DE3331860A1 - Verfahren zur herstellung von tendamistat - Google Patents
Verfahren zur herstellung von tendamistatInfo
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Classifications
-
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Description
HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT " HOE 83/F 175 Dr.KL/mü
Verfahren zur Herstellung von Tendamistat
Tendamistat ist ein^-Amylase-Inaktivator, der durch Fermentation
von Streptomyces tendae gewonnen wird. In der deutschen Offenlegungsschrift 27 01 890 (bzw. den US-Patentschriften'
4 226 764, 4 282 318 und 4 339 436) ist
£Φ 5 ein Fermentationsverfahren beschrieben, bei dem der Stamm
S. tendae ATCC 31 210 eingesetzt wird. Gemäß der ver-OO
öffentlichten europäischen Patentanmeldung (EP-A 2) 49
c^ ist dieser Inaktivator ein Peptid aus 74 Aminosäuren (im
Gemisch mit weiteren, partiell abgebauten Peptiden), der besonders vorteilhaft durch Fermentation mit S. tendae
DSM 1912 (ATCC 31 969) gewonnen wird. In dieser Druckschrift wird der Inaktivator auch als HOE 46 7 bzw. die
Komponenten als HOE 467-A und HOE 467-B bezeichnet. Isolierung und Reinigung erfolgen durch Absorption bzw.
Chromatographie. Es wurdeauch schon ein Kristallisierverfahren vorgeschlagen (Deutsche Patentanmeldung
P 33 09 059.9).
Es wurde nun gefunden, daß die Ausbeute von Tendamistat durch eine Stammverbesserung noch erheblich verbessert
werden kann. Während nach den bekannten Verfahren mit
dem Stamm DSM 1912 (ATCC 31 969) eine Tendamistat-Ausbeute von 0,07 g/l erreicht wird, wird diese durch die
erfindungsgemäße Stammverbesserung auf mindestens 1,
meistens sogar 1,5 bis 1,8 g/l erhöht. Die erfindungsgemäße
Stammverbesserung v/ird durch Behandlung der Tendamistat produzierenden S. tendae-Stämme, vorzugsweise
von S. tendae DSM 2727, mit dem Mutagen Acriflavin. in sublethalen Dosen erreicht. Der Stamm DSM 2727 wurde
durch passive Selektion aus dem Stamm DSM .1912 isoliert. Als Selektionskriterium diente die Tendamistatbildung,
wobei dieser Stamm ca. 0,0 9 g/l liefert.
Die Erfindung beLrifft weiterhin die verbesserten Stämme,
ein diese Stämme charakterisierendes DNA-Segment von ca. 37 kb (Kilobasenpaare) Größe mit definiertem Fragracntmuster,
GOPY /
das Gen für Tendamistat, dieses Gen enthaltende Hybridplasmide
und solche Hybridplasmide enthaltende Wirtsorganismen.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausgestaltungen sind in den Patentan-Sprüchen
definiert. Im folgenden werden vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung näher erläutert:
Eine Stammverbesserung hinsichtlich der Überproduktion eines Proteins, wie es Tendamistat darstellt, kann durch Verbesserung
der Durchlässigkeit des Proteins durch die Zellmembran sowie durch Erhöhung der Syntheserate oder durch Kombination
von beiden erreicht werden (J. Mandelstam et al., Biochemistry of
Bacterial Growth; Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne; Blackwell Scientific Publications, 1982). Eine
Steigerung der Syntheserate läßt sich z.B. erreichen auf physiologischem Wege durch Induktion der Genaktivität mittels
eines Induktors; auf genetischem Wege durch mutatives Entfernen eines die Ablesung des Gens blockierenden Repressors,
durch strukturelle Veränderung regulatorischer Bereiche (Promotoren) vor dem Strukturgen, die eine erhöhte Ableserrate
des Gens zur Folge haben, oder durch die Vermehrung der Kopienzahl eines Gens inclusive seiner regulatorischen
Bereiche über Genmanipulation. Die Kombination dieser Möglichkeiten wird im Rahmen des genetic engineering in der Regel mit Hilfe
von Plasmiden beschritten (R.E. Glass, Gene Function. London; Croom Helm, 1982) .
