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CN119101162A - 一种抗cldn18_2的抗体及体外诊断试剂盒 - Google Patents

一种抗cldn18_2的抗体及体外诊断试剂盒 Download PDF

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CN119101162A
CN119101162A CN202310675165.8A CN202310675165A CN119101162A CN 119101162 A CN119101162 A CN 119101162A CN 202310675165 A CN202310675165 A CN 202310675165A CN 119101162 A CN119101162 A CN 119101162A
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seq
amino acid
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sequence shown
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孙吉叶
文勇
侯顾伟
傅松
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Jiangsu Aosaikang Biomedical Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Aosaikang Biomedical Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种抗CLDN18.2的抗体及其体外诊断试剂盒。

Description

一种抗CLDN18_2的抗体及体外诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种抗CLDN18.2的抗体及含有所述抗CLDN18.2的抗体的体外诊断试剂盒。
背景技术
胃癌是威胁生命健康的主要恶行肿瘤之一；数据显示2020年中国胃癌新发病例47.9万，死亡病例37.4万；2003～2015年，中国胃癌5年相对生存率有所升高，从27.4％提高到35.1％；但仍明显低于部分其他国家/地区。(《中国胃癌筛查与早诊早治指南(2022)》，中国国家癌症中心，http://chinancpcn.org.cn)。这些统计数据清晰的表明胃癌有限的治疗方案是严重不满足医疗状况的。
抗体是一类相对较新的靶向治疗化合物，其在各种癌症的治疗上已有广泛应用。抗体靶向治疗相对于多种传统的非抗体类型的肿瘤治疗具有更高特异性和更低的副作用的潜能。Claudin 18.2最近被发现作为抗体的靶点来治疗胃癌和食道癌(J HematolOncol.2017(1):105)。同时它也是胰腺癌开发抗体药物的靶点。目前临床上有多个抗Claudin 18.2单抗在开发中，例如Zolbetuximab(IMAB362)、ASKB589等。
细胞紧密连接蛋白(Claudin)是构成细胞紧密连接的重要分子，紧密连接决定了上皮细胞的渗透性，也起到阻挡细胞膜表面蛋白和脂质扩散的作用。Claudin18属于Claudins蛋白家族，在人体内由Claudin18基因编码。人的Claudin18基因具有两个不同的1号外显子，转录后经过可变剪接最终生成仅在N端具有不同序列的两个蛋白亚型Claudin18.1和Claudin18.2。在人体中Claudin18.1和Claudin18.2的表达具有组织特异性，Claudin18.1主要表达在肺组织中，在胃组织或胃癌没有表达。Claudin18.2作为一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上表皮细胞上。在原发性胃癌及其转移后癌症类型中大部分都表达Claudin18.2分子。由于Claudin18.2在正常组织表达的高度特异性及在多种癌症中被激活表达，因此针对上皮性肿瘤，Claudin18.2成为极具潜力的靶点。
为使表达Claudin18.2的胃癌或胃食管结合部癌人群精准获益，在使用治疗性抗Claudin 18.2单抗治疗前，需要进行Claudin 18.2阳性患者的诊断筛选。因此研制开发了细胞紧密连接蛋白(Claudin)18.2抗体试剂(免疫组织化学法)作为药物的原研伴随诊断试剂。在进行临床伴随诊断检测时，胃癌或胃食管结合部癌病理组织通常石蜡包埋切片后，进行Claudin 18.2的免疫组化染色。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；所述抗CLDN18.2的抗体包括：(1)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗体重链CDR1，(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链CDR2，(3)SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的抗体重链CDR3，(4)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体轻链CDR1，(5)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的抗体轻链CDR2，(6)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的抗体轻链CDR3。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体包括：SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体重链可变区，SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有不低于90％相似性(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)的抗体轻链可变区。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体为本发明中记载的DS-3抗体。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体包括：SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体重链，SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与SEQ IDNO：10所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体轻链。
