럽 공개특허공보 제0,161,629호(여기에서는 DNA 서열 C이다 ; 첨부된 표 1참조)에 기술되어 있다. 이 구조 유전자는 제한효소에 대한 여러개의 절단부위를 함유하며, 이것은 암호화된 아미노산 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다. 적합한 절단부위는 삼중자(triplets) 31 및 32에 있는 BstEⅡ 부위, 삼중자 43 및 44에 있는 StuⅠ 부위, 삼중자 52 및 53에 있는 Sau3A 부위이다. 적합한 링커를 도입함으로써, 이러한 부위에 하나 이상의 아미노산을 추가로 삽입하거나, 이러한 절단부위 사이의 DNA 단편을 제거하거나, 또는 종료 코돈을 도입하여 단축된 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 또한, 위치-특이적 돌연변이 발생(sitespecific mutagenesis)에 의해 목적하는 아미노산을 삽입, 치환 또는 제거할 수 있다. 이러한 방법으로 α-아밀라제 억제작용을 지닌 단백질 뿐만 아니라, 이러한 활성을 갖지는 않으나 상응하는 수용체와 반응하는 단백질을 수득한다.
본 발명은 또한 적합한 유전자 구조물, 이러한 유전자 구조물을 함유하는 백터, 이러한 백터로 형질전환시킨 스트렙토마이세테스 세포, 분비된 융합 단백질 및 외래성 단백질과 텐다미스태트 유도체를 제조하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 이후에서 상세히 기술되며 특허청구의 범위에서 규정된다.
제1도 내지 제4도는 본 발명에 따른 몇몇 플라즈미드의 작제를 나타낸다.
세포로부터 추출되는, 본 발명에 따라 수득된 융합 단백질은 이들을 배양물 여액으로부터 용이하게 분리할 수 있다는 잇점을 지닌다. 분리 과정은 공지된 방법, 유리하게는 흡착 또는 이온 교환 크로마토그라피 및/또는 겔 여과에 의해 수행할 수 있다.
목적하는 외래성 단백질(융합 파트너)은 공지된 방법으로 효소적 또는 화학적 절단에 의해 유리시킨다.
이와 관련하여, 절단 양식은 특히, 목적하는 단백질의 아미노산 서열에 따라 달라진다. 대부분의 경우에서, 텐다미스태트 서열과 목적하는 단백질의 아미노산 서열간의 절단부위에 연결원 또는 가교원을 도입하는 것이 편리할 것이다. 예를들어, 목적하는 단백질이 메티오닌을 함유하지 않은 경우, 연결원은 Met을 의미할 수 있으며, 이때 염화시아노겐 또는 브롬화 시아노겐을 사용하여 화학적으로 절단할 수 있다. 연결원이 카복실-말단 시스테인을 지니거나, 연결원이 Cys인 경우 효소적 시스테인-특이적 절단, 또는 예를들어, 특이적 S-시아닐화한 후 화학적 절단을 수행할 수 있다. 가교원이 카복실-말단 트립토판을 지니거나, 연결원이 Trp인 경우, N-브로모석신 이미드로 화학적 절단을 수행할 수 있다.
아미노산 서열중에 Asp-Pro를 함유하지 않고 산에 대하여 충분히 안정한 목적하는 단백질은, 상기 가교원을 갖는 융합 단백질로서 그 자체가 공지된 방법으로 단백질 분해적으로 절단시킬 수 있다. 이로써, N-말단 프롤린 및 C-말단 아스파르트 산을 함유하는 단백질이 생성된다. 그러므로 이러한 방법으로 변형된 단백질을 합성할 수도 있다.
가교원이 (Asp)n-Pro를 나타내거나 Glu-(Asp)n-Pro(여기에서, n은 1 내지 3이다)인 경우, Asp-Pro결합은 산에 대해 훨씬 더 불안정할 수도 있다.
효소적 절단의 예는 다음 문헌에 기술되어 있으며, 개선된 특이성을 지닌 변형된 효소를 사용할 수도 있다[참조 : C.S. Craik et al.,Science 228(1985) 291-297]. 목적하는 진핵성 펩타이드가 프로인슐린인 경우, 트립신에 의해 제거될 수 있는 아미노산(Arg, Lys)이 프로인슐린의 N-말단 아미노산(Phe)에 결합된 펩타이드 서열, 예를들어, Ala-Ser-Met-Thr-Arg을 선택하는 것이 유리한데, 이는 이렇게 하면 단백질 분해 효소 트립신을 사용하여 아르기닌-특이적 절단을 수행할 수 있기 때문이다.