Es wurde nun gefunden, daß - insbesondere ausgehend vom Stamm DSM 2727 - bedeutend leistungsfähigere Mutanten isoliert
werden können nach einer für Streptomyceten bislang nicht beschriebenen Mutationstechnik. Das Mutationsprinzip
. besteht darin, daß Acriflavin in niedriger Dosierung von etwa 5 bis 50, vorzugsweise 10 bis 30, ,ug pro ml Kulturlösung
über den gesamten Zeitraum des Zellwachstums in einer Schüttelkultur einwirkt. Vorteilhaft ist die Verwendung des
Fermentationsmediums als Schüttelkulturmedium. 12-24 Std. nach Erreichen der stationären Wachstumsphase werden die mutierten
Zeilverbände homogenisiert und die aus 5-10 Zellen bestehenden
Mycelbruchstüeke auf einem Agarmedium ausplattiert. Die aus diesem ausgewachsenen, mutierten Zellklone werden
auf Schrägagarröhrchen vermehrt und in der Schüttelkultur getestet. Die Selektion überproduzierender Stämme erfolgt
über die Messung des (^-Amylasegehaltes im Fermentationsmedium.
So selektionierte Mutanten, wie die Stämme 1-9353» 1-9362 und 1-9418, treten mit außergewöhnlich hohen Mutationsraten
auf. Die Produktionserhohung gegenüber dem Stand der Technik'(DSM 1912) beträgt oft mehr als
2000 %.
Es wurde weiterhin gefunden, daß die Mutanten gegenüber dem Staiim
DSM 1912 eine um weitere 60 % verringerte Bildung eines roten Pigmentes (vgl. EP-A 49 847) aufweisen. Die vermehrte
Bildung an Tendamistat sowie der wesentlich geringere Verunreinigungsgrad
der Kulturlösung erleichtern folglich die Aufarbeitung des inaktivators und stellen somit einen bedeutsamen
verfahrenstechnischen Fortschritt dar.
Es wurde gefunden, daß die erhaltenen Mutanten genetisch stabil sind, d. h. ihre Produktivität bleibt über mehrere
Generationen erhalten. Die Stämme und deren Abkömmlinge eignen sich somit zur Produktion von Inaktivator in großem
Maßstab durch Fermentation.
Es wurde durch molekularbiologische Analyse bewiesen, daß die Überproduktion des Tendamistat auf die Vermehrung des
entsprechenden Gens zurückzuführen ist. Diese Genmanipulation wurde aber nicht auf üblichem Wege durch Einführen
eines MuIticopy-Plasmids, welches das Gen enthält, erreicht.
Durch die hier beschriebene Art der Mutation wurde vielnehr
eine tiefgreifende Umorientierung und Neuorganisation der DNA des Stammes bewirkt, in deren Rahmen ein genetisches,
offenbar chromosomales DNA-Element von ca. 37 kb
Größe neu gestaltet und selektiv vermehrt wurde. Das Gen für Tendamistat wurde
im Rahmen dieses Genom-Rearrangements von seiner ursprüngliehen
Lage auf einem 4,1 kb großen Pst I-Fragment auf der chromosomalen DNA der Ausgangsstamme auf das
37 kb-Element der Mutanten verlagert (transponiert) . Gleichzeitig
mit der Vermehrung des 37 kb-Elements trat somit eine Amplifizierung des Tendamistat-Gens auf. Spontan auftretende
Amplifikationen von DNA sind für Streptomyceten in neuester Literatur beschrieben (H. Schrempf, Mol. Gen. Genet. 189
(1983) 501), jedoch ist kein vergleichbarer Fall der Amplifikation
eines definierten Gens und der damit verbundenen Überproduktion eines Proteins bislang gefunden worden.