本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸，所述核酸编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明第二方面所述的核酸。
本发明的第四方面，提供了一种体外诊断试剂盒，所述体外诊断试剂盒包含抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；所述抗CLDN18.2的抗体包括：(1)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗体重链CDR1，(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链CDR2，(3)SEQ IDNO：3所示氨基酸序列的抗体重链CDR3，(4)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体轻链CDR1，(5)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的抗体轻链CDR2，(6)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的抗体轻链CDR3。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体包括：SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体重链可变区，SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体轻链可变区。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体包括：SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体重链，SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与SEQ IDNO：10所示氨基酸序列具有不低于90％(例如不低于90％、或不低于95％、或不低于98％、或不低于99％)相似性的抗体轻链。
本发明的一个实施方式，所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段与至少一个可检测标记物偶联。
本发明的第五方面，提供了提供一种利用本发明第五方面所述体外诊断试剂盒来检测样本的方法。
本发明的一个实施方式，一种检测样本的方法包括：(i)将样本固定于固体支持物；(ii)使样本与本发明第五方面所述体外诊断试剂盒中包括的抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段接触；(iii)将所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段与可检测标记物接触；(iv)确定所述CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与样本的结合水平；所述可检测标记物用于标记所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
本发明的一个实施方式，提供了一种检测样本的方法，包括：(i)将样本固定于固体支持物；(ii)使样本与本发明第五方面所述体外诊断试剂盒中包括的抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段接触；(iii)通过可检测标记物确定所述抗体或其抗原结合片段与样本的结合水平。所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段与至少一个可检测标记物偶联。
本发明的一个实施方式，所述可检测标记物为辣根过氧化酶。
本发明的一个实施方式，所述样本为组织切片。
本发明的一个实施方式，所述组织选自胰腺、食道、卵巢、肺、胰腺、胃、支气管、乳腺或耳鼻喉。
本发明的一个实施方式，其中所述固体支持物为载玻片。
本领域技术人员可以基于重链或轻链可变区的序列，轻易地确定CDR序列。对抗体可变区进行CDR标注，需要选择一种编号方案(antibody numbering scheme)和一种标注方案(definition scheme)。编号方案包括但不限于：IMGT、Chothia、Kabat、Martin(扩展版Chothia)；标注方案(definition scheme)包括但不限于Chothia、Kabat、IMGT、Contact。
序列比对,通常一个序列作为对照序列，来将测试序列进行比对。本发明中，术语序列的“相似性”(similarity)是指测试序列与目标序列之间相同的氨基酸占整个序列的比例(相对宏观的一个描述)。在氨基酸序列比对中相似性还包括，除了完全相同的残基外，在对应位置的两个残基是否具有相似的特性，如侧链基团的大小、电荷性、亲疏水性等。序列排列进行比对的方法是本领域技术的公知常识。
本发明中，术语“Claudin 18”、“密蛋白18”或“CLDN18”为可互相替换的术语；术语“Claudin 18.1”、“密蛋白18.1”、“CLDN18.1”或“CLDN18_1”为可互相替换的术语；术语“Claudin 18.2”、“密蛋白18.2”、“CLDN18.2”或“CLDN18_2”为可互相替换的术语。
本发明中，术语“体外诊断试剂”或“体外诊断试剂盒”，是指在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品，可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。