목적하는 단백질이 아미노산 서열 Ile-Glu-Gly-Arg을 함유하지 않는 경우, 상응하는 가교원을 갖는 융합 단백질은 인자 Xa로 절단할 수 있다[참조 : 유럽 공개특허공보 제0,025,190호 및 제0,161,973호].
절단 생성물의 분리방법은 이들 단백질의 특성에 따라 결정된다. 텐다미스태트 및 이의 유도체의 분리에 관하여는 독일연방공화국 공개특허공보 제3,331,860호에서 인용된 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에서 상세하게 설명된다. 달리 언급하지 않는한, 퍼센트 데이타는 중량을 기준으로 한다. 실시예에서 언급한 번호가 도면에 대해서도 동일하게 적용된다.
실시예
사용되는 출발물질은 플라즈미드 pKAI 650이며, 이것은 독일연방공화국 공개특허공보 제3,536,182호 및 유럽 공개특허공보 제0,218,204호에 기술되어 있다. 상기 플라즈미드는 650bp의 HincⅡ/SstⅠ 단편을 분리한 후 이들 효소에 의해 개환시킨 플라즈미드 pUC19에 클로닝시킴으로써 플라즈미드 pKAI 1(이것은 독일 연방공화국 공개특허공보 제3,331,860호에 기술되어 있다)으로부터 제조할 수 있다. 상기 플라즈미드에 존재하는 독특한 HindⅢ 절단부위는(HindⅢ로 절단하여, 돌출 말단을 메운 다음 연결함으로써) 제거하여 플라즈미드 pKAI 650a(1)를 수득한다.
CsCl 농도구배 원심분리에 의해 정제된 (1) DNA 2㎍을 반응 혼합물 50㎕중에서 제조업자가 명시한 바와 같이 2시간 동안 StuⅠ으로 완전히 분해시키고 상기 효소는 페놀 추출 반응을 통하여 제거한다. 선형화된 DNA를 에탄올로 침전시키고 재용해시킨 후 연결 혼합물에 도입시키고, 여기에 추가의 반응물로서, 화학적으로 합성된 하기의 이본쇄 올리고뉴클레오타이드(2)(이것은 5'말단이 인산화된 것이다) 0.1㎍을 가한다.
Figure kpo00001
이 연결 혼합물을 이 콜라이(E.coli) JM109내로 형질전활시킨 후, 재조합 플라즈미드 pKK 3a(3)를 함유하는 클론을 분리한다. 분리된 플라즈미드 DNA는 제한효소 HindⅢ에 대한 절단부위를 지니므로, 제한분석에 의한 성상 확인이 가능해진다. pKK 3a(3)는 pKAI 650a(1)보다 12개의 염기쌍이 더 많으며, 다음과 같이, 4개의 아미노산에 의해 아미노산 서열이 연장된 뉴클레오타이드 서열을 지니고 있다.
Figure kpo00002
HindⅢ
사용되는 또다른 출발물질은 플라즈미드 pYE 24(4)이다. 이 플라즈미드는 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 벡터 pUC8을 개환하고, 이와 같이 선형화된 플라즈미드를 멍키 프로인슐린에 대한 유전자에 연결한다[표 2 : 참조 ; Wetekam et al., Gene 19(1982) 179-183].
플라즈미드 pYE 24(4)을 2㎍을 제한효소 EcoRⅠ 및 HindⅢ와 반응시키고, 멍키 프로인슐린에 대한 유전자를 전기용출법으로 분리한 후 정제하고, 에탄올 침전법으로 농축시킨 후, 하기의 합성 DNA 링커(5)에 연결한다.
Figure kpo00003
이제 연결 생성물(6)을 HindⅢ로 개환시킨 플라즈미드 pKK 3a(3)에 삽입하여 플라즈미드 pKK 31(7)을 수득한다. 이같은 작제는 텐다미스태트 유전자의 아미노산 Gly 43에 대한 코돈 하부에 하기의 가교원이 존재하는 결과를 초래한다.
Figure kpo00004
상기 서열식 및 표 2에서의 B1은 멍키 프로인슐린의 B쇄의 시작을 의미한다.
플라즈미드(7)에서 프로인슐린 서열은 텐다미스태트 유전자내에 존재한다. 상기 플라즈미드를 본 발명에 따른 플라즈마드로 재작제하기 위해, (7)을 SphⅠ 및 SalⅠ 으로 개환시키고 이로써 선형화된 플라즈미드를 단편(8)과 연결한다. 생성된 플라즈미드 pKK 310(9)은 단축된 텐다미스태트 서열 및 상술한 링커에 바로 이어서 프로인슐린 서열만이 존재하는 융합 단백질을 암호화한다.