Das amplifizierte DNA-Element aus den überprodusierenden
Stämmen wird nach Spaltung der isolierten chromosomalen DNA mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen und nach elektrophoretischer
Trennung in 0,5 - 1,5 % Agarosegelen durch Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar. Molekulare Hybridisierungen
unter Nutzung allgemein beschriebener Verfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor, 1982) mit klonierten Sequenzen der amplifizierten DNA zeigen, daß lediglich Teilbereiche des
Elements in den Ausgangsstammen vorhanden
sind, aber nicht vermehrt vorliegen.
Es wurde gefunden, daß man die chromosomale DNA von Streptomyces
tendae sowie der Mutanten nach Zentrifugation im CsCl-Dichtegradienten isolieren kann, wenn die Zellen in Hauptkulturmedium
angezüchtet, gewaschen, in Tris-EDTA-NaCl haltigem Puffer mit Lysozym behandelt und mit einem Detergenz
(Natriumsalz von N-Lauroylsarcosin) lysiert werden. Die Kopienzahl des Inaktivator-Gens läßt sich abschätzen, wenn
man eine dem Gen homologe Probe radioaktiv markiert und in einem Southern-Hybridisierungsexperiment (Southern, 1975)
gegen äquivalente Mengen chromosomaler DNA von Ausgangsstamm
(z.B. DSM 2727) und isolierten Mutanten hybridisiert. Die Menge an gebundener Radioaktivität ist dann proportional zur
Häufigkeit des Gens in den verglichenen DNA-Spezies. (F.C. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1541).
Die homologe Probe stellt entweder das isolierte Gen selbst dar oder einen chemisch synthetischen Teilbereich des Gens,
dessen DNA-Sequenz abgeleitet wurde aus der Primärsequenz des Proteins. Danach hybridisiert die Probe zu einem 2,3kb
großen Pst I-Fragment der amplifizierten DKA, z.B. der überproduzierenden
Mutante 1-9362, jedoch zu einem 4,7kb großen
Pst I-Fragment der DNA der Ausgangsstamme· Die Hybridisierungsrate
ist ca. 20 mal höher zur 1-9362 DNA, so daß eine Genaraplifikation um einen Faktor
>20 geschlossen werden kann. Das entspricht der Steigerung der Produktbildung durch die
neuen Mutanten.
Die das Tendamistat-Gen enthaltende DNA kann in bekannter
Weise (Maniatis et al., a.a.O.) in Plasmide wie pBR 322 eingebaut und in Wirtsorganismen wie E. coil kloniert und
vermehrt werden. Die vermehrte DNA kann für weitere Stammverbesserungen herangezogen werden.
Tendamistat ist von großem therpeutischen Interesse bei der Behandlung weitverbreiteter Stoffwechselkrankheiten wie
Diabetes mellitus, Adipositas oder Hyperlipoproteinämie: Oral aufgenommen inhibiert der Inaktivator die intestinal
vorkommende menschliche ts<-Amylase. Dosisabhängig kann durch
den Inaktivator nun Einfluß genommen werden auf die Menge anfallender Glucose im Darm, die durch die *C-Amylase aus der
Stärke gebildet wird, und damit auch direkt auf den Glucosegehalt im Blut. Durch Applikation des Inaktivators wird der
gefürchtete, im Falle der o. g. Krankheiten unkontrollierte, Anstieg des Blutzuckerspiegels nach den Mahlzeiten reguliert
und ein neuer Weg zur Theraphie rnetabolischer Krankheiten eröffnet (Meyer et al., The Lancet, April I983, 934).
In den folgenden Beispielen beziehen sich Prozentangaben auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.