本发明中，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”或“由…构成”。
本发明中，“质量体积百分数”或“％(w/v)”或““％w/v”是质量体积浓度的一种表示方式，表示每100ml溶液中含有的溶质克数，例如20％(w/v)表示每100ml溶液中含有20g溶质。
本发明提供了一种抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，以及含有所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段的体外诊断试剂盒；所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2蛋白的结合活性高；含有所述抗体或其抗原结合片段的体外诊断试剂盒操作简便、检测灵敏度高、存放稳定性好。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
6-8周龄雌性Balb/c小鼠，经免疫人Claudin18蛋白，于三次免疫后一周取血，使用间接ELISA测血清效价，以1000倍稀释血清OD-blank＞0.5为效价合格标准，效价合格的小鼠血清进行免疫组化检测，挑选组化优势小鼠进行冲击免疫，冲击免疫3-4天后取小鼠脾脏进行杂交瘤融合。
采用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行结合检测，以筛选获得阳性细胞。将筛选获得的每株阳性细胞培养后取上清进行ELISA和IHC检测，挑选ELISA和IHC双阳性细胞再次进行1～2轮有限稀释，直至获得稳定的阳性细胞。利用获得的稳定的阳性细胞，进一步制备纯化抗CLDN18.2单抗，获得DS-3。
经测序，抗体DS-3的具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的抗体重链可变区，SEQ IDNO：8所示氨基酸序列的抗体轻链可变区；抗体DS-3的具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的抗体重链，SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的抗体轻链；其CDR信息如下(编号方案基于Kabat，标注方案基于Kabat)：
重链CDR1 SEQ ID NO：1 SHWVH
重链CDR2 SEQ ID NO：2 EIDPNNGRTNFNEKFKR
重链CDR3 SEQ ID NO：3 ARSSLAY
轻链CDR1 SEQ ID NO：4 KSSQSLLDSDGKTYLH
轻链CDR2 SEQ ID NO：5 LVSKLDS
轻链CDR3 SEQ ID NO：6 WQNTHFP
SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：8
已知抗体DS-3的氨基酸序列后，可以进一步利用基因工程技术，构建质粒，再将构建好的质粒转染/转化入适合的宿主细胞(包括但不限于CHO细胞、大肠杆菌)，从而表达获得抗体DS-3。
实施例2DS-3抗体结合活性测定
DS-3抗体的活性检测采用抗原抗体结合实验，包被5μg/ml的CLDN18.2捕获蛋白，设置DS-3抗体最大检测浓度为1.2ug/ml，采用3倍梯度稀释；二抗采用羊抗鼠IgG，稀释比1：1500。实验得到，DS-3与CLDN18.2蛋白的结合活性EC50为3.59ng/ml。
实施例3DS-3作为体外诊断试剂
在Leica Bond III全自动免疫组化仪上进行Claudin18.2染色实验，实验步骤如下：
(i)样本预处理：(1)将待检样本切片和质控片置于65±5℃烘箱烤片30～60分钟；(2)取出切片，冷却至室温；
(ii)切片染色实验步骤：
(iii)清洗封片：上述染色步骤结束后，将样本载玻片取出，通过DAKEWE全自动染色封片一体机进行脱水封片操作。
实施例4DS-3检测试剂染色结果判读
CLDN18.2抗体试剂的细胞染色定位模式是细胞膜和/或细胞质；在肿瘤组织样本的染色中，仅判读肿瘤细胞的细胞膜染色情况，不考虑细胞质染色。评估整个样本：切片上所有有效的肿瘤细胞都应进行评估，满足不少于100个肿瘤细胞。CLDN18.2抗体试剂在肿瘤组织中的染色判读标准：仅判读肿瘤细胞的细胞膜染色情况，同时分别计算细胞膜各染色强度的肿瘤细胞染色比例(TC)。
计算公式如下：
染色强度分为0，1+，2+和3+，染色强度评分判读如下：
0：肿瘤细胞中无目标染色；
1+：肿瘤细胞呈现微弱或不完整的细胞膜染色；
2+：肿瘤细胞呈现中等强度的细胞膜染色；
3+：肿瘤细胞呈现强的细胞膜染色；
取51份不同样本，分别用DS-3检测试剂、对照抗体R检测试剂进行检测。抗体R检测试剂是一个市售的CLDN18.2的诊断试剂。其中DS-3检测试剂检测试剂的步骤参照实施例3，抗体R检测试剂的步骤参照其附带的使用说明。
当定义临界值为TC(2+&3+)＝40％，即TC(2+&3+)≥40％时，判读结果为阳性；检测结果对比如表1所示。表1中，用DS-3检测试剂判读为阳性，用抗体R检测试剂判读为阴性的有2个样本；样本编号为B1786-1、221208-18。这两个样本的染色结果如表2所示。
样本B1786-1，DS-3检测试剂的TC(2+&3+)＝45％，抗体R检测试剂的TC(2+&3+)＝35％；样本221208-18，DS-3检测试剂的TC(2+&3+)＝50％，抗体R检测试剂的TC(2+&3+)＝30％；经分析，DS-3与抗体R呈相似的染色模式，但DS-3在部分肿瘤细胞上染色更强，可能由于两个克隆识别的抗原位点不同，或DS-3灵敏度更高。
表1DS-3检测试剂与市售抗体R检测试剂的配对检测结果(cutoff值为40％)
表2
当定义临界值为TC(2+&3+)＝75％，即TC(2+&3+)≥75％时，判读结果为阳性；检测结果对比如表3所示。其中，DS-3检测试剂、抗体R检测试剂存在差异的3个样本的具体结果如表4所示。3个样本的染色差异均较小，或DS-3灵敏度更高。
表3DS-3检测试剂与市售抗体R检测试剂的配对检测结果(cutoff值为75％)
表4
实施例5DS-3检测试剂稳定性