전반적인 작제 과정은 제1도에 도시되어 있다.
실시예 2
플라즈미드 pKK 310(9)을 발현 플라즈미드내에 재작제하기 위해, (9)를 SstⅠ 및 SphⅠ과 반응시켜 단편(10)을 분리한다.
시판중인 발현 벡터 pIJ. 702(11)(John Innes Foundation, Norwich, England로부터 구입할 수 있다)를 SphⅠ 및 SstⅠ 으로 개환시키고, 이로써 선형화된 플라즈미드(12)를 단편(10)에 연결시킨다. 균주 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces Lividans) TK 24(John Innes Foundation로부터 구입)를 형질전환시킨후, 티오스트렙톤에 대한 내성을 기준으로 선별하여 목적하는 클론을 동정한다. 티오스트렙톤-내성 클론으로부터 수득된 플라즈미드 DNA를 분리하고 제한 분석법으로 분석한다. 목적하는 배향의 유전자를 지닌 플라즈미드를 pTF1(13)이라 명명한다. 이러한 재조합 플라즈미드를 함유하는 클론은 분자량이 16kD인 단백질을 배양 배지내로 분비한다. 상기 단백질은 인슐린 항체와의 양성 면역블롯팅(immunoblotting) 반응을 나타낸다(실시예 5참조).
pTF1(13)의 작제 과정은 제2도에 도시되어 있다.
실시예 3
플라즈미드 pKK 3a(3) 및 벡터 pUC18을 각기 HindⅢ로 개환시키고 서로 연결한다. 이 연결 혼합물을 사용하여 이 콜라이 균주 JM 109를 형질전환시키는데, 이는 이소프로필-β-티오-갈락토피라노사이드(IPTG) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-Gal)의 존재하에서 무색의 콜로니를 형성하면, 성공적으로 클로닝된 것으로 판정한다. 생성된 재조합 플라즈미드 pRS1(14)은 그 자체가 공지된 방법으로 분리한다. 상기 플라즈미드 1㎍을 제한 효소 SstⅠ으로 절단하고, 재연결시키면 폴리링커 서열(mcs)과 텐다미스태트 유전자의 나머지 부분을 제외한 pUC18 부위가 결실된다. 플라즈미드 pRS10(15)이 수득된다.
플라즈미드(15)는 이의 폴리링커 부분 때문에 목적하는 어떠한 구조 유전자도 클로닝하기에 적합하므로, 단축된 텐다미스태트 서열을 갖는 상응하는 융합 단백질을 암호화하는 플라즈미드를 수득할 수 있다.
pRS10(15)을 SphⅠ 및 SstⅠ 으로 절단하여, 보다 작은 단편이 분리되면, 이를 실시예 2와 유사하게 발현 벡터 pIJ 702에 연결할 수 있다. 이러한 방법으로 발현 베겉 pTF10(16)을 수득할 수 있는데, 이는 마찬가지로, 이의 폴리링커 부위 때문에 다기능성 구조를 지니게 된다.
pTF10(16)의 작제 과정은 제3도에 도시되어 있다.
실시예 4
플라즈미드 pYE 24(4)를 EcoRⅠ으로 개환시키고 하기의 링커를 삽입한 후, 플라즈미드 pYE 241을 수득한다.
Figure kpo00005
실시예 1과 유사하게, HindⅢ로 절단하고, HindⅢ로 절단시킨 pKK 3a(3)에 연결하여 플라즈미드 pKK 32를 수득한다. 이것은 텐다미스태트 서열이 하기의 가교원을 통하여 프로인슐린 서열에 연결된 융합 단백질을 암호화한다.
Figure kpo00006
실시예 1과 유사하게, pKK 32를 SphⅠ 및 SstⅠ으로 절단하고, 크기가 대략 650bp인 단편을, 이들 효소로 이미 개환시킨 pUC19에 클로닝한다. 생성된 플라즈미드 pKK 320은 상기 언급된 가교원(여기에서는 링커에 의해 도입된 서열을 진하게 표시함으로써 강조하였다)을 제외하고는 플라즈미드 pKK 310(9)에 상응한다.