Charakterisierung des AusgangsStamms DSM 2727 Streptomyces
tendae:
Morphologie der Sporenkette * - retxnaculum apertum
Sporenoberfläche - glatt Sporenform - kugelig Farbe Luftmycel - grau (e)
Substratmycel - oliv-rotbraun
physiolog. Test: Melaninbildung negativ
Verwertung von
D-Glucose +
D-Arabinose +
D-Xylose +
Fructose +
Rhamnose +
Saccharose +
Raffinose +
Mannit +
Inosit -
Lactose +
Mutations-Verfahren: Ca. 0,25 cm versporten Mycels des Stammes DMS 2727, der auf Haferflockenagar angezüchtet
wird (EP-A 49 847), werden in 100 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die mit 25 ml des folgenden Kulturmediums gefüllt
sind:
Sojamehl 2 %
Glucose 3 %
Maisstärke 0,2 %
Harnstoff 0,1 %
Ammoniumeitrat 0,1 %
Malzextrakt 0,5 %
KH2PO4 0,2 %
τ - „
Das Medium wird 30 Minuten bei 1210C und 1 Bar autoklaviert,
der pH-Wert beträgt 7,0. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 300C auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Dann werden 2 ml
der gewachsenen Vorkultur in 20 ml Hauptkulturmedium, das sich in 100 ml Erlenmeyer-Kolben befindet (EP-A 49 847),
überimpft:
lösliche Stärke 2 - 4 %
Sojamehl 0,4 %
Q Cornsteep flüssig 0,4 %
Magermilchpulver 0,7 %
Glucose 1,0 %
^ pn 1 ? <£
Der pH-Wert des Mediums beträgt nach dem Autoklavieren pH 7,6.
Diesem Medium wird Acriflavin in einer Konzentration von 10 25 /Ug/ml als mutagenes Agens zugesetzt. Die Kultur wird
für 5 Tage bei 28°C und 220 U/min geschüttelt. Danach wird die Kulturlösung zentrifugiert (1 300 g, 5 Minuten) und das
Zellpellet in Hauptkulturmedium gewaschen. Die gewaschenen Zellen v/erden mit einem Glashomogenisator fragmentiert und
auf Agarplatten mit folgendem Medium ausplattiert:
| 25 | Rohrzucker | 0,3 |
| Dextrin ' | 1,5 | |
| NaCl | 0,05 | |
| K2HPO4 | 0,05 | |
| FeSO^ χ 7 H20 | 0,001 | |
| 30 | Tryptone Soja Broth (Fa. Oxoid) |
0,5 |
| Fleischextrakt (Fa. Difco) |
0,1 | |
| •Hefeextrakt (Fa. Difco) |
0,2 | |
| 35 | Agar (Fa. Merck) | 1,5 |
Der pH-Viert der Lösung beträgt 7,1 (Autoklavierungsbe
dingungcn wie oben).
Die Platten werden 5 Tage bei 28°C bebrütet und Einzelkolonien in Schrägröhrchen mit Haferflockenagar überimpft. Diese
werden wie beschrieben bebrütet, bis das Mycel versport ist.
Das versporte Mycel wird wie oben beschrieben in der Vor- und Hauptkultur vermehrt und das Kulturfiltrat nach 5-tägiger
Hauptkultur auf seinen Gehalt an Tendamistat geprüft (vgl. EP-A 49 847). Auf diese Weise können die Stämme 1-9353,
1-9362, 1-9417, 1-9418 selektioniert werden, die in ihrer
Wachstumsperiode unter den beschriebenen Bedingungen ca. 90 000 - 100 000 IE Tendamistat/1 Kulturlösung, entsprechend
1,5 - 1,8 g Inaktivator/1 produzieren.
Man arbeitet gemäß Beispiel 1, jedoch wird die Hauptfermentation
in einem Fermeter von 10 1 Gesamtvolumen mit einer 7 1-Füllung mit Hauptkulturmedium wie unter Beispiel 1 beschrieben,
durchgeführt. Als Stämme werden die Stämme 1-9353 und 1-9362 fermentiert. Beimpft wird die Hauptkultur mit
100 - 300 ml der unter Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur.
Die Fermentation erfolgt bei 3O0C bei einer Belüftungsrate von 300 l/h und einer Rührung von 70 0 - 900 Upm.