研发小试生产的3个批次(0880812071、0880812072和0880812073)的DS-3伴随诊断试剂盒(免疫组织化学法)经检验合格后，每支试剂各自分装适量体积保存到37℃温箱中，分别在第0天、第3天、第7天和第14天取出，对组织芯片的连续切片各进行一次测试，比较染色结果，并由一名专业的病理医生对染色的切片进行判读，分析判读结果。
结果显示，3个批次试剂盒中的试剂阳性信号的定位和强度在14天中的4次测试均无明显变化，阴性对照试剂未见任何目标阳性信号；3个批次试剂盒中，同一支试剂在14天内的4次测试中，同一组织的判读结果无较大差异，ΔTC(≥2+)≤10％；14天内的每一次测试中，3个批次试剂盒的即用型CLDN18.2鼠单抗试剂同一组织的判读结果几乎无差异，ΔTC(≥2+)≤5％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；所述抗CLDN18.2的抗体包括：
(1)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗体重链CDR1，
(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链CDR2，
(3)SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的抗体重链CDR3，
(4)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体轻链CDR1，
(5)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的抗体轻链CDR2，
(6)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的抗体轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗CLDN18.2的抗体包括：
SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有不低于90％相似性的抗体重链可变区，
SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有不低于90％相似性的抗体轻链可变区。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2中所述的抗体或其抗原结合片段。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。
5.一种体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒包含抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；所述抗CLDN18.2的抗体包括：
(1)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的抗体重链CDR1，
(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体重链CDR2，
(3)SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的抗体重链CDR3，
(4)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抗体轻链CDR1，
(5)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的抗体轻链CDR2，
(6)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的抗体轻链CDR3。
6.根据权利要求5所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述抗CLDN18.2的抗体包括：
SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有不低于90％相似性的抗体重链可变区，
SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有不低于90％相似性的抗体轻链可变区。
7.根据权利要求5或6所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段与至少一个可检测标记物偶联。
8.一种检测样本的方法，包括：
(i)将样本固定于固体支持物；
(ii)使样本与权利要求5或6所述体外诊断试剂盒中包括的抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段接触；
(iii)将所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段与可检测标记物接触；
(iv)确定所述CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与样本的结合水平；
所述可检测标记物用于标记所述抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
9.一种检测样本的方法，包括：
(i)将样本固定于固体支持物；
(ii)使样本与权利要求7所述体外诊断试剂盒中包括的抗CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段接触；
(iii)通过可检测标记物确定所述抗体或其抗原结合片段与样本的结合水平。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述可检测标记物为辣根过氧化酶。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述样本为组织切片。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述组织选自胰腺、食道、卵巢、肺、胰腺、胃、支气管、乳腺或耳鼻喉。
13.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述固体支持物为载玻片。
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