실시예 2와 유사하게, pKK 320에서 수득한 재조합 유전자를 지니는 SstⅠ-SphⅠ 단편을 pIJ 702에 클로닝시켜, 발현 플라즈미드 pTF2를 수득한다. 16kD의 융합 단백질은 에스.리비단스 TK 24에서 발현시켜 분비시키며, 당해 단백질은 인슐린 항체와 반응한다(참조 ; 실시예 5).
pTF2의 작제 과정은 제1도 및 제2도에 도시된 pTF1(13)의 작제 과정과 유사하므로 본 도면에서는 도시하지 않았다.
실시예 5
pKK 310(9)을 EcoRⅠ으로 부분적으로 분해하여 2개의 EcoRⅠ 절단부위중 어느 하나만을 개환시킨다. 돌출 말단을 클레나우(Klenow) 폴리머라제를 사용하여 채운 후, 플라즈미드를 재연결시키고, 제한 분석을 통하여 결과를 확인한다. 프로인슐린 유전자의 말단에 위치하는 EcoRⅠ 부위가 제거된 목적하는 플라즈미드를 pKK 310a(17)라 한다. 이렇게 함으로써, 이 플라즈미드는 단축된 텐다미스태트 유전자와 프로인슐린 유전자 사이의 링커 영역내에 EcoRⅠ에 대한 독특한 제한부위를 함유하게 된다.
완전한 텐다미스태트 서열을 지니는 융합 단백질을 암호화하는 플라즈미드를 제조하기 위해, kpnⅠ에 대한 독특한 절단부위를, 아미노산 68/69에 대한 코돈 영역에서 텐다미스태트를 암호화하는 DNA 서열(표 1)에 도입시킨다. 상기 플라즈미드는 SstⅠ 및 SphⅠ으로 분해하는 pKAI 650a(1) 및 파아지 M13mp18RF DNA(이것은 상기 두개의 효소에 의해 마찬가지로 절단된다)에 클로닝되는 크기가 650bp인 단편으로부터 분리한 DNA 및 공지의 방법으로 제조되는 일본쇄 DNA를 함유한다. 상기 ssDNA 1㎍을 부위-지시된 돌연변이 발생에서의 돌연변이원성 프라이머(primer) 5' C GAG GTA CCG GGC GT 3' 0.1㎍과 함께 사용한다[참조 ; M.J. Zoller and J. Smith, Nucleic Acid Res. 10(1982) 6487-6500].
RF DNA는 돌연변이된 유전자를 지니는 분리된 M13 클론에서 분리되며, 이것은 추가의 kpnⅠ 절단부위에 의해 선별될 수 있으며, 염기교환(Arg68에 대한 코돈에서 3번째 부위의 C가 G로 치환됨)은 서열분석으로 확인한다. 이러한 뉴클레오타이드 교환은 아미노산 서열변화를 유발하지는 않으나 텐다미스태트 구조 유전자에 목적하는 새로운 독특한 절단부위(하기 참조)를 도입한다.
Figure kpo00007
SstⅠ-SphⅠ 절단 후에, 돌연변이된 서열을 M13mp18 RF DNA로부터 제거하여 플라즈미드 pUC19내로 클로닝시키면, 플로즈미드 pKAI 651(18)가 수득된다.
확인하기 위해, (18)로부터 수득한 650bp의 SstⅠ-SphⅠ 삽입체를 실시예 2에서와 같이 플라즈미드 pIJ 702에 삽입하여 플라즈미드 pAX 651을 수득한다. 이러한 플라즈미드를 스트렙토마이세스 리비단스 TK 24에 형질전환시킨 후, 수득된 텐다미스태트의 발현율은 변형되지 않는 탠다미스태트 유전자를 지니는 플라즈미드 pAX 650(참조 : 독일연방공화국 공개특허공보 제3,536,182호 ; 제3도)의 발현율은 동일하다.
텐다미스태트의 완전한 아미노산 서열을 지니는 융합 단백질에 대한, 본 발명에 따른 플라즈미드를 제조하기 위해, 플라즈미드 pKAI 651(18)을 SphⅠ 및 KpnⅠ으로 절단하고, 작은 단편을 하기의 링커(19) 및 SphⅠ 및 KpnⅠ으로 절단하고, 작은 단편을 하기의 링커(19) 및 SphⅠ 및 EcoRⅠ으로 개환시킨 플라즈미드 pKK 320a(17)에 연결시킨다.
Figure kpo00008
이러한 연결 혼합물을 사용하여 이.콜라이 JM 109를 형질전환시키고, 이 플라즈미드 DNA를 분리한 후, DNA 서열 분석을 통해 융합 여부를 확인한다. 목적하는 서열을 지닌 플라즈미드를 pKK 400(20)이라 한다.