Durch Probeentnahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlieh
der Inaktivatoraktivität, des Substratabbaus und der Biomasseentwicklung überv/acht und verfolgt. Die Fermentation wird am Ende der exponentiellen Wachstumsphase abgebrochen.
Die maximale Inhibitoraktivität wird nach ca. 60 -SO Stundep nut ca. 1,2 - 1 >5 S/:L erreicht. Danach wird der Fermentationsinhalt
der Aufarbeitung zugeführt.
Isolation der Desoxyribonucleinsäure aus S. tendae und deren molekularbiologische Charakterisierung.
Die Anzucht der Zellen erfolgt entsprechend Beispiel 1. Nach
3-tägigem Wachstum im Hauptkulturmedium werden die Zellen eines Erlenmeyer-Kolbens durch 5-minütige Zentrifugation bei
3000 g bei 1J0C geerntet und zweimal mit 50 ml einer Lösung
aus 50 mM Tris/HCl-Puffer, 100 mM NaCl und 25 mM EDTA gewaschen.
Bei einer typischen Präparation werden 3 g fest-zentrifugierter
Zellen in flüssigem Stickstoff bei -198°C schockartig tiefgefroren und anschließend mit einem Schneidmesserhomogenisator
(Warring Commercial Blender) in Gegenwart von N?
zu einem.feinen Pulver homogenisiert. Dieses Pulver wird in
10 ml des genannten Puffers aufgenommen, auf Eis gelöst und mit 0,8 ml Lysozymlösung (30 mg/ml) 20 Minuten bei 28°C
unter leichtem Schütteln inkubiert. Der Suspension wird dann 0,8 ml einer Proteinase K-Lösung (15 mg/ml) und 0,8 ml einer
20 % Lösung des Natriumsalzes von N-Lauroylsarcosin zugefügt.
Nach vorsichtigem Mischen wird das Gemisch 30 Minuten auf Eis und weitere 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Zugabe und Lösung von 22 g festem Caesiumchlorid
wird das Volumen mit dem obengenannten Puffer auf 22 ml eingestellt und aie Suspension bei 12 000 g und 40C 25 Minuten zentrifugiert. Das klare
Zentrifugat wird mit Ethidiumbromid versetzt und der Brechungsindex
mit CsCl refraktometrisch auf n= 1 , 3920 eingestellt.
Nach präparativer Ultrazentrifugation (120 000 g, 36 Std.,
150C) wird die Bande ehromosomaler DNA aus den Zentrifugenröhrchen
entnommen und unter denselben Bedingungen rezentrifugiert. Die isolierte Bande wird durch Ausschütteln mit
n-Butanol vom Ethidiumbromid befreit und zur restlosen Entfernung des CsCl dialysiert. Die so gewonnene DNA ist
schneidbar z.B. mit den Enzymen Pst I, Bam H I, Sau 3a ,q j
BgI II und Xho I, und nicht schneidbar z.B. mit den Endonukleasen
Eco R I und Hind III.
Die beispielsweise aus den Mutanten 1-9353 und 1-9362 gewonnene
DNA ist gegenüber der DNA von ATCC 31210 bzw.DSM 2727 charakterisiert durch ein amplifiziertes genetisches
Element, dessen Einzelfragmente deutlich sichtbar nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid aus
dem Hintergrund nicht selektiv vermehrter Fragmente hervortreten.
Die Größe des amplifizierten Elementes sowie die charakteristischen Einzelfragmente nach Verdauung mit
Restriktionsendonukleasen sind nachfolgend wiedergegeben:
| Fragment | Pst I | Fragmentgröße | (kbp) | Bam H I |
| Nr. | 9,0 | Xho I | 7,2 | |
| 1 | 7,0 | 13,5 | 6,1 | |
| 2 | 6,8 | 11,5 | 5,3 | |
| 3 | 4,6 | 9,3 | 2,9 | |
| 4 | 3,4 | 2,8 | 2,6 | |
| 5 | 3,1 | 0,7 | 2,5 | |
| 6 | 2,3 | 2,15 | ||
| 7 | ' υ | 2,1 | ||
| 8 | 1,5 | |||
| 9 | 1,2 | |||
| 10 | 1,1 | |||
| 11 | 1,0 | |||
| 12 | 0,8 | |||
| 13 | 0,5 | |||
| 14 | 0,48 | |||
| 15 | 37,3 | 37,43 | ||
| Gesamt | 37,8 | |||
Klonierung von Teilsequenzen des amplifizierten genetischen
Elements aus der Mutante 1-9362.
100 ,ug der nach Beispiel 3 isolierten DNA.aus 1-9362
werden vollständig mit der Restriktionsendonuklease Pst I verdaut. Die bei der Verdauung entstandenen DNA-Fragmente
werden in einem 0,8 #-Gel aus niedrigschmelzender (low melting point) Agarose gelelektrophoretisch aufgetrennt und
nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Bereiche des Gels, die
durch ihre intensive Fluoreszenz auffallende, amplifizierte
DNA-Fragmente enthalten, werden sorgfältig ausgeschnitten und die DNA nach Schmelzen des Gels bei 680C (2 Minuten)
durch zweimalige Extraktion mit wassergesattigtem Phenol und anschließender Etherextraktion isoliert. Die DNA wird aus
der so erhaltenen wäßrigen Phase durch Ammoniumacetat-Fällung konzentriert und zur weiteren Reinigung mit N,N'-Bis-(3-aminopropyl)-1,4-butandiamin
(spermin) umgefällt. Die so erhaltene DNA wird in einem 25 /Ul Reaktionsansatz mit der
DNA des gereinigten, Pst I-verdauten und mit dem Enzym
Alkalische Phosphatase behandelten Plasmids, z.B.pBR 322, mit Hilfe des Enzyms T4 DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch
wird in für die Aufnahme von DNA mit CaCl„ kompetent gemachten
Zellen von Escherichia coli HB 101 transformiert.
Transformierte Zellen, die ein rekombinantes Plasmid mit einem in die Pst I-Schnittstelle insertierten DNA-Fragment
enthalten, sind resistent gegen das Antibiotikum Tetracyclin, jedoch sensitiv gegen das Antibiotikum Ampicillin.
Die Selektion von Klonen mit dem Hybridplasmid erfolgt demnach durch Replika-Plattieren von Agarplatten mit Tetracyclin
auf Agarplatten mit Ampicillin.
Um zu prüfen, in welchem E. coli-Klon sich ein rekombinantes
Plasmid mit einem Insert aus der amplifizierten DNA befindet, wird die Plasmid-DNA aus den einzelnen E. coli-Klonen
mit Hilfe der "Rapid Boiling"-Methode (Holmes und Quigley, Analyt. Biochem. 114 (I98I) 193) isoliert und mit
dem Enzym Pst I verdaut. Alternativ wird die DNA beispielsweise mit den Endonukleasen Bam H I und Sal I nachverdaut,
da Schnittstellen dieser Enzyme für das jeweilige klonierte Fragment spezifisch sind. Die erhaltenen Fragmentmuster
werden nach Auftrennung in Agarose-Gelen mit den Fragmentmustern der entsprechend verdauten DNA aus der niedrigschmelzenden Agarose verglichen. Im Falle übereinstimmender
Größe und Anzahl der Teilfragmente wird die Plasmid-DNA"
dann zusätzlich mittels Nick-Translation radioaktiv markiert
333*880
und in einem Southern-Hybridisierungsexperiment gegen die
Restriktionsfragmente der Gesamt-DNA aus 1-9362 nach Verdauung mit den o. a. Enzymen hybridisiert. Die Identifizierung
eines klonierten Fragments als Bestandteil des amplifizierten genetischen Elementes gilt dann als gesichert, wenn a)
die Fragmentmuster identisch sind mit denen der DNA aus 1-9362 nach Anwendung verschiedener Restriktionsenzyme und
wenn b) das klonierte Fragment ausschließlich gegen das homologe Fragment aus der amplifizierten DNA des 1-9362
TO hybridisiert.