링커(19)는 텐다미스태트의 잔여 아미노산 뿐만아니라 텐다미스태트와 프로인슐린 유전자를 서로 분리시키는 스페이서(spacer)부위까지 암호화하며 모두 표 2에 나타낸 바와 같은 5' 말단과 함께 하기의 11개 아미노산에 대한 코돈도 함유한다.
Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg
그러므로, 융합 단백질은 스페이서내에, 특히 아미노산 메티오닌 및 아르기닌을 함유하므로 시아노겐 할라이드 또는 트립신으로 절단될 수 있다.
약 1090bp의 삽입체를 SstⅠ 및 SphⅠ으로 이중-절단하여 플라즈미드 pKK 400(20)으로부터 분리하고 이 DNA를 동일한 효소로 개환시킨 플라즈미드 pIJ 702(12)에 연결시킨다. 플라즈미드 pGF1(21)을 수득한다. 이 연결 혼합물을 에스.리비단스 TK 24내로 형질전환시키고, 텐다미스태트 활성을 지닌 티오스트렙톤-내성 형질전환체에서 플라즈미드 DNA를 분리한다. 모든 양성 클론은 크기가 1090bp인 pGF1 SstⅠ-SphⅠ 삽입체를 함유한다.
pGF1(21)의 작제 과정은 제4도에 도시되어 있다.
텐다미스태트 활성은 유럽 공개특허공보 제0,161,629호의 실시예 3 및 독일연방공화국 공개특허공보 제3,536,182호의 실시예 2에 기술된 플레이트 분석을 통해 측정한다.
pGF1에 의해 암호화된 융합 단백질은 공지의 방법으로 발현시킬 수 있다. 형질전환된 균주 에스.리비단스 TK 24를 28℃에서 4일간 진탕 플라스크내에서 배양하고 원심분리하여 균사를 배양액에서 제거한 후, 융합 단백질을 투명한 용액중에서 하기와 같이 검출할 수 있다.
용액 10 내지 100㎕를 15% 트리클로로아세트산 20 내지 200㎕와 혼합하고 침전된 단백질을 원심분리하여 농축시킨 후, 세척하고 SDS-함유 시료 완충액에 용해시킨다[참조 : U. Laemmli, Nature 227(1970) 680-685]. 90℃에서 2분간 배양한 후, 시료를 10 내지 17% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동적으로 분리한다. 분자량이 19kd인 단백질을 수득하며, 이것은 즉, 텐다미스태트 및 프로인슐린으로 구성된 융합 단백질의 예상 분자량 범위이다. 이 융합 단백질은 텐다미스태트에 대한 항체 및 인슐린에 대한 항체 모두와 반응한다.
Figure kpo00009
Figure kpo00010
B1, C1 및 A1는 멍키 프로인슐린의 B, C 및 A쇄의 시작을 나타낸다.

Claims (7)

  1. 변형되지 않은 텐다미스태트(tendamistat) 유전자 또는 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 갖도록 이의 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트 유전자의 암호화 쇄의 3'말단상에 목적하는 단백질에 대한 구조 유전자를 커플링시키고, 스트랩토마이세테스(Streptomycetes) 숙주 세포내에서 상기 유전자 구조물의 발현을 유도한 후, 분비된 융합 단백질을 상등액으로부터 분리함을 특징으로 하는, 융합 단백질의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 갖도록 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트 유전자의 3'말단에서 커플링이 수행되는 방법
  3. 추가의 단백질에 대한 구조 유전자가 3'말단상에 커플링된 변형되지 않은 텐다미스태트 유전자 또는 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 갖도록 이의 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트 유전자를 함유하는 유전자 구조물.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 갖도록 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트 유전자를 함유하는 유전자 구조물.
  5. 제3항 또는 4항에서 청구된 유전자 구조물을 함유하는 벡터.
  6. 변형되지 않은 텐다미스태트 유전자 또는 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 갖도록 이의 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트의 N-말단 부분말을 함유하는 유합 단백질.
  7. 제6항에 청구된 융합 단백질, 또는 제1항 또는 제2항에 청구된 바와 같이 수득할 수 있는 융합 단백질을 절단함을 특징으로 하여, 변형되지 않은 텐다미스태트 또는 아미노산 잔기 제1번에서 제43번까지의 아미노산 서열을 갖도록 이의 C-말단 단축화를 통해 변형시킨 텐다미스태트와 추가의 단백질(이는 상기 융합 단백질에서 융합 파트너가 된다)을 제조하는 방법.
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