Auf diesem Wege wurde ein 2,3 kb großes Fragment der amplifizierten
DNA in E. coli kloniert, welches gemäß Beispiel 3 das komplette Gen für Tendamistat enthält. Das 2,3 kb große
Pst I-Fragment mit dem Tendamistat-Gen ist charakterisiert durch die Reihenfolge, die Lage und die Größe einzelner
Teilfragmente, produziert durch die Restriktionsenzyme
Pst I, Bam H I und Sal I. Die Struktur des rekombinanten Plasmids pKAI 1 ist in Figur 1, die Struktur des klonierten
2,3 kb Fragments in der Figur 2 wiedergegeben. Die einzelnen hier angewandten molekularbiologischen Arbeitsmethoden
sind bei Maniatis et al. (a.a.O.) beschrieben.
- Leerseite -
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von Tendamistat durch Fermentation
von Streptomyces tendae, dadurch gekennzeichnet, daß Tendamistat produzierende S. tendae-Stämme
eingesetzt werden, die mit sublethalen Dosen
Acriflavin behandelt wurden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 5 bi-s 50 ug Acriflavin pro ml Kulturlösung eingesetzt
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 3.0 μg Acriflavin pro ml Kulturlösung eingesetzt
werden.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Acriflavin
über den gesamten Zeitraum des Zellwachstums einwirkt.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der S. tendae-Stamm
DSM 2727 eingesetzt wird.
6. Tendamistat produzierende Stämme der Art S. tendae,
die mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden und deren Tendamistat-Produktion auf mindestens 1 g/l erhöht wurde.
die mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden und deren Tendamistat-Produktion auf mindestens 1 g/l erhöht wurde.
7. Streptomyces tendae-Starnm DSM 2727.
8. DNA-Fragment mit dem Gen für Tendamistat, erhältlich
aus Stämmen gemäß Anspruch 6.
aus Stämmen gemäß Anspruch 6.
9. Hybridplasmido, enthaltend die DNA gemäß Anspruch 8.
10. Wirtsorganismus, enthaltend ein Plasmid gemäß Anspruch
COPY J
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|---|---|---|---|
| DE19833331860 DE3331860A1 (de) | 1983-09-03 | 1983-09-03 | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3331860A1 true DE3331860A1 (de) | 1985-03-21 |
| DE3331860C2 DE3331860C2 (de) | 1992-01-16 |
Family
ID=6208186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19833331860 Granted DE3331860A1 (de) | 1983-09-03 | 1983-09-03 | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3331860A1 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0161629A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten |
| EP0289936A3 (en) * | 1987-05-05 | 1989-11-23 | Hoechst Aktiengesellschaft | Method for the preparation of foreign proteins in streptomyces |
| US4918007A (en) * | 1985-10-10 | 1990-04-17 | Hoechst Aktiengesellschaft | Promoter arrangement for streptomycetes vectors |
| EP0281090A3 (en) * | 1987-03-06 | 1990-05-02 | Hoechst Aktiengesellschaft | Tendamistate derivatives |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0049847A2 (de) * | 1980-10-09 | 1982-04-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels |
-
1983
- 1983-09-03 DE DE19833331860 patent/DE3331860A1/de active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0049847A2 (de) * | 1980-10-09 | 1982-04-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0161629A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten |
| US4918007A (en) * | 1985-10-10 | 1990-04-17 | Hoechst Aktiengesellschaft | Promoter arrangement for streptomycetes vectors |
| EP0281090A3 (en) * | 1987-03-06 | 1990-05-02 | Hoechst Aktiengesellschaft | Tendamistate derivatives |
| EP0289936A3 (en) * | 1987-05-05 | 1989-11-23 | Hoechst Aktiengesellschaft | Method for the preparation of foreign proteins in streptomyces |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3331860C2 (de) | 1992-01-16 |
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